JP2022539343A - 細胞中に生体分子を送達するための修飾ポリアミンポリマー - Google Patents

細胞中に生体分子を送達するための修飾ポリアミンポリマー Download PDF

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Abstract

本明細書では、細胞に生体分子を送達するための化合物、組成物、及び方法が提供される。特に、本開示は、フッ素化置換基を有するポリアミンポリマーを含めた、修飾ポリアミンポリマーを提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６５，６３８号の優先権を主張するものであり、同文献の内容全体が参照により本明細書に完全に援用される。
電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下、すなわち「３６７５４－６０１＿ＳＴ２５」と名付けられ、２０２０年６月２３日に作成された１０，０００バイトの１つのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして特定される、コンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表が、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書では、細胞に生体分子を送達するための化合物、組成物、及び方法が提供される。特に、本開示は、フッ素化置換基を有するポリアミンポリマーを含めた、修飾ポリアミンポリマーを提供する。
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー等のカチオン性ポリマーは、細胞中に外来遺伝子を導入するための担体として広く使用される。これらの材料は、製造が容易であり、ウイルス遺伝子送達と比較して優れた安全性を有する。しかしながら、それらの商用応用及び臨床応用は、トランスフェクションの有効性が比較的低いこと及び細胞生存率が良好でないことにより限定される。
本明細書では、細胞に生体分子を送達するための化合物、組成物、及び方法が提供される。特に、本開示は、フッ素化置換基を有するポリアミンポリマーを含めた、修飾ポリアミンポリマーを提供する。
本開示の実施形態は、化合物またはその塩であって、該化合物が、
ポリエチレンイミンポリマーと、
該ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
－Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
（Ｉ）、
式中、
Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり、
Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、該化合物またはその塩を含む。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、約５００Ｄａ～約２５００００Ｄａの重量平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、約５００Ｄａ～約２０００Ｄａの重量平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、約５０００Ｄａ～約２５０００Ｄａの重量平均分子量を有する。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンポリマーである。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、直鎖状ポリエチレンイミンポリマーである。
一部の実施形態では、Ｚは、以下の式、－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態では、Ｚは、ペンタフルオロフェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ピリジル基である。
一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、Ｚは、以下の式、－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、または５である。
一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。
本開示の実施形態はまた、化合物またはその塩であって、該化合物が、
ポリ（アミドアミン）デンドリマーと、
該ポリ（アミドアミン）デンドリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
－Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
（Ｉ）、
式中、
Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
ｎが、０、１、または２であり、
Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、該化合物またはその塩を含む。
一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代、または第１０世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第１世代、第２世代、第３世代、または第４世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。
一部の実施形態では、Ｚは、以下の式、－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態では、Ｚは、ペンタフルオロフェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ピリジル基である。
一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。一部の実施形態では、Ｚは、以下の式、－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、または５である。
一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１である。
一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。
本開示の実施形態はまた、細胞に生体分子を送達する方法であって、細胞を、有効量の本明細書に記載の化合物（すなわち、ポリエチレンイミンポリマー及び式（Ｉ）の複数の置換基を含む化合物、またはポリ（アミドアミン）デンドリマー及び式（Ｉ）の複数の置換基を含む化合物）、またはその塩に接触させることと、細胞を生体分子に接触させることと、を含む、該方法を含む。一部の実施形態では、該方法は、細胞を、有効量の２つ以上の異なる化合物またはそれらの塩に接触させることを含む。
一部の実施形態では、生体分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、生体分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。一部の実施形態では、生体分子は、発光活性が可能なペプチドまたはポリペプチドである。一部の実施形態では、生体分子は、配列番号４のポリペプチド配列（ＬｇＢｉＴ）を含む。一部の実施形態では、生体分子は、Ｃａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体である。一部の実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びドナーＤＮＡテンプレートをさらに含み、該ドナーＤＮＡテンプレートが、配列番号３からのポリペプチドをコードする配列を含む。
一部の実施形態では、該方法は、該化合物及び該生体分子を混合して混合物を形成させることと、その後、細胞を該混合物に接触させることとを含む。
本開示の実施形態はまた、化合物またはその塩を含むキットであって、該化合物またはその塩が、本明細書に記載の化合物（すなわち、ポリエチレンイミンポリマー及び式（Ｉ）の複数の置換基を含む化合物、またはポリ（アミドアミン）デンドリマー及び式（Ｉ）の複数の置換基を含む化合物）である、該キットを含む。
一部の実施形態では、キットは、容器中に該化合物または該その塩を含む。
一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、生体分子は、発光活性が可能なペプチドまたはポリペプチドである。一部の実施形態では、生体分子は、配列番号４のポリペプチド配列（ＬｇＢｉＴ）を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号３からのポリペプチドをコードする配列を含むドナーＤＮＡテンプレートである。
一部の実施形態では、キットは、生体分子のトランスフェクションのために該化合物または該その塩を使用するための説明書をさらに含む。
本開示の実施形態はまた、細胞において内因性タンパク質の配列を改変する方法を含み、該方法は、
Ｃａｓ９タンパク質、ドナーＤＮＡテンプレート、及びガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を組み立てることと、
本明細書に記載の化合物を使用して細胞中にＲＮＰ複合体を送達することと、を含む。
本開示の実施形態はまた、細胞において内因性タンパク質をタグ付けするための方法を含み、該方法は、
Ｃａｓ９タンパク質、ドナーＤＮＡテンプレート、及びガイドＲＮＡを含み、該ドナーＤＮＡテンプレートが、ペプチドまたはポリペプチドタグ配列をコードする配列を含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を組み立てることと、
本明細書に記載の化合物を使用して細胞中にＲＮＰ複合体を送達することと、を含む。
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、配列番号３及び配列番号５から選択されるペプチドタグをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、ペプチドまたはポリペプチドタグ配列をコードする配列に隣接するホモロジーアームをさらに含む。
Ａ～Ｂは、実施例２に記載されるような一定のモル比の修飾ＰＥＩポリマーによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションからの結果を図示する。Ａは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現量によって測定したときのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベクターのトランスフェクション効率を示す。Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 Ａ～Ｂは、実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ化合物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションからの結果を、対照としての未修飾ポリマー及びＦｕＧＥＮＥ ＨＤと比較して図示する。Ａは、対照と比べたＮａｎｏＬｕｃからの発光シグナルの比率を示す。Ｂは、トランスフェクション試薬不使用の試料と比較した、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩポリマーのタイトレーション及び一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、ＨＥＫ細胞のトランスフェクションからの結果を図示する。血清の存在下で実施したトランスフェクションからのデータを示す。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩポリマーのタイトレーション及び一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、ＨＥＫ細胞のトランスフェクションからの結果を図示する。血清の不在下で実施したトランスフェクションからのデータを示す。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩポリマーのタイトレーション及び一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、ＨＥＫ細胞のトランスフェクションからの結果を図示する。血清の存在下でのトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での９つの異なる細胞種のトランスフェクションからの、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を使用した発光結果を図示する。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 実施例２に記載されるような、血清の存在下での９つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 Ａ～Ｅは、実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での５つの異なる細胞種のトランスフェクションからの結果を図示する。 Ａ～Ｄは、実施例２に記載されるような、血清の存在下での４つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 Ａ～Ｅは、実施例２に記載されるような、修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションならびに一定量のＤＮＡとのインキュベーションに次ぐ、血清の存在下での５つの異なる細胞種のトランスフェクションからの結果を図示する。 Ａ～Ｄは、実施例２に記載されるような、血清の存在下での５つの異なる細胞種における修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを用いたトランスフェクション後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用した細胞生存率の測定値を示す。 Ａ～Ｂは、ＨｉＢｉＴ融合体を安定に発現したクローンにＬｇＢｉＴを送達した結果を図示する。Ａは、修飾ＰＥＩ化合物を使用してＨｅＬａ細胞のＰＫＣα－ＨｉＢｉＴもしくはＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴクローンまたはＨＥＫ２９３細胞のＣＤＫ６－ＨｉＢｉＴクローンにＬｇＢｉＴを送達した結果を、未修飾ポリマー及び上記の対応するクローンへのＢａｃＭａｍ ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴの直線的な形質導入と比較して図示する。試験された種々のＰＥＩ化合物について、ＬｇＢｉＴを送達されたＰＫＣα－ＨｉＢｉＴクローン、ＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴ、またはＣＤＫ６－ＨｉＢｉＴクローンからの発光シグナルの百分率が、対応するＢａｃＭａｍ ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ形質導入ＨｉＢｉＴクローンからの発光シグナルと比べて示される。Ｂは、修飾ＰＥＩ化合物を使用してＨｅＬａ細胞のＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴクローンまたはＨＥＫ２９３細胞のＣＤＫ１２－ＨｉＢｉＴクローンにＬｇＢｉＴを送達した結果を、未修飾ポリマー及び上記の対応するクローンへのＢａｃＭａｍ ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴの直線的な形質導入と比較して図示する。試験された種々のＰＥＩ化合物について、ＬｇＢｉＴを送達されたＨｅＬａ細胞のＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴクローンまたはＨＥＫ２９３細胞のＣＤＫ１２－ＨｉＢｉＴクローンからの発光シグナルの百分率が、対応するＢａｃＭａｍ ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ形質導入ＨｉＢｉＴ－クローンと比べて示される。 Ａ～Ｂは、ＬｇＢｉＴを送達した後の、ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞に由来するＨｉＢｉＴクローンの細胞生存率の測定値を図示する。Ａは、ＰＫＣα－ＨｉＢｉＴ、ＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴ、及びＣＤＫ６－ＨｉＢｉＴを含む。Ｂは、ＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴ及びＣＤＫ１２－ＨｉＢｉＴを含む。これらの細胞へのＬｇＢｉＴ送達は、修飾ＰＥＩ化合物または未修飾ポリマーのいずれかによるものであった。陰性対照は、細胞へのＰＥＩ添加なしであった。発光シグナル（ＲＬＵ）は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイを使用して測定したときの細胞生存率を表すものである。 ＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴまたはＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴを安定に発現したクローンに、修飾ＰＥＩ化合物７６６６－３によりＬｇＢｉＴを送達した、生物発光イメージングの結果を図示する。 ＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴまたはＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴを安定に発現したクローンに、修飾ＰＥＩ化合物７６６８－１によりＬｇＢｉＴを送達した、生物発光イメージングの結果を図示する。 ＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴまたはＨｅＬａ細胞においてＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴを安定に発現したクローンに、修飾ＰＥＩ化合物７６６９－２によりＬｇＢｉＴを送達した、生物発光イメージングの結果を図示する。 Ａ～Ｂは、異なるＨｉＢｉＴ編集細胞へのＬｇＢｉＴの送達を検査するための修飾ＰＥＩ化合物及び未修飾ＰＥＩのスクリーニングの結果を図示する。Ａは、ＰＥＩによるＬｇＢｉＴ送達の百分率をＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴ形質導入と比較して図示する。Ｂは、ＰＥＩ－ＬｇＢｉＴ複合体で２４時間処理された細胞の生存率を表す。 細胞表面、細胞質、及び核上に局在するＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質にＬｇＢｉＴを送達した後の、異なる細胞株の生物発光イメージングの結果を図示する。 細胞表面、細胞質、及び核上に局在するＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質にＬｇＢｉＴを送達した後の、異なる細胞株の生物発光イメージングの結果を図示する。 細胞表面、細胞質、及び核上に局在するＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質にＬｇＢｉＴを送達した後の、異なる細胞株の生物発光イメージングの結果を図示する。 修飾ＰＥＩを使用したＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ送達後の、ＨｅＬａ細胞の蛍光イメージングの結果を未修飾ＰＥＩと比較して図示する。 修飾ＰＥＩを使用したＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ送達後の、ＨｅＬａ細胞の蛍光イメージングの結果を未修飾ＰＥＩと比較して図示する。 修飾ＰＥＩを使用したＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ送達後の、ＨｅＬａ細胞の蛍光イメージングの結果を未修飾ＰＥＩと比較して図示する。 Ａ～Ｂは、修飾ＰＥＩ化合物７６６７－４を使用した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＰＤＨのＣ末端上のＶＳ－ＨｉＢｉＴタグのＲＮＰ送達からの結果を、対照としてのＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、ＶｉａＦｅｃｔ（商標）、ＣＲＩＳＰＲＭａｘ、及びヌクレオフェクションと比較して図示する。細胞数に対して正規化された発光シグナル（ＲＬＵ）は、ＲＮＰ送達の効率を表すものである。細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイによって決定される（Ａ）。ＰＥＩの濃度を増加させることで、ＲＮＰ送達の改善が示されるが、より高い細胞毒性が引き起こされる（Ｂ）。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介してＦｌｕｃのＮ末端でＨｉＢｉＴを挿入するように設計された一定量のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートの、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞）中への送達を図示する。列挙される最終濃度での修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ化合物のタイトレーションを用いて、ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を細胞中に送達した。２日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（ＣＴＦ）を使用して、生存率に関して細胞を測定した。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介してＦｌｕｃのＮ末端でＨｉＢｉＴを挿入するように設計された一定量のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートの、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞）中への送達を図示する。列挙される最終濃度での修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ化合物のタイトレーションを用いて、ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を細胞中に送達した。２日後、ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸを使用して、Ｆｌｕｃ発現量に関して細胞を測定した。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介してＦｌｕｃのＮ末端でＨｉＢｉＴを挿入するように設計された一定量のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートの、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞）中への送達を図示する。列挙される最終濃度での修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ化合物のタイトレーションを用いて、ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を細胞中に送達した。２日後、ＨｉＢｉＴ ＮａｎｏＤＬＲアッセイを使用して、ＨｉＢｉＴシグナルに関して細胞を測定した。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介してＦｌｕｃのＮ末端でＨｉＢｉＴを挿入するように設計された一定量のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートの、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞）中への送達を図示する。列挙される最終濃度での修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ化合物のタイトレーションを用いて、ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を細胞中に送達した。ＨｉＢｉＴ／ＣＴＦ比率を使用して、ＨｉＢｉＴシグナルを細胞数に対して正規化した。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介してＦｌｕｃのＮ末端でＨｉＢｉＴを挿入するように設計された一定量のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及び一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーテンプレートの、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞）中への送達を図示する。列挙される最終濃度での修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭ化合物のタイトレーションを用いて、ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を細胞中に送達した。ＨｉＢｉＴ／Ｆｌｕｃ比率を使用して、ＨｉＢｉＴシグナルをＦｌｕｃ発現量に対して正規化した。 Ａ～Ｂは、ヌクレオフェクションまたは修飾ＰＥＩもしくはＰＡＭＡＭポリマーのいずれかを使用してＣＲＩＳＰＲによるＨｉＢｉＴのノックインのためのＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を送達した、ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞のプールを図示する。処理中の細胞死による複雑化を排除するために、測定前に細胞プールを数日間増殖させた。ＦｌｕｃのＮ末端でのＨｉＢｉＴのノックイン後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ＋ＨｉＢｉＴ ＮａｎｏＤＬＲを使用して、生存率、Ｆｌｕｃ発現量、及びＨｉＢｉＴシグナルを測定した（Ａ）。ヌクレオフェクション細胞についてのＦｌｕｃ／ＣＴＦ比率の大幅な低下は、ＩｎＤｅｌ変異によって引き起こされた発現消失を示し得る。ＨｉＢｉＴ／ＣＴＦ比率によって示されるように、修飾ポリマーによって媒介されたＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ送達は、より高い正規化Ｆｌｕｃ発現量のみならず、より高い正規化ＨｉＢｉＴシグナルもまたもたらした。同様に、修飾ＰＥＩポリマーは、ＧＡＰＤＨのＣ末端でＨｉＢｉＴをノックインするように設計されたＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物の送達後に、ヌクレオフェクションと比較してより高い正規化ＨｉＢｉＴシグナルを示す（Ｂ）。 Ａ～Ｂは、実施例６に記載されるような、本明細書に記載の修飾ＰＥＩポリマーが細胞中に機能的ＬｇＢｉＴを送達することを実証するためのタンパク質分解アッセイの結果を示す。 実施例７に記載されるような、細胞株（ＨＥＫ２９３）における細胞内発光系及び細胞外発光系を識別するアッセイの結果を示す。 実施例７に記載されるような、細胞株（Ａ５４９）における細胞内発光系及び細胞外発光系を識別するアッセイの結果を示す。 実施例７に記載されるような、細胞株（Ｈ１２９９）における細胞内発光系及び細胞外発光系を識別するアッセイの結果を示す。 実施例７に記載されるような、細胞株（Ｍｉａ－ＰａＣａ２）における細胞内発光系及び細胞外発光系を識別するアッセイの結果を示す。
本明細書では、細胞に生体分子を送達する際に使用するための修飾ポリエチレンイミンポリマー及び修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーが提供される。
この修飾ポリマー及びデンドリマーは、一部の実施形態では、フッ素化置換基を含む。フッ素化化合物は、極性環境及び非極性環境の両方で高い相分離傾向を有して、疎水性であると同時に疎油性であり、したがって、フッ素化は、細胞膜に対するポリマーの親和性を改善し得、また細胞膜の脂質二重層ならびにエンドソーム／リソソーム膜を横断する分子の輸送を補助して、ポリマーのエンドソーム脱出を容易にし得る。加えて、フッ素化ポリマーは、低い表面エネルギーを有し、低濃度で互いに優先的に会合することにより、低濃度で核酸またはタンパク質とのポリマー複合体の形成を可能にする。
この節及び本開示全体において使用されるような節の見出しは、単に編成目的のものであり、限定することは意図されない。
１．定義
本明細書で別途定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の学術用語、及びそれらの技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。用語の意味及び範囲は明確であるはずであるが、何らかの潜在的な曖昧さが存在する場合には、本明細書に提供される定義が、いずれの辞書または外部からの定義に対しても優先される。さらに、文脈上他の解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
特定の官能基及び化学用語の定義は、下記により詳細に記載される。本開示の目的において、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳ版（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄ．，見返し）に従って特定され、具体的な官能基は、一般に、同文献に記載されるように定義される。追加として、有機化学の一般原理、ならびに具体的な官能性部分及び反応性は、Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２nd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，２００６、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１３、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１８、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載され、同文献の各々の内容全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１～３０個の炭素原子、例えば、１～１６個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ16アルキル）、１～１４個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ14アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ12アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ10アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ8アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ6アルキル）、または１～４個の炭素原子（Ｃ1～Ｃ4アルキル）を含有する直鎖状または分岐状の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「アリール」という用語は、フェニル基、または二環式もしくは三環式芳香族縮合環系を指す。二環式縮合環系としては、フェニル基が親分子部分に付加され、フェニル基に縮合されたものが例として挙げられる。三環式縮合環系としては、フェニル基が親分子部分に付加され、２つの他のフェニル基に縮合されたものが例として挙げられる。二環式アリールの代表的な例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限定されない。三環式アリールの代表的な例としては、アントラセニルが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、３～１０個の炭素原子及び０個のヘテロ原子を含有する飽和炭素環式環系を指す。シクロアルキルは、単環式、二環式、架橋、縮合、またはスピロ環式であり得る。シクロアルキルの代表的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及びビシクロ［５．２．０］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
本明細書で使用される「ハロアルキル」という用語は、本明細書で定義されるようなアルキル基において、１個または複数の水素原子がハロゲンによって置き換えられているものを意味する。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の水素原子がハロゲンによって置き換えられ得る。ハロアルキルの代表的な例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、及び２，２，２－トリフルオロエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、芳香族単環式環または芳香族二環式環系もしくは芳香族三環式環系を指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立して選択される１個、２個、３個、または４個のヘテロ原子）を含有する５員または６員環である。５員の芳香族単環式環は、２個の二重結合を有し、６員の芳香族単環式環は、３個の二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基としては、単環式ヘテロアリール環が、本明細書で定義されるような単環式アリール基または本明細書で定義されるような単環式ヘテロアリール基に付加され縮合されたものが例として挙げられる。三環式ヘテロアリール基としては、単環式ヘテロアリール環が、本明細書で定義されるような単環式アリール基または本明細書で定義されるような単環式ヘテロアリール基から独立して選択される２つの環に縮合されたものが例として挙げられる。単環式ヘテロアリールの代表的な例としては、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ベンゾピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、１，２，４－トリアジニル、及び１，３，５－トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの代表的な例としては、ベンズイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、クロメニル（ｃｈｒｏｍｅｎｙｌ）、イミダゾピリジン、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、プリニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、チアゾロピリジニル、チアゾロピリミジニル、チエノピロリル、及びチエノチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表的な例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロアリールは、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分につなげられる。
本明細書で使用される「複素環」または「複素環式」という用語は、単環式複素環、二環式複素環、または三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有する３員、４員、５員、６員、７員、または８員環である。３員または４員環は、０個または１個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含有する。５員環は、０個または１個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個、２個、または３個のヘテロ原子を含有する。６員環は、０個、１個、または２個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個、２個、または３個のヘテロ原子を含有する。７員及び８員環は、０個、１個、２個、または３個の二重結合、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個、２個、または３個のヘテロ原子を含有する。単環式複素環の代表的な例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式複素環は、単環式複素環がフェニル基に縮合されたもの、または単環式複素環が単環式シクロアルキルに縮合されたもの、または単環式複素環が単環式シクロアルケニルに縮合されたもの、または単環式複素環が単環式複素環に縮合されたもの、またはスピロ複素環基、あるいは架橋単環式複素環系において、環の２個の非隣接原子が、１個、２個、３個、もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋、または２個、３個、もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されているものである。二環式複素環の代表的な例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式複素環としては、二環式複素環がフェニル基に縮合されたもの、または二環式複素環が単環式シクロアルキルに縮合されたもの、または二環式複素環が単環式シクロアルケニルに縮合されたもの、または二環式複素環が単環式複素環に縮合されたもの、あるいは二環式複素環において、二環式環の２個の非隣接原子が、１個、２個、３個、もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋、または２個、３個、もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結されているものが例として挙げられる。三環式複素環の例としては、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及びオキサ－アダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式複素環は、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分につなげられる。
本明細書で使用される「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基において、各水素がフッ素と置き換えられているものを指す。ペルフルオロアルキルの代表的な例としては、トリフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロペンチル、及びペルフルオロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ポリ（アミドアミン）」（または「ＰＡＭＡＭ」）という用語は、ジアミンコア、ならびにこのジアミンとアクリル酸メチル及び次いで別のジアミンとの反応によって生成される、アミド及びアミン官能基を有する繰り返し分岐したサブユニットを有する、当該技術分野で認識されるデンドリマーのクラスを指す。これらのデンドリマーは、コアから伸長するアミドアミン基の「層」の数によって定義され、各「層」が「世代」と称される。例えば、エチレンジアミンをアクリル酸メチルと反応させて、３－［２－［ビス（３－メトキシ－３－オキソプロピル）アミノ］エチル－（３－メトキシ－３－オキソプロピル）アミノ］プロパン酸メチルを生成することができ、次いで、これをさらなるエチレンジアミンと反応させて、「第０世代」ＰＡＭＡＭである、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－［［３－（２－アミノエチルアミノ）－３－オキソプロピル］－［２－［ビス［３－（２－アミノエチルアミノ）－３－オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］プロパンアミドを形成させることができる。同じ反応順序を繰り返して、第０世代ＰＡＭＡＭの各一級アミノ基を同様に官能基化することにより、第１世代ＰＡＭＡＭを形成させることができ、これ以降も同様である。「コア」の第０世代ＰＡＭＡＭ構造が強調された、第１世代ＰＡＭＡＭの化学構造が下記に示される。
Figure 2022539343000002
本明細書で使用される「ポリエチレンイミン」（または「ＰＥＩ」）という用語は、イミノエチレン基の繰り返しに基づくポリマーを指す。「直鎖状ポリエチレンイミン」は、式－（ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＨ）n－を有する直鎖状ポリマーであり、故に、ポリマー鎖内に二級アミノ基のみを含む。「分岐状ポリエチレンイミン」は、アジリジンの開環重合によって合成される分岐状ポリマーであり、一級、二級、及び三級アミノ基を含む。分岐状ポリエチレンイミンは、下記に例示されるように図示される場合が多いが、当業者であれば、分岐状ポリエチレンイミンが、括弧間に示される厳密な種類の繰り返し単位を有するポリマーではなく、むしろ、これが単に、個々の－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＨ－基が一緒に連結され得る様々な方式の実例を提供するものであり、追加の連結及び分岐点が可能であることを理解しよう。
Figure 2022539343000003
一部の事例では、基（例えば、アルキル、ハロアルキル、またはシクロアルキル）における炭素原子の数は、「Ｃx～Ｃy－」という接頭辞によって指定され、ここで、ｘは、その基における炭素原子の最小数であり、ｙは、最大数である。故に、例えば、「Ｃ1～Ｃ3－アルキル」は、１～３個の炭素原子を含有するアルキル基を指し、「Ｃ1～Ｃ6－ハロアルキル」は、１～６個の炭素原子を含有するハロアルキル基を指す。
「置換基」という用語は、指定される基の原子上で置換された基を指す。
ある基または部分が置換され得る場合、「置換」という用語は、「置換」を使用した表現により指定される基にある１個または複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個、一部の実施形態では１個、２個、または３個、他の実施形態では１個または２個）の水素が、列挙される指定の基の選択肢、または当該技術分野で既知の好適な基（例えば、下記に列挙される基のうちの１つまたは複数）と置き換えられ得ることを示す。置換基には、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、－ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、及びアシルが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」及び「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ」という用語は、互換的に使用され、野生型、そのバリアント及び変異体を含めた深海エビＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓから分泌されるルシフェラーゼ（例えば、配列番号１）を指す。例えば、好適なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼバリアントは、米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号に記載され、同文献の各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。例となるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼには、例えば、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書で互換的に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも称される）が含まれる。
本明細書に記載の化合物に関して、その基及び置換基は、その選択及び置換が、例えば、転位、環化、脱離等によるような変換を自発的に経ることのない、安定な化合物をもたらすように、許容される原子及び置換基の原子価に準拠して選択され得る。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及びそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を除外しない開放式の移行句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。本明細書における多くの実施形態は、開放形式の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言い回しを使用して記載される。かかる実施形態は、複数の閉鎖式の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態を包含し、これらは代替として、かかる文言を使用して特許請求または記載され得る。本開示はまた、明示的に定められるか否かにかかわらず、本明細書で提示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙に関しては、それらの間に介在する同じ精度を有する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲の場合、６及び９に加えて７及び８という数が企図され、６．０～７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に企図される。
２．ポリマー
本開示は、遺伝子、タンパク質、及びリボ核タンパク質、ならびに関連する複合体等の生体分子の細胞中への送達に好適である、修飾ポリアミンポリマーを含む。
一部の実施形態では、本開示は、
ポリエチレンイミンポリマーと、
該ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
－Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
（Ｉ）、
式中、
Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
ｎが、０、１、２、３、４、または５であり、
Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、化合物を提供する。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、約５００Ｄａ～約２５００００Ｄａ、または約５００Ｄａ～約３００００Ｄａ、または約５００Ｄａ～約２０００Ｄａ、または約５０００Ｄａ～約２５０００Ｄａの重量平均分子量を有する。例えば、ポリエチレンイミンポリマーは、約５００Ｄａ、約６００Ｄａ、約７００Ｄａ、約８００Ｄａ、約９００Ｄａ、約１０００Ｄａ、約１２００Ｄａ、約１４００Ｄａ、約１６００Ｄａ、約１２００Ｄａ、約１４００Ｄａ、約１６００Ｄａ、約１８００Ｄａ、約２０００Ｄａ、約３０００Ｄａ、約４０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約６０００Ｄａ、約７０００Ｄａ、約８０００Ｄａ、約９０００Ｄａ、約１００００Ｄａ、約１５０００Ｄａ、約２００００Ｄａ、約２５０００Ｄａ、約３００００Ｄａ、約３５０００Ｄａ、約４００００Ｄａ、約４５０００Ｄａ、約５００００Ｄａ、約１０００００Ｄａ、約１５００００Ｄａ、約２０００００Ｄａ、または約２５００００Ｄａの重量平均分子量を有し得る。特定の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、約６００Ｄａ、約８００Ｄａ、約１２００Ｄａ、約１８００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１００００Ｄａ、または約２５０００Ｄａの重量平均分子量を有する。
ポリエチレンイミンポリマーは、直鎖状または分岐状であってもよい。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、直鎖状ポリエチレンイミンポリマーである。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンポリマーである。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーは、架橋されていてもよい。例えば、ポリエチレンイミンポリマーは、該ポリマーが式（Ｉ）の複数の置換基を含むようになる官能基化前または後に、尿素と架橋され得る（すなわち、２つの異なるポリマー上の２つのアミノ基がＣ＝Ｏ基によって一緒に連結されるように）。
式（Ｉ）の複数の置換基において、Ｘは、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。一部の実施形態では、Ｘは、結合である。一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。
式（Ｉ）の複数の置換基において、ｎは、０、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態では、ｎは、０である。一部の実施形態では、ｎは、１である。一部の実施形態では、ｎは、２である。一部の実施形態では、ｎは、３である。一部の実施形態では、ｎは、４である。一部の実施形態では、ｎは、５である。一部の実施形態では、ｎは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、ｎは、１または２である。一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１または２である。
式（Ｉ）の複数の置換基において、Ｚは、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される。一部の実施形態では、Ｚは、ハロアルキル基、置換アリール基、及び非置換ヘテロアリール基から選択される。
一部の実施形態では、Ｚは、ハロアルキル基である。一部の実施形態では、ハロアルキル基は、ペルフルオロアルキル基である。一部の実施形態では、Ｚは、式－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、一部の実施形態では、ｍは、１である。一部の実施形態では、ｍは、２である。一部の実施形態では、ｍは、３である。一部の実施形態では、ｍは、４である。一部の実施形態では、ｍは、５である。一部の実施形態では、ｍは、６である。一部の実施形態では、ｍは、７である。一部の実施形態では、ｍは、８である。一部の実施形態では、ｍは、９である。一部の実施形態では、ｍは、１０である。一部の実施形態では、ｍは、３、４、５、６、または７である。
一部の実施形態では、Ｚは、アリール基または置換アリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、置換アリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、置換フェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、ハロから選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの置換基で置換されたフェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、ペンタフルオロフェニル基である。
一部の実施形態では、Ｚは、ヘテロアリール基または置換ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換単環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、Ｎ、Ｏ、及びＳから独立して選択される１個、２個、または３個のヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ピリジル基である。
一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｎは、１または２である。一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。例えば、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基の約０．１ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％、約７０ｍｏｌ％、約７５ｍｏｌ％、または約８０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。修飾の程度は、例えば、下記でさらに考察されるような異なる量の試薬を使用することによって、調整することができる。修飾の程度は、例えば、1Ｈ ＮＭＲ分光法を使用して、決定することができる。
一部の実施形態では、本開示は、
ポリ（アミドアミン）デンドリマーと、
該ポリ（アミドアミン）デンドリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
－Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
（Ｉ）、
式中、
Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
ｎが、０、１、または２であり、
Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、化合物を提供する。
一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代、または第１０世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代、または第１０世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第１世代、第２世代、第３世代、または第４世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第１世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第２世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第３世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第４世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである。
式（Ｉ）の複数の置換基において、Ｘは、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。一部の実施形態では、Ｘは、結合である。一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。
式（Ｉ）の複数の置換基において、ｎは、０、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態では、ｎは、０である。一部の実施形態では、ｎは、１である。一部の実施形態では、ｎは、２である。一部の実施形態では、ｎは、３である。一部の実施形態では、ｎは、４である。一部の実施形態では、ｎは、５である。一部の実施形態では、ｎは、０、１、または２である。一部の実施形態では、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１である。
式（Ｉ）の複数の置換基において、Ｚは、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される。一部の実施形態では、Ｚは、ハロアルキル基、置換アリール基、及び非置換ヘテロアリール基から選択される。
一部の実施形態では、Ｚは、ハロアルキル基である。一部の実施形態では、ハロアルキル基は、ペルフルオロアルキル基である。一部の実施形態では、Ｚは、式－（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、一部の実施形態では、ｍは、１である。一部の実施形態では、ｍは、２である。一部の実施形態では、ｍは、３である。一部の実施形態では、ｍは、４である。一部の実施形態では、ｍは、５である。一部の実施形態では、ｍは、６である。一部の実施形態では、ｍは、７である。一部の実施形態では、ｍは、８である。一部の実施形態では、ｍは、９である。一部の実施形態では、ｍは、１０である。一部の実施形態では、ｍは、３、４、５、６、または７である。
一部の実施形態では、Ｚは、アリール基または置換アリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、置換アリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、置換フェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、ハロから選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの置換基で置換されたフェニル基である。一部の実施形態では、Ｚは、ペンタフルオロフェニル基である。
一部の実施形態では、Ｚは、ヘテロアリール基または置換ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換単環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、Ｎ、Ｏ、及びＳから独立して選択される１個、２個、または３個のヘテロ原子を有する単環式ヘテロアリール基である。一部の実施形態では、Ｚは、非置換ピリジル基である。
一部の実施形態では、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｎは、１または２である。一部の実施形態では、Ｘは、結合であり、ｎは、１または２である。
一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。例えば、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、または約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。一部の実施形態では、ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約０．１ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％、約７０ｍｏｌ％、約７５ｍｏｌ％、または約８０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している。修飾の程度は、例えば、下記でさらに考察されるような異なる量の試薬を使用することによって、調整することができる。修飾の程度は、例えば、1Ｈ ＮＭＲ分光法を使用して、決定することができる。
ポリマーは、カチオン性であり得る官能基を含み（例えば、－ＮＨ2は、－ＮＨ3 +であり得る）、故に、一部の実施形態では、好適なアニオンと塩が形成され得る。好適な無機アニオンの例としては、以下の無機酸、すなわち、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。好適な有機アニオンの例としては、以下の有機酸、すなわち、２－アセチオキシ安息香酸（ａｃｅｔｙｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ）、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、該化合物は、塩酸塩である。
該化合物は、様々な方法によって調製される。例えば、カルバメート修飾された直鎖状もしくは分岐状ＰＥＩポリマーまたはＰＡＭＡＭデンドリマーは、スキーム１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃに例示されるように、フッ素化アルキルｐ－ニトロベンゼンカーボネート化合物と反応させることによって調製することができる。ＰＥＩポリマー及びＰＡＭＡＭデンドリマーはまた、スキーム２に例示されるように、フッ素化アルデヒドと反応させてイミン付加体を形成させ、続いてＮａＢＨ4でイミン還元を行って、所望のアルキル化ポリマーを得ることによっても修飾することができる。アミンの修飾百分率は、異なる量の試薬を添加することによって調整することができる。加えて、スキーム３に例示されるように、分岐状ＰＥＩの一級アミンをＢＯＣによってある程度保護し、続いてフッ素化ハロゲン化アルキルでアルキル化し、脱保護して、遊離一級アミンアルキル化ＰＥＩ化合物を生み出すことができる。
以下のスキームにおいては、以下の略号が使用される：Ｂｏｃは、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルであり、ＤＣＭは、ジクロロメタンであり、ＴＨＦは、テトラヒドロフランであり、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり、ＴＩＰＳは、トリイソプロピルシランである。
スキーム１．カルバメート修飾を介した修飾ポリマーの合成
Ａ．カルバメート修飾された分岐状ＰＥＩ化合物の合成
Figure 2022539343000004
 Ｂ．カルバメート修飾された直鎖状ＰＥＩ化合物の合成
Figure 2022539343000005
 Ｃ．カルバメート修飾されたＰＡＭＡＭ第１世代の合成
Figure 2022539343000006
 スキーム２．イミン還元による修飾ＰＥＩポリマーの合成
Figure 2022539343000007
 スキーム３．ＢＯＣ保護、アルキル化、及び脱保護を介した遊離一級アミンを有するアルキル化ＰＥＩ
Figure 2022539343000008
ここでの化合物及び中間体は、有機合成分野の当業者に周知の方法によって単離及び精製され得る。化合物を単離及び精製するための慣習的な方法の例としては、例えば、「Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），ｂｙ Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，ｐｕｂ．Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に記載されるような、アルキルシラン基で誘導体化されたシリカゲル、アルミナ、またはシリカ等の固体支持体上でのクロマトグラフィー、活性炭での任意選択的な前処理を伴う高温または低温での再結晶によるもの、薄層クロマトグラフィー、種々の圧力での蒸留、真空下での昇華、及びトリチュレーションが挙げられるが、これらに限定されない。
個々のステップの各々についての反応条件及び反応時間は、用いられる特定の反応物及び使用される反応物中に存在する置換基に応じて様々であり得る。具体的な手順は、実施例の節に提供される。反応は、慣習的な様態で、例えば、溶媒を残渣から排除することによって後処理し、限定されないが、結晶化、蒸留、抽出、トリチュレーション、及びクロマトグラフィー等の当該技術分野で一般に既知の手法に従ってさらに精製することができる。別途記載されない限り、出発物質及び試薬は、市販ものであるか、または当業者が、化学文献に記載される方法を使用して市販の材料から調製することができるかのいずれかである。出発物質は、市販されていない場合、標準的な有機化学技法、構造的に類似した既知の化合物の合成に類似する技法、または上述のスキームもしくは合成の実施例の節に記載される手順に類似する技法から選択される手順によって調製することができる。
反応条件、試薬、及び合成経路の順序の適切な操作、反応条件と適合することができない任意の化学官能基の保護、ならびにその方法の反応順序における好適な時点での脱保護を含めた、通例の実験が本発明の範囲に含まれる。好適な保護基、ならびにかかる好適な保護基を使用して異なる置換基を保護及び脱保護するための方法は、当業者に周知であり、その例は、ＰＧＭ Ｗｕｔｓによる「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（５ｔｈ ｅｄ．）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０１４））と題される論文に見出すことができ、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。本発明の化合物の合成は、上述の合成スキーム及び具体的な実施例に記載される方法に類似した方法によって遂行することができる。
記載されるような合成スキーム及び具体的な実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲は特許請求の範囲で規定されるため、本発明の範囲を限定するものとして閲読されるものではない。合成方法及び具体的な実施例のあらゆる代替形態、修正形態、及び等価物が、特許請求の範囲内に含まれる。
調製された例となるポリマーには、表１に列挙されるものが含まれる。実際及び／または理論上の修飾百分率を用いた具体的な実施例を含む、これらのポリマーの合成に関するさらなる詳細は、実施例に見出すことができる。
Figure 2022539343000009
Figure 2022539343000010
３．方法
本開示の実施形態は、細胞中に目的の生体分子を送達するために使用される種々の組成物及び方法を含む。これらの実施形態によれば、該組成物及び方法は、場合によってはエレクトロポレーションの必要性なしに、細胞中にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボ核タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの１つまたは複数を送達するための、ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭデンドリマー等の修飾ポリアミンポリマーの使用を含む。
本明細書に開示されるようなＰＥＩもしくはＰＡＭＡＭデンドリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物を使用して、細胞中に核酸分子を送達することができる（例えば、遺伝子トランスフェクション）。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ及び誘導体を含むポリヌクレオチドである。「核酸分子」、「核酸配列」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同義語であり、一本鎖または二本鎖であり得、非天然または改変ヌクレオチドを含有し得るＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを包含することが意図される。これらの用語は、等価物として、限定されないが、メチル化及び／またはキャップ付加ポリヌクレオチド等のヌクレオチド類似体及び修飾ポリヌクレオチドから作製される、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含む。核酸は、典型的には、リン酸結合を介して連結されて、核酸配列またはポリヌクレオチドを形成するが、多くの他の連結が当該技術分野で既知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート等）。
１つまたは複数の核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）であり得る。一部の実施形態では、核酸分子は、プラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡから物理的に分離されており、独立して（すなわち「エピソーム」として）複製することができる、細胞内の小さなＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、細菌、古細菌、及び他の真核生物に天然に存在し、小さな環状二本鎖ＤＮＡ分子として一般的に存在する。分子クローニングにおけるベクターとして合成プラスミドが当該技術分野で広く使用され、宿主生物内で組換えＤＮＡ配列の複製を駆動する。プラスミドＤＮＡは、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｎｅ １５，２０１２）に記載される技法等の通例の分子生物学技法を使用して生成されてもよいし、または商業的供給源から得られてもよい。
プラスミドは、インビトロまたはインビボのいずれかで標的細胞に送達されることになる異種核酸配列を含む、任意の好適な組換えＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドであってもよい。異種核酸配列は、例えば疾患の治療または予防の目的で、目的の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードし得、任意選択で、発現カセットの形態であり得る。「組換え」という用語は、天然に存在しないか、または自然界では見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結されているかのいずれかである、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される「異種」という用語は、それが比較されている残りの実体とは遺伝学的に明確に異なる実体から得られたまたはそれに由来する核酸配列を指す。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるようなＰＥＩまたはＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して、細胞中にタンパク質、ペプチド、または抗体を送達することができる。例えば、ＰＥＩまたはＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して、限定されないが、ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号２）、ＨｉＢｉＴ（配列番号３）、ＬｇＢｉＴ（配列番号４）、ＳｍＢｉＴ（配列番号５）、ＤａｒｋＢｉＴ（配列番号６）、ＤａｒｋＢｉＴ（配列番号７、配列番号８）、ＬｇＴｒｉｐ ３０９２（配列番号９）、ＬｇＴｒｉｐ ３５４６（配列番号１０）、ＬｇＴｒｉｐ ２０９８（配列番号１１）、及びＳｍＴｒｉｐ９（配列番号１２）等の、生物発光複合体を形成することができる（例えば、相補的）タンパク質またはペプチド（またはそのポリヌクレオチド）を送達することができる。一部の実施形態では、相補的な生物発光タンパク質またはペプチドを使用して、生物発光（例えば、生物発光複合体の形成）の検出または非検出に基づく後続の評価または監視のために、１つまたは複数の目的のタンパク質または目的のペプチドをタグ付けすることができる。
これらの実施形態によれば、修飾ＰＥＩまたはＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して送達されたタンパク質またはペプチドを使用して、タンパク質間相互作用、遮断抗体によるタンパク質干渉、細胞内トラフィッキング、及びタンパク質またはペプチドの生物学的機能を研究することができる。例えば、修飾ＰＥＩまたはＰＡＭＡＭデンドリマーを使用して送達されたペプチドまたはタンパク質は、生細胞におけるタンパク質の定量のために、他方の断片でタグ付けされた標的タンパク質と相補的タンパク質を形成することができる。一実施形態では、細胞においてＬｇＢｉＴを直接送達することによって、ＨｉＢｉＴタグ付きタンパク質標的（例えば、ＨｉＢｉＴタグを含む目的のタンパク質）を定量することができ、これにより別個の遺伝子トランスフェクションステップ（例えば、ＢａｃＭａｍトランスフェクション、ヌクレオフェクション等）の必要性を取り除く。
一部の実施形態では、核酸分子は、標的遺伝子の編集または修飾を媒介する１つまたは複数の核酸配列を含むＤＮＡプラスミドである。例えば、ＤＮＡプラスミドは、Ｃａｓ９遺伝子またはタンパク質を含むがこれらに限定されない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集系の構成要素を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系は、細胞において目的の特定の遺伝子の標的化された修飾を可能にするために開発されてきた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系は、原核生物の規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列ＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）適応免疫系からのＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼに基づく（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６（２０１２）、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９，Ｅ２５７９（２０１２）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６８：６７（２０１０）、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４７５（２０１０）、Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７：１６７（２０１０）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，４６７（２０１１）、Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，４５，２７３（２０１１）、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３（２０１３）、ならびに米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７９５，９６５号、及び同第９，３２２，０３７号を参照されたく、これらの文献の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。
一部の実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲ標的化型ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むｇＲＮＡ等の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系と適合性であるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素は、ゲノムＤＮＡの特定の配列を標的化するために１つのＲＮＡ分子へと融合される（ｇＲＮＡは自然界で見出されない）。ｃｒＲＮＡ配列は一般に、所望のゲノムＤＮＡを標的化するために合成される一方で、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するために必要とされる細菌配列に由来する。ガイドＲＮＡはまた、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称され得る。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を構成することができる。ＲＮＰは一般に、ｇＲＮＡと複合体を形成した精製Ｃａｓ９タンパク質を含む。かかるＲＮＰは、インビトロで組み立てることができ、場合によってはエレクトロポレーションの必要性なしに、本開示のＰＥＩ及びＰＡＭＡＭデンドリマー等の修飾ポリアミンポリマーを使用して細胞に直接送達することができる。Ｃａｓ９ ＲＮＰは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのプラスミドベースの発現と比較して類似の効率でゲノム標的を切断することができ、多種多様な細胞種における単一遺伝子または複数遺伝子ノックアウトの生成、相同配列依存的修復（ＨＤＲ）を使用した遺伝子編集、及び大きなゲノム欠失の生成を含むがこれらに限定されない、ほとんどの現行のＣＲＩＳＰＲのゲノム操作用途に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書にさらに開示されるように、細胞において目的のタンパク質上の発光ペプチドまたはポリペプチドタグの挿入を容易にするために、ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭデンドリマー等の修飾ポリアミンポリマーを使用して、細胞中にＣａｓ９ ＲＮＰが送達される。一部の実施形態では、細胞中へのかかるＲＮＰの送達は、目的のタンパク質及び発光タグの発現をもたらし（例えば、タグの発光によって測定されるような）、及び／または目的のタンパク質及び発光タグの安定な発現を示すクローンの生産をもたらし得る。例えば、Ｃａｓ９ ＲＮＰは、Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡテンプレートを含み得る。ドナーＤＮＡテンプレートは、発光活性が可能なペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに目的の内因性タンパク質の近くでのペプチドまたはポリペプチドの挿入を容易にするゲノム配列（例えば、ホモロジーアーム）を含み得る。Ｃａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡテンプレートを含むＲＮＰは、タンパク質発現（例えば、発光）の一過性の定量及び安定な定量の両方のために、細胞中への送達を容易にするための本開示の修飾ポリアミンポリマーを含む組成物に組み込むことができる。
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＮａｎｏＬｕｃに由来する１８ｋＤａのサブユニット（ＬｇＢｉＴ）との高い親和性での相補性により高輝度の定量的発光を生じさせることができる１１アミノ酸のポリペプチドである、ＨｉＢｉＴ（配列番号３）をコードする配列を含む。これらの実施形態によれば、ＨｉＢｉＴをコードする配列を含むドナーＤＮＡを有するＲＮＰは、本開示の修飾ポリアミンポリマーを使用して細胞中に送達することができる。一部の実施形態では、発光を生成するために、発光基質及びＬｇＢｉＴ（配列番号４）が細胞溶解物に添加されるか、または本開示の修飾ポリアミンポリマーを使用して細胞中に直接送達される。基質の存在下でのＨｉＢｉＴ及びＬｇＢｉＴの相補性により、目的のタンパク質の発現に比例する発光シグナルが生成される。場合によっては、本開示の修飾ポリアミンポリマーによる細胞中へのＲＮＰ及び／または発光性ペプチドもしくはポリペプチドの送達は、顕著な細胞毒性を引き起こすことなく、エレクトロポレーション等の他の送達方法を使用する必要性を取り除く。
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＮａｎｏＬｕｃに由来する１８ｋＤａのサブユニット（例えば、ＬｇＢｉＴ）との高い親和性での相補性により高輝度の定量的発光を生じさせることができる１１アミノ酸のポリペプチド（例えば、ＳｍＢｉＴ（配列番号５））をコードする配列を含む。これらの実施形態によれば、ＳｍＢｉＴをコードする配列を含むドナーＤＮＡを有するＲＮＰは、本開示の修飾ポリアミンポリマーを使用して細胞中に送達することができる。一部の実施形態では、発光を生成するために、発光基質及びＬｇＢｉＴ（配列番号４）が細胞溶解物に添加されるか、または本開示の修飾ポリアミンポリマーを使用して細胞中に直接送達される。基質の存在下でのＳｍＢｉＴ及びＬｇＢｉＴの相補性により、目的のタンパク質の発現に比例する発光シグナルが生成される。場合によっては、本開示の修飾ポリアミンポリマーによる細胞中へのＲＮＰ及び／または発光性ペプチドもしくはポリペプチドの送達は、顕著な細胞毒性を引き起こすことなく、エレクトロポレーション等の他の送達方法を使用する必要性を取り除く。
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、米国特許第９，７９７，８９０号に開示されるペプチドまたはポリペプチドのうちのいずれかをコードする配列を含み、同文献は参照によりその全体が全目的で本明細書に援用される。例えば、ドナーテンプレートは、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ（配列番号８）との単一のアミノ酸の相違を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ドナーテンプレートは、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ（配列番号２）との２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個等）のアミノ酸の相違を含むペプチドもしくはポリペプチド、または米国特許第９，７９７，８９０号に開示される任意の他のペプチドもしくはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、米国仮特許第６２／６８４，０１４号に開示されるペプチドまたはポリペプチドのうちのいずれかをコードする配列を含み、同文献は参照によりその全体が全目的で本明細書に援用される。例えば、ドナーテンプレートは、ＬｇＴｒｉｐ ３０９２（配列番号９）、ＬｇＴｒｉｐ ３５４６（配列番号１０）、ＬｇＴｒｉｐ ２０９８（配列番号１１）、またはＳｍＴｒｉｐ９（配列番号１２）のアミノ酸との単一のアミノ酸の相違を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ドナーテンプレートは、配列番号９～１２との２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個等）のアミノ酸の相違を含むペプチドもしくはポリペプチド、または米国仮特許第６２／６８４，０１４号に開示される任意の他のペプチドもしくはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含み得る。
本開示の実施形態はまた、例えば、トランスフェクション効率及び毒性レベルの関連において許容される結果を提供し得る、目的の生体分子に最適な濃度での最適な修飾ＰＥＩもしくはＰＡＭＡＭの濃度、またはそれらの組み合わせを特定することを含む。これらの比率または濃度は、経験的に決定されてもよく、ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭにおけるアミンの修飾百分率、目的の生体分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド）、細胞の種類、細胞密度、アッセイの性質等を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存しよう。一部の実施形態では、最適な濃度は、ｎＭ～μＭの範囲である。一部の実施形態では、最適な濃度は、１μＭ～２０μＭの範囲である。
本開示の組成物及び方法と共に使用することができる細胞には、任意の好適な原核または真核細胞が含まれる。好適な細胞には、容易かつ確実に増殖させられる細胞、適度に速い増殖速度を有する細胞、特徴がよく解明されている発現系を有する細胞、及び容易かつ効率的に形質転換またはトランスフェクトされ得る細胞が含まれ得る。好適な原核細胞の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ等）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（Ｅ．ｃｏｌｉ等）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、及びＥｒｗｉｎｉａ属由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な原核細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの種々の株（例えば、Ｋ１２、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５ａ、ＤＨ１０、ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８）、及びＣＣ１０２）が含まれる。好適な真核細胞は当該技術分野で既知であり、これには、例えば、初代細胞及び形質転換細胞を含めた、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの好適な哺乳類宿主細胞が当該技術分野で既知であり、多くがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。好適な哺乳類細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６－４２２０（１９８０））、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳類細胞株は、サルＣＯＳ－１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ－７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ならびにＣＶ－１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。
本開示の実施形態はまた、本明細書に記載の種々の構成要素を含むキットを含む。例えば、キットは、本明細書に記載の修飾ポリアミンポリマー化合物またはその塩のうちのいずれかを、容器及び／または説明書と共に含み得る。キットはまた、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの少なくとも１つを含んでもよい。一部の実施形態では、キットは、Ｃａｓ９タンパク質のペプチドまたはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、キットは、発光ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＨｉＢｉＴ、ＬｇＢｉＴ）をコードする配列を含むドナーＤＮＡテンプレートを含む。一部の実施形態では、キットは、ｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、キットは、例えば、Ｃａｓ９タンパク質のペプチドまたはポリペプチド、発光ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＨｉＢｉＴ、ＬｇＢｉＴ）をコードする配列を含むドナーＤＮＡテンプレート、及びｇＲＮＡを含む、ＲＮＰ複合体を含む。
本明細書に記載される本開示の方法の他の好適な修正及び適合が容易に適用可能かつ認識可能であり、本開示の範囲または本明細書に開示される態様及び実施形態を逸脱することなく好適な等価物を使用してなされ得ることが当業者には容易に明らかとなろう。以上、本開示を詳細に記載したが、同じことが、以下の実施例を参照することでより明確に理解されることになり、これらの実施例は、単に本開示の一部の態様及び実施形態を例示することのみを意図しており、本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で参照される全ての学術誌参考文献、米国特許、及び刊行物の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
本開示は、以下の非限定的な実施例により例示される複数の態様を有する。
これらの実施例においては、以下の略号が使用される：Ｂｏｃは、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルであり、ＤＭＥＭは、ダルベッコ変法イーグル培地であり、ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであり、ＥｔＯＨは、エタノールであり、ＦＢＳは、ウシ胎児血清であり、ＭｅＯＨは、メタノールであり、ＴＨＦは、テトラヒドロフランである。
実施例１
化合物合成
Ｉ．カルバメート修飾
フッ素化アルキルｐ－ニトロベンゼンカーボネートの合成。
Figure 2022539343000011
脱水ＴＨＦ中のフッ素化アルコール（１当量）及びｐ－ニトロベンゼンクロロホルメート（１．５当量）の溶液に、脱水ピリジン（３当量）を０℃で添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。白色の固体を濾過によって除去した後、濾液の溶媒を蒸発させ、残渣を、溶離液としてヘプタン／酢酸エチルを使用したシリカカラムによって精製して、８０～９０％の収率で所望の化合物を得た。
４－ニトロフェニル（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクチル）カーボネート（ＷＺ－０８４５）： 1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ2Ｃｌ2， δ ｐｐｍ）： ８．３１ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４６ （ｄ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２Ｏ）， ２．６９ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ15Ｈ8Ｆ13ＮＯ5）： 計算値５２９．２１， 観測値５２９．４。
４－ニトロフェニル（３，３，４，４，５，５，６，６，６－ノナフルオロヘキシル）カーボネート（ＷＺ－０９２１）。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ2Ｃｌ2， δ ｐｐｍ）： ８．３３ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２Ｏ）， ２．７０ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ13Ｈ8Ｆ9ＮＯ5）： 計算値４２９．１９， 観測値４３０．２。
４－ニトロフェニル（２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６－ウンデカフルオロヘキシル）カーボネート（ＷＺ－０８５１）。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ2Ｃｌ2， δ ｐｐｍ）： ８．３４ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， ２Ｈ）， ４．８４ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ13Ｈ6Ｆ11ＮＯ5）： 計算値４６５．１８， 観測値４６５．２。
４－ニトロフェニル（２，２，３，３，４，４，５，５，５－ノナフルオロペンチル）カーボネート（ＷＺ－０８８６）。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ2Ｃｌ2， δ ｐｐｍ）： ８．３４ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， ２Ｈ）， ４．８５ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ12Ｈ6Ｆ9ＮＯ5）： 計算値４１５．１７， 観測値４１５．３。
４－ニトロフェニル（３，３，４，４，５，５，５－ヘプタフルオロペンチル）カーボネート（ＷＺ－０８８７）。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ2Ｃｌ2， δ ｐｐｍ）： ８．３２ （ｄ， ２Ｈ）， ７．４５ （ｄ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２Ｏ）， ２．６８ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）。ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ12Ｈ8Ｆ7ＮＯ5）： 計算値３７９．１９， 観測値３７９．２。
カルバメート修飾ＰＥＩ ７６７７の合成。スキーム４に示されるように、５ｍｌのＴＨＦ／１ｍｌのＭｅＯＨ中のＰＥＩ（ＭＷ８００）及び１５０ｍｇ（３．４９ｍｍｏｌのモノマー）の溶液を含有する４つのバイアルに、０．１ｇ／ｍｌの４－ニトロフェニル（３，３，４，４，５，５，６，６，６－ノナフルオロヘキシル）カーボネート（ＷＺ－０８５０）、ＴＨＦ溶液を、それぞれモノマー１６％（０．２４ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、２７％（０．４０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、４２％（０．６３ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、及び５３％（０．７９ｇ、１．８４ｍｍｏｌ）のモル百分率に相当する量で添加した。結果として得られた溶液を２日間にわたって撹拌した。次いで、４つの個々の溶液を４つのＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析デバイス（０．５～１．０ｋＤ、１０ｍｌ）に移し、ＭｅＯＨ中、ＭｅＯＨ中０．０２ＭのＨＣｌ、及びＨ2Ｏ中０．０２ＭのＨＣｌで３日間にわたって順次に透析した。混合物を、ｔ－ブタノール（１０ｍｌ）を含む４本のチューブにさらに移した。結果として得られた４つの混合物を４つのバイアル中に濾過し、濾液を２日間にわたって凍結乾燥させ、４つの異なる理論上の修飾百分率を有する白色の粉末７６６７－ａ－１、７６６７－ａ－２、７６６７－ａ－３、及び７６６７－ａ－４を得た。1Ｈ ＮＭＲによって得られた実際の修飾百分率は、それぞれ１０．２％、１６．４％、２２．０％、及び３０．０％であった。
スキーム４．カルバメート修飾された第７６６７番の合成。
Figure 2022539343000012
Figure 2022539343000013
他のカルバメート修飾された分岐状ＰＥＩ、直鎖状ＰＥＩ、またはＰＡＭＡＭは、７６６７について記載した類似の方法を用いることによって調製した。ＰＥＩモノマーまたはＰＡＭＡＭ一級アミンについての理論上及び実際の修飾百分率を表２に列挙した。
Figure 2022539343000014
Figure 2022539343000015
Figure 2022539343000016
Figure 2022539343000017
Figure 2022539343000018
ＩＩ．イミン還元修飾
イミン還元によって修飾されたＰＥＩ ７６３６の合成。スキーム５に示されるように、２ｍｌのＭｅＯＨ中のＰＥＩ（ＭＷ８００）１００ｍｇ（２．３３ｍｍｏｌのモノマー）の溶液を含有する４つのバイアルに、ＴＨＦ中の３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクタナール（０．５ｇ／ｍｌ）の溶液を、それぞれモノマー１６％（０．１３５ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、２１％（０．１８１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、２７％（０．２２６ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、及び３８％（０．３１５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）のモル百分率に相当する量で添加した。結果として得られた溶液を一晩撹拌した。上記の４つの対応する溶液に、それぞれ４３ｍｇ、５７ｍｇ、７１ｍｇ、８５ｍｇ、及び９９ｍｇのＮａＢＨ4を０℃でゆっくりと添加した。混合物を、気泡が消失するまで室温で２時間撹拌した。次いで、４つの個々の溶液を４つのＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析デバイス（０．５～１．０ｋＤ、１０ｍｌ）中に移し、ＭｅＯＨ中、ＭｅＯＨ中０．０２ＭのＨＣｌ、及びＨ2Ｏ中０．０２ＭのＨＣｌで３日間にわたって順次に透析した。混合物を、ｔ－ブタノール（１０ｍｌ）を含む４本の異なるチューブに移した。結果として得られた４つの混合物を４つのバイアル中に濾過し、濾液を２日間にわたって凍結乾燥させ、４つの異なる理論上の修飾百分率を有する淡黄色の粉末７６３６－ｂ－１、７６３６－ｂ－２、７６３６－ｂ－３、及び７６３６－ｂ－４を得た。
スキーム５．イミン還元を介した修飾ＰＥＩ ７６３６－ｂの合成。
Figure 2022539343000019
Figure 2022539343000020
他のイミン還元により修飾された分岐状ＰＥＩは、７６３６について記載した類似の方法を用いることによって調製した。ＰＥＩモノマーについての理論上の修飾百分率を表３に列挙する。
Figure 2022539343000021
Figure 2022539343000022
ペンタフルオロベンジル修飾ＰＥＩ ７６６９及び７６７７ならびにピリジンメチル修飾ＰＥＩ ７６７６は、類似の方法を用いることによってイミン還元を介して調製することができる。ＰＥＩモノマーの理論上及び実際の修飾百分率を表４に列挙した。
Figure 2022539343000023
Figure 2022539343000024
Figure 2022539343000025
ＩＩＩ．ＢＯＣ保護、アルキル化、及び脱保護を介したアルキル化ＰＥＩ。
ＢＯＣ保護されたＰＥＩ。２．５ｇ（５８．１ｍｍｏｌのモノマー）のＰＥＩ １２００またはＰＥＩ ２５０００及びＮａＨＣＯ3を２０ｍｌのＴＨＦ／４０水中に溶解させた。２０ｍｌのＢＯＣ無水物（５．０７ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦを０℃で添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を６５℃まで一晩加熱した。ＴＬＣにおいて、ヨウ素染色によってＢＯＣ無水物が完全に消失したことが確認された。ＴＨＦを除去した後、溶液を凍結させ、凍結乾燥によって乾燥させた。ＢＯＣ保護されたＰＥＩが1Ｈ ＮＭＲによって確認された。
ＢＯＣ保護されたＰＥＩのアルキル化。ＢＯＣ－ＰＥＩ（０．２０ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨまたはＤＭＦ中に懸濁させた。この混合物に、１，１，１，２，２，３，３，４，４－ノナフルオロ－６－ヨードヘキサンを、３０％、４０％、及び５０％のＰＥＩモノマーに相当する量で添加し、結果として得られた混合物を９５℃まで４８時間加熱した。ＥｔＯＨを除去した後、各反応の残渣をエーテルでトリチュレーションしたか、またはエーテルを個々の反応ＤＭＦ溶液の各々に注ぎ、溶媒を遠心分離によって除去した。次いで、各反応からの淡黄色の固体をエーテルで洗浄し、さらに２回遠心分離によって除去し、真空下で乾燥させた。アルキル化ＢＯＣ－ＰＥＩがＦＮＭＲによって確認された。
アルキル化ＢＯＣ－ＰＥＩの脱保護。１２ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１）をＴＩＰＳ（０．１ｍｌ）の存在下で上記の白色の各固体に添加した。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留する固体をエーテルでトリチュレーションし、３回遠心分離し、真空下で乾燥させた。固体を水中に溶解させ、Ｈ2Ｏ中で３回、３日間透析した。溶液を凍結乾燥させ、淡黄色の粉末を得た。修飾百分率を、内部対照としてＣＦ3ＣＨ2ＯＨを使用してＨＮＭＲ及びＦＮＭＲによって算出した（表５）。
Figure 2022539343000026
実施例２
修飾ＰＥＩポリマーによる遺伝子送達
ＨＥＫ２９３細胞を１００μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ中１．５×１０5細胞／ｍｌでプレートし、翌日、９０ｎｇ／ウェルの担体ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ４８８１）で希釈した１０ｎｇ／ウェルのＴＫ／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現構築物（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１５０１）でトランスフェクトした。異なる濃度での種々の修飾ＰＥＩポリマーを用いて細胞をトランスフェクトし、標準的な３：１比率でのＦｕＧＥＮＥ ＨＤ陽性対照（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２３１１）及び緩衝液単独の陰性対照と比較した。これらの条件は、トランスフェクションから２４時間後にＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１１０）の添加によってトランスフェクション効率を測定するための、幅広いダイナミックレンジを提供した。場合によっては、血清を欠いた培地中でもトランスフェクションを実施し、トランスフェクションから数時間後に血清を添加し直した。再構成されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を反復実験用ウェルに添加することによって、毒性を測定した。
重量対重量比を使用するのではなく、９対１比率のＰＥＩモノマー（Ｎ原子）対ＤＮＡリン原子を初期設定の１倍濃度として最初に選定した。この比率によってトランスフェクション効率及び毒性の両方が影響を受ける。標準的な１倍モル濃度に対して使用した異なる濃度のＰＥＩを報告する。
この固定比率のモノマー対ＤＮＡを用いた初期実験は、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトする上で修飾ＰＥＩポリマーがＦｕＧＥＮＥ ＨＤと全く同程度に有効な可能性があることを示した。図１Ａに示されるように、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現量によって測定したときのトランスフェクション効率は、化合物のうちの一部についてＦｕＧＥＮＥ ＨＤと同程度に高い可能性があった一方で、試薬の不在下ではＤＮＡの取り込みは見られなかった。ベースポリマーの修飾の程度は、トランスフェクション効率及び毒性の両方に対して顕著な影響を有し、この用途において化学合成を微調整することの重要性が強調される。少なくともＰＥＩモノマーのこの一定の比率で、８００Ｄａのポリマーに基づく化合物は、２５，０００Ｄａのポリマーに基づく化合物よりも有効であり、このうち７６３６－２及び７６３３－５が特に良好な成績を示した。２５，０００Ｄａのポリマーに基づくＰＥＩ化合物は一般に、より低い相対的トランスフェクションを示して、トランスフェクション中の血清の存在に対してより感受性があるように思われた一方で、８００Ｄａのポリマーでは、この影響はより低かった。
細胞生存率データが図１Ｂに示される。ほとんどの化合物が良好な耐容性を示した。
さらなる実験により、追加の修飾基を使用して、とりわけ、ごくわずかなトランスフェクション及び高い毒性を示したＭＷ８００Ｄａのポリマー出発物質と比較して、トランスフェクションの効率を改善するかまたは毒性を減少させることが可能であることが実証された。図２に見られるように、修飾を有しない２５，０００Ｄａのポリマーは既に、比較的高いトランスフェクション効率及び低い毒性を示す。７６６９系列の修飾された２５，０００Ｄａのポリマーも同様に、全ての修飾レベルで非常に有効であった。一方で、７６６６系列は、修飾のレベルが増加すると共に低減された効率を示した。７６６６－１の場合、ポリマー対ＤＮＡの比率を増加させることで、トランスフェクション効率が減少する。しかしながら、８００Ｄａのポリマーに基づく７６６７－２では、標準的な１倍条件の少なくとも２倍の濃度でのみ効率的なトランスフェクションが見られた。７６３６－２、７６７６－３、及び７６７７－２は全て、１倍濃度で良好な結果をもたらした。
種々の化合物の最適な濃度をよりよく決定するために、種々の修飾ＰＥＩのタイトレーションを一定量のＤＮＡに添加し、これを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。データが図３に示され、このうち図３Ａは、血清の存在下でのデータを示し、図３Ｂは、血清の不在下でのデータを示す。図３Ｃは、血清の存在下でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して測定したときの細胞生存率を示す。凡例において、ＭＷ８００及びＭＷ２５０００は、指定される分子量の未修飾ＰＥＩポリマーを指す。この図において、１の相対ＰＥＩ濃度は、初期設定の９対１比率のＰＥＩモノマー対ＤＮＡリンを示す。この実験により、トランスフェクション効率を比較したときの各化合物についてのＰＥＩモノマー対ＤＮＡの最適なモル比が特定された。標準比率の２倍では、７６３６－２及び７６６７－４の両方が、顕著な毒性を伴わずにＦｕＧＥＮＥ ＨＤよりも高いトランスフェクション効率を示した。血清の不在下では、７６７６－１もまたＦｕＧＥＮＥ ＨＤに匹敵することができた。
異なる分子量のＰＥＩポリマー、またはＰＡＭＡＭポリマーを含むポリマーのパネルを使用して、異なるポリマー濃度で９つの細胞株をトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨｅｐＧ２、Ａ３７５、ＨＣＴ１１６、Ｕ２－ＯＳ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＡ５４９細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ（ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨｅｐＧ２、Ａ３７５、ＨＣＴ１１６、Ｕ２－ＯＳ）、ＲＰＭＩ／ＦＢＳ（Ｊｕｒｋａｔ）、またはＦ１２／ＦＢＳ（Ａ５４９）中１．０×１０5細胞／ｍｌでプレートし、翌日、９０ｎｇ／ウェルの担体ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ４８８１）で希釈した１０ｎｇ／ウェルのＴＫ／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現構築物（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１５０１）でトランスフェクトした。異なる濃度での種々の修飾ＰＥＩまたはＰＡＭＡＭポリマーを用いて細胞をトランスフェクトし、３：１比率でのＦｕＧＥＮＥ ＨＤ及びＶｉａＦｅｃｔ（商標）陽性対照（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２３１１及び番号Ｅ４９８１）ならびに緩衝液単独の陰性対照と比較した。これらの条件は、トランスフェクションから２４時間後にＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１１０）の添加によってトランスフェクション効率を測定するための、幅広いダイナミックレンジを提供した（図４Ａ～４Ｉ）。再構成されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を反復実験用ウェルに添加することによって、毒性を測定した（図５Ａ～５Ｈ）。最適な濃度で、第３世代ＰＡＭＡＭポリマーである７７６７－４は、全ての細胞株についてのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現量に関してＶｉａＦｅｃｔ（商標）及びＦｕＧＥＮＥ ＨＤ対照の成績を超えたか、またはそれに事実上匹敵していた。
多種多様な細胞種をトランスフェクトするＰＡＭＡＭポリマーの能力をさらに調査するために、異なるサイズ及び修飾レベルのＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションを使用して、５つの異なる細胞株をトランスフェクトした（図６～９）。ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨｅｐＧ２、及びＪｕｒｋａｔ細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ中（ＲＰＭＩ／ＦＢＳ中にプレートしたＪｕｒｋａｔを除く全ての細胞種）１．５×１０5細胞／ｍｌでプレートし、翌日、９０ｎｇ／ウェルの担体ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ４８８１）で希釈した１０ｎｇ／ウェルのＴＫ／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現構築物（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１５０１）でトランスフェクトした。細胞を、７７６６（－１～－４）、７７６７（－１～－４）、及び７７６８－１ｂ（図６及び７）、ならびに７７６８（－２～－４）、７８２５（－１～－４）、及び７８２６（－１～－４）（図８及び９）の種々のＰＡＭＡＭポリマーのタイトレーションを用いてトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ及びＶｉａＦｅｃｔ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２３１１及び番号Ｅ４９８１）を陽性対照として３：１比率で使用し、緩衝液単独を陰性対照として使用した。トランスフェクションから２４時間後にＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ１１１０）を使用して、トランスフェクション効率を測定した（図６Ａ～６Ｅ及び８Ａ～８Ｅ）。再構成されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を、ＨｅＬａを除く全ての細胞の反復実験用ウェルに添加することによって、毒性を測定した（図７Ａ～７Ｄ及び９Ａ～９Ｄ）。ポリマーの修飾の程度は、最適な濃度及びトランスフェクション効率に対して影響を有した。７７６７－４が再び、広範な濃度にわたって全ての細胞種の有効なトランスフェクションを示した一方で、修飾のより少ないバージョンである７７６７－２及び７７６７－３は、より高い濃度を必要としたが、そのようなより高い濃度では７７６７－４と類似の、またはさらにはそれよりも高い量のＤＮＡを送達することが可能であった。
実施例３
ＬｇＢｉＴ送達
この実施例は、Ｓｃｈｗｉｎｎらの「ＣＲＩＳＰＲ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ」（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１８，１３，４６７－４７４）に全般的に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ媒介性のタグ付けを伴った。ＨｉＢｉＴ編集細胞をＣＲＩＳＰＲによって生成し、クローンをシングルセルソーティングによって単離した。クローンを９６ウェルプレート中、１ウェル当たり１０，０００細胞でプレートした。２４時間後、細胞を修飾ＰＥＩ（１μｇ／ｍｌ）とＬｇＢｉＴタンパク質（１７０ｎＭ）の異なる複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地中で修飾ＰＥＩ（１００μｇ／ｍｌ）をＬｇＢｉＴ（１７μＭ）と室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。ＣＭＶ／ＬｇＢｉＴ発現構築物を形質導入するように１０％ＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴで処理した細胞が、ベンチマーク対照としての役目を果たした。２４時間後、ＬｇＢｉＴに対して高い親和性を有するペプチドであるＤａｒｋＢｉＴ（配列番号６または配列番号７）で細胞を処理して（ＬｇＢｉＴ／ＤａｒｋＢｉＴ複合体は、発光をほとんどまたは全く生じさせない）（１μＭ）、細胞外ＬｇＢｉＴの発光活性を消光させた。１時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０１１）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して、細胞をアッセイした。発光は、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒで測定した。データをＰｒｉｓｍ ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で分析した。結果が図１０～１１に示される。
発光シグナルの輝度は、送達されている細胞内ＬｇＢｉＴの量に比例し、この量はタンパク質取り込みの効率と相関し得る。一般に、修飾の有無にかかわらず、大きなサイズのＰＥＩ（ＭＷ＝２５，０００）が、ＬｇＢｉＴ送達において、それらのそれぞれ対応する小さなサイズのＰＥＩ（ＭＷ＝８００）よりも良好な成績を示した。修飾された大きなサイズのＰＥＩは、未修飾ＰＥＩよりも良好であった。上位のヒットの中でも、７６６６－３、７６６８－１、７６６９－２、７６７５－１、及び７７０９－３が、５つの異なるＨｉＢｉＴクローンにわたってＬｇＢｉＴ取り込みを容易にする上で最も良好に働いた（図１０及び１１）。６つの最良候補のうち、７６６９－２及び７６７５－１は、わずかな細胞毒性を引き起こした。７６６６－３、７６６８－１、７７０９－３では、毒性は観察されなかった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
ＨｅＬａ細胞のＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴ及びＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉＴクローンを８ウェルのチャンバースライド中、１ウェル当たり２５，０００細胞でプレートした。２４時間後、細胞をＰＥＩ（１μｇ／ｍｌ）及びＬｇＢｉＴタンパク質（１７０ｎＭ）の異なる複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地中で１７μＭのＬｇＢｉＴを１００μｇ／ｍｌの７６６６－４、７６６８－１、または７６６９－２と室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。２４時間後、細胞をＣＯ2非依存性培地に切り替え、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）生細胞基質を添加した。細胞を生物発光撮像装置で撮像した（図１２Ａ～１２Ｃ）。
ＨｉＢｉＴ編集ＨｅＬａまたはＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートのウェル中、１０，０００細胞／ウェルでプレートした。２４時間後、細胞をＰＥＩ（修飾及び未修飾、５ｕｇ／ｍｌ）及びＬｇＢｉＴタンパク質（２００ｎＭ）の異なる複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地中でＰＥＩをＬｇＢｉＴと室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ発現構築物を形質導入するように１０％ＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴで処理した細胞が、対照としての役目を果たした。２４時間後、細胞培地を交換し、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０１１）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して、細胞をアッセイした。発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒで測定した。図１３Ａは、送達されたＬｇＢｉＴタンパク質のパーセントを、ＢａｃＭａｍ形質導入を介して送達されたＬｇＢｉＴタンパク質と比較して図示する。発光シグナルの輝度は、細胞に送達されている細胞内ＬｇＢｉＴの量に比例し、この量はタンパク質取り込みの効率と相関し得る。図１３Ｂは、未処理の細胞と比べた生細胞の百分率を図示する。
ＨｉＢｉＴ編集ＨｅＬａまたはＨＥＫ２９３細胞を８チャンバースライド中４００ｕＬで、２５，０００細胞／ウェルでプレートした。２４時間後、細胞をＰＢＩ－７６６６－３・ＬｇＢｉＴ複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地中で２ｕＭのＬｇＢｉＴを１００ｕｇ／ｍＬのＰＢＩ－７６６６－３と室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。４０マイクロリットルの複合体を各ウェルに添加した。２４時間後、細胞をＣＯ2非依存性培地に切り替え、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０１１）を添加した。細胞を生物発光撮像装置で撮像した。ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ発現構築物を形質導入するように１０％ＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴで処理した細胞が、対照としての役目を果たした。図１４Ａは、ＨｅＬａ細胞のＣＡＳＰ３－ＨｉＢｉＴ及びＥＧＦＲ－ＨｉＢｉＴクローンの画像を示す。図１４Ｂは、ＨｅＬａ細胞のＧＳＫ３ｂ－ＨｉＢｉＴ及びＨＤＡＣ６－ＨｉＢｉｔクローンの画像を示す。図１４Ｃは、ＨｅＬａ細胞のＨＤＡＣ２－ＨｉＢｉＴクローン及びＨＥＫ２９３細胞のＣＤＫ１１－ＨｉＢｉＴクローンの画像を示す。
実施例４
ＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ送達
ＨｅＬａ細胞を８ウェルのチャンバースライド中、１ウェル当たり２５，０００細胞でプレートした。２４時間後、細胞をＰＥＩ（１μｇ／ｍｌ）及びＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴタンパク質（２００ｎＭ）の異なる複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地中でＰＥＩ（１００μｇ／ｍｌ）をＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ（２０μＭ）と室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。２４時間後、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地に切り替え、次いで、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）リガンド（１μＭ）と３０分間インキュベートした。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地で３回洗浄した。最後の洗浄は、細胞を培地中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2（ｇ）下で、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行った。最後の５分間、細胞を核プローブＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）試薬により３７℃で対比染色した。細胞をＣ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で撮像した。
緑色の蛍光強度は、送達されている細胞内ＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴの量に比例し、この量はタンパク質取り込みの効率と相関し得る。修飾された大きなサイズのＰＥＩ（ＭＷ＝２５０００）は、ＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴの送達において、未修飾ＰＥＩよりも良好であった。上位のヒットの中でも、７６３６－２、７６３７－３、７６６６－３、７６６８－１、及び７６７６－５が最も良好に働いた（図１５Ａ～１５Ｃ）。これらのうち、３つはまた、ＬｇＢｉＴ送達のための最良候補でもあり（７６６６－３及び７６６８－１）、このことは、カーゴのサイズが取り込み効率に影響を及ぼすことを示唆している。
全ての処理において点状染色が観察され、このことは、ＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴタンパク質の大部分がエンドソームに常在することを示している。エンドソームにおける輝度は、サイトゾルに放出されているタンパク質の部分を定量することの技術的困難を生み出した。
実施例５
ＲＮＰ送達
ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＰＤＨのＣ末端へのＨｉＢｉＴノックイン。ＲＮＰ複合体のアセンブリの調製及び細胞中への複合体のエレクトロポレーションを以前に記載されたように実施した（Ｓｃｈｗｉｎｎらの「ＣＲＩＳＰＲ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ」（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１８，１３，４６７－４７４））。簡潔に述べると、５μｌの反応量で、トレーサーＲＮＡ及びガイドＲＮＡの二本鎖（２４μＭまで）を調製し、その後、５μｌのＣａｓ９（２０μＭ）と合わせて、室温で１０分間さらにインキュベートした。ＨＥＫ２９３については、細胞（２×１０5）を２０μｌの４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＳＦ中に再懸濁させた。次いで、ＲＮＰ複合体（１０μｌ）及びドナーＤＮＡ（１００μＭの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む１μｌ）を細胞に添加した。ドナーＤＮＡは、ＶＳ－ＨｉＢｉＴ配列をＧＡＰＤＨ遺伝子のＣ末端に付加するように設計されていた。細胞に４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ系でエレクトロポレーションを行った。次いで、細胞を室温で５分間インキュベートし、培養のために６ウェルプレートに移した。
修飾ＰＥＩを使用した初期ＲＮＰ送達実験のために、類似の手順を使用した。簡潔に述べると、ＲＮＰ混合物（１２μＭの二本鎖ガイドＲＮＡ及び１０μＭのＣａｓ９を含む１０μｌ）を上述したように調製した。ドナーＤＮＡ（１００μＭを含む１μｌ）をＲＮＰ混合物に添加した後、混合物をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地により９８μｌにした。次いで、修飾ＰＥＩ ７６６７－４（１０ｍｇ／ｍｌを含む２μｌ）をＲＮＰ反応物に添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、複合体（１００μｌ）を細胞（１．９ｍｌの無血清培地中２×１０5）に添加し、培養のために６ウェルプレートに移した。細胞を無血清培地中で１時間おいた。その後、増殖及びアッセイのために細胞にＦＢＳ（１０％）を補充した。２４～４８時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ溶解性試薬及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０を使用して、編集細胞をアッセイした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して、生細胞の百分率を未処理の細胞と比べて算出した（図１６Ｂ）。
生存細胞の数に対して正規化されたＨｉＢｉＴ発光シグナルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子座におけるＨｉＢｉＴ挿入の効率に比例するはずであり、これはＲＮＰ送達の効率と相関し得る。ヌクレオフェクションは、最も効率的なＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ送達を提供することが予想された。図１６Ａに示されるように、ヌクレオフェクションは、初期条件でＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、ＶｉａＦｅｃｔ（商標）、ＣＲＩＳＰＲＭａｘ、または７６６７－４よりも高いノックイン効率を示した。しかしながら、修飾ＰＥＩ化合物または送達条件を最適化しなくても、７６６７－４は、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ及びＶｉａＦｅｃｔ（商標）よりもはるかに良好なＲＮＰ送達効率を生み出し、ＣＲＩＳＰＲｍａｘよりもほんのわずかに低かった。
同じ試料中でのＨｉＢｉＴノックイン、標的発現量、及び生存率を測定するためのモデル系。多くの化合物及び送達条件をスクリーニングするためには、より情報伝達的なプレートベースの系が必要とされた。ＨＥＫ２９３／ＣＭＶ－Ｆｌｕｃ安定細胞株においてＨｉＢｉＴをホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子のＮ末端でノックインした。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復が、発現をノックアウトする挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）変異を生じさせる傾向を持つ一方で、相同配列依存的修復（ＨＤＲ）が、ＨｉＢｉＴシグナルを生み出すと共にＦｌｕｃシグナルを保持するように、開始メチオニンコドン内に二本鎖切断を生成したｇＲＮＡを設計した（ダイアグラム１Ａ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ６０８０）は、細胞生存率を測定するために、Ｆｌｕｃシグナル及びＨｉＢｉＴシグナルの両方が生存細胞の蛍光に対して正規化され得るように多重化される。Ｆｌｕｃシグナル及びＨｉＢｉＴシグナルについての正規化された比率を使用して、ＩｎＤｅｌ変異によるＦｌｕｃノックアウト及びＨＤＲによるＨｉＢｉＴノックインの程度を推定することが可能であった。
修飾ＰＥＩ及びＰＡＭＡＭポリマーを使用して細胞へのＲＮＰ／ｓｓＯＤＮの送達のための条件を最適化させる場合、様々な濃度のＲＮＰ、ｓｓＯＤＮ、及びポリマーを使用した。頻繁に、１．２５μＭのＣａｓ９を１．５μＭのｇＲＮＡと室温で１０分間インキュベートして、ＲＮＰを生成した。次いで、ドナーｓｓＯＤＮ及び修飾ＰＥＩまたはＰＡＭＡＭポリマーを添加して、２５０ｎＭのＲＮＰ、１μＭのｓｓＯＤＮ、及び２２～１１０μｇ／ｍｌのポリマーで１１倍溶液を生成した。室温で３０分間のインキュベーション後、複合体を細胞に添加して、それらを培地（例えば、９６ウェルプレート中１０μｌ＋１００μｌの培地）中で１１倍希釈する。２日後、ウェル中の生存細胞の数を測定するために、細胞培地を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ６０８０）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ－Ｉと交換することによって、ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞を分析した（図１７Ａ）。ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸを使用してＦｌｕｃ発現量を測定し（図１７Ｂ）、ＨｉＢｉＴ ＮａｎｏＤＬＲアッセイを使用してＨｉＢｉＴシグナルを測定した（図１７Ｃ）。ＨｉＢｉＴ／ＣＴＦ比率を使用して、ＨｉＢｉＴシグナルを細胞数に対して正規化した（図１７Ｄ）。次いで、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ系（ＨｉＢｉＴ ＮａｎｏＤＬＲ（商標））を使用して、ウェル中のＦｌｕｃ及びＨｉＢｉＴシグナルを定量した（図１７Ｅ）。
図１８Ａ～１８Ｂは、ヌクレオフェクションまたは修飾ＰＥＩもしくはＰＡＭＡＭポリマーのいずれかを使用してＣＲＩＳＰＲによるＨｉＢｉＴのノックインのためのＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物を送達した、ＨＥＫ２９３／Ｆｌｕｃ細胞のプールを図示する。処理中の細胞死による複雑化を排除するために、測定前に細胞プールを数日間増殖させた。ＦｌｕｃのＮ末端でのＨｉＢｉＴのノックイン後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ及びＨｉＢｉＴ ＮａｎｏＤＬＲを使用して、生存率、Ｆｌｕｃ発現量、及びＨｉＢｉＴシグナルを測定した（図１８Ａ）。ヌクレオフェクション細胞についてのＦｌｕｃ／ＣＴＦ比率の大幅な低下は、ＩｎＤｅｌ変異によって引き起こされた発現消失を示し得る。ＨｉＢｉＴ／ＣＴＦ比率によって示されるように、修飾ポリマーによって媒介されたＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ送達は、より高い正規化Ｆｌｕｃ発現量のみならず、より高い正規化ＨｉＢｉＴシグナルもまたもたらした。同様に、修飾ＰＥＩポリマーは、ＧＡＰＤＨのＣ末端でＨｉＢｉＴをノックインするように設計されたＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ混合物の送達後に、ヌクレオフェクションと比較してより高い正規化ＨｉＢｉＴシグナルを示す（図１８Ｂ）。
他の細胞種については、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＨｉＢｉＴ溶解性アッセイを使用して、ＨｉＢｉＴ挿入の程度を測定し、同じウェル中でのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ、または反復実験用ウェル中でのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）のいずれかを使用して、生存率を測定した。
ダイアグラム１Ａ．ＨｉＢｉＴノックイン及びＦｌｕｃノックアウトを測定するためのハイスループットモデル系。
Figure 2022539343000027
ダイアグラム１Ｂ．ＨＥＫ２９３／ＣＭＶ－Ｆｌｕｃ安定細胞株におけるＨｉＢｉＴノックインのためのｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮ設計。
Figure 2022539343000028
Figure 2022539343000029
実施例６
ＰＲＯＴＡＣによるＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の分解
ＰＥＩが細胞中に機能的ＬｇＢｉＴを送達することを実証するために、タンパク質分解アッセイを使用した。ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートのウェル中に１０，０００細胞／ウェルでプレートした。２４時間後、細胞をＰＢＩ－７６６６－３（１０ｕｇ／ｍｌ）及びＬｇＢｉＴタンパク質（２００ｎＭ）の複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地中でＰＥＩをＬｇＢｉＴと室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ発現構築物を形質導入するように１０％ＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴで処理した細胞が、対照としての役目を果たした。２１時間後、細胞培地を、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）Ｅｎｄｕｒａｚｉｎｅ基質（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２５７１）を含有する新鮮な培地と交換し、３時間インキュベートした。次に、分解に向けてＢＲＤ４を標的化するために、細胞をブロモドメインＢＥＴ阻害剤であるＭＺ１のタイトレーションで処理した。Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ機器を使用して、反応速度測定を２４時間行った。図１９Ａは、ＢａｃＭａｍ及びＰＥＩの２つの送達方法の間の応答の類似性を示すようにプロットした、分解されたＢＲＤ４のパーセントを図示する。図１９Ｂは、ＭＺ１の２４時間の処置後の分解されたＢＲＤ４のパーセントを図示し、それは用量依存的様態で応答した。
実施例７
細胞外ＬｇＢｉＴの除去
４つの異なる細胞バックグラウンド（ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、Ｈ１２９９、またはＭｉａＰａＣａ－２）に由来するＨｉＢｉＴ－ＫＲＡＳクローンを、９６ウェルプレートのウェル中に１０，０００細胞／ウェルでプレートした。２４時間後、細胞をＰＢＩ－７６６６－３（５ｕｇ／ｍｌ）及びＬｇＢｉＴタンパク質（２００ｎＭ）の複合体でトランスフェクトした。複合体は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地中でＰＥＩをＬｇＢｉＴと室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。ＣＭＶ－ＬｇＢｉＴ発現構築物を形質導入するように１０％ＢａｃＭａｍ－ＬｇＢｉＴで処理した細胞が、対照としての役目を果たした。細胞をジギトニン（５０ｕｇ／ｍＬ）及びＬｇＢｉＴタンパク質（２００ｎＭ）で処理した。細胞内対細胞外の発光シグナルを識別するために、４つの条件を検査した。「交換なし条件」は、細胞をＬｇＢｉＴ・７６６６－３により４時間または２４時間のいずれかで処理し、培地交換なしで所与の時間に発光を測定する場合である。「交換条件」は、ＬｇＢｉＴ送達後に、細胞をＤａｒｋＢｉＴ（配列番号６）（１ｕＭ）の不在下または存在下のいずれかで、新鮮な培地と交換した場合である。細胞非透過性ペプチドであるＤａｒｋＢｉＴペプチドは、細胞外ＬｇＢｉＴを不活性化するために必要とされる。「洗浄条件」は、ＬｇＢｉＴ送達後に細胞を新鮮な培地で１回洗浄し、新鮮な培地と交換し、続いて発光測定を行った場合である。洗浄条件は、ＮａｎｏＢｉＴの細胞内測定値を反映する。交換条件は、全てではないが一部の細胞外ＬｇＢｉＴを除去し、故に、発光シグナルは、交換なし条件よりも低かったが、洗浄条件よりは高かった。所与の時間で、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）生細胞アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｎ２０１１）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を使用して、細胞をアッセイした。発光は、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒで測定した。結果が図２０Ａ～２０Ｄに示される。
ＰＥＩベースの系は、細胞中に機能的ＬｇＢｉＴを送達する。ＰＥＩ法から得られた細胞内シグナルは、４時間及び２４時間のインキュベーション時間の間で類似しており、このことは、この方法がその飽和シグナルに達するために最低４時間のインキュベーション時間を必要とすることを示唆している。対照的に、ＢａｃＭａｍ形質導入は、核酸を送達する。試験された細胞株の各々について、４時間のインキュベーション時間後に、ＢａｃＭａｍに由来するシグナルは、ＰＥＩ法のシグナルよりもはるかに低かった。２４時間のインキュベーション後には、ＨＥＫ２９３細胞の場合において、シグナルは、ＰＥＩ法及びＢａｃＭａｍ形質導入の間で同等であった。その他の３つの場合のうち、ＢａｃＭａｍ形質導入は、ＬｇＢｉＴを送達する上で、修飾ＰＥＩ化合物よりも良好であった。
上述の発明を実施するための形態及び付随する実施例は単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ規定される本開示の範囲に対する限定と見なされるべきではないことが理解される。
開示される実施形態に対する種々の変更及び修正が当業者には明らかであろう。限定されるものではないが、本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含めて、かかる変更及び修正が、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなくなされてもよい。
下記に提供される配列は、本明細書で参照されるものであり、添付の配列表及び配列表に関する陳述の一部として提供される。
ＷＴ ＯｇＬｕｃ（配列番号１）
MFTLADFVGDWQQTAGYNQDQVLEQGGLSSLFQALGVSVTPIQKVVLSGENGLKADIHVIIPYEGLSGFQMGLIEMIFKVVYPVDDHHFKIILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYPGIAVFDGKQITVTGTLWNGNKIYDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCENILA
ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号２）
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
ＨｉＢｉＴ（配列番号３）
VSGWRLFKKIS
ＬｇＢｉＴ（配列番号４）
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTIN
ＳｍＢｉＴ（配列番号５）
VTGYRLFEEIL
ＤａｒｋＢｉＴ（配列番号６）
VSGWALFKKIS
ＤａｒｋＢｉＴ（配列番号７）
MVSGWALFKKIS
ＤａｒｋＢｉＴ（配列番号８）
MGVTGWRLCERILA
ＬｇＴｒｉｐ ３０９２（配列番号９）
VFTLDDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIMRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLITPD
ＬｇＴｒｉｐ ３５４６（配列番号１０）
VFTLDDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIMRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPD
ＬｇＴｒｉｐ ２０９８（配列番号１１）
VFTLDDFVGDWEQTAAYNLDQVLEQGGVSSLLQNLAVSVTPIMRIVRSGENALKIDIHVIIPYEGLSADQMAQIEEVFKVVYPVDDHHFKVILPYGTLVIDGVTPNKLNYFGRPYEGIAVFDGKKITTTGTLWNGNKIIDERLITPD
ＳｍＴｒｉｐ９（配列番号１２）
GSMLFRVTINS

Claims (46)

  1. 化合物またはその塩であって、前記化合物が、
    ポリエチレンイミンポリマーと、
    前記ポリエチレンイミンポリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
    －Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
    （Ｉ）、
    式中、
    Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
    ｎが、０、１、２、３、４、または５であり、
    Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、前記化合物またはその塩。
  2. 前記ポリエチレンイミンポリマーが、約５００Ｄａ～約２５００００Ｄａの重量平均分子量を有する、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
  3. 前記ポリエチレンイミンポリマーが、約５００Ｄａ～約２０００Ｄａの重量平均分子量を有する、請求項２に記載の化合物、またはその塩。
  4. 前記ポリエチレンイミンポリマーが、約５０００Ｄａ～約２５００００Ｄａの重量平均分子量を有する、請求項２に記載の化合物、またはその塩。
  5. 前記ポリエチレンイミンポリマーが、分岐状ポリエチレンイミンポリマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  6. 前記ポリエチレンイミンポリマーが、直鎖状ポリエチレンイミンポリマーである、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  7. Ｚが、以下の式、
    －（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  8. Ｚが、ペンタフルオロフェニル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  9. Ｚが、非置換ピリジル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  10. Ｘが、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、
    ｎが、１または２である、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  11. Ｚが、以下の式、
    －（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍが、１、２、３、４、または５である、請求項１０に記載の化合物、またはその塩。
  12. Ｘが、結合であり、
    ｎが、１または２である、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  13. 前記ポリエチレンイミンポリマーの前記アミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  14. 前記ポリエチレンイミンポリマーの前記アミノ基の約５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項１３に記載の化合物、またはその塩。
  15. 前記ポリエチレンイミンポリマーの前記アミノ基の約８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項１４に記載の化合物、またはその塩。
  16. 化合物またはその塩であって、前記化合物が、
    ポリ（アミドアミン）デンドリマーと、
    前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーのアミノ基に結合した複数の置換基と、を含み、各置換基が独立して、式（Ｉ）を有し、
    －Ｘ－（ＣＨ2）n－Ｚ
    （Ｉ）、
    式中、
    Ｘが、結合または－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、
    ｎが、０、１、または２であり、
    Ｚが、ハロアルキル基、アリール基、置換アリール、ヘテロアリール基、及び置換ヘテロアリール基から選択される、前記化合物またはその塩。
  17. 前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーが、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代、または第１０世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１６に記載の化合物、またはその塩。
  18. 前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーが、第１世代、第２世代、第３世代、または第４世代ポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１７に記載の化合物、またはその塩。
  19. Ｚが、以下の式、
    －（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  20. Ｚが、ペンタフルオロフェニル基である、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  21. Ｚが、非置換ピリジル基である、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  22. Ｘが、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  23. Ｚが、以下の式、
    －（ＣＦ2）m－ＣＦ3を有するハロアルキル基であり、式中、ｍが、１、２、３、４、または５である、請求項２２に記載の化合物、またはその塩。
  24. Ｘが、結合であり、
    ｎが、１である、
    請求項１６～２３のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  25. 前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーの一級アミノ基の約０．１ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  26. 前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーの前記一級アミノ基の約１０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項２５に記載の化合物。
  27. 前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーの前記一級アミノ基の約２０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％が、式（Ｉ）の置換基に結合している、請求項２６に記載の化合物。
  28. 細胞に生体分子を送達する方法であって、
    前記細胞を、有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩に接触させることと、
    前記細胞を前記生体分子に接触させることと、
    を含む、前記方法。
  29. 前記方法が、前記細胞を、有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の２つ以上の異なる化合物、またはそれらの塩に接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記生体分子が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの少なくとも１つである、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記生体分子が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子である、請求項２８または２９に記載の方法。
  32. 前記生体分子が、発光活性が可能なペプチドまたはポリペプチドである、請求項２８または２９に記載の方法。
  33. 前記生体分子が、配列番号４のポリペプチド配列を含む、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
  34. 前記生体分子が、Ｃａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体である、請求項２８または２９に記載の方法。
  35. 前記リボ核タンパク質複合体が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びドナーＤＮＡテンプレートをさらに含み、前記ドナーＤＮＡテンプレートが、配列番号３からのポリペプチドをコードする配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記化合物及び前記生体分子を混合して混合物を形成させることと、その後、前記細胞を前記混合物に接触させることと、を含む、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩を含む、キット。
  38. 前記キットが、容器中に前記化合物または前記その塩を含む、請求項３７に記載のキット。
  39. ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項３７または３８に記載のキット。
  40. 前記ペプチドが、Ｃａｓ９タンパク質を含む、請求項３９に記載のキット。
  41. 前記ＤＮＡ分子が、配列番号３からのポリペプチドをコードする配列を含むドナーＤＮＡテンプレートである、請求項３９に記載のキット。
  42. 生体分子のトランスフェクションのために前記化合物または前記その塩を使用するための説明書をさらに含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載のキット。
  43. 細胞において内因性タンパク質の配列を改変する方法であって、前記方法が、
    Ｃａｓ９タンパク質、ドナーＤＮＡテンプレート、及びガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を組み立てることと、
    請求項１～２７のいずれかに記載の化合物を使用して細胞中に前記ＲＮＰ複合体を送達することと、
    を含む、前記方法。
  44. 細胞において内因性タンパク質をタグ付けするための方法であって、前記方法が、
    Ｃａｓ９タンパク質、ドナーＤＮＡテンプレート、及びガイドＲＮＡを含み、前記ドナーＤＮＡテンプレートが、ペプチドまたはポリペプチドタグ配列をコードする配列を含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を組み立てることと、
    請求項１～２７のいずれかに記載の化合物を使用して細胞中に前記ＲＮＰ複合体を送達することと、
    を含む、前記方法。
  45. 前記ドナーＤＮＡテンプレートが、配列番号３及び配列番号５から選択されるペプチドタグをコードする配列を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ドナーＤＮＡテンプレートが、ペプチドまたはポリペプチドタグ配列をコードする前記配列に隣接するホモロジーアームをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
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