CN105647918A - 抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法 - Google Patents

抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，通过基因工程手段，将合成的甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina？mazei)物种的氨酰-tRNA合成酶(mPylRS)的基因与质粒pBK重组，获得mPylRS-pBK；以mPylRS-pBK为模板，构建突变库lib-mPylRS-pBK；将lib-mPylRS-pBK电击转化、筛选；筛选重组NBDKRS-pBK质粒；将抗HBeAg抗体的DNA与pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；分别将质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD和NBDKRS-pBK转化到感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原红色荧光抗体的生物表达系统。本发明实现了抗乙肝e抗原红色荧光抗体的制备，提高了检测的灵敏度。

Description

抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎的简称是乙型肝炎，它是由乙肝病毒感染引起的传染性疾病，也是肝硬化和肝癌的主要病因。我国是乙型肝炎的高发地区，感染人数超过9300万，乙肝防控的难度依然严峻。
乙肝e抗原的定量是医生判断病情和指导治疗的重要依据。受技术所限，乙肝e抗原的检测一直处于手工定性或者半定量状态。最近，国外的公司有通过化学显色的方法来定量乙肝e抗原，然而化学显色方法灵敏度低，检测不到血液中低丰度的乙肝e抗原，会给乙肝e抗原的检测带来误判。荧光发光检测的方法灵敏度高，可以检测到样本中单个拷贝的靶标。目前绿色荧光标记抗体比较单一，而抗体的种类有很多，发展红色荧光标记的乙肝e抗原，在同一个检测中检测多个抗原，提高检测效率。
基于此，有必要设计一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，用来提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加强对乙型肝炎的发病的监控力度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，旨在提高乙肝e抗原的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于乙肝e抗原的精确定量检测。
为实现上述目的，本发明提供一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，所述抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK；
S2：获得NBD-赖氨酸；
S3：筛选获得NBDKRS-pBK质粒，该NBDKRS-pBK质粒包括能够特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体NBDKRS的基因序列；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的NBDKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及柱纯化得到抗乙肝e抗原红色荧光抗体。
优选地，所述第一预设比例为1：1。
优选地，所述步骤S1包括如下步骤：
S101：人工合成甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒mPylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L309NNK、引物r-L309NNK、引物f-L305NNK、引物r-L305NNK、引物f-N346F348NNK、引物r-N346F348NNK、引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK；
S104：以所述重组质粒mPylRS-pBK为模板，以所述引物f-L309NNK和引物r-L309NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L305NNK和引物r-L305NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N346F348NNK和引物r-N346F348NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于NBD-赖氨酸筛选用的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK。
优选地，所述第二预设比例为1：1：32：1。
优选地，所述NBDKRS的突变位点为L305A，L309G，N346C，F348A。
优选地，所述步骤S2包括如下步骤：
S201：取预设量的4-氯-7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑(NBD-Cl)，及赖氨酸溶于乙酸乙酯和水的混合液中，并加热到30℃，滴加预设量的表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺，反应2小时，得到NBD-赖氨酸A；
S202：取第三预设量的上述NBD-赖氨酸A；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到NBD-赖氨酸母液C。
优选地，所述NBD-赖氨酸母液C的浓度设定为100mM。
优选地，所述特定的物质为由NBD-赖氨酸母液C、卡那霉素、四环素和L-阿拉伯糖组成的混合物。
优选地，所述步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1：100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603：在所述培养液C中，添加NBD-赖氨酸母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL培养7小时，获得培养液D；
S604：取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607：将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608：将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的红色荧光抗体。
优选地，所述超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4℃NBD-赖氨酸ANBD-赖氨酸A。
本发明提供的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法通过合成甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(mPylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上获得mPylRS-pBK；通过“一步饱和突变”的方法，构建mPylRS酶活力中心的突变库lib-mPylRS-pBK；将lib-mPylRS-pBK电击转化至包含有筛选质粒pREP的筛选Top10感受态中，制备筛选用大肠杆菌；合成NBD-赖氨酸；筛选重组了特异识别NBD-赖氨酸的氨酰-tRNA合成酶突变体NBDKRS的NBDKRS-pBK质粒；通过基因工程手段，将抗HBeAg抗体anti-HBeAg的DNA序列与质粒pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；通过转化的方法，将anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒和NBDKRS-pBK质粒转化Top10感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原红色荧光抗体的表达系统，从而实现了抗乙肝e抗原红色荧光抗体的制备。本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法提高了乙肝e抗原检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的流程示意图；
图2为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S1的流程示意图；
图3为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S2的流程示意图；
图4为本发明NBD-赖氨酸的结构示意图；
图5为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S6的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
如图1所示，图1为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的流程示意图。本发明提供的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK；
S2：获得NBD-赖氨酸；
S3：筛选获得NBDKRS-pBK质粒，该NBDKRS-pBK质粒包括能够特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体NBDKRS的基因序列；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的NBDKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及柱纯化得到抗乙肝e抗原红色荧光抗体。
在本实施例中，乙肝e抗原的英文缩写为HbeAg，是乙肝病毒内核的一种主要结构蛋白。甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)表示一种产甲烷厌氧菌；mPylRS(pyrrolysineaminoacyl-tRNAsynthetase)中文为吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶。核苷酸序列表1为特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶NBDKRS的基因序列；氨基酸序列表为特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶NBDKRS的氨基酸序列；核苷酸序列表2为抗乙肝e抗原抗体的突变基因序列。
在实施例中，野生型产甲烷厌氧菌的mPylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)只识别吡咯赖氨酸(第22种基因编码的天然氨基酸)，并催化吡咯赖氨酸和对应的tRNA发生转运反应，从而把吡咯赖氨酸连接到对应tRNA上，延伸因子EF-Tu携带上述产物至核糖体，参与蛋白质合成。tRNA又称转运RNA(transferribonucleicacidtRNA)，是具有携带并转运氨基酸功能的一类小分子核糖核酸。但是野生型的产甲烷厌氧菌的mPylRS(吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶)并不识别NBD-赖氨酸，因此并不能确定哪一种mPylRS突变体能够识别NBD-赖氨酸，所以要做突变-建库-筛选(定向进化)，最终筛选到能够特异识别NBD-赖氨酸的mPylRS突变体，即命名为NBDKRS。
如图2所示，图2为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S1的流程示意图。在本实施例中，步骤S1为获得甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS突变库；在实现步骤S1的过程中，又可分8个步骤来实现，分别是步骤S101、S102、S103、S104、S105、S106、S107和S108。具体的步骤如下：
S101：人工合成甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒mPylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L309NNK、引物r-L309NNK、引物f-L305NNK、引物r-L305NNK、引物f-N346F348NNK、引物r-N346F348NNK、引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK；
S104：以所述重组质粒mPylRS-pBK为模板，以所述引物f-L309NNK和引物r-L309NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L305NNK和引物r-L305NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N346F348NNK和引物r-N346F348NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于NBD-赖氨酸筛选用的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK。
在步骤S101中首先人工合成甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS的DNA序列，然后通过步骤S102将甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS的DNA连接到pBK质粒上，既可以通过传统酶切链接，也可以采用分步PCR方法，利用饱和突变的方法，设计引物，把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密码子)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。达到“无中生有”的目的，最终获得重组质粒A。此外，pBK质粒比较小，有利于下游的大容量库的构建。当上述合成的甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS的编码DNA连接到pBK质粒中，是通过分步聚合酶链式反应(PCR)方法时，实现步骤如下：在特定50μLPCR扩增体系和特定方法下实现突变库的构建。50μLPCR扩增体系包括：无菌水40μL、10倍浓度的缓冲液5μL，质粒DNA模板1μL，PCR扩增引物正负链各1μL，10mMdNTPs1μL，高保真酶1μL。以下各步骤PCR反应体系均按照该体系进行。以上所述的反应体系，在PCR扩增仪上进行扩增，PCR反应扩增的方法为：94℃，4分钟，预变性；94℃，1分钟，变性；58℃，30秒，退火；72℃，3分钟，延伸；重复变性-退火-延伸步骤26个循环后，72℃保温5分钟，然后降温到16度，完成反应。以下各步骤突变库，均按照此方法进行。每一步骤的PCR扩增后，需要经过电击感受态大肠杆菌进行转化，并在大肠杆菌中进行扩增，经过质粒提取步骤得到可用于下一步PCR扩增反应的质粒。以上所述的可用于电击的感受态的制备采用标准步骤进行。
在本实施例中，设计定点突变引物的原理为先把野生型的pylrs连接到pBK上，然后设计引物(在特定位点有突变)，PCR后，得到本底pylrs-pBK和突变pylrs-pBK，由于本底的pylrs-pBK从DH5a中提取，腺嘌呤核苷上会甲基化，用特异识别甲基化腺嘌呤核苷的DpnI酶切即可去除本底。得到的线性质粒片段(含有突变)转化到感受态细胞中，得到环化的质粒。提取环化的质粒，以此为模版，再利用另一对突变引物进行突变，同样用DpnI处理，得到突变库2，再次重复，得到突变库3，得到突变库4。把单个氨基酸的密码子突变为NNK(N代表A，T，C，G四种密码子，K代表T，G两种密码子。)NNK组合把一个氨基酸的密码子突变为4*4*2＝32种，对应20种氨基酸。根据蛋白质晶体结构，可以获得结合底物的酶活中心，该中心由多个氨基酸组成，经过InsightII分子模拟计算，分子模拟软件InsightII对mPylRS酶活力中心进行测算，可以预测底物分子周围的氨基酸，这些氨基酸是进化mPylRS的重要依据。在步骤S103中，通过定点突变原理设计4对不同的引物，如表1所示，表1为采用本发明较佳实施例的引物的序列。该4对引物分别是引物f-L309NNK、引物r-L309NNK、引物f-L305NNK、引物r-L305NNK、引物f-N346F348NNK、引物r-N346F348NNK、引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK。在步骤S104中，利用步骤S103中的引物f-L309NNK、引物r-L309NNK，通过PCR(聚合酶链式反应)，可获得突变库1；同理，利用步骤S103中的引物f-L305NNK和引物r-L305NNK、引物f-N346F348NNK和引物r-N346F348NNK、引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK，分别通过PCR(聚合酶链式反应)，可分别获得突变库2、突变库3、突变库4。将得到的突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照1：1：32：1的比例混合，最终可获得用于NBD-赖氨酸筛选用的甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK。详细步骤如下：在以上所述反应体系中加入上述引物f-L309NNK和引物r-L309NNK，进行PCR扩增，得PCR产物1；PCR产物1，经过电击转化到感受态大肠杆菌中扩增，经质粒提取，得到突变库1；以上述突变库1为模板，在反应体系中加入上述引物f-L305NNK和引物r-L305NNK，经PCR扩增和上述突变库1相同的步骤处理，得到突变库2；以上述突变库2为模板，经过引物f-N346F348NNK和引物r-N346F348NNK扩增，得到PCR产物3，PCR产物3经过上述突变库1相同的制备方法，得到突变库3，突变库3经过引物Y349NNK-f和引物Y349NNK-r引物扩增、转化、质粒提取步骤得到突变库4；把以上所述突变库1-4按照第二预设比例为1：1：32：1混合，得到最终用于NBD-赖氨酸筛选用的甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS突变库(lib-mPylRS-pBK)。
表1本发明较佳实施例的引物序列
如图3所示，图3为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S2的流程示意图。
步骤S2包括如下步骤：
S201：取预设量的4-氯-7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑(NBD-Cl)和赖氨酸，溶于乙酸乙酯和水中，并加热到30℃，滴加预设量的十六烷基三甲基溴化胺，反应2小时，即可得到NBD-赖氨酸A；
S202：取第三预设量的上述NBD-赖氨酸A；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到NBD-赖氨酸母液C。
在步骤S2中，主要涉及NBD-赖氨酸的合成；如图4所示，图4为本发明NBD-赖氨酸的结构示意图。其合成步骤如下：在步骤S201中，首先取4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑(NBD-Cl)5g，溶于水中，并加热到30℃，慢慢向4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑(NBD-Cl)溶液中滴加溶于水的赖氨酸2.4克，搅拌混匀2分钟，得到预反应混合液，慢慢向预反应混合液中滴加十六烷基三甲基溴化胺100毫升，得到NBD-赖氨酸A。NBD-赖氨酸A溶于100毫升水中，经液相色谱分离，得到NBD-赖氨酸3克以供筛选。在本实施例中，NBD-赖氨酸经过0.22微米滤膜过滤除菌。
在步骤S3中，主要筛选特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶NBDKRS突变体：在步骤S2中合成的非天然氨基酸NBD-赖氨酸，溶解到水中，经过0.22微米滤膜过滤除菌，得到终浓度为100mM的NBD-赖氨酸母液。进行筛选之前，构建筛选pREP质粒，pREP质粒上携带氯霉素抗性基因，该氯霉素抗性基因上含有一个TAG，用TAG取代编码蛋氨酸的密码子ATG，如果没有氨基酸插入的情况下，该氯霉素基因无法表达，当有氯霉素存在的情况下，大肠杆菌无法生存；只有当特定的甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)mPylRS的单个突变体特意识别NBDK，并插入到氯霉素基因上的TAG位点时，氯霉素才可得到表达，共包含pREP和NBDKRS-pBK质粒的目的菌株才能生存，获得具有氯霉素抗性的阳性克隆，该克隆中包含的NBDKRS-pBK质粒和步骤S4中的pBAD质粒共转化，即可实现连接到pBAD质粒上的anti-HBeAg-4tag基因编码的蛋白质HBeAg的表达以及特定位点的标记。
所述NBDKRS的筛选步骤如下：首先转化lib-mPylRS-pBK至包含pREP质粒的Top10大肠杆菌感受态中，Top10大肠杆菌感受态细胞可用于DNA的化学转化。经37℃，1小时孵育后，涂布在正筛选培养板上。正筛选把目的克隆呈现出来，对应的负筛选则是把非目的克隆剔除。正筛选培养板的配制方法如下：100毫升LB培养基中加入0.15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的NBD-赖氨酸母液，100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为12.5mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。经过37℃下，48小时的培养，挑选在正筛选板子上存活的单克隆细菌进行培养12小时，得到的单克隆细菌分别印在两种培养基上1和培养基2上。培养基1的配方为：100毫升LB培养基中加入0.015g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入1毫升以上所述的浓度为100mM的NBD-赖氨酸母液，100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为12.5mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。培养基2的配方为：100毫升LB培养基中加入0.15g琼脂粉，高压灭菌处理，并降温到60℃；在其中加入100μL80mg/mL的氯霉素液体，浓度为50mg/mL的四环素100μL，浓度为50mg/mL的卡那霉素100μL，混匀过后，倒入无菌培养板中，冷却后备用。印在培养基1和2上的细菌在37℃下培养48小时，能够在培养基1上生存同时不能在培养基2上生存的单克隆即为含有NBDKRS的菌株。该菌株特异识别NBD-赖氨酸。NBDKRS的突变位点为L305A，L309G，N346C，F348A4个突变位点。
在本实施例中，NBD-赖氨酸是目的底物，因此在筛选的时候添加到筛选平板上。配制母液是生化研究的常规或者常识。假设100毫升液体中含有若干成分，把他们直接混合，体积会增大，只有配成母液，才能保证浓度的情况下，不影响体积。参考PCR中的10倍buffer，就是母液。转化成功的菌株能够在氯霉素抗性平板上活下来。pREP质粒的作用就是让识别氨基酸的酶活下来。pylT基因编码携带NBD-赖氨酸进入核糖体翻译的tRNA；通过NBDKRS的突变位点为L305A，L309G，N346C，F348A的设计及筛选最终可以得到只识别NBD-赖氨酸，提高了特异性。
在步骤S4中设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗乙肝e抗原抗体的突变DNA与质粒pBAD重组，获得表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD，对于表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD来说，能够将抗HBeAg(乙肝e抗体)的基因的第4个密码子突变为TAG。质粒pBAD也来自于Invitrogen公司，质粒pBAD为表达质粒中的一种，用于目的基因的表达。具体过程可表述为：设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列(见序列表中的序列3)也可以通过基因公司合该突变体，并把其克隆到质粒pBAD，该pBAD质粒的多克隆位点选择在EcoRI和NotI酶切位点之间进行酶切连接，达到基因重组的目的，最终得到大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD。
在步骤S5中分别将步骤S4中构建的NBDKRS-pBK质粒线性化；将步骤S5中构建的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，该第一预设比例为1：1；经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10感受态中，获得菌株A。Top10感受态来自于Invitrogen公司，Top10为原核表达中的常用的感受态菌株，为大肠杆菌的一种。电击转化，电压为1.8千伏，电击时间为3.8秒。
参照图5，图5为本发明抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法的步骤S6的流程示意图。
步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1：100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603：在所述培养液C中，添加NBD-赖氨酸母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL37℃，200转速，培养7小时，获得培养液D；
S604：取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607：将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608：将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的红色荧光抗体。
在本实施例中，L-阿拉伯糖是一种作用温和的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。继续添加NBD-赖氨酸母液1mL，于30℃，200rpm下继续培养7小时得到大肠杆菌菌体，经5000rpm，30min离心，超声破碎，镍柱纯化步骤得到抗乙肝e抗原荧光抗体。在步骤S603中，卡那霉素、四环素起到抗性筛选的作用；超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4℃。
为检测上述得到的抗乙肝e抗原荧光抗体的识别乙肝e抗原的效率和特异性，我们采取以下实例对本发明进行解释，本发明并不局限于以下实施例。实例1：
利用低浓度的乙肝e抗原作为样品，测试本发明制备的荧光抗体的灵敏度，具体步骤如下。
S120：取乙肝e抗原，用磷酸缓冲液(PBS)对乙肝e抗原进行稀释，配制成浓度为0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL10个梯度的乙肝e抗原液备用。
S130：将所述抗乙肝e抗原荧光抗体10μL、磷酸缓冲液90μL，分别加入到酶标板的11个孔中，在第11个孔中加入没有荧光标记的乙肝e抗原荧光抗体10μL、磷酸缓冲液90μL，分别命名为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11室温孵育12h。
S140：将所述S130中的酶标板中的液体吸弃，重新加入100μL磷酸缓冲液至酶标板中，将所述酶标板置于摇床上，每分钟30rpm，室温清洗5分钟。
S150：重复步骤S140两次，并吸弃酶标板中1-11板孔中的磷酸缓冲液。
S160：在所述酶标板板孔1中加入100μL磷酸缓冲液，在板孔1-11中分别加入10μL浓度为0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL10个梯度的乙肝e抗原液，其中板孔1为阳性对照，板孔11为阴性对照，板孔2-10为样本组。
S170：在板孔1-11中分别加入90μL磷酸缓冲液。把酶标板置于摇床上，按照每分钟30rpm的rpm速室温孵育2h。
S180：将S170所述酶标板1-11板孔中的液体吸弃，并在酶标板的1-11板孔中加入100μLPBS，按照每分钟30rpm，室温清洗5分钟。
S190：重复S180两次。
S200：将所述清洗后的酶标板置于酶标仪上进行检测，550nm激光激发，采集595nm下的荧光，结果如表2所示。
表2本发明制备的荧光抗体的荧光强度值
板孔编号 荧光强度(a.u) 抗原终浓度(ng/mL)
1 10000 0
2 8000 0.02
3 6100 0.04
4 4375 0.06
5 2114 0.13
6 1005 0.2
7 823 0.31
8 432 0.89
9 331 1.34
10 100.9 2.0
11 0.21 0.02
从表2的测试结果发现：对于阴性对照组11(即未标记的抗乙肝e抗原抗体)荧光强度为0.21a.u；对于阳性对照组1(荧光标记的抗乙肝e抗原抗体)没有与其对应的乙肝e抗原识别，荧光强度最大为10000，当不同浓度的乙肝e抗原和荧光标记的抗乙肝e抗原抗体结合时，荧光信号不同，且随着乙肝e抗原的浓度逐渐增大，荧光信号逐渐减弱；此外，通过该测试还能够得出该荧光抗体可以检测到0.02ng/L级的抗原的结论。
本发明提供的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法通过合成甲烷马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(mPylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上获得NBDKRS-pBK；通过设计抗乙肝e抗原抗体的突变DNA序列，获得该突变体，将所述抗乙肝e抗原抗体的突变DNA与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；通过将质粒NBDKRS-pBK、anti-HBeAg-4tag-pBAD按照一定的比例混合，电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，进行抗性筛选，获得了制备抗乙肝e抗原荧光抗体的生物表达系统，该系统介导NBD-赖氨酸在抗乙肝e抗原抗体的氨基酸序列的4位点插入，从而实现了抗乙肝e抗原荧光抗体的制备；大幅度提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加强了对乙肝病情的监控力度。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK；
S2：获得NBD-赖氨酸；
S3：筛选获得NBDKRS-pBK质粒，该NBDKRS-pBK质粒包括能够特异识别NBD-赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体NBDKRS的基因序列；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的NBDKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及柱纯化得到抗乙肝e抗原红色荧光抗体。
2.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述第一预设比例为1：1。
3.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S101：人工合成甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒mPylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L309NNK、引物r-L309NNK、引物f-L305NNK、引物r-L305NNK、引物f-N346F348NNK、引物r-N346F348NNK、引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK；
S104：以所述重组质粒mPylRS-pBK为模板，以所述引物f-L309NNK和引物r-L309NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L305NNK和引物r-L305NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N346F348NNK和引物r-N346F348NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y384NNK和引物r-Y384NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于NBD-赖氨酸筛选用的甲烷马氏甲烷八叠球菌mPylRS突变库lib-mPylRS-pBK。
4.如权利要求3所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述第二预设比例为1：1：32：1。
5.如权利要求1所述的NBDKRS，其特征在于，所述NBDKRS的突变位点为L305A，L309G，N346C，F348A。
6.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
S201：取预设量的4-氯-7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑(NBD-Cl)，及赖氨酸溶于乙酸乙酯和水的混合液中，并加热到30℃，滴加预设量的表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺，反应2小时，得到NBD-赖氨酸A；
S202：取第三预设量的上述NBD-赖氨酸A；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到NBD-赖氨酸母液C。
7.如权利要求6所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述NBD-赖氨酸母液C的浓度设定为100mM。
8.如权利要求6所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述特定的物质为由NBD-赖氨酸母液C、卡那霉素、四环素和L-阿拉伯糖组成的混合物。
9.如权利要求8所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S6包括如下步骤：
S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；
S602：将所述菌种母液B按照1：100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；
S603：在所述培养液C中，添加NBD-赖氨酸母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL培养7小时，获得培养液D；
S604：取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；
S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；
S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；
S607：将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；
S608：将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的红色荧光抗体。
10.如权利要求9所述的抗乙肝e抗原的红色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4℃。
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