JP2016509855A - 新規の核酸分子 - Google Patents

Abstract

中でも、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列と、真核生物発現系において、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡｐｙｌを発現させるように作用することができるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ配列とを含むＤＮＡ構築物が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、中でも、新規の核酸分子、それらを含むベクター、真核宿主細胞、及び前記ベクターで形質転換された宿主細胞株、並びにタンパク質生産、特に非天然アミノ酸を含有するタンパク質の生産におけるそれらの使用に関する。

古細菌（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）（メチルアミンを異化するメタン生成古細菌）のサブセットにおいて自然に変化した、１つの直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ＲＳ／ｔＲＮＡペアが、アミノ酸ピロリシンに対する特異性を有することが認められる。ピロリシンは、２１番目のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを用いるが、これは、自然に変化して他の全てのアミノ酸及びｔＲＮＡに対して直交性になった。

ピロリシンは、天然のアミノ酸で、アンバーコドンにより真正に指定される唯一のアミノ酸である。Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００４は、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンバーコドンにピロリシンを組み込むことができることを証明した。彼らは、ｗｔＰｙＬＲＳが、天然に乱交雑性であり、リシンの類似体を組み込み得ることも明らかにした。

Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ（欧州特許第１９１１８４０号明細書）は、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ系が、真核細胞において直交性であることを立証し、細菌細胞のアンバーコドンによってコード化された標的タンパク質への複数のｎｎＡＡの組み込みを示した。これらの著者は、アミノ酸結合ポケットを形成し、かつ、他の規定アミノ酸に対してピロリシンを選択する上で機能する、ｐｙｌＲＳの重要なアミノ酸も明らかにした。この部位での突然変異によって、ｔＲＮＡｐｙｌを認識し、ＡｚＺ−ｌｙｓでアミノアシル化することができる突然変異体が作製された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８）。

この直交性は、細菌及び真核細胞まで拡張する。

ＰｙｌＲＳは、天然に進化してリシンを排除した、天然に乱交雑性のシンテターゼであるが、アジド、アルキン及びアルケンなどのリシン類似体を突然変異なしで組み込み得る（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。この特異性の基準は、ｐｙｌＲＳ結合ポケットのアミノ酸残基と、シンテターゼの活性部位におけるアミノ酸を安定化し、かつ正しく配置するピロリシンのピロール環との疎水性相互作用に依存する（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このＲＳ／ｔＲＮＡペアは、細菌、酵母及び哺乳動物細胞中に、一過性トランスフェクションによって導入されており、標的タンパク質へのいくつかの非天然アミノ酸の組み込みに有効であることがわかっている。

例えば、欧州特許第１９１１８４０号明細書は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における標的タンパク質へのＮ−ε−ｂｏｃ−リシンの組み込みを立証している。

真菌細胞におけるｔＲＮＡの発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（「ＰｏｌＩＩＩ」）により実施され、これは、２つの部分から成る構造を含む２型遺伝子内プロモータを必要とし、ここには、Ａボックス及びＢボックスとして知られる２つの短い保存配列が、可変配列によって隔てられている。哺乳動物のｔＲＮＡ遺伝子とは対照的に、原核生物のｔＲＮＡ遺伝子は、遺伝子外プロモータエレメントによって調節される。その結果、多くの原核生物のｔＲＮＡは、哺乳動物細胞においてプロモータとして機能するＡボックス及びＢボックスエレメントを含有していない。このことは、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）由来のｔＲＮＡｐｙｌにもあてはまる。

ｔＲＮＡｐｙｌコード配列をＰｙｌＲＳと一緒に哺乳動物細胞に導入しても、リポータ構築物のアンバー抑制は起こらなかったが、これは、保存Ａ−及びＢボックスエレメントが欠失しているためであると推測される（Ｍｕｋａｉ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。

Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ（Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ，２０１０．ＪＡＣＳ）は、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌ内の機能性Ａボックス及びＢボックスを再構築しようとして、酵母における突然変異ｔＲＮＡ遺伝子の機能性アンバー抑制を立証することに失敗したが、これは、ｔＲＮＡ配列にＡ−及びＢボックスエレメントを導入するあらゆる修飾が、ｔＲＮＡアーキテクチャを改変し、その機能全体を妨害することを示唆している。Ｍｍ ｔＲＮＡｐｙｌの配列解析から、Ｂボックスは、共通Ｂボックスに対し有意な相同性を有するが、Ａボックスは、有意なダイバージェンスを呈示することが明らかである。

哺乳動物細胞においてサプレッサーｔＲＮＡを発現させるための最適条件をみいだす試みは、遺伝病の遺伝子治療のためのナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの作製に関連して、１９８２年（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ，１９８２，Ｌａｓｋｉ ｅｔ ａｌ，１９８２）にさかのぼり、その際、ある停止コドンが、ある主要タンパク質の転写の早期終結を引き起こした。

細胞に導入されるＤＮＡの量、ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数、並びにその発現を駆動するプロモータエレメントが、例えば、細胞に毒性をもたらさずに効率的な活性を可能にするために、最適なｔＲＮＡレベルを達成するための重要な要素として特定された。

バイシストロニック構築物のプロセシングによるｔＲＮＡの発現が、真核細胞に存在することが判明している。酵母細胞において、ｔＲＮＡａｒｇ−ｔＲＮＡａｓｐについてゲノムによりコード化された遺伝子ペアが記載されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．１９８０）。この遺伝子は、単一の前駆体ＲＮＡとして発現され、これは、転写後に修飾されて、ｉｎ ｖｉｖｏで、及び卵母細胞抽出物中に、２つの成熟ｔＲＮＡを生成する。この場合、これらのｔＲＮＡ遺伝子は、ＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴ（配列番号６８）から成る短いスペーサ領域により隔てられている。この遺伝子配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、通常酵母に発現しないｔＲＮＡを発現させるためにも用いられている（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ １９９０）。ここで、共通Ａ−及びＢボックスエレメントを含むが、酵母では転写されないヒトｔＲＮＡｍｅｔ遺伝子を、ｔＲＮＡａｒｇエレメントの下流に配置したとき、酵母細胞において発現させることに成功した。上記の著者は、２つのＲＮＡ遺伝子の距離が、転写効率に影響することを示している。遺伝子外ｔＲＮＡの発現は、２つのｔＲＮＡが、酵母Ａｒｇ−Ａｓｐ ｔＲＮＡペアの間に存在する短い１０ｂｐチミジンリッチスペーサによって隔てられた場合に達成された。ｔＲＮＡｍｅｔ遺伝子の発現はまた、このスペーサ長さが、介在配列から増加した（９２ｂｐまで）ときにも認められたが、その有効性は低かった（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。別の例では、Ｓｔｒａｂｙ（１９８８）は、通常転写的にサイレントなサプレッサーｔＲＮＡｓｕｐ（ｔｙｒ）を発現させるために、バイシストロニック酵母Ａｒｇ−Ａｓｐ ｔＲＮＡ遺伝子ペアを使用した。一構築物において、ｔＲＮＡｓｕｐをｔＲＮＡａｓｐ遺伝子の代わりに用い、酵母Ａｒｇ−Ａｓｐ ｔＲＮＡペアの間に存在する短い１０ｂｐチミジンリッチスペーサを保持したところ、効率的なｔＲＮＡｓｕｐ発現を示した。

ｔＲＮＡはさらに、Ｕ６プロモータ（Ｋｏｕｋｕｎｔｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００８）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ（Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００８）、ＳＮＲ５２（Ｗａｎｇ及びＷａｎｇ，２０１２）などの外部プロモータの下で、また、上流ｔＲＮＡ遺伝子により調節されるバイシストロニック構築物の１成分として（Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｔｒａｂｙ １９８８；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００８）；ｔＲＮＡｓｅｒなどの多量体として（Ｂｕｖｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）も発現されている。

Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，１６８，４０７号明細書も参照）並びにＨａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．により、様々な遺伝子外プロモータが、ｔＲＮＡｐｙｌの発現について調べられている。これらには、ヒトｔＲＮＡ、例えば、バイシストロニック構築物としてのｔＲＮＡｖａｌ又はｔＲＮＡａｒｇが含まれた。バイシストロニック系は、酵母細胞において機能性であった（Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌを参照）が、Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）は、真核細胞において真核生物ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｖａｌ）遺伝子の下流にｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を配置すると、最適に満たないｔＲＮＡｐｙｌの発現が起こり、これは、発現レベルが、哺乳動物細胞における最適なアンバー抑制には低すぎたため、理想的ではなかったことを報告している。

さらに、Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）及びＨａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、ｔＲＮＡｐｙｌの発現用のＰｏｌＩＩ依存性ＣＭＶプロモータ、さらにはファージＴ７ポリメラーゼプロモータ、また、核内低分子ＲＮＡ Ｕ６の遺伝子のＰｏｌＩＩＩ／３型プロモータを試験した。特に、上記著者は、ｔＲＮＡｐｙｌのコード配列の５’末端に連結したＵ６プロモータが、ＰｙｌＲＳ、ｎｎＡＡ及びアンバーコドン含有標的と一緒に真核細胞に導入したとき、アンバー抑制を引き起こす上でとりわけ効率的であったことを明らかにした。

ｓｎＲＮＡ遺伝子Ｕ６及びＨ１のプロモータは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ種の発現に広く用いられてきた。これらのプロモータは、遺伝子外プロモータとしてのその機能を考えれば、発現ツールとして特に有用である。さらに、上記プロモータは、それらのエレメントの下流に配置される遺伝子の極めて高度な発現を可能にする。

しかし、Ｕ６及びＨ１プロモータは、これらの構築物でトランスフェクトした細胞に有害な作用をもたらし、このプロモータの高い転写要求のために起こると考えられる細胞傷害性を引き起こすことがわかっている（Ｅｈｌｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）（Ｇｉｅｒｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００８）（Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００５）。さらに、とりわけＵ６プロモータは、ＲＮＡ産物の局在化に影響を与え、核内に多く見られる蓄積を引き起こすことも判明しているため、細胞質機構によるその使用に問題をもたらす（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

前述した遺伝子外プロモータの使用は、ｔＲＮＡｐｙｌの高レベルの発現をもたらしたが、発現したｔＲＮＡの大部分は、核分画内の誤った場所に局在化されるため、細胞質ゾル中のアミノアシル化には利用できないと思われる。効率的なアンバー抑制は認められたが、これは、核から逸脱したｔＲＮＡの比較的小さい部分によるものであった可能性がある。

よって、ｔＲＮＡの優れた局在化と、転位機構へのその利用可能性を可能にするために、別のｔＲＮＡプロモータを作製することが望ましい。

また、前記ｔＲＮＡ構築物を安定して発現する細胞株における低レベルのタンパク質発現、及び細胞生存能の低下に寄与すると考えられる、Ｕ６及びＨ１プロモータエレメントなどの外部プロモータについて報告されている細胞傷害作用の発生を防ぐｔＲＮＡプロモータを作製することも望ましい。

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（本明細書では「ＰｏｌＩＩＩ」と称することもある）転写機構は、真核細胞における小サイズの非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）の生産に向けられる（Ｄｉｅｃｉ ｅｔ ａｌ．２０１３による論文）。

ＰｏｌＩＩＩ転写遺伝子は、このポリメラーゼにより選択的に認識される転写因子と結合し、これにより活性化される。これらの因子は、それぞれ対応した異なるプロモータアーキテクチャによって指定されるように、２、３の異なる組み合わせで作用する。これらは、主として３つのクラスに分類される：１型プロモータ（例えば、５Ｓ ｒＲＮＡにより用いられるもの）は、遺伝子内エレメント（遺伝子のコード配列内に存在するプロモータ）を含み、Ａボックス、Ｃボックス及び中間エレメント（ＩＥ）に細分される内部制御領域から構成される。これらのエレメントは、基礎転写因子ＴＦＩＩＩＣ及びＴＦＩＩＩＡにより結合されるため、転写に必要である。２型プロモータは、ｔＲＮＡ遺伝子により用いられ、Ａボックス及びＢボックスとして知られる保存エレメントから構成される遺伝子内プロモータを含む。これらは、転写因子ＴＦＩＩＩＣの結合部位であり、これが、次には、転写開始部位に関して位置−４０まで延びる上流領域に開始因子ＴＦＩＩＩＢを動員する。３型プロモータは、遺伝子外の、上流に位置するプロモータであり、遠位及び近位配列エレメントとＴＡＴＡボックスから構成される。Ｕ６ｓｎＲＮＡ及びＲＮａｓｅＰ（Ｈ１）ＲＮＡのプロモータは、このプロモータクラスのメンバーである。これらのプロモータは、転写因子ＳＮＡＰｃ（ＰＢＰ又はＰＴＦ）により独自に認識され、これが、次には、ＴＦＩＩＩＢの特定の変異体を動員する。興味深いことに、ＰｏｌＩＩＩ／３型プロモータは、真核細胞における阻害性ＲＮＡの発現並びにＡ−及びＢボックスエレメントを欠失したｔＲＮＡの発現のために改変されており、例えば、哺乳動物細胞のＵ６プロモータ（Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００８）及び酵母で用いられるＳＮＲ５２プロモータ（Ｗａｎｇ及びＷａｎｇ，２０１２）がある。

いくつかのｎｃＲＮＡ遺伝子の発現は、３型プロモータと同様に、遺伝子内プロモータ、例えば、ｔＲＮＡ遺伝子により用いられるＡボックス及びＢボックスと組み合わせて、転写領域の上流に位置するプロモータエレメントによって調節される。これらは、遺伝子外及び遺伝子内制御エレメントの両方が存在することから、ハイブリッドプロモータと考えることができ、「４型プロモータ」と呼ぶ。これらのプロモータによって調節される遺伝子としては、７ＳＬ（ＳＲＰ）ＲＮＡ遺伝子、ヴォールト（Ｖａｕｌｔ）ＲＮＡ遺伝子、及びエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスにコードされた低分子ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）がある。

７ＳＬＲＮＡは、小胞体のルーメンへの分泌タンパク質の共翻訳挿入を媒介するシグナル認識粒子（ＳＲＰ）のＲＮＡ成分である。そのプロモータエレメントは、中でも、Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４において特性決定されている。

ＶａｕｌｔＲＮＡは、高分子アセンブリ及び輸送に関与する大型の細胞質リボ核タンパク質粒子に含まれる低分子ＲＮＡである。そのプロモータエレメントは、中でも、Ｍｏｓｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００２において特性決定されている。

ＥＢＥＲ遺伝子は、機能が不明の低分子ＲＮＡである。ＥＢＥＲは、哺乳動物細胞において効率的に発現されるエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスゲノムによりコード化され、その調節プロモータエレメントは、十分に特性決定されている（Ｈｏｗｅ及びＳｈｕ，Ｃｅｌｌ １９８９）。ＥＢＥＲは、２つの既知の変異体−ＥＢＥＲ１及びＥＢＥＲ２を有し、ＥＢＥＲ２の方が高レベルで発現される。

本発明者らは、真核細胞、特に哺乳動物細胞において、新規の改善されたプロモータ系の下、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の発現のための新規のＤＮＡ構築物を作製した。

ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子配列は、真核生物のＡボックス及びＢボックスに類似する２つの内部領域を有し、Ｂボックス様領域の方が、機能性Ｂボックスに酷似している。

Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ（２０１０）及びＭｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許第８，１６８，４０７号明細書）において報告されているように、共通Ａボックス及びＢボックスを再構成する以前の試みは成功しなかったが、本発明者らは、驚くことに、機能性の遺伝子内プロモータを可能にすると共に、ＷＴｐｙｌＲＳと組み合わせて効率的なアンバー抑制を媒介し得るｔＲＮＡｐｙｌが得られるように、ｔＲＮＡｐｙｌ配列を改変することができることをみいだした。

このような新規のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を用いて、細胞へのｎｎＡＡの組み込みのために高度に活性で、しかも安定した細胞株を作出することができる。

また、本発明者らは、機能性遺伝子内プロモータエレメントを含有する新規の修飾されたｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、これらを、４型プロモータ下で発現した遺伝子の５’調節エレメントの下流に配置し、これによって、遺伝子外及び遺伝子内エレメントの両方を含有する機能性４型プロモータを再構成することにより、さらに改善し得ることもみいだした。

さらに、本発明者らは、驚くことに、ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子及び／又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子が、ＷＴ ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の上流に配置されて、バイシストロニックメッセージを有効に形成するために、転写終結配列を欠失するように改変されると、ＷＴｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子及び／又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子の転写制御下で発現され得ることもみいだした。

本発明の新規ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子のタンデム反復配列を担持するＤＮＡ構築物は、アンバー抑制の増大をもたらすことが判明している。

本発明のＤＮＡ構築物（配列番号６９〜７１）を示す。 図１−１の続きである。 野生型メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号３）の推定Ａ及びＢボックス領域を示す。 ＷＴ及び突然変異メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）及びメタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ）ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子（それぞれ、配列番号７２、３、７３、及び７４）間の配列アラインメントを示す。 アンバー抑制依存性ＧＦＰ発現により立証されるように、ｔＲＮＡ突然変異体は、Ｈ１プロモータによって発現されると、機能を保持する。 遺伝子内ｐｏｌＩＩＩプロモータを含む突然変異ｔＲＮＡｐｙｌの使用から呈示され、アンバー抑制依存性ＧＦＰ発現の増大により立証される、機能性ｔＲＮＡ発現を示す。 ｔＲＮＡ突然変異体は、哺乳動物細胞において機能性であり、しかも直交性を保持する。 同じ構造物中の遺伝子の数の増加による遺伝子用量の増加によって、アンバー抑制依存性ＧＦＰ発現の増大が起こる。 アンバー抑制依存性ＧＦＰ発現により決定されるように、４型５’プロモータエレメントは、機能性Ｂボックスを含有するｔＲＮＡの発現を可能にする。 ４型５’プロモータエレメント及びｔＲＮＡ Ｂ突然変異体単独は、野生型ｔＲＮＡより高いレベルのｔＲＮＡ機能を可能にする。 同じ構造物中の遺伝子の数の増加による遺伝子用量の増加によって、アンバー抑制依存性ＧＦＰ発現の増大が起こる。 上流ｔＲＮＡｇｌｕ及びｔＲＮＡａｓｐ遺伝子により駆動されるｔＲＮＡｐｙｌ発現を示す。

配列表の簡単な説明：
配列番号１：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、ＷＴ
配列番号２：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、ＷＴ
配列番号３：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、ＷＴ
配列番号４：ｔＲＮＡｐｙｌメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、ＷＴ
配列番号５：ｔＲＮＡｐｙｌデスルホバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、ＷＴ
配列番号６：ＷＴ及び突然変異体Ａボックス及び／又はＢボックス及びｔＲＮＡｐｙｌ構築物に用いられる転写終結配列
配列番号７：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ突然変異、ｔＲＮＡ−Ａ１
配列番号８：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ、Ａ５２Ｃ突然変異、ｔＲＮＡ−ＡＢ
配列番号９：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ５２Ｃ突然変異、ｔＲＮＡ−Ｂ
配列番号１０：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ、Ｔ１４Ａ、Ａ５２Ｃ突然変異、ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ
配列番号１１：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ、Ｔ１４Ａ突然変異、ｔＲＮＡ−Ａ２
配列番号１２：７ＳＬプロモータ５’領域配列
配列番号１３：７ＳＬ構築物で用いられるスペーサ
配列番号１４：７ＳＬ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物
配列番号１５：７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物
配列番号１６：７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物
配列番号１７：７ＳＬ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物
配列番号１８：７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物
配列番号１９：７ＳＬ、Ｖａｕｌｔ、ＥＢＥＲ構築物で用いられる転写終結配列
配列番号２０：Ｖａｕｌｔプロモータ５’領域配列
配列番号２１：Ｖａｕｌｔ構築物に用いられるスペーサ
配列番号２２：Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物
配列番号２３：Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物
配列番号２４：Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物
配列番号２５：Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物
配列番号２６：ＥＢＥＲ２プロモータ５’領域配列
配列番号２７：ＥＢＥＲ構築物に用いられるスペーサ
配列番号２８：ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物
配列番号２９：ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物
配列番号３０：ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物
配列番号３１：ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物
配列番号３２：ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物
配列番号３３：Ｈ１プロモータ配列
配列番号３４：Ｈ１ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物
配列番号３５：Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物
配列番号３６：Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物
配列番号３７：Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ２構築物
配列番号３８：Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物
配列番号３９：Ｈ１−ｔＲＮＡ構築物で用いられる転写終結配列
配列番号４０：ハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡｇｌｕコード配列
配列番号４１：上流及び下流領域を有するハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡｇｌｕコード配列
配列番号４２：ｔＲＮＡｇｌｕ−ｔＲＮＡｐｌｙ ＤＮＡ構築物
配列番号４３：３×ｔＲＮＡｇｌｕ−ｔＲＮＡｐｙｌ：バイシストロニック構築物の３反復配列を含むＤＮＡ構築物
配列番号４４：ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物のリーダ配列
配列番号４５：ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物に用いられる転写終結配列
配列番号４６：ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物に用いられる転写終結配列
配列番号４７：ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物に用いられるインタージーン（ｉｎｔｅｒｇｅｎｅ）配列
配列番号４８：ハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡａｓｐコード配列
配列番号４９：上流及び下流領域を有するハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡａｓｐコード配列
配列番号５０：ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ ＤＮＡ構築物
配列番号５１：２×ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ：バイシストロニック構築物の２反復配列を含むＤＮＡ構築物
配列番号５２：ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられるリーダ配列
配列番号５３：ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられる転写終結配列
配列番号５４：ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられるインタージーン配列
配列番号５５：ヒトｔＲＮＡｇｌｕコード配列
配列番号５６：ヒトｔＲＮＡａｓｐコード配列
配列番号５７：７ＳＬプロモータ変異体：７ＳＬ−１
配列番号５８：７ＳＬプロモータ変異体：７ＳＬ−２
配列番号５９：７ＳＬプロモータ変異体：ＳＬ２８
配列番号６０：７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ６３
配列番号６１：７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ２３
配列番号６２：７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ７
配列番号６３：ＥＢＥＲプロモータ変異体：ＥＢＥＲ１
配列番号６４：Ｖａｕｌｔプロモータ変異体：Ｈｖｇ３
配列番号６５：Ｖａｕｌｔプロモータ変異体：Ｈｖｇ２
配列番号６６：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｐｙｌＲＳアミノ酸配列
配列番号６７：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｐｙｌＲＳヌクレオチド配列
配列番号６８：短いスペーサ領域
配列番号６９：図１に示すＤＮＡ構築物
配列番号７０：図１に示すＤＮＡ構築物
配列番号７１：図１に示すＤＮＡ構築物
配列番号７２：図３に示すＤＮＡ配列
配列番号７３：図３に示すＤＮＡ配列
配列番号７４：図３に示すＤＮＡ配列
配列番号７５：Ｖａｕｌｔプロモータの近位配列エレメント
配列番号７６：ＥＢＥＲプロモータのＳＰ１結合部位
配列番号７７：ＥＢＥＲプロモータのＡＴＦ結合部位

本発明によれば、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列と、真核生物発現系において、ナンセンス抑制（特にアンバー抑制）を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡｐｙｌを発現させるように作用することができるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ配列とを含むＤＮＡ構築物が提供される。

好適には、本発明のｔＲＮＡｐｙｌコード配列は、最後の３つのヌクレオチド、ＣＣＡを欠失しており、これらは、真核細胞において転写後に付加される。

好適には、本発明のＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の下流にある転写終結配列を含む。好適には、転写終結配列は、転写の終結のためのシグナルとして機能するｔＲＮＡコード配列の３’側の４つ以上のチミジンヌクレオチドの区間（ｒｕｎ）から構成される。

本発明の好ましい転写終結配列は、配列番号６、１９、３９、４５、４６及び５３、特に配列番号６として特定される。

一実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の２〜６０の反復配列を含む。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、２〜３０の反復配列、より好ましくは８つの反復配列を含む。

好適には、本発明のＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列と、機能性遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータとを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含む。前記遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、２つの成分−Ａボックス及びＢボックスを含む。

好適には、本発明は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータのＡボックス及び／又はＢボックス内の１つ又は２つのヌクレオチド位置に突然変異を含む、ＤＮＡ構築物を提供する。

例えば、本発明は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、Ｂボックス内の１つ又は２つ（例えば、１つ）のヌクレオチド位置に突然変異を含む、ＤＮＡ構築物を提供する。

本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、例えば、図１Ｄに示すように、遺伝子内ＰｏｌＩＩＩプロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含み、これは、真核生物発現系においてナンセンス抑制を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡＰｙｌを発現させるように作用することができる。

本発明の好ましい実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（特に配列番号９若しくは１０）由来の配列番号７、８、９、１０及び１１から選択される配列を有する、又は含むか、あるいは、配列番号７、８、９、１０及び１１（特に配列番号９若しくは１０）に太字で示される突然変異が同等位置に実施されている別の細菌種に由来する相似ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の配列を含む、ＤＮＡ構築物が提供される。

同等位置の決定は、従来のアラインメントプログラムにより、例えば、ＢＬＡＳＴＮを用いて実施してよい。

本発明の特に好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号９又は１０のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子と、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の下流の転写終結配列とを含み、該転写終結配列は、配列番号６である。

本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の複数のコピーを含む、ＤＮＡ構築物を提供する。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の２〜３０コピー、より好ましくは８コピーを含む。

一実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに作動可能に連結され、ここで前記プロモータは、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に配置されている、ＤＮＡ構築物を提供する。

好適には、５’プロモータとｔＲＮＡｐｙｌコード配列は、転写開始部位を含むスペーサ配列によって隔てられている。

好ましくは、スペーサ配列は、転写開始部位と、プロモータ配列の終了点からｔＲＮＡコード配列の開始点までの４〜６ヌクレオチドを含む。本発明で用いられる好ましいスペーサ配列は、配列番号１３、２１及び２７として記載される。

好適には、ＤＮＡ構築物は、遺伝子内プロモータエレメントと、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に配置されているＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータエレメントである５’プロモータエレメントとを、前記遺伝子内プロモータエレメントと前記５’プロモータエレメントとの組み合わせが、例えば、図１Ｃに示すハイブリッドプロモータを構成するように含む。

好適には、前記５’プロモータエレメントは、４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの５’エレメントである。従って、これは、典型的に、ｐｏｌ ＩＩＩ／３型プロモータのクラスに典型的な上流プロモータエレメントを含み、例えば、これは、ＴＡＴＡボックス（例えば、Ｕ６又はＨ１プロモータに用いられているもの）を含む。好適には、前記遺伝子内プロモータエレメントは、ｐｏｌＩＩＩ／２型プロモータに特有のエレメント、例えば、Ａ−及びＢボックス（例えば、真核細胞ｔＲＮＡプロモータに用いられているもの）を含む。

「エレメント」が、単一のヌクレオチド配列に限定されず、２つ以上のヌクレオチド配列を含むと解釈され得ることは理解されよう。従って、例えば、Ａ及びＢボックスは、合わせて「遺伝子内プロモータエレメント」を表すことができる。Ａ及びＢボックスは、遺伝子内プロモータエレメントの個別の成分として考えることもできる。

好ましくは、４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの５’プロモータエレメントは、ＥＢＥＲ ＲＮＡ遺伝子プロモータの５’プロモータエレメント、７ＳＬ ＲＮＡ遺伝子プロモータ、及びＶａｕｌｔ ＲＮＡ遺伝子プロモータから選択され、特に、７ＳＬ ＲＮＡ遺伝子プロモータである。

ＥＢＥＲ ＲＮＡ遺伝子プロモータは、例えば、ＥＢＥＲ変異体ＥＢＥＲ１又はＥＢＥＲ２、特にＥＢＥＲ２であってよい。

７ＳＬ ＲＮＡ遺伝子プロモータは、例えば、７ＳＬ−１、７ＳＬ−２、ＳＬ２８、７Ｌ６３、７Ｌ２３若しくは７Ｌ７であってよい。

Ｖａｕｌｔ ＲＮＡ遺伝子プロモータは、例えば、変異体Ｈｖｇ２又はＨｖｇ３であってよい。

好ましくは、前記５’プロモータエレメントは、配列番号１２、２０、２６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５から選択される。

好適には、前記５’プロモータエレメントとＲＮＡｐｙｌコード配列は、転写開始部位を含むスペーサ配列によって隔てられている。好適には、スペーサ配列は、転写開始部位と、プロモータ配列の終了点からｔＲＮＡコード配列の開始点までの４〜６ヌクレオチドを含む。本発明で用いられる好ましいスペーサ配列は、配列番号１３、２１及び２７として記載される。

好ましくは、４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、真核生物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、さらに好ましくは、ヒト遺伝子に由来する。

特に好ましい５’プロモータエレメントは、配列番号１２、２０及び２６から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列を含有するｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含む真核生物発現系において、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡＰｙｌを発現させるように作用することができるＤＮＡ構築物が提供され、前記ｔＲＮＡｐｙｌコード配列は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである５’プロモータエレメントに作動可能に連結された遺伝子内プロモータエレメントの推定Ａボックス及び／又はＢボックスに１つ又は２つのヌクレオチド位置に突然変異を含有し、ここで、前記遺伝子内プロモータエレメントと、前記５’プロモータエレメントとの組み合わせは、ハイブリッドプロモータを構成する。

本発明に関して特に好ましいＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子コード配列と、遺伝子内プロモータエレメントとを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含み、ここで、前記遺伝子は、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来の配列番号７、８、９、１０及び１１から選択される配列を有する、又は含むか、あるいは、配列番号７、８、９、１０及び１１において太字で示される突然変異が同等位置に実施されている別の細菌宿主に由来する相似ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の配列を含み、これは、真核生物発現系において、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡＰｙｌを発現させるように作用することができ、ここで、前記ｔＲＮＡｐｙｌコード配列は、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータエレメントである５’プロモータエレメントに作動可能に連結され、これらはスペーサ配列で隔てられており、前記５’プロモータエレメントと遺伝子内プロモータの組み合わせは、ハイブリッドプロモータを構成する。

従って、本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号１５、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２５、２８、２９、３０、３１及び３２、特に、配列番号１５、１６、１７、１８、２３、２５及び２９、特に配列番号１５、１８及び２３から選択される。

本発明の一態様は、前述したＤＮＡ構築物のいずれかの複数のコピー（例えば、２〜６０コピー、例えば、２〜３０コピー、例えば、８コピー）を含む多量体ＤＮＡ構築物を提供する。

本発明の特に好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号１５、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２５、２８、２９、３０、３１及び３２から選択されるｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の８コピーを含む。

本発明のＤＮＡ構築物において複数回反復される最も好ましいｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、配列番号１５、１８及び２３から選択される。

別の実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ２型プロモータを含む真核生物ｔＲＮＡ遺伝子に作動可能に連結され、図１Ａに示すように、バイシストロニックメッセージとして発現されるＤＮＡ構築物を提供する。

好適には、真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、３’終結配列を欠失しているため、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ２型プロモータの制御下で、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の発現を起こすことが可能である。

従って、ｔＲＮＡｐｙｌに作動可能に連結される真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、ｔＲＮＡｐｙｌの高レベルの発現をもたらす、ｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐである。

より好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子に作動可能に連結された真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、哺乳動物ｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐ、より好ましくはマウス又はヒト由来である。

従って、本発明は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に真核生物ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子を含むＤＮＡ構築物を提供し、ここで、前記ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子は、転写終結配列を欠失しているため、転写の際にバイシストロニックメッセージをもたらす。

ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、野生型遺伝子であってよい。あるいは、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、例えば、前述のように、Ａボックス及び／又はＢボックスに１つ又は２つのヌクレオチド位置に突然変異を含有してもよい。

好適には、第１ｔＲＮＡは、転写の終結のシグナルを構成するチミジンヌクレオチドが欠失した配列から成るスペーサ配列によって、第２ｔＲＮＡから隔てられている。

好ましいスペーサ配列は、配列番号４７及び５４に記載されている。

好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子に作動可能に連結された真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、配列番号４１、４９、５５若しくは５６の哺乳動物ｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐ；より好ましくは、配列番号４１若しくは４９のマウスｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐに作動可能に連結される。

一実施形態では、マウスｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子が、マウス細胞株でのｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の発現に用いられる。一実施形態では、ヒトｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子が、マウス細胞株でのｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の発現に用いられる。

本発明の特に好ましい実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、配列番号４２若しくは配列番号５０のバイシストロニックメッセージとして発現される。

別の実施形態では、最初のｔＲＮＡの前に５’リーダ配列が位置し、該リーダ配列は、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位（ＴＳＳ）、及び成熟ｔＲＮＡを生成するように、前駆体ｔＲＮＡ（ｐｒｅ−ｔＲＮＡ）の転写後プロセシングを調節する配列を含有し得る。

リーダ配列は、転写された任意の哺乳動物ｔＲＮＡのコード配列の上流の非翻訳領域から選択される。好ましくは、リーダ配列は、配列番号４４及び５２から選択される。あるいは、リーダ配列は、最初のｔＲＮＡの５’側のゲノム非翻訳領域に含まれる。

本発明の特に好ましい構築物は、配列番号４２又は５０のバイシストロニック転写単位の複数のコピー（例えば、２〜２０コピー）を含む。従って、本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２又は５０の転写単位の２、３、４、５、６、７若しくは８コピーを含む。本発明の最も好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２のｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌバイシストロニック転写単位の３コピーに相当する配列番号４３、及び配列番号５０のｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌバイシストロニック単位の２コピーに相当する配列番号５１である。

本発明の態様として、前述したＤＮＡ構築物のいずれも、ＰｙｌＲＳコード配列又は遺伝子を含んでもよい。

本発明の一態様によれば、前述したＤＮＡ構築物を含むベクターで形質転換した真核宿主細胞が提供される。

本発明の第２の態様によれば、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現するか、又は発現することができる真核細胞株が提供され、ここで、ｔＲＮＡｐｙｌは、本発明のＤＮＡ構築物と一緒に該細胞に導入され、これは、前記真核細胞株において機能する。

本発明の第３の態様によれば、無細胞発現系が提供され、ここで、宿主細胞から得られた合成反応溶解物は、ポリペプチドの合成に必要な少なくとも１つの成分を含む。

好適には、合成反応溶解物は、細菌又は真核細胞から得られる。好ましくは、合成反応溶解物は、真核細胞から、より好ましくは、ウサギ網状赤血球若しくは麦芽から得られる。

好ましくは、無細胞発現系は、ＷＴ ＰｙｌＲＳ及び本発明のｔＲＮＡｐｙｌを発現することができ、ここで、ｔＲＮＡｐｙｌは、本発明のＤＮＡ構築物と一緒に、合成反応溶解物を得るために用いられる細胞に導入される。

本発明での使用に好適な無細胞発現系は、例えば、国際公開第２０１００８１１０号パンフレット、同第２０１００８１１１１号パンフレット、同第２０１００８３１４８号パンフレットに記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の真核宿主細胞は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換してもよい。

一実施形態では、真核細胞株は、機能性ＰｙｌＲＳ及び機能性ｔＲＮＡｐｙｌを発現するか、又は発現することができ、ここで、機能性ｔＲＮＡｐｙｌ発現は、遺伝子内プロモータエレメントと、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータエレメントである５’プロモータエレメントとの制御下で起こるが、この発現は、前記遺伝子内プロモータエレメントと前記５’プロモータエレメントとの組み合わせが、ナンセンス抑制を支持する上で十分にハイブリッドプロモータを構成するように起こる。

好適には、ナンセンス抑制は、アンバー抑制である。

好適には、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。

本発明の第４の態様では、本発明は、ナンセンスコドンによりコード化される１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質を調製する方法を提供し、これは、真核細胞株において前記標的タンパク質を発現させるステップを含み、前記真核細胞株は、ナンセンスコドンによりコード化される１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質をコード化する遺伝子で形質転換されると共に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコード化する遺伝子でも、前記ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが、ナンセンス抑制を支持する上で、前記真核細胞株において十分に発現され、かつ機能するように、形質転換される。

好適には、宿主細胞は、本明細書に記載する本発明の他の態様のＤＮＡ構築物で形質転換される。

従って、本発明の実施形態で使用するナンセンスコドンは、アンバーコドン、オパールコドン、又はオーカーコドンであってよい。特に好ましいナンセンスコドンは、アンバーコドンである。

本発明は、化学的に修飾した標的タンパク質を調製する方法を提供し、これは、本発明の前記態様に従い標的タンパク質を調製するステップと、得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む。このタンパク質は、非天然アミノ酸上の側鎖を介して化学的に修飾してもよい。

従って、本発明の実施形態で使用する非天然アミノ酸、又はその少なくとも１つは、アルキン又はアジド部分を含んでもよい。これらの部分は、例えば、トリアゾールリンカー部分の生成をもたらすヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）反応による、化学修飾によく適合している。

本発明の第５の態様では、本発明の方法に従う製法を用いて調製された抗体コンジュゲートなどのタンパク質コンジュゲートが提供され、該コンジュゲートにおいて、抗体などのタンパク質が、タンパク質、薬剤及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数の他の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介して結合されている。

本発明の第６の態様では、本発明は、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現するように安定に形質転換された真核細胞株の生存能を高める方法を提供し、これは、真核細胞株をｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子で形質転換するステップを含み、該ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質を発現させるために、本発明のＤＮＡ構築物と一緒に前記細胞に導入され、かつ前記真核細胞株において機能する。

第７の態様では、本発明は、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質を発現すると共に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現するように安定に形質転換された真核細胞株の生存能を高める方法を提供し、これは、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが発現され、かつ機能するように、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコード化する遺伝子で、前記真核細胞株を形質転換するステップを含む。

定義及び略語：
本明細書で用いる場合、「遺伝子」とは、遺伝の単位に相当するゲノム配列の位置確認可能な領域を意味し、これは、調節領域、転写領域、及び又はその他の機能性配列領域を伴う。従って、遺伝子は、プロモータエレメントなどの調節領域と一緒に、コード配列（例えば、ｔＲＮＡのようなＲＮＡのコード配列）を含み得る。

本明細書で用いる場合、「遺伝子内プロモータ」とは、遺伝子配列内に含まれるプロモータを意味する。

本明細書で用いる場合、「転写領域」とは、コード配列、すなわち、成熟ＲＮＡ産物の一部である配列と、除去されているため、成熟ＲＮＡ中に現れない一次転写物の部分、例えば、ｔＲＮＡ前駆体の５’リーダ部分の両方を包含する。

本明細書で用いる場合、「プロモータエレメント」とは、プロモータ、特に、いくつかのエレメント（例えば、遺伝子内プロモータエレメント及び５’プロモータエレメント）を有し得るハイブリッドプロモータのエレメントを意味する。本明細書で用いる場合、「４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ」とは、１つ又は複数の上流プロモータエレメント（例：３型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに特有のもの、例えば、Ｕ６又はＨ１プロモータで用いられるＴＡＴＡボックス）、及び１つ又は複数の遺伝子内プロモータエレメント（例：２型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに特有のもの、例えば、ｔＲＮＡプロモータで用いられるＡ及びＢボックス）を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータを意味する。

本明細書で用いる場合、「ＴＡＴＡボックス」は、典型的に、特定の遺伝子のプロモータ領域に存在し、転写開始部位の上流に位置する、配列ＴＡＴＡＡＡを含むＤＮＡ配列又はその変異体である。

本明細書で用いる場合、「ナンセンスコドン」とは、アンバー、オーカー又はオパールコドンを意味する。

本明細書で用いる場合、「ナンセンス抑制」とは、ナンセンスコドンによる鎖終結の抑制を意味する。

本明細書で用いる場合、「ｎｎＡＡ」又は「非天然アミノ酸」とは、タンパク質への組み込みに好適なアミノ酸を意味し、遺伝子コードによって天然にコードされる２０のアミノ酸、ピロリシン及びセレノシステインの１つではない。

本明細書で用いる場合、「ＷＴ」とは、野生型、すなわち、自然界で天然に得られる形態を意味する。

本明細書で用いる場合、「ＲＳ」は、「ｔＲＮＡシンターゼ」の略語である。

本明細書で用いる場合、「ＴＳＳ」は、「転写開始部位」の略語である。

本明細書で用いる場合、「ＣＰＥ」は、「サイクリックＡＭＰ応答エレメント」の略語である。

本明細書で用いる場合、「ＰＳＥ」は、「近位配列エレメント」の略語である。

本明細書で用いる場合、「ＣＨＯ」は、「チャイニーズハムスター卵巣」の略語である。

本明細書で用いる場合、「コード配列」は、遺伝子産物（ｔＲＮＡ、ＲＳなど）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列であり、調節配列などの非コード配列は含まない。

本明細書で用いる場合、一次転写物の一部であるが、成熟ＲＮＡのものではない転写配列が存在する場合もあり、従って、これは「非コード」とみなされる。

本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ構築物」とは、発現系に導入しようとする核酸の人工的に構築されたセグメントを意味する。ＤＮＡ構築物は、典型的に、発現カセットを含み、核酸を発現系に導入するのに用いるベクター系に属するヌクレオチドも含有し得る。

本明細書で用いる場合、「発現カセット」とは、発現系に導入しようとする核酸の人工的に構築されたセグメントを意味し、これは、最適な発現に必要な任意の調節領域と一緒に、ｃＤＮＡ又はＲＮＡコード配列などの１つ又は複数の遺伝子コード配列を含む。発現カセットは、ベクター系に属するヌクレオチドは含まない。

本明細書で用いる場合、「バイシストロニック」転写物は、最終産物をコードする能力を有する転写物である。

本発明の細胞株に発現させようとするｔＲＮＡｐｙｌ
本発明のＰｙｌＲＳと組み合わせて発現させようとするｔＲＮＡｐｙｌは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するために、アンチコドンと、アンバーナンセンスコドンＵＡＧに対し相補的な３次構造を有する。

サプレッサーｔＲＮＡとして機能するために、ＵＧＡ、オパール；ＵＡＡ、オーカーコドンなどの他のナンセンスコドンと相補的な人工的ｔＲＮＡを構築することもできる。

従って、ｎｎＡＡをコードするアンバーコドンの使用を参照し、アンバー抑制の概念について論じることにより、本発明を実質的に説明し、例示するが、アンバーコドンに代わり、オパール又はオーカーコドンなどの別のナンセンスコドンを用いてもよく、その場合も同様に作用すると予想されることは、理解されよう。

しかし、アンバーコドンの使用が好ましい。

好ましくは、本発明のｔＲＮＡｐｙｌは、次の菌株：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号３）、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）（配列番号１）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）（配列番号５）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）（配列番号２）、メタノサルシナ・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）（配列番号４）、又はメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の１つに由来するｔＲＮＡｐｙｌである。

より好ましくは、本発明のｔＲＮＡｐｙｌは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号３）由来のｔＲＮＡｐｙｌである。

好適には、本発明の態様で用いるｔＲＮＡｐｙｌは、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）（配列番号１）由来のｔＲＮＡｐｙｌではない。

真核細胞株における発現を最適化することを目的としたｔＲＮＡｐｙｌ配列の操作は、国際公開第２００７０９９８５４号パンフレット、同１２０３８７０６号パンフレット、及びＨａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ（２０１０）に記載されており、これらの文献は、参照により本明細書に組み込む。

国際公開第２００７０９９８５４号パンフレットには、中でも、古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）由来のｔＲＮＡコード配列、好ましくはｔＲＮＡｐｙｌ、前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’側に位置する転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ若しくはＩＩＩによる転写を誘導するプロモータ配列、例えば、前記ｔＲＮＡコード配列の５’側に位置するＵ１ｓｎＲＮＡプロモータ又はＵ６ｓｎＲＮＡプロモータを含むＤＮＡ構築物が提供される。

国際公開第１２０３８７０６号パンフレットには、中でも、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに作動可能に連結された、特に、酵母ｔＲＮＡａｒｇ遺伝子のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに連結された、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌを含むＤＮＡ構築物が提供される。

国際公開第１２０３８７０６号パンフレットには、さらに、図３に要約されている複数の内部位置で突然変異したメタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌを含む、酵母細胞での発現用のＤＮＡ構築物も提供される。興味深いことに、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ）ｔＲＮＡｐｙｌは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌとは、配列番号３の３位のヌクレオチドＧに対応する１ヌクレオチドが異なる。

遺伝子内ｐｏｌＩＩＩプロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌ
本発明のＤＮＡ構築物に含まれるｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、遺伝子内ｐｏｌＩＩＩプロモータを含んでもよい。

Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ（２０１０）は、図３に要約されている複数の内部位置で突然変異したメタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌを含む、酵母細胞でのｔＲＮＡｐｙｌの発現用のＤＮＡ構築物を記載している。酵母の場合、Ｂボックスへの突然変異の導入により、共通Ｂボックス配列が生成されて、非常に低いが、検出可能なレベルの突然変異ｔＲＮＡｐｙｌ発現をもたらした。しかし、突然変異ｔＲＮＡｐｙｌの発現は、酵母細胞におけるアンバー抑制を支持しなかった。上記著者らは、ｔＲＮＡが不適切にフォールディング若しくはプロセシングされたか、又は上記突然変異がシンテターゼ認識を無効にしたかのいずれかであると結論付けた。

同様に、上記著者らは、発現が検出不能であった近似共通Ａボックスを再構築し、ＡボックスとＢボックス突然変異を組み合わせたところ、検出可能な発現レベルが得られたが、アンバー抑制は得られなかった。

具体的には、Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌにより、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ）遺伝子において生成された突然変異は、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）の１０、１４、２５、及び５２位に対応する。興味深いことに、野生型メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ）ｔＲＮＡｐｙｌは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡｐｙｌとは、配列番号１の３位のヌクレオチドＧに対応する１ヌクレオチドが異なる。

驚くことに、本発明者らは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の推定Ａボックス及びＢボックス領域への特定の突然変異の導入により、哺乳動物細胞におけるｔＲＮＡｐｙｌの良好な発現が達成され、これは効率的アンバー抑制を伴うことをみだした。

本発明者らは、共通Ｂボックス及び近似共通Ａボックスを再構築したが、これらは、実施例１及び図４〜７で述べるように、組み合わせ及び個別のどちらでも、アンバー抑制を可能にするように機能する。

好適には、Ｂボックス突然変異は、配列番号３のＷＴ配列に関してＡ５２Ｃである。

好適には、Ａボックス突然変異は、一緒に、及び個別に分析されて、哺乳動物細胞においてアンバー抑制をもたらすことが判明した２つの突然変異を含み、これらは、配列番号３のＷＴ配列に関して１０位及び１４位に対応する。

配列番号７、８、９、１０又は１１（メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子由来の突然変異配列に対応する）の例示的ｔＲＮＡｐｙｌ突然変異遺伝子と、突然変異（配列番号７、８、９、１０又は１１において太字で示す）が同等の位置に実施された他の細菌種（例えば、既述したもの）に由来する相似ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子。突然変異は、例えば、推定Ａボックス及び／又は推定Ｂボックスにおける１つ又は２つのヌクレオチド位置であってよい。例えば、推定Ｂボックスにおいて、例えば配列番号７、８、９、１０又は１１に示す位置に、単一の突然変異を実施する。例えば、単一又は２つの突然変異を推定Ａボックスに実施し、Ｂボックスには、例えば配列番号７〜１１に示す位置に単一の突然変異を実施する。推定Ａ及びＢボックスを図２に示すが、当業者であれば、他の細菌種（例えば、既述したもの）に由来する相似ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子についての推定Ａ及びＢボックスを導き出すことができる。

好適には、本発明のＤＮＡ構築物は、突然変異したｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子とこれに続く転写終結配列を含む。転写終結配列の一例を配列番号６に記載する。

ｔＲＮＡの適正なフォールディングは、その配列のどんな修飾に対しても高度に感受性である。驚くことに、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ）及びメタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）由来の同等位置における突然変異によって、国際公開第２０１２／０３８７０６号パンフレット、及び本発明の実施例に示すように、著しく異なる結果が得られた。特に、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ）ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、同等位置にＡを有するメタノサルシナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡに対し、３位に異なるヌクレオチド（Ｇ）を有する。

３位のＧは、ＲＳアミノアシル化の効果を低減すること、また、３位のＧは、酵母におけるｔＲＮＡｐｙｌの直交性に影響することが想定されている。（Ｈａｎｃｏｃｋ ２０１０；Ｇｕｎｄｌｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ ２００８）。

手短には、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによる特定のｔＲＮＡの認識及びｔＲＮＡアミノアシル化が、ｔＲＮＡ配列によって指定される同一性エレメント（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を通して起こる。アクセプターステムは、ｔＲＮＡの３’及び５’末端により形成される７つのヌクレオチドペアから構成され、酵素によるｔＲＮＡの認識に重要であり、翻訳において極めて重要である。メタノサルシナ・バーケリ・フラロ（Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ Ｆｕｓａｒｏ）のｔＲＮＡｐｙｌは、アクセプターステム領域に、他のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子には存在しない特異なＧ３：７０Ｕ塩基対を含有している。この突然変異は、酵母セリルｔＲＮＡシンテターゼによるｔＲＮＡｐｙｌのミスアシル化を可能にすることにより、酵母におけるｔＲＮＡの直交性に影響を与えることがわかった。

更なるコメントとして、ｐｏｌＩＩＩ依存性遺伝子の発現の調節は、酵母及び哺乳動物細胞の間で変動し得る。いずれの場合にも、ｔＲＮＡは、遺伝子内Ａ及びＢボックスエレメントに制御されるが、遺伝子外配列は、発現レベル、転写開始部位（ＴＳＳ）及び前駆体ｔＲＮＡのプロセシングに影響を与え得る。酵母では、ＴＳＳは、多くの場合、Ａボックスの最初の塩基を示すＴから１８〜２０ｂｐ上流（又は成熟ｔＲＮＡコード配列の開始から１０〜１２ｂｐ上流）に存在する。さらに、酵母において、ＴＳＳは、往々にして、コアプロモータエレメントｔＣＡＡｃａ（大文字は、高度の保存を示す）によって取り囲まれている。

驚くことに、本発明者らは、本発明の突然変異ｔＲＮＡ遺伝子の一連の反復配列を構築することにより形成されたＤＮＡ構築物が、図７及び実施例２に例示するように、発現及びアンバー抑制の増大をもたらすこともみいだした。

好適には、本発明のＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の２〜６０の反復配列を含む。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、２〜３０の反復配列、より好ましくは、８つの反復配列を含む。

５’プロモータエレメント下で発現した遺伝子内ｐｏｌＩＩＩプロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌ
構造遺伝子内のＡ−及びＢボックス配列の突然変異により機能性ｔＲＮＡｐｙｌの転写を増強することによって機能性アンバーサプレッサーを生産することが成功しなかったため、当分野の研究者らは、既述したように、遺伝子外配列だけを用いて、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の転写を増大させるＤＮＡ構築物を作製するに到った。

そこで、本発明者らは、上流プロモータエレメントと遺伝子内プロモータエレメントを組み合わせた新規の改善されたプロモータエレメントを作製した。

特定の真核生物ＲＮＡ遺伝子は、ｐｏｌＩＩＩ／３型クラスのプロモータに特有の上流プロモータエレメント（例えば、Ｕ６若しくはＨ１プロモータで用いられているＴＡＴＡボックス）（又は場合によっては、３型プロモータ配列と無関係の配列も含む）、及びｐｏｌＩＩＩ／２型クラスのプロモータに特有の遺伝子内プロモータエレメント（例えば、ｔＲＮＡプロモータに用いられるＡ−及びＢボックス）を含むハイブリッドポリメラーゼＩＩＩプロモータの下で発現させる。

好適には、本発明で使用する上流プロモータエレメントは、７ＳＬ（ＳＲＰ）ＲＮＡ遺伝子、ＶａｕｌｔＲＮＡ遺伝子、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスにコードされた低分子ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）（配列番号１２、２０、２６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は６５に示す）のプロモータから選択される。

好適には、本発明の上流プロモータエレメントは、哺乳動物遺伝子、好ましくはヒト若しくはマウス遺伝子、最も好ましくは配列番号１２、２０若しくは２６などのヒト遺伝子から単離される。

好適には、プロモータ配列は、図１Ｅ（配列番号６９〜７１）に示すようなｐｏｌＩＩＩ ＲＮＡポリメラーゼによる転写を調節する転写因子を動員する機能性エレメントを含有する。

従って、７ＳＬプロモータは、転写開始部位から４３〜５１ｂｐ上流に位置する、活性化転写因子（ＡＴＦ）又は環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）結合部位（ｔｇａｃｇｔｃａｃ）を含有する。プロモータは、ＴＳＳから２０〜３１ｂｐ上流にＥＴＡＢ配列（ｔｔｃｔａｇｔｇｃｔ）と呼ばれるＴＡＴＡ様配列も含有する。

Ｖａｕｌｔプロモータは、ＴＳＳ（ｔｇａｃｇｔａｇｇｔｃｔｔｔｃｔｃａｃｃａｇｔｃａ）から２３〜５３ｂｐ上流に位置する近位配列エレメント（ＰＳＥ）（配列番号７５）を有し、これは、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の変異体でもある。さらに、Ｖａｕｌｔプロモータは、ＴＳＳから１６〜２２ｂｐ上流にＴＡＴＡボックス（ｔａｔａａｔ）を含有する。

ＥＢＥＲプロモータは、３つの調節領域、すなわち、ＴＳＳから７６〜５５ｂｐ上流のＳＰ１結合部位（ｇｃａｃｇｃｔｔａａｃｃｃｃｇｃｃｔａｃａ）（配列番号７６）、ＴＳＳから５５〜３６ｂｐ上流のＡＴＦ結合配列（ａｃｃｇｔｇａｃｇｔａｇｃｔｇｔｔｔａ）（配列番号７７）、及びＴＳＳから２８〜２１ｂｐ上流のＴＡＴＡ様ボックス（ｔａｔａｇａｇ）を含有する。

本発明に関連して、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子内の、７ＳＬ、ＥＢＥＲ、Ｖａｕｌｔ ＲＮＡの上流プロモータエレメントと再構成遺伝子内プロモータ（Ａ−及び／又はＢボックス）との組み合わせは、図８及び実施例３に示すように、再構成遺伝子内プロモータのみを含有するｔＲＮＡｐｙｌ、及びＷＴｔＲＮＡｐｙｌと比較して、該ｔＲＮＡのアンバー抑制機能を改善することが証明されている。

好適には、配列番号１２の７ＳＬプロモータを、配列番号１５の構築物と同様に、配列番号９のＢボックス突然変異と組み合わせる。

あるいは、配列番号１２の７ＳＬプロモータを、配列番号１８の構築物と同様に、配列番号１０のＡ−及びＢボックス突然変異と組み合わせる。

本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、スペーサによって転写開始部位から隔てられた上流プロモータエレメントを含む。好適には、スペーサ配列は、転写開始部位と、プロモータ配列の終了点からｔＲＮＡコード配列の開始点までの４〜６ヌクレオチドを含む。

本発明のＤＮＡ構築物は、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の３’側に位置する下流転写終結部位を含み、ここで、前記転写終結部位は、小さなポリ−チミジン（４〜６）配列によって、ポリメラーゼＩＩＩ転写の終結を伝達する。本発明の好ましい転写終結配列は、配列番号１９に記載されている。

バイシストロニックメッセージとして真核生物ｔＲＮＡの下で発現したｔＲＮＡｐｙｌ
Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ，２００８及び欧州特許第１９９２６９８号明細書は、どのようにして、真核生物ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｖａｌ）遺伝子に対し下流のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、最適に満たないｔＲＮＡｐｙｌの発現（これは、発現のレベルが、哺乳動物細胞において最適なアンバー抑制には低すぎたため、理想的ではなかった）をもたらしたかを記載している。

本発明者らは、驚くことに、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列が、ｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐなどの真核生物ｔＲＮＡ遺伝子に作動可能に連結したＤＮＡ構築物（図１Ａ）が、図１１及び実施例４に詳しく説明するように、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子産物の最適発現並びにアンバー抑制をもたらすことをみいだした。

好適には、本発明のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、真核宿主細胞においてバイシストロニックメッセージとして発現される。

好適には、真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、３’転写終結配列を欠失しているため、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の発現が、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ２型プロモータの下で起こることを可能にする。

従って、最初のｔＲＮＡは、転写の終結のためのシグナルを構成するチミジンヌクレオチドを欠失した配列から構成されるスペーサ配列によって、２番目のｔＲＮＡから隔てられている。

例示的スペーサ配列を配列番号４７及び５４に示す。

好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列に作動可能に連結した真核生物ｔＲＮＡ遺伝子は、配列番号４１、４９、５５若しくは５６の哺乳動物ｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐ遺伝子；より好ましくは、配列番号４１又は４９のマウスｔＲＮＡｇｌｕ又はｔＲＮＡａｓｐである。

本発明者らは、驚くことに、最初のｔＲＮＡ遺伝子の前に、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位（ＴＳＳ）、及び成熟ｔＲＮＡを生成するように前駆体ｔＲＮＡの翻訳後プロセシングを調節する配列（集合的にリーダ配列と呼ばれる）を含む５’リーダ配列が位置するとき、ｔＲＮＡｐｙｌの発現及びアンバー抑制が、特に効率的であることをみいだした。

従って、リーダ配列は、任意の哺乳動物ｔＲＮＡ遺伝子の５’領域であり、これは転写されて、成熟ｔＲＮＡの構成部分にはならないｔＲＮＡ前駆体の一部を生成する。

本発明に用いる特に好ましいリーダ配列は、配列番号４１及び４９に開示され、配列番号４４（ｔＲＮＡａｓｐ）及び配列番号５２（ｔＲＮＡｇｌｕ）として記載されている。

本発明の特に好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２及び配列番号５０として記載されている。

配列番号４２は、マウスｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子と、これに続く、チミジン欠失スペーサ領域（ｃｃｃｃａａａｃｃｔｃ）とから構成され、該スペーサ領域は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子に連結されている。従って、配列番号４２の構築物は、単一の実体として転写され、これが、翻訳後プロセシングされて、成熟ｔＲＮＡｐｙｌを生成する。

配列番号５０は、マウスｔＲＮＡａｓｐ遺伝子と、これに続くチミジン欠失スペーサ領域（ｔａｇｃｃｃｃａｃｃｔｃ）とから構成され、該スペーサ領域は、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子に連結されている。従って、配列番号５０の構築物は、単一の実体として転写され、これは、翻訳後プロセシングされて、成熟ｔＲＮＡｐｙｌを生成する。

本発明の特に好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２及び５０のバイシストロニック転写単位の複数のコピーを含む。

従って、特に好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２又は５０の２、３、４、５、６、７、８コピーを含む。最も好ましいＤＮＡ構築物は、配列番号４２のｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌバイシストロニック転写単位の３コピーに相当する配列番号４３、及び配列番号５０のｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌバイシストロニック単位の２コピーに相当する配列番号５１である。

本発明のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子は、真核細胞株に導入することができる。好適には、細胞株は、哺乳動物細胞株である。

より好ましくは、細胞株は、ＣＨＯ細胞株であるが、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ６、ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ ＶＥＲＯ、又はマウスハイブリドーマ細胞株であってもよい。

ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞株が特に好適である。

ＰｙｌＲＳ
好適には、本発明のｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を、ｐｙｌＲＳ遺伝子と一緒に真核細胞株に導入する。

本明細書で用いる場合、ｐｙｌＲＳは、好適なｔＲＮＡ分子をピロシン又はその誘導体でアミノアシル化するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関する。

本発明のｐｙｌＲＳは、メタン生成古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ａｒｃｈａｅａ）種に由来する真核細胞において直交性のピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼである。すなわち、これは、メタン生成古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ａｒｃｈａｅａ）種において野生型であるか、又はその突然変異体である。

好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、以下：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、メタノサルシナ・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、メタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、メタノサルスム・ジリナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）、メタノハロビウム・エバスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖａｓｔｉｇａｔｕｍ）、メタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）、デスルホトマクルム・ギブソニアエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）、デスルホスポロシヌス・メリデイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｍｅｒｉｄｅｉ）及びデルスルホトマクルム・アセトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ）の１つに由来するピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼである。

最も好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来のピロリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｐｙｌＲＳ）である。

本発明のｐｙｌＲＳは、野生型シンテターゼであってもよい。

あるいは、本発明のｐｙｌＲＳは、例えば、その触媒活性を増大するため、及び／又はその基質アミノ酸に対する選択性を修飾するために、１つ又は複数の位置で突然変異させてもよい（例えば、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８を参照）。

好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、Ｔｙｒ３８４又はその同等物に対応する位置で突然変異させてもよい。最も好ましくは、Ｔｙｒ３８４を、フェニルアラニンに突然変異させる。

一実施形態では、本発明のｐｙｌＲＳは、その特異性を修飾し、ピロリシン類似体の組み込みを可能にする（又は改善する）ために、１つ又は複数の位置で突然変異させてもよい。

別の突然変異ＰｙｌＲＳ酵素は、国際公開第０９０３８１９５号パンフレット及び同第２０１０１１４６１５号パンフレットに記載されており、各文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

ナンセンスコドンによりコード化された非天然アミノ酸の組み込み
本発明の細胞株を用いて調製されたタンパク質に、１つ又は複数のｎｎＡＡを組み込んでもよい。好適には、１つのｎｎＡＡをタンパク質鎖に組み込む。抗体であるタンパク質の場合、１つのｎｎＡＡを軽鎖若しくは重鎖、又はその両方に組み込んでもよい。

他の実施形態では、２つ以上、例えば、最大４つ、例えば、２つ（若しくは恐らく３つ）のｎｎＡＡをタンパク質鎖に組み込んでよい。好適には、組み込まれるｎｎＡＡはすべて同じである。

ｎｎＡＡは、好適には、アンバーコドンによってコード化する。

標的タンパク質への組み込みのためのアンバーコドンによりコード化され得る非天然アミノ酸
標的タンパク質への組み込みのための非天然アミノ酸
ペプチドとの複数の部分の結合を可能にするために非天然アミノ酸を用いることは、国際公開第２００７／１３０４５３号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に開示されている。

本明細書で用いる場合、「非天然アミノ酸」は、セレノシステイン、ピロシン、並びに次の２０のαアミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はアミノ酸類似体を指す。αアミノ酸の一般構造を式Ｉ：

により示す。

非天然アミノ酸は、典型的に、Ｒ基が、２０の天然アミノ酸に用いられるもの以外の任意の置換基である。例えば、２０の天然アミノ酸の構造については、任意の生化学文献、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，３ｒｄ ｅｄ．１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本明細書に開示する非天然アミノ酸が、前記２０のαアミノ酸以外の天然に存在する化合物であってもよいことは、留意されたい。本明細書に開示する非天然アミノ酸は、典型的に、天然アミノ酸とは側鎖のみが異なるため、非天然アミノ酸は、天然に存在するタンパク質においてそれらが形成されるのと同じ様式で、他のアミノ酸、例えば、天然又は非天然アミノ酸と結合する。しかし、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸とそれらを区別する側鎖基を有する。例えば、式ＩのＲは、任意選択で、アルキル−、アリール−、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハロゲン化物、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシ−、ヒドラジン−、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホフフィン、複素環−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロアルキン、例えば、シクロオクチンのような制限環（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｒｉｎｇ）などのシクロアルキン、ノルボルネンなどのシクロアルケン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、テトラジン、ピロン、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、α−ケトカルボン酸、α若しくはβ不飽和酸及びアミド、グリオキシルアミド、又はオルガノシラン基など、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む。

新規の側鎖を含む非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸は、任意選択で、例えば、式ＩＩ及びＩＩＩ：

（式中、Ｚは典型的に、ＯＨ、ＮＨ．ｓｕｂ．２、ＳＨ、ＮＨ．ｓｕｂ．２Ｏ−−、ＮＨ−−Ｒ’、Ｒ’ＮＨ−−、Ｒ’Ｓ−−、又はＳ−−Ｒ’−−を含み；Ｗ及びＹは、同じでも異なっていてもよく、典型的に、Ｓ、Ｎ、若しくはＯを含み、Ｒ及びＲ’は、任意選択で同じでも異なっていてもよく、典型的に、式Ｉを有する非天然アミノ酸について上に記載したＲ基の成分の同じリスト、並びに水素又は（ＣＨ．ｓｕｂ．２）ｓｕｂ．ｘ又は天然アミノ酸側鎖から選択される）
の構造により示されるような、修飾骨格構造を含んでもよい。

アミノ酸類似体の他の例として（限定はしないが）、リシン又はピロリシンアミノ酸の非天然アミノ酸類似体が挙げられ、これは、以下の官能基の１つを含む；アルキル、アリール、アシル、アジド、ニトリル、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、シクロアルケン、アルキニル、シクロアルキン、シクロオクチンのような制限環（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｒｉｎｇ）などのシクロアルキン、ノルボルネンなどのシクロアルケン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アジリジン、ニトロ、ヒドロキシル、エーテル、エポキシド、ビニルエーテル、シリルエノールエーテル、チオール、チオエーテル、スルホンアミド、スルホニル、スルホン、セレノ、エステル、チオ酸、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、ホスホノ、ホスフィン、複素環、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、テトラジン、ピロン、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、チオエステル、エステル、チオ酸、オルガノシラン基、アミノ、光励起性架橋剤；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；別の分子と共有結合的に、又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化アミノ酸；光異性化アミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は炭水化物修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエステルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能な、若しくは光切断可能なアミノ酸；伸長された側鎖を有するアミノ酸；有毒基を含有するアミノ酸。

本発明の一実施形態では、下記の一般構造の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）をタンパク質生産のために使用する。

好ましくは、Ｘ基は、メチレン基、アルケン、アレン、酸素、イオウ、リン、窒素、エステル、アミド、炭素酸塩、カルバメート、エーテル、アミン、チオエーテル、アルキン、及び複素環であってよい。

好ましくは、Ｙ基は、メチレン、アルケン、アレン、酸素、イオウ、リン、窒素、エステル、アミド、炭素酸塩、カルバメート、エーテル、アミン、チオエーテル、アルキン、及び複素環であってよい。

好ましくは、Ｚ基は、窒素、酸素、イオウ、リン、α−メチレンアミノ、α−ヒドロキシルアミノ、α−メチレンアジドであってよい。

ＦＧ基は、アルキルアジド、アルキル−アルキン、アルキル−アルケン、アルキルシクロヘキセン、アルキルシクロアルキン、ハロゲン化アルキルアリール、ハロゲン化アリール、アミドシクロアルキン、アミドシクロアルケン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、テトラジン、ピロン、ノルボルネン、アリールアジド、アジド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アリール、テトラジン、ピロン、イミン、ボロン酸エステル又は酸、シアノ、アルデヒド又はケトンなどのカルボニル基であってよい。

好ましい実施形態では、前記一般構造の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）は、ｎ＝１〜１２である、様々な長さのメチレン基を有してもよい。好ましくは、前記一般構造の非天然アミノ酸は、結合構造の一部としてシクロアルカン及び芳香環を含んでもよい。

好適には、本発明のｎｎＡＡは、以下の構造表に挙げるリシンから得られる。市販されていないものは、任意選択で、米国特許出願公開第２００４／１３８１０６Ａ１号明細書（参照により本明細書に組み込む）に記載のように、又は当業者に周知の標準的方法を用いて合成する。有機合成技術のためには、例えば、以下：Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びに国際公開第０２／０８５９２３号パンフレット（これらは全て、参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。

本発明のｎｎＡＡは、公開された方法により合成してもよい。例えば、（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロプ−２−イニルオキシ）カルボニルアミド）ヘキサン酸及びＳ）−２−アミノ−６（（２アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸の合成は、国際公開第２０１０１３９９４８号パンフレット及びＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９（参照により本明細書に組み込む）に公開されている。

好適には、本発明のｎｎＡＡは、国際公開第２０１０１３９９４８号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に一部が記載されているように、以下の表に示すリシンから得られる。

好適には、本発明のｎｎＡＡは、以下の表に挙げる（２Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸から得られる。

好適には、本発明のｎｎＡＡは誘導されて、以下の表に挙げる様々な官能基を含む。そのいくつかは、国際公開第２０１１０４４２２５５Ａ１号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に記載されている。

好適には、本発明のｎｎＡＡは誘導されて、金属遊離環状付加化学に好適な様々な官能基を含み、これらは、国際公開第２０１２１０４４２２Ａ１号パンフレット（参照により本明細書に組み込む）に記載されており、また以下の表に挙げる。

組み込まれた非天然アミノ酸とタンパク質の部位特異的結合
本発明の方法を用いて組み込まれた非アミノ酸を有するタンパク質は、官能基化タンパク質コンジュゲートの調製に用いることもできる。組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質に結合させることができる分子としては、（ｉ）他のタンパク質、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体及び（ｉｉ）当該系の半減期延長をもたらし得るＰＥＧ基又は他の基がある。さらに、これらの強力な化合物の標的化送達のためにこれらの修飾タンパク質を薬剤又はヌクレオチドに結合することができる。

特定の実施形態について、以下の抗体薬剤コンジュゲートの説明でさらに詳細に記述する。

非天然アミノ酸は、好都合には、他のアミノ酸との副反応のリスクなしで、標的化方式で結合を可能にするユニークな化学基を含有してもよい。例えば、非天然アミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有し、ヒュスゲン１，３−双極子環状付加反応を用いて、対応するアルキン又はアジド基を含有する、結合させようとする分子との反応を可能にする。

本発明の別の態様は、化学的に修飾された標的タンパク質を調製する方法であって、これは、本発明の一態様の方法に従い、標的タンパク質を調製するステップと、得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む。

本発明の好ましい結合化学は、天然の２０のアミノ酸に対して直交性の反応を含む。こうした反応は、天然の２０のアミノ酸と相互作用しないか、又はこれらとの副反応を引き起こさず、反応に伴う官能基に特異的である。好適には、ｎｎＡＡを用いて、必要な官能基を標的タンパク質に組み込む。

さらに、タンパク質に対して破壊的でない、条件例えば、タンパク質に対して許容可能で、かつその溶解度を維持するｐＨ範囲を有し、タンパク質に有害な作用をもたらさない温度での水性条件下で、前記反応を進行させる。

タンパク質とリンカーとの結合部分の安定性を高めることも有利となりうる。従来の方法は、マレイミドとの反応によりシステインのチオール基と結合させて、チオールエーテルを形成する。チオールエーテルを逆反応に付して、抗体からリンカー薬剤誘導体を放出させることもできる。本発明の一実施形態では、アジドとアルキンとの間で使用される結合化学によって、芳香族トリアゾールが形成されるが、これは、有意に安定しており、可逆性を被りにくい。

さらに、反応の産物、タンパク質とペイロード同士の連結は、安定である、すなわち、従来の連結（アミド、チオールエーテル）に関連する安定性と等しいか、それより高くなければならない。結合に対する障害ではないが、結合反応がネイティブ条件下で実施することができれば、それ以上のリフォールディングプロセシングステップが排除されることから、多くの場合、有利である。

本発明のコンジュゲートの生成のための好ましい化学結合としては、以下のものが挙げられる：３＋２アルキン−アジド環状付加；３＋２双極子環状付加；ヘック（Ｈｅｃｋ）反応など、パラジウムを用いたカップリング；薗頭（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ）反応；鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）反応；スティル（Ｓｔｉｌｌｅ）カップリング；檜山／デンマーク（Ｈｉｙａｍａ／Ｄｅｎｍａｒｋ）反応；オレフィンメタセシス；ディールス・アルダー（Ｄｉｅｌｓ−ａｌｄｅｒ）反応；ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン又はヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合；歪促進アジドアルキン環状付加などの歪促進環状付加；金属促進アジドアルキン環状付加；電子促進環状付加；断片放出（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）環状付加；アルケン環状付加とこれに続くｂ−脱離反応。

１つの好ましい実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有し、化学修飾の方法は、前記アジド又はアルキン基を、アルキン又はアジド基を含む試薬と反応させるステップを含む。考慮される反応は、トリアゾール連結の生成をもたらすヒュスゲン１，３−双極子環状付加である。アルキン又はアジド基を含む試薬は、タンパク質（例えば、抗体）、又は毒素若しくは細胞障害性薬剤、又は任意選択でリンカーを介してアルキン又はアジド基を担持し、半減期の延長に好適な物質（例えば、ＰＥＧ基）であってよい。

前記反応に用いるアルキン基は、例えば、末端アルキン、シクロオクチン、例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン、ジベンゾシクロオクチン、及びジフルオロシクロオクチン部分である。

変種の反応では、組み込まれたアミノ酸は、アジド又はアルケン基を含有し、化学修飾の方法は、前記アジド又はアルケン基を、アルケン又はアジド基を含む試薬と反応させるステップを含む。アルケン又はアジド基を含む試薬は、タンパク質（例えば、抗体）若しくは毒素、又は半減期の延長に好適な物質（例えば、ＰＥＧ基）であってよく、これは、任意選択でリンカーを介して、アルキン若しくはアルケン基を担持する。

２つ以上のｎｎＡＡが、標的タンパク質（例えば、抗体）に組み込まれる場合、化学修飾は、同じでも異なっていてもよい。例えば、２つのｎｎＡＡが組み込まれる場合、一方を薬剤部分に結合するように修飾し、他方をＰＥＧ部分に結合するように修飾してもよい。

一実施形態では、抗体薬剤コンジュゲートを調製するために、本発明の結合化学を用いる。

標的タンパク質
標的タンパク質は、抗体を含む。

本発明の抗体は、完全長抗体及び抗体フラグメントを含み、以下のものが挙げられる：Ｆａｂ、Ｆａｂ２、及びＴＲＯＰ−２に向けられた一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、ＳＳＴＲ３、Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＦ、ＲａＳＬ、Ｃ３５Ｄ３、ＥｐＣａｍ、ＴＭＣＣ１、ＶＥＧＦ／Ｒ、コネクシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ）−３０、ＣＡ１２５（Ｍｕｃ１６）、セマホリン（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）−５Ｂ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＨＢ２、ＳＬＣ４５Ａ３（ＰＣＡＮＡＰ）、ＡＢＣＣ４（ＭＯＡＴ−１）、ＴＳＰＡＮ１、ＰＳＧＲＤ−ＧＰＣＲ、ＧＤ２、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、ＴＭＥＦＦ２、ＣＤ７４、ＣＤ１７４（ｌｅＹ）、Ｍｕｃ−１、ＣＤ３４０（Ｈｅｒ２）、Ｍｕｃ１６、ＧＰＮＭＢ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＴＡＧ−７２、ＣＡ９（ＩＸ）、ａ−ｖ−インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＦＡＰ、Ｔｉｍ−１、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、α葉酸受容体、ＣＤ４４ｖ６、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ２０、ＣＡ５５．１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＲＯＮ、ＣＤ４０、ＨＭ１．２４、ＣＳ−１、β２ミクログロブリン、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＧＲＮＭＰ、トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＣＡＩＸ、ＦａｓＬ受容体、ＭＭＰマトリックスメタロプロテアーゼ。

本発明の好ましい実施形態では、腫瘍標的に向けられる本発明の抗体を、以下から選択されるタンパク質部分に結合する：免疫刺激及びアポトーシス促進性タンパク質、特に、免疫刺激因子、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、他のＩＬ−１ファミリーメンバー、限定はしないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ファミリー、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２８を含むインターロイキンのいずれか、又はＢ７．１及びＢ７．２、ＴＡＣＩなどの共刺激リガンド。Ｉ型ＩＦＮファミリーのいずれか（ＩＦＮα及びβ及びλ）又はＩＩ型ＩＦＮγなどのインターフェロン。ＧＭ−ＣＳＦなどの造血増殖因子。ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−６、ＣＸＣＬ−８、ＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０、及びＣＸＣＬ−１１、ＣＸＣＬ−１３、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−２１、ＩＰ−１０、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、ＰＦ４、ＧＲＯ関連ペプチド、ＩＬ−８。アポトーシス促進性リガンド、例えば、ＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＰＤ−Ｌ１などのＴＮＦスーパーファミリーに属するもの。抗微生物ペプチド、例えば、α及びβディフェンシン並びにカテリシジンＬＬ３７／ｈＣＡＰ１８、ヒスタチン、カテプシンＧ、アズロシジン、キマーゼ、好酸球由来ニューロトキシン、高移動群１核タンパク質、ＨＭＧＢ１、ラクトフェリン。ＲＯＳ及びＲＮＳ生成酵素、例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）のメンバー、一酸化窒素シンターゼＮＯＳ、ＩＮＯＳ）、エラスターゼ及びカテプシンなどのプロテアーゼを含む好酸球顆粒タンパク質、アズロシジン（ＣＡＰ３７又はＨＢＰとしても知られる）、ミエロペルオキシダーゼ、ペルホリン、グランザイム。

一実施形態では、標的タンパク質は、抗Ｈｅｒ−２抗体である。

一実施形態では、標的タンパク質は、抗ＩＬ６抗体である。

一実施形態では、標的タンパク質は、抗ＰＳＭＡ抗体である。

好ましい実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体は、ｓｃｆｖである。

好ましい実施形態では、ＦＧＦ２１は、位置Ｒ１３１に非天然アミノ酸ｌｙｓ−アジド又は位置Ｒ１３１にプロパルギルリシンを含有するように修飾され、トリアゾールリンカーを介してＰＥＧ部分に結合している。

ＰＥＧ部分
標的タンパク質は、ＰＥＧ部分と結合させてもよい。ＰＥＧ部分を抗体薬剤コンジュゲートに組み込んでもよい。ＰＥＧ部分は、典型的に、５ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有し得る。より好ましくは、ＰＥＧ部分は、約２０ｋＤａの分子量を有し得る。ＰＥＧ部分は直鎖でも、分岐していてもよい。

抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明の細胞株は、均質性である抗体薬剤コンジュゲート（所与の薬剤、典型的には、細胞傷害性薬剤、あるいは、タンパク質若しくはＰＥＧ基に、合成リンカーにより共有結合された組換え抗体）の製造に特に有用であり、該コンジュゲート中の抗体当たりの薬剤（又は他の結合された分子）の数及びこれら薬剤の位置は制御されており、これによって、組み込まれた非天然アミノ酸含有のモノクローナル抗体が得られ、直交性化学により、薬剤部分（又は他の結合された分子）を担持するリンカーに部位特異的に結合される。

好適には、本発明は、ＡＤＣを取得する方法を提供し、これは、以下：
１．完全長抗体をコードするＤＮＡ配列を担持する１つ又は複数のプラスミドを安定した細胞株に導入することにより、停止コドンを上記配列内の特定の位置に導入するステップ、
２．所望の位置に導入された非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む修飾抗体を精製するステップ、
３．抗体に導入されたｎｎＡＡに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、直交性化学により、相補的反応基を含有する修飾抗体と反応させるステップ、
４．得られたＡＤＣを生成するステップ
を含む。

従って、本発明は、抗体成分が、所望の位置にユニークな反応性官能基を担持する非天然アミノ酸を組み込むように修飾され、前記官能基が薬剤部分（又はタンパク質若しくはＰＥＧ基）との結合を可能にするＡＤＣも提供する。

一実施形態では、本発明は、タンパク質、薬剤及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ若しくは４つ、好ましくは１つ若しくは２つ、特に１つ）の部分と、トリアゾール部分を含むリンカーによって結合された抗Ｈｅｒ−２抗体を含む抗体コンジュゲートを提供する。

特に、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬剤若しくはＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応により形成することができる。

一実施形態において、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬剤若しくはＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との、銅（Ｉ）触媒作用の条件下での反応により形成される。

別の実施形態において、抗体コンジュゲートは、トリアゾール部分を含むリンカーによって、薬剤及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数の部分と結合した抗体を含み、ここで、前記トリアゾール部分は、抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド部分と、薬剤若しくはＰＥＧ部分に結合したアルキン部分との反応により形成され、前記アルキン部分は、シクロオクチン部分である。

別の実施形態において、抗体コンジュゲートは、トリアゾール部分を含むリンカーによって、薬剤及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数の部分に結合された抗体を含み、ここで、前記トリアゾール部分は、抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアルキン部分と、薬剤若しくはＰＥＧ部分に結合したアジド部分との反応により形成され、前記アルキン部分は、末端アルキン、置換アルキン若しくはシクロオクチン部分である。

シクロオクチン部分は、例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン、ジベンゾシクロオクチン、及びジフルオロシクロオクチン部分であってよい。

前記抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸は、好適には、ＰｙｌＲＳの非天然アミノ酸基質、特に、（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸などの非天然リシン類似体である。

抗体
本発明において、ＡＤＣは、完全長抗体、並びに限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、及び単鎖抗体断片などの抗体断片を含む。

細胞毒との結合に好適な抗体として、以下：抗Ｈｅｒ−２、抗ＩＬ−６、ＴＲＯＰ−２、ＳＳＴＲ３、Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＦ、ＲａＳＬ、Ｃ３５Ｄ３、ＥｐＣａｍ、ＴＭＣＣ１、ＶＥＧＦ／Ｒ、コネクシン（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ）−３０、ＣＡ１２５（Ｍｕｃ１６）、セマホリン（Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）−５Ｂ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＨＢ２、ＳＬＣ４５Ａ３（ＰＣＡＮＡＰ）、ＡＢＣＣ４（ＭＯＡＴ−１）、ＴＳＰＡＮ１、ＰＳＧＲＤ−ＧＰＣＲ、ＧＤ２、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、ＴＭＥＦＦ２、ＣＤ７４、ＣＤ１７４（ｌｅＹ）、Ｍｕｃ−１、ＣＤ３４０（Ｈｅｒ２）、Ｍｕｃ１６、ＧＰＮＭＢ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＴＡＧ−７２、ＣＡ９（ＩＸ）、ａ−ｖ−インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＦＡＰ、Ｔｉｍ−１、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、α葉酸受容体、ＣＤ４４ｖ６、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ２０、ＣＡ５５．１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＲＯＮ、ＣＤ４０、ＨＭ１．２４、ＣＳ−１、β２ミクログロブリン、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＧＲＮＭＰ、トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＣＡＩＸ、ＦａｓＬ受容体、ＭＭＰマトリックスメタロプロテアーゼに対してターゲティングされるものが挙げられる。

目的とする１つの具体的抗体は、抗Ｈｅｒ−２である。

目的とする別の具体的抗体は、抗ＰＳＭＡ抗体、特にｓｃｆｖである。

前記ｓｃｆｖは、例えば、オーリスタチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、又はアマニチン誘導体であってもよい。

実施例１：
遺伝子内プロモータエレメントの作製
部位特異的突然変異誘発を用いて、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子に下記の突然変異を誘発した：５２位のＡ（ＷＴメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｔＲＮＡｐｙｌ配列、配列番号３に関して））をＣに突然変異させ；１０位のＡをＧに、また１４位のＴをＡに突然変異させた。

特に、単一の突然変異Ａ５２Ｃを含む構築物（ｔＲＮＡ−Ｂと称する構築物、配列番号９）、前述した突然変異の全て、すなわちＡ５２Ｃ、Ａ１０Ｇ及びＴ１４Ａを含む構築物（ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ、配列番号１０）又はＡボックスにのみ突然変異を含む構築物（Ａ１０Ｇ及びＴ１４Ａ、ｔＲＮＡ−Ａ２、配列番号１１若しくはＡ１０Ｇ、ｔＲＮＡ−Ａ１、配列番号７）を作製した。

遺伝子内プロモータを含むｔＲＮＡｐｙｌの機能性発現の立証
ｔＲＮＡ変異体の機能を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを確認したが、ここでは、ｔＲＮＡ構築物、及びそのリーディングフレームに介在するアンバーコドン含有のＧＦＰをコード化するリポータ構築物（ＧＦＰＹ４０）で一時的に細胞をトランスフェクトする。ｐｙｌＲＳを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、様々なｔＲＮＡ構築物（１μｇ）及びＧＦＰＹ４０リポータ（１μｇ）で一時的にトランスフェクトした。アンバー抑制を支持するエレメントの非存在下で、短縮ＧＦＰタンパク質を作製するが、細胞は蛍光ではない。しかし、機能性ｔＲＮＡの導入と、アンバー抑制を支持するｎｎＡＡの存在によって、蛍光細胞をもたらす完全長ＧＦＰの作製が可能になる。ＧＦＰ発現のレベルは、アンバー抑制の効率を表しており、フローサイトメトリーにより定量される。野生型ｔＲＮＡｐｙｌをコードするｔＲＮＡ遺伝子（ＷＴｔＲＮＡ）、又はＢボックス（ＢｔＲＮＡ−配列番号９）、Ａ及びＢボックスの両方（Ａ２ＢｔＲＮＡ−配列番号１０）、若しくはＡボックス（Ａ１ｔＲＮＡ−配列番号７；又はＡ２ｔＲＮＡ−配列番号１１）に突然変異を含むｔＲＮＡ遺伝子を全てＨ１プロモータの制御下で、部位特異的突然変異誘発により作製して、アッセイした。Ｈ１プロモータは、変異体の発現を確実にしたため、ｔＲＮＡ遺伝子に導入された突然変異の機能的作用を調べることができた。さらに、ＧＦＰＹ４０単独でトランスフェクトしたサンプルを作製して、バックグラウンドＧＦＰレベルを確認した。トランスフェクトした細胞をアミノ酸ｌｙｓアジド（２ｍＭ）の存在下で増殖させ、１８時間インキュベートした。次に、フローサイトメトリーによりＧＦＰ蛍光をアッセイし、平均蛍光強度を各サンプルについて決定した。データをＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓで分析した後、陰性対照を上回る蛍光を示す細胞にデータセットを限定するマーカを用いて、各サンプルの平均蛍光強度を決定した。図４に示すように、データから、Ａボックス部位（Ｈ１−Ａ１ｔＲＮＡ及びＨ１Ａ２ｔＲＮＡ）での突然変異の組み込みは、野生型Ｈ１ＷＴｔＲＮＡに対し、アンバー抑制を支持する能力に関してｔＲＮＡの活性に影響を与えないことが明らかである。ＢｔＲＮＡ及びＡ２ＢｔＲＮＡをコードする構築物は、ＷＴｔＲＮＡより低レベルであるにもかかわらず、アンバー抑制を支持する。従って、構築物は機能性であり、Ｈ１プロモータのような上流プロモータエレメントの非存在下でもｔＲＮＡの発現を可能にするのに必要な遺伝子配列を含み得る。

ｔＲＮＡ突然変異が、ｔＲＮＡの発現を支持することができるかどうかの評価を始めるために、Ｈ１プロモータの非存在下で野生型ｔＲＮＡをコード化するｔＲＮＡ構築物をアッセイした。野生型ｔＲＮＡｐｙｌ（ＷＴｔＲＮＡ）をコードする構築物、又はＢボックス（Ｂ ｔＲＮＡ−配列番号９）若しくはＡ及びＢボックスの両方（Ａ２Ｂ；Ａ２Ｂ ｔＲＮＡ−配列番号１０）に突然変異を含む構築物を、前述した本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏアンバー抑制アッセイを用いて評価した。Ｈ１プロモータの制御下のＷＴｔＲＮＡ（Ｈ１−ｔＲＮＡ）を陽性対照として使用し、さらに、ｔＲＮＡの非存在下でのバックグラウンドアンバー抑制を示すために、１つのサンプルをＧＦＰＹ４０リポータのみでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２ｍＭのｌｙｓ−アジドｎｎＡＡに暴露し、細胞を３日間インキュベートした。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより検定し、平均蛍光強度を決定した。これらのデータをプロッティングし、図５に示した。Ｈ１−ｔＲＮＡ構築物は、効率的なアンバー抑制（ＭＦＩ＝１，００４，２２８．００）を可能にすることがすでに判明している。しかし、ＧＦＰ蛍光は、ｔＲＮＡを欠失するサンプルでは全く観測されず（ＧＦＰＹ４０；ＭＦＩ＝６５，９２９）、ｗｔｔＲＮＡを含むサンプルでは低レベル（ＭＦＩ＝１１４，４７８．１）が観察された。ｔＲＮＡ突然変異体ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝４１０，１３１．１）及びＡ２Ｂ ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝２４２，７４７．９）は、ｗｔｔＲＮＡ構築物より、それぞれ４倍及び２．５倍高いＧＦＰの発現を可能にした。このデータは、Ｂ及びＡ２Ｂ突然変異が、機能性遺伝子内プロモータを再構成すること、及び発現されたｔＲＮＡは、標的タンパク質へのｎｎＡＡの送達を媒介することができるため、機能性であることを示している。

ｐｙｌｔＲＮＡ配列に導入されたＢ突然変異は、アンバー抑制を支持したｔＲＮＡの発現を可能にしたことを確認し、本発明者らは、次に、この突然変異が、ｔＲＮＡの直交性に影響を与え、天然のアミノ酸の組み込みをもたらしたかどうかを調べた。そのために、この３Ｈ７細胞を、ＧＦＰＹ４０リポータと一緒に、ＷＴ−ｔＲＮＡ、Ｂ−ｔＲＮＡ、Ｈ１−ｔＲＮＡ及びＨ１−Ｂ−ｔＲＮＡをコード化する発現構築物で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、表示のように（図６）、２ｍＭのｌｙｓアジドの存在下又はｎｎＡＡの非存在下で増殖させてから、３日後、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を評価した。さらに、ＧＦＰＹ４０のみでトランスフェクトしたサンプルを検定して、ｔＲＮＡの非存在下でのバックグラウンドアンバー抑制を決定した。図３は、ｌｙｓアジドＨ１−ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝３４７，９５８）、Ｈ１−Ｂ ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝３１３，３８６）及びＢ−ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝２３２，５０５）の存在下では、全て、頑健なアンバー抑制及びバックグラウンドレベル（ＭＦＩ＝２３，４８７）を超える完全長ＧＦＰの発現を支持することを示している。ｎｎＡＡの非存在下では、３つの構築物を含む細胞においてバックグラウンドレベルのＧＦＰ発現が観測された（それぞれ、ＭＦＩ＝３３，４５２；３６，２１７；４２，１０４）。これらのデータから、Ｂ ｔＲＮＡが直交性であり、高レベルの発現を支持することが事前に判明した構築物（Ｈ１−ｔＲＮＡＢ）を含め、ｎｎＡＡの非存在下では、バックグラウンドを超えるアンバー抑制レベルを支持しないことがわかる。ＷＴｔＲＮＡ（ＭＦＩ３３，７８１）と、遺伝子外プロモータエレメントを欠失したｔＲＮＡＢ（２３２，５０５）とのＧＦＰの発現の比較から、Ｂ突然変異が、機能性遺伝子内プロモータを生成することが確認される。実際、Ｂ ｔＲＮＡ構築物は、ＷＴｔＲＮＡに対して、ＧＦＰのアンバー抑制依存性発現のレベルの７倍増大を可能にした。

実施例２
コピー数及びアンバー抑制
ｔＲＮＡ−Ｂ構築物によるアンバー抑制の効果を高めるために、増加したコピー数が活性の増大をもたらすかどうかを評価した。

ＷＴ、Ｂ、又はＡ２Ｂ ｔＲＮＡの２コピーをタンデムでクローニングして、ＷＴ、Ｂ、又はＡ２Ｂ ｔＲＮＡの２コピーを含む単一のベクターを作製した。これらの構築物による増加遺伝子用量の効果を評価するために、ＷＴｐｙｌＲＳを発現する細胞をｔＲＮＡ構築物で一時的にトランスフェクトし、２日後に、ＧＦＰＹ４０リポータ構築物及びＧＦＰ発現を評価した。図７に示すデータから、Ｂ（ＭＦＩ＝６７，４８７）及びＡ２Ｂ ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝６１，９５０）は、ＷＴｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝１８，００２）によるものを超えるアンバー抑制レベルを支持することができることがわかり、Ｂ及びＡ２Ｂ ｔＲＮＡが、機能性プロモータエレメントを含むことが確認される。さらに、本発明者らは、Ｂ（ＭＦＩ＝１１０，９４１）及びＡ２Ｂ ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝９６，１５８）のタンデムコピーが、ＧＦＰ発現により決定されるように、アンバー抑制の有効性の同時増加をもたらすことも観測した。遺伝子用量は、ＷＴｔＲＮＡアンバーリードスルーを改善しなかった（ＭＦＩ＝２０，６１７）。

実施例３
遺伝子外プロモータ及びハイブリッド（４型）プロモータの下でのｔＲＮＡｐｙｌの発現
Ｈ１プロモータは、本明細書で、また他者により、ｔＲＮＡｐｙｌの発現を支持することが証明されている。しかし、哺乳動物細胞において、ｐｏｌＩＩＩ／３型（例えば、Ｈ１及びＵ６）プロモータの使用により、有意な有害作用が観測されている。従って、これらの欠陥を解消するために、ＲＮＡ発現を制御することが知られる遺伝子外プロモータエレメントのセットを、ｔＲＮＡｐｙｌを発現するその能力について評価した。遺伝子外プロモータエレメントは、ヒトＶａｕｌｔ、ＥＢＥＲ及び７ＳＬＲＮＡの発現を調節することがわかっている（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｏｗｅ ＆ Ｓｈｕ １９８９）。これらのプロモータの各々は、転写因子ＴＦＩＩＩｃを動員するが、ＳＮＡＰｃ（Ｕ６及びＨ１により用いられる）は動員しないことが判明している（Ｍｏｑｔａｄｅｒｉ ｅｔ ｌａ．，２０１０）（Ｆｅｌｔｏｎ−Ｅｄｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：３３８７１）。興味深いことに、これらのプロモータによる効率的な転写は、遺伝子内及び遺伝子外調節配列の両方を必要とする（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００４）；Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）；Ｈｏｗｅ ＆ Ｓｈｕ（１９８９））。共通Ａ及びＢボックスを含む機能性ｔＲＮＡｐｙｌの同定により、ｔＲＮＡｐｙｌの発現でのそれらの使用が可能になった。Ｖａｕｌｔ、７ＳＬ、及びＥＢＥＲ２ ＲＮＡを調節することがわかっているプロモータエレメントを既に記載されている配列から構築した（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｉｃｋｈｏｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｏｗｅ ＆ Ｓｈｕ １９８９）。本発明者らは、遺伝子外プロモータエレメントとして、ヒトＶａｕｌｔ及び７ＳＬＲＮＡ遺伝子並びにエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスＥＢＥＲ遺伝子のプロモータを、これらをＷＴｔＲＮＡ、ＢｔＲＮＡ、Ａ２ＢｔＲＮＡ、並びにＡ１０Ｇ及びＡ５２Ｃを含有する別の変異体（ＡＢｔＲＮＡ；配列番号８）又はＡ１０Ｇに単一の突然変異を含有する別の変異体（Ａ１ｔＲＮＡ；配列番号７）をコードする遺伝子の５’側に配置することにより試験した。

各構築物の活性は、前述したように、ＷＴｐｙｌＲＳを安定して発現する細胞に対するＧＦＰＹ４０リポータによる一過性トランスフェクションにより評価した。この実験のために、記載した構築物の各々をコードする１μｇのＰＣＲ産物を用いた。いずれの場合も、細胞をｌｙｓアジドｎｎＡＡに３日間暴露した後、フローサイトメトリーによりＧＦＰレベルをアッセイした。平均蛍光強度を各サンプルについて決定し、プロッティングした（図８）。ＧＦＰＹ４０だけ（ｔＲＮＡなし）でトランスフェクトしたサンプルを用いて、ｔＲＮＡの非存在下でのバックグラウンドアンバー抑制を確認した（ｔＲＮＡなし、ＭＦＩ＝１３７，５８９）。さらに、Ｈ１−ＷＴｔＲＮＡでトランスフェクトしたサンプルを用いて、ＧＦＰの高い発現レベル及びｔＲＮＡの機能（Ｈ１ＷＴｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝８２８，５０３）並びにｔＲＮＡ欠失遺伝子外プロモータによって決定された低レベルのアンバー抑制（ＷＴｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１１７，６２６）を画定した。図７に示すように、遺伝子外プロモータ（ＥＢＥＲ、Ｖａｕｌｔ及び７ＳＬ）を使用すると、ＥＢＥＲ、Ｖａｕｌｔ及び７ＳＬプロモータを含むＷＴｔＲＮＡに対して、ＧＦＰリポータの発現レベルが向上することがわかった。しかし、これらのプロモータの各々からの性能の向上には、遺伝子内ｔＲＮＡエレメントが必要であった。実際、７ＳＬＷＴｔＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、最低限のアンバー抑制を示した（７ＳＬＷＴｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１０６，０７５）。しかし、相対的アンバー抑制有効性は、保存Ａ及びＢボックスエレメントを含むｔＲＮＡで向上した（７ＳＬｔＲＮＡＡ１、ＭＦＩ＝１１４，３９３；７ＳＬＡＢ、ＭＦＩ＝２１０，３８０；７ＳＬＡ２Ｂ、ＭＦＩ＝２４５，１２０）。興味深いことに、最も高いアンバー抑制レベルは、機能性Ｂボックスのみを含むｔＲＮＡ構築物で観測された（７ＳＬＢｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝２６５，３９５）。この一般的傾向は、ＶａｕｌｔＲＮＡプロモータでも認められた。機能性Ｂボックスを含む構築物（Ｖａｕｌｔ、ＭＦＩ＝１７０，８３８）は、共通Ａ及びＢボックス（Ｖａｕｌｔ Ａ２ＢｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１５４，４４５）の両方を含むもの、並びに野生型ｔＲＮＡ（Ｖａｕｌｔ ＷＴｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１０２，４１５）に対して性能の向上を示した。ＥＢＥＲプロモータは、ｔＲＮＡが、保存Ａ及びＢボックスエレメントを含むとき、最もよく機能した（ＥＢＥＲ Ａ２ＢｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１３６，１９６）。この構築物は、Ｂ突然変異を含むｔＲＮＡ（ＥＢＥＲ ＢｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１１３，４９６）及び単一Ｂボックスと部分的に再構築されたＡボックスを含むｔＲＮＡ（ＥＢＥＲ ＡＢｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝１１９，７１９）、並びに非修飾ｔＲＮＡ（ＥＢＥＲ ＷＴｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝９９，３９３）より性能が優れていた。本発明者らのデータは、Ｖａｕｌｔ ｓｎＲＮＡ、７ＳＬ ＲＮＡ及びＥＢＥＲ ＲＮＡの遺伝子内ＲＮＡプロモータは、ｔＲＮＡｐｙｌの発現及び機能を支持することができることを示している。アンバー抑制の効果は、機能性Ｂボックスの存在に依存的である。

次に、本発明者らは、様々な機能性ｔＲＮＡ発現構築物の間でｔＲＮＡ依存性アンバー抑制のレベルを直接比較するために、アンバー抑制活性を試験した（図９）。このアッセイでは、ＷＴｐｙｌＲＳを安定して発現する細胞を、１μｇのＧＦＰＹ４０リポータ及び１μｇのｔＲＮＡ発現プラスミド（Ｈ１−ｔＲＮＡ、ＶａｕｌｔＢｔＲＮＡ、７ＳＬＢｔＲＮＡ、ＥＢＥＲＢｔＲＮＡ、ＢｔＲＮＡ若しくはＷＴｔＲＮＡ）の１つで一時的にトランスフェクトした。図９は、７ＳＬ−ＢｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝１６７，０２４）及びＶａｕｌｔ−ＢｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝１６８，２９８）の両方が、Ｈ１−ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝２４１，９０１）で認められたものと同等のアンバー抑制活性を支持することができ、これにより、Ｈ１−ｔＲＮＡ（図８）に対し、ｔＲＮＡ−Ｂ構築物（ＭＦＩ＝８９，８６９）及びＷＴｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝２５，４５９）と比較して活性の向上をもたらしたことを示している。

Ｂ ｔＲＮＡを含む遺伝子外７ＳＬプロモータにより支持されるアンバー抑制レベルを増大するために、Ｈ１ｔＲＮＡに対する７ＳＬ−ｔＲＮＡ−Ｂのタンデム反復配列の作用を調べた。このために、７ＳＬ−ｔＲＮＡ−Ｂの２コピーを単一ベクターにクローニングしてから、ＧＦＰＹ４０と一緒にＷＴｐｙｌＲＳを安定して発現する細胞の一過性トランスフェクションを用いて、アンバー抑制レベルを評価した。細胞をｌｙｓアジドと一緒に３日間インキュベートした後、ＧＦＰレベルをフローサイトメトリーにより定量した。図１０は、７ＳＬ−Ｂ−ｔＲＮＡ並びにＨ１−ｔＲＮＡの遺伝子コピーの増加が、アンバー抑制有効性及びＧＦＰ発現レベルの向上をもたらすことを示している。この実験では、ＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞を陰性対照（ＭＦＩ＝０）として使用した。Ｈ１−ｔＲＮＡのタンデムコピー（２×Ｈ１ｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝６２９）でトランスフェクトした細胞は、Ｈ１ｔＲＮＡの単一コピー（ＭＦＩ＝４５３）に対して、ＧＦＰＹ４０リポータ構築物の発現の２８％増大をもたらした。同じ効果が、遺伝子外プロモータを欠失しているが、機能性Ｂボックスを含むｔＲＮＡのタンデム反復配列でも認められた。ここで、ｔＲＮＡ Ｂのタンデム反復配列（２×ｔＲＮＡ Ｂ、ＭＦＩ＝３６６）は、単一遺伝子コピー（ｔＲＮＡ、ＭＦＩ＝３２９）に対して１０％の向上を示した。７ＳＬｔＲＮＡＢのタンデムコピー（２×７ＳＬｔＲＮＡＢ、ＭＦＩ＝５６８）もまた、単一遺伝子で観測されたシグナル（７ＳＬｔＲＮＡＢ、ＭＦＩ＝５２０）に対して８．５％の向上を示した。７ＳＬプロモータの制御下で、機能性Ｂボックスを欠失した野生型ｔＲＮＡをコード化する構築物は、７ＳＬｔＲＮＡＢより有効ではないことが既に判明している。前者の構築物も、この効果を確認するために、該分析に包含した（７ＳＬｔＲＮＡＷＴ、ＭＦＩ＝３１２）。実際、このデータは、Ｂ突然変異が、７ＳＬ−ｔＲＮＡ構築物の性能を向上させるという以前の実験結果を裏付けるものである。これらのデータから、遺伝子数の増加によって、サプレッサーｔＲＮＡの有効性を向上させることができることがわかる。さらに、これらのデータはまた、７ＳＬプロモータが、ｔＲＮＡｐｙｌの発現を促進する上でＨ１プロモータと同等であることも示している。

実施例４
バイシストロニックメッセージの一部としてのｔＲＮＡｐｙｌの発現
本発明者らは、ｔＲＮＡｐｙｌを発現するその能力について、バイシストロニックｔＲＮＡ発現構築物の有用性も試験した。その際、マウスｔＲＮＡ ＧｌｕとｔＲＮＡ Ａｓｐを使用した。いずれの場合も、活性を増大するために、構築物の複数の反復配列を作製した（３×Ｇｌｕ−ｐｙｌ及び２×Ａｓｐ−ｐｙｌ）。ここで、１μｇのリポータ構築物ＧＦＰＹ４０と１μｇの表示ｔＲＮＡ発現ベクター（図１１）で３Ｈ７細胞を一時的にトランスフェクトしてから、ｌｙｓアジドと一緒に３日間インキュベートした。データをフローサイトメトリーにより収集し、各サンプルについて平均蛍光強度をプロッティングした。本発明者らは、バイシストロニック構築物が、Ｈ１−ｔＲＮＡ陽性対照に対して高レベルのアンバー抑制を可能にすることを認めた。マウスｔＲＮＡｇｌｕ及びｐｙｌｔＲＮＡペアの３つのタンデム反復配列（３×Ｇｌｕ、ＭＦＩ＝４１９）、並びにマウスｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌｔＲＮＡペアの２つのタンデム反復配列（２×Ａｓｐ、ＭＦＩ＝４１９）から構成されるｔＲＮＡ発現カセットは、Ｈ１−ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝４５３）により生成されるシグナルの＞９０％を呈示したが、これは、機能性ｔＲＮＡを効率的に生産するその能力を示している。さらに、７ＳＬｔＲＮＡＢ（ＭＦＩ＝５２０）もまた、ｔＲＮＡの効率的な発現を明らかにした。７ＳＬ ＷＴ ｔＲＮＡ（ＭＦＩ＝３１２）から成る構築物は、低い効率の測定基準として包含した。加えて、ＧＦＰＹ４０リポータのみを含む細胞株を陰性対照（ＭＦＩ＝０）として用いた。このデータは、バイシストロニック構築物が、機能性Ａ及びＢボックスエレメントを欠失したｔＲＮＡの発現の効率的な方法であることを示し、さらに、哺乳動物細胞が、これらのＲＮＡ分子をプロセッシングして、成熟及び機能性ｔＲＮＡを産生することができることも明らかにしている。

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配列表：
下線を引いた配列は、Ａボックス及び／又はＢボックス配列を示す。
太字は、突然変異したヌクレオチドを示す。

配列番号１
＞ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、ＷＴ；コード配列

配列番号２
＞ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、ＷＴ；コード配列

配列番号３
＞ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、ＷＴ；コード配列

配列番号４
＞ｔＲＮＡｐｙｌ メタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、ＷＴ；コード配列

配列番号５
＞ｔＲＮＡｐｙｌ デスルホバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）、ＷＴ；コード配列

配列番号６
＞ＷＴ及び突然変異体Ａボックス及び／又はＢボックスｔＲＮＡｐｙｌ構築物に用いられる転写終結配列

配列番号７
＞ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ突然変異（「ｔＲＮＡ−Ａ１」）；コード配列

配列番号８
ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ Ａ５２Ｃ突然変異（「ｔＲＮＡ−ＡＢ」）；コード配列

配列番号９
ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ５２Ｃ突然変異（「ｔＲＮＡ−Ｂ」）；コード配列

配列番号１０
ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ１０Ｇ、Ｔ１４Ａ、Ａ５２Ｃ突然変異（「ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ」）；コード配列

配列番号１１
ｔＲＮＡｐｙｌ メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ａ５２Ｃ、Ｔ１４Ａ、突然変異（「ｔＲＮＡ−Ａ２」）；コード配列

配列番号１２
７ＳＬプロモータ５’領域配列

配列番号１３
７ＳＬ構築物に用いられるスペーサ

配列番号１４
７ＳＬ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物

配列番号１５
７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物

配列番号１６
７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物

配列番号１７
７ＳＬ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物

配列番号１８
７ＳＬ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物

配列番号１９
７ＳＬ、Ｖａｕｌｔ、ＥＢＥＲ構築物で用いられる転写終結配列

配列番号２０
Ｖａｕｌｔプロモータ５’領域配列

配列番号２１
Ｖａｕｌｔ−ｔＲＮＡ構築物に用いられるスペーサ

配列番号２２
Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物

配列番号２３
Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物

配列番号２４
Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物

配列番号２５
Ｖａｕｌｔ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物

配列番号２６
ＥＢＥＲ２プロモータ５’領域配列

配列番号２７
ＥＢＥＲ構築物で用いられるスペーサ

配列番号２８
ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物

配列番号２９
ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物

配列番号３０
ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物

配列番号３１
ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−ＡＢ構築物

配列番号３２
ＥＢＥＲ２ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物

配列番号３３
Ｈ１プロモータ配列

配列番号３４
Ｈ１ ｔＲＮＡ−ＷＴ構築物

配列番号３５
Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ｂ構築物

配列番号３６
Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ１構築物

配列番号３７
Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ２構築物

配列番号３８
Ｈ１ ｔＲＮＡ−Ａ２Ｂ構築物

配列番号３９
Ｈ１−ｔＲＮＡ構築物で用いられる転写終結配列

配列番号４０
ハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡｇｌｕコード配列

配列番号４１
５’及び３’非コード領域を有するハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）

配列番号４２
１×ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ ＤＮＡ構築物

配列番号４３
３×ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ：バイシストロニック構築物ｔＲＮＡｇｌｕ−ｔＲＮＡｐｌｙの３つの反復配列を含むＤＮＡ構築物

配列番号４４
ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物の５’リーダ配列

配列番号４５
ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物で用いられる転写終結配列

配列番号４６
ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物で用いられる転写終結配列

配列番号４７
ｔＲＮＡｇｌｕ−ｐｙｌ構築物で用いられるインタージーン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅ）配列

配列番号４８
ハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡａｓｐコード配列

配列番号４９
上流及び下流領域を有するハツカネズミ（Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｔＲＮＡａｓｐコード配列

配列番号５０
１×ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ ＤＮＡ構築物

配列番号５１
２×ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ：バイシストロニック構築物ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌの２反復配列を含むＤＮＡ構築物

配列番号５２
２×Ａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられるリーダ配列

配列番号５３
２×Ａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられる転写終結配列

配列番号５４
ｔＲＮＡａｓｐ−ｐｙｌ構築物で用いられるインタージーン配列

配列番号５５
ヒトｔＲＮＡｇｌｕコード配列

配列番号５６
ヒトｔＲＮＡａｓｐコード配列

配列番号５７
７ＳＬプロモータ変異体：７ＳＬ−１

配列番号５８
７ＳＬプロモータ変異体：７ＳＬ−２

配列番号５９
７ＳＬプロモータ変異体：ＳＬ２８

配列番号６０
７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ６３

配列番号６１
７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ２３

配列番号６２
７ＳＬプロモータ変異体：７Ｌ７

配列番号６３
ＥＢＥＲプロモータ変異体：ＥＢＥＲ１

配列番号６４
Ｖａｕｌｔプロモータ変異体：Ｈｖｇ３

配列番号６５
Ｖａｕｌｔプロモータ変異体：Ｈｖｇ２

配列番号６６
メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｐｙｌＲＳａａ配列

配列番号６７
メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ｐｙｌＲＳヌクレオチド配列

本発明、並びに以下に記載する特許請求の範囲全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」という用語、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形は、記載された整数、ステップ、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、いずれか他の整数、ステップ、整数若しくはステップ群の除外を意味するわけではないことは理解されよう。

本明細書の説明及びクレームがその一部を形成する本出願は、あらゆる後願に対する優先権の根拠として用いることができる。こうした後願のクレームは、本明細書に記載するいずれかの特徴又は特徴の組み合わせに関連し得る。これらは、製品、組成物、方法、又は使用クレームの形態であってよく、例えば、限定するものではないが、以下のクレームを含み得る。

Claims (35)

1. ｔＲＮＡｐｙｌコード配列と、真核生物発現系において、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、機能性ｔＲＮＡｐｙｌを発現させるように作用することができるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ配列とを含むＤＮＡ構築物。
2. 前記ナンセンス抑制が、アンバー抑制である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
3. 前記ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の下流にある転写終結配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ構築物。
4. 前記構築物が、前記ｔＲＮＡｐｙｌコード配列と、機能性遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータとを含むｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
5. 前記ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、前記遺伝子内ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの推定Ａボックス及び／又は推定Ｂボックス内の１つ又は２つのヌクレオチド位置に突然変異を含む、請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
6. 前記ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、推定Ｂボックス内の１つ又は２つ（例えば、１つ）のヌクレオチド位置に突然変異を含む、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
7. 前記ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｃｒｉｎａ ｍａｚｅｉ）由来の配列番号７、８、９、１０、若しくは１１の配列を有する若しくは含むか、又は、配列番号７、８、９、１０若しくは１１に太字で示される突然変異が同等位置に実施されている別の細菌種に由来する相似ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の配列を有する若しくは含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
8. 前記ｔＲＮＡｐｙｌコード配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータに作動可能に連結され、ここで、前記プロモータは、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に位置する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
9. 前記５’プロモータとｔＲＮＡｐｙｌコード配列が、転写開始部位を含むスペーサ配列によって隔てられている、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
10. 遺伝子内プロモータエレメントと、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータエレメントである５’プロモータエレメントとを、前記遺伝子内プロモータエレメントと前記５’プロモータエレメントとの組み合わせが、ハイブリッドプロモータを構成するように含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
11. 前記５’プロモータエレメントが、４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの５’エレメントである、請求項１０に記載のＤＮＡ構築物。
12. ４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの前記５’プロモータエレメントが、ＥＢＥＲ ＲＮＡ遺伝子プロモータの５’プロモータエレメント、７ＳＬ ＲＮＡ遺伝子プロモータ、及びＶａｕｌｔ ＲＮＡ遺伝子プロモータから選択される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
13. 前記５’プロモータエレメントが、配列番号１２、２０、２６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４及び６５から選択される、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
14. ４型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの前記５’プロモータエレメントが、７ＳＬ ＲＮＡ遺伝子プロモータである、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
15. 前記５’プロモータエレメントと前記ＲＮＡｐｙｌコード配列が、転写開始部位を含むスペーサ配列によって隔てられている、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
16. 前記スペーサ配列が、配列番号１３、２１及び２７から選択される、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物の複数のコピー（例えば、２〜６０コピー）を含む多量体ＤＮＡ構築物。
18. ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に真核生物ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子又は真核生物ｔＲＮＡａｓｐ遺伝子を含むＤＮＡ構築物であって、前記ｔＲＮＡｇｌｕ遺伝子又はｔＲＮＡａｓｐが、転写終結配列を欠失しているために、転写の際に、バイシストロニックメッセージをもたらす、ＤＮＡ構築物。
19. 前記ＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、野生型遺伝子である、請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
20. 前記ＲＮＡｐｙｌ遺伝子が、推定Ａボックス及び／又は推定Ｂボックス内の１つ又は２つのヌクレオチド位置に突然変異を含む、請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
21. ＰｙｌＲＳコード配列又は遺伝子をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
22. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むベクターで形質転換された真核宿主細胞。
23. ナンセンスコドンによりコードされる１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されている、請求項１７に記載の真核宿主細胞。
24. 機能性ＰｙｌＲＳ及び機能性ｔＲＮＡｐｙｌを発現するか、又は発現することができる真核宿主細胞であって、機能性ｔＲＮＡｐｙｌ発現は、遺伝子内プロモータエレメントと、ｔＲＮＡｐｙｌコード配列の５’側に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータエレメントである５’プロモータエレメントとの制御下で、前記遺伝子内プロモータエレメントと前記５’プロモータエレメントとの組み合わせが、ナンセンス抑制を支持する上で十分にハイブリッドプロモータを構成するように起こる真核宿主細胞。
25. 前記ナンセンス抑制が、アンバー抑制である、請求項１９に記載の真核宿主細胞。
26. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の真核宿主細胞。
27. ナンセンスコドンによりコードされる１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質を調製する方法であって、真核細胞株において前記標的タンパク質を発現させるステップを含み、前記真核細胞株が、ナンセンスコドンによりコード化される１つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質をコード化する遺伝子で形質転換されると共に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコード化する遺伝子でも、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが、ナンセンス抑制を支持する上で、十分に発現され、かつ機能するように、形質転換される方法。
28. 前記細胞株が、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物で形質転換される、請求項２７に記載の方法。
29. 化学的に修飾した標的タンパク質を調製する方法であって、請求項２７又は２８に記載の方法に従い標的タンパク質を調製するステップ、及び得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む方法。
30. 前記ナンセンスコドンが、アンバーコドンである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の細胞、細胞株又は方法。
31. 前記非天然アミノ酸の少なくとも１つは、アルキン又はアジド部分を含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の細胞、細胞株又は方法。
32. 請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法に従う製法を用いて調製された抗体コンジュゲートなどのタンパク質コンジュゲートであって、抗体などの前記タンパク質が、タンパク質、薬剤及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数の他の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介して結合されている、タンパク質コンジュゲート。
33. １つ又は複数の非天然アミノ酸を含有する標的タンパク質を発現すると共に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現するように安定に形質転換された真核細胞株の生存能を高める方法であって、ナンセンス抑制を支持する上で十分に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが発現され、かつ機能するように、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコード化する遺伝子で前記真核細胞株を形質転換するステップを含む方法。
34. 前記ナンセンス抑制が、アンバー抑制である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記ＲＮＡｐｙｌが、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）由来のｔＲＮＡｐｙｌではない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞、細胞株、方法又はタンパク質コンジュゲート。

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