ES2929362T3 - Activación de la bioluminiscencia mediante complementación estructural - Google Patents

Activación de la bioluminiscencia mediante complementación estructural Download PDF

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Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para el ensamblaje de un complejo bioluminiscente a partir de dos o más unidades peptídicas y/o polipeptídicas no luminiscentes (p. ej., sustancialmente no luminiscentes). En particular, la actividad bioluminiscente se confiere a un polipéptido no luminiscente a través de la complementación estructural con otro péptido no luminiscente complementario. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Activación de la bioluminiscencia mediante complementación estructural
Campo
En el presente documento se proporcionan sistemas, complejos y métodos que implican unidades peptídicas y polipeptídicas no luminiscentes (por ejemplo, sustancialmente no luminiscentes) tal como se define en las reivindicaciones. En particular, la actividad bioluminiscente se confiere a un polipéptido no luminiscente a través de la complementación estructural con otro péptido no luminiscente complementario.
Antecedentes
Los procesos biológicos se basan en interacciones covalentes y no covalentes entre moléculas, macromoléculas y complejos moleculares. Para comprender tales procesos y desarrollar técnicas y compuestos para manipularlos con fines de investigación, clínicos y otras aplicaciones prácticas, es necesario disponer de herramientas para detectar y monitorizar estas interacciones. El estudio de estas interacciones, particularmente en condiciones fisiológicas (por ejemplo, a niveles de expresión normales para monitorizar las interacciones de proteínas), requiere una alta sensibilidad.
Inouye et al., 2000. FEBS LETTERS, vol. 481, n.° 1 describen una luciferasa secretora del camarón luminoso Oplophorus gracilirostris.
El documento EP 1156103 A2 describe una luciferasa de Oplophorus, una fotoproteína y un método para producir la luciferasa de Oplophorus recombinante o la fotoproteína.
El documento WO 2014/093677 A1 describe composiciones y métodos para la detección y el análisis de la unión intracelular de un agente bioactivo a una diana celular.
El documento US 2012/174242 A1 describe un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de luciferasa modificado y sustratos.
Hall et al., 2012. ACS CHEM. BIOL., vol. 7 describen un indicador de luciferasa modificado por ingeniería obtenido de un camarón de aguas profundas que utiliza un sustrato de imidazopirazinona.
Sumario
La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona un sistema de pares no luminiscentes para su uso en la detección y monitorización de interacciones moleculares, por ejemplo, interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN, ARN-ADN, proteína-molécula pequeña o ARN-molécula pequeña, comprendiendo dicho sistema:
(a) un péptido no luminiscente que tiene menos del 100% y más del 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 390 o s Eq ID NO: 2271, en el que se produce una señal bioluminiscente detectable en presencia de un sustrato cuando el péptido se asocia con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440; y
(b) un polipéptido no luminiscente que tiene menos del 100% y más del 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 440, en el que el polipéptido comprende dos o más diferencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 440, y en el que se produce una señal bioluminiscente detectable en presencia de un sustrato cuando el polipéptido se asocia con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 2;
en el que la señal bioluminiscente detectable se produce en presencia de un sustrato cuando el péptido no luminiscente se asocia con el polipéptido no luminiscente.
Aspectos adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones.
En el presente documento se divulgan péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene menos del 100% (por ejemplo, el 70%... el 80% o más) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 390 o s Eq ID NO: 2271, en los que se produce una señal bioluminiscente detectable cuando el péptido entra en contacto con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440 tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones. En el presente documento se divulgan péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene menos del 100% y más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271, en los que se produce una señal bioluminiscente detectable cuando el péptido entra en contacto con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440 tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones. Se produce una señal bioluminiscente detectable cuando el péptido entra en contacto con un polipéptido que tiene menos del 100% y más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 440. La señal bioluminiscente detectable se produce, o aumenta sustancialmente, cuando el péptido se asocia con el polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440. El péptido puede presentar alteración (por ejemplo, mejora) de uno o más rasgos en comparación con un péptido de SEQ ID NO: 2, en el que los rasgos se seleccionan de: afinidad por el polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440, expresión, solubilidad intracelular, estabilidad intracelular y actividad bioluminiscente cuando se combina con el polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440. La secuencia de aminoácidos del péptido puede seleccionarse de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271. En el presente documento se divulgan polipéptidos de fusión que comprenden: (a) un péptido descrito anteriormente, y (b) un primer polipéptido de interacción que forma un complejo con un segundo polipéptido de interacción tras el contacto del primer polipéptido de interacción y el segundo polipéptido de interacción tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones. Se proporcionan complejos bioluminiscentes que comprenden: (a) un primer polipéptido de fusión descrito anteriormente y (b) un segundo polipéptido de fusión tal como se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se divulgan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 440 tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones, en los que se produce una señal bioluminiscente detectable cuando el polipéptido entra en contacto con un péptido que consiste en SEQ ID NO: 2. En el presente documento se divulgan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene menos del 100% y más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 440 tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones, en el que se produce una señal bioluminiscente detectable cuando el polipéptido entra en contacto con un péptido que consiste en SEQ ID NO: 2. Una señal bioluminiscente detectable se produce cuando el polipéptido entra en contacto con un péptido que tiene menos del 100% y más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271. El polipéptido puede presentar alteración (por ejemplo, mejora) de uno o más rasgos en comparación con un péptido de SEQ ID NO: 440, en el que los rasgos se seleccionan de: afinidad por el péptido que consiste en SEQ ID NO: 2, expresión, solubilidad intracelular, estabilidad intracelular y actividad bioluminiscente cuando se combina con el péptido que consiste en SEQ ID NO: 2. La señal bioluminiscente detectable se produce cuando el polipéptido se asocia con el péptido que consiste en SEQ ID NO: 2. En el presente documento se divulga un polipéptido de fusión que comprende: (a) un polipéptido descrito anteriormente y (b) un primer polipéptido de interacción que forma un complejo con un segundo polipéptido de interacción tras el contacto del primer polipéptido de interacción y el segundo polipéptido de interacción tal como comprenden los sistemas definidos en las reivindicaciones. Se proporciona un complejo bioluminiscente que comprende: (a) un primer polipéptido de fusión descrito anteriormente; y (b) un segundo polipéptido de fusión tal como se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona complejos bioluminiscentes, tal como se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se proporcionan métodos para detectar una interacción entre los polipéptidos de interacción primero y segundo tal como se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un gráfico que representa el efecto de diversas mutaciones del péptido GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) sobre la luminiscencia resultante de la complementación con SEQ ID NO: 440.
La figura 2 muestra un gráfico que representa el efecto de diversas mutaciones del polipéptido de SEQ ID NO: 440 sobre la luminiscencia resultante de la complementación con los péptidos GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) o GVTGWRLFKRISA (SEQ ID NO: 108).
La figura 3A muestra la luminiscencia (RLU) detectada en cada mutante de polipéptido no luminiscente (NLpoly) que contiene una única sustitución de glicina por alanina. La figura 3B muestra el aumento en veces en la luminiscencia con respecto al tipo natural.
La figura 4A muestra la luminiscencia (RLU) detectada en cada mutante de NLpoly que contiene un compuesto de sustituciones de glicina a alanina. La figura 4B muestra el aumento en veces en la luminiscencia con respecto al tipo natural.
La figura 5 muestra un gráfico que representa la luminiscencia (RLU) detectada en las fusiones HT-péptido NL.
La figura 6 muestra un gráfico que representa la luminiscencia (RLU) detectada en las fusiones HT-NLpep.
La figura 7 muestra un gráfico que representa la luminiscencia (RLU) detectada en fusiones péptido NL-HT.
La figura 8 muestra la luminiscencia (RLU) generada por un complejo luminiscente después de ciclos de congelación-descongelación de péptido no luminiscente (NLpep).
La figura 9 muestra la actividad de concentración normalizada de los péptidos y el gel de TMR usado para determinar las concentraciones relativas.
La figura 10 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo R11 de NLpoly-5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 11 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo A15 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 12 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo L18 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 13 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo F31 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 14 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo V58 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 15 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo A67 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 16 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo M106 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 17 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo L149 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 18 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas mutaciones del residuo V157 de NLpoly 5A2 en presencia de NLpep53 (arriba) y en ausencia de péptido complementario (abajo).
La figura 19 muestra un gráfico de la luminiscencia de las fusiones NLpep-HT.
La figura 20 muestra un gráfico de la luminiscencia de las fusiones NLpep-HT y un gel de TMR que indica sus niveles de expresión relativos.
La figura 21 muestra un gráfico de la luminiscencia de las fusiones NLpep-HT.
La figura 22 muestra un gráfico de la luminiscencia de NLpoly 5A2 (arriba) y NLpoly5A2+R11E en presencia de diversos NLpep (abajo).
La figura 23 muestra un gráfico de la luminiscencia de las fusiones NLpep-HT.
La figura 24 muestra un gráfico de la luminiscencia de NLpoly 1-13 con NLpep53 (arriba) y sin péptido complementario (abajo).
La figura 25 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversos NLpoly con NLpep53 con tampón NANOGLO o DMEM y sustrato furimazina o coelenterazina.
La figura 26 muestra un gráfico que compara la luminiscencia en presencia de una razón de furimazina con respecto a coelenterazina para diversos NLpoly y NLpep53.
La figura 27 muestra un gráfico que compara la luminiscencia en presencia de una razón de furimazina con respecto a coelenterazina para diversos NLpoly y NLpep53.
La figura 28 muestra un gráfico que compara la luminiscencia en presencia de furimazina con coelenterazina para diversos NLpoly y NLpep53 en lisado de células HEK293.
La figura 29 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversas combinaciones de pares de NLpoly y NLpep en tampón DMEM con furimazina.
La figura 30 muestra un gráfico de la señal/luminiscencia de fondo de diversas combinaciones de pares de NLpoly y NLpep en tampón DMEM con furimazina.
La figura 31 muestra un gráfico de la luminiscencia y la especificidad de sustrato de diversos mutantes de NLpoly con NLpep69 usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato.
La figura 32 muestra una comparación de la luminiscencia y la especificidad de sustrato de diversos mutantes de NLpoly con NLpep69 usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato, y en condiciones o bien líticas (gráfico inferior) o bien de células vivas (gráfico superior).
La figura 33 muestra una comparación de la luminiscencia y la especificidad de sustrato de los mutantes de NLpoly con NLpep78 usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato, y en condiciones o bien líticas (gráfico inferior) o bien de células vivas (gráfico superior).
La figura 34 muestra una comparación de la luminiscencia y la especificidad de sustrato de diversos mutantes de NLpoly con NLpep79 usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato, y en condiciones o bien líticas (gráfico inferior) o bien de células vivas (gráfico superior).
La figura 35 muestra gráficos de la luminiscencia de las fusiones NLpep78-HT (arriba) y NLpep79-HT (abajo) en presencia de diversos NLpoly.
La figura 36 muestra un gráfico de la luminiscencia de diversos NLpoly en ausencia de NLpep.
La figura 37 muestra gráficos de la luminiscencia de las fusiones NLpep78-HT (arriba) y NLpep79-HT (abajo) en presencia de diversos NLpoly con sustratos o bien furimazina o bien coelenterazina.
La figura 38 muestra un gráfico de la luminiscencia de NLpep78-HT con diversos NLpoly expresados en células CHO y HeLa.
La figura 39 muestra gráficos de la luminiscencia normalizada y sin procesar de NLpoly fusionado con luciferasa de luciérnaga expresada en lisados de células HEK293, Hela y CHO.
La figura 40 muestra gráficos de la luminiscencia normalizada y sin procesar de NLpoly fusionado con luciferasa roja de elatérido expresada en lisados de células HEK293, Hela y CHO.
La figura 41 muestra gráficos de la luminiscencia de complementación en células vivas usando o bien NLpoly de tipo natural o bien 5P.
La figura 42 muestra gráficos de la luminiscencia de la complementación sin células de la fusión NLpep78-HT (arriba) y la fusión NLpep79-HT (abajo) con diversos NLpoly.
La figura 43 muestra un gráfico de afinidades de unión para diversas combinaciones de NLpep y NLpoly expresadas en lisado de células HeLa, HEK293 y CHO.
La figura 44 muestra un gráfico de afinidades de unión para diversas combinaciones de NLpep y NLpoly en tampón PBS o NANOGLO.
La figura 45 muestra un gráfico de afinidades de unión para NLpoly 5P con NLpep9 o NLpep53 expresado en lisado de células HeLa, HEK293 o CHO.
La figura 46 muestra un gráfico de la luminiscencia de cantidades variables de NLpoly en ausencia de NLpep. La figura 47 muestra un gráfico de la luminiscencia de fondo de diversas variantes de NLpoly.
La figura 48 muestra un gráfico de la luminiscencia de fondo de diversas variantes de NLpoly.
La figura 49 muestra un gel de SDS-PAGE de lisado total y fracción soluble de diversas variantes de NLpoly.
La figura 50 muestra (a) un gel de SDS-PAGE del lisado total y la fracción soluble de las variantes de NLpoly y (b) la luminiscencia de fondo de las variantes de NLpoly.
La figura 51 muestra gráficos de la luminiscencia generada con varias variantes de NLpoly cuando se complementan con 10 nM (derecha) o 100 nM (izquierda) de NLpep78.
La figura 52 muestra gráficos que representan la luminiscencia de fondo en lisado de E.coli de diversas variantes de NLpoly.
La figura 53 muestra gráficos que representan la luminiscencia en lisado de E.coli de diversas variantes de NLpoly complementadas con NLpep78.
La figura 54 muestra gráficos que representan la luminiscencia en lisado de E. coli de diversas variantes de NLpoly complementadas con NLpep79.
La figura 55 muestra un gráfico de señal con respecto a fondo de diversas variantes de NLpoly complementadas con NLpep78 o NLpep79 y normalizadas frente a NLpoly 5P.
La figura 56 muestra un gráfico que representa el fondo, la luminiscencia con NLpep79 (derecha) o NLpep78 (izquierda) y la señal con respecto a ruido de diversas variantes de NLpoly.
La figura 57 muestra un gel de SDS-PAGE del lisado total y la fracción soluble en diversas variantes de NLpoly 5P. La figura 58 muestra (A) la cantidad de lisado total y la fracción soluble de NLpoly 5P y NLpoly I107L, (B) la luminiscencia generada por NLpoly 5P o NLpoly I107L sin NLpep o con NLpep78 o NLpep79 y (C) la señal con respecto a fondo mejorada de NLpoly I107L con respecto a NLpoly 5P.
La figura 59 muestra gráficos de la luminiscencia para diversas variantes de NLpoly (A) sin péptido complementario, (B) con NLpep78-HT y (C) con NLpep79-HT.
La figura 60 muestra gráficos de la luminiscencia para diversas variantes de NLpoly (A) sin péptido complementario, (B) con NLpep78-HT y (C) con NLpep79-HT.
La figura 61 muestra gráficos de la luminiscencia para diversas variantes de NLpoly (A) sin péptido complementario, (B) con NLpep78-HT y (C) con NLpep79-HT.
La figura 62 muestra gráficos de la luminiscencia para diversas variantes de NLpoly (A) sin péptido complementario, (B) con NLpep78-HT y (C) con NLpep79-HT.
La figura 63 muestra la afinidad de unión entre una variante de NLpoly alargada (aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal) y un NLPep acortado (aminoácidos delecionados en el extremo N-terminal).
La figura 64 muestra un gráfico de la afinidad de unión de diversas variantes de NLpoly con NLpep78.
La figura 65 muestra la unión y la Vmáx de NLpep80 y NLpep87 a 5P expresado en células de mamífero (CHO, HEK293T y HeLa).
La figura 66 muestra la unión y la Vmáx de NLpep80 y NLpep87 a NLpoly 5P expresado en E. coli.
La figura 67 muestra un gráfico de la luminiscencia de NLpoly acortados con NLpep alargados.
La figura 68 muestra gráficos de Kd y Vmáx de NLpoly 5P en lisado de HeLa con diversos NLpep complementarios. La figura 69 muestra un gráfico de afinidades de unión para diversas variantes de NLpoly con NLpep81.
La figura 70 muestra un gráfico de afinidades de unión para diversas variantes de NLpoly con NLpep82.
La figura 71 muestra un gráfico de afinidades de unión para varios mutantes de NLpoly con NLpep78.
La figura 72 muestra un gráfico de las constantes de Michaelis para varios mutantes de NLpoly con NLpep78. La figura 73 muestra gráficos de la luminiscencia de una complementación terciaria de dos NLpep y NLpoly 5P-B9. La figura 74 muestra un gráfico de la luminiscencia de la titulación de NLpoly 5P con NLpep88-HT.
La figura 75 muestra imágenes de localización intracelular de diversas fusiones NLpep con HaloTag (HT).
La figura 76 muestra imágenes de localización intracelular de NLpoly(wt) y NLpoly(5P).
La figura 77 demuestra la capacidad de detectar, mediante complementación, una proteína de interés conjugada con NLPep después de la separación por SDS-PAGE y la transferencia a una membrana de PVDF.
La figura 78 muestra un gráfico de la señal luminiscente relativa de diversas variantes de NLpoly en comparación con NLpoly 5P (en ausencia de NLpep).
La figura 79 muestra un gráfico de la señal luminiscente relativa con respecto al fondo de diversos NLpoly en comparación con NLpoly 5P (en ausencia de NLpep).
La figura 80 compara las constantes de disociación para NLpep que consisten en o bien 1 o bien 2 unidades de repetición de NLpep78.
La figura 81 muestra la afinidad entre NLpoly 5A2 y NLpep86.
La figura 82 muestra gráficos de la luminiscencia de variantes de NLpoly sin NLpep, con NLpep78 y NLpep79.
Las figuras 83-90 muestran las constantes de disociación así como los valores de Vmáx para NLpoly 5A2, 5P, 8S y 11S con 96 variantes de NLpep.
La figura 91 muestra una imagen de un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly.
La figura 92 muestra una imagen de un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly, así como una tabla que contiene las constantes de disociación para las mismas variantes. La figura 93 muestra la especificidad de sustrato para NLpoly 5P y 11S con NLpep79 y demuestra que NLpoly 11S tiene una especificidad superior para furimazina que 5P.
La figura 94 muestra una imagen de un gel de proteína que sigue a la purificación por afinidad de NLpoly 8S mediante la unión de NLpep78.
La figura 95 contiene una tabla de las constantes de velocidad de asociación y disociación para la unión de NLpoly WT o 11S a NLpepWT, 78 ó 79.
La figura 96 muestra los valores de Km para diversos pares de NLpoly/NLpep.
La figura 97 compara la constante de disociación para NLpoly 11S/NLpep79 a concentraciones de furimazina subsaturadas y saturadas.
La figura 98 compara los valores de Km para NLpoly 5A2 con NLpepWT, 78 y 79.
La figura 99 muestra la luminiscencia de NLpoly de diversas etapas en el proceso de evolución en ausencia de NLpep.
La figura 100 muestra la mejora en la luminiscencia de NLpoly derivado de E. coli durante el transcurso del proceso de evolución con una mejora global de ~105 (de NLpolyWT:NLpepWT a NLpoly11S:NLpep80).
La figura 101 muestra la mejora en la luminiscencia de NLpoly expresado por HeLa durante el transcurso del proceso de evolución con una mejora global de ~105 (de NLpolyWT:NLpepWT a NLpoly11S:NLpep80).
La figura 102 muestra la mejora en la luminiscencia de NLpoly expresado por células HEK293 durante el transcurso del proceso de evolución con una mejora global de ~104 (de NLpolyWT:NLpepWT a NLpoly11S:NLpep80).
La figura 103 muestra las constantes de disociación y demuestra una mejora de ~104 veces en la afinidad de unión de NLpolyWT:NLpepWT a NLpoly11S:NLpep86.
La figura 104 muestra una imagen de un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly de diversas etapas del proceso de evolución.
La figura 105 muestra la luminiscencia de diversos NLpoly en ausencia de NLpep y en presencia de NLpep78 y NLpep79.
La figura 106 muestra la luminiscencia de diversos NLpoly en ausencia de NLpep y en presencia de NLpep78 y NLpep79.
La figura 107 muestra la luminiscencia de diversos NLpoly en ausencia de NLpep y en presencia de NLpep78 y NLpep79.
La figura 108 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87 después de 15 min de tratamiento con rapamicina o vehículo. La inducción en veces se refiere a la señal generada en presencia de rapamicina en comparación con la señal generada con el vehículo.
La figura 109 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87 después de 60 min de tratamiento con rapamicina o vehículo.
La figura 110 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87 después de 120 min de tratamiento con rapamicina o vehículo.
La figura 111 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87 después de 120 min de tratamiento con rapamicina o vehículo. Se sometieron a prueba las 8 combinaciones posibles de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly/NLpep y se usó menos ADN total.
La figura 112 muestra una comparación de la luminiscencia generada por fusiones de FRB o FKBP expresadas en ausencia de pareja de unión.
La figura 113 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87.
La figura 114 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P o FKBP-NLpep80/87 en ausencia de pareja de unión.
La figura 115 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87. Este ejemplo difiere de la figura 113 en que se usaron niveles más bajos de ADN.
La figura 116 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P o FKBP-NLpep80/87 en ausencia de pareja de unión. Esto difiere de la figura 114 en que se usaron niveles más bajos de ADN.
La figura 117 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80 después del tratamiento con rapamicina durante diferentes periodos de tiempo.
La figura 118 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep87 después del tratamiento con rapamicina durante diferentes periodos de tiempo.
La figura 119 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5P con FKBP-NLpep80/87/95/96/97. El ensayo se realizó en formato tanto de dos como de tres días.
La figura 120 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5A2 con FKBP-NLpep80/87/95/96/97. El ensayo se realizó en formato tanto de dos como de tres días.
La figura 121 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5A2 o FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep101/104/105/106/107/108/109/110.
La figura 122 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5A2 o FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep87/96/98/99/100/101/102/103.
La figura 123 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes niveles de ADN de FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep87/101/102/107.
La figura 124 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes niveles de ADN de FRB-NLpoly5A2 y FKBP-NLpep87/101/102/107.
La figura 125 muestra una curva de respuesta a la dosis de rapamicina que muestra la luminiscencia de células que expresan ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87.
La figura 126 muestra una curva de respuesta a la dosis de rapamicina que muestra la luminiscencia de células que expresan ADN de FRB-NLpoly5A2 o FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep87/101.
La figura 127 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan FRB-11S y FKBP-101 y tratadas con sustrato PBI-4377 o furimazina.
La figura 128 muestra el curso temporal de rapamicina de células que expresan FRB-NLpoly11S/5A2 y FKBP-NLpep87/101 realizado en presencia o ausencia de rapamicina, en el que la rapamicina se añadió manualmente.
La figura 129 muestra el curso temporal de rapamicina de células que expresan FRB-NLpoly11S/5A2 y FKBPNLpep87/101 realizado en presencia o ausencia de rapamicina, en el que la rapamicina se añadió a través de un inyector de instrumentos.
La figura 130 muestra la luminiscencia generada por FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 medida en dos instrumentos de lectura de luminiscencia diferentes.
La figura 131 proporciona imágenes que muestran la luminiscencia de las células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 en diversos momentos después del tratamiento con rapamicina.
La figura 132 proporciona un gráfico que muestra la cuantificación por Image J de la señal generada por células individuales que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 en diversos momentos después del tratamiento con rapamicina.
La figura 133 muestra una comparación de la luminiscencia en diferentes líneas celulares que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101.
La figura 134 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 después del tratamiento con el inhibidor competitivo de rapamicina FK506.
La figura 135 muestra (lado izquierdo) la luminiscencia generada por células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 después del tratamiento con el inhibidor competitivo de rapamicina FK506 y (lado derecho) el porcentaje de luminiscencia restante después del tratamiento con FK506.
La figura 136 muestra la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes combinaciones de V2R-NLpoly5A2 o V2R-NLpoly11S con NLpep87/101-ARRB2 en presencia o ausencia del agonista de V2R AVP.
La figura 137 muestra un transcurso de tiempo de tratamiento con AVP que muestra la luminiscencia generada por células transfectadas con V2R-NLpoly11S y NLpep87/101-ARRB2 después del tratamiento con AVP en el que AVP se añadió manualmente.
La figura 138 muestra un transcurso de tiempo de tratamiento con AVP que muestra la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes combinaciones de V2R-NLpoly5A2 o V2R-NLpoly11S con NLpep87/101-ARRB2 después del tratamiento con AVP en el que se añadió AVP mediante un inyector de instrumentos.
La figura 139 muestra un transcurso de tiempo de tratamiento con AVP a 37°C que muestra la luminiscencia generada por células que expresan diferentes configuraciones de V2R y ARRB2 fusionadas con NLpoly11S y NLpep101 después del tratamiento con AVP.
La figura 140 muestra una comparación de la luminiscencia en diferentes líneas celulares que expresan V2R-NLpep11S y NLpep101-ARRB2.
La figura 141 muestra imágenes de 60X que muestran la luminiscencia de células que expresan V2R-NLpoly11S y NLpep101-ARRB2 en diversos momentos después del tratamiento con AVP.
La figura 142 muestra imágenes de 150X que muestran la luminiscencia de células que expresan V2R-NLpoly11S y NLpep101-ARRB2 en diversos momentos después del tratamiento con AVP.
La figura 143 muestra un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly.
La figura 144 muestra las constantes de disociación para NLpoly 5P y combinaciones de mutaciones en las posiciones 31, 46, 75, 76 y 93 en NLpoly 5P.
La figura 145 muestra un ejemplo de transferasa de detección de actividad enzimática de modificación postraduccional usando un NLpep y aminopeptidasa.
La figura 146 muestra un ejemplo de hidrolasa de detección de actividad enzimática de modificación postraduccional usando un NLpep y un anticuerpo específico de metilo.
La figura 147 contiene exploraciones de longitud de onda para NLpoly WT complementado con o bien NLpepWT o bien NLpepWT conjugado con TMR.
La figura 148 contiene exploraciones de longitud de onda para NanoLuc fusionado con HaloTag (NL-HT) y NLpoly 5A2 complementado con NLPepWT con 4 aminoácidos adicionales (DEVD) y conjugado con TOM no cloro (NCT). La figura 149 muestra un esquema de una interacción terciaria en la que la transferencia de energía con un NLpoly y NLpep también puede usarse para medir la interacción de tres moléculas. En el esquema, un GPCR marcado con un NLpoly y una proteína que interactúa con GPCR marcada con un NLpep forman un complejo bioluminiscente cuando interactúan. Esto permite medir la interacción binaria. Si un ligando de GPCR de molécula pequeña que porta un resto fluorescente apropiado para la transferencia de energía interactúa con este sistema, se producirá la transferencia de energía. Por tanto, la interacción binaria proteína-proteína y la interacción ternaria fármacoproteína-proteína pueden medirse en el mismo experimento.
La figura 150 muestra un gráfico y una tabla de afinidades de unión de NLpoly11S a NLPep78 y NLPep78 sintéticos en el extremo N-terminal o C-terminal de una pareja de fusión (HaloTag).
La figura 151 muestra un gráfico y una tabla de afinidades de unión de NLpoly11S a NLPep79 y NLPep79 sintéticos en el extremo N-terminal o C-terminal de una pareja de fusión (HaloTag).
La figura 152 muestra un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia normalizada de NLpoly11S con NLPep86 o PBI-4877.
La figura 153 muestra un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia normalizada de NLpoly11S con NLPep86 o PBI-5434.
La figura 154 muestra un gráfico que representa la intensidad de fluorescencia normalizada de NLpoly11S con NLPep86 o PBI-5436.
La figura 155 muestra un gráfico que demuestra la afinidad de unión de furimazina en el tampón de afinidad de complejos entre NLpoly11S y NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 y 114.
La figura 156 muestra un gráfico que demuestra la afinidad de unión de furimazina en el tampón de ensayo NanoGlo de complejos entre NLpoly11S y NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 y 114.
La figura 157 muestra gráficos que representan el cambio de afinidad (NLpoly156/NLPep1 y NLpoly11S/NLPep1) con concentraciones crecientes de sustrato furimazina.
La figura 158 muestra gráficos que representan el cambio de afinidad (NLpoly156/NLPep1 y NLpoly11S/NLPep1) con concentraciones crecientes de NLPep1.
La figura 159 muestra un gráfico que representa Vmáx y Bmáx de NLPoly156, NLPoly11S y luciferasa NanoLuc® (Nluc) con NLPep1.
La figura 160 muestra un gráfico que representa RLU en función de la concentración de NLPep para NLPoly11S y NLPep86, 78, 79, 99, 101, 104, 114, 128 y wt.
La figura 161 muestra una inmunotransferencia de tipo Western que representa el nivel de expresión en células HEK293T de NLPoly156 y NLPoly11S en comparación con luciferasa NanoLuc® de longitud completa.
La figura 162 muestra gráficos que representan una comparación de la afinidad de la p-lactamasa SME y su inhibidor BLIPY50A como proteínas no fusionadas o cuando se fusionan con NLPoly11S y NLPep114.
La figura 163 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep101/111-136.
La figura 164 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep114 y 137-143.
La figura 165 muestra las curvas de respuesta a la dosis de rapamicina de células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep78/79/99/101/104/114/128.
La figura 166 muestra la respuesta de las células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-78/79/99/101/104/114/128 al inhibidor competitivo de rapamicina FK506.
La figura 167 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes razones de FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep114.
La figura 168 muestra una comparación de la luminiscencia generada por células que expresan fusiones NLpoly11S/NLpep114 de FRB/FKBP en diferentes orientaciones y con diferentes longitudes de ligador.
La figura 169 muestra gráficos que representan la inducción de rapamicina (A) específica de la dosis y (B) específica del tiempo de FRB-NLpoly11S/FKBP-NLpep114 o señales de complementación de luciérnaga dividida.
La figura 170 muestra gráficos que representan la inhibición (A) específica de la dosis y (B) específica del tiempo de FK506 de FRB-NLpoly11S/FKBP-NLpep114 o señales de complementación de luciérnaga dividida.
La figura 171 muestra inmunotransferencias de tipo Western que representan niveles de expresión similares de FKBP-NLpepl 14 y FKBP-Fluc(394-544) a niveles iguales de ADN transfectado.
La figura 172 muestra gráficos que representan la inhibición (A) específica de la dosis y (B) específica del tiempo de la interacción de NLpoly11S-BRD4 e histona H3.3-NLpep114 por IBET-151.
La figura 173 muestra un gráfico que representa aumentos dependientes de la dosis en la dimerización de RAS/CRAF, BRAF/BRAF y CRAF/BRAF en respuesta al inhibidor de BRAF GDC0879.
La figura 174 muestra un gráfico que representa RLU en función de la concentración de NLPep para NLpoly11S y NLpep86, wt y NLpep114.
La figura 175 muestra un esquema de un ensayo que utiliza un péptido de alta afinidad de un par luminiscente como etiqueta de proteína intracelular y el polipéptido del par luminiscente como reactivo de detección.
La figura 176 muestra un gráfico que demuestra el intervalo lineal de la afinidad de NLpoly11S y MLpep86.
La figura 177 muestra imágenes que demuestran la sensibilidad de detección de proteínas etiquetadas con un NLPep de alta afinidad usando 11s . Esta figura también compara la detección usando NLPep/NLPoly con la detección usando HaloTag marcado con fluorescencia.
La figura 178 muestra un gráfico que demuestra la estabilidad de NLpoly11S.
La figura 179 muestra un gráfico que demuestra el intervalo lineal de la afinidad de NLpoly11S y NLpep78.
La figura 180 muestra un resumen de las secuencias de NLpep. Los péptidos de alta afinidad (espontáneos) son aquellos péptidos (NLpep) que se unen a NLpoly11S con alta afinidad. Los péptidos extintores/oscuros son aquellos péptidos (NLpep) que pueden reducir los niveles de luz producidos o detectados por NLpoly11S.
La figura 181 muestra un esquema del concepto de complementación estructural, en el que LSP y SSP (es decir, NLpoly y NLpep) se unen para producir una señal bioluminiscente (paneles A, B). Tras la interrupción de una interacción de proteínas (es decir, X e Y), LSP y SSP se separan, lo que da como resultado una disminución de la luminiscencia (panel C).
La figura 182 A muestra dos opciones (A, B) para modificar por ingeniería la complementación estructural para que sea una pérdida de señal tras la interacción de proteínas entre X e Y una ganancia de señal tras la interrupción de la interacción entre X e Y. La opción A representa la complementación estructural intermolecular. La opción B representa la complementación estructural intramolecular. La figura 182B muestra una lista de constructos genéticos que pueden ser adecuados para la complementación estructural intramolecular.
La figura 183 muestra (A) la inhibición de la unión de NLpoly11S y NLpep114 por diversos péptidos oscuros, y (B) la inhibición dependiente de la dosis por los péptidos Lys-162 y Gln-162.
La figura 184A muestra que la inhibición por Q-162 y A-162 depende de la dosis. El panel B muestra que el Q-162 produce una señal por sí mismo de manera dependiente de la dosis, mientras que la dependencia de la dosis del A-162 es, en el mejor de los casos, sutil.
La figura 185 muestra gráficos que demuestran la respuesta a la dosis de los péptidos oscuros con CP Nluc.
La figura 186 muestra gráficos que representan el transcurso del tiempo del péptido oscuro con CP Nluc.
La figura 187 muestra la inhibición dependiente de la dosis del péptido oscuro de la luminiscencia generada a partir de FRB-NLpoly11S solo y también entre FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep114 en presencia y ausencia de rapamicina. La figura 188 muestra la inhibición dependiente de la dosis del péptido oscuro de la luminiscencia generada a partir de o bien FRB-NanoLuc (311) o bien NanoLuc-FRB (307) en presencia y ausencia de rapamicina (RLU).
La figura 189 muestra la inhibición dependiente de la dosis del péptido oscuro de la luminiscencia generada a partir de o bien FRB-NanoLuc (311) o bien NanoLuc-FRB (307) en presencia y ausencia de rapamicina (normalizado frente a un péptido de control no oscuro; 100%).
La figura 190 muestra que los péptidos oscuros, cuando se fusionan con FKBP, pueden competir con péptidos de afinidad baja (114) y alta (80) (también fusiones de FKBP) y, como resultado, reducen la luminiscencia total que se produce y detecta en células vivas.
La figura 191 muestra la comparación de señales entre los ensayos basados en Fluc y NLpep86 para los niveles intracelulares de Fluc.
La figura 192 muestra gráficos que demuestran la utilidad de NLpep ligados en tándem para complementar Npoly11S.
La figura 193 muestra un gráfico que demuestra que los componentes de NLpoly y NLpep no interfieren con la degradación intracelular de la proteína indicadora FlucP.
La figura 194 muestra un esquema que demuestra un ensayo de actividad de proteasa extracelular.
La figura 195 muestra un esquema de un ensayo para medir la actividad de una enzima usando un ProNLpep.
La figura 196 muestra un esquema de un ensayo para cribar anticuerpos, proteínas, péptidos o transportadores que median la internalización celular.
La figura 197 muestra un esquema de un ensayo de modificación postraduccional con transferasa.
La figura 198 muestra un esquema de un ensayo de hidrolasa de modificación postraduccional.
La figura 199 muestra gráficos que correlacionan la actividad de SRC de tirosina cinasa con la luminiscencia con respecto al fondo en un ensayo de modificación postraduccional.
La figura 200 muestra un gráfico que representa la complementación espontánea de tres versiones diferentes de NLpoly11S con doce péptidos sintéticos.
La figura 201 muestra un esquema de un formato de inmunoensayo homogéneo que utiliza fusiones de NLpep y NLpoly con restos de unión separados A y B.
La figura 202 muestra gráficos que demuestran: (A) reducción en la luminiscencia de fondo de NLpoly11S tras la formación de complejos con GWALFKK y dabcilo-GWALFKK, y (B) NLpep86 forma un complejo con NLpoly11S en presencia de GWALFKK y dabcilo-GWALFKK.
La figura 203 muestra gráficos que demuestran que: (A) VTGWALFEEIL (Trp 11 meros) y VTGYALFEEIL (Tyr 11 meros) inducen luminiscencia con respecto al fondo (NLpoly11S sólo; sin control de péptido), y que las versiones de dabcilo N-terminales de cada uno proporcionan una extinción significativa de esta señal, y (B) NLpep86 forma un complejo con NLpoly11S en presencia de versiones de dabcilo de Trp 11 meros y Tyr 11 meros.
Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente” significa que no es necesario lograr exactamente la característica, el parámetro y/o el valor enumerados, sino que las desviaciones o variaciones, incluyendo, por ejemplo, tolerancias, errores de medición, limitaciones de precisión de la medición y otros factores conocidos por un experto en la técnica, pueden producirse en cantidades que no excluyen el efecto que se pretendía que proporcionara por la característica. Una característica o rasgo que está sustancialmente ausente (por ejemplo, sustancialmente no luminiscente) puede ser uno que esté dentro del ruido, debajo del fondo, por debajo de las capacidades de detección del ensayo que está usándose, o una pequeña fracción (por ejemplo, <1%, <0,1%, <0,01%, <0,001%, <0,00001%, <0,000001%, <0,0000001%) de la característica significativa (por ejemplo, intensidad luminiscente de una proteína bioluminiscente o complejo bioluminiscente).
Tal como se usa en el presente documento, el término “bioluminiscencia” se refiere a la producción y emisión de luz por una reacción química catalizada o activada por una enzima, proteína, complejo proteico u otra biomolécula (por ejemplo, complejo bioluminiscente). Normalmente, un sustrato para una entidad bioluminiscente (por ejemplo, proteína bioluminiscente o complejo bioluminiscente) se convierte en una forma inestable por la entidad bioluminiscente; el sustrato emite luz posteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “complementario” se refiere a la característica de dos o más elementos estructurales (por ejemplo, péptido, polipéptido, ácido nucleico, molécula pequeña, etc.) de poder hibridarse, dimerizarse o, de otro modo, formar un complejo entre sí. Por ejemplo, un “péptido y un polipéptido complementarios” son capaces de unirse para formar un complejo. Los elementos complementarios pueden requerir asistencia para formar un complejo (por ejemplo, a partir de elementos de interacción), por ejemplo, para colocar los elementos en la conformación adecuada para la complementariedad, para colocalizar elementos complementarios, para reducir la energía de interacción para complementario, etc.
Tal como se usa en el presente documento, el término “complejo” se refiere a un ensamblaje o agregado de moléculas (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, etc.) en contacto directo y/o indirecto entre sí. En un aspecto, “contacto”, o más particularmente, “contacto directo” significa que dos o más moléculas están lo suficientemente cerca como para que las interacciones atractivas no covalentes, tales como fuerzas de Van der Waal, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas e hidrófobas, y similares, dominen la interacción de las moléculas. En tal aspecto, se forma un complejo de moléculas (por ejemplo, un péptido y un polipéptido) en condiciones de ensayo tales que el complejo se favorece termodinámicamente (por ejemplo, en comparación con un estado no agregado o no complejado de sus moléculas de componente). Tal como se usa en el presente documento, el término “complejo”, a menos que se describa de otro modo, se refiere al ensamblaje de dos o más moléculas (por ejemplo, péptidos, polipéptidos o una combinación de los mismos).
Tal como se usa en el presente documento, el término “no luminiscente” se refiere a una entidad (por ejemplo, péptido, polipéptido, complejo, proteína, etc.) que presenta la característica de no emitir una cantidad detectable de luz en el espectro visible (por ejemplo, en presencia de un sustrato). Por ejemplo, puede hacerse referencia a una entidad como no luminiscente si no muestra una luminiscencia detectable en un ensayo dado. Tal como se usa en el presente documento, el término “no luminiscente” es sinónimo del término “sustancialmente no luminiscente”. Por ejemplo, un polipéptido no luminiscente (NLpoly) es sustancialmente no luminiscente, que presenta, por ejemplo, una reducción de la luminiscencia de 10 veces o más (por ejemplo, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1*103 veces, 1*104 veces, 1*105 veces, 1*106 veces, 1*107 veces, etc.) en comparación con un complejo del NLpoly con su péptido complementario no luminiscente. Por ejemplo, una entidad es “no luminiscente” si cualquier emisión de luz es lo suficientemente mínima como para no crear un fondo de interferencia para un ensayo en particular.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “péptido no luminiscente” (por ejemplo, NLpep) y “polipéptido no luminiscente” (por ejemplo, NLpoly) se refieren a péptidos y polipéptidos que sustancialmente no muestran luminiscencia (por ejemplo, en presencia de un sustrato), o una cantidad que está por debajo del ruido, o 10 veces o más (por ejemplo, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1*103 veces, 1*104 veces, 1*105 veces, 1*106 veces, 1*107 veces, etc.) cuando se compara con una señal significativa (por ejemplo, complejo luminiscente) en condiciones convencionales (por ejemplo, condiciones fisiológicas, condiciones de ensayo, etc.) y con instrumentación típica (por ejemplo, luminómetro, etc.). Tales péptidos y polipéptidos no luminiscentes pueden ensamblarse, según los criterios descritos en el presente documento, para formar un complejo bioluminiscente. Tal como se usa en el presente documento, un “elemento no luminiscente” es un péptido no luminiscente o un polipéptido no luminiscente. El término “complejo bioluminiscente” se refiere al complejo ensamblado de dos o más péptidos no luminiscentes y/o polipéptidos no luminiscentes. El complejo bioluminiscente cataliza o permite la conversión de un sustrato para el complejo bioluminiscente en una forma inestable; el sustrato emite luz posteriormente. Cuando no forman complejos, dos elementos no luminiscentes que forman un complejo bioluminiscente pueden denominarse “par no luminiscente”. Si un complejo bioluminiscente está formado por tres o más péptidos no luminiscentes y/o polipéptidos no luminiscentes, los constituyentes no complejados del complejo bioluminiscente pueden denominarse “grupo no luminiscente”.
Tal como se usa en el presente documento, el término “elemento de interacción” se refiere a un resto que ayuda a unir un par de elementos no luminiscentes o un grupo no luminiscente para formar un complejo bioluminiscente. Normalmente, un par de elementos de interacción (también conocido como “par de interacción”) se une a un par de elementos no luminiscentes (por ejemplo, un par de péptido/polipéptido no luminiscente), y la atractiva interacción entre los dos elementos de interacción facilita la formación del complejo bioluminiscente; aunque no se limita a tal mecanismo, y no se requiere una comprensión del mecanismo. Los elementos de interacción pueden facilitar la formación del complejo bioluminiscente mediante cualquier mecanismo adecuado (por ejemplo, acercar un par/grupo no luminiscente, colocar un par/grupo no luminiscente en la conformación adecuada para una interacción estable, reducir la energía de activación para la formación de complejos, combinaciones de los mismos, etc.). Un elemento de interacción puede ser una proteína, polipéptido, péptido, molécula pequeña, cofactor, ácido nucleico, lípido, hidrato de carbono, anticuerpo, etc. Un par de interacción puede estar formado por dos elementos de interacción iguales (es decir, homopar) o dos elementos de interacción diferentes (es decir, heteropar). En el caso de un heteropar, los elementos de interacción pueden ser el mismo tipo de resto (por ejemplo, polipéptidos) o pueden ser dos tipos diferentes de restos (por ejemplo, polipéptido y molécula pequeña). Cuando se estudia la formación del complejo por el par de interacción, un par de interacción puede denominarse “par diana” o “par de interés”, y los elementos de interacción individuales se denominan “elementos diana” (por ejemplo, “péptido diana”, “polipéptido diana”, etc.) o “elementos de interés” (por ejemplo, “péptido de interés”, “polipéptido de interés”, etc.).
Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína preexistente” se refiere a una secuencia de aminoácidos que existía físicamente antes de un determinado acontecimiento o fecha. Un “péptido que no es un fragmento de una proteína preexistente” es una cadena corta de aminoácidos que no es un fragmento o una subsecuencia de una proteína (por ejemplo, sintética o que se produce de manera natural) que existía físicamente antes del diseño y/o la síntesis del péptido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento” se refiere a un péptido o polipéptido que resulta de la disección o “fragmentación” de una entidad completa más grande (por ejemplo, proteína, polipéptido, enzima, etc.), o un péptido o polipéptido preparado para tener la misma secuencia como tal. Por tanto, un fragmento es una subsecuencia de la entidad completa (por ejemplo, proteína, polipéptido, enzima, etc.) a partir de la cual se elabora y/o diseña. Un péptido o polipéptido que no es una subsecuencia de una proteína completa preexistente no es un fragmento (por ejemplo, no es un fragmento de una proteína preexistente). Un péptido o polipéptido que “no es un fragmento de una proteína bioluminiscente preexistente” es una cadena de aminoácidos que no es una subsecuencia de una proteína (por ejemplo, natural o sintética) que: (1) existía físicamente antes del diseño y/o la síntesis del péptido o polipéptido, y (2) muestra una actividad bioluminiscente sustancial.
Tal como se usa en el presente documento, el término “subsecuencia” se refiere a un péptido o polipéptido que tiene un 100% de identidad de secuencia con otro péptido o polipéptido más grande. La subsecuencia es una coincidencia de secuencia perfecta para una porción de la cadena más larga de aminoácidos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “identidad de secuencia” se refiere al grado en que dos secuencias poliméricas (por ejemplo, péptido, polipéptido, ácido nucleico, etc.) que tienen la misma composición secuencial de subunidades monoméricas. El término “similitud de secuencia” se refiere al grado en que dos secuencias poliméricas (por ejemplo, péptido, polipéptido, ácido nucleico, etc.) tienen secuencias poliméricas similares. Por ejemplo, los aminoácidos similares son aquellos que comparten las mismas características biofísicas y pueden agruparse en familias, por ejemplo, ácidas (por ejemplo, aspartato, glutamato), básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). El “porcentaje de identidad de secuencia” (o “porcentaje de similitud de secuencia”) se calcula: (1) comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación (por ejemplo, la longitud de la secuencia más larga, la longitud de la secuencia más corta, una ventana especificada), (2) determinando el número de posiciones que contienen monómeros idénticos (o similares) (por ejemplo, los mismos aminoácidos aparecen en ambas secuencias, los aminoácidos similares aparecen en ambas secuencias) para obtener el número de posiciones coincidentes, (3) dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (por ejemplo, la longitud de la secuencia más larga, la longitud de la secuencia más corta, una ventana específica) y (4) multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia o porcentaje de similitud de secuencia. Por ejemplo, si los péptidos A y B tienen ambos 20 aminoácidos de longitud y tienen aminoácidos idénticos en todas las posiciones excepto en 1, entonces el péptido A y el péptido B tienen una identidad de secuencia del 95%. Si los aminoácidos en la posición no idéntica compartieran las mismas características biofísicas (por ejemplo, ambos fueran ácidos), entonces el péptido A y el péptido B tendrían el 100% de similitud de secuencia. Como otro ejemplo, si el péptido C tiene una longitud de 20 aminoácidos y el péptido D tiene una longitud de 15 aminoácidos, y 14 de los 15 aminoácidos en el péptido D son idénticos a los de una porción del péptido C, entonces los péptidos C y D tienen el 70% de identidad de secuencia, pero el péptido D tiene un 93,3% de identidad de secuencia con una ventana de comparación óptima del péptido C. Para el propósito de calcular la “porcentaje de identidad de secuencia” (o “porcentaje de similitud de secuencia”) en el presente documento, cualquier hueco en las secuencias alineadas se trata como apareamientos erróneos en esa posición.
Tal como se usa en el presente documento, el término “condiciones fisiológicas” abarca cualquier condición compatible con las células vivas, por ejemplo, condiciones predominantemente acuosas de temperatura, pH, salinidad, composición química, etc. que son compatibles con las células vivas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se usa en su sentido más amplio. En un sentido, se pretende que incluya un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales (incluyendo humanos) y abarcan líquidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, tales como plasma, suero y similares. La muestra también puede referirse a lisados celulares o formas purificadas de los péptidos y/o polipéptidos descritos en el presente documento. Los lisados celulares pueden incluir células que se han lisado con un agente de lisis o lisados tales como lisados de germen de trigo o reticulocitos de conejo. La muestra también puede incluir sistemas de expresión sin células. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia superficial, suelo, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, tales ejemplos no deben interpretarse como limitativos de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.
La propia invención se define en las reivindicaciones.
Tal como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, los términos “péptido” y “polipéptido” se refieren a compuestos poliméricos de dos o más aminoácidos unidos a través de la cadena principal mediante enlaces peptídicos de amida (--C(O)NH--). El término “péptido” generalmente se refiere a polímeros de aminoácidos cortos (por ejemplo, cadenas que tienen menos de 25 aminoácidos), mientras que el término “polipéptido” generalmente se refiere a polímeros de aminoácidos más largos (por ejemplo, cadenas que tienen más de 25 aminoácidos).
Descripción detallada
El estudio de las interacciones de proteínas, particularmente en condiciones fisiológicas y/o a niveles de expresión fisiológica, requiere una alta sensibilidad. Tal como se describe en el presente documento, las interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, otras proteínas, etc. pueden detectarse basándose en la asociación de dos elementos no luminiscentes, tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones, que se unen para formar un complejo bioluminiscente capaz de producir una señal detectable (por ejemplo, luminiscencia). La formación del complejo bioluminiscente depende de la interacción de proteínas que esté monitorizándose. La actividad bioluminiscente se confiere a un polipéptido no luminiscente a través de la complementación estructural con un péptido no luminiscente, tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones.
Por ejemplo, pueden realizarse ensayos para detectar la interacción de dos moléculas de interés anclando cada una a un miembro separado de un par no luminiscente. Si las moléculas de interés interactúan (por ejemplo, interactúan de manera transitoria, interactúan de manera estable, etc.), el par no luminiscente se acerca para dar una conformación adecuada y se forma un complejo bioluminiscente (y se produce/detecta una señal bioluminiscente (en presencia de un sustrato)). En ausencia de una interacción entre las moléculas de interés (por ejemplo, sin formación de complejos, ni siquiera interacción transitoria, etc.), el par no luminiscente no interactúa de manera suficiente, y no se produce una señal bioluminiscente o sólo se produce débilmente. Esto puede usarse para estudiar el efecto de los inhibidores en la formación de complejos, el efecto de las mutaciones en la formación de complejos, el efecto de las condiciones (por ejemplo, temperatura, pH, etc.) en la formación de complejos, la interacción de una molécula pequeña (por ejemplo, potencial terapéutico) con una molécula diana, etc.
Diferentes pares no luminiscentes pueden requerir diferente fuerza, duración y/o estabilidad del complejo de interacción para dar como resultado la formación del complejo bioluminiscente.
Normalmente, un elemento de interacción es un resto (por ejemplo, péptido, polipéptido, proteína, molécula pequeña, ácido nucleico, lípido, hidrato de carbono, etc.) que se une a un péptido y/o polipéptido para ensamblarse en el complejo bioluminiscente. El elemento de interacción facilita la formación de un complejo bioluminiscente mediante cualquier mecanismo adecuado, que incluye: interactuar con uno o ambos elementos no luminiscentes, inducir un cambio conformacional en un elemento no luminiscente, interactuar con otro elemento de interacción (por ejemplo, un elemento de interacción unido al otro elemento no luminiscente), acercar los elementos no luminiscentes, orientar los elementos no luminiscentes para una interacción adecuada, etc.
Normalmente, un elemento de interacción se une a cada miembro de un par no luminiscente. Las interacciones favorables entre los elementos de interacción facilitan las interacciones entre los elementos no luminiscentes. El par de interacción puede interactuar de manera estable, interactuar de manera transitoria, formar un complejo, etc. La interacción del par de interacción facilita la interacción de los elementos no luminiscentes (y la formación de un complejo bioluminiscente) mediante cualquier mecanismo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a: acercar los miembros del par no luminiscente, orientar adecuadamente los miembros del par no luminiscente para que no interactúen, reducir las fuerzas no covalentes que actúan contra la interacción del par no luminiscente, etc.
Un par de interacción puede comprender dos restos químicos cualesquiera que facilitan la interacción de un par no luminiscente asociado. Un par de interacción puede consistir, por ejemplo, en: dos ácidos nucleicos complementarios, dos polipéptidos capaces de dimerización (por ejemplo, homodímero, heterodímero, etc.), una proteína y un ligando, una proteína y una molécula pequeña, un anticuerpo y un epítopo, un par reactivo de moléculas pequeñas, etc. Cualquier par adecuado de moléculas que interactúan puede encontrar uso como un par de interacción.
Un par de interacción puede comprender dos moléculas de interés (por ejemplo, proteínas de interés) o moléculas diana. Los métodos proporcionados en el presente documento, tal como se define en las reivindicaciones, proporcionan ensayos útiles (por ejemplo, in vitro, in vivo, in situ, animal completo, etc.) para estudiar las interacciones entre un par de moléculas diana.
Un par de elementos de interacción, cada uno unido a uno de los elementos no luminiscentes, puede interactuar entre sí y facilitar así la formación del complejo bioluminiscente, tal como se define en las reivindicaciones. La presencia de un sustrato puede ser necesaria para inducir la interacción entre los elementos de interacción y facilitar la formación de complejos bioluminiscentes. La detección de una señal del complejo bioluminiscente indica la presencia del sustrato o las condiciones que permiten la interacción con los elementos de interacción.
Se fusionan un elemento de interacción y un elemento no luminiscente. Normalmente, un primer elemento no luminiscente y un primer elemento de interacción se unen entre sí, y un segundo elemento no luminiscente y un segundo elemento de interacción se unen entre sí. La unión de elementos de señal e de interacción puede lograrse mediante cualquier mecanismo adecuado, química, ligador, etc. Los elementos de interacción y no luminiscentes se unen a través de una conexión covalente. Por ejemplo, los elementos de señal e de interacción pueden conectarse directamente o mediante un ligador.
El elemento de interacción es un péptido o polipéptido, y los elementos de señal e de interacción están contenidos dentro de una única cadena de aminoácidos. Una única cadena de aminoácidos comprende, consiste en o consiste esencialmente en un elemento no luminiscente y un elemento de interacción o una sola cadena de aminoácidos comprende, consiste en o consiste esencialmente en un elemento no luminiscente, un elemento de interacción y, opcionalmente, uno o más de una secuencia N-terminal, una secuencia C-terminal, elementos reguladores (por ejemplo, promotor, sitio de inicio de la traducción, etc.) y una secuencia ligadora. Los elementos de señal e de interacción están contenidos dentro de un polipéptido de fusión. Los elementos de señal e de interacción (y cualquier otro segmento de aminoácidos que se incluya en la fusión) pueden expresarse por separado; o se expresa una proteína de fusión que comprende o consiste en secuencias tanto de interacción como de señal.
Una primera proteína de fusión que comprende un primer elemento no luminiscente y un primer elemento de interacción así como una segunda proteína de fusión que comprende un segundo elemento no luminiscente y un segundo elemento de interacción pueden expresarse dentro de las mismas células. Las proteínas de fusión primera y segunda se purifican y/o aíslan de las células, o se analiza la interacción de las proteínas de fusión dentro de las células. Alternativamente, las proteínas de fusión primera y segunda se expresan en células separadas y se combinan (por ejemplo, después de la purificación y/o aislamiento, o después de la fusión de las células o porciones de las células, o mediante la transferencia de una proteína de fusión de una célula a otra, o por secreción de una o más proteínas de fusión en el medio extracelular) para la detección de señales. Una o más proteínas de fusión pueden expresarse en lisado celular (por ejemplo, lisado de reticulocitos de conejo) o en un sistema sin células o una o más proteínas de fusión pueden expresarse a partir del genoma de un virus u otro patógeno celular.
Un elemento no luminiscente y un elemento de interacción pueden conectarse mediante un ligador. Por ejemplo, un ligador conecta los elementos de señal y de interacción mientras proporciona una cantidad deseada de espacio/distancia entre los elementos. Un ligador puede permitir que los elementos tanto de señal como de interacción formen sus respectivos pares (por ejemplo, par no luminiscente y par de interacción) simultáneamente. Un ligador puede ayudar al elemento de interacción a facilitar la formación de una interacción de pares no luminiscentes. Por ejemplo, cuando se forma un par de interacción, los ligadores que conectan cada elemento no luminiscente con sus respectivos elementos de interacción colocan los elementos no luminiscentes a la distancia y conformación adecuadas para formar un complejo bioluminiscente. Un ligador puede mantener un elemento de interacción y un elemento no luminiscente muy cerca (por ejemplo, <4 unidades de monómero). Un ligador puede proporcionar una cantidad deseada de distancia (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6... 10... 20, o más unidades de monómero) entre los elementos de señal y de interacción (por ejemplo, para evitar interacciones no deseadas entre los elementos de señal e de interacción, por consideraciones estéricas, para permitir la orientación adecuada del elemento no luminiscente tras la formación del complejo de interacción, para permitir la propagación de una formación compleja desde el complejo de interacción hasta los elementos no luminiscentes, etc.). Un ligador puede proporcionar una química de unión adecuada entre los elementos de señal y de interacción. Un ligador también puede mejorar el proceso sintético de elaborar el elemento de señal y de interacción (por ejemplo, permitiendo que se sinteticen como una sola unidad, permitiendo la conexión posterior a la síntesis de los dos elementos, etc.).
Un ligador es cualquier resto químico adecuado capaz de ligar, conectar o anclar un elemento no luminiscente a un elemento de interacción tal como se define en el complejo y sistema reivindicados. Un ligador es un polímero de una o más unidades monoméricas de repetición o de no repetición (por ejemplo, aminoácido). Cuando un elemento no luminiscente y un elemento de interacción forman parte de una proteína de fusión tal como se define en el complejo y sistema reivindicados, un ligador (cuando está presente) es normalmente una cadena de aminoácidos. Cualquier resto adecuado capaz de unir los elementos de señal y de interacción puede encontrar uso como ligador.
Puede usarse una amplia variedad de ligadores. Por ejemplo, el ligador es un enlace covalente simple. Los polipéptidos de fusión comprendidos en el sistema y el complejo reivindicados no están limitados por los tipos de ligadores disponibles. Los elementos de señal e de interacción están ligados, o bien directamente (por ejemplo, el ligador consiste en un enlace covalente simple) o bien a través de un ligador adecuado. Los polipéptidos de fusión comprendidos en el sistema y el complejo reivindicados no se limitan a ningún grupo ligador particular. Se contempla una variedad de grupos ligadores, y los ligadores adecuados pueden comprender, pero no se limitan a, grupos alquilo, cadenas de carbono de metileno, éter, poliéter, ligador de amida de alquilo, un ligador peptídico, un ligador peptídico modificado, un ligador de poli(etilenglicol) (PEG), un ligador de estreptavidina-biotina o avidinbiotina, poliaminoácidos (por ejemplo, polilisina), PEG funcionalizado, polisacáridos, glicosaminoglicanos, polímeros dendríticos (documento WO93/06868 y por Tomalia et al. en Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-175 (1990)), polímeros quelantes de PEG (documentos W94/08629, WO94/09056 y WO96/26754), ligador de oligonucleótidos, derivados de fosfolípidos, cadenas de alquenilo, cadenas de alquinilo, disulfuro o una combinación de los mismos. El ligador es escindible, por ejemplo, enzimáticamente (por ejemplo, sitio de la proteasa TEV), químicamente, fotoinducido, etc.
En el presente documento se describen péptidos no luminiscentes con menos del 100% de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271, tal como comprenden el sistema y el complejo definidos en las reivindicaciones. En el presente documento se describen péptidos no luminiscentes con menos del 100%, pero más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271, tal como comprenden el sistema y el complejo definidos en las reivindicaciones. En el presente documento se describen polipéptidos no luminiscentes con menos del 100% de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO: 440, tal como comprenden el sistema y el complejo definidos en las reivindicaciones. En el presente documento se describen polipéptidos no luminiscentes con menos del 100%, pero más del 70% (por ejemplo, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO: 440, tal como comprenden el sistema y el complejo definidos en las reivindicaciones. Tabla 1. Secuencias de péptidos
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Los péptidos comprendidos en el sistema y el complejo de la invención se definen en las reivindicaciones.
Los polipéptidos no luminiscentes que encuentran uso en la presente invención incluyen polipéptidos con una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 440, tal como comprenden el sistema y el complejo definidos en las reivindicaciones.
La propia invención se define en las reivindicaciones.
Los polipéptidos comprendidos en el sistema y el complejo de la invención se definen en las reivindicaciones.
Tabla 2. Secuencias de polipéptidos
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Todos los polipéptidos y las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de la tabla 2 (SEQ ID NO: 441-1298) contienen residuos Met N-terminales (aminoácidos) o codones de inicio ATG (ácidos nucleicos).
Un péptido o polipéptido no luminiscente y/o un elemento de interacción puede comprender un péptido sintético, un péptido que contiene uno o más aminoácidos no naturales, un péptido mimético, un péptido sintético conjugado (por ejemplo, conjugado con un grupo funcional (por ejemplo, fluoróforo, sustrato luminiscente, etc.)).
La presente invención proporciona sistemas, complejos y métodos tal como se define en las reivindicaciones, que son útiles en una variedad de campos que incluyen investigación básica, investigación médica, diagnóstico molecular, etc. Aunque los reactivos y ensayos descritos en el presente documento no se limitan a ninguna aplicación en particular, los siguientes son ensayos, kits, campos, configuraciones experimentales a modo de ejemplo, etc. que pueden hacer uso de la invención reivindicada en el presente documento. La propia invención se define en las reivindicaciones.
Las aplicaciones típicas que hacen uso de la presente invención implican la monitorización/detección de dimerización de proteínas (por ejemplo, heterodímeros, homodímeros), interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-ARN, interacciones proteína-ADN, hibridación de ácidos nucleicos, interacciones proteínamolécula pequeña, o cualquier otra combinación de entidades moleculares. Una primera entidad de interés está unida a un primer miembro de un par no luminiscente y la segunda entidad de interés está unida al segundo miembro de un par no luminiscente. Si se produce una señal detectable bajo las condiciones particulares del ensayo, entonces se infiere la interacción de las entidades primera y segunda. Tales ensayos son útiles para monitorizar las interacciones moleculares en cualquier condición adecuada (por ejemplo, in vitro, in vivo, in situ, animal completo, etc.) y encuentran uso, por ejemplo, en el descubrimiento de fármacos, la elucidación de rutas moleculares, el estudio de aspectos del equilibrio o de la cinética de ensamblaje complejo, cribado de alto rendimiento, sensor de proximidad, etc.
Por ejemplo, se usa un par no luminiscente de características conocidas (por ejemplo, características espectrales, afinidad mutua del par) para elucidar la afinidad, o para comprender la interacción, de un par de interacción de interés o se usa un par de interacción bien caracterizado para determinar las características (por ejemplo, características espectrales, afinidad mutua del par) de un par no luminiscente.
Las aplicaciones descritas en el presente documento pueden encontrar uso en el cribado de fármacos y/o desarrollo de fármacos. Por ejemplo, la interacción de un fármaco de molécula pequeña o una biblioteca completa de moléculas pequeñas con una proteína diana de interés (por ejemplo, diana terapéutica) se monitoriza en una o más condiciones relevantes (por ejemplo, condiciones fisiológicas, condiciones de la enfermedad, etc.). Alternativamente, se somete a ensayo la capacidad de un fármaco de molécula pequeña o de una biblioteca completa de moléculas pequeñas para potenciar o inhibir las interacciones entre dos entidades (por ejemplo, receptor y ligando, proteínaproteína, etc.). Las aplicaciones de cribado de fármacos pueden llevarse a cabo en un formato de alto rendimiento para permitir la detección de la unión de decenas de miles de moléculas diferentes a una diana, o para analizar el efecto de esas moléculas en la unión de otras entidades.
La presente invención proporciona métodos para la detección de interacciones moleculares, tal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, en organismos vivos (por ejemplo, bacterias, levaduras, eucariotas, mamíferos, primates, humanos, etc.) y/o células. Las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de señal e de interacción (diana) pueden coexpresarse en la célula o en el organismo completo, y la señal se detecta y correlaciona con la formación del complejo de interacción. Las células pueden transformarse o transfectarse de manera transitoria y/o estable con vector(es) que codifica(n) para elemento(s) no luminiscente(s), elemento(s) de interacción, proteínas de fusión (por ejemplo, que comprenden un elemento de señal y de interacción), etc. Pueden generarse los organismos transgénicos que codifiquen para las proteínas de fusión necesarias para llevar a cabo los ensayos descritos en el presente documento o se inyectan vectores en organismos completos. Por ejemplo, se usa una célula o un animal transgénico (por ejemplo, que expresa una proteína de fusión) para monitorizar la biodistribución de una molécula pequeña o una secuencia biológica unida (por ejemplo, conjugada o fusionada genéticamente) a la secuencia de péptido NL que formaría un complejo en los compartimentos subcelulares. y/o tejidos donde se concentra.
Una porción de péptido (por ejemplo, un péptido no luminiscente) de un complejo luminiscente tal como se define en las reivindicaciones puede emplearse como una etiqueta de proteína (por ejemplo, dentro de las células). Una porción de polipéptido (por ejemplo, polipéptido no luminiscente) de un complejo luminiscente (por ejemplo, capaz de formar un complejo luminiscente con el péptido no luminiscente) se aplica a las células (por ejemplo, como parte de un reactivo) para detectar/cuantificar la presencia de proteínas marcadas con el péptido no luminiscente. Por ejemplo, una proteína de interés se fusiona con un NLpep de alta afinidad (por ejemplo, NLpep86). Luego, el NLpep se transfecta en las células de interés, luego se añade un reactivo que contiene NanoGlo+NLpoly11S a las células+medio y se detecta la luminiscencia. Este esquema de ensayo se muestra en la figura 175. El pequeño tamaño del péptido es útil para el marcado de proteínas. Los polipéptidos no luminiscentes usados en un sistema de este tipo pueden ser lo suficientemente estables para existir en un tampón adecuado durante periodos de tiempo prolongados (por ejemplo, en presencia del sustrato furimazina). El polipéptido no luminiscente puede tener una luminiscencia mínima detectable en ausencia del péptido complementario (por ejemplo, incluso en presencia de sustrato furimazina). Pueden usarse condiciones de tampón optimizadas para cumplir los criterios necesarios para el marcado de proteínas. Los polipéptidos y péptidos espontáneos de alta afinidad son útiles en tales sistemas, tal como se define en las reivindicaciones, y tienen utilidad, por ejemplo, en inmunoensayos, detección de partículas de virus, estudio de la dinámica de proteínas en células vivas, etc. Un sistema de este tipo proporciona detección de alta sensibilidad, estabilidad (por ejemplo, particularmente en condiciones de desnaturalización) y/o un amplio intervalo dinámico.
Los sistemas, complejos y métodos proporcionados en el presente documento, tal como se define en las reivindicaciones, así como cualquier técnica o tecnología basada en ellos, encuentran uso en una variedad de aplicaciones y campos, a continuación se incluye una lista no limitativa de ejemplos de aplicaciones:
• Inmunotransferencia de tipo Western sin anticuerpos: por ejemplo, una proteína de interés se fusiona con un péptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se expresa mediante cualquier medio adecuado. Se separan las proteínas (por ejemplo, mediante PAGE) y se transfieren a una membrana. Luego, se lava la membrana con polipéptido no luminiscente complementario (por ejemplo, permitiendo que se forme un complejo luminiscente) y se coloca en un dispositivo de obtención de imágenes (por ejemplo, utilizando una cámara CCD) con furimazina (PBI-3939) encima de la membrana, y se detecta la proteína de interés (por ejemplo, a través de la luminiscencia del complejo luminiscente).
“LucCytochemistry”: por ejemplo, una proteína de interés se expresa fusionada con un péptido o polipéptido no luminiscente y luego se detecta con un polipéptido o péptido no luminiscente complementario de una manera análoga a la inmunocitoquímica.
Ensayo de localización de proteínas: por ejemplo, se añade una señal de localización a un polipéptido o polipéptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se expresa en células (por ejemplo, una señal de localización nuclear añadida daría como resultado la expresión del polipéptido no luminiscente en el núcleo). Un péptido o polipéptido no luminiscente complementario se fusiona con una proteína de interés (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se expresa en células con el polipéptido o péptido no luminiscente. La luminiscencia se produce si la proteína de interés se localiza en el mismo compartimento subcelular (por ejemplo, el núcleo) que el polipéptido no luminiscente localizado por señal.
Ensayo de estabilidad de proteínas: por ejemplo, una proteína de interés se fusiona con un péptido o polipéptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se incuba en una o más condiciones de interés. Se añade un polipéptido o péptido no luminiscente complementario (por ejemplo, en diversos puntos de tiempo) y se usa la luminiscencia para cuantificar la cantidad de proteína de interés (por ejemplo, un indicador de estabilidad).
Detección/cuantificación de proteínas: por ejemplo, una proteína de interés fusionada con un péptido o polipéptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y expresada y/o manipulada por cualquier método. Luego se añade el polipéptido o péptido no luminiscente complementario para detectar y/o cuantificar la proteína de interés.
Purificación de proteínas: por ejemplo, una proteína de interés se fusiona con un péptido o polipéptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se expresa mediante cualquier método. Se hace pasar la mezcla de proteínas a través de un polipéptido o péptido complementario no luminiscente inmovilizado (por ejemplo, en perlas, en una columna, en un chip, etc.), se lava con un tampón adecuado y se eluye (por ejemplo, con un tampón de alta fuerza iónica o pH bajo). Puede usarse una forma mutante del péptido o polipéptido no luminiscente que no activa la luminiscencia del péptido o polipéptido no luminiscente complementario para eluir la proteína de interés.
Co-inmunoprecipitación (pull-down): por ejemplo, se usa un polipéptido no luminiscente, complementario e inmovilizado para aislar una proteína de interés (y proteínas que interactúan) que se fusiona con un péptido no luminiscente (por ejemplo, mediante ingeniería genética).
Ensayo de internalización del receptor de proteína acoplado a G (GPCR): por ejemplo, un péptido o polipéptido no luminiscente se fusiona con un GPCR de interés (por ejemplo, mediante ingeniería genética) y se expresa en la superficie de las células. Se añade un polipéptido o péptido no luminiscente complementario al medio de las células y se usa para detectar el GPCR en la superficie celular. Se añade un ligando para estimular la internalización del GPCR y se observa una disminución de la luminiscencia.
Ensayo de integridad de la membrana para la viabilidad celular: por ejemplo, cuando la membrana celular de una célula que expresa un polipéptido no luminiscente se ve comprometida, un péptido no luminiscente ingresa a la célula (por ejemplo, un péptido que de otro modo no puede cruzar la membrana celular), formando así un complejo luminiscente y generando luminiscencia.
Detección de 5-hidroximetilcitosina: por ejemplo, se añade una cisteína a un péptido no luminiscente y se incuba con ADN y una metiltransferasa. La metiltransferasa cataliza la adición del tiol (cisteína) sólo en los residuos de citosina que están 5-hidroximetilados. Luego el péptido no incorporado se separa del ADN (usando cualquier método posible) y se añade un polipéptido no luminiscente para detectar el péptido conjugado con el ADN.
Detección de formilcitosina: por ejemplo, similar a la detección de 5-hidroximetilcitosina anterior, este método de detección usa química con reactividad específica para formilcitosina.
Incorporación viral: el ácido nucleico que codifica para un péptido o polipéptido no luminiscente se incorpora en un genoma viral, y el polipéptido o péptido no luminiscente complementario se expresa constitutivamente en las células diana. Tras la infección de las células diana y la expresión del péptido no luminiscente, se forma el complejo bioluminiscente y se detecta una señal (por ejemplo, en presencia de un sustrato).
• Mareaje químico de proteínas: un péptido no luminiscente se fusiona o se ancla a un grupo reactivo (por ejemplo, biotina, éster succinimidílico, maleimida, etc.). Una proteína de interés (por ejemplo, un anticuerpo) se marca con el péptido no luminiscente mediante la unión del grupo reactivo a la proteína de interés. Debido a que el péptido es pequeño, no afecta la funcionalidad de la proteína de interés. Se añade al sistema un polipéptido no luminiscente complementario y se produce un complejo luminiscente tras la unión del polipéptido al péptido.
• Ensayo de proteasa: por ejemplo, una secuencia peptídica que es reconocida por una proteasa de interés puede unirse a NLPep de tal manera que evita la bioluminiscencia tras la exposición a NLPoly. Las maneras de hacer esto incluyen unir un extintor de luminiscencia a la secuencia de reconocimiento de proteasa o unir la secuencia de reconocimiento de proteasa a NLPep de tal manera que se obstaculice la complementación. Tras la actividad de la proteasa para escindir la secuencia de reconocimiento, se restablece la capacidad de NLPoly para complementar a NLPep y emitir luminiscencia y, por tanto, el sistema es un ensayo de proteasa sensible.
• Detección de ARN.
• Caracterización del ligador de biomoléculas: por ejemplo, puede evaluarse la estabilidad de un ligador unido a una biomolécula, tal como un anticuerpo, en un conjunto de condiciones mediante la unión de NLPep a la molécula a través del ligador de interés. Con el tiempo, la producción de NLPep libre a través de la degradación del ligador puede monitorizarse mediante la adición de NLPoly y furimazina y la cuantificación de la bioluminiscencia producida.
• Ensayo de mutación: por ejemplo, una mutación puntual, una mutación de cambio de marco, etc.
introducida in vitro o in vivo da como resultado o bien una ganancia de señal o bien pérdida de señal de un par de complementación. Un ensayo de este tipo puede usarse, por ejemplo, para analizar la mutagenicidad de los compuestos.
• Acoplamiento de la diana para los inhibidores de péptidos: uso de péptidos conjugados con NLpep de baja afinidad (expresados en células) para monitorizar el acoplamiento de la diana de los inhibidores basados en péptidos. NLpoly se ancla a la diana de interés. El acoplamiento da como resultado la pérdida de señal del complejo luminiscente.
• Biosensores de proteasa de ganancia de señal: se expresa un sitio de escisión de proteasa entre NLpoly y un péptido oscuro NLpep (baja afinidad). La escisión libera péptido oscuro que permite que NLpep de alta afinidad complemente a NLpoly.
• Ensayo de proteasa de ganancia de función: la secuencia de un NLpep se modifica por ingeniería proximal a un sitio de escisión de un sustrato de longitud completa para una proteasa (por ejemplo, caspasa, ADAM, etc.). El péptido permanece estéricamente inaccesible siempre que el sustrato permanezca intacto y el péptido esté “enterrado”. Tanto el sustrato de proteasa modificado por ingeniería como un NLpoly (por ejemplo, NLpoly11S) se cotransfectan en una línea de células diana. La actividad de la luciferasa se induce tras la inducción de la actividad de la proteasa que conduce a la escisión del sustrato y la exposición del péptido activador en el extremo N-terminal o C-terminal de uno de los fragmentos. Este principio es ampliable para detectar cambios conformacionales y/o modificaciones de proteínas también.
• Cuantificación de analitos intracelulares usando intracuerpos recombinantes: fragmentos de anticuerpos expresados dentro de las células como fusión de NLpoly o NLpep. La subunidad complementaria se fusiona genéticamente con un analito de interés. Cuando el analito está presente, el anticuerpo se une y se forma un complejo luminiscente. La aplicación es ampliable a biosensores PTM intracelulares (por ejemplo, fosforilación), en los que el intracuerpo sólo se une al analito cuando ha sido fosforilado (o unido de otro modo por el Ac específico de la modificación).
Las aplicaciones anteriores de los sistemas, complejos y métodos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, no son limitativas y pueden modificarse de cualquier manera adecuada.
Un péptido de un par luminiscente, tal como comprenden el sistema o el complejo definido en las reivindicaciones, puede ser un “péptido oscuro” o uno que se une a su complemento (por ejemplo, NLpoly) (por ejemplo, con baja o alta afinidad) pero produce una luminiscencia mínima o no produce ninguna luminiscencia (véanse las figuras 180­ 182). Por ejemplo, un péptido oscuro de alta afinidad encuentra uso en la complementación inversa, o en ensayos de ganancia de señal para medir inhibidores. Puede usarse un péptido oscuro de baja afinidad para reducir el fondo de NLpoly11S en un reactivo para la detección de una etiqueta peptídica de alta afinidad (por ejemplo, NLpep86). Los péptidos oscuros a modo de ejemplo se muestran en la figura 180.
Un péptido de un par luminiscente puede ser un “péptido extintor” o uno que contenga un resto extintor (por ejemplo, DAB), y el extintor absorbe la luz/energía producida tanto por un NLpoly aislado (por ejemplo, la señal producida independientemente de un NLpep complementario) como un complejo NLpoly-NLpep (por ejemplo, la señal producida como resultado de la formación del complejo). Los péptidos extintores oscuros a modo de ejemplo tendrían un espectro de absorción adecuado e incluirían Da B-161 (dAB-GWRLFKK), DAB-162 (DAB-GWa Lf KK), DAB-163 (DAB-VTGWALFEEIL), DAB-164 (DAB-VTGYALFQEIL), DAB-165 (DAB-VTGYALFEQIL) y DAB-166 (DAB-VTGYALFEEIL); donde DAB = dabcilo (extintor a 475 nm) espaciador dPEG4.
La fuerza de la interacción entre los elementos de pares no luminiscentes, tal como comprende el sistema definido en las reivindicaciones, puede alterarse mediante mutaciones para garantizar que sea insuficiente para producir funcionalidad en ausencia de elementos de interacción que faciliten la formación del complejo bioluminiscente, tal como se define en las reivindicaciones.
Sección experimental
Ejemplo 1
Generación de péptidos
Se generaron constructos peptídicos mediante uno de tres métodos: hibridación de oligonucleótidos fosforilados en 5' seguido de ligamiento al vector pF4Ag-Barnase-HALOTAG (Promega Corporation; cortado con SgfI y XhoI) o pFN18A (Promega Corporation; cortado con SgfI y XbaI), mutagénesis dirigida al sitio usando el kit Quik Change Lightning Multi de Agilent o subcontratando la clonación a Gene Dynamics.
Ejemplo 2
Preparación de péptidos
Los péptidos generados en el ejemplo 1 se prepararon para el análisis mediante la inoculación de una sola colonia de células KRX de E.coli (Promega Corporation) transformadas con un plásmido que codifica para un péptido en 2­ 5 ml de cultivo LB y se hicieron crecer a 37°C durante la noche. Luego se diluyeron los cultivos durante la noche (10 ml) en 1 l de LB y se hicieron crecer a 37°C durante 3 horas. Luego se indujeron los cultivos añadiendo 10 ml de ramnosa al 20% al cultivo de 1 l y se indujeron a 25°C durante 18 horas.
Después de la inducción, se centrifugaron 800 ml de cada cultivo a 5000xg a 4°C durante 30 minutos. Luego se resuspendió el sedimento generado en 80 ml de tampón de lisis de péptidos (HEPES 25 mM, pH 7,4, tampón de lisis pasivo 0,1x (Promega Corporation), 1 ml/ml de lisozima y 0,03 U/pl de DNasa RQ1 (Promega Corporation)) y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se congelaron las células lisadas en hielo seco durante 15 minutos y luego se descongelaron en un baño a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se centrifugaron las células a 3500xg a 4°C durante 30 minutos. Se dividieron en alícuotas los sobrenadantes para dar muestras de 10 ml con una alícuota de 50 pl colocada en un tubo de 1,5 ml.
A las muestras de 50 pl, se les añadieron 450 pl de H2O y 167 pl de colorante de carga SDS 4x, y se incubaron las muestras a 95°C durante 5 minutos. Después del calentamiento, se cargaron 5 pl de cada muestra (por triplicado) en un gel de SDS-PAGE, y se desarrolló y se tiñó el gel según el protocolo del fabricante. Luego se exploró el gel en un dispositivo explorador Typhoon (excitación 532 nm, emisión 580 nm, sensibilidad PMT 400 V). Se cuantificaron las bandas resultantes usando el software ImageQuant (5.2). Se promedió cada una de las tres intensidades de réplica, y la intensidad promedio de NLpep53-HT se definió a una concentración de 12x. Las concentraciones de todos los demás péptidos eran relativas a Pep53-HT.
Ejemplo 3
Análisis de péptidos
Todos los péptidos generados en los ejemplos 1-2 contenían mutaciones únicas en la secuencia peptídica: GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236). Todos los péptidos se fusionaron con una proteína HALOTAG (Promega Corporation). Los péptidos identificados como “HT-NLpep” indican que el péptido está ubicado en el extremo C-terminal de la proteína HALOTAG. En este caso, el gen que codifica para el péptido incluye un codón de terminación, pero no incluye una metionina para iniciar la traducción. Los péptidos identificados como “NLpep-HT” indican que el péptido está en el extremo N-terminal de la proteína HALOTAg . En este caso, el péptido incluye una metionina para iniciar la traducción, pero no incluye un codón de terminación.
Para determinar la capacidad de los péptidos para activar la luminiscencia, se transformaron colonias individuales de células KRX de E. coli (Promega Corporation) con un plásmido que codifica para un péptido del ejemplo 1, se inocularon en 200 pl de medio mínimo (sales M9 1x, CaCh 0,1 mM, MgSO42 mM, HCl de tiamina 1 mM, gelatina al 1%, glicerol al 0,2% y 100 ul/ml de ampicilina) y se hicieron crecer a 37°C durante la noche. Además de los péptidos, se hizo crecer un cultivo de células KRX de E.coli que expresan un fragmento de tipo natural (WT) de los residuos 1­ 156 de NanoLuc. Todos los péptidos y el fragmento WT se inocularon en al menos 3 cultivos separados.
Después del primer crecimiento durante la noche, se diluyeron 10 pl de cultivo en 190 pl de medio mínimo recién preparado y se hicieron crecer de nuevo a 37°C durante la noche.
Después del segundo crecimiento durante la noche, se diluyeron 10 pl del cultivo en 190 pl de medio de autoinducción (medio mínimo glucosa al 5% y ramnosa al 2%). Luego se indujeron los cultivos a 25°C durante aproximadamente 18 horas.
Después de la inducción, se sometió a ensayo la actividad de cultivos mutantes de péptidos pequeños. Se agruparon los cultivos que contenían el fragmento WT 1-156, se mezclaron con 10 ml de tampón de lisis 2x (HEPES 50 mM pH 7,4, tampón de lisis pasivo 0,3x y 1 mg/ml de lisozima) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se dividieron alícuotas de 30 pl del cultivo WT 1-156 lisado en pocillos de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos de fondo redondo (Costar 3355). A los pocillos de la placa de ensayo se le añadieron 20 pl de un cultivo de péptido y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO (Promega Corporation) y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s.
Los resultados (véase la tabla 3 y la figura 1) demuestran diversas mutaciones en el péptido (en relación con SEQ ID NO: 1) que alteraron (por ejemplo, aumentaron, disminuyeron) la luminiscencia tras la complementación con el polipéptido no luminiscente de tipo natural. Se cree que el aumento de la luminiscencia proviene de uno (o una combinación) de cinco factores principales, cualquiera de los cuales es beneficioso: afinidad entre el péptido no luminiscente y el polipéptido no luminiscente, expresión del péptido, solubilidad intracelular, estabilidad intracelular y actividad bioluminiscente. Sin embargo, la presente invención, que se define en las reivindicaciones, no se limita a ningún mecanismo de acción en particular y no es necesario comprender el mecanismo de acción para poner en práctica la presente invención.
Tabla 3
Figure imgf000046_0001
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Ejemplo 4
Generación de polipéptidos no luminiscentes
Usando pF4Ag-NanoLuc1-156 (WT 1-156) como molde, se realizó una PCR propensa a errores (epPCR) usando el kit de mutagénesis aleatoria Diversify PCR de Clontech. El producto de PCR resultante se digirió con SgfI y XbaI y se ligó a pF4Ag-Barnase (Promega Corporation), una versión del vector pF4A disponible comercialmente (Promega) que contiene promotores T7 y CMV y se modificó para contener un sitio de unión al ribosoma de E. coli. Después de la transformación en células KRX de E. coli (Promega Corporation) por choque térmico a 42°C, se usaron colonias individuales para inocular cultivos de 200 |il en placas transparentes de 96 pocillos de fondo plano (Costar 3370). Ejemplo 5
Análisis de polipéptidos no luminiscentes
Para determinar la luminiscencia de los mutantes de polipéptidos no luminiscentes generados en el ejemplo 4, se hicieron crecer colonias individuales de células KRX de E. coli (Promega Corporation) transformadas con un plásmido que contenía uno de los mutantes de polipéptidos no luminiscentes del ejemplo 4 según el procedimiento usado en el ejemplo 3. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 3. Para someter a ensayo cada cultivo inducido por mutantes de polipéptidos no luminiscentes, se dividieron alícuotas en pocillos de una placa de ensayo de 96 pocillos (Costar 3355)30 |il de tampón de lisis de ensayo (HEPES 25 mM pH 7,4, tampón de lisis pasivo 0,3x (Promega Corporation)), 0,006 U/pl de DNasa RQ1 (Promega Corporation) y disolución peptídica 1x (la concentración relativa de los péptidos se determinó tal como se explica en el ejemplo 2; a partir de la concentración relativa determinada, se diluyeron los péptidos a 1x en el tampón de lisis) que contenía o bien el fragmento peptídico GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 18) o bien GVTGWRLFKRISA (SEQ ID NO: 106 ). A los pocillos de la placa de ensayo se les añadieron 20 pl de un cultivo de mutantes de polipéptidos no luminiscentes inducido y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO (Promega Corporation) y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s.
Los resultados (tabla 4 y figura 2) demuestran numerosas mutaciones puntuales que mejoran la luminiscencia del polipéptido no luminiscente tras la complementación con dos péptidos diferentes. De manera similar a las mutaciones en el péptido, estas mutaciones en el polipéptido no luminiscente pueden provenir de diversos factores, todos los cuales son beneficiosos para el sistema como un todo.
Tabla 4
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
desv. est.
GVTGWRLFKRISA
desv. est.
Mutación
GVTGWRLCKRISA
Figure imgf000048_0001
desv. est.
GVT GWRLFKRISA
desv. est.
Figure imgf000049_0001
*las unidades en la tabla 4 son RLU (mutante)/RLU (WT)
Ejemplo 6
Sustituciones de glicina por alanina en polipéptido no luminiscente
El siguiente ejemplo identificó residuos de glicina dentro del polipéptido no luminiscente que pueden sustituirse por alanina para proporcionar un polipéptido no luminiscente mejorado (por ejemplo, mayor señal luminiscente). Las sustituciones se realizaron individualmente (véase la figura 3), o en compuestos (figura 2). Se generaron polipéptidos no luminiscentes que contenían sustituciones de glicina por alanina tal como se describe en el ejemplo 1.
Cada colonia mutante individual se inoculó en 200 |il de medio mínimo (sales M9 1x, CaCl 0,1 mM2, MgSO42 mM, HCl de tiamina 1 mM, gelatina al 1%, glicerol al 0,2% y ampicilina 1x) y se incubó con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 |il del cultivo a 190 |il de medio mínimo recién preparado y se incubaron de nuevo con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 |il del segundo cultivo a 190 |il de medio de autoinducción (medio mínimo glucosa al 5% ramnosa al 2%) y se incubaron con agitación a 25°C durante 18 horas para permitir la expresión del polipéptido no luminiscente.
Para someter a ensayo cada cultivo mutante, se añadieron 30 |il de tampón de lisis de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7.5, tampón de lisis pasivo 0,3x (Promega Corporation)) y 0,006 U/|il de DNasa RQ1 (Promega Corporation)) que contiene péptido no luminiscente (dilución 1:10 de NLpep9-HT (NLpep9 es SEQ ID NO: 17 y 18; HT es lisado clarificado de E. coli HaloTag). Se agitaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añadieron 50 |il de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO (Promega Corporation). Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s.
Para generar el lisado clarificado de E. coli de NLpep9-HT, se inocularon 5 ml de LB con una sola colonia de E. coli de NLpep9-HT y se incubaron a 37°C durante la noche. Luego se diluyeron 500 |il del cultivo durante la noche en 50 ml de LB y se incubaron a 37°C durante 3 horas. Se añadieron 500 |il de ramnosa al 20% y se incubaron a 25°C durante 18 horas. Se centrifugó el cultivo de expresión a 3000xg durante 30 minutos y se resuspendió el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis de péptidos (HEPES 25 mM, pH 7,5, tampón de lisis pasivo 0,1x, 1 mg/ml de lisozima y 0,3 U/|il de DNasa RQ1) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se colocó la muestra lisada en hielo seco durante 15 minutos, se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente y se centrifugó a 3500xg durante 30 minutos. El sobrenadante fue el lisado clarificado.
Las figuras 3 y 4 demuestran los efectos de las mutaciones sobre la luminiscencia.
Ejemplo 7
Mutaciones en péptido no luminiscente
En el siguiente ejemplo, se realizaron mutaciones en el péptido no luminiscente basándose en la alineación con otras proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) y se eligieron basándose en la alta probabilidad (frecuencia en FABP) para identificar una mutación que conserva/mejora la actividad (tal como NLpep2, 4 y 5) o establecer que es poco probable que se tolere una mutación en esa posición (tal como NLpep3). NLpepl-5 contiene mutaciones únicas (consulte la tabla 1) y NLpep6-9 son conjuntos compuestos de las mutaciones en NLpep2, 4 y 5 (véase la tabla 1). Se generaron los mutantes tal como se describe en el ejemplo 1.
Se inoculó cada colonia mutante en 200 |il de medio mínimo y se incubó con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 |il del cultivo a 190 |il de medio mínimo recién preparado y se incubaron de nuevo con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 |il del segundo cultivo a 190 |il de medio de autoinducción y se incubaron con agitación a 25°C durante 18 horas para permitir la expresión del mutante de péptido no luminiscente.
Para someter a ensayo cada cultivo mutante, se añadieron 30 |il de tampón de lisis de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7.5, tampón de lisis pasivo 0,3x (Promega Corporation)) y 0,006 U/|il de DNasa RQ1 (Promega Corporation)) que contiene polipéptido no luminiscente (dilución 1:10 de lisado clarificado de E. coli de polipéptido no luminiscente de tipo natural). Se agitaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se añadieron 50 |il de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO (Promega Corporation). Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos y se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s. La figura 1 muestra la luminiscencia (RLU) detectada en cada mutante de péptido no luminiscente. Los resultados demuestran diversas posiciones que pueden tolerar una mutación sin una pérdida sustancial de luminiscencia, así como algunas mutaciones específicas que mejoran la luminiscencia.
Ejemplo 8
Efecto de la orientación de la etiqueta de fusión sobre la luminiscencia
En el siguiente ejemplo, se comparó la luminiscencia generada por péptidos no luminiscentes con la proteína HaloTag de extremo N-terminal o C-terminal.
Se hizo crecer una sola colonia de cada fusión péptido-HT según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Las figuras 6 y 7 demuestran la luminiscencia (RLU) detectada en cada fusión péptido-HT. Los resultados demuestran combinaciones de mutaciones que producen una luminiscencia similar a la de NLpep 1.
Ejemplo 9
Efecto de múltiples ciclos de congelación-descongelación sobre péptidos no luminiscentes
Se congeló 1 ml de NLpep9-HT en hielo seco durante 5 minutos y luego se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego se extrajeron 60 pl para el ensayo. Luego se repitió el procedimiento de congelación-descongelación otras 10 veces. Después de cada ciclo de congelacióndescongelación, se extrajeron 60 pl de muestra para su ensayo.
Para el ensayo, se mezclaron 20 pl de cada muestra congelada-descongelada con 30 pl de SEQ ID NO:2 y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s. Los resultados se representan en la figura 8 y demuestran que NLpep puede someterse a múltiples ciclos de congelación-descongelación sin pérdida de actividad (luminiscencia). Ejemplo 10
Distinción de mutaciones en péptidos no luminiscentes
En el siguiente ejemplo, se usó el análisis en gel de TMR para normalizar la concentración de los mutantes de péptidos no luminiscentes para distinguir las mutaciones que alteran la expresión de aquellas que alteran la luminiscencia (por ejemplo, la luminiscencia alterada puede deberse a una afinidad de unión alterada).
Se inocularon 5 ml de LB con una sola colonia de péptido mutante y se incubaron con agitación a 37°C durante 20 horas. Se diluyeron 50 pl del cultivo durante la noche en 5 ml de LB recién preparado y se incubaron con agitación a 37°C durante 3 horas. Luego se añadieron 50 pl de ramnosa al 20% y se incubaron con agitación a 25°C durante 18 horas.
Para el análisis en gel de TMR, se mezclaron 79 pl de cada cultivo inducido con 10 pl de 10x tampón de lisis Fast Break (Promega Corporation), 10 pl de una dilución 1:100 de polipéptido no luminiscente de ligando HALOTAG TMR (Promega Corporation) y 10 pl de DNasa RQ1 y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 33,3 pl de tampón de carga SDS 4x y se incubaron las muestras a 95°C durante 5 minutos. Se cargaron 15 pl de cada muestra en un gel de SDS y se procesaron según las instrucciones del fabricante. Luego se exploró el gel en un dispositivo Typhoon.
Cada cultivo se diluyó basándose en la intensidad del gel de TMR para normalizar las concentraciones. Luego se mezclaron 20 pl de cada cultivo diluido con 30 pl de tampón de lisis de ensayo que contenía polipéptido no luminiscente (dilución 1:10 de lisado clarificado de E. coli de SEQ ID NO: 2) y se incubaron con agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NANOGLO y se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GLOMAX con integraciones de 0,5 s (véase la figura 9).
Ejemplo 11
Saturación del sitio en polipéptido no luminiscente
En el siguiente ejemplo, las posiciones 11, 15, 18, 31, 58, 67, 106, 149 y 157 se identificaron como sitios de interés a partir del cribado de la biblioteca de mutaciones aleatorias en el polipéptido no luminiscente de tipo natural. Los 20 aminoácidos en estas posiciones (basados en el mutante no luminiscente 5A2 generado en el ejemplo 6 (SEQ ID NO: 539 y 540) para validar con otras mutaciones en el mutante 5A2) se compararon para determinar el aminoácido óptimo en esa posición. Se generaron polipéptidos mutantes no luminiscentes tal como se describió previamente en el ejemplo 1. Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido mutante no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 6. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 6. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 6, excepto que se usó lisado clarificado de E. coli de NLpep53 a una dilución de 1:11,85.
Las figuras 10-18 demuestran el efecto de las mutaciones sobre la capacidad de producir luminiscencia con y sin NLpep.
Ejemplo 12
Comparación de cisteína frente a prolina como primer aminoácido en péptido no luminiscente
En el siguiente ejemplo, se realizó una comparación del uso de cisteína o prolina como primer aminoácido (después de la metionina necesaria) en el péptido no luminiscente. Los péptidos mutantes no luminiscentes se generaron tal como se describió previamente en el ejemplo 1. Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido mutante no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7. La figura 19 demuestra que tanto la cisteína como la prolina pueden usarse como el primer aminoácido de NLpep y producir luminiscencia.
Ejemplo 13
Identificación del conjunto compuesto óptimo de mutaciones para el péptido no luminiscente
En los siguientes ejemplos, se identificó/identificaron un(os) conjunto(s) compuesto(s) óptimo(s) de mutaciones para el péptido no luminiscente. Los péptidos mutantes no luminiscentes se generaron tal como se describió previamente en el ejemplo 1.
1) Para los mutantes compuestos de péptidos no luminiscentes NLpep53, NLpep66, NLpep67 y NLpep68, se hizo crecer una sola colonia de cada uno según el procedimiento usado en el ejemplo 10. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 10. Análisis en gel de TMR y se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 10. Los resultados en la figura 20 demuestran la luminiscencia así como la expresión en E. coli de NLpep que contienen múltiples mutaciones.
2) Para los mutantes compuestos de péptidos no luminiscentes NLpep53 y NLpep 66-74, se hizo crecer una sola colonia de cada uno según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los resultados en la figura 21 demuestran la luminiscencia de NLpep que contienen múltiples mutaciones.
3) Para los mutantes compuestos de péptidos no luminiscentes NLpep53 y NLpep 66-76, se hizo crecer una sola colonia de cada uno según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7 excepto que el polipéptido no luminiscente era 5A2 o 5A2+R11E (dilución 1:10 de lisado clarificado de E. coli). Los resultados de la figura 22 demuestran la luminiscencia de NLpep que contienen múltiples mutaciones con 5A2 o 5A2+R11E. Estos resultados también demuestran la menor luminiscencia cuando la mutación de NLpoly R11E se complementa con un NLpep que contiene E como el noveno residuo (NLpep72, 75 y 76).
4) Para los mutantes compuestos de péptidos no luminiscentes NLpep 1, NLpep69, NLpep78 y NLpep79, se hizo crecer una sola colonia de cada uno según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a prueba y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7 excepto que el polipéptido no luminiscente era WT (dilución 1:10 de lisado clarificado de E. coli). Los resultados de la figura 23 demuestran la luminiscencia de NLpep que contienen múltiples mutaciones.
Ejemplo 14
Mutantes compuestos de polipéptidos no luminiscentes
En el siguiente ejemplo, se combinaron 9 mutaciones de los cribados de la biblioteca en un clon compuesto (NLpoly1, SEQ ID NO: 941, 942), y luego una de las mutaciones se revirtió al aminoácido original (NLpoly2-10, SEQ ID NO: 943-960) con el fin de identificar el conjunto compuesto óptimo. Basándose en los resultados anteriores de NLpoly1-10, NLpoly11-13 (SEQ ID NO: 961-966) se diseñaron y se sometieron a prueba con el mismo propósito. Se generaron NLpoly mutantes tal como se describió previamente en el ejemplo 1. Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido mutante no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 6. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 6. Se sometió a prueba y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 6 excepto que se usó un lisado clarificado de E. coli de NLpep53 a una dilución 1:11,85.
La figura 24 demuestra la luminiscencia de NLpoly que contienen múltiples mutaciones.
Ejemplo 15
Especificidad de sustrato de mutantes de polipéptidos no luminiscentes
El siguiente ejemplo investiga la especificidad de sustrato de los mutantes de polipéptidos no luminiscentes. Luminiscencia generada a partir de complejos luminiscentes formados a partir de diversos mutantes de polipéptidos no luminiscentes, o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato, y diversos péptidos no luminiscentes.
Se sembraron células HEK 293 a 100.000 células/ml en pocillos de placas de 24 pocillos que contenían 0,5 ml de DMEM FBS al 10% (50.000/pocillo). Se incubaron las células en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Se transfectó por duplicado ADN para la expresión de cada mutante de polipéptido no luminiscente. Se mezcló 1 ug de ADN plasmídico que contenía un mutante de polipéptido no luminiscente con OptiMEM (Life Technologies) hasta un volumen final de 52 ul. Se añadieron 3,3 |il de FuGENE HD (Promega Corporation) y se incubaron las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 25 |il de cada mezcla de muestra a dos pocillos y se incubaron durante la noche en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Después de la incubación durante la noche, se retiró el medio de cultivo y se añadieron 0,5 ml de DMEM (sin rojo de fenol) Prionex al 0,1%. Luego se congelaron las células en hielo seco (durante cuánto tiempo) y se descongelaron antes de detectar la luminiscencia.
En las figuras 25-26, se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 6, excepto que se usó lisado clarificado de E. coli de NLpep53 a una dilución 1:10 y se usó o bien furimazina o bien coelenterazina en bien tampón de ensayo de luciferasa NanoGlo o bien DMEm . Estos datos demuestran la luminiscencia de NLpoly en NANOGLO y DMEM con o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato. Esto indica la especificidad de sustrato (furimazina frente a coelenterazina) del NLpoly tanto en NANOGLO como en DMEM.
En la figura 27, se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 6, excepto que se usó lisado clarificado de E. coli de diversos péptidos no luminiscentes (NLpep1, NLpep9, NLpep48, NLpep53, NLpep69 o NLpep76) a una dilución 1:10. Además, se usó o bien furimazina o bien coelenterazina en cualquier tampón de ensayo de luciferasa NanoGlo. Estos datos demuestran la especificidad de sustrato de los pares NLpoly/NLpep.
En la figura 28, se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia diluyendo por separado la fusión NLpep53-HT 1:10 y los lisados de polipéptidos no luminiscentes 1:10 en DMEM Prionex al 0,1%. Luego se combinaron 20 |il de péptido no luminiscente y 20 |il de polipéptido no luminiscente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadieron a las muestras 40 |il de tampón NanoGlo con furimazina 100 uM o DMEM con Prionex al 0,1% y furimazina 20 uM y se detectó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi. Estos datos demuestran la especificidad de sustrato de NLpoly expresados en células HEK293.
En la figura 29, se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia diluyendo por separado la fusión NLpep1-HT, NLpep53-HT, NLpep69-HT o NLpep76-HT 1:10 y los lisados de polipéptidos no luminiscentes 1:10 en d Me M Prionex al 0,1%. Luego se combinaron 20 |il de péptido no luminiscente y 20 |il de polipéptido no luminiscente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadieron a las muestras 40 |il de tampón NanoGlo con furimazina 100 uM o DMEM con Prionex al 0,1% y furimazina 20 uM y se detectó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi. Estos datos demuestran la luminiscencia de NLpoly expresados en células de mamífero y analizados con varios NLpep.
Ejemplo 16
Señal con respecto a fondo de mutantes de polipéptidos no luminiscentes con furimazina o coelenterazina
El siguiente ejemplo investiga la señal con respecto a fondo de los mutantes de polipéptidos no luminiscentes. La luminiscencia generada a partir de diversos mutantes de polipéptidos no luminiscentes se midió usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato, así como con diversos péptidos no luminiscentes.
Se sembraron células HEK 293 a 15.000 células/pocillo en 100 pl de DMEM FBS al 10% en pocillos de placas de 96 pocillos. Se incubaron las células en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Los complejos de transfección se prepararon cada uno añadiendo 0,66 ug de ADN plasmídico para la expresión de un mutante de polipéptido no luminiscente y un plásmido de mutante de péptido no luminiscente hasta un volumen final de 31 pl en OptiMem. Se añadieron 2 pl de FuGENE HD a cada complejo de transfección y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para cada combinación de péptido/polipéptido, se añadieron 5 pl de un complejo de transfección a 6 pocillos de la placa de 96 pocillos y se hicieron crecer durante la noche a 37°C en una incubadora de CO2. Después de la incubación durante la noche, se retiró el medio de crecimiento y se reemplazó con medios independientes de CO2 que contienen o bien coelenterazina 20 uM o bien furimazina 20 uM. Se incubaron las muestras durante 10 minutos a 37°C y se midió la cinética en el transcurso de 1 hora a 37°C en un dispositivo GloMax Multi . La figura 30 demuestra la especificidad de sustrato de diversos pares NLpoly/NLpep cuando el NLpoly se expresa en células de mamífero.
Ejemplo 17
Luminiscencia y especificidad de sustrato
El siguiente ejemplo investiga la luminiscencia y la especificidad de sustrato de diversos mutantes de polipéptidos no luminiscentes con NLpep69 y usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato.
Se sembraron células CHO a 20.000 células/pocillo en 100 pl de DMEM FBS al 10% en pocillos de placas de 96 pocillos. Se incubaron las células en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Los complejos de transfección se prepararon cada uno añadiendo 0,66 ug de ADN plasmídico para la expresión de un mutante de polipéptido no luminiscente y un plásmido de mutante de péptido no luminiscente hasta un volumen final de 31 pl en OptiMem. Se añadieron 2 pl de FuGENE HD a cada complejo de transfección y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para cada combinación de péptido/polipéptido, se añadieron 5 pl de complejo de transfección a 6 pocillos de la placa de 96 pocillos y se hicieron crecer durante la noche a 37°C en una incubadora de CO2. Después de la incubación durante la noche, se retiró el medio de crecimiento y se reemplazó con medios independientes de CO2 que contienen o bien coelenterazina 20 uM o bien furimazina 20 uM. Se incubaron las muestras durante 10 minutos a 37°C y se midió la cinética en el transcurso de 1 hora a 37°C en un dispositivo GloMax Multi . La figura 31 demuestra la especificidad de sustrato cuando los NLpoly se coexpresan en células de mamífero con NLpep69.
Ejemplo 18
Luminiscencia y especificidad de sustrato entre condiciones de células vivas y líticas
El siguiente ejemplo investiga la luminiscencia y la especificidad de sustrato de diversos mutantes de polipéptidos no luminiscentes con NLpep69, NLpep78 o NLpep79, usando o bien furimazina o bien coelenterazina como sustrato y en condiciones o bien de células vivas o bien líticas.
Se sembraron células HEK 293 a 15.000 células/pocillo en 100 pl de DMEM FBS al 10% en pocillos de placas de 96 pocillos. Se incubaron las células en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2 durante la noche. Los complejos de transfección se prepararon cada uno añadiendo 0,66 ug de ADN plasmídico para la expresión de un mutante de polipéptido no luminiscente y un plásmido de mutante de péptido no luminiscente hasta un volumen final de 31 pl en OptiMem. Se añadieron 2 pl de FuGENE HD a cada complejo de transfección y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para cada combinación de NLpoly-NLpep, se añadieron 5 pl de complejo de transfección a 6 pocillos de la placa de 96 pocillos y se hicieron crecer durante la noche a 37°C en una incubadora con CO2. Después de la incubación durante la noche, se extrajo el medio de crecimiento y se reemplazó con medios independientes de CO2 que contienen o bien coelenterazina 20 uM o bien furimazina 20 uM. Se incubaron las muestras durante 10 minutos a 37°C y se midió la cinética en el transcurso de 1 hora a 37°C en un dispositivo GloMax Multi . Las figuras 32-34 demuestran la especificidad de sustrato de NLpoly coexpresados en células de mamífero con NLpep69, 78 o 79 en formatos de células vivas y líticos.
Ejemplo 19
Comparación de mutantes de polipéptidos no luminiscentes expresados en E. coli
Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7 excepto que se usó NLpep78-HT o NLpep79-HT a una dilución 1:1.000. La figura 35 demuestra la luminiscencia de NLpoly expresados en E. coli y analizados con NLpep78 o 79.
Ejemplo 20
Capacidad de los clones de polipéptidos no luminiscentes para producir luminiscencia sin complementar el péptido no luminiscente
Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo 7 excepto que no se añadió péptido no luminiscente al tampón de ensayo. La figura 36 demuestra la luminiscencia de NLpoly expresados en E. coli y analizados en ausencia de NLpep.
Ejemplo 21
Especificidad de sustrato de mutantes de polipéptidos no luminiscentes expresados en E. coli
Se hizo crecer una sola colonia de cada polipéptido no luminiscente según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Los cultivos bacterianos también se indujeron según el procedimiento usado en el ejemplo 7. Se sometió a ensayo y se detectó la luminiscencia según el procedimiento usado en el ejemplo, excepto que se mezcló o bien furimazina o bien coelenterazina con tampón de ensayo NANOGLO. La figura 37 demuestra la especificidad de sustrato de NLpoly expresados en E. coli y analizados con NLpep78 o 79.
Ejemplo 22
Luminiscencia mejorada de mutantes de polipéptidos no luminiscentes con NLpep78
La complementación de los mutantes de polipéptidos no luminiscentes con NLpep78-HT se demostró en células CHO y Hela.
Se transfectaron células CHO y Hela (CHO: 100.000 sembradas el día anterior a la transfección; Hela: 50.000 sembradas el día anterior a la transfección) con 5 ng de un mutante de polipéptido no luminiscente 5A2 o 5P o con polipéptido no luminiscente de tipo natural usando FuGENE HD en pocillos de una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37°C durante la noche. Después de la incubación durante la noche, se reemplazó el medio con DMEM sin rojo fenol y se congelaron las células a -80°C durante 30 minutos. Luego se descongelaron las células y se transfirieron a un tubo de 1,5 ml. Luego se diluyeron los lisados celulares 1:10 en DMEM sin rojo fenol, se mezclaron 20 |il con NLpep78 (lisado de E. coli de NLpep78-HT7 diluido 1:1000 en DMEM sin rojo fenol) y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 |il de DMEM sin rojo fenol y furimazina 20 |iM y se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con una integración de 0,5 segundos. La figura 38 demuestra la luminiscencia de NLpoly expresados en células de mamífero y analizados con NLpep78.
Ejemplo 23
Fusiones de polipéptidos no luminiscentes y normalización de concentraciones de polipéptidos no luminiscentes Se realizó una comparación de la luminiscencia sin procesar y normalizada del polipéptido no luminiscente fusionado con o bien luciferasa de luciérnaga (figura 39) o bien luciferasa roja de elatérido (figura 40) para proporcionar una idea de cuánto beneficio, por ejemplo, en cuanto a expresión, solubilidad y/o estabilidad, proviene de la concentración del polipéptido no luminiscente, así como de la complementación como un polipéptido no luminiscente de fusión.
Se transfectaron células HEK293, Hela o CHO con 5 ng de fusión NLpoly 5P-luciferasa de luciérnaga, fusión NLpoly 5P-luciferasa de elatérido, fusión 5P de tipo natural-luciferasa de luciérnaga o fusión 5P de tipo natural-luciferasa de elatérido según el procedimiento del ejemplo 22 Los lisados también se prepararon según el ejemplo 22. Luego se diluyeron los lisados celulares 1:10 en DMEM sin rojo fenol, se mezclaron 20 |il con NLpep78 (diluido 1:100 en DMEM sin rojo fenol; lisado de E. coli) y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 |il de NanoGlo con furimazina 20 |iM o Bright-Glo (Promega Corporation) y se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 segundos. Las figuras 39 y 40 demuestran la actividad específica de NLpoly 5P frente a WT expresados en células de mamífero y analizados con NLpep78.
Ejemplo 24
Complementación en células vivas
Este ejemplo demuestra la complementación en células vivas usando o bien NLpoly de tipo natural o bien 5P. Se sembraron células Hela en pocillos de una placa de 96 pocillos, se transfectaron con 0,5 ng de ADN plasmídico de polipéptido no luminiscente 5P o de tipo natural usando FuGENE HD y se incubaron a 37°C durante la noche. Después de la incubación durante la noche, se transfectaron las células con 0,5 ng de ADN plasmídico de NLpep78-HT usando FuGENE HD y se incubaron a 37°C durante 3 horas. Luego se reemplazó el medio con medios independientes de CO2 FBS al 0,1% y PBI-4377 20 uM y se midió la luminiscencia a 37°C en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 segundos. La figura 41 demuestra la complementación de células vivas entre NLpoly 5P o WT y NLpep78.
Ejemplo 25
Complementación en extracto sin células
Para demostrar la complementación en el extracto sin células, se mezclaron 0,5 ug de NLpep78-HT y 0,5 ug de ADN plasmídico de mutante de polipéptido no luminiscente con mezcla maestra de lisado de reticulocitos de conejo TNT (Promega Corporation) y se incubaron a 30°C durante 1 hora. Se mezclaron 25 pl del extracto de expresión sin células con 25 pl del reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con una integración de 0,5 segundos. La figura 42 demuestra la luminiscencia de pares NLpoly/NLpep complementarios expresados en un formato sin células.
Ejemplo 26
Afinidad de unión del polipéptido no luminiscente expresado en células de mamífero con péptido no luminiscente sintético
Para demostrar la afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente y los pares de péptidos no luminiscentes, se prepararon lisados de polipéptidos no luminiscentes de células Hela, HEK293 y c Ho tal como se describió anteriormente y se diluyeron 1:10 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x de péptido no luminiscente (sintético) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 pl del lisado de polipéptido no luminiscente con 20 pl de péptido no luminiscente y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo o PBS Prionex al 0,1% con furimazina y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detectó luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. Los valores de Kd se determinaron usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio. Las figuras 43 y 44 muestran las constantes de disociación medidas en varias condiciones de tampón (PBS para complementación, luego NanoGlo para detección, PBS para complementación y detección, NanoGlo para complementación y detección).
Ejemplo 27
Afinidad de unión mejorada cuando se mutó la cisteína a fenilalanina en mutantes de péptidos no luminiscentes
Para demostrar una afinidad de unión mejorada en mutantes de péptidos no luminiscentes con una cisteína mutada en el 8° residuo del péptido, se prepararon lisados de mutantes de polipéptidos no luminiscentes de células Hela, HEK293 y CHO tal como se describió previamente y se diluyeron 1:10 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x de péptido no luminiscente (NLpep) en PBS Prionex al 0,1% DTT 10 mM. Se mezclaron 20 pl del lisado de polipéptido no luminiscente con 20 pl de péptido no luminiscente y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detectó luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 45 demuestra que la mutación C8F de NLpep mejora significativamente la afinidad de unión por 5P.
Ejemplo 28
Luminiscencia detectable de variantes de polipéptidos sin péptido no luminiscente en células Hela
Para demostrar la luminiscencia en polipéptido no luminiscente sin péptido no luminiscente, se transfectaron células Hela (10.000 sembradas el día anterior a la transfección) en pocillos de una placa de 96 pocillos con cantidades variables de polipéptido no luminiscente ADN portador pGEM-3zf hasta un total de 50 ng usando FuGENE HD y se incubaron a 37°C durante la noche. Después de la incubación, se reemplazó el medio con medios independientes de CO2 FBS al 0,1% furimazina 20 uM y se incubó a 37°C durante 10 minutos, y se detectó luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 46 demuestra la luminiscencia de NLpoly WT o 5P en células Hela vivas sin NLpep después de la transfección de diversas cantidades de ADN plasmídico.
Ejemplo 29
Generación de variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales
Se generaron variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales: Ile-11 (Ile en el residuo 11), Val-11, Tyr-11, Glu-11, Glu-157, Pro-157, Asp-157, Ser-157, Met-149, Leu-106, NLpoly11 y NLpoly12 tal como se describe a continuación y se analizó su expresión. Las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales se prepararon en el fondo de polipéptido no luminiscente 5A2.
Se seleccionaron colonias individuales recién preparadas (KRX) de cada variante de polipéptido no luminiscente adicional y se hicieron crecer durante la noche en LB+ampicilina (100 ug/ml) a 30°C y luego se diluyeron 1:100 en LB+ampicilina y se hicieron crecer a 37°C durante 2,5 horas (DO600 ~0,5). Se añadió ramnosa hasta una concentración final del 0,2%, y se dividieron las células por triplicado y se hicieron crecer durante la noche a 25°C durante ~18 h. Se lisaron las células usando 0,5X Fast Break durante 30 minutos a temperatura ambiental, se ultracongelaron en hielo seco y se almacenaron a -20°C. Después de la descongelación rápida, las fracciones solubles se prepararon mediante centrifugación a 10 K durante 15 min a 4°C. Se analizó la luminiscencia de las muestras en un luminómetro Tecan Infinite F-500.
La figura 49 demuestra el lisado total y la fracción soluble de cada variante de polipéptido no luminiscente analizada mediante SDS-PAGE. Los datos proporcionan información sobre la expresión, solubilidad y estabilidad de las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales. La mayoría de las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales produjeron más proteína (total y soluble) que el tipo natural, pero en muchos casos, la diferencia es sutil. La expresión mejorada para NLpoly11 y NLpoly12 fue más notable.
Ejemplo 30
Luminiscencia de fondo de variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales
La luminiscencia de fondo de las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales generadas en el ejemplo 29 se midió incubando 25 pl de lisado de variante de polipéptido no luminiscente con 25 pl de DMEM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se midió la luminiscencia a los 5 y 30 minutos en un dispositivo Tecan Infinite F500. Se usaron como controles NLpep53 (Pep 53) solo y DMEM (DMEM) solo. La figura 47 demuestra que la mayoría de las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales mostraron una luminiscencia de fondo elevada.
Ejemplo 31
Luminiscencia de variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales después de la complementación
La luminiscencia de las variantes de polipéptidos no luminiscentes adicionales generadas en el ejemplo 28 se midió incubando 25 pl de lisado de variante de polipéptido no luminiscente con 25 pl de NLpep-53 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se midió la luminiscencia a los 5 y 30 minutos en un dispositivo Tecan Infinite F500. Se usaron como controles NLpep53 (Pep 53) solo y DMEM (DMEM) solo. La figura 48 demuestra que las variantes de polipéptidos no luminiscentes Val-11, Glu-11, Glu-157, Pro-157, Asp-157, Ser-157 y Met-149 generaron significativamente más luminiscencia que el 5A2 original.
Ejemplo 32
Correlación entre la luminiscencia de fondo aumentada del polipéptido no luminiscente en ausencia de péptido no luminiscente y la cantidad de proteína en la fracción soluble
Las colonias individuales de las variantes de polipéptidos no luminiscentes 3P, 3E, 5P, 5E, 6P y 6E se seleccionaron y se cultivaron durante la noche en LB+ampicilina a 30°C y luego se diluyeron 1:100 en LB+ampicilina y se cultivaron a 37°C durante 2,5 horas (DO600 ~0,5). Se añadió ramnosa a una concentración final del 0,2%, y se dividieron las células por triplicado y se cultivaron durante la noche a 25°C durante ~18 h. Se lisaron las células usando Fast Break 0,5X durante 30 minutos a temperatura ambiental, se ultracongelaron en hielo seco y se almacenaron a -20°C. Después de la descongelación rápida, las fracciones solubles se prepararon mediante centrifugación a 10 K durante 15 min a 4°C. Se analizó la luminiscencia de las muestras en un dispositivo Tecan Infinite F-500. La figura 50A muestra el lisado total y la fracción soluble de cada variante de polipéptido no luminiscente. La figura 50B muestra la luminiscencia de fondo de cada variante de polipéptido no luminiscente. La figura 51 muestra la luminiscencia generada con cada variante de polipéptido no luminiscente cuando se complementa con NLpep78 (NVSGWRLFKKISN) 10 ó 100 nM en medio LB.
Ejemplo 33
Alargamientos y deleciones de polipéptido no luminiscente
La variante de polipéptido no luminiscente 5P se alargó en el extremo C-terminal o bien mediante la adición de los residuos VAT, AA, VTG, VT, VTGWR, VTGW, V, A, VA, GG, AT, GTA, ATG o GT o bien mediante la deleción de 1 a 7 residuos en el extremo C-terminal de 5P, por ejemplo, D1 = deleción de 1 residuo, D2 = deleción de 2 residuos, etc. Se midieron la luminiscencia de fondo en lisados de E. coli (figura 52) y la luminiscencia generada después de la complementación con NLpep78 (figura 53; NVSGWRLFKKISN) o NLpep79 (figura 54; NVTGYRLFKKISN). La figura 55 muestra la señal con respecto a fondo de las variantes de polipéptidos no luminiscentes 5P. La figura 56 proporciona un resumen de los resultados de luminiscencia. La figura 57 muestra la cantidad de lisado total y fracción soluble en cada variante de polipéptido no luminiscente 5P.
Ejemplo 34
Comparación de la variante de polipéptido no luminiscente 5P e I107L
La figura 58 muestra la cantidad de lisado total y fracción soluble de 5P e I107L (A), la luminiscencia generada por 5P o I107L sin péptido no luminiscente o con NLpep78 o NLpep79 (B) y la señal con respecto a fondo mejorada de I107L sobre 5P (C).
Ejemplo 35
Generación de mutantes de polipéptidos no luminiscentes 5P
Las mutaciones identificadas en un cribado de mutaciones aleatorias en la variante de polipéptido no luminiscente 5P se generaron tal como se describió previamente. Cada colonia de mutantes de polipéptidos no luminiscentes 5P se inoculó en 200 pl de medio mínimo y se incubó con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 pl del cultivo a 190 pl de medio mínimo recién preparado y se incubaron de nuevo con agitación a 37°C durante 20 horas. Luego se añadieron 10 pl del segundo cultivo a 190 pl de medio de autoinducción (medio mínimo glucosa al 5% ramnosa al 2%) y se incubaron con agitación a 25°C durante 18 horas para permitir la expresión del mutante de polipéptido no luminiscente. Se añadieron 10 pl del cultivo de expresión de mutantes de polipéptidos no luminiscentes 5P a 40 pl de tampón de lisis de ensayo que contenía NLpep78-HT (dilución 1:386) o NLpep79-HT (dilución 1:1000) y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 50 pl de tampón de ensayo NanoGlo que contenía coelenterazina 100 uM y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 segundos. Las figuras 59-62A muestran la luminiscencia de fondo, mientras que las figuras 59-62B y C muestran la luminiscencia generada después de la complementación con NLpep78 o NLpep79.
Ejemplo 36
Afinidad de unión entre la variante de polipéptido no luminiscente alargada y el péptido no luminiscente delecionado Se determinó la afinidad de unión entre una variante de polipéptido no luminiscente alargada, es decir, que contiene aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal, y un péptido no luminiscente delecionado, es decir, aminoácidos delecionados en el extremo N-terminal.
Los lisados de E. coli que expresan el polipéptido no luminiscente 5P/+V/+VT/+VTG preparado tal como se describió previamente se diluyeron 1:2000 en PBS Prionex al 0,1%. Se incubaron 25 pl de lisado diluido con 25 pl de NLpep78, NLpep80, NLpep81 o NLpep82 (diluido 0-500 nM en tampón de dilución) durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadieron a cada muestra 50 pl de furimazina diluida hasta 1X con tampón de ensayo NanoGlo y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 63 demuestra la afinidad de unión entre NLpoly con aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal con NLpep con aminoácidos delecionados del extremo N-terminal.
Ejemplo 37
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente expresado en E. coli y el péptido no luminiscente sintético Se prepararon lisados en LB de polipéptido no luminiscente y se diluyeron 1:100 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon diluciones 2X de NLpep78 sintético en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 pl de lisado de polipéptido no luminiscente diluido con 25 pl de cada dilución de péptido no luminiscente y se incubaron 3 minutos a temperatura ambiental. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo, se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+. La figura 64 muestra los valores de Kd calculados usando la unión específica de un sitio.
Ejemplo 38
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente 5P expresado en células de mamífero y NLpep80 o NLpep87 Los lisados de células CHO, HEK293T o HeLa que expresan NLpoly 5P se diluyeron 1:1000 en tampón de dilución (PBS Prionex al 0,1%). Se incubaron 25 pl de lisado diluido con 25 pl de NLpep80/87 (diluido 0-5 pM en tampón de dilución) durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadieron a cada pocillo 50 pl de furimazina (diluida hasta 1X con tampón NanoGlo) y se incubó la placa durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s (figura 65).
Ejemplo 39
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente 5P expresado en E. coli y NLpep80 o NLpep87
Los lisados de E. coli que expresan NLpoly 5P se diluyeron 1:2000 en tampón de dilución (PBS Prionex al 0,1%). Se incubaron 25 pl de lisado diluido con 25 pl de NLpep80/87 (diluido 0-5 pM en tampón de dilución) durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadieron a cada pocillo 50 pl de furimazina (diluida hasta 1X con tampón NanoGlo) y se incubó la placa durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s (figura 66).
Ejemplo 40
Complementación entre un polipéptido no luminiscente delecionado y un péptido no luminiscente alargado
Se realizó la complementación entre un polipéptido no luminiscente delecionado, es decir, aminoácidos delecionados del extremo C-terminal, y un péptido no luminiscente alargado, es decir, aminoácidos añadidos al extremo N-terminal. Se prepararon lisados clarificados de E. coli de NLpep-HT tal como se describió previamente en el ejemplo 6. La cantidad de NLpep-HT se cuantificó mediante la fusión HaloTag. Brevemente, se mezclaron 10 pl de lisado clarificado con 10 pl de ligando HaloTag-TMR (diluido 1:100) y 80 pl de agua y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 33,3 pl de tampón de carga SDS 4x y se incubaron a 95°C durante 5 minutos. Se cargaron 15 pl en un gel de SDS-PAGE y se obtuvieron imágenes en un dispositivo Typhoon. Basándose en las intensidades del gel de SDS-PAGE, los péptidos no luminiscentes se diluyeron en PBS péptidos no luminiscentes con Prionex al 0,1% para obtener concentraciones equivalentes. Luego, los lisados de polipéptidos no luminiscentes se diluyeron 1:100 en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 pl de polipéptido no luminiscente diluido y 20 pl de péptido no luminiscente diluido y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax usando una integración de 0,5 segundos. La figura 67 demuestra la luminiscencia de NLpoly con aminoácidos delecionados del extremo C-terminal con NLpep con aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal.
Ejemplo 41
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente 5P expresado en células HeLa y NLpep78 o NLpep78 truncado (NLpep80-87)
Se preparó lisado de polipéptido no luminiscente 5P a partir de células HeLa tal como se describió previamente y se preparó diluido 1:10 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x (intervalo determinado en el experimento de titulación preliminar) de péptido no luminiscente (péptido sintético; por Peptide 2.0 (Virginia); preparado a una escala de 5, 10 ó 20 mg; bloqueado en los extremos por acetilación y amidación, y verificado por análisis del contenido neto de péptidos) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 pl de polipéptido no luminiscente 5P y 20 pl de péptido no luminiscente y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 68 demuestra la afinidad de unión y la luminiscencia correspondiente entre 5P y versiones truncadas de NLpep78. La afinidad de unión aumenta cuando se deleciona 1 aminoácido del extremo N-terminal, del extremo C-terminal, o 1 aminoácido de cada extremo terminal. La deleción de más de 1 aminoácido de cualquiera de los extremos terminales reduce la afinidad, pero no siempre reduce la Vmáx en la misma medida.
Ejemplo 42
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente alargado y el péptido no luminiscente truncado
Se determinó la afinidad de unión entre un polipéptido no luminiscente alargado, es decir, uno con 2 aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal, y un péptido no luminiscente truncado, es decir, uno con 2 aminoácidos delecionados del extremo N-terminal (NLpep81).
El lisado de polipéptido no luminiscente se preparó tal como se describió previamente y se preparó diluido 1:100 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon diluciones 2x de NLpep81 (péptido sintético; por Peptide 2.0 (Virginia); preparado a una escala de 5, 10 ó 20 mg; bloqueado en los extremos por acetilación y amidación, y verificado por análisis del contenido neto de péptidos) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 pl de polipéptido no luminiscente y 25 pl de cada dilución de péptido no luminiscente y se agitaron a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 69 muestra los valores de Kd calculados usando la unión específica de un sitio.
Ejemplo 43
Afinidad de unión entre el polipéptido no luminiscente alargado y el péptido no luminiscente truncado
Se determinó la afinidad de unión entre un polipéptido no luminiscente alargado, es decir, uno con 3 aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal, y un péptido no luminiscente truncado, es decir, uno con 3 aminoácidos delecionados del extremo N-terminal (NLpep82).
Se preparó lisado de polipéptido no luminiscente y se preparó diluido 1:100 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon diluciones 2x de NLpep82 (péptido sintético; por Peptide 2.0 (Virginia); preparado a una escala de 5, 10 ó 20 mg; bloqueado en los extremos por acetilación y amidación, y verificado por análisis del contenido neto de péptidos) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 pl de polipéptido no luminiscente y 25 pl de cada dilución de péptido no luminiscente y se agitaron a temperatura ambiente durante 3 minutos. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 70 muestra los valores de Kd calculados derivados usando la unión específica de un sitio.
Ejemplo 44
Afinidad de unión entre clones de polipéptidos no luminiscentes expresados en E. coli y NLpep78 sintético
Las variantes de polipéptidos no luminiscentes se cultivaron en medio mínimo M9. Se inocularon colonias individuales y se cultivaron durante la noche a 37°C. Las muestras se diluyeron 1:20 en medio mínimo M9 y se cultivaron durante la noche a 37°C. Las muestras se diluyeron 1:20 nuevamente en medio de inducción M9 y se cultivaron durante la noche a 25°C. Se agruparon las muestras y se lisaron 100 pl de las células agrupadas con 400 pl de tampón de lisis PLB y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los lisados se diluyeron 1:100 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon diluciones 2X de NLpep78 sintético en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 pl de dilución de polipéptido no luminiscente con 25 pl de cada dilución de péptido no luminiscente y se incubaron durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo, se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+. La figura 71 muestra los valores de Kd calculados derivados usando la unión específica de un sitio.
Ejemplo 45
Determinación del efecto de mutaciones sobre la Km
Usando lisados agrupados diluidos del ejemplo 11, se mezclaron 25 pl de lisado diluido de polipéptido no luminiscente (1:100 en PBS Prionex al 0,1%) con 25 pl de NLpep78 500 nM para cada muestra y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se prepararon diluciones 2X de furimazina en tampón de ensayo de luciferasa NanoGlo, y se mezclaron 50 pl de péptido no luminiscente y muestra de polipéptido no luminiscente con 50 pl de diluciones de NanoGlo/furimazina. Se midió la luminiscencia después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente. La figura 72 muestra la Km calculada derivada usando Michaelis-Menten.
Ejemplo 46
Demostración de una complementación de tres componentes.
Se demuestra una complementación terciaria usando 2 NLpep y polipéptido no luminiscente NLpoly 5P. Se prepararon lisados de NLpoly 5P-B9 (5P con los residuos 147-157 delecionados) y NLpep B9-HT (Met residuos 147-157 fusionados con el extremo N-terminal de HT7).
A) Titulación de NLpoly 5P-B9 NLpoly B9 con NLpep78
Se tituló NLpoly 5P-B9 NLpoly B9 con NLpep78. Se mezclaron 20 pl de 5P-B9 (sin diluir) con 20 pl de péptido B9-HT (sin diluir). Se prepararon diluciones de NLpep78 (péptido sintético, concentración más alta = 100 uM) en PBS Prionex al 0,1%. Se añadieron 20 pl de NLpep78 a 40 pl de la mezcla 5P-B9 péptido B9-HT y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 60 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s.
B) Titulación de NLpoly 5P-B9 NLpep78 con NLpepB9-HT
Se mezclaron 20 pl de NLpoly 5P-B9 (sin diluir) con 20 pl de NLpep78 (100 uM). Se prepararon diluciones de péptido B9-HT (concentración más alta = sin diluir) en PBS Prionex al 0,1%. Se añadieron 20 pl de péptido B9-HT a 40 pl de la mezcla 5P-B9 NLpep78 y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 60 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s.
La figura 73 demuestra la viabilidad de un sistema ternario que consiste en 2 NLpep diferentes y un NLpoly truncado. Dado que ninguno de los 3 componentes es luminiscente sin los otros 2, este sistema puede configurarse de manera que cada NLpep se fusione (sintéticamente o mediante ingeniería genética) a un resto de unión y el NLpoly truncado se use en altas concentraciones para producir luz sólo en presencia de una interacción entre los restos de unión, o de manera que cada uno de los 3 componentes se fusione con los restos de unión para producir luz sólo en el caso de formación de un complejo ternario.
Ejemplo 47
Complementación con NLpep88 (NLpep78 con Gly como 6° residuo en lugar de Arg)
Los lisados clarificados de E. coli de 5P y NLpep88-HT se prepararon tal como se describió previamente. Se prepararon diluciones en serie de lisado de NLpep88-HT en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 pl de lisado de 5P y 20 pl de lisado de NLpep88-HT y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 40 pl de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax con integración de 0,5 s. La figura 74 demuestra la importancia del residuo de arginina en la 6a posición de NLpep. Si bien no hay un aumento en la luminiscencia por encima de 5P solo a concentraciones más bajas de NLpep88, las concentraciones altas de NLpep aumentaron la luminiscencia, lo que sugiere un complejo catalíticamente comprometido y no una falta de interacción entre 5P y NLpep88.
Ejemplo 48
Localización subcelular de NLpep78 y 79 como fusiones N-terminales a HaloTag.
Se sembraron en placa células U2OS y se dejó que se recuperaran durante la noche a 37°C. Luego se transfectaron las células con el constructo de ADN HaloTag solo o los constructos de ADN de péptido HaloTag-NanoLuc (todos bajo el control del promotor de CMV): P1-HT, P78-HT o P79-HT diluidos 1:10 con ADN portador (pSI) usando FuGENE HD y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Luego se marcaron las células con el ligando HaloTag-TMR mediante el protocolo de marcaje rápido convencional del fabricante y se obtuvieron imágenes. La figura 75 demuestra que NLpep78 y 79 no alteran la localización intracelular de la proteína HaloTag.
Ejemplo 49
Localización subcelular de polipéptido no luminiscente (WT y 5P)
Se sembraron en placa células U2OS y se dejó que se recuperaran durante la noche a 37°C. Las células se mantuvieron o bien como controles sin transfección o bien transfectadas con constructos de ADN de NanoLuc: FL, NLpoly (wt) o NLpoly(5P) diluidos 1:10 con ADN portador (pSI) usando FuGENE HD e incubadas durante 24 horas a temperatura ambiente. Las células se fijaron y posteriormente se procesaron para ICC. La ICC se realizó usando un anticuerpo primario 1:5000 GS (PRO) durante la noche a 4°C, seguido de un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo marcado con Alexa488. La figura 76 demuestra que tanto NLpoly WT como NLpoly 5P se localizan uniformemente en las células.
Ejemplo 50
Demostración de que el polipéptido no luminiscente puede detectar fácil y rápidamente el péptido no luminiscente conjugado con una proteína de interés.
Se mezclaron 99 pl de lisado clarificado de E. coli de NLpep53-HT con 24,75 pl de tampón de carga SDS 4x. Se prepararon diluciones en serie 1:10 de la mezcla lisado-tampón de carga y se incubaron a 95°C durante 5 minutos. Se cargaron 15 pl en un gel de SDS-PAGE. Después de completarse el gel, se transfirió a PVDF usando iBlot y se lavó con 10 ml de lisado clarificado de E. coli de NLpoly L149M a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se colocó la membrana en un dispositivo de obtención de imágenes LAS4000 y se añadieron 2 ml de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo®. Se tomó una exposición de 60 segundos (figura 77).
Ejemplo 51
Saturación del sitio en las posiciones de polipéptido no luminiscente 31, 46, 108, 144 y 157 en el contexto de 5P Se construyeron variantes de un solo cambio de aminoácido en NLpoly 5P (fondo del vector pF4Ag) en los sitios según la tabla 5 a continuación. En efecto, el residuo nativo se varió con respecto a cada uno de los 19 aminoácidos alternativos para un total de 95 variantes.
Tabla 5
Posición 31 Posición 46 Posición 108 Posición 144 Posición 157
B1 Ala E3 Ala H5 Ala C8 Ala F10 Ala
C1 Cys F3 Cys A6 Cys D8 Cys G10 Cys
D1 Asp G3 Asp B6 Asp E8 Asp H10 Asp
E1 Glu H3 Glu C6 Glu F8 Glu A11 Glu
F1 Gly A4 Phe D6 Phe G8 Phe B11 Phe
G1 His B4 Gly E6 Gly H8 Gly C11 Gly
H1 Ile C4 His F6 His A9 His D11 His
A2 Lys D4 Ile G6 Ile B9 Ile E11 Ile
B2 Leu E4 Lys H6 Lys C9 Lys F11 Lys
C2 Met F4 Met A7 Leu D9 Leu G11 Leu
D2 Asn G4 Asn B7 Met E9 Met H11 Met
E2 Pro H4 Pro C7 Pro F9 Asn A12 Asn
F2 Gln A5 Gln D7 Gln G9 Pro B12 Gln
G2 Arg B5 Arg E7 Arg H9 Gln C12 Arg
H2 Ser C5 Ser F7 Ser A10 Arg D12 Ser
A3 Thr D5 Thr G7 Thr B10 Ser E12 Thr
B3 Val E5 Val H7 Val C10 Val F12 Val
C3 Trp F5 Trp A8 Trp D10 Trp G12 Trp
D3 Tyr G5 Tyr B8 Tyr E10 Tyr H12 Tyr
Las colonias individuales se cultivaron en LB+amp y se incubaron durante la noche a 30°C. También se incluyó un control de 5P. Los cultivos durante la noche se usaron para inocular LB+amp recién preparado (1:100), y estos cultivos crecieron durante 2 horas 45 minutos a 37°C. Se añadió ramnosa al 0,2%, y los cultivos se dejaron cultivar/inducir durante la noche a 25°C. Después de 18 horas de inducción, se lisaron las células usando FastBreak 0,5X (30 min a temperatura ambiental), se ultracongelaron en hielo seco y se almacenaron a -20°C. Tras una descongelación rápida, las muestras se analizaron en ausencia y presencia de Pep87 (también conocido como NLpep87).
Para las reacciones del péptido (-), se incubaron 30 ul de lisado con 30 ul de PBS pH 7,5 durante 10 min y luego se añadieron 60 ul de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo® (Promega Corporation). Después de 5 minutos, se midió la luminiscencia. Para las reacciones del péptido (+), se incubaron 30 ul de lisado con 30 ul de Pep87 8 nM. Después de 10 min, se añadieron 60 ul de reactivo de ensayo de luciferasa NanoGlo® y se midió la luminiscencia a los 5 minutos.
Los datos de luminiscencia (RLU) para las muestras de péptidos (-) se normalizaron con respecto a las lecturas del control de 5P, y estos resultados se presentan en la figura 78. Los datos de luminiscencia (RLU) para las muestras de péptidos (+) también se normalizaron con respecto a 5P, pero luego también se normalizaron con respecto a los valores de la figura 76 para representar la señal con respecto a fondo (S/F; figura 79).
Ejemplo 52
Uso de la alta afinidad entre NLpoly y NLpep para la purificación/co-inmunoprecipitación de proteínas
Se equilibraron perlas MAGNEHALOTAG (Promega Corporation; G728A) tal como sigue: a) se colocó 1 ml de perlas en un imán durante ~30 segundos y se retiró el tampón; b) las perlas se retiraron del imán, se resuspendieron en 1 ml de PBS Prionex al 0,1% y se agitaron durante 5 minutos a TA; y c) las etapas a) y b) se repitieron dos veces más, se unió NLpep78-HaloTag (lisado clarificado de E. coli ) a perlas MAGNEHALOTAG resuspendiendo las perlas en 1 ml de lisado clarificado de NLpep78-HT, agitando durante 1 h a TA y colocándolas en el imán durante ~ 30 s. Se retiró el lisado (fracción no retenida) y se guardó para su análisis. NLpoly 8S (lisado clarificado de E. coli ) se unió a las perlas MagneHaloTag unidas a NLpep78 de la etapa anterior resuspendiendo las perlas en 1,5 ml de lisado de 8S, agitando durante 1 h a TA y colocándolas en un imán durante ~ 30 segundos. Se retiró el lisado (fracción no retenida) y se guardó para su análisis. Las perlas se resuspendieron en 1 ml de PBS Prionex al 0,1%, se agitaron durante 5 min a TA, se colocaron en un imán durante ~30 segundos y se retiró el PBS (lavado). Las perlas se lavaron tres veces más.
Para eluir el péptido/polipéptido unido, las perlas se resuspendieron en 500 ul de tampón SDS 1x y se agitaron durante 5 minutos a TA. Luego, las perlas se colocaron en un imán durante ~ 30 segundos; se retiró el tampón SDS (elución) y se guardó para su análisis. La elución se repitió una vez más.
Luego se analizaron las muestras mediante gel. Se mezclaron 37,5 ul de muestra (excepto las eluciones) con 12,5 ul de tampón SDS 4x y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 5 ul en un gel de Tris-glicina al 4-20% Novex y se desarrollaron a ~180 V durante ~50 min. Se tiñó el gel con SimplyBlue Safe Stain y se obtuvieron imágenes en un dispositivo de obtención de imágenes LAS4000.
La figura 94 ilustra que la afinidad de NLpoly y NLpep es suficiente para permitir la purificación a partir de un lisado de E. coli. Como NLpoly 8S se purificó a partir de un lisado de E. coli, es razonable esperar que una proteína fusionada con NLpoly 8S (u otra variante descrita en el presente documento) también pueda purificarse de manera similar. Mientras que en este ejemplo se inmovilizó el NLpep y se usó para purificar el NLpoly, también es razonable esperar un resultado similar si se inmovilizara el NLpoly.
Ejemplo 53
Cinética de la unión NLpoly/NLpep
Se prepararon concentraciones 2x de NLpep sintético y se diluyeron 2,7 veces nueve veces (10 concentraciones) en PBS Prionex al 0,1%. Las concentraciones finales usadas en el ensayo fueron 30 uM-3,9 nM. NLpoly WT (lisado clarificado de E. coli; 1:10.000) u 11S (1:10.000.000) se diluyó en NanoGlo+furimazina 100 uM (Fz). Se colocaron 50 ul de NLpep en pocillos de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos. Se inyectaron 50 ul de NLpoly/NanoGlo/Fz en los pocillos usando el inyector del instrumento GloMax® Multi+ y se midió la luminiscencia cada 3 segundos durante 5 minutos. Se encontró la kobs ajustando los datos a: Y = Ymáx (1 - e~ko b s t) usando Graphpad Prism. Luego se ajustaron kon y koff a: kobs = [NLpep]kon + koff. La figura 95 ilustra las constantes de velocidad de asociación y disociación para la unión entre NLpoly y NLpep.
Ejemplo 54
Afinidad del sustrato NLpoly/NLpep
Se diluyó NLpoly en PBS Prionex al 0,1% tal como sigue: WT a 1:105, 5P a 1:107 y 11S a 1:108. Se diluyó NLpep en PBS Prionex al 0,1% tal como sigue: 30 uM para estudios con NLpoly WT o 3 uM para estudios con NLpoly 5P y 11S. Se incubaron 50 ul de NLpoly/NLpep a TA durante 5 min, se añadieron 50 ul de NanoGlo Fz (en un intervalo desde 100 uM hasta 1,2 uM, 2X) y se incubaron durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax® Multi+ con integración de 0,5 segundos. La Km se derivó usando Graphpad Prism, valores de mejor ajuste de Michaelis-Menton. La figura 96 ilustra los valores de Km para varios pares NLpoly/NLpep.
Ejemplo 55
Efecto del sustrato sobre la afinidad de NLpoly/NLpep
Se diluyó 11S (lisado clarificado de E. coli) en PBS Prionex al 0,1% a 1:107 El NLpep79 sintético se diluyó en serie (1:2) desde 800 nM hasta 0,39 nM (2X). Luego se mezclaron 20 ul de 11S 20 ul de NLpep79 y se incubaron durante 5 min a TA. Se añadieron 40 ul de NanoGlo 5 uM o 50 uM de Fz y se incubaron otros 5 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax® Multi+ con integración de 0,5 segundos. La Kd se derivó usando Graphpad prism, valor de unión específico de un sitio. La figura 97 ilustra que las concentraciones de saturación de furimazina aumentan la afinidad entre 11S y NLpep79.
Ejemplo 56
Km para NLpoly 5A2:NLpep
Se diluyó NLpoly 5A2 en PBS Prionex al 0,1% a 1:105. Se diluyó NLpep (WT, NLpep78 o NLpep79) en PBS Prionex al 0,1% hasta 30 uM. Se incubaron 50 ul de NLpoly/NLpep a TA durante 5 min. Se añadieron 50 ul de NanoGlo Fz (entre 100 uM y 1,2 uM, 2X) y se incubaron durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax® Multi+ con integración de 0,5 segundos. La Km se derivó usando Graphpad Prism, valores de mejor ajuste de Michaelis-Menton. La figura 98 ilustra los valores de Km para NLpoly5A2 y NLpep WT, 78 y 79.
Ejemplo 57
Luminiscencia de NLpoly sin NLpep
Se preparó lisado clarificado de E. coli tal como se describió previamente para NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S y 11S. Se mezclaron 50 ul de cada lisado y 50 ul de NanoGlo Fz y se incubaron durante 5 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax® Multi+ con integración de 0,5 segundos. La figura 99 ilustra que la capacidad del NLpoly para producir luminiscencia en ausencia de NLpep aumentó gradualmente a lo largo del proceso de evolución, lo que dio como resultado una luminiscencia ~500 veces mayor para 11S que para NLpoly WT.
Ejemplo 58
Luminiscencia mejorada en E. coli a lo largo del proceso de evolución
Se inoculó una sola colonia de NLpoly de WT, 5A2, 5P, 8S u 11S en 200 ul de medio mínimo y se cultivó durante 20 horas a 37°C en un agitador. Se diluyeron 10 ul del cultivo durante la noche en 190 ul de medio mínimo recién preparado y se cultivaron durante 20 horas a 37°C en un agitador. Se diluyeron 10 ul de este cultivo durante la noche en 190 ul de medio de autoinducción (descrito previamente) y se cultivaron durante 18 horas a 25°C en un agitador. Se diluyeron los cultivos autoinducidos 50 veces (4 ul en 196 ul de tampón de lisis de ensayo), se añadieron 10 ul de cultivo de expresión a 40 ul de tampón de lisis de ensayo que contenía NLpep (sintético; 1 nM; WT, NLpep78, NLpep79 o NLpep80) y se agitaron durante 10 minutos a TA. Se añadieron 50 ul de NanoGlo Fz y se agitaron las muestras durante 5 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 segundos. La figura 100 ilustra la mejora en la luminiscencia de NLpoly derivado de E. coli durante el transcurso del proceso de evolución, una mejora global de ~105 (desde NLpolyWT:NLpepWT hasta NLpoly11S:NLpep80).
Ejemplo 59
Luminiscencia mejorada en células HeLa a lo largo del proceso de evolución
Se transfectaron 50 ng de ADN plasmídico que expresa NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S u 11S en células HeLa en pocillos de una placa de 12 pocillos usando FugeneHD. Luego, se incubaron las células durante la noche a 37°C/el 5% de CO2. Se reemplazó el medio por 500 ul de DMEM sin rojo de fenol y se congelaron las células a -80°C durante >30 min. Se descongelaron las células y se transfirieron a tubos de 1,5 ml. Se diluyeron NLpep WT, NLpep78, NLpep79 o NLpep80 (sintético) hasta 10 nM en PBS Prionex al 0,1%, y se mezclaron 25 ul con 25 ul de cada uno de los lisados de células de NLpoly. Se agitaron las muestras durante 10 min a TA y luego se añadieron 50 ul de NanoGlo 100 uM de Fz y se incubaron durante 5 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 s. La figura 101 ilustra la mejora en la luminiscencia de NLpoly expresado por HeLa durante el transcurso del proceso de evolución, una mejora global de ~105 (desde NLpolyWT:NLpepWT hasta NLpoly11S:NLpep80).
Ejemplo 60
Luminiscencia mejorada en células HEK293 a lo largo del proceso de evolución
Se transfectaron 50 ng de ADN plasmídico que expresa NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S u 11S en células HEK293 en pocillos de una placa de 12 pocillos usando FugeneHD. Luego, se incubaron las células durante la noche a 37°C/el 5% de CO2. Se reemplazó el medio por 500 ul de DMEM sin rojo de fenol y se congelaron las células a -80°C durante >30 min. Se descongelaron las células y se transfirieron a tubos de 1,5 ml. Se diluyeron NLpep WT, NLpep78, NLpep79 o NLpep80 (sintético) hasta 10 nM en PBS Prionex al 0,1%, y se mezclaron 25 ul con 25 ul de cada uno de los lisados de células de NLpoly. Se agitaron las muestras durante 10 minutos a TA y luego se añadieron 50 ul de NanoGlo 100 uM de Fz y se incubaron durante 5 minutos a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 s. La figura 102 ilustra la mejora en la luminiscencia de NLpoly expresado por HEK293 durante el transcurso del proceso de evolución, una mejora global de ~104 (desde NLpolyWT:NLpepWT hasta NLpoly11S:NLpep80).
Ejemplo 61
Afinidad de unión mejorada a lo largo de la evolución
Se diluyeron NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S u 11S (lisados clarificados de E. coli) en PBS Prionex al 0,1% tal como sigue: WT 1:104; 5A2 1:105; 5P 1:106; 8S 1:107; y 11S 1:107. Se colocaron NLpepWT, NLpep78, NLpep79 o NLpep80 (sintético) en serie en PBS Prionex al 0,1% a una concentración 4X. Se mezclaron 25 ul de NLpoly y 25 ul de NLpep y se incubaron durante 10 minutos a TA. Se añadieron 50 ul de NanoGlo 100 uM de Fz y se incubaron durante 5 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+ con integración de 0,5 segundos. Se determinó la Kd usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de ajuste óptimo. La figura 103 ilustra una afinidad mejorada en 104 veces (afinidad inicial: NLpolyWT:NLpepWT, Kd~10 uM) de Kd<1 nM (NLpoly11S:NLpep86 o NLpoly11S:NLpep80) de las variantes sometidas a prueba con respecto al tipo natural.
Ejemplo 62
Luminiscencia de NLpoly
Se inocularon colonias de una sola variante de NLpoly con 200 ul de medio mínimo y se cultivaron durante 20 horas a 37°C en un agitador. Se diluyeron 10 ul del cultivo durante la noche en 190 ul de medio mínimo recién preparado y se cultivaron durante 20 horas a 37°C en un agitador. Luego se diluyeron 10 ul de este cultivo durante la noche en 190 ul de medio de autoinducción (descrito previamente) y se cultivaron durante 18 horas a 25°C en un agitador. Se mezclaron 10 ul de este cultivo de expresión con 40 ul de tampón de lisis de ensayo (descrito previamente) sin NLpep o NLpep78-HT (dilución 1:3860) o NLpep79-HT (dilución 1:10.000) y se agitaron durante 10 min a temperatura ambiente. Se añadieron 50 ul de NanoGlo Fz y se volvieron a agitar durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en luminómetro GloMax® con integración de 0,5 s. Las figuras 105-107 ilustran la luminiscencia de diversos NLpoly en ausencia de NLpep.
Ejemplo 63
Solubilidad de variantes de NLpoly
Se inoculó una colonia de una sola variante de NLpoly (véase la figura 143) en 5 ml de cultivo LB y se incubó a 37°C durante la noche con agitación. Se diluyó 1:100 el cultivo durante la noche en LB recién preparado y se incubó a 37°C durante 3 horas con agitación. Se añadió ramnosa al 0,2% a los cultivos y se incubó a 25°C durante la noche con agitación. Se mezclaron 900 ul de estos cultivos durante la noche con 100 ul de tampón de lisis FastBreak 10X (Promega Corporation) y se incubaron durante 15 min a TA. Se extrajo una alícuota de 75 ul (total) de cada cultivo y se guardó para su análisis. Se centrifugó el cultivo restante de cada muestra a 14.000 x rpm en una microcentrífuga de sobremesa a 4°C durante 15 min. Se extrajo una alícuota de 75 ul de sobrenadante (soluble) de cada muestra y se guardó para su análisis. Se añadieron 25 ul de tampón SDS 4x a las alícuotas guardadas y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 5 ul de cada muestra en un gel de Tris-glicina-SDS al 4-20% y se desarrollaron a ~190 V durante ~50 min. Se tiñó el gel con SimplyBlue Safe Stain y se obtuvieron imágenes en un dispositivo LAS4000. La figura 143 muestra un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para las variantes de NLpoly.
Ejemplo 64
Constantes de disociación
El lisado de variante de NLpoly (véase la figura 144; preparado tal como se describió previamente) se diluyó 1:10 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x de NLpep78 (NLpep78 sintético) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 ul de lisado de variante de NLpoly y 20 ul de NLpep y se agitaron durante 10 minutos a TA. Se añadieron 40 ul de NanoGlo/Fz y se agitaron durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax® con integración de 0,5 s. Se determinó la Kd usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de mejor ajuste. La figura 144 ilustra las constantes de disociación de NLpep78 con diversos NLpoly.
Ejemplo 65
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con 1 pg de pF4A Ag FKBP o 1 pg de vectores pF4A Ag FRB que expresan fusiones N-terminales o C-terminales de NLpoly5P y/o NLpep80/87 usando FuGENE HD a una razón de a Dn con respecto a FuGENE HD de 1:4. 24 horas tras la transfección, las células se tripsinizaron y volvieron a sembrarse en placas de ensayo opacas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo. 24 horas después de la siembra en placa, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron con o sin rapamicina 20 nM durante 15, 60 ó 120 min en OptiMEMI sin rojo de fenol. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM con o sin rapamicina 20 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Las figuras 108 (inducción de 15 min), 109 (inducción de 60 min) y 110 (inducción de 120 min) ilustran un aumento general de la inducción a lo largo del tiempo, con las combinaciones NLpoly5P y NLpep80 generando la mayor luminiscencia. Los componentes individuales contribuyen mínimamente a la señal.
Ejemplo 66
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly5P y NLpep80/87
Aunque similar al ejemplo 65, este ejemplo sometió a prueba las 8 combinaciones posibles de FRB y FKBP fusionadas con NLpoly/NLpep y también usó menos ADN total. Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 0,001 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y 0,001 pg de pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 usando FuGENE HD a una razón de a Dn con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con rapamicina 0 ó 50 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 111 ilustra que las combinaciones de NLpep80 generaron la mayor luminiscencia y que todas las configuraciones respondieron al tratamiento con rapamicina.
Ejemplo 67
Comparación de la luminiscencia generada por fusiones de FRB o FKBP expresadas en ausencia de pareja de unión
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 0,001 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P o pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 usando FuGe Ne HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con p Bs y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con rapamicina 0 ó 50 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 112 ilustra que los componentes individuales generan un bajo nivel basal de luminiscencia que no responde al tratamiento con rapamicina.
Ejemplo 68
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 2, 0,2, 0,02 ó 0,002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y pF4A Ag FKBP-NLpep80 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 2 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 20 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 20 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 113 ilustra que la transfección con menos ADN disminuye la luminiscencia general pero aumenta la inducción en veces.
Ejemplo 69
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P o FKBP-NLpep80/87 en ausencia de pareja de unión
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 2, 0,2, 0,02 ó 0,002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P o pF4A Ag FKBP-NLpep80 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 2 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 20 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 20 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 114 ilustra que menores niveles de ADN no cambian la luminiscencia general de las células transfectadas con componentes individuales.
Ejemplo 70
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 0,2, 0,02, 0,002 ó 0,0002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 2 pg.
24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 115 ilustra que pueden lograrse una luminiscencia por encima del fondo, tal como se determina en los ejemplos 69 y 71, y la inducción de rapamicina con niveles de ADN de hasta 2,5 pg.
Ejemplo 71
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P o FKBP-NLpep80/87 en ausencia de pareja de unión
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 0,2, 0,02, 0,002 ó 0,0002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P o pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 2 pg.
24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 116 ilustra que no se produjo ningún cambio significativo en la luminiscencia generada por los componentes individuales cuando se usó menos ADN.
Ejemplo 72
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con cantidades variables de ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80 o FKBP-NLpep87 después del tratamiento con rapamicina durante diferentes periodos de tiempo
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 2, 0,2, 0,02 ó 0,002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y pF4A Ag FKBP-NLpep80 o FKBP-NLpep87 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 2 pg.
24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 20 nM durante 5/15/30/60/120 min. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 20 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Las figuras 117 y 118 ilustran una disminución en la luminiscencia con menos ADN y un aumento en la inducción de rapamicina a lo largo del tiempo.
Ejemplo 73
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5P o FRB-NLpoly5A2 con FKBP-NLpep80/87/95/96/97
En este ejemplo, el ensayo se realizó en un formato tanto de dos como de tres días. Para el ensayo de 2 días, se transfectaron inversamente 20.000 células HEK293T en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly5P o FRB-NLpoly5A2 y pF4A Ag FKBP-NLpep80/87/95/96/97 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s.
Para el ensayo de 3 días, se transfectaron inversamente 400.000 células HEK293T con un total de 0,002 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y pF4A Ag FKBP-NLpep80/87/95/96/97 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Las figuras 119 y 120 ilustran niveles similares de luminiscencia en los ensayos de 2 y 3 días. Los ensayos realizados con NLpoly5A2 mostraron una mayor inducción de rapamicina en relación con NLpoly5P, y los ensayos realizados con NLpoly5A2 y NLpep96 mostraron la mayor inducción de rapamicina de todas las combinaciones sometidas a prueba.
Ejemplo 73
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5A2 o FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep101/104/105/106/107/108/109/110
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly5A2/11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101/104/105/106/107/108/109/110 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 121 ilustra que, de las combinaciones sometidas a prueba, NLpoly11S con NLpep101 mostró la mayor inducción de rapamicina y una de las señales luminiscentes específicas de rapamicina más fuertes.
Ejemplo 74
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes combinaciones de FRB-NLpoly5A2 o FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep87/96/98/99/100/101/102/103
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly5A2/11S y pF4A Ag FKBP-NLpep87/96/98/99/100/101/102/103 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 122 ilustra que la combinación de NLpoly11S y NLpep101 produce la mayor inducción al tiempo que mantiene altos niveles de luminiscencia específica.
Ejemplo 75
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes niveles de ADN de FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep87/101/102/107
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,01, 0,1, 1 ó 10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep87/101/102/107 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 123 ilustra que NLpoly11S con NLpep101 produce la luminiscencia más baja en general en muestras sin tratar en todos los niveles de ADN sometidos a prueba, y la combinación mantiene niveles relativamente altos de luminiscencia en muestras tratadas con rapamicina.
Ejemplo 76
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes niveles de ADN de FRB-NLpoly5A2 y FKBP-NLpep87/101/102/107
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,01, 0,1, 1 ó 10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly5A2 y pF4A Ag FKBP-NLpep87/101/102/107 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocilio el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 124 ilustra que NLpoly5A2 genera mayor luminiscencia en muestras sin tratar que NLpoly11S mostrado en el ejemplo 75.
Ejemplo 77
Curva de respuesta a la dosis de rapamicina que muestra la luminiscencia de las células que expresan ADN de FRB-NLpoly5P y FKBP-NLpep80/87
Se transfectaron inversamente células HEK293T (400.000) con un total de 0,001 pg de pF4A Ag FRB-NLpoly5P y 0,001 pg de pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 10.000 células en placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas adicionales. Se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina de 0 a 500 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con rapamicina de 0 a 500 nM en OptiMEM y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Se calculó la Kd con GraphPad Prism versión 5.00 para Windows. La figura 125 ilustra un aumento en la luminiscencia específico de rapamicina.
Ejemplo 78
Curva de respuesta a la dosis de rapamicina que muestra la luminiscencia de las células que expresan ADN de FRB-NLpoly5A2 y FKBP-NLpep87/101
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly5A2/11S y pF4A Ag FKBP-NLpep87/101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina de 0 a 1 pM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final en células) con rapamicina de 0 a 1 pM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 126 ilustra una respuesta a la dosis de rapamicina sigmoidea con combinaciones de NLpoly5A2/NLpep101 y NLpoly11S/NLpep101. Mientras que las combinaciones con NLpep87 muestran un aumento de la luminiscencia con rapamicina, los puntos de datos recopilados se desvían más de la curva sigmoidea.
Ejemplo 79
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan FRB-11S y FKBP-101 y tratadas con el sustrato PBI-4377 o furimazina
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1/1/10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina o PBI-4377 10 pM (concentración final en las células) con rapamicina de 0 a 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 127 ilustra una disminución en la luminiscencia y la inducción en veces con el sustrato PBI-4377 en comparación con el sustrato furimazina.
Ejemplo 80
Evolución temporal de células que expresan FRB-NLpoly11S/5A2 y FKBP-NLpep87/101 realizada en presencia o ausencia de rapamicina
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S/5A2 y pF4A Ag FKBP-NLpep87/101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM y furimazina 10 pM, manualmente o mediante inyección instrumental. Se midió inmediatamente la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Las figuras 128 y 129 ilustran que, de todas las combinaciones sometidas a prueba, NLpoly11S con NLpep101 tiene la luminiscencia más baja a tiempo 0, alcanza una meseta luminiscente más rápido y tiene el intervalo dinámico más grande.
Ejemplo 81
Luminiscencia generada por FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 medida en dos instrumentos diferentes
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM durante 20 min. Se añadió furimazina 10 pM (concentración final en células) en OptiMEMI con rapamicina 0 ó 50 nM y se incubó durante 5 min adicionales. Se midió inmediatamente la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s y en el dispositivo Varioskan Flash con filtro de paso de banda de 450 nM. La figura 130 ilustra que la inducción específica de rapamicina de FRB-NLpoly11S y f Kb P-NLpep101 puede medirse en diferentes instrumentos.
Ejemplo 82
Imágenes que muestran la luminiscencia de células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 en diversos momentos después del tratamiento con rapamicina
Se transfectaron inversamente células HeLa (500.000) con 1 pg de pF4 Ag FRB-NLpoly11S y 1 pg de pF4 Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se transfectaron las células en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek #p35gc-1.5-14-C). 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron con furimazina 10 pM en OptiMEM durante 5 min. Se añadió a las células rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se adquirieron imágenes de luminiscencia con el dispositivo LV200 a intervalos de 10 s durante un total de 20 min. El instrumento estaba a 37°C, el objetivo era 60X, la ganancia era 200 y la exposición era 600 ms. La figura 131 ilustra que la obtención de imágenes puede detectar un aumento en la luminiscencia celular en células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 después del tratamiento con rapamicina.
Ejemplo 83
Cuantificación de la señal generada por células individuales que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 en diversos momentos después del tratamiento con rapamicina
Se transfectaron inversamente células HeLa (500.000) con 1 pg de pF4 Ag FRB-NLpoly11S y 1 pg de pF4 Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se transfectaron las células en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek #p35gc-1.5-14-C). 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron con furimazina 10 pM en OptiMEM durante 5 min. Se añadió a las células rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se adquirieron imágenes de luminiscencia con el dispositivo LV200 a intervalos de 10 s durante un total de 20 min. El instrumento estaba a 37°C, el objetivo era 60X, la ganancia era 200 y la exposición era 600 ms. La intensidad de la señal de cada célula en el campo de visión se analizó con el software Image J durante todo el periodo de tiempo. La figura 132 ilustra que puede medirse la señal generada por células individuales y que el aumento en la señal de cada célula es paralelo al aumento observado en el ensayo de placa de 96 pocillos mostrado en las figuras 128 y 129.
Ejemplo 84
Comparación de la luminiscencia en diferentes líneas celulares que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101
Se transfectaron inversamente células HEK293T, HeLa o U2-OS (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió A d N de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 50 nM durante 20 min. Se añadió furimazina 10 pM (concentración final en células) en OptiMEMI con rapamicina 0 ó 50 nM y se incubó durante 5 min adicionales. Se midió inmediatamente la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 133 ilustra niveles similares de luminiscencia generados en ausencia y presencia de rapamicina en tres líneas celulares diferentes transfectadas con FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101.
Ejemplo 85
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 después del tratamiento con el inhibidor competitivo de rapamicina FK506
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 |ig. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 20 nM durante 20 min. Se añadió el inhibidor FK506 en OptiMEM a la célula a una concentración final de 5 |iM y se incubó durante 3 ó 5 horas. Se añadió furimazina en OptiMEM a las células para una concentración final de 10 |iM en las células. Se midió inmediatamente la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 134 ilustra una disminución en la luminiscencia inducida por rapamicina después del tratamiento con el inhibidor competitivo FK506.
Ejemplo 86
Luminiscencia generada por células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep101 después del tratamiento con el inhibidor competitivo de rapamicina FK506
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 |ig. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 0 ó 20 nM durante 2,5 horas. Se añadió el inhibidor FK506 en OptiMEM a la célula mediante un inyector a una concentración final de 0, 1 ó 10 |iM en OptiMEM con 10 |iM. Se midió la luminiscencia cada 10 min durante 4 horas en un dispositivo GloMax Multi ajustado a 37°C con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 135 ilustra que en 200 s, el inhibidor FK506 puede reducir la luminiscencia hasta niveles próximos a los de las células sin tratar.
Ejemplo 87
Luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes combinaciones de V2R-NLpoly5A2 o V2R-NLpoly11S con NLpep87/101-ARRB2 en presencia o ausencia del agonista de V2R AVP
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1, 1 ó 10 ng de pF4A Ag V2R-NLpoly11S y pF4A Ag ARRB2-NLpep87/101 usando FuGe Ne HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 |ig. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con AVP 0 ó 1 |iM y furimazina 10 |iM durante 25 min. Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 136 ilustra que V2R-NLpoly11S con NLpep101 genera el mayor aumento en la luminiscencia específico de AVP. Las combinaciones con NLpep87 no muestran una respuesta significativa a AVP.
Ejemplo 88
Evolución temporal que muestra la luminiscencia generada por células transfectadas con V2R-NLpoly5A2 o V2R-NLpoly11S y NLpep87/101-ARRB2 después del tratamiento con AVP
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ó 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoly11S o 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoly5A2 y pF4A Ag ARRB2-NLpep87/101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 |ig. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con AVP 0 ó 1 |iM y furimazina 10 |iM, manualmente (figura 137) o mediante inyección instrumental (figura 138). Luego se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi cada 5 min durante 25 min con un tiempo de integración de 0,5 s a temperatura ambiente (figuras 137 y 138) o 37°C (figura 139). Las figuras 137 y 138 ilustran un aumento dependiente del tiempo en la luminiscencia inducida por AVP para V2R-NLpoly11S con NLpep101-ARRB2 que comienza a alcanzar su máximo a los 600 s. Las combinaciones con V2R-NLpoly5A2 y NLpep87 no muestran ningún aumento significativo de la luminiscencia con el tiempo. La figura 139 ilustra que a 37°C todas las combinaciones de NLpoly11S y NLpep101 sometidas a prueba muestran un aumento dependiente del tiempo en la luminiscencia inducida por a Vp que se nivela a aproximadamente 200 s.
Ejemplo 89
Comparación de la luminiscencia en diferentes líneas celulares que expresan V2R-NLpoly11S y NLpep101-ARRB2
Se transfectaron inversamente células HEK293T, HeLa o U2-OS (20.000) en placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoly11S y pF4A Ag ARRB2-NLpep87/101 usando FuGe NE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con AVP 0 ó 1 pM durante 20 min. Luego se añadió furimazina en OptiMEM hasta una concentración final de 10 pM en las células y se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s.
La figura 140 ilustra niveles de luminiscencia similares en tres líneas celulares diferentes que expresan V2R-NLpoly11S y NLpep101-ARRB2 en presencia y ausencia de AVP.
Ejemplo 90
Luminiscencia de células que expresan V2R-NLpoly11S y NLpep101-ARRB2 en diversos momentos después del tratamiento con AVP
Se transfectaron inversamente células HeLa (500.000) con 1 pg de pF4 Ag V2R-NLpoly11S y 1 pg de pF4 Ag ARRB2-NLpep101 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se transfectaron las células en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek # p35gc-1.5-14-C). 24 horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron con furimazina 10 pM en OptiMEM durante 5 min. Se añadió AVP 1 pM en OptiMEMI a las células y se adquirieron imágenes de luminiscencia con el dispositivo LV200 a intervalos de 15 s durante un total de 30 min. El instrumento estaba a 37°C, el objetivo era 60X o 150X, la ganancia era 600 y la exposición era 1 s o 2 s. Las figuras 141 y 142 ilustran que la obtención de imágenes puede detectar el aumento en la luminiscencia y la formación de puntos en células individuales después del tratamiento con AVP. Ejemplo 91
Constantes de disociación para NLpep
Se diluyó el lisado clarificado de E. coli de NLpoly 5P (preparado tal como se describió previamente) 1:1000 en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x de NLpep78-HT (lisado clarificado de E. coli preparado tal como se describió previamente) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 ul de NLpoly 5P y 20 ul de NLpep78 y se agitaron durante 10 minutos a TA. Se añadieron 40 ul de NanoGlo/Fz y se agitaron durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 s. Se determinó la Kd usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de mejor ajuste. La figura 80 compara las constantes de disociación para un NLpep que consiste en 1 ó 2 unidades de repetición de NLpep78.
Ejemplo 92
Afinidad entre NLpoly 5A2 y NLpep86
Se diluyó 1:10 el lisado de NLpoly 5A2 (preparado tal como se describió previamente después de transfectar células CHO) en PBS Prionex al 0,1%. Se prepararon concentraciones 4x de NLpep86 (NLpep sintético) en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 ul de NLpoly y 20 ul de NLpep y se agitaron durante 10 minutos a TA. Se añadieron 40 ul de NanoGlo/Fz y se agitaron durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 s. Se determinó la Kd usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de mejor ajuste. La figura 81 ilustra la afinidad entre NLpoly 5A2 y NLpep86.
Ejemplo 93
Luminiscencia de variantes de NLpoly
Se inoculó individualmente una sola colonia de diversos NLpoly en 200 ul de medio mínimo y se cultivó durante 20 horas a 37°C en un agitador. Se diluyeron 10 ul de cultivo durante la noche en 190 ul de medio mínimo recién preparado y se cultivaron durante 20 horas a 37°C en un agitador. Se diluyeron 10 ul de este cultivo durante la noche en 190 ul de medio de autoinducción (descrito previamente) y se cultivaron durante 18 horas a 25°C en un agitador. Se mezclaron 10 ul del cultivo de expresión con 40 ul de tampón de lisis de ensayo (descrito previamente) sin NLpep o con NLpep78-HT (dilución 1:3860) o NLpep79-HT (dilución 1:10.000). Las mezclas se agitaron durante 10 min a TA, se añadieron 50 ul de NanoGlo Fz y se agitaron de nuevo durante 10 min a TA. Se midió la luminiscencia en un luminómetro GloMax con integración de 0,5 segundos. La figura 82 demuestra la luminiscencia de las variantes de NLpoly sin NLpep o con NLpep78 o NLpep79. Los resultados muestran que la variante de NLpoly 11S (12S-51) ha tiene una luminiscencia mejorada con respecto a las otras variantes.
Ejemplo 94
Constantes de disociación y valores de Vmáx para NLpoly con 96 variantes de NLpep
Se sintetizaron NLpep en formato de matriz por New England Peptide (péptidos bloqueados en el extremo Nterminal por acetilación y en el extremo C-terminal por amidación; los péptidos en matrices se sintetizaron a una escala de ~1 mg) (tabla 6). Cada péptido se liofilizó en 3 placas independientes. Cada pocillo de 1 de las 3 placas de péptidos se disolvió en 100 ul de agua nanopura, y se midió la A260 y se usó para calcular la concentración usando el coeficiente de extinción de cada péptido. Luego se ajustó la concentración en función de la pureza del péptido, y se añadió agua nanopura para dar una concentración final de 750 uM.
Se diluyeron los péptidos hasta 12,66 uM (4X) en PBS Prionex al 0,1% y luego se diluyeron en serie 7 veces (8 concentraciones en total) en etapas de 0,5 log (dilución de 3,162 veces). Se diluyeron los NLpoly 5P, 8S, 5A2 u 11S en PBS Prionex al 0,1% tal como sigue: 5P 1:2.000; 8S 1:10.000; 11S 1:150.000, 5A2 1:1.000. Se mezclaron 25 ul de cada NLpep 25 ul de cada NLpoly y se incubaron durante 30 minutos a TA. Se añadieron 50 ul de NanoGlo 100 uM de Fz y se incubaron durante 30 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+ con integración de 0,5 segundos. Se determinaron Kd/Vmáx usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de mejor ajuste. Las figuras 83-90 ilustran la constante de disociación y los valores de Vmáx de NLpoly con las 96 variantes de NLpep. Los resultados indican mutaciones específicas en los NLpep que presentan una menor afinidad de unión sin pérdida de Vmáx.
Tabla 6. Matriz de péptidos 1
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Ejemplo 95
Solubilidad de variantes de NLpoly
Se inoculó una sola colonia de NLpoly 5A2, 12S, 11S, 12S-75, 12S-107 o 5P-B9 en 5 ml de cultivo LB y se incubó a 37°C durante la noche con agitación. Se diluyó 1:100 el cultivo durante la noche en LB recién preparado y se incubó a 37°C durante 3 horas con agitación. Se añadió ramnosa al 0,2% a los cultivos y se incubó a 25°C durante la noche con agitación. Se mezclaron 900 ul de estos cultivos durante la noche con 100 ul de tampón de lisis FastBreak 10X (Promega Corporation) y se incubaron durante 15 min a TA. Se extrajo una alícuota de 75 ul (total) de cada cultivo y se guardó para su análisis. Se centrifugó el cultivo restante de cada muestra a 14.000 x rpm en una microcentrífuga de sobremesa a 4°C durante 15 min. Se extrajo una alícuota de 75 ul de sobrenadante (soluble) de cada muestra y se guardó para su análisis. Se añadieron 25 ul de tampón SDS 4x a las alícuotas guardadas y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 5 ul de cada muestra en un gel de Tris-glicina-SDS al 4-20% y se desarrollaron a ~190 V durante ~50 min. Se tiñó el gel con SimplyBlue Safe Stain y se obtuvieron imágenes en un dispositivo LAS4000. La figura 91 muestra un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para las variantes de NLpoly. Con la excepción de 5A2, todas las variantes presentan un porcentaje de NLpoly en la fracción soluble.
Ejemplo 96
Solubilidad y constante de disociación de variantes de NLpoly
Se inoculó una sola colonia de NLpoly (enumerada en la figura 92) en 5 ml de cultivo LB y se incubó a 37°C durante la noche con agitación. Se 1:100 diluyó el cultivo durante la noche en LB recién preparado y se incubó a 37°C durante 3 horas con agitación. Se añadió ramnosa al 0,2% a los cultivos y se incubó a 25°C durante la noche con agitación. Se mezclaron 900 ul de estos cultivos durante la noche con 100 ul de tampón de lisis FastBreak 10X (Promega Corporation) y se incubaron durante 15 min a TA. Se extrajo una alícuota de 75 ul (total) de cada cultivo y se guardó para su análisis. Se centrifugó el cultivo restante de cada muestra a 14.000 x rpm en una microcentrífuga de sobremesa a 4°C durante 15 min. Se extrajo una alícuota de 75 ul de sobrenadante (soluble) de cada muestra y se guardó para su análisis. Se añadieron 25 ul de tampón SDS 4x a las alícuotas guardadas y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 5 ul de cada muestra en un gel de Tris-glicina-SDS al 4-20% y se desarrollaron a ~190 V durante ~50 min. Se tiñó el gel con SimplyBlue Safe Stain y se obtuvieron imágenes en un dispositivo LAS4000.
La figura 92 muestra un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly, así como una tabla que contiene las constantes de disociación para las mismas variantes.
Ejemplo 97
Especificidad de sustrato para NLpoly 5P y 11S con NLpep79
Se prepararon lisados clarificados de E. coli para NLpoly 5P u 11S tal como se describió previamente. Luego se diluyeron en serie lisados de NLpoly en etapas de 10 veces en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 ul de NLpoly y 25 ul de NLpep79 sintético (400 nM, 4X) y se incubaron durante 10 min a TA. Se añadieron 50 ul de NanoGlo 100 uM de Fz, se incubaron durante 10 min a TA, se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+ con integración de 0,5 s. La figura 93 muestra la especificidad de sustrato para 5P y 11S con NLpep79 y demuestra que 11S tiene una especificidad superior para furimazina que 5P.
Ejemplo 98
Solubilidad de variantes de NLpoly a partir de diversas etapas de evolución
Se inoculó una sola colonia de NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S u 11S en 5 ml de cultivo LB y se incubó a 37°C durante la noche con agitación. Se diluyó 1:100 el cultivo durante la noche en LB recién preparado y se incubó a 37°C durante 3 horas con agitación. Se añadió ramnosa al 0,2% a los cultivos y se incubó a 25°C durante la noche con agitación. Se mezclaron 900 ul de estos cultivos durante la noche con 100 ul de tampón de lisis FastBreak 10X (Promega Corporation) y se incubaron durante 15 min a TA. Se extrajo una alícuota de 75 ul (total) de cada cultivo y se guardó para su análisis. Se centrifugó el cultivo restante de cada muestra a 14.000 x rpm en una microcentrífuga de sobremesa a 4°C durante 15 min. Se extrajo una alícuota de 75 ul de sobrenadante (soluble) de cada muestra y se guardó para su análisis. Se añadieron 25 ul de tampón SDS 4x a las alícuotas guardadas y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 5 ul de cada muestra en un gel de Tris-glicina-SDS al 4-20% y se desarrollaron a ~190 V durante ~50 min. Se tiñó el gel con SimplyBlue Safe Stain y se obtuvieron imágenes en un dispositivo LAS4000. La figura 104 muestra un gel de proteína de lisados totales y la fracción soluble del mismo lisado para variantes de NLpoly a partir de diversas etapas del proceso de evolución. Estos resultados demuestran que la solubilidad de NLpoly aumentó drásticamente en el proceso de evolución.
Ejemplo 99
Marcaje químico de proteínas
Los péptidos no luminiscentes (NLpep) pueden usarse para marcar proteínas químicamente. Un NLpep puede sintetizarse para que contenga un grupo reactivo, por ejemplo, biotina, éster succinimidílico, maleimida, etc., y unirse (por ejemplo, conjugarse, ligarse, etiquetarse, etc.) a una proteína, por ejemplo, un anticuerpo. La proteína marcada con NLpep, por ejemplo, anticuerpo NLpep, puede usarse en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, ELISA. La interacción/unión de la proteína marcada con NLpep, por ejemplo, anticuerpo NLpep, con su diana/pareja de unión se detectaría mediante la adición de un NLpoly y reactivo de ensayo NanoGlo®. La luminiscencia generada por la interacción de la proteína marcada con NLpep y el NLpoly se correlacionaría con la interacción de la proteína marcada con NLpep con su diana/pareja de unión. Este concepto podría permitir que se unieran múltiples NLpep a una sola molécula de proteína, lo que daría como resultado múltiples interacciones proteína marcada con NLpep/NLpoly que conducirían a la amplificación de la señal.
Ejemplo 100
Detección de modificación de proteínas postraduccional usando HaloTag-NLpep mediante inmunotransferencia de tipo Western
Pueden modificarse postraduccionalmente varias proteínas mediante AMPilación o ADP-ribosilación. En la AMPilación, el AMP se añade a la proteína diana mediante un enlace fosfodiéster usando ATP como molécula donadora. De manera similar, en la ADP-ribosilación, se añade un resto de ADP-ribosa a las proteínas diana a través de un enlace fosfodiéster usando NAD+ como molécula doandora. Se ha demostrado que la posición N6 tanto de ATP como de NAD+ puede usarse para etiquetar ligadores sin afectar al acontecimiento postraduccional. Si se usa un NAD+ o ATP con cloroalcano modificado en N6 para realizar la reacción de AMPilación o ADP-ribosilación, las proteínas diana se modificarían para contener el NAD+ o ATP con cloroalcano.
El ATP/NAD modificado en N6 se ha usado en combinación con química clic para desarrollar sistemas de detección basados en fluorescencia en gel. La detección de estas modificaciones postraduccionales mediante técnicas de inmunotransferencia de tipo Western requiere anticuerpos, que a menudo no son específicos o no están disponibles.
Un enfoque alternativo podría ser combinar las propiedades de la tecnología HaloTag® y la alta luminiscencia de la luciferasa NanoLuc® (Nl ). Tras la modificación postraduccional de las proteínas diana con ATP con cloroalcano (para AMPilación) o NAD+ con cloroalcano (para ADP-ribosilación) usando lisado celular o proteínas purificadas, las muestras pueden resolverse mediante SDS-PAGE y transferirse a una membrana de pVd F. Tras el bloqueo, la transferencia puede incubarse con HaloTag-NLpep. HaloTag se unirá a las proteínas modificadas postraduccionalmente. En la siguiente etapa, podrían añadirse NLpoly y furimazina a la transferencia para detectar la bioluminiscencia. Este método de detección es una alternativa a un enfoque basado en quimioluminiscencia para la detección de inmunotransferencias de tipo Western. Un enfoque basado en quimioluminiscencia podría implicar la incubación de fusiones HaloTag-proteína G (como primario), en la siguiente etapa podría usarse cualquier anticuerpo secundario unido a HRP seguido de una reacción de ECL.
Ejemplo 101
Ensayos de modificación postraduccional
Las modificaciones postraduccionales (PTM) de las proteínas son fundamentales para todos los aspectos de la regulación biológica. Las PTM amplifican las diversas funciones del proteoma mediante la adición covalente de grupos funcionales a las proteínas. Estas modificaciones incluyen fosforilación, metilación, acetilación, glicosilación, ubiquitinación, nitrosilación, lipidación e influyen en muchos aspectos de la patogenia y la biología celular normal. Más específicamente, las PTM relacionadas con histonas son de gran importancia. Las modificaciones covalentes epigenéticas de las proteínas histonas tienen un fuerte efecto sobre la regulación transcripcional de los genes y la actividad celular. Los ejemplos de enzimas de modificación postraduccional incluyen, pero no se limitan a, cinasas/fosfatasas, metiltransferasas (HMT)/desmetilasas (HDMT), acetiltransferasas/histona desacetilasas, glicosiltransferasas/glucanasas y ADP-ribosiltransferasas. En condiciones fisiológicas normales, la regulación de las enzimas de PTM está estrictamente regulada. Sin embargo, en condiciones patológicas, la actividad de estas enzimas puede desregularse y la interrupción de las redes intracelulares gobernadas por estas enzimas conduce a muchas enfermedades, incluyendo cáncer e inflamación.
Los péptidos no luminiscentes (NLpep) y los polipéptidos no luminiscentes (NLpoly) pueden usarse para determinar la actividad de las enzimas de PTM al monitorizar los cambios en la transferencia de grupos covalentes (por ejemplo, fosforilo, acetilo) a un sustrato peptídico específico unido a un NLpep. El NLpep se unirá a través de síntesis de péptidos al péptido pequeño específico de la enzima de PTM y se usará como sustrato para la enzima de PTM.
A) Ensayos de PTM con transferasa (HAT)
Una vez que se ha producido la reacción con la enzima de PTM, puede usarse una aminopeptidasa para degradar el péptido no modificado (NLpep; control). El péptido modificado (acetilado) (sustrato NLpep-enzima de PTM) se degradaría a una velocidad muy lenta o no se degradaría en absoluto ya que se sabe que la actividad aminopeptidasa se ve afectada por una PTM. Una vez que se completa la reacción con la aminopeptidasa, se añade el NLpoly con reactivo de ensayo NanoGlo® que contiene furimazina. La luminiscencia se generaría a partir de la muestra en la que se produjo la PTM a través de la interacción de NLpep y NLpoly. Si no se produjera la PTM, el NLpep se degradaría y no se produciría ninguna interacción entre el NLpep y el NLpoly, por lo que no se generaría luminiscencia. Este concepto se ejemplifica en la figura 197 para un concepto general de enzima transferasa y en la figura 145 para acetiltransferasas H3K4/9.
La reacción se realizaría en condiciones óptimas de reacción enzimática usando el sustrato peptídico de histona unido a NLpep y acetil-CoA o SAM como donador de grupos acetilo o metilo. Se añadiría un tampón que contuviera aminopeptidasa o una mezcla de aminopeptidasas para degradar específicamente todos los sustratos no modificados. Se añadiría un tampón que contuviera un NLpoly y un inhibidor de aminopeptidasa. Se añadiría reactivo de ensayo NanoGlo® y se detectaría la luminiscencia. La luminiscencia generada sería proporcional a la cantidad de NLpep no degradado presente y, por tanto, se correlacionaría con la cantidad de sustratos metilados o acetilados, indicando así la cantidad de actividad metiltransferasa o acetiltransferasa. El ensayo también puede aplicarse a una PTM tal como fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, nitrosilación y lipidación.
B) Ensayos de PTM con hidrolasa (HDMT)
En un concepto similar a A) puede usarse para histonas desmetilasas (HDMT). Sin embargo, en lugar de una aminopeptidasa, puede usarse un anticuerpo específico de PTM para crear una interferencia en la actividad. Un NLpep podría unirse a través de la síntesis de péptidos a un péptido pequeño metilado y usarse como sustrato para la hidrolasa. Una vez que se ha completado la reacción con la hidrolasa, puede añadirse un anticuerpo anti-metilo a la reacción. Este anticuerpo se unirá específicamente al péptido metilado (control). El producto peptídico generado por la HDMT no se unirá al anticuerpo. Luego, puede añadirse un NLpoly. Si el anticuerpo interfiere con la interacción de NLpep y NLpoly, no se generará luminiscencia. Si hubo hidrólisis de la PTM por la desmetilasa, NLpep y NLpoly interactuarán y se generará luminiscencia. Este concepto se ejemplifica en la figura 198 para un concepto general de enzima hidrolasa y en la figura 146 para desmetilasas H3K4/9.
El concepto de degradación de aminopeptidasa del sustrato no modificado también puede usarse para un ensayo con hidrolasa excepto que sería un ensayo de pérdida de señal en lugar de ganancia de señal. La reacción se realizaría en condiciones óptimas de reacción enzimática usando un sustrato peptídico de histona modificado (metilado o acetilado) unido a un NLpep. Se añadiría un tampón que contuviera un anticuerpo capaz de reconocer el grupo metilo o acetilo. Se añadiría un tampón que contuviera un NLpoly. El NLpoly interactuaría con el NLpep no unido al anticuerpo. Se añadiría reactivo de ensayo NanoGlo® y se detectaría la luminiscencia. La luminiscencia generada sería proporcional a la cantidad de NLpep no unido al anticuerpo y, por tanto, se correlacionaría con la cantidad de sustrato desmetilado o desacetilado, indicando así la cantidad de actividad desmetilasa o desacetilasa. Ambos conceptos del ensayo con hidrolasa también pueden aplicarse a hidrolasas con PTM tales como fosfatasas, glucanasas y desubiquitinasas.
En otra versión de estos conceptos, la transferencia o hidrólisis de PTM en el péptido-NLpep sería suficiente por sí sola para reducir o mejorar la interacción de NLpep con NLpoly y, por tanto, disminuir o aumentar la señal de luminiscencia sin la necesidad de aminopeptidasa o anticuerpo.
El método se usó para someter a ensayo una transferasa representativa, la tirosina cinasa SRC, usando el siguiente péptido sustrato NLpep-SRC: YIYGAFKRRGGVTGWRLCERILA. La enzima SRC se tituló en 10 pl de tampón de reacción A (Tris 40 mM pH 7,5, MgCh 20 mM y BSA 0,1 mg/ml) en presencia de ATP 150 pM y sustrato NLpep-Src 2,5 pM y se incubó durante 1 hora a 23°C. Después de la incubación, se añadieron 10 pl del reactivo aminopeptidasa M (APM) (Tris 40 mM pH 7,5, BSA 0,1 mg/ml y APM 50 mU), se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital y luego se incubaron a 37°C durante 2 horas. A las muestras, se les añadieron 30 pl de reactivo NLpoly y se incubaron las muestras a temperatura ambiente. El reactivo NLpoly contenía el fragmento de NLpoly y un inhibidor de aminopeptidasa. Después de 30 minutos, se añadieron 50 pl de reactivo de ensayo NanoGlo® y se registró la luminiscencia después de 3 minutos en un luminómetro. Se encontró que un aumento en la actividad de la enzima cinasa SRC se correlaciona con un aumento en la luminiscencia con respecto al fondo (figura 199). Sólo se encontró actividad de fondo cuando SRC no estaba presente, lo que indica que se digirió el péptido sustrato NLpep-SRC no fosforilado, lo que dio como resultado que el fragmento NLpoly no produjera luz, lo que demuestra el uso del método para monitorizar la actividad de una enzima transferasa tal como una cinasa.
Ejemplo 102
Detección de ARN específicos (ARNm o ARN no codificante) de interés en células de mamífero, lisado celular o muestra clínica
El péptido no luminiscente (NLpep) y el polipéptido no luminiscente (NLpoly) pueden anclarse a un dominio de unión a ARN (RBD) con especificidad de secuencia modificada por ingeniería. La especificidad del RBD puede cambiarse con precisión cambiando los aminoácidos únicos que confieren la especificidad de bases del RBD. Un ejemplo de uno de estos RBD es el dominio pumilio humano (denominado en este caso PUM). El código de reconocimiento de ARN de PUM ha sido muy bien establecido. PUM se compone de ocho repeticiones en tándem (cada repetición consiste en 34 aminoácidos que se pliegan en dominios muy compactos que se componen de hélices alfa). Los aminoácidos conservados del centro de cada repetición hacen contactos específicos con bases individuales dentro de la secuencia de reconocimiento de ARN (que se compone de ocho bases). La especificidad de secuencia de PUM puede alterarse con precisión cambiando el aminoácido conservado (mediante mutagénesis dirigida al sitio) involucrado en el reconocimiento de bases dentro de la secuencia de reconocimiento de ARN. Para la detección de ARN específicos en la célula, los dominios PUM (PUM1 y PUM2) con especificidades de secuencia personalizadas para el ARN diana pueden anclarse a un NLpep y a un NLpoly (por ejemplo, como una proteína de fusión genética mediante ingeniería genética) y pueden expresarse en células de mamífero. PUM1 y PUM2 están diseñados para reconocer secuencias de 8 nucleótidos en el ARN diana que están próximas entre sí (separadas sólo por unos pocos pares de bases, determinado experimentalmente). La interacción óptima de PUM1 y PUM2 con su secuencia diana está garantizada mediante la introducción de un ligador flexible (la secuencia y la longitud del ligador se determinarán experimentalmente) que separa el PUM y el péptido no luminiscente y el polipéptido no luminiscente. La unión de PUM1 y PUM2 a su secuencia diana acercará el NLpep y el NLpoly en una orientación que da como resultado la formación de un complejo funcional capaz de generar una señal bioluminiscente en las condiciones de ensayo específicas. No se generaría un complejo bioluminiscente funcional en ausencia de la diana de ARN debido a la interacción inestable de los pares NLpep y NLpoly que constituyen el complejo.
También puede usarse una estrategia similar para detectar ARN en una muestra clínica in vitro. Las proteínas de fusión NLpep-PUM con especificidad de ARN personalizada pueden expresarse y purificarse a partir de un sistema de expresión de proteínas adecuado (tal como un sistema de expresión de proteínas de mamífero o E. coli). Los componentes purificados pueden añadirse a la muestra biológica junto con el sustrato y los componentes del ensayo adecuados para generar la señal bioluminiscente.
Ejemplo103
Detección basada en oligos de ADN de ARN específico (ARNm o ARN no codificante) en muestra clínica o lisado de células de mamífero
Un péptido no luminiscente (NLpep) y un polipéptido no luminiscente (NLpoly) pueden unirse a oligonucleótidos complementarios al ARN diana con un ligador adecuado (aminoácidos o nucleótidos). El ensamblaje funcional del complejo bioluminiscente se produce sólo cuando la hibridación específica de secuencia del oligo de ADN con su ARN diana acerca al NLpep y NLpoly en una conformación ideal óptima para la generación de una señal bioluminiscente en las condiciones de ensayo. La detección también puede lograrse a través de un sistema de complementación de tres componentes que involucra dos NLpep y un tercer NLpoly. Por ejemplo, se mezclarán dos conjugados NLpep-ADN con el ARN diana. El ensamblaje funcional del complejo bioluminiscente se logra mediante la adición posterior del tercer NLpoly. Por tanto, si se produce una señal detectable en condiciones de ensayo específicas usando una muestra clínica o un lisado celular, se infiere la presencia de ARN diana en dicha muestra. Tales ensayos son útiles para detectar ARN derivados de agentes infecciosos (ARN virales) y biomarcadores de ARN específicos (implicados en muchos estados patológicos tales como diversas formas de cáncer, hepatopatías y cardiopatías), y podrían proporcionar una nueva vía para el diagnóstico y el pronóstico de muchos estados patológicos.
Ejemplo 104
Obtención de imágenes in vivo
Los productos derivados de biotecnología (productos biológicos), incluyendo anticuerpos, péptidos y proteínas, son muy prometedores como agentes terapéuticos. A diferencia de los fármacos de molécula pequeña, los productos biológicos son moléculas grandes con estructuras secundarias y terciarias y, a menudo, contienen modificaciones postraduccionales. La internalización, el tráfico intracelular, la biodistribución, la farmacocinética y la farmacodinamia (PK/PD), la inmunogenicidad, etc., de los productos biológicos difieren significativamente de los fármacos de molécula pequeña, y existe la necesidad de nuevas herramientas para “rastrear” estos anticuerpos in vivo. El marcaje químico convencional con indicadores enzimáticos (HRP, luciferasa, etc.) o pequeñas etiquetas fluorescentes pueden alterar significativamente el valor terapéutico de los productos biológicos y no son ideales para la obtención de imágenes in vivo usando productos biológicos. El marcaje con radioisótopos para obtención de imágenes basada en PET tampoco es conveniente.
Los NLpoly y NLpep descritos en el presente documento ofrecen una nueva solución para la obtención de imágenes in vivo de productos biológicos. El NLpep puede codificarse genéticamente en una terapia con productos biológicos sin etapas de síntesis. La codificación genética permite un control preciso sobre la cantidad de péptido por molécula biológica, así como su posición, minimizando así cualquier perturbación de su valor terapéutico. Para obtener imágenes, puede inyectarse en el animal un NLpoly junto con un sustrato, por ejemplo, furimazina. Si el NLpep-producto biológico y el NLpoly interactúan, se generaría luminiscencia. Alternativamente, un animal transgénico que expresa NLpoly puede usarse como sistema modelo.
Ejemplo 105
Aplicaciones de BRET
Este concepto mide fundamentalmente la unión de tres restos. Dos de los NLpoly y/o NLpep forman un complejo, y el tercer resto, que es o bien fluorescente o bien bioluminiscente, proporciona un componente de transferencia de energía. Si el complejo formado es bioluminiscente, pueden medirse tanto la bioluminiscencia como la transferencia de energía (es decir, BRET). Si el complejo formado es fluorescente, puede medirse la magnitud de la transferencia de energía si el tercer componente es una molécula bioluminiscente.
A) Este ejemplo demuestra un colorante fluorescente unido a un NLpep. Alternativamente, podría fusionarse una proteína fluorescente, por ejemplo, una proteína de fusión, con un NLpoly o NLpep (creado a partir de un constructo genético).
Se preparó lisado clarificado de E. coli de NLpoly WT tal como se describió previamente. Se mezclaron 40 ul de lisado de NLpoly WT con 10 ul de PBI-4730 (NLpep1) o PBI-4877 (NLpep1-TMR) y se incubaron durante 10 min a TA. Se añadieron 50 ul de furimazina 100 uM en HEPES 50 mM, pH 7,4, y se incubaron durante 30 min a TA. Se midió la luminiscencia a lo largo de 400-700 nm en un dispositivo t Ec AN M1000.
La figura 147 ilustra una transferencia de energía muy eficiente desde el complejo NLPoly/NLPep (donador) a TMR (aceptor) y el correspondiente desplazamiento hacia el rojo en la longitud de onda de la luz que se emite.
B) Este ejemplo demuestra el uso de BRET en la detección, tal como la detección de la concentración de moléculas pequeñas o la actividad enzimática. Debido a que la transferencia de energía depende en gran medida de la distancia, la magnitud de la transferencia de energía a menudo puede estar relacionada con la conformación del sistema. Por ejemplo, puede usarse la inserción de un polipéptido que quela el calcio para medir la concentración de calcio a través de la modulación de la transferencia de energía.
Una enzima que también cambia la distancia, o bien provocando un cambio conformacional del sensor tal como se indicó anteriormente o bien mediante la escisión del sensor a partir del resto fluorescente, puede medirse a través de un sistema tal como se describe en el presente documento. Un NLpoly o NLpep unido a un resto fluorescente proporciona transferencia de energía cuando interactúan NLpoly y NLpep. Un ejemplo de esto es un sensor peptídico que se ha preparado en el que NLpep se conjuga con un colorante TOM fluorescente a través de un ligador DeV d (sitio de escisión de caspasa-3). Cuando se expone al NLpoly, se observa transferencia de energía. Cuando se expone a caspasa-3, se elimina la transferencia de energía, pero permanece la luminiscencia a 460 nm.
Se purificaron NLpoly 5A2 y NL-HT (NanoLuc fusionado con HaloTag). Se mezclaron 20 ul de NL-HT 8 pM con 20 ul de PBI-3781 100 nM (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 13/682.589) y se incubaron durante 10 min a t A. Se añadieron 40 ul de NanoGlo 100 uM de furimazina y se midió la luminiscencia a lo largo de 300-800 nm en un dispositivo TECAN M1000.
Se mezclaron 20 ul de NLpoly 5A2 33 ng/ul con 20 ul de PBI-5074 ~500 uM (TOM-NCT-NLpep). Se añadieron 40 ul de NanoGlo+100 uM de furimazina y se midió la luminiscencia a lo largo de 300-800 nm en un dispositivo TECAN M1000.
La figura 148 ilustra la transferencia de energía del complejo NLPoly/NLPep (donador) al colorante TOM (aceptor) y el correspondiente desplazamiento hacia el rojo en la longitud de onda de la luz que se emite.
C) Interacciones ternarias
La transferencia de energía con un NLpoly y NLpep también puede usarse para medir la interacción de tres moléculas. Un ejemplo sería un GPCR marcado con NLpoly y una proteína que interactúa con GPCR con NLpep, que forman un complejo bioluminiscente cuando interactúan. Esto permite medir la interacción binaria. Si un ligando de GPCR de molécula pequeña que porta un resto fluorescente apropiado para la transferencia de energía interactúa con este sistema, se producirá la transferencia de energía. Por tanto, la interacción binaria proteínaproteína y la interacción ternaria fármaco-proteína-proteína pueden medirse en el mismo experimento. Además, la molécula fluorescente sólo provoca una señal cuando interactúa con un par de proteínas, lo que elimina cualquier señal del ligando que interactúa con una proteína inactiva (figura 149).
Ejemplo 106
6-Tetrametilrrodamina-PEG3-NH2:
A una disolución de éster succinimidílico de 6-tetrametilrrodamina (0,25 g, 0,5 mmol) en DMF (5 ml), se le añadió 1-Boc-4,7,10-trioxatridecan-1,13-diamina (0,15 g, 0,5 mmol) seguido de diisopropiletilamina (0,25 ml, 1,4 mmol). Después de agitar durante 16 h, se analizó la reacción mediante HPLC para confirmar el consumo completo del éster succinimidílico de 6-tetrametilrrodamina. Se concentró la reacción hasta obtener una película rosa, que se disolvió en una combinación de triisopropilsilano (0,2 ml) y ácido trifluoroacético (4 ml). Se agitó la disolución rosa durante 2 h, después de lo cual la HPLC analítica confirmó el consumo completo del material de partida. Se concentró la reacción hasta sequedad para proporcionar 6-tetrametilrrodamina-PEG3-NH2 en bruto como una película rosa.
H-GVTGWRLCERILA-PEG-TMR (PBI-4877):
Figure imgf000079_0001
Se sintetizó el péptido completamente protegido Boc-GVTGWRLCERILA-resina mediante síntesis de péptidos en fase sólida convencional usando técnicas de Fmoc, luego se escindió de la resina usando ácido dicloroacético para liberar el péptido completamente protegido como un sólido blanco. A una disolución de 6-tetrametilrrodamina-PEG3-NH2 (0,05 g, 0,08 mmol) en DMF (1,5 ml), se le añadieron este Boc-GVTGWRLCERILA-OH (0,2 g, 0,07 mmol), 1-hidroxiazabenzotriazol (11 mg, 0,08 mmol), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (15 mg, 0,08 mmol) y diisopropiletilamina (0,28 ml, 0,16 mmol). Después de agitar durante 30 min, se concentró la reacción y se sometió a reparto el crudo resultante entre CH2Cl2 y agua, se separaron las fases, y se lavó la fase orgánica con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. Se disolvió el sólido rosa resultante en una combinación de triisopropilsilano (0,2 ml) y ácido trifluoroacético (4 ml). Después de agitar durante 3 h, se concentró la reacción y se purificó la película rosa resultante mediante HPLC de fase inversa usando un gradiente de ACN en TFA acuoso al 0,1% para proporcionar PBI-4877 como un polvo rosa: EM (M+) calc. 2088,5, encontrado 2089,1.
TOM-DEVDGVTGWRLCERILA-OH (PBI-5074):
Figure imgf000080_0001
Se sintetizó el péptido totalmente protegido H-DEVDGVTGWRLCERILA-resina mediante síntesis de péptidos en fase sólida convencional usando técnicas de Fmoc. Aún sobre la resina, se añadió una disolución de éster succinimidílico de 6-TOM (PBI-3739) y se dejó reaccionar con el extremo N-terminal libre. Luego, se escindió el péptido de la resina y se desprotegió completamente usando ácido trifluoroacético (TFA) para proporcionar un sólido azul. Se purificó este sólido mediante HPLC de fase inversa usando un gradiente de ACn en t Fa acuoso al 0,1% para proporcionar PBI-5074 como un polvo azul: EM (M+Z/2) calc. 1238,9, encontrado 1238,8.
Ejemplo 107
Comparación de complementación entre una fusión N-terminal y una fusión C-terminal de NLPep78 sintéticas Se cuantificaron las fusiones de NLpep78-HaloTag (78-HT) y HaloTag-NLPep78 (HT-78), con una fusión GST-HaloTag® (GST-HT) como control, marcando lisados de E. coli con el ligando HaloTag-TMR®, se separaron por SDS-PAGE y se exploraron en un dispositivo Typhoon. Luego se creó una curva de calibración usando concentraciones conocidas de patrón GST-HT, y se usaron las intensidades de banda de 78-HT y HT-78 para determinar sus concentraciones.
Los lisados de E. coli que contenían NLpoly11S se diluyeron 1:107 en PBS pH 7 Prionex al 0,1%. Se realizaron diluciones en serie de 78-HT, HT-78 y NLpep78 sintético en PBS pH 7 Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 ul de NLpoly11S y 20 ul de uno de los NLPep y se incubaron a temperatura ambiental durante 5 minutos. Se añadieron 40 ul de reactivo NanoGlo® (Promega Corporation) Fz 100 uM, y las muestras se incuban a temperatura ambiental durante 5 min. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GlomaxMulti+ usando una integración de 0,5 s. Los datos se ajustaron a la unión específica de un sitio usando GraphPad Prism para determinar Bmáx y Kd.
Los resultados (figura 150) comparan la unión de NLpoly11S a NLPep78 y NLPep78 sintético en el extremo N-terminal o C-terminal de una pareja de fusión (HaloTag). No se encontró que las afinidades de unión cambiaran significativamente, pero Bmáx se redujo cuando NLPep78 estaba en el extremo C-terminal.
Ejemplo 108
Comparación de complementación entre una fusión N-terminal y una fusión C-terminal de NLPep79 sintéticas Se cuantificaron las fusiones de NLpep79-HaloTag (79-HT) y HaloTag-NLPep79 (HT-79), con una fusión GST-HaloTag® (GST-HT) como control, marcando lisados de E. coli con ligando HaloTag-TMR®, se separaron por SDS-PAGE y se exploraron en un dispositivo. Luego se creó una curva de calibración usando concentraciones conocidas de patrón GST-HT, y se usaron las intensidades de banda de 79-HT y HT-79 para determinar sus concentraciones. Los lisados de E. coli que contenían NLpoly11S se diluyeron 1:107 en PBS pH 7 Prionex al 0,1%. Se realizaron diluciones en serie de 79-HT, HT-79 y NLpep79 sintético en PBS pH 7 Prionex al 0,1%. Se mezclaron 20 ul de NLpoly11S y 20 ul de uno de los NLPep y se incubaron a temperatura ambiental durante 5 minutos. Se añadieron 40 ul de reactivo NanoGlo® (Promega Corporation) Fz 100 uM, y las muestras se incuban a temperatura ambiental durante 5 min. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GlomaxMulti+ usando una integración de 0,5 s. Los datos se ajustaron a la unión específica de un sitio usando GraphPad Prism para determinar Bmáx y Kd.
Los resultados (figura 151) comparan la unión de NLpoly11S a NLPep79 y NLPep79 sintético en el extremo N-terminal o C-terminal de una pareja de fusión (HaloTag). No se encontró que las afinidades de unión cambiaran significativamente, pero Bmáx se redujo cuando NLPep79 estaba en el extremo C-terminal.
Ejemplo 109
Exploración espectral de NLpoly11S con NLPep86 en comparación con PBI-4877 (NLPep1-fluoróforo)
El NLpoly11S purificado se diluyó hasta 1 nM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. NLPep86 o PBI-4877 se diluyó hasta 40 uM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. Se mezclaron 25 ul de NLpoly11S y 25 ul de NLPep86 o PBI-4877 y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 10 min. Luego se añadieron 50 ul de tampón (PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM) Fz 100 uM. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Tecan Infinite M1000: 300-800 nm, cada 5 nm, ancho de banda 10 nm, ganancia 127, integración 0,5 s, posición z 22.000 um.
Los resultados demuestran (figura 152) que NLPep puede conjugarse con moléculas pequeñas como colorantes fluorescentes y mantener la interacción con NLpoly11S para producir luminiscencia. También demuestra una transferencia de energía eficiente y la capacidad de alterar los espectros de emisión.
Ejemplo 110
Exploración espectral de NLpoly11S con NLPep86 en comparación con PBI-5434 (fluoróforo-NLPep1)
El NLpoly11S purificado se diluyó hasta 1 nM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. NLPep86 o PBI-5434 se diluyó hasta 40 uM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. Se mezclaron 25 ul de NLpoly11S y 25 ul de NLPep86 o PBI-5434 y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 10 min. Luego se añadieron 50 ul de tampón (PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM) Fz 100 uM. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Tecan Infinite M1000: 300-800 nm, cada 5 nm, ancho de banda 10 nm, ganancia 127, integración 0,5 s, posición z 22.000 um.
Los resultados demuestran (figura 153) que el NLPep puede conjugarse con moléculas pequeñas como colorantes fluorescentes y mantener la interacción con 11S para producir luminiscencia. Esto, junto con los resultados con PBI-4877 en el ejemplo 109, también sugiere que el extremo terminal y/o la longitud del ligador usado para la conjugación pueden afectar significativamente a la transferencia de energía.
Ejemplo 111
Exploración espectral de NLpoly11S con NLPep86 en comparación con PBI-5436 (fluoróforo-NLPep1)
El NLpoly11S purificado se diluyó hasta 1 nM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. NLPep86 o PBI-5436 se diluyó hasta 40 uM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM. Se mezclaron 25 ul de NLpoly11S y 25 ul de NLPep86 o PBI-5436 y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 10 minutos. Luego se añadieron 50 ul de tampón (PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM) Fz 100 uM. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Tecan Infinite M1000: 300-800 nm, cada 5 nm, ancho de banda 10 nm, ganancia 127, integración 0,5 s, posición z 22.000 um.
Los resultados demuestran (figura 154) que el NLPep puede conjugarse con moléculas pequeñas como tintes fluorescentes y mantener la interacción con 11S para producir luminiscencia. También demuestra una transferencia de energía eficiente y la capacidad de alterar los espectros de emisión.
Ejemplo 112
Comparación de valores de Km para 11S con diversos NLpep en tampón de afinidad
El NLpoly11S purificado se diluyó hasta 40 pM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005% (tampón de afinidad) o reactivo de ensayo NanoGlo (Promega Corporation). NLpep (NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 y 114) se diluyeron hasta 400 uM (NLPep hasta 1 mM) en tampón de afinidad o reactivo de ensayo NanoGlo. Se mezclaron 300 ul de NLpoly11S y 300 ul de un NLPep y se incubaron a temperatura ambiental durante 30 min. Luego se añadieron 50 ul a un pocillo de placas blancas de 96 pocillos. Se añadieron a cada pocillo 50 ul de tampón de afinidad Fz 2x (12,5 |iM diluido 2 veces 7 veces) o 50 ul de NanoGlo 2x Fz (100 |iM diluido 2 veces 7 veces) y se midió la luminiscencia en un dispositivo Glomax Multi+ usando una integración de 0,5 s. La Km se determinó usando GraphPad Prism, Michaelis-Menten.
Los resultados demuestran la unión del sustrato en el tampón de afinidad (figura 155) o el tampón de ensayo NanoGlo (figura 156) al complejo entre NLpoly11S y diversos NLpep. Los valores de Km determinados no fluctúan significativamente con los NLpep indicados.
Ejemplo 113
Afinidad de unión de NLPep1 a NLpoly11S a diversas concentraciones de furimazina
Se diluyeron NLpoly156 y NLpoly11S purificados hasta 40 pM en tampón de afinidad (PBS pH 7 Prionex al 0,01% + DTT 1 mM Tergitol al 0,005%). Se diluyó NLPepl sintético (WT) hasta 560 uM para NLpoly156 o hasta 80 uM para NLpoly11S en tampón de afinidad y luego se diluyó en serie 3 veces para preparar 8 concentraciones. Se mezclaron 350 ul de NLPep1 y 350 ul de NLPoly156 ó 11S y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 30 min. Luego se dividieron alícuotas de 50 ul en un pocillo de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos. Se añadió Fz al tampón de afinidad a 40, 20, 10, 5, 2,5 y 1,25 uM, se añadieron 50 ul de tampón de afinidad/Fz a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiental durante 2 min. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Glomax Multi+ con integración de 0,5 s. Se usaron GraphPad Prism y la unión específica de 1 sitio para calcular la Kd a cada concentración de Fz.
Los resultados (figura 157) indican el cambio en la afinidad (NLPoly/NLPep) con concentraciones crecientes de Fz.
Ejemplo 114
Valores de Km de furimazina para NLpoly156/NLPep1 y NLpoly11S/NLPep1 a diversas concentraciones de NLPep1
Se diluyeron NLpoly156 y NLpoly11S purificados hasta 40 pM en tampón de afinidad (PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005%). Se diluyó NLPep1 sintético (WT) hasta 560 uM para NLpoly156 o hasta 80 uM para NLpoly11S en tampón de afinidad y luego se diluyó en serie 3 veces para preparar 8 concentraciones. Luego se dividieron alícuotas de 50 ul en un pocillo de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos. Se añadió Fz al tampón de afinidad a 40, 20, 10, 5, 2,5 y 1,25 uM, se añadieron 50 ul de tampón de afinidad/Fz a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiental durante 2 min. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Glomax Multi+ con integración de 0,5 s. Se usaron GraphPad Prism y la unión específica de 1 sitio para calcular la Kd a cada concentración de NLPep1.
Los resultados (figura 158) indican el cambio en la afinidad (NLPoly/NLPep) con concentraciones crecientes de NLPep1.
Ejemplo 115
Comparación de actividad máxima para NLPoly156/NLPep1, NLPoly11S/NLPep1 y luciferasa NanoLuc®
Se diluyeron NLPoly156, NLPoly11S o luciferasa NanoLuc® purificados (Nluc) hasta 40 pM en tampón de afinidad (PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005%). Se diluyó NLPep1 sintético (WT) hasta 560 uM para NLPoly156 o hasta 80 uM para NLPoly11S en tampón de afinidad y luego se diluyó en serie 3 veces para preparar 8 concentraciones. Se mezclaron 350 ul de NLPep1 (o tampón de afinidad) y 350 ul de NLPoly (o Nluc) y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 30 minutos. Luego se dividieron alícuotas de 50 ul en un pocillo de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos. Se añadió Fz al tampón de afinidad a 40, 20, 10, 5, 2,5 y 1,25 uM, se añadieron 50 ul de tampón de afinidad/Fz a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiental durante 2 min. Se midió la luminiscencia en un dispositivo Glomax Multi+ con integración de 0,5 s. Se usaron GraphPad Prism y la ecuación de Michaelis-Menton para calcular Vmáx a cada concentración de NLPep (introducir los valores de Vmáx calculados a cada concentración de NLPep1 en la unión específica de 1 sitio para calcular Bmáx). Se usaron GraphPad Prism y la unión específica de 1 sitio para calcular Bmáx a cada concentración de Fz (introducir los valores de Bmáx calculados a cada concentración de Fz en la ecuación de Michaelis-Menton para calcular Vmáx).
Los resultados (figura 159) demuestran la actividad máxima de NLPoly156 o NLPoly11S tras la activación por NLPep1 con respecto a la actividad máxima de luciferasa NanoLuc.
Ejemplo 116
Valores de luminiscencia resultantes de la titulación de NLpoly11S con diversos NLpep
Se diluyó NLPoly11S purificado hasta 40 pM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005% (tampón de afinidad). Los NLpep sintéticos (NLPep86, 78, 79, 99, 101, 104, 114, 128 o wt) se diluyeron en un tampón de afinidad tal como sigue: NLPep86 = 60 nM, NLPep78 = 280 nM, NLPep79 = 800 nM, NLPep99 = 4 uM, NLPep101 = 34 uM, NLPep104 = 20 uM, NLPep128 = 4 uM, NLPep114 = 4,48 mM y NLPepWT = 20 uM. Se mezclaron 25 ul de NLpoly11S y 25 ul de NLPep y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 30 minutos. Luego se añadieron a cada mezcla 50 ul de tampón de afinidad 20 uM de Fz y se midió la luminiscencia en un dispositivo GlomaxMulti+ usando una integración de 0,5 s. Se determinaron los valores de Bmáx y Kd usando Graphpad Prism y la unión específica de 1 sitio.
Los resultados (figura 160) demuestran un intervalo de afinidades de ~100.000 veces usando NLPoly11S y diversos NLpep. Se observó una pérdida mínima en Bmáx entre los NLpep de alta y baja afinidad.
Ejemplo 117
Inmunotransferencia de tipo Western de NLPoly156, NLPoly11S y luciferasa NanoLuc® después de la transfección en células HEK293T
El día 1, se preparó una mezcla de transfección de 2 ng de ADN de NLPoly156, NLPoly11S o luciferasa NanoLuc® (Nluc), 1 ug de ADN portador de pGEM3Zf(+), 4 ul de FuGENE HD (Promega Corporation) y OptiMEM sin rojo de fenol hasta 100 ul y se incubó a t A durante 10 minutos. Luego, la mezcla de transfección se transfirió a un pocillo de una placa de 6 pocillos y se añadieron 2 ml de células HEK293T a 400.000 células/ml (800.000 células en total). Se incubaron las células durante la noche a 37°C.
El día 2, se lavaron las células con DMEM sin rojo de fenol, se añadieron 500 ul de DMEM sin rojo de fenol a cada pocillo y se congelaron las células a -70°C durante al menos 30 min. Luego se descongelaron las células, se transfirieron 500 ul a un tubo de microcentrífuga y se mezclaron 20 ul con 80 ul de tampón de carga SDS 1,25x y se incubaron a 95°C durante 5 min. Se cargaron 10 ul en gel de Bis-Tris NuPAGE al 10% con tampón de desarrollo MES. La proteína se transfirió a PVDF usando iBlot y la membrana se lavó en metanol. Luego se bloqueó la membrana en TBST BSA al 5% durante 1 hora a temperatura ambiental, se lavó 3 veces en TBST y luego se incubó con 10 ml de TBST 2 ul de anticuerpo policlonal de conejo anti-Nluc 2 ul de anticuerpo policlonal de conejo anti-p-actina (Abcam #ab8227) a 4°C durante la noche.
El día 3, la membrana se lavó 3 veces en TBST, se incubó con 10 ml de TBST 2 ul de anticuerpo conjugado anti-HRP de conejo durante 1 h a temperatura ambiental, se lavó nuevamente 3 veces con TBST y se incubó con 12 ml de sustrato de inmunotransferencia de tipo Western ECL durante 1 min. Se obtuvieron imágenes de quimioluminiscencia con un dispositivo LAS 4000 Image Quant.
Los resultados (figura 161) muestran el nivel de expresión de NLPoly en comparación con luciferasa NanoLuc® de longitud completa. NLPoly156 no se expresa tan bien como la luciferasa NanoLuc® (Nluc), mientras que NLPoly11S se expresa de manera similar a Nluc.
Ejemplo 118
Determinación de la influencia de la afinidad de NLPoly11S/NLPep114 en la interacción entre una P-lactamasa (SME) y una proteína inhibidora de P-lactamasa (BLIP) y comparación entre los valores de afinidad medidos a través de la actividad de 11S/114 y P-lactamasa
Purificación de proteínas
Se indujeron pFIK-señal-6H-SME, pF1K-señal-6H-SME-11S, pF1K-señal-6H-BLIPY50A y pF1K-señal-6H-BLIPy50A-114 (vectores Flexi de Promega para la expresión basada en el promotor T7 de proteína recombinante en E. coli (señal se refiere al péptido señal nativo para SME o BLIP) con ramnosa para su expresión en el periplasma de células KRX a 25°C durante 18-20 h. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en reactivo de lisis B-Per (Pierce; 1/50 del volumen de cultivo) y se incubaron a temperatura ambiental durante 15 min. Luego se diluyó el lisado mediante la adición de un volumen 1,5x de Tris 20 mM pH 8 NaCl 500 mM y se centrifugó a 12.000 xg durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio, se añadió 1 ml de ADNasa RQ1 (Promega Corporation) y se centrifugó de nuevo a 12.000 xg durante 10 min. El sobrenadante se purificó en una columna HisTALON (Clontech) con tampón de carga Tris 25 mM pH 8 y NaCl 500 mM y se eluyó con Tris 25 mM pH 8, NaCl 500 mM e imidazol 50 mM. La proteína eluida se dializó en Tris 25 mM pH 7,5 y NaCl 25 mM y se purificó en una columna HiTrap Q FF (GE Healthcare) con tampón de carga Tris 25 mM pH 7,5 y NaCl 25 mM y se eluyó con Tris 25 mM pH 7,5 y NaCl 125 mM. La fuerza iónica se ajustó a la concentración final de NaCl 150 mM y se concentró usando un concentrador VivaSpin.
Ensayo
Se diluyeron BLIPY50A y BLIPY50A-114 hasta 312,5 nM en tampón de afinidad (PBS pH 7, Prionex al 0,01%, Tergitol al 0,005%, DTT 1 mM) y luego se diluyeron en serie 1,5 veces. Se diluyeron SME y SME-11S hasta 0,2 nM en tampón de afinidad. Se mezclaron 11,11 ul de SME y 88,89 ul de BLIP y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 2 horas. Se transfirieron 90 ul de la mezcla a una placa transparente de 96 pocillos con 10 ul de nitrocefina 100 uM (Calbiochem, en tampón de afinidad). Se transfirieron 90 ul de SME-11S/BLIPY50A-114 a una placa blanca de 96 pocillos con 10 ul de Fz 100 uM (en tampón de afinidad). Se midió la absorbancia (nitrocefina) a 486 nm cada 15 s durante 30 min y se midió la luminiscencia (Fz) cada 2 min durante 30 min.
Para la nitrocefina, las velocidades iniciales se ajustaron usando Excel. Se trazaron las velocidades iniciales frente a la concentración de BLIP. Se ajustó Ki usando E_free=[E]-([E_0 ]+[/_0 ]+K_app-V(([E_0 ]+[/_0 ]+K_app )A2-(4[E_0 ][/_0])))/2 y K_app=K_i(1+([S])/K_M ). Para Fz, se ajustó Kd usando RLU=(Bmáx * [BL/P-114])/([BL/P-114]+K_D ).
Los resultados (figura 162) comparan la afinidad de una interacción de proteínas (la p-lactamasa SME y su inhibidor BLIPY50A) como proteínas no fusionadas con la afinidad cuando se fusionan NLPoly y NLPep y demuestran que la afinidad entre NLPoly11S y NLPep114 no da como resultado una afinidad aparente aumentada para la interacción SME/BLIPY50A. Esto también demuestra el uso de NLPoly11S y NLPep114 para medir una constante de unión en equilibrio para una interacción de proteínas, y la afinidad medida a través de NLPoly11S y NLPep114 es coherente con la afinidad medida por la actividad de la proteína diana (SME).
Ejemplo 119
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLPoly11S con FKBP-NLPep101 y 111-136
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 1 ng de ADN plasmídico de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep101 ó 111-136 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s.
La figura 163 demuestra que, de las combinaciones sometidas a prueba, NLpoly11S con NLpep114 muestra la mayor inducción de rapamicina y una de las señales luminiscentes específicas de rapamicina más fuertes.
Ejemplo 120
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan diferentes combinaciones de FRB-NLpoly11S con FKBP-NLpep114 y 137-143
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 1 ng de ADN plasmídico de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep114 ó 137-143 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s.
La figura 164 demuestra que, de las combinaciones sometidas a prueba, NLpoly11S con NLpep114 muestra la mayor inducción de rapamicina y una de las señales luminiscentes específicas de rapamicina más fuertes.
Ejemplo 121
Curvas de respuesta a la dosis de rapamicina de células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep78/79/99/101/104/114/128
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de ADN plasmídico de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep78/79/99/101/104/128 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FugEn E de 1 a 8. Se añadió Ad N de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina de 0 a 300 nM durante 2 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final) con rapamicina de 0 a 300 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Se usó Graphpad Prism para ajustar los datos a la curva sigmoidea y calcular los valores de CE50.
La figura 165 muestra una respuesta a la dosis de rapamicina sigmoidea para NLpoly11S con NLpep78/79/99/101/104/114/128. De las combinaciones representadas gráficamente, NLpoly11S con NLpep114 muestra el mayor intervalo dinámico.
Ejemplo 122
Respuesta de células que expresan FRB-NLpoly11S y FKBP-78/79/99/101/104/114/128 al inhibidor competitivo de rapamicina FK506
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos con un total de 0,1 ng de ADN plasmídico de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep78/79/99/101/104/114/128 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se añadió OptiMEMI sin rojo de fenol con rapamicina 10 nM durante 2 h. Se añadió inhibidor FK506 en OptiMEM a las células a concentraciones finales de 0 a 50 pM y se incubaron durante 3 horas. Se añadió furimazina en OptiMEM a las células para una concentración final de 10 pM en las células. La luminiscencia se leyó inmediatamente en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. Se usó Graphpad Prism para representar gráficamente los datos, ajustarlos a una curva sigmoidea y calcular los valores de CI50.
La figura 166 demuestra disminuciones dependientes de la dosis en la señal inducida por rapamicina de FRB-NLpoly11S y FKBP-78/79/99/101/104/114/128 con el inhibidor competitivo de rapamicina, f K506.
Ejemplo 123
Comparación de la luminiscencia generada por células transfectadas con diferentes razones de FRB-NLpoly11S y FKBP-NLpep114
Se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos con 1 ng de ADN plasmídico de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 ng de pF4A Ag FKBP-NLpep114 usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a FuGENE de 1 a 8. También se transfectaron inversamente células HEK293T (20.000) con 1 ng de pF4A Ag FKBP-NLpep114 y 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S. En ambas situaciones, se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Se añadió directamente a cada pocillo el sustrato furimazina 10 pM (concentración final) con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Luego se leyó la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s. La figura 167 demuestra que una razón de ADN de 1:1 generó la mayor inducción de rapamicina, aunque se observó una inducción significativa en todas las razones de ADN sometidas a prueba.
Ejemplo 124
Comparación de la luminiscencia generada por células que expresan fusiones NLpoly11S/NLpep114 de FRB/FKBP en diferentes orientaciones y con diferentes longitudes de ligador
Se transfectaron células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de 96 pocillos con vectores que expresan combinaciones de fusiones N-terminales y C-terminales de pF4Ag NLpoly11S y pF4Ag NLpep114 con FRB o FKBP. En estos constructos, se separaron NLpoly11S/NLpep114 de sus parejas de fusión con un ligador de o bien 4, 10 o bien 15 serinas/glicinas. Se transfectaron 0,1 ng de ADN de NLpoly11S y NLpep114 por pocillo a una razón de ADN con respecto a FugeneHD de 1 a 8. Veinticuatro horas tras la transfección, se lavaron las células con PBS y luego se incubaron en OptiMEMI sin rojo de fenol con o sin rapamicina 50 nM en OptiMEMI durante 2 h. Luego se añadió el sustrato furimazina 10 pM y, tras una incubación de 5 min a temperatura ambiente, se leyó la placa usando un dispositivo GloMax Multi con un tiempo de integración de 0,5 s.
La figura 168 ilustra un aumento específico de rapamicina en RLU independientemente de la orientación de fusión o la longitud del ligador.
Ejemplo 125
Comparación de la curva de respuesta a la dosis de rapamicina y la evolución temporal generado por sistemas de complementación de FRB-NLpoly11S/FKBP-NLpep114 y de luciérnaga dividida
Se transfectaron células HEK293T (800.000) en pocillos de placas de 6 pocillos con un total de 20 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep114 ó 750 ng de pF4A Ag N-Fluc(1-398)-FRB y FKBP-C-Fluc (394-544) usando FuGENE HD a una razón de A d N con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 20.000 células en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h adicionales. Para los experimentos de respuesta a la dosis (figura 169A), las células que expresan NLpoly11S/NLpep114 se trataron con rapamicina 0-1 pM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 3 h y luego se incubaron con furimazina 10 pM durante 5 min antes de registrar la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi. Las células que expresan N-Fluc(1-398)/C-Fluc(394-544) se incubaron con rapamicina 0-1 pM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 2 h, seguido de una incubación adicional de 1 h en presencia de D-luciferina 4 mM, antes de registrar la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi.
Para los experimentos de evolución temporal (figura 169B), las células que expresan NLpoly11S/NLpep114 se trataron con rapamicina 0 ó 50 nM en OptiMEMI sin rojo de fenol, que se añadió a través del inyector del dispositivo GloMax Multi y se midió inmediatamente la luminiscencia. Las células que expresan N-Flu(1-398)/C-Flu(394-544) se trataron con D-luciferina 4 mM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 1 hora, seguido de la adición de rapamicina 0 ó 50 nM a través del inyector y la medición de la luminiscencia mediante el dispositivo GloMax Multi. Las curvas se ajustaron usando el software GraphPad Prism 6.
La figura 169A-B demuestra que los sistemas de complementación tanto de NLpoly11S/NLpep114 como de luciérnaga dividida responden de una manera dependiente de la rapamicina, generando curvas de respuesta a la dosis sigmoideas y valores de CE50 similares. El sistema NLpoly11S/NLpep114 muestra una cinética de asociación más rápida y una señal máxima más alta.
Ejemplo 126
Comparación de la curva de respuesta a la dosis de FK506 y la evolución temporal generada por los sistemas de complementación de FRB-NLpoly11S/FKBP-NLpep114 y de luciérnaga dividida
Se transfectaron células HEK293T (800.000) en pocillos de placas de 6 pocillos con un total de 20 ng de pF4A Ag FRB-NLpoly11S y pF4A Ag FKBP-NLpep114 ó 750 ng de pF4A Ag N-Fluc(1-398)-FRB y FKBP-C-Fluc (394-544) usando FuGENE HD a una razón de A d N con respecto a FuGENE de 1 a 4. Se añadió ADN de pGEM-3Zf(+) para llevar el ADN total en cada transfección hasta 1 pg. Veinticuatro horas tras la transfección, volvieron a sembrarse 20.000 células en pocillos de placas de ensayo opacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h adicionales. Luego se trataron las células con rapamicina 0 ó 20 nM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 3 h.
Para los experimentos de respuesta a la dosis de FK506 (figura 170A), se incubaron las células con el inhibidor FK506 de 0 a 100 pM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 5 h, se trataron con furimazina 10 pM y luego se leyeron con un dispositivo GloMax Multi en modo de luminiscencia con un tiempo de integración de 0,5 s.
Para los experimentos de evolución temporal (figura 170B), las células se trataron con FK506 10 pM en OptiMEMI sin rojo de fenol que contenía furimazina 10 pM y se leyó inmediatamente la luminiscencia con un dispositivo GloMax Multi.
La figura 170A-B demuestra que los sistemas de complementación de NLpoly11S/NLpep114 y de luciérnaga dividida muestran una disminución dependiente de la dosis en la producción de luz después del tratamiento con el inhibidor FK506. La pérdida de señal en el sistema de NLpoly11S/NLpep114 comienza en un punto de tiempo anterior, es más rápida y más completa que el sistema de luciérnaga dividida.
Ejemplo 127
Inmunotransferencia de tipo Western que muestra los niveles de expresión de FKBP-NLpep114 y FKBP-Fluc(394-544)
Se transfectaron células HEK293T (200.000) con de 0 a 30 ng de ADN de pF4Ag NLpep114-FKBP o pF4Ag FKBP-Fluc(394-544) usando FugeneHD a una razón de ADN con respecto a Fugene de 1 a 8. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se recogieron las células con tampón de carga de gel de SDS 1X. Las muestras se separaron en un gel de SDS-PAGE de Tris-HCl al 4-10% y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó en BSA al 5% en TBST durante 1 h y luego se incubó con anticuerpo anti-FKBP (Abcam #ab2918) durante la noche. La incubación del anticuerpo secundario con anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante se realizó durante 1 h y luego se desarrolló la transferencia usando sustrato de inmunotransferencia de tipo Western ECL (Promega Corporation) y el sistema Image Quant LAS 4000.
La figura 171 demuestra niveles de expresión similares de FKBP-NLpep114 y FKBP-Fluc(394-544) a niveles iguales de ADN transfectado.
Ejemplo 128
Inhibición específica de dosis y tiempo de la interacción NLpoly11S-BRD4 e histona H3.3-NLpep114 por IBET-151
Se transfectaron células HEK293T (20.000) en pocillos de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos con 10 ng de pF4Ag histona H3.3-NLpep114 y NLpoly11S-NLpoly11S usando FuGENE HD a una razón de ADN con respecto a Fugene de 1 a 8.
Para el experimento de respuesta a la dosis (figura 172A), las células se trataron con IBET-151 de 0 a 10 pM en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 4 h a 37°C y luego se trataron con furimazina 10 pM durante 5 min antes de leer la luminiscencia con un dispositivo GloMax Multi.
Para el experimento de evolución temporal (figura 172B), las células se preincubaron con furimazina 10 pM durante 5 min, se trataron con IBET-151 0-500 nM y se colocaron inmediatamente en un dispositivo GloMax Multi para mediciones de luminiscencia cada 5 min.
La figura 172A-B demuestra una disminución en la luminiscencia dependiente de la dosis tras el tratamiento con el inhibidor de BRD4 IBET-151, que se produce en el plazo de 3 horas de tratamiento, coherente con los informes de la bibliografía.
Ejemplo 129
Dimerización de RAS/CRAF, BRAF/BRAF y CRAF/BRAF en respuesta a GDC0879
Se cotransfectaron células HEK293T (20.000) en pocillos de placas de ensayo de 96 pocillos con combinaciones de pF4Ag NLpoly11S-BRAF, NLpoly11S-CRAF, NLpep114-KRAS o NLpep114-BRAF usando un total de 0,1 ng de ADN por pocillo y FuGENE HD a una razón de 1 a 4. Veinticuatro horas tras la transfección, las células se trataron con de 0 a 10 pM del inhibidor de BRAF GDC0879 en OptiMEMI sin rojo de fenol durante 4 h. Se añadió el sustrato furimazina en OptiMEMI sin rojo de fenol a 10 pM, y se leyó inmediatamente la luminiscencia con un dispositivo GloMax Multi ajustado a 0,5 s de tiempo de integración.
La figura 173 demuestra un aumento dependiente de la dosis de la dimerización de RAS/CRAF, BRAF/BRAF y CRAF/BRAF en respuesta al inhibidor de BRAF GDC0879.
Ejemplo 130
Se examinó la capacidad de doce péptidos sintéticos (figura 180) para complementar estructuralmente tres versiones diferentes de NLpoly11S (es decir, 11S, 11S-aminoácido 157, 11S-aminoácidos 156 y 157). Se prepararon reservas de NLpoly a 35 nM en reactivo NanoGlo y se prepararon reservas de NLpep a 12,5 nM en PBS pH 7,2. Se mezclaron volúmenes iguales y se midió la luminiscencia de las muestras en un lector Tecan Infinite F500 (tiempo de integración de 100 ms; punto de tiempo de 10 min) (figura 200).
Ejemplo 131
Péptido NLpep86 que interactúa espontáneamente
Se diluyó NLPoly11S purificado hasta 40 pM en PBS pH 7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005% (tampón de afinidad). Los NLpep sintéticos (NLPep86, WT, 114) se diluyeron en tampón de afinidad tal como sigue: NLPep86 = 60 nM, NLPep114 = 4,48 mM y NLPepWT = 20 uM. Se mezclaron 25 ul de NLPoly11S y 25 ul de NLPep y luego se incubaron a temperatura ambiental durante 30 min. Luego se añadieron a cada mezcla 50 ul de tampón de afinidad Fz 20 uM y se midió la luminiscencia en un dispositivo GlomaxMulti+ usando una integración de 0,5 s. Se determinaron los valores de Bmáx y Kd usando Graphpad Prism y la unión específica de 1 sitio.
La figura 174 demuestra un intervalo de afinidades de ~100.000 veces usando NLPoly11S y diversos NLpep. Pep86 es un ejemplo de un péptido que interactúa espontáneamente (con LSP 11S), y Pep 114 se muestra a modo de referencia como un péptido que interactúa con baja afinidad.
Ejemplo 132
Titulación de péptido de alta afinidad in vitro
Se titularon NLpoly11S purificado (purificación con HaloTag/expresión de E. coli; pFN18K) y el péptido sintético NLpep86 (obtenido de Peptide 2.0) en un intervalo dinámico lineal usando NLpoly11S 33 nM en tampón de ensayo Nano-Glo® para NLpep86 de alta afinidad 3,3 fM - 100 nM. Para una proteína de 30 kDa, esto corresponde a un LOD de 10 fg.
La figura 176 demuestra el amplio intervalo lineal y la capacidad para detectar concentraciones femtomolares de la etiqueta peptídica de alta afinidad (NLpep86). Esto compite con los kits de inmunotransferencia de tipo Western (WB) quimioluminiscencia potenciada (ECL) más sensibles.
Ejemplo 133
Utilidad similar a inmunotransferencia de tipo Western de NLpoly y NLpep
Se realizó una titulación de HaloTag (HT7)-NLpep80 (80) o NLpep80-HaloTag (HT7) en un gel de SDS-PAGE. Se obtuvieron imágenes de la proteína Halo® con el ligando HaloTag-TMR (Promega Corporation) en un dispositivo de exploración Typhoon. Las muestras se transfirieron a una membrana y se usó PBS pH 7 Prionex al 0,1% NLpoly11S (lisado de E. coli diluido 1:1000) para someter a inmunotransferencia la membrana. Luego se añadió NanoGlo/Fz a la membrana y se obtuvieron imágenes en un dispositivo ImageQuant.
La figura 177 demuestra la sensibilidad de detectar proteínas marcadas con un NLPep de alta afinidad usando NLpoly11S. La figura 177 también compara la detección con NLPep/NLPoly con la detección usando HaloTag marcado con fluorescencia.
Ejemplo 134
Estabilidad de un reactivo NLpoly11S
Se incubó NLpoly11S 100 nM en tampón de ensayo NanoGlo (Promega Corporation) furimazina 100 uM y se sometió a ensayo con cantidades iguales de NLpep86 diluido. Como control, se usó tampón de ensayo NanoGlo furimazina 100 uM para someter a ensayo un mismo volumen de luciferasa NanoLuc® diluida (Promega Corporation).
Los resultados (figura 178) demuestran que un reactivo NLpoly11S (que contiene Fz) tiene una estabilidad similar en comparación con el reactivo de ensayo NanoGlo® comercial (que también contiene Fz).
Ejemplo 135
Titulación de ADN para fusión NLpep78-HT7 de alta afinidad
Se transfectaron inversamente células HEK293 (200.000/ml) con diluciones de 10 veces de ADN (comenzando con 100 ng) de un péptido de alta afinidad, NLpep78, fusionado con proteína HaloTag® (HT7). Se sembraron 100 ul de cada transfección por triplicado en pocillos de una placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas tras la transfección, se añadieron y mezclaron 100 ul de tampón de ensayo NanoGlo® que contenía NLpoly11S 100 nM y 100 ul de furimazina. Se midió la luminiscencia 10 minutos después de la adición del reactivo en un luminómetro GloMax. Los resultados (figura 179) demuestran el amplio intervalo lineal similar al del ejemplo 131/figura 27. Este es esencialmente un experimento similar al que se realizó en el ejemplo 131, excepto que este ejemplo usa un péptido expresado de manera recombinante (fusionado con HaloTag) en una célula de mamífero.
Ejemplo 136
Resultados preliminares (péptidos de matriz)
En la figura 183A, se mezcló NLpoly11S 50 nM con NLpep114 7,5 pM y candidato a péptido oscuro (DP) 37,5 pM (Q-162, A-162, K-162 o E-162). Se añadió reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation) y se incubó durante 5 minutos. Se detectó la luminiscencia.
En la figura 183B, se mezcló NLpoly11S 50 nM en tampón de ensayo (PBS pH7 Prionex al 0,01% DTT 1 mM Tergitol al 0,005%) con NLpep114 7,5 pM (también en tampón de ensayo) y cantidades variables de candidatos a péptido oscuro (DP) Q-162 o K-162 (también en tampón de ensayo). Se añadió reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation) y se incubó durante 5 minutos. Se detectó la luminiscencia en un lector Tecan Infinite F500; tiempo de integración de 100 ms; punto de tiempo de 5 min usado.
El panel A indica que cada uno de los candidatos a péptido (a 7,5 uM) puede inhibir la unión entre NLpoly11S y NLpep114, tal como se indica mediante una menor bioluminiscencia. Obsérvese que estos péptidos “oscuros” generan algo de luminiscencia, por tanto, la señal aumenta en comparación con la ausencia de péptido.
El panel B indica que, con los péptidos Lys-162 y Gln-162, la inhibición depende de la dosis.
Ejemplo 137
Péptidos oscuros de alta pureza (>95%)
En la figura 184A, se mezcló NLpoly11S 5 nM con NLpep114 500 nM y cantidades variables de un candidato a péptido oscuro (DP) Q-162 o A-162 (n=3). Se añadió reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation) y se incubó durante 5 minutos. Se detectó la luminiscencia.
En la figura 184B, se mezcló NLpoly11S 5 nM en tampón de ensayo con cantidades variables de candidatos a péptido oscuro (DP) Q-162 o A-162 en tampón de ensayo (sin NLpep114) (n=3). Se añadió reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation) y se incubó durante 5 minutos. Se detectó la luminiscencia.
Los resultados (figura 184A y B) corroboran los resultados del ejemplo 135, pero en este caso hay una mayor confianza porque los péptidos son más puros. Estos resultados también sugieren que, de las variantes de péptidos oscuros sometidas a prueba, el péptido Ala es el más potente como inhibidor.
Ejemplo 138
Inhibición de luciferasa NanoLuc® permutada circularmente mediante péptidos oscuros
Para determinar si los NLpep de “alta afinidad/baja actividad” (también conocidos como péptidos oscuros) pueden competir con la interacción intramolecular (es decir, el plegamiento de proteínas) entre los residuos de luciferasa (Nluc) NanoLuc® 1-156 y 157-169 en el contexto de Nluc permutada circularmente (CP Nluc).
CP NLuc: NLuc 157-169 --- ligador de 33aa --- Nluc 1-156
Péptidos oscuros: VTGWRLCERIL (wt)
1. Gln-162 VSGWWQLFKKIS
2. Ala-162 VSGWALFKKIS
Se preparó CP Nluc recombinante como una fracción soluble de un lisado concentrado 5x de E. coli (promotor T7; expresión durante la noche). Se usó una dilución de 10.000 veces de CP Nluc en tampón de ensayo (PBS pH 7/Prionex al 0,01%/DTT 1 mM/Tergitol al 0,005%). Se prepararon péptidos oscuros derivados sintéticamente en un intervalo de concentraciones, también en tampón de ensayo. Las reacciones se prepararon usando 30 pl de CP NLuc y 60 pl de péptido oscuro y se sometieron a ensayo mediante la adición de 90 pl de reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation). Se midió la luminiscencia (5 min) en un lector Tecan Infinite F500 (100 ms de integración). Se usaron tres réplicas para las muestras de péptido oscuro. Se usaron dos réplicas para los controles de tampón (ácido acético de reservas de péptidos).
La figura 185 demuestra una dosis-respuesta de los péptidos oscuros con CP Nluc. La figura 186 demuestra una evolución temporal del péptido oscuro (péptido 56 pM) con CP Nluc.
Los resultados indican que ambos péptidos oscuros, en particular la versión Ala162, pueden inhibir significativamente la generación de luminiscencia mediante CP Nluc (Ala162 >2 log; Gln162 >1 log). Esto indica que un enfoque de CP Nluc tiene utilidad para la complementación inversa.
Ejemplo 139
Péptidos oscuros en células
En este ejemplo, se usaron los siguientes constructos:
• Cuatro vectores de péptidos oscuros: pF4Ag FKBP-péptido oscuro Ala-162, Leu-162, Gln-162 y Val-162 • Dos vectores de péptidos no oscuros: pFc5K2 FKBP-NLpep114 (péptido de baja afinidad) y pFc5K2 FKBP-NLpep80 (péptido de alta afinidad)
• Un vector de NLpoly: pFc5K2 FRB-NLpoly11S
Todos los constructos albergaban un promotor de CMV para la expresión en células de mamífero. Todos los constructos de fusiones contenían un ligador flexible Gly-Ser de 10aa.
Se prepararon diluciones en serie de los constructos de péptidos oscuros, Ala-162 (A), Leu-162 (L), Gln-162 (Q) y Val-162 (V), en OptiMem y además contenían ADN portador (pGEM-3Z).
Para la transfección que contenía sólo NLpoly11S, se mezclaron 20 ul de péptido oscuro diluido con 20 ul de NLpoly11S, 60 ul de OptiMem y 8 ul de Fugene. Para las transfecciones que contenían NLpoly11S y NLpep114 o NLpep80, se mezclaron 20 ul de péptido oscuro diluido con 20 ul de NLpoly11S (10 ng/ul), 20 ul de NLpep114 o NLpep80 (10 ng/ul), 40 ul de OptiMem y 8 ul de Fugene. Todos se incubaron a TA durante 15 minutos. Se añadieron 5 ul de cada transfección, por triplicado, a pocillos de dos placas de 96 pocillos (una con rapamicina y otra sin rapamicina). Luego se añadieron a los pocillos 100 ul de HEK293T a 200.000 células/ml en DMEM FBS al 10% y se incubaron las células transfectadas durante la noche a 37°C.
Luego se retiró el medio de las células y se lavaron las células con 200 pl de DPBS. Se añadieron 50 pl de rapamicina 50 nM y se incubaron las células durante 1 hora a 37°C. Se diluyeron 20 pl de furimazina 5 mM en 5 ml de OptiMEMI sin rojo de fenol rapamicina 50 nM, se añadieron 50 pl directamente a las células y se incubaron durante 5 min en un dispositivo GloMax Multi+. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax.
La figura 187 demuestra que los péptidos oscuros, cuando se fusionan con FKBP, pueden reducir la señal de fondo de NLpoly11S (es decir, FRB-NLpoly11S). En conjunto, las figuras 188-190 demuestran que los péptidos oscuros, cuando se fusionan con FKBP, pueden 1) competir con el plegamiento de NanoLuc de longitud completa (es decir, FRB-NanoLuc o NanoLuc-FRB) y 2) competir con péptidos de baja y alta afinidad (también fusiones FKBP) por la unión a NLpoly11S (es decir, FRB-NLpoly11S) y, como resultado, reducir la luminiscencia total que se produce y detecta en células vivas.
Ejemplo 140
Aplicaciones en virología
Además de permitir la medición de los títulos virales, los NLpep que interactúan espontáneamente también permiten estudiar la reagrupación de virus (por ejemplo, gripe). La reagrupación de virus se refiere a la formación de nuevos virus “híbridos” a partir de infecciones duales, por ejemplo, H1N1, H5N1, H3N2 (H es hemaglutinina; N es neuraminidasa); ave, humano, cerdo, pollo (más común en cerdos).
Debido a su naturaleza segmentada, el genoma de la gripe puede mezclarse fácilmente en células huésped infectadas con más de un virus. Cuando una célula se infecta con virus de la gripe de diferentes especies, la reagrupación puede dar como resultado virus de progenie que contienen genes de cepas que normalmente infectan a las aves y genes de cepas que normalmente infectan a los humanos, lo que lleva a la creación de nuevas cepas que nunca se han visto en la mayoría de huéspedes. Además, debido a que se han caracterizado al menos 16 subtipos diferentes y nueve subtipos de neuraminidasa diferentes, son posibles muchas combinaciones diferentes de proteínas de la cápside. De estos subtipos, tres subtipos de hemaglutinina (H1, H2 y H3) y dos subtipos de neuraminidasa (N1 y N2) han causado epidemias sostenidas en la población humana. Las aves son huéspedes de todos los subtipos de gripe A y son el reservorio desde el cual se introducen nuevos subtipos de HA en humanos (Palese, 2004).
La aplicación del presente sistema para detectar la reagrupación es que los dos componentes de los NLpep que interactúan espontáneamente se colocan en diferentes partículas virales, o el componente grande en las células y el componente pequeño en un virus, y la presencia de ambos elementos (por ejemplo, estando presente en una célula) se detecta mediante luminiscencia.
Ejemplo 141
Validación del uso de NLpep86 que interactúa espontáneamente como etiqueta de epítopo para proteínas degradadas por el proteasoma
Se llevaron a cabo experimentos durante el desarrollo para validar el uso de NLpep86 como etiqueta para monitorizar los niveles de expresión de proteínas degradadas por el proteasoma. Para hacer esto, se fusionó NLpep86 con variantes de luciferasa de luciérnaga que también se fusionaron o bien con una o bien con más secuencias de PEST, CL1 o ubiquitina (pBC21, 22, 24-29). Se espera que cada uno de estos constructos experimente una renovación mediada por proteasoma en diversos grados después de la expresión de un promotor de CMV mutante (d1CMV).
Los constructos pBC21, 22, 24-29 y los constructos de control que expresan luciferasa de luciérnaga sin etiquetar o luciferasa de luciérnaga sin etiquetar fusionada con una secuencia de PEST (ATG082 y ATG083) se transfectaron transitoriamente en células HELA sembradas a 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos usando 100 pl de DMEM FBS al 10%. Al día siguiente, se añadieron 10 pl de una mezcla de transfección (920 ul de OptiMEMI 5 ug del constructo respectivo 15 ul de FuGENE HD) por pocillo y se permitió que las células se incubaran durante 48 horas en una incubadora a 37°C que contenía el 5% de CO2. Los niveles de expresión de proteínas se cuantificaron en pocillos replicados para cada constructo mediante la detección de la actividad de luciferasa de luciérnaga o mediante la adición de un reactivo de detección que contenía NLpoly11S (NLpoly11S purificado añadido a NanoGlo®). Se observó una buena correlación entre las señales de NLpep86 y Fluc en cada caso, lo que sugiere que la detección de NLpep86 puede usarse para monitorizar los niveles de expresión de proteínas de fusión para proteínas degradadas por el proteasoma.
BC21 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc (alta afinidad)
BC22 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-FlucP (alta afinidad)
BC24 pFC15A/MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-CL1
BC25 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-PEST12opt (alta afinidad)
BC26 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-CP (alta afinidad)
BC27 UBQ G76V-VGKLGRQDP-Fluc(EDAKNIKK..)-GGSGGGGSGG-VSGWRLFKKIS (alta afinidad)
BC28 UBQ-RGKLGRQDP-Fluc(EDAKNIKK..)-GGSGGGGSGG-VSGWRLFKKIS (alta afinidad)
BC29 UBQ-LGKLGRQDP-Fluc (EDAKNIKK..)-GGSGGGGSGG-VSGWRLFKKIS (alta afinidad)
ATG083 D1 FlucP; pF4Ag CMV Luc2-PEST
ATG082 D1Fluc; pF4Ag CMV Luc2
Después de una incubación de 48 horas, se añadieron a cada pocillo 100 ul de reactivo de NLpep11S NanoGlo® (90 ul de NLpoly11S en 50 ml de reactivo de ensayo NanoGlo®) y se incubaron durante 3 minutos con agitación. Luego se leyó la luminiscencia en un luminómetro GloMax (0,5 s/pocillo).
Los resultados de la figura 191 demuestran que la señal de Fluc y NLpep86 parecen reflejarse entre sí con respecto al brillo relativo y tienen RLU similares. BC21, BC25 y BC29 son los constructos más brillantes de la serie Bc , y BC21 parece ser el más brillante en este experimento. BC24, 26 y 27 son los menos brillantes que se predicen a partir de la desestabilización diseñada por ingeniería.
Ejemplo 142
Este ejemplo demuestra que un péptido complementario conocido puede usarse como ligador entre el mismo, o uno diferente, NLpep complementario y NLpoly11S (por ejemplo, NLpep78(2X)).
Se transfectaron células HEK293T (20.000) con una mezcla que contenía 20 |il de ADN de NLpep78-HaloTag (HT) o NLpep78(2x)-HT, 80 |il de Opimex sin fenol y 8 |il de FugeneHD. Las células se cultivaron durante la noche a 37°C y se sometieron a ensayo a las 24 h con reactivo de ensayo NanoGlo® (Promega Corporation) que contenía NLpoly11S purificado 33 nM.
Los resultados (figura 192) demuestran que puede usarse un péptido de unión en tándem y que puede ser suficiente como ligador.
Ejemplo 143
Comparación de las actividades específicas de los residuos 1-156 de luciferasa de Oplophorus de tipo natural, NLpoly11S y NanoLuc en lisados de HEK293T
Cada clon se insertó en el vector pFN21A HaloTag® CMV Flexi® (Promega G2821) y los lisados se prepararon tal como sigue: se sembraron 3 ml de células HEK293T que se diluyeron hasta una concentración de 200.000 células/ml (600.000 células en total) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37°C en una incubadora con CO2. Al día siguiente, se prepararon complejos de transfección de cada ADN combinando 6,6 |ig de ADN, Opti-MEM® (Life Technologies 11058-021) hasta un volumen final de 310 |il y 20 |il de FuGENE® HD (Promega E231a). Los complejos de transfección se incubaron durante 20 minutos y luego se añadieron 150 |il de cada complejo por duplicado a las células. Las células se cultivaron durante la noche a 37°C en una incubadora con CO2. Al día siguiente, se lavaron las células con DPBS (Life Technologies 14190-144) y se añadió 1 ml de DPBS recién preparado. Se congelaron las células para la lisis y luego se descongelaron para las pruebas. Se combinaron lisados de reacciones de transfección por duplicado.
Para cuantificar el nivel de expresión de proteína para cada muestra, se marcó cada muestra con ligando HaloTag® TMR (Promega Corporation) tal como sigue: se diluyó 1:100 el ligando HaloTag® TMR (Promega G8251) en agua hasta una concentración de 0,05 mM; se mezclaron 100 |il de cada lisado con 2 |il de ligando TMR diluido y se incubaron durante 30 minutos a TA; se añadieron 20 |il de colorante de carga SDS y se calentaron las muestras hasta 95°C durante 5 minutos. Se cargaron 10 |il y 20 |il de cada muestra en un gel de poliacrilamida (Bio-Rad, gel de Tris-HCl Criterion™ al 4-15% #345-0030), se desarrollaron a 200 V durante 1 hora y luego se cuantificaron usando un dispositivo ImageQuant™ LAS 4000 (GE). Tanto NLpoly11S como la luciferasa NanoLuc® (Nluc) se expresaron aproximadamente 4 veces más que 1-156.
Con el fin de comparar las actividades específicas de Nluc (enzima de longitud completa) con Oplophorus 1-156 wt y NLpoly11S en combinación con el péptido Oplophorus 157-169 wt (proteínas binarias), se desarrollaron titulaciones de sustrato para todas las muestras, excepto para las muestras binarias en las que las titulaciones de sustrato se desarrollaron a múltiples concentraciones de péptidos. Usando este formato, fue posible calcular un valor de Vmáx para Nluc y valores de Vmáx y Bmáx para NLpoly11S y Oplophorus 1-156 wt. Se realizaron tres experimentos independientes usando este formato y los valores de Vmáx y Bmáx se normalizaron frente a Vmáx de NanoLuc. Las actividades específicas relativas (calculadas como promedios de Vmáx y Bmáx) se normalizan frente a NanoLuc.
Muestra Actividad específica relativa (*con péptido 157-169 wt)
NanoLuc 1,00
1-156 wt 0,07
11S 0,18'
Ejemplo 144
Efecto de NLpoly y NLpep sobre la semivida intracelular de FlucP
Para determinar si agregar o bien NLpoly11S o bien NLpep114 a Luc2-PEST altera la semivida intracelular medida por la disminución en la señal después del tratamiento con cicloheximida (CHX).
Día 1: sembrar células HeLa en placas de 6 pocillos. Colocar 3 ml de células (200.000/ml) en dos placas de 6 pocillos. Cultivar durante la noche. DMEM+FBS al 10%.
Se transfectaron constructos que contenían FlucP, 157-169 wt FlucP, NLpoly11S, NLpep114 FlucP y pBC22 (todos pF4Ag D1-CMV) en células HeLa. Brevemente, se añadieron 33 ul de a Dn (3,3 ug) a 122 ul de OptiMem, se mezclaron y se añadieron 9,9 ul de FuGENE®HD. Luego se incubaron las mezclas de transfección a TA durante 20 minutos y se añadieron 150 ul a las células. Después de una incubación durante la noche, las células volvieron a sembrarse a 10.000 células/pocillo y se incubaron de nuevo durante la noche.
Después de la incubación, se retiró el medio de crecimiento y se reemplazó con cicloheximida (CHX) 0,4 mM o control (DMSO). En cada punto de tiempo, se añadió reactivo de ensayo ONE-Glo™, se incubó a TA durante 3 minutos y se midió la luminiscencia en un luminómetro Tecan GENios Pro.
La figura 193 demuestra que ninguno de los componentes de NLpoly o NLpep sometidos a prueba interfiere con la degradación intracelular normal de una enzima indicadora (FlucP).
Ejemplo 145
Ensayo de actividad de proteasa extracelular
En este ejemplo se divulga un ensayo para la actividad de proteasa extracelular (por ejemplo, caspasa). Se proporciona un péptido extinguido (por ejemplo, péptido de alta afinidad tal como NLpep86) al que sólo puede accederse y que puede replegarse en una luciferasa activa con un NLpoly, por ejemplo, NLpoly11S, tras la retirada del resto extintor por una proteasa (por ejemplo, caspasa) (figura 194). Se introducen NLpoly11S y furimazina en el ensayo como reactivo y luego se mide la bioluminiscencia de las muestras.
Ejemplo 146
Progrupos unidos medialmente (isopéptidos y aminoácidos glicosilados)
Se proporcionan ensayos para medir la actividad de una enzima mediante el uso de un ProNLpep. Esta configuración de ProNLpep es un NLPep con uno de los aminoácidos internos conjugado con un grupo que impide la complementación del péptido a un NLpoly. Cuando este ProNLpep encuentra una enzima que retira el grupo bloqueador (por ejemplo, caspasa 1 en el caso de WEHD o una glucosidasa en el caso del glicósido de serina), se restablece la capacidad del NLpep para complementarse con un NLpoly (figura 195). En presencia de furimazina, esto da como resultado la producción de luz en proporción a la actividad de la enzima de interés. Debido a que cada escisión enzimática da como resultado la formación de una luciferasa, se espera que la sensibilidad de este sistema para someter a ensayo pequeñas concentraciones de enzima sea alta.
Ejemplo 147
Evaluación del ligador
Se proporcionan ensayos que miden la liberación de carga de un anticuerpo. Un NLpep se une a un resto de reconocimiento de anticuerpo, proteína, péptido o transportador de tal manera que evita que se asocie con un NLpoly para formar una luciferasa. Tras un estímulo, tal como internalización celular, se escinde el ligador entre el resto de reconocimiento de anticuerpo, proteína, péptido o transportador y el NLpep, debido al potencial de reducción intracelular, y se libera el NLpep (figura 196). El NLpep ahora puede complementarse con un NLpoly para formar una luciferasa, y la luz generada será proporcional a la escisión del ligador. Esto proporciona un sistema para medir la liberación de un compuesto a partir de un anticuerpo, que es un sustituto de la liberación de fármacos citotóxicos a partir de conjugados fármaco-anticuerpo. El ligador puede escindirse de cualquier manera conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante proteasas intracelulares o sensibilidad al pH. Nuevamente, debido a que se genera una luciferasa a través de cada escisión, se espera que este sea un método sensible para someter a ensayo la escisión.
Ejemplo 148
El uso de anticuerpos para seleccionar como diana y destruir células enfermas ha demostrado ser una promesa terapéutica significativa y se produce a través de un proceso denominado citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Hay muchas formas de monitorizar la actividad de ADCC, incluyendo la reticulación de diferentes tipos de células o la monitorización de la transcripción de genes usando indicadores de luciferasa específicos expresados en las células efectoras. Una posible lectura alternativa para el mecanismo de acción de la ADCC podría estar en el control de interacciones proteína:proteína específicas inducidas o interrumpidas después de la unión de anticuerpos terapéuticos a sus antígenos o receptores diana presentados en la superficie celular. Las interacciones proteína:proteína específicas se monitorizan usando el sistema de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, que proporciona una lectura en el marco de tiempo de minutos frente a horas que requieren otros métodos.
Ejemplo 149
Inmunoensayos
En este ejemplo se divulga un uso en inmunoensayos homogéneos, por ejemplo, tal como se muestra en la figura 201, donde NLpep y NLpoly se fusionan con restos de unión (por ejemplo, A y B). Los restos de unión A y B pueden comprender muchos componentes diferentes, formando varios formatos de inmunoensayos diferentes que pueden utilizarse como ensayos específicos de la diana o reactivos más generalizados para su uso en inmunoensayos. Los restos de unión sólo entrarán en contacto íntimo en presencia de la diana, por lo que NLpep y NLpoly entrarán en contacto íntimo, lo que dará como resultado la producción de luminiscencia tras la adición del sustrato. La tabla 7 enumera ejemplos de restos de unión (Mie et al. The Analyst. 7 de marzo de 2012; 137 (5): 1085-9; Stains et al. ACS chemical biology. 15 de octubre de 2010; 5 (10): 943-52; Ueda et al. Journal of immunological methods. Agosto de 2003;279(1-2):209-18; Ueda et al. Nature biotechnology. Diciembre de 1996; 14 (13): 1714-8; Lim et al. Analytical biochemistry. 15 de agosto de 2007; 79 (16): 6193-200; Komiya et al. Analytical biochemistry. 15 de abril de 2004; 327 (2): 241-6; Shirasu et al. Analytical sciences: the international journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. Septiembre de 2009; 25 (9): 1095-100).
Tabla 7.
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Cuando los restos de unión están compuestos por proteína A, proteína G o dominios de proteína A o G, el sistema de inmunoensayo utiliza las fusiones de NLpoly y NLpep para formar complejos con anticuerpos antes de que se le añada la muestra que contiene la diana. Los anticuerpos se unen de manera no covalente a las proteínas A y G de forma natural. La introducción de un acoplamiento covalente entre el anticuerpo y las fusiones se introducen en la etapa de formación del complejo. Los restos de unión de las fusiones NLpep/NLpoly-proteína A/G/dominio pueden formar complejos con los anticuerpos en diversos formatos, por ejemplo:
• individualmente con dos anticuerpos específicos diferentes que seleccionan como diana dos proteínas diferentes para determinar si las proteínas existen en el complejo;
• junto con un único anticuerpo policlonal específico de la diana;
• junto con el anticuerpo secundario (por ejemplo, anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón) para unirse a la muestra preincubada con el anticuerpo primario (por ejemplo, IgG de ratón específica de la diana); e
• individualmente con dos anticuerpos que seleccionan como diana dos epítopos diferentes en la misma proteína diana.
Tal como se describe en la tabla 7, los restos de unión son anticuerpos específicos de la diana, dominios de anticuerpos específicos de la diana, dominios de receptor que se unen a ligandos de la diana o una combinación de anticuerpos, dominios de anticuerpo y dominios de receptor de la diana.
Las dianas se monitorizan en muestras que incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, suero, lisados celulares, células (primarias o líneas celulares), sobrenadante de cultivo celular, líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, muestras de biopsia de tejido, compuestos químicos, etc.
Los métodos describen el análisis de dianas que incluyen, pero no se limitan a: proteínas, moléculas y compuestos pequeños, haptenos, péptidos, hormonas, interacciones heterodiméricas proteína-proteína, antígenos de la superficie celular, interacciones entre receptores y ligandos, proteínas en complejos, virus y componentes virales, bacterias, toxinas, fármacos sintéticos y naturales, esteroides, catecolaminas, eicosanoides, acontecimientos de fosforilación de proteínas, etc.
Las aplicaciones incluyen, pero no se limitan a, detección o cuantificación de la diana para monitorización clínica de enfermedades, diagnósticos, monitorización de fármacos terapéuticos, investigación biológica, productos farmacéuticos, detección y monitorización de compuestos en la industria de alimentos/bebidas/fragancias, identificación de clados virales, etc.
Las aplicaciones adicionales incluyen cribado de alto rendimiento de moléculas capaces de alterar las interacciones de la diana con su receptor, lo que da como resultado un ensayo de pérdida de señal. Hay varios formatos propuestos para el uso de NLpep/NLpoly en inmunoensayos. En algunas realizaciones, estos se realizan de manera homogénea y se suministran como un kit, como componentes independientes del kit de investigación y diagnóstico, o como reactivos independientes personalizables para el ensayo individual.
Por ejemplo, el inmunoensayo homogéneo que utiliza NLpep/NLpoly utiliza variaciones de la tecnología HitHunter o CEDIA (Yang et al. Analytical biochemistry. 1 de enero de 2005; 336 (1): 102-7; Golla y Seethala, Journal of biomolecular screening. Diciembre de 2002;7(6):515-25). En tales ensayos, los componentes incluyen: anticuerpo específico de la diana, NLpoly, fusión NLpep-diana recombinante, y sustrato. El NLpoly y la fusión NLpep-diana recombinante forman un complejo luminiscente cuando el NLpep no está unido al anticuerpo específico de la diana. Tras la adición de la muestra de prueba a los componentes de ensayo, la cantidad de luminiscencia es directamente proporcional a la concentración de la diana en la muestra de prueba, ya que la diana presente en la muestra de prueba competirá con la fusión NLpep-diana recombinante en el anticuerpo (por ejemplo, la ganancia de señal indica la presencia de la diana).
Ejemplo 150
Configuraciones a modo de ejemplo para NLpoly11S en complementación espontánea
Diversas configuraciones de NLpoly 11S pueden encontrar uso en sistemas o ensayos de complementación espontánea. Tales configuraciones pueden incluir: deleciones en el extremo C-terminal (por ejemplo, para reducir la luminiscencia de fondo), agregaciones N-terminales y/o C-terminales (por ejemplo, basándose en si van a purificarse mediante His o HaloTag), etc. Por ejemplo, la agregación que deja HaloTag cuando es una etiqueta N-terminal es SDNIAI. Las configuraciones a modo de ejemplo incluyen: SDNAIA-11S (purificación con HaloTag); SDN-11S; SDNAIA-11S, con única del. en el extremo C-terminal; SDN-11S, con única del. en el extremo C-terminal; SDNAIA-11S, con doble del. en el extremo C-terminal; SDN-11S, con doble del. en el extremo C-terminal; SDNAIA-11S, con triple del. en el extremo C-terminal; SDN-11S, con triple del. en el extremo C-terminal; 6His-AIA-11S; 6His-11S; 6His-AIA-11S con única del. en el extremo C-terminal; 6His-11S con única del. en el extremo C-terminal; 6His-AIA-11S con doble del. en el extremo C-terminal; 6His-11S con doble del. en el extremo C-terminal; 6His-AIA-11S con triple del. en el extremo C-terminal; 6His-11S con triple del. en el extremo C-terminal; 11S-6His; 11S-6His, menos el residuo de 11S del extremo C-terminal; 11S-6His, menos los dos últimos residuos de 11S del extremo C-terminal; 11S-6His, menos los últimos tres residuos de 11S del extremo C-terminal; 11S-HT7, menos el residuo de 11S del extremo C-terminal; 11S-HT7, menos los dos últimos residuos de 11S del extremo C-terminal; 11S-HT7, menos los últimos tres residuos de 11S del extremo C-terminal; 6His-HT7-AIA-11S; 6His-HT7-11S; 6His-AIA-HT7-11S (con del. únicas, dobles, triples de 11S del extremo C-terminal); 6His-HT7-11S (con del. únicas, dobles, tiples de 11S del extremo C-terminal); 11S-HT7-6His; 11S-HT7-6His (con del. únicas, dobles, tiples de 11S del extremo C-terminal); y 11S ternario.
Ejemplo 151
Interacciones de proteínas para estudios de complementación binaria
El sistema de complementación binaria descrito en el presente documento se ha usado para analizar una amplia variedad de interacciones de proteínas (véase la tabla 8).
Tabla 8. Interacciones de proteínas para estudios de complementación binaria
Interacción Estado
V2R/ARRB2 Sometida a prueba
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Homodimerización de GR Sometida a prueba
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Multimerización de GABAA En progreso
Ejemplo 152
Constantes de disociación y valores de Bmáx para NLpoly con 108 variantes de NLpep (matriz n.° 2)
Se sintetizaron NLpep en formato de matriz por New England Peptide (péptidos bloqueados en el extremo N-terminal por acetilación y en el extremo C-terminal por amidación; los péptidos en matrices se sintetizaron a una escala de ~2 mg) (tabla 9). Cada péptido se liofilizó en 2 placas independientes. Cada pocillo de 1 de las placas de péptidos se disolvió en 100 ul de agua nanopura, y se midió la A260 y se usó para calcular la concentración usando el coeficiente de extinción de cada péptido. Luego se ajustó la concentración basándose en la pureza del péptido y se añadió agua nanopura para dar una concentración final de 800 uM.
Tabla 9. Secuencias de matriz 2 de péptidos
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Se diluyeron los péptidos hasta 400 uM (4X) en PBS Prionex al 0,1% y luego se diluyeron en serie 7 veces (8 concentraciones en total) en etapas de 0,5 log (dilución de 3,162 veces). Se diluyó 1:10A6 NLpoly 11S en PBS Prionex al 0,1%. Se mezclaron 25 ul de cada NLpep 25 ul de NLpoly 11S y se incubaron durante 30 min a TA. Se añadieron 50 ul de NanoGlo+ Fz 100 uM y se incubaron durante 30 min a TA. Se midió la luminiscencia en un dispositivo GloMax Multi+ con integración de 0,5 segundos. Se determinaron Kd/Bmáx usando Graphpad Prism, unión específica de un sitio, valores de mejor ajuste. La tabla 10 indica la constante de disociación y los valores de Bmáx para NLpoly 11S y el NLPep indicado. Los resultados indican los efectos de las mutaciones sobre la unión a NLpoly 11S y la capacidad del complejo para producir luminiscencia.
Tabla 10
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Ejemplo 153
Péptidos oscuros y péptidos extintores para reducir la señal de fondo de NLpoly11S
Se diluyó una muestra purificada de NLpoly11S en el reactivo NanoGlo para dar una concentración final de 2 uM. Pep86 es un péptido luminogénico de alta afinidad y se usó para inducir la señal máxima para NLpoly11S. Pep86 se preparó a 1 nM en PBS (pH 7,2) para una disolución de trabajo. Se disolvieron el péptido oscuro y los péptidos extintores (figura 180) hasta 1 mM (o menos) en o bien PBS pH 7,2 o bien NH4HCO3 150 mM y se añadieron en un mismo volumen a NanoGlo/NLpoly11S y luego se leyeron las muestras en un lector Tecan Infinite F500 usando un punto de tiempo de 5 min.
La figura 202A muestra que tanto GWALFKK como dabcilo-GWALFKK reducen la luminiscencia de fondo generada por NLpoly11S en ausencia de cualquier otro péptido luminogénico. La figura 202B muestra que Pep86 es capaz de inducir luminiscencia incluso en presencia de GWALFKK y dabcilo-GWALFKK.
La figura 203A muestra que VTGWALFEEIL (Trp 11 meros) y VTGYALFEEIL (Tyr 11 meros) inducen luminiscencia con respecto al fondo (NLpoly11S solo; sin control de péptido), pero que las versiones de dabcilo N-terminales de cada uno proporcionan una extinción significativa de esta señal. La figura 203B muestra que Pep86 es capaz de inducir luminiscencia incluso en presencia de las versiones de dabcilo de Trp 11 meros y Tyr 11 meros.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Sistema de pares no luminiscentes para su uso en la detección y monitorización de interacciones moleculares, por ejemplo, interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína-ARN, ARN-ADN, proteína-molécula pequeña o ARN-molécula pequeña, comprendiendo dicho sistema:
(a) un péptido no luminiscente que tiene menos del 100% y más del 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 390 o SEQ ID NO: 2271, en el que se produce una señal bioluminiscente detectable en presencia de un sustrato cuando el péptido se asocia con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 440; y
(b) un polipéptido no luminiscente que tiene menos del 100% y más del 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 440, en el que el polipéptido comprende dos o más diferencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 440, y en el que se produce una señal bioluminiscente detectable en presencia de un sustrato cuando el polipéptido se asocia con un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 2;
en el que la señal bioluminiscente detectable se produce en presencia de un sustrato cuando el péptido no luminiscente se asocia con el polipéptido no luminiscente.
2. Sistema según la reivindicación 1, en el que el péptido no luminiscente presenta una mejora de uno o más rasgos en comparación con SEQ ID NO: 2, en el que los rasgos se seleccionan de: afinidad por el polipéptido no luminiscente que consiste en SEQ ID NO: 440, expresión, solubilidad intracelular, estabilidad intracelular y actividad bioluminiscente cuando se asocia con el polipéptido no luminiscente que consiste en SEQ ID NO: 440.
3. Sistema según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido no luminiscente es sintética, contiene aminoácidos no naturales o es un mimético peptídico.
4. Sistema según la reivindicación 1, en el que el péptido no luminiscente forma parte de un primer polipéptido de fusión con un primer polipéptido de interacción, en el que el polipéptido no luminiscente forma parte de un segundo polipéptido de fusión con un segundo polipéptido de interacción, en el que los polipéptidos de interacción primero y segundo están configurados para formar un complejo tras el contacto del primer polipéptido de interacción y el segundo polipéptido de interacción, y en el que el péptido no luminiscente y el polipéptido no luminiscente forman un complejo bioluminiscente y producen una señal bioluminiscente detectable en presencia de un sustrato tras la formación del complejo entre los polipéptidos de interacción primero y segundo.
5. Complejo bioluminiscente que comprende los polipéptidos de fusión primero y segundo según la reivindicación 4.
6. Sistema según la reivindicación 1, en el que el polipéptido no luminiscente presenta una mejora de uno o más rasgos en comparación con SEQ ID NO: 440, en el que los rasgos se seleccionan de: afinidad por el péptido no luminiscente que consiste en SEQ ID NO: 2, expresión, solubilidad intracelular, estabilidad intracelular y actividad bioluminiscente cuando se asocia con el péptido no luminiscente que consiste en SEQ ID NO: 2.
7. Sistema según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido no luminiscente es sintética, contiene aminoácidos no naturales o es un mimético peptídico.
8. Método para detectar una interacción molecular entre los polipéptidos de interacción primero y segundo del sistema según la reivindicación 4 para formar un complejo de interacción, comprendiendo el método la medición de una señal bioluminiscente en presencia de un sustrato, en el que una señal bioluminiscente sirve como indicador de la formación del complejo de interacción.
9. Método según la reivindicación 8, en el que los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de fusión se usan para la expresión de los polipéptidos de fusión.
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