CN104812734B - 氨基酸衍生物 - Google Patents

氨基酸衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN104812734B
CN104812734B CN201380060971.9A CN201380060971A CN104812734B CN 104812734 B CN104812734 B CN 104812734B CN 201380060971 A CN201380060971 A CN 201380060971A CN 104812734 B CN104812734 B CN 104812734B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
formula
amino acid
protein
mutein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380060971.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104812734A (zh
Inventor
K·H·格拉布斯坦
布伦特 M·范
M·马瑞利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
Original Assignee
MedImmune Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Vaccines Inc filed Critical MedImmune Vaccines Inc
Publication of CN104812734A publication Critical patent/CN104812734A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104812734B publication Critical patent/CN104812734B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/49—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a carbon atom of an acyclic unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/56—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of carboxyl groups, e.g. oxamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/70—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/72—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C235/74—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C247/00—Compounds containing azido groups
    • C07C247/02—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
    • C07C247/04—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/12—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/20—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01025—1,4-Lactonase (3.1.1.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)

Abstract

提供了具有在此定义的式V和VI的氨基酸衍生物，这些氨基酸衍生物是用在生物共轭方法中的吡咯赖氨酸类似物。

Description

氨基酸衍生物
本发明涉及用在生物共轭方法中的氨基酸衍生物。
引言
吡咯赖氨酸是天然氨基酸，是真正由琥珀密码子指定的天然氨基酸。它使用了第21氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)，天然进化与所有其他氨基酸和tRNA正交。布莱特(Blight)等人，2004示出，PylRS和其配对物tRNA(tRNApyl)可在大肠杆菌中的琥珀密码子处掺入吡咯赖氨酸。他们还示出，该wt PylRS是天然混杂的，并且可掺入赖氨酸的类似物。
横山(Yokoyama)等人(EP 1911840)证明该PylRS/tRNApyl系统在真核细胞中是正交的，并且示出若干非天然氨基酸(nnAA)掺入到由细菌细胞中的琥珀密码子编码的靶蛋白质中。这些作者还鉴别了pylRS中的关键氨基酸残基，这些关键氨基酸残基形成氨基酸结合口袋，并在优于其他标准氨基酸而选择吡咯赖氨酸方面起作用。在此位点的突变产生使得能够用AzZ-lys识别并氨酰化tRNApyl的突变体(柳泽(Yanagisawa)2008)。
这种正交性延伸到细菌和真核细胞。
PylRS是天然混杂的合成酶，它已经天然进化到排除赖氨酸，但会掺入赖氨酸类似物(不经突变)，包括叠氮化物、炔烃和烯烃(柳泽等人，2008；诺伊曼(Neumann)等人，2008；向井(Mukai)等人，2008；阮(Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础依赖于pylRS结合口袋的氨基酸残基与吡咯赖氨酸的吡咯环之间的疏水相互作用，该吡咯赖氨酸的吡咯环稳定并正确地将氨基酸定位在该合成酶的活性位点处(卡佛兰(卡佛兰)等人，2007)。这个RS/tRNA对已通过瞬时转染引入细菌、酵母和哺乳动物细胞中，并显示对于将多个非天然氨基酸掺入到靶蛋白质中是有效的。
例如，EP 1911840证明将N--boc-赖氨酸掺入到大肠杆菌细胞中的靶蛋白质中。
吡咯赖氨酸类似物(定义为由天然或遗传进化的PylRS识别并且掺入到琥珀密码子位点处的蛋白质中的氨基酸衍生物)已在过去几年被披露并且已由例如，费克内尔(Feckner)等人(费克内尔(Fekner)、李(Li)&陈(Chan)，2010)和刘(Liu)等人综述。已经使用pylRS-tRNApyl系统将具有官能团或翻译后修饰的类似物以位点特异性的方式掺入到蛋白质中。若干研究，参见例如柳泽等人，聚焦于PylRS酶内的突变，以容纳类似物，在这些类似物中N6取代基为该结合口袋吡咯赖氨酸内的芳族环。其他人，例如阮等人(也于WO 2010/139948中)和李(Li)等人(也于WO 2011/044255中)聚焦于不携带庞大N6取代基的吡咯赖氨酸类似物的鉴别，结果获得更简单的类似物，这些更简单的类似物对于合成天然pylRS/tRNApyl对和与之相互作用是简单的。此外，金(Chin)等人开发了两种具有末端炔烃和叠氮化物基团的类似物，该类似物可落实通过铜催化点击化学(CUAAC)用于蛋白质标记。
仍存在开发另外的吡咯赖氨酸类似物的需要。在迄今为止制造的吡咯赖氨酸类似物被局限于从赖氨酸骨架发展的那些的时候，诸位发明人已起始于各种氨基酸结构产生了成功掺入到具有天然pylRS/tRNApyl对的蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物。
发明概述：
根据本发明，提供了如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物。
还提供了包含作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物的突变体蛋白质。
还提供了在每个重链和/或轻链中包含作为非天然氨基酸的一种或多种(例如一种)如此处所述的具有式V和VII的吡咯赖氨酸类似物的抗体。
还提供了如前述的突变体蛋白质或抗体，该突变体蛋白质或抗体通过该一种或多种(例如一种)非天然氨基酸共轭至选自以下各项的一个或多个(例如一个)部分：蛋白质、细胞毒素剂、药物和聚合物。
还提供了如前述的吡咯赖氨酸类似物在制造包含一个或多个非天然氨基酸的突变体蛋白质例如抗体中的用途。
本发明中描述的氨基酸类似物是新的并且有用的，并且具有以下优点：制备简单明了、易于掺入到蛋白质中(典型地在适当使用时不损失生物活性)以及为生物共轭提供有用的手段。
附图简要说明
图1.包含单克隆抗体的叠氮化物的PEG化。泳道1：未经处理的抗体，泳道2：具有掺入到重链中的吡咯赖氨酸类似物式V.1并经受PEG化条件的抗体；泳道3：具有掺入到重链中的吡咯赖氨酸类似物式VI.1并经受PEG化条件的抗体。
图2.具有本来包含掺入到重链中的吡咯赖氨酸类似物式VI.1的抗体的4D5-阿里他汀F抗体药物共轭物的HIC色谱图。
序列表中的序列的简要说明
SEQ ID No 1：PylRS马氏甲烷八叠球菌WT核苷酸序列
SEQ ID No 2：PylRS马氏甲烷八叠球菌WT氨基酸序列
SEQ ID No 3：PylRS马氏甲烷八叠球菌，Y384F突变体核苷酸序列
SEQ ID No 4：PylRS马氏甲烷八叠球菌，Y384F突变体氨基酸序列
SEQ ID No 5：tRNApyl马氏甲烷八叠球菌
SEQ ID No 6：U6snRNA启动子
SEQ ID No 7：U6-tRNApyl构建体
SEQ ID No 8：GFP核苷酸序列
SEQ ID No 9：GFP氨基酸序列
SEQ ID No 10：GFPY40核苷酸序列
SEQ ID No 11：GFPY40氨基酸序列
SEQ ID No 12：抗-Her2(4D5)γ核苷酸序列
SEQ ID No 13：抗-Her2(4D5)γ氨基酸序列
SEQ ID No 14：抗-Her2(4D5)γ_K274琥珀核苷酸序列
SEQ ID No 15：抗-Her2(4D5)γ_K274琥珀氨基酸序列
SEQ ID No 16：抗-Her2(4D5)κ核苷酸序列
SEQ ID No 17：抗-Her2(4D5)κ氨基酸序列
发明详述
定义
术语“酰胺”是指–C(＝O)-NH-键。
术语“氨基甲酸酯”是指–O-C(＝O)-NH-键。
术语“酯”是指–C-C(＝O)-O-C键
术语“烷基”是指脂肪族键或取代基，典型地包含1-6个例如1-4个碳原子，并且可以是直链或支链的。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基。
术语“烷氧基”是指基团–O-烷基。
术语“烯基”、“链烯烃”或“烯烃”是指脂肪族键或取代基，典型地包含2-6个例如2-4个碳原子，并且可以是直链或支链的，并且就包含至少一个C＝C部分而言是不饱的。实例包括乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、以及2-甲基-丙烯-2-基。烯基基团可任选地被例如一个或多个(例如1个)取代基(例如卤素(例如Cl)或醚基团(例如–O-C1-6烷基))取代，尽管适合地它是未被取代的。
术语“炔基”或“炔烃”是指脂肪族键或取代基，典型地包含2-6个例如2-4个碳原子，并且可以是直链或支链的，并且就包含至少一个C≡C部分而言是不饱的。实例包括-C≡CH和-C≡C-CH3。炔基基团可任选地被例如一个或多个(例如1个)取代基(例如卤素(例如Cl)或醚基团(例如–O-C1-6烷基))取代，尽管适合地它是未被取代的。
术语“环烷基”是指典型地包含3至8个环碳原子的脂环的和不饱和的化合物。环烷基基团可包含分支。碳原子的总数典型地会是3至10个。示例性基团包括环丙基、环丁基、环戊基、3-甲基-环丙基以及环己基。
术语“环烯基”是指典型地包含5至8个环碳原子并包含至少一个C＝C部分的脂环化合物。环烯基基团可包含分支。碳原子的总数典型地会是5至10个。示例性基团包括环戊烯基、3-甲基-环丙烯基和环己烯基。
术语“杂环基”是指环烷基或环烯基部分，其中该环包含一个或多个(例如一个、两个或三个，例如一个或两个，尤其一个)选自O、N和S的杂原子。实例包括氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪、吗啉、以及硫代吗啉。
术语“芳基”是指可以是键的部分或取代基的部分的芳族环结构。芳基部分可包含一个环(例如苯基)或两个环(例如萘基)。芳基基团可以被例如一个或多个(例如一个或两个，例如一个)取代基取代，该取代基选自烷基、烯基、炔基、氟烷基、卤素、烷氧基、硝基和氰基。示例性的芳基是苯基。
术语“杂芳基”是指可以是键的部分或取代基的部分的杂芳族环结构。该杂芳族环可包含1-4个(更通常1-3个例如一个或两个)选自O、N和S的杂原子。杂芳基部分可包含一个环或两个环。包含一个6元环的示例基团包括吡啶和嘧啶。包含一个5元环的示例基团包括吡咯、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、二唑、噻二唑和四唑。包含两个环的杂芳基部分可在一个或两个环中包含杂原子。实例包括喹啉和异喹啉。杂芳基基团可以被例如一个或多个(例如一个或两个，例如一个)取代基取代，该取代基选自烷基、烯基、炔基、氟烷基、卤素、烷氧基、硝基和氰基。
术语“芳族卤化物”是指被至少一个(例如一个)卤素基团例如氟、氯、溴或碘取代的芳族环(典型地苯基)。所述芳族环可进一步包含取代基，例如针对芳基提到的那些。
术语“叠氮化物”和“叠氮基”是指N＝N(+)＝N(-)官能团。
术语“环炔烃”是指碳原子(典型地6-9元，尤其8-9元)的环安排，其包括环结构中捕获的碳碳三键。实例包括环辛炔和环壬炔。另外一个实例是苯炔。环炔烃基团可包含分支。碳原子的总数将典型地是6至12个，例如6至10个。
术语“酮”是指C-C(＝O)-C键。
术语“吡咯赖氨酸类似物”意指由天然或遗传进化的PylRS识别并且掺入到蛋白质中的琥珀密码子位点处的氨基酸衍生物。
表述“这20个天然氨基酸中一个的侧链”是指涉及由其单个字母代码A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y所知道的20个天然氨基酸的式HOOC-CHR-NH2中的基团R。预期了L或S立体化学(或其混合物)，但是优选L立体化学。
本发明披露了吡咯赖氨酸类似物。
本发明的一些吡咯赖氨酸类似物具有式V的结构：
式V
其中
Z＝化学键、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、O、S或CH-NH2；
b是0或整数1-7；并且
FG＝叠氮化物、链烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃。
在式V中，当FG表示芳基时，实例是芳族卤化物，例如4-卤代苯基，例如4-碘苯基。
部分Z(CH2)bFG可以，例如，表示CO-芳基，例如CO-苯基或–CO烷基，例如-COMe。具有式V的示例性化合物如下：
(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙氧基)羰基]氨基}己酸
式V.1；
(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
式V.2；
(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
式V.3；
(2S)-2-氨基-6-(3-叠氮基丙酰胺基)己酸
式V.4；
(2S)-2-氨基-6-(戊-4-烯酰胺基)己酸
式V.5。
(S)-2-氨基-6((2-氧代-2-苯基乙酰胺)己酸
式V.6；
(S)-2-氨基-6((2-氧代-2-丙酰胺)己酸
式V.7；以及
(2S)-2-氨基-6-(2-叠氮基乙酰胺基)己酸
式V.8
适合用作本发明中的非天然氨基酸的可替代的吡咯赖氨酸类似物具有式VI的结构：
式VI
其中
Z＝CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、O或S；
FG＝叠氮化物、链烯烃、炔烃、酮、酯、芳基或环炔烃；并且
b＝整数1-4。
在式VI中，当FG表示芳基时，实例是芳族卤化物，例如4-卤代苯基，例如4-碘苯基。
适合地，Z表示NH。在另一个实施例中，它表示CH。
例如，b可以表示1或2。
例如，FG可以表示–N3、-CH＝CH2、-C≡CH、-COCH3、COOCH3、被卤素取代的苯基、或环辛炔。
具有式VI的示例性化合物是：
(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸
式VI.1；
(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}己酸
式VI.2；以及
(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-烯-1-基)氨基甲酰基]氧基}己酸
式VI.3
在式V和VI的结构中，当FG表示链烯烃时，它适合地表示–CH＝CH2或–CH＝CH-CH3，优选地–CH＝CH2。
在式V和VI的结构中，当FG表示炔烃时，它适合地表示–C≡CH或–C≡C-CH3，优选地–C≡CH。
在式V和VI的结构中，当FG表示酮时，它适合地表示–C(＝O)-CH3或–C(＝O)-CH2-CH3，优选地–C(＝O)-CH3。
在式VI的结构中，当FG表示酮时，它可以例如表示–C(＝O)-芳基，例如–C(＝O)-苯基。
在式V和VI的结构中，当FG表示酯时，它适合地表示–C(＝O)-O烷基，例如–C(＝O)-O甲基。
在式V和VI的结构中，当FG表示芳族卤化物时，它适合地表示被卤素尤其碘取代的苯基(例如4-碘-苯基)。
在式V和VI的结构中，当FG表示环炔烃时，它适合地表示环辛炔，例如环辛-4,5-炔。
有利地，本发明的具有式V和VI的nnAA已显示具有如由GFP测定证明的良好的掺入。在作为掺入测定的GFP测定中，式VI.1与式V.1具有相似水平的翻译能力。式V和VI两者易被修饰以掺入各种有用的官能团，这些官能团可被用于位点选择性翻译后修饰。炔烃和链烯烃易被掺入。可使用各种方法制造此处披露的吡咯赖氨酸类似物。一般这些反应条件可由本领域的普通技术人员确定。
式V类似物可容易地通过将活化的羰基基团(例如氯甲酸酯)、活化羧酸酯、异氰酸酯、活化碳酸酯或磺酰卤化物添加到类型1的单保护的二氨基底物来制备，其中ɑ-氨基基团受保护基团(“PG”)例如Boc、Cbz、TFA、乙酰基或Fmoc基团(参见方案1)的保护。偶联的产物3可经受另外的修饰，例如用叠氮基亲核试剂置换卤化物以安置所希望的官能度。否则，将中间体3去保护以去除ɑ-氨基酸掩蔽基团，以给予所希望的式V类似物。
方案1：
通过将羟基氨基酸9共轭至具有活化羰基例如羧酸酯、异氰酸酯、酰基氯、活化碳酸酯或磺酰卤化物的底物来制备式VI类似物。偶联的产物11可经受另外的修饰，例如通过置换离去基团例如卤化物或活化醇来设置叠氮化物官能团。通过最终去保护以去除ɑ-氨基酸掩蔽基团来获得所希望的氨基酸类似物12。可按照方案1使用保护基团。参见方案2：
将非天然氨基酸掺入到蛋白质中
可将此处披露的吡咯赖氨酸类似物掺入到重组蛋白质中。具体言之，可通过琥珀压制实现将该类似物位点特异地掺入到重组蛋白质中，其中无义(琥珀)密码子被插入到编码该重组蛋白质的核苷酸序列内，在该吡咯赖氨酸类似物待插入的位点处。该突变的核苷酸序列，连同编码PylRS和tRNApyl的一个或多个质粒一起，被插入到无细胞表达系统的细胞中。
该宿主细胞可以是被包括如前述DNA构建体的载体转化的真核细胞系。
可替代地，提供了无细胞表达系统，其中获得自宿主细胞的合成反应溶菌产物包括合成多肽所需的至少一钟组分。该合成反应溶菌产物获得自细菌或真核细胞。优选地，该合成反应溶菌产物获得自真核细胞，更优选地，获得自兔网织红细胞或小麦胚芽。
优选地，该无细胞表达系统能够表达本发明的WT PylRS和tRNApyl，其中tRNApyl被引入用于获得合成反应溶菌产物的具有本发明的DNA构建体的细胞中。
适于用在本发明中的无细胞表达系统描述于，例如WO 201008110、WO2010081111、WO 2010083148，将其通过引用以其全文结合在此。
当将该吡咯赖氨酸类似物添加到该细胞或表达系统中时，所述类似物被掺入到重组蛋白质中指定位置处。该nnAA和该tRNApyl被pylRS结合，并且该tRNApyl随后被该nnAA氨酰化。包含琥珀反密码子的此tRNApyl被释放到胞液中，在响应于琥珀终止密码子的情况下可与核糖体和所释放的nnAA相互作用以形成与生长的多肽链结合的肽。
被修饰以掺入本发明的吡咯赖氨酸类似物的重组蛋白质包括所有易于进行位点特异性翻译后修饰的重组蛋白质，例如治疗蛋白质，例如细胞因子、抗体和抗体衍生物(例如Fab片段或单链抗体，例如单链可变片段(scfv))、肽、酶、融合蛋白质、诱骗受体、蛋白质疫苗、蛋白质激素，例如胰岛素、生长因子(例如人类生长激素、hGH、hGCSF、hFSH、hHCG)。其他可用本发明的吡咯赖氨酸类似物修饰的蛋白质包括诊断标签、成像试剂。
适合地，可将蛋白质位点特异性地修饰以掺入本发明的一种或多于一种nnAA(吡咯赖氨酸类似物)。例如，抗体可在重链、或在轻链、或在轻链和重链两者处掺入本发明的nnAA。
具有掺入的非天然氨基酸的蛋白质的位点特异性共轭
具有本发明的掺入的吡咯赖氨酸类似物的蛋白质可被用于制备官能化的蛋白质共轭物。可被共轭至具有掺入的非天然氨基酸的蛋白质的分子包括(i)其他蛋白质，例如抗体，尤其单克隆抗体；(ii)聚合物，例如PEG基团或其他可引起系统中半衰期延长的基团；(iv)细胞毒素剂，例如阿里他汀F；以及(v)药物部分，例如阿霉素和包含放射性同位素的部分。此外，这些修饰的蛋白质可被共轭至药物或核苷酸，用于这些高效化合物的靶向递送。
某些实施例的更多细节在以下抗体药物共轭的讨论中给出。
常规地，吡咯赖氨酸类似物可包含独特的化学基团，该化学基团允许以靶向方式共轭而没有与其他氨基酸发生副反应的风险。例如非天然氨基酸可包含叠氮化物或炔烃基团，该叠氮化物或炔烃基团允许使用胡伊斯根(Huisgen)1,3-偶极环加成反应，与待被共轭的包含相应的炔烃或叠氮化物基团的分子发生反应。
本发明的优选的共轭化学包括正交于天然的二十个氨基酸的反应。此类反应不与天然的20个氨基酸相互作用或引起副反应，这20个氨基酸对于与该反应相关的官能团是特异性的。适合地，通过本发明的吡咯赖氨酸类似物，这些必需官能团被掺入到靶蛋白质中。
此外，所述反应在对于该蛋白质是非破坏性的条件下进行，例如水性溶剂，pH值范围是该蛋白质可以接受的并且维持其溶解性，温度对该蛋白质不会导致有害影响。
增加该蛋白质和该连接体之间的附接部分的稳定性可以是有利的。常规方法通过与马来酰亚胺反应形成硫醇醚，共轭至半胱氨酸的硫醇基团。该硫醇醚可经受逆反应，从该抗体释放连接体药物衍生物。在本发明的实施例中，叠氮化物和炔烃之间采用的共轭化学导致芳族三唑，该芳族三唑显著地更稳定，并且不容易发生可逆性。
此外，该反应的产物、蛋白质和有效载荷之间的键应该是稳定的，等于或大于与常规键(酰胺、硫醇醚)相关的稳定性。虽然不是对共轭的妨碍，如果共轭反应可以在天然条件下完成的话通常是有利的，因为这将消除额外的重折叠处理步骤。
用于产生本发明的共轭物的优选的化学共轭包括：3+2炔烃-叠氮化物环加成、3+2偶极环加成、胡伊斯根(Husigen)3+2环加成、铜促进的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、钌促进的叠氮化物炔烃环加成(RAAC)、金属促进的叠氮化物炔烃环加成(MAAC)、以及张力促进的叠氮化物炔烃环加成(SPAAC)；基于钯的偶联，包括赫克(Heck)反应，薗头(Sonogashira)反应铃木(Suzuki)反应史帝勒(Stille)偶联桧山(Hiyama)/丹麦(Denmark)反应烯烃复分解狄尔斯-阿尔德(Diels-alder)反应羰基与肼、酰肼、烷氧基胺或羟基胺的缩合；张力促进的与腈和腈氧化物的环加成；电子促进的环加成；片段挤出环加成；链烯烃环加成，随后β-消除反应。
根据一个优选的实施例，该掺入的氨基酸包含叠氮化物或炔烃基团，并且化学修饰的方法包括使所述叠氮化物或炔烃基团与包括炔烃或叠氮化物基团的试剂反应。设想的反应是胡伊斯根1,3-偶极环加成反应，其导致三唑键的产生。包括炔烃或叠氮化物基团的试剂可以是携带炔烃或叠氮化物基团(可任选地通过连接体)的蛋白质(例如抗体)或细胞毒素剂或药物或适于半衰期延长的物质(例如PEG基团)。
可任选地，该胡伊斯根1,3-偶极环加成反应可在Cu(I)催化作用的存在下进行。
优选地，铜催化的环加成反应是在室温下，在水性溶液中，在半胱氨酸和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)的存在下进行。可替代地，该铜催化的环加成反应是在从4℃至50℃下，在水性溶液中，在抗坏血酸钠和三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)的存在下进行的。该反应还可在混合的水性/有机溶液中进行，其中有机组分由以下各项组成：DMSO、DMF、甲醇、乙醇、t-丁醇、三氟乙醇、丙二醇、乙二醇和己二醇。
在变体反应中，该掺入的氨基酸包含叠氮化物或链烯烃基团，并且化学修饰的方法包括使所述叠氮化物或链烯烃基团与包括链烯烃或叠氮化物基团的试剂反应。包括链烯烃或叠氮化物基团的试剂可以是携带炔烃或链烯烃基团(可任选地通过连接体)的蛋白质(例如抗体)或毒素或适于半衰期延长的物质(例如PEG基团)。
掺入的nnAA和靶有效载荷之间的位点特异性共轭可以用完全折叠的蛋白质(例如抗体、抗体片段、和细胞因子)进行。可替代地，该共轭可以在变性剂例如十二烷基硫酸钠和脲的存在下，在变性的蛋白质上进行。该铜催化的叠氮化物炔烃加成可以在变性剂和还原剂例如二硫苏糖醇和2-巯基乙醇的存在下进行。
当多于一个nnAA被掺入到靶蛋白质(例如抗体)中时，该化学修饰可以相同或不同。例如如果两个nnAAs被掺入，一个可被修饰为共轭至药物部分，并且一个可被修饰为共轭至PEG部分。
便利地，在掺入多于一个本发明的具有不同但互补的反应性的基团的nnAA时，所述nnAA可彼此发生反应以产生分子内连接。
在实施例中，本发明的共轭化学被用于制备抗体药物共轭物。该共轭化学还可被用于组装抗体-蛋白质共轭物、蛋白质蛋白质共轭物(例如由抗体片段构成的双特异性物)。该共轭化学还可被用于将聚合物结合的药物共轭物共轭至靶向剂例如抗体和抗体片段。该共轭化学还可被用于将聚合物例如PEG附接至蛋白质，以操纵药代动力学性质。
PEG部分
靶蛋白质可被共轭至PEG部分。PEG部分可被掺入到抗体药物共轭物中。该PEG部分可典型地具有在0.5kDa和40kDa例如5kDa和40kDa之间变化的分子量。更优选地，该PEG部分可具有20kDa左右的分子量。此外，该PEG部分可具有从100-2000Da变化的分子量。PEG部分可以是直链或支链的或多臂的。
该PEG部分可以用末端炔烃、叠氮化物、氰化物、环炔烃、链烯烃、芳基卤化物官能化。该PEG可以如下方式官能化，例如单官能化、同双官能化、异双官能化和多-同官能化。
抗体药物共轭物(ADC)
根据本发明的吡咯赖氨酸类似物特别用于产生具有均质性质的抗体药物共轭物(由合成连接体共价结合到给定药物(典型地细胞毒性药物)或者蛋白质或PEG基团的重组的抗体)，其中每抗体的药物(或其他共轭分子)的数目和那些药物在该抗体上的位置被明确地控制，从而获得包含掺入的非天然氨基酸的单克隆抗体并且通过正交化学位点特异性地共轭至携带药物部分(或其他共轭分子)的连接体。
可以遵循包括以下步骤的方法来制造用本发明的吡咯赖氨酸类似物获得的ADC：
1.将一个或多个携带编码全长抗体的DNA序列的质粒引入本发明的稳定细胞系中，借此将终止密码子引入到该序列内的特异位置处
2.对修饰的在所希望的一个或多个位置处具有装入的吡咯赖氨酸类似物(nnAA)的抗体进行纯化。
3.通过正交化学使被修饰以包括如下官能团的细胞毒素-连接体衍生物与包含互补的反应性基团的修饰的抗体发生反应，该官能团互补于装入该抗体中的nnAA
4.纯化所得到的ADC
因此，本发明还提供了ADC，借此该抗体组分已被修饰以在所希望的位置掺入具有独特反应性官能团的非天然氨基酸，借此此类官能团允许共轭至药物部分(或蛋白质或PEG基团)。
在实施例中，本发明提供了包括抗-Her-2抗体的抗体共轭物，该抗-Her-2抗体通过包括三唑部分的连接体而共轭至一个或多个(例如一个、两个、三个或四个，优选地一个或两个，尤其一个)选自蛋白质、药物和PEG部分的部分。
具体言之，该三唑部分可以通过非天然氨基酸的侧链中的叠氮化物或炔烃部分和附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔烃或叠氮化物部分的反应形成，该非天然氨基酸被掺入到抗-Her-2抗体的序列中。
在一个实施例中，该三唑部分是通过在Cu(I)催化作用的条件下，非天然氨基酸的侧链中的叠氮化物或炔烃部分和附接至蛋白质、药物或PEG部分的炔烃或叠氮化物部分的反应形成，该非天然氨基酸被掺入到抗-Her-2抗体的序列中。
Cu(I)催化作用是通过使用天然Cu(I)来源例如碘化铜、溴化铜、氯化铜、硫醇铜、氰化铜来完成。Cu(I)种类还可以通过使用铜(II)来源和还原剂原位产生。铜(II)来源可以是硫酸铜、氯化铜(II)、或乙酸铜。该还原剂可以是抗坏血酸钠、二硫苏糖醇、TCEP、b-巯基乙醇、肼、羟基胺、亚硫酸氢钠、胱胺和半胱氨酸。
适合地，Cu(I)催化的环加成是在配体的存在下进行的，以稳定存在于反应起始时或通过用抗坏血酸钠还原Cu(II)来源例如硫酸钠原位产生的Cu(I)种类，包括TBTA、THPTA、邻二氮杂菲衍生物、吡啶基甲亚胺衍生物、二亚乙基三胺、联吡啶衍生物、TMEDA、N,N-联(2-吡啶基甲基)胺(BPMA)衍生物、N,N,N’,N’-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)衍生物、三烷基胺(例如三乙胺、二异丙基乙胺)、HEPES和MES。
在一个实施例中，铜叠氮化物炔烃环加成被用于共轭。适合地，该反应利用了细胞毒素剂，例如具有末端炔烃的阿里他汀(auristatin)、鹅膏蕈碱、紫杉酚或阿霉素。此外，该反应采用了铜来源，例如硫酸铜、乙酸铜、碘化铜或溴化铜；还原剂例如抗坏血酸钠、肼、羟基胺、亚硫酸氢钠、二硫苏糖醇、半胱氨酸、b-巯基乙醇；铜螯合配体例如三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)或三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)。适合地，该反应可在4℃-50℃下进行。适合地，该反应时间从0.5至48小时变化。在可替代的实施例中，张力促进的叠氮化物炔烃环加成被用于共轭。适合地，该反应利用了染料、PEG聚合物、或细胞毒素剂，例如具有环辛炔基团的阿里他汀。适合地，允许将反应在室温下孵育0.5-48小时。
药物部分
本发明的药物部分，例如细胞毒素药物部分，包括小分子、天然产物、合成上衍生的药物、蛋白质例如免疫毒素和放射性核素。
在实施例中，该药物部分是阿里他汀部分，例如阿里他汀或其衍生物，例如单甲基阿里他汀E(MMAE)(威多廷(Vedotin))或单甲基阿里他汀F(MMAF)、阿里他汀F(AF)、鹅膏蕈碱、紫杉醇和阿霉素。
其他药物部分包括美登素、紫杉醇、阿霉素和免疫毒素，例如外毒素或bouganin，连同放射性核素，例如碘-131、钇-90、钐-135和锶-89，还可以将其掺入到有机分子中(参见例如：MMAE：森特(Senter)，PE等人，血液(BLOOD)，102，1458-1465.MMAF：森特，PE等人，生物共轭化学(Bioconj.Chem.)2006，17，114-124.美登素：路易斯-飞利浦(Lewis-Phillips)GD，癌症研究(Cancer Res.)，63，9280-9290，2008.Bouganin：MacDonald GC等人，免疫疗法杂志(J.Immunotherapy)，32574-84，2009)。
最适合地，该药物部分是选自阿霉素、紫杉醇和阿里他汀部分的部分。
盐类
此处所述的吡咯赖氨酸类似物可任选地以盐的形式采用。任何此类盐形成本发明的部分。羧酸的盐可包括与基团1和基团2金属，尤其可溶盐例如钠和钾盐形成的盐。胺的盐可包括与弱酸和强酸，例如HCl、HBr或乙酸形成的盐。
实例
实例1.制备式V和VI类似物
制备(2S)-2-氨基-6-(戊-4-烯酰胺基)己酸(式V.5)
在25mL圆底烧瓶中放置悬浮于二噁烷(10mL)中的N-Boc-赖氨酸(500mg，2.0mmol)。添加1M K2CO3(5mL)并将该溶液冷却至0℃。缓慢添加于二噁烷(2mL)中的4-戊烯酰氯(224uL，2.0mmol)。允许将该溶液在0℃搅拌1h并且然后在室温4h。将该溶液转移到萃取漏斗并在水和醚之间分配。将有机层去除并用柠檬酸使水层成为酸性(pH＝2)。用乙酸乙酯(3x50mL)萃取水层，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。将所得到的残余物转到下一步。
将粗的N-Boc--N-4-戊烯酰胺-赖氨酸放置在具有乙腈(5mL)和TFA(2mL)的50mL圆底烧瓶中并磁力搅拌2h。浓缩该混合物。将该溶液用甲苯(10mL)处理并浓缩(2X)，并且用乙腈(10mL)处理并浓缩(2X)。将残余物在真空下干燥过夜。将残余物吸收于MeOH中并用甲基-叔丁醚沉淀。将粘性油通过离心分离，将上清液进行处置。分析MS：m/z(ES+)预期229.2(M+H)+，观察到230.3。
制备(S)-2-氨基-6((2-氧代-2-苯基乙酰胺)己酸(式V.6)
在具有磁力搅拌器的50mL圆底烧瓶中，将丙酮酸(3.5g，23.3mmol)溶解在二氯甲烷和DMF(20mL)的2:1混合物中。向该混合物中添加DCC(5.7g，27.6mmol)和NHS(3.2g，27.6mmol)。伴随着搅拌，将该混合物加热至50℃持续30min。允许将该溶液冷却，并且然后通过过滤器添加到在单独的具有磁力搅拌器的100mL圆底烧瓶中的N-Boc-赖氨酸(5.2g，21.2mmol)于DMF(20mL)中的悬浮液中。在添加活化酯之后，添加三乙胺(8.8mL，63.6mmol)，并将该混合物搅拌过夜。将该混合物在乙酸乙酯与柠檬酸之间分配。将各层分离并且将水层用乙酸乙酯萃取4次。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩。将所得到的残余物进一步通过快速色谱法纯化，以给予最终的呈油状的N-Boc赖氨酸衍生物。
在100mL圆底烧瓶中放置乙腈(50mL)中的酮基-N-Boc赖氨酸衍生物(4g，10.6mmol)。向其中添加盐酸(15mL，4N于二噁烷中)的溶液。将该溶液搅拌2h并且浓缩。最终通过快速色谱法纯化，给予靶氨基酸。分析MS：m/z(ES+)预期278.1(M+H)+，观察到279.2。
制备(2S)-2-氨基-6-(2-叠氮基乙酰胺基)己酸(式V.8)
在25mL圆底烧瓶中放置悬浮于二噁烷(5mL)中的N-Boc-赖氨酸(500mg，2.0mmol)。添加饱和NaHCO3(2mL)并将该溶液冷却至0℃。缓慢添加于二噁烷(2mL)中的溴乙酰氯(169uL，2.0mmol)。允许将该溶液在0℃搅拌1h并且然后在室温4h。将该溶液转移到萃取漏斗并在水和醚之间分配。将有机层去除并用柠檬酸使水层成为酸性(pH＝2)。用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取水层，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。将所得到的残余物转到下一步。
在50mL圆底烧瓶中放置粗的于二噁烷(10mL)中的N-Boc--2-溴乙酰基-赖氨酸(740mg，2.0mmol)。向其中添加叠氮化钠(10mL，1M)的溶液。将该溶液在60℃下搅拌过夜。将该混合物在柠檬酸(1M，50mL)和乙酸乙酯(100mL)之间分配。保留有机层，并且将水层萃取另外3次。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩为油。
将粗的N-Boc--2-叠氮基-乙酰基-赖氨酸溶解于乙腈(10mL)中并添加TFA(2mL)。将该混合物搅拌2h，并且然后浓缩。将该溶液用甲苯(10mL)处理并浓缩(2X)，并且用乙腈(10mL)处理并浓缩(2X)。将残余物在真空下干燥过夜。将残余物吸收于MeOH中并用甲基-叔丁醚沉淀。将粘性油通过离心分离，将上清液进行处置。分析MS：m/z(ES+)预期229.1(M+H)+，观察到230.2。
制备羟基-正亮氨酸衍生物(式VI.1和式VI.2)
伴随着磁力搅拌在100mL圆底烧瓶中放置N-Boc-羟基正亮氨酸(1g，4.1mmol)和乙腈(50mL)。将该混合物冷却到0℃并添加对硝基苯基氯甲酸酯(979mg，4.9mmol)和吡啶(2mL)，并将该混合物搅拌过夜。浓缩该混合物并通过快速色谱纯化。(二氧化硅，DCM/MeOH梯度)。
伴随着磁力搅拌在100mL圆底烧瓶中放置于25mL二噁烷中的2-N-Boc-乙基溴化物(1g，4.4mmol)。向其中添加叠氮化钠(1M，22.2mmol)的溶液。将该溶液在60℃下搅拌过夜。将该混合物在水与乙酸乙酯之间分配。保留乙酸乙酯层并将水层用乙酸乙酯萃取另外三次。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩为油。
将油吸收于乙腈(35mL)中并添加于二噁烷中的HCL(4M，10mL)。将该混合物搅拌两小时，并在真空下浓缩。
制备(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸(式VI.1)
在50mL圆底烧瓶中放置于二噁烷(10mL)中的N-Boc-正亮氨酸对硝基苯基碳酸酯(503mg，1.2mmoL)。向其中添加氨基-叠氮化物(105mg，1.2mmol)于二噁烷(5mL)和吡啶(1mL)中的溶液。将该溶液搅拌过夜。将该混合物在乙酸乙酯和500mM柠檬酸之间分配。保留乙酸乙酯层并将将水层用乙酸乙酯萃取另外三次。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩为油。将油进一步通过快速色谱法纯化。
将分离的Boc-保护的氨基酸吸收于乙腈(15mL)中并用二噁烷中的HCl(4M，5mL)处理。将该混合物搅拌两小时，并在真空下浓缩。
可替代地制备(2S)-2-氨基-6-[[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基]己酸，式VI.1.
步骤1：在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-羟基正亮氨酸(50mg，1eq)和DMF(1mL)。向其中添加2-氯乙基异氰酸酯(17.3mg，1.0eq)和吡啶(32.3uL，2eq)。将该小瓶加盖并允许搅拌5h。将该溶液转移到萃取漏斗，用乙酸乙酯和100mM柠檬酸稀释。摇动该混合物并分离各层。将水层用乙酸乙酯萃取另外两次。将有机层合并，用5％氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。将该产物通过质谱法鉴别并且直接向前用于下一步骤。
步骤2：在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置来自以上的粗的氯衍生物和DMSO(1mL)。将叠氮化钠(130mg，5eq)和吡啶(32.3uL，2eq)添加到该混合物中并将该小瓶加盖。将该混合物在60℃下搅拌过夜。将该混合物转移到萃取漏斗并用100mM柠檬酸和乙酸乙酯稀释。摇动该混合物并分离各层。将水层用乙酸乙酯萃取另外两次。将有机层合并，用5％氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。将该产物转到下一步骤。
最终步骤：在20mL小瓶中放置粗的Boc保护的氨基酸和乙腈(2mL)。向其中添加盐酸于二噁烷中的溶液(4N，2.5mL)。将该溶液搅拌2h，并且然后在减压下浓缩。将该混合物冻干为半固体并用在翻译测试中。分析MS：m/z(ES+)预期259.1(M+H)+，观察到260.2。
制备(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}己酸(式VI.2)
在50mL圆底烧瓶中放置于二噁烷(10mL)中的N-Boc-正亮氨酸对硝基苯基碳酸酯(337mg，0.8mmoL)。向其中添加氨基-叠氮化物(135mg，2.4mmol)于二噁烷(5mL)中的溶液。将该溶液搅拌过夜。将该混合物在乙酸乙酯和500mM柠檬酸之间分配。保留乙酸乙酯层并将将水层用乙酸乙酯萃取另外三次。合并有机层，用硫酸钠干燥并浓缩为油。将油进一步通过快速色谱法纯化。
将分离的Boc-保护的氨基酸吸收于乙腈(15mL)中并用二噁烷中的HCl(4M，5mL)处理。将该混合物搅拌两小时，并在真空下浓缩。
制备(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-烯-1-基)氨基甲酰基]氨基}己酸，式VI.3。
在具有磁力搅拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-羟基正亮氨酸(50mg，1eq)和DMF(1.5mL)。向其中添加烯丙基异氰酸酯(18.0uL，1.0eq)和吡啶(32.3uL，2eq)。将该小瓶加盖并允许搅拌4h。将该溶液转移到萃取漏斗中，用乙酸乙酯和100mM柠檬酸稀释。摇动该混合物并分离各层。将水层用乙酸乙酯萃取另外两次。将有机层合并，用5％氯化锂洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。将该产物通过质谱法鉴别并且直接向前用于下一步骤。
在20mL小瓶中放置粗的于乙腈(2mL)中的羟基亮氨酸–烯丙基氨基甲酸酯衍生物。向其中添加盐酸于二噁烷中的溶液(4N，2.5mL)。将该溶液搅拌2h，并且然后在减压下浓缩。将该混合物冻干为半固体并用在翻译测试中。将该产物通过质谱法确认。用离子交换色谱法(DOWEX-50)进行另外的纯化。分析MS：m/z(ES+)预期230.1(M+H)+，观察到231.2。
实例2.用GFP测定进行的作为nnAA的新的吡咯赖氨酸类似物的翻译测试。
开展基于细胞的体外测定以通过nnAA整合到靶蛋白质的效率评估pylRS/tRNA对和本发明的吡咯赖氨酸类似物(nnAA)的兼容性。为此，使用标准转染方案，将稳定表达pylRS(3H7)的HEK293细胞用质粒瞬时转染用于表达tRNApyl和编码GFPY40(包含琥珀密码子，代替氨基酸残基编号40处的酪氨酸(其中1是起始子蛋氨酸))的报告子构建体。将经转染的细胞与2mM的nnAA孵育2-3天，通过在显微镜下目视检查定性分析GFP产生。通过流式细胞术使用Accuri流式细胞仪量化GFP荧光并确定荧光细胞的几何平均数。
使用该基于细胞的测定以确定是否不同的nnAA针对pylRS是适合的底物并允许其翻译为靶蛋白质。在nnAA的存在下孵育表达PylRS/tRNApyl对并包含编码GFPY40报告基因的载体的细胞。容易被PylRS/tRNApyl对利用的nnAA支持将nnAA翻译到GFP的琥珀位点并允许产生全长GFP(荧光蛋白质)的基因的通读。这些细胞的荧光强度依赖于nnAA掺入的效率。因此，可利用性差的nnAA产生弱荧光或不发出发荧光的细胞。显微镜观察鉴别多个可被pylRS使用的nnAA(表1，阳性GFP)。此外，将在每个样品中的相对表达水平与已知可被pylRS有效利用的底物产生的那些相比。式V.1(MFI＝931,289)，式V.2(MFI＝1,676,250)和式V.3(MFI＝2,250,000)(参见表1)以几何平均数支持高水平的GFP表达。
诸位发明人发现，本发明的类似物式VI.1和VI.3在所使用的实验条件下被掺入到GFP报告基因中并且产生绿细胞。其中，具有式VI.1的类似物支持高水平的GFP表达(MFI904206)并表示在所测试的实验条件下被pylRS/tRNA对高效利用的类似物(参见表2)。
表1：式V类似物GFP结果
表2：式VI类似物GFP结果
抗-Her2抗体的构建和表达
在哺乳动物细胞中表达包含两个非天然氨基酸(每个重链中一个)(4D5-2AZ ab)的全长抗-Her2抗体。将包含叠氮化物部分的nnAA在所选择的位点掺入并且通过亲和色谱法使用蛋白质A树脂(GE Healthcare)或通过IgSelect(通用医疗公司(GE Healthcare)，17096901)纯化。然后将经纯化的材料浓缩并经受共轭反应。
通过将小鼠抗体4D5的重链和轻链两者的可变区克隆到包含编码人类IgG的基因的载体中产生针对Her2/neu的胞外结构域的抗体。通过基因合成使用重叠寡聚物产生4D5的可变区并将其克隆到由pFUSE-CHIg-hG1(IgG1重链；γ)和pFUSE-CHLIg-hK(轻链；κ；Invivogen公司)编码的人类IgG1框架中，以产生小鼠-人类杂交体。通过位点定向诱变将琥珀密码子引入到位置K274处的重链(γ)中。通过DNA测序鉴别包含该琥珀密码子的克隆。为了产生整合构建体，将针对该重链的启动子和ORF通过PCR扩增，并通过限制酶消化并连接到pOptivec(生命技术公司(Life Technologies))中而克隆。将该轻链和tRNA的单拷贝通过两步骤PCR方法使用重叠寡聚物进行连接，并克隆到可用位点到包含该重链的pOptivec质粒中。然后将该构建体转染到CHO细胞系中，该CHO细胞系包含pylRS/tRNA对和稳定转染的细胞系，该稳定转染的细胞系显示所选择的IgG的高表达。这表示稳定表达包含nnAA的mAb的细胞系的第二个实例，表明该方法对于用在mAb的表达中具有广泛应用性。利用此细胞系来产生包含上述nnAA的IgG。使这些细胞在Excel DHFR-培养基(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中生长到1-2x 106个细胞/mL的密度并向培养物中添加nnAA到1mM的最终浓度。将细胞孵育5天并从生长培养基中纯化IgG。收获上清液并使其经受离心以收集悬浮的细胞和其他碎片。然后将上清液通过0.22um过滤器过滤，以在施加到色谱柱之前去除任何颗粒材料。以1-5mL/min流速使用AKTA色谱法系统，将经过滤的上清液施加到1mL-5mL预包装的HiTrap蛋白质A琼脂糖凝胶。将结合的材料和树脂用PBS洗涤以去除松弛结合的蛋白质，并将该结合材料用100mM甘氨酸(pH 3.0)以1mL/min的流速洗脱。将包含靶蛋白质的峰级分用0.1体积分数的1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。在4℃，将所有构建体透析到PBS持续16小时进入最终的磷酸盐缓冲液中。式VI.1作为nnAA在位置274处被掺入到其重链中的抗体被称为“4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸”。
4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸的PEG化
在200uL PCR管中放置磷酸盐缓冲液(5uL，500mM，pH＝7.4)。添加4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸(式VI.1)的溶液(10uL，0.55mg/mL)，随后添加20KPEG环辛炔的溶液(3.3，60mg/mL)。将该溶液在漩涡器上大力混合。允许该混合物静置过夜。将该混合物稀释到200uL并施加到蛋白质-A磁珠。将该混合物涡旋并允许旋转以将这些珠混合90min。固定这些珠并处置贯穿的材料。将这些珠用PBS(2X)洗涤并且然后悬浮于还原凝胶缓冲液中。涡旋并且然后加热到95C持续3min。将该悬浮液直接装载到SDS-PAGE凝胶上。SDS-PAGE凝胶的考马斯(Commassie)染色表明该重链的选择性PEG化(图1，泳道3)。
4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸与荧光素染料通过SPAAC的共轭。
在200uL PCR管中放置磷酸盐缓冲液(65uL，50mM，pH＝7.4)。添加4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-6-{[(2-叠氮基乙基)氨基甲酰基]氧基}己酸的溶液(30uL，0.55mg/mL)，随后添加溶液DMCO-Fluor 488环辛炔(5.4，5mM在DMSO中，点击化学工具)。将该溶液在漩涡机上大力混合。允许该混合物静置24h。将该混合物通过HIC色谱法(Tosoh TSK凝胶丁基NPR(Tosoh TSKgel Butyl NPR)，以1M硫酸钠至磷酸盐缓冲液的梯度)进行分析，显示已经发生了共轭并且得到了混合物，其中共轭已经在一个或两个位点处发生(通常称为DAR1和DAR2种类；其中DAR被定义为药物-对-抗体比率)(图2)。
序列表
SEQ ID NO 1
PylRS马氏甲烷八叠球菌WT核苷酸序列
ATGGATAAAAAACCACTAAACACTCTGATATCTGCAACCGGGCTCTGGATGTCCAGGACCGGAACAATTC
ATAAAATAAAACACCACGAAGTCTCTCGAAGCAAAATCTATATTGAAATGGCATGCGGAGACCACCTTGT
TGTAAACAACTCCAGGAGCAGCAGGACTGCAAGAGCGCTCAGGCACCACAAATACAGGAAGACCTGCAAA
CGCTGCAGGGTTTCGGATGAGGATCTCAATAAGTTCCTCACAAAGGCAAACGAAGACCAGACAAGCGTAA
AAGTCAAGGTCGTTTCTGCCCCTACCAGAACGAAAAAGGCAATGCCAAAATCCGTTGCGAGAGCCCCGAA
ACCTCTTGAGAATACAGAAGCGGCACAGGCTCAACCTTCTGGATCTAAATTTTCACCTGCGATACCGGTT
TCCACCCAAGAGTCAGTTTCTGTCCCGGCATCTGTTTCAACATCAATATCAAGCATTTCTACAGGAGCAA
CTGCATCCGCACTGGTAAAAGGGAATACGAACCCCATTACATCCATGTCTGCCCCTGTTCAGGCAAGTGC
CCCCGCACTTACGAAGAGCCAGACTGACAGGCTTGAAGTCCTGTTAAACCCAAAAGATGAGATTTCCCTG
AATTCCGGCAAGCCTTTCAGGGAGCTTGAGTCCGAATTGCTCTCTCGCAGAAAAAAAGACCTGCAGCAGA
TCTACGCGGAAGAAAGGGAGAATTATCTGGGGAAACTCGAGCGTGAAATTACCAGGTTCTTTGTGGACAG
GGGTTTTCTGGAAATAAAATCCCCGATCCTGATCCCTCTTGAGTATATCGAAAGGATGGGCATTGATAAT
GATACCGAACTTTCAAAACAGATCTTCAGGGTTGACAAGAACTTCTGCCTGAGACCCATGCTTGCTCCAA
ACCTTTACAACTACCTGCGCAAGCTTGACAGGGCCCTGCCTGATCCAATAAAAATTTTTGAAATAGGCCC
ATGCTACAGAAAAGAGTCCGACGGCAAAGAACACCTCGAAGAGTTTACCATGCTGAACTTCTGCCAGATG
GGATCGGGATGCACACGGGAAAATCTTGAAAGCATAATTACGGACTTCCTGAACCACCTGGGAATTGATT
TCAAGATCGTAGGCGATTCCTGCATGGTCTATGGGGATACCCTTGATGTAATGCACGGAGACCTGGAACT
TTCCTCTGCAGTAGTCGGACCCATACCGCTTGACCGGGAATGGGGTATTGATAAACCCTGGATAGGGGCA
GGTTTCGGGCTCGAACGCCTTCTAAAGGTTAAACACGACTTTAAAAATATCAAGAGAGCTGCAAGGTCCG
AGTCTTACTATAACGGGATTTCTACCAACCTGTAA
SEQ ID NO 2
PylRS，马氏甲烷八叠球菌WT氨基酸序列
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCK
RCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPV
STQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISL
NSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDN
DTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQM
GSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
SEQ ID NO 3
PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体核苷酸序列
ATGGATAAAAAACCACTAAACACTCTGATATCTGCAACCGGGCTCTGGATGTCCAGGACCGGAACAATTC
ATAAAATAAAACACCACGAAGTCTCTCGAAGCAAAATCTATATTGAAATGGCATGCGGAGACCACCTTGT
TGTAAACAACTCCAGGAGCAGCAGGACTGCAAGAGCGCTCAGGCACCACAAATACAGGAAGACCTGCAAA
CGCTGCAGGGTTTCGGATGAGGATCTCAATAAGTTCCTCACAAAGGCAAACGAAGACCAGACAAGCGTAA
AAGTCAAGGTCGTTTCTGCCCCTACCAGAACGAAAAAGGCAATGCCAAAATCCGTTGCGAGAGCCCCGAA
ACCTCTTGAGAATACAGAAGCGGCACAGGCTCAACCTTCTGGATCTAAATTTTCACCTGCGATACCGGTT
TCCACCCAAGAGTCAGTTTCTGTCCCGGCATCTGTTTCAACATCAATATCAAGCATTTCTACAGGAGCAA
CTGCATCCGCACTGGTAAAAGGGAATACGAACCCCATTACATCCATGTCTGCCCCTGTTCAGGCAAGTGC
CCCCGCACTTACGAAGAGCCAGACTGACAGGCTTGAAGTCCTGTTAAACCCAAAAGATGAGATTTCCCTG
AATTCCGGCAAGCCTTTCAGGGAGCTTGAGTCCGAATTGCTCTCTCGCAGAAAAAAAGACCTGCAGCAGA
TCTACGCGGAAGAAAGGGAGAATTATCTGGGGAAACTCGAGCGTGAAATTACCAGGTTCTTTGTGGACAG
GGGTTTTCTGGAAATAAAATCCCCGATCCTGATCCCTCTTGAGTATATCGAAAGGATGGGCATTGATAAT
GATACCGAACTTTCAAAACAGATCTTCAGGGTTGACAAGAACTTCTGCCTGAGACCCATGCTTGCTCCAA
ACCTTTACAACTACCTGCGCAAGCTTGACAGGGCCCTGCCTGATCCAATAAAAATTTTTGAAATAGGCCC
ATGCTACAGAAAAGAGTCCGACGGCAAAGAACACCTCGAAGAGTTTACCATGCTGAACTTCTGCCAGATG
GGATCGGGATGCACACGGGAAAATCTTGAAAGCATAATTACGGACTTCCTGAACCACCTGGGAATTGATT
TCAAGATCGTAGGCGATTCCTGCATGGTCTTTGGGGATACCCTTGATGTAATGCACGGAGACCTGGAACT
TTCCTCTGCAGTAGTCGGACCCATACCGCTTGACCGGGAATGGGGTATTGATAAACCCTGGATAGGGGCA
GGTTTCGGGCTCGAACGCCTTCTAAAGGTTAAACACGACTTTAAAAATATCAAGAGAGCTGCAAGGTCCG
AGTCTTACTATAACGGGATTTCTACCAACCTGTAA
SEQ ID NO 4
PylRS马氏甲烷八叠球菌Y384F突变体氨基酸序列
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCK
RCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPV
STQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISL
NSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDN
DTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQM
GSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVFGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
SEQ ID NO 5
tRNApyl马氏甲烷八叠球菌Go1
GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCA
SEQ ID NO 6
U6snRNA启动子
Agagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc
SEQ ID NO 7
U6-tRNApyl构建体
Aaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgaattctctagactcgagggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggtttttgttt
SEQ ID NO 8
GFP核苷酸序列
ATGGCCTCCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGTCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATCAGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAA
SEQ ID NO 9
GFP氨基酸序列
MASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDQAKPLSQEESTLIERATATINSIPISEDYSVASAALSSDGRIFTGVNVYHFTGGPCAELVVLGTAAAAAAGNLTCIVAIGNENRGILSPCGRCRQVLLDLHPGIKAIVKDSDGQPTAVGIRELLPSGYVWEG
SEQ ID NO 10
GFPY40核苷酸序列
ATGGCCTCCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATAGGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGTCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATCAGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGCCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCCATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAA
SEQ ID NO 11
GFPY40氨基酸序列
MASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDAT*GKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDQAKPLSQEESTLIERATATINSIPISEDYSVASAALSSDGRIFTGVNVYHFTGGPCAELVVLGTAAAAAAGNLTCIVAIGNENRGILSPCGRCRQVLLDLHPGIKAIVKDSDGQPTAVGIRELLPSGYVWEG
SEQ ID NO 12
抗-Her2(4D5)γ核苷酸序列
ATGGAGGCTCCCGCCCAGCTGCTCTTTCTGCTCCTTCTCTGGCTTCCCGACACAACCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTACAGCCGGGCGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCCGCTTCCGGATTCAACATCAAAGACACGTATATTCACTGGGTCCGTCAGGCACCTGGCAAGGGTCTGGAGTGGGTGAGCCGCATTTATCCTACCAATGGTTACACTCGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCGCCGACACGTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTGTATTACTGCAGCCGCTGGGGCGGTGATGGCTTTTACGCGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO 13
抗-Her2(4D5)γ氨基酸序列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 14
抗-Her2(4D5)γ_K274琥珀核苷酸序列
ATGGAGGCTCCCGCCCAGCTGCTCTTTCTGCTCCTTCTCTGGCTTCCCGACACAACCGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCTTGGTACAGCCGGGCGGGTCCCTGCGCCTCTCCTGTGCCGCTTCCGGATTCAACATCAAAGACACGTATATTCACTGGGTCCGTCAGGCACCTGGCAAGGGTCTGGAGTGGGTGAGCCGCATTTATCCTACCAATGGTTACACTCGCTACGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCGCCGACACGTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTGTATTACTGCAGCCGCTGGGGCGGTGATGGCTTTTACGCGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCTAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO 15
抗-Her2(4D5)γ_K274琥珀氨基酸序列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV*FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 16
抗-Her2(4D5)κ核苷酸序列
ATGGAGGCTCCCGCCCAGCTGCTCTTTCTGCTCCTTCTCTGGCTTCCCGACACAACCGGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACCGTGTCACAATCACTTGCCGTGCTAGCCAGGATGTGAATACAGCGGTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGCAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTTTTTGTACAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTCAGCGGCAGCCGTTCTGGTACCGATTTCACTCTCACCATCAGCTCTCTGCAACCGGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCACTACACCACTCCTCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCGAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
SEQ ID NO 17
抗-Her2(4D5)κ氨基酸序列
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIERTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
参考文献
费克内尔(Fekner)，T.，李(Li)，X.，&陈(Chan)，M.K.(2010)，用于翻译掺入到蛋白质中的吡咯赖氨酸类似物(Pyrrolysine Analogs for Translational Incorporationinto Proteins)，欧洲有机化学杂志(European Jouranal of Organic Chemistry)，4171-4179。
卡佛兰，J.M.，冈斗拉帕里(Gundllapalli)，S.，O'多诺霍(Donoghue)，P.，恩格勒特(Englert)，M.，索尔(Soll)，D.，&施特尔兹(Steltz)，T.A.(2007)，吡咯赖氨酰(pyrrolysyl)-tRNA合成酶——用于遗传密码创新的古细菌酶的结构(Structure ofpyrrolysyl-tRNA synthetase,an archaeal enzyme for genetic code innovation)，美国国家科学院院刊(Proceedings National Academy of Sciences)，104(27)，11268-11273。
小林(Kobayashi)，T.，柳泽，T.，坂本(Sakamoto)，K.，&横山(Yokoyama)，S.(2009)，吡咯赖氨酰-tRNA合成酶对非-a-氨基底物的识别(吡咯赖氨酰)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1352-1360)，385。
刘(Liu)，昌(Chang)C，和彼得G舒尔茨(Peter G Schultz)，“向遗传代码中添加新的化学反应(Adding New Chemistries to the Genetic Code)”，生物化学年鉴(AnnualReview of Biochemistry)，2010:413-444。
陈(Chan)，迈克尔(Michael)K，托马斯费克内尔(Tomasz Fekner)，李鑫(Xin Li)，玛丽安·李(Marianne Lee)，和詹妮弗J奥特森(Jennifer J Ottesen)，国际专利WO 2011/044255A1，2011。
阮，D.P.，鲁斯科(Lusic)，H.，诺伊曼(Neumann)，H.K.，戴特斯(Deiters)，A.，&金(Chin)，J.W.(2009)，通过吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/tRNAcua对和点击化学对重组蛋白质中的脂肪族叠氮化物和炔烃进行基因编码和标记(Genetic Encoding and Labeling ofAliphatic Azides and Alkynes in Recombinant Proteins via a Pyrrolysyl-tRNASynthetase/tRNAcua Pair and Click Chemistry)，美国化学会志(Journal of theAmerican Chemistry Society)，8720-8721。
柳泽，T.，石井(Ishii)，R.，福永(Fukunaga)，R.，小林，T.，坂本，K.，&横山，S.(2008)，吡咯赖氨酰-tRNA合成酶中活性位点环的多个构象状态的晶体研究(Crystallographic Studies on Multiple Conformational States of Active-siteloops in Pyrrolysyl-tRNA synthetase)，分子生物学杂志，378，634-652。
柳泽，T.，石井，R.，福永，R.，小林，T.，坂本，K.，&横山，S.(2008)，吡咯赖氨酰-tRNA合成酶遗传编码Ne-(o-叠氮基苄氧基羰基)赖氨酸用于位点特异性蛋白质修饰的多步骤工程化(Multistep Engineering of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase to GeneticallyEncode Ne-(o-Azidobenzyloxycarbonyl)lysine for Site Specific ProteinModification)，化学和生物学(Chemistry and Biology)，15，1187-1197。
柳泽，T.，苏迈达(Sumida)，T.，石井，R.，&横山，S.(2013)，新晶体形式的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶揭示氨酰基-tRNA合成前和后腺苷酸盐和氨酰基部分和催化位点处的天冬酰胺残基的构象状态(A novel crystal fom of pyrrolysyl-tRNA synthetase revealsthe pre-and post-aminoacyl-tRNA synthesis conformational states of theadenylate and aminoacyl moieties and an asparagine residue in the catalyticsite)，结晶学报·D部(Acta Crystallographica Section D)，D69，5-15。
在此提及的所有专利以及专利申请均通过引用以其全文结合。

Claims (13)

1.一种具有式VI的吡咯赖氨酸类似物：
式VI
其中
Z＝NH；
FG＝–N3,-CH＝CH2或-C≡CH；并且
b＝1-4的整数。
2.根据权利要求1所述的具有式VI的吡咯赖氨酸类似物，其中b是1或2。
3.根据权利要求1所述的吡咯赖氨酸类似物，该吡咯赖氨酸类似物选自：
式VI.1，
式VI.2，
和
式VI.3，
4.一种突变体蛋白质，该突变体蛋白质包含一个或多个根据权利要求1至3中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物作为非天然氨基酸。
5.根据权利要求4所述的突变体蛋白质，该突变体蛋白质包含一个根据权利要求1至3中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物作为非天然氨基酸。
6.一种抗体，该抗体在每个重链和/或轻链中包含一个或多个根据权利要求1至3中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物作为非天然氨基酸。
7.根据权利要求4或5所述的突变体蛋白质或权利要求6所述的抗体，该突变体蛋白质或抗体通过该一个或多个非天然氨基酸共轭至选自以下各项中的一个或多个部分：蛋白质、细胞毒素剂、药物和聚合物。
8.根据权利要求7所述的突变体蛋白质或抗体，其共轭至PEG部分。
9.根据权利要求7所述的突变体蛋白质或抗体，其共轭至抗体部分。
10.根据权利要求7所述的突变体蛋白质或抗体，其共轭至细胞毒素剂部分。
11.根据权利要求7所述的突变体蛋白质或抗体，其共轭至药物部分。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的吡咯赖氨酸类似物在制造包含一个或多个非天然氨基酸的突变体蛋白质中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中该蛋白质是抗体。
CN201380060971.9A 2012-09-24 2013-09-24 氨基酸衍生物 Expired - Fee Related CN104812734B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261705116P 2012-09-24 2012-09-24
US61/705,116 2012-09-24
US201361862495P 2013-08-05 2013-08-05
US61/862,495 2013-08-05
PCT/EP2013/069888 WO2014044873A1 (en) 2012-09-24 2013-09-24 Amino acid derivatives

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104812734A CN104812734A (zh) 2015-07-29
CN104812734B true CN104812734B (zh) 2017-08-22

Family

ID=49237211

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380060916.XA Active CN105026574B (zh) 2012-09-24 2013-09-24 细胞系
CN201380060971.9A Expired - Fee Related CN104812734B (zh) 2012-09-24 2013-09-24 氨基酸衍生物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380060916.XA Active CN105026574B (zh) 2012-09-24 2013-09-24 细胞系

Country Status (11)

Country Link
US (4) US9732367B2 (zh)
EP (2) EP2898085B1 (zh)
JP (2) JP6532404B2 (zh)
KR (1) KR102155389B1 (zh)
CN (2) CN105026574B (zh)
AU (1) AU2013320184B2 (zh)
BR (1) BR112015006368B1 (zh)
CA (1) CA2885796C (zh)
HK (2) HK1211569A1 (zh)
SG (2) SG11201502216UA (zh)
WO (2) WO2014044873A1 (zh)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088381A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
WO2013171485A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Medical Research Council Methods of incorporating an amino acid comprising a bcn group into a polypeptide using an orthogonal codon encoding it and an orthorgonal pylrs synthase.
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
CN105026574B (zh) 2012-09-24 2019-08-30 米迪缪尼有限公司 细胞系
CN110724707A (zh) 2013-03-15 2020-01-24 米迪缪尼有限公司 新型核酸分子
ES2658039T3 (es) * 2013-07-10 2018-03-08 Sutro Biopharma, Inc. Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
CN105980350B (zh) 2013-08-05 2018-11-27 米迪缪尼有限公司 氨基酸衍生物
EP3079668A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
GB2528227A (en) * 2014-03-14 2016-01-20 Medical Res Council Cyclopropene amino acids and methods
US10920208B2 (en) 2014-10-22 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
CN106146663B (zh) * 2015-04-10 2019-11-08 北京大学 非天然氨基酸标记的新型抗体-药物偶联物及其制备
US11299729B2 (en) 2015-04-17 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
WO2017015545A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
US11524983B2 (en) 2015-07-23 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Evolution of Bt toxins
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
WO2017030156A1 (ja) * 2015-08-19 2017-02-23 国立研究開発法人理化学研究所 非天然アミノ酸導入抗体
CN106929482A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 北京大学 定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用
KR20180104106A (ko) 2016-01-27 2018-09-19 서트로 바이오파마, 인크. anti-CD74 항체 접합체, anti-CD74 항체 접합체를 포함하는 조성물 및 anti-CD74 항체 접합체의 이용 방법
CN112725282A (zh) * 2016-01-27 2021-04-30 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
CN105524167A (zh) * 2016-01-30 2016-04-27 深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司 抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法
CN105647918A (zh) * 2016-02-20 2016-06-08 深圳市圣必智科技开发有限公司 抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法
MA45408A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Magenta Therapeutics Inc Compositions et procédés pour la déplétion des cellules cd117+
WO2018045376A2 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Ikaria Inc. Functionally modified polypeptides and radiobiosynthesis
KR102013742B1 (ko) * 2016-09-05 2019-11-04 한국과학기술원 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스, 이의 제조방법 및 그 용도
WO2018044143A1 (ko) * 2016-09-05 2018-03-08 한국과학기술원 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스, 이의 제조방법 및 그 용도
JP2020502238A (ja) * 2016-12-23 2020-01-23 バイスクルアールディー・リミテッド 新規連結構造を有するペプチド誘導体
US10576161B2 (en) 2017-01-20 2020-03-03 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of CD137+ cells
WO2019010164A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 President And Fellows Of Harvard College EVOLUTION OF ARNT SYNTHÉTASES
US11624130B2 (en) 2017-09-18 2023-04-11 President And Fellows Of Harvard College Continuous evolution for stabilized proteins
AU2018394189B2 (en) 2017-12-27 2023-12-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. IL-2 variant
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
CN110835633B (zh) * 2018-08-13 2021-10-01 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用
EP3847271A4 (en) * 2018-09-07 2022-10-12 MedImmune, LLC CELL SELECTION METHODS
CN109553643B (zh) * 2018-11-29 2020-09-22 深圳先进技术研究院 单糖类似物及包含其的分子探针和该分子探针的应用
CN111850020B (zh) * 2019-04-25 2021-05-07 苏州鲲鹏生物技术有限公司 利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸
CN111909256A (zh) 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法
AU2022262365A1 (en) * 2021-04-21 2023-11-09 Asimov Inc. Stable production systems for adeno-associated virus production
WO2022232377A2 (en) * 2021-04-28 2022-11-03 The Regents Of The University Of California Bioreactive proteins containing unnatural amino acids
CA3222899A1 (en) * 2021-07-29 2023-02-02 Jinwei Yang Unnatural amino acid, and use thereof, recombinant protein containing same, and recombinant protein conjugate
EP4130254A1 (en) * 2021-08-03 2023-02-08 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Eukaryotic cell lysates comprising exogenous enzymes and methods for preparing the same
CN113698468B (zh) * 2021-09-01 2022-10-11 浙江新码生物医药有限公司 人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其应用
CN113788890B (zh) * 2021-09-01 2022-11-08 浙江新码生物医药有限公司 一种人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其应用
WO2023164676A1 (en) * 2022-02-27 2023-08-31 The Regents Of The University Of California Methods to generate novel acyl-trna species

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041752A2 (en) * 2002-11-04 2004-05-21 University Of Massachusetts Chemical encoding technology for combinatorial synthesis
EP1911840A1 (en) * 2005-08-02 2008-04-16 Riken tRNA SYNTHESIS METHOD, NUCLEIC ACID, AMINOACYL tRNA SYNTHESIS METHOD, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING NON-NATURAL AMINO ACID INTEGRATED THEREIN
WO2011044255A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 The Ohio State University Pyrrolysine analogs
CN102666578A (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3711458A (en) 1969-08-21 1973-01-16 Research Corp Substituted and unsubstituted vinyloxycarbonyl groups as amino protecting groups in the syntheses of peptides
US4512979A (en) 1981-03-23 1985-04-23 Merck & Co., Inc. Dipeptides containing thialysine and related amino acids as antihypertensives
JPH0710451B2 (ja) 1986-11-25 1995-02-08 三五重機株式会社 鋼板カツタ−
HU207287B (en) 1989-01-17 1993-03-29 Biosignal Kutato Fejlesztoe Kf Polyene fatty acid derivatives of tyrozine-quinaze inhibiting activity and pharmaceutical composition containing them as active component
US5180674A (en) 1990-04-16 1993-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
JP2005502322A (ja) 2001-04-19 2005-01-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 非天然アミノ酸のインビボ組込み
NZ532027A (en) 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
ATE445709T1 (de) 2002-10-16 2009-10-15 Scripps Research Inst Glycoproteinsynthese
CN101223272B (zh) * 2003-04-17 2013-04-03 斯克利普斯研究院 扩展真核生物遗传密码
ES2545533T3 (es) 2004-11-01 2015-09-11 The Regents Of The University Of California Composiciones y métodos para modificación de biomoléculas
JP5196378B2 (ja) 2006-02-22 2013-05-15 独立行政法人理化学研究所 サプレッサーｔＲＮＡの合成方法、ＤＮＡ構築物及びそれを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造
EP2395099A3 (en) 2006-05-02 2012-05-16 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
KR20090094812A (ko) * 2006-10-18 2009-09-08 더 스크립스 리서치 인스티튜트 포유동물 세포에서 비천연 아미노산의 단백질 내로의 유전적 도입
CN101952428B (zh) 2007-09-20 2013-10-23 独立行政法人理化学研究所 突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶以及使用该酶的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法
US8584447B2 (en) 2008-07-18 2013-11-19 Alantum Corporation Filter device for filtering automobile exhaust gas
EP2376647B1 (en) 2009-01-12 2014-03-05 Sutro Biopharma, Inc. Mono charging system for selectively introducing non-native amino acids into proteins using an in vitro protein synthesis system
WO2010083148A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Sutro Biopharma, Inc. Use of dna gyrase inhibitors for in vitro polypeptide synthesis reactions
WO2010114615A2 (en) 2009-04-03 2010-10-07 The Scripps Research Institute A facile system for encoding unnatural amino acids in mammalian cells
GB2470770A (en) * 2009-06-04 2010-12-08 Medical Res Council Incorporation of unnatural amino acids having an orthogonal functional group into polypeptides using orthogonal tRNA/tRNA synthetase pairs
MX349301B (es) * 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
CN103153927B (zh) 2010-04-27 2017-02-15 西纳福克斯股份有限公司 稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用
JP6173911B2 (ja) * 2010-09-10 2017-08-09 メディミューン リミテド 抗体誘導体
DE102010041261A1 (de) * 2010-09-23 2012-03-29 Robert Bosch Gmbh Flip-Chip Anordnung mit einem Kühlelement und Verfahren zur Herstellung einer Flip-Chip Anordnung
WO2012038706A1 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Medical Research Council Methods for incorporating unnatural amino acids in eukaryotic cells
ES2661095T3 (es) * 2011-02-03 2018-03-27 European Molecular Biology Laboratory Aminoácidos no naturales que comprenden un grupo análogo de ciclooctinilo o trans-ciclooctenilo y usos de los mismos
ES2907763T3 (es) 2012-08-31 2022-04-26 Sutro Biopharma Inc Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido
CN105026574B (zh) 2012-09-24 2019-08-30 米迪缪尼有限公司 细胞系
CN110724707A (zh) 2013-03-15 2020-01-24 米迪缪尼有限公司 新型核酸分子

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041752A2 (en) * 2002-11-04 2004-05-21 University Of Massachusetts Chemical encoding technology for combinatorial synthesis
EP1911840A1 (en) * 2005-08-02 2008-04-16 Riken tRNA SYNTHESIS METHOD, NUCLEIC ACID, AMINOACYL tRNA SYNTHESIS METHOD, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING NON-NATURAL AMINO ACID INTEGRATED THEREIN
WO2011044255A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 The Ohio State University Pyrrolysine analogs
CN102666578A (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Design, Synthesis, and Antitumor Activity of 4-Halocolchicines and Their Pro-drugs Activated by Cathepsin B;Naoko Yasobu等;《Med. Chem. Lett.》;20110304;第2卷;348-352页 *
Optimization of the posttranslational click modification of proteins;Milan VRABEL1等;《Collect. Czech. Chem. Commun.》;20110822;第76卷(第9期);1089-1101页 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112015006368B1 (pt) 2022-02-08
US20170306380A1 (en) 2017-10-26
JP6532404B2 (ja) 2019-06-19
CA2885796C (en) 2022-05-03
CN105026574B (zh) 2019-08-30
SG10201702387YA (en) 2017-04-27
US20150259721A1 (en) 2015-09-17
EP2897935B1 (en) 2019-02-27
HK1211569A1 (zh) 2016-05-27
AU2013320184A1 (en) 2015-04-09
KR102155389B1 (ko) 2020-09-11
HK1211623A1 (zh) 2016-05-27
US9670521B2 (en) 2017-06-06
KR20150070186A (ko) 2015-06-24
CA2885796A1 (en) 2014-03-27
US10214761B2 (en) 2019-02-26
EP2898085A1 (en) 2015-07-29
US20170306381A1 (en) 2017-10-26
JP6321658B2 (ja) 2018-05-09
US9732367B2 (en) 2017-08-15
JP2015531789A (ja) 2015-11-05
AU2013320184B2 (en) 2017-10-12
CN104812734A (zh) 2015-07-29
US20150251994A1 (en) 2015-09-10
WO2014044872A1 (en) 2014-03-27
EP2898085B1 (en) 2019-01-23
JP2015530091A (ja) 2015-10-15
WO2014044873A1 (en) 2014-03-27
BR112015006368A2 (zh) 2017-09-05
US10253345B2 (en) 2019-04-09
CN105026574A (zh) 2015-11-04
EP2897935A1 (en) 2015-07-29
SG11201502216UA (en) 2015-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104812734B (zh) 氨基酸衍生物
CN105980350B (zh) 氨基酸衍生物
ES2880336T3 (es) Métodos y productos para la síntesis de proteínas de fusión
Haque et al. Site-selective lysine conjugation methods and applications towards antibody–drug conjugates
CN105683215B (zh) 高稳定性的t细胞受体及其制法和应用
WO2019034177A1 (zh) 具有两种不同药物的抗体药物偶联物
JP2020514403A (ja) Ｍｔ１−ｍｍｐに結合するためのペプチドリガンド
CN108602878B (zh) C端赖氨酸缀合免疫球蛋白
US11753669B2 (en) Lysine conjugated immunoglobulins
WO2014140342A1 (en) Modification of polypeptides
KR20150090081A (ko) 디술피드-함유 단백질로부터 접합체를 제조하는 방법
CN107108717B (zh) 一种可溶且稳定的异质二聚tcr
US20230148277A1 (en) Disulfide bond containing compounds and uses thereof
Dengl et al. Hapten-directed spontaneous disulfide shuffling: a universal technology for site-directed covalent coupling of payloads to antibodies
US20120083599A1 (en) Biomolecular Labelling Using Multifunctional Biotin Analogues
Cui et al. 2-Cyanobenzothiazole (CBT) condensation for site-specific labeling of proteins at the terminal cysteine residues
Taggart et al. Development of an oxazole-based cleavable linker for peptides
Frutos Streamlined Expressed Protein Ligation: Site-Specific Antibody–Drug Conjugate
US20200317723A1 (en) Bioconjugation of Polypeptides
Dennler Microbial Transglutaminase as a Versatile Tool for Site-Specific Protein Modification
Ericson A novel iterative reducible ligation strategy for the synthesis of homogeneous gene delivery polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: MEDIMMUNE VACCINES INC.

Free format text: FORMER OWNER: ALLOZYNE INC.

Effective date: 20150720

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150720

Address after: cambridge

Applicant after: MEDIMMUNE, LLC

Address before: Washington State

Applicant before: Elozina

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170822

Termination date: 20210924