BR112015023394B1

BR112015023394B1 - Sistema e complexo bioluminescente

Info

Publication number: BR112015023394B1
Application number: BR112015023394-5A
Authority: BR
Inventors: Andrew S. Dixon; Lance Encell; Mary Hall; Keith Wood; Monika Wood; Marie Schwinn; Brock F. Binkowski; Hicham Zegzouti; Nidhi Nath; Subhanjan Mondal; Said Goueli; Poncho Meisenheimer; Thomas Kirkland; James Unch; Dileep K. Pulukkunat; Matthew Robers; Melanie Dart; Thomas Machleidt
Original assignee: Promega Corporation
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2023-08-29
Also published as: DK2970412T3; SG10201601929YA; JP2020097597A; JP7280842B2; US10648971B2; BR112015023394B8; EP2970412A1; US9869670B2; IL273989B; IL240985A0; IL286816A; ES2929362T3; BR112015023394A2; AU2014236949A1; PT2970412T; CN105143249A; US20180313825A1; US20200292534A1; US9797889B2; US10288605B2

Abstract

SISTEMA, COMPLEXO BIOLUMINESCENTE E MÉTODO DE DETECÇÃO DE UMA INTERAÇÃO Aqui apresentados estão composições e métodos para a montagem de um complexo bioluminescente a partir de duas ou mais unidades peptídicas e/ou polipeptídicas não luminescentes (por exemplo, significativamente não luminescentes). Em particular, a atividade bioluminescente é conferida mediante a ligação de um polipeptídeo não lumines-cente através de complementação estrutural a outro peptídeo não luminescente comple-mentar. Processos biológicos dependem de interações covalentes e não covalentes entre moléculas, macromoléculas e complexos moleculares. A fim de compreender esses processos e desenvolver técnicas e compostos para manipular os mesmos para aplica-ções de pesquisa, clinicas e outras aplicações práticas, se necessário para ter ferra-mentas disponíveis para detectar e monitorar estas interações.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório de Patente US N.° de Série 61/791.549, depositado em 15 de março de 2013, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] São aqui apresentados composições e métodos para a montagem de um complexo bioluminescente a partir de duas ou mais unidades peptídicas e/ou polipeptídicas não luminescentes (por exemplo, significativamente não luminescentes). Em particular, a atividade bioluminescente é conferida a um polipeptídeo não luminescente através da complementação estrutural com outro peptídeo não luminescente complementar.

FUNDAMENTOS

[003] Os processos biológicos dependem de interações covalentes e não covalentes entre as moléculas, macromoléculas e complexos moleculares. Para entender tais processos e desenvolver técnicas e compostos para manipulá-los para pesquisa, clínica e outras aplicações práticas, é necessário ter ferramentas disponíveis para detectar e monitora estas interações. O estudo destas interações, particularmente em condições fisiológicas (por exemplo, em níveis de expressão normal para monitoramento de interações proteicas), requer alta sensibilidade.

SUMÁRIO

[004] A presente invenção refere-se a composições que compreendem cadeias de aminoácidos não luminescentes complementares (por exemplo, peptídeos significativamente não luminescentes e/ou polipeptídeos que não são fragmentos de uma proteína preexistente), os seus complexos, e métodos para geração de um sinal bioluminescente opticamente detectável mediante a associação das cadeias de aminoácidos não luminescentes (por exemplo, peptídeos e/ou polipeptídeos). Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta dois ou mais peptídeos e/ou polipeptídeos não luminescentes ou significativamente não luminescentes, que, quando juntos, se unem em um complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, um par de unidades peptídicas e/ou polipeptídicas significativamente não luminescentes se une em um complexo bioluminescente. Em outras modalidades, três ou mais unidades peptídicas e/ou polipeptídicas significativamente não luminescentes se unem em um complexo bioluminescente (por exemplo, complexo ternário, complexo terciário, etc.). São aqui apresentadas tecnologias para a detecção de interações entre as entidades moleculares (por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, pequenas moléculas (por exemplo, pequenas bibliotecas moleculares)), correlacionando tais interações à formação de um complexo bioluminescente de cadeias de aminoácidos outrora não luminescentes (por exemplo, significativamente não luminescentes).

[005] Em algumas modalidades, o par montado catalisa uma reação química de um substrato apropriado em um estado de alta energia, e luz é emitida. Em algumas modalidades, um complexo bioluminescente exibe luminescência na presença de substrato (por exemplo, coelenterazina, furimazina, etc.).

[006] Embora as modalidades aqui descritas primariamente descrevam e refiram-se a cadeia de aminoácidos não luminescentes complementares que formam complexos bioluminescentes, observa-se que a presente tecnologia pode igualmente ser aplicada a outros atributos detectáveis (por exemplo, outras atividades enzimáticas, geração de um fluoróforo, a geração de um cromóforo, etc.). As modalidades aqui descritas relacionando-se à luminescência devem ser vistas como se aplicando a cadeias de aminoácidos complementares significativamente não enzimaticamente ativas (por exemplo, peptídeos e/ou polipeptídeos que não são fragmentos de uma proteína preexistente) que carecem separadamente de uma atividade detectável específica (por exemplo, atividade enzimática) ou subunidades significativamente não enzimaticamente ativas de um polipeptídeo, seus complexos, e métodos para gerar a atividade detectável (por exemplo, uma atividade enzimática) mediante a associação das cadeias de aminoácidos complementares significativamente não enzimaticamente ativos (por exemplo, peptídeos e/ou polipeptídeos). Além disso, modalidades aqui descritas que se referem a peptídeos e/ou polipeptídeos não luminescentes são aplicadas, em algumas modalidades, a peptídeos e/ou polipeptídeos significativamente não luminescentes.

[007] A invenção é ainda dirigida a ensaios para a detecção de interações moleculares entre moléculas de interesse ao ligar a interação de um par de peptídeos/polipeptídeos não luminescentes à interação das moléculas de interesse (por exemplo, associação transitória, associação estável, formação de complexos, etc.). Em tais modalidades, um par de elementos não luminescentes é unido (por exemplo, fundido) a moléculas de interesse e a montagem do complexo bioluminescente é operada pela interação molecular das moléculas de interesse. Se as moléculas de interesse se engajam em uma interação suficientemente estável, o complexo bioluminescente se forma, e um sinal bioluminescente é gerado. Se as moléculas de interesse falham em se engajar em uma interação suficientemente estável, o complexo bioluminescente não se formará ou se formará apenas fracamente, e um sinal bioluminescente não é detectável ou é significativamente reduzido (por exemplo, significativamente indetectável, essencialmente não detectável, etc.). Em algumas modalidades, a magnitude do sinal bioluminescente detectável é proporcional (por exemplo, diretamente proporcional) à quantidade, potência, favorecimento e/ou estabilidade das interações moleculares entre as moléculas de interesse.

[008] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% (por exemplo, 20%... 30%... 40%... 50%... 60%... 70%... 80% ou mais) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o peptídeo entra em contato com um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta peptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o peptídeo entra em contato com um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o peptídeo entra em contato com um polipeptídeo possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440. Em certas modalidades, o sinal bioluminescente detectável é produzido, ou é significativamente aumentado, quando o peptídeo se associa com o polipeptídeo que compreende ou consiste na SEQ ID NO: 440, ou sua fração. Em modalidades preferidas, o peptídeo exibe alteração (por exemplo, aprimoramento) de uma ou mais características em comparação a um peptídeo da SEQ ID NO: 2, em que as características são selecionadas a partir de: afinidade para o polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440, expressão, solubilidade intracelular, estabilidade intracelular e atividade bioluminescente quando combinado com o polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440. Embora não se limite a estas sequências, a sequência de aminoácidos do peptídeo pode ser selecionada a partir de sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados polipeptídeos de fusão que compreendem: (a) um peptídeo descrito acima, e (b) um primeiro polipeptídeo de interação que forma um complexo com um segundo polipeptídeo de interação mediante contato do primeiro polipeptídeo de interação com o segundo polipeptídeo de interação. Em certas modalidades, são apresentados complexos bioluminescentes que compreendem: (a) um primeiro polipeptídeo de fusão descrito acima e (b) um segundo polipeptídeo de fusão que compreende: (i) o segundo polipeptídeo de interação e (ii) um polipeptídeo complementar que emite um sinal bioluminescente detectável quando associado ao peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2; em que o primeiro polipeptídeo de fusão e o segundo polipeptídeo de fusão estão associados; e em que o peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 e o polipeptídeo complementar estão associados.

[009] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o polipeptídeo entra em contato com um peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o polipeptídeo entra em contato com um peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o polipeptídeo entra em contato com um peptídeo possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo exibe alteração (por exemplo, aprimoramento) de uma ou mais características em comparação com um peptídeo da SEQ ID NO: 440, em que as características são selecionadas a partir de: afinidade para o peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2, expressão, solubilidade intracelular, estabilidade intracelular e atividade bioluminescente quando combinado com o peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2. Embora não se limite a tais sequências, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo pode ser selecionada a partir de uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, o sinal bioluminescente detectável é produzido quando o polipeptídeo se associa com o peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, é apresentado um polipeptídeo de fusão que compreende: (a) um polipeptídeo descrito acima e (b) um primeiro polipeptídeo de interação que forma um complexo com um segundo polipeptídeo de interação mediante contato do primeiro polipeptídeo de interação com o segundo polipeptídeo de interação. Em certas modalidades, é apresentado um complexo bioluminescente que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo de fusão descrito acima; e (b) um segundo polipeptídeo de fusão que compreende: (i) o segundo polipeptídeo de interação e (ii) um peptídeo complementar que faz com que o polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440 emita um sinal bioluminescente detectável quando uma associação é formada entre os dois; em que o primeiro polipeptídeo de fusão e o segundo polipeptídeo de fusão estão associados; e em que o polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440 e o peptídeo complementar estão associados.

[010] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA, etc.), oligonucleotídeos, vetores, etc., que codificam qualquer um dos peptídeos, polipeptídeos, proteínas de fusão, etc., aqui descritos. Em algumas modalidades, é apresentado um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma das sequências de ácidos nucleicos das SEQ ID NO: 3-438 e 2162-2365 (codificando os peptídeos não luminescentes) e/ou SEQ ID NOS 441-2156 (codificando os polipeptídeos não luminescentes). Em algumas modalidades, são apresentadas outras sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365 e/ou SEQ ID NOS 441-2156.

[011] Em certas modalidades, a presente invenção apresenta complexos bioluminescentes que compreendem: (a) um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos do peptídeo possuindo menos de 100% de identidade de sequência (por exemplo, >99%, <95%, <90%, <80%, <70%, <60%, <50%, etc.) com a SEQ ID NO: 2; e (b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440, em que o complexo bioluminescente exibe luminescência detectável. Em certas modalidades, a presente invenção apresenta complexos bioluminescentes que compreendem: (a) um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos do peptídeo possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO : 2; e (b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo possuindo menos de 100% e mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440, em que o complexo bioluminescente exibe luminescência detectável. Embora não se limite a sequências específicas, em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do peptídeo é selecionada a partir de uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365.

[012] Em várias modalidades, são apresentados complexos bioluminescentes que compreendem: (a) uma primeira sequência de aminoácidos que não é um fragmento de uma proteína preexistente; e (b) uma segunda sequência de aminoácidos que não é um fragmento de uma proteína preexistente, em que o complexo bioluminescente exibe luminescência detectável, em que a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos estão associadas. Alguns destes complexos bioluminescentes compreendem ainda: (c) uma terceira sequência de aminoácidos que compreende um primeiro membro de um par da interação, em que a terceira sequência de aminoácidos está ligada covalentemente à primeira sequência de aminoácidos; e (d) uma quarta sequência de aminoácidos que compreende um segundo membro de um par da interação, em que a quarta sequência de aminoácido está ligada covalentemente à segunda sequência de aminoácidos. Em certas modalidades, as interações (por exemplo, interações não covalentes (por exemplo, pontes de hidrogênio, ligações iônicas, forças de van der Waals, interações hidrofóbicas, etc.), interações covalentes (por exemplo, pontes dissulfeto), etc.) entre a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos não associam de forma significativa a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos na ausência das interações entre o primeiro membro e o segundo membro do par da interação. Em algumas modalidades, uma primeira cadeia polipeptídica compreende a primeira sequência de aminoácidos e a terceira sequência de aminoácidos, e em que uma segunda cadeia polipeptídica compreende a segunda sequência de aminoácidos e a quarta sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a segunda cadeia polipeptídica são expressas dentro de uma célula.

[013] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um complexo bioluminescente que compreende: (a) um par de elementos não luminescentes, em que cada elemento não luminescente não é um fragmento de uma proteína preexistente; (b) um par da interação, em que cada elemento de interação do par da interação está ligado de forma covalente a um dos elementos não luminescentes.

[014] Várias modalidades aqui descritas apresentam métodos para detectar uma interação entre uma primeira sequência de aminoácidos e uma segunda sequência de aminoácidos que compreendem, por exemplo, as etapas de: (a) unir a primeira sequência de aminoácidos a uma terceira sequência de aminoácidos e unir a segunda sequência de aminoácidos a uma quarta sequência de aminoácidos, em que a terceira e a quarta sequências de aminoácidos não são fragmentos de uma proteína preexistente, em que um complexo da terceira e quarta sequências de aminoácidos emite um sinal bioluminescente detectável (por exemplo, bioluminescência significativamente aumentada em relação às cadeias polipeptídicas separadamente), em que as interações (por exemplo, não covalentes) entre a terceira e a quarta sequências de aminoácidos são insuficientes para formar, ou apenas formar fracamente, um complexo da terceira e quarta sequências de aminoácidos na ausência de condições adicionais de estabilização e/ou agregação, e em que uma interação entre a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos fornece forças adicionais de estabilização e/ou agregação para produzir um complexo da terceira e quarta sequências de aminoácidos; (b) colocar a primeira, segunda, terceira, e quarta sequências de aminoácidos da etapa (a) em condições que permitam que ocorram interações entre a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos; e (c) detectar o sinal bioluminescente emitido pelo complexo da terceira e quarta sequências de aminoácidos, em que a detecção do sinal bioluminescente indica uma interação entre a primeira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, unir a primeira sequência de aminoácidos à terceira sequência de aminoácidos e a segunda sequência de aminoácidos à quarta sequência de aminoácidos compreende a formação de uma primeira proteína de fusão compreendendo a primeira sequência de aminoácidos e a terceira sequência de aminoácidos e a formação de uma segunda proteína de fusão compreendendo a segunda sequência de aminoácidos e a quarta sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, a primeira proteína de fusão e a segunda proteína de fusão ainda compreendem ligantes entre as referidas primeira e terceira sequências de aminoácidos e referidas segunda e quarta sequências de aminoácidos, respectivamente. Em certas modalidades, a primeira proteína de fusão é expressa a partir de uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codificam a primeira e a terceira sequências de aminoácidos, e a segunda proteína de fusão é expressa a partir de uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codificam a segunda e a quarta sequências de aminoácidos. Em algumas modalidades, um único vetor compreende a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos. Em outras modalidades, a primeira sequência de ácidos nucleicos e a segunda sequência de ácidos nucleicos estão em vetores separados. Em certas modalidades, as etapas de (a) “unir” e (b) “colocar” compreendem expressar a primeira e a segunda proteínas de fusão dentro de uma célula.

[015] São aqui apresentados métodos de criação, produção, geração e/ou otimização de um par de elementos não luminescentes compreendendo: (a) o alinhamento das sequências de três ou mais proteínas; (b) a determinação de uma sequência de consenso para as proteínas relacionadas; (c) o fornecimento do primeiro e segundo fragmentos de uma proteína relacionada a três ou mais proteínas (ou fornecer o primeiro e segundo fragmentos de uma das três ou mais proteínas), em que os fragmentos são significativamente não luminescentes individualmente, mas exibem luminescência após interação do fragmentos; (d) a mutação do primeiro e segundo fragmentos em uma ou mais posições, cada, em que as mutações alteram as sequências dos fragmentos para serem mais semelhantes a uma fração correspondente da sequência de consenso (por exemplo, em que os mutantes resultam em um par de elementos não luminescentes, que não são fragmentos de uma proteína preexistente), e (e) o teste do par de elementos não luminescentes para a ausência (por exemplo, ausência essencial, ausência significativa, etc.) de luminescência quando não associados, e luminescência mediante a associação do par não luminescente em um complexo bioluminescente. Exemplos de tal processo são descritos nos Exemplos 1-5. Em algumas modalidades, os elementos não luminescentes exibem aprimoramento de uma ou mais características em comparação ao primeiro e segundo fragmentos, em que as características são selecionadas a partir de: afinidade aumentada de reconstituição, afinidade reduzida de reconstituição, expressão aprimorada, solubilidade intracelular aumentada, estabilidade intracelular aumentada e intensidade aumentada da luminescência reconstituída.

[016] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta reagentes de detecção compreendendo: (a) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 440, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o polipeptídeo entra em contato com um peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2, e (b) um substrato para um complexo bioluminescente produzido pelo polipeptídeo e por um peptídeo que consiste na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta reagentes de detecção compreendendo: (a) um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o peptídeo entra em contato com um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440, e (b) um substrato para um complexo bioluminescente produzido pelo peptídeo e por um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta reagentes de detecção compreendendo: (a) um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos possuindo menos de 100% e mais de 40% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, em que um sinal bioluminescente detectável é produzido quando o peptídeo entra em contato com um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440, e (b) um substrato para um complexo bioluminescente produzido pelo peptídeo e por um polipeptídeo que consiste na SEQ ID NO: 440.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[017] A Figura 1 mostra um gráfico que representa o efeito de várias mutações do peptídeo GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) sobre a luminescência resultante da complementação com a SEQ ID NO: 440.

[018] A Figura 2 mostra um gráfico que representa o efeito de várias mutações do polipeptídeo da SEQ ID NO: 440 sobre a luminescência resultante da complementação com os peptídeos GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) ou GVTGWRLFKRISA (SEQ ID NO: 108).

[019] A Figura 3 A mostra o luminescência (RLUs) detectada para cada mutante polipeptídico não luminescente (NLpoly) contendo uma única substituição de glicina por alanina. A Figura 3B mostra o aumento em vezes na luminescência em relação ao polipeptídeo selvagem.

[020] A Figura 4A mostra a luminescência (RLUs) detectada em cada mutante NLpoly contendo um composto de substituições de glicina por alanina. A Figura 4B mostra o aumento em vezes na luminescência em relação ao polipeptídeo selvagem.

[021] A Figura 5 mostra um gráfico que luminescência (RLUs) detectada em fusões HT-NLpeptídeo.

[022] A Figura 6 mostra um gráfico que representa luminescência (RLUs) detectada em fusões HT-NLpep. luminescência (RLUs) detectada em fusões NLpeptídeo-HT.

[023] A Figura 7 mostra um gráfico que representa a luminescência (RLUs) detectada em fusões NLpeptídeo-HT.

[024] A Figura 8 mostra a luminescência (RLUs) gerada por complexo luminescente após ciclos de congelamento e descongelamento peptídeo não luminescente (NLpep).

[025] A Figura 9 mostra a atividade normalizada pela concentração dos peptídeos, e o gel TMR utilizado para determinar as concentrações relativas.

[026] A Figura 10 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo R11 do NLpoly-5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[027] A Figura 11 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo A15 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[028] A Figura 12 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo L18 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[029] A Figura 13 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo F31 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[030] A Figura 14 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo V58 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[031] A Figura 15 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo A67 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[032] A Figura 16 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo M106 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[033] A Figura 17 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo L149 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[034] A Figura 18 mostra um gráfico da luminescência de várias mutações do resíduo V157 do NLpoly 5A2 na presença do NLpep53 (acima) e na ausência do peptídeo complementar (abaixo).

[035] A Figura 19 mostra um gráfico da luminescência das fusões NLpep-HT.

[036] A Figura 20 mostra um gráfico da luminescência das fusões NLpep-HT, e um gel TMR indicando seus níveis de expressão relativa.

[037] A Figura 21 mostra um gráfico da luminescência das fusões NLpep-HT.

[038] A Figura 22 mostra um gráfico da luminescência do NLpoly 5A2 (acima) e NLpoli5A2+R11E na presença de vários NLpeps (abaixo).

[039] A Figura 23 mostra um gráfico da luminescência das fusões NLpep-HT.

[040] A Figura 24 mostra um gráfico da luminescência dos NLpolis 1-13 com NLpep53 (acima) e sem peptídeo complementar (abaixo).

[041] A Figura 25 mostra um gráfico da luminescência de vários NLpolis com NLpep53 com tampão NANOGLO ou DMEM e substrato furimazina ou coelenterazina.

[042] A Figura 26 mostra um gráfico que compara a luminescência na presença de uma proporção de furimazina com coelenterazina para vários NLpolis e NLpep53.

[043] A Figura 27 mostra um gráfico que compara a luminescência na presença de uma proporção de furimazina em relação à coelenterazina para vários NLpolis e NLpep53.

[044] A Figura 28 mostra um gráfico que compara a luminescência na presença de furimazina com coelenterazina para vários NLpolis e NLpep53 em lisado de células HEK293.

[045] A Figura 29 mostra um gráfico da luminescência de várias combinações de pares de NLpoly e NLpep em tampão DMEM com furimazina.

[046] A Figura 30 mostra um gráfico da luminescência sinal/de fundo de várias combinações de pares de NLpoly e NLpep em tampão DMEM com furimazina.

[047] A Figura 31 mostra um gráfico da luminescência e especificidade do substrato de vários mutantes de NLpoly com NLpep69 usando furimazina ou coelenterazina como substrato.

[048] A Figura 32 mostra uma comparação da luminescência e especificidade do substrato de vários mutantes de NLpoly com NLpep69 usando furimazina ou coelenterazina como substrato, e em qualquer condição lítica (gráfico abaixo) ou de células vivas (gráfico acima).

[049] A Figura 33 mostra uma comparação da luminescência e especificidade do substrato de mutantes de NLpoly com NLpep78 usando furimazina ou coelenterazina como substrato, e em qualquer condição lítica (gráfico abaixo) ou de células vivas (gráfico acima).

[050] A Figura 34 mostra uma comparação da luminescência e especificidade do substrato de vários mutantes de NLpoly com NLpep79 usando furimazina ou coelenterazina como substrato, e em qualquer condição lítica (gráfico abaixo) ou de células vivas (gráfico acima).

[051] A Figura 35 mostra gráficos da luminescência das fusões NLpep78-HT (acima) e NLpep79-HT (abaixo) na presença de vários NLpolis.

[052] A Figura 36 mostra um gráfico da luminescência de vários NLpolis na ausência de NLpep.

[053] A Figura 37 apresenta gráficos da luminescência das fusões NLpep78-HT (acima) e NLpep79-HT (abaixo) na presença de vários NLpolis com substratos furimazina ou coelenterazina.

[054] A Figura 38 mostra um gráfico da luminescência do NLpep78-HT com vários NLpolis expressos em células CHO e HeLa.

[055] A Figura 39 mostra os gráficos da luminescência bruta e normalizada do NLpoly fundido à luciferase de vaga-lumes (lampirídeos), expresso em lisados de células HEK293, HeLa e CHO.

[056] A Figura 40 mostra os gráficos da luminescência bruta e normalizada do NLpoly fundido à luciferase de elaterídeos vermelhos, expresso em lisados de células HEK293, HeLa e CHO.

[057] A Figura 41 mostra um gráfico da luminescência da complementação em células vivas utilizando NLpoly selvagem ou 5P.

[058] A Figura 42 mostra os gráficos da luminescência da complementação isenta de células da fusão NLpep78-HT (acima) e fusão NLpep79-HT (abaixo) com vários NLpolis.

[059] A Figura 43 mostra um gráfico das afinidades de ligação para várias combinações de NLpeps e NLpolis expressas em lisados de células HeLa, HEK293 e CHO.

[060] A Figura 44 mostra um gráfico das afinidades de ligação para várias combinações de NLpeps e NLpolis em tampão PBS ou NANOGLO.

[061] A Figura 45 mostra um gráfico das afinidades de ligação para NLpoly 5P com NLpep9 ou NLpep53, expresso em lisados de células HeLa, HEK293 ou CHO.

[062] A Figura 46 mostra um gráfico da luminescência de quantidades variadas de NLpolis na ausência de NLpep.

[063] A Figura 47 mostra um gráfico da luminescência de fundo de vários variantes de NLpoly.

[064] A Figura 48 mostra um gráfico da luminescência de fundo de vários variantes de NLpoly.

[065] A Figura 49 mostra um gel de SDS-PAGE do lisado total e da fração solúvel de vários variantes de NLpoly.

[066] A Figura 50 mostra (a) um gel de SDS-PAGE do lisado total e da fração solúvel de variantes de NLpoly e (b) luminescência de fundo de variantes de NLpoly.

[067] A Figura 51 mostra gráficos da luminescência gerada com vários variantes de NLpoly quando complementadas com 10 nM (à direita) ou 100 nM (à esquerda) de NLpep78.

[068] A Figura 52 mostra gráficos ilustrando a luminescência de fundo em lisado de E. coli de vários variantes de NLpoly.

[069] A Figura 53 mostra gráficos ilustrando a luminescência em lisado de E. coli de vários variantes de NLpoly complementados com NLpep78.

[070] A Figura 54 mostra gráficos ilustrando a luminescência em lisado de E. coli de vários variantes de NLpoly complementados com NLpep79.

[071] A Figura 55 mostra um gráfico da luminescência sinal em relação à luminescência de fundo de vários variantes de NLpoly complementados com NLpep78 ou NLpep79 e normalizados para NLpoly 5P.

[072] A Figura 56 mostra um gráfico que ilustra a com luminescência de fundo com NLpep79 (à direita) ou NLpep78 (à esquerda) e sinal em relação a ruído ou vários variantes de NLpoly.

[073] A Figura 57 mostra um gel de SDS-PAGE do lisado total e fração solúvel em vários variantes do NLpoly 5P.

[074] A Figura 58 mostra (A) a quantidade de lisado total e fração solúvel do NLpoly 5P e NLpoly I107L, (B) luminescência gerada pelo NLpoly 5P ou NLpoly I107L sem NLpep ou com NLpep78 ou NLpep79 e (C) a luminescência sinal em relação à de fundo do NLpoly I107L em comparação ao NLpoly 5P.

[075] A Figura 59 mostra gráficos de luminescência para vários variantes de NLpoly (A) sem peptídeo complementar, (B) com NLpep78-HT e (C) com NLpep79-HT.

[076] A Figura 60 mostra gráficos de luminescência para vários variantes de NLpoly (A) sem peptídeo complementar, (B) com NLpep78-HT e (C) com NLpep79-HT.

[077] A Figura 61 mostra gráficos de luminescência para vários variantes de NLpoly (A) sem peptídeo complementar, (B) com NLpep78-HT e (C) com NLpep79-HT.

[078] A Figura 62 mostra gráficos de luminescência para vários variantes de NLpoly (A) sem peptídeo complementar, (B) com NLpep78-HT e (C) com NLpep79-HT.

[079] A Figura 63 mostra a afinidade de ligação entre um variante alongado de NLpoly (aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal) e um variante encurtado de NLpep (aminoácidos excluídos na extremidade N- terminal).

[080] A Figura 64 mostra um gráfico da afinidade de ligação de vários variantes de NLpoly com NLpep78.

[081] A Figura 65 mostra a ligação e Vmax do NLpep80 e NLpep87 em relação ao 5P expresso em células de mamíferos (CHO, HEK293T e HeLa).

[082] A Figura 66 mostra a ligação e Vmax do NLpep80 e NLpep87 em relação ao NLpoly 5P expresso em E. coli.

[083] A Figura 67 mostra um gráfico de luminescência de NLpolis encurtados com NLpeps alongados.

[084] A Figura 68 mostra gráficos de Kd e Vmax do NLpoly 5P em lisado de células HeLa com vários NLpeps complementares.

[085] A Figura 69 mostra um gráfico de afinidades de ligação para vários variantes de NLpoly com NLpep81.

[086] A Figura 70 mostra um gráfico de afinidades de ligação para vários variantes de NLpoly com NLpep82.

[087] A Figura 71 mostra um gráfico de afinidades de ligação para vários mutantes de NLpoly com NLpep78.

[088] A Figura 72 mostra um gráfico das constantes de Michaelis para vários mutantes de NLpoly com NLpep78.

[089] A Figura 73 mostra gráficos de luminescência de uma complementação terciária de dois NLpeps e NLpoly 5P-B9.

[090] A Figura 74 mostra um gráfico de luminescência da titulação de NLpoly 5P com NLpep88-HT.

[091] A Figura 75 mostra imagens da localização intracelular de várias fusões de NLpep com HaloTag (HT).

[092] A Figura 76 mostra imagens da localização intracelular de NLpoly(selvagem) e NLpoly(5P).

[093] A Figura 77 demonstra a capacidade de detectar uma proteína de interesse conjugada com NLPep através de complementação após separação por SDS-PAGE e transferência para uma membrana de PVDF.

[094] A Figura 78 mostra um gráfico do sinal luminescente relativo de vários variantes de NLpoly em comparação com NLpoly 5P (na ausência de NLpep).

[095] A Figura 79 mostra um gráfico do sinal luminescente relativo sobre a luminescência de fundo de vários NLpolis em comparação com NLpoly 5P (na ausência de NLpep).

[096] A Figura 80 compara as constantes de dissociação para NLpeps consistindo em 1 ou 2 unidades repetidas de NLpep78.

[097] A Figura 81 mostra a afinidade entre NLpoly 5A2 e NLpep86.

[098] A Figura 82 mostra gráficos da luminescência de variantes de NLpoly sem NLpep, com NLpep78, e NLpep79.

[099] As Figuras 83-90 mostram as constantes de dissociação, bem como os valores de Vmax para NLpoly 5A2, 5P, 8S e 11S com 96 variantes de NLpeps.

[0100] A Figura 91 mostra uma imagem de um gel de proteína de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly.

[0101] A Figura 92 mostra uma imagem de um gel de proteína de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly, bem como uma tabela contendo as constantes de dissociação para os mesmos variantes.

[0102] A Figura 93 mostra a especificidade de substrato para NLpoly 5P e 11S com NLpep79 e demonstra que NLpoly 11S possui especificidade superior para furimazina do que 5P.

[0103] A Figura 94 mostra uma imagem de um gel de proteína que se segue a purificação por afinidade de NLpoly 8S através da ligação ao NLpep78.

[0104] A Figura 95 contém uma tabela das constantes de velocidade de associação e dissociação para a ligação do NLpoly WT ou 11S ao NLpepWT, 78 ou 79.

[0105] A Figura 96 mostra os valores de Km para vários pares de NLpoly/NLpep.

[0106] A Figura 97 compara a constante de dissociação para NLpoly 11S/NLpep79 em concentrações subsaturantes e saturantes de furimazina.

[0107] A Figura 98 compara os valores de Km para NLpoly 5A2 com NLpepWT, 78 e 79.

[0108] A Figura 99 mostra a luminescência de NLpolis a partir de várias etapas do processo de evolução na ausência de NLpep.

[0109] A Figura 100 mostra a melhora na luminescência a partir de NLpoly derivada de E. coli ao longo do processo de evolução com uma melhora global de ~105 (de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

[0110] A Figura 101 mostra a melhora na luminescência a partir de NLpoly expresso em células HeLa ao longo do processo de evolução com uma melhora global de ~105 (de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

[0111] A Figura 102 mostra a melhora na luminescência a partir de NLpoly expresso em células HEK293 ao longo do processo de evolução com uma melhora global de ~104 (de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

[0112] A Figura 103 mostra as constantes de dissociação e demonstra uma melhora de ~104 vezes na afinidade de ligação de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep86.

[0113] A Figura 104 mostra uma imagem de um gel de proteína de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly a partir de várias etapas do processo de evolução.

[0114] A Figura 105 mostra a luminescência de vários NLpolis na ausência de NLpep e na presença de NLpep78 e NLpep79.

[0115] A Figura 106 mostra a luminescência de vários NLpolis na ausência de NLpep e na presença de NLpep78 e NLpep79.

[0116] A Figura 107 mostra a luminescência de vários NLpolis na ausência de NLpep e na presença de NLpep78 e NLpep79.

[0117] A Figura 108 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB e FKBP fundidas com NLpoli5P e NLpep80/87 após 15 minutos de tratamento com rapamicina ou veículo. Indução em vezes refere-se ao sinal gerado na presença de rapamicina em relação ao sinal gerado com veículo.

[0118] A Figura 109 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB e FKBP fundidas com NLpoli5P e NLpep80/87 após 60 minutos de tratamento com rapamicina ou veículo.

[0119] A Figura 110 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB e FKBP fundidas com NLpoli5P e NLpep80/87 após 120 minutos de tratamento com rapamicina ou veículo.

[0120] A Figura 111 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB e FKBP fundidas com NLpoli5P e NLpep80/87 após 120 minutos de tratamento com rapamicina ou veículo. Todas as 8 combinações possíveis de FRB e FKBP fundidas com NLpoly/NLpep foram testadas e foi utilizado menos DNA total.

[0121] A Figura 112 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas fusões de FRB ou FKBP expressas na ausência do parceiro de ligação.

[0122] A Figura 113 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P e FKBP-NLpep80/87.

[0123] A Figura 114 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P ou FKBP-NLpep80/87 na ausência do parceiro de ligação.

[0124] A Figura 115 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P e FKBP-NLpep80/87. Esta difere da Figura 113 pelo fato de que níveis mais baixos de DNA foram usados.

[0125] A Figura 116 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P ou FKBP-NLpep80/87 na ausência do parceiro de ligação. Esta difere da Figura 114 pelo fato de que níveis mais baixos de DNA foram usados.

[0126] A Figura 117 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P e FKBP-NLpep80 após o tratamento com rapamicina por diferentes períodos de tempo.

[0127] A Figura 118 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com quantidades variadas de DNA de FRB- NLpoli5P e FKBP-NLpep87 após o tratamento com rapamicina por diferentes períodos de tempo.

[0128] A Figura 119 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB-NLpoli5P com FKBP-NLpep80/87/95/96/97. O ensaio foi realizado em um formato de dois dias e três dias.

[0129] A Figura 120 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB-NLpoli5A2 com FKBP-NLpep80/87/95/96/97. O ensaio foi realizado em um formato de dois dias e três dias.

[0130] A Figura 121 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB-NLpoli5A2 ou FRB-NLpoli11S com FKBP-NLpep101/104/105/106/107/108/109/110.

[0131] A Figura 122 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes combinações de FRB- NLpoli5A2 ou FRB-NLpoli11S com FKBP-NLpep87/96/98/99/100/101/102/103.

[0132] A Figura 123 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes níveis de DNA de FRB- NLpoli11S e FKBP-NLpep87/101/102/107.

[0133] A Figura 124 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes níveis de DNA de FRB- NLpoli5A2 e FKBP-NLpep87/101/102/107.

[0134] A Figura 125 mostra uma curva de dose-resposta da rapamicina apresentando a luminescência das células que expressam DNA de FRB-NLpoli5P e FKBP-NLpep80/87.

[0135] A Figura 126 mostra uma curva de dose-resposta da rapamicina apresentando a luminescência das células que expressam DNA de FRB-NLpoli5A2 ou FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep87/101.

[0136] A Figura 127 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam FRB-11S e FKBP-101 e tratadas com substrato PBI-4377 ou furimazina.

[0137] A Figura 128 mostra um curso temporal da rapamicina de células que expressam FRB-NLpoli11S/5A2 e FKBP-NLpep87/101 conduzido na presença ou ausência de rapamicina, em que a rapamicina foi adicionada manualmente.

[0138] A Figura 129 mostra um curso temporal da rapamicina de células que expressam FRB-NLpoli11S/5A2 e FKBP-NLpep87/101 conduzido na presença ou ausência de rapamicina, em que a rapamicina foi adicionada por meio de instrumento injetor.

[0139] A Figura 130 mostra a luminescência gerada pelo FRB- NLpoli11S e FKBP-NLpep101 conforme medida em dois instrumentos diferentes de leitura de luminescência.

[0140] A Figura 131 apresenta imagens que mostram a luminescência das células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep101 em vários momentos após o tratamento com rapamicina.

[0141] A Figura 132 apresenta um gráfico que mostra a quantificação do sinal gerado pelas células individuais que expressam FRB- NLpoli11S e FKBP-NLpep101 em vários momentos após o tratamento com rapamicina.

[0142] A Figura 133 mostra uma comparação da luminescência em diferentes linhagens celulares que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP- NLpep101.

[0143] A Figura 134 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep101 após o tratamento com o inibidor competitivo da rapamicina, FK506.

[0144] A Figura 135 mostra (à esquerda) a luminescência gerada pelas células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep101 após o tratamento com o inibidor competitivo da rapamicina, FK506, e (à direita) o percentual de luminescência remanescente após o tratamento com FK506.

[0145] A Figura 136 mostra a luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes combinações de V2R-NLpoli5A2 ou V2R- NLpoli11S com NLpep87/101-ARRB2 na presença ou na ausência do agonista de V2R, AVP.

[0146] A Figura 137 mostra um curso temporal do tratamento com AVP apresentando a luminescência gerada pelas células transfectadas com V2R-NLpoli11S e NLpep87/101-ARRB2 após o tratamento com AVP, em que AVP foi adicionado manualmente.

[0147] A Figura 138 mostra um curso temporal do tratamento com AVP apresentando a luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes combinações de V2R-NLpoli5A2 ou V2R-NLpoli11S com NLpep87/101-ARRB2 após o tratamento com AVP, em que AVP foi adicionado por meio de instrumento injetor.

[0148] A Figura 139 mostra um curso temporal do tratamento com AVP a 37°C, apresentando a luminescência gerada pelas células que expressam diferentes configurações de V2R e ARRB2 fundidas com NLpoli11S e NLpep101 após o tratamento com AVP.

[0149] A Figura 140 mostra uma comparação da luminescência em diferentes linhagens celulares que expressam V2R-NLpep11S e NLpep101- ARRB2.

[0150] A Figura 141 mostra imagens com ampliação de 60X apresentando a luminescência das células que expressam V2R-NLpoli11S e NLpep101-ARRB2 em vários momentos após o tratamento com AVP.

[0151] A Figura 142 mostra imagens com ampliação de 150X apresentando a luminescência das células que expressam V2R-NLpoli11S e NLpep101-ARRB2 em vários momentos após o tratamento com AVP.

[0152] A Figura 143 mostra um gel de proteína de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly.

[0153] A Figura 144 mostra as constantes de dissociação para NLpoly 5P e combinações de mutações nas posições 31, 46, 75, 76 e 93 no NLpoly 5P.

[0154] A Figura 145 mostra um exemplo de transferase de detecção de atividade enzimática por modificação pós-traducional usando um NLpep e aminopeptidase.

[0155] A Figura 146 mostra um exemplo de hidrolase de detecção de atividade enzimática por modificação pós-traducional usando um NLpep e anticorpo metil-específico.

[0156] A Figura 147 contém varreduras de comprimento de onda para NLpoly WT complementado com NLpepWT ou NLpepWT conjugado com TMR.

[0157] A Figura 148 contém varreduras de comprimento de onda para NanoLuc fundido com HaloTag (NL-HT) e NLpoly 5A2 complementado com NLPepWT com 4 aminoácidos adicionais (DEVD) e conjugado com não- cloroTOM (NCT).

[0158] A Figura 149 mostra um diagrama esquemático de uma interação terciária em que a transferência de energia com um NLpoly e NLpep também pode ser utilizada para medir três moléculas interagindo. No diagrama esquemático, um GPCR marcado com um NLpoly e uma proteína de interação com GPCR marcada com um NLpep formam um complexo bioluminescente quando interagem. Isto permite a medição da interação binária. Se uma pequena molécula ligante ao GPCR portadora de uma fração fluorescente adequada para a transferência de energia interage com este sistema, a transferência de energia irá ocorrer. Por conseguinte, a interação binária proteína-proteína e a interação ternária proteína-proteína-fármaco podem ser medidas no mesmo experimento.

[0159] A Figura 150 mostra um gráfico e tabela de afinidades de ligação do NLpoli11S ao NLPep78 sintético e NLPep78 na extremidade N- ou C- terminal de um parceiro de fusão (HaloTag).

[0160] A Figura 151 mostra um gráfico e tabela de afinidades de ligação do NLpoli11S ao NLPep79 sintético e NLPep79 na extremidade N- ou C- terminal de um parceiro de fusão (HaloTag).

[0161] A Figura 152 mostra um gráfico ilustrando a intensidade normalizada de fluorescência do NLpoli11S com NLPep86 ou PBI-4877.

[0162] A Figura 153 mostra um gráfico ilustrando a intensidade normalizada de fluorescência do NLpoli11S com NLPep86 ou PBI-5434.

[0163] A Figura 154 mostra um gráfico ilustrando a intensidade normalizada de fluorescência do NLpoli11S com NLPep86 ou PBI-5436.

[0164] A Figura 155 mostra um gráfico ilustrando a afinidade de ligação da furimazina em tampão de afinidade de complexos entre NLpoli11S e NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 e 114.

[0165] A Figura 156 mostra um gráfico ilustrando a afinidade de ligação da furimazina em tampão de ensaio NanoGlo de complexos entre NLpoli11S e NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 e 114.

[0166] A Figura 157 mostra gráficos ilustrando a alteração na afinidade (NLpoli156/NLPep1 e NLpoli11S/NLPep1) com concentrações crescentes de substrato furimazina.

[0167] A Figura 158 mostra gráficos ilustrando a alteração na afinidade (NLpoli156/NLPep1 e NLpoli11S/NLPep1) com concentrações crescentes de NLPep1.

[0168] A Figura 159 mostra um gráfico ilustrando Vmax e Bmax do NLPoli156, NLPoli11S, e luciferase NanoLuc® (Nluc) com NLPep1.

[0169] A Figura 160 mostra um gráfico ilustrando RLU como uma função da concentração do NLPep para NLPoli11S e NLPep86, 78, 79, 99, 101, 104, 114, 128 e wt.

[0170] A Figura 161 mostra um Western blot ilustrando o nível de expressão em células HEK293T do NLPoli156 e NLPoli11S em comparação à luciferase NanoLuc® de comprimento total.

[0171] A Figura 162 mostra gráficos ilustrando uma comparação da afinidade da ß-lactamase SME e seu inibidor BLIPY50A como proteínas não- fundidas ou quando fundidas com NLPoli11S e NLPep114.

[0172] A Figura 163 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB-NLpoli11S com FKBP-NLpep101/111-136.

[0173] A Figura 164 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam diferentes combinações de FRB-NLpoli11S com FKBP-NLpep114 e 137-143.

[0174] A Figura 165 mostra as curvas de dose-resposta da rapamicina de células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep78/79/99/l 01/104/114/128.

[0175] A Figura 166 mostra a resposta de células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP-78/79/99/101/104/114/128 para o inibidor competitivo da rapamicina, FK506.

[0176] A Figura 167 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células transfectadas com diferentes proporções de FRB- NLpoli11S e FKBP-NLpep114.

[0177] A Figura 168 mostra uma comparação da luminescência gerada pelas células que expressam fusões de NLpoli11S/NLpep114 com FRB/FKBP em diferentes orientações e com ligantes de diferentes comprimentos.

[0178] A Figura 169 mostra gráficos ilustrando a indução (A) dose- específica e (B) tempo-específica do FRB-NLpoli11S/FKBP-NLpep114 ou sinais de complementação divididos dos vaga-lumes pela rapamicina.

[0179] A Figura 170 mostra gráficos que a inibição (A) dose- específica e (B) tempo-específica do FRB-NLpoli11S/FKBP-NLpep114 ou sinais de complementação divididos dos vaga-lumes pelo FK506.

[0180] A Figura 171 mostra Western blots ilustrando níveis de expressão semelhantes de FKBP-NLpep114 e FKBP-Fluc(394-544) em níveis iguais de DNA transfectado.

[0181] A Figura 172 mostra gráficos ilustrando a inibição (a) dose- específica e (B) tempo-específica da interação do NLpoli11S-BRD4 e histona H3.3-NLpep114 por IBET-151.

[0182] A Figura 173 mostra um gráfico ilustrando aumentos dose- dependentes na dimerização de RAS/CRAF, BRAF/BRAF e CRAF/BRAF em resposta ao inibidor de BRAF, GDC0879.

[0183] A Figura 174 mostra um gráfico que representa RLU como uma função da concentração de NLPep para NLpoli11S e NLpep86, wt, e NLpep114.

[0184] A Figura 175 mostra um diagrama esquemático de um ensaio utilizando um peptídeo de alta afinidade de um par luminescente como uma marcação proteica intracelular e o polipeptídeo do par luminescente como um reagente de detecção.

[0185] A Figura 176 mostra um gráfico demonstrando o intervalo linear da afinidade do NLpoli11S e MLpep86.

[0186] A Figura 177 mostra imagens demonstrando a sensibilidade da detecção de proteínas marcadas com um NLPep de alta afinidade usando 11S. Esta figura também compara a detecção utilizando NLPep/NLPoli para a detecção utilizando HaloTag marcado com fluorescência.

[0187] A Figura 178 mostra um gráfico demonstrando a estabilidade do NLpoli11S.

[0188] A Figura 179 mostra um gráfico demonstrando o intervalo linear da afinidade do NLpoli11S e NLpep78.

[0189] A Figura 180 mostra um resumo das sequências do NLpep. Peptídeos (espontâneos) de alta afinidade peptídeos são aqueles peptídeos (NLpep) que se ligam ao NLpoli11S com alta afinidade. Peptídeos escuros/supressores são aqueles peptídeos (NLpep) que podem reduzir os níveis de luz sendo produzida ou detectada a partir do NLpoli11S.

[0190] A Figura 181 mostra um diagrama esquemático para o conceito da complementação estrutural onde LSP e SSP (ou seja, NLpoly e NLpep) são unidos para produzir um sinal bioluminescente (painéis A, B). Após a interrupção de uma interação proteica (ou seja, X e Y), LSP SSP se separam, resultando em uma diminuição da luminescência (Painel C).

[0191] A Figura 182 mostra duas opções (A, B) para manipular a complementação estrutural resultando em uma perda de sinal após a interação entre X e Y e um ganho de sinal após a interrupção da interação entre X e Y. A Opção A representa a complementação estrutural intermolecular. A Opção B representa a complementação estrutural intramolecular. A Figura 182B mostra uma lista de construções genéticas que poderiam ser adequadas para a complementação estrutural intramolecular.

[0192] A Figura 183 mostra (A) a inibição da ligação de NLpoli11S e NLpep114 por vários peptídeos escuros, e (B) a inibição dose-dependente por peptídeos Lys-162 e Gln-162.

[0193] A Figura 184 mostra que a inibição por Q-162 e A-162 é dose-dependente. O Painel B mostra que Q-162 produz um sinal por conta própria de uma maneira dose-dependente, enquanto que a dose-dependência de A-162 é, no mínimo, discreta.

[0194] A Figura 185 mostra gráficos demonstrando a dose-resposta dos peptídeos escuros com CP Nluc.

[0195] A Figura 186 mostra gráficos ilustrando um curso temporal do peptídeo escuro com CP Nluc.

[0196] A Figura 187 mostra a inibição dose-dependente pelo peptídeo escuro da luminescência gerada a partir do FRB-NLpoli11S isolado e também entre FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep114 na presença e ausência de rapamicina.

[0197] A Figura 188 mostra a inibição dose-dependente pelo peptídeo escuro da luminescência gerada a partir de FRB-NanoLuc (311) ou NanoLuc-FRB (307) na presença e ausência de rapamicina (RLU).

[0198] A Figura 189 a inibição dose-dependente pelo peptídeo escuro da luminescência gerada a partir de FRB-NanoLuc (311) ou NanoLuc- FRB (307) na presença e ausência de rapamicina (normalizada para controle sem peptídeo escuro; 100%).

[0199] A Figura 190 mostra que os peptídeos escuros, quando fundidos ao FKBP, podem competir com ambos os peptídeos de baixa (114) e alta (80) afinidade (também fusões de FKBP) e, como resultado, reduzem a luminescência total sendo produzida e detectada em células vivas.

[0200] A Figura 191 mostra a comparação do sinal entre ensaios à base de Fluc e NLpep86 para níveis intracelulares de Fluc.

[0201] A Figura 192 mostra gráficos demonstrando a utilidade NLpeps ligados em tandem na complementação do Npoli11S.

[0202] A Figura 193 mostra um gráfico demonstrando que os componentes do NLpoly e NLpep não interferem com a degradação intracelular da proteína repórter FlucP.

[0203] A Figura 194 mostra um diagrama esquemático demonstrando um ensaio de atividade de protease extracelular.

[0204] A Figura 195 mostra um diagrama esquemático de um ensaio para medir a atividade de uma enzima usando um ProNLpep.

[0205] A Figura 196 mostra um diagrama esquemático de um ensaio para a triagem de anticorpos, proteínas, peptídeos ou transportadores que são responsáveis por mediar a internalização celular.

[0206] A Figura 197 mostra um diagrama esquemático de um ensaio de transferase de modificação pós-traducional.

[0207] A Figura 198 mostra um diagrama esquemático de um ensaio de hidrolase de modificação pós-traducional.

[0208] A Figura 199 mostra gráficos correlacionando a atividade da tirosina quinase SRC com a luminescência sobre a base em um ensaio de modificação pós-traducional.

[0209] A Figura 200 mostra um gráfico ilustrando a complementação espontânea de três versões diferentes do NLpoli11S com doze peptídeos sintéticos.

[0210] A Figura 201 mostra um diagrama esquemático de um formato de imunoensaio homogêneo utilizando fusões de NLpep e NLpoly com frações separadas de ligação A e B.

[0211] A Figura 202 mostra gráficos demonstrando: (A) a redução na luminescência de fundo a partir do NLpoli11S após formação do complexo com GWALFKK e Dabcyl-GWALFKK, e (B) que NLpep86 forma um complexo com NLpoli11S na presença de GWALFKK e Dabcyl-GWALFKK.

[0212] A Figura 203 mostra gráficos demonstrando: (A) que VTGWALFEEIL (Trp 11mer) e VTGYALFEEIL (Tyr 11mer) induzem luminescência sobre o fundo (NLpoli11S isolado; sem peptídeo controle), e que as versões N-terminais de Dabcyl de cada um proporcionam supressão significativa deste sinal, e (B) que NLpep86 forma um complexo com NLpoli11S na presença de versões de Dabcyl de Trp 11mer e Tyr 11mer.

DEFINIÇÕES

[0213] Tal como aqui utilizado, o termo “significativamente” significa que a característica, parâmetro e/ou valor recitado não precisa ser obtido exatamente, mas que desvios ou variações, incluindo, por exemplo, tolerâncias, erros de medição, limitações de precisão da medição e outros fatores conhecidos pelos especialistas na técnica, podem ocorrer em quantidades que não descartem o efeito que a característica foi destinada a fornecer. Uma característica ou aspecto que esteja significativamente ausente (por exemplo, significativamente não luminescente) pode ser aquele que se encontra dentro do ruído, abaixo da base, abaixo das capacidades de detecção do ensaio sendo utilizado, ou uma fração pequena (por exemplo, <1%, <0,1%, <0,01%, <0,001%, <0,00001%, <0,000001%, 0,0000001%) da característica significativa (por exemplo, intensidade luminescente de uma proteína bioluminescente ou complexo bioluminescente).

[0214] Tal como aqui utilizado, o termo “bioluminescência” refere- se à produção e emissão de luz através de uma reação química catalisada ou possibilitada por uma enzima, proteína, complexo proteico ou outra biomolécula (por exemplo, complexo bioluminescente). Em modalidades típicas, um substrato para uma entidade bioluminescente (por exemplo, proteína bioluminescente ou complexo bioluminescente) é convertido para uma forma instável pela entidade bioluminescente; subsequentemente, o substrato emite luz.

[0215] Tal como aqui utilizado, o termo “complementar” refere-se à característica de dois ou mais elementos estruturais (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, ácido nucleico, molécula pequena, etc.) de serem capazes de hibridizar, dimerizar ou, de outro modo, formar um complexo entre si. Por exemplo, um “peptídeo e polipeptídeo complementares” são capazes de se unirem para formar um complexo. Os elementos complementares podem necessitar de assistência para formar um complexo (por exemplo, de elementos de interação), por exemplo, para colocar os elementos na conformação adequada para complementaridade, para colocalizar elementos complementares, para reduzir a energia de interação para a complementaridade, etc.

[0216] Tal como aqui utilizado, o termo “complexo” refere-se a uma montagem ou agregado de moléculas (por exemplo, peptídeos, polipeptídeos, etc.) em contato direto e/ou indireto entre si. Em um aspecto, “contato” ou, mais particularmente, “contato direto” significa que duas ou mais moléculas estão perto o suficiente de modo que interações não covalentes atrativas, como forças de Van der Waals, pontes de hidrogênio, interações iônicas e hidrofóbicas, e semelhantes, dominem a interação das moléculas. Em tal aspecto, um complexo de moléculas (por exemplo, um peptídeo e polipeptídeo) é formado em condições de ensaio de modo que o complexo seja termodinamicamente favorecido (por exemplo, em comparação com um estado não agregado ou não complexado de suas moléculas componentes). Tal como aqui utilizado, o termo “complexo”, salvo descrição em contrário, refere-se à montagem de duas ou mais moléculas (por exemplo, peptídeos, polipeptídeos ou uma combinação destes).

[0217] Tal como aqui utilizado, o termo “não luminescente” refere- se a uma entidade (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, complexo, proteínas, etc.) que exibe a característica de não emitir uma quantidade detectável de luz no espectro visível (por exemplo, na presença de um substrato). Por exemplo, uma entidade pode ser referida como não luminescente se não exibir luminescência detectável em um determinado ensaio. Tal como aqui utilizado, o termo “não luminescente” é sinônimo do termo “significativamente não luminescente”. Por exemplo, um polipeptídeo não luminescente (NLpoly) é significativamente não luminescente, exibindo, por exemplo, uma redução de 10 vezes ou mais (por exemplo, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1x103 vezes, 1x104 vezes, 1x105 vezes, 1x106 vezes, 1x107 vezes, etc.) na luminescência em comparação a um complexo do NLpoly com seu peptídeo complementar não luminescente. Em algumas modalidades, uma entidade é “não luminescentes” se qualquer emissão de luz for suficientemente mínima de modo a não criar interferência de fundo para um determinado ensaio.

[0218] Tal como aqui utilizados, os termos “peptídeo não luminescente” (por exemplo, NLpep) e “polipeptídeo não luminescente” (por exemplo, NLpoly) referem-se a peptídeos e polipeptídeos que exibem significativamente nenhuma luminescência (por exemplo, na presença de um substrato), ou uma quantidade que esteja abaixo do ruído, ou 10 vezes ou mais (por exemplo, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1x103 vezes, 1x104 vezes, 1x105 vezes, 1x106 vezes, 1x107 vezes, etc.) em comparação a um sinal significativo (por exemplo, complexo luminescente) em condições padronizadas (por exemplo, condições fisiológicas, condições de ensaio, etc.) e com instrumentação típico (por exemplo, luminômetro, etc.). Em algumas modalidades, tais peptídeos e polipeptídeos não luminescentes se unem, de acordo com os critérios aqui descritos, para formar um complexo bioluminescente. Tal como aqui utilizado, um “elemento não luminescente” é um peptídeo não luminescente ou polipeptídeo não luminescente. O termo “complexo bioluminescente” refere-se ao complexo montado de dois ou mais peptídeos não luminescentes e/ou polipeptídeos não luminescentes. Complexo bioluminescente catalisa ou permite a conversão de um substrato para o complexo bioluminescente em uma forma instável; subsequentemente, o substrato emite luz. Quando não-complexados, dois elementos não luminescentes que formam um complexo bioluminescente podem ser referido como um “par não luminescente”. Se um complexo bioluminescente for formado por três ou mais peptídeos não luminescentes e/ou polipeptídeos não luminescentes, os constituintes não-complexados do complexo bioluminescente podem ser referidos como um “grupo não luminescente.”

[0219] Tal como aqui utilizado, o termo “elemento de interação” refere-se a uma fração que auxilia na união de um par de elementos não luminescentes ou um grupo não luminescente para formar um complexo bioluminescente. Em uma modalidade típica, um par de elementos de interação (também conhecido como “par da interação”) é ligado a um par de elementos não luminescentes (por exemplo, par de peptídeo/polipeptídeo não luminescentes) e a interação atrativa entre os dois elementos de interação facilita a formação do complexo bioluminescente, embora a presente invenção não se limite a tal mecanismo e uma compreensão do mecanismo não seja necessária para a prática da invenção. Elementos de interação podem facilitar a formação do complexo bioluminescente por qualquer mecanismo adequado (por exemplo, aproximando intimamente um par/grupo não luminescente, colocando um par/grupo não luminescente em conformação adequada para interação estável, reduzindo a energia de ativação para a formação do complexo, combinações destes, etc.). Um elemento de interação pode ser uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, molécula pequena, cofator, ácido nucleico, lipídio, carboidrato, anticorpo, etc. Um par de interação pode ser constituído por dois dos mesmos elementos de interação (isto é, um par homogêneo) ou dois elementos diferentes de interação (ou seja, um par heterogêneo). No caso de um par heterogêneo, os elementos de interação pode ser do mesmo tipo de fração (por exemplo, polipeptídeos) ou podem ser dois tipos diferentes de frações (por exemplo, polipeptídeo e molécula pequena). Em algumas modalidades, nas quais a formação do complexo pelo par de interação é estudada, um par de interação pode ser referido como um “par alvo” ou um “par de interesse”, e os elementos de interação individuais são referidos como “elementos-alvo” (por exemplo, “peptídeo-alvo”, “polipeptídeo-alvo”, etc.) ou “elementos de interesse” (por exemplo, “peptídeo de interesse”, “polipeptídeo ou interesse”, etc.).

[0220] Tal como aqui utilizado, o termo “proteína preexistente” refere-se a uma sequência de aminoácidos que existia fisicamente antes de um determinado evento ou data. Um “peptídeo que não é um fragmento de uma proteína preexistente” é uma cadeia curta de aminoácidos que não é um fragmento ou subsequência de uma proteína (por exemplo, sintética ou de ocorrência natural) que existia fisicamente antes da elaboração e/ou síntese do peptídeo.

[0221] Tal como aqui utilizado, o termo “fragmento” refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que resulta da dissecção ou “fragmentação” de uma entidade inteira maior (por exemplo, proteína, polipeptídeo, enzima, etc.), ou um peptídeo ou polipeptídeo preparado para ter a mesma sequência como tal. Portanto, é um fragmento é uma subsequência da entidade inteira (por exemplo, proteína, polipeptídeo, enzima, etc.) a partir da qual é fabricado produzido e/ou elaborado. Um peptídeo ou polipeptídeo que não seja uma subsequência de uma proteína inteira preexistente não é um fragmento (por exemplo, não é um fragmento de uma proteína preexistente). Um peptídeo ou polipeptídeo que “não é um fragmento de uma proteína bioluminescente preexistente” é uma cadeia de aminoácidos que não é uma subsequência de uma proteína (por exemplo, natural ou sintética) que: (1) existia fisicamente antes da elaboração e/ou síntese do peptídeo ou polipeptídeo, e (2) exibe atividade bioluminescente significativa.

[0222] Tal como aqui utilizado, o termo “subsequência” refere-se ao peptídeo ou polipeptídeo que possui 100% de identidade de sequência com outro peptídeo ou polipeptídeo maior. A subsequência é uma correspondência perfeita de sequência para uma fração da cadeia de aminoácidos maior.

[0223] Tal como aqui utilizado, o termo “identidade de sequência” refere-se ao grau com que duas sequências poliméricas (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, ácido nucleico, etc.) têm a mesma composição sequencial de subunidades monoméricas. O termo “semelhança de sequência” refere-se ao grau com que duas sequências poliméricas (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, ácido nucleico, etc.) têm sequências poliméricas semelhantes. Por exemplo, aminoácidos semelhantes são aqueles que possuem as mesmas características biofísicas e podem ser agrupados nas famílias, por exemplo, ácida (por exemplo, aspartato, glutamato), básica (por exemplo, lisina, arginina, histidina), não-polar (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e polar sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). A “identidade percentual de sequência” (ou “semelhança percentual de sequência”) é calculada: (1) pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas em relação a uma janela de comparação (por exemplo, o comprimento da sequência mais longa, o comprimento da sequência mais curta, uma janela especificada), (2) pela determinação do número de posições contendo monômeros idênticos (ou semelhantes) (por exemplo, os mesmos aminoácidos ocorrem em ambas as sequências, aminoácidos semelhantes ocorrem em ambas as sequências) para se obter o número de posições emparelhadas, (3) pela divisão do número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (por exemplo, o comprimento da sequência mais longa, o comprimento da sequência mais curta, uma janela especificada), e (4) pela multiplicação do resultado por 100 para se obter a identidade percentual de sequência ou semelhança percentual de sequência. Por exemplo, se ambos os peptídeos A e B tiverem 20 aminoácidos de comprimento e aminoácidos idênticos em todas as posições, exceto 1, então o peptídeo A e o peptídeo B têm 95% de identidade de sequência. Se os aminoácidos na posição não idêntica compartilhavam as mesmas características biofísicas (por exemplo, ambos eram ácidos), então o peptídeo A e o peptídeo B teriam 100% de semelhança de sequência. Como outro exemplo, se o peptídeo C tiver 20 aminoácidos de comprimento e o peptídeo D tiver de 15 aminoácidos de comprimento, e 14 dos 15 aminoácidos do peptídeo D forem idênticos àqueles de uma fração do peptídeo C, então os peptídeos C e D têm 70% de identidade de sequência, porém o peptídeo D possui 93,3% de identidade de sequência em relação a uma janela ideal de comparação do peptídeo C. Para fins de calcular a “identidade percentual de sequência” (ou “semelhança percentual de sequência”) neste documento, quaisquer lacunas nas sequências alinhadas são tratadas como emparelhamentos equivocados nesta posição.

[0224] Tal como aqui utilizado, o termo “condições fisiológicas” engloba quaisquer condições compatíveis com células vivas, por exemplo, condições predominantemente aquosas de uma temperatura, pH, salinidade, composição química, etc., que sejam compatíveis com células vivas.

[0225] Tal como aqui utilizado, o termo “amostra” é utilizado no seu sentido mais amplo. Em um sentido, destina-se a incluir um espécime ou cultura obtido a partir de qualquer fonte, assim como amostras biológicas e ambientais. As amostras biológicas podem ser obtidas a partir de animais (incluindo seres humanos) e englobam fluidos, sólidos, tecidos, e gases. As amostras biológicas incluem hemoderivados, tais como plasma, soro e semelhantes. A amostra também pode referir-se a lisados celulares ou formas purificadas dos peptídeos e/ou polipeptídeos aqui descritos. Os lisados celulares podem incluir células que foram lisadas com um agente de lise ou lisados de reticulócitos de coelho ou lisados de gérmen de trigo. A amostra pode também incluir sistemas de expressão isentos de células. As amostras ambientais incluem material ambiental, tais como amostras de matéria de superfície, solo, água, cristais e industriais. No entanto, tais exemplos não devem ser interpretados como limitantes aos tipos de amostras aplicáveis à presente invenção.

[0226] Como aqui utilizado, salvo especificação em contrário, os termos “peptídeo” e “polipeptídeo” referem-se a compostos poliméricos de dois ou mais aminoácidos unidos através da cadeia principal por ligações peptídicas amida (--C(O)NH--). Tipicamente, o termo “peptídeo” refere-se a polímeros curtos de aminoácidos (por exemplo, cadeias com menos de 25 aminoácidos), enquanto que o termo “polipeptídeo” refere-se tipicamente polímeros mais longos de aminoácidos (por exemplo, cadeias com mais de 25 aminoácidos).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0227] O estudo das interações proteicas, particularmente em condições fisiológicas e/ou em níveis fisiológicos de expressão, requer alta sensibilidade. Em modalidades particulares aqui descritas, as interações proteicas com moléculas pequenas, ácidos nucleicos, outras proteínas, etc. são detectadas com base na associação de dois elementos não luminescentes que se unem para formar um complexo bioluminescente capaz de produzir um sinal detectável (por exemplo, luminescência). A formação do complexo bioluminescente é dependente da interação proteica que está sendo monitorada.

[0228] São aqui apresentadas composições e métodos para a montagem de um complexo bioluminescente a partir de duas ou mais unidades peptídicas e/ou polipeptídicas não luminescentes (por exemplo, par não luminescente). Em algumas modalidades, as unidades peptídicas e/ou polipeptídicas não luminescentes não são fragmentos de uma proteína preexistente (por exemplo, não são subsequências complementares de uma sequência polipeptídica conhecida). Em particular, a atividade bioluminescente é conferida a um polipeptídeo não luminescente através da complementação estrutural com um peptídeo não luminescente.

[0229] Em algumas modalidades, são aqui apresentados pares não luminescentes para utilização na detecção e monitoramento de interações moleculares (por exemplo, proteína-proteína, proteína-DNA, interações proteína-RNA, RNA-DNA, proteína-molécula pequena, RNA-molécula pequena, etc.). Também são aqui apresentados painéis complementares de elementos não luminescentes intercambiáveis (por exemplo, peptídeos e polipeptídeos) que possuem afinidades e luminescência variadas após a formação dos vários complexos bioluminescentes (por exemplo, um par de alta afinidade/alta luminescência, um par de afinidade moderada/alta luminescência, um par de baixa afinidade/luminescência moderada, etc.). Utilizar diferentes combinações de elementos não luminescentes fornece um sistema adaptável que compreende vários pares que variam de afinidades mais baixas até afinidades mais altas, luminescência e outras características variadas. Esta capacidade de adaptação permite que a detecção/monitoramento de interações moleculares sejam ajustados à(s) molécula(s) específica(s) de interesse e amplia o intervalo de interações moleculares que podem ser monitoradas para incluir interações com afinidades muito altas ou baixas. Além disso, são aqui apresentados métodos pelos quais os pares (ou grupos) não luminescentes e painéis de pares (ou grupo) não luminescentes são desenvolvidos e testados.

[0230] Em algumas modalidades, a interação entre os membros peptídicos/polipeptídicos do par não luminescente isolado é insuficiente para formar o complexo bioluminescente e produzir o sinal bioluminescente resultante. No entanto, se um elemento de interação é ligado a cada membro peptídico/polipeptídico do par não luminescente, então as interações do par da interação (por exemplo, para formar um complexo de interação) facilitam a formação do complexo bioluminescente. Em tais modalidades, o sinal bioluminescente do complexo bioluminescente (ou a capacidade de produzir tal sinal na presença de substrato) serve como um repórter para a formação do complexo de interação. Se um complexo de interação for formado, então um complexo bioluminescente é formado, e um sinal bioluminescente é detectado/medido/monitorado (por exemplo, na presença de substrato). Se um complexo de interação não se forma (por exemplo, devido a condições desfavoráveis, devido à interação instável entre os elementos de interação, devido a elementos de interação incompatíveis), então um complexo bioluminescente não se forma, e um sinal bioluminescente não é produzido.

[0231] Em certas modalidades, o par da interação compreende duas moléculas de interesse (por exemplo, proteínas de interesse). Por exemplo, os ensaios podem ser realizados para detectar a interação de duas moléculas de interesse ao ligar cada uma a um membro separado de um par não luminescente. Se as moléculas de interesse interagirem (por exemplo, interagirem transitoriamente, interagirem de forma estável, etc.), o par não luminescente é aproximado intimamente em uma conformação adequada e um complexo bioluminescente é formado (e sinal bioluminescente é produzido/detectado (na presença de substrato)). Na ausência de uma interação entre as moléculas de interesse (por exemplo, nenhuma formação de complexo, nem mesmo interação transitória, etc.), o par não luminescente não interage de maneira suficiente, e um sinal bioluminescente não é produzido ou apenas fracamente produzido. Tais modalidades podem ser usadas para estudar o efeito dos inibidores sobre a formação do complexo, o efeito das mutações na formação do complexo, o efeito das condições (por exemplo, temperatura, pH, etc.) sobre a formação do complexo, a interação de uma molécula pequena (por exemplo, terapêutica em potencial) com uma molécula alvo, etc.

[0232] Diferentes pares não luminescentes podem requerer potência, duração e/ou estabilidade diferentes do complexo de interação para resultar na formação do complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, um complexo de interação estável é necessário para produzir um sinal bioluminescente detectável. Em outras modalidades, mesmo um complexo de interação fraca ou transitória resulta na formação do complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, a potência ou extensão de um complexo de interação é diretamente proporcional à potência do sinal bioluminescente resultante. Alguns pares não luminescentes produzem um sinal detectável quando combinados com um complexo de interação com uma alta constante de dissociação alta milimolar (por exemplo, Kd>100 mM). Outros pares não luminescentes requerem um par de interação com uma baixa constante de dissociação milimolar (por exemplo, Kd<100 mM), micromolar (por exemplo, Kd<1 mM), nanomolar (por exemplo, Kd<1 µM) ou mesmo picomolar (por exemplo, Kd<1 nM), a fim de produzir um complexo bioluminescente com um sinal detectável.

[0233] Em algumas modalidades, um ou mais dos peptídeos/polipeptídeos não luminescentes não são fragmentos de uma proteína preexistente. Em algumas modalidades, um ou mais dos peptídeos/polipeptídeos não luminescentes não são fragmentos de uma proteína bioluminescente preexistente. Em algumas modalidades, um ou outro/nenhum dos peptídeos/polipeptídeos não luminescentes são fragmentos de uma proteína preexistente. Em algumas modalidades, um ou outro/nenhum dos peptídeos/polipeptídeos não luminescentes são fragmentos de uma proteína bioluminescente preexistente. Em algumas modalidades, nem o peptídeo não luminescente nem o polipeptídeo não luminescente que se unem para formar um complexo bioluminescente são fragmentos de uma proteína preexistente. Em algumas modalidades, um elemento não luminescente para utilização nas modalidades da presente invenção não é uma subsequência de uma proteína preexistente. Em algumas modalidades, um par não luminescente para utilização nas modalidades aqui descritas não compreende subsequências complementares de uma proteína preexistente.

[0234] Em algumas modalidades, os peptídeos/polipeptídeos não luminescentes são significativamente não luminescentes isoladamente. Em certas modalidades, quando colocados em condições adequadas (por exemplo, condições fisiológicas), os peptídeos/polipeptídeos não luminescentes interagem para formar um complexo bioluminescente e produzir um sinal bioluminescente na presença do substrato. Em outras modalidades, sem a adição de um ou mais elementos de interação (por exemplo, elementos complementares de interação ligados ao componente peptídeo não luminescente e polipeptídeo não luminescente), os peptídeos/polipeptídeos não luminescentes são incapazes de formar um complexo bioluminescente ou apenas formar fracamente um complexo. Em tais modalidades, os peptídeos/polipeptídeos não luminescentes são significativamente não luminescente na presença uns dos outros isoladamente, mas produzem luminescência significativa detectável quando agregados, associados, orientados, ou unidos de outro modo por elementos de interação. Em algumas modalidades, sem a adição de um ou mais elementos de interação (por exemplo, elementos complementares de interação ligados ao componente peptídeo e polipeptídeo), os peptídeos e/ou polipeptídeos que se unem no complexo bioluminescente produzem um baixo nível de luminescência na presença uns dos outros, mas são submetidos a um aumento significativo da luminescência detectável quando agregados, associados, orientados, ou unidos de outro modo por elementos de interação.

[0235] Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui descritos compreendem um ou mais elementos de interação. Em uma modalidade típica, um elemento de interação é uma fração (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, molécula pequena, ácido nucleico, lipídio, carboidrato, etc.), que está ligada a um peptídeo e/ou polipeptídeo para montar o complexo bioluminescente. O elemento de interação facilita a formação de um complexo bioluminescente por qualquer mecanismo adequado, incluindo: interagir com um ou ambos os elementos não luminescentes, induzir uma alteração conformacional em um elemento não luminescente, interagir com outro elemento de interação (por exemplo, um elemento de interação ligado ao outro elemento não luminescente), aproximar intimamente os elementos não luminescentes, orientar elementos não luminescentes para uma interação adequada, etc.

[0236] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de interação são adicionados a uma solução contendo os elementos não luminescentes, mas não são ligados aos elementos não luminescentes. Em tais modalidades, o(s) elemento(s) de interação interage(m) com os elementos não luminescentes para induzir a formação do complexo bioluminescente ou criar condições adequadas para a formação do complexo bioluminescente. Em outras modalidades, um único elemento de interação é ligado a um membro de um par não luminescente. Em tais modalidades, o elemento de interação isolado interage com um ou ambos os elementos não luminescentes para criar interações favoráveis para a formação do complexo bioluminescente. Em modalidades típicas da presente invenção, um elemento de interação é ligado a cada membro de um par não luminescente. Interações favoráveis entre os elementos de interação facilitam a interações entre os elementos não luminescentes. O par de interação pode interagir de forma estável, interagir transitoriamente, formar um complexo, etc. A interação do par de interação facilita a interação dos elementos não luminescentes (e a formação de um complexo bioluminescente) por qualquer mecanismo adequado, incluindo, entre outros: aproximar intimamente os membros do par não luminescente, orientar adequadamente os membros do par não luminescente de interação, reduzir as ligações não covalentes que agem contra a interação do par não luminescente, etc.

[0237] Em algumas modalidades, um par de interação compreende quaisquer duas frações químicas que facilitam a interação de um par não luminescente associado. Um par de interação pode consistir em, por exemplo: dois ácidos nucleicos complementares, dois polipeptídeos capazes de dimerização (por exemplo, homodímero, heterodímero, etc.), uma proteína e seu ligante, proteína e molécula pequena, um anticorpo e seu epítopo, um par reativo de moléculas pequenas, etc. Qualquer par adequado de moléculas que interagem pode ser usado como um par de interação.

[0238] Em algumas modalidades, um par de interação compreende duas moléculas de interesse (por exemplo, proteínas de interesse) ou moléculas- alvo. Em algumas modalidades, as composições e métodos deste documento apresentam ensaios úteis (por exemplo, in vitro, in vivo, in situ, animal inteiro, etc.) para o estudo das interações entre um par de moléculas-alvo.

[0239] Em certas modalidades, um par de elementos de interação, cada um ligado a um dos elementos não luminescentes, interage entre si e, assim, facilita a formação do complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, a presença de um ligante, substrato, cofator ou elemento adicional de interação (por exemplo, não-ligado ao elemento não luminescente) é necessária para induzir a interação entre os elementos de interação e facilitar a formação do complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, a detecção de um sinal a partir do complexo bioluminescente indica a presença do ligante, substrato e cofator ou elemento adicional de interação ou condições que permitem a interação com os elementos de interação.

[0240] Em algumas modalidades, um par de elementos de interação e um par de elementos não luminescentes estão presentes em uma única cadeia de aminoácidos (por exemplo, (elemento de interação 1)-NLpep- (elemento de interação 2)-NLpoly, NLpoly- (elemento de interação 1)-NLpep-- (elemento de interação 2), NLpoly-(elemento de interação 1)-(elemento de interação 2)-NLpep, etc.). Em algumas modalidades nas quais um par de elementos de interação e um par de elementos não luminescentes estão todos presentes em uma única cadeia de aminoácidos, um ligante, substrato, cofator ou elemento adicional de interação é necessário para que o par de interação forme um complexo de interação e facilite a formação do complexo bioluminescente.

[0241] Em certas modalidades, um elemento de interação e um elemento não luminescente estão unidos, fundidos, ligados, conectados, etc. Em modalidades típicas, um primeiro elemento não luminescente e um primeiro elemento de interação estão unidos entre si, e um segundo elemento não luminescente e um segundo elemento de interação estão unidos entre si. A ligação elementos de sinal e de interação pode ser obtida por qualquer mecanismo adequado, química, ligante, etc. Os elementos de interação e não luminescentes estão tipicamente ligados através de ligações covalentes, porém a ligação não covalente dos dois elementos também é apresentada. Em algumas modalidades, os elementos de sinal e de interação estão conectados diretamente e, em outras modalidades, eles estão conectados por um ligante.

[0242] Em algumas modalidades, em que o elemento de interação é um peptídeo ou polipeptídeo, os elementos de sinal e de interação estão contidos dentro de uma única cadeia de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma única cadeia de aminoácidos compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em um elemento não luminescente e um elemento de interação. Em algumas modalidades, uma única cadeia de aminoácidos compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em um elemento não luminescente, um elemento de interação e, opcionalmente, uma ou mais sequências N-terminais, sequências C-terminais, elementos reguladores (por exemplo, promotor, sítio de início da tradução, etc.) e uma sequência ligante. Em algumas modalidades, os elementos de sinal e de interação estão contidos dentro de um polipeptídeo de fusão. Os elementos de sinal e de interação (e quaisquer outros segmentos de aminoácidos a serem incluídos na fusão) podem ser expressos separadamente; no entanto, em outras modalidades, uma proteína de fusão é expressa de modo a compreender ou consistir em ambas as sequências de interação e de sinal.

[0243] Em algumas modalidades, uma primeira proteína de fusão compreendendo um primeiro elemento não luminescente e um primeiro elemento de interação, bem como uma segunda proteína de fusão compreendendo um segundo elemento não luminescente e um segundo elemento de interação são expressas nas mesmas células. Em tais modalidades, a primeira e a segunda proteínas de fusão são purificadas e/ou isoladas a partir das células, ou a interação das proteínas de fusão é testada dentro das células. Em outras modalidades, a primeira e a segunda proteínas de fusão são expressas em células separadas e combinadas (por exemplo, após purificação e/ou isolamento, ou após fusão das células ou partes das células, ou por transferência de uma proteína de fusão de uma célula para outra, ou por secreção de uma ou mais proteínas de fusão para o meio extracelular) para a detecção de sinal. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de fusão são expressas em lisado de células (por exemplo, lisado de reticulócitos de coelho) ou em um sistema isento de células. Em algumas modalidades, uma ou mais proteínas de fusão são expressas a partir do genoma de um vírus ou outro patógeno celular.

[0244] Em certas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos, DNA, RNA, vetores, etc. que codificam o peptídeo, polipeptídeos, polipeptídeo de fusão, proteínas de fusão, etc. da presente invenção. Tais ácidos nucleicos e vetores podem ser usados para a expressão, transformação, transfecção, injeção, etc.

[0245] Em algumas modalidades, um elemento não luminescente e um elemento de interação estão ligados por um ligante. Em algumas modalidades, um ligante conecta os elementos de sinal e de interação, proporcionando uma quantidade desejada de espaço/distância entre os elementos. Em algumas modalidades, um ligante permite que ambos os elementos de sinal e de interação formem seus respectivos pares (por exemplo, par não luminescente e par de interação) simultaneamente. Em algumas modalidades, um ligante auxilia o elemento de interação no sentido de facilitar a formação da interação de um par não luminescente. Em algumas modalidades, quando um par de interação é formado, os ligantes que conectam cada um dos elementos não luminescentes aos seus respectivos elementos de interação posicionam os elementos não luminescentes na distância e conformação adequadas para formar um complexo bioluminescente. Em algumas modalidades, um elemento de interação e um elemento não luminescente são mantidos em estreita proximidade (por exemplo, <4 unidades monoméricas) por um ligante. Em algumas modalidades, um ligante proporciona uma distância desejada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6... 10... 20, ou mais unidades monoméricas) entre os elementos de sinal e de interação (por exemplo, para evitar interações indesejáveis entre os elementos de sinal e de interação, por considerações estéricas, para permitir a orientação apropriada do elemento não luminescente após a formação do complexo de interação, para permitir a propagação da formação de um complexo a partir do complexo de interação para os elementos não luminescentes, etc.). Em certas modalidades, um ligante proporciona química apropriada de ligação entre os elementos de sinal e de interação. Um ligante também pode melhorar o processo sintético de produção do elemento de sinal e de interação (por exemplo, permitindo que sejam sintetizados como uma única unidade, permitindo a conexão pós-síntese dos dois elementos, etc.).

[0246] Em algumas modalidades, um ligante é qualquer fração química adequada capaz de ligar, conectar ou vincular um elemento não luminescente a um elemento de interação. Em algumas modalidades, um ligante é um polímero de uma ou mais unidades monoméricas de repetição ou não repetição (por exemplo, ácido nucleico, aminoácido, polímero contendo carbono, cadeia de carbono, etc.). Quando um elemento não luminescente e um elemento de interação fazem parte de uma proteína de fusão, um ligante (quando presente) é, tipicamente, uma cadeia de aminoácidos. Quando um elemento não luminescente e um elemento de interação são ligados juntos após a expressão dos elementos individuais, um ligante pode compreender qualquer fração química com grupos funcionais (ou reativos) em ambas as extremidades que sejam reativos com grupos funcionais sobre os elementos de sinal e de interação, respectivamente. Qualquer fração adequada capaz de ligar os elementos de sinal e de interação pode ser usada como um ligante.

[0247] Pode ser utilizada uma grande variedade de ligantes. Em algumas modalidades, o ligante é uma única ligação covalente. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma estrutura linear ou ramificada, cíclica ou heterocíclica, saturada ou insaturada apresentando 1-20 átomos diferentes de hidrogênio (por exemplo, C, N, P, O e S) e é composta por qualquer combinação de ligações alquil, éter, tioéter, imina, carboxílica, amina, éster, carboxamida, sulfonamida, hidrazida e ligações aromáticas ou heteroaromáticas. Em algumas modalidades, os ligantes são mais longos do que 20 átomos diferentes de hidrogênio (por exemplo, 21 átomos diferentes de hidrogênio, 25 átomos diferentes de hidrogênio, 30 átomos diferentes de hidrogênio, 40 átomos diferentes de hidrogênio, 50 átomos diferentes de hidrogênio, 100 átomos diferentes de hidrogênio, etc.). Em algumas modalidades, o ligante compreende 1-50 átomos diferentes de hidrogênio (em adição aos átomos de hidrogênio) selecionados a partir do grupo de C, N, P, O e S (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 átomos diferentes de hidrogênio).

[0248]A presente invenção não está limitada pelos tipos de ligantes disponíveis. Os elementos de sinal e de interação estão ligados diretamente (por exemplo, ligante consiste em uma única ligação covalente) ou ligados através de um ligante adequado. A presente invenção não está limitada a nenhum grupo de ligantes em particular. Uma série de grupos de ligantes é contemplada, e os ligantes adequados poderiam incluir, entre outros, grupos alquil, cadeias de carbono de metileno, éter, poliéter, ligante alquil amida, um ligante peptídico, um ligante peptídico modificado, um ligante poli(etilenoglicol) (PEG), um ligante biotina-estreptavidina ou avidina- biotina, poliaminoácidos (por exemplo, polilisina), polissacarídeos, PEG funcionalizado, glicosaminoglicanos, polímeros dendríticos (WO93/06868 e por Tomalia et al. em Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-175 (1990), aqui incorporados por referência em sua totalidade), polímeros PEG-quelantes (W94/08629, WO94/09056 e WO96/26754, aqui incorporados por referência em sua totalidade), ligante oligonucleotídico, derivados de fosfolipídios, cadeias de alcenil, cadeia de alcinil, pontes dissulfeto, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o ligante é clivável (por exemplo, de forma enzimática (por exemplo, sítio de protease TEV), química, fotoinduzida, etc.

[0249] Em algumas modalidades, os peptídeos e polipeptídeos significativamente não luminescentes são apresentados com menos de 100% de identidade e/ou semelhança de sequência com qualquer fração de uma luciferase existente (por exemplo, uma luciferase de vaga-lume, uma luciferase de Renilla, uma luciferase de Oplophorus, luciferases aprimoradas de Oplophorus, conforme descritas no Pedido de Patente U.S. 2010/0281552 e Pedido de Patente US 2012/0174242, aqui incorporados por referência em sua totalidade). Certas modalidades da presente invenção envolvem a formação de complexos bioluminescentes de peptídeos e polipeptídeos não luminescentes com menos de 100% de identidade de sequência com a totalidade ou uma fração (por exemplo, 8 ou mais aminoácidos, menos do que cerca de 25 aminoácidos para os peptídeos) da SEQ ID NO: 2157 (por exemplo, sequência NANOLUC completa). Certas modalidades da presente invenção envolvem a formação de complexos bioluminescentes de peptídeos e polipeptídeos não luminescentes com menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade de sequência com a totalidade ou uma fração (por exemplo, 8 ou mais aminoácidos, menos do que cerca de 25 aminoácidos para os peptídeos) da SEQ ID NO: 2157 (por exemplo, sequência NANOLUC completa). Em algumas modalidades, os peptídeos e polipeptídeos não luminescentes são apresentados com menos de 100% de semelhança de sequências com uma fração (por exemplo, 8 ou mais aminoácidos, menos do que cerca de 25 aminoácidos para os peptídeos) da SEQ ID NO: 2157 (por exemplo, peptídeos e polipeptídeos que interagem para formar complexos bioluminescentes). Em algumas modalidades, os peptídeos e polipeptídeos não luminescentes são apresentados com menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de semelhança de sequência com uma fração (por exemplo, 8 ou mais aminoácidos, menos do que cerca de 25 aminoácidos para os peptídeos) da SEQ ID NO: 2157 (por exemplo, peptídeos e polipeptídeos que interagem para formar complexos bioluminescentes). São apresentados peptídeos não luminescentes que têm menos do que 100% de identidade e/ou semelhança de sequência com uma fração de cerca de 25 aminoácidos ou menos da SEQ ID NO: 2157, em que tais peptídeos formam um complexo bioluminescente quando combinados em condições apropriadas (por exemplo, estabilizados por um par de interação) com um polipeptídeo que tem menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade e/ou semelhança de sequência com outra fração da SEQ ID NO: 2157. São apresentados peptídeos não luminescentes que têm menos de 100% de identidade e/ou semelhança de sequência com uma fração de cerca de 25 aminoácidos ou menos da SEQ ID NO: 2157, em que tais peptídeos formam um complexo bioluminescente quando combinados em condições apropriadas (por exemplo, estabilizados por um par de interação) com um polipeptídeo que tem menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade e/ou semelhança de sequência com outra fração da SEQ ID NO: 2157. São apresentados peptídeos não luminescentes que têm menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade e/ou semelhança de sequência com uma fração de cerca de 25 aminoácidos ou menos da SEQ ID NO: 2157, em que tais peptídeos formam um complexo bioluminescente quando combinados em condições apropriadas (por exemplo, estabilizados por um par de interação) com um polipeptídeo que tem menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade e/ou semelhança de sequência com outra fração da SEQ ID NO: 2157. Do mesmo modo, são apresentados polipeptídeos não luminescentes que têm menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade ou semelhança de sequência com uma fração da SEQ ID NO: 2157, em que tais polipeptídeos formam um complexo bioluminescente quando combinados em condições apropriadas (por exemplo, estabilizados por um par de interação) com um peptídeo com menos de 100%, porém, opcionalmente, mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade e/ou semelhança de sequência com outra fração da SEQ ID NO: 2157. Em algumas modalidades, são apresentados peptídeos não luminescentes com menos de 100% de identidade ou semelhança de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, são apresentados peptídeos não luminescentes com menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade ou semelhança de sequência com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, são apresentados polipeptídeos não luminescentes com identidade ou semelhança de sequência inferior a 100% com a SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, são apresentados polipeptídeos não luminescentes com menos de 100%, porém mais de 40% (por exemplo, >40%, >45%, >50%, >55%, >60%, >65%, >70%, >75%, >80%, >85%, >90%, >95%, >98%, >99%) de identidade ou semelhança de sequência com a SEQ ID NO: 440.

[0250] Em algumas modalidades, os peptídeos não luminescentes que podem ser usados nas modalidades da presente invenção incluem peptídeos com uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos a partir de GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236). Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta peptídeos que compreendem uma ou mais sequências de aminoácidos da Tabela 1, e/ou ácidos nucleicos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos da Tabela 1 (que codificam as sequências peptídicas da Tabela 1).

[0251] Em certas modalidades, é apresentado um peptídeo da Tabela 1. Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem uma única diferença de aminoácidos de GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) e/ou qualquer um dos peptídeos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, os peptídeos compreendem duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) diferenças de aminoácidos de GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236) e/ou qualquer um dos peptídeos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, são apresentados peptídeos que compreendem uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados peptídeos que compreendem uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, um peptídeo ou uma fração do mesmo compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) com um ou mais sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem uma das sequências de ácidos nucleicos que codifica as sequências de SEQ ID NOS: 3438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem uma das sequências de ácido nucleico das SEQ ID NOS: 3438 e 2162-2365 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou uma fração do mesmo compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) com uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que codificam uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que codificam uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, é apresentado um ácido nucleico que codifica um aminoácido com mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) com uma ou mais das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-438 e 2162-2365.

[0252] Em certas modalidades, é apresentado um ácido nucleico da Tabela 1. Em algumas modalidades, é apresentado um ácido nucleico que codifica um peptídeo da Tabela 1. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da presente invenção codifica um peptídeo que compreende uma única diferença de aminoácidos de MGVTGWRLCERILA (SEQ ID NO: 2) e/ou qualquer um dos peptídeos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica peptídeos que compreendem duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) diferenças de aminoácidos de MGVTGWRLCERILA (SEQ ID NO: 2) e/ou qualquer um dos peptídeos listados na Tabela 1. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem a sequência de um dos ácidos nucleicos na Tabela 1. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem um dos ácidos nucleicos da Tabela 1 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou uma fração do mesmo compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) com um ou mais dos ácidos nucleicos da Tabela 1.

[0253] Em algumas modalidades, polipeptídeos não luminescentes que podem ser usados em modalidades da presente invenção incluem polipeptídeos com uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos da SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta polipeptídeos que compreendem uma ou mais das sequências de aminoácidos da Tabela 2, e/ou ácidos nucleicos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos da Tabela 2 (que codificam as sequências polipeptídicas da Tabela 2).

[0254] Todos polipeptídeos e sequências de ácidos nucleicos que os codificam da Tabela 2 (SEQ ID NOS: 441-1298) contêm resíduos N-terminais de Met (aminoácidos) ou códons de iniciação ATG (ácidos nucleicos). Em algumas modalidades, os polipeptídeos e sequências de ácidos nucleicos que os codificam da Tabela 2 são apresentados sem os resíduos N-terminais de Met ou códons de iniciação ATG (SEQ ID NOS: 1299-2156).

[0255] Em certas modalidades, é apresentado um polipeptídeo de um dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma única diferença de aminoácidos da SEQ ID NO: 440. Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreendem duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30... 35... 40... 45... 50 ou mais) diferenças de aminoácidos da SEQ ID NO: 440 e/ou qualquer um dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, são apresentados polipeptídeos que compreendem a sequência de um dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou uma fração do mesmo compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, >71%, >75%, >80%, >85%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98% ou >99%) com um ou mais dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156.

[0256] Em certas modalidades, é apresentado um ácido nucleico da Tabela 2. Em algumas modalidades, é apresentado um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da Tabela 2. Em algumas modalidades, um ácido nucleico da presente invenção codifica um polipeptídeo que compreende uma única diferença de aminoácidos da SEQ ID NO: 440 e/ou qualquer um dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos codificam um polipeptídeo que compreende duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30... 35... 40... 45... 50 ou mais) diferenças de aminoácidos da SEQ ID NO: 440 e/ou qualquer um dos polipeptídeos apresentados na Tabela 2. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem a sequência de um dos polímeros de ácidos nucleicos da SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que compreendem a sequência de um dos polímeros de ácidos nucleicos da SEQ ID NOS: 441-2156 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou uma fração do mesmo compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, >71%, >75%, >80%, >85%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98% ou >99%) com um ou mais dos polímeros de ácidos nucleicos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou uma fração do mesmo codifica um polipeptídeo que compreende mais de 70% de identidade de sequência (por exemplo, >71%, >75%, >80%, >85%, >90%, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98% ou >99%) com um ou mais dos polímeros de aminoácidos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que codificam um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 441-2156. Em algumas modalidades, são apresentados ácidos nucleicos que codificam um dos polipeptídeos das SEQ ID NOS: 441-2156 com uma ou mais adições, substituições e/ou deleções.

[0257] Em algumas modalidades, um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente e/ou um elemento de interação compreende um peptídeo sintético, peptídeo contendo um ou mais aminoácidos não-naturais, peptídeo mimético, peptídeo sintético conjugado (por exemplo, conjugado com um grupo funcional (por exemplo, fluoróforo, substrato luminescente, etc.)).

[0258] A presente invenção apresenta composições e métodos que são úteis vários campos, incluindo pesquisa básica, investigação médica, diagnóstico molecular, etc. Embora os reagentes e ensaios aqui descritos não estejam limitados a quaisquer aplicações em particular, e qualquer aplicação útil deva ser vista como estando dentro do âmbito da presente invenção, os seguintes são exemplos de ensaios, kits, campos, instalações experimentais, etc. que fazem uso da invenção aqui reivindicada.

[0259] Aplicações típicas que fazem uso das modalidades da presente invenção incluem o monitoramento/detecção da dimerização de proteínas (por exemplo, heterodímeros, homodímeros), interações proteína- proteína, interações proteína-RNA, interações proteína-DNA, hibridização de ácidos nucleicos, interações proteína-molécula pequena, ou quaisquer outras combinações de entidades moleculares. A primeira entidade de interesse está ligada a um primeiro membro de um par não luminescente e a segunda entidade de interesse está ligada ao segundo membro de um par não luminescente. Se um sinal detectável for produzido nas condições particulares do ensaio, então a interação da primeira e segunda entidades é inferida. Tais ensaios são úteis para monitorar interações moleculares em quaisquer condições apropriadas (por exemplo, in vitro, in vivo, in situ, animal inteiro, etc.) e podem ser utilizados, por exemplo, na descoberta de medicamentos, em elucidar vias moleculares, estudar o equilíbrio ou aspectos cinéticos da montagem do complexo, triagem de alto rendimento, sensor de proximidade, etc.

[0260] Em algumas modalidades, um par não luminescente de características conhecidas (por exemplo, características espectrais, afinidade mútua do par) é usado para elucidar a afinidade de, ou compreender a interação de, um par de interação de interesse. Em outras modalidades, um par de interação bem caracterizado é usado para determinar as características (por exemplo, características espectrais, afinidade mútua do par) de um par não luminescente.

[0261] As modalidades aqui descritas podem ser utilizadas na triagem de fármacos e/ou desenvolvimento de fármacos. Por exemplo, a interação de uma molécula pequena ou uma biblioteca inteira de moléculas pequenas com uma proteína-alvo de interesse (por exemplo, alvo terapêutico) é monitorada em uma ou mais condições relevantes (por exemplo, condições fisiológicas, condições de doença, etc.). Em outras modalidades, a capacidade de um fármaco de molécula pequena ou uma biblioteca inteira de moléculas pequenas para intensificar ou inibir as interações entre duas entidades (por exemplo, receptor e ligante, proteína-proteína, etc.) é testada. Em algumas modalidades, as aplicações de triagem de fármacos são realizadas em um formato de alto rendimento para permitir a detecção da ligação de dezenas de milhares de moléculas diferentes a um alvo, ou para testar o efeito destas moléculas sobre a ligação de outras entidades.

[0262] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta a detecção de interações moleculares em organismos vivos (por exemplo, bactérias, leveduras, eucariotos, mamíferos, primatas, seres humanos, etc.) e/ou células. Em algumas modalidades, as proteínas de fusão que compreendem polipeptídeos de sinal e interação (alvo) são coexpressas na célula ou organismo inteiro, e o sinal é detectado e correlacionado à formação do complexo de interação. Em algumas modalidades, as células são transitória e/ou estavelmente transformadas ou transfectadas com vetor(es) que codificam elemento(s) não luminescente(s), elemento(s) de interação, proteínas de fusão (por exemplo, compreendendo um elemento de sinal e interação), etc. Em algumas modalidades, organismos transgênicos são gerados que codificam as proteínas de fusão necessárias para realizar os ensaios aqui descritos. Em outras modalidades, os vetores são injetados em organismos inteiros. Em algumas modalidades, um animal transgênico ou uma célula transgênica (por exemplo, expressando uma proteína de fusão) é usado para monitorar a biodistribuição de uma molécula pequena ou um produto biológico ligado (por exemplo, conjugado ou fundido geneticamente) a sequência peptídica não luminescente que iria formar um complexo nos compartimentos subcelulares e/ou tecidos onde se concentra.

[0263] Em algumas modalidades, uma fração peptídica (por exemplo, peptídeo não luminescente) de um complexo luminescente é empregada como uma marcação proteica (por exemplo, no interior das células). Em tais modalidades, uma fração polipeptídica (por exemplo, polipeptídeo não luminescente) de um complexo luminescente (por exemplo, capaz de formar um complexo luminescente com o peptídeo não luminescente) é aplicada às células (por exemplo, como parte de um reagente) para detectar/quantificar a presença de proteínas marcadas com o peptídeo não luminescente. Por exemplo, uma proteína de interesse é fundida a um NLpep de alta afinidade (por exemplo, NLpep86). O NLpep é então transfectado nas células de interesse, um reagente contendo NanoGlo+NLpoli11S é, então, adicionado às células+meio, e a luminescência é detectada. Este esquema de ensaio é demonstrado na Figura 175. Em algumas modalidades, o pequeno tamanho do peptídeo é útil para a marcação proteica. Em algumas modalidades, polipeptídeos não luminescentes utilizados em tal sistema são suficientemente estáveis para existir em um tampão adequado durante períodos prolongados de tempo (por exemplo, na presença do substrato furimazina). Em certas modalidades, o polipeptídeo não luminescente possui luminescência detectável mínima na ausência do peptídeo complementar (por exemplo, mesmo na presença do substrato furimazina). Em algumas modalidades, condições tamponadas otimizadas são utilizadas para atender aos critérios necessários para a marcação proteica. Polipeptídeos e peptídeos de alta afinidade espontânea são úteis em tais sistemas, e têm utilidade, por exemplo, em imunoensaios, na detecção de partículas virais, no estudo da dinâmica de proteínas em células vivas, etc. Em algumas modalidades, tal sistema fornece uma marcação proteica extremamente pequena (por exemplo, 11 aminoácidos), proporcionando detecção de alta sensibilidade, estabilidade (por exemplo, particularmente em condições de desnaturação) e/ou um amplo intervalo dinâmico.

[0264] As composições e métodos aqui apresentados, bem como quaisquer técnicas ou tecnologias à base destes podem ser utilizados em várias aplicações e campos; uma lista não-limitante de exemplos de aplicações segue abaixo: • Western Blot sem anticorpos: Por exemplo, uma proteína de interesse é fundida com um peptídeo não luminescente (por exemplo, por engenharia genética) e expressa por quaisquer meios adequados. As proteínas são separadas (por exemplo, por PAGE) e transferidas para uma membrana. A membrana é então lavada com polipeptídeo não luminescente complementar (por exemplo, permitindo que um complexo luminescente se forme) e colocada no gerador de imagens (por exemplo, utilizando uma câmara CCD) com Furimazina (PBI-3939) na parte superior da membrana, e a proteína de interesse é detectada (por exemplo, através da luminescência do complexo luminescente) • “LucCytochemistry”: Por exemplo, uma proteína de interesse é expressa fundida com um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente e, em seguida, é detectada com um polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar de forma análoga à imunocitoquímica • Ensaio de localização proteica: Por exemplo, um sinal de localização é adicionado a um polipeptídeo não luminescente ou polipeptídeo (por exemplo, através de engenharia genética) e expresso nas células (por exemplo, um sinal de localização nuclear adicionado resultaria na expressão do polipeptídeo não luminescente no núcleo). Um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente complementar é fundido com uma proteína de interesse (por exemplo, através de engenharia genética) e expresso nas células com o polipeptídeo ou peptídeo não luminescente. A luminescência é produzida se a proteína de interesse se localizar no mesmo compartimento subcelular (por exemplo, no núcleo) como o polipeptídeo não luminescente localizado por sinal • Ensaio de Estabilidade Proteica: Por exemplo, uma proteína de interesse é fundida com um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente (por exemplo, através de engenharia genética) e incubada em uma ou mais condições de interesse. Polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar é adicionado (por exemplo, em vários momentos), e a luminescência é utilizada para quantificar a quantidade de proteína de interesse (por exemplo, um indicador para estabilidade) • Detecção/Quantificação Proteica: Por exemplo, uma proteína de interesse é fundida com um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente (por exemplo, através de engenharia genética) e expressa e/ou manipulada por qualquer método. Polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar é então adicionado para detectar e/ou quantificar a proteína de interesse • Purificação Proteica: Por exemplo, uma proteína de interesse é fundida com um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente (por exemplo, através de engenharia genética) e expressa por qualquer método. A mistura de proteínas é passada por um polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar imobilizado (por exemplo, em esferas, em uma coluna, sobre um chip, etc.), lavada com tampão adequado e eluída (por exemplo, com um tampão de força iônica elevada ou pH baixo). Uma forma mutante do peptídeo ou polipeptídeo não luminescente que não ativa a luminescência do peptídeo ou polipeptídeo não luminescente complementar pode ser usada para eluir a proteína de interesse • Degradação: Por exemplo, um polipeptídeo não luminescente imobilizado, complementar é usado para isolar uma proteína de interesse (e proteínas que interagem) que está fundida com um peptídeo não luminescente (por exemplo, através de engenharia genética) • Ensaio de Internalização do Receptor Acoplado à Proteína G (GPCR): Por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente é fundido com um GPCR de interesse (por exemplo, através de engenharia genética) e expresso na superfície das células. Polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar é adicionado ao meio das células e utilizado para detectar o GPCR sobre a superfície das células. Um ligante é adicionado para estimular a internalização do GPCR, e uma diminuição na luminescência é observada • Ensaio de Integridade da Membrana para a Viabilidade Celular: Por exemplo, quando a membrana celular de uma célula que expressa um polipeptídeo não luminescente se torna comprometida, um peptídeo não luminescente entra na célula (por exemplo, um peptídeo que, de outra forma, não pode atravessar a membrana celular), formando assim um complexo luminescente, e gerando luminescência.

[0265] Detecção de 5-Hidroximetil Citosina: Por exemplo, uma cisteína é adicionada a um peptídeo não luminescente e incubada com DNA e uma metiltransferase. A metiltransferase catalisa a adição do tiol (cisteína) apenas nos resíduos de citosina que são 5-hidroximetilados. O peptídeo não- incorporado é então separado do DNA (utilizando qualquer método possível) e um polipeptídeo não luminescente é adicionado para detectar o peptídeo conjugado ao DNA.

[0266] Detecção de Formil Citosina: Por exemplo, semelhante à detecção de 5-hidroximetil citosina acima, este método de detecção utiliza química com reatividade específica para formil citosina • Incorporação Viral: Ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo não luminescente é incorporado em um genoma viral, e o polipeptídeo ou peptídeo não luminescente complementar é expresso de forma constitutiva nas células-alvo. Após a infecção das células-alvo e a expressão do peptídeo não luminescente, o complexo bioluminescente se forma e um sinal é detectado (por exemplo, na presença de substrato).

[0267] Marcação proteica química: Um peptídeo não luminescente é fundido ou ligado a um grupo reativo (por exemplo, biotina, succinimidil éter, maleimida, etc.). Uma proteína de interesse (por exemplo, anticorpo) é marcada com o peptídeo não luminescentes por meio da ligação do grupo reativo com a proteína de interesse. Uma vez que o peptídeo é pequeno, ele não afeta a funcionalidade da proteína de interesse. Polipeptídeo não luminescente complementar é adicionado ao sistema, e um complexo luminescente é produzido após a ligação do polipeptídeo ao peptídeo • Ensaio de Protease: Por exemplo, uma sequência peptídica que é reconhecida por uma protease de interesse pode ser unida ao NLPep de tal forma que impeça a bioluminescência após a exposição ao NLPoli. Maneiras de fazer isso incluem ligar um supressor da luminescência à sequência de reconhecimento da protease ou ligar a sequência de reconhecimento da protease em relação ao NLPep de tal forma que a complementação seja impedida. Após a atividade da protease em clivar a sequência de reconhecimento, a capacidade do NLPoli em complementar o NLPep e emitir luminescência é restaurada e, assim, o sistema é um ensaio sensível de protease • Detecção de RNA • Caracterização de Ligantes a Biomoléculas: Por exemplo, um ligante ligado a uma biomolécula, tal como um anticorpo, pode ser avaliado quanto à sua estabilidade em várias condições através da ligação de NLPep à molécula através do ligante de interesse. Ao longo do tempo, a produção de NLPep livre através da degradação do ligante pode ser monitorada pela adição de NLPoli e furimazina e pela quantificação da bioluminescência produzida • Ensaio de Mutação: Por exemplo, uma mutação pontual, uma mutação de deslocamento do quadro de leitura, etc. introduzida in vitro ou in vivo resulta em um ganho de sinal ou perda de sinal a partir de um par de complementação. Tal ensaio pode ser utilizado, por exemplo, para testar compostos quanto à mutagenicidade • Envolvimento do alvo para inibidores peptídicos: Uso de peptídeos conjugados a NLpep de baixa afinidade (expressos nas células) para monitorar o envolvimento do alvo de inibidores à base de peptídeos. NLpoly é ligado ao alvo de interesse. O envolvimento resulta em perda de sinal a partir do complexo luminescente • Biossensores de protease de ganho de sinal: Um sítio de clivagem da protease é expresso entre NLpoly e um peptídeo escuro NLpep (baixa afinidade). A clivagem libera o peptídeo escuro permitindo que o NLpep de alta afinidade complemente o NLpoly • Ensaio de protease de ganho de função: A sequência de um NLpep é manipulada de modo proximal a um sítio de clivagem de um substrato de comprimento completo para uma protease (por exemplo, caspase, ADAM, etc.). O peptídeo permanece estericamente inacessível, desde que o substrato permaneça intacto e o peptídeo esteja “soterrado”. Tanto o substrato da protease geneticamente modificada quanto um NLpoly (por exemplo, NLpoli11S) são cotransfectados em uma linhagem de células-alvo. A atividade da luciferase é induzida após a indução da atividade da protease, que leva à clivagem do substrato e exposição do peptídeo ativador na extremidade N- ou C-terminal de um dos fragmentos. Este princípio é expansível para detectar também alterações conformacionais e/ou modificações proteicas • Quantificação de analitos intracelulares usando intracorpos recombinantes: Fragmentos de anticorpos são expressos dentro das células como NLpoly ou NLpep de fusão. Uma subunidade complementar é geneticamente fundida a um analito de interesse. Quando o analito está presente, o anticorpo se liga e o complexo luminescente é formado. A aplicação é expansível para biossensores intracelulares PTM (por exemplo, fosforilação), em que o intracorpo liga-se apenas ao analito quando tiver sido fosforilado (ou de outra forma ligado pelo Ab específico da modificação).

[0268] As aplicações acima das composições e métodos da presente invenção não são limitantes e podem ser modificados de qualquer maneira adequada, enquanto ainda estiverem dentro do âmbito da presente invenção.

[0269] A presente invenção também apresenta métodos para a elaboração e/ou otimização de pares/grupos não luminescentes e os complexos bioluminescentes que se formam a partir destes. Qualquer método adequado para a elaboração de pares/grupos não luminescentes que são consistentes com as modalidades aqui descritas, e/ou painéis destes, está dentro do âmbito da presente invenção.

[0270] Em certas modalidades, os pares/grupos não luminescentes são elaborados de novo para apresentarem ausência de luminescência individualmente e exibirem luminescência após a associação. Em tais modalidades, a força da interação entre os elementos não luminescentes é insuficiente para produzir um sinal bioluminescente na ausência de elementos de interação para facilitar a formação do complexo bioluminescente.

[0271] Em outras modalidades, elementos não luminescentes e/ou pares não luminescentes são racionalmente elaborados, por exemplo, utilizando uma proteína bioluminescente (por exemplo, SEQ ID NO: 2157) como um ponto de partida. Por exemplo, tais métodos podem compreender: (a) alinhar as sequências de três ou mais proteínas relacionadas; (b) determinar uma sequência de consenso para as proteínas relacionadas; (c) fornecer primeiro e segundo fragmentos de uma proteína bioluminescente que está relacionada àqueles a partir dos quais a sequência de consenso foi determinada, em que os fragmentos são individual e significativamente não luminescentes, mas exibem luminescência após a interação dos fragmentos; (d) mutar o primeiro e segundo fragmentos em uma ou mais posições de cada um (por exemplo, in vitro, in silico, etc.), em que as referidas mutações alteram as sequências dos fragmentos para serem mais semelhantes a uma fração correspondente da sequência de consenso, em que a mutação resulta em um par não luminescente que não é um fragmento de uma proteína preexistente, e (e) testar o par não luminescente para a ausência de luminescência quando não-associado e a luminescência após a associação do par não luminescente. Em outras modalidades, o primeiro e o segundo fragmentos de uma das proteínas usadas na determinação da sequência de consenso são apresentados, mutados e testados.

[0272] Em algumas modalidades, um peptídeo de um par luminescente é um “peptídeo escuro”, ou um que se liga ao seu complemento (por exemplo, NLpoly) (por exemplo, com baixa ou alta afinidade), mas produz luminescência mínima ou nenhuma luminescência (Ver figuras 180-182). Em algumas modalidades, um peptídeo escuro de alta afinidade pode ser utilizado na complementação inversa, ou ensaios de ganho de sinal para medir inibidores. Em algumas modalidades, um peptídeo escuro de baixa afinidade é usado para reduzir a base de NLpoli11S em um reagente para a detecção de um marcador de peptídeo de alta afinidade (por exemplo, NLpep86). Exemplos de peptídeos escuros são apresentados na Figura 180.

[0273] Em algumas modalidades, um peptídeo de um par luminescente é um “peptídeo supressor”, ou aquele que contém uma fração supressora (por exemplo, DAB), e o supressor absorve a luz/energia produzida por um NLpoly isoladamente (por exemplo, o sinal produzido independente de um NLpep complementar) e um complexo NLpoly-NLpep (por exemplo, o sinal produzido como resultado da formação do complexo). Exemplos de peptídeos supressores escuros teriam um espectro adequado de absorção e incluem DAB- 161 (DAB-GWRLFK), DAB-162 (DAB-GWALFK), DAB- 163 (DAB- VTGWALFEEIL), DAB-164 (DAB-VTGYALFQEIL), DAB-165 (DAB- VTGYALFEQIL) e DAB-166 (DAB-VTGYALFEEIL); em que DAB = Dabcyl (supressor de 475 nm)+espaçador dPEG4.

[0274] Em algumas modalidades, os métodos acima não são limitados à elaboração e/ou otimização dos pares não luminescentes. As mesmas etapas são realizadas para produzir pares de elementos que não possuem uma determinada funcionalidade (por exemplo, atividade enzimática) individualmente, mas exibem tal funcionalidade quando associados. Em qualquer um destes casos, a força da interação entre os elementos do par não luminescente podem ser alterados por meio de mutações para assegurar que isso seja insuficiente para produzir funcionalidade na ausência de elementos de interação que facilitam a formação do complexo bioluminescente.

EXPERIMENTAL EXEMPLO1 GERAÇÃO DE PEPTÍDEOS

[0275] Construções peptídicas foram geradas por um de três métodos: anelamento de oligonucleotídeos 5’-fosforilados seguido por ligação ao vetor pF4Ag-Barnase-HaloTag (Promega Corporation; corte com SgfI e XhoI) ou pFN18A (Promega Corporation; corte com SgfI e XbaI), mutagênese dirigida ao sítio usando kit Quik Change Lightning Multi da Agilent ou terceirização da clonagem à Gene Dynamics.

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE PEPTÍDEOS

[0276] Os peptídeos gerados no Exemplo 1 foram preparados para análise pela inoculação de uma única colônia de células KRX de E. coli (Promega Corporation) transformadas com um plasmídeo que codifica um peptídeo em 25 mL de cultura LB e crescidas a 37°C durante a noite. As culturas durante a noite (10 mL) foram então diluídas em 1 L de LB e cresceram a 37°C durante 3 horas. As culturas foram então induzidas pela adição de 10 mL de ramnose 20% para a cultura de 1 L e induzidas a 25°C durante 18 horas.

[0277] Após a indução, 800 mL de cada cultura foram centrifugados a 5000 x g a 4°C durante 30 minutos. O pellet gerado foi então ressuspenso em 80 mL de Tampão de Lise Peptídica (HEPES 25 mM, pH 7,4, Tampão de Lise Passiva 0,1x (Promega Corporation), lisozima 1 mL/mL e RQ1 DNAase 0,03 U/µL (Promega Corporation)) e incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. As células lisadas foram então congeladas em gelo seco durante 15 minutos e depois descongeladas em um banho à temperatura ambiente durante 15 minutos. As células foram, então, centrifugadas a 3500 x g a 4°C durante 30 minutos. Os sobrenadantes foram aliquotados em amostras de 10 mL com uma alíquota de 50 µL colocada em um tubo de 1,5 mL.

[0278] Para as amostras de 50 µL, 450 µL de H20 e 167 µL de Corante de Carregamento SDS 4x foram adicionados, e as amostras incubadas a 95°C durante 5 minutos. Após o aquecimento, 5 µL de cada amostra foram aplicados (em triplicata) em um gel de SDS-PAGE, e o gel foi corrido e corado de acordo com o protocolo do fabricante. O gel foi então digitalizado em um Typhoon Scanner (excitação 532 nm, emissão 580 nm, sensibilidade PMT 400V). As bandas resultantes foram quantificadas utilizando o software ImageQuant (5.2). Foi calculada a média das intensidades de cada uma das três replicatas, e a intensidade média de NLpep53-HT foi definida em uma concentração de 12x. As concentrações de todos os demais peptídeos foram calculadas em relação ao Pep53-HT.

EXEMPLO 3 ANÁLISE DE PEPTÍDEOS

[0279] Todos os peptídeos gerados nos Exemplos 1-2 continham mutações únicas para a sequência peptídica: GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 236). Todos os peptídeos foram fundidos a uma proteína HALOTAG (Promega Corporation). Os peptídeos identificados como “TH-NLpep” indicam que o peptídeo está localizado na extremidade C-terminal da proteína HALOTAG. Neste caso, o gene que codifica o peptídeo inclui um códon de terminação, mas não inclui uma metionina para iniciar a tradução. Os peptídeos identificados como “NLpep-HT” indicam que o peptídeo está na extremidade N-terminal da proteína HALOTAG. Neste caso, o peptídeo inclui uma metionina para iniciar a tradução, mas não inclui um códon de terminação.

[0280] Para determinar a capacidade dos peptídeos em ativar luminescência, colônias individuais de células KRX de E. coli (Promega Corporation) foram transformadas com um plasmídeo que codifica um peptídeo do Exemplo 1, inoculadas em 200 µL de meio mínimo (sais M9 1x, CaCl2 0,1 mM, MgSO4 2 mM, cloridrato de tiamina 1mM, gelatina 1%, glicerol 0,2%, e 100 uL/mL de ampicilina) e cultivadas a 37°C durante a noite. Além dos peptídeos, uma cultura de células KRX de E. coli que expressam KRX um fragmento selvagem (WT) dos resíduos 1-156 da NanoLuc foi cultivada. Todos os peptídeos e o fragmento WT foram inoculados em pelo menos 3 culturas separadas.

[0281] Após o primeiro crescimento durante a noite, 10 µL de cultura foram diluídos em 190 µL de meio mínimo fresco e cultivadas novamente a 37°C durante a noite.

[0282]Após o segundo crescimento durante a noite, 10 µL da cultura foram diluídos em 190 µL de meio de autoindução (meio mínimo+glicose 5% e ramnose 2%). As culturas foram, então, introduzidas a 25°C durante aproximadamente 18 horas.

[0283]Após a indução, as culturas de pequenos peptídeos mutantes foram testadas quanto à atividade. As culturas contendo o fragmento WT 1-156 foram agrupadas, misturadas com 10 mL de tampão de lise 2x (HEPES 50 mM pH 7,4, Tampão de Lise Passiva 0,3x, e 1 mg/mL de lisozima) e incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. 30 µL da cultura lisada de WT 1-156 foram então divididos em alíquotas para os poços de uma placa branca de ensaio de 96 poços arredondados (Costar 3355). Para os poços da placa de ensaio, 20 µL de uma cultura de peptídeos foram adicionados, e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a incubação, 50 µL de Reagente de Ensaio de Luciferase NANOGLO (Promega Corporation) foram adicionados, e as amostras incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s.

[0284] Os resultados (Ver Tabela 3 e Figura 1) demonstram várias mutações no peptídeo (em relação à SEQ ID NO: 1) que alteraram (por exemplo, aumentaram, diminuíram) a luminescência após complementação com o polipeptídeo não luminescente selvagem. Acredita- se que a luminescência aumentada seja originada de um (ou uma combinação) dos cinco fatores principais, qualquer dos quais são benéficos: afinidade entre o peptídeo não luminescente e o polipeptídeo não luminescente, expressão do peptídeo, solubilidade intracelular, estabilidade intracelular, e atividade bioluminescente. No entanto, a presente invenção não se limita a qualquer mecanismo de ação em particular e uma compreensão do mecanismo de ação não é necessário para a prática da presente invenção. TABELA 3

EXEMPLO 4 GERAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0285] Usando pF4Ag-NanoLuc1-156 (WT 1-156) como molde, foi realizado PCR sujeita a erros (epPCR) usando o Kit Diversify PCR Random Mutagenesis da Clontech. O produto resultante da PCR foi digerido com SgfI e XbaI e ligado a pF4Ag-Barnase (Promega Corporation), uma versão do vetor pF4A disponível comercialmente (Promega) que contém os promotores T7 e CMV e que foi modificado para conter um sítio de ligação ao ribossomo da E. coli. Após a transformação nas células KRX de E. coli (Promega Corporation) por choque térmico a 42°C, colônias individuais foram utilizadas para inocular 200 µL de cultura em placas transparentes de 96 poços de fundo chato (Costar 3370).

EXEMPLO 5 ANÁLISE DE POLIPEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0286] Para determinar a luminescência dos mutantes polipeptídicos não luminescentes gerados no Exemplo 4, colônias individuais das células KRX de E. coli (Promega Corporation) transformadas com um plasmídeo contendo um dos mutantes polipeptídicos não luminescentes do Exemplo 4 foram cultivadas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 3.

[0287] Para testar cada cultura induzida pelo mutante polipeptídico não luminescente, 30 µL de tampão de lise do ensaio (HEPES 25 mM pH 7,4, Tampão de Lise Passiva 0,3x (Promega Corporation)), 0,006 U/µL de RQ1 DNAase (Promega Corporation) e Solução Peptídica 1x (a concentração relativa dos peptídeos foi determinada tal como explicado no Exemplo 2; a partir da concentração relativa determinada, os peptídeos foram diluídos para 1x no tampão de lise) contendo o fragmento peptídico GVTGWRLCKRISA (SEQ ID NO: 18) ou GVTGWRLFKRISA (SEQ ID NO: 106) foram divididos em alíquotas para os poços de uma placa de ensaio de 96 poços (Costar 3355). Para os poços da placa de ensaio, 20 µL de uma cultura de mutante polipeptídico não luminescente induzida foram adicionados, e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após a incubação, 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NANOGLO (Promega Corporation) foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s.

[0288] Os resultados (Tabela 4 e Figura 2) demonstram inúmeras mutações pontuais que melhoram a luminescência do polipeptídeo não luminescente após a complementação com dois peptídeos diferentes. Semelhante às mutações no peptídeo, estas mutações no polipeptídeo não luminescente podem se originar a partir de vários fatores, todos os quais são benéficos para o sistema como um todo. TABELA 4 *As unidades na Tabela 4 são RLU(mutante)/RLU(WT)

EXEMPLO 6 SUBSTITUIÇÕES DE GLICINA POR ALANINA NO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0289] O exemplo a seguir identificou resíduos de glicina dentro do polipeptídeo não luminescente que podem ser substituídos por alanina para fornecer um polipeptídeo não luminescente melhorado (por exemplo, maior sinal luminescente). As substituições foram feitas isoladamente (ver Figura 3) ou em compostos (Figura 2). Os polipeptídeos não luminescentes contendo substituições de glicina por alanina foram gerados tal como descrito no Exemplo 1.

[0290] Cada colônia mutante isolada foi inoculada em 200 µL meio mínimo (sais M9 1x, CaCl2 0,1 mM, MgSO4 2 mM, cloridrato de tiamina 1 mM, gelatina 1%, glicerol 0,2% e ampicilina 1x) e incubada com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da cultura foram então adicionados a 190 µL de meio mínimo fresco e incubados de novo com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da segunda cultura foram então adicionados a 190 µL de meio de autoindução (meio mínimo+glicose 5%+ramnose 2%) e incubados com agitação a 25°C durante 18 horas para permitir a expressão do polipeptídeo não luminescente.

[0291] Para testar cada cultura mutante, 30 µL de tampão de ensaio de lise (HEPES 50 mM pH 7,5, Tampão de Lise Passiva 0,3x (Promega Corporation)) e 0,006 U/µL de RQ1 DNAase (Promega Corporation)) contendo peptídeo não luminescente (diluição 1:10 de NLpep9-HT (NLpep9 é a SEQ ID NO: 17 e 18; HT é HaloTag do lisado clarificado de E. coli) foram adicionados. As amostras foram agitadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NANOGLO (Promega Corporation) foram adicionados. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, e a luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s.

[0292] Para gerar o lisado clarificado de E. coli NLpep9-HT, 5 mL de LB foram inoculados com uma única colônia de E. coli de NLpep9-HT e incubados a 37°C durante a noite. 500 µL da cultura durante a noite foram então diluídos em 50 mL de LB e incubados a 37°C durante 3 horas. 500 µL de ramnose 20% foram adicionados e incubados a 25°C durante 18 horas. A cultura de expressão foi centrifugada a 3000 x g durante 30 minutos, e o pellet de células foi ressuspenso em 5 mL de tampão de lise peptídica (HEPES 25 mM, pH 7,5, tampão de lise passiva 0,1x, 1 mg/mL de lisozima e 0,3 U/µL de RQ1 DNAase) e incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos. A amostra lisada foi colocada em gelo seco durante 15 minutos, descongelada em banho-maria à temperatura ambiente e centrifugada a 3500 x g durante 30 minutos. O sobrenadante era o lisado clarificado.

[0293] As Figuras 3 e 4 demonstram os efeitos das mutações na luminescência.

EXEMPLO 7 MUTAÇÕES NO PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0294] No exemplo a seguir, mutações foram feitas no peptídeo não luminescente com base no alinhamento a outras proteínas de ligação a ácidos graxos (FABPs) e foram escolhidas com base na probabilidade elevada (frequência nos FABPs) de identificar uma mutação que mantém/melhora a atividade (tal como NLpep2, 4 e 5) ou estabelecer que não é provável que uma mutação seja tolerado naquela posição (tal como NLpep3). NLpep1-5 contêm mutações individuais (ver Tabela 1), e NLpep6-9 são conjuntos compostos das mutações em NLpep2, 4 e 5 (ver Tabela 1). Os mutantes foram gerados tal como descrito no Exemplo 1.

[0295] Cada colônia mutante foi inoculada em 200 µL de meio mínimo e incubada com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da cultura foram então adicionados a 190 µL de meio mínimo fresco e incubados de novo com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da segunda cultura foram então adicionados a 190 µL de meio de autoindução e incubados com agitação a 25°C durante 18 horas para permitir a expressão do mutante peptídico não luminescente.

[0296] Para testar cada cultura mutante, 30 µL de tampão de lise de ensaio (HEPES 50 mM pH 7,5, Tampão de Lise Passiva 0,3x (Promega Corporation)) e 0,006 U/µL de RQ1 DNAase (Promega Corporation)) contendo polipeptídeo não luminescente (diluição 1:10 do lisado clarificado de E. coli do polipeptídeo não luminescente selvagem) foram adicionados. As amostras foram agitadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NANOGLO (Promega Corporation) foram adicionados. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e a luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s. A Figura 1 mostra a luminescência (RLUs) detectada para cada mutante peptídico não luminescente. Os resultados demonstram várias posições que são capazes de tolerar uma mutação sem perda significativa na luminescência, bem como algumas mutações específicas que melhoram a luminescência.

EXEMPLO 8 EFEITO DA ORIENTAÇÃO DA MARCAÇÃO DE FUSÃO NA LUMINESCÊNCIA

[0297] No exemplo a seguir, luminescência gerada por peptídeos não luminescentes com proteína HaloTag N- ou C-terminal foi comparada.

[0298] Uma única colônia de cada fusão peptídeo-HT foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As Figuras 6 e 7 demonstram a luminescência (RLUs) detectada em cada fusão peptídeo-HT. Os resultados demonstram as combinações de mutações que produzem luminescência semelhante como NLpep1.

EXEMPLO 9 EFEITO DE MÚLTIPLOS CICLOS DE CONGELAMENTO-DESCONGELAMENTO EM PEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0299] 1 mL de NLpep9-HT foi congelado em gelo seco durante 5 minutos e depois descongelado em banho-maria à temperatura ambiente durante 5 minutos. 60 µL foram então removidos para o ensaio. O procedimento de congelamento-descongelamento foi então repetido outras 10 vezes. Depois de cada ciclo de congelamento-descongelamento, 60 µL de amostra foram removidos para o ensaio.

[0300] Para o ensaio, 20 µL de cada amostra de congelamento- descongelamento foram misturados com 30 µL de SEQ ID NO: 2 e incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NANOGLO foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s. Os resultados estão ilustrados na Figura 8 e demonstram que NLpep pode ser submetido a vários ciclos de congelamento-descongelamento, sem perda na atividade (luminescência).

EXEMPLO 10 DISTINÇÃO DE MUTAÇÕES EM PEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0301] No exemplo a seguir, a análise em gel TMR foi utilizada para normalizar a concentração dos mutantes peptídicos não luminescentes para distinguir as mutações que alteram a expressão daquelas que alteram a luminescência (por exemplo, luminescência alterada pode se originar a partir da afinidade de ligação alterada).

[0302] 5 mL de LB foram inoculados com uma única colônia de mutante peptídico e incubados com agitação a 37°C durante 20 horas. 50 µL da cultura durante a noite foram diluídos em 5 mL de LB fresco e incubados com agitação a 37°C durante 3 horas. 50 µL de ramnose 20% foram então adicionados e incubados com agitação a 25°C durante 18 horas.

[0303] Para a análise em gel TMR, 79 µL de cada cultura induzida foram misturados com 10 µL de Tampão de Lise FastBreak 10x (Promega Corporation), 10 µL de uma diluição 1:100 de polipeptídeo não luminescente ligado a HALOTAG TMR (Promega Corporation) e 10 µL de RQ1 DNAase e incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 33,3 µL de tampão de aplicação SDS 4x foram adicionados, e as amostras foram incubadas a 95°C durante 5 minutos. 15 µL de cada amostra foram aplicados em um gel de SDS e corridos de acordo com as instruções do fabricante. O gel foi então digitalizado em um Scanner Typhoon. Cada cultura foi diluída com base na intensidade do gel TMR para normalizar as concentrações. 20 µL de cada cultura diluída foram então misturados com 30 µL de tampão de liso de ensaio contendo polipeptídeo não luminescente (diluição 1:10 do lisado clarificado de E. coli da SEQ ID NO: 2) e incubados com agitação à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NANOGLO foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um luminômetro GLOMAX com integrações de 0,5 s (VER FIG. 9).

EXEMPLO 11 SATURAÇÃO DO SÍTIO NO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0304] No exemplo a seguir, as posições 11, 15, 18, 31, 58, 67, 106, 149 e 157 foram identificados como sítios de interesse para a triagem da biblioteca de mutações aleatórias no polipeptídeo não luminescente selvagem. Todos os 20 aminoácidos nestas posições (construídas em um mutante 5A2 não luminescente gerado no Exemplo 6 (SEQ ID NOS: 539 e 540) para validar outras mutações no mutante 5A2) foram comparados para determinar o aminoácido ideal nesta posição. Polipeptídeos não luminescentes mutantes foram produzidos tal como previamente descrito no Exemplo 1. Uma colônia isolada de cada mutante polipeptídico não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6, exceto que o lisado clarificado de E. coli NLpep53 foi utilizado em uma diluição 1:11,85. As Figuras 10-18 mostram o efeito das mutações sobre a capacidade de produzir luminescência com e sem NLpep.

EXEMPLO 12 COMPARAÇÃO DA CISTEÍNA VS. PROLINA COMO O PRIMEIRO AMINOÁCIDO NO PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0305] No exemplo a seguir, foi realizada a comparação do uso de uma cisteína ou prolina como primeiro aminoácido (após metionina necessária) no peptídeo não luminescente. Os peptídeos não luminescentes mutantes foram produzidos como previamente descrito no Exemplo 1. Uma colônia isolada de cada mutante polipeptídico não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A Figura 19 demonstra que tanto a cisteína quanto a prolina podem ser utilizadas como o primeiro aminoácido do NLpep e produzir luminescência.

EXEMPLO 13 IDENTIFICAÇÃO DO CONJUNTO COMPOSTO IDEAL DE MUTAÇÕES PARA O PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0306] Nos exemplos a seguir, foram identificados conjuntos compostos ideais de mutações para o peptídeo não luminescente. Os peptídeos não luminescentes mutantes foram produzidos tal como previamente descrito no Exemplo 1 1) Para os mutantes peptídicos não luminescentes compostos NLpep53, NLpep66, NLpep67 e NLpep68, uma única colônia de cada foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 10. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 10. Análise em gel TMR e luminescência foram testadas e detectadas de acordo com o processo utilizado no Exemplo 10. Os resultados na Figura 20 demonstram a luminescência, bem como a expressão em E. coli de NLpeps contendo mutações múltiplas; 2) Para os mutantes peptídicos não luminescentes compostos NLpep53 e NLpeps 66-74, uma única colônia de cada foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. Os resultados na Figura 21 demonstram a luminescência de NLpeps contendo mutações múltiplas; 3) Para os mutantes peptídicos não luminescentes compostos NLpep53 e NLpeps 66-76, uma única colônia de cada foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o processo utilizado no Exemplo 7, exceto que o polipeptídeo não luminescente foi 5A2 ou 5A2+R11E (diluição 1:10 do lisado clarificado de E. coli). Os resultados na Figura 22 demonstram a luminescência de NLpeps contendo múltiplas mutações com 5A2 ou 5A2+R11E. Estes resultados também demonstram a menor luminescência quando a mutação R11E em NLpoly é complementada com um NLpep contendo E como o nono resíduo (NLpep72, 75 e 76); 4) Para os mutantes de peptídicos não luminescentes compostos NLpep1, NLpep69, NLpep78 e NLpep79, uma única colônia de cada foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7, exceto que o polipeptídeo não luminescente foi WT (diluição 1:10 do lisado clarificado de E. coli). Os resultados na Figura 23 demonstram a luminescência de NLpeps contendo mutações múltiplas.

EXEMPLO 14 MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES COMPOSTOS

[0307] No exemplo a seguir, 9 mutações a partir das triagens da biblioteca foram combinados em um clone composto (NLpoli1, SEQ ID NOS: 941,942) e, em seguida, uma das mutações foi revertida para o aminoácido original (NLpoli2-10, SEQ ID NOS: 943-960), a fim de identificar o conjunto composto ideal. Com base nos resultados anteriores de NLpoli1-10, NLpoli11-13 (SEQ ID NOS: 961-966), foram elaborados e testados para a mesma finalidade. NLpolis mutantes foram gerados tal como previamente descrito no Exemplo 1. Uma única colônia de cada mutante polipeptídico não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6, exceto que o lisado clarificado de E. coli NLpep53 foi utilizado em uma diluição 1:11,85.

[0308] A Figura 24 demonstra a luminescência de NLpolis contendo mutações múltiplas.

EXEMPLO 15 ESPECIFICIDADE DE SUBSTRATO DE MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES

[0309] O exemplo a seguir investiga a especificidade de substrato dos mutantes polipeptídicos não luminescentes. A luminescência gerada a partir dos complexos luminescentes formados a partir de vários mutantes polipeptídicos não luminescentes, sendo Furimazina ou coelenterazina como substrato, e vários peptídeos não luminescentes.

[0310] Células HEK 293 foram plaqueadas a 100.000 células/mL em poços de placas de 24 poços contendo 0,5 mL de DMEM+FBS 10% (50.000/poço). As células foram incubadas em um incubador a 37°C, CO2 5% durante a noite. DNA para a expressão de cada mutante polipeptídico não luminescente foi transfectado em duplicata. 1 ug de DNA plasmidial contendo um mutante polipeptídico não luminescente foi misturado com OptiMEM (Life Technologies) para um volume final de 52 uL. 3,3 µL de Fugene HD (Promega Corporation) foram adicionados, e as amostras foram incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. 25 µL de mistura de cada amostra foram adicionados a dois poços e incubados durante a noite em um incubador a 37°C, CO2 5% durante a noite. Após incubação durante a noite, o meio de crescimento foi removido e 0,5 mL de DMEM (sem vermelho de fenol)+Prionex 0,1% adicionado. As células foram então congeladas em gelo seco (pelo tempo necessário) e descongeladas antes da detecção da luminescência.

[0311] Nas Figuras 25-26, a luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6, exceto que o lisado clarificado de e. coli NLpep53 foi utilizado em uma diluição de 1:10 e Furimazina ou coelenterazina em tampão de ensaio de luciferase NanoGlo ou DMEM foram usados. Estes dados demonstram a luminescência de NLpolis em NANOGLO e DMEM com Furimazina ou Coelenterazina como substrato. Isso indica a especificidade do substrato (Furimazina versus Coelenterazina) do NLpoly em ambos NANOGLO e DMEM.

[0312] Na Figura 27, a luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 6, exceto que o lisado clarificado de E. coli proveniente de vários peptídeos não luminescentes (NLpep1, NLpep9, NLpep48, NLpep53, NLpep69 ou NLpep76) foi usado em uma diluição 1:10. Além disso, foram usadas Furimazina ou coelenterazina em tampão de ensaio de luciferase NanoGlo. Estes dados demonstram a especificidade do substrato dos pares NLpoly/NLpep.

[0313] Na Figura 28, a luminescência foi testada e detectada através da diluição 1:10 em separado da fusão NLpep53-HT e diluição 1:10 dos lisados polipeptídicos não luminescentes em DMEM+Prionex 0,1%. 20 µL de peptídeo não luminescente e 20 µL de polipeptídeo não luminescente foram combinados e então incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 µL de tampão NanoGlo com Furimazina 100 uM ou DMEM com Prionex 0,1% e Furimazina 20 uM foi depois adicionada às amostras, e a luminescência foi detectada em GloMax Multi. Estes dados demonstram a especificidade do substrato de NLpolis expressos em células HEK293.

[0314] Na Figura 29, a luminescência foi testada e detectada através da diluição 1:10 em separado das fusões NLpep1-HT, NLpep53-HT, NLpep69-HT ou NLpep76-HT e diluição 1:10 dos lisados polipeptídicos não luminescentes em DMEM+Prionex 0,1%. 20 µL de peptídeo não luminescente e 20 µL de polipeptídeo não luminescente foram combinados e então incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 µL de tampão NanoGlo com Furimazina 100 uM ou DMEM com Prionex 0,1% e Furimazina 20 uM foi depois adicionada às amostras, e a luminescência foi detectada em GloMax Multi. Estes dados demonstram a luminescência de NLpolis expressos em células de mamíferos e testada com vários NLpeps.

EXEMPLO 16 SINAL-FUNDO DE MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES COM FURIMAZINA OU COELENTERAZINA

[0315] O exemplo a seguir investiga sinal-fundo dos mutantes polipeptídicos não luminescentes. A luminescência gerada a partir de vários mutantes polipeptídicos não luminescentes foi medida utilizando Furimazina ou coelenterazina como substrato, bem como com vários peptídeos não luminescentes.

[0316] Células HEK 293 foram plaqueadas a 15.000 células/poço em 100 µL de DMEM+FBS 10% em poços de placas de 96 poços. As células foram incubadas em um incubador a 37°C, CO2 5% durante a noite. Complexos de transfecção foram preparados pela adição de 0,66 ug cada de DNA plasmidial para a expressão de um plasmídeos com mutante polipeptídico não luminescente e mutante peptídico não luminescente para um volume final de 31 µL em OptiMem. 2µL de Fugene HD foram adicionados a cada complexo de transfecção e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para cada combinação de peptídeo/polipeptídeo, 5 µL de um complexo de transfecção foram adicionados a 6 poços da placa de 96 poços e cultivados durante a noite a 37C em incubador de CO2. Após incubação durante a noite, o meio de crescimento foi removido e substituído por meio independente de CO2 contendo coelenterazina 20uM ou Furimazina 20 uM. As amostras foram incubadas durante 10 minutos a 37°C, e a cinética foi medida ao longo de 1 hora a 37°C em um GloMax Multi+. A Figura 30 demonstra a especificidade do substrato de vários pares NLpoly/NLpep quando o NLpoly é expresso em células de mamífero.

EXEMPLO 17 LUMINESCÊNCIA E ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO

[0317] O exemplo a seguir investiga a luminescência e a especificidade de substrato de vários mutantes polipeptídicos não luminescentes com NLpep69 usando Furimazina coelenterazina como substrato.

[0318]Células CHO foram plaqueadas a 20.000 células/poço em 100 µL de DMEM+FBS 10% em poços de placas de 96 poços. As células foram incubadas em um incubador a 37°C, CO2 5% durante a noite. Complexos de transfecção foram preparados pela adição de 0,66 ug cada de DNA plasmidial para a expressão de um plasmídeo com mutante polipeptídico não luminescente e mutante peptídico não luminescente para um volume final de 31 µL em OptiMem. 2 µL de Fugene HD foram adicionados a cada complexo de transfecção e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para cada combinação de peptídeo/polipeptídeo, 5 µL de complexo de transfecção foram adicionados a 6 poços da placa de 96 poços e cultivados durante a noite a 37C em incubador de CO2. Após incubação durante a noite, o meio de crescimento foi removido e substituído por meio independente de CO2 contendo coelenterazina 20uM ou Furimazina 20 uM. As amostras foram incubadas durante 10 minutos a 37°C, e a cinética foi medida ao longo de 1 hora a 37°C em um GloMax Multi+. A Figura 31 demonstra a especificidade do substrato quando NLpolis são coexpressos em células de mamíferos com NLpep69.

EXEMPLO 18 LUMINESCÊNCIA E ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO ENTRE CONDIÇÕES DE CÉLULAS VIVAS E LÍTICAS

[0319] O exemplo a seguir investiga a luminescência e especificidade do substrato de vários mutantes polipeptídicos não luminescentes com NLpep69, NLpep78 ou NLpep79, usando Furimazina ou coelenterazina como substrato e em condições líticas ou de células vivas.

[0320]Células HEK 293 foram plaqueadas a 15.000 células/poço em 100 µL de DMEM+FBS 10% em poços de placas de 96 poços. As células foram incubadas em um incubador a 37°C, CO2 5% durante a noite. Complexos de transfecção foram preparados pela adição de 0,66 ug cada de DNA plasmidial para a expressão de um plasmídeo com polipeptídeo mutante não luminescente e um mutante peptídico não luminescente para um volume final de 31 µL em OptiMem. 2 µL de Fugene HD foram adicionados a cada complexo de transfecção e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para cada combinação de NLpoly- NLpep, 5 µL de complexo de transfecção foram adicionados a 6 poços da placa de 96 poços e cultivados durante a noite a 37C em incubador de CO2. Após incubação durante a noite, o meio de crescimento foi removido e substituído por meio independente de CO2 contendo coelenterazina 20uM ou Furimazina 20 uM. As amostras foram incubadas durante 10 minutos a 37°C, e a cinética foi medida ao longo de 1 hora a 37°C em um GloMax Multi+. As Figuras 32-34 demonstram a especificidade do substrato de NLPolis coexpressos em células de mamíferos com NLpep69, 78 ou 79 em formatos de células vivas e formatos líticos.

EXEMPLO 19 COMPARAÇÃO DOS MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES EXPRESSOS EM E. COLI

[0321]Uma única colônia de cada polipeptídeo não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7, exceto que NLpep78-HT ou NLpep79-HT foi usado em uma diluição 1:1,000. A Figura 35 demonstra a luminescência de NLpolis expressos em E. coli e testados com NLpep78 ou 79.

EXEMPLO 20 CAPACIDADE DE CLONES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES PARA PRODUZIR LUMINESCÊNCIA SEM PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE COMPLEMENTAR

[0322] Uma única colônia de cada polipeptídeo não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7, exceto que nenhum peptídeo não luminescente foi adicionado ao tampão de ensaio. A Figura 36 demonstra a luminescência de NLpolis expressos em E. coli e testados na ausência de NLpep.

EXEMPLO 21 ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO DE MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES EXPRESSOS EM E. COLI

[0323] Uma única colônia de cada polipeptídeo não luminescente foi cultivada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. As culturas bacterianas também foram induzidas de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo 7. A luminescência foi testada e detectada de acordo com o procedimento utilizado no Exemplo, exceto que Furimazina ou coelenterazina foi misturada com tampão de ensaio NANOGLO. A Figura 37 demonstra a especificidade do substrato de NLpolis expressos em E. coli e testados com NLpep78 ou 79.

EXEMPLO 22 LUMINESCÊNCIA MELHORADA DE MUTANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES COM NLPEP78

[0324] A complementação de mutantes polipeptídicos não luminescentes com NLpep78-HT foi demonstrada em células CHO e HeLa.

[0325] Células CHO e HeLa (CHO: 100.000 semeadas no dia anterior à transfecção; HeLa: 50.000 semeadas no dia anterior à transfecção) foram transfectadas com 5 ng de um mutante polipeptídico não luminescente 5A2 ou 5P ou com polipeptídeo não luminescente selvagem usando Fugene HD em poços de uma placa de 24 poços e incubadas a 37°C durante a noite. Após a incubação durante a noite, o meio foi substituído por DMEM sem vermelho de fenol, e as células foram congeladas a -80°C durante 30 minutos. As células foram então descongeladas e transferidas para um tubo de 1,5 mL. Os lisados celulares foram então diluídos 1:10 em DMEM sem vermelho de fenol, 20 µL foram misturados com NLpep78 (lisado de E. coli NLpep78-HT7 diluído 1:1000 em DMEM sem vermelho de fenol) e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de DMEM sem vermelho de fenol e Furimazina 20 uM foram adicionados e a luminescência foi medida em um GloMax com uma integração de 0,5 segundo. A Figura 38 demonstra a luminescência de NLpolis expressos em células de mamíferos e testada com NLpep78.

EXEMPLO 23 FUSÕES POLIPEPTÍDICAS NÃO LUMINESCENTES E NORMALIZAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE POLIPEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0326] Uma comparação da luminescência bruta e normalizada do polipeptídeo não luminescente fundido à luciferase de vaga-lume (Figura 39) ou luciferase de elaterídeos vermelhos (Figura 40) foi realizada para fornecer informações quanto benefício, por exemplo, na expressão, solubilidade e/ou estabilidade, se origina a partir da concentração do polipeptídeo não luminescente, bem como da complementação como um polipeptídeo não luminescente de fusão.

[0327] Células HEK293, HeLa ou CHO foram transfectadas com 5 ng da fusão NLpoly 5P-luciferase de vaga-lume, fusão NLpoly 5P-luciferase de elaterídeos vermelhos, fusão 5P selvagem-luciferase de vaga-lume ou fusão 5P selvagem-luciferase de elaterídeos vermelhos de acordo com o procedimento no Exemplo 22. Os lisados também foram preparados de acordo com o Exemplo 22. Os lisados celulares foram então diluídos 1:10 em DMEM sem vermelho de fenol, 20 µL foram misturados com NLpep78 (diluído 1:100 em DMEM sem vermelho de fenol; lisado de E. coli) e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de NanoGlo com Furimazina 20 uM ou Bright-Glo (Promega Corporation) foram adicionados e a luminescência foi medida em um GloMax com integração de 0,5 segundo. As Figuras 39 e 40 demonstram a atividade específica de NLpoly 5P versus WT expresso em células de mamífero e testados com NLpep78.

EXEMPLO 24 COMPLEMENTAÇÃO EM CÉLULAS VIVAS

[0328] Este exemplo demonstra a complementação em células vivas utilizando NLpoly selvagem ou 5P. Células HeLa foram plaqueadas em poços de uma placa de 96 poços, transfectadas com 0,5 ng de DNA plasmidial de polipeptídeo não luminescente selvagem ou 5P usando Fugene HD e incubadas a 37°C durante a noite. Após a incubação durante a noite, as células foram então transfectadas com 0,5 ng de DNA plasmidial de NLpep78-HT usando Fugene HD e incubadas a 37°C durante 3 horas. Meio foi então substituído por meio independente de CO2-FBS 0,1% e PBI-4377 20 uM e a luminescência foi medida a 37°C em um GloMax com integração de 0,5 segundo. A Figura 41 demonstra a complementação em células vivas entre NLpoly 5P ou WT e NLpep78.

EXEMPLO 25 COMPLEMENTAÇÃO EM EXTRATO ISENTO DE CÉLULAS

[0329] Para demonstrar a complementação em extrato isento de células, 0,5 ug de NLpep78-HT e 0,5 ug de DNA plasmidial de mutante polipeptídico não luminescente foram misturados com a mistura mestre de lisado de reticulócitos de coelho TNT (Promega Corporation) e incubados a 30°C durante 1 hora. 25 µL do extrato de expressão isento de células foram misturados com 25 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo e incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um GloMax com integração de 0,5 segundo. A Figura 42 demonstra a luminescência de pares NLpoly/NLpep complementares expressos em um formato isento de células.

EXEMPLO 26 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE EXPRESSO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS COM O PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE SINTÉTICO

[0330] Para demonstrar a afinidade de ligação entre o polipeptídeo não luminescente e pares de peptídeos não luminescentes, lisados polipeptídicos não luminescentes de células HeLa, HEK293 e CHO foram preparados tal como descrito anteriormente e diluídos 1:10 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x de peptídeo não luminescente (sintético) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL do lisado polipeptídico não luminescente foram misturados com 20 µL de peptídeo não luminescente e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de Reagente de Ensaio de Luciferase NanoGlo ou PBS+Prionex 0,1% com Furimazina foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi detectada em um GloMax com integração de 0,5 s. Os valores de Kd foram determinados utilizando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio. As Figuras 43 e 44 demonstram as constantes de dissociação medidas em várias condições tamponada (PBS para complementação, em seguida NanoGlo para detecção, PBS para complementação e detecção, NanoGlo para complementação e detecção).

EXEMPLO 27 AFINIDADE DE LIGAÇÃO MELHORADA QUANDO CISTEÍNA É MUTADA PARA FENILALANINA EM MUTANTES PEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES

[0331] Para demonstrar a afinidade de ligação melhorada em mutantes peptídicos não luminescentes com uma cisteína mutada no 8° resíduo do peptídeo, lisados de mutantes polipeptídicos não luminescentes a partir de células HeLa, HEK293 e CHO foram preparados tal como descrito anteriormente e diluídos 1:10 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x de peptídeo não luminescente (NLpep) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%+DTT 10 mM. 20 µL do lisado polipeptídico não luminescente foram misturados com 20 µL de peptídeo não luminescente e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi detectada em um GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 45 demonstra que a mutação C8F em NLpep melhora significativamente a afinidade de ligação para 5P.

EXEMPLO 28 LUMINESCÊNCIA DETECTÁVEL DE VARIANTES POLIPEPTÍDICOS SEM PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE EM CÉLULAS HELA

[0332] Para demonstrar a luminescência em polipeptídeos não luminescentes sem peptídeo não luminescente, células HeLa (10.000 semeadas no dia anterior à transfecção) em poços de uma placa de 96 poços foram transfectadas com quantidades variadas de polipeptídeo não luminescente+DNA transportador de pGEM-3zf para um total de 50 ng usando Fugene HD e incubadas a 37°C durante a noite. Após a incubação, o meio foi substituído por meio independente de CO2+FBS 0,1%+Furimazina 20 uM e incubadas a 37°C durante 10 minutos, e a luminescência foi detectada em um GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 46 demonstra a luminescência de NLpoly WT ou 5P em células HeLa vivas sem NLpep após transfecção de várias quantidades de DNA plasmidial.

EXEMPLO 29 GERAÇÃO DE VARIANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES ADICIONAIS

[0333]Os variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais: Ile-11 (Ile no resíduo 11), Val-11, Tyr-11, Glu-11, Glu-157, Pro- 157, Asp-157, Ser-157, Met-149, Leu-106, NLpoli11 e NLpoli12 foram gerados tal como descrito abaixo, e sua expressão foi analisada. Os variantes polipeptídicos não luminescentes adicionados foram feitas no fundo de polipeptídeo não luminescente 5A2.

[0334]Colônias individuais frescas (KRX) de cada variante polipeptídico não luminescente adicional foram repicadas e cultivadas durante a noite em LB+ampicilina (100 ug/mL) a 30°C e, em seguida, diluídas 1:100 em LB+ampicilina e cultivadas a 37°C durante 2,5 horas (OD600 ~0,5). Ramnose foi adicionada a uma concentração final de 0,2%, e as células foram divididas em triplicata e cultivadas durante a noite a 25°C durante ~18 h. As células foram lisadas usando FastBreak 0,5X durante 30 minutos à temperatura ambiente, congeladas instantaneamente em gelo seco, e armazenadas a -20°C. Após o descongelamento rápido, frações solúveis foram preparadas por centrifugação a 10K durante 15 minutos a 4°C. As amostras foram analisadas para luminescência em um luminômetro Tecan Infinite F-500.

[0335] A Figura 49 demonstra o lisado total e a fração solúvel de cada variante polipeptídico não luminescente, tal como analisados por SDS-PAGE. Os dados fornecem informações sobre a expressão, solubilidade e estabilidade dos variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais. A maioria dos variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais produziu mais proteína (total e solúvel) do que o selvagem, porém, em muitos casos, a diferença é sutil. A expressão melhorada para NLpoly 11 e NLpoli12 foi mais perceptível.

EXEMPLO 30 LUMINESCÊNCIA DE FUNDO DOS VARIANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES ADICIONAIS

[0336] A luminescência de fundo dos variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais gerados no Exemplo 29 foi medida através da incubação de 25 µL de lisado de variante polipeptídico não luminescente com 25 µL de DMEM à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram então adicionados, e a luminescência foi medida em 5 e 30 minutos em um Tecan Infinite F500. NLpep53 (Pep 53) isolado e DMEM (DMEM) isolado foram utilizados como controles. A Figura 47 demonstra que a maioria dos variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais mostrou elevada luminescência de fundo.

EXEMPLO 31 LUMINESCÊNCIA DOS VARIANTES POLIPEPTÍDICOS NÃO LUMINESCENTES ADICIONAIS APÓS COMPLEMENTAÇÃO

[0337] A luminescência dos variantes polipeptídicos não luminescentes adicionais gerados no Exemplo 28 foi medida através da incubação de 25 µL de lisado de variantes polipeptídicos não luminescentes com 25 µL de NLpep-53 à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram então adicionados, e a luminescência foi medida em 5 e 30 minutos em um Tecan Infinite F500. NLpep53 (Pep 53) isolado e DMEM (DMEM) isolado foram utilizados como controles. A Figura 48 demonstra que os variantes polipeptídicos não luminescentes Val-11, Glu-11, Glu-157, Pro-157, Asp-157, Ser-157 e Met-149 geraram significativamente mais luminescência do que o 5A2 parental.

EXEMPLO 32 CORRELAÇÃO ENTRE A LUMINESCÊNCIA DE FUNDO AUMENTADA DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE NA AUSÊNCIA DE PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE E QUANTIDADE DE PROTEÍNA NA FRAÇÃO SOLÚVEL

[0338] Colônias individuais dos variantes polipeptídicos não luminescentes 3P, 3E, 5P, 5E, 6P e 6E foram repicadas e cultivadas durante a noite em LB+ampicilina a 30°C e, em seguida, diluídas 1: 100 em LB+ampicilina e cultivadas a 37°C durante 2,5 horas (OD600 ~0,5). Ramnose foi adicionada a uma concentração final de 0,2%, e as células foram divididas em triplicata e cultivadas durante a noite a 25°C durante ~18 h. As células foram lisadas usando FastBreak 0,5X durante 30 minutos à temperatura ambiente, congeladas instantaneamente em gelo seco, e armazenadas a -20°C. Após o descongelamento rápido, as frações solúveis foram preparadas por centrifugação a 10K durante 15 minutos a 4°C. As amostras foram analisadas para luminescência em um Tecan Infinite F-500. A Figura 50A mostra o lisado total e a fração solúvel de cada variante polipeptídico não luminescente. A Figura 50B mostra a luminescência de fundo de cada variante polipeptídico não luminescente. A Figura 51 mostra a luminescência gerada com cada variante polipeptídico não luminescente quando complementado com 10 ou 100 nM de NLpep78 (NVSGWRLFKKISN) em meio LB.

EXEMPLO 33 ALONGAMENTOS E DELEÇÕES DE POLIPEPTÍDEOS NÃO LUMINESCENTES

[0339] A variante 5P do polipeptídeo não luminescente foi alongado na extremidade C-terminal por meio da adição dos resíduos, VAT, AA, VTG, VT, VTGWR, VTGW, V, A, VA, GG, AT, GTA, ATG ou GT ou deleção de 1 a 7 resíduos na extremidade C-terminal de 5P, por exemplo, D1 = deleção de 1 resíduo, D2 = deleção de 2 resíduos, etc. A luminescência de fundo em lisados de E. coli (Figura 52) e a luminescência gerada após complementação com NLpep78 (Figura 53; NVSGWRLFKKISN) ou NLpep79 (Figura 54; NVTGYRLFKKISN) foram medidas. A Figura 55 mostra a relação sinal-fundo dos variantes 5P do polipeptídeo não luminescente. A Figura 56 apresenta um resumo dos resultados luminescentes. A Figura 57 mostra a quantidade de lisado total e fração solúvel em cada variante 5P do polipeptídeo não luminescente.

EXEMPLO 34 COMPARAÇÃO DOS VARIANTES 5P E I107L DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE

[0340] A Figura 58 mostra a quantidade de lisado total e fração solúvel de 5P e I107L (A), luminescência gerada por 5P ou I107L sem peptídeo não luminescente ou com NLpep78 ou NLpep79 (B) e a melhora do sinal-fundo de I107L sobre 5P (C).

EXEMPLO 35 GERAÇÃO DE MUTANTES DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE 5P

[0341] As mutações identificadas em uma triagem de mutações aleatórias no variante do polipeptídeo não luminescente 5P foram geradas tal como descrito anteriormente. Cada colônia isolada de mutante polipeptídico não luminescente 5P foi inoculada em 200 µL de meio mínimo e incubada com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da cultura foram então adicionados a 190 µL de meio mínimo fresco e incubadas de novo com agitação a 37°C durante 20 horas. 10 µL da segunda cultura foram então adicionados a 190 µL de meio de autoindução (meio mínimo+glicose 5%+ramnose 2%) e incubados com agitação a 25°C durante 18 horas para permitir a expressão do mutante polipeptídico não luminescente. 10 µL da cultura da expressão do mutante polipeptídico não luminescente 5P foram adicionados a 40 µL de tampão de lise de ensaio contendo NLpep78-HT (diluição 1:386) ou NLpep79-HT (diluição 1:1.000) e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 µL de Tampão de Ensaio NanoGlo contendo coelenterazina 100 uM foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. As Figuras 59-62A mostram a luminescência de fundo enquanto as Figuras 59-62B e C mostram a luminescência gerada após complementação com NLpep78 ou NLpep79.

EXEMPLO 36 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE VARIANTE POLIPEPTÍDICA NÃO LUMINESCENTE ALONGADO E PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE DELETADO

[0342] A afinidade de ligação entre um variante polipeptídico não luminescente alongado, ou seja, contendo aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal, e um peptídeo não luminescente deletado, ou seja, aminoácidos deletados na extremidade N-terminal.

[0343] Lisados de E. coli expressando polipeptídeo não luminescente 5P/+V/+VT/+VTG preparados tal como descrito anteriormente foram diluídos 1:2000 em PBS+Prionex 0,1%. 25 µL do lisado diluído foram incubados com 25 µL de NLpep78, NLpep80, NLpep81 ou NLpep82 (diluídos 0-500 nM em tampão de diluição) durante 5 minutos à temperatura ambiente. 50 µL de Furimazina diluída para 1X com tampão de ensaio NanoGlo foram adicionados a cada amostra e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 63 demonstra a afinidade de ligação entre NLpolis com aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal com NLpeps com aminoácidos deletados da extremidade N-terminal.

EXEMPLO 37 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE EXPRESSO EM E. COLI E PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE SINTÉTICO

[0344] Lisados LB de polipeptídeo não luminescente foram preparados e diluídos 1:100 em PBS+Prionex 0,1%. Diluições 2X de NLpep78 sintético foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 25 µL do lisado diluído de polipeptídeo não luminescente foram misturados com 25 µL de cada diluição de peptídeo não luminescente e incubados durante 3 minutos à temperatura ambiente. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados, incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente, e a luminescência foi medida em um GloMax Multi+. A Figura 64 mostra os valores de Kd calculados utilizando ligação específica a um único sítio.

EXEMPLO 38 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE 5P EXPRESSO EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS E NLPEP80 OU NLPEP87

[0345]Lisados de células CHO, HEK293T ou HeLa que expressam NLpoly 5P foram diluídos 1:1000 em tampão de diluição (PBS+Prionex 0,1%). 25 µL de lisado diluído foram incubados com 25 de µL de NLpep80/87 (diluído 0-5 µM em tampão de diluição) durante 5 minutos à temperatura ambiente. 50 µL de furimazina (diluída para 1X com tampão NanoGlo) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s (Figura 65).

EXEMPLO 39 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE 5P EXPRESSO EM E. COLIE NLPEP80 OU NLPEP87

[0346] Lisados de E. coli expressando NLpoly 5P foram diluídos 1:2000 em tampão de diluição (PBS+Prionex 0,1%). 25 µL de lisado diluído foram incubados com 25 µL de NLpep80/87 (diluído 0-5 µM em tampão de diluição) durante 5 minutos à temperatura ambiente. 50 µL de furimazina (diluída para 1X com tampão NanoGlo) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s (Figura 66).

EXEMPLO 40 COMPLEMENTAÇÃO ENTRE UM POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE DELETADO E PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE ALONGADO

[0347] Foi realizada complementação entre um polipeptídeo não luminescente deletado, ou seja, aminoácidos deletados da extremidade C- terminal, e um peptídeo não luminescente alongado, isto é, aminoácidos adicionados à extremidade N-terminal. Lisados clarificados de E. coli NLpep- HT foram preparados tal como anteriormente descrito no Exemplo 6. A quantidade de NLpep-HT foi quantificada através da fusão HaloTag. Resumidamente, 10 µL de lisado clarificado foi misturado com 10 µL de ligante HaloTag-TMR (diluído 1:100) e 80 µL de água e incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 33,3 µL de tampão de aplicação SDS 4x foram adicionados e incubados a 95°C durante 5 minutos. 15 µL foram aplicados em um gel de SDS-PAGE e visualizados em um Typhoon. Com base nas intensidades do gel de SDS-PAGE, peptídeos não luminescentes foram diluídos em PBS+Prionex 0,1% peptídeos não luminescentes para produzir concentrações equivalentes. Os lisados de polipeptídeo não luminescente foram então diluídos 1:100 em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL de polipeptídeo não luminescente diluído e 20 µL de peptídeo não luminescente diluído foram misturados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em um GloMax usando integração de 0,5 s. A Figura 67 demonstra a luminescência de NLpolis com aminoácidos removidos da extremidade C-terminal com NLpeps com aminoácidos adicionais na extremidade N-terminal.

EXEMPLO 41 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE 5P EXPRESSO EM CÉLULAS HELA E NLPEP78 OU NLPEP78 TRUNCADO (NLPEP80-87)

[0348] Lisado de polipeptídeo não luminescente 5P foi preparado a partir de células HeLa tal como descrito anteriormente e diluído 1:10 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x (intervalo determinado em experimento preliminar de titulação) de peptídeo não luminescente (peptídeo sintético; por Peptide 2.0 (Virginia); produzido em escala de 5, 10 ou 20 mg; bloqueado nas extremidades por acetilação e amidação, e verificado por análise do teor líquido de peptídeos) foram preparadas em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL de polipeptídeo não luminescente 5P e 20 µL de peptídeo não luminescente foram misturados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 68 demonstra a afinidade de ligação e luminescência correspondente entre 5P e versões truncadas do Nlpep78. A afinidade de ligação é aumentada quando 1 aminoácido é removido a partir da extremidade N-terminal, C-terminal, 1 aminoácido de cada extremidade terminal. Remover mais de 1 aminoácido de qualquer uma das extremidades reduz a afinidade, mas nem sempre reduz a Vmax na mesma medida.

Exemplo 42 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE ALONGADO E PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE TRUNCADO

[0349] A afinidade de ligação entre um polipeptídeo não luminescente alongado, isto é, aquele com 2 aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal, e um peptídeo não luminescente truncado, ou seja, aquele com 2 aminoácidos removidos da extremidade N-terminal (NLpep81), foi determinada.

[0350] Lisado de polipeptídeo não luminescente foi preparado tal como anteriormente descrito e diluído 1:100 em PBS+Prionex 0,1%. Diluições 2x de NLpep81 (peptídeo sintético; por Peptide 2.0 (Virgínia); produzido em escala de 5, 10 ou 20 mg; bloqueado nas extremidades por acetilação e amidação, e verificado por análise de conteúdo líquido de peptídeo) foram preparadas em PBS+Prionex 0,1%. 25 µL de polipeptídeo não luminescente e 25 µL da diluição de cada peptídeo não luminescente foram misturados e agitados à temperatura ambiente durante 3 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 69 mostra os valores de Kd calculados usando ligação específica a um único sítio.

EXEMPLO 43 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE ALONGADO E PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE TRUNCADO

[0351] A afinidade de ligação entre um polipeptídeo não luminescente alongado, ou seja, aquele com 3 aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal, e um peptídeo não luminescente truncado, ou seja, aquele com 3 aminoácidos removidos da extremidade N-terminal (NLpep82), foi determinada.

[0352] Lisado de polipeptídeo não luminescente foi preparado e diluído 1:100 em PBS+Prionex 0,1%. Diluições 2x de NLpep82 (peptídeo sintético; por Peptide 2.0 (Virginia); produzido em escala de 5, 10 ou 20 mg; bloqueado nas extremidades por acetilação e amidação, e verificado por análise de conteúdo líquido de peptídeo) foram preparadas em PBS+Prionex 0,1%. 25 µL de polipeptídeo não luminescente e 25 µL da diluição de cada peptídeo não luminescente foram misturados e agitados à temperatura ambiente durante 3 minutos. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 70 mostra os valores de Kd calculados derivados usando ligação específica a um único sítio.

EXEMPLO 44 AFINIDADE DE LIGAÇÃO ENTRE CLONES DE POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE EXPRESSOS EM E. COLIE NLPEP78 SINTÉTICO

[0353] Variantes polipeptídicos não luminescentes foram cultivados em meio mínimo M9. Colônias individuais foram inoculadas e cultivadas durante a noite a 37°C. As amostras foram diluídas 1:20 em meio mínimo M9 e cultivadas durante a noite a 37°C. As amostras foram novamente diluídas 1:20 em meio de indução M9 e cultivadas durante a noite a 25°C. As amostras foram agrupadas, e 100 µL das células agrupadas foram lisadas com 400 µL de tampão de lise PLB e incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. Os lisados foram diluídos 1:100 em PBS+Prionex 0,1%. Diluições 2X de NLpep78 sintético foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 25 µL da diluição de polipeptídeo não luminescente foram misturados com 25 µL de cada diluição do peptídeo não luminescente e incubados durante 3 minutos à temperatura ambiente. 50 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados, incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos, e a luminescência foi lida em GloMax Multi+. A Figura 71 mostra os valores de Kd calculados derivados usando ligação específica a um único sítio.

EXEMPLO 45 DETERMINAÇÃO DO EFEITO DE MUTAÇÕES NA KM

[0354] Utilizando lisados agrupados diluídos do Exemplo 11, 25 µL de lisado diluído de polipeptídeo não luminescente (1: 100 em PBS+Prionex 0,1%) foram misturados com 25 µL de NLpep78 500 nM para cada amostra e incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. Foram preparadas diluições 2X de Furimazina em tampão de ensaio de luciferase NanoGlo, e 50 µL de amostra de peptídeo não luminescente e polipeptídeo não luminescente foram misturados com 50 µL de diluições de NanoGlo/Furimazina. A luminescência foi medida após incubação de 5 minutos à temperatura ambiente. A Figura 72 mostra a Km calculada utilizando Michaelis-Menten.

EXEMPLO 46 DEMONSTRAÇÃO DE UMA COMPLEMENTAÇÃO DE TRÊS COMPONENTES

[0355] A complementação terciária usando 2 NLpeps e polipeptídeo não luminescente NLpoly 5P é demonstrada. Lisados de NLpoly 5P- B9 (5P com resíduos 147-157 deletados) e NLpep B9-HT (Met+resíduos 147157 fundidos à extremidade N-terminal de HT7) foram preparados. A) TITULAÇÃO DE NLPOLY 5P-B9+NLPOLY B9 COM NLPEP78

[0356] NLpoly 5P-B9+NLpoly B9 foram titulados com NLpep78. 20 µL de 5P-B9 (não-diluído) foram misturados com 20 µL de peptídeoB9-HT (não- diluído). Diluições do NLpep78 (peptídeo sintético, maior concentração = 100 uM) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL de NLpep78 foram adicionados a 40 µL da mistura 5P-B9+peptídeoB9-HT e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 60 µL de Reagente de Ensaio de Luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. B) TITULAÇÃO DE NLPOLY 5P-B9+NLPEP78 COM NLPEPB9-HT

[0357]20 µL de NLpoly 5P-B9 (não-diluído) foram misturados com 20 µL de NLpep78 (100 uM). Diluições de peptídeoB9-HT (maior concentração = não-diluído) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL de peptídeoB9-HT foram adicionados a 40 µL da mistura 5P-B9+NLpep78 e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 60 µL de Reagente de Ensaio de Luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s.

[0358]A Figura 73 demonstra a viabilidade de um sistema ternário que consiste em 2 NLpeps diferentes e um NLpoly truncado. Uma vez que todos os 3 componentes são não luminescentes sem os outros 2, este sistema poderia ser configurado de tal modo que cada NLpep fosse fundido (sinteticamente ou por engenharia genética) a uma fração de ligação e o NLpoly truncado utilizado em altas concentrações para produzir luz apenas na presença de uma interação entre as frações de ligação, ou de tal modo que cada um dos 3 componentes fossem fundidos a frações de ligação para produzir luz apenas no caso da formação do complexo ternário.

EXEMPLO 47 COMPLEMENTAÇÃO COM NLPEP88 (NLPEP78 COM GLY COMO 6° RESÍDUO EM VEZ DE ARG)

[0359] Lisados clarificados de E. coli NLpep88-HT e 5P foram preparados tal como descrito anteriormente. Diluições em série de lisado NLpep88-HT foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 µL de lisado 5P e 20 µL de lisado NLpep88-HT foram misturados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 40 µL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo foram adicionados e agitados à temperatura ambiente durante 10 minutos. A luminescência foi medida em GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 74 demonstra a importância do resíduo de arginina na 6° posição do NLpep. Embora não haja aumento da luminescência acima de 5P isolado em concentrações mais baixas de NLpep88, altas concentrações de NLpep aumentaram a luminescência, sugerindo um complexo cataliticamente comprometido e não uma ausência de interação entre 5P e NLpep88.

EXEMPLO 48 LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DO NLPEP78 E 79 COMO FUSÕES N-TERMINAIS A HALOTAG

[0360]Células U2OS foram plaqueadas e deixadas em repouso durante a noite a 37°C. As células foram então transfectadas com construção de DNA de HaloTag isolado ou construções de DNA de peptídeo HaloTag- NanoLuc (todos sob controle do promotor CMV): P1 -HT, P78-HT ou P79-HT diluídos 1:10 com DNA transportador (pSI) utilizando FuGENE HD e incubados durante 24 horas a 37°C. As células foram então marcadas com ligante HaloTag-TMR por protocolo padrão de marcação rápida do fabricante e analisados por imagem. A Figura 75 demonstra que NLpep78 e 79 não alteram a localização intracelular da proteína HaloTag.

EXEMPLO 49 LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE (WT E 5P)

[0361]Células U2OS foram plaqueadas e deixadas em repouso durante a noite a 37°C. As células foram mantidas como controles para a não-transfecção ou transfectadas com as construções de DNA NanoLuc: FL, NLpoly (wt) ou NLpoly(5P) diluídos 1:10 com DNA transportador (pSI) utilizando FuGENE HD e incubados durante 24 horas à temperatura ambiente. As células foram fixadas e processadas posteriormente para ICC. ICC foi feito utilizando anticorpo primário GS (PRO) 1:5000 durante a noite a 4°C seguido por anticorpo secundário de cabra anti-coelho Alexa488. A Figura 76 demonstra que NLpoly WT e NLpoly 5P se localizam uniformemente nas células. EXEMPLO 50 DEMONSTRAÇÃO DE QUE O POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE PODE FÁCIL E RAPIDAMENTE DETECTAR PEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE CONJUGADO COM UMA PROTEÍNA DE INTERESSE

[0362]99 µL de lisado clarificado de E. coli NLpep53-HT foram misturados com 24,75 µL de tampão de aplicação SDS 4x. Diluições em série 1:10 da mistura lisado-tampão de aplicação foram feitas e incubadas a 95°C durante 5 minutos. 15 µL foram aplicados em um gel de SDS-PAGE. Após os preenchimentos do gel, este foi transferido para PVDF utilizando iBlot e lavado com 10 mL de lisado clarificado de E. coli NLpoly L149M à temperatura ambiente durante 30 minutos. A membrana foi então colocada em um gerador de imagens LAS4000 e 2 mL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo® foram adicionados. Uma exposição de 60 segundos foi feita (Figura 77).

EXEMPLO 51 SATURAÇÃO DO SÍTIO NAS POSIÇÕES 31, 46, 108, 144 E 157 DO POLIPEPTÍDEO NÃO LUMINESCENTE NO CONTEXTO DE 5P

[0363]Variantes com alteração em aminoácidos únicos foram construídos para NLpoly 5P (com base no vetor pF4Ag) nos sítios de acordo com a Tabela 5 abaixo. Com efeito, o resíduo nativo foi variado para cada um dos 19 aminoácidos alternativos para um total de 95 variantes. TABELA 5

[0364]Colônias individuais foram cultivadas em LB+amp e incubadas durante a noite a 30°C. Controle 5P também foi incluído. As culturas durante a noite foram usadas para inocular LB fresco+amp (1:100), e estas culturas cresceram durante 2 horas e 45 minutos a 37°C. Ramnose foi adicionada a 0,2% e as culturas foram deixadas para crescer/induzir durante a noite a 25°C. Após 18 horas de indução, as células foram lisadas usando FastBreak 0,5X (30 minutos à temperatura ambiente), congeladas rapidamente em gelo seco, e armazenadas a -20°C. Após um descongelamento rápido, as amostras foram testadas na presença e ausência de Pep87 (também conhecido como NLpep 87).

[0365] Para as reações peptídicas (-), 30 uL de lisado foram incubados com 30 uL de PBS pH 7,5 durante 10 minutos e, em seguida, 60 uL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo® (Promega Corporation) foram adicionados. Após 5 minutos, foi medida a luminescência. Para as reações peptídicas (+), 30 uL de lisado foram incubados com 30 uL de Pep87 8 nM. Após 10 minutos, 60 uL de reagente de ensaio de luciferase NanoGlo® foram adicionados, e a luminescência foi medida em 5 minutos.

[0366] Dados de luminescência (RLU) para as amostras peptídicas (-) foram normalizados para as leituras para o controle 5P, e estes resultados são apresentados na Figura 78. Dados de luminescência (RLU) para as amostras peptídicas (+) também foram normalizados para 5P, mas, em seguida, também foram normalizados para os valores na Figura 76, a fim de representar o sinal em relação ao fundo (S/B; Figura 79).

EXEMPLO 52 USO DE ALTA AFINIDADE ENTRE NLPOLY E NLPEP PARA A PURIFICAÇÃO/DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNAS

[0367] Esferas MAGNEHALOTAG (Promega Corporation; G728A) foram equilibradas como se segue: a) 1 mL de grânulos foi colocado no ímã por ~ 30 segundos e o tampão foi removido; b) as esferas foram removidas do ímã, ressuspensas em 1 mL de PBS+Prionex 0,1%, e agitadas durante 5 minutos à temperatura ambiente; e c) as etapas a) e b) foram repetidas mais duas vezes. NLpep78-HaloTag (lisado clarificado de E. coli) foi ligado a esferas MAGNEHALOTAG pela ressuspensão das esferas em 1 mL de lisado clarificado NLpep78-HT, com agitação por 1 hora à temperatura ambiente e colocação no ímã por ~30 segundos. O lisado (eluato) foi removido e guardado para análise. NLpoly 8S (lisado clarificado de E. coli) foi ligado às esferas MagneHaloTag ligadas a NLpep78 a partir da etapa acima pela ressuspensão das esferas em 1,5 mL de lisado 8S, com agitação por 1 hora à temperatura ambiente e colocação em um ímã por ~30 segundos. O lisado (eluato) foi removido e guardado para análise. As esferas foram novamente ressuspensas em 1 mL de PBS+Prionex 0,1%, agitadas durante 5 minutos à temperatura ambiente, colocadas em ímã por ~30 segundos e o PBS (lavagem) foi removido. As esferas foram lavadas mais três vezes.

[0368] Para eluir o peptídeo/polipeptídeo ligado, as esferas foram ressuspensas em 500 uL de tampão SDS 1x e agitadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. As esferas foram então colocadas em um ímã por ~30 segundos; o tampão SDS (eluição) foi removido e guardado para análise. A eluição foi repetida mais uma vez.

[0369] As amostras foram então analisadas por gel. 37,5 uL de amostra (exceto eluições) foram misturados com 12,5 uL de tampão SDS 4X e incubados a 95°C durante 5 minutos. 5 uL foram aplicados em um gel Novex 4- Tris-Glicina 20% e corridos a ~180 V por ~50 minutos. O gel foi corado com SimplyBlue SafeStain e imagens foram captadas por LAS4000.

[0370]A Figura 94 ilustra que a afinidade de NLpoly e NLpep é suficiente para permitir a purificação a partir de um lisado de E. coli. Como NLpoly 8S foi purificado a partir de um lisado de E. coli, é razoável esperar que uma proteína fundida com NLpoly 8S (ou outro variante aqui descrito) também poderia ser purificada de forma semelhante. Embora neste exemplo o NLpep tenha sido imobilizado e utilizado para purificar NLpoly, também é razoável esperar um resultado semelhante se NLpoly for imobilizado.

EXEMPLO 53 CINÉTICA DA LIGAÇÃO NLPOLY/NLPEP

[0371] Concentrações 2x de NLpep sintético foram feitas e diluídas 2,7 vezes por nove vezes (10 concentrações) em PBS+Prionex 0,1%. As concentrações finais utilizadas no ensaio foram de 30 uM-3,9 nM. NLpoly WT (lisado clarificado de E. coli; 1:10.000) ou 11S (1:10.000.000) foi diluído em NanoGlo+Furimazina 100 uM (Fz). 50 uL de NLpep foram colocados nos poços de uma placa branca de ensaio de 96 poços. 50 uL de NLpoly/NanoGlo/Fz foram injetados nos poços utilizando o injetor no instrumento GloMax® Multi+, e a luminescência foi medida a cada 3 segundos durante 5 minutos. kobs foi encontrada ao ajustar os dados para: Y = Ymax(1 - e-k°bst) usando Graphpad Prism. kon e koff foram então ajustadas para: kobs = [NLpep]kon + koff. A Figura 95 ilustra as constantes da taxa de associação e de dissociação para a ligação entre NLpolis e NLpeps.

EXEMPLO 54 AFINIDADE AO SUBSTRATO DE NLPOLY/NLPEP

[0372] NLpoly foi diluído em PBS+Prionex 0,1% como se segue: WT a 1:105, 5P a 1:107 e 11S a 1:108. NLpep foi diluído em PBS+Prionex 0,1% como se segue: 30 uM para estudos de NLpoly WT ou 3 uM para estudos de NLpoly 5P e 11S. 50 uL de NLpoly/NLpep foram incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos, 50 uL de NanoGlo + Fz (variando de 100 uM a 1,2 uM, 2X) foram adicionados, e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em GloMax® Multi+ com integração de 0,5 s. A Km foi derivada usando Graphpad Prism, valores de melhor ajuste de Michaelis-Menton. A Figura 96 ilustra os valores de Km para vários pares de NLpoly/NLpep.

EXEMPLO 55 EFEITO DO SUBSTRATO SOBRE A AFINIDADE DE NLPOLY/NLPEP

[0373] 11S (lisado clarificado de E. coli) foi diluído em PBS+Prionex 0,1% a 1:107. NLpep79 sintético foi diluído em série (1:2) de 800 nM até 0,39 nM (2X). 20 uL de 11S + 20 uL de NLpep79 foram então misturados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. 40 uL de NanoGlo + 5 uM ou 50 uM de Fz foram adicionados e incubados durante outros 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em GloMax® Multi+ com integração de 0,5 segundo. Kd foi derivada usando Graphpad prism, valor de ligação específica a um único sítio. A Figura 97 ilustra que a concentrações saturantes de furimazina aumentam a afinidade entre 11S e NLpep79.

EXEMPLO 56 KM PARA NLPOLY 5A2:NLPEP

[0374] NLpoly 5A2 foi diluído em PBS+Prionex 0,1% a 1:105. NLpep (WT, NLpep 78 ou NLpep79) foi diluído em PBS+Prionex 0,1% a 30 uM. 50 uL de NLpoly/NLpep foram incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. 50 uL de NanoGlo + Fz (variando de 100 uM a 1,2 uM, 2X) foram adicionados e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em GloMax® Multi+ com integração de 0,5 segundo. Km foi derivada usando Graphpad Prism, valores de melhor ajuste de Michaelis-Menton. A Figura 98 ilustra os valores de Km para NLpoli5A2 e NLpep WT, 78 e 79.

EXEMPLO 57 LUMINESCÊNCIA DE NLPOLY SEM NLPEP

[0375] Lisado clarificado de E. coli foi preparado tal como descrito anteriormente para NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S e 11S. 50 uL de cada lisado e 50 uL de NanoGlo+Fz foram misturados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em GloMax® Multi+ com integração de 0,5 segundo. A Figura 99 ilustra que a capacidade do NLpoly em produzir luminescência na ausência de NLpep aumentou gradualmente ao longo do processo de evolução, resultando em luminescência ~500 vezes maior para 11S em relação ao NLpoly WT.

EXEMPLO 58 LUMINESCÊNCIA MELHORADA EM E. COLI AO LONGO DO PROCESSO DE EVOLUÇÃO

[0376] Uma única colônia de NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S ou 11S foi inoculada em 200 uL de meio mínimo e cultivada durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL da cultura durante a noite foram diluídos em 190 uL de meio mínimo fresco e cultivados durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL desta cultura durante a noite foram diluídos em 190 uL de meio de autoindução (anteriormente descrito) e cultivadas durante 18 horas a 25°C em um agitador. As culturas autoinduzidas foram diluídas 50 vezes (4 uL em 196 uL de tampão de lise de ensaio), 10 uL de cultura de expressão foram adicionados a 40 uL de tampão de lise de ensaio contendo NLpep (sintético; 1 nM; WT, NLpep78, NL79 ou NLpep80) e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz foram adicionados, e as amostras agitadas durante 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro GloMax com integração de 0,5 segundo. A Figura 100 ilustra a melhora na luminescência do NLpoly derivado de E. coli ao longo do processo de evolução, uma melhora global de ~105 (de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

EXEMPLO 59 LUMINESCÊNCIA MELHORADA EM CÉLULAS HELA AO LONGO DO PROCESSO DE EVOLUÇÃO

[0377] 50 ng de DNA plasmidial que expressa NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S ou 11S foram transfectados em células HeLa nos poços de uma placa de 12 poços utilizando FugeneHD. As células foram então incubadas durante a noite a 37°C/CO2 5%. Meio foi substituído por 500 uL de DMEM sem vermelho de fenol, e as células congeladas a -80°C durante >30 minutos. As células foram descongeladas e transferidas para tubos de 1,5 mL. NLpep WT, NLpep78, NLpep79 ou NLpep 80 (sintético) foram diluídos para 10 nM em PBS+Prionex 0,1%, e 25 uL foram misturados com 25 uL de cada lisado celular de NLpoly. As amostras foram agitadas durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, 50 uL de NanoGlo+Fz 100 nM foram adicionados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 101 ilustra a melhora na luminescência a partir do NLpoly expresso por células HeLa ao longo do processo de evolução, uma melhora global de ~105 (de NLpoliWT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

EXEMPLO 60 LUMINESCÊNCIA MELHORADA EM CÉLULAS HEK293 AO LONGO DO PROCESSO DE EVOLUÇÃO

[0378] 50 ng de DNA plasmidial que expressa NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S ou 11S foram transfectados em células HEK293 em poços de uma placa de 12 poços utilizando FugeneHD. As células foram então incubadas durante a noite a 37°C/CO2 5%. Meio foi substituído por 500 uL de DMEM sem vermelho de fenol, e as células congeladas a -80°C durante >30 minutos. As células foram descongeladas e transferidas para tubos de 1,5 mL. NLpep WT, NLpep78, NLpep79 ou NLpep 80 (sintético) foram diluídos para 10 nM em PBS+Prionex 0,1% e 25 uL foram misturados com 25 uL de cada lisado celular de NLpoly. As amostras foram agitadas durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, 50 uL de NanoGlo+Fz 100 nM foram adicionados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro GloMax com integração de 0,5 s. A Figura 102 ilustra a melhora na luminescência de NLpoly expresso em células HEK293 ao longo do processo de evolução, uma melhora global de ~104 (de NLpoly WT:NLpepWT a NLpoli11S:NLpep80).

EXEMPLO 61 AFINIDADE DE LIGAÇÃO MELHORADA AO LONGO DA EVOLUÇÃO

[0379] NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S ou 11S (lisados clarificado de E. coli) foram diluídos em PBS+Prionex 0,1% como se segue: WT 1:104; 5A2 1:105; 5P 1:106; 8S 1:107; e 11S 1:107. NLpep WT, NLpep78, NLpep79 ou NLpep80 (sintético) foram diluídos em série em PBS+Prionex 0,1% para concentração 4X. 25 uL de NLpep e 25 uL de NLpoly foram misturados e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz 100 nM foram adicionados e incubados durante 5 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um GloMax Multi+ com integração de 0,5 segundo. Kd foi determinada utilizando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio, valores de melhor ajuste. A Figura 103 ilustra a afinidade melhorada em 104 vezes (afinidade inicial: NLpoliWT:NLpepWT, Kd ~10 uM) da Kd<1 nM (NLpoli11S:NLpep86 ou NLpoli11S:NLpep80) dos variantes testados em comparação ao selvagem.

EXEMPLO 62 LUMINESCÊNCIA DE NLPOLY

[0380]Colônias isoladas de variantes de NLpoly foram inoculadas com 200 uL de meio mínimo e cultivadas durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL da cultura durante a noite foram diluídos em 190 uL de meio mínimo fresco e cultivadas durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL desta cultura durante a noite foram então diluídos em 190 uL de meio autoindução (anteriormente descrito) e cultivados durante 18 horas a 25°C em um agitador. 10 uL desta cultura de expressão foram misturados com 40 uL de tampão de lise de ensaio (anteriormente descrito) sem NLpep ou NLpep78-HT (diluição 1:3.860) ou NLpep79-HT (diluição 1:10.000) e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz foram adicionados e novamente agitados por 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em luminômetro GloMax® com integração de 0,5 segundo. As Figuras 105-107 ilustram a luminescência de vários NLpolis na ausência de NLpep.

EXEMPLO 63 SOLUBILIDADE DE VARIANTES DE NLPOLY

[0381] Uma única colônia de variante de NLpoly (VER FIG. 143) foi inoculada em 5 mL de cultura LB e incubada a 37°C durante a noite com agitação. A cultura durante a noite foi diluída 1:100 em LB fresco e incubada a 37°C durante 3 horas com agitação. Ramnose foi adicionada às culturas a 0,2% e estas foram incubadas a 25°C durante a noite com agitação. 900 uL destas culturas durante a noite foram misturados com 100 uL de tampão de lise FastBreak 10X (Promega Corporation) e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Uma alíquota de 75 uL (total) foi removida de cada cultura e guardada para análise. A cultura restante de cada amostra foi centrifugada a 14.000 x rpm em uma microcentrífuga de bancada a 4°C durante 15 minutos. Uma alíquota de 75 uL de sobrenadante (solúvel) foi removida de cada amostra e guardada para análise. 25 uL de tampão SDS 4x foram adicionados às alíquotas guardadas e estas foram incubadas a 95°C durante 5 minutos. 5 uL de cada amostra foram aplicados em um gel de SDS Tris-Glicina 4-20% e corridos a ~190 V por ~50 minutos. O gel foi corado com SimplyBlue SafeStain e imagens foram captadas por LAS4000. A Figura 143 mostra um gel proteico de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para os variantes de NLpoly.

EXEMPLO64 CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO

[0382] Lisado de variante de NLpoly (VER FIG. 144; preparado tal como descrito anteriormente) foi diluído 1:10 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x de NLpep78 (NLpep78 sintético) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 uL de lisado de variantes de NLpoly e 20 uL de NLpep foram misturados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 uL de NanoGlo/Fz foram adicionados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro GloMax® com integração de 0,5 s. A Kd foi determinada usando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio, valores de melhor ajuste. A Figura 144 ilustra as constantes de dissociação de NLpep78 com vários NLpolis.

EXEMPLO 65 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB E FKBP FUNDIDAS COM NLPOLl5P E NLPEP80/87

[0383] Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com 1 µg de pF4A Ag FKBP ou 1 µg de vetores pF4A Ag FRB expressando fusões N- ou C-terminais de NLpoli5P e/ou NLpep80/87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE HD de 1:4. 24 horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços em uma densidade de 10.000 células por poço. 24 horas após o plaqueamento, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com ou sem rapamicina 20 nM durante 15, 60 ou 120 minutos em OptiMEMI isento de vermelho de fenol. Substrato furimazina 10 µM com ou sem rapamicina 20 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. As Figuras 108 (15 minutos de indução), 109 (60 minutos de indução) e 110 (120 minutos de indução) ilustram um aumento geral na indução ao longo do tempo, com combinações de NLpoli5P e NLpep80 gerando a maior luminescência. Os componentes individuais contribuem minimamente para o sinal.

EXEMPLO 66 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB E FKBP FUNDIDAS COM NLPOLl5P E NLPEP80/87

[0384]Embora semelhante ao Exemplo 65, este exemplo testou todas as 8 possíveis combinações de FRB e FKBP fundidas com NLpoly/NLpep, bem como utilizou menos DNA total. Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,001 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P e 0,001 µg de pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com 0 ou 50 nM de rapamicina em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 111 ilustra que as combinações de NLpep80 geraram a maior luminescência e que todas as configurações responderam ao tratamento com rapamicina.

EXEMPLO 67 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR FUSÕES DE FRB OU FKBP EXPRESSAS NA AUSÊNCIA DO PARCEIRO DE LIGAÇÃO

[0385] Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,001 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P ou pF4A Ag FKBP- NLpep80/NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com 0 ou 50 nM de rapamicina em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 112 ilustra que os componentes individuais geram um baixo nível basal de luminescência que não é responsiva ao tratamento com rapamicina.

EXEMPLO 68 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM QUANTIDADES VARIADAS DE DNA DE FRB-NLPOLI5P E FKBP-NLPEP80/87

[0386] Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 2, 0,2; 0,02 ou 0,002 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P e pF4A Ag FKBP-NLpep80 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 2 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 20 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 20 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 113 ilustra que a transfecção com menos DNA reduz a luminescência global, mas aumenta a indução em vezes.

EXEMPLO 69 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM QUANTIDADES VARIADAS DE DNA DE FRB-NLPOLI5P OU FKBP-NLPEP80/87 NA AUSÊNCIA DO PARCEIRO DE LIGAÇÃO

[0387]Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 2, 0,2; 0,02 ou 0,002 µg de pF4A Ag FRB- NLpoli5P ou pF4A Ag FKBP-NLpep80 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 2 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 20 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 20 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 114 ilustra que níveis mais baixos de DNA não alteram a luminescência global de células transfectadas com componentes individuais.

EXEMPLO 70 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM QUANTIDADES VARIADAS DE DNA DE FRB-NLPOLI5P E FKBP-NLPEP80/87

[0388] Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,2, 0,02; 0,002, ou 0,0002 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P e pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 2 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 115 ilustra que luminescência acima do fundo, tal como determinada nos Exemplos 69 e 71, e a indução pela rapamicina podem ser obtidas com níveis de DNA reduzidos para 2,5 pg.

EXEMPLO 71 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM QUANTIDADES VARIADAS DE DNA DE FRB-NLPOLI5P OU FKBP-NLPEP80/87 NA AUSÊNCIA DO PARCEIRO DE LIGAÇÃO

[0389] Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,2, 0,02; 0,002 ou 0,0002 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P ou pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 2 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 116 ilustra nenhuma alteração significativa na luminescência gerada pelos componentes individuais quando menos DNA foi usado. EXEMPLO 72 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNC IA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM QUANTIDADES VARIADAS DE DNA DE FRB-NLPOLI5P E FKBP-NLPEP80 OU FKBP- NLPEP87 APÓS O TRATAMENTO COM RAPAMICINA DURANTE PERÍODOS DE TEMPO DIFERENTES

[0390]Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 2, 0,2; 0,02 ou 0,002 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P e pF4A Ag FKBP-NLpep80 ou FKBP-NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 2 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram rebanhado em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 20 nM durante 5/15/30/60/120 minutos. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 20 nM em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. As Figuras 117 e 118 ilustram um declínio na luminescência com menos DNA e um aumento na indução pela rapamicina ao longo do tempo.

EXEMPLO 73 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB-NLPOLl5P OU FRB-NLPOLl5A2 COM FKBP-NLPEP80/87/95/96/97

[0391] Neste exemplo, o ensaio foi realizado em um formato de dois dias e de três dias. Para o ensaio de 2 dias, 20.000 células HEK293T transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli5P ou FRB-NLpoli5A2 e pF4A Ag FKBP-NLpep80/87/95/96/97 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0392]Para o ensaio de 3 dias, 400.000 células HEK293T foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,002 µg de pF4A Ag FRB- NLpoli5P e pF4A Ag FKBP-NLpep80/87/95/96/97 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. As Figuras 119 e 120 ilustram níveis semelhantes de luminescência em ambos os ensaios de 2 e 3 dias dia. Os ensaios realizados com NLpoli5A2 apresentaram maior indução pela rapamicina em relação ao NLpoli5P, e os ensaios realizados com NLpoli5A2 e NLpep96 apresentaram maior indução pela rapamicina em relação a todas as combinações testadas.

EXEMPLO 73 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB-NLPOLl5A2 OU FRB-NLPOLIIIS COM FKBP-NLPEP1 01/104/105/106/107/108/109/110

[0393]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli5A2/L e pF4A Ag FKBP- NLpep101/104/105/106/107/108/109/110 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 121 ilustra que, em relação às combinações testadas, NLpoli11S com NLpep101 apresentou a maior indução pela rapamicina e um dos sinais luminescentes mais fortes específicos da rapamicina.

EXEMPLO 74 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB-NLPOLl5A2 OU FRB-NLPOLIIIS COM FKBP-NLPEP87/96/98/99/100/101/102/103

[0394]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0.1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli5A2/11S e pF4A Ag FKBP- NLpep87/96/98/99/100/101/102/103 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 122 ilustra que a combinação de NLpoli11S e NLpep101 produz a maior indução, enquanto mantém altos níveis de luminescência específica.

EXEMPLO 75 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM DIFERENTES NÍVEIS DE DNA DE FRB-NLPOLIIIS E FKBP- NLPEP87/101/102/107

[0395] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,01; 0,1; 1 ou 10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP- NLpep87/101/102/107 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 123 ilustra que NLpoli11S com NLpep101 produz o menor luminescência global nas amostras não-tratadas em todos os níveis testados de DNA, e que a combinação mantém níveis relativamente altos de luminescência em amostras tratadas com rapamicina.

EXEMPLO 76 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM DIFERENTES NÍVEIS DE DNA DE FRB-NLPOLl5A2 E FKBP- NLPEP87/101/102/107

[0396] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,01; 0,1; 1 ou 10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli5A2 e pF4A Ag FKBP- NLpep87/101/102/107 usando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 124 ilustra que NLpoli5A2 gera maior luminescência em amostras não-tratadas do que NLpoli11S apresentado no Exemplo 75.

EXEMPLO 77 CURVA DE DOSE-RESPOSTA DA RAPAMICINA APRESENTANDO A LUMINESCÊNCIA DAS CÉLULAS QUE EXPRESSAM DNA DE FRB-NLPOLl5P E FKBP-NLPEP80/87

[0397]Células HEK293T (400.000) foram transfectadas de forma reversa com um total de 0,001 µg de pF4A Ag FRB-NLpoli5P e 0,001 µg de pF4A Ag FKBP-NLpep80/NLpep87 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, 10.000 células foram replaqueadas em placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 horas. As células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 a 500 nM de rapamicina durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com 0 a 500 nM de rapamicina em OptiMEM foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Kd foi calculada com GraphPad Prism versão 5.00 para Windows. A Figura 125 ilustra um aumento específico da rapamicina na luminescência.

EXEMPLO 78 CURVA DE DOSE-RESPOSTA DA RAPAMICINA MOSTRANDO A LUMINESCÊNCIA DAS CÉLULAS QUE EXPRESSAM DNA DE FRB-NLPOLl5A2 E FKBP-NLPEP87/101

[0398]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli5A2/11S e pF4A Ag e FKBP-NLpep87/101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 a 1 µM de rapamicina durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final nas células) com 0 a 1 µM de rapamicina em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 126 ilustra uma curva sigmoidal de dose- resposta da rapamicina com as combinações NLpoli5A2/NLpep101 e NLpoli11S/NLpep101. Embora as combinações com NLpep87 mostrem um aumento na luminescência com rapamicina, os pontos de dados coletados desviam-se mais da curva sigmoidal.

EXEMPLO 79 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-11S E FKBP-101 E TRATADAS COM SUBSTRATO PBI-4377 OU FURIMAZINA

[0399]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1/1/10 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma proporção de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção a 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM ou PBI-4377 (concentração final nas células) com 0 a 50 nM de rapamicina em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 127 ilustra uma redução na luminescência e indução em vezes com o substrato PBI-4377 em comparação ao substrato furimazina.

EXEMPLO 80 CURSO TEMPORAL DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLI11S/5A2 E FKBP-NLPEP87/101 CONDUZIDO NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE RAPAMICINA

[0400] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S/5A2 e pF4A Ag FKBP-NLpep87/101 utilizando

[0401]FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina e furimazina 10 µM foi adicionado manualmente ou por meio de injeção do instrumento. A luminescência foi imediatamente medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. As Figura 128 e 129 mostram que, de todas as combinações testadas, NLpoli11S com NLpep101 apresenta a menor luminescência no tempo 0, atinge um platô luminescente mais rapidamente e possui o maior intervalo dinâmico.

EXEMPLO 81 LUMINESCÊNCIA GERADA POR FRB-NLPOLI11S E FKBP-NLPEP101 MEDIDA EM DOIS INSTRUMENTOS DIFERENTES

[0402]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina foi adicionado durante 20 minutos. Furimazina 10 µM (concentração final nas células) em OptiMEMI com 0 ou 50 nM de rapamicina foi adicionada e incubada por mais 5 minutos. A luminescência foi imediatamente medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s e em Varioskan Flash com o filtro de passagem de banda de 450 nM. A Figura 130 ilustra que a indução específica pela rapamicina do FRB-NLpoli11S e FKBP-NLpep101 pode ser medida com instrumentos diferentes.

EXEMPLO 82 IMAGENS APRESENTANDO A LUMINESCÊNCIA DAS CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLI11S E FKBP-NLPEPIOI EM VÁRIOS MOMENTOS APÓS O TRATAMENTO COM RAPAMICINA

[0403] Células HeLa (500.000) foram transfectados de forma reversa com 1 µg de pF4 Ag FRB-NLpoli11S e 1 µg de pF4 Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. As células foram transfectadas em placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro (MatTek #p35gc- 1.5-14-C). 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com furimazina 10 µM em OptiMEM durante 5 minutos. Rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionada às células e as imagens luminescentes foram adquiridas com LV200 em intervalos de 10 s, para um total de 20 minutos. O instrumento estava a 37oC, a objetiva era de 60X, o ganho foi de 200 e a exposição foi de 600 ms. A Figura 131 ilustra que as imagens podem detectar um aumento na luminescência celular em células que expressam FRB-NLpoli11S e FKBP- NLpep101 após o tratamento com rapamicina.

EXEMPLO 83 QUANTIFICAÇÃO DO SINAL GERADO POR CÉLULAS INDIVIDUAIS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLIIIS E FKBP-NLPEPIOI EM VÁRIOS MOMENTOS APÓS O TRATAMENTO COM RAPAMICINA

[0404] Células HeLa (500.000) foram transfectadas de forma reversa com 1 µg de pF4 Ag FRB-NLpoli11S e 1 µg de pF4 Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. As células foram transfectadas em placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro (MatTek #p35gc- 1.5-14-C). 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com furimazina 10 µM em OptiMEM durante 5 minutos. Rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionada às células, e as imagens luminescentes foram adquiridas com LV200 em intervalos de 10 s, para um total de 20 minutos. O instrumento estava a 37°C, a objetiva era de 60X, o ganho foi de 200 e a exposição foi de 600 ms. A intensidade do sinal de cada célula no campo de visão foi analisada com o software Image J ao longo de todo o período de tempo. A Figura 132 ilustra que o sinal gerado pelas células individuais pode ser medido e que o aumento do sinal por cada célula é paralelo ao aumento observado no ensaio em placa de 96 poços apresentado nas Figuras 128 e 129.

EXEMPLO 84 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLIIIS E FKBP-NLPEPIOI

[0405] Células HEK293T, HeLa ou U2-OS (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 50 nM de rapamicina foi adicionado durante 20 minutos. Furimazina 10 µM (concentração final nas células) em OptiMEMI com 0 ou 50 nM de rapamicina foi adicionada e incubada por mais 5 minutos. A luminescência foi imediatamente medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 133 ilustra níveis semelhantes de luminescência gerados na ausência e presença de rapamicina em três linhagens celulares diferentes transfectadas com FRB-NLpoli11S e FKBP- NLpep101.

EXEMPLO 85 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLIIIS E FKBP-NLPEPIOI APÓS O TRATAMENTO COM O INIBIDOR COMPETITIVO DA RAPAMICINA, FK506

[0406] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 20 nM de rapamicina foi adicionado durante 20 minutos. O inibidor FK506 em OptiMEM foi adicionado às células para uma concentração final de 5 µM e incubado durante 3 ou 5 horas. Furimazina em OptiMEM foi adicionada às células para uma concentração final de 10 µM nas células. A luminescência foi imediatamente medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 134 ilustra uma redução na luminescência induzida pela rapamicina após o tratamento com o inibidor competitivo FK506.

EXEMPLO 86 LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLI11S E FKBP-NLPEPIOI APÓS O TRATAMENTO COM O INIBIDOR COMPETITIVO DA RAPAMICINA,FK506

[0407] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 20 nM de rapamicina foi adicionado durante 2,5 horas. O inibidor FK506 em OptiMEM foi adicionado às células através do injetor em uma concentração final de 0, 1 ou 10 µM em OptiMEM com 10 µM. A luminescência foi medida a cada 10 minutos durante 4 horas sobre um GloMax Multi ajustado para 37oC com de tempo de integração de 0,5 s. A Figura 135 ilustra que, aos 200 s, o inibidor FK506 pode reduzir a luminescência para próximo dos níveis das células não-tratadas.

EXEMPLO 87 LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE V2R-NLPOLI5A2 OU V2R-NLPOLI11S COM NLPEP87/101- ARRB2 NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DO AGONISTA DE V2R, AVP

[0408]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1; 1 ou 10 ng de pF4A Ag V2R-NLpoli11S e pF4A Ag ARRB2-NLpep87/101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para l µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 1 µM de AVP e furimazina 10 µM foi adicionado durante 25 minutos. A luminescência foi então medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. A Figura 136 ilustra que V2R-NLpoli11S com NLpep101 gera o maior aumento específico do AVP na luminescência. Combinações com NLpep87 não apresentam uma resposta significativa ao AVP.

EXEMPLO88 CURSO TEMPORAL APRESENTANDO A LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM V2R-NLPOLI5A2 OU V2R-NLPOLI11S E NLPEP87/101-ARRB2 APÓS O TRATAMENTO COM AVP

[0409] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ou 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoli11S ou 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoli5A2 e pF4A Ag ARRB2- NLpep87/101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 1 µM de AVP e furimazina 10 µM foi adicionado manualmente (Figura 137) ou através de injeção do instrumento (Figura 138). A luminescência foi então medida em um GloMax Multi cada 5 minutos durante 25 minutos, com tempo de integração de 0,5 segundo à temperatura ambiente (Figuras 137 e 138) ou 37°C (Figura 139). As Figuras 137 e 138 ilustram um aumento dependente do tempo na luminescência induzida pela AVP para V2R- NLpoli11S com NLpep101-ARRB2 que começa a atingir pico aos 600 s. Combinações com V2R-NLpoli5A2 e NLpep87 não apresentam um aumento significativo na luminescência ao longo do tempo. A Figura 139 ilustra que, a 37°C, todas as combinações de NLpoli11S e NLpep101 testadas apresentam um aumento dependente do tempo na luminescência induzida pelo AVP que nivela em torno de 200 s.

EXEMPLO 89 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES QUE EXPRESSAM V2R-NLPOLI11S E NLPEP101-ARRB2

[0410]Células HEK293T, HeLa ou U2-OS (20.000) foram transfectadas de forma reversa em placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 1 ng de pF4A Ag V2R-NLpoli11S e pF4A Ag ARRB2- NLpep87/101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 ou 1 µM de AVP foi adicionado durante 20 minutos. Furimazina em OptiMEM foi então adicionada para uma concentração final de 10 µM nas células, e a luminescência foi medida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0411]A Figura 140 ilustra níveis semelhantes de luminescência em três linhagens celulares diferentes que expressam V2R-NLpoli11S e NLpep101-ARRB2 na presença e ausência de AVP.

EXEMPLO 90 LUMINESCÊNCIA DAS CÉLULAS QUE EXPRESSAM V2R-NLPOLI11S E NLPEP101-ARRB2 EM VÁRIOS MOMENTOS APÓS O TRATAMENTO COM AVP

[0412] Células HeLa (500.000) foram transfectados de forma reversa com 1 µg de pF4 Ag V2R-NLpoli11S e 1 µg de pF4 Ag ARRB2-NLpep101 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. As células foram transfectadas em placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro (MatTek #p35gc-1.5-14-C). 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com furimazina 10 µM em OptiMEM durante 5 minutos. AVP 1 µM em OptiMEMI foi adicionado às células, e as imagens luminescentes foram adquiridas com LV200 em intervalos de 15 s, para um total de 30 minutos. O instrumento estava a 37°C, a objetiva era de 60X ou 150X, o ganho foi de 600 e a exposição foi de 1 s ou 2 s. As Figuras 141 e 142 ilustram que as imagens podem detectar o aumento na luminescência e a formação de pontos nas células individuais após o tratamento com AVP.

EXEMPLO 91 CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO PARA NLPEPS

[0413] Lisado clarificado de E. coli de NLpoly 5P (preparado tal como descrito anteriormente) foi diluído 1:1.000 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x de NLpep78-HT (lisado clarificado de E. coli preparado tal como descrito anteriormente) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 uL de NLpoly 5P e 20 uL de NLpep78 foram misturados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 uL de NanoGlo/Fz foram adicionados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em luminômetro GloMax com integração de 0,5 s. A Kd foi determinada utilizando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio, valores de melhor ajuste. A Figura 80 compara as constantes de dissociação para um NLpep consistindo em 1 ou 2 unidades repetidas de NLpep78.

EXEMPLO 92 AFINIDADE ENTRE NLPOLY5A2 E NLPEP86

[0414] Lisado de NLpoly 5A2 (preparado tal como descrito anteriormente após transfecção de células CHO) foi diluído 1:10 em PBS+Prionex 0,1%. Concentrações 4x de NLpep86 (NLpep sintético) foram feitas em PBS+Prionex 0,1%. 20 uL de NLpoly e 20 uL de NLpep foram misturados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 uL de NanoGlo/Fz foram adicionados e agitados durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em luminômetro GloMax com integração de 0,5 s. A Kd foi determinada utilizando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio, valores de melhor ajuste. A Figura 81 ilustra a afinidade entre NLpoly 5A2 e NLpep86.

EXEMPLO 93 LUMINESCÊNCIA DE VARIANTES DE NLPOLY

[0415] Uma única colônia de vários NLpolis foi inoculada individualmente em 200 uL de meio mínimo e cultivada durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL de cultura durante a noite foram diluídos em 190 uL de meio mínimo fresco e cultivados durante 20 h a 37°C em um agitador. 10 uL desta cultura durante a noite foram diluídos em 190 uL de meio de autoindução (anteriormente descrito) e cultivados durante 18 horas a 25°C em um agitador. 10 uL da cultura de expressão foram misturados com 40 uL de tampão de lise de ensaio (anteriormente descrito), sem NLpep ou com NLpep78-HT (diluição 1:3.860) ou NLpep79-HT (diluição 1:10.000). As misturas foram agitadas durante 10 minutos à temperatura ambiente, 50 uL de NanoGlo+Fz foram adicionados e agitados novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um luminômetro GloMax com integração de 0,5 seg. A Figura 82 demonstra a luminescência de variantes de NLpoly sem um NLpep ou com NLpep78 ou NLpep79. Os resultados mostram que o variante 11S do NLpoly (12S-51) apresenta luminescência melhorada em relação aos demais variantes.

EXEMPLO94 CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO E VALORES DE VMAX PARA NLPOLIS COM 96 VARIANTES DE NLPEPS

[0416] NLpeps foram sintetizados em formato de matriz pela New England Peptide (peptídeos bloqueados na extremidade N-terminal por acetilação e na extremidade C-terminal por amidação; peptídeos em matrizes foram sintetizados em uma escala de ~1 mg) (Tabela 6). Cada peptídeo foi liofilizado em 3 placas separadas. Cada poço de 1 das 3 placas de peptídeos foi dissolvido em 100 uL de água nanopura, e a A260 foi medida e usada para calcular a concentração utilizando o coeficiente de extinção de cada peptídeo. A concentração foi então ajustada com base na pureza do peptídeo, e água nanopura foi adicionada para uma concentração final de 750 uM.

[0417] Os peptídeos foram diluídos para 12,66 uM (4X) em PBS+Prionex 0,1% e depois diluídos em série por 7 vezes (8 concentrações totais) em etapas de 0,5 log (diluição de 3,162 vezes). Os NLpolis 5P, 8S, 5A2 ou 11S foram diluídos em PBS+Prionex 0,1% como se segue: 5P 1:2.000; 8S 1:10.000; 11S 1:150.000, 5A2 1:1.000. 25 uL de cada NLpep + 25 uL de cada NLpoly foram misturados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz 100 uM foram adicionados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um GloMax Multi+ com integração de 0,5 s. Kd/Vmax foram determinadas usando Graphpad Prism, ligação específica a um único sítio, valores de melhor ajuste. As Figuras 83-90 ilustram a constante de dissociação e os valores de Vmax dos NLpolis com os 96 variantes de NLpeps. Os resultados indicam mutações específicas nos NLpeps que exibem menor afinidade de ligação sem perda na Vmax. TABELA 6. MATRIZ 1 DE PEPTÍDEOS

EXEMPLO 95 SOLUBILIDADE DE VARIANTES DE NLPOLY

[0418] Uma única colônia de NLpoly 5A2, 12S, 11S, 12S-75, 12S-107 ou 5P-B9 foi inoculada em 5 mL de cultura LB e incubada a 37°C durante a noite com agitação. A cultura durante a noite foi diluída 1:100 em LB recentemente preparado e incubada a 37°C durante 3 horas com agitação. Ramnose foi adicionada às culturas para 0,2% e incubada a 25°C durante a noite com agitação. 900 uL destas culturas durante a noite foram misturados com 100 uL de tampão de lise FastBreak 10X (Promega Corporation) e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Uma alíquota de 75 uL (total) foi removida de cada cultura e guardada para análise. A cultura restante de cada amostra foi centrifugada a 14.000 x rpm em uma microcentrífuga de bancada a 4°C durante 15 minutos. Uma alíquota de 75 uL do sobrenadante (solúvel) foi removida de cada amostra e guardada para análise. 25 uL de tampão SDS 4x foram adicionados às alíquotas guardadas e incubados a 95°C durante 5 minutos. 5 uL de cada amostra foram aplicados em um gel de SDS Tris- Glicina 4-20% e corridos a ~190 V por ~50 minutos. O gel foi corado com SimplyBlue SafeStain e imagens foram captadas por LAS4000. A Figura 91 mostra um gel proteico de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para os variantes de NLpoly. Com exceção de 5A2, todos os variantes exibem um percentual de NLpoly na fração solúvel.

EXEMPLO 96 SOLUBILIDADE E CONSTANTE DE DISSOCIAÇÃO DE VARIANTES DE NLPOLY

[0419] Uma única colônia de NLpoly (listada na Figura 92) foi inoculada em 5 mL de cultura LB e incubada a 37°C durante a noite com agitação. A cultura durante a noite foi diluída 1:100 em LB recentemente preparado e incubada a 37°C durante 3 horas com agitação. Ramnose foi adicionada às culturas para 0,2% e incubada a 25°C durante a noite com agitação. 900 uL destas culturas durante a noite foram misturados com 100 uL de tampão de lise FastBreak 10X (Promega Corporation) e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Uma alíquota de 75 uL (total) foi removida de cada cultura e guardada para análise. A cultura restante de cada amostra foi centrifugada a 14.000 x rpm em uma microcentrífuga de bancada a 4°C durante 15 minutos. Uma alíquota de 75 uL do sobrenadante (solúvel) foi removida de cada amostra e guardada para análise. 25 uL de tampão SDS 4x foram adicionados às alíquotas guardadas e incubados a 95°C durante 5 minutos. 5 uL de cada amostra foram aplicados em um gel de SDS Tris-Glicina 4-20% e corridos a 190~V por ~50 minutos. O gel foi corado com SimplyBlue SafeStain e as imagens foram captadas por LAS4000. A Figura 92 mostra um gel proteico de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly bem como uma tabela contendo as constantes de dissociação para os mesmos variantes.

EXEMPLO 97 ESPECIFICIDADE DO SUBSTRATO PARA NLPOLY 5P E 11S COM NLPEP79

[0420] Lisados clarificado de E. coli foram preparados para NLpoly 5P ou 11S tal como descrito anteriormente. Os lisados de NLpoly foram então diluídos em série em etapas de 10 vezes em PBS+Prionex 0,1%. 25 uL de NLpoly e 25 uL de NLpep79 sintético (400 nM, 4X) foram misturados e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz 100 uM foram adicionados, incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente, e a luminescência foi medida em um GloMax Multi+ com integração de 0,5 s. A Figura 93 mostra a especificidade do substrato para 5P e 11S com NLpep79 e demonstra que 11S apresenta especificidade superior para furimazina em relação a 5P.

EXEMPLO 98 SOLUBILIDADE DE VARIANTES DE NLPOLY A PARTIR DE VÁRIAS ETAPAS DE EVOLUÇÃO

[0421] Uma única colônia de NLpoly WT, 5A2, 5P, 8S ou 11S foi inoculada em 5 mL de cultura LB e incubada a 37°C durante a noite com agitação. A cultura durante a noite foi diluída 1:100 em LB recentemente preparado e incubada a 37°C durante 3 horas com agitação. Ramnose foi adicionada às culturas para 0,2% e incubada a 25°C durante a noite com agitação. 900 uL destas culturas durante a noite foram misturados com 100 uL de tampão de lise FastBreak 10X (Promega Corporation) e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Uma alíquota de 75 uL (total) foi removida de cada cultura e guardada para análise. A cultura restante de cada amostra foi centrifugada a 14,000 x rpm em uma microcentrífuga de bancada a 4°C durante 15 minutos. Uma alíquota de 75 uL de sobrenadante (solúvel) foi removida de cada amostra e guardada para análise. 25 uL de tampão SDS 4x foram adicionados às alíquotas guardadas e incubados a 95°C durante 5 minutos. 5 uL de cada amostra foram aplicados em um gel de SDS Tris-Glicina 4-20% e corridos a ~190 V por ~50 minutos. O gel foi corado com SimplyBlue SafeStain e as imagens foram captadas por LAS4000. A Figura 104 mostra um gel proteico de lisados totais e a fração solúvel do mesmo lisado para variantes de NLpoly a partir de várias etapas do processo de evolução. Estes resultados demonstram que a solubilidade do NLpoly foi dramaticamente aumentada no processo de evolução.

EXEMPLO 99 MARCAÇÃO QUÍMICA DE PROTEÍNAS

[0422] Os peptídeos não luminescentes (NLpeps) da presente invenção podem ser usados para marcar quimicamente proteínas. Um NLpep da presente invenção pode ser sintetizado para conter um grupo reativo, por exemplo, biotina, succinimidil éster, maleimida, etc., e ser ligado (por exemplo, conjugado, vinculado, marcado, etc.) a uma proteína, por exemplo, anticorpo. A proteína marcada com NLpep, por exemplo, NLpep-anticorpo, pode ser então usada em várias aplicações, por exemplo, ELISA. A interação/ligação da proteína marcada com NLpep, por exemplo, NLpep-anticorpo, com seu alvo/parceiro de ligação seria detectada pela adição de um NLpoly da presente invenção e reagente de ensaio NanoGlo®. A luminescência gerada pela interação da proteína marcada com NLpep e NLpoly estaria correlacionada à interação da proteína marcada com NLpep com seu alvo/parceiro de ligação. Este conceito poderia permitir que vários NLpeps fossem ligados a uma única molécula proteica resultando, assim, em várias interações proteína marcada com NLpep/NLpoly, levando à amplificação do sinal.

EXEMPLO 100 DETECÇÃO DE MODIFICAÇÃO PROTEICA PÓS-TRADUCIONAL USANDO HALOTAG- NLPEP POR WESTERN BLOTTING

[0423] Várias proteínas podem ser modificados de modo pós- traducional por AMPilação ou ADP-ribosilação. Na AMPilação, AMP é adicionado à proteína-alvo por uma ligação fosfodiéster usando ATP como a molécula doadora. Da mesma forma, na ADP-ribosilação, uma fração de ADP- ribose é adicionada para se direcionar a proteínas através de uma ligação fosfodiéster utilizando NAD+ como a molécula doadora. Foi demonstrado que a posição N6 no ATP e em NAD+ pode ser usada para marcar ligantes sem afetar o evento pós-traducional. Se um cloroalcano-ATP ou -NAD+ modificado em N6 for usado para realizar a reação de AMPilação ou ADP-ribosilação, as proteínas- alvo seriam modificadas para conter o cloroalcano-ATP ou -NAD+.

[0424] ATP/NAD modificado em N6 foi usado em combinação com química-clique para desenvolver sistemas de detecção à base de fluorescência em gel. A detecção destas modificações pós-traducionais, por técnicas de western blotting requer anticorpos, que frequentemente não são específicos ou não estão disponíveis. Uma abordagem alternativa poderia ser combinar as propriedades da tecnologia HaloTag® e a alta luminescência da luciferase NanoLuc® (NL). Após a modificação pós-traducional das proteínas-alvo com cloroalcano-ATP (para AMPilação) ou cloroalcano-NAD+ (para ADP-ribosilação) usando lisado celular ou proteínas purificadas, as amostras podem ser resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF. Após o bloqueio, o blot pode ser incubado com HaloTag-NLpep. HaloTag irá se ligar às proteínas modificadas de modo pós-traducional. Na etapa seguinte, o NLpoly e a furimazina poderiam ser adicionados ao blot para detectar a bioluminescência. Este método de detecção é uma alternativa à abordagem à base de quimioluminescência para detecção de western blots. Uma abordagem à base de quimioluminescência pode envolver a incubação de fusões HaloTag-proteína G (como primário) e, na etapa seguinte, qualquer anticorpo secundário ligado a HRP poderia ser usado após reação de ECL.

EXEMPLO 101 ENSAIOS DE MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL

[0425] Modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas são fundamentais para todos os aspectos da regulação biológica. PTMs amplificam as diversas funções do proteoma pela adição covalente de grupos funcionais às proteínas. Estas modificações incluem fosforilação, metilação, acetilação, glicosilação, ubiquitinação, nitrosilação, lipidação e influenciam muitos aspectos da biologia celular normal e patogênese. Mais especificamente, PTMs relacionadas a histonas são de grande importância. Modificações covalentes epigenéticas de proteínas histonas têm um forte efeito sobre a regulação da transcrição gênica e a atividade celular. Exemplos de enzimas de modificação pós-traducional incluem, entre outras, quinases/fosfatases, metiltransferases (HMT)/desmetilases (HDMT), acetiltransferases/histona desacetilases, glicosiltransferases/glucanases e ADP-ribosil-transferases. Em condições fisiológicas normais, a regulação das enzimas de PTM é estreitamente regulada. Contudo, em condições patológicas, a atividade destas enzimas pode estar desregulada, e a interrupção das redes intracelulares reguladas por estas enzimas leva a muitas doenças incluindo câncer e inflamação.

[0426] Os peptídeos não luminescentes (NLpep) e polipeptídeos não luminescentes (NLpoly) da presente invenção podem ser utilizados para determinar a atividade das enzimas de PTM pelo monitoramento das alterações na transferência de grupo covalente (por exemplo, fosforil, acetil) para um substrato peptídico específico ligado a um NLpep da presente invenção. O NLpep será ligado através de síntese peptídica a peptídeo pequeno específico da enzima de PTM e utilizado como substrato para a enzima de PTM. A) ENSAIOS DE TRANSFERASE DE PTM (HAT)

[0427] Uma vez que a reação enzimática de PTM tiver ocorrido, uma aminopeptidase pode ser utilizada para degradar o peptídeo não- modificado (NLpep; controle). O peptídeo modificado (acetilado) (substrato da enzima NLpep-PTM) seria degradado em uma velocidade muito lenta ou não seria degradado em absoluto, uma vez que a atividade da aminopeptidase é conhecida por ser afetada por uma PTM. Uma vez que reação da aminopeptidase estiver concluída, o NLpoly é adicionado com o reagente de ensaio NanoGlo® contendo Furimazina. A luminescência seria gerada a partir da amostra onde a PTM ocorreu através da interação do NLpep e NLpoly. Se nenhuma PTM tiver ocorrido, o NLpep seria degradado, e nenhuma interação entre o NLpep e NLpoly ocorreria, assim, nenhuma luminescência seria gerada. Este conceito é exemplificado na Figura 197 para um conceito geral da enzima transferase e, na Figura 145, para H3K4/9 acetiltransferases.

[0428] A reação seria realizada em condições ideais de reação enzimática utilizando o substrato peptídico da histona ligado ao NLpep da presente invenção e Acetil-CoA ou SAM como o doador de grupo acetil ou metil. Um tampão contendo aminopeptidase ou uma mistura de aminopeptidases seria adicionado para degradar especificamente todos os substratos não-modificados. Um tampão contendo um NLpoly da presente invenção e um inibidor de aminopeptidase seria adicionado. Reagente de ensaio NanoGlo® seria adicionado, e a luminescência detectada. A luminescência gerada seria proporcional à quantidade do NLpep não-degradado presente e, portanto, se correlacionaria à quantidade de substratos metilados ou acetilados, indicando, assim, a quantidade de metil ou acetil transferase. O ensaio também pode ser aplicado à PTM tal como fosforilação, glicosilação, ubiquitinação, nitrosilação e lipidação. B) ENSAIOS DE HIDROLASE DE PTM (HDMT)

[0429] Conceito semelhante ao apresentado em A) pode ser usado para histona desmetilases (HDMT). No entanto, em vez de uma aminopeptidase, um anticorpo específico para PTM pode ser usado para criar interferência da atividade. Um NLpep da presente invenção poderia ser ligado através de síntese peptídica a um peptídeo pequeno desnaturado e utilizado como substrato para a hidrolase. Uma vez que uma reação da hidrolase tiver sido concluída, um anticorpo anti-metil pode ser adicionado à reação. Este anticorpo irá se ligar especificamente ao peptídeo metilado (controle). O produto peptídico gerado pela HDMT não irá se ligar ao anticorpo. Em seguida, um NLpoly da presente invenção pode ser adicionado. Se o anticorpo interferir com a interação do NLpep e NLpoly, nenhuma luminescência será gerada. Se tiver havido hidrólise da PTM pela desmetilase, o NLpep e NLpoly irão interagir, e luminescência será gerada. Este conceito é exemplificado na Figura 198 para um conceito geral da enzima hidrolase e, na Figura 146, H3K4/9 desmetilases.

[0430] Conceito de degradação pela aminopeptidase do substrato não-modificado também pode ser utilizado para um ensaio de hidrolase, exceto que haveria uma perda de sinal do ensaio em vez de um ganho de sinal. A reação seria realizada em condições ideais de reação enzimática utilizando um substrato peptídico modificado de histona (metilada ou acetilada) ligado a um NLpep da presente invenção. Um tampão contendo um anticorpo capaz de reconhecer o grupo metil ou acetil seria adicionado. Um tampão contendo um NLpoly da presente invenção seria adicionado. O NLpoly iria interagir com o NLpep não-ligado ao anticorpo. Reagente de ensaio NanoGlo® seria adicionado, e a luminescência detectada. A luminescência gerada seria proporcional à quantidade de NLpep não-ligado ao anticorpo e, portanto, se correlacionaria com a quantidade de substrato desmetilado ou desacetilado, indicando, assim, a quantidade de atividade de desmetilase ou desacetilase. Ambos os conceitos de ensaio de hidrolase também pode ser aplicados a hidrolases de PTM tais como fosfatases, glucanases e desubiquitinases.

[0431] Em outra versão destes conceitos, a transferência ou hidrólise da PTM no peptídeo-NLpep seria por si só suficiente para reduzir ou intensificar a interação de NLpep com NLpoly e, portanto, reduzir ou aumentar o sinal luminescente sem a necessidade de aminopeptidase ou anticorpo.

[0432] Método da presente invenção foi utilizado para testar uma transferase representativa, a Tirosina Quinase SRC usando o seguinte substrato peptídico NLpep-SRC: YIYGAFKRRGGVTGWRLCERILA. A enzima SRC foi titulada em 10 µL de Tampão de Reação A (Tris 40 mM 7,5, MgCl2 20 mM e 0,1 mg/mL de BSA) na presença de ATP 150 µM e substrato NLpep-Src 2,5 µM e incubada durante 1 hora a 23°C. Após a incubação, 10 µL de reagente aminopeptidase M (APM) (Tris 40 mM pH 7,5, 0,1 mg/mL de BSA e 50 mU de APM) foram adicionados, misturados durante 2 minutos em um agitador orbital e, em seguida, incubados a 37°C durante 2 horas. Para as amostras, 30 µL de Reagente NLpoly foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente. O Reagente NLpoly continha o fragmento de NLpoly e um inibidor de aminopeptidase. Após 30 minutos, 50 µL de reagente de ensaio NanoGlo® foram adicionados e a luminescência foi registrada após 3 minutos em um luminômetro. Verificou-se que um aumento na atividade da enzima quinase SRC está correlacionado a um aumento na luminescência em relação ao fundo (Figura 199). Apenas atividade de fundo foi encontrada quando SRC não estava presente, indicando que o substrato peptídico NLpep-SRC não- fosforilado foi digerido, resultando na ausência de produção de luz pelo fragmento de NLpoly, demonstrando, assim, a utilização do método da presente invenção para monitorar a atividade de uma enzima transferase tal como uma quinase.

EXEMPLO 102 DETECÇÃO DE RNAS ESPECÍFICOS (RNA NÃO-CODIFICANTE OU RNAM) DE INTERESSE EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS, LISADOS CELULARES OU AMOSTRAS CLÍNICAS

[0433] O peptídeo não luminescente (NLpep) e o polipeptídeo não luminescente (NLpoly) da presente invenção podem ser ligados a um domínio de ligação ao RNA (RBD) com especificidade manipulada de sequência. A especificidade do RBD pode ser alterada com precisão, alterando aminoácidos únicos que conferem a especificidade de bases do RBD. Um exemplo de tal RBD é o domínio Pumilio humano (aqui referido como PUM). O código de reconhecimento do RNA de PUM foi muito bem estabelecido. PUM é composto por oito repetições em tandem (cada uma consiste em repetição de 34 aminoácidos que se dobram em domínios firmemente empacotados compostos de alfa-hélices). Os aminoácidos conservados do centro de cada repetição fazem contatos específicos com bases individuais dentro da sequência de reconhecimento do RNA (composta por oito bases). A especificidade de sequência do PUM pode ser alterada precisamente, alterando o aminoácido conservado (por mutagênese dirigida ao sítio) envolvido no reconhecimento de bases dentro da sequência de reconhecimento do RNA. Para a detecção de RNAs específicos na célula, os domínios PUM (PUM1 e PUM2) com especificidades de sequência personalizadas para o RNA-alvo podem ser ligados a um NLpep e NLpoly da presente invenção (por exemplo, como uma proteína de fusão genética através de engenharia genética) e podem ser expressos em células de mamífero. PUM1 e PUM2 são elaborados para reconhecer sequências de 8 nucleotídeos no RNA-alvo que estão próximos entre si (separados por apenas alguns pares de bases, determinadas experimentalmente). A interação ideal de PUM1 e PUM2 à sua sequência-alvo é garantida através da introdução de um ligante flexível (sequência e comprimento do ligante a serem determinados experimentalmente), que separa o PUM e o peptídeo não luminescente e polipeptídeo não luminescente. A ligação do PUM1 e PUM2 à sua sequência-alvo irá fazer com que NLpep e NLpoly se aproximem em uma orientação que resulta na formação de um complexo funcional capaz de gerar sinal bioluminescente em nossa condição específica de ensaio. Complexo bioluminescente funcional não seria gerado na ausência do RNA-alvo devido à interação instável dos pares de NLpep e NLpoly que constituem o complexo.

[0434] Uma estratégia semelhante também pode ser utilizada para a detecção de RNA em amostras clínicas in vitro. As proteínas de fusão NLpep-PUM com especificidade personalizada de RNA podem ser expressas e purificadas a partir do sistema de expressão proteica adequado (tal como E. coli ou sistema de expressão proteica de mamíferos). Componentes purificados podem ser adicionados à amostra biológica, juntamente com componentes adequados de substrato e de ensaio, para gerar o sinal bioluminescente.

EXEMPLO 103 DETECÇÃO À BASE DE OLIGO-DNA DE RNA ESPECÍFICO (RNA NÃO-CODIFICANTE OU RNAM) EM AMOSTRAS CLÍNICAS OU LISADOS DE CÉLULAS DE MAMÍFERO

[0435] Um peptídeo não luminescente (NLpep) e um polipeptídeo não luminescente (NLpoly) da presente invenção podem ser ligados a oligonucleotídeos complementares ao RNA-alvo com o ligante adequado (aminoácidos ou nucleotídeos). A montagem funcional do complexo bioluminescente ocorre somente quando a hibridização específica da sequência do oligo-DNA para o seu RNA-alvo faz com que o NLpep e NLpoly se aproximem em uma conformação ideal ótima para a geração de um sinal bioluminescente nas condições de ensaio. A detecção também pode ser obtida através de um sistema de complementação de três componentes que envolve dois NLpeps e um terceiro NLpoly. Por exemplo, dois conjugados NLpep-DNA serão misturados com o RNA-alvo. A montagem funcional do complexo bioluminescente é obtida pela adição subsequente do terceiro NLpoly. Assim, se um sinal detectável for produzido nas condições específicas de ensaio usando uma amostra clínica ou lisado celular, a presença do RNA-alvo em tal amostra é inferida. Tais ensaios são úteis para a detecção de RNAs originados de agentes infecciosos (RNAs virais) e biomarcadores de RNA específicos (implicados em muitas condições de doença, tais como várias formas de câncer, doenças hepáticas e doenças cardíacas), e podem proporcionar um novo caminho para o diagnóstico e prognóstico de muitas condições de doença.

EXEMPLO 104 AQUISIÇÃO DE IMAGENS IN VIVO

[0436] Produtos derivados da biotecnologia (biológicos), incluindo anticorpos, peptídeos e proteínas, reservam grandes promessas como agentes terapêuticos. Ao contrário de fármacos de pequenas moléculas, os agentes biológicos são moléculas grandes com estruturas secundárias e terciárias e que, muitas vezes, contêm modificações pós-traducionais. Internalização, tráfico intracelular, biodistribuição, farmacocinética e farmacodinâmica (PK/PD), imunogenicidade, etc. dos agentes biológicos diferem significativamente dos fármacos de moléculas pequenas, e há uma necessidade de novas ferramentas para “rastrear” estes anticorpos in vivo. A marcação química convencional com repórteres enzimáticos (HRP, luciferase, etc.) ou pequenas marcações fluorescentes podem alterar significativamente o valor terapêutico dos agentes biológicos e não são ideais para imagens in vivo utilizando agentes biológicos. A marcação por radioisótopos para imagens à base de PET também não é conveniente.

[0437] Os NLpolis e NLpeps aqui descritos oferecem uma nova solução para a aquisição de imagens in vivo dos agentes biológicos. O NLpep pode ser geneticamente codificado para uma terapia biológica, sem quaisquer etapas de síntese. A codificação genética permite o controle preciso sobre a quantidade de peptídeo por molécula biológica, bem como a sua posição, minimizando assim qualquer perturbação ao seu valor terapêutico. Para a aquisição de imagens, um NLpoly juntamente com substrato, por exemplo, furimazina, pode ser injetado no animal. Se o NLpep-agente biológico e NLpoly interagirem, luminescência seria gerada. Alternativamente, um animal transgênico que expresse NLpoly pode ser usado como um sistema modelo.

EXEMPLO 105 APLICAÇÕES DA BRET

[0438] Este conceito mede fundamentalmente três frações juntas. Dois dos NLpolis e/ou NLpeps formam um complexo, e a terceira fração, que é fluorescente ou bioluminescente, proporciona um componente de transferência de energia. Se o complexo formado for bioluminescente, a transferência de bioluminescência e energia (ou seja, BRET) pode ser medida. Se o complexo formado for fluorescente, a magnitude da transferência de energia pode ser medida se o terceiro componente for uma molécula bioluminescente. A) Este exemplo demonstra um corante fluorescente ligado a um NLpep. Alternativamente, uma proteína fluorescente pode ser fundida, por exemplo, a uma proteína de fusão, com um NLpoly ou NLpep (criado a partir de uma construção genética).

[0439] Lisado clarificado de E. coli de NLpoly WT foi preparado tal como descrito anteriormente. 40 uL de lisado de NLpoly WT foram misturadas com 10 uL de pBI-4730 (NLpep1) ou pBI-4877 (NLpep1-TMR) e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de furimazina 100 uM em HEPES 50 mM pH 7,4 foram adicionados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida ao longo de 400-700 nm em TECAN M1000.

[0440] A Figura 147 ilustra uma transferência de energia muito eficiente do complexo NLPoli/NLPep (doador) para TMR (aceitador), e a alteração corresponde do vermelho no comprimento de onda da luz a ser emitida. B) Este exemplo demonstra o uso de BRET na detecção, como na detecção da concentração ou atividade enzimática da molécula pequena. Uma vez que a transferência de energia é fortemente dependente da distância, a magnitude da transferência de energia pode estar muitas vezes relacionada à conformação do sistema. Por exemplo, a inserção de um polipeptídeo que quela o cálcio pode ser utilizada para medir a concentração de cálcio por meio da modulação da transferência de energia.

[0441] Uma enzima que também altera a distância, causando uma alteração conformacional do sensor como apresentado acima ou por meio de clivagem do sensor a partir da fração fluorescente, pode ser medida através de um sistema tal como aqui descrito. Um NLpoly ou NLpep ligado a uma fração fluorescente fornece transferência de energia quando o NLpoly e NLpep interagem. Um exemplo disto é um sensor peptídico que tenha sido produzido, em que o NLpep está conjugado com um corante fluorescente TOM através de um ligante DEVD (sítio de clivagem da caspase-3). Quando exposta ao NLpoly, a transferência de energia é observada. Quando exposta à caspase-3, a transferência de energia é eliminada, porém luminescência em 460 nm permanece.

[0442] NLpoly 5A2 e NL-HT (NanoLuc fundido com HaloTag) foram purificados. 20 uL de NL-HT 8 pM foram misturados com 20 uL de PBI-3781 100 nM (Ver, por exemplo, Pedido de Pat. US N.° de série 13/682.589, aqui incorporado por referência em sua totalidade) e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. 40 uL de NanoGlo+furimazina 100 uM foram adicionados, e a luminescência foi medida ao longo de 300-800 nm em TECAN M1000.

[0443] 20 uL de 33 ng/uL de NLpoly 5A2 foram misturados com 20 uL de PBI-5074 ~500 uM (TOM-NCT-NLpep). 40 uL de NanoGlo+furimazina 100 uM foram adicionados, e a luminescência foi medida ao longo de 300-800 nm em TECAN M1000.

[0444] A Figura 148 ilustra a transferência de energia do complexo NLPoli/NLPep (doador) para o corante TOM (aceitador), e a alteração correspondente do vermelho no comprimento de onda de luz a ser emitida. C) Interações ternárias

[0445] A transferência de energia com um NLpoly e NLpep também pode ser utilizada para medir três moléculas que interagem. Um exemplo seria um GPCR marcado com NLpoly e uma proteína de interação ao GPCR com NLpep que formam um complexo bioluminescente quando interagem. Isto permite a medição da interação binária. Se um ligante ao GPCR de molécula pequena portador de uma fração fluorescente adequada para a transferência de energia interagir com este sistema, a transferência de energia ocorrerá. Portanto, a interação binária proteína-proteína e a interação terciária proteína-proteína- fármaco podem ser medidas no mesmo experimento. Além disso, a molécula fluorescente só provoca um sinal ao interagir com um par proteico, o que elimina qualquer sinal do ligante interagindo com uma proteína inativa (Figura 149).

EXEMPLO 106 6-TETRAMETILRODAMINA-PEG3-NH2:

[0446] A uma solução de 6-tetrametilrodamina succidimidil éster (0,25 g, 0,5 mmol) em DMF (5 mL), 1-Boc-4,7,10-trioxatridecan-1,13-diamina (0,15 g, 0,5 mmol) foi adicionado seguido por diisopropiletilamina (0,25 mL, 1,4 mmol). Após agitação durante 16 h, a reação foi analisada por HPLC para confirmar o consumo completo do 6-tetrametilrodamina succidimil éster. A reação foi concentrada até se obter um filme rosa, o qual foi dissolvido em uma combinação de triisopropilsilano (0,2 mL) e ácido trifluoroacético (4 mL). A solução rosa foi agitada durante 2 h, tempo após o qual o HPLC analítico confirmou o consumo completo do material de partida. A reação foi concentrada até à secura para fornecer 6-tetrametilrodamina-PEG3-NH2 bruta como um filme rosa. H-GVTGWRLCERILA-PEG-TMR (PBI-4877):

[0447] O peptídeo totalmente protegido Boc-GVTGWRLCERILA- resina foi sintetizado por síntese peptídica padrão em fase sólida utilizando técnicas Fmoc, em seguida, clivado da resina utilizando ácido dicloroacético para liberar o peptídeo totalmente protegido como um sólido branco. A uma solução de 6-tetrametilrodamina-PEG3-NH2 (0,05 g, 0,08 mmol) em DMF (1,5 mL), este Boc-GVTGWRLCERILA-OH (0,2 g, 0,07 mmol), 1-hidroxiazabenzotriazol (11 mg, 0,08 mmol), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (15 mg, 0,08 mmol) e diisopropiletilamina (0,28 mL, 0,16 mmol) foram adicionados. Após agitação durante 30 minutos, a reação foi concentrada, e o produto bruto resultante foi dividido entre CH2Cl2 e água, as camadas foram separadas e a camada orgânica foi lavada com água e salmoura, secado sobre sulfato de sódio e concentrado. O sólido rosa resultante foi dissolvido em uma combinação de triisopropilsilano (0,2 mL) e ácido trifluoroacético (4 mL). Após agitação durante 3 h, a reação foi concentrada, e o filme rosa resultante foi purificado por HPLC de fase reversa utilizando um gradiente de ACN em TFA aquoso 0,1% para fornecer PBI-4877 como um pó rosa: MS (M+) calculado 2088,5, encontrado 2089,1. TOM-DEVDGVTGWRLCERILA-OH (PBI-5074):

[0448] O peptídeo totalmente protegido H- DEVDGVTGWRLCERILA-resina foi sintetizado por síntese peptídica em fase sólida utilizando técnicas padrão Fmoc. Enquanto ainda estava na resina, uma solução de 6-TOM (PBI-3739) succidimidil éster foi adicionada e deixada para reagir com a extremidade N-terminal livre. O peptídeo foi então clivado da resina e totalmente desprotegido usando ácido trifluoroacético (TFA) para resultar em um sólido azul. Este sólido foi purificado por HPLC de fase reversa utilizando um gradiente de ACN em TFA aquoso 0,1% para fornecer PBI-5074 como um pó azul: MS (M+Z/2) calculado 1238,9, encontrado 1238,8.

EXEMPLO 107 COMPARAÇÃO DA COMPLEMENTAÇÃO ENTRE UM NLPEP78 SINTÉTICO, DE FUSÃO N-TERMINAL E DE FUSÃO C-TERMINAL

[0449] As fusões de NLpep78-HaloTag (78-HT) e HaloTag- NLPep78 (HT-78) foram quantificadas, com uma fusão de GST-HaloTag® (GST- HT) como controle, pela marcação de lisados de E. coli com o ligante HaloTag- TMR®, separadas por SDS-PAGE, e digitalizadas em Typhoon. Uma curva padrão foi então criada usando concentrações conhecidas de GST-HT padrão, e as intensidades das bandas de 78-HT e HT-78 foram utilizadas para determinar suas concentrações.

[0450] Lisados de E. coli contendo NLpoli11S foram diluídos 1:107 em PBS pH 7+Prionex 0,1%. As diluições em série de 78-HT, HT-78 e NLpep78 sintético foram feitas em PBS pH 7+Prionex 0,1%. 20 uL de NLpoli11S e 20 uL de um dos NLPep foram misturados e incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. 40 uL de reagente NanoGlo® (Promega Corporation) + Fz 100 uM foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi medido em GlomaxMulti+ usando integração de 0,5 s. Os dados foram ajustados para ligação específica a um único sítio utilizando GraphPad Prism para determinar Bmax e Kd.

[0451] Os resultados (Figura 150) comparam a ligação de NLpoli11S ao NLPep78 sintético e NLPep78 na extremidade N- ou C-terminal de um parceiro de fusão (HaloTag). As afinidades de ligação não se alteraram significativamente, mas Bmax foi reduzida quando NLPep78 estava na extremidade C-terminal.

EXEMPLO 108 COMPARAÇÃO DA COMPLEMENTAÇÃO ENTRE UM NLPEP79 SINTÉTICO, DE FUSÃO N- TERMINAL E DE FUSÃO C-TERMINAL

[0452] As fusões de NLpep79-HaloTag (79-HT) e HaloTag- NLPep79 (HT-79) foram quantificadas, com uma fusão de GST-HaloTag® (GST- HT) como controle, pela marcação de lisados de E. coli com o ligante HaloTag- TMR®, separadas por SDS-PAGE, e digitalizadas em Typhoon. A curva padrão foi então criada usando concentrações conhecidas de GST-HT padrão, e as intensidades das bandas de 79-HT e HT-79 foram utilizadas para determinar suas concentrações.

[0453] Lisados de E. coli contendo NLpoli11S foram diluídos 1:107 em PBS, pH 7+Prionex 0,1%. As diluições em série de 79-HT, HT-79 e NLpep79 sintético foram feitas em PBS pH 7+Prionex 0,1%. 20 uL de NLpoli11S e 20 uL de um dos NLPep foram misturados e incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. 40 uL de reagente NanoGlo® (Promega Corporation) + Fz 100 uM foram adicionados, e as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi medida em GlomaxMulti+ usando integração de 0,5 s. Os dados foram ajustados para ligação específica a um único sítio utilizando GraphPad Prism para determinar Bmax e Kd.

[0454] Os resultados (Figura 151) comparam a ligação de NLpoli11S ao NLPep79 sintético e NLPep79 na extremidade N- ou C-terminal de um parceiro de fusão (HaloTag). As afinidades de ligação não se alteraram significativamente, mas Bmax foi reduzida quando NLPep79 estava na extremidade C-terminal.

EXEMPLO 109 EXAME ESPECTRAL DE NLPOLIIIS COM NLPEP86 EM COMPARAÇÃO A PBI-4877 (NLPEPI -FLUORÓFORO)

[0455] NLpoli11S purificado foi diluído para 1 nM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + TDT 1 mM. NLPep86 ou PBI-4877 foi diluído para 40 uM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM. 25 uL de NLpoli11S e 25 uL de NLPep86 ou PBI- 4877 foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 uL de tampão (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM) + Fz 100 uM foram então adicionados. A luminescência foi medida em Tecan Infinite M1000: 300800 nm, a cada 5 nm, largura de banda de 10 nm, ganho de 127, integração de 0,5 s, posição z de 22.000 um.

[0456] Os resultados demonstram (Figura 152) que o NLPep pode ser conjugado com moléculas pequenas, tais como corantes fluorescentes, e manter a interação com NLpoli11S para produzir luminescência. Isto também demonstra a transferência eficiente de energia e a capacidade de alterar os espectros de emissão.

EXEMPLO 110 EXAME ESPECTRAL DE NLPOLIIIS COM NLPEP86 EM COMPARAÇÃO A PBI—5434 (FLUORÓFORO-NLPEPI)

[0457] NLpoli11S purificado foi diluído para 1 nM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + TDT 1 mM. NLPep86 ou PBI-5434 foi diluído para 40 uM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM. 25 uL de NLpoly 11S e 25 uL de NLPep86 ou PBI-5434 foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 uL de tampão (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM) + Fz 100 uM foram então adicionados. A luminescência foi medida em Tecan Infinite M1000: 300-800 nm, a cada 5 nm, largura de banda de 10 nm, ganho de 127, integração de 0,5 s, posição z de 22.000 um.

[0458] Os resultados demonstram (Figura 153) que o NLPep pode ser conjugado com moléculas pequenas, tais como corantes fluorescentes, e manter a interação com 11S para produzir luminescência. Isto, juntamente com os resultados com PBI-4877 no Exemplo 109, também sugere que a extremidade terminal e/ou o comprimento do ligante utilizado para a conjugação podem afetar significativamente a transferência de energia.

EXEMPLO 111 EXAME ESPECTRAL DE NLPOLIIIS COM NLPEP86 EM COMPARAÇÃO A PBI-5436 (FLUORÓFORO-NLPEPI)

[0459] NLpoli11S purificado foi diluído para 1 nM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + TDT 1 mM. NLPep86 ou PBI-5436 foi diluído para 40 uM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM. 25 uL de NLpoly 11S e 25 uL de NLPep86 ou PBI-5436 foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 10 minutos. 50 uL de tampão (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM) + Fz 100 uM foram então adicionados. A luminescência foi medida em Tecan Infinite M1000: 300-800 nm, a cada 5 nm, largura de banda de 10 nm, ganho de 127, integração de 0,5 s, posição z de 22.000 um.

[0460] Os resultados demonstram (Figura 154) que o NLPep pode ser conjugado com moléculas pequenas, tais como corantes fluorescentes, e manter a interação com 11S para produzir luminescência. Isto também demonstra a transferência eficiente de energia e a capacidade de alterar os espectros de emissão.

EXEMPLO 112 COMPARAÇÃO DE VALORES DE KM PARA 11S COM VÁRIOS NLPEPS EM TAMPÃO DE AFINIDADE

[0461] NLpoli11S purificado foi diluído para 40 pM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005% (tampão de afinidade) ou reagente de ensaio NanoGlo (Promega Corporation). NLPeps (NLpep86, 78, 99, 101, 104, 128 e 114) foram diluídos para 400 uM (NLPep para 1 mM) em tampão de afinidade ou reagente de ensaio NanoGlo. 300 uL de NLpoli11S e 300 uL de um NLPep foram misturados e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 uL foram então adicionados a um poço de placas brancas de 96 poços. 50 uL de tampão de afinidade + Fz 2x (12,5 uM diluído em 2 vezes por 7 vezes) ou 50 uL de NanoGlo + Fz 2x (100 uM diluído em 2 vezes por 7 vezes) foram adicionados a cada poço, e a luminescência foi medida em um Glomax Multi+ usando integração de 0,5 s. A Km foi determinada utilizando GraphPad Prism, Michaelis-Menten.

[0462] Os resultados demonstram ligação ao substrato em tampão de afinidade (Figura 155) ou tampão de ensaio NanoGlo (Figura 156) para o complexo entre NLpoli11S e vários NLPeps. Os valores determinados de Km não oscilam significativamente com os NLPeps indicados.

EXEMPLO 113 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DO NLPEPI AO NLPOLIIIS EM VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE FURIMAZINA

[0463] NLpoli156 e NLpoli11S purificados foram diluídos para 40 pM em tampão de afinidade (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005%). NLPep1 sintético (WT) foi diluído para 560 uM para NLpoli156 ou 80 uM para NLpoli11S em tampão de afinidade e, em seguida, diluído em série em três vezes para produzir 8 concentrações. 350 uL de NLPep1 e 350 uL de NLPoli156 ou 11S foram misturados e, em seguida, incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 uL foram então aliquotados para um poço de uma placa branca de ensaio de 96 poços. Fz foi adicionada ao tampão de afinidade para 40, 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 uM, 50 uL de Fz/tampão de afinidade foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. A luminescência foi medida em um Glomax Multi+ com integração de 0,5 s. GraphPad Prism e ligação específica a um único sítio foram usados para calcular a Kd para cada concentração de Fz.

[0464] Os resultados (Figura 157) indicam a alteração na afinidade (NLPoli/NLPep) com concentrações crescentes de Fz.

EXEMPLO 114 VALORES DE KM DA FURIMAZINA PARA NLPOLI156/NLPEP1 E NLPOLI11S/NLPEP1 EM VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE NLPEPI

[0465] NLpoli156 e NLpoli11S purificados foram diluídos para 40 pM em tampão de afinidade (PBS pH 7+ Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005%). NLPep1 sintético (WT) foi diluído para 560 uM para NLpoli156 ou 80 uM para NLpoli11S em tampão de afinidade e, em seguida, diluídos em série em três vezes para produzir 8 concentrações. 50 uL foram então aliquotados para um poço de uma placa branca de ensaio de 96 poços. Fz foi adicionada ao tampão de afinidade para 40, 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 uM, 50 uL de Fz/tampão/afinidade foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. A luminescência foi medida em um Glomax Multi+ com integração de 0,5 s. GraphPad Prism e ligação específica a um único sítio foram usados para calcular a Kd, para cada concentração de NLPep1.

[0466] Os resultados (Figura 158) indicam a alteração na afinidade (NLPoli/NLPep) com concentrações crescentes de NLPep1.

EXEMPLO 115 COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE MÁXIMA PARA NLPOLI156/NLPEP1, NLPOLIIIS/NLPEPI E LUCIFERASE NANOLUC®

[0467] NLPoli156, NLPoli11S ou luciferase NanoLuc® (Nluc) purificados foram diluídos para 40 pM em tampão de afinidade (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005%). NLPep1 sintético (WT) foi diluído para 560 uM para NLPoli156 ou 80 uM para NLPoli11S em tampão de afinidade e, em seguida, diluídos em série em 3 vezes para produzir 8 concentrações. 350 uL de NLPep1 (ou tampão de afinidade) e 350 uL de NLPoli (ou Nluc) foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 uL foram então aliquotados para um poço de uma placa branca de ensaio de 96 poços. Fz foi adicionada ao tampão de afinidade para 40, 20, 10, 5, 2,5 e 1,25 uM, 50 uL de Fz/tampão de afinidade foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. A luminescência foi medida em um Glomax Multi+ com integração de 0,5 s. GraphPad Prism e equação de Michaelis-Menton foram usados para calcular a Vmax em cada concentração de NLPep (entrada de valores calculados de Vmax em cada concentração de NLPep1 na ligação específica a um único sítio para calcular Bmax). GraphPad Prism e ligação específica em um único sítio foram usados para calcular Bmax em cada concentração de Fz (entrada de valores calculados de Bmax em cada concentração de Fz na equação de Michaelis-Menton para calcular Vmax).

[0468] Os resultados (Figura 159) demonstram a atividade máxima de NLPoli156 ou NLPoli11S após a ativação por NLPep1 em relação à atividade máxima da luciferase NanoLuc.

EXEMPLO 116 VALORES LUMINESCENTES RESULTANTES DA TITULAÇÃO DE NLPOLIIIS COM VÁRIOS NLPEPS

[0469] NLPoli11S purificado foi diluído para 40 pM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005% (tampão de afinidade). NLPeps sintéticos (NLPep86, 78, 79, 99, 101, 104, 114, 128 ou wt) foram diluídos em tampão de afinidade como se segue: NLPep86 = 60 nM, NLPep78 = 280 nM, NLPep79 = 800 nM, NLPep99 = 4 uM, NLPep101 = 34 uM, NLPep104 = 20 uM, NLPep128 = 4 uM, NLPep114 = 4,48 mM e NLPep WT = 20 uM. 25 uL de NLPoli11S e 25 uL de um NLPep foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 uL de tampão de afinidade + Fz 20 uM foram então adicionados a cada mistura, e a luminescência foi medida em um GlomaxMulti+ usando integração de 0,5 s. Os valores de Bmax e Kd foram determinados utilizando GraphPad Prism e ligação específica a um único sítio.

[0470] Os resultados (Figura 160) demonstram intervalo de ~100.000 vezes das afinidades usando NLPoli11S e vários NLPeps. Observou-se uma perda mínima em Bmax entre os NLPeps de alta afinidade e baixa afinidade.

EXEMPLO 117 WESTERN BLOT DE NLPOLI156, NLPOLIIIS E LUCIFERASE NANOLUC® APÓS TRANSFECÇÃO EM CÉLULAS HEK293T

[0471] No dia 1, uma mistura de transfecção de 2 ng de DNA de NLPoli156, NLPoli11S ou luciferase NanoLuc® (Nluc), 1 ug de DNA transportador pGEM3Zf(+), 4 uL de Fugene HD (Promega Corporation) e OptiMEM isento de vermelho de fenol para 100 uL foi feita e incubada à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura de transfecção foi então transferida para um poço de uma placa de 6 poços, e 2 mL de células HEK293T em 400.000 células/mL (total de 800.000 células) foram adicionados. As células foram incubadas durante a noite a 37°C.

[0472] No dia 2, as células foram lavadas com DMEM isento de vermelho de fenol, 500 uL de DMEM isento de vermelho de fenol foram adicionados a cada poço, e as células foram congeladas a -70°C durante pelo menos 30 minutos. As células foram então descongeladas, 500 uL foram transferidos para tubo de microcentrífuga e 20 uL foram misturados com 80 uL de tampão de aplicação SDS 1,25x e incubados a 95°C durante 5 minutos. 10 uL foram aplicados em um gel de Bis-Tris NuPAGE 10% com tampão de corrida MES. A proteína foi transferida para PVDF utilizando iBlot, e a membrana foi lavada em metanol. A membrana foi então bloqueada em TBST+BSA 5% durante 1 h à temperatura ambiente, lavada 3 vezes em TBST e, em seguida, incubada com 10 mL de TBST + 2 uL de anticorpo policlonal de coelho anti-Nluc + 2 uL de anticorpo policlonal de coelho anti-ß-actina (Abcam #ab8227) a 4°C durante a noite.

[0473] No dia 3, a membrana foi lavada 3 vezes em TBST, incubada com 10 mL de TBST + 2 uL de anticorpo conjugado anti- HRP de coelho durante 1 h à temperatura ambiente, lavada novamente 3 vezes com TBST e incubada com 12 mL de Substrato ECL de Western Blotting durante 1 minuto. A quimiluminescência teve sua imagem captada por LAS 4000 Image Quant.

[0474] Os resultados (Figura 161) mostram o nível de expressão do NLPoli em comparação à luciferase NanoLuc® de comprimento completo. NLPoli156 não se expressa, bem como luciferase NanoLuc® (Nluc), enquanto NLPoli11S se expressa de forma semelhante à Nluc.

EXEMPLO 118 DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA AFINIDADE DE NLPOLI11S/NLPEP114 SOBRE A INTERAÇÃO ENTRE UMA B-LACTAMASE (SME) E PROTEÍNA INIBITÓRIA DA B-LACTAMASE(BLIP) E COMPARAÇÃO ENTRE OS VALORES DE AFINIDADE MEDIDOS ATRAVÉS DA ATIVIDADE DE 11S/114 E B-LACTAMASE PURIFICAÇÃO PROTEICA

[0475] pF1K-sinal-6H-SME, pF1K-sinal-6H-SME-11S, pF1K- sinal-6H-BLIPY50A e pF1K-sinal-6H-BLIPy50A-114 (vetores Promega Flexi para a expressão à base do promotor T7 da proteína recombinante em E. coli; o sinal refere-se ao peptídeo sinal nativo para SME ou BLIP) foram induzidos com ramnose para se expressarem no periplasma de células KRX a 25°C durante 18-20 horas. As células foram sedimentadas e ressuspensas em reagente de lise B-Per (Pierce; 1/50 do volume de cultura) e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. O lisado foi então diluído pela adição de Tris 20 mM 1,5x pH 8 + NaCl 500 mM e centrifugado a 12.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo limpo, 1 mL de RQ1 DNAase (Promega Corporation) foi adicionado e centrifugado novamente a 12.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi purificado na coluna HisTALON (Clontech) com Tris 25 mM pH 8 e NaCl 500 mM de tampão de aplicação e eluído com Tris 25 mM pH 8, NaCl 500 mM e imidazol 50 mM. A proteína eluída foi dialisada em Tris 25 mM pH 7,5 e NaCl 25 mM e purificada em coluna HiTrap Q FF (GE Healthcare) com Tris 25 mM pH 7,5 e NaCl 25 mM de tampão de aplicação e eluída com Tris 25 mM pH 7,5 e NaCl 125 mM. A força iônica foi ajustada para uma concentração final de NaCl 150 mM e concentrada utilizando um concentrador Vivaspin.

ENSAIO

[0476]BLIPY50A e BLIPY50A-114 foram diluídas para 312,5 nM em tampão de afinidade (PBS pH 7, Prionex 0,01%, Tergitol 0,005%, DTT 1 mM) e então diluídas em série em 1,5 vezes. SME e SME-11S foram diluídas para 0,2 nM em tampão de afinidade. 11,11 uL de SME e 88,89 uL de BLIP foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 2 horas. 90 uL da mistura foram transferidos para uma placa transparente de 96 poços com 10 uL Nitrocefin 100 uM (Calbiochem em tampão de afinidade). 90 uL de SME-11S/BLIPY50A-114 foram transferidos para uma placa branca de 96 poços com 10 uL de Fz 100 uM (em tampão de afinidade). A absorbância (nitrocefin) foi medida em 486 nm a cada 15 segundos durante 30 minutos, e a luminescência (Fz) foi medida a cada 2 minutos durante 30 minutos.

[0477] Para nitrocefin, as velocidades iniciais foram ajustadas usando Excel. As velocidades iniciais vs. concentração de BLIP foram representadas graficamente. Ki foi ajustada utilizando E_ livre= [^]-( [^_0]+ [/_0]+^_app-V(( [F_0]+ [/_0]+^_app)A2-(4 [F_0] [/_0])))/2 e K_app=K_i (1+( [S])/K_M). Para Fz, Kd foi ajustada usando RLU=(Bmax x [BLIP-114])/( [BLIP-114]+K_D).

[0478] Os resultados (Figura 162) comparam a afinidade de uma interação proteica (a SME ß-lactamase e seu inibidor BLIPY50A) como proteínas não fundidas com a afinidade quando NLPoli e NLPep são fundidos a elas e demonstram que a afinidade entre NLPoli11S e NLPep114 não resulta em um aumento da afinidade aparente para a interação SME/BLIPY50A. Isto também demonstra a utilização de NLPoli11S e NLPep114 para medir a constante de ligação no equilíbrio para uma interação proteica, e que a afinidade medida através de NLPoli11S e NLPep114 é consistente com a afinidade medida pela atividade da proteína- alvo (SME).

EXEMPLO 119 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB-NLPOLl11S COM FKBP-NLPEP1O1 E 111- 136

[0479]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 1 ng de DNA plasmidial de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag NLpep101 ou FKBP-111-136 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final), com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0480]A Figura 163 demonstra que, das combinações testadas, NLpoli11S com NLpep114 mostra a maior indução pela rapamicina e um dos sinais luminescentes mais fortes específicos da rapamicina.

EXEMPLO 120 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM DIFERENTES COMBINAÇÕES DE FRB-NLPOLIIIS COM FKBP-NLPEP114 E 137- 143

[0481]Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 1 ng de DNA plasmidial de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP- Nepep114 ou 137-143 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0482]A Figura 164 demonstra que, das combinações testadas, NLpoli11S com NLpep114 mostra a maior indução pela rapamicina e um dos sinais luminescentes mais fortes específicos da rapamicina.

EXEMPLO 121 CURVA DE DOSE-RESPOSTA DA RAPAMICINA DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLI11S E FKBP-NLPEP78/79/99/101/104/114/128

[0483] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de DNA plasmidial de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP- NLpep78/79/99/101/104/128 usando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com 0 a 300 nM de rapamicina durante 2 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final) com 0 a 300 nM de rapamicina em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. Graphpad Prism foi usado para ajustar os dados à curva sigmoidal e calcular valores de EC50.

[0484]Figura 165 mostra dose-resposta sigmoidal à rapamicina para NLpoli11S com NLpep78/79/99/101/104/114/128. Das combinações representadas graficamente, NLpoli11S com NLpep114 mostra o maior intervalo dinâmico.

EXEMPLO122 RESPOSTA DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM FRB-NLPOLI11S E FKBP- 78/79/99/101/104/114/128 AO INIBIDOR COMPETITIVO DA RAPAMICINA, FK506

[0485] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços com um total de 0,1 ng de DNA plasmidial de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP- NLpep78/79/99/101/104/114/128 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e, em seguida, OptiMEMI isento de vermelho de fenol com rapamicina 10 nM foi adicionado durante 2 h. O inibidor FK506 em OptiMEM foi adicionado às células em concentrações finais de 0 a 50 µM e incubado durante 3 h. Furimazina em OptiMEM foi adicionada às células para uma concentração final de 10 µM nas células. A luminescência foi imediatamente lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s. Graphpad Prism foi usado para representar graficamente os dados, ajustados a uma curva sigmoidal, e calcular os valores de IC50.

[0486] A Figura 166 demonstra reduções dose-dependentes no sinal induzido pela rapamicina de FRB-NLpoli11S e FKBP-78/79/99/101/104/114/128 com o inibidor competitivo da rapamicina, FK506.

EXEMPLO 123 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS TRANSFECTADAS COM DIFERENTES PROPORÇÕES DE FRB-NLPOLIIIS E FKBP-NLPEP114

[0487] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas de forma reversa em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços com 1 ng de DNA plasmidial de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e 0,01; 0,1; 1, 10 ou 100 ng de pF4A Ag FKBP-NLpep114 utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8. As células HEK293T (20.000) também foram transfectadas de forma reversa com 1 ng de pF4A Ag FKBP-NLpep114 e 0,01; 0,1; 1, 10 ou 100 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S. Em ambas as situações, DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 µg. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM durante 1,5 h. Substrato furimazina 10 µM (concentração final) com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI foi adicionado diretamente a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. A luminescência foi então lida em um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0488] A Figura 167 demonstra que uma proporção de DNA de 1:1 gerou a maior indução pela rapamicina, embora uma indução significativa tenha sido observada em todas as proporções testadas de DNA.

EXEMPLO 124 COMPARAÇÃO DA LUMINESCÊNCIA GERADA POR CÉLULAS QUE EXPRESSAM FUSÕES DE NLPOLII 1S/NLPEP114 COM FRB/FKBP EM ORIENTAÇÕES DIFERENTES E COM DIFERENTES COMPRIMENTOS DE LIGANTE

[0489] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas em poços de placas de 96 poços com vetores que expressam combinações de fusões N- e C- terminais de pF4Ag NLpoli11S e pF4Ag NLpep114 com FRB ou FKBP. Nestas construções, NLpoli11S/NLpep114 foram separados dos seus parceiros de fusão por um ligante de 4, 10 ou 15 serinas/glicinas. 0,1 ng de DNA de NLpoli11S e 14 foi transfectado por poço em uma razão de DNA para FugeneHD de 1 para 8. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e depois incubadas em OptiMEMI isento de vermelho de fenol com ou sem rapamicina 50 nM em OptiMEMI durante 2 h. Substrato Furimazina 10 µM foi então adicionado e, após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, a placa foi lida usando um GloMax Multi com tempo de integração de 0,5 s.

[0490] A Figura 168 ilustra um aumento específico da rapamicina em RLU independentemente da orientação da fusão ou comprimento do ligante.

EXEMPLO 125 COMPARAÇÃO DA CURVA DE DOSE-RESPOSTA DA RAPAMICINA E CURSO TEMPORAL GERADA POR FRB-NLPOLI11S/FKBP-NLPEP114 E SISTEMAS DE COMPLEMENTAÇÃO DIVIDIDOS DOS VAGA-LUMES

[0491] Células HEK293T (800.000) foram transfectados em poços de placas de 6 poços com um total de 20 ng de pF4A Ag FRB-NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep114 ou 750 ng de pF4A Ag N-Fluc(1-398)-FRB e FKBP-C-Fluc(394- 544) utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 ug. Vinte e quatro horas após a transfecção, 20.000 células foram replaqueadas em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 h.

[0492] Para os experimentos de dose-resposta (Figura 169A), células expressando NLpoli11S/NLpep114 foram tratadas com rapamicina 0-1 µM em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 3 h e, em seguida, incubadas com furimazina 10 µM durante 5 minutos antes do registro da luminescência em GloMax Multi. As células expressando N-Fluc(1-398)/C-Fluc(394-544) foram incubadas com rapamicina 0-1 µM em meio isento de vermelho de fenol durante 2 h, seguido pela incubação por 1 h adicional na presença de D-Luciferina 4 mM, antes do registro da luminescência em GloMax Multi.

[0493] Para os experimentos de curso temporal (Figura 169B), células expressando NLpoli11S/NLpep114 foram tratadas com 0 ou 50 nM de rapamicina em OptiMEMI isento de vermelho de fenol adicionado através de injetor GloMax Multi, e a luminescência foi imediatamente medida. As células expressando N-Flu(1-398)/C- Flu(394-544) foram tratadas com D-luciferina 4 mM em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 1 h seguido pela adição de 0 ou 50 nM de rapamicina através do injetor e medição da luminescência por GloMax Multi. As curvas foram ajustadas usando o software GraphPad Prism 6. As Figura 169A-B demonstram que NLpoli11S/NLpep114 e sistemas de complementação divididos dos vaga-lumes respondem de forma dependente da rapamicina, gerando curvas sigmoidais de dose-resposta e valores de EC50 semelhantes. O sistema NLpoli11S/NLpep114 exibe cinética de associação mais rápida e um maior sinal máximo.

EXEMPLO 126 COMPARAÇÃO DA CURVA DOSE-RESPOSTA DEFK506 E CURSO TEMPORAL GERADA PRO FRB-NLPOLI11S/FKBP-NLPEP114 E SISTEMAS DE COMPLEMENTAÇÃO DIVIDIDOS DOS VAGA-LUMES

[0494]Células HEK293T (800.000) foram transfectadas em poços de placas de 6 poços com um total de 20 ng de pF4A Ag FRB- NLpoli11S e pF4A Ag FKBP-NLpep114 ou 750 ng de pF4A Ag N-Fluc(1-398)- FRB e FKBP-C-Fluc(394-544) utilizando FuGENE HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 4. DNA de pGEM-3Zf(+) foi adicionado para levar o DNA total em cada transfecção para 1 ug. Vinte e quatro horas após a transfecção, 20.000 células foram replaqueadas em poços de placas opacas de ensaio de 96 poços e incubadas por mais 24 h. As células foram então tratadas com 0 ou 20 nM de rapamicina em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 3 h.

[0495] Para os experimentos de dose-resposta de FK506 (Figura 170A), as células foram incubadas com 0 a 100 µM do inibidor FK506 em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 5 h, tratadas com furimazina 10 µM e, em seguida, lidas com GloMax Multi no modo de luminescência com tempo de integração de 0,5 s. Para os experimentos de curso temporal (Figura 170B), as células foram tratadas com FK506 10 µM em OptiMEMI isento de vermelho de fenol contendo furimazina 10 µM e a luminescência foi imediatamente lida com GloMax Multi.

[0496] As Figuras 170A-B demonstram que NLpoli11S/NLpep114 e sistemas de complementação divididos dos vaga-lumes sistemas de complementação mostram uma redução dose-dependente na produção de luz após o tratamento com o inibidor FK506. A perda de sinal no sistema NLpoli11S/NLpep114 começa em um momento anterior, é mais rápida e é mais completa do que o sistema dividido de vaga-lumes.

EXEMPLO 127 WESTERN BLOT APRESENTANDO OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE FKBP- NLPEP114 E FKBP-FLUC(394-544)

[0497] Células HEK293T (200.000) foram transfectadas com 0 a 30 ng de DNA de pF4Ag NLpep114-FKBP ou pF4Ag FKBP-Fluc(394-544) usando FugeneHD em uma razão de DNA para Fugene de 1 para 8. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram coletadas com tampão de aplicação de gel SDS 1X. As amostras foram separadas em um gel de SDS-PAGE Tris- HCl 4-10% e transferidas para membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada em BSA 5% em TBST durante 1 hora e depois incubada com anti-FKBP (Abcam #ab2918) durante a noite. A incubação do anticorpo secundário com anticorpo de burro conjugado com peroxidase de rábano anti-IgG de coelho foi realizada durante 1 hora e, em seguida, o blot foi desenvolvido utilizando Substrato ECL de Western Blotting (Promega Corporation) e sistema Imagem Quant LAS 4000.

[0498] A Figura 171 demonstra os níveis semelhantes de expressão de FKBP-NLpep114 e FKBP-Fluc(394-544) em níveis iguais ao DNA transfectado.

EXEMPLO 128 INIBIÇÃO DOSE- E TEMPO-ESPECÍFICA DE NLPOLI11S-BRD4 E INTERAÇÃO HISTONA H3.3-NLPEP114 POR IBET-151

[0499] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas em poços de uma placa branca de ensaio de 96 poços com 10 ng de pF4Ag Histona H3.3- NLpep114 e NLpoli11S-NLpoli11S usando Fugene HD em uma razão de DNA para FuGENE de 1 para 8.

[0500] Para o experimento de dose-resposta (Figura 172A), as células foram tratadas com 0 a 10 µM de IBET-151 em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 4 h a 37°C e depois tratadas com furimazina 10 µM durante 5 minutos antes da leitura da luminescência com GloMax Multi.

[0501] Para o experimento de curso temporal (Figura 172B), as células foram pré-incubadas com furimazina 10 µM durante 5 minutos, tratadas com IBET-151 0-500 nM e imediatamente colocadas em um GloMax Multi para medições da luminescência a cada 5 minutos.

[0502] As Figuras 172A-B demonstram um declínio dose-dependente na luminescência após o tratamento com inibidor de BRD4, IBET-115, que ocorre dentro de 3 horas do tratamento, consistente com os relatos da literatura.

EXEMPLO 129 DIMERIZAÇÃO DE RAS/CRAF, BRAF/BRAF E CRAF/BRAF EM RESPOSTA A GDC0879

[0503] Células HEK293T (20.000) foram cotransfectadas em poços de placas de ensaio de 96 poços com combinações de pF4Ag NLpoli11S-BRAF, NLpoli11S-CRAF, NLpep114-KRAS ou NLpep114-BRAF usando um total de 0,1 ng de DNA por poço e Fugene HD em uma razão de 1 para 4. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com 0 a 10 µM do inibidor de BRAF, GDC0879, em OptiMEMI isento de vermelho de fenol durante 4 h. Substrato furimazina em OptiMEMI isento de vermelho de fenol foi adicionado para 10 µM, e a luminescência foi lida imediatamente com GloMax Multi ajustado para tempo de integração de 0,5 s.

[0504] A Figura 173 demonstra um aumento dose-dependente da dimerização de RAS/CRAF, BRAF/BRAF e CRAF/BRAF em resposta ao inibidor de BRAF, GDC0879.

EXEMPLO 130

[0505] Doze peptídeos sintéticos (Figura 180) foram investigados quanto à sua capacidade de complementar estruturalmente três versões diferentes de NLpoli11S (ou seja, 11S, 11S-aminoácido 157, 11S-aminoácidos 156 e 157). Os estoques de NLpoly foram feitos para 35 nM em reagente NanoGlo e os estoques de NLpep foram feitos para 12,5 nM em PBS pH 7,2. Volumes iguais foram misturados e as amostras foram medidas para luminescência em um leitor Tecan Infinite F500 (100 ms de tempo de integração; momento de 10 minutos) (Figura 200).

EXEMPLO 131 PEPTÍDEO NLPEP86 DE INTERAÇÃO ESPONTÂNEA

[0506]NLPoli11S purificado foi diluído para 40 pM em PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005% (tampão de afinidade). NLPeps sintéticos (NLPep86, WT, 114) foram diluídos em tampão de afinidade da seguinte forma: NLPep86 = 60 nM, NLPep114 = 4,48 mM e NLPep WT = 20 uM. 25 uL de NLPoli11S e 25 uL de um NLPep foram misturados e depois incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 uL de tampão de afinidade + Fz 20 uM foram então adicionados a cada mistura, e a luminescência foi medida em um Glomax Multi+ usando integração de 0,5 s. Os valores de Bmax e Kd foram determinados utilizando GraphPad Prism e ligação específica a um único sítio.

[0507] A Figura 174 demonstra um intervalo de ~100.000 vezes de afinidades usando NLPoli11S e vários NLPeps. Pep 86 é um exemplo de um peptídeo de interação espontânea (com LSP 11S), e Pep 114 é mostrado para referência como um peptídeo de baixa afinidade de interação.

EXEMPLO 132 TITULAÇÃO DE PEPTÍDEOS DE ALTA AFINIDADE IN VITRO

[0508] NLpoli11S purificado (purificação por HaloTag/expressão em E. coli; pFN18K) e o peptídeo sintético NLpep86 (obtido a partir de Peptide 2.0) foram titulados em um intervalo dinâmico linear utilizando NLpoli11S 33 nM em tampão de ensaio Nano-Glo® para NLpep86 de alta afinidade 3,3 fM - 100 nM. Para uma proteína de 30 kDa, isso corresponde ao LOD (limite de detecção) de 10 fg.

[0509] A Figura 176 demonstra o intervalo linear amplo e a capacidade de detectar concentrações fentomolares do peptídeo de alta afinidade marcador (NLpep86). Isso compete com os kits mais sensíveis de Western Blot (WB) + quimioluminescência intensificada (ECL).

EXEMPLO 133 UTILIDADE TIPO WESTERN BLOT DE NLPOLY E NLPEP

[0510] A titulação de HaloTag (HT7)-NLpep 80 (80) ou NLpep80- HaloTag (HT7) foi realizada em um gel de SDS-PAGE. A proteína HaloTag® teve suas imagens captadas com ligante HaloTag TMR (Promega Corporation) em um scanner Typhoon. As amostras foram transferidas para uma membrana e PBS pH 7 + Prionex 0,1% + NLpoli11S (lisado de E. coli diluído 1:1.000) foi usado para fazer um blot da membrana. NanoGlo/Fz foi então adicionado à membrana e teve sua imagem captada em ImageQuant.

[0511] A Figura 177 demonstra a sensibilidade da detecção de proteínas marcadas com um NLPep de alta afinidade usando NLpoli11S. A Figura 177 também compara a detecção utilizando NLPep/NLPoli para a detecção usando HaloTag marcado com fluorescência.

EXEMPLO 134 ESTABILIDADE DE UM REAGENTE NLPOLIIIS

[0512] NLpoli11S 100 nM foi incubado em tampão de ensaio NanoGlo (Promega Corporation) + furimazina 100 uM e testado com quantidades iguais de NLpep86 diluído. Como controle, tampão de ensaio NanoGlo + furimazina 100 uM foi usado para testar um volume igual de luciferase NanoLuc® diluída (Promega Corporation).

[0513] Os resultados (Figura 178) demonstram que um reagente NLpoli11S (contendo Fz) tem uma estabilidade semelhante em comparação ao reagente de ensaio NanoGlo® comercial (também contendo Fz).

EXEMPLO 135 TITULAÇÃO DE DNA PARA A FUSÃO NLPEP78-HT7 DE ALTA AFINIDADE

[0514] Células HEK293 (200.000/mL) foram transfectadas de forma reversa com diluições em 10 vezes de DNA (começando com 100 ng) a partir de um peptídeo de alta afinidade, NLpep78, fundido à proteína HaloTag® (HT7). 100 uL de cada transfecção foram plaqueados em triplicata em poços de uma placa de 96 poços. Vinte e quatro horas após a transfecção, 100 uL de tampão de ensaio NanoGlo® contendo NLpoli11S 100 nM e 100 uL de furimazina foram adicionados e misturados. A luminescência foi medida 10 minutos após a adição do reagente em um luminômetro GloMax.

[0515] Os resultados (Figura 179) demonstram o intervalo linear amplo semelhante ao do Exemplo 131/Figura 27. Este é, essencialmente, um experimento semelhante ao que foi feito no Exemplo 131, exceto que este exemplo utiliza peptídeo expresso de forma recombinante (fundido com HaloTag) em uma célula de mamífero.

EXEMPLO 136 RESULTADOS PRELIMINARES (PEPTÍDEOS DE MATRIZ)

[0516]Na Figura 183A, NLpoli11S 50 nM foi misturado com NLpep114 7,5 µM e peptídeo escuro (DP) candidato 37,5 µM (Q-162, A-162, K-162 ou E-162). Reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation) foi adicionado e incubado durante 5 minutos. A luminescência foi detectada. Na Figura 183B, NLpoli11S 50 nM em tampão de ensaio (PBS pH 7 + Prionex 0,01% + DTT 1 mM + Tergitol 0,005%) foi misturado com NLpep114 7,5 µM (também em tampão de ensaio) e quantidades variadas de peptídeo escuro (DP) candidatos Q-162 ou K-162 (também em tampão de ensaio). Reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation) foi adicionado e incubado durante 5 minutos. A luminescência foi detectada em um leitor Tecan Infinite F500; tempo de integração de 100 ms; momento de 5 minutos usados.

[0517] O Painel A indica que cada um dos candidatos peptídicos (a 7,5 uM) pode inibir a ligação entre NLpoli11S e NLpep114, tal como indicado por menos bioluminescência. Observe que estes peptídeos “escuros” geram alguma luminescência, assim, o sinal aumentado em comparação a nenhum peptídeos.

[0518] O painel B indica que, com os peptídeos Lys-162 e Gln-162, a inibição é dependente da dose.

EXEMPLO 137 PEPTÍDEOS ESCUROS DE ALTA PUREZA (>95%)

[0519] Na Figura 184A, NLpoli11S 5 nM foi misturado com NLpep114 500 nM e quantidades variadas de um peptídeo escuro (DP) candidato Q-162 ou A-162 (n = 3). Reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation) foi adicionado e incubado durante 5 minutos. A luminescência foi detectada.

[0520] Na Figura 184B, NLpoli11S 5 nM em tampão de ensaio foi misturado com quantidades variadas de peptídeos escuros (DP) candidatos Q- 162 ou A-162 em tampão de ensaio (sem NLpep114) (n = 3). Reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation) foi adicionado e incubado durante 5 minutos. A luminescência foi detectada.

[0521] Os resultados (Figura 184 A e B) confirmam os resultados obtidos a partir do Exemplo 135, mas há aqui uma maior confiança porque os peptídeos são mais puros. Estes resultados também sugerem que, dos variantes peptídicos escuros testados, o peptídeo Ala é o mais potente como inibidor.

EXEMPLO 138 INIBIÇÃO DA LUCIFERASE NANOLUC® PERMUTADA CIRCULARMENTE PELOS PEPTÍDEOS ESCUROS

[0522] Para determinar se os NLpeps de “alta afinidade/baixa atividade” (também conhecidos como peptídeos escuros) podem competir com a interação intramolecular (isto é, dobramento de proteínas) entre os resíduos 1-156 e 157-169 da luciferase NanoLuc® (Nluc) no contexto das Nluc permutada circularmente (CP Nluc). CP NLuc: NLuc 157-169---33aa-ligante---Nluc 1-156

[0523] CP Nluc recombinante foi preparada como uma fração solúvel de um lisado de E. coli concentrado 5x (promotor T7; expressão durante a noite). Utilizou-se uma diluição em 10.000 vezes da CP Nluc em tampão de ensaio (PBS pH 7/Prionex 0,01%/DTT 1mM/Tergitol 0,005%). Peptídeos escuros sinteticamente derivados foram preparados em várias concentrações, também no Tampão de Ensaio. As reações foram estabelecidas usando 30 µL da CP NLuc e 60 µL do peptídeo escuro e testadas pela adição de 90 µL de reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation). A luminescência foi medida (5 minutos) em um leitor Tecan Infinite F500 (integração de 100 ms). Três replicatas foram usadas para amostras de peptídeos escuros. Duas replicatas foram utilizadas para controles do tampão (ácido acético a partir de estoques de peptídeos).

[0524] A Figura 185 demonstra uma dose-resposta dos peptídeos escuros com CP Nluc. A Figura 186 demonstra um curso temporal do peptídeo escuro (peptídeo 56 µM) com CP Nluc.

[0525] Os resultados indicam que ambos os peptídeos escuros, particularmente a versão Ala162, são capazes de inibir significativamente a geração de luminescência pela CP Nluc (Ala162 >2 logs; Gln162 >1 log). Isto indica que uma abordagem com CP Nluc possui utilidade para complementação inversa.

EXEMPLO 139 PEPTÍDEOS ESCUROS EM CÉLULAS

[0526] Neste exemplo, foram usadas as seguintes construções: -Quatro vetores de peptídeos escuros: pF4Ag + FKBP-peptídeo escuro Ala-162, Leu-162, Gln-162 e Val-162 -Dois vetores de peptídeos não escuros: pFc5K2 FKBP-NLpep114 (peptídeo de baixa afinidade) e pFc5K2 FKBP-NLpep80 (peptídeo de alta afinidade) -Um vetor de NLpoly: pFc5K2 FRB-NLpoli11S

[0527] Todas as construções abrigavam um promotor CMV para a expressão em células de mamíferos. Todas as construções de fusão continham um ligante flexível Gli-Ser de 10 aminoácidos.

[0528] As diluições em série das construções de peptídeos escuros, Ala-162 (A), Leu-162 (L), Gln-162 (Q) e Val-162 (V), foram feitas em OptiMem e, adicionalmente, continham DNA transportador (pGEM-3Z).

[0529] Para a transfecção contendo NLpoli11S somente, 20 uL de peptídeo escuro diluído foram misturados com 20 uL de NLpoli11S, 60 uL de OptiMem e 8 uL de Fugene. Para as transfecções contendo NLpoli11S e NLpep114 ou NLpep80, 20 uL de peptídeo escuro diluído foram misturados com 20 uL de NLpoli11S (10 ng/uL), 20 uL de NLpep114 ou NLpep80 (10 ng/uL), 40 uL de OptiMEM e 8 uL de Fugene. Todos foram incubados à temperatura ambiente durante 15 minutos. 5 uL de cada transfecção, em triplicata, foram adicionados aos poços de duas placas de 96 poços (uma com rapamicina, uma sem rapamicina). 100 uL de células HEK293T a 200.000 células/mL em DMEM+FBS 10% foram então adicionados aos poços, e as células transfectadas foram incubadas durante a noite a 37°C.

[0530] Meio foi então removido das células, e as células foram lavadas com 200 µL de DPBS. 50 µL de rapamicina 50 nM foram adicionados, e as células foram incubadas durante 1 h a 37°C. 20 µL de furimazina 5 mM em 5 mL de OptiMEMI isento de vermelho de fenol + rapamicina 50 nM foram diluídos, 50 µL adicionados diretamente às células e incubados durante 5 minutos em GloMax Multi+. A luminescência foi medida em GloMax.

[0531] A Figura 187 mostra que os peptídeos escuros, quando fundidos a FKBP, podem reduzir o sinal de fundo de NLpoli11S (isto é, FRB- NLpoli11S). Juntas, as Figuras 188-190 demonstram que os peptídeos escuros, quando fundidos a FKBP, podem 1) competir com o dobramento da NanoLuc de comprimento completo (isto é, FRB-NanoLuc ou NanoLuc-FRB) e 2) competir com os peptídeos de baixa e de alta afinidade (também fusões de FKBP) para a ligação ao NLpoli11S (ou seja, FRB-NLpoli11S) e, como resultado, reduzir a luminescência total sendo produzida e detectada nas células vivas.

EXEMPLO 140 APLICAÇÕES EM VIROLOGIA

[0532] Além de permitir a medição de títulos virais, NLpeps de interação espontânea também permitem estudar o rearranjo viral (por exemplo, influenza). O rearranjo viral refere-se à formação de novos vírus “híbridos” a partir de infecções duplas, por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2 (H é hemaglutinina; N é neuraminidase); aves, seres humanos, suínos, frango (mais comum em suínos).

[0533] Devido à sua natureza segmentada, o genoma da influenza pode ser facilmente embaralhado em células hospedeiras infectadas com mais do que um vírus. Quando uma célula é infectada com vírus influenza de espécies diferentes, o rearranjo pode resultar em vírus da progênie que contenham genes de cepas que normalmente infectam aves e genes de cepas que normalmente infectam os seres humanos, levando à criação de novas cepas que nunca foram observadas na maioria dos hospedeiros. Além disso, uma vez que foram caracterizados pelo menos 16 subtipos diferentes e nove subtipos diferentes de neuraminidase, muitas combinações diferentes de proteínas capsídicas são possíveis. Destes subtipos, três subtipos de hemaglutinina (H1, H2 e H3) e dois subtipos de neuraminidase (N1 e N2) causaram epidemias prolongadas na população humana. As aves são hospedeiras para todos os subtipos de influenza A e são o reservatório a partir do qual novos subtipos de HA são introduzidos em seres humanos (Palese, 2004).

[0534] A aplicação do presente sistema para detectar o rearranjo é que os dois componentes dos NLpeps de interação espontânea sejam colocados em partículas virais diferentes, ou o grande componente em células e o pequeno componente em um vírus, e a presença de ambos os elementos (por exemplo, estando presentes em uma célula) é detectada por luminescência.

EXEMPLO 141 VALIDANDO O USO DO NLPEP86 DE INTERAÇÃO ESPONTÂNEA COMO UM MARCADOR DE EPÍTOPO PARA AS PROTEÍNAS DEGRADADAS PELO PROTEASSOMO

[0535] Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento das modalidades da presente invenção para validar o uso de NLpep86 como um marcador para monitorar os níveis de expressão de proteínas degradadas pelo proteassomo. Para isso, NLpep86 foi fundido a variantes da luciferase do vaga- lume que também foram fundidos a uma ou mais sequências PEST, CL1 ou ubiquitina (pBC21, 22, 24-29). Espera-se que cada uma destas construções seja submetida ao turnover mediado pelo proteassomo em graus variados após a expressão a partir de um promotor CMV mutante (d1CMV).

[0536] As construções pBC21, 22, 24-29 e construções controle que expressam a luciferase do vaga-lume não-marcada ou luciferase do vaga- lume não-marcada fundida a uma sequência PEST (ATG082 e ATG083) foram transitoriamente transfectadas em células HeLa plaqueadas a 10.000 células por poço em uma placa de 96 poços, utilizando 100 µL de DMEM + FBS 10%. No dia seguinte, 10 µL de uma mistura de transfecção (920 uL de OptiMEM I + 5 ug da respectiva construção + 15 uL de Fugene HD) foram adicionados por poço e as células foram incubadas durante 48 horas em um incubador a 37°C contendo CO2 5%. Os níveis de expressão da proteína foram quantificados em poços replicados para cada construção pela detecção da atividade da luciferase do vaga-lume ou pela adição de um reagente de detecção contendo NLpoli11S (NLpoli11S purificado adicionado a NanoGlo®). Observou-se uma boa correlação entre os sinais de NLpep86 e Fluc em cada caso, sugerindo que a detecção de NLpep86 pode ser utilizada para monitorar os níveis de expressão da proteína de fusão para proteínas degradadas pelo proteassomo. BC21 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc(alta afinidade) BC22 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-FlucP(alta afinidade) BC24 pFC15A/MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-CL1 BC25 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-PEST12opt(alta afinidade) BC26 MVSGWRLFKKIS-GGSGGGGSGG-Fluc-CP(alta afinidade) BC27 UBQ G76V-VGKLGRQDP-Fluc(EDAKNIKK..)- GGSGGGGSGG-VSGWRLFKKIS(alta afinidade) BC28 UBQ-RGKLGRQDP-Fluc(EDAKNIKK..)-GGSGGGGSGG- VSGWRLFKKIS(alta afinidade) BC29 UBQ-LGKLGRQDP-Fluc (EDAKNIKK..)-GGSGGGGSGG- VSGWRLFKKIS(alta afinidade) ATG083 D1 FlucP; pF4Ag CMV Luc2-PEST ATG082 D1Fluc; pF4Ag CMV Luc2

[0537] Após uma incubação de 48 horas, 100 uL de reagentes NanoGlo® NLpep11S (90 uL de NLpoli11S em 50 mL de reagente de ensaio NanoGlo®) foram adicionados a cada poço e incubados durante 3 minutos, com agitação. A luminescência foi então lida em luminômetro GloMax (0,5 s/poço).

[0538] Os resultados na Figura 191 demonstram que o sinal de Fluc e NLpep86 parecem refletir entre si no que diz respeito ao brilho relativo e possuem RLUs semelhantes. BC21, BC25 e BC29 são as construções mais brilhantes da série BC, com BC21 parecendo mais brilhante neste experimento. BC24, 26 e 27 são os menos brilhantes, o que é previsto a partir da desestabilização manipulada.

EXEMPLO 142

[0539] Este exemplo demonstra que um peptídeo complementar conhecido pode ser usado como um ligante entre o mesmo ou um NLpep complementar diferente e NLpoli11S (por exemplo, NLpep78(2X)).

[0540] Células HEK293T (20.000) foram transfectadas com uma mistura contendo 20 µL de DNA de NLpep78-HaloTag (HT) ou NLpep78(2x)- HT, 80 µL de Opimex isento de fenol e 8 µL de FugeneHD. As células foram cultivadas durante a noite a 37°C e testadas em 24 h usando reagente de ensaio NanoGlo® (Promega Corporation) contendo NLpoli11S purificado 33 nM.

[0541] Os resultados (Figura 192) demonstram que um peptídeo de ligação em tandem pode ser utilizado e que este pode ser suficiente como um ligante.

EXEMPLO 143 COMPARAÇÃO DAS ATIVIDADES ESPECÍFICAS DOS RESÍDUOS 1-156 DA LUCIFERASE DE OPLOPHORUS, NLPOLIIIS E NANOLUC EM LISADOS DE HEK293T

[0542] Cada clone foi inserido em um vetor pFN21A HaloTag® CMV Flexi® (Promega G2821), e os lisados foram preparados como se segue: 3 mL de células HEK293T que foram diluídas para uma concentração de 200.000 células/mL (600.000 células totais) foram plaqueados em cada poço de uma placa de 6 poços e cultivados durante a noite a 37°C em um incubador de CO2. No dia seguinte, complexos de transfecção de cada DNA foram preparados através da combinação de 6,6 µg de DNA, Opti-MEM® (Life Technologies 11058-021) para um volume final de 310 µL e 20 µL de FuGENE® HD (Promega E231a). Os complexos de transfecção foram incubados durante 20 minutos e, em seguida, 150 µL de cada complexo foram adicionados em duplicata às células. As células foram cultivadas durante a noite a 37°C em um incubador de CO2. No dia seguinte, as células foram lavadas com DPBS (Life Technologies 14190-144), e 1 mL de DPBS fresco foi adicionado. As células foram congeladas para lisar e depois descongeladas para teste. Duplicatas de lisados de reações de transfecção foram combinadas.

[0543] Para quantificar o nível de expressão da proteína para cada amostra, cada amostra foi marcada com ligante HaloTag® TMR (Promega Corporation) como se segue: ligante HaloTag® TMR (Promega G8251) foi diluído 1:100 em água para uma concentração de 0,05 mM; 100 µL de cada lisado foram misturados com 2 µL de ligante TMR diluído e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente; 20 µL de corante de aplicação SDS foram adicionados, e as amostras foram aquecidas a 95°C durante 5 minutos. 10 µL e 20 µL de cada amostra foram aplicados em um gel de poliacrilamida (Bio-Rad, 4-15% Criterion™ Tris-HCl Gel #345-0030), corridos a 200 V durante 1 hora e, em seguida, quantificados utilizando ImageQuant™ LAS4000 (GE). NLpoli11S e luciferase NanoLuc® (Nluc) se expressaram aproximadamente 4 vezes mais do que os resíduos 1 -156.

[0544] A fim de comparar as atividades específicas de Nluc (enzima de comprimento total) aos resíduos 1 -156 wt de Oplophorus e NLpoli11S em combinação com o peptídeo 157-169 wt de Oplophorus proteínas binárias), titulações de substrato foram realizadas para todas as amostras, mas, para as amostras binárias, as titulações de substrato foram realizadas em várias concentrações peptídicas. Usando este formato, foi possível calcular um valor de Vmax para Nluc e ambos os valores de Vmax e Bmax para NLpoli11S e 1-156 wt de Oplophorus. Três experimentos separados foram realizados usando este formato e os valores de Vmax e Bmax foram normalizados para a Vmax de NanoLuc. As atividades específicas relativas (calculadas como médias de Vmax e Bmax) são normalizadas para NanoLuc.

EXEMPLO 144 EFEITO DO NLPOLY E NLPEP NA MEIA-VIDA INTRACELULAR DE FLUCP

[0545] Para determinar se acrescentar qualquer NLpoli11S ou NLpep114 a Luc2-PEST altera a meia-vida intracelular, foi medido o decaimento do sinal após o tratamento com ciclo-heximida (CHX).

[0546] Dia 1: Plaquear células HeLa em placas de 6 poços. Plaquear 3 mL de células (200.000/mL) em duas placas de 6 poços. Cultivar durante a noite. DMEM+FBS 10%.

[0547] As construções contendo FlucP, wt 157-169 FlucP, NLpoli11S, NLpep114 FlucP e pBC22 (todos pF4Ag D1-CMV) foram transfectadas em células HeLa. Resumidamente, 33 uL de DNA (3,3 ug) foram adicionados em 122 uL de OptiMem, misturados e 9,9 uL de FuGENE® HD adicionados. As misturas de transfecção foram então incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos, e 150 uL foram adicionados às células. Após uma incubação durante a noite, as células foram novamente plaqueadas a 10.000 células/poço e incubadas novamente durante a noite.

[0548] Após a incubação, o meio de cultura foi removido e substituído por ciclo-heximida 0,4 mM (CHX) ou controle (DMSO). Em cada momento, reagente de ensaio ONE-Glo™ foi adicionado, incubado à temperatura ambiente durante 3 minutos e a luminescência medida em luminômetro Tecan GENios Pro.

[0549] A Figura 193 demonstra que nenhum dos componentes NLpoly ou NLpep testados interfere com a degradação intracelular normal de uma enzima repórter (FlucP).

EXEMPLO 145 ENSAIO DA ATIVIDADE DA PROTEASE EXTRACELULAR

[0550] Em algumas modalidades, a presente invenção apresenta um ensaio para atividade da protease extracelular (por exemplo, caspase). Um peptídeo suprimido é apresentado (por exemplo, peptídeo de alta afinidade, tais como NLpep86) que apenas pode ser acessado e redobrado em uma luciferase ativa com um NLpoly, por exemplo, NLpoli11S, após a remoção da fração supressora por uma protease (por exemplo, caspase) (Figura 194). NLpoli11S e furimazina são introduzidos ao ensaio como reagentes e, em seguida, as amostras são medidas para bioluminescência.

EXEMPLO 146 PRÓ-GRUPOS MEDIALMENTE LIGADOS (ISOPEPTÍDEOS E AMINOÁCIDOS GLICOSILADOS)

[0551] São apresentados ensaios para medir a atividade de uma enzima através da utilização de um ProNLpep. Esta configuração de ProNLpep é um NLpep com um dos aminoácidos internos conjugado com um grupo que impede a complementação do peptídeo a um NLpoly. Quando este ProNLpep encontra uma enzima que remove o grupo de bloqueio (por exemplo, a caspase 1 no caso de WEHD ou uma glicosidase no caso de glicosídeo serina), a capacidade do NLpep para complementar um NLpoly é restaurada (Figura 195). Na presença de furimazina, isso resulta na produção de luz em proporção à atividade da enzima de interesse. Uma vez que cada clivagem enzimática resulta na formação de uma luciferase, espera-se que a sensibilidade deste sistema para testar pequenas concentrações de enzima seja alta.

EXEMPLO 147 AVALIAÇÃO DE LIGANTES

[0552] São apresentados ensaios para medir a liberação da carga de um anticorpo. Um NLpep é ligado a um anticorpo, proteína, peptídeo ou fração de reconhecimento do transportador de tal maneira que o impede de se associar com um NLpoly para formar uma luciferase. Após um estímulo, como a internalização celular, o ligante entre o anticorpo, proteína, peptídeo ou fração de reconhecimento do transportador e o NLpep é clivado, devido ao potencial redutor intracelular, e o NLpep é liberado (Figura 196). O NLpep pode agora complementar um NLpoly para formar uma luciferase, e a luz gerada será proporcional à clivagem do ligante. Isto fornece um sistema para medir a liberação de um composto a partir de um anticorpo, que é um substituto para a entrega de fármacos citotóxicos a partir de conjugados entre anticorpos e fármacos. O ligante pode ser clivado através de qualquer maneira conhecida na técnica, tal como através de proteases intracelulares ou sensibilidade ao pH. Novamente, uma vez que uma luciferase é gerada através de cada clivagem, espera-se que este seja um método sensível para testar a clivagem.

EXEMPLO 148

[0553] A utilização de anticorpos para se direcionar contra e destruir células doentes revelou promessa terapêutica significativa e ocorre através de um processo chamado de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Há muitas maneiras para monitorar a atividade de ADCC, incluindo a ligação cruzada de tipos celulares diferentes ou monitoramento da transcrição gênica usando repórteres específicos de luciferase expressos nas células efetoras. Uma possível leitura alternativa ao mecanismo de ação da ADCC poderia ser o monitoramento das interações proteína:proteína específicas induzidas ou interrompidas após a ligação dos anticorpos terapêuticos contra seus antígenos-alvo ou receptores apresentados na superfície da célula. Em algumas modalidades, as interações proteína:proteína específicas são monitoradas usando o sistema da presente invenção, que fornece uma leitura no intervalo de tempo de minutos em vez de horas, o que é exigido por outros métodos.

EXEMPLO 149 IMUNOENSAIOS

[0554] Modalidades da presente invenção podem ser usadas em imunoensaios homogêneos, por exemplo, como representado na Figura 201, onde o NLpep e NLpoly são fundidos a frações de ligação (por exemplo, A e B). As frações de ligação A e B podem compreender vários componentes diferentes, resultando em vários formatos diferentes de imunoensaios que podem ser utilizados como ensaios específicos ao alvo ou reagentes mais generalizadas a ser utilizados em imunoensaios. As frações de ligação apenas se aproximarão na presença do alvo, aproximando, assim, o NLpep e o NLpoly e resultando na produção de luminescência após a adição do substrato. A Tabela 7 lista exemplos de frações de ligação (Mie et al. The Analyst. 2012 Mar 7;137(5):1085- 9; Stains et al. ACS chemical biology. 2010 Oct 15;5(10):943-52.; Ueda et al. Journal of immunological methods. 2003 Aug;279(1-2):209-18. Ueda et al. Nature biotechnology. 1996 Dec;14(13):1714-8.; Lim et al. Analytical chemistry. 2007 Aug 15;79(16):6193-200.; Komiya et al. Analytical biochemistry. 2004 Apr 15;327(2):241-6.; Shirasu et al. Analytical sciences : the international journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 2009 Sep;25(9):1095-100.; aqui incorporados por referência em sua totalidade). TABELA 7

[0555] Em algumas modalidades em que as frações de ligação são constituídas por proteína A, proteína G, ou domínios da proteína A ou G, o sistema de imunoensaio utiliza as fusões de NLpoly e NLpep para complexar anticorpos antes da adição à amostra contendo o alvo. Os anticorpos se ligam de modo não covalente às proteínas A e G naturalmente. A introdução de um acoplamento covalente entre o anticorpo e as fusões é realizada na etapa de formação do complexo. As frações de ligação fundidas NLpep/NLpoly-proteína A/G/domínio podem ser complexadas aos anticorpos em diferentes formatos, por exemplo: • individualmente com dois anticorpos diferentes específicos dirigidos contra duas proteínas diferentes para determinar se há proteínas no complexo; • juntos com um anticorpo policlonal específico de único alvo; • juntos com anticorpo secundário (por exemplo, de coelho anti-IgG de camundongo) para se ligar à amostra pré-incubado com anticorpo primário (por exemplo, IgG de camundongo específico contra o alvo); e • individualmente com dois anticorpos dirigidos contra dois epítopos diferentes na mesma proteína-alvo.

[0556] Tal como descrito na Tabela 7, em algumas modalidades, as frações de ligação são anticorpos alvo-específicos, domínios de anticorpos alvo- específicos, domínios do receptor que se ligam a ligantes-alvo, ou uma combinação de anticorpos, domínios de anticorpos e domínios de receptor-alvo.

[0557] Em algumas modalidades, os alvos são monitorados em amostras que incluem, entre outros, sangue, plasma, urina, soro, lisados celulares, células (primárias ou linhagens celulares), sobrenadante de cultura de células, fluido cerebroespinal, lavado alveolar brônquico, amostras de biópsia tecidual, compostos químicos, etc.

[0558] Os métodos descrevem a análise de alvos que incluem, entre outros: proteínas, moléculas e compostos pequenos, haptenos, peptídeos, hormônios, interações proteína-proteína heterodiméricas, antigênios de superfície celular, interações entre receptores e ligantes, proteínas no complexo, vírus e componentes virais, bactérias, toxinas, fármacos sintéticos e naturais, esteroides, catecolaminas, eicosanoides, eventos de fosforilação proteica, etc.

[0559] As aplicações incluem, entre outras, a detecção ou quantificação do alvo para o monitoramento clínico da doença, diagnóstico, monitoramento de fármacos terapêuticos, pesquisa biológica, produtos farmacêuticos, detecção e monitoramento de compostos na indústria de alimento/bebidas/fragrâncias, identificação de clade viral, etc.

[0560] Outras aplicações incluem triagem de alto rendimento de moléculas capazes de alterar as interações do alvo com seu receptor resultando, assim, em uma perda de sinal de ensaio. Existem vários formatos propostos para a utilização de NLpep/NLpoly em imunoensaios. Em algumas modalidades, estes são realizados de forma homogênea e fornecidos como um kit, como componentes separados de kits de diagnóstico e de pesquisa, ou como reagentes isolados personalizáveis para ensaio do indivíduo.

[0561] Em outras modalidades, imunoensaio homogêneo utilizando NLpep/NLpoly utiliza variações da tecnologia HitHunter ou CEDIA (Yang et al. Analytical biochemistry. 2005 Jan 1;336(1):102-7.; Golla and Seethala. Journal of biomolecular screening. 2002 Dec;7(6):515-25.; aqui incorporados por referência em sua totalidade). Em tais ensaios, os componentes incluem: anticorpo alvo-específico, NLpoly, NLpep-fusão-alvo recombinante, e substrato. O NLpoly e o NLpep-fusão-alvo recombinante formam um complexo luminescente quando o NLpep não está ligado ao anticorpo alvo-específico. Após a adição da amostra de teste aos componentes do ensaio, a quantidade de luminescência é diretamente proporcional à concentração do alvo na amostra de teste, uma vez que o alvo presente na amostra de teste irá competir com o NLpep-fusão-alvo recombinante no anticorpo (por exemplo, o ganho de sinal indica a presença do alvo).

EXEMPLO 150 EXEMPLOS DE CONFIGURAÇÕES PARA NLPOLIIIS NA COMPLEMENTAÇÃO ESPONTÂNEA

[0562] Várias configurações de NLpoli11S podem ser utilizadas em ensaios ou sistemas de complementação espontânea. Tais configurações podem incluir: deleções na extremidade C-terminal (por exemplo, para reduzir a luminescência de fundo), apêndices N- e/ou C-terminais (por exemplo, com base em se eles devem ser purificados por His ou HaloTag), etc. Por exemplo, o apêndice deixado por HaloTag quando este é um marcador N-terminal é SDNIAI. Exemplos de configurações incluem: SDNAIA-11S (purificação por HaloTag); SDN-11S; SDNAIA-11S, com única del na extremidade C-terminal; SDN-11S, com única del na extremidade C-terminal; SDNAIA-11S, com dupla del na extremidade C-terminal; SDN-11S, com dupla del na extremidade C-terminal; SDNAIA-11S, com tripla del na extremidade C-terminal; SDN-11S, com tripla del na extremidade C-terminal; 6His-AIA-11S; 6His-11S; 6His-AIA-11S com única del na extremidade C-terminal; 6His-11S com única del na extremidade C- terminal; 6His-AIA-11S com dupla del na extremidade C-terminal; 6His-11S com dupla del na extremidade C-terminal; 6His-AIA-11S com tripla del na extremidade C-terminal; 6His-11S com tripla del na extremidade C-terminal; 11S- 6His; 11S-6His, menos resíduo 11S C-terminal; 11S-6His, menos dois últimos resíduos 11S C-terminais; 11S-6His, menos três últimos resíduos 11S C- terminais; 11S-HT7, menos resíduo 11S C-terminal; 11S HT7, menos dois últimos resíduos 11S C-terminais; 11S HT7, menos três últimos resíduos 11S C-terminais; 6His-HT7-AIA-11S; 6His-HT7-11S; 6His-AIA-HT7-11S (com del única, dupla, tripla do resíduo 11S C-terminal); 6His-HT7-11S (com del única, dupla, tripla do resíduo 11S C-terminal); 11S-HT7-6His; 11S-HT7-6His (com del única, dupla, tripla do resíduo 11S C-terminal); e 11S ternário.

EXEMPLO 151 INTERAÇÕES PROTEICAS PARA ESTUDOS DE COMPLEMENTAÇÃO BINÁRIA

[0563] O sistema de complementação binária aqui descrito foi usado para analisar uma grande variedade de interações proteicas (ver Tabela 8). TABELA 8. INTERAÇÕES PROTEICAS PARA ESTUDOS DE COMPLEMENTAÇÃO BINÁRIA

EXEMPLO 152 CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO E VALORES DE BMAX PARA NLPOLIS COM 108 VARIANTES DE NLPEPS (MATRIZ #2)

[0564] NLpeps foram sintetizados em formato de matriz pela New England Peptide (peptídeos bloqueados na extremidade N-terminal por acetilação e na extremidade C-terminal por amidação; peptídeos em matrizes foram sintetizados em uma escala de ~2 mg) (Tabela 9). Cada peptídeo foi liofilizado em 2 placas separadas. Cada poço de uma das placas de peptídeos foi dissolvido em 100 uL de água nanopura, e a A260 foi medida e usada para calcular a concentração, utilizando o coeficiente de extinção de cada peptídeo. A concentração foi então ajustada com base na pureza do peptídeo, e água nanopura foi adicionada para uma concentração final de 800 uM. TABELA 9. SEQUÊNCIAS DE MATRIZ 2 DE PEPTÍDEOS

[0565] Os peptídeos foram diluídos para 400 uM (4X) em PBS+Prionex 0,1% e depois diluídos em série por 7 vezes (8 concentrações totais) em etapas de 0,5 log (diluição de 3,162 vezes). NLpoly 11S foi diluído 1:10A6 em PBS+Prionex 0,1%. 25 uL de cada NLpep + 25 uL de NLpoliIIS foram misturados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. 50 uL de NanoGlo+Fz 100 uM foram adicionados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. A luminescência foi medida em um GloMax Multi+ com integração de 0,5 s. Kd/Bmax foram determinadas utilizando Graphpad Prism, ligação específica em um único sítio, valores de melhor ajuste. A Tabela 10 indica as constantes de dissociação e os valores de Bmax para NLpoly 11S e o NLPep indicado. Os resultados indicam os efeitos das mutações sobre a ligação ao NLpoli11S e a capacidade do complexo em produzir luminescência. TABELA10

EXEMPLO 153 PEPTÍDEOS ESCUROS E PEPTÍDEOS SUPRESSORES PARA REDUÇÃO DO SINAL DE FUNDO DE NLPOLIIIS

[0566] Uma amostra purificada de NLpoli11S foi diluída em reagente NanoGlo para uma concentração final de 2 uM. Pep86 é um peptídeo luminogênico de alta afinidade e foi usado para induzir sinal máximo para NLpoli11S. Pep86 foi preparado a 1 nM em PBS (pH 7,2) para uma solução de trabalho. Peptídeos escuros e peptídeos supressores (Figura 180) foram dissolvidos a 1 mM (ou menos) em PBS pH 7,2 ou NH4HC03 150 mM e adicionados em volume igual a NanoGlo/NLpoli11S e, em seguida, as amostras foram lidas em um leitor Tecan Infinite F500 usando um momento de 5 minutos.

[0567] A Figura 202A mostra que GWALFK e Dabcyl-GWALFK reduzem a luminescência de fundo gerada por NLpoli11S na ausência de qualquer outro peptídeo luminogênico. A Figura 202B mostra que Pep86 é capaz de induzir luminescência mesmo na presença de GWALFKK e Dabcyl- GWALFKK.

[0568] A Figura 203A mostra que VTGWALFEEIL (Trp 11mer) e VTGYALFEEIL (Tyr 11mer) induzem a luminescência em relação ao fundo (NLpoli11S isolado; nenhum peptídeo controle), mas que versões N-terminais de Dabcyl de cada um apresentam supressão significativa deste sinal. A Figura 203B mostra que Pep86 é capaz de induzir luminescência mesmo na presença das versões Dabcyl de Trp 11mer e Tyr 11mer.

[0569] Todas as publicações e patentes mencionados na especificação acima estão aqui incorporados por referência. Várias modificações e variações do método descrito e do sistema da invenção serão evidentes àqueles especialistas na técnica sem afastamento do âmbito e essência da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita juntamente com modalidades específicas, deve-se entender que a invenção tal como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para conduzir a invenção que são óbvias àqueles especialistas nos campos relevantes são destinadas a estarem dentro do âmbito da presente invenção.

Claims

1. SISTEMA, caracterizado por consistir em: (a) um peptídeo representado por uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 390 ou 2271; e (b) um polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 440; em que um sinal bioluminescente é produzido na presença de um substrato furimazina por um complexo do peptídeo e do polipeptídeo, em que o sinal bioluminescente produzido pelo complexo do peptídeo e do polipeptídeo na presença de um substrato furimazina é substancialmente aumentado quando comparado a um sinal bioluminescente produzido pelo peptídeo ou polipeptídeo sozinho na presença de um substrato furimazina.

2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo peptídeo ser parte de uma primeira fusão com um primeiro polipeptídeo de interação, em que o polipeptídeo é parte de uma segunda fusão com um segundo polipeptídeo de interação, em que o primeiro e segundo polipeptídeos de interação são configurados para formar um complexo mediante contato do primeiro polipeptídeo de interação e do segundo polipeptídeo de interação.

3. COMPLEXO BIOLUMINESCENTE, caracterizado por compreender a primeira e a segunda fusões, conforme definidas na reivindicação 2.