BR112015022641B1 - Construção de dna e processo de preparação de uma proteína-alvo - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO DE DNA, CÉLULA HOSPEDEIRA EUCARIÓTICA, LINHAGEM DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA-ALVO. É proporcionada, inter alia, uma construção de DNA que compreende uma sequência codificante de tRNApyl e uma sequência promotora de RNA polimerase III que é capaz de atuar para expressar tRNApyl funcional suficientemente para suportar supressão sem sentido em um sistema de expressão eucariótico.

Description

Domínio da invenção

[001] Esta invenção refere-se, inter alia, a novas moléculas de ácidos nucleicos, vetores contendo as mesmas, células hospedeiras e linhagens de células hospedeiras eucarióticas transformadas com os referidos vetores e seu uso na produção de proteínas, especialmente produção de proteínas contendo aminoácidos não naturais.

Introdução

[002] Foi observado que um par RS/tRNA ortogonal, que evoluiu naturalmente em um subconjunto de arqueobactérias (bactérias Archaea metanogênicas que catabolizam metilaminas), tem especificidade para o aminoácido pirrolisina. A pirrolisina usa uma 21a aminoacil-tRNA sintetase, que evoluiu naturalmente para ser ortogonal a todos os outros aminoácidos e tRNAs.

[003] A pirrolisina é um aminoácido natural, o único que é autenticamente especificado por um códon âmbar. Blight et al., 2004 mostraram que PylRS e tRNApyl podem incorporar Pirrolisina em códons âmbar em E. coli. Também mostraram que a PyLRS de tipo selvagem é naturalmente promíscua e pode incorporar análogos de lisina.

[004] Yokoyama et al (EP1911840) demonstraram que o sistema PylRS/tRNA é ortogonal em células eucarióticas e mostraram a incorporação de vários nnAAs em proteínas-alvo codificadas por códons âmbar em células bacterianas. Estes autores também identificaram resíduos de aminoácidos-chave em pylRS que formam a bolsa ligante de aminoácidos e atuam na seleção de pirrolisina relativamente a outros aminoácidos canônicos. Mutações neste local geraram mutantes capazes de reconhecer e aminoacilar o tRNApyl com AzZ-lys (Yanagisawa 2008).

[005] Esta ortogonalidade estende-se a bactérias e células eucarióticas.

[006] A PylRS é uma sintetase naturalmente promíscua que evoluiu naturalmente para excluir lisina, mas irá incorporar análogos de lisina sem mutação, incluindo azidas, alquinos e alquenos (Yanagisawa et al, 2008; Neumann et al. 2008; Mukai et al., 2008; Nguyen et al., 2009) . A base desta especificidade depende de interações hidrofóbicas entre resíduos de aminoácidos da bolsa ligante de pylRS com o anel pirrol de pirrolisina que estabiliza e posiciona corretamente o aminoácido no local ativo da sintetase (Kavran et al., 2007). Este par RS/tRNA foi introduzido, via transfecção transitória, em células bacterianas, de levedura e mamífero e verificou-se que é eficaz para incorporação de alguns aminoácidos não naturais em proteínas-alvo.

[007] Por exemplo, EP 1911840 demonstra a incorporação de N- □-boc-Lisina em uma proteína-alvo em células de E. coli.

[008] A expressão de tRNA em células eucarióticas é efetuada por RNA polimerase III ("PolIII"), requerendo um promotor intragênico do tipo 2 que contém uma estrutura bipartida, na qual dois elementos curtos de sequência conservada conhecidos como uma caixa A e uma caixa B estão separados por uma sequência variável. Em contraste com genes de tRNA de mamífero, genes de tRNA procariótico são regulados por elementos promotores extragênicos. Em consequência, muitos tRNAs procarióticos não contêm elementos de caixa A e caixa B que atuem como promotores em células de mamífero. É este o caso de tRNApyl derivado de Methanosarcina.

[009] A introdução de uma sequência codificante de tRNApyl em células de mamífero, juntamente com PylRS, não originou supressão âmbar de uma construção repórter, presumivelmente devido à ausência de elementos de caixa A e B conservados (Mukai, et al., 2008).

[0010] Hancock et al (Hancock et al, 2010. JACS) tentaram reconstruir uma Caixa A e Caixa B funcionais no gene tRNApyl de Methanosarcina barkeri, e não conseguiram demonstrar supressão âmbar funcional dos genes de tRNA mutados em levedura, sugerindo que quaisquer modificações para introduzir elementos de caixa A e B na sequência de tRNA alteram a arquitetura do tRNA, impedindo sua função global. A análise de sequência do tRNApyl de Mm mostra que a caixa B tem homologia significativa com uma caixa B de consenso, mas a caixa A mostra divergência significativa.

[0011] Tentativas de encontrar condições ótimas para expresser tRNAs supressores em células de mamífero datam de 1982 (Hudziak et al, 1982, Laski et al, 1982) no contexto da geração de tRNAs supressores sem sentido para terapia genética de doenças genéticas nas quais um códon de terminação causou terminação precoce da transcrição de uma proteína-chave.

[0012] A quantidade de DNA introduzido em células, o número de cópias do gene de tRNA bem como os elementos promotores que conduzem a sua expressão foram identificados como elementos-chave para alcançar um nível ótimo de tRNA, por exemplo, para permitir atividade eficiente sem causar toxicidade para a célula.

[0013] Foi mostrado que existe expressão de tRNA por processamento de uma construção bicistrônica em células eucarióticas. Um par de genes codificados de modo genômico para tRNAarg - tRNAasp foi descrito em células de levedura (Schmidt et al. 1980). Este gene é expresso como um único RNA precursor que é modificado de modo pós-transcrição para gerar dois tRNAs maduros in vivo e em extratos celulares de oócitos (Schmidt et al. 1980). Neste caso, os genes de tRNA estão separados por uma região espaçadora curta consistindo de CTTTGTTTCT (SEQ ID No. 68). Esta disposição genética também tem sido usada para expressar tRNAs que não são normalmente expressos em levedura (Francis et al 1990). Aqui, o gene tRNAmet humano, que contém elementos de caixa A e B de consenso mas não é transcrito em levedura, foi expresso com êxito em células de levedura quando colocado a jusante de um elemento tRNAarg. Os autores mostram que a distância dois dois genes de RNA afeta a eficiência da transcrição. Foi obtida expressão do tRNA exógeno quando os dois tRNAs foram separados por um espaçador rico em timidina curto de 10 pb presente entre o par de tRNA Arg-Asp de levedura. Também foi observada expressão do gene tRNAmet quando o comprimento da sequência interveniente deste espaçador foi aumentado (até 92 pb), mas com menor eficácia (Francis et al., 1990). Em outro exemplo, Straby (1988) usou o par de genes bicistrônico de tRNA Arg-Asp de levedura para expressar o supressor tRNAsup (tyr) normalmente silencioso quanto à transcrição. Em uma construção, o tRNAsup substituiu o gene tRNAasp e reteve o espaçador rico em timidina curto de 10 pb presente entre o par de tRNA Arg-Asp de levedura e exibiu expressão eficiente de tRNAsup.

[0014] tRNAs também foram expressos sob promotores externos,como o promotor de U6 (Koukuntla et al., 2013 Mukai et al. 2008), promotor de RNA polimerase de T7 (Mukai et al. 2008), SNR52 (Wang e Wang, 2012) e como um componente de uma construção bicistrônica regulada por um gene de tRNA a montante (Hancock et al., 2010; Francis et al., 1990; Straby 1988; Schmidt et al., 1980; Mukai et al. 2008); como multímeros, tal como o tRNAser (Buvoli et al., 2000).

[0015] Uma variedade de promotores extragênicos foi examinada quanto à expressão de tRNApyl por Mukai et al. (ver também US 8,168,407) bem como por Hancock et al. Estes incluíram um tRNA humano, por exemplo, tRNAval ou tRNAarg, como construções bicistrônicas. Enquanto o sistema bicistrônico foi funcional em células de levedura (ver Hancock et al), Mukai et al. (2008) relataram que, em células eucarióticas, colocar o gene tRNApyl a jusante de um gene de tRNA eucariótico (tRNAval) originou expressão subótima de tRNApyl, o que não foi ideal, pois os níveis de expressão foram demasiado baixos para supressão âmbar ótima em células de mamífero.

[0016] Além disso, Mukai et al. (2008) e Hancock et al. (2010) testaram o promotor de CMV dependente de PolII quanto à expressão de tRNApyl bem como o promotor de polimerase de T7 fágico, e o promotor de PolIII/tipo 3 do gene para o pequeno RNA nuclear de U6. Em particular, os autores mostraram que o promotor de U6 ligado à extremidade 5' da sequência codificante para o tRNApyl, foi particularmente eficiente em causar supressão âmbar quando introduzido em células eucarióticas juntamente com a PylRS, um nnAA e um alvo incluindo um códon âmbar.

[0017] Os promotores para o gene de snRNA U6 e H1 foram extensamente usados para a expressão de espécies de RNA em células de mamífero. Estes promotores são particularmente úteis como ferramentas de expressão, dada a sua função como promotores extragênicos. Adicionalmente, permitem expressão muito elevada de genes que são colocados a jusante destes elementos.

[0018] No entanto, foi recentemente mostrado que os promotores de U6 e H1 têm efeitos prejudiciais em células transfectadas com estas construções, conduzindo a citotoxicidade que se crê ocorrer devido às elevadas demandas de transcrição deste promotor (Ehlert, et al., 2010) (Giering, et al., 2008) (Stegmeier, et al., 2005). Adicionalmente, foi mostrado que o promotor de U6 em particular afeta a localização do produto de RNA, conduzindo ao seu acúmulo prevalente no núcleo, desse modo colocando um problema quanto à sua utilização por maquinarias citoplasmáticas (Paul et al., 2003).

[0019] Enquanto o uso de promotores extragênicos descritos acima conduziu à expressão de níveis elevados de tRNApyl, é provável que a maior parte do tRNA expresso esteja mal localizada no compartimento nuclear e indisponível para aminoacilação no citosol. Apesar de ter sido observada supressão âmbar eficiente, é possível que tal se tenha devido à proporção relativamente pequena de tRNA que escapou do núcleo.

[0020] Assim, é desejável planejar um promotor de tRNA alternative para permitir uma melhor localização do tRNA e sua disponibilidade para a maquinaria de tradução.

[0021] Também é desejável planejar um promotor de tRNA que obvie os efeitos tóxicos celulares que foram relatados para promotores externos, tais como os elementos promotores de U6 e H1 que podem contribuir para níveis baixos de expressão de proteínas e perda de viabilidade celular em linhagens de células que expressam de modo estável as referidas construções de tRNA.

[0022] A maquinaria da transcrição da RNA polimerase III (por vezes designada aqui "pol III") é dedicada à produção de RNAs não codificantes de proteínas (ncRNA) de pequena dimensão em eucariotas (revisto por Dieci et al. 2013).

[0023] Genes transcritos com Pol III são ligados e ativados por fatores de transcrição que são seletivamente reconhecidos por esta polimerase. Estes fatores atuam em algumas combinações diferentes, como especificado pelas arquiteturas dos promotores correspondentemente diferentes. Estes foram classificados em três classes gerais: Promotores do tipo 1 (como o usado por 5S rRNA) contêm elementos intragênicos (promotores estão presentes dentro da sequência codificante do gene) e consistem de uma região de controle interna que é subdividida em uma caixa A, uma caixa C e um elemento intermédio (IE). Estes elementos são necessários para a transcrição, pois são ligados pelos fatores de transcrição basais TFIIIC e TFIIIA. Promotores do tipo 2 são usados por genes de tRNA e contêm promotores intragênicos que consistem de elementos conservados conhecidos como caixa A e caixa B. Estes são os locais ligantes para o fator de transcrição TFIIIC, que por sua vez recruta o fator de iniciação TFIIIB em uma região a montante que se estende até à posição -40 relativamente ao local de início da transcrição. Promotores do tipo 3 são promotores extragênicos localizados a montante e consistem de elementos de sequências distais e próximos e uma caixa TATA. Os promotores para o snRNA de U6 e RNA de RNase P (H1) são membros desta classe de promotores. Estes promotores são unicamente reconhecidos pelo fator de transcrição SNAPc (PBP ou PTF), que por sua vez recruta uma variante específica de TFIIIB. É interessante notar que promotores de PolIII/Tipo3 foram adaptados para a expressão de RNA inibitório e a expressão de tRNA desprovido de elementos de caixa A e B em células eucarióticas, por exemplo, promotores de U6 em células de mamífero (Mukai, et al., 2008) e o promotor de SNR52 usado em levedura (Wang e Wang, 2012).

[0024] A expressão de vários genes de ncRNA é regulada por elementos promotores colocados a montante da região transcrita, de modo similar a promotores do Tipo 3, em combinação com promotores intragênicos, por exemplo, Caixa A e Caixa B usados por genes de tRNA. Estes podem ser considerados promotores híbridos - denominados promotores do "Tipo 4" devido à presença de elementos de controle extragênicos e intragênicos. Genes regulados por estes promotores incluem o gene de RNA 7SL (SRP), gene de RNA Vault, e o pequeno RNA codificado pelo vírus Epstein Barr (EBER).

[0025] RNA 7SL é o componente de RNA da partícula de reconhecimento de sinal (SRP) que medeia a inserção cotradução de proteínas secretoras no lúmen do retículo endoplasmático. Seus elementos promotores foram caracterizados, inter alia, em Englert et al., 2004.

[0026] RNAs Vault são pequenos RNAs contidos em grandes partículas de ribonucleoproteínas citoplasmáticas envolvidas na montagem e transporte macromoleculares. Seus elementos promotores foram caracterizados, inter alia, em Mossink et al., 2002.

[0027] O gene EBER é um pequeno RNA de função desconhecida. EBER é codificado pelo genoma do vírus Epstein-Barr que é eficientemente expresso em células de mamífero e seus elementos promotores reguladores foram bem caracterizados (Howe e Shu, Cell 1989). EBER tem duas variantes conhecidas - EBER1 e EBER2, EBER2 sendo expresso em níveis mais elevados.

Sumário da Invenção

[0028] Os inventores planejaram novas construções de DNA para a expressão dos genes tRNApyl em células eucarióticas, especialmente células de mamífero, sob sistemas promotores novos e aperfeiçoados.

[0029] A sequência do gene tRNApyl possui duas regiões internas que se assemelham a uma caixa A e caixa B eucarióticas, em que a região do tipo caixa B se assemelha mais de perto a uma caixa B funcional.

[0030] Apesar de tentativas anteriores para reconstituir uma Caixa A e Caixa B de consenso não terem sido bem sucedidas, como relatado em Hancock et al (2010) e Mukai et al. (US 8,168,407), os inventores descobriram agora surpreendentemente que a sequência de tRNApyl pode ser alterada para permitir um promotor intragênico funcional e obter um tRNApyl capaz de mediar supressão âmbar eficiente em combinação com pylRS TS.

[0031] Tal novo gene tRNApyl pode ser usado para gerar linhagens de células altamente ativas e estáveis para a incorporação de nnAAs em células.

[0032] Os inventores também descobriram que o novo gene tRNApyl modificado contendo um elemento promotor intragênico funcional pode ser adicionalmente melhorado colocando-o a jusante dos elementos reguladores 5' de genes expressos sob promotores do tipo 4, desse modo reconstituindo um elemento promotor do tipo 4 funcional contendo elementos extragênicos e intragênicos.

[0033] Os inventores também descobriram surpreendentemente que o gene tRNApyl TS pode ser expresso sob o controle da transcrição de um gene tRNAglu e/ou um gene tRNAasp, quando o referido gene tRNAglu e/ou gene tRNAasp é colocado a montante do gene tRNApyl e alterado para ficar desprovido da sequência de terminação da transcrição para formar eficazmente uma mensagem bicistrônica.

[0034] Foi mostrado que construções de DNA contendo repetições em série de novos genes tRNApyl da invenção conduzem a supressão âmbar acrescida.

Breve Descrição das Figuras:

[0035] Figura 1. Construções de DNA da invenção (SEQ ID Nos: 69 — 71)

[0036] Figura 2. Regiões de caixas A e B putativas de tRNApyl de tipo selvagem de Methanosarcina mazei (SEQ ID No: 3).

[0037] Figura 3. Alinhamento de sequências entre genes tRNApyl de M. mazei e M. barkeri TS e mutantes (SEQ ID Nos: 72, 3, 73, & 74, respectivamente)

[0038] Figura 4. Mutantes de tRNA retêm a função quando expressos pelo promotor de H1, demonstrado por expressão de GFP dependente de supressão âmbar.

[0039] Figura 5. Expressão tRNA funcional mostrada por uso de tRNApyl mutante compreendendo um promotor de polIII intragênico, demonstrado por expressão de GFP dependente de supressão âmbar acrescida.

[0040] Figura 6. Mutantes de tRNA são funcionais e retêm a ortogonalidade em células de mamífero.

[0041] Figura 7. O aumento da dose de genes, por aumento do número de genes na mesma construção, origina expressão de GFP dependente de supressão âmbar acrescida.

[0042] Figura 8. Elementos promotores 5' do tipo 4 permitem expressão de um tRNA contendo uma caixa B funcional, determinado por expressão de GFP dependente de supressão âmbar.

[0043] Figura 9. Elementos promotores 5' do tipo 4 e o mutante de tRNA B isoladamente permitem níveis mais elevados de função de tRNA do que o tRNA de tipo selvagem.

[0044] Figura 10. O aumento da dose de genes, por aumento do número de genes na mesma construção, origina expressão de GFP dependente de supressão âmbar acrescida.

[0045] Figura 11. Expressão de tRNApyl conduzida por genes tRNAglu e tRNAasp a montante. Descrição breve da listagem de sequências: SEQ ID No 1: tRNApyl de Methanosarcina barkeri, TS SEQ ID No 2: tRNApyl de Methanosarcina acetivorans, TS SEQ ID No 3: tRNApyl de Methanosarcina mazei, TS SEQ ID No 4: tRNApyl de Methanococcoides burtonii, TS SEQ ID No 5: tRNApyl de Desulfobacterium hafniense, TS SEQ ID No 6: Sequência terminadora usada para construções de tRNApyl de caixa A e/ou caixa B TS e mutantes SEQ ID No 7: tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A10G, tRNA- A1 SEQ ID No 8: tRNApyl de Methanosarcina mazei mutações A10G, A52C, tRNA-AB SEQ ID No 9: tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A52C, tRNA- B SEQ ID No 10: tRNApyl de Methanosarcina mazei mutações A10G, T14A, A52C, tRNA-A2B SEQ ID No 11 tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A10G, T14A, tRNA-A2 SEQ ID No 12: Sequência da região 5' do promotor de 7SL SEQ ID No 13: Espaçador usado em construções de 7SL SEQ ID No 14: Construção de tRNA de 7SL-TS SEQ ID No 15: Construção de tRNA de 7SL-B SEQ ID No 16: Construção de tRNA de 7SL-A1 SEQ ID No 17: Construção de tRNA de 7SL-AB SEQ ID No 18: Construção de tRNA de 7SL-A2B SEQ ID No 19: Sequência terminadora usada nas construções 7SL, Vault, EBER SEQ ID No 20: Sequência da região 5' do promotor de Vault SEQ ID No 21: Espaçador usado para construções Vault SEQ ID No 22: Construções de tRNA de Vault-TS SEQ ID No 23: Construção de tRNA de Vault-B SEQ ID No 24: Construção de tRNA de Vault-AB SEQ ID No 25; Construção de tRNA de Vault-A2B SEQ ID No 26: Sequência da região 5' do promotor de EBER2 SEQ ID No 27: Espaçador usado em construções EBER SEQ ID No 28: Construções de tRNA de EBER2-TS SEQ ID No 29: Construção de tRNA de EBER2-B SEQ ID No 30: Construção de tRNA de EBER2-A1 SEQ ID No 31: Construção de tRNA de EBER2-AB SEQ ID No 32: Construção de tRNA de EBER2-A2B SEQ ID No 33: Sequência do promotor de H1 SEQ ID No 34: Construção de tRNA de H1-TS SEQ ID No 35: Construção de tRNA de H1-B SEQ ID No 36: Construção de tRNA de H1-A1 SEQ ID No 37: Construção de tRNA de H1-A2 SEQ ID No 38: Construção de tRNA de H1-A2B SEQ ID No 39: Sequência terminadora usada nas construções H1- tRNA: SEQ ID No 40: Sequência codificante de tRNAglu de M. Musculus SEQ ID No 41: Sequência codificante de tRNAglu de M. Musculus com regiões a montante e a jusante SEQ ID No 42: Construção de DNA tRNAglu-tRNApyl SEQ ID No 43: 3x tRNAglu-tRNApyl: Construção de DNA incluindo 3 repetições da construção bicistrônica. SEQ ID No 44: Sequência líder para as construções tRNAglu-pyl SEQ ID No 45: Sequência terminadora usada nas construções tRNAglu- pyl SEQ ID No 46: Sequência terminadora usada nas construções tRNAglu- pyl SEQ ID No 47: Sequência intergênica usada nas construções tRNAglu- pyl SEQ ID No 48: Sequência codificante de tRNAasp de M. Musculus SEQ ID No 49: Sequência codificante de tRNAasp de M. Musculus com regiões a montante e a jusante SEQ ID No 50: Construção de DNA de tRNAasp-pyl SEQ ID No 51: 2x tRNAasp-pyl: Construção de DNA incluindo 2 repetições da construção bicistrônica. SEQ ID No 52: Sequência líder usada na construção tRNAasp-pyl SEQ ID No 53: Sequência terminadora usada na construção tRNAasp- pyl SEQ ID No 54: Sequência intergênica usada nas construções tRNAasp- pyl SEQ ID No 55: Sequência codificante de tRNAglu humano SEQ ID No 56: Sequência codificante de tRNAasp humano SEQ ID No 57: Variante do promotor de 7SL: 7SL-1 SEQ ID No 58: Variante do promotor de 7SL: 7SL-2 SEQ ID No 59: Variante do promotor de 7SL: SL28 SEQ ID No 60: Variante do promotor de 7SL: 7L63 SEQ ID No 61: Variante do promotor de 7SL: 7L23 SEQ ID No 62: Variante do promotor de 7SL: 7L7 SEQ ID No 63: Variante do promotor de EBER: EBER1 SEQ ID No 64: Variante do promotor de Vault: Hvg3 SEQ ID No 65: Variante do promotor de Vault: Hvg2 SEQ ID No 66: Sequência de aminoácidos de pylRS de Methanosarcina mazei SEQ ID No 67: Sequência de nucleotídeos de pylRS de Methanosarcina mazei SEQ ID No 68: Região espaçadora curta SEQ ID No 69: Uma construção de DNA apresentada na Figura 1 SEQ ID No 70: Uma construção de DNA apresentada na Figura 1 SEQ ID No 71: Uma construção de DNA apresentada na Figura 1 SEQ ID No 72: Uma sequência de DNA apresentada na Figura 3 SEQ ID No 73: Uma sequência de DNA apresentada na Figura 3 SEQ ID No 74: Uma sequência de DNA apresentada na Figura 3 SEQ ID No 75: Elemento de sequência próximo do promotor de Vault SEQ ID No 76: Local ligante de SP1 do promotor de EBER SEQ ID No 77: Sequência ligante de ATF do promotor de EBER

Modalidades da invenção

[0046] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionada uma construção de DNA que compreende uma sequência codificante de tRNApyl e uma sequência promotora de RNA polimerase III que é capaz de atuar para expressar tRNAPyl funcional suficientemente para suportar supressão sem sentido (particularmente supressão âmbar) em um sistema de expressão eucariótico.

[0047] Adequadamente, a sequência codificante de tRNApyl da invenção está desprovida dos três nucleotídeos finais, CCA, que são adicionados de modo pós-transcrição em células eucarióticas.

[0048] Adequadamente, a construção de DNA da invenção compreende uma sequência terminadora que está a jusante da sequência codificante de tRNApyl. Adequadamente, uma sequência terminadora consiste de uma série de 4 ou mais nucleotídeos timidina a 3' da sequência codificante de tRNA que atua como sinal de terminação da transcrição.

[0049] Sequências terminadoras preferenciais da invenção são identificadas como SEQ ID Nos 6, 19, 39, 45,46 e 53, especialmente, SEQ ID No. 6.

[0050] Em uma modalidade, uma construção de DNA da invenção compreende 2 até 60 repetições de um gene tRNApyl. Preferencialmente, a construção de DNA compreende 2 até 30 repetições, mais preferencialmente 8 repetições.

[0051] Adequadamente, a construção de DNA da invenção compreende um gene tRNApyl compreendendo a sequência codificante de tRNApyl e um promotor de RNA polimerase III intragênico funcional. O referido promotor de RNA polimerase III intragênico compreende dois componentes - uma caixa A e uma caixa B.

[0052] Adequadamente, a invenção proporciona uma construção de DNA em que o gene tRNApyl contém mutações em 1 ou 2 posições de nucleotídeos na caixa A e/ou na caixa B do promotor de RNA polimerase III intragênico.

[0053] Por exemplo, a invenção proporciona uma construção de DNA em que o gene tRNApyl contém mutações em 1 ou 2 (por exemplo, 1) posições de nucleotídeos na caixa B.

[0054] Em uma modalidade da invenção, a construção de DNA compreende um gene tRNApyl compreendendo um promotor de PolIII intragênico, por exemplo, como apresentado na Figura 1D, que é capaz de atuar para expressar tRNAPyl funcional suficientemente para suportar supressão sem sentido em um sistema de expressão eucariótico.

[0055] Em uma modalidade preferencial da invenção, é proporcionada uma construção de DNA em que o gene tRNApyl tem ou compreende uma sequência selecionada das SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 e 11 derivadas de Methanosarcina mazei (especialmente SEQ ID Nos 9 ou 10) ou tem ou compreende a sequência de um gene tRNApyl análogo derivada de outra espécie bacteriana em que as mutações indicadas a negrito nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11 (especialmente SEQ ID Nos 9 ou 10) são efetuadas em posições equivalentes.

[0056] A determinação de posições equivalentes pode ser efetuada por programas de alinhamento convencionais, por exemplo, usando BLASTN.

[0057] Construções de DNA particularmente preferenciais da presente invenção compreendem um gene tRNApyl das SEQ ID Nos 9 ou 10, e uma sequência terminadora a jusante da sequência codificante de tRNApyl, cuja sequência terminadora é a SEQ ID No 6.

[0058] Em uma modalidade adicional, preferencial, a invenção proporciona uma construção de DNA compreendendo múltiplas cópias do gene tRNApyl compreendendo um promotor de RNA polimerase III intragênico. Preferencialmente, a construção de DNA compreende 2 até 30 cópias, mais preferencialmente 8 cópias do gene tRNApyl compreendendo um promotor de RNA polimerase III intragênico.

[0059] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma construção de DNA em que a sequência codificante de tRNApyl é operavelmente ligada a um promotor de RNA polimerase III em que o referido promotor é colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl.

[0060] Adequadamente, o promotor 5' e a sequência codificante de tRNApyl estão separados por uma sequência espaçadora contendo um local de início da transcrição.

[0061] Preferencialmente, a sequência espaçadora contém um local de início da transcrição e 4 até 6 nucleotídeos desde a extremidade da sequência promotora até ao início da sequência codificante de tRNA. Sequências espaçadoras preferenciais a serem usadas na presente invenção estão listadas como SEQ ID NOs 13, 21 e 27.

[0062] Adequadamente, uma construção de DNA compreende um elemento promotor intragênico e um elemento promotor 5' é um elemento promotor de RNA polimerase III colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl de modo que a combinação do referido elemento promotor intragênico e referido elemento promotor 5' constitui um promotor híbrido, por exemplo, como apresentado na Figura 1C.

[0063] Adequadamente, o referido elemento promotor 5' é o elemento 5' de um promotor de RNA polimerase III do Tipo T4. Assim, tipicamente compreende um elemento promotor a montante típico da classe de promotores de pol III/tipo 3, por exemplo, compreende uma caixa TATA (como uma usada em um promotor de U6 ou H1). Adequadamente, o referido elemento promotor intragênico compreende um elemento típico dos promotores de polIII/tipo 2, por exemplo, uma caixa A e B (por exemplo, como usado em promotores de tRNA eucariótico).

[0064] Será entendido que "um elemento" não está restringido a uma única sequência de nucleotídeos e pode considerar-se que inclui mais do que uma sequência de nucleotídeos. Assim, por exemplo, uma caixa A e B em conjunto podem representar "um elemento promotor intragênico". A caixa A e B podem ser consideradas componentes separados do elemento promotor intragênico.

[0065] Preferencialmente, o elemento promotor 5' de promotores de RNA Polimerase III do Tipo 4 é selecionado de elementos promotores 5' do promotor do gene de RNA EBER, do promotor do gene de RNA 7SL e do promotor do gene de RNA Vault, particularmente o promotor do gene de RNA 7SL.

[0066] O promotor do gene de RNA EBER pode ser, por exemplo, a variante de EBER EBER1 ou EBER2, especialmente EBER2.

[0067] O promotor do gene de RNA 7SL pode ser, por exemplo, a variante 7SL-1, 7SL-2, SL28, 7L63, 7L23 ou 7L7.

[0068] O promotor do gene de RNA Vault pode ser, por exemplo, a variante Hvg2 ou Hvg3.

[0069] Preferencialmente, o referido elemento promotor 5' é selecionado das SEQ ID Nos 12, 20, 26, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 e 65.

[0070] Adequadamente, o elemento promotor 5' e a sequência codificante de tRNApyl estão separados por uma sequência espaçadora contendo um local de início da transcrição. Adequadamente, a sequência espaçadora contém um local de início da transcrição e 4 a 6 nucleotídeos desde a extremidade da sequência promotora até ao início da sequência codificante de tRNA. Sequências espaçadoras preferenciais a serem usadas na presente invenção estão listadas como SEQ ID NOs 13, 21 e 27.

[0071] Preferencialmente, os promotores de RNA polimerase III do Tipo 4 são promotores de genes eucarióticos, mais preferencialmente genes de mamífero, mais preferencialmente, genes humanos.

[0072] Elementos promotores 5' particularmente preferenciais são selecionados das SEQ ID Nos 12, 20 e 26.

[0073] Em uma modalidade preferencial da invenção, é proporcionada uma construção de DNA que é capaz de atuar para expressar tRNAPyl funcional suficientemente para suportar supressão sem sentido em um sistema de expressão eucariótico compreendendo um gene tRNApyl compreendendo uma sequência codificante de tRNApyl que contém mutações em 1 ou 2 posições de nucleotídeos na caixa A e/ou caixa B putativa de um elemento promotor intragênico que é operavelmente ligado a um elemento promotor 5' que é um promotor de RNA polimerase III colocado a 5' do gene tRNApyl, e em que a combinação do referido elemento promotor intragênico e referido elemento promotor 5' constitui um promotor híbrido.

[0074] Uma construção de DNA particularmente preferencial no contexto da presente invenção compreende um gene tRNApyl compreendendo uma sequência codificante do gene tRNApyl e um elemento promotor intragênico, em que o referido gene tem ou compreende uma sequência selecionada das SEQ ID No 7, 8, 9, 10 e 11, derivada de Methanosarcina mazei, ou tem ou compreende a sequência de um gene tRNApyl análogo derivada de outra espécie bacteriana em que as mutações indicadas a negrito nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 e 11 são efetuadas em posições equivalentes, que é capaz de atuar para expressar tRNAPyl funcional suficientemente para suportar supressão sem sentido em um sistema de expressão eucariótico, em que a sequência codificante de tRNApyl é operavelmente ligada a um elemento promotor 5' que é um elemento promotor de RNA polimerase III que é colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl, separado por uma sequência espaçadora e em que a combinação do referido elemento promotor 5' e promotor intragênico constitui um promotor híbrido.

[0075] Assim, construções de DNA preferenciais da invenção são selecionadas das SEQ ID NOs 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 31 e 32, particularmente SEQ ID 15, 16, 17, 18, 23, 25 e 29, especialmente SEQ ID Nos 15, 18 e 23.

[0076] Um aspecto da invenção proporciona uma construção de DNA multimérica compreendendo múltiplas cópias (por exemplo, 2 até 60 cópias, por exemplo, 2 até 30 cópias, por exemplo, 8 cópias) de qualquer uma das construções de DNA acima mencionadas.Construções de DNA particularmente preferenciais da invenção compreendem 8 cópias do gene tRNApyl selecionado das SEQ ID NOs 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 31 e 32.

[0077] Os genes tRNApyl mais preferenciais repetidos múltiplas vezes em construções de DNA da presente invenção são selecionados das SEQ ID Nos 15, 18 e 23.

[0078] Em uma modalidade alternativa, a invenção proporciona uma construção de DNA em que um gene tRNApyl é operavelmente ligado a um gene de tRNA eucariótico que compreende um promotor de RNA polimerase III do tipo 2 e expresso como uma mensagem bicistrônica, por exemplo, como apresentado na Figura 1A.

[0079] Adequadamente, o gene de tRNA eucariótico está desprovido da sequência terminadora 3', desse modo permitindo a ocorrência de expressão do gene tRNApyl sob o controle do promotor de RNA polimerase III do tipo 2 eucariótico.

[0080] Preferencialmente, o gene de tRNA eucariótico operavelmente ligado ao tRNApyl é tRNAglu ou tRNAasp que conduzem a um nível elevado de expressão do tRNApyl.

[0081] Mais preferencialmente, o gene de tRNA eucariótico operavelmente ligado ao gene tRNApyl é um tRNAglu ou um tRNAasp de mamífero, mais preferencialmente murino ou humano.

[0082] Assim, a invenção proporciona uma construção de DNA que compreende um gene tRNAglu eucariótico ou um gene tRNAasp eucariótico a 5' de um gene tRNApyl, em que o referido gene tRNAglu ou gene tRNAasp está desprovido de uma sequência de terminação, desse modo conduzindo a uma mensagem bicistrônica por transcrição.

[0083] O gene tRNApyl pode ser um gene de tipo selvagem. Alternativamente, o gene tRNApyl pode conter mutações em 1 ou 2 posições de nucleotídeos na caixa A e/ou na caixa B, por exemplo, como descrito acima.

[0084] Adequadamente, o primeiro tRNA é separado do Segundo tRNA por uma sequência espaçadora consistindo de uma sequência desprovida de nucleotídeos timidina que constituem um sinal de terminação da transcrição.

[0085] Sequências espaçadoras preferenciais são definidas nas SEQ ID Nos 47 e 54.

[0086] Preferencialmente, o gene de tRNA eucariótico operavelmente ligado ao gene tRNApyl é um tRNAglu ou um tRNAasp de mamífero da SEQ ID No 41, 49, 55 ou 56; mais preferencialmente, um tRNAglu ou tRNAasp murino da SEQ ID No 41 ou 49.

[0087] Em uma modalidade, um gene tRNAglu ou tRNAasp murino é usado para expressão do gene tRNApyl em linhagens de células murinas. Em uma modalidade, um gene tRNAglu ou tRNAasp humano é usado para expressão do gene tRNApyl em linhagens de células murinas.

[0088] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, é proporcionada uma construção de DNA em que o gene tRNApyl é expresso como uma mensagem bicistrônica da SEQ ID No 42 ou SEQ ID No 50.

[0089] Em uma modalidade adicional, o primeiro tRNA é precedido de uma sequência líder 5' que pode conter elementos de sequência tais como uma caixa TATA, um local de início da transcrição (TSS), e sequências que regulam o processamento pós-transcrição do pré-tRNA para gerar um tRNA maduro.

[0090] A sequência líder pode ser selecionada de regiões não traduzidas a montante da sequência codificante de qualquer tRNA de mamífero que seja transcrito. Preferencialmente, a sequência líder é selecionada das SEQ ID Nos 44 e 52. Alternativamente, a sequência líder está compreendida na região genômica não traduzida a 5' do primeiro tRNA.

[0091] Construções particularmente preferenciais de acordo com a presente invenção compreendem múltiplas cópias (por exemplo, 2-20 cópias) da unidade de transcrição bicistrônica das SEQ ID Nos 42 ou 50. Assim, construções de DNA preferenciais da presente invenção compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 cópias da unidade de transcrição das SEQ ID Nos 42 ou 50. Construções de DNA muito preferenciais de acordo com a presente invenção são a SEQ ID No 43, representando 3 cópias da unidade de transcrição bicistrônica de tRNAglu-pyl da SEQ ID No 42, e SEQ ID No 51, representando 2 cópias da unidade bicistrônica de tRNAasp-pyl da SEQ ID No 50.

[0092] Como um aspecto da invenção, qualquer uma das construções de DNA acima mencionadas podem compreender uma sequência codificante ou gene PylRS.

[0093] De acordo com um aspecto da invenção é proporcionada uma célula hospedeira eucariótica que é transformada com um vetor compreendendo uma construção de DNA acima mencionada.

[0094] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é proporcionada uma linhagem de células eucarióticas que expressa ou é capaz de expressar PylRS e tRNApyl, em que tRNApyl é introduzido nas células com construções de DNA da invenção e que atua na referida linhagem de células eucarióticas.

[0095] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é proporcionado um sistema de expressão desprovido de células em que um lisado da reação de síntese obtido de uma célula hospedeira compreende pelo menos um componente requerido para a síntese de polipeptídeos.

[0096] Adequadamente, o lisado da reação de síntese é obtido de células bacterianas ou eucarióticas. Preferencialmente, o lisado da reação de síntese é obtido de células eucarióticas, mais preferencialmente, de reticulócitos de coelho ou gérmen de trigo.

[0097] Preferencialmente, o sistema de expressão desprovido de células é capaz de expressar PylRS e tRNApyl TS da presente invenção, em que tRNApyl é introduzido nas células usadas para obter o lisado da reação de síntese com construções de DNA da invenção.

[0098] Sistemas de expressão desprovidos de células adequados para uso na presente invenção são descritos, por exemplo, em WO201008110, WO2010081111, WO2010083148, incorporados na sua totalidade aqui a título de referência.

[0099] Uma célula hospedeira eucariótica de acordo com a invenção pode ser transformada com um vetor compreendendo um gene codificando uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais codificados por um códon sem sentido.

[00100] Em uma modalidade, uma linhagem de células eucarióticas expressa ou é capaz de expressar PylRS funcional e tRNApyl funcional, em que a expressão de tRNApyl funcional ocorre sob o controle de um elemento promotor intragênico e em que um elemento promotor 5' é um elemento promotor de RNA polimerase III colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl de modo que a combinação do referido elemento promotor intragênico e referido elemento promotor 5' constitui um promotor híbrido suficientemente para suportar supressão sem sentido.

[00101] Adequadamente, a supressão sem sentido é supressão âmbar.

[00102] Adequadamente, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.

[00103] Em um quarto aspecto, a invenção proporciona um processo de preparação de uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais codificados por um códon sem sentido, que compreende expressar a referida proteína-alvo em uma linhagem de células eucarióticas que é transformada com um gene codificando uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais codificados por um códon sem sentido e que também é transformada com genes codificando PylRS e tRNApyl, de modo que PylRS e tRNApyl são expressos e atuam na referida linhagem de células eucarióticas suficientemente para suportar supressão sem sentido.

[00104] Adequadamente, a linhagem de células é transformada com uma construção de DNA de acordo com outros aspectos da invenção descritos aqui.

[00105] Assim, o códon sem sentido usado nas modalidades da invenção pode ser um códon âmbar, um códon opala, ou um códon ocre. Um códon sem sentido particularmente preferencial é um códon âmbar.

[00106] A invenção proporciona um processo de preparação de uma proteína-alvo quimicamente modificada que compreende preparar uma proteína-alvo de acordo com um aspecto acima da invenção e modificar quimicamente a proteína-alvo resultante. A proteína pode ser quimicamente modificada via uma cadeia lateral presente em um aminoácido não natural.

[00107] Assim, os aminoácidos não naturais usados em modalidades da presente invenção, ou pelo menos um deles, podem compreender uma fração alquino ou azida. Estas frações estão bem adaptadas a modificação química, por exemplo, via a reação de Huisgen conducente à geração de uma fração ligadora triazol.

[00108] Em um quinto aspecto da presente invenção, é proporcionado um conjugado proteico, como um conjugado de anticorpo, preparado usando um processo de acordo com processos da presente invenção, em que a proteína, tal como um anticorpo, é conjugada a uma ou mais frações diferentes selecionadas de frações proteína, fármaco e PEG via ligadores compreendendo uma fração triazol.

[00109] Em um sexto aspecto, a presente invenção proporciona um processo para aumentar a viabilidade de uma linhagem de células eucarióticas transformada de modo estável para expressar PylRS e tRNApyl, que compreende transformar a linhagem de células eucarióticas com um gene tRNApyl que é introduzido nas células com construções de DNA da invenção e que atua na referida linhagem de células eucarióticas para expressar uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais.

[00110] Em um sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um processo para aumentar a viabilidade de uma linhagem de células eucarióticas transformada de modo estável para expressar uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais e para expressar PylRS e tRNApyl, que compreende transformar a linhagem de células eucarióticas com genes codificando PylRS e tRNApyl de modo que PylRS e tRNApyl são expressos e atuam suficientemente para suportar supressão sem sentido.

Definições e abreviaturas:

[00111] Como usado aqui, "gene" significa uma região localizável de uma sequência genômica, correspondente a uma unidade de hereditariedade, que está associada a regiões reguladoras, regiões transcritas, e ou outras regiões de sequências funcionais. Assim, um gene incluirá uma sequência codificante (por exemplo, uma sequência codificante para um RNA, como um tRNA) juntamente com regiões reguladoras incluindo elementos promotores.

[00112] Como usado aqui, "promotor intragênico" significa um promotor contido na sequência do gene.

[00113] Como usado aqui, uma "região transcrita" inclui uma sequência codificante, isto é, uma sequência que faz parte do produto de RNA maduro, e porções do transcrito primário que são removidas e, assim, não aparecem no RNA maduro, como a porção líder 5' de precursores de tRNA.

[00114] Como usado aqui, "elemento promotor" significa um elemento de um promotor, especialmente de um promotor híbrido que pode ter alguns elementos (por exemplo, um elemento promotor intragênico e um elemento promotor 5'). Como usado aqui, "promotor de RNA polimerase III do Tipo 4" significa um promotor de RNA polimerase III tendo um elemento ou elementos promotores a montante (por exemplo, típico da classe de tipo 3 de promotores de RNA polimerase III, por exemplo, uma caixa TATA usada em promotores de U6 ou H1) e um elemento ou elementos promotores intragênicos (por exemplo, típico da classe de tipo 2 de promotores de RNA polimerase III, por exemplo, uma caixa A e B, por exemplo, como usado em promotores de tRNA).

[00115] Como usado aqui, uma caixa TATA é uma sequência de DNA tipicamente contendo a sequência TATAAA ou uma variante respectiva presente na região promotora de certos genes, localizada a montante do local de início da transcrição.Como usado aqui, um "códon sem sentido" significa um códon âmbar, ocre ou opala. Como usado aqui "supressão sem sentido" significa supressão de terminação de cadeia por um códon sem sentido.

[00116] Como usado aqui, "nnAA" ou "aminoácido não natural" significa um aminoácido que é adequado para incorporação em proteínas e que não é um dos 20 aminoácidos naturalmente codificados pelo código genético, Pirrolisina e Selenocisteína.

[00117] Como usado aqui, "TS" significa de tipo selvagem, isto é, uma forma naturalmente obtida na natureza.

[00118] Como usado aqui, "RS" é uma abreviatura de "tRNA sintase".

[00119] Como usado aqui, "TSS" é uma abreviatura de "local de início da transcrição".

[00120] Como usado aqui, "CPE" é uma abreviatura de "elemento de resposta de AMP cíclico".

[00121] Como usado aqui, "PSE" é uma abreviatura de "elemento de sequência próximo".

[00122] Como usado aqui, "CHO" é uma abreviatura de "ovário de hamster chinês".

[00123] Como usado aqui, uma "sequência codificante" é a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica o produto genético (tRNA, RS, etc.) e não inclui sequências não codificantes, tais como sequências reguladoras.

[00124] Como usado aqui, pode haver sequências transcritas que fazem parte do transcrito primário, mas não do RNA maduro, e são consequentemente consideradas "não codificantes".

[00125] Como usado aqui, uma "construção de DNA" significa um segmento construído artificialmente de ácido nucleico a ser introduzido em um sistema de expressão. Uma construção de DNA inclui tipicamente um cassete de expressão e também pode conter nucleotídeos pertencentes ao sistema vetorial usado para introduzir o ácido nucleico no sistema de expressão.

[00126] Como usado aqui, um "cassete de expressão" significa um segmento construído artificialmente de ácido nucleico a ser introduzido em um sistema de expressão que compreende uma ou mais sequências codificantes de genes, tais como sequências codificantes de cDNA ou RNA, juntamente com quaisquer regiões reguladoras necessárias para expressão ótima. Um cassete de expressão não contém nucleotídeos pertencentes ao sistema vetorial.

[00127] Como usado aqui, um transcrito "bicistrônico" é um transcrito com o potencial de codificar dois produtos finais.

Descrição detalhada tRNApyl a ser expresso em linhagens de células de acordo com a invenção

[00128] O tRNApyl a ser expresso em combinação com a PylRS da presente invenção tem um anticódon e uma estrutura terciária que são complementares ao códon sem sentido âmbar UAG, para atuar como um tRNA supressor.

[00129] Pode ser construído um tRNA artificial que é complementar a outros códons sem sentido, tais como códons UGA, opala; UAA, ocres, para atuar como um tRNA supressor.

[00130] Assim, será entendido que, apesar de a presente invenção ser substancialmente descrita e exemplificada com referência ao uso do códon âmbar para codificar os nnAA e com a discussão do conceito de supressão âmbar, o códon âmbar pode ser substituído por outro códon sem sentido, como os códons opala ou ocre, e é esperado que funcione do mesmo modo.No entanto, o uso do códon âmbar é preferencial.

[00131] Preferencialmente, o tRNApyl da presente invenção é um tRNApyl derivado de uma das seguintes estirpes bacterianas: Methanosarcina mazei (SEQ ID No 3), Methanosarcina barkeri (SEQ ID No 1), Desulfitobacterium hafniense (SEQ ID No 5), Methanosarcina acetivorans (SEQ ID No 2), Methanosarcina burtonii (SEQ ID No 4), ou Methanosarcina thermophila.

[00132] Mais preferencialmente, o tRNApyl da presente invenção é um tRNApyl derivado de Methanosarcina mazei (SEQ ID No 3).

[00133] Adequadamente, o tRNApyl usado em aspectos da presente invenção não é um tRNApyl derivado de Methanosarcina barkeri (SEQ ID No 1).

[00134] A manipulação de sequências de tRNApyl para otimizar a expressão em linhagens de células eucarióticas foi descrita em WO2007099854, WO12038706, e Hancock et al (2010) incorporados aqui a título de referência.

[00135] WO2007099854 proporciona, inter alia, construções de DNA compreendendo uma sequência codificante de tRNA que deriva de Arqueobactérias, preferencialmente tRNApyl, uma sequência terminadora da transcrição colocada a 3' do referido gene de tRNA, uma sequência promotora que induz transcrição por RNA Polimerase II ou III, como o promotor de snRNA de U1 ou promotor de snRNA de U6 colocado a 5' da referida sequência codificante de tRNApyl.

[00136] WO12038706 proporciona, inter alia, construções de DNA compreendendo tRNApyl de Methanosarcina barkeri operavelmente ligado a um promotor de RNA polimerase III, em particular ligado ao promotor de RNA polimerase III de um gene tRNAarg de levedura.

[00137] WO12038706 proporciona adicionalmente construções de DNA para expressão em células de levedura, compreendendo tRNApyl de Methanosarcina barkeri mutado em várias posições internas, resumido na Figura 3. É interessante notar que tRNApyl de M. Barkeri difere em um nucleotídeo de tRNApyl de M. mazei, correspondente ao nucleotídeo G na posição 3 da SEQ ID No. 3.

tRNApyl com promotor de polIII intragênico

[00138] Um gene tRNApyl incluído em construções de DNA da presente invenção pode compreender um promotor de polIII intragênico.

[00139] Hancock et al (2010) descreveram construções de DNA para expressão de tRNApyl em células de levedura, compreendendo tRNApyl de Methanosarcina barkeri mutado em várias posições internas, resumido na Figura 3. Em levedura, a introdução de uma mutação na caixa B originou a geração da sequência da caixa B de consenso, e conduziu a níveis muito baixos, mas detectáveis, de expressão do tRNApyl mutante. No entanto, a expressão do tRNApyl mutante não suportou supressão âmbar nas células de levedura. Os autores concluíram que o tRNA foi inapropriadamente dobrado ou processado, ou que a mutação aboliu o reconhecimento de sintetase.

[00140] De modo similar, os autores recriaram uma caixa A próxima do consenso cuja expressão não foi detectável e combinaram as mutações da caixa A e caixa B que conduziram a níveis de expressão detectáveis, mas ausência de supressão âmbar.

[00141] Em particular, as mutações geradas por Hancock et al. no gene tRNApyl de M. Barkeri correspondem às posições 10, 14, 25, e 52 de M. mazei. É interessante notar que tRNApyl de M. Barkeri de tipo selvagem difere em um nucleotídeo de tRNApyl de M. mazei, correspondendo ao nucleotídeo G na posição 3 da SEQ ID No. 1.

[00142] Surpreendentemente, os inventores descobriram agora que a introdução de determinadas mutações nas regiões da caixa A e caixa B putativas do gene tRNApyl de M. mazei não origina expressão com êxito de tRNApyl em células de mamífero, associada a supressão âmbar eficiente.Os inventores recriaram uma caixa B de consenso e uma caixa A quase de consenso que atuam em combinação e separadamente para permitir supressão âmbar, como discutido no Exemplo 1 e Figuras 4 a 7.

[00143] Adequadamente, a mutação da caixa B é A52C com referência à sequência TS da SEQ ID 3.

[00144] Adequadamente, a mutação da caixa A compreende duas mutações que foram analisadas em conjunto e separadamente, e determinou-se que conduzem a supressão âmbar em células de mamífero, correspondendo às posições 10 e 14 com referência à sequência TS da SEQ ID No 3.

[00145] Genes tRNApyl mutantes exemplares das SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11 (correspondendo a sequências mutadas do gene tRNApyl de Methanosarcina mazei) e genes tRNApyl análogos derivados de outras espécies bacterianas (por exemplo, as mencionadas acima) em que uma mutação (indicada a negrito nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10, e 11) é efetuada em uma posição equivalente. As mutações podem, por exemplo, consistir de 1 ou 2 posições de nucleotídeos na caixa A putativa e/ou na caixa B putativa. Por exemplo, uma única mutação é efetuada na caixa B putativa, por exemplo, na posição mostrada nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11. Por exemplo, uma única ou duas mutações são efetuadas na caixa A putativa e uma única mutação é efetuada na caixa B, por exemplo, nas posições mostradas nas SEQ ID No. 7-11. As caixas A e B putativas estão apresentadas na Figura 2 e o perito pode derivar as regiões das caixas A e B putativas para genes tRNApyl análogos derivados de outras espécies bacterianas (por exemplo, as mencionadas acima).

[00146] Adequadamente, as construções de DNA da presente invenção compreendem um gene tRNApyl mutado seguido de uma sequência terminadora. Uma sequência terminadora exemplar está listada na SEQ ID 6.

[00147] O dobramento apropriado do tRNA é altamente sensível a qualquer modificação de sua sequência. Surpreendentemente, as mutações em posições equivalentes no tRNA de M. barkeri e M. mazei conduziram a resultados dramaticamente diferentes, como mostrado em WO2012/038706 e nos exemplos da presente invenção. De modo notável, o gene tRNApyl de M. barkeri tem um nucleotídeo diferente na posição 3 (G) em comparação com o tRNA de M. mazei onde, na posição equivalente, está um A.

[00148] Foi colocada a hipótese de que o G na posição 3 diminuiu a eficácia da aminoacilação da RS, e que G na posição 3 afeta a ortogonalidade de tRNApyl em levedura. (Hancock 2010; Gundllapalli et al 2008).

[00149] Em resumo, o reconhecimento de tRNAs específicos pelas Aminoacil tRNA sintetases e a aminoacilação de tRNA ocorrem através de elementos de identidade especificados pela sequência de tRNA. O talo aceitador consiste de 7 pares de nucleotídeos formados pelas extremidades 3' e 5' terminais do tRNA e é importante para o reconhecimento de tRNA por enzimas e crítico na tradução. O tRNApyl de M. barkeri Fusaro contém um par de bases G3:70U invulgar na região do talo aceitador que não se encontra em outros genes tRNApyl. Foi mostrado que esta mutação afeta a ortogonalidade do tRNA em levedura ao permitir acilação defeituosa do tRNApyl pela seril tRNA sintetase de levedura.

[00150] Como comentário adicional, a regulação da expressão de genes dependentes de polIII pode variar entre células de levedura e de mamífero. Em ambas, tRNAs são governados por elementos de caixa A e B intragênicos, mas sequências extragênicas podem afetar o nível de expressão, local de início da transcrição (TSS) e o processamento de pré-tRNA. Em levedura, o TSS está frequentemente presente 18-20 pb a montante de T que marca a primeira base da caixa A (ou 10-12 pb a montante do início da sequência codificante de tRNA maduro). Adicionalmente, em levedura, o TSS está muitas vezes rodeado de um elemento promotor de núcleo tCAAca (em que as letras maiúsculas indicam conservação elevada).

[00151] Surpreendentemente, os inventores também descobriram que construções de DNA edificadas por montagem de uma série de repetições dos genes de tRNA mutantes da invenção proporcionam expressão e supressão âmbar intensificadas, como exemplificado na Figura 7 e Exemplo 2.

[00152] Adequadamente, construções de DNA da invenção compreendem 2 até 60 repetições de um gene tRNApyl. Preferencialmente, a construção de DNA compreende 2 até 30 repetições, mais preferencialmente 8 repetições.

tRNApyl com promotor de polIII intragênico expresso sob elementos promotores 5'

[00153] A falta de êxito na produção de um supressor âmbar funcional por intensificação da transcrição de um tRNApyl funcional por mutação das sequências das caixas A e B no interior do gene estrutural, levou os pesquisadores do domínio a criarem construções de DNA nas quais a transcrição do gene tRNApyl é aumentada usando somente sequências extragênicas, como relatado acima.

[00154] Os inventores criaram agora um elemento promotor novo e melhorado que combina elementos promotores a montante e elementos promotores intragênicos.

[00155] Determinados genes de RNA eucariótico são expressos sob um promotor de polimerase III híbrido, ou promotor do tipo 4, compreendendo elementos promotores a montante típicos da classe pol III/tipo 3 de promotores (por exemplo, caixa TATA, usada no promotor de U6 ou H1), ou também possivelmente compreendendo sequências não relacionadas a sequências promotoras do tipo 3, e elementos promotores intragênicos típicos dos promotores polIII/tipo 2 (por exemplo, caixas A e B, usadas em promotores de tRNA).

[00156] Adequadamente, elementos promotores a montante usados na invenção são selecionados de promotores do gene de RNA 7SL (SRP), gene de RNA Vault, pequeno RNA codificado pelo vírus Epstein Barr (EBER) identificados nas SEQ ID Nos 12, 20, 26, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65.

[00157] Adequadamente, elementos promotores a montante da invenção são isolados de genes de mamífero, preferencialmente genes humanos ou murinos, muito preferencialmente humanos, como nas SEQ ID Nos 12, 20 ou 26.

[00158] Adequadamente, as sequências promotoras contêm elementos funcionais que recrutam fatores de transcrição que regulam a transcrição por RNA polimerase de PolIII como apresentado na Figura 1E (SEQ ID Nos: 69 - 71).

[00159] Assim, o promotor de 7SL contém um local de ligação de Fator de transcrição ativador (ATF) ou elemento de resposta de AMP cíclico (CRE) (tgacgtcac) localizado 43-51 pb a montante do local de início da transcrição. O promotor também contém uma sequência do tipo TATA denominada sequência ETAB (ttctagtgct) 20-31 pb a montante do TSS.

[00160] O promotor de Vault contém um elemento de sequência próximo (PSE) localizado 23-53 pb a montante do TSS (tgacgtaggtctttctcaccagtca) (SEQ ID No: 75) e também é uma variante do elemento de resposta de AMP cíclico (CRE). Adicionalmente, o promotor de Vault contém uma caixa TATA (tataat) 16-22 pb a montante do TSS.

[00161] O promotor de EBER contém três regiões reguladoras, um local de ligação SP1 (gcacgcttaaccccgcctaca) (SEQ ID No: 76) 76-55 pb a montante do TSS, uma sequência ligante de ATF (accgtgacgtagctgttta) (SEQ ID No:77) 55-36 pb a montante do TSS, e uma caixa do tipo TATA (tatagag) 28-21 pb a montante do TSS.

[00162] No contexto da presente invenção, a combinação de elementos promotores a montante dos RNAs de 7SL, EBER, Vault com o promotor intragênico (caixa A e/ou B) reconstituído no gene tRNApyl demonstrou melhorar a função de supressão âmbar de tal tRNA, relativamente ao tRNApyl contendo o promotor intragênico reconstituído isoladamente, e relativamente ao tRNApyl TS, como apresentado na Figura 8 e exemplo 3.

[00163] Adequadamente, o promotor de 7SL da SEQ ID No 12 é combinado com a mutação da caixa B da SEQ ID No 9, tal como na construção da SEQ ID No 15.

[00164] Alternativamente, o promotor de 7SL da SEQ ID No 12 é combinado com a mutação da caixa A e B da SEQ ID No 10, tal como na construção da SEQ ID No 18.

[00165] Construções de DNA preferenciais da presente invenção compreendem um elemento promotor a montante, separado pelo local de início da transcrição por um espaçador. Adequadamente, a sequência espaçadora contém um local de início da transcrição e 4 a 6 nucleotídeos desde a extremidade da sequência promotora até ao início da sequência codificante de tRNA.

[00166] Construções de DNA da invenção compreendem um local de terminação a jusante, colocado a 3' da sequência codificante de tRNApyl, em que o referido local de terminação sinaliza a terminação da transcrição por polimerase III através de uma pequena sequência poli- timidina (4-6). Uma sequência terminadora preferencial da invenção está listada como SEQ ID No 19.

tRNApyl expresso sob genes de tRNA eucariótico na forma de mensagens bicistrônicas

[00167] Mukai et al, 2008 e EP1992698 descrevem o modo como o gene tRNApyl a jusante de um gene de tRNA (tRNAval) eucariótico conduziu a uma expressão subótima de tRNApyl, não ideal, pois os níveis de expressão foram demasiado baixos para supressão âmbar ótima em células de mamífero.

[00168] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que construções de DNA em que a sequência codificante de tRNApyl é operavelmente ligada a um gene de tRNA eucariótico, tal como tRNAglu ou tRNAasp (Figura 1A), conduziram a expressão ótima do produto do gene tRNApyl bem como supressão âmbar, como descrito em detalhe na Figura 11 e exemplo 4.

[00169] Adequadamente, o gene tRNApyl da presente invenção é expresso como uma mensagem bicistrônica em uma célula hospedeira eucariótica.

[00170] Adequadamente, o gene de tRNA eucariótico está desprovido da sequência terminadora 3', desse modo permitindo a ocorrência de expressão do gene tRNApyl sob o promotor de RNA polimerase III de tipo 2 eucariótico.

[00171] Assim, o primeiro tRNA é separado do segundo tRNA por uma sequência espaçadora consistindo de uma sequência desprovida de nucleotídeos Timidina que constituem um sinal para terminação da transcrição.Sequências espaçadoras exemplares são apresentadas nas SEQ ID Nos 47 e 54.

[00172] Preferencialmente, o gene de tRNA eucariótico operavelmente ligado à sequência codificante de tRNApyl é um gene tRNAglu ou tRNAasp de mamífero, da SEQ ID No 41, 49, 55 ou 56; mais preferencialmente, um tRNAglu ou tRNAasp murino da SEQ ID No 41 ou 49.

[00173] Os inventores descobriram surpreendentemente que a expressão do tRNApyl e supressão âmbar são particularmente eficientes quando o primeiro gene de tRNA é precedido de uma sequência líder 5' que contém elementos de sequência tais como uma caixa TATA, um local de início da transcrição (TSS), e sequências que regulam o processamento pós-transcrição do pré-tRNA para gerar um tRNA maduto, coletivamente referidos como sequência líder.

[00174] Assim, a sequência líder é a região 5' de qualquer gene de tRNA de mamífero que é transcrita para gerar uma porção do precursor de tRNA que não fará parte do tRNA maduro.

[00175] Sequências líder particularmente preferenciais usadas na presente invenção são reveladas nas SEQ ID No 41 e 49 e listadas como SEQ ID No 44 (tRNAasp) e SEQ ID No 52 (tRNAglu).

[00176] Construções de DNA particularmente preferenciais da invenção estão listadas como SEQ ID No 42 e SEQ ID No 50.

[00177] A SEQ ID No 42 consiste do gene tRNAglu murino seguido de uma região espaçadora (ccccaaacctc) desprovida de Timidinas, ligada ao gene tRNApyl. Assim, a construção da SEQ ID No 42 é transcrita como uma única entidade que é processada de modo pós- transcrição para gerar um tRNApyl maduro.

[00178] A SEQ ID No 50 consiste do gene tRNAasp murino seguido de uma região espaçadora (tagccccacctc) desprovida de Timidinas, ligada ao gene tRNApyl. Assim, a construção da SEQ ID No 50 é transcrita como uma única entidade que é processada de modo pós- transcrição para gerar um tRNApyl maduro.

[00179] Construções de DNA particularmente preferenciais da presente invenção compreendem múltiplas cópias da unidade de transcrição bicistrônica das SEQ ID Nos 42 e 50.

[00180] Assim, construções de DNA particularmente preferenciais compreendem, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 cópias da unidade de transcrição das SEQ ID Nos 42 ou 50. Construções de DNA muito preferenciais são a SEQ ID No 43, representando 3 cópias da unidade de transcrição bicistrônica de tRNAglu-pyl da SEQ ID No 42, e SEQ ID No 51, representando 2 cópias da unidade bicistrônica de tRNAasp-pyl da SEQ ID No 50.

[00181] Os genes tRNApyl da invenção podem ser introduzidos em linhagens de células eucarióticas. Adequadamente, as linhagens de células são linhagens de células de mamífero.

[00182] Mais preferencialmente, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO, mas também pode ser uma linhagem de células HEK293, PERC6, COS-1, HeLa VERO, ou hibridoma de camundongo.

[00183] Linhagens de células CHO e HEK293 são particularmente adequadas.

PylRS

[00184] Adequadamente, os genes tRNApyl da presente invenção são introduzidos em linhagens de células eucarióticas em associação com genes pylRS.

[00185] Como usado aqui, pylRS se refere a uma amino acil tRNA sintetase que irá aminoacilar uma molécula de tRNA adequada com pirrolisina ou um respectivo derivado.

[00186] A pylRS da presente invenção é adequadamente uma Pirrolisil-tRNA Sintetase ortogonal em células eucarióticas que é derivada de Archaea spp. metanogênicas - o mesmo é dizer, é de tipo selvagem em Archaea spp. metanogênicas ou é um respectivo mutante.

[00187] Preferencialmente, a pylRS da presente invenção é uma Pirrolisil-tRNA Sintetase derivada de uma dos seguintes: Methanosarcina mazei, Methanosarcina barkeri, Desulfitobacterium hafniense, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina burtonii, Methanosarcina thermophila, Methanosalsum zhilinae,Methanohalobium evastigatum, Methanohalophilus mahii,Desulfotomaculum gibsoniae, Desulfosporosinus meridei e Desulfotomaculum acetoxidans.

[00188] Muito preferencialmente, a pylRS da presente invenção é a pirrolisil tRNA sintetase (pylRS) derivada de Methanosarcina mazei.

[00189] A pylRS da presente invenção pode ser uma sintetase de tipo selvagem.

[00190] Alternativamente, a pylRS da presente invenção pode ser mutada em um ou mais posições, por exemplo, para aumentar a sua atividade catalítica e/ou para modificar a sua seletividade para aminoácidos de substrato (Ver, por exemplo, Yanagisawa 2008).

[00191] Preferencialmente, a pylRS da presente invenção pode ser mutada na posição correspondendo a Tyr 384 ou seu equivalente. Muito preferencialmente, Tyr 384 é mutado em Fenilalanina.

[00192] Em uma modalidade, a pylRS da presente invenção pode ser mutada em um ou mais posições para modificar sua especificidade para substratos e permitir (ou melhorar) a incorporação de análogos de pirrolisina.

[00193] Outras enzimas PylRS mutantes são descritas em WO09038195 e em WO2010114615, em que cada documento é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

Incorporação de aminoácidos não naturais codificados por códon sem sentido

[00194] Em proteínas preparadas usando linhagens de células da invenção, um ou mais nnAAs podem ser incorporados. Adequadamente, um nnAA é incorporado em uma cadeia proteica. No caso de a proteína ser um anticorpo, um nnAA pode ser incorporado na cadeia leve ou na cadeia pesada ou em ambas.

[00195] Em outras modalidades, mais do que um, por exemplo, até quatro, por exemplo, dois (ou talvez três) nnAAs podem ser incorporados em uma cadeia proteica. Adequadamente, todos os nnAAs incorporados são iguais.

[00196] nnAAs são adequadamente codificados por um códon âmbar.

Aminoácidos não naturais que podem ser codificados por códon âmbar para incorporação em proteínas-alvo Aminoácidos não naturais para incorporação em proteínas-alvo

[00197] O uso de aminoácidos não naturais para permitir a conjugação de frações a peptídeos é divulgado em WO 2007/130453, incorporado aqui a título de referência.

[00198] Como usado aqui, um "aminoácido não natural" se refere a qualquer aminoácido, aminoácido modificado, ou análogo de aminoácido diferente de selenocisteína, pirrolisina, e os seguintes vinte alfa-aminoácidos: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico,cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina. A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada pela Fórmula I:

[00199] Um aminoácido não natural é tipicamente qualquer estrutura tendo a Fórmula I em que o grupo R é qualquer substituinte diferente de um usado nos vinte aminoácidos naturais. Ver, por exemplo, qualquer texto de bioquímica, tal como Biochemistry de L. Stryer, 3a edição 1988, Freeman and Company, Nova Iorque, quanto às estruturas dos vinte aminoácidos naturais. De notar que os aminoácidos não naturais revelados aqui podem ser compostos de ocorrência natural diferentes dos vinte alfa-aminoácidos acima. Uma vez que os aminoácidos não naturais revelados aqui diferem tipicamente dos aminoácidos naturais somente na cadeia secundária, os aminoácidos não naturais formam ligações amida com outros aminoácidos, por exemplo, naturais ou não naturais, do mesmo modo que são formadas em proteínas de ocorrência natural. No entanto, os aminoácidos não naturais têm grupos de cadeia secundária que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R na Fórmula I compreende opcionalmente um grupo alquil-, aril-, haleto de arila, haleto de vinila, haleto de alquila, acetila, cetona, aziridina, nitrila, nitro, haleto, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tioéter, epóxido, sulfona, ácido borônico, éster boronato, borano, ácido fenilborônico, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico-, piridila, naftila, benzofenona, cicloalquinos, tais como os de anel restringido, como um ciclo-octino, cicloalquenos, tais como norbornenos, transcicloalquenos, ciclopropenos, tetrazinas, pironas, tioéster, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ácido carboxílico, ácido alfa-ceto carboxílico, ácidos e amidas alfa ou beta insaturados, glioxil amida, ou organosilano, ou similares, ou qualquer combinação respectiva.

[00200] Para além de aminoácidos não naturais que contêm cadeias laterais novas, aminoácidos não naturais também compreendem opcionalmente estruturas de cadeia principal modificada, por exemplo, como ilustrado pelas estruturas da Fórmula II e III:

[00201] em que Z compreende tipicamente OH, NH.sub.2, SH, NH.sub.2O--, NH--R', R'NH--, R'S--, ou S--R'--; X e Y, que podem ser iguais ou diferentes, compreendem tipicamente S, N, ou O, e R e R', que são opcionalmente iguais ou diferentes, são tipicamente selecionados da mesma lista de constituintes para o grupo R descrita acima para os aminoácidos não naturais tendo a Fórmula I, bem como hidrogênio ou (CH.sub.2).sub.x ou as cadeias laterais de aminoácidos naturais.

[00202] Outros exemplos de análogos de aminoácidos incluem (mas não estão limitados a) um análogo não natural de um aminoácido Lisina ou Pirrolisina, que incluem um dos seguintes grupos funcionais; um grupo alquila, arila, acila, azido, nitrila, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxila, alquenila, cicloalquenos, alquinila, cicloalquinos, cicloalquinos tais como os de anel restringido, como um ciclo-octino, cicloalquenos, tais como norbornenos, transcicloalquenos, ciclopropenos, haleto de arila, haleto de vinila, haleto de alquila, aziridina, nitro, hidroxila, éter, epóxido, éteres de vinila, éteres de silil enol, tiol, tioéter, sulfonamida, sulfonila, sulfona, seleno, éster, tioácido, ácido borônico, éster boronato, borano, fosfono, fosfina, heterocíclico, piridila, naftila, benzofenona, tetrazinas, pironas, enona, imina, aldeído, hidroxilamina, ceto, tioéster, éster, tioácido, grupo organosilano, amino, um reticulador fotoativável; um aminoácido com marcador de spin; um aminoácido fluorescente; um aminoácido que interage, de modo covalente ou não covalente, com outra molécula; um aminoácido ligante de metal; um aminoácido contendo metal; um aminoácido radioativo; um aminoácido fotoenjaulado; um aminoácido fotoisomerizável; um aminoácido contendo biotina ou um análogo de biotina; um aminoácido glicosilado ou modificado com carboidrato; um aminoácido contendo ceto; um aminoácido compreendendo polietileno glicol; um aminoácido compreendendo poliéter; um aminoácido substituído com um átomo pesado; um aminoácido quimicamente clivável ou fotoclivável; um aminoácido com uma cadeia lateral alongada; um aminoácido contendo um grupo tóxico.

[00203] Em uma modalidade da presente invenção, aminoácidos não naturais (nnAA) da estrutura geral embaixo são usados para a produção de proteínas:

[00204] Preferencialmente, o grupo X pode ser um grupo metileno, alqueno, areno, oxigênio, enxofre, fósforo, nitrogênio, éster, amida, carbonato, carbamato, éter, amina, tioéter, alquino, e heterociclo.

[00205] Preferencialmente, o grupo x pode ser um metileno, alqueno, areno, oxigênio, enxofre, fósforo, nitrogênio, éster, amida,carbonato, carbamato, éter, amina, tioéter, alquino, e heterociclo.

[00206] Preferencialmente, o grupo Z pode ser um nitrogênio,oxigênio, enxofre, fósforo, a-metilenoamino, a-hidroxilamino, a-metilenoazido.

[00207] O grupo FG pode ser uma alquil azida, alquil-alquino, alquil- alqueno, alquil ciclohexeno, alquil cicloalquino, haleto de alquil arila, haleto de arila, amido cicloalquino, amido cicloalqueno, transcicloalqueno, ciclopropenos, tetrazinas, pironas, norbornenos, aril azida, azido, uma hidroxil amina, uma hidrazida, um haleto de vinila, um haleto de arila, uma tetrazina, uma pirona, uma imina, éster ou ácido borônico, um ciano, um grupo carbonila, tal como um aldeído ou cetona.

[00208] Em uma modalidade preferencial, aminoácidos não naturais (nnAA) da estrutura geral acima podem ter grupos metileno de comprimento variável em que n=1-12. Preferencialmente, aminoácidos não naturais (nnAA) da estrutura geral acima podem conter cicloalcanos e anéis aromáticos como parte da estrutura conectiva.

[00209] Adequadamente, nnAAs da presente invenção são derivados de lisina como listado nas tabelas de estruturas embaixo. Os que não estão disponíveis no mercado são opcionalmente sintetizados como indicado nos exemplos de US 2004/138106 A1 (incorporado aqui a título de referência) ou usando métodos comuns conhecidos dos peritos na técnica. Quanto a técnicas de síntese orgânica, ver, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, (1982, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry de March (Terceira Edição, 1985, Wiley and Sons, Nova Iorque); e Advanced Organic Chemistry de Carey e Sundberg (Terceira Edição, Partes A e B, 1990, Plenum Press, Nova Iorque), e WO 02/085923, todos os quais são aqui incorporados a título de referência.

[00210] nnAAs da invenção podem ser sintetizados por métodos publicados. Por exemplo, a síntese de ácido (S)-2-amino-6((prop-2- iniloxi)carbonilamino)hexanoico e ácido (S)-2-amino-6((2- azidoetoxi)carbonilamino)hexanoico é publicada em WO2010139948 e Nguyen et al. 2009, incorporado aqui a título de referência.

[00211] Adequadamente, nnAAs da presente invenção são derivados de lisina, como mostrado na tabela embaixo, como descrito em parte em WO2010139948, incorporado aqui a título de referência.Análogos à base de lisina

[00212] Adequadamente, nnAAs da presente invenção são derivados de ácido (2S)-2-amino-6-hidroxihexanoico, como listado na tabela embaixo.Análogos de Pirrolisina

[00213] Adequadamente, nnAAs da presente invenção são derivados de modo a incluírem diferentes grupos funcionais listados na tabela embaixo. Alguns dos quais são descritos em parte em WO20110442255A1, incorporado aqui a título de referência.Análogos de Pirrolisina

[00214] Adequadamente, nnAAs da presente invenção são derivados de modo a incluírem diferentes grupos funcionais adequados para a química de cicloadição de metais livres e são descritos em parte em WO2012104422A1 e listados na tabela embaixo.Análogos de Pirrolisina

Conjugação Sítio-específica de proteínas com aminoácidos não naturais incorporados

[00215] Proteínas tendo aminoácidos não naturais incorporados usando métodos de acordo com a invenção podem ser usadas para a preparação de conjugados proteicos funcionalizados. Moléculas que podem ser conjugadas a proteínas tendo aminoácidos não naturais incorporados incluem (i) outras proteínas, por exemplo, anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais e (ii) grupos PEG ou outros grupos que possam originar extensão da semivida do sistema. Adicionalmente, estas proteínas modificadas podem ser conjugadas a fármacos ou nucleotídeos para administração dirigida destes compostos potentes.

[00216] Mais detalhes de certas modalidades são apresentados embaixo na discussão de conjugados anticorpo fármaco.

[00217] Aminoácidos não naturais podem convenientemente conter um grupo químico único permitindo conjugação de um modo dirigido sem risco de reações secundárias com outros aminoácidos. Por exemplo, aminoácidos não naturais contêm convenientemente grupos azida ou alquino que permitem reação com uma molécula a ser conjugada que contém um grupo alquino ou azida correspondente usando a reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen.

[00218] Um aspecto adicional da invenção é um processo de preparação de uma proteína-alvo quimicamente modificada, que compreende preparar uma proteína-alvo de acordo com o processo de acordo com um aspecto da invenção e modificar quimicamente a proteína-alvo resultante.

[00219] Químicas de conjugação preferenciais da invenção incluem reações que são ortogonais aos vinte aminoácidos naturais. Tais reações não interagem nem causam reações secundárias com os 20 aminoácidos nativos, são específicas dos grupos funcionais associados à reação. Adequadamente, os grupos funcionais necessários são incorporados na proteína-alvo via o nnAA.

[00220] Adicionalmente, tais reações prosseguem em condições que não são destrutivas para a proteína, por exemplo, condições aquosas, com um intervalo de pH que é aceitável para a proteína e mantém sua solubilidade, a uma temperatura que não conduz a efeitos prejudiciais na proteína.

[00221] Aumentar a estabilidade da fração de conexão entre a proteína e o ligador pode ser vantajoso. Métodos convencionais conjugam aos grupos tiol de cisteína por reação com uma maleimida, formando um éter de tiol. O éter de tiol pode sofrer a reação reversa, liberando o derivado ligador fármaco do anticorpo. Em uma modalidade da invenção, a química de conjugação empregue entre uma azida e um alquino origina um triazol aromático que é significativamente mais estável, e não tão propenso a reversibilidade.

[00222] Adicionalmente, o produto da reação, a ligação entre proteína e carga útil, deve ser estável, com estabilidade igual ou maior do que a estabilidade associada a ligações convencionais (amida, éter de tiol). Apesar de não ser um impedimento à conjugação, muitas vezes é vantajoso que as reações de conjugação possam ser realizadas sob condições nativas, pois tal eliminará uma etapa de processamento extra de redobramento.

[00223] Conjugações químicas preferenciais para a produção de conjugados da invenção incluem: uma cicloadição 3+2 alquino-azida; cicloadição 3+2 dipolar; acoplamentos à base de paládio incluindo a reação de Heck; reação de Sonogashira; reação de Suzuki; acoplamento de Stille; reação de Hiyama/Denmark; metátase de olefinas; reação de Diels-alder; condensação de carbonila com hidrazina, hidrazida, alcoxi amina ou hidroxil amina; cicloadições promovidas por deformação, incluindo Cicloadição promovida por deformação de azida alquino; cicloadição de azida alquino promovida por metais; cicloadição promovida por elétrons; cicloadição com extrusão de fragmentos; cicloadição de alqueno seguido de uma reação de b-eliminação.

[00224] De acordo com uma modalidade preferencial, o aminoácido incorporado contém um grupo azida ou alquino e o processo de modificação química compreende fazer reagir o referido grupo azida ou alquino com um reagente compreendendo um grupo alquino ou azida. A reação considerada é uma reação de cicloadição 1,3-dipolar de Huisgen que conduz à produção de uma ligação triazol. O reagente compreendendo um grupo alquino ou azida pode ser uma proteína (por exemplo, um anticorpo) ou uma toxina ou um fármaco citotóxico ou uma substância adequada para extensão da semivida (por exemplo, um grupo PEG) que contém um grupo alquino ou azida opcionalmente via um ligador.

[00225] O grupo alquino a ser usado na referida reação é, por exemplo, um alquino terminal, um ciclo-octino, tal como uma fração biciclo[6.1.0]non-4-ino, dibenzociclo-octino, e difluorociclo-octino.

[00226] Em uma reação variante, o aminoácido incorporado contém um grupo azida ou alqueno e o processo de modificação química compreende fazer reagir o referido grupo azida ou alqueno com um reagente compreendendo um grupo alqueno ou azida. O reagente compreendendo um grupo alqueno ou azida pode ser uma proteína (por exemplo, um anticorpo) ou uma toxina ou uma substância adequada para extensão da semivida (por exemplo, um grupo PEG) que contém um grupo alquino ou alqueno opcionalmente via um ligador.

[00227] Quando mais do que um nnAA for incorporado em uma proteína-alvo (por exemplo, um anticorpo), a modificação química pode ser igual ou diferente. Por exemplo, se forem incorporados dois nnAAs, um pode ser modificado de modo a ser conjugado a uma fração de fármaco e um pode ser modificado de modo a ser conjugado a uma fração de PEG.

[00228] Em uma modalidade, química de conjugação da invenção é usada para preparar um conjugado anticorpo fármaco.

Proteínas-alvo Proteínas-alvo incluem anticorpos.

[00229] Anticorpos da invenção incluem anticorpos completos e fragmentos de anticorpos, incluindo fragmentos Fab, Fab2, e de anticorpo de cadeia simples (scFvs) dirigidos a TROP-2, SSTR3, B7S1/B7x, PSMA, STEAP2, PSCA, PDGF, RaSL, C35D3, EpCam, TMCC1, VEGF/R, Conexina-30, CA125 (Muc16), Semaforina-5B,ENPP3, EPHB2, SLC45A3 (PCANAP), ABCC4 (MOAT-1), TSPAN1, PSGRD-GPCR, GD2, EGFR (Her1), TMEFF2, CD74, CD174 (leY), Muc-1, CD340(Her2), Muc16, GPNMB, Cripto, EfA2, 5T4, Mesotelina, TAG-72, CA9 (IX), a-v-Integrina, FAP, Tim-1, NCAM/CD56, receptor de alfa folato, CD44v6, proteoglicana de Sulfato de condroitina, CD20, CA55.1, SLC44A4, RON, CD40, HM1.24, CS-1, Beta2 microglobulina, CD56, CD105, CD138, Lewis Y, GRNMP, Tomoregulina, CD33, FAP, CAIX, Receptor de FasL, metalo proteases de matriz MMP.

[00230] Em uma modalidade preferencial da invenção, anticorpos da invenção dirigidos a alvos tumorais são conjugados a frações proteicas selecionadas das seguintes: proteínas imunoestimuladoras e pró- apoptóticas, particularmente Imuno estimuladores, tais como IL-1alfa, IL-1beta, outros membros da família IL-1, quaisquer das interleucinas, incluindo mas não se limitando a IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, família IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-28, ou ligantes coestimuladores, tais como B7.1 e B7.2, TACI. Interferons, como qualquer um da família IFN do Tipo I (IFN alfa e beta e lambda) ou o IFN gama do Tipo II. Fatores de crescimento hematopoiéticos, tais como GM-CSF. Quimiocinas incluindo CXCL-1, CXCL-2, CXCL-5, CXCL-6, CXCL-8, CXCL-9, CXCL-10, e CXCL-11, CXCL-13, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-21, IP-10, Eotaxina, RANTES, PF4, peptídeos relacionados a GRO, IL-8. Ligantes pró-apoptóticos, tais como os da superfamília TNF incluindo FasL, TNF, PD-L1. Peptídeos antimicrobianos, tais como alfa e beta defensinas e catelicidina LL37/hCAP18, histatinas, catepsina G, azurocidina, quimase, neurotoxina derivada de eosinófilos, proteínas nucleares do grupo 1 de alta mobilidade, HMGB1, lactoferrina. Enzimas produtoras de ROS e RNS, tais como os membros das NADPH oxidases (NOXs), óxido nítrico sintase NOS, INOS), proteínas granulares de neutrófilos, incluindo proteases, tais como elastases e catepsinas, Azurocidina (também conhecida como CAP37 ou HBP), mieloperoxidase, perforina, granzimas.

[00231] Em uma modalidade, a proteína-alvo é um anticorpo anti- Her-2.

[00232] Em uma modalidade, a proteína-alvo é um anticorpo anti-IL6.

[00233] Em uma modalidade, a proteína-alvo é um anticorpo anti- PSMA.

[00234] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo anti-PSMA é um scfv.

[00235] Em uma modalidade preferencial, FGF21 é modificado de modo a conter o aminoácido não natural lys-azida ou propargil lisina na posição R131 e conjugado a uma fração PEG via um ligador triazol. Frações PEG

[00236] Proteínas-alvo podem ser conjugadas a frações PEG. Frações PEG podem ser incorporadas em conjugados anticorpo fármaco. A fração PEG pode tipicamente ter um peso molecular variando entre 5 kDa e 40 kDa. Mais preferencialmente, a fração PEG pode ter um peso molecular de cerca de 20 kDa. Frações PEG podem ter cadeia linear ou ramificada.

Conjugados Anticorpo Fármaco (ADCs)

[00237] Linhagens de células de acordo com a invenção são particularmente úteis para a produção de Conjugados Anticorpo Fármaco (anticorpo recombinante ligado covalentemente, por um ligador sintético, a um determinado fármaco, tipicamente um fármaco citotóxico, ou então uma proteína ou um grupo PEG) que são de natureza homogênea, em que o número de fármacos (ou outra molécula conjugada) por anticorpo e posição desses fármacos no anticorpo são explicitamente controlados, de modo que anticorpos monoclonais contendo aminoácidos não naturais incorporados são obtidos e conjugados de modo sítio-específico a um ligador contendo uma fração de fármaco (ou outra molécula conjugada) através de química ortogonal.

[00238] Adequadamente, a presente invenção proporciona um processo para obter ADCs incluindo as etapas seguintes: 1. Introduzir em uma linhagem de células estáveis da invenção um ou mais plasmídeos contendo a sequência de DNA que codifica um anticorpo completo, de modo que um códon de terminação é introduzido em posições específicas na sequência. 2. Purificar o anticorpo modificado com aminoácido não natural (nnAA) instalado em posição(ões) desejada(s). 3. Fazer reagir um derivado citotoxina-ligador modificado de modo a incluir um grupo funcional complementar ao nnAA instalado no anticorpo com o anticorpo modificado contendo um grupo reativo complementar através de uma química ortogonal. 4. Purificar o ADC resultante.

[00239] Assim, a presente invenção também proporciona ADCs nos quais o componente de anticorpo foi modificado para incorporar aminoácidos não naturais contendo um único grupo funcional reativo em posições desejadas, de modo que tal grupo funcional permite conjugação a uma fração de fármaco (ou proteína ou grupo PEG).

[00240] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um conjugado de anticorpo compreendendo um anticorpo anti-Her-2 que é conjugado a uma ou mais frações (por exemplo, uma, duas, três ou quatro, preferencialmente uma ou duas, especialmente uma) selecionadas de frações de proteína, fármaco e PEG via ligadores compreendendo uma fração triazol.

[00241] Em particular, a fração triazol pode ser formada por reação de uma fração azida ou alquino na cadeia lateral de um aminoácido não natural incorporado na sequência do anticorpo anti-Her-2 e uma fração alquino ou azida ligada à fração de proteína, fármaco ou PEG.

[00242] Em uma modalidade, a fração triazol é formada por reação de uma fração azida ou alquino na cadeia lateral de um aminoácido não natural incorporado na sequência do anticorpo anti-Her-2 e uma fração alquino ou azida ligada à fração de proteína, fármaco ou PEG sob condições de catálise com Cu(I).

[00243] Em outra modalidade, um conjugado de anticorpo compreende um anticorpo que é conjugado a uma ou mais frações, selecionadas de frações de fármaco e PEG, via ligadores compreendendo uma fração triazol, em que a fração triazol é formada por reação de uma fração azida na cadeia lateral de um aminoácido não natural incorporado na sequência do anticorpo e uma fração alquino ligada à fração de fármaco ou PEG e em que a fração alquino é uma fração ciclo-octino.

[00244] Em outra modalidade, um conjugado de anticorpo compreende um anticorpo que é conjugado a uma ou mais frações, selecionadas de frações de fármaco e PEG, via ligadores compreendendo uma fração triazol, em que a fração triazol é formada por reação de uma fração alquino na cadeia lateral de um aminoácido não natural incorporado na sequência do anticorpo e uma fração azida ligada à fração de fármaco ou PEG e em que a fração alquino é uma fração alquino terminal, um alquino substituído ou um ciclo-octino.

[00245] A fração ciclo-octino pode ser, por exemplo, uma fração biciclo[6.1.0]non-4-ino, dibenzociclo-octino, e difluorociclo-octino.

[00246] O aminoácido não natural incorporado na sequência do anticorpo é adequadamente um substrato de aminoácido não natural para PylRS, particularmente um análogo de lisina não natural, tal como ácido (S)-2-amino-6((2-azidoetoxi)carbonilamino)hexanoico.

Anticorpos

[00247] Na presente invenção, ADCs incluem o uso de anticorpos completos bem como de fragmentos de anticorpos, tais como, mas não limitados a fragmentos Fab, Fab2, e de anticorpos de cadeia simples.

[00248] Anticorpos adequados para conjugação a citotoxinas incluem os dirigidos contra: anti-Her2, anti-IL-6, TROP-2, SSTR3, B7S1/B7x, PSMA, STEAP2, PSCA, PDGF, RaSL, C35D3, EpCam, TMCC1, VEGF/R, Conexina-30, CA125 (Muc16), Semaforina-5B,ENPP3, EPHB2, SLC45A3 (PCANAP), ABCC4 (MOAT-1), TSPAN1, PSGRD-GPCR, GD2, EGFR (Her1), TMEFF2, CD74, CD174 (leY), Muc-1, CD340(Her2), Muc16, GPNMB, Cripto, EfA2, 5T4, Mesotelina, TAG-72, CA9 (IX), a-v-Integrina, FAP, Tim-1, NCAM/CD56, receptor de alfa folato, CD44v6, proteoglicana de Sulfato de condroitina, CD20, CA55.1, SLC44A4, RON, CD40, HM1.24, CS-1, Beta2 microglobulina, CD56, CD105, CD138, Lewis Y, GRNMP, Tomoregulina, CD33, FAP, CAIX, Receptor de FasL, metalo proteases de matriz MMP.

[00249] Um anticorpo particular de interesse é um anticorpo anti-Her- 2.

[00250] Outro anticorpo particular de interesse é um anticorpo anti- PSMA, especialmente um scfv.

[00251] O referido scfv pode, por exemplo, ser conjugado a um derivado auristatina, paclitaxel, doxorrubicina, ou amanitina.

Exemplos da invenção: Exemplo 1: Geração de elementos promotores intragênicos

[00252] Foi usada mutagênese sítio-dirigida para gerar as seguintes mutações no gene tRNApyl: A na posição 52 (com referência à sequência de tRNApyl de Methanosarcina mazei TS, SEQ ID No 3)) foi mutado em C; A na posição 10 foi mutado em G e T na posição 14 foi mutado em A .

[00253] Em particular, foram preparadas construções contendo uma única mutação A52C (Construção denominada tRNA-B, SEQ ID No 9), todas as mutações descritas acima, nomeadamente A52C, A10G e T14A (tRNA-A2B, SEQID No 10) ou mutações somente na caixa A (A10G e T14A, tRNA-A2, SEQ ID No 11 ou A10G, tRNA-A1, SEQ ID No 7).

Demonstração de expressão funcional de tRNApyl com promotor intragênico

[00254] Para avaliar a função das variantes de tRNA, foi estabelecido um ensaio in vitro no qual células são transfectadas de modo transitório com uma construção de tRNA e uma construção repórter codificando GFP contendo um códon âmbar interrompendo seu quadro de leitura (GFPY40). Células HEK293 expressando de modo estável pylRS foram transfectadas de modo transitório com várias construções de tRNA (1 ug) e o repórter GFPY40 (1 ug). Na ausência de elementos que suportam supressão âmbar, é gerada uma proteína GFP truncada e a célula não é fluorescente. No entanto, a introdução de um tRNA funcional e a presença de um nnAA que suporta supressão âmbar permitem a produção de GFP completa, resultando em células fluorescentes. O nível de expressão de GFP reflete a eficiência da supressão âmbar e é quantificado por citometria de fluxo. Genes de tRNA codificando tRNApyl de tipo selvagem (tRNA TS), ou contendo mutações na caixa B (tRNA B - SEQ ID No 9), em ambas as caixas A e B (tRNA A2B - SEQ ID No 10), ou na caixa A (tRNA A1 - SEQ ID No 7; ou tRNA A2 SEQ ID No 11), todas sob o controle do promotor de H1, foram gerados por mutagênese sítio-dirigida e foram avaliados. O promotor de H1 assegurou que as variantes foram expressas e permitiu- nos examinar os efeitos funcionais das mutações introduzidas nos genes de tRNA. Adicionalmente, foi gerada uma amostra transfectada com GFPY40 isoladamente para estabelecer níveis de fundo de GFP. As células transfectadas foram cultivadas na presença do análogo de aminoácido lys azida (2 mM) e foram incubadas por 18 horas. A fluorescência de GFP foi então avaliada por citometria de fluxo e a intensidade média da fluorescência foi determinada para cada amostra. Os dados foram analisados com FCS Express e a intensidade média da fluorescência de cada amostra foi determinada usando marcadores que restringem o conjunto de dados a células exibindo fluorescência acima de controles negativos. Os dados, como mostrado na figura 4, demonstram que a incorporação de mutações no local da caixa A (tRNA H1-A1 e tRNA H1 A2) não afeta a atividade do tRNA relativamente à sua capacidade de suportar supressão âmbar relativamente ao tRNA TS de H1 de tipo selvagem. As construções codificando tRNA B e tRNA A2B suportam supressão âmbar, apesar de a um nível menor do que o tRNA TS. Assim, as construções são funcionais e podem conter a sequência genética necessária para permitir a expressão do tRNA também na ausência de um elemento promotor a montante, como o promotor de H1.

[00255] Para começar a avaliar se as mutações de tRNA conseguem suportar expressão do tRNA, avaliámos construções de tRNA codificando o tRNA de tipo selvagem na ausência do promotor de H1. Construções codificando tRNApyl de tipo selvagem (tRNA TS) ou contendo mutações na caixa B (tRNA B - SEQ ID No 9) ou em ambas as caixas A e B (A2B; tRNA A2B - SEQ ID No 10) foram avaliadas usando o nosso ensaio de supressão âmbar in vitro descrito acima. tRNA TS sob o controle do promotor de H1 (H1-tRNA) foi usado como controle positivo, e adicionalmente uma amostra foi transfectada somente com o repórter GFPY40 para ilustrar supressão âmbar de fundo na ausência de tRNA. As células transfectadas foram expostas a nnAA lys-azida 2 mM e as células foram incubadas por três dias. A expressão de GFP foi examinada por citometria de fluxo e a intensidade média da fluorescência foi determinada. Estes dados foram representados graficamente e estão mostrados na Figura 5. Havia sido previamente mostrado que a construção H1-tRNA permite supressão âmbar eficiente (IMF= 1 004 228,00). No entanto, não foi observada nenhuma fluorescência de GFP em uma amostra desprovida de tRNA (GFPY40; IMF= 65 929) e níveis baixos em amostras contendo tRNA ts (IMF= 114 478,1). Os mutantes de tRNA tRNA B (IMF =410 131,1) e tRNA A2B (IMF =242 747,9) permitiram expressão de GFP quatro vezes e 2,5 vezes mais elevada, respectivamente, do que a construção de tRNA ts. Estes dados mostram que as mutações B e A2B reconstituem um promotor intragênico funcional e que o tRNA expresso é funcional, pois consegue mediar a entrega do nnAA na proteína-alvo.

[00256] Tendo estabelecido que a mutação B introduzida na sequência de pyltRNA permitiu expressão do tRNA que suportou supressão âmbar, então questionámos se esta mutação afetou a ortogonalidade do tRNA e conduziu à incorporação de aminoácidos naturais. Para fazê-lo, células 3H7 foram transfectadas de modo transitório com construções de expressão codificando TS-tRNA, B- tRNA, H1-tRNA e H1-B tRNA juntamente com o repórter GFPY40. Células transfectadas foram cultivadas na presença de lys azida 2 mM ou ausência de nnAA, como indicado (Figura 6), e a expressão de GFP foi avaliada por citometria de fluxo passados três dias. Adicionalmente, uma amostra transfectada somente com GFPY40 foi examinada para determinar níveis de fundo de supressão âmbar na ausência de tRNA. A Figura 3 mostra que na presença de lys-azida, H1-tRNA (IMF= 347 958), H1-B tRNA (IMF=313 386) e B-tRNA (IMF=232 505) suportam supressão âmbar robusta e expressão de GFP completa acima dos níveis de fundo (IMF=23 487). Na ausência de nnAA, níveis de fundo de expressão de GFP foram observados em células contendo estas três construções (IMF=33 452; 36 217; 42 104, respectivamente). Estes dados mostram que tRNA B é ortogonal e não promove níveis de supressão âmbar acima do fundo na ausência de nnAA, incluindo uma construção que previamente foi mostrado que suporta níveis elevados de expressão (H1-tRNA B). Uma comparação da expressão de GFP entre o tRNA TS (IMF 33 781) e tRNA B (232 505) desprovido de elementos promotores extragênicos confirma que a mutação B gera um promotor intragênico funcional. De fato, a construção de tRNA B permitiu um aumento de sete vezes do nível de expressão de GFP dependente de supressão âmbar relativamente a tRNA TS.

Exemplo 2 Número de cópias e supressão âmbar

[00257] Em um esforço para aumentar a eficácia da supressão âmbar pela construção tRNA-B, avaliámos se números aumentados de cópias conduziram a uma atividade acrescida.

[00258] Duas cópias do tRNA TS, B, ou A2B foram clonadas em série para gerar um único vetor contendo duas cópias de tRNA TS, B, ou A2B. Para avaliar o efeito de doses genéticas acrescidas por estas construções, células expressing TSpylRS foram transfectadas de modo transitório com as construções de tRNA e a construção repórter GFPY40 e expressão de GFP foi avaliada passados dois dias. Os dados da figura 7 mostram que tRNA B (IMF=67 489) e A2B (IMF=61 950) conseguem suportar níveis de supressão âmbar acima dos de tRNA TS (IMF=18 002), confirmando a observação de que os tRNAs B e A2B contêm elementos promotores funcionais. Adicionalmente, observámos que cópias em série de tRNA B (IMF=110 941) e A2B (IMF=96 158) conduziram a um aumento concomitante da eficácia da supressão âmbar, determinado por expressão de GFP. A dosagem de genes não melhorou a transleitura âmbar de tRNA TS (IMF=20 617).

Exemplo 3 Expressão de tRNApyl sob promotores extragênicos e promotores híbridos (Tipo 4)

[00259] Foi demonstrado aqui e por outros que o promotor de H1 suporta expressão de tRNApyl. No entanto, foram observados efeitos prejudiciais significativos pelo uso de promotores de polIII/Tipo3 (por exemplo, de H1 e U6) em células de mamífero. Assim, para ultrapassar estas deficiências, foi avaliado um conjunto de elementos promotores extragênicos, que é sabido governarem expressão de RNA, quanto à sua capacidade de expressar tRNApyl. É conhecido que elementos promotores extragênicos regulam a expressão de RNA Vault, EBER e 7SL humano (Englert et al., 2004; Kickhoefer et al., 2003; Howe & Shu 1989). Foi mostrado que cada um destes promotores recruta o fator de transcrição TFIIIc, e não SNAPc (usado por U6 e H1) (Moqtaderi et la., 2010) (Felton-Edkins et al (2006) J Biol Chem 281:33871) . É interessante notar que uma transcrição eficiente por estes promotores requer sequências reguladoras intragênicas e extragênicas (Englert et al., (2004); Kickhoefer et al., (2003); e Howe & Shu (1989)). A identificação de um tRNApyl funcional contendo caixas A e B de consenso abriu a porta ao seu uso na expressão do tRNApyl. Os elementos promotores que é conhecido regularem RNA Vault, 7SL, e EBER2 foram construídos a partir de sequências previamente descritas (Englert et al., 2004; Kickhoefer et al., 2003; Howe & Shu 1989). Testámos os promotores quanto aos genes de RNA Vault e 7SL humanos e gene EBER do vírus Epstein Barr na forma de elementos promotores extragênicos colocando-os a 5' de genes codificando tRNA TS, tRNA B, tRNA A2B, e variantes adicionais contendo A10G e A52C (tRNA AB; SEQ ID No. 8) ou contendo uma única mutação em A10G (tRNA A1; SEQ ID No. 7).

[00260] A atividade de cada construção foi avaliada por transfecção transitória em células que expressam de modo estável pylRS TS com o repórter GFPY40 como descrito acima. Para este experimento, foi usado 1 ug de um produto de PCR codificando cada uma das construções indicadas. Em cada caso, células foram expostas ao nnAA lys azida por três dias e os níveis de GFP foram avaliados por citometria de fluxo. Intensidades médias da fluorescência foram determinadas para cada amostra e representadas graficamente (Figura 8). Uma amostra transfectada somente com GFPY40 (sem tRNA) foi usada para estabelecer supressão âmbar de fundo na ausência de tRNA (sem tRNA, IMF= 137 589). Adicionalmente, uma amostra transfectada com tRNA H1-TS foi usada para definir níveis elevados de expressão de GFP e função do tRNA (tRNA de H1 TS, IMF= 828 503) e níveis baixos de supressão âmbar determinados por tRNA desprovido de promotores intragênicos (tRNA TS, IMF=117 626). Como mostrado na figura 7, o uso de promotores extragênicos (EBER, Vault e 7SL) exibiu níveis melhorados de expressão do repórter GFP relativamente a tRNA TS com promotores de EBER, Vault e 7SL. No entanto, um desempenho melhorado de cada um destes promotores requereu elementos de tRNA intragênicos. De fato, células transfectadas com tRNA de 7SL TS exibiram supressão âmbar mínima (tRNA de 7SL TS, IMF= 106 075). No entanto, a eficácia relativa da supressão âmbar melhorou com tRNA contendo elementos de caixa A e B conservados (tRNA de 7SL A1, IMF= 114 393; 7SL AB, IMF=210 380; 7SL A2B, IMF= 245 120). É interessante notar que os níveis mais elevados de supressão âmbar foram observados com as construções de tRNA contendo somente uma caixa B funcional (tRNA de 7SL B, IMF=265 396). Esta tendência geral também foi observada com o promotor de RNA Vault. Construções contendo uma caixa B funcional (tRNA de Vault B, IMF=170 838 ) exibiram desempenho melhorado relativamente às contendo ambas as caixas A e B de consenso (tRNA Vault A2B, IMF=154 445) e construções do tRNA de tipo selvagem (tRNA de Vault TS, IMF=102 415). O promotor de EBER funcionou melhor quando o tRNA continha elementos de caixa A e B conservados (tRNA de EBER A2B, IMF=136 196). O desempenho desta construção ultrapassou o de tRNA contendo uma mutação B (tRNA de EBER B, IMF=113 496) e tRNA contendo uma única caixa B e uma caixa A parcialmente reconstituída (tRNA de EBER AB, IMF=119 719), e tRNA não modificado (tRNA de EBER TS, IMF=99 393). Os nossos dados mostram que os promotores de RNA extragênicos para snRNA de Vault, RNA de 7SL e RNA de EBER conseguem suportar expressão e função de tRNApyl. A eficácia da supressão âmbar depende da presença de uma caixa B funcional.

[00261] Então testámos a atividade de supressão âmbar para comparar diretamente os níveis de supressão âmbar dependente de tRNA entre as várias construções expressão de tRNA funcional (Figura 9). Neste ensaio, células expressando de modo estável TSpylRS foram transfectadas de modo transitório com 1 ug de repórter GFPY40 e 1 ug de um dos plasmídeos de expressão de tRNA (H1-tRNA, tRNA de Vault B, tRNA de 7SL B, tRNA de EBER B, tRNA B ou tRNA TS). A Figura 9 mostra que tRNA 7SL-B (IMF=167 024) e tRNA Vault-B (IMF=168 298) conseguem suportar atividade de supressão âmbar comparável à observada com a construção de H1-tRNA (IMF= 241 901), originando uma melhoria da atividade em comparação com a construção de tRNA- B (IMF= 89 869) e tRNA TS (IMF= 25 459), relativamente a H1-tRNA (Figura 8).

[00262] Em uma tentativa para aumentar os níveis de supressão âmbar que são suportados pelo promotor de 7SL extragênico com tRNA B, examinámos os efeitos de repetições em série de 7SL-tRNA-B relativamente a tRNA de H1. Para fazê-lo, duas cópias das construções de 7SL- tRNA-B foram clonadas em um único vetor e os níveis de supressão âmbar foram avaliados usando transfecções transitórias de células expressando de modo estável a TSpylRS juntamente com GFPY40. As células foram incubadas com lys azida por três dias e os níveis de GFP foram quantificados por citometria de fluxo. A Figura 10 mostra que cópias genéticas aumentadas de tRNA 7SL- B bem como de H1-tRNA originam propriedades melhoradas de eficácia de supressão âmbar e níveis de expressão de GFP. Neste experimento, células transfectadas somente com GFP foram usadas como controle negativo (IMF=0). Células transfectadas com uma cópia em série do H1- tRNA (2x H1 tRNA, IMF=629) originaram um aumento de 28 % da expressão da construção repórter GFPY40 relativamente a uma única cópia do tRNA de H1 (IMF=453). O mesmo efeito foi observado com repetições em série de tRNA desprovido de um promotor externo mas contendo uma caixa B funcional. Aqui, repetições em série de tRNA B (2x tRNA B, IMF 366) exibiram uma melhoria de 10 % relativamente à cópia única do gene (tRNA B, IMF=329). Cópias em série do tRNA de 7SL B (2x tRNA de 7SL B, IMF=568), também exibiram uma melhoria de 8,5 % relativamente ao sinal observado com um único gene (tRNA de 7SL B, IMF=520). Foi previamente mostrado que uma construção codificando tRNA de tipo selvagem desprovido de uma caixa B funcional sob o controle do promotor de 7SL é menos eficaz do que tRNA de 7SL B. Esta construção anterior foi incluída nesta análise para verificar o seu efeito (tRNA de 7SL TS, IMF=312). De fato, estes dados confirmam experimentos prévios segundo os quais a mutação B melhora o desempenho da construção 7SL-tRNA. Estes dados mostram que números aumentados de genes podem melhorar a eficácia do tRNA supressor. Adicionalmente, estes dados também mostram que o promotor de 7SL facilita a expressão de tRNApyl de modo equivalente ao promotor de H1.

Exemplo 4 Expressão de tRNApyl como parte de uma mensagem bicistrônica

[00263] Também testámos a utilidade de uma construção de expressão de tRNA bicistrônica quanto à sua capacidade para expressar tRNApyl. Aqui, foram usados o tRNA Glu e tRNA Asp murinos. Em cada caso, múltiplas repetições das construções foram geradas para aumentar a atividade (3xGlu-pyl e 2x Asp-pyl). Aqui, células 3H7 foram transfectadas de modo transitório com 1 ug da construção repórter GFPY40 e 1 ug dos vetores de expressão de tRNA indicados (Figura 11) e foram incubadas com lys-azida por três dias. Os dados foram recolhidos por citometria de fluxo e as intensidades médias da fluorescência para cada amostra foram representadas graficamente. Observámos que as construções bicistrônicas permitiram níveis elevados de supressão âmbar relativamente ao controle positivo H1- tRNA. Cassetes de expressão de tRNA consistindo de três repetições em série do par tRNA glu e pyltRNA murinos (3xGlu, IMF=419) e duas repetições em série do par tRNA asp-pyl tRNA murinos (2x Asp, IMF=419) exibiram >90 % do sinal gerado por H1-tRNA (IMF=453), indicando sua capacidade para produzir eficientemente tRNA funcional. Adicionalmente, tRNA de 7SL B (IMF=520) também demonstrou expressão eficiente do tRNA. A construção consistindo do tRNA de 7SL TS (IMF=312) foi incluída como métrica de baixa eficiência. Adicionalmente, linhagens de células contendo somente o repórter GFPY40 foram usadas como controles negativos (IMF=0). Estes dados indicam que a construção bicistrônica é um método eficiente para a expressão de tRNAs desprovidos de elementos de caixa A e B funcionais e demonstram adicionalmente que células de mamífero podem processar estas moléculas de RNA para gerar tRNAs maduros e funcionais. Referências: 1. Blight et aL. 2004 Nature. 431 333-335. 2. 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Listagem de sequências: Sequências sublinhadas identificam sequências de caixa A e/ou caixa B Caracteres a negrito identificam nucleotídeos mutados SEQ ID No 1 >tRNApyl de Methanosarcina_barkeri, TS; sequência codificante GGAAACCTGATCATGTAGATCGTGGACTTCTAAATCCGCAGCCGG GTAGATTCCCGGGGTTTCCG SEQ ID No 2 >tRNApyl de Methanosarcina acetivorans, TS; sequência codificante GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGC CGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCG SEQ ID No 3 >tRNApyl de Methanosarcina mazei Go1, TS; sequência codificante GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGC CGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCG SEQ ID No 4 >tRNApyl de Methanococcoides burtonii DSM, TS; sequência codificante GGAGACTTGATCATGTAGATCGAACGGACTCTAAATCCTTTCAGC CGGGTTAGATTCCCGGAGTTTCCG SEQ ID No 5 >tRNApyl de Desulfobacterium hafniense, TS; sequência codificante GGAAACCTGATCATGTAGATCGTGGACTCTAAATCCGCAGCCGGG TAGATTCCCGGGGTTTCCG SEQ ID No 6 >Sequência terminadora usada para construções de tRNApyl de caixa A e/ou caixa B TS e mutantes gacaagtgcggttttttt SEQ ID No 7 > tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A10G ("tRNA-A1"); sequência codificante ggaaacctggtcatgtagatcgaatg gactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttc cg SEQ ID No 8 tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A10G A52C ("tRNA-AB"); sequência codificante ggaaacctggtcatgtagatcgaatg gactctaaatccgttcagccgggttcgattcccggggtttc cg SEQ ID No 9 tRNApyl de Methanosarcina mazei mutação A52C ("tRNA-B"); sequência codificante ggaaacctgatcatgtagatcgaatg gactctaaatccgttcagccgggttcgattcccggggtttc cg SEQ ID No 10 tRNApyl de Methanosarcina mazei mutações A10G, T14A, A52C ("tRNA-A2B"); sequência codificante ggaaacctg gtcaagtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcgattcccggggttt ccg SEQ ID No 11 tRNApyl de Methanosarcina mazei mutações A52C, T14A ("tRNA-A2"); sequência codificante ggaaacctg gtcaagtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcgattcccggggttt ccg SEQ ID No 12 Sequência da região 5' do promotor de 7SL cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgacc SEQ ID No 13 Espaçador usado em construções de 7SL acca SEQ ID No 14 Construção de tRNA de 7SL-TS cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgaccaccagg aaacctg atcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttag attcccg gggtttccg gacaagtgcggttttt SEQ ID No 15 Construção de tRNA de 7SL-B cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgaccaccagg aaacctg atcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcg attcccg gggtttccg gacaagtgcggttttt SEQ ID No 16 Construção de tRNA de 7SL-A1 cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgaccaccagg aaacctg gtcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttag attcccg gggtttccg gacaagtgcggttttt SEQ ID No 17 Construção de tRNA de 7SL-AB cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgaccaccagg aaacctg gtcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcg attcccg gggtttccg gacaagtgcggttttt SEQ ID No 18 Construção de tRNA de 7SL-A2B Cccagttgatgacgtcaccataccacagcttctagtgctattctgcgccggtatccgaccaccagg aaacctg gtcaagtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcg attcccg gggtttcc ggacaagtgcggttttt SEQ ID No 19 Sequência terminadora usada nas construções 7SL, Vault, EBER GACAAGTGCGGTTTTT SEQ ID No 20 Sequência da região 5' do promotor de Vault tggtcgctgagtcatgctgaagcactctctttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aataaaatataatccgaaagcaacctc SEQ ID No 21 Espaçador usado para Construções Vault-tRNA CCACCA SEQ ID No 22 Construção de tRNA de Vault-TS tggtcgctgagtcatgctgaagcactctctttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aataaaatataatccgaaagcaacctcccaccagg aaacctgatcatgtagatcgaatggactc taaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttt SEQ ID No 23 Construção de tRNA de Vault-B tggtcgctgagtcatgctgaagcactctctttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aataaaatataatccgaaagcaacctcccaccagg aaacctgatcatgtagatcgaatggactc taaatccgttcagccgggttcgattcccggggtttccggacaagtgcggttttt SEQ ID No 24 Construção de tRNA de Vault-AB tggtcgctgagtcatgctgaagcactctctttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aataaaatataatccgaaagcaacctcccaccaggaaacctggtcatgtagatcgaatggactc taaatccgttcagccgggttcgattcccggggtttccggacaagtgcggttttt SEQ ID No 25 Construção de tRNA de Vault-A2B Tggtcgctgagtcatgctgaagcactctctttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aataaaatataatccgaaagcaacctcccaccaggaaacctggtcaagtagatcgaatggact ctaaatccgttcagccgggttcgattcccggggtttccggacaagtgcggttttt SEQ ID No 26 Sequência da região 5' do promotor de EBER2 agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaac SEQ ID No 27 Espaçador usado em construções EBER acca SEQ ID No 28 Construção de tRNA de EBER2-TS agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaacaccaggaaacctgatcatgtagatcgaatg gactctaaatccgttcagccg g gttagattcccgg ggtttccgggacaagtgcggttttt SEQ ID No 29 Construção de tRNA de EBER2-B agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaacaccaggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgg gttcgattcccgg ggtttccgggacaagtgcggttttt SEQ ID No 30 Construção de tRNA de EBER2-A1 agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaacaccaggaaacctggtcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgg gttagattcccgg ggtttccgggacaagtgcggttttt SEQ ID No 31 Construção de tRNA de EBER2-AB agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaacaccaggaaacctggtcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgg gttcgattcccgg ggtttccgggacaagtgcggttttt SEQ ID No 32 Construção de tRNA de EBER2-A2B agatgcacgcttaaccccgcctacaaccgtgacgtagctgtttaccagcatgtatagagttacggtt cgctacatcaaacaccaggaaacctggtcaagtagatcgaatggactctaaatccgttcagccg ggttcgattcccggggtttccgggacaagtgcggttttt SEQ ID No 33 Sequência do promotor de H1 Aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagag acttataagttccctatcagtgatagagacacca SEQ ID No 34 Construção de tRNA de H1-TS aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagaga cttataagttccctatcagtg atagagacaccaggaaacctgatcatgtag atcgaatggactcta aatccgttcagccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt SEQ ID No 35 Construção de tRNA de H1-B Aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagag acttataagttccctatcagtgatagagacaccagg aaacctgatcatgtagatcgaatggactct aaatccgttcagccgggtcagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt SEQ ID No 36 Construção de tRNA de H1-A1 aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagaga cttataagttccctatcagtgatagagacaccaggaaacctggtcatgtagatcgaatggactcta aatccgttcagccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt SEQ ID No 37 Construção de tRNA de H1-A2 aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagaga cttataagttccctatcagtgatagagacaccaggaaacctggtcaagtagatcgaatggactcta aatccgttcagccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt SEQ ID No 38 Construção de tRNA de H1-A2B aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagaga cttataagttccctatcagtgatagagacaccaggaaacctggtcaagtagatcgaatggactcta aatccgttcagccgggtcagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt SEQ ID No 39 Sequência terminadora usada nas construções H1-tRNA: gacaagtgcggttttttt SEQ ID No 40 Sequência codificante de tRNAglu de M.Musculus tccctggtggtctagtggttaggattcg gcgctctcaccg ccgcggcccg g gttcgattctcggtca gggaa SEQ ID No 41 tRNA Glu de Mus musculus com regiões não codificantes 5' e 3': Gcctgtagtagtccgccggagcggaggttccaggcgggcaagcagtgtatctgccacggtggc ggagaggctgtgtgtctgagtgtctccaggagtcggtagccgtgacctcgggccgacgctccctg gtggtctagtggttagg attcggcgctctcaccg ccgcg gcccg ggttcgattctcggtcagggaa gcctctcttcttcctctctgcaccctcacttccccaaacctcgctcctcttccctcgctcacttttgccca acaccaacgcacacc SEQ ID No 42 Construção de DNA 1xtRNAglu-pyl gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcg gcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatc gaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttct SEQ ID No 43 3x tRNAglu-pyl: Construção de DNA incluindo 3 repetições da construção bicistrônica tRNAglu-tRNApyl gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcg gcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatc gaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttctgcaccct cacttcagctgagccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgct ctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacct gatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcc tcttttctgcaccccaatattgccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattc ggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcgg aaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccg tagcgtcctttttggaaagacaagtgggtggcgaattcgatatc SEQ ID No 44 Sequência líder 5' para construções de tRNAglu-pyl gccgtgacctcgggccgacgc SEQ ID No 45 Sequência terminadora usada nas construções tRNAglu-pyl tagcgtcctttttg SEQ ID No 46 Sequência terminadora usada nas construções tRNAglu-pyl Cttcttcctcttttct SEQ ID No 47 Sequência intergênica usada nas construções tRNAglu-pyl gcctctcccccaaacctc SEQ ID No 48 Sequência codificante de tRNAasp de M. Musculus Tcctcgttagtatagtggtg agtatccccgcctgtcacccgcgag accgg cgttccattccccgac ggggag SEQ ID No 49 tRNA Asp de M. musculus com regiões a montante e a jusante tgggtgagacggaggttgtgggtcgtgtgtgtcgtcgtagacggtcgggcgacggtgcgtcgtagt cggcgttgtcctcgttagtatagtggtgagtatccccg cctgtcacccgcgagaccg gcgttccattc cccgacggggagacgtagcgtcctttttggaaagacaagtgggtggcccgcggg SEQ ID No 50 Construção de DNA 1x tRNAasp-pyl ggtgcgtcgtagtcggcgttgtcctcgttagtatagtggtg agtatccccgcctgtcacccgcgaga ccggcgttccattccccgacggggagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcg a atggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccg SEQ ID No 51 2x tRNAasp-pyl: Construção de DNA incluindo 2 repetições da construção bicistrônica tRNAasp-pyl tcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacg gggagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagc cgggttagattcccggggtttccgtagcgtcctttttggaaagacaaggtgcgtcgtagtcggcgttg tcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacg gggagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagc cgggttagattcccggggtttccgtagcgtccttttt SEQ ID No 52 Sequência líder usada na construção 2xAsp-pyl Ggtgcgtcgtagtcggcgttg SEQ ID No 53 Sequência terminadora usada na construção 2xAsp-pyl tagcgtccttttt SEQ ID No 54 Sequência intergênica usada nas construções tRNAasp-pyl acgtagccccacctc SEQ ID No 55 Sequência codificante de tRNAglu humano TCCCTGGTGGTCTAGTGGCTAGGATTCGGCGCTTTCACCGCCGC GGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGGAAT SEQ ID No 56 Sequência codificante de tRNAasp humano TCCTTGTTAGTATAGTGGTGAGTGTTTCTGCCTGTCATGTGGAGAC TGGAGTTTGAGTCCCCAACAGGGA SEQ ID No 57 Variante do promotor de 7SL: 7SL-1 CGCTCCCCAATGACGTAACTGCCCTGC-AGCTTCTAGTAGCT- TTTCGCAGCGTCTCCGACCG SEQ ID No 58 Variante do promotor de 7SL: 7SL-2 TCTGGTTGCTACCATGTGTAGCC- TGCAAGCCTCTAGCAGCTCTTTTGCAGCGACGCCGACCG SEQ ID No 59 Variante do promotor de 7SL: SL28 TAACATTGCTAATGAGTTTTGGGCACACATTGTCATTGATAACATC TTATCAGGAGACAGGG SEQ ID No 60 Variante do promotor de 7SL: 7L63 ACAGAGGAACTACCATAACAAGAACCAAAGAGAAATGGCAtACcTC AGG SEQ ID No 61 Variante do promotor de 7SL: 7L23 CTCCCTCTCAAAACTCAAGGAAATCTAGTGGGCATGGTGCACAT SEQ ID No 62 Variante do promotor de 7SL: 7L7 AGGTACTACCCAATGGTTTTCTAAAATACTTGCATC- TGCACATGCCATG SEQ ID No 63 Variante do promotor de EBER: EBER1 GATCCAAACTTTTGTTTTAG GATTTATGCA TCCATTATCC CGCAGTTCCA CCTAAACGGG GCTTAACGTT GCATCCCAGA AGATGCACGC TTAACCCCGC CTACAACCGT GACGTAGCTG TTTACCAGCA TGTATAGAGT TACGGTTCGC TACATCAAAC SEQ ID No 64 Variante do promotor de Vault: Hvg3 aggtcgctgagtcaagctaaagcaccgttgttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccagt caagaaaatacaatccgaaagcaacctctg SEQ ID No 65 Variante do promotor de Vault: Hvg2 Tggttgctgagtcatgctaaaacactgttgttttgactcactttgtgacgtaggtctttctcaccagtca agaaaatataatccggagatagcctctg SEQ ID No 66 Sequência de aminoácidos de pylRS de Methanosarcina mazei Mdkkplntlisatglwmsrtgtihkikhhevsrskiyiemacgdhlvvnnsrssrtaralrhhkyrkt ckrcrvsdedlnkfltkanedqtsvkvkvvsaptrtkkampksvarapkplenteaaqaqpsgsk fspaipvstqesvsvpasvstsissistgatasalvkgntnpitsmsapvqasapaltksqtdrlevll npkdeislnsgkpfrelesellsrrkkdlqqiyaeerenylgklereitrffvdrgfleikspilipleyier mgidndtelskqifrvdknfclrpmlapnlynylrkldralpdpikifeigpcyrkesdgkehleeftml nfcqmgsgctrenlesiitdflnhlgidfkivgdscmvygdtldvmhgdlelssavvgpipldrewgi dkpwigagfglerllkvkhdfknikraarsesyyngistnl SEQ ID No 67 Sequência de nucleotídeos de pylRS de Methanosarcina mazei atggataaaaaaccattgaatacgctcattagcgcaactgggctgtggatgagccgtacgggaa cgattcataaaatcaagcaccacgaagtatctcgtagcaaaatctatatcgagatggcttgcggc gaccatctcgtggtaaacaatagcaggtcctcacggaccgcccgtgccttgcgccaccacaaat atcgtaaaacttgtaagagatgtagagtgagcgacgaggatctgaacaagtttcttacaaaggcc aacgaggaccaaaccagcgtcaaagtcaaggttgtgagcgccccaacacgcaccaagaagg ccatgcccaagtctgttgcgcgggcaccgaaacctctggagaatactgaggccgctcaggccca gcccagcggttcaaaattctctcctgccattccagttagcactcaagagtcagtcagcgtgcccgc ctctgtgtctacatccatcagctctatctccaccggcgcaacagcctctgccctggtgaagggtaat acgaaccctatcacgagtatgtccgcacccgtgcaagcaagtgctcccgcactcactaaatccc aaacggaccggctggaggtcctgcttaaccctaaggatgaaatcagcctgaacagtggaaaac cgtttcgagaactggaatccgagctcttaagccggcgaaagaaagatttgcaacagatttacgcc gaagaacgggaaaattatctgggcaagctggagagagaaatcactaggttctttgtagataggg gctttctggagattaagagtcccatattgatccctctcgaatacattgagcgtatgggcatcgacaa cgacacagaacttagcaagcagatctttcgggtggacaaaaacttctgcctcaggcctatgctgg ctccaaatctgtacaactatcttaggaaactcgaccgggccctgcccgatcccattaaaatcttcga aattggaccttgctatagaaaggagagcgatggcaaggagcacctggaggagtttactatgctc aatttctgtcaaatgggctccggctgcacacgtgagaacctcgaatccattataaccgacttcctga atcacctggggattgatttcaagatcgtgggcgactcctgcatggtgtttggtgatacgttggatgtg atgcacggagatttggaattgtcaagcgctgtggtaggccccattcctctcgacagggagtggggt attgacaagccctggatcggcgcaggttttggactggagcgcctgttgaaggttaagcatgacttc aaaaacataaagagagccgcacgcagcgaatcctattataatggaatcagcactaacttgtaa

[00264] Ao longo da especificação e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outro modo, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas referidos, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas.

[00265] O pedido de que esta descrição e reivindicações fazem parte pode ser usado como base de prioridade relativamente a qualquer pedido subsequente. As reivindicações de tal pedido subsequente podem ser dirigidas a qualquer característica ou combinação de características descritas aqui. Podem tomar a forma de reivindicações de produto, composição, processo, ou uso e podem incluir, a título exemplar e sem limitação, as reivindicações seguintes:-

Claims (11)

1. Construção de DNA caracterizada por um gene tRNApyl compreendendo uma sequência codificante de tRNApyl e uma sequência promotora intragênica funcional de RNA polimerase III que é capaz de atuar para expressar suficientemente tRNApyl funcional para suportar supressão âmbar em um sistema de expressão eucariótico; em que o gene tRNApyl contém 1 ou 2 mutações de nucleotídeos na caixa A putativa e/ou caixa B putativa do promotor de RNA polimerase III intragênico,em que o gene tRNApyl consiste em uma sequência de SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11 derivada de Methanosacrina mazei ou consiste em uma sequência de um gene tRNApyl análogo derivado de outra espécie bacteriana com mutações feitas em posições equivalentes a A10G, A52C, T14A ou uma combinação dos mesmos, nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11.

2. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma sequência terminadora que está a jusante da sequência codificante de tRNApyl.

3. Construção de DNA de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o gene tRNApyl contém mutações em 1 ou 2 posições de nucleotídeos na caixa B putativa.

4. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene tRNApyl consiste em uma sequência SEQ ID No 5, SEQ ID No 2, SEQ ID No 4, ou um gene tRNApyl derivado de Methanosarcina thermophila, com mutações feitas em posições equivalentes a A10G, A52C, T14A ou uma combinação dos mesmos, nas SEQ ID Nos 7, 8, 9, 10 ou 11.

5. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a sequência codificante de tRNApyl é operavelmente ligada a um promotor de RNA polimerase III, em que o referido promotor é colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl; e opcionalmente o promotor 5' e a sequência codificante de tRNApyl estão separados por uma sequência espaçadora contendo um local de início da transcrição; ou em que a construção de DNA compreende um elemento promotor intragênico e em que um elemento promotor 5' é um elemento promotor de RNA polimerase III colocado a 5' da sequência codificante de tRNApyl de modo que a combinação do referido elemento promotor intragênico e referido elemento promotor 5' constitui um promotor híbrido; em que opcionalmente o promotor 5’ e a sequência codificadora de tRNApyl são separados por uma sequência espaçadora contendo um local de início de transcrição.

6. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que referido elemento promotor 5' é o elemento 5' de um promotor de RNA polimerase III do Tipo T4.

7. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o elemento promotor 5' de promotor de RNA Polimerase III do Tipo 4 é selecionado de:- elementos promotores 5' do promotor do gene de RNA EBER, do promotor do gene de RNA 7SL e do promotor do gene de RNA Vault, e - SEQ ID Nos 12, 20, 26, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 e 65.

8. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de que a sequência espaçadora é selecionada das SEQ ID NOs 13, 21 e 27.

9. Construção de DNA multimérica caracterizada por 2 até 60 cópias da construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por uma sequência codificante PylRS ou gene PylRS.

11. Processo de preparação de uma proteína-alvo contendo um ou mais aminoácidos não naturais codificados por um códon âmbar, caracterizado por expressar a referida proteína-alvo em uma linhagem de células eucarióticas que é transformado com um vetor compreendendo um construto de DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, que é transformada com um gene codificando uma proteína-alvo.

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