CN108350489A - 用于使用rna引导的核酸结合蛋白的分子邻位检测的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于使用RNA引导的核酸结合蛋白的特定内源核酸的原位分子邻位检测的试剂和方法。

Description

用于使用RNA引导的核酸结合蛋白的分子邻位检测的方法和 试剂
领域
本公开内容一般涉及包含RNA引导的核酸结合蛋白的探针以及包含所述探针的复合物经由分子邻位(proximity)而原位检测内源核酸的用途。
背景
真核生物的核基因组DNA包装成染色质且在细胞核中排列成染色体。染色质的空间组构和特定染色体区的相对位置，与正常细胞功能和疾病期间的基因调控密切相关。荧光原位杂交(FISH)，其为使用仅结合具有高度序列互补性的那些染色体部分的荧光探针的一种细胞遗传学技术，已用于使特定的染色质结构域、基因或RNA显现，包括信使RNA (mRNA)和非编码RNA (ncRNA)二者。然而，该技术需要严格处理以使双链基因组DNA变性以用于探针杂交，且所述处理影响染色质结构和/或染色体组构的完整性和RNA二级结构、稳定性及其与蛋白质和染色质的相互作用。因此，需要使用较温和的反应条件并提供稳健的信号扩增的染色质和RNA原位成像技术。
概述
在本公开内容的各方面中，提供了包含至少一种探针的复合物，所述探针包含(i)工程改造的非天然存在的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas) (CRISPR/Cas)系统，其包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA，和(ii)与CRISPR/Cas系统直接或间接连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。在一些情况下，Cas9蛋白包含两个功能性核酸酶结构域、一个功能性核酸酶结构域或不含功能性核酸酶结构域。在其它实施方案中，Cas9蛋白包含至少一个核定位信号。在一个实施方案中，Cas9蛋白不含功能性核酸酶结构域且缺失所有核酸酶活性。在另一个实施方案中，Cas9蛋白缺失所有核酸酶活性且包含至少一个核定位信号。在一些实施方案中，复合物包含(a)第一探针，其包含CRISPR/Cas系统和通过共价键或非共价键与CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA连接的第一寡核苷酸，和(b)第二探针，其包含(i)第二CRISPR/Cas系统和通过共价键或非共价键与第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白连接的第二寡核苷酸；(ii)第二CRISPR/Cas系统和通过共价键或非共价键与第二CRISPR/Cas系统的向导RNA连接的第二寡核苷酸；或(iii)针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接的第二寡核苷酸。在另外的实施方案中，复合物包含(a)第一探针，其包含CRISPR/Cas系统和与针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接的第一寡核苷酸；和(b)第二探针，其包含针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接的第二寡核苷酸。在另外的实施方案中，复合物包含探针，其包含CRISPR/Cas系统、与抗物种第二抗体连接的第一和第二寡核苷酸以及针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。在一些重复(iteration)中，包含含有探针的CRISPR/Cas的复合物(所述探针包含与抗物种第二抗体连接的第一和第二寡核苷酸)进一步包含至少一种另外的CRISPR/Cas系统。在某些实施方案中，上文详述的复合物的寡核苷酸为单链的和/或包含茎、环和/或发夹二级结构。在其它实施方案中，复合物的寡核苷酸包含脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合，其中脱氧核苷酸或核糖核苷酸为标准核苷酸、核苷酸类似物或2’-O-甲基修饰核苷酸。
本公开内容的另一方面包括试剂盒，其包含上文详述的复合物中的任一种。
本公开内容的又一方面提供用于在细胞中检测内源核酸的方法。所述方法包括使细胞与邻位检测探针复合物接触，所述复合物包含含有RNA引导的核酸结合蛋白的至少一种探针，其中RNA引导的核酸结合蛋白通过RNA导向内源核酸以进行结合，从而形成结合的邻位检测探针复合物，和经由原位邻位依赖性扩增反应使结合的邻位检测探针复合物显现以检测内源核酸。在一些实施方案中，邻位检测探针复合物包含第一探针，其包含含有CRISPR/Cas蛋白和靶向内源核酸中的第一位点的向导RNA的CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA连接的第一邻位检测寡核苷酸。在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。在一些情况下，Cas9蛋白包含两个功能性核酸酶结构域、一个功能性核酸酶结构域或不含功能性核酸酶结构域。在其它实施方案中，Cas9蛋白包含至少一个核定位信号。在一个实施方案中，Cas9蛋白不含功能性核酸酶结构域且缺失所有核酸酶活性。在另一个实施方案中，Cas9蛋白缺失所有核酸酶活性且包含至少一个核定位信号。在一些实施方案中，邻位检测探针复合物进一步包含第二探针，其包含(a)包含靶向内源核酸中的第二位点的第二向导RNA的第二CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白连接的第二邻位检测寡核苷酸；(b)包含靶向内源核酸中的第二位点的第二向导RNA的第二CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与第二CRISPR/Cas系统的第二向导RNA连接的第二邻位检测寡核苷酸；或(c)针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。在其它实施方案中，邻位检测探针复合物包含：第一探针，其包含含有CRISPR/Cas蛋白和靶向内源核酸中的第一位点的向导RNA的CRISPR/Cas系统，以及其为针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体的第一邻位检测寡核苷酸，和第二探针，其包含针对内源核酸中的核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体，以及与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。在另外的实施方案中，邻位检测探针复合物包含探针，其包含含有CRISPR/Cas蛋白和靶向内源核酸中的第一位点的向导RNA的CRISPR/Cas系统，以及与抗物种第二抗体连接的第一和第二寡核苷酸，且邻位检测探针复合物进一步包含针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。在该实施方案的一些重复中，使细胞与第二或另外的CRISPR/Cas系统接触，所述系统包含针对内源核酸中的第二位点或另外的位点的第二或另外的向导RNA。在各实施方案中，内源核酸为核染色体DNA、信使RNA或非编码RNA。在某些实施方案中，细胞为原代细胞、细胞系细胞或者在获自受试者的组织或流体样品之内。在其它实施方案中，细胞为活的、固定的或冷冻的。在另外的实施方案中，原位邻位依赖性扩增反应包括邻位连接测定(proximity ligation assay，PLA)或邻位依赖性杂交链反应引发(proximity-dependent initiation of hybridization chain reaction，proxHCR)。
本公开内容的其它方面和重复在下文详述。
附图简述
图1图示了经由两个dCas9-gRNA复合物的邻位基因组结合和经由邻位连接测定(PLA)的信号扩增来检测基因组基因座。通过与dCas9蛋白共价或非共价结合的单链核酸分子来引发信号扩增。
图2阐述了经由使PLA相容性dCas9-gRNA复合物与针对邻位蛋白X的PLA相容性抗体进行邻位基因组结合，和基于PLA的信号扩增来检测基因组基因座和邻位蛋白X。
图3图示了经由使dCas9-gRNA复合物与针对邻位蛋白X的PLA相容性抗体进行邻位基因组结合来检测基因组基因座和邻位蛋白X。基于PLA的扩增使用了PLA相容性抗Cas9抗体。
图4阐述了经由两个PLA相容性Cas9-gRNA复合物的邻位基因组结合来检测基因组基因座，其中通过与gRNA分子共价或非共价结合的单链核酸分子来引发PLA信号。
图5图示了使用dCas9-gRNA复合物和使用多克隆(兔)抗Cas9抗体和抗兔PLA (+)和(-)探针经由PLA引发信号扩增，来检测基因组基因座。
图6阐述了使用dCas9-gRNA复合物(装配有平铺(tile)在基因组基因座的gRNA)和使用多克隆(兔)抗Cas9抗体和抗兔PLA (+)和(-)探针经由PLA引发信号扩增，来检测基因组基因座。
图7显示染色体的示意图。着丝粒染色质为独特的，因为CENP-A (左)替换了组蛋白H3 (右)。
图8A-D显示使用由dCas9、DIG-tracrRNA和小卫星crRNA或阴性对照1 (NC1)crRNA形成的CRISPR RNP复合物核转染(nucleofect)的U2OS细胞的图象。使用抗Cas9和/或抗CENP-A抗体进行PLA (DUOLINK®)测定。叠加图以红色(Cy5)显示Duolink信号、以蓝色(DAPI)显示细胞核(DNA)和以绿色(鬼笔环肽Atto488)显示肌动蛋白。图8A显示与小卫星crRNA以及抗Cas9和抗CENP-A抗体二者接触的细胞。图8B显示与阴性对照crRNA以及抗Cas9和抗CENP-A抗体接触的细胞。图8C显示与小卫星crRNA和抗CENP-A抗体接触的细胞。图8D显示与小卫星crRNA和抗Cas9抗体接触的细胞。
图9A图示阐述带有相关的TRF1和TRF2蛋白的端粒。图9B阐述TRF1和TRF2蛋白与端粒DNA (5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；SEQ ID NO:18)的端粒重复序列TTAGGG (带下划线)的结合，所述端粒重复序列与DNA (AATCCCAATCCC；SEQ ID NO:19)或包含CAAUCCCAAUC (SEQ ID NO:20)的端粒酶模板RNA碱基配对。
图10A-D显示使用由dCas9、DIG-tracrRNA和端粒crRNA或阴性对照1 (NC1) crRNA形成的CRISPR RNP复合物核转染的U2OS细胞的图象。使用抗Cas9和/或抗TRF2抗体进行PLA(DUOLINK®)测定。叠加图以红色(Cy5)显示Duolink信号和以蓝色(DAPI)显示细胞核(DNA)。图10A显示与端粒crRNA以及抗Cas9和抗TRF2A抗体二者接触的细胞。图10B显示与阴性对照crRNA以及抗Cas9和抗TRF2抗体二者接触的细胞。图10C显示与端粒crRNA和抗Cas9抗体接触的细胞。图10D显示与端粒crRNA和抗TRF2抗体接触的细胞。
图11A-D显示与由dCas9、DIG-tracrRNA和小卫星crRNA或阴性对照1 (NC1) crRNA形成的CRISPR RNP复合物一起孵育的固定的U2OS细胞的图象。使用抗Cas9和/或抗CENP-A抗体进行PLA (DUOLINK®)测定。叠加图以红色(Cy5)显示Duolink信号和以蓝色(DAPI)显示细胞核(DNA)。图11A显示与小卫星crRNA以及抗Cas9和抗CENP-A抗体二者接触的细胞。图11B显示与阴性对照crRNA以及抗Cas9和抗CENP-A抗体二者接触的细胞。图11C显示与小卫星crRNA和抗Cas9抗体接触的细胞。图11D显示与小卫星crRNA和抗CENP-A抗体接触的细胞。
发明详述
本公开内容提供用于使用RNA引导的核酸结合蛋白的特定内源核酸的原位分子邻位检测的试剂和方法。RNA引导的核酸结合蛋白，例如通过II型规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas) (CRISPR/Cas)系统编码的蛋白，具有有效且灵活的核酸结合特性。酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR/Cas系统，已在生物化学和结构方面进行非常详尽的研究，集中于其在缺乏任何能量依赖性解旋酶活性时令人费解的解开双链DNA的能力(Sternberg等，Nature，2014，506(7490):62-67)。CRISPR/Cas系统已用作高特异性且高效的酶探针，用于标记固定细胞和组织的未受干扰的细胞核中的DNA的重复序列(Deng等，Proc Natl Acad Sci USA.，2015，112(37):E5123-32)。在本文中，CRISPR/Cas系统的检测能力通过邻位检测而引人注目地提高。本文提供了包含至少一种CRISPR/Cas系统的邻位检测探针复合物、使用所述邻位检测探针复合物来原位检测内源核酸的方法、以及包含所述邻位检测探针复合物的试剂盒。
I.邻位检测探针复合物
本公开内容的一方面提供包含RNA引导的核酸结合蛋白的邻位检测探针复合物。RNA引导的核酸结合蛋白可为包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA (gRNA)的CRISPR/Cas系统。本文所公开的邻位检测探针复合物包含至少一种探针，所述探针包含CRISPR/Cas系统和邻位检测寡核苷酸，所述CRISPR/Cas系统指导探针与靶核酸的结合，所述邻位检测寡核苷酸经由可扩增的邻位检测测定法来促进结合探针的检测。一般而言，邻位检测寡核苷酸与CRISPR/Cas系统直接或间接连接。在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与探针的CRISPR/Cas蛋白(见图1)或向导RNA (见图4)直接连接。在其它实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与针对CRISPR/Cas蛋白的抗体连接(见图3，基因组位点1上的探针)。在另外的实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与抗物种第二抗体连接，且邻位检测探针复合物进一步包含针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体(见图5和6)。邻位检测探针复合物可进一步包含额外的探针，如下文所详述。
(a)包含CRISPR/Cas系统的探针
邻位检测探针复合物包含至少一种探针，其包含含有RNA引导的核酸结合蛋白的结合部分和至少一个邻位检测寡核苷酸。RNA引导的核酸结合蛋白可为包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA的CRISPR/Cas系统。
(i) CRISPR/Cas系统
本文所公开的邻位检测探针复合物包含含有CRISPR/Cas系统的至少一种探针。CRISPR/Cas系统可为非天然存在的基因工程改造的系统CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA。
CRISPR/Cas蛋白。邻位检测探针复合物的CRISPR/Cas蛋白可来源于I型(即IA、IB、IC、ID、IE或IF)、II型(即IIA、IIB或IIC)、III型(即IIIA或IIIB)或V型CRISPR系统，其存在于多种细菌和古生菌中。CRISPR/Cas系统可来自链球菌属(Streptococcus sp.) (例如酿脓链球菌)、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.) (例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))、弗朗西斯菌属(Francisella sp.) (例如新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida))、蓝细菌属(Acaryochloris sp.)、醋盐杆菌属(Acetohalobium sp.)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)、硫杆菌属(Acidithiobacillus sp.)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus sp.)、等着色菌属(Allochromatium sp.)、Ammonifex属、鱼腥藻属(Anabaena sp.)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、伯克氏菌属(Burkholderiales sp.)、Caldicelulosiruptor属、暂定属(Candidatus sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)、鳄球藻属(Crocosphaera sp.)、蓝丝菌属(Cyanothece sp.)、微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)、芬戈尔德菌属(Finegoldia sp.)、纤线杆菌属(Ktedonobacter sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、林氏藻属(Lyngbya sp.)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、甲烷盐菌属(Methanohalobium sp.)、微颤菌属(Microscilla sp.)、微鞘藻属(Microcoleus sp.)、微囊藻属(Microcystis sp.)、盐碱厌氧菌属(Natranaerobius sp.)、奈瑟菌属(Neisseria sp.)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus sp.)、诺卡氏菌属(Nocardiopsis sp.)、节球藻属(Nodularia sp.)、念珠藻属(Nostoc sp.)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、极单胞菌属(Polaromonas sp.)、Pelotomaculum属、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、石袍菌属(Petrotoga sp.)、普氏菌属(Prevotella sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、链孢子囊菌属(Streptosporangium sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)或栖热腔菌属(Thermosipho sp.)。
合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas蛋白、Cpf蛋白、Cmr蛋白、Csa蛋白、Csb蛋白、Csc蛋白、Cse蛋白、Csf蛋白、Csm蛋白、Csn蛋白、Csx蛋白、Csy蛋白、Csz蛋白及其衍生物或变体。在具体的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可为II型Cas9蛋白、V型Cpf1蛋白、或其衍生物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可为酿脓链球菌Cas9 (SpCas9)或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) Cas9 (StCas9)。在其它实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可为空肠弯曲杆菌Cas9 (CjCas9)。在备选的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可为新凶手弗朗西斯菌Cas9 (FnCas9)。在又另外的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可为新凶手弗朗西斯菌Cpf1 (FnCpf1)。
CRISPR/Cas蛋白可包含至少一个RNA识别域和/或RNA结合域，其与向导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白亦可包含核酸酶结构域(即DNA酶或RNA酶结构域)、DNA结合域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、二聚体化结构域及其它结构域。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可来源于野生型Cas9蛋白或其片段。一般而言，Cas9蛋白包含至少两个核酸酶(即DNA酶)结构域。例如，Cas9蛋白可包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC和HNH结构域共同起作用以切割单链，从而在DNA中产生双链断裂。(Jinek等，Science，2013，337:816-821)。在其它实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可来源于修饰的Cas9蛋白。例如，可将Cas9蛋白或其衍生物修饰成仅含一个功能性核酸酶结构域(RuvC样或HNH样核酸酶结构域)。具体而言，可对Cas9衍生的蛋白或其衍生物进行修饰以使核酸酶结构域之一缺失或突变，由此核酸酶结构域不再为功能性的(即核酸酶活性缺失)。在其中核酸酶结构域之一为无活性的实施方案中，Cas9蛋白能够切割双链DNA的一条链(即所述蛋白质称为“切口酶”)。切口酶不能在DNA中产生双链断裂。例如，在RuvC样结构域中将天冬氨酸转换成丙氨酸(D10A)，使Cas9蛋白或其衍生物转化成切口酶。同样，在HNH结构域中将组氨酸转换成丙氨酸(H840A或H839A)，使Cas9蛋白或其衍生物转化成切口酶。在另外的实施方案中，可对RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域二者进行修饰或删除，以使Cas9蛋白或其衍生物不能切开或切割双链核酸(这类蛋白质称为死Cas9或dCas9)。例如，Cas9蛋白可包含D10A和H840A (或者D10A和H839A)突变。在一些实施方案中，Cas9蛋白或其衍生物的所有核酸酶结构域均可进行修饰或删除，以使衍生蛋白缺失所有核酸酶活性。
在任何的上述实施方案中，可使用众所周知的方法，例如定点诱变、PCR介导的诱变和全基因合成以及本领域已知的其它方法，通过一个或多个缺失突变、插入突变和/或置换突变来使任何的或全部的核酸酶结构域失活。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可进一步包含至少一个核定位信号。一般而言，NLS包含一段碱性氨基酸。核定位信号为本领域已知的(参见例如Lange等，J. Biol.Chem.，2007，282:5101-5105)。例如，在一个实施方案中，NLS可为单份(monopartite)序列，例如PKKKRKV (SEQ ID NO:1)或PKKKRRV (SEQ ID NO:2)。在另一个实施方案中，NLS可为二分(bipartite)序列，例如KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO:3)。NLS可位于CRISPR/Cas蛋白的N端、C端或内部位置。
在又另外的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可进一步包含至少一个细胞穿透结构域。在一个实施方案中，细胞穿透结构域可为来源于HIV-1 TAT蛋白的细胞穿透肽序列。例如，TAT细胞穿透序列可为GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO:4)。在另一个实施方案中，细胞穿透结构域可为TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV；SEQ ID NO:5)，其为来源于人乙型肝炎病毒的细胞穿透肽序列。在又一个实施方案中，细胞穿透结构域可为MPG(GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV；SEQ ID NO:6或GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:7)。在另一个实施方案中，细胞穿透结构域可为Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；SEQ IDNO:8)、来自单纯胞疹病毒的细胞穿透肽VP22、或者多聚精氨酸肽序列。细胞穿透肽结构域可位于CRISPR/Cas蛋白的N端、C端或内部位置。
在又另外的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白亦可包含至少一个标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签和表位标签。在一些实施方案中，标志物结构域可为荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其它合适的荧光蛋白。在其它实施方案中，标志物结构域可为纯化标签和/或表位标签。示例性的标签包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和钙调蛋白。标志物结构域可位于CRISPR/Cas蛋白的N端或C端。
CRISPR/Cas蛋白可获自商业来源。或者，可使用标准程序，将编码CRISPR/Cas蛋白的DNA克隆到表达载体中并且从细菌或真核细胞表达和纯化CRISPR/Cas蛋白。在又另外的实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可提供为编码核酸。例如，编码核酸可为信使RNA。或者，编码核酸可为DNA (例如可为载体的部分)，其中可将编码DNA与合适的启动子调控序列(例如真核生物/哺乳动物启动子，如CMV、SV40、RSV、MMTV)可操作连接。可对编码核酸进行密码子优化以用于在目的细胞中表达。
向导RNA。CRISPR/Cas系统亦包含向导RNA。向导RNA与CRISPR/Cas蛋白相互作用以将CRISPR/Cas蛋白导向染色体序列或内源核酸中的特定靶位点，其中向导RNA的5’端与靶序列中的特异性前间区序列碱基配对。
除序列(下游)紧跟有共有序列之外，靶位点无序列限制。该共有序列亦称为前间区序列邻位基序(PAM)。例如，Cas9的PAM序列包括3'-NGG、3'-NGGNG、3'-NNAGAAW和3'-ACAY，而Cpf1的PAM序列包括5’-TTN (其中N定义为任意核苷酸，W定义为A或T，和Y定义为C或T)。在一些实施方案中，靶位点可位于基因的编码区中、基因的内含子中、基因的调控区中、基因之间的间隔区中、非编码区中，等等。基因可为蛋白编码基因或RNA编码基因。在其它实施方案中，靶位点可在RNA分子中。
各向导RNA包含三个区：与核酸序列中的靶位点互补的5’端的第一区，形成茎环结构的第二内部区，和基本上保持为单链的第三3’区。各向导RNA的第一区(在5’端)为不同的，由此各向导RNA将CRISPR/Cas蛋白导向特定的靶位点。在所有向导RNA中，各向导RNA的第二区和第三区可为相同的。
向导RNA的第一区与核酸序列中的靶位点互补，由此向导RNA的第一区能够与靶位点碱基配对。各向导RNA的第一区(亦称为crRNA)包含与靶序列互补的序列。在各实施方案中，向导RNA的第一区可包含约10个核苷酸-多于约25个核苷酸。例如，向导RNA的第一区与核酸序列中的靶位点之间的碱基配对的区域的长度可为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25个或多于25个核苷酸。在具体的实施方案中，向导RNA的第一区长度为约20个核苷酸。例如，Cas9 gRNA可包含GN17-20GG。
在一个实施方案中，可设计多个非重叠的独特crRNA以平铺在靶向的内源核酸上。例如，多个crRNA可用于平铺在2 kb基因组靶区域的两条链上。多个CRISPR/Cas系统接着募集至靶向的基因组基因座，将提供更大的三维拓扑染色质形貌(landscape)并利于目的基因组基因座的邻位检测。
向导RNA亦包含形成二级结构的第二区。在一些实施方案中，二级结构包括茎(或发夹)和环。环和茎的长度可变化。例如，环长度范围可为约3-约10个核苷酸，而茎长度范围可为约6-约20个碱基对。茎可包含1-约10个核苷酸的一个或多个凸出部分。因此，第二区的总长范围可为约16-约60个核苷酸长。在具体的实施方案中，环长度为约4个核苷酸，而茎包含约12个碱基对。
可使用地高辛配基(DIG)表位在5’端标记tracrRNA来提供另一抗体(抗DIG)以检测CRISPR/Cas系统，因为tracrRNA对于各CRISPR/Cas系统而言为通用的。
向导RNA亦包含基本保持为单链的3’端的第三区。因此，第三区与目的细胞中的任何核酸序列均无互补性，且与向导RNA的剩余部分无互补性。第三区的长度可变化。一般而言，第三区长度大于约4个核苷酸。例如，第三区的长度范围可为约5-约30个核苷酸长。
在一些实施方案中，向导RNA包含单个分子。在其它实施方案中，向导RNA可包含两个独立分子。第一RNA分子(亦称为crRNA)可构成向导RNA的第一区和向导RNA的第二区的“茎”的一半。第二RNA分子(亦称为tracrRNA)可构成向导RNA的第二区的“茎”的另一半和向导RNA的第三区。因此，在该实施方案中，第一和第二RNA分子各自含有彼此互补的核苷酸的序列。例如，在一个实施方案中，第一和第二RNA分子各自包含与另一个序列碱基配对的序列(具有约6-约20个核苷酸)。
向导RNA可包含标准核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物。核苷酸类似物是指天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，向导RNA可包含2’-O-甲基核苷酸。
可使用标准寡核苷酸合成程序来化学合成向导RNA。例如，可化学合成crRNA。或者，可经由体外转录来合成向导RNA。为此，可将编码向导RNA的DNA与启动子序列(例如T7、T3或SP6启动子)可操作连接且可通过聚合酶(例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶)体外产生向导RNA。在一些实施方案中，可化学合成crRNA且可体外转录tracrRNA。或者，向导RNA可提供为编码DNA分子，以用于在目的真核细胞中表达。例如，可将编码向导RNA的DNA与RNA聚合酶III (Pol III)识别的启动子序列可操作连接。合适的Pol III启动子的实例包括但不限于哺乳动物U6、U3、H1和7SL RNA启动子。
(ii)邻位检测寡核苷酸
邻位检测探针复合物的含CRISPR/Cas的探针亦包含邻位检测寡核苷酸。邻位检测寡核苷酸可与探针的CRISPR/Cas系统直接或间接连接。
在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸可为单链核酸。在其它实施方案中，邻位检测寡核苷酸可包含单链区和双链区。即，邻位检测寡核苷酸可包含茎、环和/或发夹区。
邻位检测寡核苷酸可包含脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合。脱氧核苷酸/核糖核苷酸可为标准核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指天然核苷酸的已知类似物(例如肌苷)，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸酯)经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸的3’端可包含一个或多个封闭核苷酸。合适的封闭核苷酸的非限制性实例包括2’-O-甲基核苷酸、2’-氟代核苷酸、3’-ONH2核苷酸、双脱氧核苷酸和丙炔核苷酸。在具体的实施方案中，邻位检测寡核苷酸的3’末端可包含三个2’-O-甲基核糖核苷酸。
邻位检测寡核苷酸的长度可不同且将不同。一般而言，邻位检测寡核苷酸长度范围可为约15个核苷酸至约200个核苷酸。在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸长度范围可为约20个核苷酸至约100个核苷酸。在其它实施方案中，邻位检测寡核苷酸长度范围可为约30个核苷酸至约60个核苷酸。
邻位检测寡核苷酸可商购得到。或者，可使用标准寡核苷酸合成程序来合成邻位检测寡核苷酸。
在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与探针的CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白直接连接(见图1)。连接可经由共价键或非共价键。例如，邻位检测寡核苷酸可通过共价键与CRISPR/Cas蛋白连接。键合可为直接的或经由接头或衔接分子。用于使寡核苷酸与蛋白质共价连接的技术为本领域众所周知的。或者，可通过非共价键使邻位检测寡核苷酸与CRISPR/Cas蛋白连接。例如，可经由氢键或离子键使邻位检测寡核苷酸与CRISPR/Cas蛋白结合。
在其它实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与探针的CRISPR/Cas系统的向导RNA直接连接(见图4)。连接可经由共价键或非共价键。例如，可通过共价键使邻位检测寡核苷酸与向导RNA的3’端、5’端或内部核苷酸连接。或者，可通过非共价键使邻位检测寡核苷酸与向导RNA连接。例如，邻位检测寡核苷酸可与向导RNA的3’端的区域碱基配对。
在另外的实施方案中，邻位检测寡核苷酸可与探针的CRISPR/Cas系统间接连接。例如，邻位检测寡核苷酸可与针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接(见图3，基因组位点1的探针)。抗CRISPR/Cas蛋白抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。邻位检测寡核苷酸和抗体之间的连接可经由共价键或非共价键。在一些实施方案中，邻位检测寡核苷酸可经由共价键与抗体连接。连接可为直接的或者经由接头或衔接分子。用于使寡核苷酸与蛋白质或抗体连接或缀合的技术为本领域众所周知的。在其它实施方案中，可通过非共价键使邻位检测寡核苷酸与抗CRISPR/Cas抗体连接。例如，邻位检测寡核苷酸可经由氢键或离子键与抗体结合。
在又另外的实施方案中(其中邻位检测寡核苷酸与CRISPR/Cas系统间接连接)，第一(和第二)邻位检测寡核苷酸可与抗物种第二抗体连接(且邻位检测探针复合物进一步包含针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体) (见图5和6)。邻位检测寡核苷酸和抗体之间的连接可经由共价键或非共价键(如上所详述)。抗物种第二抗体针对抗CRISPR/Cas蛋白抗体在其中生成的物种(例如兔、大鼠等)。在其中复合物包含多于一个与抗物种第二抗体连接的邻位检测寡核苷酸的情况下，多于一个邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构不同。在具体的实施方案中，复合物包含与抗物种第二抗体连接的第一和第二邻位检测寡核苷酸，其中第一邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构与第二邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构不同。
(iii)包含CRISPR/Cas样蛋白的特异性第一探针
在一些实施方案中，邻位检测探针复合物的第一探针包含CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA连接的第一寡核苷酸。在备选的实施方案中，邻位检测探针复合物的第一探针包含CRISPR/Cas系统，和与针对CRISPR/Cas蛋白的抗体连接的第一寡核苷酸。在又另外的实施方案中，邻位检测探针复合物的第一探针包含CRISPR/Cas系统，和与抗物种第二抗体连接的至少一个寡核苷酸，且复合物进一步包含针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。在各实施方案中，Cas9蛋白具有核酸酶活性、具有切口酶活性或者经修饰以缺失所有核酸酶活性。在一些实施方案中，对Cas蛋白进行修饰以缺失所有核酸酶活性。在其它实施方案中，Cas9蛋白包含至少一个核定位信号。
(b)额外的探针
邻位检测探针复合物通常进一步包含一个或多个额外的探针。第二(或额外的)探针包含结合部分和第二(或额外的)额外邻位检测寡核苷酸，所述结合部分可为包含不同向导RNA的CRISPR/Cas系统，所述第二(或额外的)额外邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构与第一邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构不同。例如，第一或第二邻位检测探针寡核苷酸可在寡核苷酸的3’末端包含一个或多个封闭核苷酸。或者，第一或第二邻位检测探针寡核苷酸可包含不同的序列和/或不同的发夹结构。在一些情况下，第一和第二邻位检测寡核苷酸可称为(+)和(-)寡核苷酸。
在其中第一探针的第一邻位检测寡核苷酸与CRISPR/Cas系统直接连接(即经由CRISPR/Cas蛋白或向导RNA)的实施方案中，邻位检测探针复合物可进一步包含第二探针。第二探针包含结合部分和第二邻位检测寡核苷酸，其中第二邻位检测寡核苷酸具有与第一探针的第一邻位检测寡核苷酸不同的序列和/或结构。在一些实施方案中，第二探针的结合部分可为另一CRISPR/Cas系统，且第二邻位检测寡核苷酸可通过共价键或非共价键与第二探针的第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA连接(见图1和图4)。在其它实施方案中，第二探针的结合部分可为针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体，且第二邻位检测寡核苷酸可与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接(见图2)。核酸相关蛋白可为通用转录因子、特异性转录因子、转录调节蛋白、染色质结合蛋白、染色质重塑蛋白或酶、染色质修饰酶(例如甲基转移酶、乙酰转移酶等)、DNA结合蛋白、组蛋白、修饰的组蛋白、剪接蛋白/因子、RNA修饰蛋白、RNA加工蛋白、RISC蛋白、RNA结合蛋白、非编码RNA加工因子，等等。核酸修饰可为通过甲基化、羟化、乙酰化、甲酰化、酰化、羧化、硫醇化、烷基化、氨基化、酯化、磷酸化或其组合修饰的脱氧核苷酸或核糖核苷酸。
在其中第一邻位检测寡核苷酸经由抗CRISPR/Cas抗体与CRISPR/Cas系统间接连接的实施方案中，邻位检测探针复合物可进一步包含第二探针。第二探针包含结合部分和第二邻位检测寡核苷酸，其中第二邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构与第一探针的第一邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构不同。在一些实施方案中，第二探针的结合部分可为针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体(如上所详述)，且第二邻位检测寡核苷酸可与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体连接(见图3，基因组位点2)。
在其它实施方案中(其中第一邻位检测寡核苷酸经由抗物种第二抗体与CRISPR/Cas系统间接连接)，邻位检测探针复合物可进一步包含与抗物种抗体连接的第二邻位寡核苷酸(见图5)，其中第一和第二邻位检测寡核苷酸的序列和/或结构不同。在另外的实施方案中(其中邻位检测探针与抗物种抗体连接)，复合物可进一步包含一种或多种CRISPR/Cas系统，其可经由抗物种抗体与邻位检测寡核苷酸间接连接(见图6)。各CRISPR/Cas系统包含不同的向导RNA。
表A列举了第一和第二探针的多种组合。
II.用于检测内源核酸的方法
本公开内容的另一方面包括用于在细胞中原位检测和显现内源核酸的方法。所述方法包括使细胞与包含含有RNA引导的核酸结合蛋白的至少一种探针的邻位检测探针复合物接触，其中通过RNA将RNA引导的核酸结合蛋白导向内源核酸以进行结合，从而形成结合的邻位检测探针复合物，以及经由原位邻位依赖性扩增反应使结合的邻位检测探针复合物显现来检测内源核酸。
一般而言，邻位检测探针复合物包含第一探针，其包含针对内源核酸中的第一位点的CRISPR/Cas系统和与CRISPR/Cas系统直接或间接连接的第一邻位检测寡核苷酸。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。在各实施方案中，Cas9蛋白具有核酸酶活性、具有切口酶活性或经修饰以缺失所有核酸酶活性。在一些实施方案中，对Cas9蛋白进行修饰以缺失所有核酸酶活性。在其它实施方案中，Cas9蛋白包含至少一个核定位信号。一般而言，复合物进一步包含第二探针，其包含结合部分(其可为针对内源核酸中邻近的第二位点的另一CRISPR/Cas系统或针对位置邻近的蛋白质或核酸修饰的抗体)和第二邻位检测寡核苷酸，其与第一邻位检测寡核苷酸不同且与结合部分直接或间接连接。结合之后，邻位检测探针复合物的第一和第二探针位置邻近且可经由原位邻位依赖性扩增反应来检测和显现。原位邻位依赖性扩增反应可为邻位连接测定(PLA，参见Söderberg等，Nature Methods，2006，2(12):995-1000)或邻位依赖性杂交链反应引发(proxHCR，参见Koos等，Nature Communications，2015，6:7294|DOI:10.1038/ ncomms8294)。
(a)使细胞与邻位检测探针复合物接触
所述方法包括使细胞与包含含有CRISPR/Cas系统的至少一种探针的邻位检测探针复合物接触。邻位检测探针复合物在上文部分(I)中描述。
在一些实施方案中，可使细胞与这样的邻位检测探针复合物接触，其包含(a)第一探针，其包含靶向内源核酸中的第一位点的第一CRISPR/Cas系统和与第一CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第一邻位检测寡核苷酸和(b)第二探针，其包含靶向内源核酸中的第二位点的第二CRISPR/Cas系统和与第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第二邻位检测寡核苷酸(见表A中的复合物1、2、4和5以及图1和4)。
在其它实施方案中，可使细胞与这样的邻位检测探针复合物接触，其包含(a)第一探针，其包含靶向内源核酸中的第一位点的CRISPR/Cas系统和与第一CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第一邻位检测寡核苷酸和(b)第二探针，其包含针对与内源核酸相关的位置邻近蛋白的抗体或针对内源核酸中的核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白的抗体或针对核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸(见表A中的复合物3和6以及图2)。
在其它实施方案中，可使细胞与这样的邻位检测探针复合物接触，其包含(a)第一探针，其包含靶向内源核酸中的第一位点的CRISPR/Cas系统和与针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接的第一邻位检测寡核苷酸，和(b)第二探针，其包含针对与内源核酸相关的位置邻近蛋白的抗体或针对内源核酸中的核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白的抗体或针对核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸(见表A中的复合物7和图3)。
在另外的实施方案中，可使细胞与包含探针的邻位检测探针复合物接触，所述探针包含靶向内源核酸中的第一位点的CRISPR/Cas系统和与抗物种第二抗体连接的第一和第二邻位检测寡核苷酸，其中邻位检测探针复合物进一步包含针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体(见表A中的复合物8和图5)。在该实施方案的一些重复中，可使细胞与针对内源核酸中的第二或额外的位点的第二或额外的CRISPR/Cas系统接触，其中CRISPR/Cas系统可经由抗CRISPR/Cas蛋白第一抗体和抗物种第二抗体与第一和第二邻位检测寡核苷酸间接连接(见表A中的复合物9和图6)。
细胞与邻位检测探针复合物的接触可以一步或多步进行。例如，可使细胞与第一探针接触并在稍后的时间点使细胞与第二探针接触。类似地，可使细胞与包含CRISPR/Cas系统的第一探针接触，并随后与针对CRISPR/Cas蛋白的抗体和/或针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体接触。在一些实施方案中，可使细胞与包含CRISPR/Cas系统的第一探针接触，然后与针对CRISPR/Cas蛋白的抗体接触，并随后与抗物种第二抗体接触。
如下所详述，与邻位检测探针复合物接触的细胞可为活的、固定的或冷冻的。一般而言，接触可在范围从约20℃至约40℃的温度进行。
在一些实施方案中，可使活细胞与含至少一种CRISPR/Cas系统的探针接触。可通过多种方式将含CRISPR/Cas系统的探针引入细胞中。合适的递送方式包括显微注射、电穿孔、声致穿孔(sonoporation)、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状聚合物转染、热休克转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染(impalefection)、光转染(optical transfection)、有专利权的试剂的强化核酸摄取和经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒或人造病毒体的递送。在具体的实施方案中，可通过核转染将含CRISPR/Cas系统的探针引入细胞中。含CRISPR/Cas系统的探针可作为核糖核蛋白(RNP)复合物引入，所述复合物包含与向导RNA (例如合成的crRNA和tracrRNA)复合的重组CRISPR/Cas蛋白(例如Cas9或dCas9)，或者可将CRISPR/Cas蛋白和向导RNA独立引入细胞中。或者，可在编码CRISPR/Cas蛋白的核酸(即mRNA或DNA)和向导RNA引入细胞之后，或者编码CRISPR/Cas蛋白的核酸(即mRNA或DNA)和编码向导RNA的DNA引入细胞之后，在细胞中组装CRISPR/Cas系统。在一段合适的时间之后，可将细胞固定(见下文)并与(i)针对CRISPR/Cas蛋白的抗体和/或针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体接触或者与(ii)针对CRISPR/Cas蛋白的抗体接触接着与抗物种第二抗体接触。可在任何的接触步骤之间用适当的缓冲液洗涤细胞。
在其它实施方案中，可使固定细胞与含至少一种CRISPR/Cas系统的探针接触。可使用任何的各种常用固定剂来固定细胞。合适的固定剂包括多聚甲醛、甲醛、甲醇、丙酮、乙酸、乙醇、戊二醛、碘仿、乳酸、苦味酸、锌或其组合。固定剂的浓度和固定过程的持续时间将根据细胞或样品的类型而不同。在一个实施方案中，可使用甲醇和乙酸的混合物(1:1)来固定细胞。在另一个实施方案中，可使用4%多聚甲醛来固定细胞。一般而言，将含CRISPR/Cas系统的探针作为RNP复合物引入细胞中(见上文)。
在一些实施方案中，通过与包含至少一种表面活性剂和/或蛋白酶的溶液一起孵育来将细胞透化处理。合适的表面活性剂的非限制性实例包括Tween-20、Tween-80、TritonX-100、鲸蜡醇、癸基葡糖苷、洋地黄皂苷、十二烷基葡糖苷、IGEPAL CA-630、leucoperm、NP-40、壬苯醇醚-9 (nonoxynol-9)、八乙二醇单十二烷基醚、正辛基β-D硫代吡喃葡萄糖苷、油醇、辛基葡糖苷、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、皂苷、硬脂醇或其组合。合适的蛋白酶包括但不限于蛋白酶K、半胱天冬酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶。在一些实施方案中，可将细胞与含Tween-20和/或Triton X-100的溶液一起孵育。表面活性剂或蛋白酶的浓度和孵育期的持续时间可根据细胞或样品的类型而不同且将根据细胞或样品的类型而不同。
一般而言，不使细胞经历化学变性过程或热变性过程来将双链染色体DNA转化成单链DNA。然而，在一些实施方案中，可使细胞与变性溶液接触以使染色体DNA变性。变性溶液可为酸性的或碱性的。酸溶液包含诸如盐酸等酸，而碱溶液包含诸如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)等碱。变性溶液中的酸或碱的浓度以及变性步骤的持续时间可根据细胞或样品的类型而不同且将根据细胞或样品的类型而不同。在其它实施方案中，可加热细胞以使染色体DNA变性。例如，可在含甲酰胺的溶液存在下将细胞加热至约70℃-约80℃的温度。加热步骤的持续时间可根据细胞或样品的类型而不同且将根据细胞或样品的类型而不同。
在其中内源核酸为RNA的实施方案中，与含至少一种CRISPR/Cas系统的探针接触，可在呈现PAM的寡核苷酸(即PAMmer，参见O'Connell等，Nature，2014，516:263-266)存在下进行。PAMmer可反式呈现给向导RNA。PAMmer可包含标准的或修饰的脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合。
在与邻位检测探针复合物的第一和第二探针接触之后，细胞包含至少一种结合的邻位检测探针复合物。
(b)使结合的邻位检测探针复合物显现
所述方法进一步包括经由原位邻位依赖性扩增反应使结合的邻位检测探针复合物显现来检测内源核酸。原位邻位依赖性扩增反应可为邻位连接测定(PLA)、邻位依赖性杂交链反应引发(proxHCR)或者产生不溶性产物或拴(tether)在邻位检测探针复合物上的产物的另一种扩增法。
PLA。在其中原位邻位依赖性扩增反应包括PLA的实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与一种或多种连接寡核苷酸接触(参见Söderberg等，Nature Methods，2006，2(12):995-1000)。一种或多种连接寡核苷酸一般为与邻位检测探针复合物的第一和第二邻位检测寡核苷酸具有序列互补性的单链核酸，且连接寡核苷酸之一包含在细胞的内源核酸中不存在的独特序列。连接寡核苷酸可包含标准的或修饰的脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合。连接寡核苷酸长度范围可为约15个核苷酸至约150个核苷酸。在一些实施方案中，连接寡核苷酸长度范围可为约20个核苷酸至约80个核苷酸。在一个具体的实施方案中，使细胞与两个单链的连接脱氧寡核苷酸接触。在与连接寡核苷酸接触之后，连接寡核苷酸与紧密邻近的第一和第二邻位检测寡核苷酸碱基配对或杂交。
所述方法进一步包括使细胞与连接酶接触，所述连接酶连接杂交的连接寡核苷酸以形成包含独特序列的环化连接产物。连接酶可为T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶或AppDNA/RNA连接酶。连接酶可为嗜温的或耐热的。在一个具体的实施方案中，连接酶为T4 DNA连接酶。连接反应在合适的连接酶缓冲液存在下且在范围为约20℃至40℃的温度下进行。
所述方法进一步包括通过滚环扩增来扩增包含独特序列的环化连接产物，以形成包含独特序列的重复的滚环扩增产物。因此，所述方法包括使细胞与用于滚环复制的聚合酶接触。聚合酶可为phi29 DNA聚合酶、bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶或T7DNA聚合酶。聚合酶可为嗜温的或耐热的。在具体的实施方案中，聚合酶为phi29 DNA聚合酶。扩增反应在包含合适的聚合酶缓冲液、dNTP和其它试剂的扩增溶液存在下进行。扩增反应在范围为约20℃至约40℃的温度下进行。
所述方法进一步包括使细胞与荧光标记的寡核苷酸接触，所述荧光标记的寡核苷酸与连接寡核苷酸中的独特序列具有序列互补性。因此，标记的寡核苷酸与滚环扩增产物中重复的独特序列杂交。标记寡核苷酸的荧光标记可发出绿色荧光(例如，用Cy2、Alexa488或者荧光素及其衍生物(例如FAM、HEX、TET和TRITC)标记)、橙色荧光(例如用Cy3或Alexa 546标记)；红色荧光(例如用Texas Red、Alexa 594或者罗丹明及其衍生物(例如ROX)标记)或远红荧光(例如用Cy5标记)。标记的寡核苷酸长度范围可为约15个核苷酸至约30个核苷酸。在具体的实施方案中，标记的寡核苷酸可长为约18-22个核苷酸。荧光标记的寡核苷酸可为上述扩增溶液的部分。
使结合的邻位检测探针复合物显现的最终步骤包括使用标准荧光显微术和图像分析软件程序来检测与滚环复制产物杂交的荧光标记寡核苷酸的荧光。离散的荧光斑点表示内源核酸的位置。细胞可包含一个或多个离散的荧光斑点，这取决于目的内源核酸的特性和位置。
proxHCR。在其中原位邻位依赖性扩增反应包括proxHCR的实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与一种或多种额外的寡核苷酸接触(参见Koos等，NatureCommunications，2015，6:7294|DOI:10.1038/ncomms8294)。例如，可使细胞与激活寡核苷酸、至少一个5’荧光标记的发夹寡核苷酸、至少一个3’荧光标记的发夹寡核苷酸和引发寡核苷酸接触。激活寡核苷酸和发夹寡核苷酸通常包含单链区，以及茎、环、发夹或其它二级结构。引发寡核苷酸通常为单链的。寡核苷酸长度范围可为约20至约100个寡核苷酸，且可包含标准的或修饰的脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合。荧光标记可如上文在PLA部分所述。可如上文在PLA部分详述的使荧光标记的扩增产物显现。
(c)内源核酸
在一些实施方案中，通过本文所公开的方法检测的内源核酸可为核染色体DNA。例如，可在核DNA中检测特定的染色体基因座或基因组基因座。特定的染色体基因座或基因组基因座可位于基因的编码区、基因的内含子、基因的调控区、CpG岛、基因之间的间隔区、非编码区、着丝粒区、端粒区、包含三核苷酸重复的区域等之内。基因可为蛋白质编码基因或RNA编码基因。在一些实施方案中，染色体基因座或基因组基因座可为与疾病或病症相关的基因中的变化或修饰，例如缺失、插入、取代(例如SNP)、颠换，等等。一般而言，邻位检测探针复合物靶向染色体基因座或基因组基因座中的两个不同位点，其在相同的染色体上可顺式间隔最大约2 kb。
在其它实施方案中，通过本文所公开的方法检测的内源核酸可为RNA分子。RNA分子可为信使RNA (mRNA)或其片段。mRNA可为多腺苷酸化的或非多腺苷酸化的。或者，RNA分子可为非编码RNA (ncRNA)。例如，ncRNA可为长非编码RNA (lncRNA)、基因间长非编码RNA(lincRNA)、微小RNA (miRNA)、小干扰RNA (siRNA)、Piwi-相互作用RNA (piRNA)、反式作用RNA (rasiRNA)、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)、线粒体tRNA (MT-tRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA (snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、剪接前导RNA (SLRNA)、端粒酶RNA组分(TERC)、其片段或其组合。
在又另外的实施方案中，通过本文所公开的方法检测的内源核酸可位于线粒体或质粒基因组中。
在一些实施方案中，用于检测特定内源核酸的方法可用于研究目的。在其它的实施方案中，用于检测特定内源核酸的方法可用于诊断目的。
(d)细胞
多种细胞可用于本文所公开的方法。一般而言，细胞为真核细胞。在各方面，细胞可为人类细胞、非人类哺乳动物细胞、非哺乳动物类脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或者单细胞真核生物。在示例性的方面，细胞为哺乳动物细胞。细胞可为原代细胞或细胞系细胞。细胞可为成体细胞、胚胎细胞或干细胞。细胞可为正常细胞、患病细胞或癌细胞。
在一些实施方案中，细胞可为人类细胞系细胞。合适的细胞系的非限制性实例包括DU145 (转移癌)、SW490 (结肠癌)、DLD-1 (结肠癌)、KM20L2 (结肠癌)、COLO 205 (结肠癌)、HCC-2998 (结肠癌)、HCT-116 (结肠癌)、HCT-15 (结肠癌)、HT29 (结肠癌)、KM12 (结肠癌)、SW-620 (结肠癌)、SF-268 (CNS)、SF-295 (CNS)、SF-539 (CNS)、SNB-19 (CNS)、SNB-75 (CNS)、U251 (CNS)、CCRF-CEM (白血病)、HL-60(TB) (白血病)、K-562 (白血病)、MOLT-4 (白血病)、RPMI-8226 (白血病)、SR (白血病)、A549 (非小细胞肺癌)、EKVX (非小细胞肺癌)、HOP-62 (非小细胞肺癌)、HOP-92 (非小细胞肺癌)、NCI-H226 (非小细胞肺癌)、NCI-H23 (非小细胞肺癌)、NCI-H322M (非小细胞肺癌)、NCI-H460 (非小细胞肺癌)、NCI-H522 (非小细胞肺癌)、LOX IMVI (黑素瘤)、MALME-3M (黑素瘤)、M14 (黑素瘤)、MDA-MB-435 (黑素瘤)、SK-MEL-2 (黑素瘤)、SK-MEL-28 (黑素瘤)、SK-MEL-5 U (黑素瘤)、ACC-257 (黑素瘤)、UACC-62 (黑素瘤)、IGR-OV1 (卵巢)、OVCAR-3 (卵巢)、OVCAR-4 OVCAR-5(卵巢)、OVCAR-8 (卵巢)、SK-OV-3 (卵巢)、786-0 (肾)、A498 (肾)、ACHN (肾)、CAKI-1(肾)、RXF 393 (肾)、SN12C (肾)、TK-10 (肾)、UO-31 (肾)、PC-3 (前列腺)、DU-145 (前列腺)、MCF7 (乳腺)、MDA-MB-231 (乳腺)、MDA-MB-468 (乳腺)、HS 578T (乳腺)、BT-549 (乳腺)和T-47D (乳腺)。
在其它实施方案中，细胞可为哺乳动物细胞系细胞。合适的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仑鼠肾(BHK)细胞；小鼠骨髓瘤NS0细胞、小鼠胚胎成纤维3T3细胞(NIH3T3)、小鼠B淋巴瘤A20细胞；小鼠黑素瘤B16细胞；小鼠成肌细胞C2C12细胞；小鼠骨髓瘤SP2/0细胞；小鼠胚胎间充质C3H-10T1/2细胞；小鼠癌CT26细胞、小鼠前列腺DuCuP细胞；小鼠乳腺EMT6细胞；小鼠肝细胞瘤Hepa1c1c7细胞；小鼠骨髓瘤J5582细胞；小鼠上皮MTD-1A细胞；小鼠心肌MyEnd细胞；小鼠肾RenCa细胞；小鼠胰腺RIN-5F细胞；小鼠黑素瘤X64细胞；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞；大鼠成胶质细胞瘤9L细胞；大鼠B淋巴瘤RBL细胞；大鼠成神经细胞瘤B35细胞；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC)；Buffalo大鼠肝BRL 3A细胞；犬肾细胞(MDCK)；犬乳腺(CMT)细胞；大鼠骨肉瘤D17细胞；大鼠单核细胞/巨噬细胞DH82细胞；猴肾SV-40转化成纤维细胞(COS7)；猴肾CVI-76细胞；非洲绿猴肾(VERO-76)细胞；和人胚肾细胞(HEK293、HEK293T)。哺乳动物细胞系的广泛列表可在美国典型培养物保藏中心目录(ATCC，Manassas，VA)中找到。
在又另外的实施方案中，细胞可在获自受试者的组织样品或流体样品内。例如，可通过外科手术切除、切除活检、切开式活检、组织芯活检(core biopsy)或针吸活检来移取组织样品或流体样品。受试者可为人类、非人类哺乳动物(例如啮齿类动物、猫、狗、家畜，等等)，或者非哺乳动物类脊椎动物(例如鱼、鸟，等等)。可使用如上所详述的固定剂将组织样品冷冻或固定。可将固定的样品包埋在包埋介质中，例如石蜡、切片石蜡(paraplast)或本领域已知的类似包埋介质。
III.试剂盒
本公开内容的另一方面包括用于在细胞中检测内源核酸的试剂盒，其中试剂盒包含如在上文部分(I)(a)中定义的含CRISPR/Cas系统的至少一种探针。
在一些实施方案中，试剂盒包含(a)第一探针，其包含第一CRISPR/Cas系统和与第一CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第一邻位检测寡核苷酸，和(b)第二探针，其包含第二CRISPR/Cas系统和与第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第二邻位检测寡核苷酸。
在其它实施方案中，试剂盒包含(a)第一探针，其包含CRISPR/Cas系统和与第一CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白或向导RNA直接连接的第一邻位检测寡核苷酸，和(b)第二探针，其包含针对与内源核酸相关的蛋白的抗体或针对内源核酸中的核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白的抗体或针对核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。
在其它实施方案中，试剂盒包含(a)第一探针，其包含CRISPR/Cas系统和与针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接的第一邻位检测寡核苷酸，和(b)第二探针，其包含针对与内源核酸相关的蛋白的抗体或针对内源核酸中的核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白的抗体或针对核酸修饰的抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。
在另外的实施方案中，试剂盒单元包含至少一种CRISPR/Cas系统、与抗物种第二抗体连接的第一和第二邻位检测寡核苷酸以及针对CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。在一些重复中，试剂盒包含两种CRISPR/Cas系统、三种CRISPR/Cas系统或多于三种CRISPR/Cas系统。
CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白可为Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白具有核酸酶活性、具有切口酶活性或者经修饰以缺失所有核酸酶活性。在具体的实施方案中，Cas9蛋白包含至少一个核定位信号且经修饰以缺失所有核酸酶活性。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可提供为纯化的蛋白。在其它实施方案中，CRISPR/Cas蛋白可提供为编码核酸(即mRNA或DNA)。可对编码CRISPR/Cas蛋白的核酸进行密码子优化以用于在目的细胞中表达。编码CRISPR/Cas蛋白的mRNA可为5’加帽的和/或3’多腺苷酸化的。可将编码CRISPR/Cas蛋白的DNA与启动子调控序列(见下文)、多腺苷酸化信号(例如SV40多聚A信号、牛生长激素多聚A信号，等等)和/或转录终止序列可操作连接。编码CRISPR/Cas蛋白的DNA可为DNA构建体(例如质粒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体，等等)的部分。在一些实施方案中，可将DNA与启动子调控序列可操作连接以用于在目的细胞中表达。合适的哺乳动物启动子调控序列包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子(ED1)-α启动子，等等。在其它实施方案中，可将DNA与噬菌体RNA聚合酶识别的启动子调控序列可操作连接以用于体外mRNA合成。例如，启动子序列可为T7、T3或SP6启动子序列或T7、T3或SP6启动子序列的变体。在另外的实施方案中，可将DNA与启动子序列可操作连接以用于在细菌细胞或真核细胞中体外表达。合适的细菌启动子包括但不限于T7启动子、lac操纵子启动子、trp启动子、tac启动子(其为trp和lac启动子的杂合物)、任何前述启动子的变体以及任何前述启动子的组合。合适的真核启动子的非限制性实例为本领域众所周知的且包括上文所列举的哺乳动物启动子序列。
在某些实施方案中，试剂盒可进一步包含用于一种或多种向导RNA的体外转录的至少一种载体系统。例如，载体系统可包含噬菌体RNA聚合酶识别的启动子序列以用于体外RNA合成。噬菌体启动子序列可为T7、T3或SP6启动子或其变体。在其它实施方案中，试剂盒可包含用于体内表达一种或多种向导RNA的至少一种载体系统。可将编码向导RNA的DNA与RNA聚合酶III (Pol III)识别的启动子序列可操作连接。合适的Pol III启动子的实例包括但不限于哺乳动物U6、U3、H1和7SL RNA启动子。载体系统可进一步包含含有多克隆位点的多接头区以用于插入编码目的向导RNA的DNA。载体系统可进一步包含复制起点、选择标记基因和/或扩增或测序引物位点。
在又另外的实施方案中，试剂盒可进一步包含用于原位邻位依赖性扩增反应的至少一种试剂。在一些实施方案中，试剂盒可包含用于PLA的至少一种试剂。PLA试剂可为一种或多种连接寡核苷酸、连接酶、连接试剂、聚合酶、扩增试剂、荧光标记的检测寡核苷酸或其组合。在其它实施方案中，试剂盒可包含激活物、标记的检测物(labeled detector)和/或用于proxHCR的引发寡核苷酸。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下列参考文献给技术人员提供用于本发明的许多术语的一般定义：Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物及分子生物学词典) (1994年第2版)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(剑桥科学与技术词典) (Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics(遗传学术语)，第5版，R. Rieger等(编辑)，Springer Verlag (1991)；和Hale & Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology(哈珀柯林斯生物词典) (1991)。除非另有规定，否则如在本文中使用的下列术语具有归于其的含义。
当介绍本公开内容或其优选方面的要素时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意图指有一个或多个要素。术语“包括”、“包含”和“具有”意图为包括性的且意指可具有除所列举的要素之外的额外的要素。
如在本文中使用的术语“互补的”或“互补性”，是指通过特定氢键进行碱基配对来使双链核酸缔合。碱基配对可为标准Watson-Crick碱基配对(例如5’-AGTC-3’与互补序列3’-TCAG-5’配对)。碱基配对亦可为Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。互补性通常是关于双链体区进行测量，因此不包括例如突出端。如果碱基对中仅某些为互补的，则双链体区的两条链之间的互补性可为部分的且可表示为百分数(例如70%)。不互补的碱基为“错配的”。如果双链体区的所有碱基对均为互补的，则互补性亦可为完全的(即100%)。
如在本文中使用的术语“内源的”，是指对细胞而言为天然的核酸。
如在本文中使用的“基因”，是指编码基因产物的DNA区(包括外显子和内含子)，以及调控基因产物的产生的所有DNA区，而不论所述调控序列是否邻接编码序列和/或转录的序列。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
术语“核酸”和“多核苷酸”，是指脱氧核苷酸或核糖核酸聚合物，呈线性或环状构象，以及单链或双链形式。对于本公开内容的目的，就聚合物的长度而言，这些术语不应理解为限制性的。术语可包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸(例如硫代磷酸酯骨架)部分经修饰的核苷酸。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
术语“核苷酸”是指脱氧核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可为标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可为天然存在的核苷酸(例如肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或去除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和巯基，以及用其它原子取代碱基的碳原子和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物亦包括双脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术在本领域中为已知的。通常，所述技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定其编码的氨基酸序列，以及将这些序列与另一个核苷酸或氨基酸序列进行比对。基因组序列亦可以此方式来确定和比较。一般而言，同一性是指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸分别精确对应。可通过确定其同一性百分数来比较两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)。两个序列的同一性百分数，不论核酸或氨基酸序列，均为两个比对序列之间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics (应用数学进展) 2:482-489 (1981)的局部同源性算法提供了用于核酸序列的近似比对。通过使用Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure (蛋白质序列和结构图集)，M. O.Dayhoff编辑，增刊5，3:353-358，国家生物医学研究基金会，Washington, D.C.，USA开发和Gribskov，Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)标准化的评分矩阵，可将该算法用于氨基酸序列。“BestFit”实用应用程序中的Genetics Computer Group (Madison, Wis.)提供了该算法用以确定序列的同一性百分数的示例性实施方式。用于计算序列之间的同一性或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中通常为已知的，例如，另一种比对程序为BLAST，以缺省参数使用。例如，可用下列缺省参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传密码=标准；过滤=无；链=两条；截断值=60；期望=10；矩阵= BLOSUM62；描述=50个序列；排序依据=高分；数据库=非冗余的GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swissprotein + Spupdate + PIR。这些程序的详情可在GenBank网站上找到。
实施例
下列实施例阐述了本发明的某些方面。
实施例1：使用dCas9-gRNA复合物检测着丝粒
着丝粒卫星DNA包含大量串联重复的非编码序列，且着丝粒染色质为独特的，在于组蛋白H3取代为CENP-A (见图7)。为确定可否使用本文所公开的方法检测着丝粒，构建了这样的探针，其包含靶向小卫星重复序列或大卫星重复序列的Cas9系统，以与邻位连接测定(PLA) (例如DUOLINK®测定)和针对CENP-A的抗体组合使用。
通过将重组dCas9 (即D10A/H840A双重突变体；1 pmol)与合成的DIG-tracrRNA(2 pmol)和crRNA (2 pmol)组合来形成作为核糖核蛋白(RNP)复合物的CRISPR/Cas探针，所述DIG-tracrRNA (2 pmol)和crRNA (2 pmol)靶向小卫星重复序列、大卫星重复序列或阴性对照1序列(不靶向任何已知的人类序列)。使用的DIG-tracrRNA和crRNA序列如在表1中所示。使用标准试剂和设备，用RNP核转染U2OS细胞。用完全培养基(DMEM +10% FBS，不含抗生素)以1:10稀释核转染细胞并接种至8孔室的带盖玻片的载玻片上。对于程序中的所有后续步骤，均使用40 μl试剂/孔。6小时之后，用4%多聚甲醛将细胞于RT固定15分钟，用1/10体积1.25 M甘氨酸于RT淬灭5分钟，用PBS洗涤并用透化缓冲液(0.75% Triton X100、075%Tween 20)透化处理1小时，以及用PLA封闭缓冲液于RT封闭1小时。
使用抗Cas9抗体(小鼠，Diagenode，1:3000稀释)和抗CENP-A抗体(兔，CellSignalling，1:1000稀释)进行PLA测定，所述抗体经4℃孵育过夜。使用PLA洗涤缓冲液A洗涤细胞(2 x 5分钟)。加入稀释的PLA第二Ab-PLA探针溶液[抗兔(+)和抗小鼠(-)] (1:5稀释)并在预热的湿度箱中将载玻片于37℃孵育1小时。以轻微的定轨振荡用PLA洗涤缓冲液A洗涤细胞(2 x 5 min，RT)。基本如在PLA (DUOLINK® Fluorescent)用户指南中进行连接反应，洗涤细胞并进行扩增反应(Far red试剂盒)。使用DAPI (用于DNA)和鬼笔环肽-Atto488(用于肌动蛋白)将细胞染色，用PBS洗涤并浸没，用载玻片覆盖，用澄清的指甲油硬化剂密封边角并用荧光显微镜观察。
仅当使用靶向小卫星重复序列的crRNA来形成CRISPR RNP时，着丝粒显现为红色点状斑点(图8A)，而当使用阴性对照(NC1) crRNA (图8B)或使用大卫星crRNA (未显示数据)时，着丝粒未显现。PLA扩增是使用抗Cas9和抗CENP-A抗体二者来触发的(图8A)。仅使用抗CENP-A抗体(图8C)或仅使用抗Cas9抗体(图8D)，未得到PLA (DUOLINK®)信号，表明PLA扩增的双重特异性和邻位依赖的性质。
实施例2：使用dCas9-gRNA复合物检测端粒
TRF1和TRF2为与染色体末端上的端粒重复序列相关的蛋白(见图9A、9B)。TRF2和TRF1与端粒重复序列5'-TTAGGG-3'结合。使用类似于在上文实施例1中的程序在U2OS细胞中检测端粒，具有以下改动。(a)使用靶向端粒重复序列的crRNA (5’-UAGGGUUAGGGUUAGGGUUAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’；SEQ ID NO:13)来组装RNP复合物，和(b)使用抗Cas9抗体(小鼠，Diagenode，1:3000稀释)和抗-TRF2抗体(兔，CellSignalling，1:1000稀释)抗体(4℃过夜)来进行PLA测定。
仅当使用靶向端粒重复序列的crRNA来形成CRISPR RNP时，端粒显现为红色点状斑点(图10A)，而当使用阴性对照(NC1) crRNA (图10B)时，端粒未显现。当使用抗Cas9和抗TRF2抗体二者时，PLA扩增被触发(图10A)。仅使用抗Cas9抗体(图10C)或仅使用抗TRF2抗体(图10D)，未得到PLA (DUOLINK®)信号，表明PLA扩增的双重特异性和邻位依赖的性质。
实施例3：使用dCas9-gRNA复合物在固定化细胞中检测着丝粒
使用1%多聚甲醛将U2OS细胞于RT固定10分钟，用1/10体积1.25 M甘氨酸于RT淬灭5分钟，用PBS洗涤。然后用透化缓冲液(0.75% Triton X100、075% Tween 20)将细胞透化处理1小时并用PLA封闭缓冲液于RT封闭1小时。通过将重组dCas9 (1 pmol)与靶向小卫星重复序列、大卫星重复序列或阴性对照1序列(不靶向任何已知的人类序列)的合成DIG-tracrRNA(2 pmol)和crRNA (2 pmol)组合来形成作为核糖核蛋白(RNP)复合物的CRISPR。DIG-tracrRNA和crRNA序列在表1中显示。封闭之后，用PBS洗涤细胞。用PBS (30 μL)覆盖细胞并用杂交覆盖物(HYBRISLIPTM；GraceBioLabs)密封载玻片，以及通过将载玻片(带有细胞)于80℃孵育5分钟来使染色体DNA变性。吸除PBS并加入RNP (用Cas9缓冲液1:10稀释：20 mMHEPES pH 7.5、150 mM KCl、1%蔗糖)，用杂交覆盖物密封载玻片并在载玻片杂交仪(THERMOBRITE®；Leica Biosystems)中于37℃孵育过夜。用PLA洗涤缓冲液A洗涤细胞(在有盖广口瓶中各自2 x 5分钟)，之后基本上如在上文实施例1中继续进行PLA (DUOLINKZ®)测定。
仅当使用靶向小卫星重复序列的crRNA来形成CRISPR RNP时，着丝粒显现为红色点状斑点(图11A)，而当使用阴性对照(NC1) crRNA (图11B)或使用大卫星crRNA (未显示数据)时，着丝粒未显现。PLA扩增是使用抗Cas9和抗CENP-A抗体二者来触发的(图11A)。仅使用抗Cas9抗体(图11C)或仅使用抗CENP-A抗体(图11D)，未得到PLA (DUOLINK®)信号，表明PLA扩增的双重特异性和邻位依赖的性质。
实施例4：使用dCas9-gRNA复合物检测基因组基因座
可将纯化的重组dCas9 (即D10A/H840A双重突变体)与crRNA或crRNA群(其平铺以靶向特定的基因组基因座)和tracrRNA复合以形成dCas9-gRNA复合物，以用于识别基因组基因座。例如，可在围绕AAVS1、EMX1或Kras中的靶位点2 kb区域内设计一种或多种gRNA (即1kb上游或1 kb下游)。人类gRNA靶标(及非靶标)如下所示。
1. AAVS1-gRNA (靶位点：GGGCCACTAGGGACAGGATTGG；SEQ ID NO:14)
2. EMX1-gRNA (靶位点：AGTCCGAGCAGAAGAAGAA；SEQ ID NO:15)
3. Kras-gRNA (靶位点：TAGTTGGAGCTGGTGGCGT；SEQ ID NO:16)
4.非靶标1 (靶位点：CGCGATAGCGCGAATATATT；SEQ ID NO:17)
可基本如在上文实施例1-3中所述，向活细胞或固定细胞中加入dCas9-gRNA复合物，且可使用PLA测定来检测局部化的复合物。为此，可将细胞与抗Cas9抗体(兔)一起孵育，然后与具有(+)和(-)寡核苷酸的抗兔PLA探针一起孵育，接着与连接寡核苷酸(其将桥接(+)和(-)寡核苷酸并具有内部非哺乳动物重复序列)一起孵育。接着，不论(+)和(-)探针在何处相距约40 nm邻近度以内，连接反应均将形成环状DNA模板。这些环状DNA分子将充当模板用于使用phi29 DNA聚合酶的滚环扩增。局部化的扩增DNA可使用荧光(例如远红荧光)寡核苷酸探针来显现，所述探针将与扩增模板的非哺乳动物重复序列特异性杂交。使用带有Cy5滤器的荧光显微镜观察到的点状亮红色信号表示PLA信号。
CPCH1860593P 序 列 表
<110> 西格马－奥尔德里奇有限责任公司
DAVIS, Gregory D.
PALHAN, Vikas
KREADER, Carol A.
<120> 用于使用RNA引导的核酸结合蛋白的分子邻位检测的方法和试剂
<130> 047497-550236
<150> US 62/232,023
<151> 2015-09-24
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
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Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
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<212> PRT
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aucuaauaug uucuacagug uguuuuagag cuaugcuguu uug 43
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cgcgauagcg cgaauauauu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
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gucggugcu 69
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<212> RNA
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uaggguuagg guuaggguua uguuuuagag cuaugcuguu uug 43
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<212> RNA
<213> 人类
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caaucccaau c 11

Claims (27)

1. 包含至少一种探针的复合物，所述探针包含(i)工程改造的非天然存在的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的(Cas) (CRISPR/Cas)系统，其包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA，和(ii)与所述CRISPR/Cas系统直接或间接连接的寡核苷酸。
2.权利要求1的复合物，其中所述CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。
3.权利要求2的复合物，其中所述Cas9蛋白包含两个功能性核酸酶结构域、一个功能性核酸酶结构域或不含功能性核酸酶结构域。
4.权利要求1-3中任一项的复合物，其中所述复合物包含第一探针，其包含(i)所述CRISPR/Cas系统和(ii)通过共价键或非共价键与所述CRISPR/Cas蛋白连接的第一寡核苷酸。
5.权利要求1-3中任一项的复合物，其中所述复合物包含第一探针，其包含(i)所述CRISPR/Cas系统和(ii)通过共价键或非共价键与所述向导RNA连接的第一寡核苷酸。
6.权利要求4或5的复合物，其进一步包含第二探针，所述第二探针包含(a)第二CRISPR/Cas系统和通过共价键或非共价键与所述第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白连接的第二寡核苷酸；(b)第二CRISPR/Cas系统和通过共价键或非共价键与所述第二CRISPR/Cas系统的向导RNA连接的第二寡核苷酸；或(c)针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的所述抗体连接的第二寡核苷酸。
7.权利要求1-3中任一项的复合物，其中所述复合物包含第一探针，其包含(i)所述CRISPR/Cas系统和(ii)与针对所述CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接的第一寡核苷酸。
8.权利要求7的复合物，其进一步包含第二探针，所述第二探针包含针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的所述抗体连接的第二寡核苷酸。
9.权利要求1-3中任一项的复合物，其中所述复合物包含探针，所述探针包含(i)所述CRISPR/Cas系统，(ii)与抗物种第二抗体连接的第一和第二寡核苷酸，和(iii)针对所述CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。
10.权利要求9的复合物，其进一步包含至少一种另外的CRISPR/Cas系统。
11.权利要求1-10中任一项的复合物，其中所述寡核苷酸为单链的和/或包含茎、环和/或发夹二级结构；所述寡核苷酸包含脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合；和所述脱氧核苷酸或核糖核苷酸为标准核苷酸、核苷酸类似物或2’-O-甲基修饰核苷酸。
12.一种试剂盒，其包含权利要求1-11中任一项的复合物。
13.一种用于在细胞中检测内源核酸的方法，所述方法包括使所述细胞与邻位检测探针复合物接触，所述复合物包含含有RNA引导的核酸结合蛋白的至少一种探针，其中所述RNA引导的核酸结合蛋白通过RNA导向所述内源核酸以进行结合，从而形成结合的邻位检测探针复合物，和经由原位邻位依赖性扩增反应使所述结合的邻位检测探针复合物显现以检测所述内源核酸。
14.权利要求13的方法，其中所述邻位检测探针复合物包含第一探针，其包含(i)CRISPR/Cas系统，其包含CRISPR/Cas蛋白和靶向所述内源核酸中的第一位点的向导RNA，和(ii)第一邻位检测寡核苷酸，其与所述CRISPR/Cas系统直接或间接连接。
15.权利要求14的方法，其中所述CRISPR/Cas蛋白为Cas9蛋白。
16.权利要求15的方法，其中所述Cas9蛋白包含两个功能性核酸酶结构域、一个功能性核酸酶结构域或不含功能性核酸酶结构域。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述第一邻位检测寡核苷酸通过共价键或非共价键与所述CRISPR/Cas蛋白连接；或者所述第一邻位检测寡核苷酸通过共价键或非共价键与所述向导RNA连接。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述邻位检测探针复合物进一步包含第二探针，其包含(a)包含靶向所述内源核酸中的第二位点的第二向导RNA的第二CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与所述第二CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas蛋白连接的第二邻位检测寡核苷酸；(b)包含靶向所述内源核酸中的第二位点的第二向导RNA的第二CRISPR/Cas系统，和通过共价键或非共价键与所述第二CRISPR/Cas系统的第二向导RNA连接的第二邻位检测寡核苷酸；或(c)针对核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的所述抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。
19.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述第一邻位检测寡核苷酸与针对所述CRISPR/Cas蛋白的第一抗体连接。
20.权利要求19的方法，其中所述邻位检测探针复合物进一步包含第二探针，所述第二探针包含针对所述内源核酸中的核酸相关蛋白或核酸修饰的抗体，和与针对核酸相关蛋白或核酸修饰的所述抗体连接的第二邻位检测寡核苷酸。
21.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述第一和第二邻位检测寡核苷酸与抗物种第二抗体连接，且所述邻位检测探针复合物进一步包含针对所述CRISPR/Cas蛋白的第一抗体。
22.权利要求21的方法，其中使所述细胞与第二或另外的CRISPR/Cas系统接触，所述系统包含针对所述内源核酸中的第二位点或另外的位点的第二或另外的向导RNA。
23.权利要求14-22中任一项的方法，其中所述邻位检测寡核苷酸为单链的和/或包含茎、环和/或发夹二级结构；所述邻位检测寡核苷酸包含脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其组合；和所述脱氧核苷酸或核糖核苷酸为标准核苷酸、核苷酸类似物或2’-O-甲基修饰核苷酸。
24.权利要求13-23中任一项的方法，其中所述内源核酸为核染色体DNA、信使RNA或非编码RNA。
25.权利要求13-24中任一项的方法，其中所述细胞为原代细胞、细胞系细胞或者在获自受试者的组织或流体样品之内。
26.权利要求13-25中任一项的方法，其中所述细胞为活的、固定的或冷冻的。
27.权利要求13-26中任一项的方法，其中所述原位邻位依赖性扩增反应包括邻位连接测定(PLA)或邻位依赖性杂交链反应引发(proxHCR)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109298174A (zh) * 2018-09-26 2019-02-01 姜云瀚 一种多色免疫荧光标记方法和成像方法
CN113166795A (zh) * 2018-11-07 2021-07-23 西门子医疗有限公司 用于检测特定核酸的方法
CN113637670A (zh) * 2021-04-27 2021-11-12 中国药科大学 一种用于任意基因表达调控的组合物及方法

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2017053762A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins
IL294014B2 (en) 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
WO2017131237A1 (ja) * 2016-01-30 2017-08-03 株式会社ボナック 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018070850A1 (ko) * 2016-10-14 2018-04-19 연세대학교 산학협력단 Kras 유전자에 상보적인 가이드 rna 및 이의 용도
KR101997116B1 (ko) 2016-10-14 2019-07-05 연세대학교 산학협력단 Kras 유전자에 상보적인 가이드 rna 및 이의 용도
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
GB2562721A (en) * 2017-05-16 2018-11-28 Fastbase Solutions Ltd Kits, methods and their uses for detecting cell-cell interactions in a sample
US10947599B2 (en) 2017-06-13 2021-03-16 Genetics Research, Llc Tumor mutation burden
US10081829B1 (en) 2017-06-13 2018-09-25 Genetics Research, Llc Detection of targeted sequence regions
WO2018231945A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-20 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Negative-positive enrichment for nucleic acid detection
CA3222176A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Isolation of target nucleic acids
US10527608B2 (en) * 2017-06-13 2020-01-07 Genetics Research, Llc Methods for rare event detection
CN107488710B (zh) * 2017-07-14 2020-09-22 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白的用途及靶标核酸分子的检测方法和试剂盒
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
EP3617325B1 (en) * 2018-08-29 2021-10-20 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Rna-guided endonuclease dna labeling
LU100916B1 (en) * 2018-08-29 2020-03-03 Leibniz Inst Fuer Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung Ipk RNA-guided endonuclease DNA labeling
WO2020191243A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020198640A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Massachusetts Institute Of Technology Programmable imaging methods and compositions
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
CN112029838B (zh) * 2020-07-23 2022-07-12 东南大学 一种用于DNA均相检测的CRISPR/Cas9分型PCR方法及其应用
WO2022032129A1 (en) * 2020-08-07 2022-02-10 Yale University Single-cell locus-specific profiling of epigenetic marks
WO2023018756A1 (en) * 2021-08-10 2023-02-16 The Broad Institute, Inc. In situ epitranscriptomic profiling
WO2024008891A1 (en) * 2022-07-07 2024-01-11 Cambridge Enterprise Limited Methods for mapping binding sites of compounds

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471588A (zh) * 2000-08-23 2004-01-28 宝生物工程株式会社 核酸扩增方法
WO2012152942A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Olink Ab Unfolding proximity probes and methods for the use thereof
US20140228239A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
US20140364333A1 (en) * 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005032015A1 (de) 2005-07-01 2007-01-04 Schering Ag Etui zur Aufnahme einer Arzneimittelpackung sowie deren Verwendung
WO2015048690A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
WO2016028843A2 (en) 2014-08-19 2016-02-25 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
EP3204496A1 (en) * 2014-10-10 2017-08-16 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CN107208086A (zh) * 2014-10-17 2017-09-26 霍华德休斯医学研究所 基因组探针
US20170306306A1 (en) * 2014-10-24 2017-10-26 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination
WO2017053762A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471588A (zh) * 2000-08-23 2004-01-28 宝生物工程株式会社 核酸扩增方法
WO2012152942A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Olink Ab Unfolding proximity probes and methods for the use thereof
US20140228239A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
US20140364333A1 (en) * 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WULAN DENG等: "CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells", 《PROCEEDINGS OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109298174A (zh) * 2018-09-26 2019-02-01 姜云瀚 一种多色免疫荧光标记方法和成像方法
CN113166795A (zh) * 2018-11-07 2021-07-23 西门子医疗有限公司 用于检测特定核酸的方法
CN113637670A (zh) * 2021-04-27 2021-11-12 中国药科大学 一种用于任意基因表达调控的组合物及方法

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