JP6321658B2 - アミノ酸誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、バイオコンジュゲーション法で使用されるアミノ酸誘導体に関する。

ピロリシンは天然アミノ酸であり、アンバーコドンによって固有に識別して指定される唯一のものである。ピロリシンは、他の全てのアミノ酸及びｔＲＮＡと直交するように天然に進化した２１番目のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）を使用する。Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００４は、ＰｙｌＲＳ及びそれに対応するｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｐｙｌ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンバーコドンにピロリシンを組み込み得ることを示した。この著者らはまた、野生型ＰｙｌＲＳが天然では広域性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であり、リシンの類似体を組み込み得ることも示した。

Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ（欧州特許第１９１１８４０号明細書）は、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ系が真核細胞において直交性であることを実証し、細菌細胞においてアンバーコドンによりコードされる標的タンパク質へのいくつかの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）の組込みを示した。この著者らはまた、アミノ酸結合ポケットを形成し、且つ他のカノニカルなアミノ酸と比べてピロリシンを選択する際に機能するｐｙｌＲＳにおける主要なアミノ酸残基も特定した。この部位における突然変異により、ｔＲＮＡｐｙｌの認識及びＡｚＺ−ｌｙｓによるアミノアシル化が可能な突然変異体が生成された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８）。

この直交性は細菌及び真核細胞にまで及ぶ。

ＰｙｌＲＳは、リシンを排除するように天然に進化してきたが、アジド、アルキン及びアルケンを含め、突然変異なしにリシン類似体を組み込み得る天然で広域性の合成酵素である（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。この特異性の基本は、ｐｙｌＲＳ結合ポケットのアミノ酸残基と、アミノ酸を安定させて合成酵素の活性部位に正しく位置付けるピロリシンのピロール環との間の疎水性相互作用に依っている（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このＲＳ／ｔＲＮＡ対が一過性のトランスフェクションによって細菌、酵母及び哺乳類細胞に導入されており、標的タンパク質への複数の非天然アミノ酸の組込みに有効であることが示されている。

例えば、欧州特許第１９１１８４０号明細書は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における標的タンパク質へのＮ−ε−ｂｏｃ−リシンの組込みを実証している。

この数年、天然のＰｙｌＲＳか或いは遺伝的に進化したＰｙｌＲＳにより認識されタンパク質にアンバーコドン部位で組み込まれるアミノ酸誘導体として定義されるピロリシン類似体が開示されており、例えばＦｅｃｋｎｅｒら（Ｆｅｋｎｅｒ，Ｌｉ，＆ Ｃｈａｎ，２０１０）及びＬｉｕらによってレビューされている。官能基又は翻訳後修飾を有する類似体が、ｐｙｌＲＳ−ｔＲＮＡｐｙｌ系を使用してタンパク質に部位特異的に組み込まれている。いくつかの研究は（例えばＹａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌを参照）、類似体を適応させるためＰｙｌＲＳ酵素内の突然変異に着目したもので、ここでは結合ポケットピロリシン内でＮ６置換基が芳香環であった。他の研究、例えばＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ（同様に国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレットにおいても）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ（同様に国際公開第２０１１／０４４２５５号パンフレットにおいても）は、大型のＮ６置換基を有しないピロリシン類似体の同定に着目したもので、その結果、合成が簡単で且つ天然ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対と相互作用し得るより単純な類似体が得られた。さらに、Ｃｈｉｎらは、銅触媒クリックケミストリー（ＣＵＡＡＣ）によるタンパク質標識に用いるのに適した、末端アルキン基及びアジド基を含む２つの類似体を開発した。

欧州特許第１９１１８４０号明細書 国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレット 国際公開第２０１１／０４４２５５号パンフレット

さらなるピロリシン類似体の開発が依然として必要とされている。これまでに作られたピロリシン類似体はリシン骨格から進化したものに限られていたが、本発明者らは、様々なアミノ酸構造から出発して天然ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対によるタンパク質への組込みが成功したピロリシン類似体を作成している。

本発明によれば、本明細書に記載されるとおりの式Ｖ及び式ＶＩＩのピロリシン類似体（アナログ）が提供される。

また、本明細書に記載されるとおりの式Ｖ及び式ＶＩＩの１つ以上の（例えば１つの）ピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む突然変異タンパク質も提供される。

また、各重鎖及び／又は軽鎖に本明細書に記載されるとおりの式Ｖ及び式ＶＩＩの１つ以上の（例えば１つの）ピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む抗体も提供される。

また、タンパク質、細胞傷害剤、薬物及びポリマーから選択される１つ以上の（例えば１つの）部分に１つ以上の（例えば１つの）非天然アミノ酸を介してコンジュゲートした前述のとおりの突然変異タンパク質又は抗体も提供される。

また、１つ以上の非天然アミノ酸を含む突然変異タンパク質、例えば抗体の製造における前述のとおりのピロリシン類似体の使用も提供される。

本発明に記載されるアミノ酸類似体は、タンパク質に（典型的には適切に使用した場合に生物活性の損失なしに）容易に組み込まれる点、及びバイオコンジュゲーションに有用な手段を提供する点で、新規且つ有用であり、調製が簡単であるという利点を有する。

アジド含有モノクローナル抗体のペグ化。レーン１：未処理抗体、レーン２：ピロリシン類似体式Ｖ．１が重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に供された抗体；レーン３：ピロリシン類似体式ＶＩ．１が重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に供された抗体。 重鎖に組み込まれたピロリシン類似体式ＶＩ．１を最初から含む抗体による４Ｄ５−アウリスタチンＦ抗体薬物コンジュゲートのＨＩＣクロマトグラム。

配列表の配列の簡単な説明
配列番号１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型ヌクレオチド配列
配列番号２：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型アミノ酸配列
配列番号３：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、Ｙ３８４Ｆ突然変異ヌクレオチド配列
配列番号４：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、Ｙ３８４Ｆ突然変異アミノ酸配列
配列番号５：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）
配列番号６：Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーター
配列番号７：Ｕ６−ｔＲＮＡｐｙｌコンストラクト
配列番号８：ＧＦＰヌクレオチド配列
配列番号９：ＧＦＰアミノ酸配列
配列番号１０：ＧＦＰＹ４０ヌクレオチド配列
配列番号１１：ＧＦＰＹ４０アミノ酸配列
配列番号１２：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γヌクレオチド配列
配列番号１３：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γアミノ酸配列
配列番号１４：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーヌクレオチド配列
配列番号１５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーアミノ酸配列
配列番号１６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κヌクレオチド配列
配列番号１７：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κアミノ酸配列

発明の詳細な説明
定義
用語「アミド」は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。

用語「カルバメート」は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。

用語「エステル」は−Ｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ結合を指す。

用語「アルキル」は、典型的には１〜６個、例えば１〜４個の炭素原子を含む、且つ直鎖状又は分枝状であってもよい脂肪族の結合又は置換基を指す。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチルが挙げられる。

用語「アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基を指す。

用語「アルケニル」、「アルケン」又は「オレフィン」は、典型的には２〜６個、例えば２〜４個の炭素原子を含む、直鎖状又は分枝状であってもよい、且つ少なくとも１つのＣ＝Ｃ部分を含む点で不飽和の、脂肪族の結合又は置換基を指す。例としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、及び２−メチル−プロペン−２−イルが挙げられる。アルケニル基は、例えばハロゲン（例えばＣｌ）又はエーテル基（例えば−Ｏ−Ｃ_1〜6アルキル）などの１つ以上の（例えば１つの）置換基によって場合により置換されていてもよく、しかしながら置換されていないことが好ましい。

用語「アルキニル」又は「アルキン」は、典型的には２〜６個、例えば２〜４個の炭素原子を含む、直鎖状又は分枝状であってもよい、且つ少なくとも１つのＣ≡Ｃ部分を含む点で不飽和の、脂肪族の結合又は置換基を指す。例としては、−Ｃ≡ＣＨ及び−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₃が挙げられる。アルキニル基は、例えばハロゲン（例えばＣｌ）又はエーテル基（例えば−Ｏ−Ｃ_1〜6アルキル）などの１つ以上の（例えば１つの）置換基によって場合により置換されていてもよく、しかしながら置換されていないことが好ましい。

用語「シクロアルキル」は、典型的には３〜８個の環状炭素原子を含む脂環式不飽和化合物を指す。シクロアルキル基は分枝を含み得る。炭素原子の総数は、典型的には３〜１０であり得る。例示的な基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、３−メチル−シクロプロピル及びシクロヘキシルが挙げられる。

用語「シクロアルケニル」は、典型的には５〜８個の環状炭素原子を含み、且つ少なくとも１つのＣ＝Ｃ部分を含む脂環式化合物を指す。シクロアルケニル基は分枝を含み得る。炭素原子の総数は、典型的には５〜１０であり得る。例示的な基としては、シクロペンテニル、３−メチル−シクロプロペニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。

用語「ヘテロシクリル」は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１つ以上の（例えば１つ、２つ又は３つ、例えば１つ又は２つ、特に１つの）ヘテロ原子が環に含まれるシクロアルキル又はシクロアルケニル部分を指す。例としては、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン及びチオモルホリンが挙げられる。

用語「アリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得る芳香環構造を指す。アリール部分は１個の環（例えばフェニル）又は２個の環（例えばナフチル）を含み得る。アリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される１つ以上の（例えば１つ又は２つ、例えば１つの）置換基によって置換されていてもよい。例示的なアリールはフェニルである。

用語「ヘテロアリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得るヘテロ芳香環構造を指す。ヘテロ芳香環は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１〜４個（より通常は１〜３個、例えば１個又は２個の）ヘテロ原子を含み得る。ヘテロアリール部分は１個の環又は２個の環を含み得る。１個の６員環を含む例示的な基としては、ピリジン及びピリミジンが挙げられる。１個の５員環を含む例示的な基としては、ピロール、フラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、チアジアゾール及びテトラゾールが挙げられる。２個の環を含むヘテロアリール部分は一方又は両方の環にヘテロ原子を含み得る。例としては、キノリン及びイソキノリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される１つ以上の（例えば１つ又は２つ、例えば１つの）置換基によって置換されていてもよい。

用語「芳香族ハロゲン化物」は、少なくとも１個の（例えば１個の）ハロ基、例えばフッ素、塩化物、臭化物又はヨウ素によって置換されている芳香環（典型的にはフェニル）を指す。前記芳香環は、さらなる置換基、例えばアリールで言及した置換基を含み得る。

用語「アジド（ａｚｉｄｅ）」及び「アジド（ａｚｉｄｏ）」は、Ｎ＝Ｎ（＋）＝Ｎ（−）官能基を指す。

用語「シクロアルキン」は、環構造に捕捉された炭素−炭素三重結合を含む環状構成の（典型的には６〜９員、特に８〜９員の）炭素原子を指す。例としては、シクロオクチン及びシクロノニンが挙げられる。さらなる例はベンザインである。シクロアルキン基は分枝を含み得る。炭素原子の総数は、典型的には６〜１２個、例えば６〜１０個であり得る。

用語「ケトン」はＣ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ結合を指す。

用語「ピロリシン類似体」は、天然のＰｙｌＲＳか或いは遺伝的に進化したＰｙｌＲＳにより認識されタンパク質にアンバーコドン部位で組み込まれるアミノ酸誘導体を意味する。

「２０個の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖」という表現は、その一文字記号Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹで知られる２０個の天然アミノ酸に関係する式ＨＯＯＣ−ＣＨＲ−ＮＨ₂のＲ基を指す。Ｌ又はＳのいずれの立体化学も（又はそれらの混合物も）意図され、しかしながらＬ立体化学が好ましい。

本発明はピロリシン類似体を開示する。

本発明のいくつかのピロリシン類似体は、式Ｖ：

［式中
Ｚ＝結合、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂；
ｂは０又は整数１〜７であり；及び
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン］
の構造を有する。

式ＶにおいてＦＧがアリールを表す場合、例は、芳香族ハロゲン化物、例えば４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

部分Ｚ（ＣＨ₂）_bＦＧは、例えば、ＣＯ−アリール、例えばＣＯ−フェニル又は−ＣＯアルキル、例えば−ＣＯＭｅを表し得る。式Ｖの例示的化合物は、以下である：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（３−アジドプロパンアミド）ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（ペンタ−４−エナミド）ヘキサン酸

（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸

（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−プロパンアミド）ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドアセトアミド）ヘキサン酸

本発明の非天然アミノ酸として使用するのに好適な代替的ピロリシン類似体は、式ＶＩ：

［式中
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；及び
ｂ＝整数１〜４］
の構造を有する。

式ＶＩにおいてＦＧがアリールを表す場合、例は、芳香族ハロゲン化物、例えば４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

好適にはＺはＮＨを表す。別の実施形態においてＺはＣＨを表す。

ｂは、例えば１又は２を表し得る。

ＦＧは、例えば、−Ｎ₃、−ＣＨ＝ＣＨ₂、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＯＣＨ₃、ＣＯＯＣＨ₃、ハロゲンによって置換されたフェニル、又はシクロオクチンを表し得る。

式ＶＩの例示的化合物は、以下である：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがアルケンを表す場合、それは好適には−ＣＨ＝ＣＨ₂又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₃、好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ₂を表す。

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがアルキンを表す場合、それは好適には−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₃、好ましくは−Ｃ≡ＣＨを表す。

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがケトンを表す場合、それは好適には−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₃又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−ＣＨ₃、好ましくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₃を表す。

式ＶＩの構造において、ＦＧがケトンを表す場合、それは例えば−Ｃ（＝Ｏ）−アリール、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−フェニルを表し得る。

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがエステルを表す場合、それは好適には−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏアルキル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏメチルを表す。

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧが芳香族ハロゲン化物を表す場合、それは好適には、ハロゲン、特にヨウ素によって置換されたフェニル（例えば４−ヨードフェニル）を表す。

式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがシクロアルキンを表す場合、それは好適にはシクロオクチン、例えばシクロオクタ−４，５−インを表す。

有利には、本発明の式Ｖ及び式ＶＩのｎｎＡＡは、ＧＦＰアッセイにより実証されるとおり良好な組込みを有することが示されている。式ＶＩ．１は組込みアッセイとしてのＧＦＰアッセイで式Ｖ．１と同程度の翻訳能力を有した。式Ｖ及び式ＶＩは両方とも、部位選択的翻訳後修飾に用い得る様々な有用な官能基を組み込むように簡単に修飾される。アルキン及びアルケンが容易に組み込まれる。本明細書に開示されるピロリシン類似体は、様々な方法を用いて作製することができる。反応条件は概して当業者により決定され得る。

式Ｖ類似体は、α−アミノ基がＢｏｃ基、Ｃｂｚ基、ＴＦＡ基、アセチル基又はＦｍｏｃ基などの保護基（「ＰＧ」）で保護されているタイプ１の単一保護ジアミノ基質に、クロロホルメート、活性カルボン酸エステル、イソシアネート、活性炭酸塩又はハロゲン化スルホニルなどの活性カルボニル基を付加することにより容易に調製される（スキーム１を参照）。カップリング生成物３は、所望の官能性を設けるためのアジド求核剤によるハロゲン化物の置換など、さらなる修飾を受け得る。他の場合、中間体３を脱保護してα−アミノ酸マスキング基を取り除くことにより、所望の式Ｖ類似体が得られる。

ヒドロキシルアミノ酸９を、活性カルボニル、例えば、カルボン酸エステル、イソシアネート、酸塩化物、活性炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを含む基質にコンジュゲートすることにより、式ＶＩ類似体を調製した。カップリング生成物１１は、ハロゲン化物又は活性アルコールなどの脱離基の置換によるアジド官能基の導入など、さらなる修飾を受けることができる。最終的な脱保護によってα−アミノ酸マスキング基を取り除くことにより、所望のアミノ酸類似体１２が得られる。保護基はスキーム１のとおり用いられ得る。スキーム２を参照：

タンパク質への非天然アミノ酸の組込み
本明細書に開示されるピロリシン類似体は組換えタンパク質に組み込まれ得る。詳細には、アンバーサプレッションを用いて組換えタンパク質への類似体の部位特異的組込みを達成することができ、ここでは組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列中のピロリシン類似体を挿入しようとする部位にナンセンス（アンバー）コドンが挿入される。この突然変異ヌクレオチド配列が、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコードする１つ以上のプラスミドと共に、無細胞発現系の細胞に挿入される。

宿主細胞は真核細胞株であってもよく、これが前述のとおりのＤＮＡコンストラクトを含むベクターで形質転換される。

或いは、無細胞発現系が提供され、ここでは宿主細胞から得られた合成反応ライセートが、ポリペプチドの合成に必要な少なくとも１つの成分を含む。合成反応ライセートは細菌細胞又は真核細胞から得られる。好ましくは、合成反応ライセートは真核細胞から、より好ましくはウサギ網状赤血球又はコムギ胚芽から得られる。

好ましくは、無細胞発現系は野生型ＰｙｌＲＳ及び本発明のｔＲＮＡｐｙｌの発現能を有し、ここでｔＲＮＡｐｙｌは、合成反応ライセートを得るために使用される細胞に本発明のＤＮＡコンストラクトで導入される。

本発明での使用に好適な無細胞発現系は、例えば、国際公開第２０１００８１１０号パンフレット、国際公開第２０１００８１１１１号パンフレット、国際公開第２０１００８３１４８号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

ピロリシン類似体が細胞又は発現系に加えられると、前記類似体は組換えタンパク質に特定の位置で組み込まれる。ｎｎＡＡ及びｔＲＮＡｐｙｌにｐｙｌＲＳが結合し、続いてｔＲＮＡｐｙｌがｎｎＡＡによってアミノアシル化される。アンバーアンチコドンを含むこのｔＲＮＡｐｙｌがサイトゾルに放出され、そこでアンバー終止コドンに応答してリボソームと相互作用することができ、ｎｎＡＡが放出されて成長ポリペプチド鎖とペプチド結合を形成する。

本発明のピロリシン類似体を組み込むように修飾される組換えタンパク質には、部位特異的翻訳後修飾に適したあらゆる組換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質、例えばサイトカイン、抗体及び抗体誘導体（Ｆａｂ断片、又は一本鎖抗体、例えば単鎖可変断片（ｓｃｆｖ）など）、ペプチド、酵素、融合タンパク質、デコイ受容体、タンパク質ワクチン、タンパク質ホルモン、例えばインスリン、成長因子（例えばヒト成長ホルモン、ｈＧＨ、ｈＧＣＳＦ、ｈＦＳＨ、ｈＨＣＧ）が含まれる。本発明のピロリシン類似体によって修飾可能なさらなるタンパク質には、診断用標識、造影用試薬が含まれる。

好適には、タンパク質は、本発明の１つ又は２つ以上のｎｎＡＡ（ピロリシン類似体）を組み込むように部位特異的に修飾され得る。例えば、抗体が本発明のｎｎＡＡを重鎖に、又は軽鎖に、又は軽鎖及び重鎖の両方に組み込み得る。

組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質の部位特異的コンジュゲーション
組み込まれた本発明のピロリシン類似体を有するタンパク質は、機能化タンパク質コンジュゲートの調製に用いられ得る。組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質とコンジュゲートされ得る分子には、（ｉ）他のタンパク質、例えば抗体、特にモノクローナル抗体；（ｉｉ）ポリマー、例えばＰＥＧ基又はその系の半減期を延長させ得る他の基；（ｉｖ）細胞傷害剤、例えばアウリスタチンＦ；及び（ｖ）薬物部分、例えばドキソルビシン及び放射性同位体を含む部分が含まれる。さらにこのような修飾タンパク質を、薬物又はそうした強力な化合物の標的化デリバリー用のヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。

特定の実施形態のさらなる詳細を、以下の抗体薬物コンジュゲートに関する考察に提供する。

ピロリシン類似体は好都合には、他のアミノ酸と副反応を起こすリスクのない標的化された形でのコンジュゲーションを可能にするユニークな化学基を含み得る。例えば非天然アミノ酸はアジド基又はアルキン基を含み、コンジュゲートしようとする対応するアルキン基又はアジド基を含む分子とのヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応を用いた反応を可能にし得る。

本発明の好ましいコンジュゲーションケミストリーは、天然２０アミノ酸と直交性の反応を含む。かかる反応は天然２０アミノ酸と相互作用せず、又はそれとの副反応を生じることなく、その反応に関連する官能基に特異的である。好適には、必要な官能基は本発明のピロリシン類似体によって標的タンパク質に組み込まれる。

さらに、前記反応は、タンパク質にとって破壊的でない条件下、例えば水性溶媒下、タンパク質が許容でき且つその溶解度を維持するｐＨ範囲において、タンパク質に有害な影響をもたらさない温度で進行する。

タンパク質とリンカーとの間の結合部分の安定性を増加させることが有利であり得る。従来の方法は、マレイミドとの反応によりシステインのチオール基にコンジュゲートしてチオールエーテルを形成する。チオールエーテルは逆反応を起こして抗体からリンカー薬物誘導体を放出させ得る。本発明のある実施形態では、アジドとアルキンとの間で用いられるコンジュゲーションケミストリーにより、大幅に安定性が増した、それほど可逆性を起こし易くない芳香族トリアゾールがもたらされる。

加えて、反応の生成物、タンパク質とペイロードとの間の結合は、安定していて、従来の結合（アミド、チオールエーテル）に伴う安定性と等しいか或いはそれより高くなるはずである。コンジュゲーションの妨げではないものの、往々にして、コンジュゲーション反応を天然の条件下で行うことができる場合、それにより余分なリフォールディング処理のステップがなくなるため有利である。

本発明のコンジュゲートの作製に好ましい化学的コンジュゲーションには、以下が含まれる：３＋２アルキン−アジド環化付加、３＋２双極性環化付加、ヒュスゲン（Ｈｕｓｉｇｅｎ）３＋２環化付加、銅によって促進されるアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、ルテニウムによって促進されるアジドアルキン環化付加（ＲＡＡＣ）、金属によって促進されるアジドアルキン環化付加（ＭＡＡＣ）、及び歪みによって促進されるアジドアルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、パラジウムベースのカップリング、例えば、ヘック反応、薗頭反応、鈴木反応、スティルカップリング、檜山／デンマーク反応、オレフィンメタセシス、ディールズ・アルダー反応、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン又はヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合；ニトリル及びニトリル酸化物による歪みによって促進される環化付加；電子によって促進される環化付加；フラグメントエクストルージョン（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）環化付加；アルケン環化付加と、続くβ脱離反応。

好ましい一実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸はアジド基又はアルキン基を含み、化学修飾方法は、前記アジド基又はアルキン基を、アルキン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。想定される反応は、トリアゾール結合の生成をもたらすヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応である。アルキン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアジド基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は細胞傷害剤又は薬物又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。

場合により、ヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応はＣｕ（Ｉ）触媒作用の存在下で実施することができる。

好ましくは、銅触媒環化付加反応は、水溶液中システイン及びトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）の存在下、室温で行われる。或いは、銅触媒環化付加反応は、水溶液中アスコルビン酸ナトリウム及びトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）の存在下、４℃〜５０℃で行われる。反応はまた、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、トリフルオロエタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール及びヘキシレングリコールからなる有機成分を含む水／有機混合溶液中で行われてもよい。

ある変形例の反応では、組み込まれたアミノ酸がアジド基又はアルケン基を含み、化学修飾方法が、前記アジド基又はアルケン基を、アルケン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。アルケン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアルケン基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は毒素又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。

組み込まれたｎｎＡＡと標的ペイロードとの間の部位特異的コンジュゲーションは、抗体、抗体断片、及びサイトカインなどの完全に折り畳まれたタンパク質で行うことができる。或いは、コンジュゲーションは、ドデシル硫酸ナトリウム及び尿素などの変性剤の存在下において変性タンパク質上で行うことができる。銅触媒によるアジドアルキン付加は、ジチオスレイトール及び２−メルカプトエタノールなどの変性剤及び還元剤の存在下で行うことができる。

２つ以上のｎｎＡＡが標的タンパク質（例えば抗体）に組み込まれるとき、化学修飾は同じであっても又は異なってもよい。例えば２つのｎｎＡＡが組み込まれる場合に、一方が薬物部分にコンジュゲートされるように修飾されてもよく、且つ一方がＰＥＧ部分にコンジュゲートされるように修飾されてもよい。

好都合には、異なるが相補的な反応基を有する２つ以上の本発明のｎｎＡＡを組み込むと、前記ｎｎＡＡが互いに反応して分子内連結を生じ得る。

ある実施形態では、本発明のコンジュゲーションケミストリーは抗体薬物コンジュゲートの調製に用いられる。このコンジュゲーションケミストリーはまた、抗体−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、例えば抗体断片で構成される二重特異性抗体の構築にも用いられ得る。このコンジュゲーションケミストリーはまた、ポリマー結合薬物コンジュゲートと抗体及び抗体断片などのターゲティング剤とのコンジュゲーションにも用いられ得る。このコンジュゲーションケミストリーはまた、ＰＥＧなどのポリマーをタンパク質と結合させることによる薬物動態特性の操作にも用いることができる。

ＰＥＧ部分
標的タンパク質はＰＥＧ部分にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧ部分は抗体薬物コンジュゲートに組み込まれ得る。ＰＥＧ部分は、典型的には０．５ｋＤａ〜４０ｋＤａ、例えば５ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。より好ましくは、ＰＥＧ部分は約２０ｋＤａの分子量を有し得る。加えて、ＰＥＧ部分は１００〜２０００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。ＰＥＧ部分は直鎖状又は分枝状又はマルチアーム型であってもよい。

ＰＥＧ部分は、末端アルキン、アジド、シアン化物、シクロアルキン、アルケン、ハロゲン化アリールで官能化することができる。ＰＥＧは、単官能性、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性、及びホモ多官能性となるようにして官能化することができる。

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明に係るピロリシン類似体は、抗体当たりの薬物（又は他のコンジュゲートされる分子）の数及び抗体におけるそれらの薬物の位置が明確に制御された均一な性質の抗体薬物コンジュゲート（所与の薬物、典型的には細胞傷害性薬物、或いはタンパク質又はＰＥＧ基に合成リンカーによって共有結合した組換え抗体）の作製に特に有用であり、従って組み込まれた非天然アミノ酸を含むモノクローナル抗体が得られ、これは直交化学により薬物部分（又は他のコンジュゲートされる分子）を有するリンカーと部位特異的にコンジュゲートされる。

本発明のピロリシン類似体によって得られるＡＤＣは、以下のステップを含む方法に従い製造され得る。
１．本発明の安定細胞株に、完全長抗体をコードするＤＮＡ配列を有する１つ以上のプラスミドを導入するステップであって、それにより配列内の特定の位置に終止コドンが導入されるステップ
２．ピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）が所望の１つ又は複数の位置に導入された修飾抗体を精製するステップ
３．抗体に導入されたｎｎＡＡに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、相補的な反応基を含む修飾抗体と直交化学によって反応させるステップ
４．得られたＡＤＣを精製するステップ

従って、本発明はまた、ユニークな反応性官能基を有する非天然アミノ酸を所望の位置に組み込むように抗体成分が修飾されているＡＤＣであって、従ってかかる官能基により薬物部分（又はタンパク質又はＰＥＧ基）とのコンジュゲーションが可能となるＡＤＣも提供する。

ある実施形態では、本発明は、タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ、好ましくは１つ又は２つ、特に１つ）とトリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートされる抗Ｈｅｒ−２抗体を含む抗体コンジュゲートを提供する。

詳細には、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応によって形成され得る。

一実施形態では、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分とのＣｕ（Ｉ）触媒作用の条件下における反応によって形成される。

Ｃｕ（Ｉ）触媒作用は、ヨウ化銅、臭化銅、塩化銅、チオール化銅、シアン化銅などの天然Ｃｕ（Ｉ）源のいずれかを使用することにより達成される。Ｃｕ（Ｉ）種はまた、銅（ＩＩ）源及び還元剤を使用することによりインサイチューで生成させることもできる。銅（ＩＩ）源は、硫酸銅、塩化銅（ＩＩ）、又は酢酸銅であってもよい。還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、ジチオスレイトール、ＴＣＥＰ、ｂ−メルカプトエタノール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、亜硫酸水素ナトリウム、シスタミン及びシステインであってもよい。

好適には、Ｃｕ（Ｉ）触媒による環化付加は、反応開始時に存在するか、又はアスコルビン酸ナトリウムによる硫酸ナトリウムなど、Ｃｕ（ＩＩ）源の還元によってインサイチューで生じるＣｕ（Ｉ）種を安定化させるため、ＴＢＴＡ、ＴＨＰＴＡ、フェナントロリン誘導体、ピリジルメタンイミン誘導体、ジエチレントリアミン、ビピリジン誘導体、ＴＭＥＤＡ、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリジルメチル）アミン（ＢＰＭＡ）誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）誘導体、トリアルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳを含めたリガンドの存在下で実施される。

一実施形態では、銅アジドアルキン環化付加がコンジュゲーションに用いられる。好適には、この反応は、末端アルキンを有するアウリスタチン、アマニチン、タキソール又はドキソルビシンなどの細胞傷害剤を利用する。さらにこの反応は、硫酸銅、酢酸銅、ヨウ化銅又は臭化銅などの銅源；アスコルビン酸ナトリウム、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイトール、システイン、ｂ−メルカプトエタノールなどの還元剤；トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）又はトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）などの銅キレートリガンドを用いる。好適には、反応は４〜５０℃で実施され得る。好適には、反応時間は０．５〜４８時間の範囲である。代替的実施形態では、歪みによって促進されるアジドアルキン環化付加がコンジュゲーションに用いられる。好適には、この反応は、色素、ＰＥＧポリマー、又はシクロオクチン（ｃｙｃｌｏｏｃｙｔｎｅ）基を有するアウリスタチンなどの細胞傷害剤を利用する。好適には、反応は室温で０．５〜４８時間インキュベートさせる。

薬物部分
細胞毒薬物部分などの本発明の薬物部分としては、小分子、天然産物、合成的に誘導された薬物、免疫毒素などのタンパク質、及び放射性核種が挙げられる。

ある実施形態では、薬物部分はアウリスタチン部分、例えば、アウリスタチン又はその誘導体、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（ベドチン）又はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＦ（ＡＦ）、アマニチン、パクリタキセル及びドキソルビシンである。

他の薬物部分としては、メイタンシン、パクリタキセル、ドキソルビシン及び免疫毒素、例えば外毒素又はボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）など、並びにヨウ素１３１、イットリウム９０、サマリウム１３５、及びストロンチウム８９などの放射性核種が挙げられ、これらもまた有機分子中に組み込まれ得る（例えば：ＭＭＡＥ：Ｓｅｎｔｅｒ，ＰＥ，ｅｔ．ａｌ，ＢＬＯＯＤ，１０２，１４５８−１４６５。ＭＭＡＦ：Ｓｅｎｔｅｒ，ＰＥ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００６，１７，１１４−１２４。メイタンシン：Ｌｅｗｉｓ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＧＤ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，９２８０−９２９０，２００８。ボウガニン（Ｂｏｕｇａｎｉｎ）：ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＧＣ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２ ５７４−８４，２００９を参照。

最も好適には、薬物部分は、ドキソルビシン、パクリタキセル及びアウリスタチン部分から選択される部分である。

塩
本明細書に記載されるピロリシン類似体は、場合により塩の形態で用いられ得る。任意のかかる塩が本発明の態様を形成する。カルボン酸の塩には、第１族及び第２族金属と形成される塩、特にナトリウム塩及びカリウム塩などの可溶性塩が含まれ得る。アミンの塩には、ＨＣｌ、ＨＢｒ又は酢酸などの弱酸及び強酸と形成される塩が含まれ得る。

実施例１．式Ｖ及び式ＶＩ類似体の調製
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（ペンタ−４−エナミド）ヘキサン酸（式Ｖ．５）の調製

２５ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中に懸濁したＮ−Ｂｏｃ−リシン（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。１Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃を添加し（５ｍＬ）、溶液を０Ｃに冷却した。ジオキサン（２ｍＬ）中の４−ペンテノイルクロリド（２２４ｕＬ、２．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を０Ｃで１時間、次に室温で４時間撹拌しておいた。溶液を抽出漏斗に移し、水とエーテルとに分配した。有機層を取り出し、水層をクエン酸で酸性（ｐＨ＝２）にした。水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。得られた残渣を次のステップに進めた。

粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−Ｎ−４−ペンテノイルアミド−リシンをアセトニトリル（５ｍＬ）及びＴＦＡ（２ｍＬ）と共に５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、２時間磁気撹拌した。混合物を濃縮した。溶液をトルエン（１０ｍＬ）で処理して濃縮し（２×）、アセトニトリル（１０ｍＬ）で処理して濃縮した（２×）。残渣を真空下で一晩乾燥させた。残渣をＭｅＯＨ中に取り、メチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。遠心によって粘稠性の油が単離され、上清は廃棄した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）予測値２２９．２（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３０．３。

（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸（式Ｖ．６）の調製

マグネチックスターラ付き５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、ジクロロメタンとＤＭＦとの２：１混合物（２０ｍＬ）中のピルビン酸（３．５ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物に、ＤＣＣ（５．７ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（３．２ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を撹拌しながら５０Ｃに３０分間加熱した。この溶液を放冷し、次に別個のマグネチックスターラ付き１００ｍＬ丸底フラスコ中のＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｎ−Ｂｏｃ−リシン（５．２ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）の懸濁液にフィルタに通して添加した。活性化エステルの添加後にトリエチルアミン（８．８ｍＬ、６３．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルとクエン酸とに分配した。これらの層を分離し、水層を酢酸エチルで４回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製すると、最終的なＮ−Ｂｏｃリシン誘導体が油として得られた。

１００ｍＬ丸底フラスコに、アセトニトリル（５０ｍＬ）中のケト−Ｎ−Ｂｏｃリシン誘導体（４ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を入れた。これに塩酸の溶液（１５ｍＬ、ジオキサン中４Ｎ）を添加した。この溶液を２時間撹拌して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによる最終的な精製により、目標のアミノ酸が得られた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）予測値２７８．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２７９．２。

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドアセトアミド）ヘキサン酸（式Ｖ．８）の調製

２５ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（５ｍＬ）中に懸濁したＮ−Ｂｏｃ−リシン（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。飽和ＮａＨＣＯ₃を添加し（２ｍＬ）、溶液を０℃に冷却した。ジオキサン（２ｍＬ）中のブロモアセチルクロリド（１６９ｕＬ、２．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を０Ｃで１時間、次に室温で４時間撹拌しておいた。溶液を抽出漏斗に移し、水とエーテルとに分配した。有機層を取り出し、水層をクエン酸で酸性（ｐＨ＝２）にした。水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。得られた残渣を次のステップに進めた。

５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中の粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−２−ブロモアセチル−リシン（７４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。これにナトリウムアジドの溶液（１０ｍＬ、１Ｍ）を添加した。この溶液を６０℃で一晩撹拌した。混合物をクエン酸（１Ｍ、５０ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）とに分配した。有機層を取り置き、水層をさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。

粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−２−アジド−アセチル−リシンをアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。混合物を２時間撹拌し、次に濃縮した。溶液をトルエン（１０ｍＬ）で処理して濃縮し（２×）、アセトニトリル（１０ｍＬ）で処理して濃縮した（２×）。残渣を真空下で一晩乾燥させた。残渣をＭｅＯＨ中に取り、メチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。遠心によって粘稠性の油が単離され、上清は廃棄した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）予測値２２９．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３０．２。

ヒドロキシノルロイシン誘導体（式ＶＩ．１及び式ＶＩ．２）の調製

磁気撹拌付き１００ｍＬ丸底フラスコに、Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドロキシルノルロイシン（１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（５０ｍＬ）を入れた。混合物を０℃に冷却し、ｐ−クロロギ酸ニトロフェニル（９７９ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）及びピリジン（２ｍＬ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（シリカ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配）。

磁気撹拌付き１００ｍＬ丸底フラスコに、２５ｍＬのジオキサン中の２−Ｎ−Ｂｏｃ−臭化エチル（１ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を入れた。これにナトリウムアジド（１Ｍ、２２．２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この溶液を６０Ｃで一晩撹拌した。混合物を水と酢酸エチルとに分配した。酢酸エチル層を取り置き、水層を酢酸エチルでさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。

この油をアセトニトリル（３５ｍＬ）中に取り、ジオキサン中のＨＣＬを添加した（４Ｍ、１０ｍＬ）。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１）の調製

５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−ノルロイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（５０３ｍｇ、１．２ｍｍｏＬ）を入れた。これにジオキサン（５ｍＬ）及びピリジン（ｐｙｉｄｉｎｅ）（１ｍＬ）中のアミノ−アジド（１０５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この溶液を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルと５００ｍＭクエン酸とに分配した。酢酸エチル層を取り置き、水層を酢酸エチルでさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。この油をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。

単離したＢｏｃ保護アミノ酸をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｒｉｌｅ）（１５ｍＬ）に取り、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、５ｍＬ）で処理した。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。

（２Ｓ）−２−アミノ−６−［［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ］ヘキサン酸、式ＶＩ．１の代替的調製

ステップ１：マグネチックスターラ付き４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１ｅｑ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を入れた。これに２−クロロエチルイソシアネート（１７．３ｍｇ、１．０ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）を添加した。バイアルにキャップをし、５時間撹拌しておいた。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物を質量分析法によって同定し、直接次のステップに回した。

ステップ２：マグネチックスターラ付き４ｍＬバイアルに、上記からの粗生成クロロ誘導体及びＤＭＳＯ（１ｍＬ）を入れた。ナトリウムアジド（１３０ｍｇ、５ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）をこの混合物に添加し、バイアルにキャップをした。混合物を６０℃で一晩撹拌した。混合物を抽出漏斗に移し、１００ｍＭクエン酸及び酢酸エチルで希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物を次のステップに進めた。

最終ステップ：２０ｍＬバイアルに、粗生成Ｂｏｃ保護アミノ酸及びアセトニトリル（２ｍＬ）を入れた。これにジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２．５ｍＬ）を添加した。この溶液を２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して半固体にし、翻訳試験で使用した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）予測値２５９．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２６０．２。

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．２）の調製

５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−ノルロイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（３３７ｍｇ、０．８ｍｍｏＬ）を入れた。これにジオキサン（５ｍＬ）中のアミノ−アジド（１３５ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この溶液を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルと５００ｍＭクエン酸とに分配した。酢酸エチル層を取り置き、水層を酢酸エチルでさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。この油をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。

単離したＢｏｃ保護アミノ酸をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｒｉｌｅ）（１５ｍＬ）に取り、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、５ｍＬ）で処理した。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝ヘキサン酸、式ＶＩ．３の調製

マグネチックスターラ付き４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１ｅｑ）及びＤＭＦ（１．５ｍＬ）を入れた。これにアリルイソシアネート（１８．０ｕＬ、１．０ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）を添加した。バイアルにキャップをし、４時間撹拌しておいた。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物を質量分析法によって同定し、直接次のステップに回した。

２０ｍＬバイアルに、アセトニトリル（２ｍＬ）中の粗生成ヒドロキシルロイシン−アリルカルバメート誘導体を入れた。これにジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２．５ｍＬ）を添加した。この溶液を２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して半固体にし、翻訳試験で使用した。生成物を質量分析法によって確認した。イオン交換クロマトグラフィー（ＤＯＷＥＸ−５０）でさらなる精製を行うことができた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）予測値２３０．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３１．２。

実施例２．ＧＦＰアッセイによるｎｎＡＡとしての新規ピロリシン類似体の翻訳試験
インビトロ細胞ベースアッセイを開発して、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対と本発明のピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）の適合性及び標的タンパク質へのｎｎＡＡの組込み効率を評価した。このために、ｐｙｌＲＳ（３Ｈ７）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に、標準的なトランスフェクションプロトコルを用いてｔＲＮＡｐｙｌの発現用プラスミド及びＧＦＰＹ４０をコードするレポーターコンストラクト（アミノ酸残基４０番（ここでは１番が開始因子メチオニンである）にチロシンの代わりにアンバーコドンを含む）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を２ｍＭのｎｎＡＡと共に２〜３日間インキュベートした。ＧＦＰ産生を顕微鏡下目視で観察することによって定性的に分析した。ＧＦＰ蛍光はＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより定量化し、蛍光細胞の幾何平均を決定した。

この細胞ベースのアッセイを用いることにより、種々のｎｎＡＡがｐｙｌＲＳの好適な基質であって、標的タンパク質へのその翻訳が可能かどうかを決定した。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対を発現し、且つＧＦＰＹ４０レポーター遺伝子をコードするベクターを含む細胞を、ｎｎＡＡの存在下でインキュベートした。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対によって容易に利用されるｎｎＡＡは、ＧＦＰのアンバー部位に対するｎｎＡＡの翻訳を裏付け、遺伝子のリードスルーを可能にして完全長ＧＦＰ（蛍光タンパク質）を産生させる。細胞の蛍光強度はｎｎＡＡの組込み効率に依存する。従って、十分に利用されないｎｎＡＡは弱蛍光又は非蛍光細胞を生じる。顕微鏡観察により、ｐｙｌＲＳが使用可能な複数のｎｎＡＡを同定した（表１、陽性ＧＦＰ）。さらに、各試料の相対発現レベルを、ｐｙｌＲＳによって効率的に利用されることが知られる基質により生じるレベルと比較した。式Ｖ．１（ＭＦＩ＝９３１，２８９）、式Ｖ．２（ＭＦＩ＝１，６７６，２５０）及び式Ｖ．３（ＭＦＩ＝２，２５０，０００）（表１を参照のこと）は、幾何平均で高いＧＦＰ発現レベルを裏付けた。

本発明の類似体、式ＶＩ．１及び式ＶＩ．３は、使用した実験条件下でＧＦＰレポーター遺伝子に組み込まれ緑色細胞を産生したことが、本発明者らにより見出された。これらのうち、式ＶＩ．１の類似体は高いＧＦＰ発現レベル（ＭＦＩ ９０４２０６）を裏付けたことから、試験した実験条件下でｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対によって効率的に利用される類似体に相当する（表２を参照のこと）。

抗Ｈｅｒ２抗体の構築及び発現
２つの非天然アミノ酸（各重鎖に１つずつ）を含む完全長抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５−２ＡＺ ａｂ）を哺乳類細胞で発現させた。ｎｎＡＡ（アジド部分を含む）を選択した部位に組み込み、プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）か或いはＩｇＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０９６９０１）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次に精製した材料を濃縮し、コンジュゲーション反応に供した。

マウス抗体４Ｄ５の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を、ヒトＩｇＧをコードする遺伝子を含むベクターにクローニングすることにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに特異的な抗体を作成した。４Ｄ５の可変領域は、重複オリゴマーを使用する遺伝子合成によって作成し、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｇＧ１重鎖；γ）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖；κ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）によりコードされるヒトＩｇＧ１フレームワークにクローニングして、マウス−ヒトハイブリッドを作成した。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によって重鎖（γ）のＫ２７４位に導入した。ＤＮＡ配列決定により、アンバーコドンを含むクローンを同定した。組込み用コンストラクトを作成するため、重鎖のプロモーター及びＯＲＦをＰＣＲ増幅し、制限酵素消化及びライゲーションによってｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。軽鎖及びｔＲＮＡの単一コピーを、重複オリゴマーを使用する二段階ＰＣＲ法でつなぎ合わせ、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドの利用可能な部位にクローニングした。次にこのコンストラクトを、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対を含むＣＨＯ細胞株にトランスフェクトし、高発現のＩｇＧを示す安定にトランスフェクトされた細胞株を選択した。これが、ｎｎＡＡを含むｍＡｂを安定に発現する細胞株の第２の例に相当し、この手順がｍＡｂの発現における使用に幅広い適用性を有することが示される。この細胞株を利用して、上記に記載したｎｎＡＡを含むＩｇＧを作成した。細胞をＥｘｃｅｌ ＤＨＦＲ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において１〜２×１０⁶細胞／ｍＬの密度まで成長させ、ｎｎＡＡを培養物に１ｍＭの終濃度となるように添加した。細胞を５日間インキュベートし、成長培地からＩｇＧを精製した。上清を回収し、遠心に供することにより懸濁細胞及び他の残屑を収集した。次に上清を０．２２ｕｍフィルタでろ過して一切の粒子状物質を取り除いた後、クロマトグラフィーカラムにかけた。ろ過した上清を、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムを使用して１ｍＬ〜５ｍＬ充填済みＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースに１〜５ｍＬ／分の流量で加えた。結合した物質及び樹脂をＰＢＳで洗浄することにより緩く結合したタンパク質を取り除き、結合した物質を１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）により１ｍＬ／分の流量で溶出させた。標的タンパク質を含むピーク画分を０．１画分容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。全てのコンストラクトをＰＢＳに対して４℃で１６時間透析し、最終的なリン酸緩衝液中に入れた。その重鎖の両方の２７４位に組み込まれた式ＶＩ．１をｎｎＡＡとして有する抗体は、「４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸」と称される。

４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸のペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（５ｕＬ、５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１）の溶液（１０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（３．３、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を一晩静置しておいた。混合物を２００ｕＬに希釈し、プロテインＡ磁気ビーズに加えた。混合物をボルテックスし、回転させてビーズを９０分間混合した。ビーズを固定化し、流れ抜ける物質は廃棄した。ビーズをＰＢＳ（２×）で洗浄し、次に還元ゲル緩衝液に懸濁した。ボルテックスし、次に９５Ｃに３分間加熱した。懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色は、重鎖の選択的なペグ化を示した（図１、レーン３）。

ＳＰＡＡＣによる蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｅ ｄｙｅ）との４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（６５ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸の溶液（３０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて溶液ＤＭＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８シクロオクチン（５．４、ＤＭＳＯ中５ｍＭ、クリックケミストリーツール）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を２４時間静置しておいた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィー（１Ｍ硫酸ナトリウムからリン酸緩衝液への勾配を含む東ソーＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲ）により分析すると、コンジュゲーションが起こり、１つ又は２つの部位でコンジュゲーションが起こった混合物（概してＤＡＲ１種及びＤＡＲ２種と称される；ここでＤＡＲは薬物対抗体比として定義される）が得られたことが示された（図２）。

配列表
配列番号１
ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型ヌクレオチド配列

配列番号２
ＰｙｌＲＳ、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型アミノ酸配列

配列番号３
ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異ヌクレオチド配列

配列番号４
ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異アミノ酸配列

配列番号５
ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｇｏ１

配列番号６
Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーター

配列番号７
Ｕ６−ｔＲＮＡｐｙｌコンストラクト

配列番号８
ＧＦＰヌクレオチド配列

配列番号９
ＧＦＰアミノ酸配列

配列番号１０
ＧＦＰＹ４０ヌクレオチド配列

配列番号１１
ＧＦＰＹ４０アミノ酸配列

配列番号１２
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γヌクレオチド配列

配列番号１３
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γアミノ酸配列

配列番号１４
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーヌクレオチド配列

配列番号１５
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーアミノ酸配列

配列番号１６
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κヌクレオチド配列

配列番号１７
抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κアミノ酸配列

参考文献
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本明細書で引用される全ての特許及び特許出願は、全体として参照により組み入れられる。
本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1) 式ＶＩ：

［式中
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；及び
ｂ＝整数１〜４である］
で表されるピロリシン類似体。
(2) ＺがＮＨである、(1)に記載の式ＶＩのピロリシン類似体。
(3) ｂが１又は２である、(1)又は(2)に記載の式ＶＩのピロリシン類似体。
(4) ＦＧが、−Ｎ₃、−ＣＨ＝ＣＨ₂、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＯＣＨ₃、ＣＯＯＣＨ₃、ハロゲンによって置換されたフェニル、又はシクロオクチンを表す、(1)〜(3)のいずれかに記載の式ＶＩのピロリシン類似体。
(5)

から選択される、(1)に記載のピロリシン類似体。
(6)

から選択されるピロリシン類似体。
(7) (1)〜(6)のいずれかに記載の１つ以上のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む突然変異タンパク質。
(8) (1)〜(6)のいずれかに記載の１つのピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む、(7)に記載の突然変異タンパク質。
(9) 各重鎖及び／又は軽鎖に(1)〜(6)のいずれかに記載の１つ以上のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む抗体。
(10) 各重鎖及び／又は軽鎖に(1)〜(6)のいずれかに記載のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む、(10)に記載の抗体。
(11) タンパク質、細胞傷害剤、薬物及びポリマーから選択される１つ以上の部分に前記１つ以上の非天然アミノ酸を介してコンジュゲートされる、(7)〜(9)のいずれかに記載の突然変異タンパク質又は抗体。
(12) ＰＥＧ部分にコンジュゲートされる、(11)に記載の突然変異タンパク質。
(13) 抗体部分にコンジュゲートされる、(11)に記載の突然変異タンパク質。
(14) 細胞傷害剤部分にコンジュゲートされる、(11)に記載の突然変異タンパク質。
(15) 薬物部分にコンジュゲートされる、(11)に記載の突然変異タンパク質。
(16) １つ以上の非天然アミノ酸を含む突然変異タンパク質の製造における(1)〜(6)のいずれかに記載のピロリシン類似体の使用。
(17) 前記タンパク質が抗体である、(16)に記載の使用。

Claims (15)

1. 式ＶＩ：
   

   

   
   ［式中
   Ｚ＝ＮＨ；
   ＦＧ＝−Ｎ _３ 、アルケニル、アルキニル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＯ−アルキル、アリール、又はシクロアルキニル；及び
   ｂ＝整数１〜４である］
   で表されるピロリシン類似体。
2. ｂが１又は２である、請求項１記載の式ＶＩのピロリシン類似体。
3. ＦＧが、−Ｎ₃、−ＣＨ＝ＣＨ₂、−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＯＣＨ₃、−ＣＯＯＣＨ₃、ハロゲンによって置換されたフェニル、又はシクロオクチンを表す、請求項１又は２記載の式ＶＩのピロリシン類似体。
4. 

   
   

   

   
   

   

   
   から選択される、請求項１記載のピロリシン類似体。
5. 請求項１〜４のいずれか１項記載の１つ以上のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む突然変異タンパク質。
6. 請求項１〜４のいずれか１項記載の１つのピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む、請求項５記載の突然変異タンパク質。
7. 各重鎖及び／又は軽鎖に請求項１〜４のいずれか１項記載の１つ以上のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む抗体。
8. 各重鎖及び／又は軽鎖に請求項１〜４のいずれか１項記載のピロリシン類似体を非天然アミノ酸として含む、請求項７記載の抗体。
9. タンパク質、細胞傷害剤、薬物及びポリマーから選択される１つ以上の部分に前記１つ以上の非天然アミノ酸を介してコンジュゲートされる、請求項５〜８のいずれか１項記載の突然変異タンパク質又は抗体。
10. ＰＥＧ部分にコンジュゲートされる、請求項９記載の突然変異タンパク質。
11. 抗体部分にコンジュゲートされる、請求項９記載の突然変異タンパク質。
12. 細胞傷害剤部分にコンジュゲートされる、請求項９記載の突然変異タンパク質。
13. 薬物部分にコンジュゲートされる、請求項９記載の突然変異タンパク質。
14. １つ以上の非天然アミノ酸を含む突然変異タンパク質の製造における請求項１〜４のいずれか１項記載のピロリシン類似体の使用。
15. 前記タンパク質が抗体である、請求項１４記載の使用。

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