CN107556493B - 一种核酸递送载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸递送载体及其制备方法和应用,所述核酸递送载体为两亲性氟化材料的纳米自组装体,所述两亲性氟化材料为全氟辛烷基取代的寡聚聚乙烯亚胺。本发明的核酸递送载体将寡聚聚乙烯亚胺与全氟辛烷基材料结合在一起,由于全氟材料的强疏水性,不仅能够提高寡聚聚乙烯亚胺的核酸压缩能力,而且还能够提高其细胞内吞以及内涵体逃逸效率,寡聚聚乙烯亚胺的正电荷不仅能够用来静电复合siRNA,而且能够在内涵体环境下利用质子海绵效应促进体系的内涵体逃逸,二者相互结合,使得所述核酸递送载体不仅在无血清条件下具有非常高的沉默效率,而且有血清的情况下仍然能够表现出很高的核酸递送效率,有望应用于基于siRNA或DNA的基因治疗。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域,涉及一种核酸递送载体及其制备方法和应用,尤其是涉及一种基于氟化材料的核酸递送载体及其制备方法和应用。
背景技术
目前,基因治疗已被认为是一种强有力的手段来治疗很多疾病,包括肿瘤、病毒感染以及高血脂等。但由于核酸自身的负电性以及其大的尺寸,它们很难凭借自身进入细胞内来发挥功能;同时,游离的核酸容易被体内的核酸酶所降解而失去功能。因此,发展一种能够在体内环境保护核酸不被降解,同时又能够帮助核酸跨过细胞膜的载体十分重要。
非病毒载体的设计与制备是目前研究非常热的一个领域,其中常见的非病毒载体包括:聚乙烯亚胺、聚赖氨酸以及聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯等。其中聚乙烯亚胺作为聚阳离子载体的黄金标准,具有非常强的核酸压缩能力以及较好的递送能力,但是其高的细胞毒性使其很难被用于体内的研究。寡聚聚乙烯亚胺具有与聚乙烯亚胺拥有相同的结构单元,同时它的细胞毒性也非常低。可惜的是,寡聚聚乙烯亚胺不具有基因递送的能力。
因此,如何利用寡聚聚乙烯亚胺的优势用于基因递送是本领域期望解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种核酸递送载体及其制备方法和应用,特别是提供一种基于氟化材料的核酸递送载体及其制备方法和应用。本发明的核酸递送载体无论在无血清以及有血清下均体现出很高的核酸递送效率。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
一方面,本发明提供一种核酸递送载体,所述核酸递送载体为两亲性氟化材料的纳米自组装体,所述两亲性氟化材料为全氟辛烷基取代的寡聚聚乙烯亚胺。
在本发明中,所述全氟辛烷基取代的寡聚聚乙烯亚胺即为在寡聚聚乙烯亚胺链上通过酰胺键连接有全氟辛烷基。
在本发明中,所述两亲性氟化材料可以形象地表示为如下结构:
其中x代表寡聚聚乙烯亚胺的重复单元,y代表连接在寡聚聚乙烯亚胺上的全氟辛烷基的个数。当然这仅仅是示例性的表示,并不代表全氟辛烷基准确的连接位置,在本发明中全氟辛烷基可以连接在寡聚聚乙烯亚胺结构中其他氨基上。
在本发明中,将全氟材料这种既不亲油也不亲水并且无论在极性或非极性的环境都具有相分离趋向的材料连接在亲水材料寡聚聚乙烯亚胺上,由于全氟材料的强疏水性,不仅能够提高寡聚聚乙烯亚胺的核酸压缩能力,而且还能够提高其细胞内吞以及内涵体逃逸效率。最终,不仅在无血清条件下具有非常高的沉默效率,而且在血清的存在下仍然能够表现出很高的核酸递送效率。
优选地,所述纳米自组装体的粒径为120-160nm,例如120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm或160nm。
优选地,所述纳米自组装体的表面电位为35-50mV,35mV、38mV、40mV、42mV、45mV、48mV或50mV。
优选地,所述寡聚聚乙烯亚胺(OEI)的数均分子量为400-1200Da,例如400Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、1100Da或1200Da。
在本发明中,所述寡聚聚乙烯亚胺为超支化带正电的寡聚物。
在本发明中,所述两亲性氟化材料中全氟辛烷基的取代度为1-4,例如1、1.3、1.5、1.8、2、2.3、2.5、2.8、3、3.2、3.6、3.8或4。所述取代度是指通过茚三酮方法测得的平均每个OEI上连接的全氟辛烷基的个数。
另一方面,本发明提供一种如上所述的核酸递送载体的制备方法,所述制备方法为:全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺发生缩合反应得到两亲性氟化材料,而后两亲性氟化材料自组装得到纳米自组装体,即为所述核酸递送载体。
在本发明中,所述两亲性氟化材料由全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺(OEI)一步法制备得到,全氟辛酰氯的酰氯基团能够与OEI的伯胺通过一步法反应生成酰胺键。
优选地,所述两亲性氟化材料的具体制备方法包括以下步骤:
(1)将寡聚聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中,加入无水三乙胺,搅拌混合;
(2)冰水混合浴下,向步骤(1)得到的混合液中滴加全氟辛酰氯溶液,搅拌下进行反应,得到两亲性氟化材料。
优选地,步骤(1)所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
优选地,步骤(1)所述将寡聚聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中得到的溶液的浓度为2.5-30mg/mL;例如2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL。
优选地,步骤(1)所述无水三乙胺与步骤(2)所述全氟辛酰氯的摩尔比为(2-3):1,例如2:1、2.3:1、2.5:1、2.7:1、2.9:1或3:1。
优选地,步骤(1)所述无水三乙胺在冰水浴下加入。
优选地,步骤(1)所述搅拌混合的时间为10-50min,例如10min、13min、15min、18min、20min、25min、28min、30min、33min、36min、38min、40min、45min、48min或50min。
优选地,步骤(2)所述全氟辛酰氯与步骤(1)所述寡聚聚乙烯亚胺(OEI)的投料摩尔比为(0.5-1.3):1,例如0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1或1.3:1。在本发明中,能够通过控制全氟辛酰氯与OEI的比例获得不同取代度的两亲性氟化材料。
优选地,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液为将全氟辛酰氯溶解在有机溶剂中得到的溶液,所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
优选地,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液的浓度为0.9-30mg/mL,例如0.9mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、28mg/mL或30mg/mL。
在本发明中,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液是通过恒压滴液漏斗逐滴加入。
优选地,所述全氟辛酰氯溶液的滴加时间为2-4h,例如2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.3h、3.5h、3.8h或4h。
优选地,步骤(2)所述反应的时间为3-4h,例如3h、3.3h、3.5h、3.7h、3.9h或4h。
在本发明步骤(2)所述反应结束后,将反应液进行旋蒸除去溶剂、透析以及冻干,得到两亲性氟化材料。
优选地,所述透析使用的透析袋的截留分子量为1000Da,透析时间为2-3天,例如2天、2.2天、2.4天、2.6天、2.8天或3天。
在本发明中,两亲性氟化材料自组装是通过薄膜水化法实现的,具体包括以下步骤:将两亲性氟化材料溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中,除去有机溶剂得到两亲性氟化材料薄膜,而后加入三蒸水超声,得到纳米自组装体。
在本发明中,所述三蒸水是指经过三次蒸馏收集的水。
优选地,所述二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为8:1-10:1,例如8:1、8.3:1、8.5:1、8.8:1、9:1、9.3:1、9.5:1、9.8:1或10:1。
优选地,所述将两亲性氟化材料溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中得到的溶液的浓度为0.4-2mg/mL,例如0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL或2mg/mL。
优选地,所述除去有机溶剂通过旋转蒸发实现,所述旋转蒸发时转速为30-60r/min(例如30r/min、35r/min、38r/min、40r/min、43r/min、45r/min、48r/min、50r/min、53r/min、55r/min、58r/min或60r/min),温度为30-40℃(例如30℃、33℃、35℃、38℃或40℃)水浴,旋转蒸发15-25min(例如15min、18min、20min、22min、24min或25min)。
优选地,所述超声的频率为80-100Hz,例如80Hz、83Hz、85Hz、90Hz、93Hz、95Hz、98Hz或100Hz。
优选地,所述超声的时间为5-15min,例如5min、8min、10min、13min或15min。
在本发明中可以根据需要调整得到的纳米自组装体体系的浓度,例如可以调整超声时加入的水的体积以得到1mg/mL的两亲性氟化材料的纳米组装体。
本发明制备所述核酸递送载体的方法简单、高效、易于操作。
另一方面,本发明提供了如上所述的核酸递送载体在递送siRNA中的应用。
优选地,所述应用中,核酸递送载体与递送的siRNA之间的质量比大于等于5:1,例如5:1、7:1、9:1、10:1、13:1、15:1、18:1、20:1、25:1等,优选大于等于10:1,进一步优选10:1-20:1。
针对siRNA非病毒载体血清下沉默效率低的问题,选择本发明所述的核酸递送载体,由于两亲性氟化材料中寡聚聚乙烯亚胺的正电荷不仅能够用来静电复合siRNA,而且能够在内涵体环境下利用质子海绵效应促进体系的内涵体逃逸;氟链的引入,不仅能使体系在血清下具有很好的稳定性,而且能够进一步提高体系的內吞以及内涵体逃逸。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明的核酸递送载体将寡聚聚乙烯亚胺与全氟辛烷基材料结合在一起,由于全氟材料的强疏水性,不仅能够提高寡聚聚乙烯亚胺的核酸压缩能力,而且还能够提高其细胞内吞以及内涵体逃逸效率,寡聚聚乙烯亚胺的正电荷不仅能够用来静电复合siRNA,而且能够在内涵体环境下利用质子海绵效应促进体系的内涵体逃逸,二者相互结合,使得所述核酸递送载体不仅在无血清条件下具有非常高的沉默效率,而且有血清的情况下仍然能够表现出很高的核酸递送效率,有望应用于基于siRNA或DNA的基因治疗。并且本发明的核酸递送载体制备方法简单、高效,易于操作。
附图说明
图1为实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的质谱检测结果图,其中A图为f0.5OEI材料的质谱检测结果,B图为f0.7OEI材料的质谱检测结果,C图为f1OEI材料的质谱检测结果,D图为f1.3OEI材料的质谱检测结果。
图2为实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体的透射电镜图,其中A图为实施例2制备得到的两亲性氟化材料(f0.5OEI)纳米组装体的透射电镜图,B图为实施例1制备得到的两亲性氟化材料(f0.7OEI)纳米组装体的透射电镜图,C图为实施例3制备得到的两亲性氟化材料(f1OEI)纳米组装体的透射电镜图,D图为实施例4制备得到的两亲性氟化材料(f1.3OEI)纳米组装体的透射电镜图;A-D图的标尺均为200nm。
图3为实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体的粒径表征结果图。
图4为实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体的表面电位测定结果图。
图5为实施例1-4制备得到的核酸递送载体在无血清情况下的siRNA递送效率结果图;其中以寡聚聚乙烯亚胺(OEI)为阴性对照,商用转染试剂Lipo2000为阳性对照。
图6为在无血清和有血清情况下f0.7OEI材料制备的核酸递送载体的siRNA递送效率结果图,其中以商用转染试剂Lipo 2000为阳性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中,所述核酸递送载体为两亲性氟化材料的纳米自组装体,所述两亲性氟化材料为全氟辛烷基取代的寡聚聚乙烯亚胺。
通过以下方法制备得到核酸递送载体,具体包括以下步骤:
(1)两亲性氟化材料的合成
称取418.2mg的寡聚聚乙烯亚胺(Mn=600Da,Sigma)将其溶于35mL的无水二氯甲烷中,充分搅拌使其完全溶解后,将其放置于冰水混合浴中;另取169.1μL无水三乙胺,将其加入上述的聚乙烯亚胺反应液中,继续搅拌30min;采用恒压滴液漏斗,将溶于无水二氯甲烷(35mL)中的全氟辛酰氯(120.3μL)逐滴加入到上述反应溶液中,共滴加2h。常温下继续搅拌3h后合成完毕。通过旋转蒸发仪除去溶剂,将样品用DMSO(5mL)与水(5mL)的混合液溶解后采用截留分子量为1000Da的透析袋透析,2天后将所得样品冻干,最终得到两亲性氟化材料,由于制备过程中全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比为0.7:1,将该材料记为f0.7OEI。
(2)两亲性氟化材料的纳米组装体的制备
称取8μg氟化材料,将其充分溶于6mL体积比为9/1的二氯甲烷/甲醇中,通过旋转蒸发仪控制条件50r/min,30℃,经过20min获得氟化材料膜。在超声的条件下(100Hz),加入8mL的三蒸水超声10分钟,获得1mg/mL的氟化材料的纳米组装体。
实施例2
与实施例1不同之处仅在于,制备过程中全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比为0.5:1,将制备得到的两亲性氟化材料记为f0.5OEI。通过与实施例1中相同的步骤(2)制备得到纳米组装体。
实施例3
与实施例1不同之处仅在于,制备过程中全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比为1:1,将制备得到的两亲性氟化材料记为f1OEI。通过与实施例1中相同的步骤(2)制备得到纳米组装体。
实施例4
与实施例1不同之处仅在于,制备过程中全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比为1.3:1,将制备得到的两亲性氟化材料记为f1.3OEI。通过与实施例1中相同的步骤(2)制备得到纳米组装体。
对实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料以及纳米组装体的测试
(I)利用质谱对实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料进行检测,其结果如图1所示(其中A图为f0.5OEI材料的质谱检测结果,B图为f0.7OEI材料的质谱检测结果,C图为f1OEI材料的质谱检测结果,D图为f1.3OEI材料的质谱检测结果),寡聚聚乙烯亚胺的相对分子质量为600Da,氟碳的相对分子质量为432.5Da。寡聚聚乙烯亚胺每链接一个氟碳,其分子量会增加396Da。从图1的结果可以看出,随着投料比的增加,所得氟碳修饰的寡聚聚乙烯亚胺的分子量会增加,氟碳修饰的个数也会增加。
(II)利用茚三酮方法对实施例1-4制备得到的核酸递送载体的全氟辛烷基取代度进行定量,结果如表1所示:
表1
注:a代表两亲性氟化材料制备中全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比,b代表通过茚三酮方法测得的核酸递送载体的全氟辛烷基取代度。
(III)两亲性氟化材料纳米组装体的生物透射电镜测试
取8μL 0.4mg/mL的实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体滴在镀有碳膜的Cu网上(200目),5min后吸掉样品留下一层样品的水膜,室温晾干。之后,滴加8μL的负染液(醋酸双氧铀),5min后吸掉,室温晾干后做透射电镜。图2是实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体的电镜图像照片,其中A图为实施例2制备得到的两亲性氟化材料(f0.5OEI)纳米组装体的电镜图,B图为实施例1制备得到的两亲性氟化材料(f0.7OEI)纳米组装体的电镜图,C图为实施例3制备得到的两亲性氟化材料(f1OEI)纳米组装体的电镜图,D图为实施例4制备得到的两亲性氟化材料(f1.3OEI)纳米组装体的电镜图,由图2可见,实施例1-4制备得到的不同两亲性氟化材料的纳米组装体都能够形成球状的形貌,没有团聚现象。
(IV)粒径和表面电位测试
利用动态光散射仪对实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米组装体的粒径以及表面电位进行测定,图3为两亲性氟化材料的纳米组装体的粒径表征结果图,由图3可以看出,f0.5OEI纳米组装体粒径为128.6±1.9nm,f0.7OEI纳米组装体粒径为150.0±1.3nm,f1OEI纳米组装体粒径为150.6±0.9nm,f1.3OEI纳米组装体粒径为146.1±2.0nm。图4为两亲性氟化材料的纳米组装体的表面电位测定结果图,由图可知,f0.5OEI纳米组装体表面电位为38.6±1.9mV,f0.7OEI纳米组装体表面电位为49.6±0.8mV,f1OEI纳米组装体表面电位为47.6±0.9mV,f1.3OEI纳米组装体表面电位为47.6±0.8mV。
实施例5
在本实施例中制备核酸递送载体与siRNA复合物,并对细胞沉默以及沉默效率进行检测。
(1)核酸递送载体与siRNA复合物的制备
取16μL 1mg/mL的实施例1-4制备得到的两亲性氟化材料的纳米自组装体用DHB无菌水稀释至25μL,取0.8μg的siRNA用DHB无菌水稀释至25μL,将二者混合均匀,室温放置30min后获得载体与siRNA质量比为20/1的复合物。同样方法制备得到载体与siRNA质量比为5/1和10/1的复合物。
(2)细胞沉默以及沉默效率的检测
将Luc-HeLa(稳定表达荧光素酶的宫颈癌)细胞以每孔50000个细胞的密度种植于24孔板中,生长24h之后,将完全培养基换为无血清培养基继续培养0.5h,来饥饿细胞从而提高载体的內吞效率。吸掉培养基,加入无血清培养基稀释的或10%血清稀释的含有0.8μg的siRNA与两亲性氟化材料的纳米自组装体(即载体)的复合物进行转染。5h后吸掉培养基,每孔加入0.5mL的完全培养基继续培养48h,转染完毕。
转染后,先用冷PBS冲洗两遍细胞,加入1×的细胞裂解液150μL,放入-80℃冰箱冻融一次进行充分裂解。收集细胞裂解液,12000r/min离心2min,取上清液进行荧光素酶的活性以及BCA测试。每个样品取10μL加入到96孔荧光板中,每孔快速加入50μL的底物,2min内采用酶标仪测试荧光值记为RLU。每孔取20μL样品,加入160μL BCA反应液,37℃孵育30min后,用酶标仪测试样品562nm处的吸收。通过标准曲线算出每孔样品的蛋白总量。最终的相对荧光强度为每孔的RLU与其蛋白总量的比值,记为RLU/蛋白质量。
图5是实施例1-4制备得到的核酸递送载体在无血清情况下的siRNA递送效率结果图(其中以寡聚聚乙烯亚胺(OEI)为阴性对照,商用转染试剂Lipo 2000为阳性对照),由图5可见,在无血清条件下,OEI的沉默效率为108.6%,商用试剂Lipo 2000沉默效率达62.2%,不同取代度的两亲性氟化材料纳米组装体都能够获得大于90%的沉默效率。说明通过全氟辛烷基取代的OEI能够大幅度提高其沉默效率,甚至高于商用转染试剂Lipo 2000。
图6是在无血清和有血清情况下f0.7OEI材料制备的核酸递送载体的siRNA递送效率结果图(其中以商用转染试剂Lipo 2000为阳性对照),由图6可见,与Lipo 2000相比,氟化材料纳米组装体(f0.7OEI)在质量比大于5/1时,例如在10/1和20/1时,无论在无血清还是血清下均比Lipo 2000的沉默效率高。
本发明通过上述实施例来说明本发明的核酸递送载体及其制备方法和应用,但本发明并不局限于上述实施例,即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (29)
2.根据权利要求1所述的核酸递送载体,其特征在于,所述纳米自组装体的粒径为120-160nm。
3.根据权利要求1所述的核酸递送载体,其特征在于,所述纳米自组装体的表面电位为35-50mV。
4.根据权利要求1所述的核酸递送载体,其特征在于,所述寡聚聚乙烯亚胺(OEI)的数均分子量为400-1200Da。
5.根据权利要求1所述的核酸递送载体,其特征在于,所述两亲性氟化材料中全氟辛烷基的取代度为1-4。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸递送载体的制备方法,其特征在于,所述制备方法为:全氟辛酰氯与寡聚聚乙烯亚胺发生缩合反应得到两亲性氟化材料,而后两亲性氟化材料自组装得到纳米自组装体,即为所述核酸递送载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述两亲性氟化材料的具体制备方法包括以下步骤:
(1)将寡聚聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中,加入无水三乙胺,搅拌混合;
(2)冰水混合浴下,向步骤(1)得到的混合液中滴加全氟辛酰氯溶液,搅拌下进行反应,得到两亲性氟化材料。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述将寡聚聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中得到的溶液的浓度为2.5-30mg/mL。
10.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述无水三乙胺与步骤(2)所述全氟辛酰氯的摩尔比为(2-3):1。
11.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述无水三乙胺在冰水浴下加入。
12.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述搅拌混合的时间为10-50min。
13.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述全氟辛酰氯与步骤(1)所述寡聚聚乙烯亚胺的投料摩尔比为(0.5-1.3):1。
14.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液为将全氟辛酰氯溶解在有机溶剂中得到的溶液,所述有机溶剂为无水二氯甲烷和/或无水三氯甲烷。
15.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液的浓度为0.9-30mg/mL。
16.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述全氟辛酰氯溶液的滴加时间为2-4h。
17.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述反应的时间为3-4h。
18.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述反应结束后,将反应液进行旋蒸除去溶剂、透析以及冻干,得到两亲性氟化材料。
19.根据权利要求18所述的制备方法,其特征在于,所述透析使用的透析袋的截留分子量为1000Da,透析时间为2-3天。
20.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,两亲性氟化材料自组装是通过薄膜水化法实现的,具体包括以下步骤:将两亲性氟化材料溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中,除去有机溶剂得到两亲性氟化材料薄膜,而后加入三蒸水超声,得到纳米自组装体。
21.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,所述二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为8:1-10:1。
22.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,所述将两亲性氟化材料溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中得到的溶液的浓度为0.4-2mg/mL。
23.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,所述除去有机溶剂通过旋转蒸发实现,所述旋转蒸发时转速为30-60r/min,温度为30-40℃水浴,旋转蒸发15-25min。
24.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,所述超声的频率为80-100Hz。
25.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,所述超声的时间为5-15min。
26.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸递送载体在递送siRNA中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用,其特征在于,所述核酸递送载体与递送的siRNA之间的质量比大于等于5:1。
28.根据权利要求26所述的应用,其特征在于,所述核酸递送载体与递送的siRNA之间的质量比大于等于10:1。
29.根据权利要求26所述的应用,其特征在于,所述核酸递送载体与递送的siRNA之间的质量比为10:1-20:1。
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