CN105524167A - 抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，通过基因工程手段，将合成M.Barkeri的(PylRS)的DNA与质粒pBK重组，获得PylRS-pBK；以PylRS-pBK为模板，构建突变库lib-PylRS-pBK；将lib-PylRS-pBK电击转化、筛选；筛选重组CoukRS-pBK质粒；将抗HBeAg抗体的DNA与pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；分别将质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD和CoukRS-pBK转化到感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的生物表达系统。本发明实现了抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的制备，提高了检测的灵敏度。

Description

抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法。
背景技术
乙肝病毒(HBV)慢性感染是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的主要原因，每年有近100万人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。目前中国有近1亿HBV慢性感染人群，每年仍有10万例新发HBV感染者。
乙肝e抗原的定量是医生判断病情和指导治疗的重要依据。受技术所限，乙肝e抗原的检测一直处于手工定性或者半定量状态。最近，国外的公司有通过化学显色的方法来定量乙肝e抗原，然而化学显色方法灵敏度低，检测不到血液中低丰度的乙肝e抗原，会给乙肝e抗原的检测带来误判。荧光发光检测的方法灵敏度高，可以检测到样本中单个拷贝的靶标。
基于此，有必要设计一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，用来大幅度提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加强对乙型肝炎的发病的监控力度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，旨在提高乙肝e抗原的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于乙肝e抗原的精确定量检测。
为实现上述目的，本发明提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，所述抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；
S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；
S3：筛选CouKRS-pBK质粒，该质粒中包含特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧光抗体。
优选地，所述步骤S1包括如下步骤：
S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒PylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；
S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK。
优选地，所述第二预设比例为1:1:32:1。
优选地，所述步骤S2包括如下步骤：
S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；
S202：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母液C。
优选地，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。
优选地，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。
优选地，所述第一预设比例为1:1。
优选地，所述特定的物质为7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖组成的混合物。
优选地，所述步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1:100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603:在所述培养液C中，添加7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL37摄氏度，200转速，培养7小时，获得培养液D；
S604:取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607:将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608:将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体。
优选地，所述超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4摄氏度。
本发明提供的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上获得PylRS-pBK；通过“一步饱和突变”的方法，构建PylRS酶活力中心的突变库lib-PylRS-pBK；将lib-PylRS-pBK电击转化至包含有筛选质粒pREP的筛选Top10感受态中，制备筛选用大肠杆菌；合成香豆素赖氨酸；筛选重组了特异识别香豆素赖氨酸的氨酰-tRNA合成酶突变体CoukRS的CoukRS-pBK质粒；通过基因工程手段，将抗HBeAg抗体anti-HBeAg的DNA序列与质粒pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；通过转化的方法，将anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒和CoukRS-pBK质粒转化Top10感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的表达系统，从而实现了抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的制备。本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法提高了乙肝e抗原检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的流程示意图；
图2为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S1的流程示意图；
图3为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S2的流程示意图；
图4为本发明香豆素赖氨酸的结构示意图；
图5为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S6的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
本发明提供的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；
S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；
S3：筛选CouKRS-pBK质粒，该质粒中包含特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧光抗体。
在本实施例中，乙肝e抗原的英文缩写为HbeAg，是乙肝病毒内核的一种主要结构蛋白。M.Barkeri表示一种产甲烷厌氧菌；PylRS(pyrrolysineaminoacyl-tRNAsynthetase)中文为吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶。核苷酸序列表1为特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶CouKRS的基因序列；氨基酸序列表为特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶CouKRS的氨基酸序列；核苷酸序列表2为抗乙肝e抗原抗体的突变基因序列。
在实施例中，如图1所示，图1为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的流程示意图。野生型产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)只识别吡咯赖氨酸(第22种基因编码的天然氨基酸)，并催化吡咯赖氨酸和对应的tRNA发生转运反应，从而把吡咯赖氨酸连接到对应tRNA上，延伸因子EF-Tu携带上述产物至核糖体，参与蛋白质合成。tRNA又称转运RNA(transferribonucleicacidtRNA)，是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸。但是野生型的产甲烷厌氧菌的PylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)并不识别香豆素赖氨酸，因此并不能确定哪一种PylRS突变体能够识别香豆素赖氨酸，所以要做突变-建库-筛选(定向进化)，最终筛选到能够特异识别香豆素赖氨酸的PylRS突变体，即命名为CoukRS。
在本实施例中，如图2所示，图2为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S1的流程示意图。步骤S1为获得M.BarkeriPylRS突变库；在实现步骤S1的过程中，又可分8个步骤来实现，分别是步骤S101、S102、S103、S104、S105、S106、S107和S108。具体的步骤如下：
S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒PylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；
S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK。
在步骤S101中首先人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列，然后通过步骤S102将M.BarkeriPylRS的DNA连接到pBK质粒上，既可以通过传统酶切链接，也可以采用分步PCR方法，利用饱和突变的方法，设计引物，把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密码子)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。达到“无中生有”的目的，最终获得重组质粒A。此外，pBK质粒比较小，有利于下游的大容量库的构建。当上述合成的M.BarkeriPylRS的编码DNA连接到pBK质粒中，是通过分步聚合酶链式反应(PCR)方法时，实现步骤如下：在特定50μLPCR扩增体系和特定方法下实现突变库的构建。50μLPCR扩增体系包括：无菌水40μL、10倍浓度的缓冲液5μL，质粒DNA模板1μL，PCR扩增引物正负链各1μL，10mMdNTPs1μL，高保真酶1μL。以下各步骤PCR反应体系均按照该体系进行。以上所述的反应体系，在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应扩增的方法为：94℃，4分钟，预变性；94℃，1分钟，变性；58℃，30秒，退火；72℃，3分钟，延伸；重复变性-退火-延伸步骤26个循环后，72℃保温5分钟，然后降温到16度，完成反应。以下各步骤突变库，均按照此方法进行。每一步骤的PCR扩增后，需要经过电击感受态大肠杆菌进行转化，并在大肠杆菌中进行扩增，经过质粒提取步骤得到可用于下一步PCR扩增反应的质粒。以上所述的可用于电击的感受态的制备采用标准步骤进行。
在本实施例中，设计定点突变引物的原理为先把野生型的pylrs连接到pBK上，然后设计引物(在特定位点有突变)，PCR后，得到本底pylrs-pBK和突变pylrs-pBK，由于本底的pylrs-pBK从DH5a中提取，腺嘌呤核苷上会甲基化，用特异识别甲基化腺嘌呤核苷的DpnI酶切即可去除本底。得到的线性质粒片段(含有突变)转化到感受态细胞中，得到环化的质粒。提取环化的质粒，以此为模版，再利用另一对突变引物进行突变，同样用DpnI处理，得到突变库2，再次重复，得到突变库3，得到突变库4。把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密码子。)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。根据蛋白质晶体结构，可以获得结合底物的酶活中心，该中心由多个氨基酸组成，经过InsightII分子模拟计算，分子模拟软件InsightII对PylRS酶活力中心进行测算，可以预测底物分子周围的氨基酸，这些氨基酸是进化PylRS的重要依据。在步骤S103中，通过定点突变原理设计4对不同的引物，如表1所示，表1为采用本发明较佳实施例的引物的序列。该4对引物分别是引物f-L274NNK、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK。在步骤S104中，利用步骤S103中的引物f-L274NNK、引物r-L274NNK，通过PCR(聚合酶链式反应)，可获得突变库1；同理，利用步骤S103中的引物f-L270NNK和引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK，分别通过PCR(聚合酶链式反应)，可分别获得突变库2、突变库3、突变库4。将得到的突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照1:1:32:1的比例混合，最终可获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK。详细步骤如下：在以上所述反应体系中加入上述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK，进行PCR扩增，得PCR产物1；PCR产物1，经过电击转化到感受态大肠杆菌中扩增，经质粒提取，得到突变库1；以上述突变库1为模板，在反应体系中加入上述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK，经PCR扩增和上述突变库1相同的步骤处理，得到突变库2；以上述突变库2为模板，经过引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK扩增，得到PCR产物3，PCR产物3经过上述突变库1相同的制备方法，得到突变库3，突变库3经过引物Y349NNK-f和引物Y349NNK-r引物扩增、转化、质粒提取步骤得到突变库4；把以上所述突变库1-4按照第二预设比例为1:1:32:1混合，得到最终用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库(lib-PylRS-pBK)。
表1采用本发明较佳实施例的引物的序列
如图3所示，图3为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S2的流程示意图。
步骤S2包括如下步骤：
S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；
S202：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母液C。
在步骤S2中，主要涉及香豆素赖氨酸的合成；如图4所示，图4为本发明香豆素赖氨酸的结构示意图。其合成步骤如下：在步骤S21中，首先取间苯二酚5.5克，溶于水中，并加热到90℃，慢慢向间苯二酚溶液中滴加溶于水的苹果酸6.7克，反应2小时，得到7-羟基香豆素；在步骤S22中，取7-羟基香豆素10克，赖氨酸2.24克，分别溶于水，在溶液中滴加10毫摩尔的LiCl水溶液10毫升，于60摄氏度搅拌过夜，时间可以为12个小时。经液相色谱分离，得到7-羟基香豆素赖氨酸9.5克以供筛选。LiCl水溶液又称氯化锂溶液，常用浓度为1mol/L。在本实施例中，香豆素赖氨酸B经过0.22微米滤膜过滤除菌。
在步骤S3中，主要筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶CouKRS突变体：在步骤S2中合成的非天然氨基酸7-羟基香豆素，溶解到水中，经过0.22微米滤膜过滤除菌，得到终浓度为100mM的7-羟基香豆素母液。进行筛选之前，构建筛选pREP质粒，和用于表达验证的pylT-pBAD质粒。所述CouKRS的筛选步骤如下：首先转化lib-PylRS-pBK至包含pREP质粒的Top10大肠杆菌感受态中，Top10大肠杆菌感受态细胞可用于DNA的化学转化。经37℃，1小时孵育后，涂布在正筛选培养板上。正筛选把目的克隆呈现出来，对应的负筛选则是把非目的克隆剔除。正筛选培养板的配制方法如下：100毫升LB培养基中加入0.15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的7-羟基香豆素母液，100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为12.5mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。经过37℃下，48小时的培养，挑选在正筛选板子上存活的单克隆细菌进行培养12小时，得到的单克隆细菌分别印在两种培养基上1和培养基2上。培养基1的配方为：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的7-羟基香豆素母液，100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为12.5mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。培养基2的配方为：100毫升LB培养基中加入0.15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为50mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。印在培养基1和2上的细菌在37℃下培养48小时，能够在培养基1上生存同时不能在培养基2上生存的单克隆即为含有CouKRS的菌株。该菌株特异识别7-羟基香豆素赖氨酸。CouKRS的突变位点为L270A，L274S，N311A，N313G，Y349N5个突变位点。
在本实施例中，7-羟基香豆素是目的底物，因此在筛选的时候添加到筛选平板上。配制母液是生化研究的常规或者常识。假设100毫升液体中含有若干成分，把他们直接混合，体积会增大，只有配成母液，才能保证浓度的情况下，不影响体积。参考PCR中的10倍buffer，就是母液。转化成功的菌株能够在氯霉素抗性平板上活下来。pylT-pREP质粒的作用就是让识别氨基酸的酶活下来。pylT基因编码tRNA为香豆素氨酰-tRNA合成酶；通过CouKRS的突变位点为L270A，L274S，N311A，N313G，Y349N的设计及筛选最终可以得到只识别香豆素赖氨酸，提高了特异性。
在步骤S4中设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗乙肝e抗原抗体的突变DNA与质粒pBAD重组，获得表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD，对于表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD来说，能够将抗HBeAg(乙肝e抗体)的基因的第4个密码子突变为TAG。质粒pBAD也来自于Invitrogen公司，质粒pBAD为表达质粒中的一种，用于目的基因的表达。具体过程可表述为：设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列(见序列表中的序列3)也可以通过基因公司合该突变体，并把其克隆到质粒pBAD，该pBAD质粒的多克隆位点选择在EcoRI和NotI酶切位点之间进行酶切连接，达到基因重组的目的，最终得到酵母表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD。
在步骤S5中分别将步骤S4中构建的CouKRS-pBK质粒线性化；将步骤S5中构建的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，该第一预设比例为1:1；经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10感受态中，获得菌株A。Top10感受态来自于Invitrogen公司，Top10为原核表达中的常用的感受态菌株，为大肠杆菌的一种。电击转化，电压为1.8千伏，电击时间为3.8秒。
参照图5，图5为本发明抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法的步骤S6的流程示意图。
步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1:100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603:在所述培养液C中，添加7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL37摄氏度，200转速，培养7小时，获得培养液D；
S604:取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607:将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608:将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体。
在本实施例中，L-阿拉伯糖是一种作用温和的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。继续添加7-羟基香豆素母液1mL，于30摄氏度，200rpm下继续培养7小时得到酵母菌体，经5000rpm，30min离心，超声破碎，镍柱纯化步骤得到抗乙肝e抗原荧光抗体。在步骤S603中，卡那霉素、四环素起到抗性筛选的作用；超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4摄氏度。
为检测上述得到的抗乙肝e抗原荧光抗体的识别乙肝e抗原的效率和特异性，我们采取以下实例对本发明进行解释，本发明并不局限于以下实施例。实例1：
利用低浓度的乙肝e抗原作为样品，测试本发明制备的荧光抗体的灵敏度，具体步骤如下。
S120：取乙肝e抗原，用磷酸缓冲液(PBS)对乙肝e抗原进行稀释，配制成浓度为0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL10个梯度的乙肝e抗原液备用。
S130：将所述抗乙肝e抗原荧光抗体10μL、磷酸缓冲液90μL，分别加入到酶标板的11个孔中，在第11个孔中加入没有荧光标记的乙肝e抗原荧光抗体10μL、磷酸缓冲液90μL，分别命名为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11室温孵育12h。
S140：将所述S130中的酶标板中的液体吸弃，重新加入100μL磷酸缓冲液至酶标板中，将所述酶标板置于摇床上，每分钟30rpm，室温清洗5分钟。
S150：重复步骤S140两次，并吸弃酶标板中1-11板孔中的磷酸缓冲液。
S160：在所述酶标板板孔1中加入100μL磷酸缓冲液，在板孔1-11中分别加入10μL浓度为0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL10个梯度的乙肝e抗原液，其中板孔1为阳性对照，板孔11为阴性对照，板孔2-10为样本组。
S170：在板孔1-11中分别加入90μL磷酸缓冲液。把酶标板置于摇床上，按照每分钟30rpm的rpm速室温孵育2h。
S180：将S170所述酶标板1-11板孔中的液体吸弃，并在酶标板的1-11板孔中加入100μLPBS，按照每分钟30rpm，室温清洗5分钟。
S190：重复S180两次。
S200：将所述清洗后的酶标板置于酶标仪上进行检测，488nm激光激发，采集525nm下的荧光，结果如表2所示。
表2本发明制备的荧光抗体的荧光强度值
板孔编号 荧光强度(a.u) 抗原终浓度(ng/mL)
1 10000 0
2 8000 0.02
3 7590 0.04
4 7100 0.06
5 5520 0.13
6 4000 0.2
7 3800 0.31
8 2600 0.89
9 1700 1.34
10 1000 2.0
11 0.21 0.02
从表2的测试结果发现：对于阴性对照组11(即未标记的抗乙肝e抗原抗体)荧光强度为0.21a.u；对于阳性对照组1(荧光标记的抗乙肝e抗原抗体)没有与其对应的乙肝e抗原识别，荧光强度最大为10000，当不同浓度的乙肝e抗原和荧光标记的抗乙肝e抗原抗体结合时，荧光信号不同，且随着乙肝e抗原的浓度逐渐增大，荧光信号逐渐减弱；此外，通过该测试还能够得出该荧光抗体可以检测到0.02ng/L级的抗原的结论。
本发明提供的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上获得CouKRS-pBK；通过设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗乙肝e抗原抗体的突变DNA与质粒pBAD重组，获得酵母表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；通过将质粒CouKRS-pBK、anti-HBeAg-4tag-pBAD按照一定的比例混合，电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，进行抗性筛选，获得了制备抗乙肝e抗原荧光抗体的生物表达系统，该系统介导7-羟基香豆素在抗乙肝e抗原抗体的氨基酸序列的4位点插入，从而实现了抗乙肝e抗原荧光抗体的制备；大幅度提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加强了对乙肝病情的监控力度。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；
S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；
S3：筛选获得CouKRS-pBK质粒，该质粒包括能够特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧光抗体。
2.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒PylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；
S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK。
3.如权利要求2所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述第二预设比例为1:1:32:1。
4.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；
S202：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母液C。
5.如权利要求4所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。
6.如权利要求5所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。
7.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述第一预设比例为1:1。
8.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述特定的物质为7-羟基香豆素母液C、卡那霉素、四环素和L-阿拉伯糖组成的混合物。
9.如权利要求8所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1:100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603:在所述培养液C中，添加7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL培养7小时，获得培养液D；
S604:取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607:将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608:将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体。
10.如权利要求9所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4摄氏度。
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