JP2015530091A - 細胞株 - Google Patents
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Abstract
特に、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現する真核細胞株であって、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な真核細胞株を安定化させる方法であって、ｔＲＮＡＰｙｌ発現が細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件下で前記細胞株を培養するステップを含む方法が提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質への非天然アミノ酸の組込みに使用するのに好適な安定真核細胞株、及びその調製方法に関する。本発明はまた、他のタンパク質、薬物又は例えば半減期を延長させる他の部分とのコンジュゲーションに好適な非天然アミノ酸が組み込まれたタンパク質、及び対応するタンパク質コンジュゲートにも関する。さらに本発明は、新規アミノ酸誘導体に関する。
標的タンパク質への非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）の部位特異的な導入は、非特異的な方法と比べて機能化タンパク質コンジュゲートの作成に顕著な利点をもたらす（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。コンジュゲーションケミストリーにバイオ直交性部位を提供し、且つそうした部位で特異的反応が起こることを可能にする部分を含む様々な非天然アミノ酸が利用可能である。コンジュゲーション部位の位置を制御することで、活性部位及び必須のタンパク質機能ドメインを回避することにより最適な機能を備える生成物が可能となる。加えて、これにより均一で予想どおりに修飾された生成物を作成することが可能となり、生成物の機能特性及び精製が向上する。
細菌細胞におけるｎｎＡＡの部位特異的な組込みは、アミノ酸置換手法、及びそのコグネイトなｔＲＮＡのみに非天然アミノ酸をチャージする直交性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の改変によって達成されている。標的タンパク質における非天然アミノ酸の位置は、遺伝子配列内の様々なコドンによって特定することができるが、ほとんどの場合にアンバーコドンが対象とされる。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の原核生物ベースの系で発現し得るタンパク質の種類は、そうした生物のタンパク質折畳み機構によって制限されている。真核生物発現系（哺乳類発現系など）は、最適な治療機能にグリコシル化が必要なもの（例えばＧ−ＣＳＦ、インスリン、エポエチンα）、タンパク質複合体として存在するもの（例えば抗体）、又は細菌系では達成できないジスルフィド結合の形成などの翻訳後修飾が必要なもの（例えば心房性ナトリウム利尿因子）を含め、より幅広い種類のタンパク質の発現能を有する。
哺乳類細胞にｎｎＡＡを導入するための系は、インビトロでチャージされたｔＲＮＡのトランスフェクションによるか（Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９７８；；Ｋｏｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｏｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、或いは直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を使用して遺伝的にコードされて（Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ ２００８，Ｌｉｕ Ｗ．ｅｔ Ａｌ．，２００７；Ｗａｎｇ Ｗ．，２００７；Ｙｅ，Ｓ．ｅｔ Ａｌ．，２００８；Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋｅｔ Ａｌ，．２００２；Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｊ．ｅｔ Ａｌ．，２００９；Ｃｈｅｎ，Ｐ．ｅｔ Ａｌ．，２００９）開発されている。化学的にアシル化されたｔＲＮＡは再アシル化されず、従ってそれを大規模タンパク質合成に使用するのは、インビトロであれインビボであれ法外に高価である。ゲノム的にコードされたＲＳ／ｔＲＮＡ対は、ｎｎＡＡ挿入の特異性を維持するために宿主細胞と直交性である必要がある。
直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の使用において、ＲＳ及びｔＲＮＡの直交性は、鍵となる部位の突然変異によってｎｎＡＡに対する特異性を実現すると同時に、カノニカルなアミノ酸の認識、及び宿主ｔＲＮＡの認識を低下又は消失させることにより達成される。ｔＲＮＡもまた、宿主ＲＳによる認識を防ぎ、且つアンバー終止コドンを認識するように修飾され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ／Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｔＲＮＡｔｙｒ（Ｌｉｕ，Ｗ．，２００７；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｙｒＲＳ／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡｔｙｒ（Ｗａｎｇ，Ｗ．，２００７；Ｔａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）を含め、いくつかのＲＳ／ｔＲＮＡ対が開発されている。
一部の古細菌（メチルアミンを異化するメタン生成古細菌）では、アミノ酸ピロリシンに対して特異性を有するある直交性のＲＳ／ｔＲＮＡ対が天然に進化したことが観察されている。ピロリシンは、他の全てのアミノ酸及びｔＲＮＡと直交するように天然に進化した２１番目のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用する。
ピロリシンは天然アミノ酸であり、アンバーコドンによって固有に識別して指定される唯一のものである。Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００４は、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンバーコドンにピロリシンを組み込み得ることを示した。この著者らはまた、野生型（「ＷＴ」）ＰｙＬＲＳが天然では広域性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であり、リシンの類似体を組み込み得ることも示した。
Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ（欧州特許第１９１１８４０号明細書）は、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ系が真核細胞において直交性であることを実証し、細菌細胞においてアンバーコドンによりコードされる標的タンパク質へのいくつかのｎｎＡＡの組込みを示した。この著者らはまた、アミノ酸結合ポケットを形成し、且つ他のカノニカルなアミノ酸と比べてピロリシンを選択する際に機能するｐｙｌＲＳにおける主要なアミノ酸残基も特定した。この部位における突然変異により、ｔＲＮＡｐｙｌの認識及びＡｚＺ−ｌｙｓによるアミノアシル化が可能な突然変異体が生成された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８）。
この直交性は細菌及び真核細胞にまで及ぶ。
ＰｙｌＲＳは、リシンを排除するように天然に進化してきたが、アジド、アルキン及びアルケンを含め、突然変異なしにリシン類似体を組み込み得る天然で広域性の合成酵素である（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。この特異性の基本は、ｐｙｌＲＳ結合ポケットのアミノ酸残基と、アミノ酸を安定させて合成酵素の活性部位に正しく位置付けるピロリシンのピロール環との間の疎水性相互作用に依っている（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このＲＳ／ｔＲＮＡ対が一過性のトランスフェクションによって細菌、酵母及び哺乳類細胞に導入されており、標的タンパク質への複数の非天然アミノ酸の組込みに有効であることが示されている。
例えば、欧州特許第１９１１８４０号明細書は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における標的タンパク質へのＮ−ε−ｂｏｃ−リシンの組込みを実証している。
真核細胞におけるｔＲＮＡの発現には、ｔＲＮＡコード配列内に２つの内部プロモーターが必要である。かかるプロモーターのコンセンサス配列はボックスＡ及びボックスＢとして知られる（Ｎａｙｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
特定の原核生物由来のｔＲＮＡは内部プロモーターとして機能する配列を天然で有し、修飾なしに、又は遺伝子内プロモーター配列を生じさせるが、但しｔＲＮＡの機能若しくはそのコグネイトなＲＳによるその認識は変化させることのない変更を加えることで、動物細胞において発現させることができるが、ｔＲＮＡＰｙｌはかかるプロモーターを含まない。さらに、ボックスＡ及びボックスＢが通常存在するＤループが異常に小さく、Ｈａｎｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ（２０１０）が酵母で報告し、且つ本発明者らが哺乳類細胞で確認したとおり、前記ボックスＡ及びボックスＢの導入によりその機能が破壊され得る。
国際公開第２００７０９９８５４号パンフレットは、真核生物ｓｎＲＮＡプロモーターを使用した真核細胞におけるｔＲＮＡＰｙｌ発現の駆動を記載している。この明細書に記載されるＤＮＡコンストラクトは、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子と、前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’側に配置された転写ターミネーター配列と、前記ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に配置されたＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター又はＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩによる転写を誘導するプロモーター配列とを含む。
哺乳類での発現は、完全長抗体のような、難題である又は現在のところ原核生物系若しくは酵母細胞には達成できない完全に折り畳まれたタンパク質及びタンパク質複合体の産生が可能となるため、特に興味深い。
ヒト（ＨＥＫ２９３）細胞及びハムスター（ＣＨＯ）細胞の両方におけるピロリシンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ）及びそのｔＲＮＡｐｙｌをコードする遺伝子の一過性トランスフェクション実験では、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対が哺乳類細胞においてアンバー終止コドンにより指定された部位でｎｎＡＡを標的タンパク質に効率的に組み込むことが示されている（例えばＭｕｋａｉ ２００８を参照）。
欧州特許第１９１１８４０号明細書は、野生型ＰｙｌＲＳを有するベクター、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を有するベクター、及び標的遺伝子を有するベクターの導入を教示し、ここではリシン誘導体を挿入しようとする部位にアンバー突然変異が導入される。ベクターの導入に利用される技術は唯一、一過性のトランスフェクションである。実際のところ、安定クローンの選択についてはこの特許出願のどこにも述べられておらず、実験的に適用もされていない。
国際公開第０９０３８１９５号パンフレットは、その触媒活性を向上させて、大型の側鎖構造を有するリシンに由来する非天然アミノ酸の組込みを可能にする突然変異ＰｙｌＲＳ酵素の作成について記載している。
詳細には、国際公開第０９０３８１９５号パンフレットは、３８４位（メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ＰｙｌＲＳアミノ酸配列を参照する）の突然変異を記載しており、この突然変異はＴｙｒ３８４を、数あるアミノ酸の中でも特に、フェニルアラニンに置き換える。Ｔｙｒ３８４が基質アミノ酸、特にその主鎖と相互作用するという事実から（Ｋａｖｒａｎ ２００７，Ｎｏｚａｗａ ２００９）、酵素触媒活性が基質と独立して増進され得る可能性があると仮定される。
上述のとおり、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌ直交対に基づく発現は、これまで一過性の安定真核細胞株においてのみ達成されていた。一過性の安定細胞株は、市販用製品の信頼できる製造には好適でない；実に本発明者らは、今日市場に流通する哺乳類細胞由来の生物学的製品が専ら安定細胞株によって作成されていると考える。
従って、当該技術分野では、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌ直交対を含む安定真核細胞の作製方法を開発し、それによりｎｎＡＡを含むタンパク質の商業的規模での作製を促進することが、依然として必要とされている。
本発明は前述の必要性に対処する。
この数年、天然のＰｙｌＲＳか或いは遺伝的に進化したＰｙｌＲＳにより認識されタンパク質にアンバーコドン部位で組み込まれるアミノ酸誘導体として定義されるピロリシン類似体が開示されており、例えばＦｅｃｋｎｅｒら（Ｆｅｋｎｅｒ，Ｌｉ，＆ Ｃｈａｎ，２０１０）及びＬｉｕらによってレビューされている。官能基又は翻訳後修飾を有する類似体が、ｐｙｌＲＳ−ｔＲＮＡｐｙｌ系を使用してタンパク質に部位特異的に組み込まれている。いくつかの研究は（例えばＹａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌを参照）、類似体を適応させるためＰｙｌＲＳ酵素内の突然変異に着目したもので、ここでは結合ポケットピロリシン内でＮ６置換基が芳香環であった。他の研究、例えばＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ（同様に国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレットにおいても）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ（同様に国際公開第２０１１／０４４２５５号パンフレットにおいても）は、大型のＮ６置換基を有しないピロリシン類似体の同定に着目したもので、その結果、合成が簡単で且つ天然ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対と相互作用し得るより単純な類似体が得られた。さらなるピロリシン類似体の開発が依然として必要とされている。これまでに作られたピロリシン類似体はリシン骨格から進化したものに限られていたが、本発明者らは、様々なアミノ酸構造から出発して天然ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対によるタンパク質への組込みが成功したピロリシン類似体を作成している。
細胞傷害性薬物を腫瘍細胞に標的化するため、合成リンカーを用いて高度に細胞傷害性の薬物に共有結合した組換えキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体で構成される抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、近年開発されている。腫瘍関連抗原を標的とする抗体、強力な毒素及び妥当なコンジュゲーションケミストリーの適切な組み合わせが、正常組織への薬物の毒性を回避しながら毒素を腫瘍細胞に直接送達するのに極めて有効であり得る。
これまでに開発されたＡＤＣは、ＡＤＣの作成時に用いられたコンジュゲーションのケミストリーに応じて、コンジュゲート抗体と非コンジュゲート抗体の不均一な混合物である。詳細には、最も一般的に用いられるコンジュゲーションプロトコルはランダムな性質であるため、抗体分子当たりにコンジュゲートした薬物の数（ＤＡＲ）が様々であるとともにコンジュゲーション部位が様々である種の集合となる。一般的なコンジュゲーションケミストリーはリシン側鎖ベースのコンジュゲーションを含み、典型的な抗体でリシン残基は利用可能性が高いため、これにより広範囲の種がもたらされる。システイン残基を改変して反応性のチオール基を作製することにより部位特異性のより高いコンジュゲーションが達成されており、ほぼ均一なＡＤＣがもたらされている。
ＥＧＦＲファミリーのメンバーであるＨｅｒ２腫瘍関連抗原は、乳癌において抗Ｈｅｒ２抗体のハーセプチンによる標的化が成功しているが、しかしながら、抗体それ自体は限られた患者群で有効である。より強力な形態のａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（それに連結した毒素を有する）が、現在利用可能である。ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンは癌細胞の細胞質に毒素を送達する能力を有するため、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンはハーセプチンに不応性の患者を有効に治療することができる。ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン及びブレンツキシマブベドチンが用いているコンジュゲーションケミストリーは、通常ジスルフィド結合を形成する既存のシステイン残基、及び最近では改変された遊離システイン残基を利用するものである。この手法は、ｍＡｂの異なる位置に異なる数の薬物を有するＡＤＣの不均一な混合物の生成をもたらしている。使用されるリンカーには、チオエーテル（Ｋａｄｃｙｌａ）並びにジペプチドリンカー（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）が含まれ、後者はリソソーム酸加水分解酵素によって特異的に切断される。いずれのタイプのリンカーも、有効であるが最適ではないように思われる。ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、及びゲムツズマブオゾガマイシンの製造に使用されるような従来のＣｙｓ又はＬｙｓ特異的バイオコンジュゲーション方法では、毒素が腫瘍細胞に入り込む前に早まって放出されることが可能である。２０００年に承認されたゲムツズマブオゾガマイシンは、酸に不安定なリンカーの使用により血中でＡＤＣから毒素の忍容し難い放出が引き起こされることに起因した毒性の高さのため、２０１０年に市場から回収された。
従って、当該技術分野では、コンジュゲーション部位及び抗体当たりの薬物の数が十分に制御された、高度に均一なＡＤＣの開発が依然として必要とされている。
本発明者らは、ｎｎＡＡの部位特異的な組込みと、続くそのｎｎＡＡの部位における抗体のコンジュゲーションを用いることにより、均一且つ強力なＡＤＣの作成が可能であることを発見した。さらに、本発明者らは、ＩｇＧ定常領域内で、抗体の結合の特異性又はそのインビボでの薬物動態特性を破壊することなくコンジュゲーションに使用することのできる部位を発見した。
本発明によれば、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現する安定真核細胞株であって、且つアンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質を発現させることが可能な遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の調製方法が提供される。
本発明は、従来技術の方法により調製された細胞株の不安定性の原因に関する本発明者らの知見から導き出される。
アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質を発現させることが可能な遺伝子を持たないｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現する従来の真核細胞、例えばＣＨＯ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞は、培養物における死細胞の割合の高さ、円形の細胞形態、成長プレートに対する細胞接着の弱さ、及び細胞成長速度の低下を含め、細胞毒性の指標となる表現型を取ることが観察され得る。本発明者らは、続いて標的タンパク質の発現を可能にする前記遺伝子を発現させると、細胞の健康が著しく向上するように見えたことを観察した。本発明者らには、この毒性が系における高量のｔＲＮＡｐｙｌの発現と関連付けられるように思われ、ｔＲＮＡｐｙｌはｎｎＡＡの非存在下では、アンバー終止コドンで終結する必須のハウスキーピング遺伝子の伸長を誘導する（Ｌｉｅｂｍａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ １９７６；Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６）。
従って、理論により拘束されるものではないが、ｔＲＮＡｐｙｌの毒性作用は、標的タンパク質の非存在下で高レベルのｔＲＮＡｐｙｌが存在するときに起こる不完全な直交性の帰結であり得る。
ｔＲＮＡｐｙｌは哺乳類細胞において大部分が直交性であるが、ｎｎＡＡの非存在下では（ここでは天然酵素ｐｙｌＲＳが空いている）ｔＲＮＡｐｙｌが宿主ＲＳの一つによって非効率にアミノアシル化され得る可能性がある。高レベルのｔＲＮＡを発現する細胞では、多量のアミノアシル化ｔＲＮＡが生じ得ることで、必須遺伝子の不規則なアンバーサプレッションが余儀なくされ得る。
従って、本発明者らは、ｔＲＮＡｐｙｌの見かけ上の毒性作用の低下又はマスキングをその目標として有する方法により、安定細胞株を作製し得ると推定した。
従って、本発明の第１の態様として、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現する真核細胞株（特に哺乳類細胞株）であって、且つアンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な真核細胞株を安定化させる方法が提供され、この方法は、ｔＲＮＡＰｙｌ発現が細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件下で前記細胞株を培養するステップを含む。
本発明の第２の態様として、本明細書に記載されるとおりの式ＶＩＩのデコイアミノ酸（ｄｎｎＡＡ）が提供され、これは、前記安定細胞株を作製又は維持する間に培養培地に加えるとｔＲＮＡｐｙｌの毒性作用を低下させ又はマスキングするという利点を有する。
本発明の第３の態様によれば、本明細書に記載されるとおりの式Ｖ及びＶＩのピロリシンの新規非天然アミノ酸類似体が提供され、これは、タンパク質に（典型的には適切に使用した場合に生物活性の損失なしに）容易に組み込まれる点、及びバイオコンジュゲーションに有用な手段を提供する点で、調製が簡単であるという利点を有する。
本発明の第４の態様によれば、非天然アミノ酸を所定の位置に部位特異的に挿入することにより高度な均一性及び活性の抗体薬物コンジュゲートを得る方法が提供される。
配列表の簡単な説明
配列番号１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型アミノ酸配列
配列番号２：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異アミノ酸配列
配列番号３：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）野生型アミノ酸配列
配列番号４：ＰｙｌＲＳデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）アミノ酸配列
配列番号５：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎ）アミノ酸配列
配列番号６：ＰｙｌＲＳメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）アミノ酸配列
配列番号７：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）アミノ酸配列
配列番号８：ＰｙｌＲＳメタノサルスム・ジリネ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）アミノ酸配列
配列番号９：ＰｙｌＲＳメタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）アミノ酸配列
配列番号１０：ＰｙｌＲＳメタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）アミノ酸配列
配列番号１１：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・ギブソニエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）アミノ酸配列
配列番号１２：ＰｙｌＲＳデスルホスポロシヌス・メリジエイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｍｅｒｉｄｉｅｉ）アミノ酸配列
配列番号１３：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・アセトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ）アミノ酸配列
配列番号１４：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型ヌクレオチド配列
配列番号１５：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異ヌクレオチド配列
配列番号１６：ＰｙｌＲＳコドン最適化メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ヌクレオチド配列
配列番号１７：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）ヌクレオチド配列
配列番号１８：ＰｙｌＲＳデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）ヌクレオチド配列
配列番号１９：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）ヌクレオチド配列
配列番号２０：ＰｙｌＲＳメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ヌクレオチド配列
配列番号２１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ヌクレオチド配列
配列番号２２：ＰｙｌＲＳメタノサルスム・ジリネ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）ヌクレオチド配列
配列番号２３：ＰｙｌＲＳメタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）ヌクレオチド配列
配列番号２４：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・ギブソニエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）ヌクレオチド配列
配列番号２５：ＰｙｌＲＳメタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）ヌクレオチド配列
配列番号２６：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）
配列番号２７：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）
配列番号２８：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）
配列番号２９：ｔＲＮＡｐｙｌメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）
配列番号３０：ｔＲＮＡｐｙｌデスルホバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）
配列番号３１：Ｈ１／ＴＯプロモーター
配列番号３２：Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーター
配列番号３３：ＳＮＲ５２プロモーター
配列番号３４：Ｈ１プロモーター
配列番号３５：Ｕ６−ｔＲＮＡｐｙｌコンストラクト
配列番号３６：ＧＦＰヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｌｏｔｉｄｅ）配列
配列番号３７：ＧＦＰアミノ酸配列
配列番号３８：ＧＦＰＹ４０アミノ酸配列
配列番号３９：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γヌクレオチド配列
配列番号４０：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γアミノ酸配列
配列番号４１：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γ＿アンバーＫ２７４ヌクレオチド配列
配列番号４２：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γ＿アンバーＫ２７４アミノ酸配列
配列番号４３：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）κヌクレオチド配列
配列番号４４：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）κアミノ酸配列
配列番号４５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γヌクレオチド配列
配列番号４６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γアミノ酸配列
配列番号４７：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーヌクレオチド配列
配列番号４８：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーアミノ酸配列
配列番号４９：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｔ３５９アンバーヌクレオチド配列
配列番号５０：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｔ３５９アンバーアミノ酸配列
配列番号５１：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κヌクレオチド配列
配列番号５２：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κアミノ酸配列
配列番号５３：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｄ７０アンバーヌクレオチド配列
配列番号５４：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｄ７０アンバーアミノ酸配列
配列番号５５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｅ８１アンバーヌクレオチド配列
配列番号５６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｅ８１アンバーアミノ酸配列
配列番号５７：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖヌクレオチド配列
配列番号５８：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖアミノ酸配列
配列番号５９：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ＿１１７アンバーヌクレオチド配列
配列番号６０：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ＿１１７アンバーアミノ酸配列
配列番号６１：ＦＧＦ２１野生型ヌクレオチド配列
配列番号６２：ＦＧＦ２１野生型アミノ酸配列
配列番号６３：ＦＧＦ２１ Ｒ１３１アンバーヌクレオチド配列
配列番号６４：ＦＧＦ２１ Ｒ１３１アンバーアミノ酸配列
配列番号６５：ＦＧＦ２１ Ｆ１２アンバーヌクレオチド配列
配列番号６６：ＦＧＦ２１ Ｆ１２アンバーアミノ酸配列
配列番号６７：ＦＧＦ２１ Ｌ６０アンバーヌクレオチド配列
配列番号６８：ＦＧＦ２１ Ｌ６０アンバーアミノ酸配列
配列番号６９：ＦＧＦ２１Ｐ ９０アンバーヌクレオチド配列
配列番号７０：ＦＧＦ２１Ｐ ９０アンバーアミノ酸配列
配列番号７１：ＦＧＦ２１ Ｐ１４０アンバーヌクレオチド配列
配列番号７２：ＦＧＦ２１ Ｐ１４０アンバーアミノ酸配列
配列番号７３：ＧＦＰＹ４０ヌクレオチド配列
配列番号７４：ハーセプチンヌクレオチド配列重鎖
配列番号７５：ハーセプチンアミノ酸配列重鎖
配列番号７６：ハーセプチンＨ２７４ヌクレオチド配列重鎖
配列番号７７：ハーセプチンＨ２７４アミノ酸配列重鎖
配列番号７８：ハーセプチンヌクレオチド配列軽鎖
配列番号７９：ハーセプチンアミノ酸配列軽鎖
配列番号８０：３ｘＦｌａｇタグ配列
配列番号８１：５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグ
配列番号８２：ヒトＩｇＧ１重鎖の一部（定常領域）
配列番号８３：配列番号５２の一部（フレームワーク領域）
配列番号８４：配列番号５２の一部（フレームワーク領域）
配列番号１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型アミノ酸配列
配列番号２：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異アミノ酸配列
配列番号３：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）野生型アミノ酸配列
配列番号４：ＰｙｌＲＳデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）アミノ酸配列
配列番号５：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎ）アミノ酸配列
配列番号６：ＰｙｌＲＳメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）アミノ酸配列
配列番号７：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）アミノ酸配列
配列番号８：ＰｙｌＲＳメタノサルスム・ジリネ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）アミノ酸配列
配列番号９：ＰｙｌＲＳメタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）アミノ酸配列
配列番号１０：ＰｙｌＲＳメタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）アミノ酸配列
配列番号１１：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・ギブソニエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）アミノ酸配列
配列番号１２：ＰｙｌＲＳデスルホスポロシヌス・メリジエイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｍｅｒｉｄｉｅｉ）アミノ酸配列
配列番号１３：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・アセトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ）アミノ酸配列
配列番号１４：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）野生型ヌクレオチド配列
配列番号１５：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｙ３８４Ｆ突然変異ヌクレオチド配列
配列番号１６：ＰｙｌＲＳコドン最適化メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ヌクレオチド配列
配列番号１７：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）ヌクレオチド配列
配列番号１８：ＰｙｌＲＳデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）ヌクレオチド配列
配列番号１９：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）ヌクレオチド配列
配列番号２０：ＰｙｌＲＳメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ヌクレオチド配列
配列番号２１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ヌクレオチド配列
配列番号２２：ＰｙｌＲＳメタノサルスム・ジリネ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）ヌクレオチド配列
配列番号２３：ＰｙｌＲＳメタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）ヌクレオチド配列
配列番号２４：ＰｙｌＲＳデスルホトマキュラム・ギブソニエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）ヌクレオチド配列
配列番号２５：ＰｙｌＲＳメタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）ヌクレオチド配列
配列番号２６：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）
配列番号２７：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）
配列番号２８：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）
配列番号２９：ｔＲＮＡｐｙｌメタノコッコイデス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）
配列番号３０：ｔＲＮＡｐｙｌデスルホバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）
配列番号３１：Ｈ１／ＴＯプロモーター
配列番号３２：Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーター
配列番号３３：ＳＮＲ５２プロモーター
配列番号３４：Ｈ１プロモーター
配列番号３５：Ｕ６−ｔＲＮＡｐｙｌコンストラクト
配列番号３６：ＧＦＰヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｌｏｔｉｄｅ）配列
配列番号３７：ＧＦＰアミノ酸配列
配列番号３８：ＧＦＰＹ４０アミノ酸配列
配列番号３９：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γヌクレオチド配列
配列番号４０：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γアミノ酸配列
配列番号４１：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γ＿アンバーＫ２７４ヌクレオチド配列
配列番号４２：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）γ＿アンバーＫ２７４アミノ酸配列
配列番号４３：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）κヌクレオチド配列
配列番号４４：抗ＩＬ−６（２８Ｄ２）κアミノ酸配列
配列番号４５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γヌクレオチド配列
配列番号４６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γアミノ酸配列
配列番号４７：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーヌクレオチド配列
配列番号４８：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーアミノ酸配列
配列番号４９：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｔ３５９アンバーヌクレオチド配列
配列番号５０：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｔ３５９アンバーアミノ酸配列
配列番号５１：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κヌクレオチド配列
配列番号５２：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κアミノ酸配列
配列番号５３：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｄ７０アンバーヌクレオチド配列
配列番号５４：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｄ７０アンバーアミノ酸配列
配列番号５５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｅ８１アンバーヌクレオチド配列
配列番号５６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κ Ｅ８１アンバーアミノ酸配列
配列番号５７：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖヌクレオチド配列
配列番号５８：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖアミノ酸配列
配列番号５９：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ＿１１７アンバーヌクレオチド配列
配列番号６０：抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ＿１１７アンバーアミノ酸配列
配列番号６１：ＦＧＦ２１野生型ヌクレオチド配列
配列番号６２：ＦＧＦ２１野生型アミノ酸配列
配列番号６３：ＦＧＦ２１ Ｒ１３１アンバーヌクレオチド配列
配列番号６４：ＦＧＦ２１ Ｒ１３１アンバーアミノ酸配列
配列番号６５：ＦＧＦ２１ Ｆ１２アンバーヌクレオチド配列
配列番号６６：ＦＧＦ２１ Ｆ１２アンバーアミノ酸配列
配列番号６７：ＦＧＦ２１ Ｌ６０アンバーヌクレオチド配列
配列番号６８：ＦＧＦ２１ Ｌ６０アンバーアミノ酸配列
配列番号６９：ＦＧＦ２１Ｐ ９０アンバーヌクレオチド配列
配列番号７０：ＦＧＦ２１Ｐ ９０アンバーアミノ酸配列
配列番号７１：ＦＧＦ２１ Ｐ１４０アンバーヌクレオチド配列
配列番号７２：ＦＧＦ２１ Ｐ１４０アンバーアミノ酸配列
配列番号７３：ＧＦＰＹ４０ヌクレオチド配列
配列番号７４：ハーセプチンヌクレオチド配列重鎖
配列番号７５：ハーセプチンアミノ酸配列重鎖
配列番号７６：ハーセプチンＨ２７４ヌクレオチド配列重鎖
配列番号７７：ハーセプチンＨ２７４アミノ酸配列重鎖
配列番号７８：ハーセプチンヌクレオチド配列軽鎖
配列番号７９：ハーセプチンアミノ酸配列軽鎖
配列番号８０：３ｘＦｌａｇタグ配列
配列番号８１：５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグ
配列番号８２：ヒトＩｇＧ１重鎖の一部（定常領域）
配列番号８３：配列番号５２の一部（フレームワーク領域）
配列番号８４：配列番号５２の一部（フレームワーク領域）
定義
用語「アルキル」は、典型的には１〜６個、例えば１〜４個の炭素原子を含む、且つ直鎖状又は分枝状であってもよい脂肪族の結合又は置換基を指す。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチルが挙げられる。
用語「アルキル」は、典型的には１〜６個、例えば１〜４個の炭素原子を含む、且つ直鎖状又は分枝状であってもよい脂肪族の結合又は置換基を指す。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチルが挙げられる。
用語「アルケニル」は、典型的には２〜６個、例えば２〜４個の炭素原子を含む、直鎖状又は分枝状であってもよい、且つ少なくとも１つのＣ＝Ｃ部分を含む点で不飽和の、脂肪族の結合又は置換基を指す。具体的な例は、Ｃ＝Ｃ部分が末端にある末端アルケン基である。アルケニルの例としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、及び２−メチル−プロペン−２−イルが挙げられる。
用語「アルキン」又は「アルキニル」は、典型的には２〜６個、例えば２〜４個の炭素原子を含む、直鎖状又は分枝状であってもよい、且つ少なくとも１つのＣ≡Ｃ部分を含む点で不飽和の、脂肪族の結合又は置換基を指す。具体的な例は、Ｃ≡Ｃ部分が末端にある末端アルキン基である。アルキニル基の例としては、−Ｃ≡ＣＨ及び−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ3が挙げられる。
用語「アリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得る芳香環構造を指す。アリール部分は１個の環（例えばフェニル）又は２個の環（例えばナフチル）又は３個以上の環を含んでもよく、ただし少なくとも１個の環は芳香族である。アリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される１つ以上の（例えば１つ又は２つ、例えば１つの）置換基によって置換されていてもよい。例示的なアリールはフェニルである。
用語「ヘテロアリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得るヘテロ芳香環構造を指す。ヘテロ芳香環は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１〜４個（より通常は１〜３個、例えば１個又は２個の）ヘテロ原子を含み得る。ヘテロアリール部分は１個の環又は２個の環又は３個以上の環を含んでもよく、ただし少なくとも１個の環はヘテロ芳香族である。１個の６員環を含む例示的な基としては、ピリジン及びピリミジンが挙げられる。１個の５員環を含む例示的な基としては、ピロール、フラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、チアジアゾール及びテトラゾールが挙げられる。２個の環を含むヘテロアリール部分は一方又は両方の環にヘテロ原子を含み得る。例としては、キノリン及びイソキノリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される１つ以上の（例えば１つ又は２つ、例えば１つの）置換基によって置換されていてもよい。
用語「メチル」又は「Ｍｅ」は、ＣＨ3基を指す。
用語「ＯＭｅ」は、Ｏ−ＣＨ3基を指す。
用語「エチル」又は「Ｅｔ」は、ＣＨ2ＣＨ3基を指す。
用語「ＯＥｔ」は、Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3基を指す。
用語「ｔＢｕ」は、Ｃ（ＣＨ3）3基を指す。
用語「ＯｔＢｕ」は、Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）3基を指す。
用語「ＯＢｎ」又は「Ｏベンジル」は、Ｏ−ＣＨ2−Ｐｈ基を指す。
用語「ＯＦｍｏｃ」又は「ＯＣＨ2フルオレン」は、以下の構造を指す：
用語「フェニル」又は「Ｐｈ」は、以下の構造にあるとおりのベンゼン環を指す：
用語「アリル」は、ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2基を指す。
用語「塩化エチル」は、ＣＨ2ＣＨ2−Ｃｌ基を指す。
用語「アジド（ａｚｉｄｅ）」及び「アジド（ａｚｉｄｏ）」は、Ｎ＝Ｎ（＋）＝Ｎ（−）又はＮ3官能基を指す。
用語「アジドアルキル」は、アジド、特に末端アジドにより置換されたアルキルを意味する。例としては、−（ＣＨ2）nＮ3（式中、ｎ＝１〜４）が挙げられる。
用語「ハロアルキル」は、１つ以上の（例えば１つ、２つ又は３つ、特に１つ又は２つ、例えば１つの）ハロゲン原子（例えばＣｌ又はＦ原子）により置換されたアルキルを意味する。例としては、−ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌが挙げられる。
用語「プロパルギル」は、末端アルキンに付加されたメチル基を指す。これは−ＣＨ2−Ｃ≡Ｃ−Ｈにより表される。
用語「アミド」は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。
用語「カルバメート」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。
用語「エステル」は、−Ｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ結合を指す。
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。
用語「ケトン」はＣ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ結合を指す。
用語「ピロリシン類似体（アナログ）」は、天然のＰｙｌＲＳか或いは遺伝的に進化したＰｙｌＲＳにより認識されタンパク質にナンセンスコドン部位で組み込まれるアミノ酸誘導体を意味する。
「２０個の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖」という用語は、その一文字記号Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹで知られる２０個の天然アミノ酸に関係する式ＨＯＯＣ−ＣＨＲ−ＮＨ2のＲ基を指す。Ｌ又はＳのいずれの立体化学も（又はそれらの混合物も）意図され、しかしながらＬ立体化学が好ましい。
用語「細胞生存能力」は、インビトロで培養される細胞というコンテクストの中で、全細胞試料を基準とする生細胞（生存可能細胞）又は死細胞の判定を指す。細胞は、それが成長及び発達する能力を有する場合に生存可能であると考えられる。生存能力アッセイは、膜の完全性などの生存可能細胞の物理的性質に基づくか、又はその代謝活性に基づく。
用語「細胞成長」は、所定の期間における細胞分裂回数で測るときの細胞増殖を指す。成長は、培養物の細胞密度（細胞／ｍＬ）を経時的に追跡することにより計測される。
用語「安定発現」は、目的の遺伝子（又は対応するｃＤＮＡ）が標的細胞の染色体に組み込まれることにより達成されるタンパク質の発現を指す。
従って用語「安定組込み」は、目的の遺伝子（又は対応するｃＤＮＡ）が標的細胞の染色体に組み込まれることを指す：初めに目的の遺伝子が細胞に、続いて核に導入されなければならず、最後にそれが染色体ＤＮＡに組み込まれなければならない。安定にトランスフェクトされた細胞は、様々な方法で選択し、培養することができる：例えば、同じベクター上か或いは第二のコトランスフェクトされたベクター上にある選択マーカーを共発現させる。トランスフェクト細胞を選択するための様々なシステムが、抗生物質耐性、例えばＧ４１８耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、又はグルタミン合成酵素を含め、存在する。トランスフェクト細胞の培養は、バルクで実施して耐性細胞の混合集団を得てもよく、或いは単一の細胞培養物によって実施して、一つの単一の組込みイベントから細胞クローンを得てもよい。
用語「標的遺伝子」は、ｎｎＡＡの挿入によって修飾しようとするタンパク質をコードする遺伝子を指す。
本発明に係る様々な実施形態
「デコイアミノ酸」手法
ある実施形態によれば、ｔＲＮＡｐｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ＰｙｌＲＳに対する基質である（即ちアミノアシル化され、ｔＲＮＡｐｙｌにロードされる）がしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできないデコイアミノ酸（囮アミノ酸）が細胞株の培養培地中に存在する条件が含まれる方法が提供される。
「デコイアミノ酸」手法
ある実施形態によれば、ｔＲＮＡｐｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ＰｙｌＲＳに対する基質である（即ちアミノアシル化され、ｔＲＮＡｐｙｌにロードされる）がしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできないデコイアミノ酸（囮アミノ酸）が細胞株の培養培地中に存在する条件が含まれる方法が提供される。
従って、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、以下のステップを含み得る：
１．細胞の成長培地に、コグネイトｔＲＮＡに対する直交性のＲＳによって容易に認識及び活性化されるデコイアミノ酸を導入するステップ
２．ＲＳ及びｔＲＮＡを１つ以上のプラスミドで真核細胞に導入するステップ
３．ＲＳ及びｔＲＮＡ発現カセットを含む細胞を選択するステップ
４．ＲＳタンパク質及びｔＲＮＡを発現する１つ以上の安定クローンを単離するステップであって、それによりプラットフォーム細胞株を作成するステップ。３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い、又は好ましくは９０％より高い非天然アミノ酸組込み率が可能な細胞が選択される。
５．非天然アミノ酸を組み込もうとする１つ又は複数の位置に１つ以上のアンバーコドンが導入されている標的タンパク質のｃＤＮＡを導入するステップ
６．高レベルの（０．５〜１０ｐｇ／細胞／日より高い）標的遺伝子産物を発現する安定クローンを単離するステップ
７．デコイアミノ酸の非存在下、しかしアンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で、細胞株を成長させるステップ。
１．細胞の成長培地に、コグネイトｔＲＮＡに対する直交性のＲＳによって容易に認識及び活性化されるデコイアミノ酸を導入するステップ
２．ＲＳ及びｔＲＮＡを１つ以上のプラスミドで真核細胞に導入するステップ
３．ＲＳ及びｔＲＮＡ発現カセットを含む細胞を選択するステップ
４．ＲＳタンパク質及びｔＲＮＡを発現する１つ以上の安定クローンを単離するステップであって、それによりプラットフォーム細胞株を作成するステップ。３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い、又は好ましくは９０％より高い非天然アミノ酸組込み率が可能な細胞が選択される。
５．非天然アミノ酸を組み込もうとする１つ又は複数の位置に１つ以上のアンバーコドンが導入されている標的タンパク質のｃＤＮＡを導入するステップ
６．高レベルの（０．５〜１０ｐｇ／細胞／日より高い）標的遺伝子産物を発現する安定クローンを単離するステップ
７．デコイアミノ酸の非存在下、しかしアンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で、細胞株を成長させるステップ。
この実施形態によれば、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡ合成酵素対を含む細胞株にデコイアミノ酸が存在するとき、デコイアミノ酸はＰｙｌＲＳに結合し、ｔＲＮＡとアミノアシル化される。次にそれがリボソームに移され、そこでｔＲＮＡがアンバーコドンに結合し、しかしアシル化されたアミノ遮断デコイにペプチド結合を形成する能力はなく、従ってタンパク質はこの部位で終結する。
一実施形態では、細胞に標的タンパク質のｃＤＮＡが導入された後にはデコイは存在しない。
或いは、標的タンパク質をコードするｃＤＮＡが細胞に導入されるとき、デコイアミノ酸は培養培地中に維持される。
代替的実施形態において、標的タンパク質の発現はデコイアミノ酸の存在下で起こる。従ってこの実施形態によれば、標的タンパク質の産生中、デコイアミノ酸及びＰｙｌＲＳによって選択的に使用される所望の非天然アミノ酸の両方が発酵培地に加えられる（又はそこに存在する）。
デコイアミノ酸は、それがＰｙｌＲＳとの結合について幾らかでも有意な程度に所望の非天然アミノ酸と競合する場合、発酵培地に加えてはならず又はそこに存在してはならない。
別の実施形態では、標的タンパク質の発現は、デコイアミノ酸の存在下では起こらない（例えば発酵培地から除去後）。従ってこの実施形態によれば、標的タンパク質の発現中、デコイアミノ酸は発酵培地に導入されない。標的タンパク質の産生中、ＰｙｌＲＳと選択的に結合する所望の非天然アミノ酸のみが発酵に加えられる（又はそこに存在する）。この実施形態によれば、デコイアミノ酸は、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡを含むプラットフォーム細胞株の選択及び単離の間にわたり培養培地中で利用される。１つ以上のアンバーコドンを含む標的遺伝子の導入及び選択後、デコイアミノ酸は取り除かれる。
必要であれば、複数の（例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つ又はそれ以上の）デコイアミノ酸が用いられ得る。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌの発現能を有する安定真核細胞株であって、且つナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできない、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減するデコイアミノ酸の存在下で、得られた細胞株を培養又は選択するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできない、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減するデコイアミノ酸の存在下で、得られた細胞株を培養又は選択するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に、前記細胞株で前記標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び（ｄ）前記デコイアミノ酸の非存在下で標的タンパク質を発現させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、前述の態様のいずれか一つに記載の安定真核細胞株の作製方法であって、細胞株を培養又は選択するステップが、ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできない、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減するデコイアミノ酸の存在下で実施される方法である。
「標的先行」手法
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質もまた前記細胞株により発現する条件が含まれる方法が提供される。
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質もまた前記細胞株により発現する条件が含まれる方法が提供される。
従って、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、以下のステップを含み得る：
１．１つ以上のプラスミドで真核細胞における非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンを含む標的遺伝子を導入するステップ
２．標的タンパク質を高レベルで（０．５ｐｇ／細胞／日より高い又は１０ｐｇ／細胞／日より高い）発現した細胞又はクローンのプールを単離するステップ
３．それらの細胞に１つ以上のプラスミドでＲＳ及びｔＲＮＡを導入し、ＲＳ及びｔＲＮＡを含むクローンを選択するステップ
４．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させ、３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い所望の部位における非天然アミノ酸の組込み効率を示す細胞を単離するステップ。
１．１つ以上のプラスミドで真核細胞における非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンを含む標的遺伝子を導入するステップ
２．標的タンパク質を高レベルで（０．５ｐｇ／細胞／日より高い又は１０ｐｇ／細胞／日より高い）発現した細胞又はクローンのプールを単離するステップ
３．それらの細胞に１つ以上のプラスミドでＲＳ及びｔＲＮＡを導入し、ＲＳ及びｔＲＮＡを含むクローンを選択するステップ
４．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させ、３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い所望の部位における非天然アミノ酸の組込み効率を示す細胞を単離するステップ。
さらなる実施形態は、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現するとともに、誘導性プロモーターの制御下で、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質も発現する安定真核細胞株である。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質とを発現する安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記遺伝子が前記細胞株に安定に組み込まれるように導入するステップ、（ｂ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を前記細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するようにさらに導入するステップ、及び（ｃ）ｔＲＮＡＰｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時に標的タンパク質も前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下において、得られた細胞株を１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で培養するステップを含む。
「抑制性ｔＲＮＡ」手法
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制性プロモーターの制御下で起こる条件が含まれる方法が提供される。
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制性プロモーターの制御下で起こる条件が含まれる方法が提供される。
また、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現するか又はその発現能を有する真核細胞株であって、ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制性プロモーターの制御下で起こる真核細胞株も提供される。
従って、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、以下のステップを含み得る：
１．ＲＳ及びｔＲＮＡを１つ以上のプラスミドで真核細胞に導入するステップであって、真核細胞が、ｔＲＮＡ発現の制御を可能にする抑制性プロモーターエレメントを含むステップ。
２．抑制条件下でＲＳ及びｔＲＮＡ発現カセットを含む細胞を選択するステップ
３．ｔＲＮＡ発現を誘導し、高レベルのＲＳタンパク質及びｔＲＮＡを発現するか又はレポーター遺伝子におけるアンバーコドンの効率的なサプレッションを示す１つ以上の安定クローンを単離するステップであって、それによりプラットフォーム細胞株を作成するステップ。３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い、又は好ましくは９０％より高い非天然アミノ酸組込み率が可能な細胞が選択される。
４．非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンが導入されている標的タンパク質のｃＤＮＡを導入するステップ
５．高レベルの（０．５〜２０ｐｇ／細胞／日より高い）標的遺伝子産物を発現する安定クローンを単離するステップ
６．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させるステップ。
１．ＲＳ及びｔＲＮＡを１つ以上のプラスミドで真核細胞に導入するステップであって、真核細胞が、ｔＲＮＡ発現の制御を可能にする抑制性プロモーターエレメントを含むステップ。
２．抑制条件下でＲＳ及びｔＲＮＡ発現カセットを含む細胞を選択するステップ
３．ｔＲＮＡ発現を誘導し、高レベルのＲＳタンパク質及びｔＲＮＡを発現するか又はレポーター遺伝子におけるアンバーコドンの効率的なサプレッションを示す１つ以上の安定クローンを単離するステップであって、それによりプラットフォーム細胞株を作成するステップ。３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い、又は好ましくは９０％より高い非天然アミノ酸組込み率が可能な細胞が選択される。
４．非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンが導入されている標的タンパク質のｃＤＮＡを導入するステップ
５．高レベルの（０．５〜２０ｐｇ／細胞／日より高い）標的遺伝子産物を発現する安定クローンを単離するステップ
６．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させるステップ。
この実施形態によれば、サプレッサーｔＲＮＡの高度な発現が回避され、アンバーサプレッションに関連する細胞傷害性が防止される。
かかる方法においてｔＲＮＡの発現は好適には、テトラサイクリン応答配列（ＴｅｔＯ又はＴｔＡ）を含むＨ１及びＵ６プロモーターなどの抑制性プロモーターの制御下にある（Ｈｅｒｏｌｄ ２００８）。本発明のさらなる態様は、前述の方法のいずれか一つに従い調製された安定細胞株である。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡＰｙｌの発現能を有する安定真核細胞株であって、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌであって抑制性プロモーターの制御下にあるｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制され、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減されるようにリプレッサーの存在下で得られた細胞株を培養するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌであって抑制性プロモーターの制御下にあるｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制され、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減されるようにリプレッサーの存在下で、得られた細胞株を培養するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に、前記細胞株で前記標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び（ｄ）ｔＲＮＡＰｙｌが発現するように前記リプレッサーの非存在下で標的タンパク質を発現させるステップを含む。
「デコイタンパク質」手法
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質もまた誘導性プロモーターの制御下で前記細胞株により発現する条件が含まれる方法が提供される。
代替的実施形態によれば、ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件に、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質もまた誘導性プロモーターの制御下で前記細胞株により発現する条件が含まれる方法が提供される。
例えば、デコイタンパク質は以下から選択される：緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、アルブミン、ＳＥＡＰ、アクチン、ｂ−２ミクログロブリン、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、ＩｇＧ、又はポリアンバー含有ペプチド。
従って、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む方法は、以下のステップを含み得る：
１．誘導性プロモーターの制御下にあるアンバーコドンを含むデコイタンパク質遺伝子を真核細胞に導入するステップ
２．デコイコンストラクトを含み、誘導することでこのタンパク質を高レベルで（０．１ｐｇ／細胞／日より高い又は１ｐｇ／細胞／日より高い）発現する能力を有する細胞又はクローンのプールを単離するステップ
３．それらの細胞に１つ以上のプラスミドでＲＳ及びｔＲＮＡを導入し、ＲＳ及びｔＲＮＡを含むクローンを選択するステップ
４．組み込まれたデコイコンストラクトを使用して非天然アミノ酸の存在下で３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い比率で所望の部位における非天然アミノ酸の組込み効率が可能なクローンを単離するステップ
５．真核細胞において非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンを含む標的遺伝子を導入するステップ
６．１ｐｇ／細胞／日より高い標的タンパク質の発現レベルが可能なクローンを単離するステップ
７．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させ、３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い所望の部位における非天然アミノ酸組込み効率を示す細胞を単離するステップ。
１．誘導性プロモーターの制御下にあるアンバーコドンを含むデコイタンパク質遺伝子を真核細胞に導入するステップ
２．デコイコンストラクトを含み、誘導することでこのタンパク質を高レベルで（０．１ｐｇ／細胞／日より高い又は１ｐｇ／細胞／日より高い）発現する能力を有する細胞又はクローンのプールを単離するステップ
３．それらの細胞に１つ以上のプラスミドでＲＳ及びｔＲＮＡを導入し、ＲＳ及びｔＲＮＡを含むクローンを選択するステップ
４．組み込まれたデコイコンストラクトを使用して非天然アミノ酸の存在下で３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い比率で所望の部位における非天然アミノ酸の組込み効率が可能なクローンを単離するステップ
５．真核細胞において非天然アミノ酸を組み込もうとする位置にアンバーコドンを含む標的遺伝子を導入するステップ
６．１ｐｇ／細胞／日より高い標的タンパク質の発現レベルが可能なクローンを単離するステップ
７．アンバーコドンにおける組込みを可能にする非天然アミノ酸の存在下で細胞株を成長させ、３０％より高い、例えば４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％より高い又は好ましくは９０％より高い所望の部位における非天然アミノ酸組込み効率を示す細胞を単離するステップ。
本発明のさらなる態様は、ｐｙｌＲＳとｔＲＮＡｐｙｌと誘導性プロモーターの制御下にあるデコイタンパク質とを発現する安定真核細胞株である。
この実施形態によれば、標的タンパク質の発現が開始されると、デコイタンパク質の発現が（例えばプロモーターの誘導物質の除去により）中断され得る。
好適な誘導性プロモーターシステムには、条件的に活性化されるプロモーター及びプロモーターシステム、例えばテトラサイクリン調節プロモーター（ＴｅｔＯ又はｔＴＡ；ＴｅｔＯｎ及びＴｅｔＯＦＦ）、ドキシサイクリン誘導性（ＴＲＥ）プロモーター、ｃＡＭＰ誘導性プロモーター、グルココルチコイド活性化プロモーターシステム、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター（ｌａｃ）、Ｃｄ２＋又はＺｎ２＋誘導性プロモーター（金属タンパク質（ｍｅｔｈａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター）、インターフェロン依存性プロモーター（例えばマウスＭＸプロモーター）、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター（Ｔａｔ）、ＤＭＳＯ誘導性プロモーター（ＧＬＶＰ／ＴＡＸＩ、エクジソン）、及びラパマイシン誘導性プロモーター（ＣＩＤ）が含まれる。
この実施形態によれば、組換え系を使用して標的タンパク質の発現が開始されると、デコイタンパク質の発現が（例えば遺伝子の除去により）中断され得る。
好適な系には、標的組換え系、例えばＣｒｅ／ｌｏｘ、ｐｈｉ３１Ｃベースの組込み系、及びＦｌｐ−ＦＲＴ組換え技術又は挿入されたカセットの相同組換えによるものが含まれる。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質との発現能を有する安定真核細胞株であって、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡｐｙｌ及び前記デコイタンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡＰｙｌ及びデコイタンパク質が安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡｐｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時にデコイタンパク質もまた前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下で、得られた細胞株を培養するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、デコイタンパク質と、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法であり、この方法は、（ａ）１つ以上のステップで、ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡｐｙｌ、及びデコイタンパク質であって誘導性プロモーターの制御下で発現するデコイタンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡＰｙｌ及びデコイタンパク質が安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡｐｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時にデコイタンパク質もまた前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下で、得られた細胞株を培養するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に、前記細胞株で前記標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び（ｄ）デコイタンパク質を発現させることなしに標的タンパク質を発現させるステップを含む。
概要
本発明のさらなる態様は、前述の方法のいずれか一つによって得られる又は得ることのできる安定真核細胞株である。
本発明のさらなる態様は、前述の方法のいずれか一つによって得られる又は得ることのできる安定真核細胞株である。
本発明のさらなる態様は、システムを修飾する前述の方法（即ち、デコイタンパク質、デコイアミノ酸、抑制性プロモーター／誘導性プロモーターの使用、Ｐｙｌ−ｔＲＮＡの導入前のナンセンスコドンを含む標的遺伝子の導入等）の２つ以上の組み合わせに従う方法によって得られる又は得ることのできる安定真核細胞株である。
本発明のさらなる態様は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で前述のとおりの安定真核細胞株を培養するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前述のとおりの安定真核細胞株に、前記細胞株で標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つデコイタンパク質の発現誘導物質の非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前述のとおりの安定真核細胞株に、前記細胞株で標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つデコイアミノ酸の非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前述のとおりの安定真核細胞株に、前記細胞株で標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つｔＲＮＡＰｙｌの発現のリプレッサーの非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前述のとおりの安定真核細胞株に、前記細胞株で標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、化学修飾された標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質を調製するステップを含み、このステップは、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前述のとおりの安定真核細胞株に、前記細胞株で標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップと、１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップと、得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップとを含む。
本発明により使用される細胞株
本発明は安定真核細胞株に関する。好適には細胞株は哺乳類細胞株である。
本発明は安定真核細胞株に関する。好適には細胞株は哺乳類細胞株である。
より好ましくは、細胞株はＣＨＯ細胞株であるが、またＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ６、ＣＯＳ−１、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、又はマウスハイブリドーマ細胞株であってもよい。別の例は、ＣＯＳ−７及びマウス骨髄腫細胞株である。
ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞株が特に好適である。
本発明の特定の要素が無細胞発現系のコンテクストで用いられてもよく、ここでは宿主細胞から得られた合成反応ライセートが、ポリペプチドの合成に必要な少なくとも１つの成分を含む。
合成反応ライセートは細菌細胞又は真核細胞から得られ得る。好ましくは、合成反応ライセートは真核細胞、より好ましくはウサギ網状赤血球又はコムギ胚芽から得られる。
無細胞発現系は野生型ＰｙｌＲＳ及び本発明のｔＲＮＡｐｙｌの発現能を有し、ここでｔＲＮＡｐｙｌは、合成反応ライセートを得るために使用される細胞に本発明のＤＮＡコンストラクトで導入される。
本発明での使用に好適な無細胞発現系は、例えば、国際公開第２０１００８１１０号パンフレット、国際公開第２０１００８１１１１号パンフレット、国際公開第２０１００８３１４８号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
本発明に係る細胞株で発現させるｐｙｌＲＳ
本明細書で使用されるとき、ｐｙｌＲＳは、好適なｔＲＮＡ分子をピロリシン又はその誘導体でアミノアシル化し得るアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に関する。
本明細書で使用されるとき、ｐｙｌＲＳは、好適なｔＲＮＡ分子をピロリシン又はその誘導体でアミノアシル化し得るアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に関する。
本発明のｐｙｌＲＳは、好適には、メタン生成古細菌種に由来する真核細胞（即ちそれはメタン生成古細菌種において野生型であるか又はその突然変異体である）において直交性のピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素である。
好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、以下の一つに由来するピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素である：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号１、配列番号２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６）、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）（配列番号３、配列番号１７）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）（配列番号４、配列番号１８）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）（配列番号５、配列番号１９）、メタノサルシナ・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）（配列番号６、配列番号２０）、メタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）（配列番号７、配列番号２１）、メタノサルスム・ジリネ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ ｚｈｉｌｉｎａｅ）（配列番号８、配列番号２２）、メタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖａｓｔｉｇａｔｕｍ）（配列番号９、配列番号２３）、メタノハロフィルス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｈｉｉ）（配列番号１０、配列番号２４）、デスルホトマキュラム・ギブソニエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｇｉｂｓｏｎｉａｅ）（配列番号１１、配列番号２５）、デスルホスポロシヌス・メリジエイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｍｅｒｉｄｅｉ）（配列番号１２、配列番号２６）及びデスルホトマキュラム・アセトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号１３、配列番号２７）。
最も好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号１）に由来するピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ）である。
本発明のｐｙｌＲＳは野生型合成酵素であってもよい。
或いは、本発明のｐｙｌＲＳは、例えばその触媒活性を高めるため及び／又は基質アミノ酸に対するその選択性を修飾するため１つ以上の位置で変異していてもよい（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８）。
好ましくは、本発明のｐｙｌＲＳは、配列番号１のＴｙｒ ３８４に対応する位置又はその等価な位置で変異していてもよい。最も好ましくは、Ｔｙｒ ３８４はフェニルアラニンに変異している（配列番号２）。
一実施形態では、本発明のｐｙｌＲＳは、その基質特異性を修飾してピロリシン類似体の組込みを可能にする（又は改善する）ため１つ以上の位置で変異していてもよい。
さらなる突然変異ＰｙｌＲＳ酵素が、国際公開第０９０３８１９５号パンフレット及び国際公開第２０１０１１４６１５号パンフレット（各文献が全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
本発明に係る細胞株で発現させるｔＲＮＡｐｙｌ
本発明のＰｙｌＲＳと組み合わせて発現させるｔＲＮＡｐｙｌは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためアンバーナンセンスコドンＵＡＧに相補的なアンチコドン及び三次構造を有する。
本発明のＰｙｌＲＳと組み合わせて発現させるｔＲＮＡｐｙｌは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためアンバーナンセンスコドンＵＡＧに相補的なアンチコドン及び三次構造を有する。
サプレッサーｔＲＮＡとして機能するように、ＵＧＡ、オパール；ＵＡＡ、オーカーコドンなどの他のナンセンスコドンに相補的な人工的ｔＲＮＡを構築することができる。
従って、本発明は、ｎｎＡＡをコードするアンバーコドンの使用を参照し、且つアンバーサプレッションの概念を考察することで実質的に説明及び例示されるが、アンバーコドンは、オパール又はオーカーコドンなどの別のナンセンスコドンに置き換えることができ、同じように機能するものと思われることは理解されるであろう。
しかしながらアンバーコドンの使用が好ましい。
真核細胞株での発現を最適化するためのｔＲＮＡｐｙｌ配列の改変が、国際公開第２００７０９９８５４号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
国際公開第２００７０９９８５４号パンフレットは、特に、古細菌に由来するｔＲＮＡ遺伝子、好ましくはｔＲＮＡｐｙｌと、前記ｔＲＮＡ遺伝子の３’側に置かれた転写ターミネーター配列と、Ｕ１ ｓｎＲＮＡプロモーター又はＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターなどの、前記ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に置かれたＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩによる転写を誘導するプロモーター配列とを含むＤＮＡコンストラクトを提供する。
好ましくは、本発明のｔＲＮＡｐｙｌは、以下の細菌株のうちの一つに由来するｔＲＮＡｐｙｌである：メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）（配列番号２８）、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）（配列番号２６）、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ）（配列番号３０）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）（配列番号２７）、メタノサルシナ・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）（（配列番号２９）、又はメタノサルシナ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）。
より好ましくは、本発明のｔＲＮＡｐｙｌは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）に由来するｔＲＮＡｐｙｌ（配列番号２８）である。
本発明の一実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌは、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞で発現する。
好ましい実施形態では、真核細胞での発現用プロモーターエレメントが天然で欠損しているｔＲＮＡｐｙｌが、外部真核生物プロモーター下で発現する。
特に好ましい実施形態では、外部プロモーターはＵ６プロモーターである。
特に好ましい実施形態では、外部プロモーターはＨ１プロモーターである。
さらなる実施形態において、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を有するプラスミドは、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の３’側の転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）配列と、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の５’側に置かれたＵ６プロモーター配列と、プロモーター領域の５’側に置かれたＣＭＶエンハンサー領域とを含む。
特に好ましい実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子を有するプラスミドのインサートは配列番号３５を有する。
本発明の一実施形態では、外部プロモーターは抑制性プロモーターである。
好ましい実施形態では、抑制性プロモーターは、このプロモーターの抑制を可能にするエレメント、例えばＴｅｔＯを含むＨ１（Ｈ１／ＴｅｔＯ；配列番号３１）、又は発現の抑制を可能にするエレメントを含むヒトＵ６ ｓｎＲＮＡのプロモーター（例えばＵ６／ＴｅｔＯ）から選択される。
標的遺伝子の終わりを示す終止コドンがアンバーコドンであり、アンバーコドンを使用してｎｎＡＡをコードすることが意図される場合、終止コドンを別の終止コドン（例えばオーカー又はオパール）に変更し得ることは理解されるであろう。別のナンセンス（ｎｏｎｓｅｎｃｅ）コドンを使用してｎｎＡＡをコードすることが意図される場合も、適宜変更して同じことが当てはまる。
ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子による真核細胞株の形質転換用ベクター
本発明は、真核細胞でｔＲＮＡｐｙｌを効率的に発現させるためのプラスミドを提供する。好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ発現プラスミドは、Ｕ６プロモーター下にある配列番号２８）のｔＲＮＡ遺伝子の複数のリピートを含む。より好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ発現プラスミドは、Ｕ６プロモーター下にある配列番号２８）のｔＲＮＡ遺伝子のタンデムリピートを含む。
本発明は、真核細胞でｔＲＮＡｐｙｌを効率的に発現させるためのプラスミドを提供する。好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ発現プラスミドは、Ｕ６プロモーター下にある配列番号２８）のｔＲＮＡ遺伝子の複数のリピートを含む。より好ましくは、ｔＲＮＡｐｙｌ発現プラスミドは、Ｕ６プロモーター下にある配列番号２８）のｔＲＮＡ遺伝子のタンデムリピートを含む。
本発明によれば、Ｐｙｌ ｔＲＮＡ遺伝子及びＰｙｌＲＳ ｃＤＮＡは、同じ又は異なるプラスミドに担持される。
一実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子及びＰｙｌＲＳ ｃＤＮＡは同じプラスミド上に存在する。
一実施形態では、ｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子及びＰｙｌＲＳ ｃＤＮＡは異なるプラスミド上に存在する。
標的タンパク質のコード遺伝子による真核細胞株の形質転換用ベクター
本発明は、場合によりプロモーター配列に作動可能に連結された、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明は、場合によりプロモーター配列に作動可能に連結された、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明で利用されるベクターには、以下が含まれる：ｐＪＴＩ−Ｆａｓｔ−ＤＥＳＴ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＳｅｌｅｃｔ−Ｂｌａｓｔｉ及びｐＳｅｌｅｃｔ−Ｚｅｏベクター（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。ｐＥＮＴＲ Ｐ５−Ｐ２ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。
好適なプロモーターの例としては、限定はされないが、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ラージＴプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＭＣＫプロモーター、及びＬＴＲプロモーターが挙げられる。
安定細胞株の構築及び安定クローンの選択
本発明者らは、部位特異的ｎｎＡＡ組込みに必須のエレメントを安定に発現する細胞株の構築には、システムの種々のエレメント（ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ、及び標的）の発現用プラスミドの逐次的な導入と、それぞれに続く高活性の安定クローンを同定するための選択ステップ及び分取ステップ（クローニングステップ）が必要であることを見出した。
本発明者らは、部位特異的ｎｎＡＡ組込みに必須のエレメントを安定に発現する細胞株の構築には、システムの種々のエレメント（ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ、及び標的）の発現用プラスミドの逐次的な導入と、それぞれに続く高活性の安定クローンを同定するための選択ステップ及び分取ステップ（クローニングステップ）が必要であることを見出した。
本発明の一実施形態では、効率的なｎｎＡＡ導入のためのエレメント全てを発現し、標的遺伝子の導入及び続く所望の位置で修飾された標的タンパク質の単離の出発点として働く安定細胞が得られた。
好適には、この手法には反復的な選択プロセスが関わり、ここでは初めにｔＲＮＡ用の発現カセットが宿主細胞に導入され、ベクターによって付与された抗生物質耐性に基づきコンストラクトを含む細胞のプールが選択される。次に、一過性のトランスフェクションによってそのオープンリーディングフレームを中断するアンバー終止コドンを含むオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレポーターコンストラクトの導入により、生存細胞が選択される。この選択プロセスは、アンバーサプレッション時に完全長ＧＦＰを生成するクローンを同定することにある（ＧＦＰの蛍光はフローサイトメトリーにより定量化される）。従ってこの集団からの高機能細胞は、蛍光活性化細胞分取を用いて単離される。増殖され、続いてｔＲＮＡのさらなるコピーをトランスフェクトされた後、上記に記載する選択方法が反復される最良のクローン。このプロセスは、最適レベルの各成分の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ）及び試験アンバーサプレッション（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎ）が得られるまで、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡの複数のコピーの発現用カセットを含む組込み発現コンストラクトの導入が続く。
アンバーコドンによりコードされる非天然アミノ酸の組込み
本発明の細胞株を使用して調製されたタンパク質では、１つ以上のｎｎＡＡが組み込まれ得る。好適には１つのｎｎＡＡがタンパク質鎖に組み込まれる。タンパク質が抗体である場合、１つのｎｎＡＡが軽鎖又は重鎖又は両方に組み込まれ得る。
本発明の細胞株を使用して調製されたタンパク質では、１つ以上のｎｎＡＡが組み込まれ得る。好適には１つのｎｎＡＡがタンパク質鎖に組み込まれる。タンパク質が抗体である場合、１つのｎｎＡＡが軽鎖又は重鎖又は両方に組み込まれ得る。
他の実施形態では、２つ以上、例えば最大４つ、例えば２つの（又は場合により３つの）ｎｎＡＡがタンパク質鎖に組み込まれ得る。好適には組み込まれたｎｎＡＡは全て同じである。
標的タンパク質に組み込まれるアンバーコドンによりコードされ得る非天然アミノ酸
部分とペプチドのコンジュゲーションを可能にするための非天然アミノ酸の使用が、国際公開第２００７／１３０４５３号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に開示されている。
部分とペプチドのコンジュゲーションを可能にするための非天然アミノ酸の使用が、国際公開第２００７／１３０４５３号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に開示されている。
本明細書で使用されるとき「非天然アミノ酸」は、セレノシステイン及び以下の２０種の遺伝的にコードされるα−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、又はアミノ酸類似体を指す。α−アミノ酸の一般構造を式Ｉに示す：
非天然アミノ酸は、典型的には、式中Ｒ基が２０種の天然アミノ酸で用いられるもの以外の任意の置換基である式Ｉを有する任意の構造である。例えば、２０種の天然アミノ酸の構造に関しては、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，３ｒｄ ｅｄ．１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋなどの任意の生化学テキストを参照のこと。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、上記の２０種のα−アミノ酸以外の天然に存在する化合物であり得ることに留意されたい。本明細書に開示される非天然アミノ酸は、典型的には側鎖のみが天然アミノ酸と異なるため、この非天然アミノ酸は他の例えば天然又は非天然のアミノ酸とのアミド結合を、天然に存在するタンパク質で形成されるのと同じように形成する。しかしながら非天然アミノ酸は、それを天然アミノ酸と区別する側鎖基を有する。例えば、式ＩのＲは、場合により、アルキル−、アリール−、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハロゲン化物、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロアルキン、例えば制約された環、例えばシクロオクチン、シクロアルケン、例えばノルボルネン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、テトラジン、ピロン、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、α−ケトカルボン酸、α又はβ不飽和酸及びアミド、グリオキシルアミド、又はオルガノシラン基など又はそれらの任意の組み合わせを含む。
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加えて、非天然アミノ酸はまた、場合により、例えば式ＩＩ及びＩＩＩの構造により示されるとおりの修飾骨格構造も含む：
［式中、Ｚは典型的には、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、ＮＨ2Ｏ−、ＮＨ−Ｒ’、Ｒ’ＮＨ−、Ｒ’Ｓ−、又はＳ−Ｒ’−を含み；同じであっても又は異なってもよいＸ及びＹは、典型的には、Ｓ、Ｎ、又はＯ、並びにＲ及びＲ’を含み、Ｒ及びＲ’は場合により同じであっても又は異なってもよく、典型的には、式Ｉを有する非天然アミノ酸に関して上記に記載されるＲ基と同じ構成要素のリスト並びに水素又は（ＣＨ2）x又は天然アミノ酸側鎖から選択される］。例えば、本明細書に開示される非天然アミノ酸は、場合により、式ＩＩ及びＩＩＩにより示されるとおりアミノ基又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては、限定はされないが、側鎖が例えば２０種の天然アミノ酸又は非天然側鎖に対応するα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレート、又はα−α−二置換アミノ酸が挙げられる。また、限定はされないが、β−アミノ酸又はγ−アミノ酸、例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸も挙げられる。加えて、α−炭素における置換又は修飾には、場合によりＬ又はＤ異性体、例えば、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などが含まれる。他の構造的代替例としては、環状アミノ酸、例えば、プロリン類似体並びに３、４、６、７、８、及び９員環プロリン類似体が挙げられる。一部の非天然アミノ酸、例えばハロゲン化アリール（ｐ−ブロモ−フェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニンは、ハロゲン化アリールと幅広い種類のカップリングパートナーとの間における炭素−炭素結合、炭素−窒素結合及び炭素−酸素結合の形成を可能にするエチン又はアセチレン反応を伴う汎用パラジウム触媒クロスカップリング反応をもたらす。
例えば、多くの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸、例えば、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどをベースとする。様々な例示的非限定的非天然アミノ酸の構造が、米国特許出願公開第２００３／０１０８８８５ Ａ１号明細書に提供され、図、例えば、図２９、図３０、及び図３１を参照のこと（この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される）。
アミノ酸類似体の他の例としては、（限定はされないが）以下の官能基のうちの一つを含むリシン又はピロリシンアミノ酸の非天然類似体が挙げられる；アルキル、アリール、アシル、アジド、ニトリル、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、シクロアルケン、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、シクロアルキン、シクロアルキン、例えば制約された環、例えばシクロオクチン、シクロアルケン、例えばノルボルネン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アジリジン、ニトロ、ヒドロキシル、エーテル、エポキシド、ビニルエーテル、シリルエノールエーテル、チオール、チオエーテル、スルホンアミド、スルホニル、スルホン、セレノ、エステル、チオ酸、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、テトラジン、ピロン、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、チオエステル、エステル、チオ酸、オルガノシラン基、アミノ、光活性化が可能な架橋剤；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；別の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージドアミノ酸；光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸；グリコシル化された又は炭水化物修飾されたアミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールを含むアミノ酸；ポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能又は光切断可能なアミノ酸；伸長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸。
本発明の方法における使用に好適な非天然アミノ酸にはまた、蛍光アミノ酸を有するもの、例えばナフチル又はダンシル又は７−アミノクマリン又は７−ヒドロキシクマリン側鎖を含むもの、光切断可能又は光異性化可能なアミノ酸、例えばアゾベンゼン又はニトロベンジルＣｙｓ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ側鎖を含むもの、ｐ−カルボキシ−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、ホモグルタミン、２−アミノオクタン酸、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、２，４−ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）なども含まれる。本発明は、上記の保護されていない形態及びアセチル化された形態を含む（例えば、「Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題される国際公開第０３／０３１４６４ Ａ２号パンフレット；及び、「Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」と題される米国特許第６，３３１，４１８号明細書；Ｔａｎｇ ａｎｄ Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３：１１０８９−１１０９０；及びＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００１）４０：８（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）も参照のこと）。
ある実施形態では、アミド部分（ｍｏｅｉｔｙ）に結合したＸ基は、アルキルアジド、アルコキシアジド、アルコキシエポキシド、アルキルアルキン、アルコキシアルキン、アルコキシアルケン、アルキルアルケン、アルキル鎖、アルキルシクロヘキセン、アルキルシクロアルキン、アルコキシルシクロアルケン、アルコキシルシクロアルキン、アミドシクロアルキン、アミドシクロアルケン、トランスシクロアルケン、シクロプロペン、テトラジン、ピロン、ノルボルネン、アリールアジド、アジド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アリール、テトラジン、ピロン、イミン、ボロン酸エステル又はボロン酸、シアノ基、カルボニル基、例えばアルデヒド又はケトンであり得る。好ましい実施形態では、上記の一般構造の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）は、アミノ酸末端から１〜１２個のメチレン基の反対側の末端におけるアミド基までのアルキル鎖を有し得る。
好ましくは、上記の一般構造の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）は、連結構造の一部としてシクロアルカン及び芳香環を含み得る。
ある実施形態では、上記の一般構造の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）は、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙＲＳ）及びｔＲＮＡｐｙｌと相互作用する。前記アミノ酸には、以下が含まれる：（Ｓ）−２−アミノ−６−（（２−アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓ−アジド）、（Ｓ）−２−アミノ−６−（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓ−アルキン）、Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸、Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−プロパンアミド）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−エチニルシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［２−（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルオキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルメトキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（｛４−［（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）アミノ］フェニル｝メトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（４Ｅ）−シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロピル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドアセトアミド）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（３−アジドプロパンアミド）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（５−アジドペンタンアミド）ヘキサン酸。
ｎｎＡＡはｐｙｌＲＳの基質であり得る。
好適には、本発明のｎｎＡＡはリシンに由来する。
参照により本明細書に援用される国際公開第２０１０１３９９４８号パンフレットは、本発明の対象となるｎｎＡＡをいくつか記載しており、詳細には以下のリシン誘導体を記載している：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓアルキン）：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓアジド）：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓアルキン）：
他の好適なｎｎＡＡは、以下である：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−プロパンアミド）ヘキサン酸：
（Ｓ）−２−アミノ−６−（アセトアミド）ヘキサン酸：
（Ｓ）−２−アミノ−６−（アリルオキシカルボニルアミノ（ａｌｌｙｌｏｘｙｌｃａｒｂｏｎｙｌアミノ））ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−エチニルシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［２−（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルオキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルメトキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（｛４−［（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）アミノ］フェニル｝メトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（４Ｅ）−シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロピル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（３−アジドプロパンアミド）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（５−アジドペンタンアミド）ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（ペンタ−４−エナミド）ヘキサン酸：
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸：
さらなるｎｎＡＡには、以下が含まれる：（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロピル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロピル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸。
好適には、本発明のｎｎＡＡは（２Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸から誘導される。
例えば：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロピル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（ブタ−３−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸：
本発明における使用に好適なさらなる非天然アミノ酸類似体は、式Ｖの構造を有するピロリシン類似体である
［式中
Ｚ＝結合、ＣＨ2、ＣＨ−ＮＨ2、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ2；
ｂは０又は整数１〜７であり；及び
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン］。
Ｚ＝結合、ＣＨ2、ＣＨ−ＮＨ2、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ2；
ｂは０又は整数１〜７であり；及び
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン］。
式ＶにおいてＦＧがアリールを表す場合、例は、芳香族ハロゲン化物、例えば４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。
部分Ｚ（ＣＨ2）bＦＧは、例えば、ＣＯ−アリール、例えばＣＯ−フェニル又は−ＣＯアルキル、例えば−ＣＯＭｅを表し得る。
式Ｖの例示的化合物は、以下である：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（３−アジドプロパンアミド）ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（ペンタ−４−エナミド）ヘキサン酸
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−プロパンアミド）ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドアセトアミド）ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
本発明の非天然アミノ酸として使用するのに好適な代替的ピロリシン類似体は、式ＶＩの構造を有する：
［式中
Ｚ＝ＣＨ2、ＣＨ−ＮＨ2、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；及び
ｂ＝整数１〜４］。
Ｚ＝ＣＨ2、ＣＨ−ＮＨ2、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；及び
ｂ＝整数１〜４］。
式ＶＩにおいてＦＧがアリールを表す場合、例は、芳香族ハロゲン化物、例えば４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。
式ＶＩの例示的化合物は、以下である：
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがアルケンを表す場合、それは好適には−ＣＨ＝ＣＨ2又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ2を表す。
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがアルキンを表す場合、それは好適には−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ3、好ましくは−Ｃ≡ＣＨを表す。
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがケトンを表す場合、それは好適には−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＣＨ3、好ましくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3を表す。
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがエステルを表す場合、それは好適には−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏアルキル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏメチルを表す。
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧが芳香族ハロゲン化物を表す場合、それは好適には、ハロゲン、特にヨウ素によって置換されたフェニル（例えば４−ヨードフェニル）を表す。
式Ｖ及び式ＶＩの構造において、ＦＧがシクロアルキンを表す場合、それは好適にはシクロオクチン、例えばシクロオクタ−４，５−インを表す。
有利には、本発明の式Ｖ及び式ＶＩのｎｎＡＡは、ＧＦＰアッセイにより実証されるとおり良好な組込みを有することが示されている。式ＶＩ．１は組込みアッセイとしてのＧＦＰアッセイで式Ｖ．１と同程度の翻訳能力を有した。式Ｖ及び式ＶＩは両方とも、部位選択的翻訳後修飾に用い得る様々な有用な官能基を組み込むように簡単に修飾される。アルキン及びアルケンが容易に組み込まれる。本明細書に開示されるピロリシン類似体は、様々な方法を用いて作製することができる。反応条件は概して当業者により決定され得る。
式Ｖ類似体は、α−アミノ基がＢｏｃ基、Ｃｂｚ基、ＴＦＡ基、アセチル基又はＦｍｏｃ基などの保護基（「ＰＧ」）で保護されているタイプ１の単一保護ジアミノ基質に、クロロホルメート、活性カルボン酸エステル、イソシアネート、活性炭酸塩又はハロゲン化スルホニルなどの活性カルボニル基を付加することにより容易に調製される（スキーム１を参照）。カップリング生成物３は、所望の官能性を設けるためのアジド求核剤によるハロゲン化物の置換など、さらなる修飾を受け得る。他の場合、中間体３を脱保護してα−アミノ酸マスキング基を取り除くことにより、所望の式Ｖ類似体が得られる。
ヒドロキシルアミノ酸９を、活性カルボニル、例えば、カルボン酸エステル、イソシアネート、酸塩化物、活性炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを含む基質にコンジュゲートすることにより、式ＶＩ類似体を調製した。カップリング生成物１１は、ハロゲン化物又は活性アルコールなどの脱離基の置換によるアジド官能基の導入など、さらなる修飾を受けることができる。最終的な脱保護によってα−アミノ酸マスキング基を取り除くことにより、所望のアミノ酸類似体１２が得られる。保護基はスキーム１のとおり用いられ得る。スキーム２を参照のこと：
上記に提供する非天然アミノ酸の多くは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から市販されている。市販されていないものは、場合により、米国特許出願公開第２００４／１３８１０６ Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）の例に提供されるとおり又は当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術に関しては、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及び国際公開第０２／０８５９２３号パンフレット（これらは全て、本明細書によって参照により援用される）を参照のこと。
本発明の他のｎｎＡＡが、発表されている方法により合成され得る。例えば、（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸及びＳ）−２−アミノ−６（（２アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸の合成が、国際公開第２０１０１３９９４８号パンフレット及びＮｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．２００９に発表されている。
Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸、Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−プロパンアミド）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−エチニルシクロペンチル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［２−（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルオキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（｛ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−イルメトキシ｝カルボニル）アミノ］ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（｛４−［（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）アミノ］フェニル｝メトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（４Ｅ）−シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（シクロプロパ−２−エン−１−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸が、Ｈａｏ，Ｚ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４７，４５０２，２０１１、Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４，２３９−２４４，２００７、Ｓｃｈｕｌｔｚ ＰＧ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１５，１５２１−１５２４，２００５、Ｄｉｅｔｅｒｓ Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５，１１７８２−１１７８３，２００５、Ｗａｎｇ，ＹＳ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，２９５０−２９５３，２０１２、Ｆｅｋｎｅｒ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４５，１６３３−１６３５，２００９．、Ｐｌａｓｓ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，５１，４１６６−４１７０，２０１２、Ｌａｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，１０３１７，２０１２及び、Ｄｅｖａｒａｊ ＮＫ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，４８，７０１３−７０１６，２００９に開示されている。
組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質の使用
本発明に係る方法を使用して組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質は、機能化タンパク質コンジュゲートの調製に用いられ得る。組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質とコンジュゲートされ得る分子には、（ｉ）他のタンパク質、例えば抗体、特にモノクローナル抗体、及び（ｉｉ）ポリマー、特にＰＥＧ基又はその系の半減期を延長させ得る他の基が含まれる。さらに、このような修飾タンパク質を、薬物又はそうした強力な化合物の標的化デリバリー用のヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。従って組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質にコンジュゲートされ得るさらなる分子には、（ｉｉｉ）細胞傷害剤、及び（ｉｖ）薬物部分が含まれる。
本発明に係る方法を使用して組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質は、機能化タンパク質コンジュゲートの調製に用いられ得る。組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質とコンジュゲートされ得る分子には、（ｉ）他のタンパク質、例えば抗体、特にモノクローナル抗体、及び（ｉｉ）ポリマー、特にＰＥＧ基又はその系の半減期を延長させ得る他の基が含まれる。さらに、このような修飾タンパク質を、薬物又はそうした強力な化合物の標的化デリバリー用のヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。従って組み込まれた非天然アミノ酸を有するタンパク質にコンジュゲートされ得るさらなる分子には、（ｉｉｉ）細胞傷害剤、及び（ｉｖ）薬物部分が含まれる。
特定の実施形態のさらなる詳細を、以下の抗体薬物コンジュゲートに関する考察に提供する。
非天然アミノ酸は好都合には、他のアミノ酸との副反応を起こすリスクのない標的化された形でのコンジュゲーションを可能にするユニークな化学基を含み得る。例えば非天然アミノ酸は好都合にはアジド基又はアルキン基を含み、コンジュゲートしようとする対応するアルキン基又はアジド基を含む分子とのヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応を使用した反応を可能にする。
部位特異的コンジュゲーション
本発明のさらなる態様は、化学修飾された標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、本発明の態様に係る方法により標的タンパク質を調製するステップ、及び得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、化学修飾された標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、本発明の態様に係る方法により標的タンパク質を調製するステップ、及び得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む。
本発明の好ましいコンジュゲーションケミストリーは、天然２０アミノ酸と直交性の反応を含む。かかる反応は天然２０アミノ酸と相互作用せず、又はそれとの副反応を生じることなく、その反応に関連する官能基に特異的である。好適には、必要な官能基はｎｎＡＡによって標的タンパク質に組み込まれる。
さらに、前記反応は、タンパク質にとって破壊的でない条件下、例えば水性溶媒下、タンパク質が許容でき且つその溶解度を維持するｐＨ範囲において、タンパク質に有害な影響をもたらさない温度で進行する。
タンパク質とリンカーとの間の結合部分の安定性を増加させることが有利であり得る。従来の方法は、マレイミドとの反応によりシステインのチオール基にコンジュゲートしてチオールエーテルを形成する。チオールエーテルは逆反応を起こして抗体からリンカー薬物誘導体を放出させ得る。本発明のある実施形態では、アジドとアルキンとの間で用いられるコンジュゲーションケミストリーにより、大幅に安定性が増した、それほど可逆性を起こし易くない芳香族トリアゾールがもたらされる。
加えて、反応の生成物、タンパク質とペイロードとの間の結合は、安定していて、従来の結合（アミド、チオールエーテル）に伴う安定性と等しいか或いはそれより高くなるはずである。コンジュゲーションの妨げではないものの、往々にして、コンジュゲーション反応を天然の条件下で行うことができる場合、それにより余分なリフォールディング処理のステップがなくなるため有利である。
本発明のコンジュゲートの作製に好ましい化学的コンジュゲーションには、以下が含まれる：３＋２アルキン−アジド環化付加；３＋２双極性環化付加；ヘック反応を含むパラジウムベースのカップリング；薗頭反応；鈴木反応；スティルカップリング；檜山／デンマーク反応；オレフィンメタセシス；ディールズ・アルダー反応；ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン又はヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合；歪みによって促進されるアジドアルキン環化付加を含む歪みによって促進される環化付加；金属によって促進されるアジドアルキン環化付加；電子によって促進される環化付加；フラグメントエクストルージョン（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）環化付加；アルケン環化付加（ｃｙｃｌｏａｄｄｔｉｏｎ）と、続くβ脱離反応。
好ましい一実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸はアジド基又はアルキン基を含み、化学修飾方法は、前記アジド基又はアルキン基を、アルキン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。想定される反応は、トリアゾール結合の生成をもたらすヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応である。アルキン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアジド基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は毒素又は細胞傷害薬物又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。
前記反応で有用なアルキン基は、例えば、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン部分（ＢＣＮ）などのシクロオクチンである。
ある変形例の反応では、組み込まれたアミノ酸がアジド基又はアルケン基を含み、化学修飾方法が、前記アジド基又はアルケン基を、アルケン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。アルケン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアルケン基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は毒素又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。
ある実施形態では、本発明のコンジュゲーションケミストリーは抗体薬物コンジュゲートの調製に用いられる。
生成物の化学修飾
本明細書の他の部分で指摘しているとおり、本発明に係る細胞株は、組み込まれた非天然アミノ酸を含むタンパク質の作製に有用である。前記非天然アミノ酸は別の化学反応で有用に用いられ得る。
本明細書の他の部分で指摘しているとおり、本発明に係る細胞株は、組み込まれた非天然アミノ酸を含むタンパク質の作製に有用である。前記非天然アミノ酸は別の化学反応で有用に用いられ得る。
本発明のさらなる態様は、化学修飾された標的タンパク質の調製方法であり、この方法は、本発明の態様に係る方法により標的タンパク質を調製するステップ、及び得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップを含む。
本発明の好ましいコンジュゲーションケミストリーは、天然２０アミノ酸と直交性の反応を含む。かかる反応は天然２０アミノ酸と相互作用せず、又はそれとの副反応を生じることなく、その反応に関連する官能基に特異的である。
さらに、前記反応は、タンパク質にとって破壊的でない条件下、例えば水性溶媒下、タンパク質が許容でき且つその溶解度を維持するｐＨ範囲において、タンパク質に有害な影響をもたらさない温度で進行する。
一実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸はアジド基又はアルキン基を含み、化学修飾方法は、前記アジド基又はアルキン基を、アルキン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。想定される反応は、トリアゾール結合の生成をもたらすヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応である。アルキン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアジド基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は薬物部分（例えば毒素又は細胞傷害性薬物）又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。
場合により、ヒュスゲン１，３−双極性環化付加反応はＣｕ（Ｉ）触媒作用の存在下で実施することができる。
好ましくは、銅触媒環化付加反応は、水溶液中システイン及びトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）の存在下、室温で行われる。或いは、銅触媒環化付加反応は、水溶液中アスコルビン酸ナトリウム及びトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）の存在下、４℃〜５０℃で行われる。反応はまた、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、トリフルオロエタノール、プロピレングリコール、エチレングリコール及びヘキシレングリコールからなる有機成分を含む水／有機混合溶液中で行われてもよい。
ある変形例の反応では、組み込まれたアミノ酸がアジド基又はアルケン基を含み、化学修飾方法が、前記アジド基又はアルケン基を、アルケン基又はアジド基を含む試薬と反応させることを含む。アルケン基又はアジド基を含む試薬は、アルキン基又はアルケン基を場合によりリンカーを介して有するタンパク質（例えば抗体）又は毒素又は半減期を延長させるのに好適な物質（例えばＰＥＧ基）であり得る。
２つ以上のｎｎＡＡが標的タンパク質（例えば抗体）に組み込まれるとき、化学修飾は同じであっても又は異なってもよい。例えば２つのｎｎＡＡが組み込まれる場合に、一方が薬物部分にコンジュゲートされるように修飾されてもよく、且つ一方がＰＥＧ部分にコンジュゲートされるように修飾されてもよい。
標的タンパク質
標的タンパク質には、抗体、特にモノクローナル抗体が含まれる。
標的タンパク質には、抗体、特にモノクローナル抗体が含まれる。
本発明の抗体には、ＴＲＯＰ−２、ＳＳＴＲ３、Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＦ、ＲａＳＬ、Ｃ３５Ｄ３、ＥｐＣａｍ、ＴＭＣＣ１、ＶＥＧＦ／Ｒ、コネキシン−３０、ＣＡ１２５（Ｍｕｃ１６）、セマフォリン−５Ｂ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＨＢ２、ＳＬＣ４５Ａ３（ＰＣＡＮＡＰ）、ＡＢＣＣ４（ＭＯＡＴ−１）、ＴＳＰＡＮ１、ＰＳＧＲＤ−ＧＰＣＲ、ＧＤ２、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、ＴＭＥＦＦ２、ＣＤ７４、ＣＤ１７４（ｌｅＹ）、Ｍｕｃ−１、ＣＤ３４０（Ｈｅｒ２）、Ｍｕｃ１６、ＧＰＮＭＢ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、メソテリン、ＴＡＧ−７２、ＣＡ９（ＩＸ）、ａ−ｖ−インテグリン、ＦＡＰ、Ｔｉｍ−１、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、α葉酸受容体、ＣＤ４４ｖ６、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ２０、ＣＡ５５．１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＲＯＮ、ＣＤ４０、ＨＭ１．２４、ＣＳ−１、β２ミクログロブリン、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ルイスＹ、ＧＲＮＭＰ、トモレギュリン、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＣＡＩＸ、ＦａｓＬ受容体、ＭＭＰマトリックスメタロプロテアーゼに特異的な完全長抗体並びにＦａｂ、Ｆａｂ２、及び一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含めた抗体断片が含まれる。
本発明の好ましい実施形態では、腫瘍標的に特異的な本発明の抗体が、以下から選択されるタンパク質部分にコンジュゲートされる：免疫賦活性及びアポトーシス促進性タンパク質、特に免疫賦活剤、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、他のＩＬ−１ファミリーメンバー、インターロイキンのいずれか、例えば限定はされないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７ファミリー、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２８、又は共刺激リガンド、例えば、Ｂ７．１及びＢ７．２、ＴＡＣＩ。インターフェロン、例えばＩ型ＩＦＮファミリー（ＩＦＮα及びβ及びλ）のいずれか又はＩＩ型ＩＦＮγなど。造血成長因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ。ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、ＣＸＣＬ−５、ＣＸＣＬ−６、ＣＸＣＬ−８、ＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０、及びＣＸＣＬ−１１、ＣＸＣＬ−１３、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−２１、ＩＰ−１０、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＦ４、ＧＲＯ関連ペプチド、ＩＬ−８。アポトーシス促進リガンド、例えばＴＮＦスーパーファミリー、例えばＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＰＤ−Ｌ１。抗菌ペプチド、例えばα及びβデフェンシン及びカテリシジンＬＬ３７／ｈＣＡＰ１８、ヒスタチン、カテプシンＧ、アズロシジン、キマーゼ、好酸球由来神経毒、高移動度グループ１核タンパク質、ＨＭＧＢ１、ラクトフェリン。ＲＯＳ及びＲＮＳ産生酵素、例えばＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）のメンバー、一酸化窒素シンターゼＮＯＳ、ＩＮＯＳ）、好中性顆粒タンパク質、例えばエラスターゼ及びカテプシンなどのプロテアーゼ、アズロシジン（ＣＡＰ３７又はＨＢＰとしても知られる）、ミエロペルオキシダーゼ、パーフォリン、グランザイム。
一実施形態では、標的タンパク質は抗Ｈｅｒ−２抗体である。
一実施形態では、標的タンパク質は抗ＩＬ−６抗体である。
一実施形態では、標的タンパク質は抗ＰＳＭＡ抗体である。
好ましい実施形態では、抗ＰＳＭＡ抗体はｓｃｆｖである。
一実施形態では、標的タンパク質は、例えば配列番号６２の配列又はそれと９５％の同一性（例えばそれと９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有する配列を有するＦＧＦ２１である。配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）は、全タンパク質を比較ウィンドウとして考えて計算される。ＢＬＡＳＴなどの従来の配列比較プログラムが用いられ得る。
好ましい実施形態では、ＦＧＦ２１は、非天然アミノ酸ｌｙｓ−アジド又はプロパルギルリシンをＲ１３１位に含むように修飾され（配列番号６４を参照）、且つトリアゾールリンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。
デコイアミノ酸
本発明に係る方法において有用なデコイアミノ酸は、伸長タンパク質に組み込まれないアミノ酸誘導体である。或いは、デコイアミノ酸は、伸長タンパク質に組み込まれるがタンパク質の伸長を阻害するアミノ酸誘導体である。
本発明に係る方法において有用なデコイアミノ酸は、伸長タンパク質に組み込まれないアミノ酸誘導体である。或いは、デコイアミノ酸は、伸長タンパク質に組み込まれるがタンパク質の伸長を阻害するアミノ酸誘導体である。
本発明のデコイアミノ酸は、一般式ＶＩＩを有する：
［式中
Ｇ＝Ｈ、ＯＨ、−ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3又はＮＨ−Ｋ−Ｑ；
Ｘ＝結合、ＣＨ2、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−又はＣＨ−Ｊ；
Ｊ＝アルキル、アリール、ヘテロアリール又は２０種の天然アミノ酸のうちの一つの側鎖；
Ｙ＝結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2；
Ｚ＝Ｏ、ＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＣＨ−ＮＨ2;
Ｋ＝ＣＯ又はＳＯ2；
ａ＝０、１、２又は３；
ｂ＝０、１、２又は３；
Ｑ＝−Ｈ、Ｃ1〜6アルキル、アリール、ヘテロアリール−ＯＣ1〜6アルキル、−ＯＣＨ2アリール、−ＯＣＨ2ヘテロアリール、−Ｃ2〜6アルケニル又は−ＯＣ2〜6アルケニル；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ１〜６アジドアルキル］。
Ｇ＝Ｈ、ＯＨ、−ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3又はＮＨ−Ｋ−Ｑ；
Ｘ＝結合、ＣＨ2、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−又はＣＨ−Ｊ；
Ｊ＝アルキル、アリール、ヘテロアリール又は２０種の天然アミノ酸のうちの一つの側鎖；
Ｙ＝結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2；
Ｚ＝Ｏ、ＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＣＨ−ＮＨ2;
Ｋ＝ＣＯ又はＳＯ2；
ａ＝０、１、２又は３；
ｂ＝０、１、２又は３；
Ｑ＝−Ｈ、Ｃ1〜6アルキル、アリール、ヘテロアリール−ＯＣ1〜6アルキル、−ＯＣＨ2アリール、−ＯＣＨ2ヘテロアリール、−Ｃ2〜6アルケニル又は−ＯＣ2〜6アルケニル；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ１〜６アジドアルキル］。
Ｑの定義の範囲内で例示的なアリール基は、フェニルである。
例示的なＲ基としては、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ3、−ＣＨ2Ｐｈ、−Ｃ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−及び−ＣＨ2−Ｃ≡Ｃ−Ｈが挙げられる。
Ｑの定義の範囲内で例示的なアリール基は、フェニルである。
Ｑの例示的な基としては、Ｈ、−ＣＨ3、−Ｅｔ、Ｐｈ、−ＯｔＢｕ、−ＯＦｍｏｃ、−ＯＢｎ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ及び−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ2が挙げられる。
一実施形態では、ＫはＣＯである。別の実施形態においてＫはＳＯ2である。
好適にはＹがＮＨ、Ｏ又はＳを表し、且つＺがＯ、ＮＨ、ＣＨ2、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ2を表すか、又はＹが結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ2を表し、且つＺがＯ、ＮＨ又はＳを表す。
好適にはＹがＮＨ、Ｏ又はＳを表す。好適にはＺがＮＨ、Ｏ又はＳを表す。好適にはＹがＮＨ、Ｏ又はＳを表し、ＺがＮＨ、Ｏ又はＳを表す。
一実施形態では、ＹがＮＨであり、且つＺがＯである。別の実施形態では、ＹがＯであり、且つＺがＮＨである。
Ｊが２０種の天然アミノ酸のうちの一つの側鎖を表す場合、例としては、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、チロシン及びトリプトファンの側鎖が挙げられる。
ある実施形態では、本発明のデコイアミノ酸は、化学修飾されたアミン基、例えばＮ−アシル化されたＶＩＩＡのアミノ酸式を含むｐｙｌＲＳに対するアミノ酸基質である：
［式中
ＫはＣＯ又はＳＯ2であり；
Ｑ＝Ｈ、Ｃ1〜6アルキル、アリール、ヘテロアリール−ＯＣ1〜6アルキル、−ＯＣＨ2アリール、−ＯＣＨ2ヘテロアリール、−Ｃ2〜6アルケニル又は−ＯＣ2〜6アルケニル］。
ＫはＣＯ又はＳＯ2であり；
Ｑ＝Ｈ、Ｃ1〜6アルキル、アリール、ヘテロアリール−ＯＣ1〜6アルキル、−ＯＣＨ2アリール、−ＯＣＨ2ヘテロアリール、−Ｃ2〜6アルケニル又は−ＯＣ2〜6アルケニル］。
有利には、本発明のデコイｎｎＡＡは、ＰｙｌｔＲＮＡの発現によって引き起こされるアンバーサプレッションの毒性作用を防ぐことができる。デコイは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡの存在下でアンバーコドンにおけるタンパク質翻訳の終結を可能にすることによりアンバーサプレッションを妨げる。好適には、式ＶＩＩＢのとおりポリペプチド合成の伝播に必要なアミノ末端基が欠失している式ＶＩＩのデコイアミノ酸：
［式中
Ｇ＝Ｈ；
ａ＝４又は５；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ1〜6アジドアルキル］。
Ｇ＝Ｈ；
ａ＝４又は５；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ1〜6アジドアルキル］。
Ｑの定義の範囲内で例示的なアリール基は、フェニルである。
ＲがＣ1〜6アジドアルキルを表す場合、それは好適にはＣ2〜6アジドアルキル、例えばＣ2〜4アジドアルキルを表す。
例示的なＲ基としては、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ3、−ＣＨ2Ｐｈ、−Ｃ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、及び−ＣＨ2−Ｃ≡Ｃ−Ｈが挙げられる。
一実施形態においてａは４である。別の実施形態においてａは５である。
式ＶＩＩＢの例示的デコイアミノ酸は、以下である：
６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
；５−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸
；６−｛［（２−クロロエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
；６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
；６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
；及び６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸
実施例１２のデータに基づけば、デコイｎｎＡＡは、ＰｙｌｔＲＮＡの発現によって引き起こされるアンバーサプレッションの毒性作用を防ぐことができる。デコイは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡの存在下でアンバーコドンにおけるタンパク質翻訳の終結を可能にすることによりアンバーサプレッションを妨げる。
デコイタンパク質
本発明に係る方法において有用なデコイタンパク質は、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的でない良性タンパク質である。
本発明に係る方法において有用なデコイタンパク質は、アンバーコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的でない良性タンパク質である。
本発明に関するデコイタンパク質は、以下から選択される：緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、アルブミン、ＳＥＡＰ、アクチン、ｂ−２ミクログロブリン、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ及びポリアンバー含有ペプチド。さらなる例はＩｇＧである。
本発明のデコイタンパク質は、好適には、条件的に活性化されるプロモーター及びプロモーターシステム、例えばテトラサイクリン調節プロモーター（ＴｅｔＯ又はｔＴＡ；ＴｅｔＯｎ及びＴｅｔＯＦＦ）、ドキシサイクリン誘導性（ＴＲＥ）プロモーター、ｃＡＭＰ誘導性プロモーター、グルココルチコイド活性化プロモーターシステム、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター（ｌａｃ）、Ｃｄ２＋又はＺｎ２＋誘導性プロモーター（金属タンパク質（ｍｅｔｈａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター）、インターフェロン依存性プロモーター（例えばマウスＭＸプロモーター）、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター（Ｔａｔ）、ＤＭＳＯ誘導性プロモーター（グロビンプロモーターグロビンＬＣＲ）、ホルモン調節プロモーター（ＧＬＶＰ／ＴＡＸＩ、エクジソン）、及びラパマイシン誘導性プロモーター（ＣＩＤ）から選択される誘導性プロモーターの制御下にある。
ＰＥＧ部分
標的タンパク質はＰＥＧ部分にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧ部分は抗体薬物コンジュゲートに組み込まれ得る。ＰＥＧ部分は、典型的には０．５ｋＤａ〜４０ｋＤａ、例えば５ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。より好ましくは、ＰＥＧ部分は約２０ｋＤａの分子量を有し得る。加えて、ＰＥＧ部分は１００〜２０００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。ＰＥＧ部分は直鎖状又は分枝状又はマルチアーム型であってもよい。
標的タンパク質はＰＥＧ部分にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧ部分は抗体薬物コンジュゲートに組み込まれ得る。ＰＥＧ部分は、典型的には０．５ｋＤａ〜４０ｋＤａ、例えば５ｋＤａ〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有し得る。より好ましくは、ＰＥＧ部分は約２０ｋＤａの分子量を有し得る。加えて、ＰＥＧ部分は１００〜２０００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。ＰＥＧ部分は直鎖状又は分枝状又はマルチアーム型であってもよい。
ＰＥＧ部分は、末端アルキン、アジド、シアン化物、シクロアルキン、アルケン、ハロゲン化アリールで官能化することができる。ＰＥＧは、単官能性、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性、及びホモ多官能性となるようにして官能化することができる。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明に係る細胞株は、抗体当たりの薬物（又は他のコンジュゲートされる分子）の数及び抗体におけるそれらの薬物の位置が明確に制御された均一な性質の抗体薬物コンジュゲート（所与の薬物、典型的には細胞傷害性薬物、或いはタンパク質又はＰＥＧ基に合成リンカーによって共有結合した組換え抗体）の作製に特に有用であり、従って組み込まれた非天然アミノ酸を含むモノクローナル抗体が得られ、これは直交化学により薬物部分（又は他のコンジュゲートされる分子）を有するリンカーと部位特異的にコンジュゲートされる。
本発明に係る細胞株は、抗体当たりの薬物（又は他のコンジュゲートされる分子）の数及び抗体におけるそれらの薬物の位置が明確に制御された均一な性質の抗体薬物コンジュゲート（所与の薬物、典型的には細胞傷害性薬物、或いはタンパク質又はＰＥＧ基に合成リンカーによって共有結合した組換え抗体）の作製に特に有用であり、従って組み込まれた非天然アミノ酸を含むモノクローナル抗体が得られ、これは直交化学により薬物部分（又は他のコンジュゲートされる分子）を有するリンカーと部位特異的にコンジュゲートされる。
好ましくは、本発明は、以下のステップを含むＡＤＣを得る方法を提供する。
１．本発明の安定細胞株に、完全長抗体をコードするＤＮＡ配列を有する１つ以上のプラスミドを導入するステップであって、それにより配列内の特定の位置に終止コドンが導入されるステップ
２．非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）が所望の１つ又は複数の位置に導入された修飾抗体を精製するステップ
３．抗体に導入されたｎｎＡＡに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、相補的な反応基を含む修飾抗体と直交化学によって反応させるステップ
４．得られたＡＤＣを精製するステップ
１．本発明の安定細胞株に、完全長抗体をコードするＤＮＡ配列を有する１つ以上のプラスミドを導入するステップであって、それにより配列内の特定の位置に終止コドンが導入されるステップ
２．非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）が所望の１つ又は複数の位置に導入された修飾抗体を精製するステップ
３．抗体に導入されたｎｎＡＡに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、相補的な反応基を含む修飾抗体と直交化学によって反応させるステップ
４．得られたＡＤＣを精製するステップ
従って、本発明はまた、ユニークな反応性官能基を有する非天然アミノ酸を所望の位置に組み込むように抗体成分が修飾されているＡＤＣであって、従ってかかる官能基により薬物部分（又はタンパク質又はＰＥＧ基）とのコンジュゲーションが可能となるＡＤＣも提供する。
ある実施形態では、本発明は、タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ、好ましくは１つ又は２つ、特に１つ）とトリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートされる抗Ｈｅｒ−２抗体を含む抗体コンジュゲートを提供する。
詳細には、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応によって形成され得る。
一実施形態では、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分とのＣｕ（Ｉ）触媒作用の条件下における反応によって形成される。
Ｃｕ（Ｉ）触媒作用は、ヨウ化銅、臭化銅、塩化銅、チオール化銅、シアン化銅などの天然Ｃｕ（Ｉ）源のいずれかを使用することにより達成される。Ｃｕ（Ｉ）種はまた、銅（ＩＩ）源及び還元剤を使用することによりインサイチューで生成させることもできる。銅（ＩＩ）源は、硫酸銅、塩化銅（ＩＩ）、又は酢酸銅であってもよい。還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、ジチオスレイトール、ＴＣＥＰ、ｂ−メルカプトエタノール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、亜硫酸水素ナトリウム、シスタミン及びシステインであってもよい。
好適には、Ｃｕ（Ｉ）触媒による環化付加は、反応開始時に存在するか、又はアスコルビン酸ナトリウムによる硫酸ナトリウムなど、Ｃｕ（ＩＩ）源の還元によってインサイチューで生じるＣｕ（Ｉ）種を安定化させるため、ＴＢＴＡ、ＴＨＰＴＡ、フェナントロリン誘導体、ピリジルメタンイミン誘導体、ジエチレントリアミン、ビピリジン誘導体、ＴＭＥＤＡ、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ピリジルメチル）アミン（ＢＰＭＡ）誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）誘導体、トリアルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳを含めたリガンドの存在下で実施される。
別の実施形態では、抗体コンジュゲートは、トリアゾール部分を含むリンカーを介して薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分とコンジュゲートした抗体を含み、ここでトリアゾール部分は、抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖にあるアジド部分と、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン部分との反応により形成され、アルキン部分はシクロオクチン部分である。
別の実施形態では、抗体コンジュゲートは、トリアゾール部分を含むリンカーを介して薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分とコンジュゲートした抗体を含み、ここでトリアゾール部分は、抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖にあるアルキン部分と、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアジド部分との反応によって形成され、アルキン部分はシクロオクチン部分である。
シクロオクチン部分は、例えばビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン部分であってもよい。
抗体の配列に組み込まれる非天然アミノ酸は、好適には、ＰｙｌＲＳに対する非天然アミノ酸基質、特に（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸などの非天然リシン類似体である。
抗体
本発明では、ＡＤＣは、完全長抗体並びに限定はされないがＦａｂ、Ｆａｂ２、及び一本鎖抗体断片などの抗体断片の使用を含む。
本発明では、ＡＤＣは、完全長抗体並びに限定はされないがＦａｂ、Ｆａｂ２、及び一本鎖抗体断片などの抗体断片の使用を含む。
細胞毒とのコンジュゲーションに好適な抗体としては、以下を標的とするものが挙げられる：抗Ｈｅｒ２、抗ＩＬ−６、ＴＲＯＰ−２、ＳＳＴＲ３、Ｂ７Ｓ１／Ｂ７ｘ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ２、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＦ、ＲａＳＬ、Ｃ３５Ｄ３、ＥｐＣａｍ、ＴＭＣＣ１、ＶＥＧＦ／Ｒ、コネキシン−３０、ＣＡ１２５（Ｍｕｃ１６）、セマフォリン−５Ｂ、ＥＮＰＰ３、ＥＰＨＢ２、ＳＬＣ４５Ａ３（ＰＣＡＮＡＰ）、ＡＢＣＣ４（ＭＯＡＴ−１）、ＴＳＰＡＮ１、ＰＳＧＲＤ−ＧＰＣＲ、ＧＤ２、ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）、ＴＭＥＦＦ２、ＣＤ７４、ＣＤ１７４（ｌｅＹ）、Ｍｕｃ−１、ＣＤ３４０（Ｈｅｒ２）、Ｍｕｃ１６、ＧＰＮＭＢ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥｐｈＡ２、５Ｔ４、メソテリン、ＴＡＧ−７２、ＣＡ９（ＩＸ）、ａ−ｖ−インテグリン、ＦＡＰ、Ｔｉｍ−１、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、α葉酸受容体、ＣＤ４４ｖ６、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ２０、ＣＡ５５．１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＲＯＮ、ＣＤ４０、ＨＭ１．２４、ＣＳ−１、Β２ミクログロブリン、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ルイスＹ、ＧＲＮＭＰ、トモレギュリン、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＣＡＩＸ、ＦａｓＬ受容体、ＭＭＰマトリックスメタロプロテアーゼ。
好ましい実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧ型の抗体である。
本発明の特に好ましい実施形態において、抗体は１つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾され、ここでかかる非天然アミノ酸の位置はＩｇＧ免疫グロブリンの間で保存されており、配列番号４６及び７５の抗Ｈｅｒ２抗体の２７４位に対応するＩｇＧについての重鎖の保存されている定常領域に相当する配列番号８２のＫ１５７位、及び配列番号４６及び７５の抗Ｈｅｒ２抗体の３５９位に対応する配列番号８２のＴ２４２位、並びにＫａｂａｔ付番に従う配列番号５２及び７９のＤ７０及びＬ８１に対応するＩｇＧの軽鎖のフレームワーク領域におけるＤ７０位及びＬ８１位から選択される。明確にするため、Ｄ７０は以下のアミノ酸コンテクストで見出され：ｓｇｓｒｓｇｔｄｆｔｌｔｉｓｓｌｑ、及びＥ８１は以下のアミノ酸コンテクストに見出される：ｓｓｌｑｐｅｄｆａｔｙｙｃｑｑ。
一つの詳細な目的とする抗体は、抗Ｈｅｒ−２抗体である。
抗Ｈｅｒ２抗体は、例えば、配列番号５２の軽鎖配列又はそれと９５％（例えば９６、９７、９８又は９９％）又はそれ以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有する誘導体、及び配列番号４６の重鎖配列又はそれと９５％（例えば９６、９７、９８又は９９％）又はそれ以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有する誘導体を有し得る。配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）は、ＣＤＲを除く抗体全体を比較ウィンドウとして考えて計算される。ＢＬＡＳＴなどの従来の配列比較プログラムが用いられ得る。本明細書に記載されるｍＡｂ配列は、ハーセプチンの配列と高い類似性を有する。ここで利用したｍＡｂ配列は、ハーセプチンに認められる抗原結合部位配列を生殖系列ＩｇＧ１に置くことにより作成した。Ｈｅｒ２の細胞外ドメインに特異的なマウス抗体４Ｄ５の可変領域は、重複オリゴマーを使用した遺伝子合成により作成し、シャトルベクターにクローニングした。次に可変領域をｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）によりコードされるヒトフレームワークにグラフトしてマウス−ヒトハイブリッドを作成した。配列比較から、構築した抗体がハーセプチンと比べて６つのアミノ酸置換を有することが示された。これらは５つの重鎖位置及び１つの軽鎖部位に対応した。これらの部位のいずれも、ＣＤＲ領域又はＣＤＲに隣接する部位には対応しなかった。
ある実施形態によれば、コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の２７４位にある。
ある実施形態によれば、コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の軽鎖配列の７０位にある。
ある実施形態によれば，コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の２７４位にあり、また、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各軽鎖の軽鎖配列の７０位にもある。
ある実施形態によれば、コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の３５９位にある。
ある実施形態によれば、コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の軽鎖配列の８１位にある。
ある実施形態によれば、コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の２７４位にあり、また、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各軽鎖の軽鎖配列の８１位にもある。
ある実施形態によれば，コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の３５９位にあり、また、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各軽鎖の軽鎖配列の７０位にもある。
ある実施形態によれば，コンジュゲーションに使用される非天然アミノ酸は、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各重鎖の重鎖配列の３５９位にあり、また、前記抗Ｈｅｒ２抗体の各軽鎖の軽鎖配列の８１位にもある。
別の詳細な目的とする抗体は、抗ＰＳＭＡ抗体、特にｓｃｆｖである。抗ＰＳＭＡ抗体は、例えば配列番号５８のｓｃｆｖ配列又はそれと９５％（例えば９６、９７、９８又は９９％）又はそれ以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有する誘導体を有し得る。配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）は、ＣＤＲを除く抗体全体を比較ウィンドウとして考えて計算される。ＢＬＡＳＴなどの従来の配列比較プログラムが用いられ得る。
詳細な実施形態では、抗ＰＳＭＡ ｓｃｆｖが非天然アミノ酸ｌｙｓ−アジドを１１７位に含むように修飾される（配列番号６０）。前記ｓｃｆｖは、例えばＭＭＡＦ−バリン−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）−ｐ−アミノ−ベンゾイル−カーボネート−シクロアルキン誘導体とコンジュゲートされ得る。
ＡＤＣを作製するための抗体の部位特異的修飾
本発明において、ｎｎＡＡを抗体に組み込むためのコンジュゲーション部位の選択には、以下のステップが含まれた。
本発明において、ｎｎＡＡを抗体に組み込むためのコンジュゲーション部位の選択には、以下のステップが含まれた。
最初の部位選択は、抗体の三次元構造、その機能ドメイン及び抗体の構造又は機能において役割を果たす必須アミノ酸残基を考慮に入れたインシリコ予測方法を用いて実施した。次に選択した部位をその物理化学的特性及び安定性に関してスクリーニングした。
好適には、最適なコンジュゲーション部位の選択基準には、以下が含まれた。
好ましい部位は、以下である：抗体の結合部位より遠位の残基；表面／溶媒露出残基（コンジュゲート形成のための接触性を高め、効率的なコンジュゲート形成を可能にする）；効率的なアンバーサプレッションを可能にすることが実験的に見出された部位；発現したタンパク質及びコンジュゲートの安定性を維持することが実験的に見出された部位。
回避される部位は、以下である：機能（例えばＦｃＲＮ結合、Ｆｃγ相互作用）にとって重要な残基、折り畳み又は構造にとって重要であることが知られるアミノ酸残基（例えばＣｙｓ、プロリン）。
上記に概説した基準に従い、ヒトＩｇＧ１における６つの部位が同定された。それらには、４つの重鎖位置（Ｔ１１４、Ｋ２７４、Ｋ２８８及びＴ３５９）及び２つの軽鎖部位（Ｄ７０及びＥ８１）が含まれる。ＨＣ Ｋ２７４、Ｋ２８８及びＴ３５９；及びＬＣ Ｄ７０、Ｅ８１が、ｎｎＡＡを効率的に組み込み、コンジュゲート形成を可能にすることが示された。
リンカー
本発明によれば、標的タンパク質又は抗体は、タンパク質又は薬物部分又はＰＥＧ部分に直接連結されても、或いはリンカー又はスペーサーを介して連結されてもよい。
本発明によれば、標的タンパク質又は抗体は、タンパク質又は薬物部分又はＰＥＧ部分に直接連結されても、或いはリンカー又はスペーサーを介して連結されてもよい。
本発明のリンカーは切断可能であっても、又は切断不可能であってもよい。
従って本発明は、トリアゾール部分を含むリンカーが、切断部位を含むスペーサーのリンカーが存在することによって切断可能なリンカーである抗体コンジュゲートを提供する。切断部位は酵素不安定性の切断部位であってもよい。酵素不安定性の切断部位の例は、酵素カテプシンＢにより認識され、且つシトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）Ｃ末端でペプチドを切断するバリン−シトルリンペプチドの組込みである。
ある実施形態では、抗体コンジュゲートのリンカーは、切断可能なリンカーではないトリアゾール部分を含む。
切断可能なリンカーの使用は、細胞毒がその標的内において変わらない状態で放出される必要性によって推進される。これはモノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｅ Ｅ）などの細胞毒により例示される＜（Ｐｅｔｔｉｔ １９９７，Ｓｅｎｔｅｒ ２００３）＞。切断可能なリンカーにおける放出機構は、酸不安定性など化学的なものであっても、又はリンカー内に切断可能なペプチドが含まれることによる酵素的なものであってもよい。この機構はまた、光若しくは他の放射源によるか、又はフッ化物などの化学的誘発により、外部から誘発されてもよい。
切断不可能なリンカーは、治療の間に所望の効力又は細胞死滅効果を達成するため細胞毒から取り除く必要がない。従って、抗体はインターナライズされ、リソソーム内でそのアミノ酸成分にまで分解して、薬物−リンカーを放出する。効力を有するためにさらなる放出を必要としないのが、この化合物である。切断不可能なリンカーは、インタクトな細胞毒を放出する内部機構を有さず、代わりに細胞毒フレームワーク上でのその包含の良性さ（ｂｅｎｉｇｎ−ｎｅｓｓ）に頼る。切断不可能なリンカーは、比較的単純な実体からより複雑な実体に至るまでの、複数の異なる構造を有し得る。
さらに、リンカーは、細胞毒及び抗体の両方との結合のし方によって定義される。従来の手法では、これには、システインチオール（マレイミド）又はリシンアミン（活性化酸）のいずれかに結合するケミストリーが含まれる。本発明のリンカーはアルキン基又はアジド基を組み込む。
好適には、本発明の切断不可能なリンカーは、一方の末端で抗体に結合するための機能ハンドル（Ｙ）と、ＡＤＣの２つの構成要素を架橋して抗体との結合及び薬物との結合に必要な官能基を提供するスペーサーと、薬物とのカップリング用の相補的官能基（Ｘ）とを含む。
好適には、好ましい機能ハンドルは、標的タンパク質に取り込まれる非天然アミノ酸上の官能基に相補的な反応性パートナーであるような化学的部分である。この分子のスペーサー部分は、抗体との結合及び薬物との結合に必要な２つの相補的官能基を含む非機能性の化学的な橋である。リンカーのこの実施形態において、このスペーサーは切断部位を有しない。
本発明の好ましい実施形態では、機能ハンドル（Ｙ）はアルキン基を含む。
好ましくは、アルキンは、末端アルキン、内部アルキン、環状アルキン及びシリル保護アルキンであり得る。
好ましくは、内部アルキンは、アルキンに隣接して電子吸引基を含み得る。好ましくは、環状アルキンは、７、８又は９員環内に含まれるアルキンであり得る。
これらの電子吸引基としては、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素などのハロゲンが挙げられる。さらなる電子吸引基としては、ヒドロキシル、エーテル、アセタール、ケタール、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、ニトリル、ニトロ、アミドが挙げられる。
より好ましくは、この環は、例えば参照により本明細書に援用されるｖａｎ Ｄｅｌｆｔ，Ｆ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，４９，１−５，２０１２、Ｍ．Ｄ．Ｂｅｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９，４８，６５７１−６５８４；Ｅ．Ｍ．Ｓｌｅｔｔｅｎ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００９，１２１，７１０８−７１３３；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，６９７４−６９９８．；Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５，１，１３−２１、Ｊ．Ａ．Ｃｏｄｅｌｌｉ，Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１１４８６−１１４９３に記載されるとおり、８員環が３個、４個、５個、又は６個の原子の別の環と縮合している二環式環系に含まれ得る。
特に好ましい環状アルキンは、参照により本明細書に援用される米国特許第７，８０７，６１９号明細書及び米国特許出願第１２／０４９，０３４号明細書に記載される。
特に好ましい二環式アルキンは、国際公開第２０１１／１３６６４５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのビシクロノニンである。
ある実施形態では、本発明の切断不可能なリンカーは抗体結合部位に機能ハンドル（Ｙ）としてアルケンを含み得る。
好適には、アルケンは、一置換、二置換、三置換又は四置換されていてもよい。
好適には、アルケンは環の一部として組み込まれ得る。
好ましい実施形態では、アルケンは３〜１２員環の一部であり得る。
さらに好ましい実施形態において、アルケンは、ノルボルネン、二環式フラン又は二環式ピロール系などの二環式環系の一部であってもよい。
好ましくは、抗体結合部位の機能ハンドル（Ｙ）は、ハロゲン化ビニルを含む。
好ましくは、ハロゲン化ビニルは、フッ素、塩化物、臭素、又はヨウ素などのハロゲン化物をＺ位又はＹ位の一方又は両方に含む。さらに、ハロゲン化ビニルは、Ｒ基が水素である末端であってもよい。ハロゲン化ビニル基はまた、アルキル基及びアリール基、カルボニル基を含め、Ｒ位にさらなる置換も含み得る。
好ましくは、ハロゲン化ビニルは環式化合物の一部である。
より好ましくは、ハロゲン化ビニルは、３個、４個及び５個の原子を有する環の一部である。
ある実施形態では、抗体結合部位の機能ハンドル（Ｙ）は、シリル基及びＬＧ位でハロゲン化物又はトリフレート、トシル化物又はメシル酸塩のいずれかで置換された反応性芳香環を含む。
さらなる実施形態において、抗体結合部位の機能ハンドル（Ｙ）は、末端に反応性アジド基を含む。
好適には、本発明の切断可能なリンカーは、一方の末端で抗体に結合するための機能ハンドル（Ｙ）と、スペーサーと、薬物とのカップリング用の相補的官能基（Ｘ）とを含む。
好適には、本発明のＡＤＣの切断可能なリンカーは切断部位を含む。
好適には、切断部位は、酵素的、化学的、又は外部的に引き起こされ得る。
ある実施形態において、切断部位は薬物結合部位に置かれる。
代替的実施形態において、切断部位は薬物結合部位にある。
ある実施形態において、切断可能なリンカーは、アルキンを含む抗体結合部位に機能ハンドル（Ｙ）を含む。
好ましくは、アルキンは、末端アルキン、内部アルキン、環状アルキン及びシリル保護アルキンであり得る。
好ましくは、好ましくは、内部アルキンは、アルキンに隣接して電子吸引基を含み得る。これらの電子吸引基としては、フッ素、臭素、塩素及びヨウ素などのハロゲンが挙げられる。さらなる電子吸引基としては、ヒドロキシル、エーテル、アセタール、ケタール、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、ニトリル、ニトロ、アミドが挙げられる。
好ましくは、環状アルキンは、７、８又は９員環内に含まれるアルキンであり得る。
より好ましくは、この環は、８員環が３個、４個、５個、又は６個の原子の別の環と縮合している二環式環系に含まれ得る。
代替的実施形態では、切断部位及びスペーサーは順序が逆にされ、切断部位が薬物結合部位にある。
ある実施形態では、本発明の切断可能なリンカーは抗体結合部位に機能ハンドル（Ｙ）としてアルケンを含み得る。
好適には、アルケンは、一置換、二置換、三置換又は四置換されていてもよい。
好適には、アルケンは環の一部として組み込まれ得る。
好ましい実施形態において、アルケンは３〜１２員環の一部であり得る。
さらなる好ましい実施形態において、アルケンは、ノルボルネン、二環式フラン又は二環式ピロール系などの二環式環系の一部であってもよい。
好ましくは、抗体結合部位の機能ハンドル（Ｙ）はハロゲン化ビニルを含む。
好ましくは、ハロゲン化ビニルは、フッ素、塩化物、臭素、又はヨウ素などのハロゲン化物をＺ位又はＹ位の一方又は両方に含む。さらに、ハロゲン化ビニルは、Ｒ基が水素である末端であってもよい。ハロゲン化ビニル基はまた、アルキル基及びアリール基、カルボニル基を含め、Ｒ位にさらなる置換も含み得る。
好ましくは、ハロゲン化ビニルは環式化合物の一部である。
より好ましくは、ハロゲン化ビニルは、３個、４個及び５個の原子を有する環の一部である。
代替的実施形態において、切断部位及びスペーサーは順序が逆にされ、切断部位が薬物結合部位にある。
ある実施形態において、抗体結合部位の機能ハンドル（Ｙ）は、シリル基及びＬＧ位でハロゲン化物又はトリフレート、トシル化物又はメシル酸塩のいずれかで置換された反応性芳香環を含む。
代替的実施形態において、切断部位及びスペーサーは順序が逆にされ、切断部位が薬物結合部位にある。
代替的実施形態において、切断部位及びスペーサーは順序が逆にされ、切断部位が薬物結合部位にある。
本発明の実施形態において、切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーの両方ともスペーサー部分は構造が多様であってよく、アルキル鎖、アルキル環、芳香環、アニリン誘導体、例えばｐ−アミノベンゾイルカーボネート、アルケン、ポリエチレングリコールなどのポリマーを含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、一方の末端でアジド−アルキン環化付加によって抗体と結合するためのシクロアルキンで構成される。シクロアルキンには炭素鎖が結合し、次にはこれがバリン−シトルリンペプチドに結合する。シトルリンのＣ末端はｐ−アミノベンゾイルカルバメート（ＰＡＢＣ）とカップリングする。これが次に、ＭＭＡＦのＮ末端に結合する。このバリン−シトルリンペプチドは酵素カテプシンＢによって認識され、カテプシンＢがこのペプチドをシトルリンＣ末端で切断する。切断後、ｐ−アミノベンゾイルが脱離反応を受け、ＣＯ２及びＭＭＡＦ基が追い出される。従って、シクロアルキン−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣの組み合わせ全体が、切断可能なリンカーである。
本発明のある実施形態では、リンカーはトリガーに基づきＡＤＣから薬物を放出する。
好適には、トリガーは標的細胞の近傍又はその中に見出され得る。
好ましくは、リンカーは細胞内に見出される。好適には細胞内トリガーは酵素的なトリガーを含む。
好適には、酵素切断部位は、細胞内酵素によって特異的に認識されるアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい酵素切断部位は、カテプシン（バリン−シトルリン）及びフューリン（Ａｒｇ−Ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）である。
或いは、化学的トリガーが標的細胞内に見出される。
好適には、化学的トリガーとしては、エステル、アミド、アセタール、ケタール、ニトリル、エーテル切断、カルバミン酸塩、尿素、スルホンアミド、スルホニル、スルフェニル、ホスフィンアミド、ホスホルアミデート、エナミン、イミン、シリルエーテル、オルトエステル、ボロン酸塩を含む化学的部分の酸加水分解が挙げられる。
或いは、化学的トリガーとしてはまた、ジスルフィドを含む化学的部分の還元、シリル基へのフッ化物付加、逆環化付加及び逆マイケル付加も挙げることができる。
或いは、リンカーからの薬物の放出は、特定の波長の放射に曝露するなど、細胞外刺激によって達成することができる。
薬物部分
細胞毒薬物部分などの本発明の薬物部分としては、小分子、天然産物、合成的に誘導された薬物、免疫毒素などのタンパク質、及び放射性核種が挙げられる。
細胞毒薬物部分などの本発明の薬物部分としては、小分子、天然産物、合成的に誘導された薬物、免疫毒素などのタンパク質、及び放射性核種が挙げられる。
ある実施形態では、薬物部分はアウリスタチン部分、例えば、アウリスタチン又はその誘導体、例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（ベドチン）又はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＦ（ＡＦ）、アマニチン、パクリタキセル及びドキソルビシンである。
他の薬物部分としては、メイタンシン、パクリタキセル、ドキソルビシン及び免疫毒素、例えば外毒素又はボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）など、並びにヨウ素１３１、イットリウム９０、サマリウム１３５、及びストロンチウム８９などの放射性核種が挙げられ、これらもまた有機分子中に組み込まれ得る（例えば：ＭＭＡＥ：Ｓｅｎｔｅｒ，ＰＥ，ｅｔ．ａｌ，ＢＬＯＯＤ，１０２，１４５８−１４６５。ＭＭＡＦ：Ｓｅｎｔｅｒ，ＰＥ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００６，１７，１１４−１２４。メイタンシン：Ｌｅｗｉｓ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＧＤ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３，９２８０−９２９０，２００８。ボウガニン（Ｂｏｕｇａｎｉｎ）：ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＧＣ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２ ５７４−８４，２００９を参照。
最も好適には、薬物部分は、ドキソルビシン、パクリタキセル及びアウリスタチン部分から選択される部分である。
塩
本明細書に記載されるアミノ酸、アミノ酸誘導体、デコイアミノ酸およびピロリシン類似体は、場合により塩の形態で用いられ得る。任意のかかる塩が本発明の態様を形成する。カルボン酸の塩には、第１族及び第２族金属と形成される塩、特にナトリウム塩及びカリウム塩などの可溶性塩が含まれ得る。アミンの塩には、ＨＣｌ、ＨＢｒ又は酢酸などの弱酸及び強酸と形成される塩が含まれ得る。
本明細書に記載されるアミノ酸、アミノ酸誘導体、デコイアミノ酸およびピロリシン類似体は、場合により塩の形態で用いられ得る。任意のかかる塩が本発明の態様を形成する。カルボン酸の塩には、第１族及び第２族金属と形成される塩、特にナトリウム塩及びカリウム塩などの可溶性塩が含まれ得る。アミンの塩には、ＨＣｌ、ＨＢｒ又は酢酸などの弱酸及び強酸と形成される塩が含まれ得る。
実施例１：安定細胞株の作成
ｎｎＡＡを標的タンパク質に部位特異的に組み込む能力を有するプラットフォーム細胞株の作成には、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡを安定に発現する細胞株の段階的な構築が必要であった。これは、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ発現エレメントの逐次導入及び反復的な選択ステップによる高機能細胞の同定により達成した（図１）。
ｎｎＡＡを標的タンパク質に部位特異的に組み込む能力を有するプラットフォーム細胞株の作成には、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡを安定に発現する細胞株の段階的な構築が必要であった。これは、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ発現エレメントの逐次導入及び反復的な選択ステップによる高機能細胞の同定により達成した（図１）。
９コピーのＵ６−ｐｙｌｔＲＮＡ発現カセット並びにヒトＩＮＦ？マトリクス付着領域（核におけるクロマチンの構造化を媒介して遺伝子発現の調節において役割を果たし、複製を通じたそれらのエレメントの安定性を高める配列エレメント（Ｋｌａｒ ２００５；Ｈｅｎｇ ２００４；Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋ １９９９））をコードする配列を含むプラスミド（ｐＳＢ−９ｘｔＲＮＡ−ＭＡＲＳ、ここでＵ６は配列番号３２に定義され、ｔＲＮＡ配列は配列番号２８に定義される）を、ＤＧ４４−ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、０．１ｍＭヒポキサンチン及び０．０１６ｍＭチミジンを含有するＨＴ添加剤、８ｍＭグルタミン、５ｕｇ／ｍＬブラストサイジンを補足したＰｒｏＣＨＯ４培地（ＰｒｏＣＨＯ４−Ｃ）で選択した。次に、ＧＦＰレポーターアッセイ及び細胞分取を用いて細胞をｔＲＮＡ機能に関して選択した。簡潔に言えば、細胞にＦＬＡＧタグ標識ｐｙｌＲＳ（配列番号２）及び４０位のチロシンをコードするコドンの代わりにアンバーコドンを含むレポーターｅＧＦＰ（ｅＧＦＰＹ４０、配列番号３８をコードするｐＪＴＩ−Ｒ４ ＰｙｌＲＳ ｅＧＦＰＹ４０をトランスフェクトし、細胞を２ｍＭ ｎｎＡＡ ＡＬＯＣ（Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）に１４時間曝露した。最も高い蛍光レベルを示す３０，０００細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーターを使用して新鮮なＰｒｏＣＨＯ４−Ｃ培地に収集し、拡大した。この細胞集団は、ｐｙｌｔＲＮＡ活性を含む分取後プールに相当する。この分取後プールが親の分取前プールと比べて機能の向上を示すかどうかを調べるため、両方の集団に、野生型ｅＧＦＰ（配列番号３７）をコードするＧＦＰ対照であるｐＪＴＩ−Ｒ４ ＰｙｌＲＳ ｅＧＦＰＹ４０（Ｆ６４Ｌ及びＳ６５Ｔ突然変異を含むように修飾したｐＴｒａｃｅｒ ＥＦ／ＨｉｓＡ；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、２ｍＭ ＡＬＯＣを含有するＰｒｏＣＨＯ４−Ｃ培地で２４時間成長させ、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用して分析し、これらの細胞及び対照細胞の蛍光レベルを定量化した（図２Ａ）。これらのデータは、親株又は非トランスフェクト対照と比較したとき、分取後細胞集団がｎｎＡＡの存在下でより高いアンバーサプレッション有効性を有することを示している。この中間細胞集団はＤＧ４４−ＣＨＯ−１９１と称される。ＤＧ４４−ＣＨＯ−１９１細胞はアンバーサプレッション能力を有したが、その有効性は限られており、ＧＦＰＹ４０を基準として４３％未満のアンバーサプレッションであった。ｔＲＮＡレベルがアンバーサプレッションの有効性の制限因子であることが示された。従って、分取後ＤＧ４４−ＣＨＯ−１９１細胞にｐＳＺ−９ｘｔＲＮＡをトランスフェクトし、ＤＭＥＭ−ＢＺ（ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、ＨＴ添加剤、５ｕｇ／ｍｌブラストサイジン、０．５ｍｇ／ｍＬゼオシン）で細胞を選択した。ＤＧ４４−ＣＨＯ−２００−１２と称される生存細胞プール、及びＤＧ４４−ＣＨＯ−１９１細胞にｐＪＴＩ−Ｒ４ ＰｙｌＲＳ ｅＧＦＰＹ４０又はｐＴｒａｃｅｒをトランスフェクトした。ｔＲＮＡ発現カセットのさらなるコピーを含む細胞は、増加したｅＧＦＰＹ４０依存性蛍光、ひいてはアンバーサプレッションの有効性を実証する（図２Ｂ）。これらのデータは、段階的な反復的選択及び細胞分取方法によって、機能が向上した細胞の同定が得られることを示している。ｔＲＮＡがこの系を制限する成分であると理解した上で、ｐｙｌｔＲＮＡの発現レベル、ひいてはこの細胞集団のアンバーサプレッションの有効性をさらに増加させるため、ＤＧ４４−ＣＨＯ−２００−１２細胞を細胞分取に供し、高いアンバーサプレッション能力を有する細胞を単離した。ここでＤＧ４４−ＣＨＯ−２００−１２細胞（ｐＳＢ−９ｘ−ＭＡＲＳ及びｐＳＺ−９ｘを含む）にｐＪＴＩ−Ｒ４−ｐｙｌＲＳ−ｅＧＦＰＹ４０を一過性にトランスフェクトし、２ｍＭ ＡＬＯＣを含有する培地で細胞を成長させた。最も高い１％蛍光レベルを示した７，０００細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーターを使用して単離し、ＤＭＥＭ−ＢＺで増殖させた。これにより、ＤＧ４４−ＣＨＯ−２０８−２と称される細胞プールを得た。
このプラットフォーム細胞株を完成させるには、ｐｙｒｌＲＳの発現用カセットを安定に導入することが必要であった。従って、２０８−２細胞に、配列番号２（Ｙ３８４Ｆ突然変異体）又は配列番号１（野生型）のｐｙｌＲＳをコードするｃＤＮＡ配列を有するｐＭＯＡＶ２又はｐＭＯＡＶ２−ｐｕｒｏをトランスフェクトし、０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＢＳＤ−Ｚｅｏ（ＤＭＥＭ−ＨＢＺ）、又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＢＺ（ＤＭＥＭ−ＰＢＺ）で形質転換体を選択し、ＤＧ４４−ＣＨＯ−２１１−１（ｈｙｇｒｏ）又はＤＧ４４−ＣＨＯ−２１１−２（ｐｕｒｏ）と称される選択された細胞プールを作成した。抗生物質耐性細胞を培養し、ｅＧＦＰレポーターコンストラクトをコードするｐＥＮＴＲ−Ｐ５−Ｐ２ ｅＧＦＰＹ４０をトランスフェクトして細胞を２ｍＭ ＡＬＯＣの存在下で１時間２０分培養し、続いて高い蛍光レベルを示す細胞を、細胞分取を用いて単離した。ここで、１３３１細胞（１，７１２，３３２個のイベントから）の２１１−１及び１１６９細胞の２１１−２が単離された。ＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−１又はＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−２と称される分取された集団を、ＤＭＥＭ−ＨＢＺ又はＤＭＥＭ−ＰＢＺで培養した。
ｐｙｌＲＳを含有する集団の分取がアンバーサプレッションの有効性を向上させたかどうかを決定するため、オープンリーディングフレームに割り込んだアンバーコドンを含むＧＦＰをコードするレポータープラスミド（Ｐ２−Ｐ５ ｅＧＦＰＹ４０）、ｅＴｒａｃｅｒによるＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−１及びその親細胞株ＤＧ４４−ＣＨＯ−２１１−１の一過性のトランスフェクションを実施し、又はトランスフェクトしないままとした。トランスフェクト細胞を２ｍＭ ＡＬＯＣと共に２８時間インキュベートし、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより蛍光を定量化した（図２Ｃ）。ＤＧ４４−ＣＨＯ−２１１−１及びＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−１は同等のトランスフェクション能力示したが（ｅＴｒａｃｅｒ対照）、ＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−１は、親細胞株の５倍超高いｅＧＦＰＹ４０依存性蛍光を示した。この結果は、分取細胞が高活性アンバー抑制細胞の単離及び効率的なプラットフォーム細胞株の単離を可能にすることを示している。
次に、このプラットフォーム細胞株を使用して、ｎｎＡＡで修飾しようとするタンパク質をコードする安定に組み込まれる遺伝子標的を含む発現細胞株を樹立した。
ＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−２細胞株に、重鎖ｃＤＮＡのＫ２７４位にアンバーコドンを有するヒトＩＬ−６に対するＩｇＧの発現用遺伝子を含むｐＯｔｉｖｅｃ−２８Ｄ２ａｍｂ２７４プラスミドをトランスフェクトした。これを行うため、全体として本明細書に参照により援用される国際公開第２０１２０３２１８１号パンフレットに記載されるとおり、ヒトサイトカインＩＬ−６に対するウサギ抗体の可変領域を、ＰＣＲ増幅及びベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（重鎖、配列番号４０）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖、配列番号４４）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）へのクローニングによってヒトフレームワークにグラフトしてウサギ−ヒトハイブリッドを作成することにより、ヒトサイトカインＩＬ−６に対する抗体を作成した。部位特異的突然変異誘発によって重鎖定常領域のＫ２７４位にアンバーコドンを導入した（配列番号４２）。アンバーコドンを含むクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。組込みコンストラクトを作成するため、このＩｇＧ、重鎖のプロモーター及びＯＲＦをＰＣＲ増幅し、制限酵素消化及びライゲーションによってｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。軽鎖及びｔＲＮＡの単一コピーを重複オリゴマーを使用した二段階ＰＣＲ法によりつなぎ合わせ、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドに利用可能な部位でクローニングした。得られたベクターをプラットフォーム細胞株ＤＧ４４−ＣＨＯ−２２３−２にトランスフェクトすることにより導入し、ヒポキサンチン及びチミジン不含成長培地のＤＭＥＭ−ＨＴ（ＤＭＥＭ、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％透析ウシ胎仔血清、５ｕｇ／ｍｌブラストサイジン、０．５ｍｇ／ｍＬゼオシン、０．７５ｕｇ／ｍｌピューロマイシン）における培養物の成長によって細胞を選択した。Ｏｐｔｉｖｅｃベクターはまた、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子も含み、これは、ＨＴ添加剤不含且つメトトレキサート存在下の培地でのＤＧ４４ ＣＨＯ細胞の成長を可能にする。ＤＭＥＭ−ＨＴ不含及び１０ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）含有培地で細胞をさらに選択した。生細胞を回収し、９６ウェルトレイ中、使用した抗生物質濃度が先に概説した濃度の半分である同じ培地に５０細胞／ウェルで分配した。成長培地中にｎｎＡＡが存在しないとき、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対は不活性であり、アンバーサプレッションは起こらない。従って、トランケート型ＩｇＧ重鎖が発現して成長培地中に分泌される。１０〜１２日後、成長に関してウェルをモニタし、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、高レベルのトランケート型ＩｇＧを発現するコロニーを含むウェルを同定した。これを行うため、ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｕｇ／ｍＬ ３ｘＦＬＡＧ−ＩＬ−６−Ａｖｉにより４Ｃで１時間又は一晩コーティングした。水で洗浄して１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした後、１５ｕｌの発現培地を０．１％脱脂乳を含有する３５ｕｌのＰＢＳで希釈し、ウェルの各々に室温で１時間加えた。ウェルを水で数回洗浄し、５０ｕｌの１：１０，０００希釈二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と室温で１時間コンジュゲートさせた（抗ヒトＨ＋Ｌ−ＨＲＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。次にウェルを洗浄し、各ウェルに５０ｕｌのＳｕｒｅｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ）を加えた。５〜１０分後、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、プレートリーダーを４５０ｎＭ波長で使用して発色を定量化した。高レベルのトランケート型ＩｇＧを発現した細胞を含むウェルを増殖させて拡大した。このアッセイにより、高いトランケート型ＩｇＧ発現を示す７つのクローンの同定がもたらされた。単離されたクローンが効率的なアンバーサプレッションを示すかどうかを決定するため、クローンを２ｍＭ ＡＬＯＣに曝露し、完全長ＩｇＧの発現レベルをＥＬＩＳＡにより計測した。簡潔に言えば、ヤギヒト抗ＦＣ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）を使用して、トランケート型ＩｇＧは捕捉せず、完全長ＩｇＧを特異的に捕捉した。試験した７つのクローンのうち、１つが高レベルの完全長発現を示した（３Ｆ２、配列番号４２）。アンバーサプレッションの効率を実証するため、ＩｇＧの発現及び精製に３Ｆ２クローンを利用した。３Ｆ２クローンを、組織培養フラスコ中の５０ｎＭ ＭＴＸ含有培地で９０％コンフルエンスになるまで培養し、細胞を２ｍＭ ｌｙｓ−アジド（ｎｎＡＡ）と共に発現培地（ＤＭＥＭ、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％低ＩｇＧウシ胎仔血清、５ｕｇ／ｍｌブラストサイジン、０．５ｍｇ／ｍＬゼオシン、０．７５ｕｇ／ｍｌピューロマイシン）でインキュベートした。細胞に抗体を７日間発現させ、培地を回収した。発現上清から抗体をプロテインＡカラムで捕捉し、ＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質を５０ｍＭグリシン ｐＨ３．０で溶出させて、ＩｇＧを含むピーク画分をＰＢＳで透析した。ｌｙｓ−アジドｎｎＡＡを含む精製抗体はＡｚＡｂと称される。代表的な試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥロード用緩衝液に再懸濁し、それぞれ０．５ｕｇ及び１ｕｇを還元条件下及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーで染色した（図３Ａ）。発現した産物がｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）を含むことを実証するため、発現したタンパク質を、環状アルキン官能基を含む１００倍過剰の２０ＫＤａ−ＰＥＧと共に室温で４時間インキュベートした。等量の出発物質及びＰＥＧ−ＩｇＧコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色で可視化した（図３Ｂ）。ＰＥＧはコンジュゲートの分子量を変化させてゲル移動度の遅れをもたらす。変性及び還元条件下で反応混合物を分離させると、ＩｇＧの重鎖（これはｎｎＡＡ組込み部位を（２７４位に）含むように設計された）のみがゲル移動度のシフトを示すことが観察された。対照的に、軽鎖には、コンジュゲーション反応による変化は見られなかった。これらのデータは、発現したタンパク質が特異的に修飾された部分を含むこと、及びコンジュゲーション条件が重鎖に特異的であることを実証している。このコンジュゲートで観察された移動度のシフトがＩｇＧ抗ＩＬ−６ ＡｚＡｂのペグ化に相当することをさらに実証するため、対照ＩｇＧ、コンジュゲーション反応の出発物質及びコンジュゲートしたＩｇＧをプロテインＡに結合させた。結合した物質をＰＢＳで洗浄してコンジュゲートしなかったＰＥＧを取り除き、２％ＳＤＳでタンパク質を溶出させた。次にこの材料を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルー染色でタンパク質を可視化し、ヨウ素染色でＰＥＧを可視化し、及び抗ヒトＦＣ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）を使用してウエスタンブロットすることにより、重鎖を検出した（図３Ｃ）。これらのデータは、コンジュゲートが重鎖で特異的に形成されること、及び分子量の増加がＰＥＧとのコンジュゲートの形成に起因することを示している。
並行してＩＬ−６に対する抗体を発現する第２のクローンを同定して特徴付け（７Ｂ１、配列番号４２）、上記に記載されるのと同じ位置（Ｋ２７４、配列番号４８）で重鎖にコードされるアンバーコドンを含む、ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する抗体に関して上記に示したとおり作成したクローン（３Ｅ９、配列番号４８）も同様にした。これらの細胞株の発現レベルを定量化し、ｌｙｓ−アジドの存在下における発現培地での細胞当たりの産生を決定した（図３Ｄ）。これらのデータは、ｎｎＡＡを含む異なる抗体の発現に対する本方法の適用性を実証している。
実施例２：アンバーサプレッション関連毒性
プラットフォーム細胞株を単離する過程で、本発明者らは、系の効率を向上させるためにｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌを導入する量を増加させると細胞の生存能力が低下したことを観察した。詳細には、ｔＲＮＡｐｙｌレベルの増加がアンバーサプレッションの有効性に最も大きい影響を有することが分かった。これは、ｐＪＴＩ−Ｒ４−ｐｙｌＲＳ−ｅＧＦＰＹ４０及び種々の数のＵ６−ｔＲＮＡ発現カセットをコードするベクターを一過性にトランスフェクトした細胞で観察され、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用して平均蛍光を決定した（図４Ａ）。本発明者らは、ｔＲＮＡ発現カセットを欠く細胞、又はＡＬＯＣの非存在下で成長した細胞が、有意なＧＦＰシグナルを示さなかったことを観察した。しかしながらｔＲＮＡ遺伝子コピーの数に伴いＧＦＰの発現レベルが増加したことから、ｔＲＮＡがアンバーサプレッション系の重要な成分であることが示される。アンバーサプレッションにおけるｔＲＮＡレベルの効果をさらに精緻化するため、本発明者らは、ｐｙｌＲＳ又はｔＲＮＡ遺伝子をコードするベクターを様々な量で一過性にトランスフェクトし、２ｍＭ ＡＬＯＣの存在下でアンバー終止コドンを含む標的タンパク質に対するアンバーサプレッションの有効性を測った。アミノ酸残基１３１にアンバーコドンを含むヒトサイトカインＦＧＦ２１（ここでは開始因子メチオニンが１である−配列番号６３、配列番号６４）をコードする発現コンストラクトに、ｐｙｌＲＳとＵ６−ｔＲＮＡカセットの６つの遺伝子コピーとをコトランスフェクトしたとき、本発明者らは、トランケート型から完全長ＦＧＦ２１への約５０％の変換を観察した（図４Ｂ）。トランスフェクションにおけるｐｙｌＲＳベクターの量を２倍にしても、トランケート型ＦＧＦ２１と完全長ＦＧＦ２１との比率が大幅に変化することはなかった（２ｘｐｙｌＲＳ）。しかしながら、ｔＲＮＡカセットのさらなるコピーの導入（１５ｘＵ６−ｔＲＮＡ）は、完全長ＦＧＦ２１の相対的発現量の大幅な増加をもたらした。これにより、ｔＲＮＡレベルがアンバーサプレッションの最も大きい制限因子であることが示された。
プラットフォーム細胞株を単離する過程で、本発明者らは、系の効率を向上させるためにｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌを導入する量を増加させると細胞の生存能力が低下したことを観察した。詳細には、ｔＲＮＡｐｙｌレベルの増加がアンバーサプレッションの有効性に最も大きい影響を有することが分かった。これは、ｐＪＴＩ−Ｒ４−ｐｙｌＲＳ−ｅＧＦＰＹ４０及び種々の数のＵ６−ｔＲＮＡ発現カセットをコードするベクターを一過性にトランスフェクトした細胞で観察され、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用して平均蛍光を決定した（図４Ａ）。本発明者らは、ｔＲＮＡ発現カセットを欠く細胞、又はＡＬＯＣの非存在下で成長した細胞が、有意なＧＦＰシグナルを示さなかったことを観察した。しかしながらｔＲＮＡ遺伝子コピーの数に伴いＧＦＰの発現レベルが増加したことから、ｔＲＮＡがアンバーサプレッション系の重要な成分であることが示される。アンバーサプレッションにおけるｔＲＮＡレベルの効果をさらに精緻化するため、本発明者らは、ｐｙｌＲＳ又はｔＲＮＡ遺伝子をコードするベクターを様々な量で一過性にトランスフェクトし、２ｍＭ ＡＬＯＣの存在下でアンバー終止コドンを含む標的タンパク質に対するアンバーサプレッションの有効性を測った。アミノ酸残基１３１にアンバーコドンを含むヒトサイトカインＦＧＦ２１（ここでは開始因子メチオニンが１である−配列番号６３、配列番号６４）をコードする発現コンストラクトに、ｐｙｌＲＳとＵ６−ｔＲＮＡカセットの６つの遺伝子コピーとをコトランスフェクトしたとき、本発明者らは、トランケート型から完全長ＦＧＦ２１への約５０％の変換を観察した（図４Ｂ）。トランスフェクションにおけるｐｙｌＲＳベクターの量を２倍にしても、トランケート型ＦＧＦ２１と完全長ＦＧＦ２１との比率が大幅に変化することはなかった（２ｘｐｙｌＲＳ）。しかしながら、ｔＲＮＡカセットのさらなるコピーの導入（１５ｘＵ６−ｔＲＮＡ）は、完全長ＦＧＦ２１の相対的発現量の大幅な増加をもたらした。これにより、ｔＲＮＡレベルがアンバーサプレッションの最も大きい制限因子であることが示された。
従って、効率的なアンバーサプレッション特性を有する細胞株の作成には、高レベルのｔＲＮＡ発現が必要である。しかしながら、本発明者らは、ｔＲＮＡプラスミドの発現が特に細胞成長にとって有害であることを見出した。ｔＲＮＡ発現カセットの固有の毒性は、親株と比較したときの高機能プラットフォーム細胞の観察可能な形態学的変化及び成長速度の低下に反映された。
プラットフォーム細胞株の有効性がｔＲＮＡレベルによって直接影響を受ける一方、高レベルのｔＲＮＡｐｙｌは細胞傷害効果をもたらす。本発明者らは、導入するＵ６−ｔＲＮＡ遺伝子の数が多い程、ｎｎＡＡ及びｐｙｌＲＳの存在下でのアンバーサプレッションが改善される一方、高レベルのｔＲＮＡはまた細胞傷害性をもたらしたことを観察した。この効果がｔＲＮＡ発現と関連付けられるかどうかを確認するため、ｐＳＢ−９ｘｔＲＮＡの存在に関して選択したＣＨＯ細胞株（ＤＧ４４−ＣＨＯ−１９１）に、ｅＧＦＰＹ４０をコードするベクター（Ｐ５−Ｐ２ ｅＧＦＰＹ４０）を単独で、又はＣＭＶプロモーターの制御下でｐｙｌＲＳをコードするベクター（ｐＣＥＰ４−ｐｙｌＲＳ）若しくはｐＯｒｉＰエレメントも含むプラスミドにＵ６−ｔＲＮＡの９つのコピーを含むベクター（ｐＯｒｉＰ−９ｘｔＲＮＡ）との組み合わせで一過性にトランスフェクトし、ＥＢＮＡ−１を発現する細胞（その全体が参照により本明細書に援用されるＳｈａｎ ２００６及び欧州特許第１９９２６９８号明細書）にこのプラスミドを持続的に維持させ、細胞を３７Ｃで４８時間インキュベートした。フローサイトメーターを使用して蛍光レベルを定量化した（図４Ｃ）。ｐｙｌｔＲＮＡを発現する細胞のバックグラウンドにｐｙｌＲＳ発現カセットを加えると、ｎｎＡＡの非存在下でアンバーサプレッションレベルの増加がもたらされるが、この効果は、ｔＲＮＡのさらなるコピーをトランスフェクトした細胞で増幅された。これらのデータは、高レベルのｔＲＮＡｐｙｌが野生型細胞よりはるかに高いバックグラウンドアンバーサプレッションレベルを生じさせることを示唆している。アンバーサプレッションに関連する毒性が様々な系について文献に報告され、大部分が、通常アンバーコドンで終結する必須遺伝子の伸長が原因であるとしている（Ｌｉｅｂｍａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ １９７６；Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６）。現在では、これらの遺伝子の、その天然の終止点を越えた伸長が、これらのタンパク質の機能を変化させ、低下させ、又は消失させ得ると考えられている。最後に、アンバーサプレッションが細胞分裂抑制効果をもたらしたかどうかを決定するため、１０００個のＨＥＫ２９３ ｃ１８細胞を９６ウェルプレートに播き、ｐＣＥＰ４−ｐｙｌＲＳ及びｐＯｒｉＰ−９ｘｔＲＮＡコンストラクトを一過性にトランスフェクトした。５ｍＭで開始して０．０８ｍＭに至るｎｎＡＡ（ＡＬＯＣ）の滴定量を含むＤＭＥＭ−Ｃ培地で細胞を成長させた。細胞生存能力を、トランスフェクション時点、及び５日間成長させた後に、ＭＴＳ比色アッセイ（ａｓｓｙ）を用いてアッセイした（図４Ｄ）。データは、低濃度のｎｎＡＡであっても細胞分裂抑制効果（ｃｙｔｏｔｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）が生じたことを示している。現在の仮説に基づけば、アンバーサプレッションに関連する毒性はこの系に固有であり、回避することはできない。従って、ｔＲＮＡｐｙｌ及びＰｒｙｌＲＳを含むプラットフォーム細胞株は、細胞当たりに産生されるタンパク質の量で測るときに高い生産性を要求するタンパク質ベースの薬物の製造には好適でない。
しかしながら本発明者らは、アンバーコドンを含む標的タンパク質をトランスフェクトし、続いて選択すると、細胞が非トランスフェクト細胞に特有の紡錘形の扁平な外観を回復し、成長速度の向上を示したことを観察した（図４Ｅ）。
これは、高レベルのメッセージ含有アンバーコドンの存在がバックグラウンドアンバーサプレッションを吸収し、必須遺伝子に対する影響を抑えることを示唆している。従って、細胞株の構築には、極めて高機能のアンバー抑制細胞の単離を可能にし得るアンバーコドンを含む既存の高発現標的が必要であり得る。
実施例３−アンバーサプレッション関連毒性の緩和技術
アンバーサプレッションに関連する毒性から、本発明者らは、高活性のアンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら発現細胞株の樹立中のこの毒性を緩和する代替的な手法を企図した。
アンバーサプレッションに関連する毒性から、本発明者らは、高活性のアンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら発現細胞株の樹立中のこの毒性を緩和する代替的な手法を企図した。
「標的先行」手法
高活性のアンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら安定発現細胞株の樹立中に観察される毒性を緩和する一つの手法は、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡを導入する前に、アンバーコドンを含む高発現標的遺伝子を導入する必要がある。この遺伝子からの高レベルのメッセージが、細胞内で利用可能な活性化ｐｙｌｔＲＮＡに関して内在性遺伝子発現と有効に競合し、従って細胞の機能的機構に対する影響が低下する。これを行うため、真核生物発現宿主細胞に、発現を目的とした、且つベクターｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングされたＩｇＧなどの１つ以上のアンバー終止コドンを含む遺伝子をトランスフェクトする。トランスフェクト細胞は、ＨＴ不含培地及びＨＴ不含且つ１０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭ ＭＴＸ添加培地におけるその抵抗性及び成長能力によって選択される。生存細胞は１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに移すことによりクローニングし、ウェルに定着させる。次にウェルをＥＬＩＳＡによってアッセイし、高力価のトランケート抗体を含むウェルを同定する。このために、ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の抗原（例えば、１ｕｇ ３ｘＦＬＡＧ−ＩＬ−６−Ａｖｏｒ ０．５ｕｇ／ｍＬ Ｈｅｒ２細胞外ドメイン）により４Ｃで１時間又は一晩コーティングする。１０％ヤギ血清又は１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄及びブロックした後、１０％ヤギ血清又は３５ｕｌの１％脱脂乳を含有する４０ｕｌのＰＢＳ及び１０ｕｌの発現培地を適切なウェルに室温で１時間加える。ウェルを水で数回洗浄し、５０ｕｌの１：４，０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（抗ヒトκ−ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を各ウェルに室温で１時間加える。次にウェルを洗浄し、各ウェルに５０ｕｌのＳｕｒｅｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ）を添加する。５〜１０分後、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を停止させ、プレートリーダーを４５０ｎＭ波長で使用して色の生成を定量化する。既知の濃度の対照ＩｇＧを使用して標準曲線を作成する。高レベルのトランケート型ＩｇＧを発現した細胞を含むウェルを増殖させて拡大する。
高活性のアンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら安定発現細胞株の樹立中に観察される毒性を緩和する一つの手法は、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡを導入する前に、アンバーコドンを含む高発現標的遺伝子を導入する必要がある。この遺伝子からの高レベルのメッセージが、細胞内で利用可能な活性化ｐｙｌｔＲＮＡに関して内在性遺伝子発現と有効に競合し、従って細胞の機能的機構に対する影響が低下する。これを行うため、真核生物発現宿主細胞に、発現を目的とした、且つベクターｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングされたＩｇＧなどの１つ以上のアンバー終止コドンを含む遺伝子をトランスフェクトする。トランスフェクト細胞は、ＨＴ不含培地及びＨＴ不含且つ１０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭ ＭＴＸ添加培地におけるその抵抗性及び成長能力によって選択される。生存細胞は１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに移すことによりクローニングし、ウェルに定着させる。次にウェルをＥＬＩＳＡによってアッセイし、高力価のトランケート抗体を含むウェルを同定する。このために、ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の抗原（例えば、１ｕｇ ３ｘＦＬＡＧ−ＩＬ−６−Ａｖｏｒ ０．５ｕｇ／ｍＬ Ｈｅｒ２細胞外ドメイン）により４Ｃで１時間又は一晩コーティングする。１０％ヤギ血清又は１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄及びブロックした後、１０％ヤギ血清又は３５ｕｌの１％脱脂乳を含有する４０ｕｌのＰＢＳ及び１０ｕｌの発現培地を適切なウェルに室温で１時間加える。ウェルを水で数回洗浄し、５０ｕｌの１：４，０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（抗ヒトκ−ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を各ウェルに室温で１時間加える。次にウェルを洗浄し、各ウェルに５０ｕｌのＳｕｒｅｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ）を添加する。５〜１０分後、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を停止させ、プレートリーダーを４５０ｎＭ波長で使用して色の生成を定量化する。既知の濃度の対照ＩｇＧを使用して標準曲線を作成する。高レベルのトランケート型ＩｇＧを発現した細胞を含むウェルを増殖させて拡大する。
ｎｎＡＡの導入用の機能性エレメントを導入し、逐次的に、或いは同時に選択する。一例では、標的遺伝子の高発現を示す細胞に、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡの遺伝子を含むｐＭＯＡＶ２又はｐＭＯＡＶ２ｐｕｒｏをトランスフェクトする。２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭでトランスフェクト細胞を選択する。生存細胞を増殖させ、この集団からの１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種する。細胞が拡大してコロニーを形成したら、細胞を２ｍＭのｎｎＡＡに曝露し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて機能アッセイすることにより、４０％又は５０％より高い又は好ましくは６０又は８０％又は９０％より高いアンバーサプレッション効率を有するクローンを同定する。完全長ＩｇＧ発現を定量化するため、ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｕｇ／ｍＬ抗ヒトＦＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）抗体により４Ｃで１時間又は一晩コーティングする。１０％ヤギ血清含有ＰＢＳ中で洗浄及びブロックした後、４０ｕｌの１０％ヤギ血清含有ＰＢＳ及び１０ｕｌの発現培地を適切なウェルに室温で１時間加える。ウェルを水で数回洗浄し、５０ｕｌの１：１０，０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲート二次抗体（抗ヒトＨ＋Ｌ−ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を各ウェルに室温で１時間加える。次にウェルを洗浄し、各ウェルに５０ｕｌのＳｕｒｅｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ）を添加する。５〜１０分後、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を停止させ、プレートリーダーを４５０ｎＭ波長で使用して色の生成を定量化する。既知の濃度の対照ＩｇＧを使用して標準曲線を作成する。このアッセイは完全長ＩｇＧの発現レベルを決定する。トランケート型ＩｇＧレベルを決定するため、ＥＬＩＳＡプレートを抗原、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１ｕｇ／ｍＬ ３ｘＦＬＡＧ−ＩＬ−６−Ａｖｏｒ ０．５ｕｇ／ｍＬ Ｈｅｒ２細胞外ドメインにより４Ｃで１時間又は一晩コーティングする。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄及びブロックした後、３５ｕｌの０．１％脱脂乳含有ＰＢＳ及び１５ｕｌの発現培地を適切なウェルに室温で１時間加える。ウェルを水で数回洗浄し、５０ｕｌの１：１０，０００希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲート二次抗体（抗ヒト κ−ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を各ウェルに室温で１時間加える。次にウェルを洗浄し、各ウェルに５０ｕｌのＳｕｒｅｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ）を添加する。５〜１０分後、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色を停止させ、プレートリーダーを４５０ｎＭ波長で使用して色の生成を定量化する。既知の濃度の対照ＩｇＧを使用して標準曲線を作成する。各ウェルにおけるトランケート型ＩｇＧと完全長ＩｇＧとの比を決定し、完全長ＩｇＧレベルが全産生ＩｇＧの少なくとも２５又は５０％、好ましくは４０〜６０％又は８０〜９０％又はそれ以上である高いアンバーサプレッション活性を示すウェルを増殖させた。
必要であれば、これらの選択された細胞プールにさらなるｔＲＮＡ遺伝子を導入してアンバーサプレッションの有効性をさらに改善し得る。これを行うため、ｐＳＢ−９ｘｔＲＮＡ−ＭＡＲＳ発現カセットをこれらの細胞にトランスフェクトし、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有し、５ｕｇ／ｍＬブラストサイジン（ｂａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＢＳＤ）か、或いは、８ｍＭグルタミン、０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシン及び５ｕｇ／ｍｌブラストサイジンを含有するＰｒｏＣＨＯ４（Ｌｏｎｚａ）若しくは等価な培地（ＰｒｏＣＨＯ４−ＢＳＤ）で抗生物質耐性によってトランスフェクタントを選択する。最も高いｔＲＮＡ活性を有する細胞を、上記に記載するＥＬＩＳＡアッセイを用いて選択し、ｎｎＡＡに曝露した細胞における完全長ＩｇＧ及びトランケート型ＩｇＧの産生収率を決定する。親細胞と比べて完全長ＩｇＧとトランケート型ＩｇＧとの比の改善を示す細胞を増殖させる。さらなるｔＲＮＡ遺伝子の挿入が必要な場合、このプロセスをｐＳＺ−９ｘｔＲＮＡで上記に記載したとおり繰り返し、細胞を５ｕｇ／ｍＬゼオシンを含有する培地で選択し、続いて機能選択スクリーニングを行う。
「デコイタンパク質」手法
高活性アンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら安定発現細胞株の樹立中に観察される毒性を緩和するための代替的な手法には、高レベルで発現するアンバーコドンを含むサロゲート遺伝子の導入が関わり、この発現が誘導性プロモーターによって駆動されることにより、標的遺伝子が発現する間のその発現の下方制御が可能となる。これには、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ直交性機構を発現する安定細胞株を作成し、それを使用して複数の標的を修飾できるという利点がある。これを行うため、ＣＨＯ細胞などの真核生物発現宿主細胞に、発現を目的とする遺伝子であって、誘導性プロモーター、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ ３Ｇ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）、Ｔ−Ｒｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、エクジソン誘導性、又はステロイド誘導性プロモーターなどを好ましくは含む哺乳類発現ベクターにクローニングされた、限定はされないがＧＦＰ、ｅＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ｂ−ミクログロブリン、又はＢ−ガラクトシドなどの１つ以上のアンバー終止コドンを含む遺伝子をトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、適切な抗生物質を含有する培地におけるその抵抗性及び成長能力によって選択する。生存細胞は１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに移すことによりクローニングし、ウェルに定着させる。次にウェルをＥＬＩＳＡアッセイによりアッセイし、高力価のトランケート型タンパク質を含むウェルを同定する。１つ以上のアンバーコドンを含む高発現のサロゲートタンパク質は、アンバーサプレッション活性を吸収して細胞をアンバーサプレッションの有害作用から保護するアンバーシンクとして機能し得る。ｎｎＡＡの導入用の、Ｕ６−ｔＲＮＡカセット及びｐｙｌＲＳ遺伝子などの機能性エレメントを宿主細胞に導入し、逐次的に、或いは同時に選択する。一例において、サロゲート標的遺伝子の高発現を示す細胞に、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡの遺伝子を含むｐＭＯＡＶ２又はｐＭＯＡＶ２ｐｕｒｏをトランスフェクトする。２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭでトランスフェクト細胞を選択する。生存細胞を増殖させて、この集団からの１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種する。細胞が拡大してコロニーを形成したら、細胞を２ｍＭのｎｎＡＡに曝露し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて機能アッセイすることにより、レポータータンパク質（ｅＧＦＰＹ４０）又はサロゲート標的タンパク質を使用して４０％又は５０％より高い又は好ましくは４０〜６０％又は８０又は９０％より高いアンバーサプレッション効率を有するクローンを同定する。限界希釈クローニング又は細胞分取によって高機能クローンを単離する。次にこれらの細胞に、タンパク質治療薬をコードする遺伝子を導入し、選択する。高発現クローンを単離し、ＥＬＩＳＡアッセイにより同定する。次に高発現クローンをアンバーサプレッションの有効性に関してスクリーニングする。各ウェルにおけるトランケート型タンパク質と完全長タンパク質との比を決定し、高いアンバーサプレッション活性を示すウェル、ｎｎＡＡを含む完全長タンパク質の少なくとも４０％又は５０％、しかし好ましくは４０〜６０％又は８０〜９０％又はそれ以上のアンバーサプレッションレベルを示すクローンを増殖させる。
高活性アンバーサプレッサー細胞の単離を可能にしながら安定発現細胞株の樹立中に観察される毒性を緩和するための代替的な手法には、高レベルで発現するアンバーコドンを含むサロゲート遺伝子の導入が関わり、この発現が誘導性プロモーターによって駆動されることにより、標的遺伝子が発現する間のその発現の下方制御が可能となる。これには、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ直交性機構を発現する安定細胞株を作成し、それを使用して複数の標的を修飾できるという利点がある。これを行うため、ＣＨＯ細胞などの真核生物発現宿主細胞に、発現を目的とする遺伝子であって、誘導性プロモーター、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ ３Ｇ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ）、Ｔ−Ｒｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、エクジソン誘導性、又はステロイド誘導性プロモーターなどを好ましくは含む哺乳類発現ベクターにクローニングされた、限定はされないがＧＦＰ、ｅＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ｂ−ミクログロブリン、又はＢ−ガラクトシドなどの１つ以上のアンバー終止コドンを含む遺伝子をトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、適切な抗生物質を含有する培地におけるその抵抗性及び成長能力によって選択する。生存細胞は１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに移すことによりクローニングし、ウェルに定着させる。次にウェルをＥＬＩＳＡアッセイによりアッセイし、高力価のトランケート型タンパク質を含むウェルを同定する。１つ以上のアンバーコドンを含む高発現のサロゲートタンパク質は、アンバーサプレッション活性を吸収して細胞をアンバーサプレッションの有害作用から保護するアンバーシンクとして機能し得る。ｎｎＡＡの導入用の、Ｕ６−ｔＲＮＡカセット及びｐｙｌＲＳ遺伝子などの機能性エレメントを宿主細胞に導入し、逐次的に、或いは同時に選択する。一例において、サロゲート標的遺伝子の高発現を示す細胞に、ｐｙｌＲＳ及びｐｙｌｔＲＮＡの遺伝子を含むｐＭＯＡＶ２又はｐＭＯＡＶ２ｐｕｒｏをトランスフェクトする。２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン又は７．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭでトランスフェクト細胞を選択する。生存細胞を増殖させて、この集団からの１〜５０細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種する。細胞が拡大してコロニーを形成したら、細胞を２ｍＭのｎｎＡＡに曝露し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて機能アッセイすることにより、レポータータンパク質（ｅＧＦＰＹ４０）又はサロゲート標的タンパク質を使用して４０％又は５０％より高い又は好ましくは４０〜６０％又は８０又は９０％より高いアンバーサプレッション効率を有するクローンを同定する。限界希釈クローニング又は細胞分取によって高機能クローンを単離する。次にこれらの細胞に、タンパク質治療薬をコードする遺伝子を導入し、選択する。高発現クローンを単離し、ＥＬＩＳＡアッセイにより同定する。次に高発現クローンをアンバーサプレッションの有効性に関してスクリーニングする。各ウェルにおけるトランケート型タンパク質と完全長タンパク質との比を決定し、高いアンバーサプレッション活性を示すウェル、ｎｎＡＡを含む完全長タンパク質の少なくとも４０％又は５０％、しかし好ましくは４０〜６０％又は８０〜９０％又はそれ以上のアンバーサプレッションレベルを示すクローンを増殖させる。
必要であれば、すぐ上で考察したとおりアンバーサプレッションの有効性をさらに改善するためこれらの選択された細胞プールにさらなるｔＲＮＡ遺伝子を導入し得る。
「抑制性ｔＲＮＡ」手法
ｔＲＮＡ発現レベルを調節し、ｔＲＮＡ関連細胞傷害性を緩和するため、代替的な戦略が設計されている。これを行うため、ｔＲＮＡ発現に必須のＵ６又はＨ１などのプロモーターエレメントが、ＴｅｔＯリプレッサーエレメントなど、遺伝子発現の抑制を可能にする配列エレメントを含むように修飾される。これにより、成長段階におけるｔＲＮＡ発現の下方制御及び標的遺伝子が発現する間のｔＲＮＡ発現の誘導が可能となる。
ｔＲＮＡ発現レベルを調節し、ｔＲＮＡ関連細胞傷害性を緩和するため、代替的な戦略が設計されている。これを行うため、ｔＲＮＡ発現に必須のＵ６又はＨ１などのプロモーターエレメントが、ＴｅｔＯリプレッサーエレメントなど、遺伝子発現の抑制を可能にする配列エレメントを含むように修飾される。これにより、成長段階におけるｔＲＮＡ発現の下方制御及び標的遺伝子が発現する間のｔＲＮＡ発現の誘導が可能となる。
「デコイアミノ酸」手法
バックグラウンドアンバーサプレッションの効果を調節する代替的な戦略が、ｐｙｌＲＳによって認識され且つｔＲＮＡｐｙｌに対して活性化されるが、しかしペプチド結合の形成は許容しないように修飾されたアミノ酸類似体を導入することにより設計されている。ｔＲＮＡｐｙｌに対するこのデコイアミノ酸の活性化は、宿主ＲＳ又はｐｙｌＲＳによる天然のアミノ酸活性化と有効に競合し、デコイアミノ酸活性化ｔＲＮＡの細胞プールを生じる。このプールはまた、アンバーコドンに関して誤ってアシル化されたｔＲＮＡｐｙｌとも競合し得る。従ってデコイアミノ酸活性化ｔＲＮＡのプールは、アンバー終止コドンにおけるタンパク質合成の通常の終結を可能にする。プラットフォーム細胞株を構築する過程では、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞などの細胞を、デコイアミノ酸を含有する培地で成長させ、ｔＲＮＡ及びｐｙｌＲＳをコードする遺伝子をこれらの細胞に安定に組み込む。適切な抗生物質を含有する培地で成長させることによりトランスフェクト細胞を選択し、生存細胞を拡大する。このプールに、ｅＧＦＰＹ４０をコードするベクターを一過性にトランスフェクトし、ペプチド結合の形成を許容してアンバーコドンのリードスルーを可能にするｎｎＡＡを含有し且つデコイアミノ酸を欠く培地で細胞を成長させる。次にｅＧＦＰＹ４０レポーターの発現レベルによって高機能細胞を同定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用したフローサイトメトリーを用いて細胞を単離し得る。分取細胞を拡大し、利用可能なレポーター（例えばｅＧＦＰＹ４０又はＦＧＦ２１−１３１ａｍｂ）を使用してこの分取後プールにおけるアンバーサプレッションの有効性を測る。必要であれば、反復的なｔＲＮＡ又はｐｙｌＲＳ遺伝子の付加及びフローサイトメトリーを用いた選択を実施して、アンバーサプレッションの効率を高めることができる。次にプラットフォーム細胞に、アンバーコドンを含む、望ましい抗原に特異的なＩｇＧなどの標的遺伝子を、Ｏｐｔｉｖｅｃプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター又はグルタミン合成酵素遺伝子を含むプラスミド（Ｌｏｎｚａ）でトランスフェクトして、遺伝子発現選択を可能にする。高レベルのトランケート型タンパク質を発現する細胞を、適切な選択下、それぞれメトトレキサート又はメチオニンスルホキシミン下で成長させて、高発現細胞を選択する。限界細胞希釈を用いてクローンを単離し、効率的なアンバーサプレッション及び高発現収率が可能な細胞をＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定する。
バックグラウンドアンバーサプレッションの効果を調節する代替的な戦略が、ｐｙｌＲＳによって認識され且つｔＲＮＡｐｙｌに対して活性化されるが、しかしペプチド結合の形成は許容しないように修飾されたアミノ酸類似体を導入することにより設計されている。ｔＲＮＡｐｙｌに対するこのデコイアミノ酸の活性化は、宿主ＲＳ又はｐｙｌＲＳによる天然のアミノ酸活性化と有効に競合し、デコイアミノ酸活性化ｔＲＮＡの細胞プールを生じる。このプールはまた、アンバーコドンに関して誤ってアシル化されたｔＲＮＡｐｙｌとも競合し得る。従ってデコイアミノ酸活性化ｔＲＮＡのプールは、アンバー終止コドンにおけるタンパク質合成の通常の終結を可能にする。プラットフォーム細胞株を構築する過程では、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞などの細胞を、デコイアミノ酸を含有する培地で成長させ、ｔＲＮＡ及びｐｙｌＲＳをコードする遺伝子をこれらの細胞に安定に組み込む。適切な抗生物質を含有する培地で成長させることによりトランスフェクト細胞を選択し、生存細胞を拡大する。このプールに、ｅＧＦＰＹ４０をコードするベクターを一過性にトランスフェクトし、ペプチド結合の形成を許容してアンバーコドンのリードスルーを可能にするｎｎＡＡを含有し且つデコイアミノ酸を欠く培地で細胞を成長させる。次にｅＧＦＰＹ４０レポーターの発現レベルによって高機能細胞を同定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用したフローサイトメトリーを用いて細胞を単離し得る。分取細胞を拡大し、利用可能なレポーター（例えばｅＧＦＰＹ４０又はＦＧＦ２１−１３１ａｍｂ）を使用してこの分取後プールにおけるアンバーサプレッションの有効性を測る。必要であれば、反復的なｔＲＮＡ又はｐｙｌＲＳ遺伝子の付加及びフローサイトメトリーを用いた選択を実施して、アンバーサプレッションの効率を高めることができる。次にプラットフォーム細胞に、アンバーコドンを含む、望ましい抗原に特異的なＩｇＧなどの標的遺伝子を、Ｏｐｔｉｖｅｃプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター又はグルタミン合成酵素遺伝子を含むプラスミド（Ｌｏｎｚａ）でトランスフェクトして、遺伝子発現選択を可能にする。高レベルのトランケート型タンパク質を発現する細胞を、適切な選択下、それぞれメトトレキサート又はメチオニンスルホキシミン下で成長させて、高発現細胞を選択する。限界細胞希釈を用いてクローンを単離し、効率的なアンバーサプレッション及び高発現収率が可能な細胞をＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定する。
実施例４：ｎｎＡＡ組込みを可能にするための標的タンパク質の修飾
ベクターｐＴｒａｃｅｒ Ｈｉｓ ＥＦ／ＨＩＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における緑色蛍光タンパク質−ブラストサイジン融合物のＯＲＦにアンバーコドンを導入してＧＦＰＹ４０レポーターコンストラクトを作成した。簡潔に言えば、部位特異的突然変異誘発を用いてＧＦＰ ＯＲＦの＋１２０位（ここでは＋１が開始コドンのＡである）の単一のヌクレオチドをシトシンからグアニンに変えることにより、インフレームのアンバー終止コドンを作成した。
ベクターｐＴｒａｃｅｒ Ｈｉｓ ＥＦ／ＨＩＳＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における緑色蛍光タンパク質−ブラストサイジン融合物のＯＲＦにアンバーコドンを導入してＧＦＰＹ４０レポーターコンストラクトを作成した。簡潔に言えば、部位特異的突然変異誘発を用いてＧＦＰ ＯＲＦの＋１２０位（ここでは＋１が開始コドンのＡである）の単一のヌクレオチドをシトシンからグアニンに変えることにより、インフレームのアンバー終止コドンを作成した。
重複オリゴマー及びＰＣＲを使用した遺伝子合成によりＦＧＦ２１ ＯＲＦを作成し、追加のアミノ末端３ｘ Ｆｌａｇタグ（ｄｙｋｄｈｄｇｄｙｋｄｈｄｉｄｙｋｄｄｄｄｋｓをコードする）を含む配列番号６１、ヌクレオチド配列；配列番号６２ アミノ酸配列）に示されるとおりのヒトＦＧＦ２１の配列を再構成した（３ｘＦＬＡＧ−ＦＧＦ２１、配列番号８０）。このコンストラクトをｐＪ２０１シャトルベクターにクローニングし、ＨｉｎＤＩＩＩ及びＸｈｏＩを使用した制限酵素消化及びライゲーションによりｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。得られたコンストラクトはＦＧＦ２１のＯＲＦを哺乳類細胞で発現させるためＣＭＶプロモーターの下流及びその制御下に置いた。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によってＦＧＦ２１ ＯＲＦのＦ１２位（配列番号６６）、Ｌ６６位（配列番号６８）、Ｐ９０位（配列番号７０）、Ｒ１３１位（配列番号６４）、及びＰ１４０位（配列番号７１）に導入した。二段階ＰＣＲ増幅スキームを使用することにより、重複オリゴマーを使用して３ｘＦＬＡＧタグを６ｘＨｉｓタグに置き換えた。簡潔に言えば、１つはＣＭＶプロモーターを増幅し、２つ目はＦＧＦ２１ ＯＲＦを増幅する且つ５’６ｘＨｉｓタグとインフレームの２つのＰＣＲ反応をセットアップした。次に第３のＰＣＲ反応で隣接オリゴマーを使用してＣＭＶプロモーターを６ｘＨｉｓ−ＦＧＦ２１コンストラクトにつなぎ合わせた。産物をＧａｔｅｗａｙによりｐＤＯＮＲ ２２１ Ｐ４ｒ−Ｐ３ｒベクターにクローニングして６ｘＨＩＳ−ＦＧＦ２１ ｗｔ及び６ｘＨＩＳ−ＦＧＦ２１ Ｒ１３１の両方を作成した。
ＩＬ−６に対する抗体を、ｎｎＡＡの組込み及び続くそのコンジュゲーションが可能となるように修飾した。この分子を作成するため、ヒトサイトカインＩＬ−６に特異的なウサギ抗体の可変領域を、ＰＣＲ増幅（国際公開第１２０３２１８１号パンフレットを参照）及びベクターｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（重鎖）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）へのクローニングによりヒトフレームワークにグラフトし、ウサギ−ヒトハイブリッドを作成した。ＩＬ−６ ＣＤＲに隣接してさらなる突然変異もまた組み込み、抗体をヒト化した。得られたベクター対ｐＦｕｓｅ−２８Ｄ２γ及びｐＦＵＳＥ−２８Ｄ２κは、一過性トランスフェクションによる抗ＩＬ−６ ＩｇＧのコトランスフェクション及び発現に役立つ。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によって所望の部位に導入することによりｎｎＡＡの組込み部位を作成し、配列決定により突然変異体をスクリーニングした。これにより、部位２７４にアンバーコドンを含む重鎖クローン（ｐＦｕｓｅ−２８Ｄ２γ＿Ｋ２７４ａｍ）（配列番号４１）が得られた。重鎖コンストラクト及び軽鎖コンストラクトのコトランスフェクションにより、抗ＩＬ−６抗体の発現が可能となる。抗ＩＬ−６ ＩｇＧ重鎖（Ｋ２７４位にアンバーを含む）を含む組込みコンストラクトを、ＴＯＰＯクローニングによりｐＯｐｔｉｖｅｃにクローニングした。軽鎖発現コンストラクトを、そのプロモーター及びポリＡ配列を含め、ＰＣＲ増幅し、ｔＲＮＡの単一コピーを、重複オリゴマーを使用した二段階ＰＣＲ法によってつなぎ合わせ、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミド（ｐＯｔｉｖｅｃ−２８Ｄ２−ＧＫｔ）に利用可能な部位でクローニングした。これらの抗体の一過性発現及び安定発現を実施し、リシン−アジド、ＡＬＯＣ、プロパルギル−リシン及びリシン−塩化物ｎｎＡＡを組み込んだ。
発現及び精製
全ての実験について、タンパク質は安定細胞株（実施例１）から単離した。或いは、一過性にトランスフェクトした細胞株を利用した。ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞を約９０％コンフルエンスになるように播き、３７Ｃで成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め処理した適切なＤＮＡと共に具体的な製造者の指示に従いインキュベートした。ｎｎＡＡ、ＡＬＯＣ、Ｌｙｓ−アジド、プロパルギルリシン又はＬｙｓ−塩化物）の存在下で２〜５日間成長させた後、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を適切な方法により精製した。ＩｇＧの発現のため、低ＩｇＧウシ胎仔血清を含有する培地で細胞を成長させた。安定にトランスフェクトされた細胞株をフラスコに接着させて９０％コンフルエンスになるまで成長させて、ｎｎＡＡ（以下から選択される：ＡＬＯＣ（Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）、ｌｙｓアジド、プロパルギルリシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１））に５〜７日間曝露し、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を適切な方法により精製した。ＩｇＧの発現のため、低ＩｇＧウシ胎仔血清を含有する培地で細胞を成長させた。
全ての実験について、タンパク質は安定細胞株（実施例１）から単離した。或いは、一過性にトランスフェクトした細胞株を利用した。ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞を約９０％コンフルエンスになるように播き、３７Ｃで成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め処理した適切なＤＮＡと共に具体的な製造者の指示に従いインキュベートした。ｎｎＡＡ、ＡＬＯＣ、Ｌｙｓ−アジド、プロパルギルリシン又はＬｙｓ−塩化物）の存在下で２〜５日間成長させた後、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を適切な方法により精製した。ＩｇＧの発現のため、低ＩｇＧウシ胎仔血清を含有する培地で細胞を成長させた。安定にトランスフェクトされた細胞株をフラスコに接着させて９０％コンフルエンスになるまで成長させて、ｎｎＡＡ（以下から選択される：ＡＬＯＣ（Ｎε−アリルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）、ｌｙｓアジド、プロパルギルリシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１））に５〜７日間曝露し、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を適切な方法により精製した。ＩｇＧの発現のため、低ＩｇＧウシ胎仔血清を含有する培地で細胞を成長させた。
ここに記載する発現したＩｇＧ、ｓｃＦｖ、又はＦＧＦ２１は、真核細胞の安定発現又は一過性発現の後に成長培地から精製した。いずれ場合も０．１容積の１０×ＰＢＳを発現上清に添加し、試料の塩及びｐＨを平衡化した。６ｘＨｉｓタグ標識タンパク質の精製のため、上清を４℃で１６、ＰＢＳに透析した。タンパク質をバッチ結合又は重力流によりニッケル−ＮＴＡ（Ｎｉｃｋｌｅ−ＮＴＡ）ビーズに結合させ、洗浄緩衝液（レシピ）で徹底的に洗浄した。結合した物質を（５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０〜５００ｍＭイミダゾール）で溶出させた。標的タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により同定した。ピーク画分をプールし、以降使用する前にＰＢＳで透析した。
ＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡潔に言えば、発現上清に０．１容積の１０×ＰＢＳを補足し、１ｍＬ又は５ｍＬプロテインＡセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ）に通した。結合した物質を５〜１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、３〜５容積の０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。続いて０．０５容積の２０×ＰＢＳを添加して中性ｐＨに至らせることにより、画分を中和した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって分析し、ピークタンパク質画分をプールして、ＰＢＳに４℃で１６時間透析した。
この方法を使用して、以下を調製した：抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈ、ＮＮＡＡ（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓ−アルキン）を１３１位に含むように修飾されたＦＧＦ２１
実施例５：ｎｎＡＡ含有タンパク質のコンジュゲーション
ＮＮＡＡ Ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれた抗ＩＬ−６抗体の、２０ＫＰＥＧ末端アルキンによるペグ化（抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）
小型マグネチックスターラを備えた８×３０ｍｍガラスバイアルにＴＢＴＡのジクロロメタン溶液（８０ｍＭ、３．７５ｍＬ）を入れ、窒素をチューブに穏やかに吹き付けることにより溶媒を蒸発させた。これにリン酸緩衝液（１２５ｍＭ、ｐＨ＝７．４、５３ｕＬ）及び２０ＫＰＥＧアルキンの水溶液（３ｍＭ、３３ｕＬ）を添加した。抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈの溶液を添加し（０．４ｍｇ／ｍＬ、６．２６ｕＬ）、続いてシステイン（１００ｍＭ、２ｕＬ）及び硫酸銅（８０ｍＭ、１．９ｕＬ）の溶液を添加した。バイアルをアルゴンでブランケットし、キャップをして４時間穏やかに混合した。
小型マグネチックスターラを備えた８×３０ｍｍガラスバイアルにＴＢＴＡのジクロロメタン溶液（８０ｍＭ、３．７５ｍＬ）を入れ、窒素をチューブに穏やかに吹き付けることにより溶媒を蒸発させた。これにリン酸緩衝液（１２５ｍＭ、ｐＨ＝７．４、５３ｕＬ）及び２０ＫＰＥＧアルキンの水溶液（３ｍＭ、３３ｕＬ）を添加した。抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈの溶液を添加し（０．４ｍｇ／ｍＬ、６．２６ｕＬ）、続いてシステイン（１００ｍＭ、２ｕＬ）及び硫酸銅（８０ｍＭ、１．９ｕＬ）の溶液を添加した。バイアルをアルゴンでブランケットし、キャップをして４時間穏やかに混合した。
反応混合物の一部を取り出し（１５ｕＬ）、非還元ゲルロード緩衝液（４×、ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７．５ｕＬ）と混合した。分析のため全容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした（図５Ａ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、銅条件によりモノペグ化（ｍｏｎｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）及びビスペグ化（ｂｉｓ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）抗体種の混合物が得られたことを示した。ＰＤＳｉデンシトメトリーは約１：１の比のモノペグ化種を示した（モノ＝４７％、ビス＝５３％）。アジドを含まない抗体は同様の条件下で反応しなかったことから、アジドに対する特異性が示される。
小型マグネチックスターラを備えた８×３０ｍｍガラスバイアルに、リン酸緩衝液（１２５ｍＭ、ｐＨ＝７．４、６０ｕＬ）及び２０ＫＰＥＧシクロオクチン（二環式ノニン）の水溶液（３ｍＭ、３３ｕＬ）を入れた。抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈの溶液を添加し（０．４ｍｇ／ｍＬ、６．２６ｕＬ）、バイアルにキャップをして４時間穏やかに混合した。
反応混合物の一部を取り出し（１５ｕＬ）、非還元ゲルロード緩衝液（４×、ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７．５ｕＬ）と混合した。分析のため全容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析（図５Ｂ：レーン１：２０ＫＰＥＧシクロオクチンで処理した（抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）、レーン２：２０Ｋ ＰＥＧシクロオクチンで処理したアジドを含まない抗体、レーン３：抗体未処理）は、モノペグ化及びビスペグ化抗体種の混合物を示した。得られたゲルのデンシトメトリーは、出発物質が消費されたことと共に、モノペグ化抗体（１０％）とビスペグ化抗体（７６％）との混合物を示した。アジド含有抗体が、反応する唯一の種であった。
ＩＬ−６に対する抗体の活性を試験し、この抗体の修飾がこの抗体の結合特性を変化させたかどうかを決定するため、本発明者らは、インビトロＩＬ−６中和アッセイを確立した。これを行うため、ＩＬ−６依存性マウスＢ細胞ハイブリドーマ細胞（Ｂ９）を、９６ウェルプレート中の５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を含有する培地に播種した。種々の濃度の抗ＩＬ−６抗体及び対照を一連のウェルに添加し、３７℃で３日間成長させた。次に、細胞の健康を定量的に計測することが可能な比色アッセイであるａｌａｍａｒ ｂｌｕｅを用いて細胞の生存能力を決定した。簡潔に言えば、２５ｕＬの試薬を各ウェルに添加し、細胞を８〜１６時間継続的に成長させる。インキュベーション後、パネルを５７０ｎｍ及び６００ｎｍ波長の分光光度法で読み取る。対応する抗体濃度に対する吸光度計測値をプロットする。データは、裸の非修飾抗体と比較して、抗ＩＬ−６抗体の部位特異的なペグ化によっては抗体の機能特性は低下しないことを示している。
ＩＬ−６阻害アッセイ（図８Ｃ）。ＩＬ−６に対する抗体の活性を試験するため、ＩＬ−６中和アッセイを使用した。ＩＬ−６依存性Ｂ９細胞を、９６ウェルプレート中の５０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を含有する培地に播種した。種々の濃度の抗ＩＬ−６抗体及び対照を一連のウェルに添加し、３７℃で３日間成長させた。ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅを使用して細胞の生存能力を決定した。簡潔に言えば、２５ｕＬの試薬を各ウェルに添加し、細胞を８〜１６時間継続的に成長させる。インキュベーション後、パネルを５７０ｎｍ及び６００ｎｍ波長の分光光度法で読み取る。対応する抗体濃度に対する吸光度計測値をプロットする。
ヒトサイトカインＩＬ２３に対するｓｃＦｖの作成を、所望の部位におけるアジド−ホモアラニンの部位特異的組込みを可能にする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系を使用して作成した。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のメチオニン栄養要求株（Ｂ８３４）を、ｈＩＬ２３に対するｓｃＦｖをコードする発現プラスミド（国際公開第２０１２／０３２１８１号パンフレット、参照により本明細書に援用される）で形質転換した。このｓｃＦｖ遺伝子は、翻訳後に切断される開始因子メチオニンと分子のＣ末端にあるメチオニンとの２つのメチオニンのみをコードする。形質転換細胞を富栄養培地で発酵させて培養物を成長させ、培養物は成長プラトーに達した。この時点で細胞をＩＰＴＧで誘導することによりｓｃＦｖの発現の抑制を解除し、培地にＡＨＡを補足した。次に細胞をさらに４時間成長させて、遠心により細菌細胞を回収した。発現したｓｃＦｖを封入体から精製し、インビトロで折り畳んだ。発現したｓｃＦｖは、アルキン含有部分によるコンジュゲーションを可能にするアジド含有アミノ酸を含む。二重特異性抗体コンストラクトを作成するため、抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈをビスアルキンＰＥＧ部分で抗ＩＬ２３ ｓｃＦｖにライゲートした（国際公開第２０１２／０３２１８１号パンフレット、参照により本明細書に援用される）。これを行うため、小型マグネチックスターラを備えた８×３０ｍｍガラスバイアルにリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、８０ｕＬ）を入れた。抗ＩＬ−６−Ｌｙｓアジド２７４ｈの溶液を添加し（０．４ｍｇ／ｍＬ、６．３ｕＬ）、続いて、−２０ＫＰＥＧアルキン（１ｍｇ／ｍＬ、２．１ｕＬ）に予めコンジュゲートした抗ＩＬ２３ ｓｃＦｖの溶液を添加した。この溶液に、ＢＭＥの溶液（１００ｍＭ、３ｕＬ）及び硫酸銅の溶液（８０ｍＭ、２．８１ｕＬ）を添加した。混合物を４時間撹拌させておいた。
反応混合物の一部を取り出し（１５ｕＬ）、非還元ゲルロード緩衝液（４×、ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、７．５ｕＬ）と混合した。分析のため全容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。抗体バンドの上側にある新規のより高分子のバンドから明らかなとおり、極めて少量の二重特異性抗体が産生された（図６Ａ）。
還元ゲルに関しては、反応混合物の一部を取り出し（１５ｕＬ）、還元ゲルロード緩衝液（４×、ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３０％ＢＭＥ、７．５ｕＬ）と混合した。分析のため全容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。予想された分子量変化と一致した、重鎖バンドの上側にある新規のより高分子のバンドから明らかなとおり、極めて少量の二重特異性抗体が産生された（図６Ｂ）。
２０Ｋ線状ＰＥＧビスアジドによるＦＧＦ−２１（ＮＮＡＡ Ｌｙｓ−アルキンを含むように修飾されている）のペグ化
全ての実験について、標準的なトランスフェクション条件を用いた。簡潔に言えば、先に安定ｐｙｌＲＳ発現に関して選択した２９３細胞のクローンを約９０％コンフルエンスになるように播き、３７℃で１６時間成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と予め組み合わせた６ｘＨＩＳ−ＦＧＦ２１ Ｒ１３１で具体的な製造者の指示に従い処理した。次に細胞を、２ｍＭプロパルギル−リシンｎｎＡＡを含有するＤＭＥＭ完全（ＤＭＥＭ、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、１０％ウシ胎仔血清）培地で５〜７日間成長させた。成長培地を回収し、５ｍＬ充填済みニッケル−ＮＴＡカラム（ＧＥ）でのアフィニティークロマトグラフィーによりＦＧＦ２１を精製した。
全ての実験について、標準的なトランスフェクション条件を用いた。簡潔に言えば、先に安定ｐｙｌＲＳ発現に関して選択した２９３細胞のクローンを約９０％コンフルエンスになるように播き、３７℃で１６時間成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と予め組み合わせた６ｘＨＩＳ−ＦＧＦ２１ Ｒ１３１で具体的な製造者の指示に従い処理した。次に細胞を、２ｍＭプロパルギル−リシンｎｎＡＡを含有するＤＭＥＭ完全（ＤＭＥＭ、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸、１０％ウシ胎仔血清）培地で５〜７日間成長させた。成長培地を回収し、５ｍＬ充填済みニッケル−ＮＴＡカラム（ＧＥ）でのアフィニティークロマトグラフィーによりＦＧＦ２１を精製した。
発現した６ｘＨＩＳ−ＦＧＦ２１を成長培地から精製した。ここでは０．１容積の１０×ＰＢＳを発現上清に添加し、試料の塩及びｐＨを平衡化した。そして培地を４℃で１６、ＰＢＳに透析した。発現したＦＧＦ２１をニッケル−ＮＴＡビーズ（ＧＥ）にバッチ結合又は重力流により結合させ、洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で徹底的に洗浄した。結合した物質をＮｉＮＴＡ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０〜５００ｍＭイミダゾール）で溶出した。標的タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により同定した。ピーク画分をプールし、以降使用する前にＰＢＳで透析した。
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、ＮＮＡＡ（Ｓ）−２−アミノ−６（（プロパ−２−イニルオキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸（Ｌｙｓ−アルキン）を１３１位に含むように修飾されたＦＧＦ２１（配列番号６４）の溶液（２０ｕｇ／ｍＬ、０．００１ｍＭ、５０００ｕＬ）を入れた。これに２０Ｋ線状ＰＥＧビス−アジドの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．６７ｍＬ）を添加した。ＳＤＳの溶液（２０％、２５０ｕＬ）及びＤＴＴの溶液（２５０ｍＭ、６０ｕＬ）を添加した。ＴＢＴＡのＤＭＳＯ溶液（８０ｍＭ、７．９６ｕＬ）及び硫酸銅の水溶液（８０ｍＭ、９４ｕＬ）。バイアルにキャップをし、反応物を一晩撹拌させておいた。混合物を遠心し（１００００ｇ、１５ｍｉｎ）、上清を取り置いた。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、明確な分子量シフトが観察され、これは２０ｋＤａ ＰＥＧとポリペプチドのコンジュゲーションと一致した（図７Ａ）。
ペグ化ＦＧＦ２１コンストラクトの効力を評価するため、肥満ｄｂ／ｄｂマウスを毎日０．２５ｍｇ／Ｋｇ ＦＧＦ２１又は２０Ｋ ＰＥＧ−ＦＧＦ２１で処理し、３治療後に携帯型グルコースモニターを使用して満腹マウスのグルコース濃度を計測した（図７Ｂ）。
ホモ接合ｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ６．ＢＫＳ（Ｄ）−Ｌｅｐｒｄｂ／ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）は糖尿病に関して十分に特徴付けられた動物モデルであり、３〜４週齢経つと肥満になる。動物はまた、高血漿インスリン、高血糖、及び創傷治癒の遅延も呈する。この試験では、７〜８週齢の雄性ｄｂ／ｄｂマウスにＬａｂ Ｄｉｅｔ ５０５３ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０を自由に摂食させた。マウスを７日間順応させて、続いてペグ化ＦＧＦ２１、未修飾ＦＧＦ２１及びビヒクル（ＰＢＳ）を１１日間にわたり毎日皮下投与した。
各マウスに０．２５ｍｇ／ＫｇのＰＥＧ−ＦＧＦ２１又は未修飾ＦＧＦ２１を３日間にわたり毎日投与した。３日目の化合物投与１時間後にテールクリップ出血により摂食時グルコース血中濃度を測定し、グルコース濃度を携帯型グルコース計測器（Ｂａｙｅｒ）で計測した。データは、アミノ酸残基１３１でのＦＧＦ２１のペグ化が野生型ＦＧＦ２１と同じ効力を有し、プラセボ対照と比較したときグルコース濃度維持の向上を示すことを示している。
実施例６：アミノ酸及びデコイアミノ酸の調製
２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＡ．４、ＢａＣｈｅｍ）、２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＡ．５、ＢａＣｈｅｍ）、６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．４）を、商業的販売業者から購入した。
２−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＡ．４、ＢａＣｈｅｍ）、２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ｝−６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＡ．５、ＢａＣｈｅｍ）、６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．４）を、商業的販売業者から購入した。
式ＶＩＩＡのデコイｎｎＡＡの調製
式ＶＩＩ類似体は、出発アミノ酸のα−アミノ基を活性求電子剤でアシル化することにより容易に調製される。これは、出発物質を酸塩化物、活性化エステル、無水物又はスルホニルクロリドで処理することにより行われる。生成物は次に、細胞株の樹立に利用することができる。
式ＶＩＩＢのデコイアミノ酸の調製：
６−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．１）の調製
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（２８０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、５．３ｍＬ）及びジオキサン（２ｍＬ）を入れた。クロロギ酸アリル（２２８ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。この混合物を１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２１５．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２１６．１。
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（２８０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、５．３ｍＬ）及びジオキサン（２ｍＬ）を入れた。クロロギ酸アリル（２２８ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。この混合物を１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２１５．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２１６．１。
６−｛［（２−クロロエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．３）の調製
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（１１８０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、２２．５ｍＬ）及びジオキサン（２３ｍＬ）を入れた。２−クロロエチルクロロホルメート（９３２ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。混合物を過剰の１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２３７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３８．１。
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（１１８０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、２２．５ｍＬ）及びジオキサン（２３ｍＬ）を入れた。２−クロロエチルクロロホルメート（９３２ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。混合物を過剰の１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２３７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３８．１。
６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．６）の調製
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−｛［（２−クロロエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（２５０ｍｇ）及びＤＭＳＯ（５ｍＬ）を入れた。ナトリウムアジドを添加し、２−クロロエチルクロロホルメート（７０ｍｇ）を６０Ｃに加熱して２０時間撹拌した。混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、１Ｍクエン酸（１０ｍＬ）に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２４４．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２４５．２。
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−｛［（２−クロロエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（２５０ｍｇ）及びＤＭＳＯ（５ｍＬ）を入れた。ナトリウムアジドを添加し、２−クロロエチルクロロホルメート（７０ｍｇ）を６０Ｃに加熱して２０時間撹拌した。混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、１Ｍクエン酸（１０ｍＬ）に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２４４．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２４５．２。
６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＶＩＩＢ．５）の調製
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（２２０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、４．２ｍＬ）及びジオキサン（２ｍＬ）を入れた。プロパルギルクロロホルメート（１６３ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。混合物を過剰の１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２１３．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２１４．１。
マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアルに、６−アミノカプロン酸（２２０ｍｇ）、水酸化ナトリウム（１Ｍ、４．２ｍＬ）及びジオキサン（２ｍＬ）を入れた。プロパルギルクロロホルメート（１６３ｕＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌した。混合物を過剰の１Ｍクエン酸で処理してｐＨを酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（×３）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２１３．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２１４．１。
５−｛［（プロパ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸（式ＶＩＩＢ．２）の調製
マグネチックスターラを備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、５−アミノ吉草酸（１５．０ｇ）、水（１００ｍＬ）及び２Ｎ炭酸ナトリウム（４０ｍＬ）を入れた。ジオキサン（１００ｍＬ）中のクロロギ酸アリル（８．２ｍＬ）を滴下して添加し、最終混合物を３時間撹拌した。混合物を２Ｎ ＨＣｌ（約５０ｍＬ）で酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（４×１００ｍＬ）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２０１．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２０２．１。
マグネチックスターラを備えた５００ｍＬ丸底フラスコに、５−アミノ吉草酸（１５．０ｇ）、水（１００ｍＬ）及び２Ｎ炭酸ナトリウム（４０ｍＬ）を入れた。ジオキサン（１００ｍＬ）中のクロロギ酸アリル（８．２ｍＬ）を滴下して添加し、最終混合物を３時間撹拌した。混合物を２Ｎ ＨＣｌ（約５０ｍＬ）で酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出し（４×１００ｍＬ）、有機層を取り置いた。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２０１．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２０２．１。
実施例７．式Ｖ及び式ＶＩの類似体の調製
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸（式Ｖ．６）の調製
マグネチックスターラ付き５０ｍＬ丸底フラスコにおいて、ジクロロメタンとＤＭＦとの２：１混合物（２０ｍＬ）中のピルビン酸（３．５ｇ、２３．３ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物に、ＤＣＣ（５．７ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（３．２ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を撹拌しながら５０Ｃに３０分間加熱した。この溶液を放冷し、次に別個のマグネチックスターラ付き１００ｍＬ丸底フラスコ中のＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｎ−Ｂｏｃ−リシン（５．２ｇ、２１．２ｍｍｏｌ）の懸濁液にフィルタに通して添加した。活性化エステルの添加後にトリエチルアミン（８．８ｍＬ、６３．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルとクエン酸とに分配した。これらの層を分離し、水層を酢酸エチルで４回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製すると、最終的なＮ−Ｂｏｃリシン誘導体が油として得られた。
（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−オキソ−２−フェニルアセトアミド）ヘキサン酸（式Ｖ．６）の調製
１００ｍＬ丸底フラスコに、アセトニトリル（５０ｍＬ）中のケト−Ｎ−Ｂｏｃリシン誘導体（４ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を入れた。これに塩酸の溶液（１５ｍＬ、ジオキサン中４Ｎ）を添加した。この溶液を２時間撹拌して濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーによる最終的な精製により、目標のアミノ酸が得られた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２７８．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２７９．１。
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドアセトアミド）ヘキサン酸（式Ｖ．８）の調製
２５ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（５ｍＬ）中に懸濁したＮ−Ｂｏｃ−リシン（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。飽和ＮａＨＣＯ3を添加し（２ｍＬ）、溶液を０℃に冷却した。ジオキサン（２ｍＬ）中のブロモアセチルクロリド（１６９ｕＬ、２．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を０Ｃで１時間、次に室温で４時間撹拌しておいた。溶液を抽出漏斗に移し、水とエーテルとに分配した。有機層を取り出し、水層をクエン酸で酸性（ｐＨ＝２）にした。水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。得られた残渣を次のステップに進めた。
５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中の粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−２−ブロモアセチル−リシン（７４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。これにナトリウムアジドの溶液（１０ｍＬ、１Ｍ）を添加した。この溶液を６０℃で一晩撹拌した。混合物をクエン酸（１Ｍ、５０ｍＬ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）とに分配した。有機層を取り置き、水層をさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。
粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−２−アジド−アセチル−リシンをアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。混合物を２時間撹拌し、次に濃縮した。溶液をトルエン（１０ｍＬ）で処理して濃縮し（２×）、アセトニトリル（１０ｍＬ）で処理して濃縮した（２×）。残渣を真空下で一晩乾燥させた。残渣をＭｅＯＨ中に取り、メチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。遠心によって粘稠性の油が単離され、上清は廃棄した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２２９．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３０．１。
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（ペンタ−４−エナミド）ヘキサン酸（式Ｖ．５）の調製
２５ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中に懸濁したＮ−Ｂｏｃ−リシン（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れた。１Ｍ Ｋ2ＣＯ3を添加し（５ｍＬ）、溶液を０Ｃに冷却した。ジオキサン（２ｍＬ）中の４−ペンテノイルクロリド（２２４ｕＬ、２．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。溶液を０Ｃで１時間、次に室温で４時間撹拌させておいた。溶液を抽出漏斗に移し、水とエーテルとに分配した。有機層を取り出し、水層をクエン酸で酸性（ｐＨ＝２）にした。水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。得られた残渣を次のステップに進めた。
粗生成Ｎ−Ｂｏｃ−ε−Ｎ−４−ペンテノイルアミド−リシンをアセトニトリル（５ｍＬ）及びＴＦＡ（２ｍＬ）と共に５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、２時間磁気撹拌した。混合物を濃縮した。溶液をトルエン（１０ｍＬ）で処理して濃縮し（２×）、アセトニトリル（１０ｍＬ）で処理して濃縮した（２×）。残渣を真空下で一晩乾燥させた。残渣をＭｅＯＨ中に取り、メチル−ｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。遠心によって粘稠性油が単離され、上清は廃棄した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２２９．２（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２２９．１。
ヒドロキシノルロイシン誘導体（式ＶＩ．１及び式ＶＩ．２）の調製
磁気撹拌を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに、Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドロキシルノルロイシン（１ｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（５０ｍＬ）を入れた。混合物を０℃に冷却し、ｐ−クロロギ酸ニトロフェニル（９７９ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）及びピリジン（２ｍＬ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。（シリカ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配）。
この油をアセトニトリル（３５ｍＬ）中に取り、ジオキサン中のＨＣＬを添加した（４Ｍ、１０ｍＬ）。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１）の調製
５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−ノルロイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（５０３ｍｇ、１．２ｍｍｏＬ）を入れた。これにジオキサン（５ｍＬ）及びピリジン（ｐｙｉｄｉｎｅ）（１ｍＬ）中のアミノ−アジド（１０５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この溶液を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルと５００ｍＭクエン酸とに分配した。酢酸エチル層を取り置き、水層を酢酸エチルでさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。この油をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。
単離したＢｏｃ保護アミノ酸をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｒｉｌｅ）（１５ｍＬ）に取り、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、５ｍＬ）で処理した。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．２）の調製
５０ｍＬ丸底フラスコに、ジオキサン（１０ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−ノルロイシンｐ−ニトロフェニルカーボネート（３３７ｍｇ、０．８ｍｍｏＬ）を入れた。これにジオキサン（５ｍＬ）中のアミノ−アジド（１３５ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この溶液を一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルと５００ｍＭクエン酸とに分配した。酢酸エチル層を取り置き、水層を酢酸エチルでさらに３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油にした。この油をフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。
単離したＢｏｃ保護アミノ酸をアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｒｉｌｅ）（１５ｍＬ）に取り、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ、５ｍＬ）で処理した。混合物を２時間撹拌し、真空下で濃縮した。
実施例８：抗Ｈｅｒ２−毒素コンジュゲーション
抗Ｈｅｒ２抗体を以下とおり得た。
抗Ｈｅｒ２抗体を以下とおり得た。
Ｈｅｒ２の細胞外ドメインに特異的なマウス抗体４Ｄ５の可変領域を、重複オリゴマーを使用した遺伝子合成により作成し、シャトルベクターにクローニングした。次に可変領域を、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）によりコードされるヒトフレームワークにグラフトし、マウス−ヒトハイブリッドを作成した。アンバーコドンを重鎖（γ）の２７４位及び３５９位（それぞれ配列番号４７及び配列番号４９）及び軽鎖（κ）の７０位及び８１位（それぞれ配列番号５３及び配列番号５５）に部位特異的突然変異誘発によって導入した。アンバーコドンを含むクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。ｐＯｐｔｉｖｅｃにこのＩｇＧ用の組込みコンストラクトを作成するため、重鎖用のプロモーター及びＯＲＦをＰＣＲ増幅し、制限酵素消化及びライゲーションによりｐＯｐｔｉｖｅｃにクローニングした。軽鎖及びｔＲＮＡの単一コピーを重複オリゴマーを使用した二段階ＰＣＲ法によってつなぎ合わせ、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドに利用可能な部位でクローニングした。
発現及び精製
ハーセプチン ＣＤＲ及び１つ又は２つの部位におけるｎｎＡＡの組込みと続くそのコンジュゲーションを可能にするように修飾されたＩｇＧ１フレームワークの遺伝子合成により、ＨＥＲ２に対する抗体を作成した。ハーセプチンのマウスＣＤＲをｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（重鎖）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にクローニングしてヒト化抗体を作成した。得られたベクター対ｐＦｕｓｅ−４Ｄ５γ及びｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κは、一過性トランスフェクションによる野生型抗Ｈｅｒ２ ＩｇＧのコトランスフェクション及び発現に役立った（配列番号４５、配列番号４６、重鎖；配列番号５１、配列番号５２、軽鎖）。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によって所望の部位に組み込むことによりｎｎＡＡ組込み部位を作成し、突然変異体を配列決定によりスクリーニングした。これにより２７４位にアンバーコドンを含む重鎖クローン（ｐＦｕｓｅ−４Ｄ５γ＿Ｋ２７４ａｍ）（配列番号４７）が得られた。ｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κにもアンバー部位を構築した。初めに終止コドンをアンバーコドンからオーカー終止コドンに置き換え、ベクターｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κ＿ＴＡＡを作成した。部位特異的突然変異誘発によってＤ７０位にアンバーコドンを導入した（配列番号５３）。これらの異なるベクターを組み合わせることにより、単一のｎｎＡＡ又は２つのｎｎＡＡを含む抗体を作成することができる。
ハーセプチン ＣＤＲ及び１つ又は２つの部位におけるｎｎＡＡの組込みと続くそのコンジュゲーションを可能にするように修飾されたＩｇＧ１フレームワークの遺伝子合成により、ＨＥＲ２に対する抗体を作成した。ハーセプチンのマウスＣＤＲをｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（重鎖）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にクローニングしてヒト化抗体を作成した。得られたベクター対ｐＦｕｓｅ−４Ｄ５γ及びｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κは、一過性トランスフェクションによる野生型抗Ｈｅｒ２ ＩｇＧのコトランスフェクション及び発現に役立った（配列番号４５、配列番号４６、重鎖；配列番号５１、配列番号５２、軽鎖）。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によって所望の部位に組み込むことによりｎｎＡＡ組込み部位を作成し、突然変異体を配列決定によりスクリーニングした。これにより２７４位にアンバーコドンを含む重鎖クローン（ｐＦｕｓｅ−４Ｄ５γ＿Ｋ２７４ａｍ）（配列番号４７）が得られた。ｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κにもアンバー部位を構築した。初めに終止コドンをアンバーコドンからオーカー終止コドンに置き換え、ベクターｐＦＵＳＥ−４Ｄ５κ＿ＴＡＡを作成した。部位特異的突然変異誘発によってＤ７０位にアンバーコドンを導入した（配列番号５３）。これらの異なるベクターを組み合わせることにより、単一のｎｎＡＡ又は２つのｎｎＡＡを含む抗体を作成することができる。
ｎｎＡＡを含む標的抗体の一過性発現を、ｐｙｌＲＳを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞で実施した。この細胞株は、ｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるｐｙｌＲＳ遺伝子を含むベクターのトランスフェクション、及びハイグロマイシンＢを含有する培地（ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．２ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン）での成長による選択により作成した。生存細胞を限界希釈によってクローニングし、ｐｙｌＲＳの高い機能活性を示すクローンを拡大した。これは、ｔＲＮＡｐｙｌをコードするベクター及びＹ４０位にアンバーコドンを含むレポーターコンストラクトＧＦＰＹ４０をＡＬＯＣ ｎｎＡＡの存在下で種々のクローンに一過性にトランスフェクトすることにより達成した。これらの細胞における蛍光レベルをＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用して定量化し、高機能クローンを単離した。標準的なトランスフェクション条件を使用して、抗Ｈｅｒ２抗体の発現を実施した。細胞を約９０％コンフルエンスになるように播き、３７℃で成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで予め処理した適切なＤＮＡと共に具体的な製造者の指示に従いインキュベートした。１〜２ｍＭ Ｌｙｓ−アジドの存在下で２〜５日間成長させた後、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を適切な方法により精製した。ＩｇＧの発現のため、低ＩｇＧウシ胎仔血清を含有する培地で細胞を成長させた。いずれ場合も０．１容積の１０×ＰＢＳを発現上清に添加して試料の塩及びｐＨを平衡化し、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡潔に言えば、発現上清を１ｍＬ又は５ｍＬ ｎＰｒｏｔｅｉｎ ＡセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ）に通した。結合した物質を５〜１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、３〜５容積の０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。続いて０．０５容積の２０×ＰＢＳを添加して中性ｐＨに至らせることにより、画分を中和した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によって分析し、ピークタンパク質画分をプールして、ＰＢＳに４℃で１６時間透析した。ｎｎＡＡとしてｌｙｓアジドを含むＩｇＧは、ＡｚＡｂと称される。
細胞毒−アルキン誘導体の調製
ＭＭＡＦ−アルキン誘導体の調製
モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（６ｍｇ、８．２ｕｍｏｌ）を小型バイアルに入れ、ＤＭＳＯ（４５０ｕＬ）を添加した。ＤＭＳＯ中のＢＣＮカーボネートの溶液（８２．６ｕｇ／ｕＬ、８４ｕＬ、２．４ｍｇ、８．２ｕｍｏｌ）をＭＭＡＦ溶液に添加した。トリエチルアミン（２．５ｕＬ、１８ｕｍｏｌ）を添加し、バイアルにキャップをして、反応物を４時間撹拌した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値９０７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値９０８．６。
モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（６ｍｇ、８．２ｕｍｏｌ）を小型バイアルに入れ、ＤＭＳＯ（４５０ｕＬ）を添加した。ＤＭＳＯ中のＢＣＮカーボネートの溶液（８２．６ｕｇ／ｕＬ、８４ｕＬ、２．４ｍｇ、８．２ｕｍｏｌ）をＭＭＡＦ溶液に添加した。トリエチルアミン（２．５ｕＬ、１８ｕｍｏｌ）を添加し、バイアルにキャップをして、反応物を４時間撹拌した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値９０７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値９０８．６。
マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、ＭＭＡＦ（５ｍｇ、６．８４ｕｍｏｌ）及びジペプチドｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−Ｆｍｏｃ（５．２４ｍｇ、６．８４ｕｍｏｌ）を入れた。この混合物にＤＭＳＯ（３５０ｕＬ）を添加した。エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテートのＤＭＳＯ溶液（４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｕＬ）、及びカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの水溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、２５ｕＬ）を添加し、バイアルにキャップをし、一晩撹拌させておいた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１３５８（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１３５９．８。この粗混合物を次のステップで直接使用した。
粗生成ＭＭＡＦ−ＶＣＰ−Ｆｍｏｃを４００ｕＬのジクロロメタン中に取り、４００ｕＬのジイソプロピルアミン（ｄｉｉｓｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）で処理した。混合物を２時間撹拌し、メタノールと共に丸底フラスコに移し濃縮した。この材料をヘプタン（２ｍＬ）で処理して濃縮し、この手順をイソプロパノールで繰り返して過剰なジイソプロピルアミン（ｄｉｉｓｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）を取り除いた。材料を高真空下で一晩濃縮し、次のステップに進めた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１１３６．７（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１１３７．６。
粗生成ＭＭＡＦ−ＶＣＰ−ＮＨ２をＤＭＦ（４２０ｕＬ）中に取り、アルキンカーボネート（４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｕＬ）及びトリエチルアミン（２．８ｕＬ）の溶液で処理した。混合物を室温で８時間撹拌した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１３１２．８（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１３１３．７。
パクリタキセル（５００ｍｇ、５９０ｕｍｏｌ）及びグルタル酸無水物を、磁気撹拌を備えた５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、ピリジン（１０ｍＬ）を添加した。この溶液を一晩撹拌した。混合物を濃縮して油にし、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（ヘキサン／アセトン溶出）すると、所望の生成物が得られた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値９６８．０（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値９６９．１
ＤＭＦ中タキソール−グルタル酸コンジュゲートの溶液（１５．６ｕｇ／ｕＬ、３２１ｕＬ、５ｍｇ、５．２ｕｍｏｌ）を、磁気撹拌子を備えた小型バイアルに入れた。ＨＡＴＵカップリング剤の溶液（４６．１ｕｇ／ｕＬ、５０ｕＬ、２．３ｍｇ、６．２ｕｍｏｌ）、シクロオクチンアミンの溶液（３４ｕｇ／ｕＬ、５０ｕＬ、１．７ｍｇ、５．２ｕｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．６ｕＬ、１１．４ｕｍｏｌ）を順番に添加した。バイアルのキャップを閉め、一晩撹拌した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１２７３．６（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１２７４．４
ドキソルビシン溶液（１２．５ｕｇ／ｕＬ、３２０ｕＬ、４ｍｇ、７．４ｕｍｏｌ）を、小型磁気撹拌子を備えた小型バイアルに入れた。ＤＭＳＯ中のシクロオクチンカーボネートの溶液（２８．５ｕｇ／ｕＬ、６３ｕＬ、１．８ｍｇ、７．４ｕｍｏｌ）をバイアルに添加した。トリエチルアミン（２．２ｕＬ、１６ｕｍｏｌ）を添加し、バイアルにキャップをして、反応物を４時間撹拌した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値７１９．７（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値７２０．５。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、３ｕＬ）及び抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）の溶液（１１．４３ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＭＭＡＦ−アルキン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．１ｕＬ、１４．５ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、６．４ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液（０．２１ｍｇ／ｍＬ）が得られた。
細胞ベースの蛍光アッセイを使用して、４Ｄ５ ＩｇＧ及びコンジュゲートした４Ｄ５−ＭＭＡＦがＨｅｒ２エピトープを発現する細胞に結合してインターナライズしたことを示した。Ｈｅｒ２の発現用コンストラクトが安定にトランスフェクトされた乳癌細胞株Ａ３４５、又はＳＫＢＲ３及びＥＬ４及びＥＬ４細胞を、完全ＲＰＭＩ−１６４０又はＤＭＥＭで成長させた。細胞を解離し、計数し、遠心によって回収した。各アッセイにつき約２００，０００〜５００，０００細胞を、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートした。次に細胞を１ｕｇの精製４Ｄ５ ＩｇＧ又は４Ｄ５ ＩｇＧ−ＭＭＡＦコンジュゲートにより、０．１％ナトリウムアジドの存在下又は非存在下、３７℃で１時間処理した。細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−フィコエリトリンコンジュゲートと共に３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ又は５０％トリパンブルー含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ）によって分析した。
細胞生存能力及び細胞死アッセイ。抗Ｈｅｒ２−ＭＭＡＦコンジュゲートが腫瘍細胞生存能力に及ぼす効果を、ＭＴＳアッセイを用いて評価した。簡潔に言えば、細胞を９６ウェルプレート上（ウェル当たり５０００細胞のＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＤ、及びＭＣＦ７）、５０ｕＬのフェノールレッド不含１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ １６４０に播いた。種々の濃度の抗体コンジュゲート及び対照を、５０ｕＬのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中、５％ＣＯ２の加湿環境下３７℃で３日間細胞に加えた。２０ｕＬの完全ＭＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することにより細胞生存能力を分析し、３７℃で１〜３時間発色させた。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を記録した（図８Ｂ）。
ＭＭＡＦ−バリン−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）−ｐ−アミノ−ベンゾイル−カーボネート−シクロオクチン誘導体による抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、３ｕＬ）及び抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）の溶液（１１．４３ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＭＭＡＦ−アルキン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．２３ｕＬ、１３ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、６．４ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液（０．２１ｍｇ／ｍＬ）が得られた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、３ｕＬ）及び抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）の溶液（１１．４３ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＭＭＡＦ−アルキン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．２３ｕＬ、１３ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、６．４ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液（０．２１ｍｇ／ｍＬ）が得られた。
パクリタキセル−シクロオクチン誘導体による抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、３ｕＬ）及び抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）の溶液（１１．４３ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにパクリタキセル−アルキン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．２４ｕＬ、１２．９ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、６．４ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、３ｕＬ）及び抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）の溶液（１１．４３ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにパクリタキセル−アルキン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．２４ｕＬ、１２．９ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、６．４ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。
実施例９：抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）に対するペグ化
抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロオクチンによるペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、１ｕＬ）を入れた。アジド含有抗体の溶液（ＡｚＡｂ−２、２．１ｍｇ／ｍＬ、１．０７ｕＬ）を添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｕＬ）を添加した。この溶液をボルテクサー（Ｆｉｓｈｅｒ）で激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を４時間静置させておいた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、１ｕＬ）を入れた。アジド含有抗体の溶液（ＡｚＡｂ−２、２．１ｍｇ／ｍＬ、１．０７ｕＬ）を添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｕＬ）を添加した。この溶液をボルテクサー（Ｆｉｓｈｅｒ）で激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を４時間静置させておいた。
最終容積が約１０ｕＬとなるように溶液を水（７ｕＬ）で希釈した。次に溶液を５ｕＬに分配し、５ｕＬの還元ゲル或いは非還元ゲルロード緩衝液に添加した。混合物を混合し、９５Ｃに３分間加熱した。次に試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％トリス−Ｇｌｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）は、ペグ化が高度の変換を伴い起こり、ほぼ全ての出発物質がビスペグ化種に変換されたことを示した。非還元ゲル（図９Ａ）レーン２：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）、レーン３：２０ＫＰＥＧ線状ＰＥＧシクロオクチンで処理した抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）。ＰＥＧ処理アジド抗体で、優勢な単一の種への、２つのＰＥＧ鎖の取込みという予想された分子量シフトと一致した明確な分子シフトが観察される。ＰＤＳＩは、高度の変換（９３％ビスペグ化、６．９％モノペグ化、出発物質なし）を示した。還元ゲル（図９Ｂ）レーン２：抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）、レーン３：２０ＫＰＥＧ線状ＰＥＧアルキンで処理した抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）。ＰＥＧ処理抗体（レーン３）における重鎖の明確な分子量シフトが観察され、アジド含有重鎖に対する特異性及びＰＥＧコンジュゲーションによる変換の程度（９６．７％、デンシトメトリー）が示された。
ｎｎＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位及び軽鎖の７０位に組み込まれた抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ）に対する２０ＫＰＥＧシクロオクチンによるペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ抗体の溶液 ０．５ｍｇ／ｍＬ、４．５ｕＬ）を入れた。２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｕＬ）を添加し、その溶液をボルテクサー（Ｆｉｓｈｅｒ）で激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を１８時間静置させておいた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ抗体の溶液 ０．５ｍｇ／ｍＬ、４．５ｕＬ）を入れた。２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｕＬ）を添加し、その溶液をボルテクサー（Ｆｉｓｈｅｒ）で激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を１８時間静置させておいた。
最終容積が約１０ｕＬとなるように溶液を水（４．５ｕＬ）で希釈した。次に溶液を５ｕＬに分配し、５ｕＬの還元ゲル或いは非還元ゲルロード緩衝液に添加した。ゲル試料を混合し、９５Ｃに３分間加熱した。次に試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％トリス−Ｇｌｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）は、ペグ化が高度の変換を伴い起こり、ほぼ全ての出発抗体がテトラペグ化種に変換されたことを示した。非還元ゲル（図１０Ａ レーン２：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ）、レーン３〜５：全て２０Ｋ線状ＰＥＧシクロオクチンで処理した、レーン３：抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）、レーン４：抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）、レーン５：ハーセプチン（アジドなし）陰性対照、レーン６：：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）及びレーン７：未処理のハーセプチン。未処理の４Ｄ５ ＡｚＡｂ−４の単一のバンドから、テトラペグ化種（これが優勢である）への明確な分子量シフトが観察される。このテトラペグ化種はビスペグ化種（レーン４）より大きい。非還元ゲルはまた、アジド含有抗体に対する反応の特異性も示し、アジドを含まないハーセプチンは反応性を示さない。ＰＤＳＩは高度の変換（８６％ビスペグ化、１４％トリスペグ化、出発物質なし）を示した。還元ゲル（図１０Ｂ）レーン２：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ）、レーン３〜５：全て２０Ｋ線状ＰＥＧシクロオクチンで処理した、レーン３：抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ）、レーン４：抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）、レーン５：ハーセプチン（アジドなし）陰性対照、レーン６：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）及びレーン７：未処理のハーセプチン。還元ゲルは、重鎖及び軽鎖の両方（レーン３）が、抗体の各サブユニットに対する単一の２０ＫＰＥＧ鎖の付加と一致する明確な分子シフトを起こしたことを示す。バンドは個別的であり、さらなるより高い分子量のバンドが存在しないことにより示されるとおり、アジド部位においてのみ反応が起こり、さらなるペグ化は起こらなかったことが示される。重鎖の同じ位置にアジドを共有する抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）との比較では、両方のバンドについて同じ分子量シフト及びゲルを通る同じラン時間が示される。２０ＫＰＥＧアルキンで処理したときのアジド不含ハーセプチンは、反応性を示さなかった。抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ７０ｌ）はコンジュゲーション効率もまた高く、ゲルは未修飾の重鎖又は軽鎖のエビデンスをほとんど乃至全く示さなかった。
実施例１０：銅触媒クリックによるＨｅｒ２抗体のペグ化
抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）に対する２０ＫＰＥＧアルキンによるペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミンのジクロロメタンの溶液（ＴＢＴＡ、１０ｍＭ、１．５ｕＬ）を入れた。窒素流下で溶媒を蒸発させ、４Ｄ５ ＡｚＡｂ−２の溶液（３．５ｍｇ／ｍＬ、２．１４ｕＬ）を添加した。２０ＫＰＥＧアルキンの水溶液を添加し（６０ｍｇ／ｍＬ、１．６７ｕＬ）、続いてシステインの水溶液（２０ｍＭ、０．５ｕＬ）を添加した。最後に、硫酸銅の溶液（１０ｍＭ、０．７５ｕＬ）を添加し、混合物を穏やかにボルテックスして構成成分を混合し、次に４時間静置させておいた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミンのジクロロメタンの溶液（ＴＢＴＡ、１０ｍＭ、１．５ｕＬ）を入れた。窒素流下で溶媒を蒸発させ、４Ｄ５ ＡｚＡｂ−２の溶液（３．５ｍｇ／ｍＬ、２．１４ｕＬ）を添加した。２０ＫＰＥＧアルキンの水溶液を添加し（６０ｍｇ／ｍＬ、１．６７ｕＬ）、続いてシステインの水溶液（２０ｍＭ、０．５ｕＬ）を添加した。最後に、硫酸銅の溶液（１０ｍＭ、０．７５ｕＬ）を添加し、混合物を穏やかにボルテックスして構成成分を混合し、次に４時間静置させておいた。
この溶液を分割し（２．５ｕＬ）、半分を７．５ｕＬの還元ゲルロード緩衝液に添加し、半分を７．５ｕＬの非還元ゲルロード緩衝液に添加した。試料を９５Ｃに３分間加熱し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％トリス−Ｇｌｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードして泳動した。非還元ゲル（図１１Ｂ）レーン２：未処理の抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）、レーン３：２０ＫＰＥＧ線状ＰＥＧアルキンで処理した抗Ｈｅｒ２抗体（抗Ｈｅｒ２−Ｌｙｓアジド２７４ｈ）。未反応の抗Ｈｅｒ２抗体（ＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが重鎖の２７４位に組み込まれている）、１つの２０ＫＰＥＧ鎖の挿入として同定されたより高い分子量のバンド、及びビスペグ化種として同定されたより高い分子量のバンドの混合物が、非還元ゲル（レーン３）で観察された。ＰＤＳＩは、モノペグ化種とビスペグ化種との間の中程度の変換を示した（５．３％ビスペグ化、３７％モノペグ化、５８％未修飾抗体）。還元ゲル（図１１Ａ）レーン２：未処理の抗体、レーン３：２０ＫＰＥＧ線状ＰＥＧアルキンで処理した抗体。ＰＤＳＩによるゲル分析は、中程度の量（１０％）の重鎖ペグ化を示した。軽鎖は変わらないように見えるとおり、反応は重鎖に特異的であった。
ＴＢＴＡ条件を利用するＣｕＡＡＣ条件下における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の２０ｋＤａペグ化のさらなる例が、図３２に示される。未処理ＡｚＡｂと比較したとき、ペグ化はアジドを有する重鎖に対し、このバンドの顕著な分子量シフトによって示されるとおり部位特異的な形で起こった。
１１７位で置換されたＮＮＡＡを有する抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ（抗ＰＳＭＡｓｃＦＶ−１１７）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロオクチンによるペグ化
抗体Ｊ５９１（ＢＡＮＤＥＲ）のＣＤＲをｓｃＦｖフレームワークにグラフトすることにより、ＰＳＭＡに特異的なｓｃＦｖを作成した。このＰＳＭＡに対するｓｃＦｖは、重複オリゴマー及びＰＣＲを使用した遺伝子合成により作成し、産物をｐＪ２０１にクローニングしてｐＪ２０１−ＰＳＭＡを得た。制限酵素消化（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ）によってｓｃＦｖのＯＲＦを切り出すことにより発現コンストラクトｐＣＤＮＡ３．１−ＰＳＭＡを作成し、ＤＮＡ断片を精製した。プラスミドｐＣＤＮＡ３．１を同じ酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＰＳＭＡ ｓｃＦｖ断片を挿入することにより、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＰＳＭＡに対するｓｃＦｖを含み且つインフレームの３’５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグ（ＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨをコードする、配列番号８１）を含むｐＣＤＮＡ３．１−Ｊ５９１ｓｃＦｖを作製した。このｓｃＦｖにアンバーコドンを組み込むため、ｓｃＦｖの最後の３’コドンの後ろ、但し５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグより前に、部位特異的突然変異誘発を使用してアンバー終止コドンを挿入した。得られたコンストラクトは抗ＰＳＭＡｓｃＦＶ−１１７と命名した。アンバーコドンを含むクローンをＤＮＡ配列決定によって同定した。
抗体Ｊ５９１（ＢＡＮＤＥＲ）のＣＤＲをｓｃＦｖフレームワークにグラフトすることにより、ＰＳＭＡに特異的なｓｃＦｖを作成した。このＰＳＭＡに対するｓｃＦｖは、重複オリゴマー及びＰＣＲを使用した遺伝子合成により作成し、産物をｐＪ２０１にクローニングしてｐＪ２０１−ＰＳＭＡを得た。制限酵素消化（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ）によってｓｃＦｖのＯＲＦを切り出すことにより発現コンストラクトｐＣＤＮＡ３．１−ＰＳＭＡを作成し、ＤＮＡ断片を精製した。プラスミドｐＣＤＮＡ３．１を同じ酵素で切断し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してＰＳＭＡ ｓｃＦｖ断片を挿入することにより、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＰＳＭＡに対するｓｃＦｖを含み且つインフレームの３’５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグ（ＰＰＰＰＰＨＨＨＨＨＨをコードする、配列番号８１）を含むｐＣＤＮＡ３．１−Ｊ５９１ｓｃＦｖを作製した。このｓｃＦｖにアンバーコドンを組み込むため、ｓｃＦｖの最後の３’コドンの後ろ、但し５ｘＰｒｏ−６ｘＨｉｓタグより前に、部位特異的突然変異誘発を使用してアンバー終止コドンを挿入した。得られたコンストラクトは抗ＰＳＭＡｓｃＦＶ−１１７と命名した。アンバーコドンを含むクローンをＤＮＡ配列決定によって同定した。
ｎｎＡＡを含む抗ＰＳＭＡｓｃＦｖ−１１７の一過性発現を、ｐｙｌＲＳを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞で実施した。この細胞株は、ｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）におけるｐｙｌＲＳ遺伝子を含むベクターのトランスフェクション、及びハイグロマイシンを含有する培地ＤＭＥＭ Ｂ（ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、６ｍＭグルタミン、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１１１４０−０５０）、１０％ウシ胎仔血清、及び０．２ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン）での成長による選択によって作成した。生存細胞を限界希釈によってクローニングし、ｐｙｌＲＳの高い機能活性を示すクローンを拡大した。これは、ｔＲＮＡｐｙｌをコードするベクター及びＹ４０位にアンバーコドンを含むレポーターコンストラクトＧＦＰＹ４０をＡＬＯＣ ｎｎＡＡの存在下で種々のクローンに一過性にトランスフェクトすることにより達成した。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒ）を使用してこれらの細胞における蛍光レベルを定量化し、高機能クローンを単離した。標準的なトランスフェクション条件を使用して、抗ＰＳＭＡｓｃＦｖ１１７の発現を実施した。細胞を約９０％コンフルエンスになるように播き、３７℃で成長させた。翌日、播いた細胞を、親油性試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、２９３ ｆｅｃｔｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め処理した適切なＤＮＡと共に具体的な製造者の指示に従いインキュベートした。１〜２ｍＭ Ｌｙｓ−アジドの存在下で２〜５日間成長させた後、成長培地を回収し、直接使用するか、或いは発現したタンパク質を精製した。簡潔に言えば、真核細胞の一過性発現後、ここに記載する発現したｓｃＦｖを成長培地から精製した。いずれ場合も０．１容積の１０×ＰＢＳを発現上清に添加して試料の塩及びｐＨを平衡化した。発現上清をＰＢＳに４℃で１６時間透析した。バッチ結合又は重力流によりタンパク質をニッケル−ＮＴＡ（Ｎｉｃｋｌｅ−ＮＴＡ）ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させ、洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で徹底的に洗浄した。結合した物質を（５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０〜５００ｍＭイミダゾール）で溶出させた。標的タンパク質を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により同定した。ピーク画分をプールし、以降使用する前にＰＢＳで透析した。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、１１７位で置換されたＮＮＡＡを有する抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖの溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ、３．６ｕＬ）を入れて添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｕＬ）を添加した。この溶液をボルテクサー（Ｆｉｓｈｅｒ）で激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を４時間静置させておいた。
最終容積が約１０ｕＬとなるように溶液を還元ゲル緩衝液（６ｕＬ）で希釈した。次に試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％トリス−Ｇｌｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）は、ペグ化により抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖバンドの大部分が成功裏に消費されたことを示した。還元ゲル（図１２Ａ）レーン２：１１７位にＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが組み込まれた抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、未処理。レーン３：２０ＫＰＥＧ線状ＰＥＧシクロオクチンで処理した、位置にＮＮＡＡ ｌｙｓ−アジドが組み込まれた抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ
Ｊ５９１−ｓｃＦｖが機能性であり、ＰＳＭＡを結合するかどうかを決定するため、細胞ベースの蛍光アッセイを使用した。前立腺癌ＰＣ３（ＰＳＭＡ陰性）及びＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ陽性）及び乳癌細胞株Ａ３４５をＲＰＭＩ−１６４０で成長させた。細胞を解離し、計数し、遠心によって回収した。各アッセイにつき５００，０００細胞を、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートした。次に細胞を２００ｕＬのｐＣＤＮＡ３．１−Ｊ５９１トランスフェクション上清で処理し、ＰＢＳで洗浄した。次に細胞を１ｕｇ／ｍＬのマウス抗６ｘＨＩＳ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、フィコエリトリンコンジュゲート抗マウス抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共に室温で３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ）により分析した。インターナリゼーションアッセイを、上記に以下の変更を加えて実施した：インターナリゼーションアッセイには精製ＰＳＭＡを利用した。抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖとのインキュベーション中、細胞のコホートをナトリウムアジド（０．１％）によっても４℃で１時間処理し、細胞表面マーカーのインターナリゼーションを阻止した。他のインキュベーションは３７℃で実施した。加えて、最後の洗浄後、トリパンブルーを添加してフィコエリトリンシグナルをクエンチすることにより表面染色を阻止した。
１１７位で置換されたＮＮＡＡを有する抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ（抗ＰＳＭＡｓｃＦＶ−１１７）の、ＭＭＡＦ−バリン−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）−ｐ−アミノ−ベンゾイル−カーボネート−シクロオクチン誘導体によるコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４、１ｕＬ）及び抗ＰＳＭＡｓｃＦＶ−１１７の溶液（４０．５ｕＬ、２．１ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＭＭＡＦ−バリン−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）−ｐ−アミノ−ベンゾイル−カーボネート−シクロオクチン誘導体のＤＭＳＯ溶液（３．４６ｕＬ、１３ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なｓｃＦｖ−薬物コンジュゲート溶液が得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）により反応混合物を調べると、タンパク質に対する薬物部分のコンジュゲーションに一致する主ＰＳＭＡバンドの小さい分子量シフトが示された。別個のｓｃＦｖコンストラクト２８Ｄ２では、ＰＡＧＥゲルにおいても僅かなシフトが観察される（図１２）。
実施例１１：デコイアミノ酸の試験
有効なｄｎｎＡＡを、インビトロアッセイでｐｙｌＲに対する高親和性基質（ｌｙｓ−アジド）と競合するその能力によって、レポータータンパク質で観察されるバックグラウンドアンバーサプレッションレベルを低減するその能力に関して、及び高いｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ活性に関して予め選択された細胞の生存能力及び機能を改善するその能力に関して同定した。
有効なｄｎｎＡＡを、インビトロアッセイでｐｙｌＲに対する高親和性基質（ｌｙｓ−アジド）と競合するその能力によって、レポータータンパク質で観察されるバックグラウンドアンバーサプレッションレベルを低減するその能力に関して、及び高いｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ活性に関して予め選択された細胞の生存能力及び機能を改善するその能力に関して同定した。
ｐｙｌＲＳ結合に関してｌｙｓ−アジドと有効に競合し得る類似体を同定するため、初めにｄｎｎＡＡをインビトロ機能アッセイにおける機能について、細胞が野生型ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現してｎｎＡＡをレポータータンパク質ＧＦＰＹ４０の標的部位に導入する能力に基づき試験した。このレポーターはそのオープンリーディングフレームにアンバーコドンを含み、これはアンバーサプレッションの非存在下では、蛍光性でないトランケート型タンパク質を生じさせる。アンバーサプレッションがある場合、蛍光検出法により検出可能な完全長ＧＦＰタンパク質が生じる。このアッセイでは、ｐｙｌＲＳを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に、ｔＲＮＡ発現コンストラクト及びＧＦＰＹ４０レポーターカセットを一過性にトランスフェクトした。次に細胞を、０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲の種々の濃度のｄｎｎＡＡの存在下又は非存在下で０．５ｍＭ ｌｙｓアジドと共にインキュベートした。次にＧＦＰ蛍光レベルをフローサイトメトリーにより定量化した。このアッセイについて、各条件における蛍光細胞の割合を求めてプロットした。ｄｎｎＡＡはｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ結合に関してｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）と競合すると予想されるとおり、有効なｄｎｎＡＡは完全長ＧＦＰの発現を低下させ又は阻止するはずである（上記に記載したとおり、ｄｎｎＡＡはｔＲＮＡによってアンバー部位に送り込まれ得るが、タンパク質合成を広めることはできない）。式ＶＩＩのｄｎｎＡＡをいくつか試験した：式ＶＩＩＢ．４のｄｎｎＡＡでは（図１３）、ｄｎｎＡＡの濃度を増加させると、同時に蛍光細胞の数が低下したことから、用量依存性の効果が示唆される（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。ｄｎｎＡＡがアンバーコドンリードスルーを可能にするかどうかを決定するため、トランスフェクト細胞をｄｎｎＡＡ単独ともインキュベートし、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現をモニタした。式ＶＩＩＢ．４のｄｎｎＡＡはＧＦＰ発現を生じさせなかった。ｄｎｎＡＡの非特異的な効果を制御するため、アンバーコドンを含まないレポータータンパク質をトランスフェクトした細胞、従ってアンバーサプレッションとは無関係に野生型ＧＦＰ（ＧＦＰｗｔ）を産生する細胞もまた、ｄｎｎＡＡの存在下でモニタした（図１３Ａ）。式ＶＩＩＢ．４のｄｎｎＡＡ（図１３Ａ）がタンパク質発現に対する効果を示さなかったことから、この後者のｄｎｎＡＡによるアンバーサプレッションの阻害が特異的であることが示唆される。
同様のインビトロアッセイを使用して、表１に掲載する式ＶＩＩＢのｄｎｎＡＡの効果を測った。表１には、試験したアミノ酸の説明及び結果の概要が示される。このアッセイは、各試料の幾何平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより決定してプロットした。試験した各ｄｎｎＡＡについて、野生型ＧＦＰをトランスフェクトした対照細胞を陽性対照として計測した。加えて、レポーターＧＦＰＹ４０をトランスフェクトし、且つ０．５ｍＭ ｌｙｓアジド又は２ｍＭ ｌｙｓアジドに曝露した細胞を使用して、阻害薬の非存在下における最大ＧＦＰ発現レベルを決定した。いずれ場合もロバストなＧＦＰ発現レベルが観察された。ｄｎｎＡＡのいずれかがＧＦＰ発現の有効性を低下させ得るかどうかを試験するため、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び２ｍＭのｌｙｓアジドの存在下で細胞をインキュベートした。ｄｎｎＡＡ濃度の増加と同時に起こるＧＦＰ発現の低下が、いずれ場合にも観察された（図１４）。式ＶＩＩＢ．１、式ＶＩＩＢ．３及び式ＶＩＩＢ．６のｄｎｎＡＡが、ｄｎｎＡＡを含まない試料と比べてＧＦＰ発現の最大の低下を示した（図１４Ａ、図１４Ｅ、図１４Ｉ）。これらのＧＦＰ発現阻害はｄｎｎＡＡ濃度の増加に伴い増加したことから、これらがｐｙｌＲＳの特異的な高親和性基質であることが示唆される。式ＶＩＩＢ．２及び式ＶＩＩＢ．５のｄｎｎＡＡもまた、ｄｎｎＡＡの濃度の増加に伴うＧＦＰ発現の低下を示した（図１４Ｃ、図１４Ｇ）。しかしながら、ＧＦＰ発現の相対的な低下ははるかに小さかったことから、これらのアミノ酸類似体がｐｙｌＲＳに対して低親和性であることが示唆される。従って、本発明のｄｎｎＡＡはｐｙｌＲＳとの結合に関してｌｙｓ−アジドｎｎＡＡと競合し、ｎｎＡＡ導入の生理学的機構を妨げ得る。ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対及びＧＦＰＹ４０レポーターコンストラクトをトランスフェクトした、しかしｌｙｓ−アジドにも又はｄｎｎＡＡにも曝露していない細胞を使用してバックグラウンドアンバーサプレッションのレベルを決定し、陰性対照として使用した。いずれ場合も低いＧＦＰ発現レベルが観察された。
高親和性基質の存在下におけるｄｎｎＡＡ阻害に関する競合アッセイにより、ｐｙｌＲＳとの結合に関して競合する、従ってｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡの特異的阻害薬であるｄｎｎＡＡが同定された。しかしながら、デコイｎｎＡＡは、ｎｎＡＡの非存在下でバックグラウンドアンバーサプレッションのレベルを低下させることを目的とする。バックグラウンドアンバーサプレッションレベルが低下し得るかどうかを決定するため、本発明者らは、ｄｎｎＡＡの一つを含む培地中でＧＦＰＹ４０レポーターコンストラクトとｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対とを含む細胞をインキュベートした。これを行うため、ｐｙｌＲＳを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞にｔＲＮＡ発現コンストラクト及びＧＦＰＹ４０レポーターカセットを一過性にトランスフェクトした。３日間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰの発現についてアッセイし、試料の幾何平均蛍光強度を決定した。本発明者らは以前、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡアンバーサプレッション系の完全な相補体を含む細胞が、アンバーサプレッション系を含まない細胞で観察されるものを上回るＧＦＰレポーターコンストラクトの検出可能な発現を示すことを観察している。この観察は、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対から生じる非直交性の活性（ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）があり、それがｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対を含まない細胞より高いアンバーサプレッションレベルをもたらすことを示唆している。バックグラウンドアンバーサプレッションレベルを低下させる能力を有するｄｎｎＡＡを同定するため、トランスフェクト細胞を、０．５ｍＭ、１ｍＭ及び２ｍＭのｄｎｎＡＡの各々とインキュベートし、ＧＦＰレベルをフローサイトメトリーにより計測した。式ＶＩＩＢ．１、式ＶＩＩＢ．３、式ＶＩＩＢ．６、式ＶＩＩＢ．２、及び式ＶＩＩＢ．５のｄｎｎＡＡは全て、対照試料（ｄｎｎＡＡを含まない細胞（図１４Ａ〜図１４Ｊ；ＧＦＰＹ４０＋ｔＲＮＡ−ｎｎＡＡ））と比べてバックグラウンドアンバーサプレッションレベルの低下を示した（図１４Ｄ、図１４Ｆ、図１４Ｊ、図１４Ｄ）。
バックグラウンドアンバーサプレッション依存性ＧＦＰ発現の低下は用量依存的で、ｄｎｎＡＡ濃度の増加に伴い向上した。興味深いことに、ｄｎｎＡＡの一つ、式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡは、このアッセイでバックグラウンドアンバーサプレッションの極めて効率的な阻害を示し、ＧＦＰ蛍光レベルが対照試料と比べて５７．７％低下したが、ｌｙｓ−アジドの強力な競合相手として同定されたものではなかった。これは、式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡが、ｌｙｓ−アジドに容易に取って代わられるｐｙｌＲＳに対する低い親和性を有し得ることを示唆している。この特徴は、それがバックグラウンドアンバーサプレッションの抑制を可能にしながらも、ｌｙｓ−アジドなどの強力なｐｙｌＲＳ基質の添加でその系を活性化することができるため、プラットフォーム開発にとって魅力的な特徴である。これらのデータは、ｄｎｎＡＡがｐｙｌＲＳ−ｔＲＮＡ対を占有し、天然アミノ酸によるアンバーサプレッションを防ぎ得ることを示唆している。式ＶＩＩＢ．１（６２．５％低下）、式ＶＩＩＢ．３（４９．７％）、式ＶＩＩＢ．６（３２％）、及び式ＶＩＩＢ．５（３５％）及び式ＶＩＩＢ．４（４６．３％）もまた、このアッセイにおいてバックグラウンドアンバーサプレッションレベルの低下に有効であった。それらの有効性を、対照試料（ｄｎｎＡＡに曝露していない）と比べたＧＦＰ発現の低下によって定量化した。データは表１に要約する。
実施例１２．本発明のデコイｎｎＡＡがプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｍ）細胞株の生存能力に及ぼす効果
本発明のｄｎｎＡＡが、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを含む細胞の生存能力を改善する働きをし得るかどうかを調べるため、本発明者らは、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを安定に発現する細胞株の成長及び生存能力を観察した。このアッセイについて、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌ並びに重鎖にアンバーコドンを含むｈｅｒ２／ｎｅｕに対するＩｇＧを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、発現したＩｇＧにｎｎＡＡを有効に組み込み、従ってｎｎＡＡを含む抗体を産生することが示された細胞を、この実験に使用した。ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対の高い発現レベルにも関わらず、この細胞株は、ｎｎＡＡを含まない培地で成長させたとき、極めてロバストな細胞成長特性を有する。アンバーコドンを含む高発現標的の存在は、細胞に高レベルのアンバーコドンを供給することにより、それがアンバーサプレッション活性を吸収することで細胞の保護作用を有し、必須遺伝子におけるバックグラウンドアンバーサプレッションの効果から細胞を保護するものと思われる。しかしながら、成長培地にｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）を添加し、アンバーサプレッション機構が活性化すると、細胞成長速度の低下が観察される。即ち培養物の細胞密度が安定したままであるように見え、アンバーサプレッション機構の活性化が細胞分裂抑制効果をもたらすことが示唆される。ｄｎｎＡＡがこの効果を救出し得るかどうかを決定するため、無血清培地で培養した細胞を０．５×１０6細胞／ｍＬの細胞密度まで成長させ、続いて０．５ｍＭ ｌｙｓアジド単独で、又は２Ｍｍ ｄｎｎＡＡとの組み合わせで処理した。細胞生存能力及び細胞数を７日間にわたり毎日観察した。ｌｙｓアジド単独で処理した細胞は、ｎｎＡＡの添加後３日目に１×１０6細胞／ｍＬを僅かに下回る細胞密度に達し、アッセイの残りの期間（７日間）にわたりこの密度のままであった（図１５Ａ）。培養物が実験全体を通して高い生存能力（ｖｉａｂｌｉｌｉｔｙ）（約７０％生細胞）を維持したとおり（図１５Ｂ）、成長がないことが生存能力の欠如に起因するものとは思われなかった。２ｍＭの式ＶＩＩＢ．４の化合物、又は２ｍＭの式ＶＩＩＢ．１を０．５ｍＭ ｌｙｓ−アジドと組み合わせて処理した培養物は、培養物の持続的な成長を支持して１．５×１０6細胞／ｍＬ超に達し、且つ９０％の細胞生存能力を維持した。式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡで処理した細胞は、アッセイの間、３×１０6を上回る細胞密度（ｄｅｎｓｉｔｉｅｄ）及び９０％を大幅に上回る生存能力を示した。対照的に、式ＶＩＩＢ．３で処理した細胞は、アッセイの経過に伴う細胞生存能力の低下（＜０．５×１０6細胞／ｍＬ）及び低い生存能力（６日目までに３０〜４０％）を示した。これらのデータは、式ＶＩＩＢ．２、式ＶＩＩＢ．４、及び式ＶＩＩＢ．１のｄｎｎＡＡが、アンバーサプレッション系の活性化により生じる細胞分裂抑制効果を妨げることを示唆している。式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡの存在下で成長した細胞は、７日間にわたり、時間とともに線形的な且つ３×１０6の細胞密度に達する細胞成長を示した。これらのデータは、式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡがｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ機能に関するｌｙｓ−アジドの最も効率的な競合相手であることを示している。
本発明のｄｎｎＡＡが、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを含む細胞の生存能力を改善する働きをし得るかどうかを調べるため、本発明者らは、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを安定に発現する細胞株の成長及び生存能力を観察した。このアッセイについて、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌ並びに重鎖にアンバーコドンを含むｈｅｒ２／ｎｅｕに対するＩｇＧを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、発現したＩｇＧにｎｎＡＡを有効に組み込み、従ってｎｎＡＡを含む抗体を産生することが示された細胞を、この実験に使用した。ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対の高い発現レベルにも関わらず、この細胞株は、ｎｎＡＡを含まない培地で成長させたとき、極めてロバストな細胞成長特性を有する。アンバーコドンを含む高発現標的の存在は、細胞に高レベルのアンバーコドンを供給することにより、それがアンバーサプレッション活性を吸収することで細胞の保護作用を有し、必須遺伝子におけるバックグラウンドアンバーサプレッションの効果から細胞を保護するものと思われる。しかしながら、成長培地にｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）を添加し、アンバーサプレッション機構が活性化すると、細胞成長速度の低下が観察される。即ち培養物の細胞密度が安定したままであるように見え、アンバーサプレッション機構の活性化が細胞分裂抑制効果をもたらすことが示唆される。ｄｎｎＡＡがこの効果を救出し得るかどうかを決定するため、無血清培地で培養した細胞を０．５×１０6細胞／ｍＬの細胞密度まで成長させ、続いて０．５ｍＭ ｌｙｓアジド単独で、又は２Ｍｍ ｄｎｎＡＡとの組み合わせで処理した。細胞生存能力及び細胞数を７日間にわたり毎日観察した。ｌｙｓアジド単独で処理した細胞は、ｎｎＡＡの添加後３日目に１×１０6細胞／ｍＬを僅かに下回る細胞密度に達し、アッセイの残りの期間（７日間）にわたりこの密度のままであった（図１５Ａ）。培養物が実験全体を通して高い生存能力（ｖｉａｂｌｉｌｉｔｙ）（約７０％生細胞）を維持したとおり（図１５Ｂ）、成長がないことが生存能力の欠如に起因するものとは思われなかった。２ｍＭの式ＶＩＩＢ．４の化合物、又は２ｍＭの式ＶＩＩＢ．１を０．５ｍＭ ｌｙｓ−アジドと組み合わせて処理した培養物は、培養物の持続的な成長を支持して１．５×１０6細胞／ｍＬ超に達し、且つ９０％の細胞生存能力を維持した。式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡで処理した細胞は、アッセイの間、３×１０6を上回る細胞密度（ｄｅｎｓｉｔｉｅｄ）及び９０％を大幅に上回る生存能力を示した。対照的に、式ＶＩＩＢ．３で処理した細胞は、アッセイの経過に伴う細胞生存能力の低下（＜０．５×１０6細胞／ｍＬ）及び低い生存能力（６日目までに３０〜４０％）を示した。これらのデータは、式ＶＩＩＢ．２、式ＶＩＩＢ．４、及び式ＶＩＩＢ．１のｄｎｎＡＡが、アンバーサプレッション系の活性化により生じる細胞分裂抑制効果を妨げることを示唆している。式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡの存在下で成長した細胞は、７日間にわたり、時間とともに線形的な且つ３×１０6の細胞密度に達する細胞成長を示した。これらのデータは、式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡがｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ機能に関するｌｙｓ−アジドの最も効率的な競合相手であることを示している。
上記のデータから、式ＶＩＩＢ．２のｄｎｎＡＡがｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡの効率的な阻害薬であることが示されたとともに、高活性アンバーサプレッション機構を含み且つｎｎＡＡの存在下で標的遺伝子を発現する細胞でアンバーサプレッション依存性細胞分裂抑制効果を低下させることが示された。しかしながら、ｄｎｎＡＡの使用目的は、高活性アンバーサプレッション機構を有する細胞をその樹立及び単離中に保護することにある。従って、本発明者らは次に、高活性アンバーサプレッション機構が強化された細胞プール（プラットフォーム細胞株）の生存能力及びパフォーマンスがｄｎｎＡＡにより向上し得るかどうかという問いを立てた。これを行うため、アンバーサプレッション機構の高い活性に関して選択されたプラットフォーム細胞株をｄｎｎＡＡの存在下又は非存在下で数代成長させ、続いて９６ウェルプレートにウェル当たり１０細胞で播種し、ｄｎｎＡＡ（式ＶＩＩＢ．２）の存在下又は非存在下で成長させた。各プレートを数日間インキュベートし、細胞を回収し、プールして計数した。興味深いことに、デコイｎｎＡＡと共にインキュベートしたプレートは、ｄｎｎＡＡの非存在下で成長させたプレートより多い細胞数を示した（ｄｎｎＡＡなしで１．６６×１０6、及び１．５×１０6細胞／ｍＬ、及びｄｎｎＡＡで成長した培養物からの３．０及び３．７×１０6細胞／ｍＬ）。この細胞数の２倍の増加は、ｄｎｎＡＡの保護作用に起因し得る。これらの条件下で成長する細胞の活性を調べるため、各プレートからのプールした０．５×１０6細胞を６ウェルプレートに播種し、ｄｎｎＡＡが存在しない且つｌｙｓ−アジドを含むＧＦＰＹ４０レポーターコンストラクトをトランスフェクトした。２４時間後、各試料の細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーにより分析した。データを、単一細胞を含むようにゲーティングしてプロットし、各イベントの強度を表示した（散布図、図１６）。各試料について、ＧＦＰ強度スペクトルの上位１０％以内に入るイベントの数を決定した（表２）。ｄｎｎＡＡの存在下で成長させた細胞は、設定したゲート内に入るイベントの数がより多いことを示した（デコイ無しｎ＝１３９及びデコイ（式ＶＩＩＢ．２）有りｎ＝１７５。これは、デコイｎｎＡＡ含有培地での成長によって、より多くの高活性細胞が維持されたことを示唆している。さらなるメトリックを利用して、最も高いＧＦＰ発現を有する上位３００イベントの幾何平均（上位３００）を隔てることにより細胞のパフォーマンスを定量化した。このメトリックに基づけば、ｄｎｎＡＡインキュベート細胞は、ｄｎｎＡＡの非存在下で成長させた細胞と比べてパフォーマンスの向上を示す（デコイ無しＧＭ＝９５４；デコイ（式ＶＩＩＢ．２）有りＧＭ＝１１４２。両群の細胞に、野生型ＧＦＰをコードするコンストラクトもトランスフェクトした。この群に対して同じ分析を実施した。これらのデータは表２に要約され、ｄｎｎＡＡ（式ＶＩＩＢ．２）を含有する培地で成長させた細胞が、ｄｎｎＡＡの非存在下で成長させた同じ細胞株と比べてより多い数の高度蛍光細胞及びより高い蛍光レベルを示すことを示している。
ｄｎｎＡＡはプラットフォーム細胞の生存能力を維持するように思われたが、より高いレベルのアンバーサプレッション機能性を有する細胞もまた維持した。高活性アンバーサプレッション系を含むプラットフォーム細胞株の細胞成長特性に対するｄｎｎＡＡの効果をさらに評価するため、本発明者らは動態学的成長アッセイを実施した。これを行うため、プラットフォーム細胞株を上記に記載したとおり９６ウェルプレートにおいてｄｎｎＡＡの存在下又は非存在下でインキュベートした。各プレートの細胞をプールし、トリプリケートで９６ウェルプレートにウェル当たり１０００細胞で播種し、細胞を４日間インキュベートした。４日目、細胞にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ色素を添加し、蛍光発光により生存能力をアッセイした。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅは細胞生存能力の好都合な指示薬として働く。生細胞は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅが産生する高度蛍光色素のレゾルフィンを代謝する。５日目、６日目、９日目、及び１１日目に蛍光レベルをモニタし、蛍光値をプロットした（図１７）。デコイ成長細胞は、ｄｎｎＡＡの非存在下で成長させた細胞と比較して、細胞生存能力の向上を示した。これは、プロットした成長速度に線を当てはめ、各々の傾きを計算することにより示された。デコイｎｎＡＡを含有する培地で成長させた細胞（傾きの平均＝１１９０）は、ｄｎｎＡＡの非存在下で成長させた細胞（傾きの平均＝６６９）より速い成長速度を示した。これらデータは、ｄｎｎＡＡの使用が、細胞をアンバーサプレッションの慢性的な効果から保護し、細胞生存能力及び培養物の成長を向上させることを示している。まとめると、これらのデータは、ｄｎｎＡＡがプラットフォーム細胞株の樹立に必須の成分であること、及び高いアンバーサプレッション活性を有する細胞の維持を示している。
実施例１３：ＧＦＰアッセイによるｎｎＡＡとしての新規ピロリシン類似体の翻訳試験
インビトロ細胞ベースアッセイを開発して、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対と本発明のピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）の適合性及び標的タンパク質へのｎｎＡＡの組込み効率を評価した。このために、ｐｙｌＲＳ（３Ｈ７）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に、標準的なトランスフェクションプロトコルを用いてｔＲＮＡｐｙｌの発現用プラスミド及びＧＦＰＹ４０をコードするレポーターコンストラクト（アミノ酸残基４０番（ここでは１番が開始因子メチオニンである）にチロシンの代わりにアンバーコドンを含む）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を２ｍＭのｎｎＡＡと共に２〜３日間インキュベートした。ＧＦＰ産生を顕微鏡下目視で観察することによって定性的に分析した。ＧＦＰ蛍光はＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより定量化し、蛍光細胞の幾何平均を決定した。
インビトロ細胞ベースアッセイを開発して、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対と本発明のピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）の適合性及び標的タンパク質へのｎｎＡＡの組込み効率を評価した。このために、ｐｙｌＲＳ（３Ｈ７）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に、標準的なトランスフェクションプロトコルを用いてｔＲＮＡｐｙｌの発現用プラスミド及びＧＦＰＹ４０をコードするレポーターコンストラクト（アミノ酸残基４０番（ここでは１番が開始因子メチオニンである）にチロシンの代わりにアンバーコドンを含む）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を２ｍＭのｎｎＡＡと共に２〜３日間インキュベートした。ＧＦＰ産生を顕微鏡下目視で観察することによって定性的に分析した。ＧＦＰ蛍光はＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより定量化し、蛍光細胞の幾何平均を決定した。
この細胞ベースのアッセイを用いることにより、種々のｎｎＡＡがｐｙｌＲＳの好適な基質であって、標的タンパク質へのその翻訳が可能かどうかを決定した。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対を発現し、且つＧＦＰＹ４０レポーター遺伝子をコードするベクターを含む細胞を、ｎｎＡＡの存在下でインキュベートした。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ対によって容易に利用されるｎｎＡＡは、ＧＦＰのアンバー部位に対するｎｎＡＡの翻訳を裏付け、遺伝子のリードスルーを可能にして完全長ＧＦＰ（蛍光タンパク質）を産生させる。細胞の蛍光強度はｎｎＡＡの組込み効率に依存する。従って、十分に利用されないｎｎＡＡは弱蛍光又は非蛍光細胞を生じる。顕微鏡観察により、ｐｙｌＲＳが使用可能な複数のｎｎＡＡを同定した（表１、陽性ＧＦＰ）。さらに、各試料の相対発現レベルを、ｐｙｌＲＳによって効率的に利用されることが知られる基質により生じるレベルと比較した。式Ｖ．１（ＭＦＩ＝９３１，２８９）、式Ｖ．２（ＭＦＩ＝１，６７６，２５０）及び式Ｖ．３（ＭＦＩ＝２，２５０，０００）（表１を参照のこと）は、幾何平均で高いＧＦＰ発現レベルを裏付けた。
本発明の類似体、式ＶＩ．１及び式ＶＩ．３は、使用した実験条件下でＧＦＰレポーター遺伝子に組み込まれ緑色細胞を産生したことが、本発明者らにより見出された。これらのうち、式ＶＩ．１の類似体は高いＧＦＰ発現レベル（ＭＦＩ ９０４２０６）を裏付けたことから、試験した実験条件下でｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対によって効率的に利用される類似体に相当する（表４を参照のこと）。
抗Ｈｅｒ２抗体の構築及び発現
２つの非天然アミノ酸（各重鎖に１つずつ）を含む完全長抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５−２ＡＺ ａｂ）を哺乳類細胞で発現させた。ｎｎＡＡ（アジド部分を含む）を選択した部位に組み込み、プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）か或いはＩｇＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０９６９０１）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次に精製した材料を濃縮し、コンジュゲーション反応に供した。
２つの非天然アミノ酸（各重鎖に１つずつ）を含む完全長抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５−２ＡＺ ａｂ）を哺乳類細胞で発現させた。ｎｎＡＡ（アジド部分を含む）を選択した部位に組み込み、プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）か或いはＩｇＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０９６９０１）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次に精製した材料を濃縮し、コンジュゲーション反応に供した。
マウス抗体４Ｄ５の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を、ヒトＩｇＧをコードする遺伝子を含むベクターにクローニングすることにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに特異的な抗体を作成した。４Ｄ５の可変領域は、重複オリゴマーを使用する遺伝子合成によって作成し、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｇＧ１重鎖；γ）及びｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈＫ（軽鎖；κ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）によりコードされるヒトＩｇＧ１フレームワークにクローニングして、マウス−ヒトハイブリッドを作成した。アンバーコドンを部位特異的突然変異誘発によって重鎖（γ）のＫ２７４位に導入した。ＤＮＡ配列決定により、アンバーコドンを含むクローンを同定した。組込み用コンストラクトを作成するため、重鎖のプロモーター及びＯＲＦをＰＣＲ増幅し、制限酵素消化及びライゲーションによってｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。軽鎖及びｔＲＮＡの単一コピーを、重複オリゴマーを使用する二段階ＰＣＲ法でつなぎ合わせ、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドの利用可能な部位にクローニングした。次にこのコンストラクトを、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対を含むＣＨＯ細胞株にトランスフェクトし、高発現のＩｇＧを示す安定にトランスフェクトされた細胞株を選択した。これが、ｎｎＡＡを含むｍＡｂを安定に発現する細胞株の第２の例に相当し、この手順がｍＡｂの発現における使用に幅広い適用性を有することが示される。この細胞株を利用して、上記に記載したｎｎＡＡを含むＩｇＧを作成した。細胞をＥｘｃｅｌ ＤＨＦＲ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において１〜２×１０6細胞／ｍＬの密度まで成長させ、ｎｎＡＡを培養物に１ｍＭの終濃度となるように添加した。細胞を５日間インキュベートし、成長培地からＩｇＧを精製した。上清を回収し、遠心に供することにより懸濁細胞及び他の残屑を収集した。次に上清を０．２２ｕｍフィルタでろ過して一切の粒子状物質を取り除いた後、クロマトグラフィーカラムにかけた。ろ過した上清を、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムを使用して１ｍＬ〜５ｍＬ充填済みＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースに１〜５ｍＬ／分の流量で加えた。結合した物質及び樹脂をＰＢＳで洗浄することにより緩く結合したタンパク質を取り除き、結合した物質を１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）により１ｍＬ／分の流量で溶出させた。標的タンパク質を含むピーク画分を０．１画分容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。全てのコンストラクトをＰＢＳに対して４℃で１６時間透析し、最終的なリン酸緩衝液中に入れた。その重鎖の両方の２７４位に組み込まれた式ＶＩ．１をｎｎＡＡとして有する抗体は、「４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸」と称される。
４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸のペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（５ｕＬ、５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１）の溶液（１０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（３．３、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を一晩静置しておいた。混合物を２００ｕＬに希釈し、プロテインＡ磁気ビーズに加えた。混合物をボルテックスし、回転させてビーズを９０分間混合した。ビーズを固定化し、流れ抜ける物質は廃棄した。ビーズをＰＢＳ（２×）で洗浄し、次に還元ゲル緩衝液に懸濁した。ボルテックスし、次に９５Ｃに３分間加熱した。懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色は、重鎖の選択的なペグ化を示した（図１８、レーン３）。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（５ｕＬ、５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸（式ＶＩ．１）の溶液（１０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（３．３、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を一晩静置しておいた。混合物を２００ｕＬに希釈し、プロテインＡ磁気ビーズに加えた。混合物をボルテックスし、回転させてビーズを９０分間混合した。ビーズを固定化し、流れ抜ける物質は廃棄した。ビーズをＰＢＳ（２×）で洗浄し、次に還元ゲル緩衝液に懸濁した。ボルテックスし、次に９５Ｃに３分間加熱した。懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色は、重鎖の選択的なペグ化を示した（図１８、レーン３）。
ＳＰＡＡＣによる蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｎｅ ｄｙｅ）との４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（６５ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸の溶液（３０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて溶液ＤＭＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８シクロオクチン（５．４、ＤＭＳＯ中５ｍＭ、クリックケミストリーツール）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を２４時間静置しておいた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィー（１Ｍ硫酸ナトリウムからリン酸緩衝液へ勾配を含む東ソーＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲ）により分析すると、コンジュゲーションが起こったことが示され、ＤＡＲ１種及びＤＡＲ２種の混合物が生じた（図１９）。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液（６５ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝ヘキサン酸の溶液（３０ｕＬ、０．５５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて溶液ＤＭＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８シクロオクチン（５．４、ＤＭＳＯ中５ｍＭ、クリックケミストリーツール）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。混合物を２４時間静置しておいた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィー（１Ｍ硫酸ナトリウムからリン酸緩衝液へ勾配を含む東ソーＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲ）により分析すると、コンジュゲーションが起こったことが示され、ＤＡＲ１種及びＤＡＲ２種の混合物が生じた（図１９）。
実施例１４：さらなるｎｎＡＡデータ
（２Ｓ）−２−アミノ−６−［［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ］ヘキサン酸、式ＶＩ．１の代替的な調製
ステップ１：マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１ｅｑ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を入れた。これに２−クロロエチルイソシアネート（１７．３ｍｇ、１．０ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）を添加した。バイアルにキャップをし、５時間撹拌させておいた。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物は次のステップに直接回した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値３５２．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値３５２．１。
ステップ１：マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１ｅｑ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を入れた。これに２−クロロエチルイソシアネート（１７．３ｍｇ、１．０ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）を添加した。バイアルにキャップをし、５時間撹拌させておいた。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物は次のステップに直接回した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値３５２．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値３５２．１。
ステップ２：マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、上記からの粗生成クロロ誘導体及びＤＭＳＯ（１ｍＬ）を入れた。ナトリウムアジド（１３０ｍｇ、５ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）をこの混合物に添加し、バイアルにキャップをした。混合物を６０℃で一晩撹拌した。混合物を抽出漏斗に移し、１００ｍＭクエン酸及び酢酸エチルで希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物を次のステップに進めた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値３５９．２（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値３６０．２。
最終ステップ：２０ｍＬバイアルに粗生成Ｂｏｃ保護アミノ酸及びアセトニトリル（２ｍＬ）を入れた。これにジオキサン中の塩酸溶液（４Ｎ、２．５ｍＬ）を添加した。この溶液を２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して半固体にし、翻訳試験で使用した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２５９．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２６０．２。
マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１ｅｑ）及びＤＭＦ（１．５ｍＬ）を入れた。これにアリルイソシアネート（１８．０ｕＬ、１．０ｅｑ）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２ｅｑ）を添加した。バイアルにキャップをし、４時間撹拌させておいた。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で希釈した。混合物を振盪し、それらの層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせ、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮した。生成物を質量分析法によって同定し、次のステップに直接回した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値３３０．２（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値３３１．３。
２０ｍＬバイアルに、アセトニトリル（２ｍＬ）中粗生成ヒドロキシルロイシン−アリルカルバメート誘導体を入れた。これにジオキサン中の塩酸溶液（４Ｎ、２．５ｍＬ）を添加した。この溶液を２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して半固体にし、翻訳試験で使用した。生成物を質量分析法によって確認した。イオン交換クロマトグラフィー（ＤＯＷＥＸ−５０）でさらなる精製を行うことができた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値２３０．１（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値２３１．２。
実施例１５：ＩｇＧ先行安定細胞株
２７４位にＮＮＡＡを導入することが可能なハーセプチン発現細胞株を構築した。ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞に、１つがｐＯｐｔｉｖｅｃに重鎖用の発現カセットを含み、もう１つがハーセプチンのｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ＋）における軽鎖用である、且つＨ２７４位にアンバーコドンを含む２つのベクターをトランスフェクトした。細胞をハイグロマイシン含有培地で選択し、続いて発現に関して、メトトレキサート含有培地での成長によって選択した。トランケート型ＩｇＧの高発現クローンをクローニングによって単離した。最良に発現するクローンに、ｐｙｌＲＳ及び１８コピーのＵ６−ｔＲＮＡｐｙｌ（ｐＭＯＡＶ−２ ｐｕｒｏ）をコードするベクターをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を抗生物質耐性によって選択し、最も高いアンバーサプレッション活性を示す細胞を、クローンをｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）に曝露した後のその完全長ＩｇＧ発現を定量化するＥＬＩＳＡアッセイにより同定した。１２ｕｇ／ｍＬのｎｎＡＡを含むＩｇＧの安定発現を示すクローンが単離された。このデータは、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対によるｎｎＡＡの組込みが可能なｍＡｂ発現細胞株の構築の第３の例を示している。加えてこの手法は、機能エレメントを導入する順序が、先に利用した方法とは異なる。
２７４位にＮＮＡＡを導入することが可能なハーセプチン発現細胞株を構築した。ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞に、１つがｐＯｐｔｉｖｅｃに重鎖用の発現カセットを含み、もう１つがハーセプチンのｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ＋）における軽鎖用である、且つＨ２７４位にアンバーコドンを含む２つのベクターをトランスフェクトした。細胞をハイグロマイシン含有培地で選択し、続いて発現に関して、メトトレキサート含有培地での成長によって選択した。トランケート型ＩｇＧの高発現クローンをクローニングによって単離した。最良に発現するクローンに、ｐｙｌＲＳ及び１８コピーのＵ６−ｔＲＮＡｐｙｌ（ｐＭＯＡＶ−２ ｐｕｒｏ）をコードするベクターをトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を抗生物質耐性によって選択し、最も高いアンバーサプレッション活性を示す細胞を、クローンをｎｎＡＡ（ｌｙｓ−アジド）に曝露した後のその完全長ＩｇＧ発現を定量化するＥＬＩＳＡアッセイにより同定した。１２ｕｇ／ｍＬのｎｎＡＡを含むＩｇＧの安定発現を示すクローンが単離された。このデータは、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対によるｎｎＡＡの組込みが可能なｍＡｂ発現細胞株の構築の第３の例を示している。加えてこの手法は、機能エレメントを導入する順序が、先に利用した方法とは異なる。
実施例１６：ｎｎＡＡを導入するためのＩｇＧ位置突然変異
実施例５、抗ＩＬ６抗体及び抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖２７４位における突然変異の導入並びに修飾抗体と様々な分子とのコンジュゲーションの成功について記載した。
実施例５、抗ＩＬ６抗体及び抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖２７４位における突然変異の導入並びに修飾抗体と様々な分子とのコンジュゲーションの成功について記載した。
ここで、新規ＩｇＧ位置突然変異体並びにＤＡＲ２及びＤＡＲ４ ＡＤＣの作成について、ｃＤＮＡへの突然変異の導入からＡＤＣの細胞傷害性データまで記載する。
重鎖のＨ２７４位及びＨ３５９位並びに軽鎖のＬ７０位及びＬ８１位に個々にアンバー終止コドンが置かれた４Ｄ５抗Ｈｅｒ２抗体を構築した。ＨＥＫ２９３細胞においてＨ２７４、Ｈ３５９及びＬ８１は個々の突然変異体として発現し、Ｈ２７４はまたＬ７０か或いはＬ８１と共に二重突然変異体としても発現した。これらの４Ｄ５突然変異体を、ＰｙｌＲＳを安定に発現するＨＥＫ細胞においてＰｙｌ−ｔＲＮＡと共発現させた。上清をプロテインＡで精製し、ｍＡｂをペグ化し、ＰＡＧＥにより分析した（図２０）。データは、ペグ化が各位置で効率的に起こり、反応混合物中に存在するＤＡＲ４種によって例証されるとおり、複数の位置に対するコンジュゲーションが同時に起こることを示している。４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）及び４Ｄ５−４ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて部位特異的なペグ化の結果としての明確な分子量シフトを起こす。同様に、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）もまた、ＰＡＧＥゲルで観察され得るとおり、同様の分子量の増加を示す。重鎖は影響されないままである（但しゲル中を動く残留ＰＥＧによって歪む）。４つのアジドを含むＨＣ２７４及びＬＣ８１突然変異体（４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４−ＬＣ８１））もまた容易にペグ化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより検出可能であった。重鎖及び軽鎖の両方が、２つのアジドを含む抗体と同様の顕著な分子シフトを示す（図２０）。
位置突然変異体のペグ化
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロオクチンのペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに４Ｄ５−２ＡｚＡｈ（ＬＣ８１）の溶液（８ｕＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ）を入れて添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（２．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。２０ｋＤａ分子量のＰＥＧの組込みと一致する明確な分子量シフトにより、軽鎖の修飾が明らかであった（レーン７）。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロオクチンのペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに４Ｄ５−２ＡｚＡｈ（ＬＣ８１）の溶液（８ｕＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ）を入れて添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（２．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。２０ｋＤａ分子量のＰＥＧの組込みと一致する明確な分子量シフトにより、軽鎖の修飾が明らかであった（レーン７）。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロオクチンのペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）の溶液（８ｕＬ、０．１４５ｍｇ／ｍＬ）を入れて添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（２．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。３５９位にアジドを有するアジド含有抗体は、部位特異的なペグ化の結果としての、重鎖に特異的な明確な分子量シフトを示した（レーン５）。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）の溶液（８ｕＬ、０．１４５ｍｇ／ｍＬ）を入れて添加し、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（２．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。３５９位にアジドを有するアジド含有抗体は、部位特異的なペグ化の結果としての、重鎖に特異的な明確な分子量シフトを示した（レーン５）。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）に対する２０ＫＰＥＧシクロオクチンのペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）の溶液（２ｕＬ、０．４７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（１．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。重鎖及び軽鎖の両方が、コンジュゲーションにより部位特異的に結合した単一のＰＥＧを有する結果として、ＰＡＧＥゲルにおいて明確な分子量の増加を起こす（レーン６）。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）の溶液（２ｕＬ、０．４７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（１．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を２４時間静置しておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２０）。重鎖及び軽鎖の両方が、コンジュゲーションにより部位特異的に結合した単一のＰＥＧを有する結果として、ＰＡＧＥゲルにおいて明確な分子量の増加を起こす（レーン６）。
位置突然変異体に対する細胞傷害剤のコンジュゲーション
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）のコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）の溶液（１５０ｕＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、０．５ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）及びＨＩＣクロマトグラフィー（図２１）で分析した。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで単一種として現れ、保持時間によって判断すると、ＨＣ２７４変異体より僅かに疎水性が高かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）は、薬物とのコンジュゲートの結果として分子量の僅かな増加を示した（図２２）。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）のコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ８１）の溶液（１５０ｕＬ、０．１０６ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、０．５ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）及びＨＩＣクロマトグラフィー（図２１）で分析した。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで単一種として現れ、保持時間によって判断すると、ＨＣ２７４変異体より僅かに疎水性が高かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）は、薬物とのコンジュゲートの結果として分子量の僅かな増加を示した（図２２）。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）の溶液（１５０ｕＬ、０．１４５ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチンのＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、０．７５ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィーによって分析した（図２１）。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで単一種として現れ、保持時間によって判断すると、ＨＣ２７４変異体と比べて著しく疎水性が高かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥもまた、ＨＣ３５９変異体の親抗体より分子量が大きいバンドの形成を示した。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）の溶液（１５０ｕＬ、０．１４５ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチンのＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、０．７５ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィーによって分析した（図２１）。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで単一種として現れ、保持時間によって判断すると、ＨＣ２７４変異体と比べて著しく疎水性が高かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥもまた、ＨＣ３５９変異体の親抗体より分子量が大きいバンドの形成を示した。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ８１）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ８１）の溶液（１５０ｕＬ、０．１８７ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、１ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）及びＨＩＣクロマトグラフィー（図２１）で分析した。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで優勢に単一種として現れ、ＤＡＲ２ ＨＣ２７４と比べて著しく疎水性が高かった。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量の増加もまた観察された。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ８１）の溶液（１５０ｕＬ、０．１８７ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（２０ｕＬ、１ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）及びＨＩＣクロマトグラフィー（図２１）で分析した。得られたコンジュゲートはＨＩＣクロマトグラムで優勢に単一種として現れ、ＤＡＲ２ ＨＣ２７４と比べて著しく疎水性が高かった。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量の増加もまた観察された。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７４）の溶液（５０ｕＬ、０．４７ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（５ｕＬ、３ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２２）。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量の増加が観察された。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７４）の溶液（５０ｕＬ、０．４７ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（５ｕＬ、３ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物を２つのミニＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２２）。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量の増加が観察された。
インビトロ細胞傷害活性
上記に記載したとおり作成したＡＤＣを、抗Ｈｅｒ２抗体及びＡＤＣ細胞株の活性を試験するのに標準的な標的細胞であるＳＫＯＶ３及びＨＣＣ１９５４及びＰＣ３腫瘍細胞株で細胞傷害活性に関して試験した。ＳＫＯＶ３及びＨＣＣ１９５４は高レベルのＨｅｒ２を発現する一方、ＰＣ３はＨｅｒ２を低レベルで発現する：細胞傷害活性は、表５に記載されるとおり、インビトロで腫瘍細胞の５０％を死滅させるＡＤＣの濃度として計算した。特に、ハーセプチン単独は、試験した細胞株のいずれに対しても細胞傷害効果を及ぼさない。
上記に記載したとおり作成したＡＤＣを、抗Ｈｅｒ２抗体及びＡＤＣ細胞株の活性を試験するのに標準的な標的細胞であるＳＫＯＶ３及びＨＣＣ１９５４及びＰＣ３腫瘍細胞株で細胞傷害活性に関して試験した。ＳＫＯＶ３及びＨＣＣ１９５４は高レベルのＨｅｒ２を発現する一方、ＰＣ３はＨｅｒ２を低レベルで発現する：細胞傷害活性は、表５に記載されるとおり、インビトロで腫瘍細胞の５０％を死滅させるＡＤＣの濃度として計算した。特に、ハーセプチン単独は、試験した細胞株のいずれに対しても細胞傷害効果を及ぼさない。
図２３Ｄ、図２３Ｅ、図２３Ｆに示すとおり、各位置突然変異体に関してＤＡＲ２ ＡＤＣとＤＡＲ４ ＡＤＣとを比較した。各Ｈｅｒ２陽性腫瘍細胞株でＤＡＲ４ ＡＤＣの方がどのＤＡＲ２よりも強力であったことから、ＤＡＲ２ ＡＤＣと比べてＤＡＲ４でより多くの薬物が送達されたことが確認された。
図２３は、表５のＥＣ５０値を導き出す元となった細胞傷害性アッセイを示す。
図２３Ａは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞株における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４，ＬＣ−７０）−ＡＦ ＤＡＲ４ ＡＤＣの腫瘍細胞傷害活性を示す。これらの細胞は単独でハーセプチン抵抗性であるが、種々の位置に毒素がコンジュゲートされたＡＤＣにより効率的に死滅する。明らかにＡＤＣは、恐らくは全てのＡＦを直接細胞へと効率的に標的化させることにより、受動拡散と比較したとき腫瘍細胞を死滅させるのに必要なＡＦの濃度を大幅に低下させる。
図２３Ｂは、ＨＣＣ１９５４細胞における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４，ＬＣ−７０）−ＡＦの腫瘍細胞傷害活性を示す。ＳＫＯＶ３細胞と同様に、ＨＣＣ１９５４細胞はハーセプチン抵抗性であるが、ＡＤＣにより、種々の位置にコンジュゲートされた毒素によって効率的に死滅する。
図２３Ｃは、ＰＣ３腫瘍細胞株における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ３５９）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４，ＬＣ−７０）−ＡＦ ＤＡＲ４ ＡＤＣの腫瘍細胞傷害活性を示し、このＰＣ３腫瘍細胞株は極めて低いレベルのＨｅｒ２を発現し、この図並びに表５に見られるとおり、ＡＤＣによる腫瘍死滅に対する抵抗性がはるかに高い。
図２３Ｄは、Ｈｅｒ２を過剰発現する腫瘍細胞株であるＨＣＣ１９５４細胞における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ−８１）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４，ＬＣ−８１）−ＡＦ ＤＡＲ４ ＡＤＣの腫瘍細胞傷害活性を示す。この図並びに表５に見られるとおり、ＤＡＲ４ ＡＤＣはどのＤＡＲ２構成成分と比べてもより強力である。
図２３Ｅは、Ｈｅｒ２を過剰発現する腫瘍細胞株であるＳＫＯＶ３細胞における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ−８１）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４、ＬＣ−８１）−ＡＦの腫瘍細胞傷害活性を示す。この図並びに表５に見られるとおり、ＤＡＲ４ ＡＤＣはどのＤＡＲ２構成成分と比べてもより強力である。
図２３Ｆは、極めて低いＨｅｒ２を発現する腫瘍細胞株であるＰＣ３細胞における４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＬＣ−８１）−ＡＦ ＤＡＲ２ ＡＤＣ並びに４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４，ＬＣ−８１）−ＡＦの腫瘍細胞傷害活性を示す。この図並びに表５に見られるとおり、この標的に対するこれらのＡＤＣの活性はほぼ乃至全くない。
実施例１７：ＨＣ２７４位でコンジュゲートした抗体の薬物動態、安定性、及びインビボ抗腫瘍活性（ａｃｉｔｉｖｔｙ）
ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８による抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５ ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４））のコンジュゲーション
マグネチックスターラを備えた１０００ｕＬ ＨＰＬＣバイアルに、リン酸塩の溶液（５１１ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂの溶液（１６４ｕＬ、６．８７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＤＭＳＯ溶液ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８（７５ｕＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加し、チューブにキャップをして２４時間撹拌した。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、５０ｕＬ）で処理し、２時間撹拌した。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍＬスピンカラムで脱塩すると、最終的な抗体−色素コンジュゲートが得られた。この材料をＨＩＣクロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＨＩＣクロマトグラフィーは、抗体当たり２つの色素分子の付加と一致する単一の主要種の形成を示した（図２４）。
ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８による抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５ ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４））のコンジュゲーション
マグネチックスターラを備えた１０００ｕＬ ＨＰＬＣバイアルに、リン酸塩の溶液（５１１ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂの溶液（１６４ｕＬ、６．８７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＤＭＳＯ溶液ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８（７５ｕＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加し、チューブにキャップをして２４時間撹拌した。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、５０ｕＬ）で処理し、２時間撹拌した。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍＬスピンカラムで脱塩すると、最終的な抗体−色素コンジュゲートが得られた。この材料をＨＩＣクロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＨＩＣクロマトグラフィーは、抗体当たり２つの色素分子の付加と一致する単一の主要種の形成を示した（図２４）。
ラットに１ｍｇ／ｋｇの用量の４Ｄ５ ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ ４８８又はハーセプチンをＩＶ注射し、２つの分子の血清レベルを、抗ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して１１日間観察した。
図２５Ａに示すとおり、定常重鎖２７４位におけるＩｇＧの修飾は、血清レベルによって測ると、未修飾のハーセプチンと比較したとき薬物動態特性に影響を及ぼさない。
ＩｇＧに対するラット新生仔Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃＲｎと同じ残基でヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを認識する。本発明のＡＤＣなどの修飾ヒトＩｇＧは、コンジュゲートとＦｃＲｎとの相互作用がインタクトなままである限り、ラットＦｃＲｎの機能に起因して生体内で長時間保持され得る。これらのデータは、ＨＣ−２７４修飾ＩｇＧがラットにおいて長い生体内半減期を維持することを実証しており、ＦｃＲｎ相互作用がコンジュゲートによってブロックされないことが示される。ラットＦｃＲｎと相互作用する４Ｄ５上の同じ残基がまた、ヒトＦｃＲｎとの相互作用にも関与する。これらデータは、ＨＣ−２７４にコンジュゲートを有するＡＤＣがヒトＦｃＲｎと相互作用し、従ってヒトで長い半減期を維持し得ることを示している。
図２５Ａに示されるＰＫ分析のために収集した同じ血清を、プラスチック製ＥＬＩＳＡウェルにコーティングされたＨｅｒ２細胞外ドメインタンパク質によって抗体を捕捉する定量的ＥＬＩＳＡアッセイにより、４Ｄ５ ＩｇＧ上のＦＩＴＣコンジュゲートの存在に関して試験した（図２５Ｂ）。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＨＲＰ基質を添加した。このＥＬＩＳＡはＡＤＣ上に残るＦＩＴＣの量を計測し、図２５Ｂに示すとおり、全てのＦＩＴＣがインタクトなＡＤＣのｎｇ／ｍｌとして報告される。ＤＡＲ２を有する血清中４Ｄ５ ＡＤＣは未処理ＡＤＣと同じレベルであり、ＦＩＴＣの損失がないことが示される。データは明らかに、この試験の全１１日間にわたりラットにおいて色素が完全に維持され生体内で安定していることを示している。
ＡＦ−シクロアルキン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）のコンジュゲーション
マグネチックスターラを備えた１０００ｍＬ ＨＰＬＣチューブに、リン酸塩の溶液（２４ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂの溶液（１４９ｕＬ、６．８７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これに５のＤＭＳＯ溶液を添加し（２７．２ｕＬ、２ｍＭｏｌ）、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を２４時間静置しておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、５０ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍＬスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。ＨＩＣクロマトグラフィーは、抗体当たり２つのアウリスタチン分子が付加されたことと一致する主要種の形成を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）は、加えられたアウリスタチン分子の付加と一致する重鎖に対する小さい分子量シフトを示した。
マグネチックスターラを備えた１０００ｍＬ ＨＰＬＣチューブに、リン酸塩の溶液（２４ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂの溶液（１４９ｕＬ、６．８７ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これに５のＤＭＳＯ溶液を添加し（２７．２ｕＬ、２ｍＭｏｌ）、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を２４時間静置しておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、５０ｕＬ）で処理してボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍＬスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＨＩＣクロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。ＨＩＣクロマトグラフィーは、抗体当たり２つのアウリスタチン分子が付加されたことと一致する主要種の形成を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）は、加えられたアウリスタチン分子の付加と一致する重鎖に対する小さい分子量シフトを示した。
インビトロ活性
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦを、Ｈｅｒ２陽性細胞株に対するそのインビトロ効力に関して試験した。Ｈｅｒ２過剰発現細胞株ＳＫＢＲ３及びＳＫＯＶ３を、極めて低レベルのＨｅｒ２を発現する細胞株であるＰＣ３と比較した。４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦをアウリスタチン（ＡＦ）単独と比較した。ＡＤＣは、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳＫＢＲ３及びＳＫＯＶ３細胞を特異的に死滅させたが、Ｈｅｒ２をほとんど発現しないＰＣ３細胞は死滅させなかった。３つの標的細胞株に対するこのＡＤＣの効力は、表６に示される。これらの値は、図２７に示す細胞傷害性データで計算した。ＡＤＣはＳＫＯＶ３及びＳＫＢＲ３に対してピコモル濃度の効力を示す一方、ＰＣ３に対しては、当該の細胞株がアウリスタチン単独に対して非常に高い感受性を有する場合であっても不活性である。これは、高レベルのＨｅｒ２を発現する細胞に対するこれらのＡＤＣの特異性を実証している。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦを、Ｈｅｒ２陽性細胞株に対するそのインビトロ効力に関して試験した。Ｈｅｒ２過剰発現細胞株ＳＫＢＲ３及びＳＫＯＶ３を、極めて低レベルのＨｅｒ２を発現する細胞株であるＰＣ３と比較した。４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦをアウリスタチン（ＡＦ）単独と比較した。ＡＤＣは、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳＫＢＲ３及びＳＫＯＶ３細胞を特異的に死滅させたが、Ｈｅｒ２をほとんど発現しないＰＣ３細胞は死滅させなかった。３つの標的細胞株に対するこのＡＤＣの効力は、表６に示される。これらの値は、図２７に示す細胞傷害性データで計算した。ＡＤＣはＳＫＯＶ３及びＳＫＢＲ３に対してピコモル濃度の効力を示す一方、ＰＣ３に対しては、当該の細胞株がアウリスタチン単独に対して非常に高い感受性を有する場合であっても不活性である。これは、高レベルのＨｅｒ２を発現する細胞に対するこれらのＡＤＣの特異性を実証している。
インビボ抗腫瘍活性
ＳＫＯＶ３腫瘍細胞株は、Ｈｅｒ２を過剰発現するヒト卵巣癌に由来するが、ハーセプチン抵抗性である；ＳＫＯＶ３細胞に由来する腫瘍をｓｃｉｄマウスに樹立した。腫瘍は２週間以内に約１００ｍｍ3に達し、その時点でマウスを無作為化し、半分のマウス（ｎ＝４／群）を６ｍｇ／ｋｇの４Ｄ５−２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ ＡＤＣの単回皮下注射で処置した（図２８）。腫瘍サイズをノギスで計測することにより腫瘍進行を追跡した。全ての処置マウスが、短い腫瘍縮小期間の後、腫瘍進行の高度に有意な遅延を示した。１匹のマウスは完全に治癒した一方、他の３匹のマウスは最終的に再発した（図２８Ｂ）。腫瘍進行は最長８０日間モニタし、１匹の治癒したマウスが再発しなかったことを確実にした。
ＳＫＯＶ３腫瘍細胞株は、Ｈｅｒ２を過剰発現するヒト卵巣癌に由来するが、ハーセプチン抵抗性である；ＳＫＯＶ３細胞に由来する腫瘍をｓｃｉｄマウスに樹立した。腫瘍は２週間以内に約１００ｍｍ3に達し、その時点でマウスを無作為化し、半分のマウス（ｎ＝４／群）を６ｍｇ／ｋｇの４Ｄ５−２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ ＡＤＣの単回皮下注射で処置した（図２８）。腫瘍サイズをノギスで計測することにより腫瘍進行を追跡した。全ての処置マウスが、短い腫瘍縮小期間の後、腫瘍進行の高度に有意な遅延を示した。１匹のマウスは完全に治癒した一方、他の３匹のマウスは最終的に再発した（図２８Ｂ）。腫瘍進行は最長８０日間モニタし、１匹の治癒したマウスが再発しなかったことを確実にした。
この例は、４Ｄ５−ＡＦ ＡＤＣが生体内で循環中において維持され、代謝分解に対して安定しているが、標的腫瘍細胞の細胞質へと特異的に強力な毒活性を送達するのに利用可能であることを実証している。
実施例１８：−二重特異性抗体／抗体断片の作成及び特性決定
４Ｄ５ ＡｚＡｂ−０．５ＫＰＥＧ中間体の調製。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝溶液（３４．３ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。これに４Ｄ５ ２−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（２３．６１ｕＬ、１３ｍｇ／ｍＬ）及びビス−シクロオクチンリンカーの溶液（２．０４ｕＬ、ジオキサン中２０ｍＭ、５００ｋＤａ）を添加した。混合物を断続的に２４時間ボルテックスした。混合物をＣＨＴ樹脂によって精製すると、機能化した中間体が得られた。
４Ｄ５ ＡｚＡｂ−０．５ＫＰＥＧ中間体の調製。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝溶液（３４．３ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。これに４Ｄ５ ２−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（２３．６１ｕＬ、１３ｍｇ／ｍＬ）及びビス−シクロオクチンリンカーの溶液（２．０４ｕＬ、ジオキサン中２０ｍＭ、５００ｋＤａ）を添加した。混合物を断続的に２４時間ボルテックスした。混合物をＣＨＴ樹脂によって精製すると、機能化した中間体が得られた。
２８Ｄ２ ｓｃＦｖ−ＡＨＡは、実施例４の抗ＩＬ６抗体に由来する。完全な配列番号及び調製の説明は、国際公開第１２０３２１８１号パンフレットを参照することができる。簡潔に言えば、抗体断片２８Ｄ２ ｓｃＦｖ−ＡＨＡを大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）で発現し、配列のＣ末端にｎｎＡＡアジドホモアラニンを組み込む。発酵からタンパク質を単離し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
４Ｄ５ ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−２８Ｄ２（ｓｃＦｖ）二重特異性抗体の調製
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−０．５ＫＰＥＧコンジュゲート（３７．５ｕＬ、２ｍｇ／ｍＬ）及び２８Ｄ２ ｓｃＦｖ−ＡＨＡの溶液（２２ｕＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ）を入れた。混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。混合物をプロテインＡ磁気ビーズ（ＧＥ）によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、１つ及び２つのｓｃＦｖ分子の付加と一致し得る出発アジド含有抗体より分子量が高い２つの個別的なバンドの形成が示された。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−０．５ＫＰＥＧコンジュゲート（３７．５ｕＬ、２ｍｇ／ｍＬ）及び２８Ｄ２ ｓｃＦｖ−ＡＨＡの溶液（２２ｕＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ）を入れた。混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。混合物をプロテインＡ磁気ビーズ（ＧＥ）によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、１つ及び２つのｓｃＦｖ分子の付加と一致し得る出発アジド含有抗体より分子量が高い２つの個別的なバンドの形成が示された。
ＥＬＩＳＡアッセイでは、抗ＩｇＧ抗体を固体表面に固定した。Ｈｅｒ２−抗ＩＬ６二重特異性抗体は二重特異性抗体のＦｃ領域で捕捉された。次に、ＩＬ−６を付加して次にそれをビオチン標識によって検出することにより、二重特異性抗体（ｂｉｐｓｐｅｃｉｆｉｃ）を機能に関して評価した。
一つのＥＬＩＳＡアッセイでは、二重特異性抗体がＨｅｒ２抗原に結合する能力を調べた。二重特異性抗体は、対照４Ｄ５ ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）抗体と同程度の抗原親和性を有することが分かった（図３０Ｃ）。
第２のＥＬＩＳＡアッセイでは、二重特異性がＩＬ−６に結合する能力を調べた。この変法のＥＬＩＳＡでは、二重特異性抗体が抗ＩｇＧ相互作用によってＥＬＩＳＡプレートに捕捉された。次にＩＬ−６親和性を調べた。二重特異性抗体がＩＬ−６に対して完全長抗体１３Ａ８と同程度の親和性を有することが分かった（図３０Ｂ）。
最後のＥＬＩＳＡアッセイでは、二重特異性抗体が両末端で同時に機能する能力を調べた。二重特異性抗体はＨｅｒ２抗原に対する抗体親和性によってＥＬＩＳＡプレートに捕捉された。次にＩＬ−６活性を調べた。二重特異性抗体がＨｅｒ２抗原及びＩＬ−６に同時に高親和性を有することが分かった。対照抗体は同様の二重機能活性を示すことができなかった（図３０Ａ）。
ＦＧＦ２１ポリペプチド（ＦＧＦ２１−ＡＨＡ（ｓ８６））を大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて配列番号６２の８６位で修飾し、アジドホモアラニンを組み込むことにより、セリンを置換した。この修飾タンパク質を封入体として単離し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
４Ｄ５ ＡｚＡｂ−ＦＧＦ２１（サイトカイン）二重特異性抗体の調製
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、抗体−リンカー中間体の溶液（３．０ｕＬ、２ｍｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ２１−ＡＨＡ（Ｓ８６）の溶液（２８．６ｕＬ、２．８ｍｇ／ｍＬ）があった。チューブにキャップをし、３７Ｃで２４時間インキュベートした。混合物をプロテインＡ磁気ビーズによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、重鎖に対する中間体リンカーを介したＦＧＦ２１（Ｓ８６）分子の付加と一致する分子量シフトが観察された。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、抗体−リンカー中間体の溶液（３．０ｕＬ、２ｍｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ２１−ＡＨＡ（Ｓ８６）の溶液（２８．６ｕＬ、２．８ｍｇ／ｍＬ）があった。チューブにキャップをし、３７Ｃで２４時間インキュベートした。混合物をプロテインＡ磁気ビーズによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、重鎖に対する中間体リンカーを介したＦＧＦ２１（Ｓ８６）分子の付加と一致する分子量シフトが観察された。
実施例１９．銅によって促進されるアジドアルキン環化付加及びトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）リガンドによる４Ｄ５ Ａｚａｂのペグ化
ＴＨＰＴＡによる２０ｋＤａペグ化。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液の溶液（３ｕＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。これに４Ｄ５アジド含有抗体の溶液（６．５ｕＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ）及び２０ｋＤａ ＰＥＧアルキンの溶液（４ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。別個のチューブに、硫酸銅の溶液（２．０ｕＬ、１０ｍＭ）、及びＴＨＰＴＡ（２．５ｕＬ、４０ｍＭ）、アミノグアニジン（１．０ｕＬ、１００ｍＭ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１．０ｕＬ、１００ｍＭ）の溶液を入れた。チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。この銅錯体全体をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、３７℃又は５０℃で２時間インキュベートさせておいた。この反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、２０ｋＤａ ＰＥＧの付加と一致する重鎖の分子量シフトが示された。
ＴＨＰＴＡによる２０ｋＤａペグ化。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにリン酸緩衝液の溶液（３ｕＬ、１５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を入れた。これに４Ｄ５アジド含有抗体の溶液（６．５ｕＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ）及び２０ｋＤａ ＰＥＧアルキンの溶液（４ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。別個のチューブに、硫酸銅の溶液（２．０ｕＬ、１０ｍＭ）、及びＴＨＰＴＡ（２．５ｕＬ、４０ｍＭ）、アミノグアニジン（１．０ｕＬ、１００ｍＭ）及びアスコルビン酸ナトリウム（１．０ｕＬ、１００ｍＭ）の溶液を入れた。チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。この銅錯体全体をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、３７℃又は５０℃で２時間インキュベートさせておいた。この反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、２０ｋＤａ ＰＥＧの付加と一致する重鎖の分子量シフトが示された。
ＴＨＰＴＡによる２ｋＤａペグ化。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５アジド含有抗体の溶液（４．９ｕＬ、１３ｍｇ／ｍＬ）及び２０ｋＤａ ＰＥＧアルキンの溶液（４．２ｕＬ、２０ｍＭ）を入れた。別個のチューブに、硫酸銅の溶液（３．５ｕＬ、２０ｍＭ）、及びＴＨＰＴＡ（８．８ｕＬ、４０ｍＭ）、アミノグアニジン（３．５ｕＬ、１００ｍＭ）及びアスコルビン酸ナトリウム（３．５ｕＬ、１００ｍＭ）の溶液を入れた。チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。銅錯体の一部（１．９３ｕＬ）をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、３７℃又は６０℃で２時間インキュベートさせておいた。この反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３４）及びＨＩＣクロマトグラフィーによって分析した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２ｋＤａ分子量ＰＥＧの付加と一致する重鎖の分子量の僅かな増加を示した。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＥＧの付加と一致する完全長抗体の小さい分子量シフトを示した。さらなる確認がＨＩＣクロマトグラフィーによってもたらされ（図３４Ｂ）、これは、抗体へのＰＥＧの付加と一致する単一の主要種を示した。
実施例２０．さらなる細胞毒−アルキン誘導体の調製
アマニチン−シクロオクチン誘導体の調製
α−アマニチン（５ｍｇ、５．５ｕｍｏｌ）及びグルタル酸無水物（１．５ｍｇ、１３．２ｕｍｏｌ）及びピリジン（５００ｕＬ）を、マグネチックスターラを備えた２ｍＬバイアルに入れた。この溶液を一晩撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、少量のジクロロメタン中に取り、メチルｔブチルエーテルで沈殿させた。固形物を次のステップに進めた。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１０３１．４（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１０３３．３。
アマニチン−シクロオクチン誘導体の調製
アマニチン−ＧＡ（５．６ｍｇ、５．５ｕｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４．６ｍｇ）、シクロオクチンアミン（１．８ｍｇ）及びトリエチルアミン（１．９ｕＬ）を５ｍＬ遠心管に入れ、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解した。小型磁気撹拌子を加え、混合物を一晩撹拌した。混合物をメチルｔブチルエーテルから沈殿させた。遠心によって固形物を分離した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１３３７．６（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１３３９．４。
アウリスタチンＦ−シクロオクチン誘導体の調製
マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアルに、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のアウリスタチンＦ（ＡＦ）（５ｍｇ、１０．ｕｍｏｌ）を入れた。この混合物に、ＨＢＴＵ（７．６ｍｇ、２０ｕｍｏｌ）、ＢＣＮアミン（３．２ｍｇ、１０ｕｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．４ｕＬ、２５ｕｍｏｌ）を添加した。バイアルにキャップをして混合物を一晩撹拌させておいた。溶液を逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水０．１％ＴＦＡ勾配）により精製した。所望の画分をプールし、凍結乾燥により粉末化した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値１０５１．７（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値１０５２．７。
ＡＦ−ＰＡ０は、アルキンとアウリスタチンＦとの間のＰＥＧスペーサーを指す。ＡＦ−ＰＡ０に関してはＰＥＧスペーサーがなく、従ってゼロ個である。ＡＦ−ＰＡ３はアルキンとアウリスタチンＦ構造との間に３つのエチレン単位を組み込む。
４ｍＬバイアルに、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のアウリスタチンＦ（ＡＦ）（６．１ｍｇ、８．１８ｕｍｏｌ）を入れた。この混合物に、ＨＢＴＵ（６．２ｍｇ、１６ｕｍｏｌ）、プロパルギルアミン（０．６ｕＬ、９ｕｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｕＬ、２０ｕｍｏｌ）の溶液を添加した。バイアルにキャップをし、混合物を一晩インキュベートさせておいた。溶液を逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水０．１％ＴＦＡ勾配）により精製した。所望の画分をプールし、凍結乾燥により粉末化した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値７８２．５（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値７８３．３。
マグネチックスターラを備えた１ｍＬバイアルに、ＤＭＦ（２００ｕＬ）中のアウリスタチンＦ（ＡＦ）（４．７ｍｇ、６．３ｕｍｏｌ）を入れた。この混合物に、ＨＢＴＵ（６．０ｍｇ、５０ｕＬ ＤＭＦ中１６ｕｍｏｌ）、プロパ−２−イン−１−イルＮ−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エチル｝カルバメート（３．７ｍｇ、１００ｕＬ ＤＭＦ中１４ｕｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．７ｕＬ、２５ｕｍｏｌ）の溶液を添加した。バイアルにキャップをして混合物を一晩撹拌させておいた。溶液を逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水０．１％ギ酸勾配）により精製した。所望の画分をプールし、凍結乾燥により粉末化した。分析的ＭＳ：ｍ／ｚ（ＥＳ＋）計算値９５７．６（Ｍ＋Ｈ）＋、実測値９５８．５。
実施例２１：毒素−アルキン誘導体による抗Ｈｅｒ２抗体とのコンジュゲーション
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）の溶液（２４ｕＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（０．８ｕＬ、１０ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体による４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）の溶液（２４ｕＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−シクロオクチン（Ｃｙｌｃｏｏｃｔｙｎｅ）のＤＭＳＯ溶液（０．８ｕＬ、１０ｍＭｏｌ）を入れ、チューブにキャップをしてボルテックスにかけ、２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、２０ｕＬ）で処理してボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）スピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４：ＬＣ７０）−ＡＦ及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦを、Ｈｅｒ２陽性細胞を死滅させるその能力に関してインビトロ効力アッセイにより評価した。このインビトロアッセイは実施例１６に記載される。簡潔に言えば、ＡＤＣを非コンジュゲート抗体（ハーセプチン）及び遊離薬物と比較した。細胞傷害性アッセイにおいて、ＤＡＲ４ ＡＤＣは、ＳＫＯＶ３及びＳＫＢＲ３などのＨｅｒ２陽性発現細胞株に対し、実施例１５及び図２３に記載する関連のＤＡＲ２（４Ｄ５ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ）化合物と比べてやや強力であることが見出された。これらの化合物は、ＰＣ３などの低Ｈｅｒ２発現細胞株に対しては最小の活性を示した。両方のＡＤＣとも、非コンジュゲート抗体又は遊離薬物と比べてより強力であった（図３５Ａ、図３５Ｂ、図３５Ｃ）。
アマニチン−シクロオクチン誘導体による抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４））のコンジュゲーション
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（３．９４ｕＬ、１３ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにアマニチンアルキンのＤＭＳＯ溶液（１．１３ｕＬ、３ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を２４時間静置しておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、７ｕＬ）で処理し、ボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−アマニチンが得られた。
２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸塩の溶液（５ｕＬ、５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）及び４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（３．９４ｕＬ、１３ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにアマニチンアルキンのＤＭＳＯ溶液（１．１３ｕＬ、３ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を２４時間静置しておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、７ｕＬ）で処理し、ボルテックスし、２時間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）ミニスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−アマニチンが得られた。
４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−アマニチンを、Ｈｅｒ２陽性細胞を死滅させる能力に関してインビトロ効力アッセイにより評価した。このインビトロアッセイは実施例１６に記載される。簡潔に言えば、ＡＤＣを別のＡＤＣ（４Ｄ５ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ）及び遊離薬物と比較した。４Ｄ５ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−アマニチンＡＤＣはＨｅｒ２陽性細胞株ＳＫＢＲ３で活性であった（図３６Ａ）一方、ＰＣ３などの低Ｈｅｒ２発現細胞株では最小の活性を示した（図３６Ｂ）。４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−アマニチンは４Ｄ５ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦと同程度に強力で、遊離薬物単独より強力であった。
実施例２２：ＣｕＡＡＣによるＡＦ−アルキンに対する４Ｄ５ ２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）とのコンジュゲーション
ＡＦ−ＰＡ０又はＡＦ−ＰＡ３との４Ｄ５−２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）のコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸緩衝液（３．０ｕＬ、５０〜５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（２．１ｕＬ、ＰＢＳ中２５ｍ／ｍＬ）及び細胞傷害剤ＡＦ−ＰＡ０又はＡＦ−ＰＡ３の有機溶液（０．７０ｕＬ、ＤＭＳＯ又はプロピレングリコール中５ｍＭ）を入れた。別個のチューブに、硫酸銅（７ｕＬ、１０〜１６０ｍＭ）、ＴＨＰＴＡ（３．６ｕＬ、１０〜１６０ｍＭ）、アミノグアニジン（７．０ｕＬ、１０〜２００ｍＭ）、及びアスコルビン酸ナトリウム（７．０ｕＬ、５０〜３００ｍＭ）の溶液を入れた。ＴＨＰＴＡ−ＣｕＳＯ４錯体にキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。銅錯体（反応当たり１．２３ｕＬ）をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、０．５〜１８時間インキュベートさせておいた（４Ｃ〜６０Ｃ）。この材料をＰｉｅｒｃｅ Ｚｅｂａミニスピンカラム（カタログ番号８９８８２、ＭＷＣＯ＝７０００）に通すことにより脱塩し、１０×ＰＢＳで処理した。或いは、反応混合物をＣＨＴクロマトグラフィーにより精製した。
ＡＦ−ＰＡ０又はＡＦ−ＰＡ３との４Ｄ５−２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）のコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸緩衝液（３．０ｕＬ、５０〜５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（２．１ｕＬ、ＰＢＳ中２５ｍ／ｍＬ）及び細胞傷害剤ＡＦ−ＰＡ０又はＡＦ−ＰＡ３の有機溶液（０．７０ｕＬ、ＤＭＳＯ又はプロピレングリコール中５ｍＭ）を入れた。別個のチューブに、硫酸銅（７ｕＬ、１０〜１６０ｍＭ）、ＴＨＰＴＡ（３．６ｕＬ、１０〜１６０ｍＭ）、アミノグアニジン（７．０ｕＬ、１０〜２００ｍＭ）、及びアスコルビン酸ナトリウム（７．０ｕＬ、５０〜３００ｍＭ）の溶液を入れた。ＴＨＰＴＡ−ＣｕＳＯ４錯体にキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。銅錯体（反応当たり１．２３ｕＬ）をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、０．５〜１８時間インキュベートさせておいた（４Ｃ〜６０Ｃ）。この材料をＰｉｅｒｃｅ Ｚｅｂａミニスピンカラム（カタログ番号８９８８２、ＭＷＣＯ＝７０００）に通すことにより脱塩し、１０×ＰＢＳで処理した。或いは、反応混合物をＣＨＴクロマトグラフィーにより精製した。
室温における１：１のＴＨＰＴＡ：ＣｕＳＯ4比でのＡＦ−ＰＡ０による４Ｄ５−２ＡｚＡｂのコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブに、リン酸緩衝液（２．８ｕＬ、５００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）、４Ｄ５−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）（２．１ｕＬ、２５ｍｇ／ｍＬ）及びＡＦ−ＰＡ０（０．７ｕＬ、５ｍＭ、ＤＭＳＯ溶液）を入れた。別個のチューブに、硫酸銅（３．５ｕＬ、２０ｍＭ）、ＴＨＰＴＡ（１．８ｕＬ、４０ｍＭ）、アミノグアニジン（３．５ｕＬ、１００ｍＭ）、及びアスコルビン酸ナトリウム（５．３ｕＬ、１００ｍＭ）の溶液を入れた。ＴＨＰＴＡ−ＣｕＳＯ４錯体にキャップをしてボルテックスにかけ、１０分間静置させておいた。銅錯体（１．４ｕＬ）をＡｚＡｂ−アルキン溶液に添加した。最終混合物にキャップをしてボルテックスにかけ、室温で１時間インキュベートさせておいた。反応物をＺｅｂａスピンカラム（ＭＷＣＯ＝７０００）で脱塩することにより精製した。ＨＩＣクロマトグラフィーによる反応物の分析は、所望のＤＡＲ２生成物のクリーンな形成を示した。（図３８）。
ＣｕＡＡＣベースの抗Ｈｅｒ２アウリスタチンＡＤＣを、効力及び選択性を計測するインビトロアッセイによって関連のシクロアルキン誘導抗Ｈｅｒ２アウリスタチンＡＤＣと比較した。実施例１６の記載と同様の方法でインビトロ効力アッセイを実行した。ＣｕＡＡＣベースのＡＤＣは、ＳＫＢＲ３及びＳＫＯＶ３などのＨｅｒ２陽性細胞株に対し、シクロアルキン誘導ＡＤＣと同程度の効力を有することが分かった（図３７Ａ、図３７Ｂ）。同じＡＤＣを、低発現Ｈｅｒ２細胞株ＰＣ３に対する選択性に関して試験し、強力でないことが見出された（図３７Ｃ）。
実施例２３ ハーセプチンＡＤＣの作成及びコンジュゲーション
実施例１５に記載される細胞株を使用して、重鎖の２７４位にｎｎＡＡを含むように修飾（突然変異重鎖、配列番号７６、７７；未修飾軽鎖、配列番号７８、７９のとおり）されたハーセプチン（配列番号７４及び７５、軽鎖；配列番号７６、７７、重鎖）、ハーセプチンＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）から誘導した抗Ｈｅｒ２ ａｚＡｂ抗体を作成した。３×１０6細胞／ｍＬを１２５ｍＬのＥｘｃｅｌｌ ＤＨＦＲ培地に播種し、ｌｙｓ−アジドに７日間曝露した。培地を収集し、細胞を遠心（１０００×ｇ、１０分）により回収した。１２．５ｍＬの１０×リン酸緩衝生理食塩水（１０×ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、培地を３００ｕｌ（充填容積）ＩｇＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３回通した。結合したタンパク質を１０カラム容積の０．１％ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ ｐＨ７．５）で洗浄した。ハーセプチン−ＡｚＡｂを０．１Ｍグリシン ｐＨ２．５で溶出し、２５０ｕｌの溶出画分を収集した。５０ｕｌ １Ｍトリス ｐＨ８．０で酸を直ちに中和した。各画分を分光測定法により分析し、ＯＤ２８０の読取りを示す画分を保持した。ピークタンパク質画分を合わせ、タンパク質を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換した。濃縮した試料をコンジュゲーション用に処理した。
実施例１５に記載される細胞株を使用して、重鎖の２７４位にｎｎＡＡを含むように修飾（突然変異重鎖、配列番号７６、７７；未修飾軽鎖、配列番号７８、７９のとおり）されたハーセプチン（配列番号７４及び７５、軽鎖；配列番号７６、７７、重鎖）、ハーセプチンＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）から誘導した抗Ｈｅｒ２ ａｚＡｂ抗体を作成した。３×１０6細胞／ｍＬを１２５ｍＬのＥｘｃｅｌｌ ＤＨＦＲ培地に播種し、ｌｙｓ−アジドに７日間曝露した。培地を収集し、細胞を遠心（１０００×ｇ、１０分）により回収した。１２．５ｍＬの１０×リン酸緩衝生理食塩水（１０×ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、培地を３００ｕｌ（充填容積）ＩｇＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３回通した。結合したタンパク質を１０カラム容積の０．１％ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ ｐＨ７．５）で洗浄した。ハーセプチン−ＡｚＡｂを０．１Ｍグリシン ｐＨ２．５で溶出し、２５０ｕｌの溶出画分を収集した。５０ｕｌ １Ｍトリス ｐＨ８．０で酸を直ちに中和した。各画分を分光測定法により分析し、ＯＤ２８０の読取りを示す画分を保持した。ピークタンパク質画分を合わせ、タンパク質を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換した。濃縮した試料をコンジュゲーション用に処理した。
ハーセプチン−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）に対する２０Ｋ線状ＰＥＧ−シクロアルキンのペグ化。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにハーセプチン−２ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）の溶液（１．０ｕＬ、２．４ｍｇ／ｍＬ）を入れ、続いて２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（１．０ｕＬ、６０ｍｇ／ｍＬ）を入れた。この溶液をボルテクサーで激しく混合した。チューブをＰＣＲチューブ遠心機に数秒間置き、全ての液体をチューブの底に置いた。混合物を４時間静置させておき、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）から、２０ｋＤａ ＰＥＧアルキンが優れた効率で重鎖のアジドに部位特異的にコンジュゲートされ、未反応重鎖は最小限しか乃至全く残らなかったことが示された（図３９）。
ＡＦ−シクロオクチン誘導体によるハーセプチン−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）のコンジュゲーション。２００ｕＬ ＰＣＲチューブにハーセプチン−２ＡｚＡｂの溶液（１９ｕＬ、４．８ｍｇ／ｍＬ）を入れた。これにＡＦ−シクロオクチン誘導体のＤＭＳＯ溶液（１．５ｕＬ、５ｍＭｏｌ）を添加し、チューブにキャップをしてボルテックスにかけた。混合物を２４時間静置させておいた。次に反応混合物をアジドホモアラニンの溶液（ＡＨＡ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中２５０ｍＭ、１０ｕＬ）で処理し、ボルテックスし、６０分間静置させておいた。次に混合物をＺＥＢＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）２ｍＬスピンカラムで脱塩すると、最終的なＡＤＣ溶液が得られた。ＨＩＣクロマトグラフィーによる分析は、所望のＤＡＲ２生成物のクリーンな形成を示した（図４０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）によるさらなる分析は、重鎖の分子量の小さい増加を示し、非還元ＰＡＧＥもまた、主要タンパク質バンドの分子量の増加を示した。
ＣｕＡＡＣ条件下におけるＡＦ−ＰＡ０によるハーセプチン−２ＡｚＡｂのコンジュゲーション。実施例２２に記載する条件下でコンジュゲーションを行った。反応物をＺｅｂａスピンカラム（ＭＷＣＯ＝７０００）で脱塩することにより精製した。ＨＩＣクロマトグラフィーによる反応物の分析は、所望のＤＡＲ２生成物のクリーンな形成を示した（図４１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）によるさらなる分析は、このサブユニットに対する薬物のコンジュゲーションに起因する分子量の小さい増加を示した。さらなるＰＡＧＥ（非還元）分析もまた、主要タンパク質バンドの分子量の増加を示した（図４１）。
インビトロ細胞傷害活性
上記に記載したとおり作成したＡＤＣを、抗Ｈｅｒ２抗体及びＡＤＣ細胞株の活性を試験するのに標準的な標的細胞であるＳＫＯＶ３及びＰＣ３腫瘍細胞株で細胞傷害活性について試験した。ＳＫＯＶ３細胞は高レベルのＨｅｒ２を発現する一方、ＰＣ３細胞はＨｅｒ２を低レベルで発現する。簡潔に言えば、９６ウェルプレートの各ウェルに、各アッセイにつき１０００細胞を播種し、アウリスタチンＦ単独、又はＳＰＡＡＣ又はＣＵＡＡＣケミストリーのいずれかによって作成したハーセプチン−ＡＦコンジュゲートの滴定量とインキュベートする。薬物処理した細胞を１００ｕｌ培地において３７Ｃで３日間インキュベートする。２０ｕｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加して細胞を１６〜２４時間インキュベートし、各ウェルについてＯＤ ４５０ｎｍを決定する。コンジュゲートの細胞傷害活性は、表８に記載されるとおり、インビトロで腫瘍細胞の５０％を死滅させるＡＤＣの濃度として計算した。
上記に記載したとおり作成したＡＤＣを、抗Ｈｅｒ２抗体及びＡＤＣ細胞株の活性を試験するのに標準的な標的細胞であるＳＫＯＶ３及びＰＣ３腫瘍細胞株で細胞傷害活性について試験した。ＳＫＯＶ３細胞は高レベルのＨｅｒ２を発現する一方、ＰＣ３細胞はＨｅｒ２を低レベルで発現する。簡潔に言えば、９６ウェルプレートの各ウェルに、各アッセイにつき１０００細胞を播種し、アウリスタチンＦ単独、又はＳＰＡＡＣ又はＣＵＡＡＣケミストリーのいずれかによって作成したハーセプチン−ＡＦコンジュゲートの滴定量とインキュベートする。薬物処理した細胞を１００ｕｌ培地において３７Ｃで３日間インキュベートする。２０ｕｌのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加して細胞を１６〜２４時間インキュベートし、各ウェルについてＯＤ ４５０ｎｍを決定する。コンジュゲートの細胞傷害活性は、表８に記載されるとおり、インビトロで腫瘍細胞の５０％を死滅させるＡＤＣの濃度として計算した。
図４２Ａ及び図４２Ｂに示すとおり、ＣＵＡＡＣ又はＳＰＡＡＣコンジュゲーションケミストリーで構築したハーセプチン−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＡＦ ＡＤＣを比較した。いずれ場合もハーセプチンＡＤＣはＳＫＯＶ３細胞（Ｈｅｒ２陽性腫瘍細胞株）で強力であったが、ＰＣ３細胞には影響を及ぼさなかった。
図４２Ａ及び図４２Ｂは、表８のＥＣ５０値を導き出す元となった細胞傷害性アッセイを示す。
図４２Ａは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞株におけるハーセプチン−ＡｚＡｂ（ＨＣ２７４）−ＣＵＵＡＣ−ＡＦ及びハーセプチン−ＡｚＡｂ ＳＰＡＡＣ−ＡＦの腫瘍細胞傷害活性を示す。これらの細胞は、種々のコンジュゲーションケミストリーによって作成した、コンジュゲートした毒素を有するＡＤＣにより、効率的に死滅した。明らかにＡＤＣは、恐らくは全てのＡＦを直接細胞へと効率的に標的化させることにより、受動拡散と比較したとき腫瘍細胞を死滅させるのに必要なアウリスタチンＦの濃度を大幅に低下させる。図４２Ｂは、ＰＣ３細胞に対するハーセプチンコンジュゲートの効果を示す。ここでは、ＳＰＡＡＣ及びＣＵＵＡＣ生成コンジュゲートの両方が、調べた濃度では細胞傷害性を示さなかった。これらのデータは、ＣＵＵＡＣ及びＳＰＰＡＡＣの両方のコンジュゲーション方法により作成されたハーセプチンＡＤＣの特異的な標的化及び活性を示している。
参考文献
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２６．Ｆｅｋｎｅｒ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｘ．，＆ Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｋ．（２０１０）．Ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１７１−４１７９．
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２４．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８ Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ．１５，１１８７−１１９７．
２５．Ｗａｎｇ ｅｔ Ａｌ，２０１１ Ａｉｊｕｎ Ｗａｎｇ，Ｎａｔａｌｉｅ Ｗｉｎｂｌａｄｅ Ｎａｉｒｎ，Ｍａｒｃｅｌｌｏ Ｍａｒｅｌｌｉ ａｎｄ ＫｅｎｎｅｔｈＧｒａｂｓｔｅｉｎ（２０１２）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｎｏｎ−Ｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｏｆ．Ｐｒａｖｉｎ Ｋａｕｍａｙａ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−５１−００３７−９，ＩｎＴｅｃｈ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｗｉｔｈ−ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ
２６．Ｆｅｋｎｅｒ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｘ．，＆ Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｋ．（２０１０）．Ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１７１−４１７９．
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通じ、文脈上特に必要ない限り、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載される完全体、ステップ、一群の完全体又は一群のステップの包含を含意し、任意の他の完全体、ステップ、一群の完全体又は一群のステップの排除を含意するものではないことが理解されるであろう。
本明細書で引用される全ての特許及び特許出願は、参照によりその全体を組み入れられる。
Claims (75)
- ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現し、かつ、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な真核細胞株を安定化させる方法であって、ｔＲＮＡＰｙｌ発現が細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する条件下で前記細胞株を培養するステップを含む方法。
- ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する前記条件に、ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできないデコイアミノ酸が前記細胞株の培養培地中に存在する条件が含まれる、請求項１に記載の方法。
- 前記デコイアミノ酸が、Ｎ−ホルミルリシンなどの化学修飾されたアミン基を有するＰｙｌＲＳに対するアミノ酸基質である、請求項２に記載の方法。
- 前記デコイアミノ酸が式ＶＩＩ：
Ｇ＝Ｈ、ＯＨ、−ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3又はＮＨ−Ｋ−Ｑ；
Ｘ＝結合、ＣＨ2、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−又はＣＨ−Ｊ；
Ｊ＝アルキル、アリール、ヘテロアリール又は２０種の天然アミノ酸のうちの一つの側鎖；
Ｙ＝結合、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2；
Ｚ＝Ｏ、ＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＣＨ−ＮＨ2;
Ｋ＝ＣＯ又はＳＯ2；
ａ＝０、１、２又は３；
ｂ＝０、１、２又は３；
Ｑ＝−Ｈ、Ｃ1〜6アルキル、アリール、ヘテロアリール−ＯＣ1〜6アルキル、−ＯＣＨ2アリール、−ＯＣＨ2ヘテロアリール、−Ｃ2〜6アルケニル又は−ＯＣ2〜6アルケニル；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ１〜６アジドアルキル］
の化合物である、請求項２に記載の方法。 - 前記式ＶＩＩの化合物が式ＶＩＩＡ：
- 前記式ＶＩＩの化合物が式ＶＩＩＢ：
ａ＝４又は５；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ1〜6アジドアルキル］
の化合物である、請求項４に記載の方法。 - 前記デコイアミノ酸が、
- ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する前記条件に、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質もまた前記細胞株により発現する条件が含まれる、請求項１に記載の方法。
- ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する前記条件に、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質もまた誘導性プロモーターの制御下で前記細胞株により発現する条件が含まれる、請求項１に記載の方法。
- 前記デコイタンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、アルブミン、ＳＥＡＰ、アクチン、ｂ−２ミクログロブリン、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、ＩｇＧ、又はポリアンバー含有ペプチドから選択される、請求項９に記載の方法。
- ｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低下又は消失する前記条件に、ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制性プロモーターの制御下で起こる条件が含まれる、請求項１に記載の方法。
- ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現するとともに、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質もまた誘導性プロモーターの制御下で発現する安定真核細胞株。
- ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌを発現する又はそれらの発現能を有する安定真核細胞株であって、ｔＲＮＡＰｙｌの発現が抑制性プロモーターの制御下で起こる、安定真核細胞株。
- 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により調製された安定細胞株。
- ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌの発現能を有する安定真核細胞株であって、且つナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできない、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減するデコイアミノ酸の存在下で、前記得られた細胞株を培養又は選択するステップを含む方法。
- ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできない、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減するデコイアミノ酸の存在下で、前記得られた細胞株を培養又は選択するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に導入するステップ、及び（ｄ）前記デコイアミノ酸の非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む方法。
- ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質とを発現する安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記遺伝子が前記細胞株に安定に組み込まれるように導入するステップ、（ｂ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を前記細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するようにさらに導入するステップ、及び（ｃ）ｔＲＮＡＰｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時に前記標的タンパク質も前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下において、前記得られた細胞株を１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で培養するステップを含む方法。
- ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含むデコイタンパク質との発現能を有する安定真核細胞株であって、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡｐｙｌ及び前記デコイタンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡＰｙｌ及び前記デコイタンパク質が安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡｐｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時にデコイタンパク質もまた前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下において、前記得られた細胞株を培養するステップを含む方法。
- 前記デコイタンパク質発現が、条件的に活性化されるプロモーター及びプロモーターシステム、例えばテトラサイクリン調節プロモーター（ＴｅｔＯ又はｔＴＡ；ＴｅｔＯｎ及びＴｅｔＯＦＦ）、ドキシサイクリン誘導性（ＴＲＥ）プロモーター、ｃＡＭＰ誘導性プロモーター、グルココルチコイド活性化プロモーターシステム、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター（ｌａｃ）、Ｃｄ２＋又はＺｎ２＋誘導性プロモーター（金属タンパク質（ｍｅｔｈａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター）、インターフェロン依存性プロモーター（例えばマウスＭＸプロモーター）、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター（Ｔａｔ）、ＤＭＳＯ誘導性プロモーター（ＧＬＶＰ／ＴＡＸＩ、エクジソン）、及びラパマイシン誘導性プロモーター（ＣＩＤ）を含めた前記誘導性プロモーターシステム下にある、請求項３又は１８に記載の方法。
- ＰｙｌＲＳと、ｔＲＮＡＰｙｌと、デコイタンパク質と、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ｐｙｌＲＳ、ｔＲＮＡｐｙｌ、及びデコイタンパク質であって誘導性プロモーターの制御下で発現するデコイタンパク質のコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡＰｙｌ及び前記デコイタンパク質が安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡｐｙｌが前記細胞株によってのみ発現すると同時にデコイタンパク質もまた前記細胞株により発現し、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減される条件下で、前記得られた細胞株を培養するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に、前記細胞株で前記標的タンパク質が安定に発現するように導入するステップ、及び（ｄ）前記デコイタンパク質を発現させることなしに前記標的タンパク質を発現させるステップを含む方法。
- ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡＰｙｌの発現能を有する安定真核細胞株であって、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質をコードする遺伝子の組込みに好適な安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌであって抑制性プロモーターの制御下にあるｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡＰｙｌ発現が抑制され、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減されるようにリプレッサーの存在下で、前記得られた細胞株を培養するステップを含む方法。
- ＰｙｌＲと、ｔＲＮＡＰｙｌと、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質との発現能を有する安定真核細胞株の作製方法において、（ａ）１つ以上のステップで、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌであって抑制性プロモーターの制御下にあるｔＲＮＡＰｙｌのコード遺伝子を真核細胞株に、前記細胞株でＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡＰｙｌが安定に発現するように導入するステップ、（ｂ）ｔＲＮＡＰｙｌ発現が抑制され、従ってｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用が低減されるようにリプレッサーの存在下で、前記得られた細胞株を培養するステップ、（ｃ）１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を前記真核細胞株に導入するステップ、及び（ｄ）ｔＲＮＡＰｙｌが発現するように前記リプレッサーの非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップを含む方法。
- 請求項１５、１８、１９、２１及び２２のいずれか一項に記載の安定真核細胞株の作製方法において、前記細胞株を培養又は選択する前記ステップが、ＰｙｌＲＳに対する基質であるがしかし伸長タンパク質鎖に組み込まれることはできないデコイアミノ酸の存在下で実施され、それによりｔＲＮＡＰｙｌが細胞生存能力及び／又は細胞成長に及ぼす有害作用を低減する、方法。
- 請求項１６、１７、２０又は２２のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- 請求項１８に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- 請求項１９に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- 請求項１５に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- 請求項２１に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- 請求項２３に記載の方法によって得られる又は得ることできる安定真核細胞株。
- ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法において、１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で請求項２４に記載の安定真核細胞株を培養するステップを含む方法。
- ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法において、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を、前記標的タンパク質が前記細胞株で安定に発現するように請求項２５又は２６に記載の安定真核細胞株に導入するステップと、前記１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つ前記デコイタンパク質発現誘導物質の非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップとを含む方法。
- ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法において、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を、前記標的タンパク質が前記細胞株で安定に発現するように請求項２７に記載の安定真核細胞株に導入するステップと、前記１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つデコイアミノ酸の非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップとを含む方法。
- ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法において、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を、標的タンパク質が前記細胞株で安定に発現するように請求項２８に記載の安定真核細胞株に導入するステップと、前記１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下、且つ前記ｔＲＮＡＰｙｌ発現のリプレッサーの非存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップとを含む方法。
- ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質の調製方法において、ナンセンスコドンによりコードされる１つ以上の非天然アミノ酸を含む標的タンパク質のコード遺伝子を、前記標的タンパク質が前記細胞株で安定に発現するように請求項２９に記載の安定真核細胞株に導入するステップと、前記１つ以上の非天然アミノ酸の供給源の存在下で前記標的タンパク質を発現させるステップとを含む方法。
- 化学修飾された標的タンパク質の調製方法において、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法により標的タンパク質を調製するステップと、前記得られた標的タンパク質を化学的に修飾するステップとを含む方法。
- 前記真核細胞株が、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ６、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、マウスハイブリドーマ及びマウス骨髄腫細胞株から選択される哺乳類細胞株である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法又は細胞株。
- 前記ナンセンスコドンがアンバーコドンである、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法又は細胞株。
- ｐｙｌＲＳに対する基質である１つ以上の非天然アミノ酸を含むＩｇＧ型の抗体であって、かかる非天然アミノ酸の位置が重鎖では配列番号８２の１５７位及び２４２位及び配列番号５２及び７９の軽鎖のフレームワーク領域では７０位及び８１位、又は異なるＩｇＧにおける対応する位置から選択される、抗体。
- 両方の重鎖の配列番号８２の１５７位に前記非天然アミノ酸を含む、請求項３８に記載の抗体。
- 両方の重鎖の配列番号８２の１５７位及び両方の軽鎖の配列番号５２及び７９の軽鎖のフレームワーク領域における７０位、又は異なるＩｇＧにおける対応する位置に前記非天然アミノ酸を含む、請求項３８又は３９に記載の抗体。
- 両方の重鎖の配列番号８２の１５７位及び両方の軽鎖の配列番号５２及び７９の軽鎖のフレームワーク領域における８１位、又は異なるＩｇＧにおける対応する位置に前記非天然アミノ酸を含む、請求項３８又は３９に記載の抗体。
- 抗Ｈｅｒ−２抗体である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗ＩＬ−６抗体である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
- タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分にコンジュゲートした、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が、タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートしている、請求項４４に記載の抗体コンジュゲート。
- タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートした抗Ｈｅｒ−２抗体を含む抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の抗体である、請求項４６に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記トリアゾール部分が、前記抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の前記側鎖のアジド又はアルキン部分と、前記タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応によって形成される、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記トリアゾール部分が、前記抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の前記側鎖のアジド又はアルキン部分と、前記タンパク質、薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との、Ｃｕ（Ｉ）触媒作用の条件下における反応によって形成される、請求項４８に記載の抗体コンジュゲート。
- 配列番号５２の軽鎖配列又はそれと９５％以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有するその誘導体と、配列番号４６の重鎖配列又はそれと９５％以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有するその誘導体とを有する抗Ｈｅｒ２抗体であるか；又は配列番号７９の軽鎖配列又はそれと９５％以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有するその誘導体と、配列番号７５の重鎖配列又はそれと９５％以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有するその誘導体とを有する抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 配列番号７９の軽鎖配列又はそれと９５％以上の配列同一性を有し且つ同じＣＤＲを有するその誘導体と、配列番号７７の重鎖配列とを有する抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分が、ＰＥＧ部分を含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記ＰＥＧ部分が０．５〜４０ｋＤａの分子量を有する、請求項５２に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分が、ドキソルビシン、パクリタキセル、アマニチン及びアウリスタチン部分から選択される部分を含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分が、抗体部分を含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- トリアゾール部分を含む前記リンカー又はリンカーが、切断部位を含むスペーサーの前記リンカーが存在することによって切断可能なリンカーである、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記切断部位が酵素不安定性切断部位である、請求項５６に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記トリアゾール部分を含む前記リンカー又はリンカーが、切断可能なリンカーではない、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記トリアゾール部分が、前記抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸側鎖のアジド部分と、前記薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン部分との反応によって形成される、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記ＰｙｌＲＳに対する１つ以上の非天然アミノ酸基質が非天然リシン類似体である、請求項３８〜５９のいずれか一項に記載の抗体又は抗体コンジュゲート。
- 前記ＰｙｌＲＳに対する１つ以上の非天然アミノ酸基質が（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸である、請求項３８〜５９のいずれか一項に記載の抗体又は抗体コンジュゲート。
- 前記薬物又はＰＥＧ部分に結合した前記アルキン部分がシクロオクチン部分などのシクロアルキンである、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートした抗体であって、前記トリアゾール部分が、前記抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド部分と、前記薬物又はＰＥＧ部分に結合したアルキン部分との反応によって形成され、及び前記アルキン部分がシクロオクチン部分などのシクロアルキンである、抗体を含む、請求項４４に記載の抗体コンジュゲート。
- タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分に、トリアゾール部分を含むリンカーを介してコンジュゲートした抗体であって、前記トリアゾール部分が、前記抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアルキン部分と、前記薬物又はＰＥＧ部分に結合したアジド部分との反応によって形成され、及び前記アルキン部分がシクロオクチン部分などのシクロアルキンである、抗体を含む、請求項４４に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記ＰｙｌＲＳに対する１つ以上の非天然アミノ酸基質が非天然リシン類似体である、請求項６３〜６４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記ＰｙｌＲＳに対する非天然アミノ酸基質が（Ｓ）−２−アミノ−６（（２−アジドエトキシ）カルボニルアミノ）ヘキサン酸である、請求項６３〜６４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記ＰｙｌＲＳに対する非天然アミノ酸基質が式ＶＩ．１である、請求項６３〜６４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分がＰＥＧ部分を含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分が、ドキソルビシン、パクリタキセル及びアウリスタチン部分から選択される部分を含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ以上の部分が抗体部分を含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が抗ＰＳＭＡ抗体、例えばｓｃｆｖである、請求項６３〜６７及び７０のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が配列の配列番号６０の抗ＰＳＭＡ抗体であり、非天然アミノ酸が１１７位に組み込まれている、請求項７１に記載の抗体コンジュゲート。
- 前記抗体が抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
- 式ＶＩＩＢのアミノ酸誘導体：
ａ＝４又は５；及び
Ｒ＝Ｃ1〜6アルキル、Ｃ2〜6アルケニル、−ＣＨ2アリール、Ｃ2〜6アルキニル、Ｃ1〜6ハロアルキル又はＣ1〜6アジドアルキル］。 - 前記デコイアミノ酸が、
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