JP2019500051A - 変異ウイルス、その調製方法およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
数年の研究の後、原核生物リボソームの翻訳メカニズムが包括的に理解され、異なる機能状態を有する様々なリボソームの結晶およびその電子顕微鏡構造が解明され、ほとんどのアミノtRNAシンテターゼの構造も解明されている。これらの研究結果に基づいて、近年、遺伝コード拡張技術が開発され、それによってアンバー終止コドン(TAG)が、複数の非天然アミノ酸をコードするために使用され、生物に部位特異的に挿入される。これまで、この技術は、いくつかの非天然アミノ酸を、生細胞の標的タンパク質において成功裏に部位特異的に発現させることを可能にし、これらのタンパク質に新規な物理的、化学的および生理学的特性を付与した。このアプローチを使用することによって、非天然アミノ酸(親和性標識および光異性化アミノ酸、カルボニルアミノ酸ならびにグリコシル化アミノ酸を含む)をタンパク質に導入できる(L. Wang et al, 2001, SCIENCE 292: 498-500; J. W. Chin et al, 2002, Journal of the American Chemical Society 124 : 9026-9027; J. W. Chin &P. G. Schultz, 2002, ChemBioChem 11: 1135-1137)。これらの研究は、例えば、カルボニル、アルキニル、およびアジド基などの特殊な化学基のような化学官能基をタンパク質に選択的かつ日常的に導入することが可能であることを示す。一般に、これらの基は、安定した共有結合を効率的かつ選択的に形成することができ、これは、タンパク質の部位特異的修飾およびタンパク質の特性の改善により貢献する。この技術は、タンパク質の部位特異的修飾だけでなく、生物(例えば、ウイルス、細菌など)の部位特異的標識、部位特異的修飾および複製制御などにも使用することができる。TAG終止コドンが導入される生物の増殖およびタンパク質発現は、対応する外因性非天然アミノ酸を含むバイオ直交系に依存する。
に示されるLys−ジアジリン、式(II)
に示されるLys−アジド、または、ジアジリンもしくはアジド構造を含む別の非天然アミノ酸から選択される。
本発明の一つの具体的な実施形態において、アンバーコドンTAGを有するインフルエンザウイルス遺伝子を、ベクター(例えば、PHH21プラスミド)へと挿入し、次いで、宿主細胞(例えば、293T細胞)に、pACYC−tRNA/PylRSプラスミドと共にそのベクターをトランスフェクトする。したがって、部位特異的変異インフルエンザウイルスは、Lys−ジアジリンおよびLys−アジドのような非天然アミノ酸を培養培地中に添加することによって得ることができる。
1.ウイルスの少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する位置において1つ以上のUAGコドンを含むことを特徴とする、変異ウイルス。
1つ以上のUAGコドンは、前記終止コドン上流の1つ以上のコドンを置換し得る。1つ以上のUAGコドンは、前記終止コドン上流の1つ以上のコドンの前記位置に挿入され得る。1つ以上のUAGコドンは、前記終止コドン上流の1つ以上のコドンを置換し得、1つ以上のUAGコドンは、前記終止コドン上流の1つ以上のコドンの前記位置に挿入され得る。
2.手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、C型肝炎ウイルスHCV、B型肝炎ウイルスHBV、A型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスHPV、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスRSV、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、SARS、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、項目1に記載の変異ウイルス。
3.ウイルスがインフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NSまたはMタンパク質から選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、項目1に記載の変異ウイルス。
4.PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NSまたはMタンパク質からなる群から選択される少なくとも2つ、3つまたは4つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、項目3に記載の変異インフルエンザウイルス。
5.PA、PB1、PB2、およびNPタンパク質からなる群から選択される少なくとも2つ、3つまたは4つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、項目3に記載の変異インフルエンザウイルス。
6.インフルエンザウイルスが、本明細書の表2a)、2b)、2c)、2d)、2e)、2f)、2g)、2h)および2i)に列挙される1つ以上の遺伝子座位内の1つ以上の位置においてUAGコドンを含む、項目3に記載の変異インフルエンザウイルス。
7.インフルエンザウイルスが、PAタンパク質のR266、PB1タンパク質のR52、PB2タンパク質のK33、および/またはNPタンパク質のD101をコードする核酸のコドンの位置においてUAGコドンを含む、項目3に記載の変異インフルエンザウイルス。
8.ウイルス内のタンパク質が、UAGコドンに対応する位置において非天然アミノ酸を含み、好ましくは非天然アミノ酸が、式(I)
に示されるLys−ジアジリン、式(II)
に示されるLys−アジド、または、ジアジリンもしくはアジド構造を含む他の少なくとも1つの非天然アミノ酸から選択されることを特徴とする、項目1から7のいずれか1項目に記載の変異ウイルス。
9.非天然アミノ酸がn位に位置するLys−ジアジリンであり、非天然アミノ酸が次の様式:
式中、R1からR2への向きが、アミノ酸配列のN末端からC末端への向きであり、n位がインフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS、またはMタンパク質のいずれか1つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、R1が1位からn−1位までのアミノ酸残基を表し、R2がn+1位からC末端までのアミノ酸残基を表し、R3が、
好ましくは、nがタンパク質の開始コドンのp−1位下流からその天然の終止コドンのq位上流までの任意の位置であり、pおよびqが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、または全長のアミノ酸配列の長さから1引いたものと等しい値までから独立して選択される、項目8に記載の変異ウイルス。
10.非天然アミノ酸がn位に位置するLys−ジアジドであり、非天然アミノ酸が次の様式:
式中、R1からR2への向きが、アミノ酸配列のN末端からC末端への向きであり、n位がインフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS、またはMタンパク質のいずれか1つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、R1が1位からn−1位までのアミノ酸残基を表し、R2がn+1位からC末端までのアミノ酸残基を表し、R4が、
好ましくは、nがタンパク質の開始コドンのp−1位下流からその天然の終止コドンのq位上流までの任意の位置であり、pおよびqが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、または全長のアミノ酸配列の長さから1引いたものと等しい値までから独立して選択される、項目8に記載の変異ウイルス。
11.タンパク質内の複数の位置において非天然アミノ酸を含む、項目8から10のいずれか1項目に記載の変異ウイルス。
12.ウイルスがインフルエンザウイルスであり、PAのR266、PB1のR52、PB2のK33、およびNPのD101において非天然アミノ酸を含む、項目11に記載の変異ウイルス。
13.ウイルスのタンパク質をコードする配列の内在性UAG終止コドンが、UAA終止コドンを提供するように変異している、項目1から12のいずれか1項目に記載のウイルス。
14.ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
非変異PB2のアミノ酸配列が配列番号2に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異PB1のアミノ酸配列が配列番号3に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異PAのアミノ酸配列が配列番号4に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異HAのアミノ酸配列が配列番号5に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異NPのアミノ酸配列が配列番号6に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異NAのアミノ酸配列が配列番号7に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異Mのアミノ酸配列が配列番号8に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、または
非変異NSのアミノ酸配列が配列番号9に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一である、
項目3から13のいずれか1項目に記載の変異ウイルス。
15.変異ウイルスが、WSN−RNP−TAGであり、PAタンパク質のR266、PB1タンパク質のR52、PB2タンパク質のK33、およびNPタンパク質のD101をコードするコドンの位置においてUAGコドンを含む、項目14に記載の変異ウイルス。
16.ウイルスがヒトまたは他の動物起源のインフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザA、BまたはCウイルスである、項目3に記載の変異ウイルス。
17.本明細書の表2a)〜2i)および表4に列挙される1以上の変異を含む、項目3に記載の変異ウイルス。
18.核酸分子が、天然終止コドンに加えて、人為的に導入されたUAGをさらに含むことを特徴とする、項目1から17のいずれか1項目に記載の変異ウイルスをコードする核酸分子またはそれによってコードされる変異タンパク質。
(1)好適なベクターに作動可能に連結した1つ以上の変異遺伝子を含む変異核酸を含む発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む核酸を含む1つ以上の発現ベクターを、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異核酸を含む発現ベクターをtRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
(2)トランスフェクトした細胞をLys−ジアジリンまたはLys−アジドを含む培養培地中で培養するステップと、
(3)変異ウイルスを回収するステップと
を含む方法。
20.ステップ(1)におけるプラスミドが、2011年6月14日にChina General Microbiological Culture Collection Centre(CGMCC)に寄託され、受託番号CGMCC No:4951を有する大腸菌pACYC−tRNA/PylRS内のプラスミドpACYC−tRNA/PylRSである、項目19に記載の方法。
21.動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは293細胞、293T細胞、Vero細胞、A549細胞、Hela細胞、CHO細胞、MDCK細胞、またはsf9細胞から選択される、項目19に記載の方法。
22.tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株が、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、項目19に記載の方法。
23.弱毒化ウイルスをスクリーニングする方法であって、
(1)遺伝子変異:ウイルスゲノム内の1つ以上の遺伝子の1つ以上の選択されたコドンを、遺伝子工学の方法によってTAGコドンに変異させて1つ以上の変異遺伝子を得るステップと、
(2)発現ベクターの構築:ステップ(1)において得られた1つ以上の変異遺伝子を好適なベクターに作動可能に連結して、変異遺伝子の発現ベクターを得るステップと、
(3)ステップ(2)において得られた変異遺伝子の発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む遺伝子を含む1つ以上の発現ベクターを、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異遺伝子を含む発現ベクターをtRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
(4)トランスフェクトされた細胞をLys−ジアジリンまたはLys−アジドを含む培養培地中で培養し、培地の上清を収集し、Lys−ジアジリンまたはLys−アジドを含むプレートを用いて、非天然アミノ酸に対する上清中のウイルスの依存性を検出するステップと、
(5)非天然アミノ酸Lys−ジアジリンまたはLys−アジドに対する依存性を維持する変異体を弱毒化ウイルスとして同定するステップと
を含む方法。
24.ステップ(5)の後に、(6)ステップ(5)における成功裏に部位特異的変異させた候補の変異部位を組み合わせ、ウイルスを再パッケージングしてUAGコドンが複数の遺伝子断片に導入され、非天然アミノ酸がパッケージングされたウイルス内の複数の対応するタンパク質に導入されるようにし、非天然アミノ酸に対するパッケージングされた生成物の依存性を再び検出し、長期間の継代の後に非天然アミノ酸に対する依存性を保持する組み合わされた変異体を、最適な部位特異的変異の候補として決定するステップをさらに含む、項目23に記載の方法。
25.ステップ(6)の後に、(7)ステップ(6)において得られた変異ウイルスの安全性を調べ、安全なウイルスを同定するステップをさらに含む、項目24に記載の方法。
26.ウイルスが、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、C型肝炎ウイルスHCV、B型肝炎ウイルスHBV、A型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスHPV、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスRSV、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、SARS、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、項目23に記載の方法。
28.ウイルスがインフルエンザウイルスである、項目23に記載の方法。
29.ステップ(3)におけるプラスミドが、2011年6月14日にCGMCCに寄託され、受託番号CGMCC No:4951を有する大腸菌pACYC−tRNA/PylRS内のプラスミドpACYC−tRNA/PylRSである、項目23に記載の方法。
30.動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは293細胞、293T細胞、Vero細胞、A549細胞、Hela細胞、CHO細胞、MDCK細胞、またはsf9細胞から選択される、項目23に記載の方法。
31.tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株が、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、項目23に記載の方法。
32.変異、パッケージングおよびスクリーニングのステップが繰り返される、項目23に記載の方法。
33.インフルエンザウイルスがインフルエンザA、BまたはCウイルスである、項目23から32のいずれか1項目に記載の方法。
34.項目1から17のいずれか1項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む組成物。
35.項目1から17のいずれか1項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含むワクチン。
36.項目1から17のいずれか1項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルス、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
37.インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するための生弱毒化ワクチンまたは関連する医薬の製造における、項目1から17のいずれか1項目に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
38.インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の予防または治療における、項目1から17のいずれか1項目に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
39.tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現することができ、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、動物細胞株。
部位特異的変異を含むインフルエンザウイルスWSNの遺伝子ベクターの構築
(1)補助プラスミドの作製
プラスミドpACYC−tRNA/PylRS(これ以降「補助プラスミド」と呼ぶ)を、受託番号No.CGMCC No:4951を有する大腸菌(China General Microbiological Culture Collection Centerに寄託され、株はNo.1 of Beichen West Road、Chaoyang District、Beijing City、Institute of Microbiology、Chinese Academy of Sciencesに寄託され、プラスミドは2011年6月14日に寄託され、大腸菌と称される細菌細胞はプラスミドpACYC−tRNA/PylRSを含む)から取得し、プラスミドは、非天然アミノ酸Lys−ジアジリンおよびLys−アジドを特異的に認識するtRNAおよびtRNAシンテターゼを発現することができる。
Pubmedによって公開されたインフルエンザウイルスA/WSN/1933の遺伝子配列に従って、インフルエンザウイルスの様々な遺伝子断片の遺伝子を全ゲノム合成によって取得した。インフルエンザウイルスの様々な遺伝子配列を、それぞれ、配列番号2〜9に示す。次いで、遺伝子配列を、pHH21、pCDNA3(neo)またはpcAAGGS/MCSベクターに連結し、野生型インフルエンザウイルスWSNをレスキューするためのプラスミドを取得した。取得したプラスミドの名称および構成を表1に示す。
インフルエンザウイルスの様々なタンパク質のアミノ酸の保存性を、バイオインフォマティクスツール「Consurf」を用いて解析した。保存、比較的保存、比較的非保存、および非保存のアミノ酸の部位(NP−PDB:2IQH;PA−PDB:4IUJ;PB1−PDB:3A1G、2ZNL;PB2−PDB:4ENF;NA−PDB:3TI6;HA−PDB:1RVT;M−PDB:4PUS、2RLF、3BKD;NS−PDB:3L4Q)を、解析したインフルエンザウイルスタンパク質の結晶構造に従って、変異のために選択した。各々のタンパク質において選択した変異部位を、それぞれ表2a)〜表2i)に示す。
Ben1 pPolI−WSN−PB2、Ben2 pPolI−WSN−PB1、Ben3 pPolI−WSN−PA、Ben4 pPolI−WSN−HA、Ben5 pPolI−WSN−NP、Ben6 pPolI−WSN−NA、Ben7 pPolI−WSN−M、またはBen8 pPolI−WSN−NSを鋳型プラスミドとして用い、従来のプライマー設計ガイドラインに従ってプライマーを設計し、部位特異的変異導入キット(QuikChange(登録商標)Lightning Site−Directed Mutagenesis Kits(カタログ番号210518)を用いて、表2a)〜2i)に列挙されるアミノ酸の部位に対応するコードヌクレオチドをアンバー終止コドンTAGへと変異した。変異の成功をシークエンシング手段によって確認した。
いくつかのタンパク質の選択した部位における変異を、表3に示すプライマー配列を用いて実施した。
ピューロマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性を有し、それぞれアミノアシル−tRNAシンテターゼおよび39位におけるTAG変異を有するGFPレポーター遺伝子を保有する、2つのレンチウイルス過剰発現ベクターを構築し、安定な細胞株pylRS/GFP39TAGを、HEK−293T細胞の2ラウンドのウイルス形質導入およびピューロマイシン/ハイグロマイシンスクリーニングによって得た。その後、12コピーのtRNAを有し、ゼオマイシン耐性を有するbjmu−zeo−12tRNAベクターを構築し、次いで、細胞株pylRS/GFP39TAGにプラスミド線状化を経てベクターをトランスフェクトし、UAAの存在下でゼオマイシンスクリーニングに供し、GFP陽性細胞を分離した(この細胞はUAAの存在下で緑色であり、UAAを除去したとき無色になった)。これにより、直交tRNA /アミノアシルtRNAシンテターゼを安定に発現する安定細胞株HEK293−PYLを得た(図11A)。
psd31ベクターから出発し、最初にsv40−puroR遺伝子を、それぞれBamHI/xbal制限酵素部位を通じてIRES−puroRおよびIRES−hygroR遺伝子によって置き換え、異なる耐性を有する、2つのウイルスベクターpsd31−IRES−puroRおよびpsd31−IRES−hygroRを生じた。IRESは、配列内リボソーム進入部位であり、IRES配列は、多シストロン性遺伝子の発現に典型的に利用される。例えば、IRES配列が目的の遺伝子の後に挿入され、その後に選択可能なマーカー遺伝子が続き、そのような転写mRNAは、両方のタンパク質を同時に発現できるようになる。IRES系を用いる目的の遺伝子を過剰発現は2つの利点がある:1.目的の遺伝子、およびマーカー遺伝子がプロモーターを共有し、偽陽性の発生を避ける、2.IRES翻訳の効率が、開始部位における伝統的な翻訳よりも低いため、目的の遺伝子の発現レベルがマーカー遺伝子のものよりも高い。したがって、CMV−pylRS配列およびCMV−GFP39TAG配列が、BamHI制限部位を通じてIRES部位の前にそれぞれ導入され、目的の2つのタンパク質を同時に過剰発現することができる二重ウイルス系psd31−CMV−pylRS−IRES−puroR/psd31−CMV−GFP39TAG−IRES−hygroRを得た。
安定なプラスミドトランスフェクションの手段によってtRNAを過剰発現した。tRNAの発現レベルを確かにするため、配列番号1に記述される配列を有するbjmu−12t−zeoベクターを構築し、取得した(図11C)。
psd31−CMV−pylRS−IRES−puroRウイルスをパッケージングし、HEK293T細胞に形質導入し、0.6μg/mlの濃度でピューロマイシンスクリーニングを実施し、よって安定な細胞株「No.1」を得た。次いで、psd31−CMV−GFP39TAG−IRES−hygroRウイルスを添加し、200μg/mlの濃度でハイグロマイシンスクリーニングを実施し、よって安定な細胞株「No.2」を得た。
3ラウンドのスクリーニングを、安定なプラスミドトランスフェクションの手段によって実施し、直交tRNA/アミノアシル−tRNAシンテターゼを安定に発現する特殊な細胞株を最終的に取得したが、ステップは次のようであった:
A.酵素消化によるbjmu−12t−zeoベクターの線状化の後、pylRSおよびGFP39TAGタンパク質を発現する安定な細胞株No.2にベクターをトランスフェクトした(10cmディッシュ、ディッシュ当たり10μgプラスミド、トランスフェクションは、抗生剤の非存在下で実施した);
B.トランスフェクションの6時間後、液体を交換し、非天然アミノ酸を添加した;
C.トランスフェクションの48時間後、緑色蛍光を観察し、液体を交換し、400μg/mlのゼオマイシンを添加した;
D.全てのブランク群が死滅するまで3日ごとに液体を交換し、トランスフェクション群においてクローンを形成した;
E.GFP陽性クローンを単離して精製し、半分の用量のゼオマイシンを含む増幅培地へと供し、12t−zeo安定化細胞株HEK293−PYLを得た。
Neumannら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 9345-50)に開示されるインフルエンザウイルスをレスキューするための通常の方法に従ってインフルエンザウイルスをレスキューするのに使用される12のプラスミドを安定な細胞株に共トランスフェクトし、12のプラスミドのうちの対応するプラスミドのみが、部位特異的変異プラスミドと置き換えられた。6ウェルプレートの各々のウェルに対し、0.1μgの各々のプラスミドを添加した。トランスフェクションの後、細胞の病的な状態を観察し、ウイルスをレスキューでき、かつ非天然アミノ酸に依存性である変異部位を、スクリーニングした。スクリーリングした部位を、タンパク質および変異部位によって命名した。例えば、Ben3 pPolI−WSN−PAプラスミドを変異導入した。変異を成功裏に実施した後、ステップ(5)で樹立した安定な細胞株に、インフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドBen1 pPolI−WSN−PB2、Ben2 pPolI−WSN−PB1、Ben4 pPolI−WSN−HA、Ben5 pPolI−WSN−NP、Ben6 pPolI−WSN−NA、Ben7 pPolI−WSN−M、Ben8 pPolI−WSN−NS、Ben9 pcDNA 3(neo)−PB2;Ben10 pcDNA 3(neo)−PB1;Ben11 pcDNA 3(neo)−PA;およびBen13 pcAGGS/MCS−NPと共に変異プラスミドを共トランスフェクトし、それによって、インフルエンザウイルスのPA遺伝子断片のS1部位にコドンTAGを導入した変異インフルエンザウイルスをレスキューしたが、ここで部位はPA−S1と称され、呼称は表2a)〜表2i)に示す変異部位に対応する。
同一の手順に従い、他の部位にTAGコドンを導入した変異インフルエンザウイルスを取得でき、変異部位に従って命名した。
部位特異的変異インフルエンザウイルスの発現および精製
TAGコドンが導入されたインフルエンザウイルスをレスキューするための本発明におけるプラスミドコンストラクトは、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現できる哺乳動物安定細胞株において転写され、発現することができる。これらのタンパク質翻訳系は、インフルエンザウイルスの対応するタンパク質に対して、非天然アミノ酸Lys−ジアジリンまたはLys−ジアジリンに構造的に類似するアジド非天然アミノ酸であるLys−アジドを組み込むのに使用でき、インフルエンザウイルスの対応するタンパク質の部位特異的変異導入をもたらす。
次に、2つの非天然アミノ酸Lys−ジアジリンまたはLys−アジドの成功した組み込みおよび変異タンパク質の生産性能を試験した。
非天然アミノ酸Lys−ジアジリン化学合成のための反応式を以下に示す:
実施例1のステップ(6)における部位特異的変異導入の後のインフルエンザウイルスのレスキューにおいて取得したインフルエンザパッケージングプラスミドを、ステップ(5)の安定な細胞株に共トランスフェクトし;6時間後、1%のFBS、2μg/mlのTPCK−トリプシン、1mMの非天然アミノ酸Lys−ジアジリンを含む新しい培養培地を用いた;そして非天然アミノ酸Lys−ジアジリンを含まない培養培地をコントロールとして使用した。このレスキュー実験において、野生型インフルエンザウイルスWSNを陽性コントロールとして使用し、ウイルスをレスキューするためのプラスミドを除いて、変異インフルエンザウイルスのレスキューにおけるものと同一の条件であった。トランスフェクションが完了した後、細胞の状態を毎日観察した。細胞にトランスフェクトするのに使用したインフルエンザウイルス変異体は、非天然アミノ酸を含む培地で培養したとき細胞が病変を示し、非天然アミノ酸を含まない培養培地で培養したとき病変をまったく示さなかった場合に、陽性変異体として同定した。対照的に、野生型インフルエンザウイルスで感染した細胞は、非天然アミノ酸の存在または非存在の培養培地中で培養したときに、病変を示した。
1)変異インフルエンザウイルスをレスキューしたステップ(2)の細胞株が完全に病変を示したとき、細胞上清を収集し、5000gで10分間遠心し、上清を0.45μm膜を通してろ過した。
2)インフルエンザウイルスを以下のようにスクロース密度勾配遠心分離によって精製した:ステップ1)のウイルス溶液を50mlの遠心チューブ(高速に耐えるようにされている)中で105gで2時間遠心し、沈殿物をもたらし、1mlのPBSでの再懸濁が後に続いた。
3)スクロースをNTEバッファー(100mM NaCl、10mM Tris−Cl、pH7.4、1mM EDTA)に溶解し、20%スクロース溶液を作製し、そして溶液を0.45μm膜上でろ過した。
4)ステップ3)のスクロース溶液を50mlまたは15mlの遠心チューブに添加し、ステップ2)のPB懸濁液をスクロース溶液上に滴下し、遠心を11×104gで2時間実施した。
5)約15mlのNTEバッファーを沈殿物に添加し、11×104gで2時間さらに遠心した。
6)ステップ5)の沈殿物をPBSで再懸濁した。
(4)変異インフルエンザウイルスにおけるLys−アジドの組み込みおよび発現、ならびにインフルエンザウイルスの精製
非天然アミノ酸Lys−アジド化学合成のための反応式を以下に示す:
生成物2(500mg、5.74mmol)を、THF(10ml)中のトリホスゲン(1.70g、5.74mmol)の溶液へと添加し、0℃で8時間、撹拌条件下で反応させ、蒸発に供して溶媒を除去した。残渣を真空下で1時間乾燥し、生成物3として無色油状液体をもたらした。
Lys−ジアジリンをLys−アジドと置き換えたこと以外は、他の条件は上述のステップ2〜3のものと同一であった。変異が成功であること、および対応する変異部位にUAGを導入した変異インフルエンザウイルスを得たことを確認するために変異ウイルスの導入に際して細胞病変形成の発生を観察した。
5. 変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagのレスキュー効率に関する研究
本発明者らは、正常哺乳動物細胞株293Tによる変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagをレスキューする効率と、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株HEK293−PYLのものと比較した。
細胞レベルにおける変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagの安全性に関する研究
調製した変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagの長期的な連続的継代培養を実施することによって、本発明者らは、変異インフルエンザウイルスの変異部位におけるUAGコドンの安定性を調査した。具体的な実験は次のとおりであった:新規に調製した変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagを1%FBS、2μg/mlのTPCK−トリプシンおよび1mMの非天然アミノ酸NAEKを含む新規の培地にMOI=0.01で接種し、コントロールとして感染した安定な細胞と非天然アミノ酸NAEKを含まない培地を用いた。1mMのNAEK培地中の細胞が完全に病変を示したのち、上清を除去し、0.45μm膜上でろ過し、1/1000の比で新規培地に接種し、コントロールとして感染した安定な細胞と非天然アミノ酸NAEKを含まない培地を用いた。そのような繰り返しによってウイルスの長期間の継代を実施した。
図4は、変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagが、長期間の継代の後、その非天然アミノ酸に対する依存性を維持したこと、すなわち、それが、非天然アミノ酸を含む培地においてのみ大規模で再生産して細胞に病変を起こすことができることを示した。これは、インフルエンザウイルス遺伝子に導入されたUAGコドンがずっと安定に存在していたことを示し、選択した部位が遺伝的に安定であることを実証した。
動物における変異インフルエンザウイルスWSN−RNP−tagの安全性および効率に関する研究
実験プログラムは図7を指すことができ、具体的な実施は以下の通りであった:
1)80匹のマウスを、各々の群に10匹のマウスとして8群に分割した。
2)マウスを環境に適用させるため1日間飼育した。
3)次の日に、マウスを秤量し、各々の群より5匹のマウスを選択し、それらの血清を収集した(マウスを失血死から保護するため20〜40μlの血液量を収集し、収集した血清を−80℃の冷凍保存に供した)。
4)2日間の飼育の後(血液を収集した動物は正常状態に復帰した)、群およびウイルス溶液のチューブ番号に従って次の対応するウイルス溶液をマウスに接種した。
ウイルス接種の方法:麻酔したマウスに、点鼻法により50μlのウイルス溶液を鼻腔内接種した。半致死量LD50は、10000ウイルス粒子/50μlであった。1倍致死量は、10*LD50であり、105ウイルス粒子/50μlに相当した。10倍致死量は、100*LD50であり、106ウイルス粒子/50μlに相当した。
第1の群は、チューブ番号1中のウイルス溶液(組成物:PBS)を接種した。
第2の群は、チューブ番号2中のウイルス溶液(組成物:WSN野生型の1倍致死量)を接種した。
第3の群は、チューブ番号3中のウイルス溶液(組成物:WSN−RNP型の1倍致死量)を接種した。
第4の群は、チューブ番号4中のウイルス溶液(組成物:WSN−RNP−tagの5倍致死量)を接種した。
第5の群は、チューブ番号5中のウイルス溶液(組成物:WSN−RNP−tagの10倍致死量)を接種した。
第6の群は、チューブ番号6中のウイルス溶液(組成物:不活化WSNの1倍致死量)を接種した。
第7の群は、チューブ番号7中のウイルス溶液(組成物:不活化WSNの5倍致死量)を接種した。
第7の群は、チューブ番号8中のウイルス溶液(組成物:不活化WSNの10倍致死量)を接種した。
群間の交差感染を防いだ。
5)接種後の各々の日において、マウスを秤量し、その体重を記録し、マウスの死亡を記録した。
6)ウイルス溶液の接種後14日目と21日目において、マウスの血清を再び収集した(20〜40μlの血液を収集し、収集した血清を−80℃の冷凍保存に供した)。
7)ウイルス溶液の接種後21日目において、各々のマウスに、100*LD50の用量の50μlの新規のウイルス溶液で鼻腔内感染した。
図9Bに示すように、免疫前後のマウスの各々の群における抗HA抗体のレベルをELISAアッセイによって試験した。結果は、免疫後14日、および免疫後21日でマウスにおける抗体のレベルは増加し、21日目における抗体のレベルは、14日目におけるものよりも高かったことを示した。
(実施例5)
インフルエンザウイルスワクチンによってワクチン接種されたマウスにおける抗−NAタンパク質および抗−NPタンパク質のレベルの測定
実施例4に記載されるウイルスを接種する方法に従って、マウスにWSN−RNP−tagおよび不活化WSNを接種した。
(実施例6)
WSN−RNP−tagによるマウス肺におけるウイルスに対する特異的IgAの産生の誘導
具体的な実施は以下のとおりであった:
1)15匹のマウスを、各々の群に5匹のマウスとして3群に分割した。
2)マウスを環境に適用させるため1日間飼育した。
3)次の日に、群およびウイルス溶液のチューブ番号に従って次の対応するウイルス溶液をマウスに接種した。
ウイルス接種の方法:麻酔したマウスに、点鼻法により50μlのウイルス溶液を鼻腔内接種した。実施例4と同様に、半致死量LD50は、10000ウイルス粒子/50μlであり;1倍致死量は10*LD50であり;10倍致死量は100*LD50であった。
第1の群は、チューブ番号1中のウイルス溶液(組成物:PBS)を接種した。
第2の群は、チューブ番号2中のウイルス溶液(組成物:WSN−RNP−tagの10倍致死量)を接種した。
第3の群は、チューブ番号3中のウイルス溶液(組成物:不活化WSNの10倍致死量)を接種した。
群間の交差感染を防いだ。
4)ウイルス溶液の接種後21日目に、各々の群のマウスより肺組織を摘出し、PBSで洗浄し、洗浄溶液を収集した。収集した洗浄溶液を−80℃の冷凍保存に供した。
図13に示した結果は、WSN−RNP−tagが、不活化WSNと比べて高いレベルでIgAの産生を誘導できたことを実証し、これはマウスに交差免疫保護をもたらすために有益であった。
WSN−RPN−tagで免疫するマウスの肺におけるNP特異的CD8+T細胞の量の変化
試験方法:マウスを免疫した3週間後、マウスの肺組織を摘出し、そこからTリンパ球を単離した。Tリンパ球を抗マウスCD8a−APC抗体およびインフルエンザNP366−374−四量体−PEで染色した。インフルエンザ特異的CD8+T細胞の数(割合)をフローサイトメトリーで測定したが、このステップは、参考文献Budimir, N. et al., Heterosubtypic cross-protection induced by whole inactivated influenza virus vaccine in mice: influence of the route of vaccine administration. Influenza Other Respir Viruses 7, 1202-1209 (2013)に見出される。
本発明者らの調製するUAGコドンを含むウイルスワクチンの野生型ウイルスに対する阻害効果の研究
UAGコドンを含むウイルスの、野生型ウイルスの複製に対する効果を、最初に細胞レベルで調査した。具体的な実施は以下のとおりであった:
1. 6ウェルプレートにMDCK細胞を、ウェル当たり5×105個の細胞で提供した。
2. 24時間後、細胞に野生型ウイルス(MOI=0.01)を感染させるか、または野生型ウイルスおよび変異ウイルス(MOI=0.1または1)の混合物を共感染させた。
3. 24時間後、200μlの細胞上清を72時間まで12時間ごとに回収した。
4. 上清中の野生型ウイルスの力価を測定した。
1. 各々の群に対して15匹のBalb/Cマウス。Balb/Cマウスに野生型ウイルス(2×104PFU)または野生型ウイルスおよび変異ウイルスの混合物(2×106PFU)を経鼻的な接種手段によって感染させた;あるいは、マウスを最初に野生型ウイルス(2×104PFU)で感染させ、24時間後にマウスを変異ウイルス(2×106PFU)で感染させた。
2. 3日後、各々の群より5匹のマウスを無作為に選択し、犠牲にした。肺組織を摘出した。肺組織中の野生型ウイルスの力価を測定した。
3. 残りの10匹のマウスの生存率および体重を2週間観察した。
上述されることは、本発明のいくつかの実施形態にのみ含まれる。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、多くの変形および改良を行うことができ、それらの全てが本発明の保護の範囲内である。
Claims (39)
- ウイルスの少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する位置において1つ以上のUAGコドンを含むことを特徴とする、変異ウイルス。
- 手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、C型肝炎ウイルスHCV、B型肝炎ウイルスHBV、A型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスHPV、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスRSV、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、SARS、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項1に記載の変異ウイルス。
- ウイルスがインフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NSまたはMタンパク質から選択される少なくとも1つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、請求項1に記載の変異ウイルス。
- PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NSまたはMタンパク質からなる群から選択される少なくとも2つ、3つまたは4つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、請求項3に記載の変異インフルエンザウイルス。
- PA、PB1、PB2、およびNPタンパク質からなる群から選択される少なくとも2つ、3つまたは4つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の1つ以上のコドンに位置する1つ以上の位置において1つ以上のUAGコドンを含む、請求項3に記載の変異インフルエンザウイルス。
- インフルエンザウイルスが、本明細書の表2a)、2b)、2c)、2d)、2e)、2f)、2g)、2h)および2i)に列挙される1つ以上の遺伝子座位内の1つ以上の位置においてUAGコドンを含む、請求項3に記載の変異インフルエンザウイルス。
- インフルエンザウイルスが、PAタンパク質のR266、PB1タンパク質のR52、PB2タンパク質のK33、および/またはNPタンパク質のD101をコードする核酸のコドンの位置においてUAGコドンを含む、請求項3に記載の変異インフルエンザウイルス。
- ウイルス内のタンパク質が、UAGコドンに対応する位置において非天然アミノ酸を含み、好ましくは非天然アミノ酸が、式(I)
に示されるLys−ジアジリン、式(II)
に示されるLys−アジド、またはジアジリンもしくはアジド構造を含む少なくとも1つの他の非天然アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載の変異ウイルス。 - 非天然アミノ酸がn位に位置するLys−ジアジリンであり、非天然アミノ酸が次の様式:
式中、R1からR2への向きが、アミノ酸配列のN末端からC末端への向きであり、n位がインフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS、またはMタンパク質のいずれか1つのアミノ酸配列の任意の位置であってよく、R1が1位からn−1位までのアミノ酸残基を表し、R2がn+1位からC末端までのアミノ酸残基を表し、R3が、
好ましくは、nがタンパク質の開始コドンのp−1位下流からその天然の終止コドンのq位上流までの任意の位置であり、pおよびqが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、または全長のアミノ酸配列の長さから1引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項8に記載の変異ウイルス。 - 非天然アミノ酸がn位に位置するLys−ジアジドであり、非天然アミノ酸が次の様式:
式中、R1からR2への向きが、アミノ酸配列のN末端からC末端への向きであり、n位がインフルエンザウイルスのPA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS、またはMタンパク質のいずれか1つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、R1が1位からn−1位までのアミノ酸残基を表し、R2がn+1位からC末端までのアミノ酸残基を表し、R4が、
好ましくは、nがタンパク質の開始コドンのp−1位下流からその天然の終止コドンのq位上流までの任意の位置であり、pおよびqが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、または全長のアミノ酸配列の長さから1引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項8に記載の変異ウイルス。 - タンパク質内の複数の位置において非天然アミノ酸を含む、請求項8から10のいずれか1項に記載の変異ウイルス。
- ウイルスがインフルエンザウイルスであり、PAのR266、PB1のR52、PB2のK33、およびNPのD101において非天然アミノ酸を含む、請求項11に記載の変異ウイルス。
- ウイルスのタンパク質をコードする配列の内在性UAG終止コドンが、UAA終止コドンを提供するように変異している、請求項1から12のいずれか1項に記載のウイルス。
- ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
非変異PB2のアミノ酸配列が配列番号2に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異PB1のアミノ酸配列が配列番号3に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異PAのアミノ酸配列が配列番号4に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異HAのアミノ酸配列が配列番号5に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異NPのアミノ酸配列が配列番号6に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異NAのアミノ酸配列が配列番号7に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異Mのアミノ酸配列が配列番号8に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、または
非変異NSのアミノ酸配列が配列番号9に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一である、
請求項3から13のいずれか1項に記載の変異ウイルス。 - 変異ウイルスが、WSN−RNP−TAGであり、PAタンパク質のR266、PB1タンパク質のR52、PB2タンパク質のK33、およびNPタンパク質のD101をコードするコドンの位置においてUAGコドンを含む、請求項14に記載の変異ウイルス。
- ウイルスがヒトまたは他の動物起源のインフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザA、BまたはCウイルスである、請求項3に記載の変異ウイルス。
- 本明細書の表2a)〜2i)および表4に列挙される1以上の変異を含む、請求項3に記載の変異ウイルス。
- 核酸分子が、天然終止コドンに加えて、人為的に導入されたUAGをさらに含むことを特徴とする、請求項1から17のいずれか1項に記載の変異ウイルスをコードする核酸分子またはそれによってコードされる変異タンパク質。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の変異ウイルスを調製するための方法であって、
(1)好適なベクターに作動可能に連結した1つ以上の変異遺伝子を含む変異核酸を含む発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む核酸を含む1つ以上の発現ベクターを、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異核酸を含む発現ベクターをtRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
(2)トランスフェクトした細胞をLys−ジアジリンまたはLys−アジドを含む培養培地中で培養するステップと、
(3)変異ウイルスを回収するステップと
を含む方法。 - ステップ(1)におけるプラスミドが、2011年6月14日にChina General Microbiological Culture Collection Centre(CGMCC)に寄託され、受託番号CGMCC No:4951を有する大腸菌pACYC−tRNA/PylRS内のプラスミドpACYC−tRNA/PylRSである、請求項19に記載の方法。
- 動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは293細胞、293T細胞、Vero細胞、A549細胞、Hela細胞、CHO細胞、MDCK細胞、またはsf9細胞から選択される、請求項19に記載の方法。
- tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株が、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、請求項19に記載の方法。
- 弱毒化ウイルスをスクリーニングする方法であって、
(1)遺伝子変異:ウイルスゲノム内の1つ以上の遺伝子の1つ以上の選択されたコドンを、遺伝子工学の方法によってTAGコドンに変異させて1つ以上の変異遺伝子を得るステップと、
(2)発現ベクターの構築:ステップ(1)において得られた1つ以上の変異遺伝子を好適なベクターに作動可能に連結して、変異遺伝子の発現ベクターを得るステップと、
(3)ステップ(2)において得られた変異遺伝子の発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む遺伝子を含む1つ以上の発現ベクターを、tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異遺伝子を含む発現ベクターをtRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
(4)トランスフェクトされた細胞をLys−ジアジリンまたはLys−アジドを含む培養培地中で培養し、培地の上清を収集し、Lys−ジアジリンまたはLys−アジドを含むプレートを用いて、非天然アミノ酸に対する上清中のウイルスの依存性を検出するステップと、
(5)非天然アミノ酸Lys−ジアジリンまたはLys−アジドに対する依存性を維持する変異体を弱毒化ウイルスとして同定するステップと
を含む方法。 - ステップ(5)の後に、(6)ステップ(5)における成功裏に部位特異的変異させた候補の変異部位を組み合わせ、ウイルスを再パッケージングしてUAGコドンが複数の遺伝子断片に導入され、非天然アミノ酸がパッケージングされたウイルス内の複数の対応するタンパク質に導入されるようにし、非天然アミノ酸に対するパッケージングされた生成物の依存性を再び検出し、長期間の継代の後に非天然アミノ酸に対する依存性を保持する組み合わされた変異体を、最適な部位特異的変異の候補として決定するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- ステップ(6)の後に、(7)ステップ(6)において得られた変異ウイルスの安全性を調べ、安全なウイルスを同定するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- ウイルスが、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、C型肝炎ウイルスHCV、B型肝炎ウイルスHBV、A型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスHPV、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスRSV、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、SARS、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上の選択されたコドンが、コード配列のn位に独立して位置し、nがタンパク質の開始コドンのp−1位下流からその天然の終止コドンのq位上流までの任意の位置であり、pおよびqが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、または全長のアミノ酸配列の長さから1引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項23に記載の方法。
- ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項23に記載の方法。
- ステップ(3)におけるプラスミドが、2011年6月14日にCGMCCに寄託され、受託番号CGMCC No:4951を有する大腸菌pACYC−tRNA/PylRS内のプラスミドpACYC−tRNA/PylRSである、請求項23に記載の方法。
- 動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは293細胞、293T細胞、Vero細胞、A549細胞、Hela細胞、CHO細胞、MDCK細胞、またはsf9細胞から選択される、請求項23に記載の方法。
- tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現する動物細胞株が、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、請求項23に記載の方法。
- 変異、パッケージングおよびスクリーニングのステップが繰り返される、請求項23に記載の方法。
- インフルエンザウイルスがインフルエンザA、BまたはCウイルスである、請求項23から32のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む組成物。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含むワクチン。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルス、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するための生弱毒化ワクチンまたは関連する医薬の製造における、請求項1から17のいずれか1項に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
- インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の予防または治療における、請求項1から17のいずれか1項に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
- tRNA(tRNAPyl)およびピロリジル−tRNAシンテターゼ(tRNAPyl)を安定に発現することができ、2015年11月17日にCGMCCに寄託され、CGMCC No:11592の受託番号を有するHEK293−PYLである、哺乳動物細胞株。
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