JP4980896B2 - インフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ変異体 - Google Patents

インフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ変異体 Download PDF

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Description

インフルエンザの様々な株および進化株に対するワクチンは、地域の保健および商業的な観点から重要であり、その理由は、毎年非常に多くの人々が、異なる株および種類のインフルエンザウイルスに感染しているためである。幼児、高齢者、十分な健康管理を伴わない幼児や高齢者、および免疫系に欠陥のある人々は、このような感染によって死亡する非常に高い危険にある。インフルエンザ感染の問題を悪化させているのは、新規インフルエンザ株が容易に進化し、様々な種間で蔓延することが可能であり、そのために、新規ワクチンを継続的に製造せざるを得ないということである。
別々のおよびインフルエンザウイルス／ウイルス株に特異的な防御免疫応答を生じさせることが可能である非常に多くのワクチンが、50年以上にわたって製造されており、かかるワクチンとしては、完全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、表面抗原ワクチンおよび生弱毒性ウイルスワクチンが挙げられる。しかし、これらワクチン型のいずれかの適切な製剤が、全身性免疫応答を生じさせることが可能である一方で、生弱毒性ウイルスワクチンは、気道における局所的な粘膜免疫系を刺激できるという利点を有する。ワクチンを製造するために、インフルエンザウイルス、およびその断片を製造することにおけるかなりの作業が、本願発明者らおよびその同僚らによってなされた（例えば、米国特許出願第60/420,708号（2002年10月23日提出）、同第60/574,117号（2004年5月24日提出）、同第10/423,828号（2003年4月25日提出）、同第60/578,962号（2004年6月12日提出）、および同第10/870,690号（2004年6月16日提出）、を参照のこと、なおこれらの開示は、本明細書中に参考として援用される）。
異なるインフルエンザ株の継続的な出現（または再出現）のために、新しいインフルエンザワクチンが絶えず望まれる。このようなワクチンは一般的に、新たに出現したウイルス株の抗原性部分を用いて製造されており、そのため、新規、新たに出現したか、または新たに再出現したウイルス株のポリペプチドおよびポリヌクレオチド（とりわけ、抗原性遺伝子の配列）が、非常に所望される。
本発明は、新規および／または新たに単離したインフルエンザの赤血球凝集素(hemagggluinin)ならびにノイラミニダーゼ変異体を提供し、これらは、非常に多くの型のワクチンを製造すること、および研究、診断などに用いることができ、以下の説明より、非常に多くの他の利点が、明らかとなるであろう。
発明の要旨
本明細書中のいくつかの態様において、本発明は、単離したポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含み、これは、以下のものから選択される：配列番号1〜配列番号10のいずれか1の配列、配列番号1〜配列番号10によってコードされるいずれか1のポリペプチド、配列番号11〜配列番号20のうちのいずれか1のポリペプチド、配列番号11〜配列番号20のポリペプチドのオープンリーディングフレームのみ、配列番号11〜20のポリペプチドの代替型（例えば、シグナルペプチドを含まないか、もしくはオープンリーディングフレームの外側の5’配列および3’配列を伴わない成熟型、またはウイルス（例えば、インフルエンザ）の表面に発現される配列）、高ストリンジェントな条件下で、配列番号1〜配列番号10のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるいずれかのポリペプチド、および上記いずれかの断片であって、その配列が、赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドを含むもの、または赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドの断片（好ましくは、その断片は、本発明の全長ポリペプチドに特異的に結合する抗体を生じる）。様々な実施形態において、本発明の単離したポリペプチドまたは組換えポリペプチドは実質的に、上記ポリペプチドのいずれかの連続した約300個のアミノ酸残基と同一である。また別の実施形態において、本発明は、単離したポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含み、かかるペプチドは、上記ポリペプチドのいずれかにおける、少なくとも約350個、少なくとも約400個、少なくとも約450個、少なくとも約500個、少なくとも約502個、少なくとも約550個、少なくとも約559個、少なくとも約565個、または少なくとも約566個の連続したアミノ酸にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチド配列（例えば、本明細書中の配列リストに挙げたもの）は、例えば565個、559個未満のアミノ酸を含む。このような実施形態において、挙げたポリペプチドのうち短いものは、場合によって例えば565個、559個未満のアミノ酸を含む。また他の実施形態において、本発明のポリペプチドは場合によって、融合タンパク質、リーダー配列を有するタンパク質、前駆体ポリペプチド、分泌シグナルもしくは局在化シグナルを有するタンパク質、またはエピトープタグ、EタグもしくはHisエピトープタグを有するタンパク質を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドの少なくとも1つに対して、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも98.5％、少なくとも99％、少なくとも99.2％、少なくとも99.4％、少なくとも99.6％、少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。本発明の配列をまた、添付物1および本明細書中の配列リストに示す。本発明の赤血球凝集素配列は、未改変および改変した多塩基性切断部位（それによって卵中でのウイルス増殖を可能にする）を有する両配列を含むことができる。配列番号11〜20の赤血球凝集素ポリペプチド配列は、内在性アミノ末端シグナルペプチド配列を含むが、本発明の赤血球凝集素ポリペプチド配列はさらに、成熟型（アミノ末端シグナルペプチド切断型）の赤血球凝集素ポリペプチドを含む。任意インフルエンザ株のいずれかの赤血球凝集素ポリペプチド配列の切断部位は、当該分野の複数の方法のいずれかを用いて慣用的に測定または予測することが可能である。
別の態様において、本発明は、上記ポリペプチドまたはその断片を1または複数含む組成物を含む。本発明はまた、少なくとも1個の抗原に対して生じたポリクローナル抗血清に特異的に結合されるポリペプチドを含む。かかる抗原は、上記アミノ酸配列またはその断片を少なくとも1個含む。上記ポリペプチドに特異的なこのような抗体もまた、本発明の特徴である。本発明のポリペプチドは場合によって、免疫原性である。
本発明はまた、免疫学的有効量の上記ポリペプチドのいずれかを1または複数含む免疫原性組成物、および生理学的に許容可能な担体中の免疫学的有効量の上記ポリペプチドのいずれかを個体に投与することによって、その個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせる方法を含む。
さらに、本発明は、上記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを1または複数個含む組換えインフルエンザウイルス、さらにそのような組換えインフルエンザウイルスを免疫学的有効量含む免疫原性組成物を含む。個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を、生理学的に許容可能な担体中の免疫学的有効量の組換えインフルエンザウイルスを投与することによって生じさせるための方法もまた、本発明の一部である。
他の態様において、本発明は、単離した核酸または組換え核酸を含み、かかる核酸は以下より選択される：配列番号1〜配列番号10のポリヌクレオチド配列のいずれか1個（またはその相補配列）、配列番号11〜配列番号20のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のいずれか1個（またはその相補的なポリヌクレオチド配列）、高ストリンジェントな条件下で、上記いずれかのポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、および上記のようなポリヌクレオチド配列のいずれかの全体または断片を含むポリヌクレオチド配列（かかるポリヌクレオチド配列は好ましくは、赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドまたは赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼポリペプチドの断片をコードする）。本発明はまた、アミノ酸配列をコードする単離した核酸または組換え核酸を含み、かかる核酸は、上記核酸のいずれかの少なくとも約300個、少なくとも約350個、少なくとも約400個、少なくとも約450個、少なくとも約500個、少なくとも約502個、少なくとも約550個、少なくとも約559個、少なくとも約565個または少なくとも約566個のアミノ酸にわたって実質的に同一である。さらに、そのアミノ酸が、例えば、566個、565個、559個未満の長さである場合（例えば、配列リストを参照のこと）、その長さが場合によって、566個、565個、559個未満であることがわかる。本発明はまた、上記核酸のいずれかを含み、かかる核酸は、赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼのポリペプチド、または1または複数の赤血球凝集素もしくはノイラミニダーゼのポリペプチドの断片を1または複数個含む。本発明の他の態様は、ポリペプチド（場合によっては赤血球凝集素またはノイラミニダーゼのポリペプチド）をコードする単離した核酸または組換え核酸を含み、かかるポリペプチド配列は、上記ポリヌクレオチドの少なくとも1個に対して、少なくとも98％、少なくとも98.5％、少なくとも99％、少なくとも99.2％、少なくとも99.4％、少なくとも99.6％、少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％の同一性を有する。本発明はまた、赤血球凝集素またはノイラミニダーゼのポリペプチドをコードする単離した核酸または組換え核酸を含み、かかる核酸は、上記ポリヌクレオチド配列の1または複数個を成熟または組み換えることによって製造される。本発明のポリヌクレオチド配列は場合によって、例えば、リーダー配列、前駆体配列、またはエピトープタグ配列などを1または複数個含むことができ、場合によって融合タンパク質（例えば、1または複数個の付加的な核酸配列を有する）をコードすることができる。
また別の実施形態において、本発明は、上記核酸を2またはそれ以上有する物質からなる組成物（例えば、少なくとも約2、5、10、50またはそれ以上の核酸を含むライブラリー）を含む。このような組成物は場合によって、1または複数個の上記核酸を（例えば、機械的に、化学的に、制限酵素/RNAse/DNAseなどを用いて酵素的に）切断することによって製造することができる。本発明の他の組成物としては、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および熱安定性核酸ポリメラーゼの存在下で、1または複数個の上記核酸をインキュベートすることによって製造される組成物が挙げられる。
本発明はまた、少なくとも1個の上記核酸、あるいはその切断した、もしくは増幅した断片またはその生成物を含む細胞を含む。このような細胞は場合によって、上記のような核酸によってコードされるポリペプチドを発現することができる。本発明の他の実施形態としては、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ウイルス断片など）が挙げられ、これは上記核酸のいずれかを含む。このようなベクターは場合によって、発現ベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターとしては、限定はしないが、pol Iプロモーターおよびターミネーター配列を含むベクターまたはpol Iおよびpol IIプロモーターの両方「polI/polIIプロモーター系」を用いるベクターが挙げられる（例えば、Zobelら、Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; US20020164770; Neumann ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor ら、J. Virol. 1999, 73:9679;およびUS20030035814）。このようなベクターによって形質導入された細胞もまた、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態において、本発明は、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）を含み、かかるウイルスは、1個もしくは複数個の上記核酸（例えば、赤血球凝集素および／もしくはノイラミニダーゼをコードするもの）または1個もしくは複数個のその断片を含む。このようなウイルスを含む免疫原性組成物もまた、本発明の一部である。このようなウイルスは、リアソートメントウイルス（例えば、6:2リアソートメントウイルスなど）を含むことができ、6:2リアソートメントウイルスとは、例えば、1または複数のドナーウイルス由来の6個の遺伝子コード領域と、場合によって赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼを含むことができる1または複数個の上記ヌクレオチド配列（あるいは1または複数個のその断片）由来の2個の遺伝子コード領域を含む。本発明のリアソートメントウイルス（場合によって生ウイルス）は、ドナーウイルスを含むことができ、これは１または複数の冷感受性、好冷性または弱毒性ウイルスである。例えば、リアソートメントウイルスは、A/Ann Arbor/6/60、PR8などを含むことができる。本発明のリアソートメントウイルスは、択一的にA/Ann Arbor/6/60を除外することができる。本発明の1つの好ましい実施形態は、リアソータントインフルエンザウイルスであり、このウイルスは、6:2リアソートメントインフルエンザウイルスであり、A/Ann Arbor/6/60由来の6個の遺伝子コード領域と配列番号11〜20のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする2個の遺伝子コード領域を含む。代替的な実施形態において、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、6:2リアソートメントインフルエンザウイルスを含み、このウイルスは、1または複数のドナーウイルス（A/Ann Arbor/6/60以外）由来の6個の遺伝子コード領域と、配列番号11〜20のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする2個の遺伝子コード領域を含む。別の代替的な実施形態において、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、6:2リアソートメントインフルエンザウイルスを含み、このウイルスは、1または複数のドナーウイルス（A/Ann Arbor/6/60以外）由来の6個の遺伝子コード領域と、2個の遺伝子コード領域を含み、かかる2個の遺伝子コード領域は、任意の汎発流行性インフルエンザ株由来のHAまたはNAポリペプチドである。組換えインフルエンザウイルスを製造するための方法であって、核酸の発現を可能とする条件下で、好適な培養培地中でインフルエンザウイルスを保有する宿主細胞を培養し、1もしくは複数の宿主細胞または培地から組換えインフルエンザウイルスを単離することによる上記製造方法も、本発明の一部である。
本明細書中の他の実施形態において、本発明は、上記いずれかの組換えインフルエンザウイルスを免疫学的有効量有する免疫原性組成物を含む。他の実施形態は、個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を、（場合によって生理学的に有効な担体中の）免疫学的有効量の上記いずれかの組換えインフルエンザウイルスを個体に投与することによって生じさせる方法を含む。
本発明の他の態様は、単離したポリペプチドまたは組換えポリペプチドを製造するための方法を含み、かかる方法は、核酸の発現を可能とする条件下で、好適な培養培地中で上記いずれかの宿主細胞を培養し、そして1もしくは複数の宿主細胞または細胞が増殖した培地からポリペプチドを単離する。
免疫原性組成物もまた、本発明の特徴である。例えば、1または複数個の上記いずれかのポリペプチドおよび／または核酸、ならびに場合によって、製薬上受容可能な賦形剤などの賦形剤または1または複数個の製薬上受容可能な投与成分を含む、免疫原性組成物。本発明の免疫原性組成物はまた、（例えば、1または複数個の製薬上受容可能な投与成分と一緒に）1または複数個の上記いずれかのウイルスも含むことができる。
有効量の上記いずれかのウイルス（または免疫原性組成物）を被験体に投与することによって、被験体に免疫原性反応を生じさせるための方法もまた、本発明の範囲内である。さらに、被験体のウイルス感染（例えば、ウイルス性インフルエンザ）を、ウイルス感染に対する免疫原性反応を生じるのに有効量の1または複数個の上記いずれかのウイルス（または免疫原性組成物）を投与することによって予防的にまたは治療的に処置するための方法もまた、本発明の一部である。このような処置に適した被験体としては、哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。このような方法にはまた、被験体へのin vivo 投与および被験体の1または複数の細胞へのin vitroもしくはex vivo 投与を含むことができる。さらに、このような方法はまた、ウイルスおよび製薬上受容可能な賦形剤からなる組成物を投与することを含み、ウイルス感染を予防的にまたは治療的処置するのに有効量を用いて被験体に投与することができる。
他の態様において、本発明は、1または複数の汎発流行性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列、ならびにA/Ann Arbor/6/60の1または複数のポリペプチドをコードする核酸配列を含む物質からなる組成物を含む。さらに、本発明は、1または複数の汎発流行性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列ならびにPR8またはA/Ann Arbor/6/60の1または複数のポリペプチドをコードする核酸配列を含む物質からなる組成物を含む。このような配列は、本明細書中の配列表に挙げたものを含むことができる。さらに、本発明の好ましい実施形態は、1または複数の汎発流行性インフルエンザ株の赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼをコードする配列、ならびに6:2リアソートメントの選択したバックボーン株をコードする核酸配列を含む物質からなる組成物を含む。このような組成物は好ましくは、本明細書中の配列表およびバックボーン株から選択される赤血球凝集素およびノイラミニダーゼをコードする配列を含み、かかるバックボーン株は、PR8またはA/Ann Arbor/6/60である。本発明はまた、上記のような組成物を含み、かかる赤血球凝集素は、改変した多塩基性切断部位を含む。本発明はまた、上記組成物を含む生弱毒性インフルエンザワクチンを含む。
本発明の上記のようなおよび他の物質ならびに特性は、以下の詳細な説明を、図面および添付物ともに読むと、より完全に明らかとなるであろう。
詳細な説明
本発明は、インフルエンザ赤血球凝集素とノイラミニダーゼのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列、ならびにその配列を含むベクター、組成物など、およびそれらの使用方法を含む。本発明のさらなる特徴は、本明細書中により詳細に記載される。
定義
特に断りのない限り、本明細書中に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。以下の定義は、当該分野におけるそれらの意味を補足し、本発明に対して与えられ、関連する件または無関係の件（例えば、一般に所有される特許または特許出願）にまで及ぶ必要性はない。本明細書中に記載されるものと同様か、または類似する方法および材料を、本発明を試験するために用いることができるが、好ましい方法および材料が、本明細書中に記載される。従って、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定することを意図しない。
本明細書および特許請求の範囲で用いられる、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈から他の意味が明確に示されない限り、複数のものを含む。したがって、例えば、「ウイルス（a virus）」とは、複数のウイルスを含み、「宿主細胞（a host cell）」とは、宿主細胞の混合物などを含む。
「アミノ酸配列」とは、文脈によって、アミノ酸残基のポリマー（タンパク質、ポリペプチドなど）であるか、またはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、文脈によって、一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドポリマー、そのキメラ体もしくは類似体、またはそれらを表す文字列をいう。本明細書中で用いられる場合、この用語は場合によって、天然ヌクレオチドの類似体からなるポリマーを含み、かかる類似体は、天然ヌクレオチドの必須の特性を有し、そのため、このポリマーは、天然ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）と同様の様式で、一本鎖核酸にハイブリダイズする。特に断りのない限り、本発明の特定の核酸配列は場合によって、明示的に示された配列に加えて、相補配列を含む。具体的に挙げたポリヌクレオチド配列より、所定の核酸または相補ポリヌクレオチド配列（例えば、相補核酸）のいずれかを、決定することができる。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語はまた、モノマー単位の物理的な列を含み、これはヌクレオチド列に相当しえ、かかるヌクレオチド列は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、典型的なDNAポリマーまたはRNAポリマー）、PNA、改変したオリゴヌクレオチド（例えば、溶液中の生物学的RNAまたはDNAにとって一般的ではない塩基を含むオリゴヌクレオチド、例えば2’-O-メチル化オリゴヌクレオチド）などを含む。核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖でありうる。
「配列」とは、全長配列のいずれかの部分、完全配列までおよび完全配列含むものである。一般的に、配列は、全長配列未満のものを含む。「特有配列」とは、これまでに決定されたインフルエンザのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のいずれにも見出されない部分配列である。
「変異体」という用語は、ポリペプチドに関しては、基準配列と比べて、1または複数個のアミノ酸が変化したアミノ酸配列をいう。変異体は、「保存的」変化を有しうる。かかる保存的変化では、置換されたアミノ酸は、同様の構造または化学的特性を有する（例えば、ロイシンとイソロイシンの置換）。あるいは、変異体は、「非保存的」変化を有しうる（例えば、グリシンとトリプトファンの置換）。同様の微小な変異にはまた、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を含むことができる。生物学的および免疫学的活性を排除することなく、どのアミノ酸残基が、置換、挿入または欠失したのかを決定するためのガイダンスは、当該分野で周知であるコンピュータープログラムを用いて見出すことができる（例えば、DNASTARソフトウェアなど）。保存的置換の例もまた、本明細書中に記載される。
「遺伝子」という用語は、幅広く用いられ、生物学的機能と関連する任意の核酸をいう。したがって、遺伝子とは、コード配列および／またはコード配列の発現に必要とされる調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列、およびcDNAまたはゲノム配列にコードされるmRNAに用いられる。
遺伝子はまた、非発現性核酸セグメントを含み、かかるセグメントは例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する。非発現性調節配列としては、「プロモーター」および「エンハンサー」が挙げられ、これらに対して調節タンパク質（転写因子など）が結合し、隣接するかまたは近傍の配列の転写を生じる。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーは、特定の組織型または細胞型における転写を調節する。
「遺伝子発現」または「核酸発現」とは、DNAからRNAへの転写（場合によっては、RNA修飾（例えばスプライシング）を含む））、RNAからポリペプチドへの翻訳（おそらくその後続くポリペプチド修飾（例えば、翻訳後修飾）を含む）、または文脈から示される場合には、転写と翻訳の両方を意味する。
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、DNAまたはRNA（例えば、遺伝子）を翻訳することが可能である読み枠であり、ポリペプチドへの翻訳が可能である。すなわち、このリーディングフレームは、ストップコドンによって遮られない。しかし、ポリヌクレオチドが実際に、ポリペプチドに翻訳されることを、ORFが必ずしも示すわけではない点に留意しなければならない。
「ベクター」という用語は、それによって、核酸の増殖および／または生物体、細胞、もしくは細胞成分間の移動を可能とする手段をいう。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリアファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられ、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体に組み込まれうる。ベクターはまた、裸の（naked）RNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖内にDNAとRNAの両方を含んでなるポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートDNAまたはRNA、ペプチドコンジュゲートDNAまたはRNA、リポソームコンジュゲートDNAなどでありえ、これらは自律的に複製しない。全てではないが、多くの一般的な実施形態において、本発明のベクターはプラスミドである。
「発現ベクター」とは、プラスミドに組み込まれた核酸の発現および複製を促進することが可能であるプラスミドなどの、ベクターである。一般的に、発現されるべき核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに機能的に結合されており、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる、転写調節制御の対象である。
「双方向性発現ベクター」とは、2つの代替的なプロモーターを特徴とし、かかるプロモーターは、これら2つのプロモーター間に配置された核酸に関して、反対向きに配置されており、その結果発現を、両方向に開始することができ、例えば、プラス（+）鎖またはセンス鎖RNAとマイナス（−）鎖またはアンチセンス鎖RNAの両方の転写を生じることができる。
「ポリペプチド」とは、2またはそれ以上のアミノ酸残基を含むポリマーである（例えば、ペプチドまたはタンパク質）。ポリマーは場合によって、グリコシル化などの修飾を含む。ポリペプチドのアミノ酸残基は、天然または非天然のものでありえ、未置換、未修飾のもの、または置換もしくは修飾されたものでありうる。
本発明との関係において、「単離した」という用語は、生物学的材料（例えば、ウイルス、核酸またはタンパク質）に関して、その天然の環境下では、上記材料が通常伴うか、または相互作用する成分が存在しないことをいう。単離した生物学的材料は場合によって、さらなる材料を含み、かかる材料は、天然の環境下（例えば、細胞または野生型ウイルス）でその生物学的材料と共に見出されない。例えば、その材料が、天然の環境下（細胞など）で存在する場合、その材料は、細胞内のある位置（例えば、ゲノムまたは遺伝子エレメント）に配置されえ、かかる位置はその材料が見出される本来の場ではない。例えば、天然の核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサーなど）は、非天然の手段で、その核酸の本来の場ではないゲノム位置（例えば、ベクター（プラスミドもしくはウイルスベクターなど）または単位複製配列）に導入された場合、単離体となる。このような核酸は、「異種」核酸ともいう。単離したウイルスは、例えば、野生型ウイルスの本来の環境（例えば、感染個体の鼻咽頭）以外の環境下（例えば、細胞培養系または細胞培養からの精製物）に存在する。
「キメラの」または「キメラ」という用語は、ウイルスについていう場合、ウイルスが、遺伝子成分および／またはポリペプチド成分を含み、かかる成分が、1種以上の親ウイルス株または供給源に由来することを示す。同様に、「キメラの」または「キメラ」という用語は、ウイルスタンパク質についていう場合、タンパク質が、ポリペプチド成分（すなわち、アミノ酸配列）を含み、かかる成分が、1種以上の親ウイルス株または供給源に由来することを示す。
「組換え」という用語は、材料（例えば、核酸またはタンパク質）が、ヒトの介在によって人工的に、または合成的に（非天然に）変化していることをいう。この変化は、天然の環境または状態内またはそこから取り出された材料で行うことができる。特に、例えば、インフルエンザウイルスが、組換え核酸が発現されることによって製造される場合、組換え体である。例えば、「組換え核酸」とは、例えばクローニング、DNAシャッフリングもしくは他の手順の間に核酸を組換えることによって、または化学的もしくは他の突然変異誘発によって製造された核酸であり、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は、組換え核酸が発現することによって製造されるポリペプチドまたはタンパク質であり、そして「組換えウイルス」（例えば、組換えインフルエンザウイルス）は、組換え核酸が発現することによって製造される。
「リアソータント(reassortant)」という用語は、ウイルスについていう場合、ウイルスが、遺伝子成分および／またはポリペプチド成分を含み、かかる成分が、1種以上の親ウイルス株または供給源に由来することを示す。例えば、7:1リアソータントは、第一の親ウイルスに由来する7個のウイルスゲノムセグメント（または遺伝子セグメント）と、1個の相補ウイルスゲノムセグメント（例えば、本発明の赤血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードするもの）を含む。6:2リアソータントは、6個のゲノムセグメント（最も一般的には、第一の親ウイルス由来の6個の内部遺伝子）と、異なる親ウイルス由来の2個の相補セグメント（例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ）を含む。
「導入した」という用語は、異種核酸または単離した核酸についていう場合、真核生物または原核生物への核酸の組み込みをいい、かかる場合、核酸は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリア DNA）へ組み込まれるか、自律性レプリコンに変えられるか、または一過的に発現されえる（例えば、トランスフェクトしたmRNA）。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」などの方法を含む。本発明との関係において、種々の方法を用いて、細胞へ核酸を導入することができる（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、脂質媒介性トランスフェクション（リポフェクション）などを含む）。
「宿主細胞」という用語は、異種核酸（例えばベクター）を含み、核酸の複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞（例えばE. coli ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、両生類、トリまたは哺乳動物の細胞（ヒト細胞を含む））でありうる。例示的な宿主細胞としては、例えば、Vero（アフリカミドリザルの腎臓）細胞、BHK（ベビーハムスター腎）細胞、ニワトリ初代腎（PCK）細胞、イヌ腎臓由来（Madin-Darby Canine Kidney：MDCK）細胞、ウシ腎臓由来（Madin-Darby Bovine Kidney：MDBK）細胞、293細胞（例えば、293T細胞）およびCOS細胞（例えば、COS1細胞、COS7細胞）などが挙げられる。
「免疫学的有効量」のインフルエンザウイルスとは、後に起こるインフルエンザウイルスへの曝露に対する、個体（例えば、ヒト）自体の免疫応答を増強するのに十分な量である。誘発された免疫レベルは、分泌性抗体および／または血清抗体を中和する量を測定すること（プラーク中和検定、補体結合検定、酵素結合免疫吸着検定またはマイクロ中和検定）によって管理することができる。
インフルエンザウイルスに対する「防御免疫応答」とは、個体（例えば、ヒト）が示す免疫応答をいい、かかる免疫応答は、個体が後にインフルエンザウイルスなどに曝されたり、および／または感染したりした場合、疾患から防御するものである。いくつかの実例において、インフルエンザウイルス（例えば、天然に蔓延している）はさらに、感染を生じるが、深刻な感染を生じ得ない。一般的に、防御免疫応答は、検出可能なレベルの宿主で生じた血清および分泌性抗体を生じ、かかる抗体は、同一株および／またはサブグループ（ならびにおそらく異なる、非ワクチン株および／またはサブグループ）のウイルスを、in vitroおよびin vivoにて中和することができる。
本明細書中で用いられる「抗体」とは、1または複数のポリペプチドを含むタンパク質であり、かかるポリペプチドは、実質的にまたは部分的に、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片にコードされる。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに多種多様の免疫グロブリンの可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、それらはその後、免疫グロブリンのクラスであるIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEにそれぞれ定義された。一般的な免疫グロブリン（抗体） 構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖対からなり、各対は、1つの「軽」鎖（約25 kD）と1つの「重」鎖（約50〜70 kD）を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110 個またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変型軽鎖（VL）および可変型重鎖（VH）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれいう。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼで消化されて製造された、複数の充分に特徴付けされた断片として存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合以下の抗体を消化し、F(ab）'2を製造する。F(ab）'2はFabの二量体であり、それ自体は、ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合した軽鎖である。F(ab）'2を、中程度の条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによって、（Fab'）2二量体をFab'単量体に変えることができる。Fab' 単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うFabである（他の抗体断片についてのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul（編） Raven Press, N.Y.（1999）を参照のこと）。様々な抗体断片は、完全な抗体の消化に関して規定されるが、当業者は、このようなFab' 断片が、化学的に、または組換えDNA方法を用いて、新規に（de novo）合成できることがわかる。従って、本明細書中で用いられる場合、抗体という用語は、抗体または断片を含み、かかる断片は、完全な抗体の改変によって製造されるか、または組換えDNA方法用いてde novoで合成される。抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重鎖抗体、または一本鎖抗体（一本鎖 Fv（sFvまたはscFv）抗体を含み、この可変重鎖および可変軽鎖は、（直接的にまたはペプチドリンカーを介して）共に結合し、連続したポリペプチドを形成する）、およびヒト化抗体またはキメラ抗体を含む。
インフルエンザウイルス
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド（配列番号1〜20）は、インフルエンザのHA配列およびNA配列の変異体である。一般的に、インフルエンザウイルスは、セグメント化された一本鎖RNAゲノムを含む内部リボヌクレオタンパク質核とマトリックスタンパク質で裏打ちされた外側のリポタンパク質エンベロープとからなる。インフルエンザウイルスのゲノムは、8個のセグメントからなる直鎖（−）リボ核酸（RNA）からなり、かかる核酸は、免疫原性赤血球凝集素（HA）タンパク質とノイラミニダーゼ（NA）タンパク質、ならびに6個の内部核ポリペプチド（ヌクレオカプシド核タンパク質（NP）、マトリックスタンパク質（M）、非構造タンパク質（NS）および3個のRNAポリメラーゼ（PA、PB1、PB2）タンパク質）をコードする。複製の間に、ゲノムウイルスRNAは、宿主細胞の核内で（+）鎖メッセンジャー RNAと、（−）鎖ゲノムcRNAに転写される。8個のゲノムセグメントの各々は、リボヌクレオタンパク質複合体に包装され、かかる複合体は、RNAに加えて、NPとポリメラーゼの複合体（PB1、PB2およびPA）を含む。
インフルエンザは一般的に、インフルエンザAとインフルエンザBに分類される。インフルエンザ AウイルスとインフルエンザBウイルスはそれぞれ、8個のセグメンからなる陰極性を有する一本鎖RNAを含む。インフルエンザAゲノムは、11個のポリペプチドをコードする。セグメント1〜3は、3個のポリペプチドをコードし、これらのポリペプチドは、RNA依存性RNAポリメラーゼを構成する。セグメント1は、ポリメラーゼ複合体タンパク質PB2をコードする。他のポリメラーゼタンパク質PB1およびPAは、それぞれ、セグメント2およびセグメント3によってコードされる。さらに、いくつかのインフルエンザ株のセグメント1は、小タンパク質PB1-F2をコードし、かかるタンパク質は、PB1コード領域内の選択的リーディングフレームより産生される。セグメント4は、赤血球凝集素（HA）表面糖タンパク質をコードし、かかるタンパク質は、感染の間の細胞接着および侵入に関与する。セグメント5は、ヌクレオカプシド核タンパク質（NP）ポリペプチドをコードし、かかるポリペプチドは、ウイルスRNAに関連する主要な構造成分である。セグメント6は、ノイラミニダーゼ（NA）エンベロープ糖タンパク質をコードする。セグメント7は、2個のマトリックスタンパク質（M1およびM2と示される）をコードし、これらは異なるようにスプライシングされたmRNAから翻訳される。セグメント8は、NS1およびNS2（2個の非構造タンパク質）をコードし、これらは選択的にスプライシングされたmRNA変異体から翻訳される。インフルエンザBの8個のゲノムセグメントは、11個のタンパク質をコードする。最も大きな3個の遺伝子は、RNAポリメラーゼの構成成分（PB1、PB2およびPA）をコードする。セグメント4は、HAタンパク質をコードする。セグメント5は、NPをコードする。セグメント6は、NAタンパク質とNBタンパク質をコードする。NBとNAの両タンパク質は、バイシストロニックmRNAの重複したリーディングフレームから翻訳される。インフルエンザBのセグメント7もまた、2個のタンパク質（M1およびBM2）をコードする。最も小さなセグメントは、2個の産物をコードし、NS1は、全長RNAから翻訳され、一方NS2は、スプライシングされたmRNA変異体から翻訳される。
インフルエンザウイルスワクチン
本明細書中の配列、組成物および方法は、主として、ただそれだけではないが、ワクチン用のインフルエンザウイルスの製造に関する。歴史的に、インフルエンザウイルスワクチンは主に、選択したウイルス株または関連株の経験的な予測に基づくウイルス株を用いて発育鶏卵で製造されている。最近では、リアソータントウイルスが製造されており、これは、認可された弱毒性、温度感受性マスター株に関連して選択した赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ抗原を組み込んでいる。鶏卵での複数回の継代によるウイルス培養の後、インフルエンザウイルスを回収し、場合によっては、例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはβ-プロピオラクトンを用いて不活性化する（あるいは代替的に生弱毒性ワクチンに用いる）。このように、HA配列およびNA配列（例えば、配列番号1〜20）が、インフルエンザワクチンを構築するのに非常に有用であることがわかる。本発明は、汎発流行性インフルエンザ株のHA配列および／またはNA配列を含むウイルス／ワクチンを含み（HA配列は、本明細書中に記載される改変体のような、改変された多塩基性切断部位を含む）、このウイルス／ワクチンは、A/AA/6/60などのca バックボーンまたはPR8のバックボーンを含む。
細胞培養において組換えワクチンおよびリアソータントワクチンを製造する試みは、ワクチン製造用に認可されたいくつかの株が、標準的な細胞培養条件下で効率的に増殖できないために妨げられている。しかし、本願発明者およびその共同研究者らによる先の研究は、培養で組換えウイルスおよびリアソータントウイルスを製造するためのベクター系および方法を提供し、それによって、1または複数の選択した抗原性ウイルス株（例えば、A株もしくはB株）、様々なサブタイプまたは亜種など（例えば本明細書中のHA配列および／もしくはNA配列を含む）に対応するワクチンを迅速に製造することが可能となった。Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus, 米国特許出願第60/420,708号（2002年10月23日提出）、米国特許出願第10/423,828号（2003年4月25日提出）および米国特許出願第60/574,117 号（2004年5月24日提出）を参照のこと。一般的に、培養物を、制御された湿度およびCO2の下、温度レギュレーター（温度が35℃を超えないことを確実にするサーモスタットなど）を用いて一定温度にした、細胞培養インキュベーターなどの系に維持する。リアソータントインフルエンザウイルスは、マスターインフルエンザウイルスのゲノムセグメントおよび目的株（例えば、本明細書中のHAおよび／またはNA抗原性変異体）由来の相補セグメントに対応するベクターサブセットを導入することによって、容易に得ることができる。一般に、マスター株は、ワクチン投与に関して望ましい特性に基づいて選択する。例えば、ワクチン製造のために（例えば、生弱毒性ワクチンの製造のために）、マスタードナーウイルス株は、弱毒性表現型、好冷性および／または温度感受性について選択することができる。本明細書中のどこか、および例えば、米国特許出願第10/423,828号などに説明されるように、本発明の様々な実施形態は、HAおよび／またはNA遺伝子（例えば、本明細書中に示した配列など）を付加する「バックボーン」としてA/Ann Arbor（AA）/6/60インフルエンザ株を利用して、望ましいリアソータントウイルスを製造する。したがって、例えば、6:2リアソータントでは、2個の遺伝子（すなわち、NAおよびHA）は、免疫原性反応が望まれるインフルエンザ株に由来し、一方その他の6個の遺伝子は、Ann Arbor 株または他のバックボーン株などに由来する。Ann Arborウイルスは、その好冷性、弱毒性、温度感受性の特性のために有用である。当然ながら、本明細書中のHA配列およびNA配列は、多数の他のウイルス遺伝子またはウイルス型と再集合(reassortment)することが可能であることがわかる（例えば、多数の異なる「バックボーン」（例えばPR8など）は、リアソータントに存在するその他のインフルエンザ遺伝子（すなわち、非HA遺伝子および非NA遺伝子）を含む。
本明細書中の様々な実施形態は、汎発流行性インフルエンザに対する生弱毒性ワクチン（本明細書中のHAおよび／またはNA配列を有する）を含む。このようなワクチンは一般に、例えば、配列番号11〜20のHA配列および／もしくはNA配列、または配列番号1〜10のヌクレオチドに対応するHA配列および／もしくはNA配列を含む。卵におけるワクチンウイルス株（例えば、リアソータント）の増殖より生じるある問題は、（汎発流行性に関与しうる）トリ系統は、その中でワクチンが製造される卵を殺すことができ、そのため、従来の（非プラスミドレスキュー）リアソータント製造法を用いても、ワクチンの操作、製造が困難である。このようなトリ系統は興味深く、その理由は、これらがヒトにおけるインフルエンザおよび世界的流行病を生じうると、証拠が示すためである。従って、汎発流行性株（様々なトリの配列（例えば、本明細書中のHA配列およびNA配列）など）を有するインフルエンザリアソータントを製造／操作するためにプラスミドレスキュー系を用いることは、非常に望ましく、またこれは本発明の特徴である。しかし、この配列はまた、非プラスミド系または従来の系と共に用いることが可能であることがわかる。
（その中でも）水鳥は、15個の赤血球凝集素（HA）と9個のノイラミニダーゼ（NA）サブタイプからなるインフルエンザAウイルスに感染しうる。このようなトリは、保菌生体として役立ち、そこから新規インフルエンザサブタイプが、ヒト集団に導入され、世界的流行を生じうる。2003年オランダにてトリH7N7インフルエンザAウイルスがヒトに感染したこと、およびそれ以前に香港および中国にてトリのH5N1およびH9N2ウイルスがヒトに感染したことは、これらの（および他の）サブタイプが、世界的流行を生じる可能性を有しているという懸念を生じる。したがって、ワクチンが、トリインフルエンザAウイルスのヒトへの感染を防ぐために必要とされる。ヒトインフルエンザウイルスに対する生弱毒性インフルエンザAウイルスワクチンが最近、米国で認可された。上記参照のこと。このようなワクチンは、リアソータントH1N1およびH3N2ウイルスであり、そのA/Ann Arbor（AA）/6/60（H2N2）好冷性（ca）ウイルスの内部タンパク質遺伝子が、リアソータントウイルス（すなわち、非Ann Arbor株由来の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子を有するもの）にAA caウイルスの好冷性、弱毒化および温度感受性表現型を与える。古典的な遺伝学的リアソートメントおよびプラスミドベースの逆遺伝学技術を用いて、リアソータントウイルスが製造されており、かかるリアソータントウイルスは、トリインフルエンザAウイルス（H4-H14サブタイプ）由来の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ遺伝子とAA caウイルス由来の6個の内部遺伝子セグメントを含む。このようなリアソータントウイルスは、本発明の特徴である。以下のHAおよびNA遺伝子配列を参照のこと。これらのウイルスは、候補ワクチンに望ましい生物学的特性を与え、それは、AA caウイルスに関連する表現型が、リアソータントウイルスに現れるためである。ワクチン用のシードウイルスとしてこれらリアソータントウイルスを製造および評価することは、世界的流行に備える重要な工程である。臨床試験によって、そのような生弱毒性汎発流行性ワクチンの安全性、感染性および免疫原性を確立することができると考えられる。本発明の他の実施形態は、本明細書中に挙げたものに加えて例えば、トリ、ブタなどの汎発流行性ウイルス株に由来する汎発的抗原性遺伝子HAおよび／またはNAを含むリアソータントウイルス（例えば、ワクチンに用いられるもの）を含み、それは汎発流行性ワクチンを製造するためであり、かかるワクチンは、プラスミドレスキューリアソートメント（例えば、A/Ann Arbor 6/60（すなわち、A/AA/6/60）、PR8などを用いたリアソートメント）より製造される。このようなウイルスおよびワクチンの構築および使用方法もまた、含まれる。本明細書中で用いられる場合「汎発流行性ウイルス株」とは、ヒト集団で蔓延しないインフルエンザAウイルス株サブタイプとして定義され、かかるウイルス株は、疾病対策センターもしくは世界保健機構または科学界で一般的に認められた機関によって汎発流行性株であると宣言される。
本明細書中の様々な実施形態において、抗原性配列（例えば、HA配列）ならびにウイルスおよびそのようなウイルス由来のワクチンは、改変された多塩基性切断部位を含む。いくつかの高病原性トリ汎発流行性インフルエンザ株は、赤血球凝集素配列内に複数の塩基性アミノ酸切断部位を含む。例えば、Liら、J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999を参照のこと。本明細書中の典型的な実施形態において、このような切断部位は、本願配列が由来する野生型の配列と比較して、その配列中に改変または変化を有する（例えば、切断できなくさせたり、切断を減少させたりなどするために）。このような改変／変化は、異なる株では異なっており、それは、野生型配列中の切断部位が多様な配列であることによる。例えば、成熟型H5の326〜329における4個の多塩基性残基（RRKK）は、本明細書中の配列では（wtと比べて）一般的に除去されている。配列表および図1を参照のこと。様々な実施形態において、多塩基性切断部位は、複数の様式で改変することができる（これら全ての様式は、本発明に含まれる）。例えば、多塩基性切断部位は、一度に1個のアミノ酸が除去されうる（例えば、Rが1個除去される、Rが2個除去される、RRKが除去される、またはRRKKが除去される）。さらに、切断部位の直接的上流のアミノ酸残基がまた、除去または変えられうる（例えば、RからTへ、など）。さらに、切断部位の直後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドもまた改変されうる。例えば、切断部位の改変を示した図1を参照のこと。さらに、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ポリペプチド配列は、アミノ末端シグナルペプチド配列を含み、したがって、本発明の赤血球凝集素ポリペプチド配列は、赤血球凝集素ポリペプチドの成熟型(アミノ末端シグナルペプチド切断型）と赤血球凝集素の前切断型の両方を含む。任意のインフルエンザ株のいずれかの赤血球凝集素ポリペプチド配列の切断部位を、当該分野の多数の方法を用いて慣用的に評価または予測することができる。
ウイルス（一般的にワクチンとして用いられるか、またはワクチン製造用）、場合によっては、本願配列を含むウイルスに用いられる場合、「温度感受性」、「好冷性」および「弱毒性」という用語は、当該分野で周知である。例えば、「温度感受性」（ts）という用語は、例えば、インフルエンザA株については、ウイルスタイターが、33℃と比べて39℃において100倍またはそれ以上減少することを示すか、あるいは、インフルエンザB株については、ウイルスタイターが、33℃と比べて37℃において100倍またはそれ以上減少することを示すことをいう。「好冷性」（ca）という用語は、ウイルスが、25℃において、33℃における増殖の100倍以下の増殖を示すことをいい、一方、「弱毒性」（att）という用語は、ウイルスが、フェレットの上気道では複製するが、肺組織では検出されず、動物にてインフルエンザ様疾患を生じないことを示す。中間の表現型を有するウイルス（すなわち、39℃（A株ウイルスについて）もしくは37℃（B株ウイルスについて）にて100倍未満のタイター減少を示すか、または25℃にて、33℃における増殖の100倍以上（例えば、200倍以下、500倍以下、1000倍以下、10,000倍未満内）の増殖を示すか、および／またはフェレットの上気道における増殖と比較して肺における減少した増殖（すなわち、部分的に弱毒性）および／もしくは動物において弱められたインフルエンザ様疾患を示すウイルス）もまた、有用なウイルスであり、本明細書中のHA配列およびNA配列と結合して用いることができることがわかる。
さらに、本発明のHA配列およびNA配列は場合によって、プラスミドリアソートメントワクチンなど（ならびに／または他のts、cs、caおよび／もしくはattウイルスやワクチン）に用いる。しかし、本発明のHA配列およびNA配列などが、特定のワクチン組成物または製造方法に限定されず、そのため、株特異的HAおよびNA抗原（例えば、配列番号11〜20または配列番号1〜10の対応ヌクレオチドのいずれか）を利用するワクチン型またはワクチン製造方法のいずれにも実質的に用いることができることに留意する。
FluMistTM
これまでに述べたように、インフルエンザワクチンの非常に多くの例および型が存在する。例示的なインフルエンザワクチンは、FluMistTMであり、これは生弱毒性ワクチンであり、インフルエンザ疾患から子供および大人を保護する（Belsheら、（1998） The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol ら、（1999） Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44）。典型的かつ好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物は好ましくは、FluMistTMワクチンの製造に適合／使用される。しかし、本明細書中の配列、方法、組成物もまた、同様のまたは異なるウイルスワクチンの製造に適合されることが、当業者に理解される。
FluMistTMワクチン株は、例えば、株（野生型株など）に由来するHAおよびNA遺伝子セグメントを含み、これに対するワクチンが、一般的なマスタードナーウイルス（MDV）に由来する6個の遺伝子セグメント（PB1、PB2、PA、NP、MおよびNS）と共に処理される。したがって、本明細書中のHA配列は、様々なFluMistTM製剤の一部である。FluMistTMのインフルエンザA株用のMDV（MDV-A）は、連続して低温にて、ニワトリ腎臓組織の初代培養中にて野生型A/Ann Arbor/6/60（A/AA/6/60）株を連続継代することによって製造した（Maassab（1967） Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4）。MDV-Aは、25℃にて効率的に複製する（ca, 好冷性）が、その増殖は、38℃および39℃にて制限される（ts, 温度感受性）。さらに、このウイルスは、感染したフェレットの肺では複製しない（att, 弱毒化）。ts表現型は、気道の最も冷めた領域を除く全ての領域における複製が制限されることによって、ヒトでのワクチンの弱毒化に関与すると考えられる。この特性の安定性は、動物モデルおよび臨床的研究で示されている。化学的突然変異誘発によって製造したインフルエンザ株のts表現型に対して、MDV-Aのts特性は、感染したハムスターを用いた継代培養後、または子供から単離したシェド中でも戻らない（最近の総説については、Murphy & Coelingh（2002） Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323）。
12種の別個の6:2リアソータント株に関わる20,000人を超える成人および子供たちにおける臨床研究は、これらのワクチンが、弱毒性であり、安全でありかつ有効であることを示している（Belsheら（1998）The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Boyceら、（2000） Safety and immunogeniciity of aduvanted and unaduvanted subunit influenza virus vaccines administered intranasally to healthy adults vaccine 19:217-26; Edwardsら（1994） A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nicholら、（1999） Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44）。MDV-Aの6個の内部遺伝子と野生型ウイルスの2個のHAおよびNA遺伝子セグメントを保有するリアソータント（すなわち、6:2リアソータント）は、一貫してca、tsおよびatt表現型を保持する（Maassabら（1982） Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis. 146:780-900）。
インフルエンザB株を用いたこのようなリアソータントウイルスの製造はより困難であるが、しかし、最近の研究（例えば、Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus、米国特許出願第60/420,708号（2002年10月23日提出）、米国特許出願第10/423,828号（2003年4月25日提出）、および米国特許出願第60/574,117号（2004年5月24日提出）などを参照のこと）は、クローン化cDNAに完全に由来するインフルエンザBウイルスを製造するための8個のプラスミド系を示した。ワクチン製剤（例えば、鼻腔内投与に有用な生ウイルスワクチン製剤）に好適な弱毒性生インフルエンザAおよびBウイルスの製造方法もまた、示された。
これまでに記載した系および方法は、組換えおよびリアソータントインフルエンザAおよびBウイルスの細胞培養における迅速な製造に有用であり、かかるウイルスは、生弱毒性ワクチン（例えば、鼻腔内投与に好適なワクチン）を含むワクチンとしての使用に好適なウイルスを含む。本発明の配列（例えば、配列番号1〜10および配列番号11〜20に対応するアミノ酸）、方法などは場合によって、例えば、ワクチン製造用のリアソータントインフルエンザウイルスに関するこれまでの研究などとともに、またはそれと組み合わせて用いて、ワクチン用のウイルスを製造する。
ワクチンを予防投与するたの方法および組成物
上記のように、FluMistTMワクチンの製造に用いることに代えて、または加えて、本発明を他のワクチン製剤に用いることができる。一般的に、本発明の組換えウイルスおよびリアソータントウイルス（例えば、配列番号1〜10のポリヌクレオチドもしくは配列番号11〜20のポリペプチド、またはそれらの断片を含むもの）を、適切な担体または賦形剤に免疫学的に有効な量で予防的に投与して、HAおよび／またはNA配列によって決定されるような1または複数のインフルエンザウイルス株に特異的な免疫応答を刺激することができる。一般的に、担体または賦形剤は、製薬上受容可能な担体または賦形剤（例えば、滅菌水、食塩水、緩衝食塩水溶液、ブドウ糖水溶液、水性グリセロール溶液、エタノールまたはそれらの組合せ）である。無菌性、pH、等張性および安定性が保証されている上記のような溶液の調製は、当該分野で確立されたプロトコルにしたがっておこなう。一般的に、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない効果を最小限にするように、かつ特定の投与経路（例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内など）に適するように選択する。
本発明の関連する態様は、個体の免疫系を刺激して、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を生じさせるための方法を提供する。この方法において、免疫学的有効量の組換えインフルエンザウイルス（例えば、本発明のHAおよび／もしくはNA分子を含む）、免疫学的有効量の本発明のポリペプチド、ならびに／または免疫学的有効量の本発明の核酸を、製薬上許容可能な担体に含めて個体に投与する。
一般的に、本発明のインフルエンザウイルスを、1または複数のインフルエンザウイルス株に特異的（すなわち、本発明のHAおよび／またはNA株に対する）免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与によって、このような株に対する防御免疫応答を誘発する。1または複数のインフルエンザ株に対する防御免疫応答を誘発するための用量および方法は、当業者に公知である。例えば、USPN 5,922,326; Wrightら、Infect. Immun. 37:397-400（1982）; Kimら、Pediatrics 52:56-63（1973）;およびWrightら、J. Pediatr. 88:931-936（1976）を参照のこと。例えば、インフルエンザウイルスを、1回の投与あたり、約1〜1000 HID50（ヒト感染用量）、すなわち、約105〜108pfu（プラーク形成単位）の範囲で投与する。一般に、この用量は、例えば、年齢、身体の状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的要因に基づいて、上記範囲内で調節する。予防的ワクチン製剤は、例えば、針とシリンジまたは無針注射装置を用いて皮下または筋肉内注射することによって、全身投与する。あるいは、ワクチン製剤を、液滴、大きな粒子状エアロゾル（約10μｍよりも大きい）、または上気道への噴霧のいずれかによって、鼻腔内投与する。上記いずれかの送達経路によって、防御的な全身性免疫応答を生じるが、鼻腔内投与は、インフルエンザウイルスの侵入箇所において粘膜免疫系を誘発するというさらなる利点をもたらす。鼻腔内投与については、弱毒性生ウイルスワクチンがしばしば好ましい（例えば、弱毒性、好冷性および／または温度感受性組換えまたはリアソータントインフルエンザウイルス）。上記参照のこと。単一用量を用いて防御免疫応答を刺激することが好ましいが、さらなる用量を、同一または異なる経路で投与して、所望される予防的効果を達成することができる。
一般的に、ワクチンに用いるような本発明の弱毒性組換えインフルエンザは、十分に弱毒性であるために、感染症状、または少なくとも重篤な感染症状は、その弱毒性インフルエンザウイルスを用いて免疫化した（そうでなければ感染した）ほとんどの個体で発症しない。いくつかの例において、弱毒性インフルエンザウイルスがなお、穏やかな疾患（例えば、穏やかな上部呼吸器疾患）の症状を生じたり、および／またはワクチン接種をしていない個体に汎発したりすることが可能である。しかし、その病原性は、十分に抑制され、そのため重篤な下気道感染は、ワクチン接種した宿主または偶発的な宿主において生じない。
あるいは、免疫応答を、本明細書中の配列を含むインフルエンザウイルスを用いて、樹状細胞をex vivoまたはin vivoにてターゲティングすることによって刺激することが可能である。例えば、増殖樹状細胞を、十分量のウイルスに、樹状細胞がインフルエンザ抗原を捕捉することができるほど十分な時間曝す。次に細胞を、ワクチン接種される被験体に、標準的な静脈内移植法によって移す。
単一用量を用いて防御免疫応答を刺激することが好ましいが、さらなる用量を、同一または異なる経路で投与して、所望される予防的効果を達成することができる。新生児および幼児では、例えば、複数回投与が十分なレベルの免疫を誘発するために必要とされうる。投与は、幼児期を通して、間をおいて継続することができ、それは、野生型インフルエンザ感染に対して十分なレベルの防御を維持するのに必要なためである。同様に、成人（とくに繰り返しまたは重篤なインフルエンザ感染を受けやすい人（例えば、医療従事者、介護士、幼い子供、高齢者および易感染性心肺機能を有する人の家族））は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要としうる。誘発された免疫レベルは、例えば、分泌型抗体および血清抗体を中和する量を測定すること、ならびに所望されるレベルの防御を誘発および維持するために必要とされる調節された用量または繰り返しおこなうワクチン接種によって管理することができる。
場合によって、インフルエンザウイルスを予防投与するための製剤はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を増強するための1または複数種のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムなど）、界面活性剤（リゾレシチン）、プルロニックポリオール(pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油または炭化水素エマルション、カルメットゲラン菌（bacille Calmette-Guerin；BCG）、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）、および合成アジュバント QS-21が挙げられる。
所望される場合、インフルエンザウイルスの予防ワクチン投与を、1または複数種の免疫賦活性分子の投与とともに行うことができる。免疫賦活性分子としては、免疫賦活性、免疫増強性および前炎症活性を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン（例えば、インターロイキン（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13など）;増殖因子（例えば、顆粒球マクロファージ（GM）コロニー刺激因子（CSF））ならびに他の免疫賦活性分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1、B7.2などが挙げられる。免疫賦活性分子を、インフルエンザウイルスと同一の製剤に含めて投与することも、別々に投与することもできる。タンパク質（例えば、本発明のHAおよび／またはNAポリペプチド（例えば、配列番号11〜20のいずれか））またはそのタンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号1〜10のいずれか）を含む発現ベクターを投与して、免疫賦活性効果を生じることができる。
上記方法は、疾患または障害（一般的に、インフルエンザ）を治療的および／または予防的に処置するのに有用であり、かかる方法は、治療的または予防的に有効なHAおよび／またはNAポリペプチド（もしくはペプチド）あるいはHAおよび／またはNA RNA（例えば、アンチセンスRNAもしくはリボザイム）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを、標的細胞の集団にin vitro、ex vivoまたはin vivoにて導入することを含む。一般的に、目的のポリペプチド（もしくはペプチド）またはRNAをコードするポリヌクレオチドは、「発現ベクター」および「付加的な発現エレメント」と表題された節にて記載されるような適切な調節配列に機能的にに結合されている。場合によって、1以上の異種コード配列が、単一のベクターまたはウイルスに組み込まれている。例えば、治療的または予防的に活性なHAおよび／もしくはNAポリペプチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドに加えて、ベクターはまた、さらなる治療的または予防ポリペプチド（例えば、抗原、同時刺激分子、サイトカイン、抗体など）および／またはマーカーなどを含むことができる。
特定のサブグループの特定の株の弱毒性インフルエンザウイルスを用いた個体のワクチン接種は、異なる株および／またはサブグループのインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘導できるが、所望される場合には交差防御を、少なくとも2つの株（例えば、それぞれ異なるサブグループを示す）に由来する弱毒性インフルエンザウイルスを用いて個体にワクチン接種することによって増強できる。さらに、ワクチンの組み合わせ物は場合によって、汎発流行性ワクチン（例えば、汎発流行性インフルエンザ株（例えば、種々のトリ株）、本明細書中の配列または他の汎発流行性株を参照のこと）に対するもの）と非汎発流行性株との混合物を含む。ワクチン混合物（または複数のワクチン接種）は、ヒト株および／または非ヒトインフルエンザ株（例えば、トリおよびヒトなど）に由来する成分を含むことができる。同様に、本発明の弱毒性インフルエンザウイルスワクチンは場合によって、他の感染性因子に対する防御免疫応答を誘導するワクチンと組み合わせることができる。
本発明のポリヌクレオチド
インフルエンザウイルスのHAおよびNAポリヌクレオチドセグメントが、コード領域（ORFをコードする）と非コード領域（NCR）（HAおよびNAのコード配列の5’配列および3’配列）の両方を含むことは当該分野にて周知である。これらNCRの例は、配列番号1〜9（ORFの外側）に見られる。プライマーを、これらNCRに対して作製し、インフルエンザウイルスの全長HAおよびNAセグメントの増幅を容易に行うことができることも公知である。（例えば、Hoffmannら、Arch Virol. 2001 Dec;146(12）:2275-89を参照のこと）。さらに、インフルエンザのHAおよびNAのNCRは、リアソータントの達成効率を高めることができることは公知である。したがって、これらNCRのポリヌクレオチド配列（それらの断片および変異体を含む（例えば、少なくとも約60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.7％、少なくとも約99％、少なくとも約99.1％、少なくとも約99.2％、少なくとも約99.3％、少なくとも約99.4％、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.6％、少なくとも約99.7％、少なくとも約99.8％、または少なくとも約99.9％の同一性））は、本発明の範囲内である。任意の汎発流行性株のHAおよびNAセグメントを増幅する場合、HAおよびNAのNCRの（例えば、関連株の間で）保存された領域に結合するポリヌクレオチドプライマーを、（例えば、RT-PCRによる）増幅のために、作製および使用することができる。一実施形態において、本発明のHAおよびNAポリヌクレオチドは、汎発流行性ウイルス株のHA配列およびNA配列（それらの断片および変異体（例えば、少なくとも約60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.7％、少なくとも約99％、少なくとも約9
9.1％、少なくとも約99.2％、少なくとも約99.3％、少なくとも約99.4％、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.6％、少なくとも約99.7％、少なくとも約99.8％、または少なくとも約99.9％の同一性））のNCRおよびORFを含む。代替的な実施形態において、本発明のHAおよびNAポリヌクレオチドは、NCRは除くが、汎発流行性ウイルス株のHA配列およびNA配列（例えば、配列番号1〜9）のORF（それらの断片および変異体（例えば、少なくとも約60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約98.5％、少なくとも約98.7％、少なくとも約99％、少なくとも約99.1％、少なくとも約99.2％、少なくとも約99.3％、少なくとも約99.4％、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.6％、少なくとも約99.7％、少なくとも約99.8％、少なくとも約99.9％の同一性））は含む。
本発明のHAおよびNAポリヌクレオチド（例えば、配列番号1〜配列番号10、およびそれらの断片）は場合によって、上記ワクチンに代えて、または加えて、多数の異なる目的に用いられる。他の例示的な用途は、実例の目的で本明細書中に記載されるのであって、用途の実際の範囲を限定するものではない。本発明のヌクレオチド配列を構築、精製、および特徴付けるための異なる方法もまた、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態において、本発明の1または複数のポリヌクレオチド配列を含む核酸は、様々な状況下で対応する核酸または関連する核酸を検出するためのプローブとして、都合よく用いられる。かかる状況とは、例えば核酸ハイブリダイゼーション実験であり、それは、他の種に感染していたり、または異なるインフルエンザの発生において同種のインフルエンザ変異体（例えば、本明細書中の配列についての相同体など）を見出したり、および／または特徴付けするためのものである。プローブは、DNA分子またはRNA分子のいずれかでありえ（例えばゲノムまたはクローン化DNAの制限断片、cDNA、PCR増幅産物、転写物、およびオリゴヌクレオチド）、約10ヌクレオチドの短い長さのものから全長配列のオリゴヌクレオチドまたは1 kbまたはそれ以上のcDNAと様々でありうる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のプローブは、ポリヌクレオチド配列または、例えば、配列番号1〜配列番号10もしくはそれらの相補配列のなかより選択される部分配列を含む。あるいは、上に示した配列のうちの1つの変異体であるポリヌクレオチド配列をプローブとして用いる。最も一般的には、このような変異体は、1または数個の保存的なヌクレオチド変異を含む。例えば、オリゴヌクレオチド対（またはセット）が選択されえ、その2つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド配列が、互いの保存的的な変異であり、１のポリヌクレオチド配列は、第一の変異体に等しく対応するか、またはその他のポリヌクレオチド配列が、さらなる変異体に等しく対応する。このようなオリゴヌクレオチドプローブ対は、例えば、特定のハイブリダイゼーション実験に特に有用であり、かかるハイブリダイゼーション実験とは、多型ヌクレオチドを検出するか、または例えば、他の種に感染しているかまたは異なる（例えば、時間的におよび／もしくは地理的に異なる）インフルエンザの発生において存在する同種のインフルエンザHAおよびNA変異体を検出するためのものである。他の用途において、プローブは、より異なったものが選択され、すなわち、少なくとも約91％（または約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約98.7％、約99％、約99.1％、約99.2％、約99.3％、約99.4％、約99.5％、約99.6％、約99.7％、約99.8％、約99.9％もしくはそれ以上）同一であるプローブが選択される。
本発明のプローブ（例えば、本明細書中の配列に由来する配列によって例示されるもの）をまた用いて、当該分野で慣用される手順にしたがって、さらなる有用なポリヌクレオチド配列を同定することができる。一実施形態のセットにおいて、1または複数の上記のようなプローブを用いて、発現産物または染色体セグメントのライブラリー（例えば、発現ライブラリーもしくはゲノムライブラリー）をスクリーニングして、クローンを同定する。かかるクローンは、本明細書中の配列（すなわち、変異体、相同体など）の1または複数のプローブに類似する重要な配列と同一であるか、またはそのような配列を有する配列を含む。ライブラリースクリーニングのような物理的方法などに加えて、コンピューターを利用した生物情報学的アプローチ（例えば、BLASTおよび他の配列相同性検索アルゴリズムなど）もまた、関連するポリヌクレオチド配列を同定するために用いることができることが理解される。この方法で同定されるポリヌクレオチド配列もまた、本発明の特徴である。
オリゴヌクレオチドプローブは場合によって、当業者に周知である種々の方法によって製造される。最も一般的には、オリゴヌクレオチドプローブは、周知の合成方法（例えば、自動合成機などを使用する固相ホスホアミダイトトリエステル法（BeaucageおよびCaruthers（1981） Tetrahedron Letts 22（20）:1859-1862に記載される）または他の方法（Needham-Van Devanterら、（1984） Nucl Acids Res, 12:6159-6168に記載される））によって製造される。オリゴヌクレオチドはまた、当業者に公知である様々な商業的供給源によってオーダーメイドされうる。オリゴヌクレオチドの精製（必要な場合）は一般に、未変性のアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLC（PearsonおよびRegnier（1983） J Chrom 255:137-149に記載される）によって行う。合成オリゴヌクレオチドの配列は、化学分解法を用いて検証できる（GrossmanおよびMoldave（編） Academic Press, New York, Methods in Enzymology 65:499-560におけるMaxamおよびGilbert（1980）らの化学分解法）。オーダーメイドのオリゴもまた、当業者に公知である様々な商業的供給源に注文することができる。
他の状況において、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを発現する細胞または生物体（例えば、本発明の配列を含むウイルスを保有するもの）の特質に関連して、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体であるプローブを、都合よく利用する。例えば、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列番号11〜20）のいずれかに由来するか、および／または本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号1〜配列番号10から選択される）にコードされる単離した、または組換えポリペプチド、ポリペプチド断片およびペプチドを都合よく用いて、ファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ポリクローナル血清などから、抗体を同定および単離する。本発明のポリペプチド断片は、本発明のHAまたはNAポリペプチド（例えば、配列番号11〜20）のアミノ酸配列の少なくとも5個連続した、少なくとも10個連続した、少なくとも15個連続した、少なくとも20個連続した、少なくとも25個連続した、少なくとも40個連続した、少なくとも50個連続した、少なくとも60個連続した、少なくとも70個連続した、少なくとも80個連続した、、少なくとも90個連続した、少なくとも100個連続した、少なくとも125個連続した、少なくとも150個連続した少なくとも175個連続した、少なくとも200個連続した、少なくとも250個連続した、少なくとも350個連続した、少なくとも400個連続した、少なくとも450個連続した、少なくとも500個連続した、または少なくとも550個連続したアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドを含む。特に、このポリペプチドに結合するポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドおよび抗体もまた、本発明の好ましい実施形態である。
任意のポリペプチド配列または配列番号11〜配列番号20および／もしくは本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号1〜配列番号10より選択される）にコードされる部分配列に特異的な抗体も同様に、例えば、細胞または組織に由来する発現産物を評価するためのプローブとして役立つ。さらに、抗体はとりわけ、アミノ酸配列（例えば、本明細書中に与えられたもの、または本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に示されたものから選択したもの）にコードされたもの）を含むタンパク質の発現を、in situ、組織アレイ、細胞、組織または生物体（例えば、同定されていないインフルエンザウイルスなどに感染した生物体）にて評価するのに好適である。抗体を、検出可能な試薬で直接的に標識するか、または特異的抗体の重鎖の定常領域（すなわち、アイソタイプ）に特異的な二次抗体を標識することによって間接的に検出することができる。特異的抗体の製造に関するさらなる詳細を以下に与える。
診断アッセイ
本発明の核酸を、診断アッセイに用いて、試料中のインフルエンザ（ならびに／または赤血球凝集素および／もしくはノイラミニダーゼ）を検出すること、赤血球凝集素様配列および／またはノイラミニダーゼ様配列を検出すること、ならびに化学的に合成したポリヌクレオチド断片または組換えポリヌクレオチド断片（例えば、本明細書中の配列から選択したもの）のいずれかを用いてインフルエンザ臨床分離株における株の違いを検出することができる。例えば、少なくとも10〜20ヌクレオチドを含む赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ配列の断片を、プライマーとして用いて、当該分野で周知であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法（例えば、逆転写PCR）を使用して核酸を増幅したり、また核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして用いて、臨床検体中のインフルエンザRNAなどの標的遺伝的物質を検出したりすることができる。
本発明のプローブ（例えば、本明細書中に与えられた特有配列から選択された配列によって例示されるもの）をまた用いて、当該分野で慣用的な手順にしたがって、さらなる有用なポリヌクレオチド配列を同定することができる（例えば、インフルエンザのさらなる株を特徴付けるため）。1セットの好ましい実施形態において、上記のような1または複数のプローブを用いて、発現産物またはクローン化ウイルス核酸のライブラリー（すなわち、発現ライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングして、本明細書中の配列と同一であるか、または有意な配列同一性を有する配列を含むクローンを同定する。その後、これらの同定した配列の各々を用いて、上記のような変異体プローブ対またはセットを含むプローブを作製することができる。ライブラリースクリーニングのような物理的方法などに加えて、コンピューターを利用した生物情報学的アプローチ（例えば、BLASTおよび他の配列相同性検索アルゴリズムなど）もまた、関連するポリヌクレオチド配列を同定するために用いることができることがわかる。
本発明のプローブは特に、細胞、組織または他の生物学的試料（例えば、鼻洗浄液または気管支洗浄液）中のインフルエンザ核酸の存在を検出すること、およびその正体を決定することに有用である。例えば、本発明のプローブを都合よく用いて、生物学的試料（例えば、被験体（ヒト被験体など）またはモデル系（培養細胞試料など）が、インフルエンザ、または特定のインフルエンザ株に曝されていたか、またはそれらに感染するか否かを決定する。生物学的試料またはモデル系に由来する（例えば、これらから単離した）核酸に対する選択したプローブのハイブリダイゼーションが検出されることによって、選択したプローブのポリヌクレオチドが由来するウイルス（または関連ウイルス）への曝露または感染を示される。
プローブの設計は、意図される用途に影響されることがわかるであろう。例えば、いくつかの対立遺伝子特異的プローブと標的との相互作用が、単一のアッセイ（例えば、単一のDNAチップ）にて検出されるべきものである場合、全てのプローブについて同様の融解温度を有していることが望ましい。したがって、プローブの長さを調節して、そしてアレイ上の全てのプローブについての融解温度が、近似するようにする（異なるプローブは異なるGC含有量を有する場合、特定のTm 値を得るためには、異なるプローブに対し異なる長さが必要とされることがわかるであろう）。プローブ設計において主に考慮することは、融解温度であるが、他の要因を場合によって用いて、プローブ構築（例えば、プライマーの自己相補性に対する選択など）をさらに調節する。
ベクター、プロモーターおよび発現系
本発明は、本明細書中に記載される1または複数の核酸配列を組み入れた組換え構築物を含む。このような構築物は場合によって、ベクター、（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）など）を含み、これに1または複数の本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号1〜配列番号10、またはその部分配列のいずれかを含む）が、順方向または逆方向で挿入される。例えば、挿入された核酸は、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を含むウイルス染色体配列またはcDNAを含むことができる。一実施形態において、構築物はさらに調節配列を含み、かかる調節配列は、例えば、配列に機能的に結合されたプロモーターを含む。多数の好適なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、これらは商業的に利用することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスRNAおよび場合によって、ポリペプチド（またはペプチド）発現産物（例えば、本発明の赤血球凝集素および／もしくはノイラミニダーゼ分子、またはその断片）を作製するのに好適な種々のベクターのうちのいずれか1つの中に含むことができる。このようなベクターには、染色体、非染色体および合成DNA配列（例えば、SV40誘導体; 細菌性プラスミド; ファージ DNA; バキュロウイルス; 酵母プラスミド;プラスミドとファージ DNAの組み合わせ物に由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのウイルスDNAおよびその他多数（例えば、pCDL）が含まれる。遺伝物質を細胞に導入することができ、複製を望む場合には、関連宿主で複製することができる任意のベクターを用いることができる。
発現ベクターにおいて、目的のHAおよび／またはNAポリヌクレオチド配列を適切な転写制御配列（例えば、プロモーター、および場合によって1もしくは複数のエンハンサー）の近くに、かつその配列に向けて物理的に配置し、mRNA合成を制御する。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列を、適切な転写制御配列に機能的に結合する。このようなプロモーターの例としては、LTRまたはSV40プロモーター、E. coli lacまたはtrpプロモーター、ファージλPLプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。
種々のプロモーターが、インフルエンザウイルスのゲノムセグメントの転写を調節するための発現ベクターに用いるのに好適である。特定の実施形態において、サイトメガロウイルス（CMV）DNA依存型RNAポリメラーゼ II（Pol II）プロモーターを用いる。所望する場合、例えば、条件発現を制御するために、他のプロモーターを代わりに用いることができ、これは特定の条件または特定の組織または細胞においてRNA転写を誘導する。非常に多くのウイルスプロモーターおよび哺乳動物（例えば、ヒト）プロモーターが入手可能であるか、または意図される特定の用途に従って単離することができる。例えば、動物およびヒトウイルスのゲノムより得られる代替的なプロモーターとしては、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス 2）、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス 40（SV40）などのプロモーター、ならびに様々なレトロウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物のプロモーターとしては、その他多くのものの中から、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどが挙げられる。
転写は場合によって、エンハンサー配列を含めることによって増強される。エンハンサーは一般に短い（例えば、10〜500 bp）シス作用性DNAエレメントであり、これは、プロモーターと協調して作用し、転写を増強する。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）ならびに真核細胞ウイルスより単離されている。エンハンサーは、異種コード配列の5'または3' 位置にてベクターにつなげることができるが、一般にプロモーターの5'位置に挿入される。一般に、プロモーターおよび、所望する場合、さらなる転写増強配列を選択し、異種DNAが導入されるべき宿主細胞型における発現を最適化する（Scharf ら（1994） Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler ら（1990） Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27）。場合によって、単位複製配列はまた、転写を開始するためのリボゾーム結合部位または内部リボソーム進入部位（IRES）を含むことができる。
本発明のベクターはまた、転写の終結およびmRNAを安定させるのに必要な配列（例えば、ポリアデニル化部位またはターミネーター配列）を都合よく含む。このような配列は一般に、真核生物、またはウイルスのDNAまたはcDNAの5'非翻訳領域（しばしば3'非翻訳領域）より得ることができる。一実施形態において、SV40ポリアデニル化シグナル配列は、双方向性ポリアデニル化部位を与えることができ、この部位は（+）鎖mRNA分子の転写を、（−）鎖ウイルスゲノムの複製を開始するPolIプロモーターから隔離する。
さらに、上記のように発現ベクターは場合によって、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型特性を与えるために1または複数の選択可能なマーカー遺伝子を含み、これまでに挙げた遺伝子に加えて、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などのマーカーが、真核細胞培養における選択に好適である。
上記のような適切な核酸配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて、タンパク質の発現を可能とする宿主細胞を形質転換することができる。本発明のベクターは、細菌細胞において複製することができ、最も頻繁には、発現のために、哺乳動物細胞（例えば、Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞など）にそれらベクターを導入することが望ましい。
他の箇所に記載したように、本明細書中のHA配列およびNA配列は様々な実施形態において、プラスミドレスキューリアソートメントに含まれるプラスミド内に含むことができる。例えば、米国特許出願第60/420,708号（2002年10月23日提出）; 同上第60/574,117号（2004年5月24日提出）; 同上第10/423,828号（2003年4月25日提出）; 同上第60/578,962号（2004年6月12日提出）;および同上第10/870,690号（2004年6月16日提出）; ならびにUS20020164770（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。例えば、本発明の好ましい発現ベクターとしては、限定はしないが、pol Iプロモーターおよびターミネーター配列を含むベクターまたはpol Iとpol IIプロモーターの両方を用いるベクター「polI/polIIプロモーター系」（例えば、Zobelら、Nucl. Acids Res. 1993, 21:3607; US20020164770; NeumannらProc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodorら、J. Virol. 1999, 73:9679;およびUS20030035814）が挙げられる。製造されるリアソータントは、A/Ann Arbor/6/60 ドナー株（ならびに／またはその誘導体および改変体）、PR8 ドナー株バックボーン、A/Leningrad/17 ドナー株バックボーンなどに由来する6個の他のインフルエンザ遺伝子と共に配置されたHAおよびNA遺伝子を含むことができる。他のバックボーン株は、例えば、20040137013および20030147916に記載され、これらは本明細書中に参考として援用される。
付加的な発現エレメント
最も一般的には、インフルエンザウイルス HAおよび／またはNAタンパク質をコードするゲノムセグメントは、その発現（ウイルスの機能的タンパク質への翻訳を含む）に必要なさらなる配列を含む。他の状況において、ミニ遺伝子、またはウイルスタンパク質（例えば、HAおよび／またはNA タンパク質）をコードする他の人工構築物を用いることができる。さらに、このような場合、特定の開始シグナルを含むことがしばしば望ましく、かかる開始シグナルは、異種コード配列の効率的な翻訳を助ける。これらのシグナルは、例えば、ATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。全挿入物の翻訳を確実にするために、開始コドンを、ウイルスタンパク質に関して正確なリーディングフレームに挿入する。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものでありうる。発現効率は、用いる細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強できる。
所望される場合、付加的に発現されるエレメント（例えば、シグナル配列、分泌配列または局在化配列など）をコードするポリヌクレオチド配列を、目的のポリヌクレオチド配列を有するベクターの通常インフレームに組み込み、例えば、所望の細胞コンパートメント、膜または細胞小器官におけるポリペプチドの発現を目的としたり、または細胞膜周辺腔もしくは細胞培養培地中へのポリペプチドの分泌を行わせたりすることができる。このような配列は、当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、細胞小器官ターゲティング配列（例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア移行配列）、膜局在化/アンカー配列（例えば、ストップトランスファー配列、GPI アンカー配列）などが挙げられる。
本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの翻訳が望まれる場合、付加的な翻訳特異的開始シグナルが翻訳の効率を改善することができる。これらのシグナルとしては、例えば、ATG開始コドンと隣接配列、IRES領域などが挙げられる。いくつかの場合には、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中の配列における）、翻訳開始コドンおよび関連配列エレメントを組み込むコード配列を含む全長cDNA分子または染色体セグメントを、目的のポリヌクレオチド配列と一緒に適切な発現ベクターに挿入する。このような場合、付加的な翻訳制御シグナルはしばしば必要ではない。しかし、ポリペプチドコード配列、またはその一部のみが挿入される場合、例えば、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルがしばしば、関連配列を発現するために与えられる。開始コドンは、正確なリーディングフレーム中に配置して、目的のポリヌクレオチド配列の転写を確実にする。外因性転写エレメントと開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものでありうる。発現効率は、用いる細胞系に適切なエンハンサーを含むことによって増強できる（例えば、Scharf D.ら（1994） Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittnerら（1987） Methods in Enzymol 153:516-544を参照のこと）。
組換えウイルスの製造
ネガティブ鎖RNAウイルスを、遺伝子的に操作して、組換え逆遺伝学的アプローチを用いて回収できる（例えば、PaleseらのUSPN 5,166,057を参照のこと）。このような方法は元々、インフルエンザウイルスゲノムを操作するために用いられており（Luytjesら（1989） Cell 59:1107-1113; Enamiら（1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567）、多種多様なセグメント化されたおよびセグメント化されていないネガティブ鎖 RNAウイルス（例えば、狂犬病（Schnellら（1994） EMBO J. 13: 4195-4203）; VSV（Lawsonら（1995） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481）; 麻疹ウイルス（Radeckeら（1995） EMBO J. 14:5773-5784）; 牛疫ウイルス（Baron & Barrett（1997） J. Virol. 71: 1265-1271）; ヒトパラインフルエンザウイルス（Hoffman & Banerjee（1997） J. Virol. 71: 3272-3277; Dubinら（1997） Virology 235:323-332）; SV5（Heら（1997） Virology 237:249-260）; 犬ジステンパーウイルス（Gassenら（2000） J. Virol. 74:10737-44）;およびセンダイウイルス（Parkら（1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Katoら（1996）Genes to Cells 1:569-579））に首尾よく用いられていた。当業者は、本発明のHA配列およびNA配列を含むインフルエンザウイルスを製造するための、これらおよび同様の技術をよく知っている。このような方法にしたがって製造される組換えインフルエンザウイルスもまた本発明の特徴であり、例えばそれは本発明の1または複数の核酸および／またはポリペプチドを含む組換えインフルエンザウイルスである。
細胞培養および発現宿主
本発明はまた、本発明のベクターが導入された（形質導入、形質転換またはトランスフェクトされた）宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造法に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えば、発現ベクター）を用いて遺伝子操作されている（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクトされている）。上記のように、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態でありうる。適切な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス、およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）; 真菌細胞(例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア（Pichia pastoris）および, アカパンカビ（Neurospora crassa）;または昆虫細胞（ハエ（Drosophila）およびガ（Spodoptera frugiperda）が挙げられる。
最も一般的には、哺乳動物細胞を用いて、本発明のHAおよびNA分子を培養する。インフルエンザウイルスを複製するのに好適な宿主細胞としては、例えば、Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞およびCOS細胞（293T細胞COS7細胞などを含む）が挙げられる。一般的に、上記細胞系統のうちの2種（例えば、MDCK細胞と293T細胞またはCOS細胞のいずれか）を例えば、１：１の割合で含む共培養を用いて複製効率を改善する。一般的に、細胞を、標準的な市販の培養培地（例えば、血清（例えば、10％胎児ウシ血清）を添加したダルベッコ改変イーグル培地）または無血清培地中で、制御された湿度および中性に緩衝されたpH（例えば、pH 7.0〜7.2）を維持するのに好適なCO2濃度下にて培養する。場合によって、培地は、細菌の増殖を防ぐための抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなど）および／または、好ましい増殖特性を促すためのL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、付加的な添加物（例えば、トリプシン、β−メルカプトエタノールなど）などの栄養分を含む。
操作した宿主細胞は、プロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または挿入したポリヌクレオチド配列を増幅することに適切なように改変した通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は一般に、発現を行うために選択された特定の宿主細胞でこれまでに用いられていた条件であり、当業者にとって、また本明細書中に引用される参考文献（例えば、Freshney（1994）Culture of Animal Cells, a Manual of BasicTechnique, 第3版, Wiley- Liss, New Yorkおよびその引用文献を含む）中にて、明らかである。他の役立つ参考文献としては、例えば、Paul（1975） Cell and Tissue Culture, 第5版, Livingston, Edinburgh; Adams（1980） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, WorkおよびBurdon（編） Elsevier, Amsterdamが挙げられる。in vitroでのインフルエンザウイルス製造に特に重要である組織培養方法に関するさらなる詳細としては、例えば、CohenおよびShafferman（編） Novel Strategies in Design and Production of vaccinesにおけるMertenら、（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparationが挙げられ、これはその全体があらゆる目的のために、本明細書中に援用される。さらに、本発明に適合されたこのような方法のバリエーションは、日常的な実験によって容易に決定でき、また当業者によく知られている。
インフルエンザウイルス（例えば、本発明のHAおよび／またはNA配列を有する）を製造するための細胞は、血清含有培地または無血清培地中にて培養できる。いくつかの場合において、例えば、精製したウイルスを調製するために、一般に無血清条件中で宿主細胞を増殖することが望ましい。細胞を小規模（例えば、25 ml未満の培地）の培養チューブもしくは培養フラスコ、または大きなフラスコで撹拌しながら、回転ボトル中で、またはフラスコ、ボトルもしくはリアクター培養中のマイクロキャリアビーズ（例えば、DEAE-デキストランマイクロキャリアビーズ（Dormacell, Pfeifer & Langenなど）、Superbead（Flow Laboratories）、スチレンコポリマー−トリ−メチルアミンビーズ（Hillex, SoloHill, Ann Arborなど）上で培養できる。マイクロキャリアビーズは、（直径100〜200ミクロンの範囲の）小さな球体であり、細胞培養の容積あたり接着性細胞増殖のための大きな表面積を与える。例えば、1リットルの培地は、2000万個以上のマイクロキャリアビーズを含み、8000 cm 2以上の増殖面を提供することができる。ウイルスを商業的に製造するために、例えば、ワクチン製造のために、しばしば細胞を、バイオリアクターまたは発酵槽中で培養することが望ましい。バイオリアクターは、1リットル未満〜100リットルを超える容量まで利用できる（例えば、Cyto3バイオリアクター（Osmonics, Minnetonka, MN）; NBSバイオリアクター（New Brunswick Scientific, Edison, NJ）; B. Braun Biotech Internationalからの実験室または商業的規模のバイオリアクター（B. Braun Biotech, Melsungen, Germany））。
培養の容積にかかわらず、本発明の多くの所望される態様において、培養物を適切な温度に維持し、温度依存性多重プラスミド系（例えば、Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus, 米国特許出願第60/420,708号（2002年10月23日提出）、米国特許出願第10/423,828号（2003年4月25日提出）および米国特許出願第60/574,117号（2004年5月24日提出）を参照のこと）を用いて、濾過を行うためにウイルス溶液を加熱して、組換えおよび／またはリアソータントインフルエンザウイルスの効率的な回収を確実にすることが重要である。一般的に、レギュレーター（例えば、サーモスタットまたは細胞培養系および／もしくは他の溶液の温度を感知および維持するための他の装置）を用いて、温度が、適当な期間（例えば、ウイルス複製などの間）、正確なレベルであることを確実にする。
本明細書中のいくつかの実施形態（例えば、リアソータントウイルスが、ベクター上のセグメントから製造されるものである場合）において、インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを、真核細胞に異種核酸を導入するための当該分野で周知である方法（例えば、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション法を含む）にしたがって、宿主細胞に導入する（例えば、トランスフェクトする）。例えば、ベクター（プラスミドなど）を、リアソータントウイルスなどを製造するために、製造者の指示に従ってポリアミントランスフェクション試薬 TransIT-LT1（Mirus）を用いて、宿主細胞（例えば、COS細胞、293T細胞またはCOS細胞もしくは293T細胞とMDCK細胞の組合せ）にトランスフェクトすることができる。したがって、1実施形態において、総容積200μｌにて、およそ1μｇの各ベクターを、160μｌの培地（好ましくは無血清培地）中に希釈したおよそ2μｌのTransIT-LT1を用いて宿主細胞の集団に導入する。DNAとトランスフェクション試薬の混合物を、室温で45分間インキュベートして、その後800μｌの培地を加える。トランスフェクション混合物を、宿主細胞に加えて、そして細胞を、記載されるように、当業者に周知である他の方法によって培養する。したがって、細胞培養にて組換えまたはリアソータントウイルスを製造するために、それぞれ8個のゲノムセグメント（PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HAおよびNA（例えば、本発明の））を組み込むベクターを、およそ20μｌのTransIT-LT1と混合し、宿主細胞にトランスフェクトする。場合によって、血清含有培地を、トランスフェクションの前に、無血清培地（例えば、Opti-MEM I）に代え、4〜6時間インキュベートする。
あるいは、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを組み込むベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、インフルエンザAウイルスまたはインフルエンザBウイルスを組み込むプラスミドベクターを、以下の手順にしたがってエレクトロポレーションを用いて、Vero細胞に都合よく導入する。簡潔に言えば、例えば、10％胎児ウシ血清（FBS）を添加した改変イーグル培地（MEM）中で増殖したおよそ5×106個のVero細胞を、0.4 mlのOptiMEM中に懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに置く。25μｌまでの容積中の20μｇのDNAを、キュベット中の細胞に添加し、次にそれをタッピングして穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、製造者の指示にしたがって、300ボルト、950 マイクロファラッド、28〜33msecの時定数で行う（例えば、BioRad Gene Pulser IIと共に接続されたCapacitance Extender Plusを用いる）。細胞を穏やかにタッピングして再び混合し、エレクトロポレーションからおよそ1〜2分後、10％ FBSを含む0.7 ml MEMをキュベットに直接加える。次に細胞を、2 ml MEM、10％ FBSを入れた標準的な6ウェル組織培養皿のうちの2ウェルに移す。キュベットを、残っている細胞を回収するために洗浄し、そしてこの洗浄懸濁液を上記2ウェルに分ける。最終容量は、およそ3.5 ｍＬである。次に細胞を、ウイルスの増殖を許容する条件下（例えば、好冷性株については、およそ33 ℃）でインキュベートする。
哺乳動物の宿主細胞において、多数の発現系（例えば、ウイルスベースの系）を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、コード配列を場合によって、後期プロモーターと3つに分かれたリーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体にライゲーションする。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域中への挿入によって、感染した宿主細胞にて目的のポリペプチドを発現することができる生存可能なウイルスを生じる（LoganおよびShenk（1984） Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー）を用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を増加させることができる。
宿主細胞株は場合によって、挿入された配列の発現を変化させる能力または所望される様式に発現されたタンパク質を処理する能力について選択される。このようなタンパク質の修飾としては、限定はされないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）およびアシル化が挙げられる。タンパク質の翻訳後プロセシング（前駆型を切断し成熟型にする）は時々、正確な挿入、折りたたみ、および／または機能にとって重要である。さらに、宿主細胞内の適切な位置（例えば、細胞表面上）もまた重要である。異なる宿主細胞（例えば、COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7など）は、翻訳後活性に関する特異的な細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、今回導入される外来性タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実に行うように選択できる。
本発明のポリヌクレオチドにコードされるか、またはそのポリペプチドにコードされる配列を有する組換えタンパク質を長期間、高収率で製造するために、安定した発現系が場合によって用いられる。例えば、本発明のポリペプチドを安定して発現する細胞系統を、発現ベクターを用いてトランスフェクトし、かかる発現ベクターは、複製または内在性発現エレメントのウイルス性開始点と選択可能なマーカー遺伝子を含む。例えば、ベクターの導入後、細胞を富栄養培地中で1〜2日間増殖させ、その後、選択培地へと変えた。選択可能なマーカーの目的は、選択するために耐性を与えることであり、それが存在することによって、導入した配列をうまく発現している細胞の増殖および回収を可能とする。したがって、例えば、単一の細胞型に由来する安定した形質転換細胞の耐性凝集塊を、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は場合によって、コードされたタンパク質の発現および細胞培養からの回収を行うのに好適な条件下で培養する。このタンパク質を発現する細胞は、選別、単離および／または精製することができる。組換え細胞によって産生されたタンパク質またはそれらの断片は、分泌されるか、膜に結合するか、または細胞内に保持することができ、それは配列（例えば、膜保持シグナルなどをコードする融合タンパク質）および／または用いたベクターによって決定される。
本発明の核酸に対応する発現産物はまた、非動物性（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）の細胞にて製造することができる。Sambrook、BergerおよびAusubelに加えて、細胞培養に関して詳しく述べる以下の全ては、Payneら、（1992） Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY中に見出される; GamborgおよびPhillips（編）（1995） Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag（Berlin Heidelberg New York）ならびにAtlasおよびParks（編） The Handbook of MIcrobiological Media（1993） CRC Press, Boca Raton, FL。
細菌系において、多数の発現ベクターを、発現される産物の意図される用途に応じて選択することができる。例えば、大量のポリペプチドまたはその断片が、抗体の製造に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現するベクターが、都合よく用いられる。このようなベクターとしては、限定はしないが、多機能性E. coli クローニングおよび発現ベクター（例えば、BLUESCRIPT（Stratagene））が挙げられ、このベクター中の目的のコード配列（例えば、本明細書中に見出される配列を含むものなど）を、アミノ末端翻訳開始メチオニンおよびそれに続く7残基のβ−ガラクトシダーゼの配列（触媒的に活性なβガラクトシダーゼ融合タンパク質を生じる）とともにベクターにインフレームでライゲーションできる; pIN ベクター（Van Heeke & Schuster（1989） J Biol Chem 264:5503-5509）; pET ベクター（Novagen, Madison WI）など。同様に、酵母（Saccharomyces cerevisiae）において、構成的または誘導性プロモーター（α因子、アルコール酸化酵素およびPGHなど）を含む多数のベクターを、所望の発現産物を製造するために用いることができる。概説については、Ausubel（下記）およびGrantら、（1987）; Methods in Enzymology 153:516-544。
核酸のハイブリダイゼーション
比較ハイブリダイゼーションを用いて、本発明の核酸（例えば、配列番号1〜10）（本発明の核酸の保存的なバリエーションを含む）を同定することができる。この比較ハイブリダイゼーション法は、本発明の核酸を識別するのに好ましい方法である。さらに、本明細書中に示される核酸によって表される核酸に、高ストリンジェンシーな、超高ストリンジェンシーなおよび非常に超高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする標的核酸は、本発明の特徴である。このような核酸の例としては、所定の核酸配列と比較した場合、1または数個のサイレントな核酸置換または保存的な核酸置換を有するものが挙げられる。
試験標的核酸は、プローブ核酸に対して特にハイブリダイズするといわれ、それは、試験核酸が、完全一致の相補的な標的に対するプローブ核酸と少なくとも半分ハイブリダイズし、その際の、シグナル対ノイズの比率が、ある条件下でのプローブと標的とのハイブリダイゼーションにおける比率の半分の大きさである場合である。かかる条件下では、完全に一致するプローブが、完全に一致する相補的な標的に結合し、その際のシグナル対ノイズの比率は、一致しない標的核酸に対するハイブリダイゼーションにて見られる比率よりも少なくとも約5−10倍高い。
一般に、溶液中で核酸は「ハイブリダイズ」する（核酸が結合する場合）。核酸は、種々の十分に特徴付けされた物理化学的な力（例えば、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなど）によってハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについて非常に多くのプロトコルが、当該分野で周知である。核酸ハイブリダイゼーションについての詳細なガイドが、Tijssen（1993） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acids Prpbes part I chapter 2,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,」（Elsevier, New York）、Ausubel、Sambrook、およびBergerならびにKimmel(以下の全て)に見出される。HamesおよびHiggins（1995） Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England,（Hames and Higgins 1）ならびにHamesおよびHiggins（1995） Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England（Hames and Higgins 2）は、DNAおよびRNA（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出および定量についての詳細を与える。
100個以上の相補的残基を有する相補的核酸を、サザンブロットまたはノザンブロットにてフィルター上でハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、1ｍｇのヘパリンを含む50％ホルマリンを用いて、42℃にてハイブリダイゼーションを一晩行うことを含む。ストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃にて15分間、0.2×SSCを用いて洗浄することを含む（SSC緩衝液および他の核酸ハイブリダイゼーションのパラメーターに関する詳細については、Sambrook（以下）を参照のこと）。しばしば高ストリンジェントな洗浄が、低ストリンジェントな洗浄に続いて行われ、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシーな洗浄の例は、40℃にて15分間、2×SSCを用いて洗浄することである。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係のプローブについてみられるものよりも、5倍の（またはそれよりも高い）シグナル対ノイズの比率が、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていない核酸を、一連の洗浄によって除去でき、その洗浄のストリンジェンシーは、所望の結果に応じて調節できる。低ストリンジェンシーな洗浄条件（より高い塩濃度とより低い温度を用いる）は、感度を高めるが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じうる。より高ストリンジェンシーな条件（例えば、より低い塩濃度およびTm値に近似する高い温度を用いる）は、一般的に、主に特異的シグナルを残しながら、バックグラウンドシグナルを低下させる。さらに、Rapley, R.およびWalker, J.M. （編）, Molecular Biomethods Handbook（Hummana Press, Inc. 1998を参照のこと。
核酸のハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーション）との関係において「ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーター下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細なガイドが、Tijssen（1993）（上記）ならびにHamesおよびHiggins, 1および2に見られる。いずれかの試験核酸についての、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、経験的に容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する場合、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、選択した一連の基準を満たすまで徐々に高める（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄の際の、温度を高める、塩濃度を下げる、界面活性剤の濃度を高めるおよび／または有機溶媒（例えば、ホルマリン）の濃度を高めることによる）。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、徐々に高め、それはプローブが、完全に一致する相補的な標的に結合し、その場合に、シグナル対ノイズの比率が、非対応の標的に対してプローブがハイブリダイゼーションしたためにみられる比率よりも、少なくとも5倍高くなるまで行う。
一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、シグナル対ノイズの比率が、無関係のプローブについて見られる比率と比べて少なくとも2倍（またはそれ以上（例えば、少なくとも倍、10倍、20倍50倍100倍もしくはそれ以上））である場合、それは特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明との関連において、2つの配列間における少なくともストリンジェンシーなハイブリダイゼーションを検出することは、例えば、本明細書中の配列リストに与えた本発明の核酸との比較的強い構造的類似性を示す。
「非常にストリンジェンシーな」条件は、特定のプローブについての熱融点（Tm）に等しくなるように選択する。Tm値は、（所定のイオン強度およびpH下における）温度であり、かかる温度にて50％の試験配列が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする。本発明のために、一般的に、「高ストリンジェンシーな」ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、所定のイオン強度およびpH下における特定配列のTm値よりも約5℃低くなるように選択する（下に示すように、高ストリンジェンシーな条件はまた、比較の用語で表すことができる）。目的のヌクレオチド配列（例えば、「プローブ」）に密接に関連するか、または同一である標的配列は、ストリンジェンシーなまたは高ストリンジェンシーな条件下で同定できる。低ストリンジェンシーな条件は、相補性の低い配列に適している。
「超高ストリンジェンシーな」ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件とは、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーを、完全に一致する相補的な標的核酸に対するプローブの結合についての、シグナル対ノイズの比率が、非対応の標的核酸に対するハイブリダイゼーションにてみられる比率の、少なくとも10倍高くなるまで増加させたものをいう。このような条件下でプローブにハイブリダイズし、その場合のシグナル対ノイズの比率が、完全に一致する相補的な標的核酸のものの少なくとも半分である、標的核酸は、超高ストリンジェンシーな条件下でプローブ結合するといわれる。
ストリンジェンシーなまたは高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件（またはさらによりストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件）および洗浄条件を決定する場合、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を、選択した一連の基準を満たすまで徐々に高める（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄の際の、温度を高める、塩濃度を下げる、界面活性剤の濃度を高めるおよび／または有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度を高めることによる）。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を徐々に高め、それは、所望されるように、1または複数の本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に与えた配列（例えば、配列番号1〜10）から選択される配列もしくは特有部分配列）および／または相補ポリヌクレオチド配列を含むプローブが、完全に一致する相補的な標的（さらに、本明細書中に与えた配列から選択される1または複数の核酸配列もしくは部分配列を含む核酸および／またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列）に結合し、その場合に、シグナル対ノイズの比率が、非対応の標的（例えば、本願提出時の公開されたデータベース（GenBankなど）に存在する既知のインフルエンザ配列から選択される1または複数の配列または部分配列を含むポリヌクレオチド配列および／またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列）へのプローブのハイブリダイゼーションに関して見られる比率の少なくとも2倍（場合によって、5倍、10倍または100倍以上）高くなるまで行われる。
本発明のポリヌクレオチド、またはそれらの部分配列を用いて、新規標的核酸を得ることができる。このような標的核酸もまた、本発明の特徴である。例えば、このような標的核酸は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号1〜10）のいずれかに対応する特有のオリゴヌクレオチドプローブに、ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする配列を含む。
同様に、さらに高いレベルのストリンジェンシーを、関連するハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を徐々に高めることによって決定できる。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーを高め、それは、完全に一致する相補的な標的核酸へプローブの結合に関する、シグナル対ノイズの比率が、非対応の標的核酸へのハイブリダイゼーションに関してみられる比率の少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍、もしくは500倍またはそれ以上高くなるまで行う。特定のシグナルは、関連アッセイに用いた標識（例えば、蛍光標識、比色分析用標識、放射性標識など）によって決まる。このような条件下でプローブにハイブリダイズし、その場合のシグナル対ノイズの比率が、完全に一致する相補的な標的核酸においてみられる比率の少なくとも半分である標的核酸は、非常に超ストリンジェンシーな条件下でプローブに結合するといわれ、このような核酸もまた本発明の特徴である。
ストリンジェンシーな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸はまた、それらがコードするポリペプチドが実際に同一である場合、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって可能となる最大限のコドン縮重を用いて作製された場合に、生じる。
目的の生体分子のクローニング、突然変異誘発および発現
本発明に適用できる分子生物学的技術（例えば、クローニング、突然変異、細胞培養など）を記載する一般的な教科書としては、以下のものが挙げられる；BergerおよびKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA（Berger）; Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual（第3版）, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000（「Sambrook」）ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら、（編）Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,（supplemented through 2002）（「Ausubel」））。これらの教科書は、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーターおよび他の多くの関連トピック（例えば、HAおよび／またはNA分子などの産生など）を記載する。
種々の型の突然変異誘発を場合によって、本発明に用いて、例えば、新規もしくは新たに単離したHAおよび／もしくはNA分子を製造および／または単離したり、ならびに／あるいは本発明のポリペプチド（例えば、配列番号11〜20のHAおよびNA分子）をさらに改変／突然変異させたりする。突然変異誘発としては、限定はしないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（DNA シャッフリング）、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート改変型DNA突然変異誘発、ギャップを有する二本鎖DNAを用いた突然変異誘発、などが挙げられる。さらなる好適な方法としては、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主系統を用いた突然変異誘発、限定選択および限定精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖損傷修復などが挙げられる。突然変異誘発（例えば、キメラ構築物を含む）もまた本発明中に含まれる。一実施形態において、突然変異誘発は、天然の分子または変化もしくは突然変異した天然の分子に関する既知の情報（例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造など）によって導くことができる。
上記教科書および本明細書中に見られる実施例は、これらの方法および以下の出版物（およびそれらに引用される参考文献）を記載する: Sieberら、Nature Biotechnology, 19:456-460（2001）; Lingら、Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2）: 157-178（1997）; Daleら、Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol Biol 57:369-374（1996）; I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8（1995）; W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91（1994）; Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455（1993）; Bassら、Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245（1988）; Fritzら、Oligonucleotide -directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999（1988）; Kramerら、Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207（1988）; Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein（transducin）, Nucl Acids Res 14: 6361-6372（1988）; Sayersら、Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide -directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802（1988）; Sayersら、strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endnucleases in the presence of ethidium bromide,（1988） Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide -directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403（1987）; Kramer & Fritz oligonucleotide -directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367（1987）; Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology（Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin））（1987）; Kunkelら、Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382（1987）; Zoller & Smith, oligonucleotide -directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-strand DNA template, Methods in Enzymol 154:329-350（1987）; Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7（1986）; Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14: 5115（1986）; Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181（1986）; Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698（1986）; Wellsら、Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423（1986）; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201（1985）; Carterら、Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443（1985）; Grundstroemら、oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316（1985）; Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492（1985）; Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985）; Taylorら、The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764（1985）; Taylorら、The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787（1985）; Wellsら、Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323（1985）; Kramerら、The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 9441-9456（1984）; Kramerら、Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887（1984）; Nambiarら、Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301（1984）; Zoller & Smith, oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500（1983）;およびZoller & Smith, oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500（1982）。上記多くの方法についてのさらなる詳細は、Methods in Enzymol Volume 154に見出すことができ、これらはまた、様々な突然変異誘発、遺伝子単離、遺伝子発現および他の方法に関するトラブルシューティングの問題に関する有用な操作を記載する。
例えば、本発明の突然変異誘発（例えば、本発明のHAおよび／またはNA分子のライブラリーを突然変異させるか、または変化させる）に用いるためのオリゴヌクレオチドは一般に、例えば、自動合成機（Needham-VanDevanterら、Nucleics Res, 12:6159-6168（1984）に記載される）を使用して、固相ホスホラミダイトトリエステル法（Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts 22（20）:1859-1862,（1981）に記載される）に従って化学的に合成される。
さらに、本質的に、任意の核酸は、種々の商業的供給源（例えば、The Midland Certified Reagent Company（mcrc@oligos.com）, The Great American Gene Company（www.genco.com）, ExpressGen Inc.（www.expressgen.com）, Operon Technologies Inc.（Alameda, CA）およびその他多数）によってオーダーメイドされるか、またはそれらに普通に注文できる。同様に、ペプチドおよび抗体は、種々の供給源（例えば、PeptidoGenic（pkim@ccnet.comにて入手できる）、HTI Bio-products, Inc.（www.htibio.com）、BMA Biomedicals Ltd.（U.K.）、Bio.Synthesis, Inc.,およびその他多数）によってオーダーメイドされうる。
本発明はまた、HAおよび／もしくはNA分子または本発明の他のポリペプチドおよび／もしくは核酸（例えば、配列番号1〜20）を含む宿主細胞および生物に関する。宿主細胞は一般的に、本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターでありうる）を用いて操作する（例えば、形質転換、形質導入またはトランスフェクトする）。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチドまたはコンジュゲート化ポリヌクレオチドの形態でありうる。ベクターは、エレクトロポレーション（Fromら、Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824（1985）を参照のこと）、ウイルスベクターによる感染、あるいは、小さなビーズもしくは粒子のマトリックス内またはその表面に核酸を伴う小さな粒子を用いた高速弾道貫入（high velocity ballistic penetration）（Kleinら、Nature 327, 70-73（1987））を含む、標準的な方法によって、細胞および／またはマイクロ生物体に導入する。Berger、Sambrook、およびAusubelは、種々の適切な形質転換法を提供する。上記を参照のこと。
標的核酸に細菌細胞へ導入するためのいくつもの周知の方法が利用可能であり、これらの方法のいずれかを、本発明に用いることができる。これらの方法としては、レシピエント細胞とDNAを含む細菌のプロトプラストとの融合、エレクトロポレーション、噴出体の照射（projectile bombardment）、およびウイルスベクターを用いた感染などが挙げられる。細菌細胞を用いて、本発明のDNA構築物を含む複数のプラスミドを増幅することができる。細菌をlog段階まで増殖し、そして細菌内のプラスミドを、当該分野で公知の種々の方法によって単離できる（例えば、Sambrookを参照のこと）。さらに、非常に多くのキットが、細菌からプラスミドを精製するために商業的に入手可能である（例えば、Pharmacia BiotechよりEasyPrepTM、FlexiPrepTM; StratageneよりStrataCleanTM;およびQiagenよりQIAprepTMを参照のこと）。次に、単離、精製したプラスミドを、さらに操作して、細胞にトランスフェクトするために用いられるか、または生物体を感染させるために関連ベクターに組み入れられる他のプラスミドを製造する。一般的なベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現を調節するのに有用なプロモーターを含む。ベクターは場合によって、少なくとも1つの独立ターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物またはその両方にてカセットの複製を可能とする配列（例えば、シャトルベクター）ならびに原核生物および真核生物の両方の系のための選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物または場合によって両方における複製および組み込みに好適である。Giliman & Smith, Gene 8:81（1979）; Robertsら、Nature, 328:731（1987）; Schneider, B.ら、Protein Expr Purif 6435:10（1995）; Ausubel, Sambrook, Berger（上記全て）を参照のこと。クローニングに有用な細菌および細菌ファージのカタログが、例えば、ATCCより与えられる（例えば、ATCCより出版されるThe ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage（1992） Ghernaら（編） ）。シークエンス、クローニングおよび分子生物学の他の態様のための、理論的考察に基づく、さらなる基本的な方法はまた、Watsonら（1992）Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NYに見いだされる。上記を参照のこと。本明細書中の配列を含む有用なさらなるベクターは、ワクチン用インフルエンザウイルスの製造に関する節およびそこで引用された参考文献中にて示される。
ポリペプチドの製造および回収
好適な宿主細胞系統または株に形質導入し、適切な細胞密度まで宿主細胞を増殖させた後、選択したプロモーターを、適切な方法（例えば、温度変化または化学物質による導入）によって導入し、そして細胞をさらなる期間培養する。いくつかの実施形態において、次に、分泌性ポリペプチド産物（例えば、分泌性融合タンパク質形態のHAおよび／またはNAポリペプチド）を培養培地から回収する。他の実施形態において、本発明のHAおよび／またはNAポリペプチドを含むウイルス粒子を、細胞より製造する。あるいは、細胞を遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって粉砕し、そして生じた粗製抽出物をさらなる精製のために確保した。タンパク質を発現するために用いた真核細胞または細菌細胞は、当業者に周知である都合の良いいずれかの方法（凍結融解を繰り返す、超音波処理、力学的な破壊もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含む）によって粉砕できる。さらに、本発明のHAおよび／またはNAポリペプチド産物を発現する細胞を、細胞からポリペプチドを分離することなく利用できる。このような状況において、本発明のポリペプチドは場合によって、細胞表面上に発現され、（例えば、抗体などに結合する、細胞表面上のHAおよび／またはNA分子（またはそれらの断片、例えば、融合タンパク質などを含む）を有することに基づいて）試験される。このような細胞もまた、本発明の特徴である。
発現されたポリペプチドは、組換え細胞の培養物から、当該分野で周知である複数の方法（硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（例えば、当業者に公知であるタグ付けシステムのいずれかを用いたもの）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む）のいずれかによって回収、および精製することができる。所望される場合、タンパク質の折りたたみ工程を用いて、成熟型タンパク質の構造を達成するために用いることができる。さらに、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を、最終精製工程に用いることができる。本明細書中に示した参考文献に加えて、種々の精製法が、当該分野で周知であり、それは例えば、Sandana（1997） Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.;ならびにBollagら、（1996） Protein Methods, 第2版Wiley-Liss, NY; Walker（1996） The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, HarrisおよびAngal（1990） Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; HarrisおよびAngal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes（1993） Protein Purification: Principles and Practice 第3版 Springer Verlag, NY; JansonおよびRyden（1998） Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, 第2版 Wiley-VCH, NY; ならびに Walker（1998） Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ、中に挙げられた方法を含む。
本発明の発現されたポリペプチドが、ウイルスにて製造された場合、ウイルスは一般に、感染した（トランスフェクトした）細胞が増殖した培養培地から回収される。一般に、粗製培地を、インフルエンザウイルスを濃縮する前に、清ませる。一般的な方法としては、限外濾過、硫酸バリウムへの吸着および溶出、ならびに遠心分離が挙げられる。例えば、感染培養物に由来する粗製培地をまず、細胞の残骸および他の大きな微粒子物質を除去するのに十分な時間（例えば、10〜30分間）、遠心分離する（例えば、1000〜2000×g）ことによって、清ませることができる。場合によって、次に清ました培地上清を遠心分離し（例えば、15,000×gにて、およそ3〜5時間 ）、インフルエンザウイルスをペレット化する。適切な緩衝液（例えば、STE（0.01 M Tris-HCl; 0.15 M NaCl; 0.0001 M EDTA）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）（pH 7.4）など）中にウイルスペレットを再懸濁した後、ウイルスを、ショ糖（60％-12％）または酒石酸カリウム（50％〜10％）を用いた密度勾配遠心分離によって濃縮する。連続的または段階的勾配（例えば、12％ずつ4段階の12％〜60％のショ糖勾配）が好適である。勾配物を、回収のための明確なバンドにウイルスを濃縮するのに十分なスピード、および時間で遠心分離する。あるいは、最大規模の商業的用途のために、ウイルスを連続的な様式で操作するゾーン遠心分離ローターを使用して密度勾配物より溶出する。当業者が組織培養からインフルエンザウイルスを調製するのに十分なさらなる詳細は、例えば、Nicholsonら（編） Textbook of Influenza pp. 324-332中のFurminger. Vaccine Production; Mertenら、（1996） Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman（編） Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151,および米国特許第5,690,937号に提供される。所望される場合、回収したウイルスを、安定剤としてのスクロースホスフェートグルタメート（SPG）存在下で−80℃にて保存できる。
あるいは、無細胞転写／翻訳系を用いて、例えば、本明細書中に与えられた配列番号11〜20などの配列または本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号1〜10）にコードされるアミノ酸配列あるいはその部分配列を含むポリペプチドを製造できる。複数の好適なin vitroでの転写および翻訳系が、商業的に利用することができる。in vitroでの転写および翻訳プロトコルの一般的なガイドが、Tymms（1995） In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NYに見出される。
さらに、ポリペプチドまたはそれらの部分配列（例えば、抗原性ペプチドを含む部分配列）を、手動で、または自動システム、固相技術を用いた直接的なペプチド合成によって製造できる（Stewartら、（1969） Solid-Phase Peotide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J（1963） J Am Chem Soc 85:2149-2154を参照のこと）。例示的な自動システムとしては、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer, Foster City, CA）が挙げられる。所望される場合、部分配列を別々に化学的に合成し、化学的方法を用いて組み合わせ、全長ポリペプチドを製造することができる。
修飾アミノ酸
本発明の発現したポリペプチドは、1または複数の修飾アミノ酸を含むことができる。修飾アミノ酸が存在することによって、例えば、（a）ポリペプチド血清の半減期を延伸させること、（b）ポリペプチドの抗原性を減少／増加させること、（c）ポリペプチドの保存安定性を増加させること、などに都合よくありうる。アミノ酸は、例えば、組換え製造の間に、翻訳と同時にもしくは翻訳後に修飾されるか（例えば、哺乳動物細胞での発現の間のN-X-S/TモチーフにおけるN結合型グリコシル化）または合成手段によって（例えば、via PEG化によって）修飾される。
修飾アミノ酸の非限定的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸など、および例えば、脂質部分または他の有機誘導剤にコンジュゲートすることによって修飾されたアミノ酸が挙げられる。アミノ酸を修飾することについて当業者をガイドするのに適した参考文献には、多数の論文が掲載される。プロトコルの例は、Walker（1998） Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJに見いだされる。
融合タンパク質
本発明はまた、本発明の配列（例えば、配列番号11〜20に例示されるようなHAおよび／またはNAポリペプチドをコードするもの）またはそれらの断片と、例えば、免疫グロブリン（もしくはその一部）、例えば、GFP（緑色蛍光タンパク質）または他の同様のマーカーなどをコードする配列との融合体を含む融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本発明の別の態様である。本発明の融合タンパク質は場合によって、例えば、本発明の非融合タンパク質と同様の用途の用いられる（例えば、治療的、予防的、診断的、実験的用途など、本明細書中に記載される用途を含む）。免疫グロブリン配列とマーカー配列との融合に加えて、本発明のタンパク質はまた場合によって、例えば、融合タンパク質の選択および／または融合タンパク質の特定の細胞型、領域などに対するターゲティングを可能とする配列と融合する。
抗体
本発明のポリペプチドを用いて、本明細書中に与えられたポリペプチドおよび／または本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書中に示されたもの）にコードされるポリペプチドならびにそれらの同類的変異体に特異的な抗体を製造することができる。上に述べたポリペプチドに特異的な抗体は、例えば、標的ポリペプチドの活性、分布および発現に関して、診断および治療目的などに有用である。
本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、当業者に周知である方法で製造することができる。このような抗体としては、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、一本鎖、Fab断片およびFab発現ライブラリーで製造される断片が挙げられる。
ポリペプチドは、抗体製造のために生物学的活性を必要としない（例えば、全長の機能的赤血球凝集素またはノイラミニダーゼは必要ではない）。しかし、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、抗原性でなけらなならない。特異的抗体を誘導するために用いられるペプチドは一般に、少なくとも約4 個のアミノ酸、しばしば少なくとも5個または10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの短いストレッチは、別のタンパク質（例えば、スカシ貝（keyhole limpet）ヘモシアニン）およびキメラ分子に対して製造される抗体と融合することができる。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造するための非常に多くの方法が当業者に公知であり、本発明のポリペプチド、および／または本発明のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドなどに特異的な抗体を製造することに適合できる。例えば、Coligan（1991） Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul（編）（1998） Fundamental Immunology, 第4版, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; HarlowおよびLane（1989）Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stitesら、（編） Basic and Clinical Immunology（第4版） Lange Medical Publications, Los Altos, CA、およびそれらに引用される参考文献; Goding（1986）Monoclonal Antibodies: Principles and Practice（第2版） Academic Press, New York, NY; ならびにKohlerおよびMilstein（1975） Nature 256: 495-497を参照のこと。抗体調製のための他の好適な技術は、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーを選択することを含む。Huseら、（1989） Science 246: 1275-1281;およびWardら、（1989） Nature 341: 544-546を参照のこと。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は一般に、KDが、例えば、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.01μMまたはそれ以下、一般に少なくとも約0.001μMまたはそれ以下で用いて結合する。
特定の治療的用途に、ヒト化抗体が望ましい。キメラ（ヒト化）抗体を製造するための詳細な方法は、米国特許第5,482,856号に見出すことができる。ヒト化抗体および他の抗体の製造技術および操作技術のさらなる詳細は、Borrebaeck（編）（1995）Antibody Engineering, 第2版 FreemanおよびCompany, NY（Borrebaeck）; McCaffertyら（1996）Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England（McCafferty）、ならびにPaul（1995）Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ（Paul）に見出すことができる。特定の手順に関するさらなる詳細は、例えば、Ostbergら（1983）, Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, 米国特許第4,634,664号、およびEngelmanら米国特許第4,634,666号に見出すことができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義付け
本発明のポリペプチドが、種々の新しいポリペプチド配列（例えば、HAおよびNA分子を含む）を提供するために、ポリペプチドはまた、例えば、免疫学的アッセイにて、認識されうる新しい構造的特徴を与える。本発明のポリペプチド、および抗血清に結合されるポリペプチドに特異的に結合する抗血清の製造は、本発明の特徴である。
例えば、本発明はポリペプチド（例えば、HAおよびNA分子）を含み、かかるポリペプチドは、本明細書中に与えられた配列（例えば、配列番号11〜20）のうちの1または複数から選択されるアミノ酸配列を含む免疫源などに対して製造された抗体または抗血清に特異的に結合するか、それらと特異的に免疫反応する。他の相同体との交差反応を取り除くために、抗体または抗血清を、出願時の公開データベースで見出されるHAおよび／またはNA分子（例えば、「対照」ポリペプチド）を用いてサブトラクションする。核酸、その核酸にコードされるポリペプチドに相当する他の対照配列を製造し、抗体／抗血清をサブトラクションするために用いる。
典型的な1形態において、免疫アッセイは、ポリクローナル抗血清を使用し、かかる抗血清は、本明細書中の配列（例えば、配列番号11〜20）など、またはそれらの実質的な配列（すなわち、与えられた全長配列の少なくとも約30％）に相当する1または複数の配列を含む1または複数のポリペプチドに対して生じた。本配列由来の生じうるポリペプチドの免疫原のセットは、集合的に「免疫原性ポリペプチド」と以下いう。得られた抗血清が場合によって、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼの対照相同体に対して低い交差反応を有するように選択し、そしてこのような交差反応を、免疫アッセイにポリクローナル抗血清を使用する前に、例えば、1または複数の赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの対照相同体を用いた免疫吸収によって、除去する。
免疫アッセイに使用するための抗血清を製造するために、1または複数の免疫原性ポリペプチドを、本明細書中に記載されるように製造および精製する。例えば、組換えタンパク質を、組換え細胞にて製造できる。マウスの同系交配（マウスの実質的な遺伝的同一性により、より再現性がある結果が得られるために、本アッセイに用いられる）を、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバントなど）と組み合わせた免疫原性タンパク質と標準的なマウス免疫化プロトコルを用いて免疫化する（特定の免疫反応を決定するために使用できる抗体製造、免疫アッセイ形式、および条件の標準的な説明については、例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと）。抗体に関するさらなる参考文献および考察はまた、本明細書中に見出され、本発明に用いて、免疫反応によってポリペプチドを同定することができる。あるいは、本明細書中に開示される配列に由来する1または複数の合成または組換えポリペプチドを、担体タンパク質にコンジュゲートし、免疫原として用いる。
ポリクローナル血清を回収し、免疫アッセイ（例えば、固相支持体上に固定した1または複数の免疫原性タンパク質を用いた固相免疫アッセイ）にて免疫原性ポリペプチドに対するタイターを評価する。106またはそれ以上のタイターを有するポリクローナル抗血清を選択し、プールして、そして赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼの対照ポリペプチドを用いてサブトラクションして、サブトラクション・プール・タイター評価したポリクローナル抗血清を製造する。
サブトラクション・プール・タイター評価したポリクローナル抗血清を、比較免疫アッセイにて、対照相同体に対する交差反応について検査する。この比較アッセイにおいて、特徴的な結合条件を、サブトラクション・タイター評価したポリクローナル抗血清について決定し、かかる血清は、タイター評価されたポリクローナル抗血清が対照相同体に結合する場合と比べて、免疫原性ポリペプチドに結合する場合に少なくとも約5〜10倍高い、シグナル対ノイズの比率を生じる。すなわち、結合反応のストリンジェンシーは、非特異的な競合体（例えば、アルブミンまたは脱脂粉乳）を添加するか、および／または塩条件、温度などを調節することによって、調節する。これらの結合条件は、その後続くアッセイに用いられ、かかるアッセイは、試験ポリペプチド（免疫原性ポリペプチドおよび／または対照ポリペプチドと比較されるポリペプチド）が、プール・サブトラクションしたポリクローナル抗血清と特異的に結合するか否かを決定するためのものである。特に、試験ポリペプチドが、特徴的な結合条件下にて対照受容体相同体よりも少なくとも2〜5倍高い、シグナル対ノイズの比率を示し、かつ免疫原性ポリペプチドと比べて少なくとも約1／2の、シグナル対ノイズの比率を示す場合、それは既知の受容体と比べて、免疫原性ポリペプチドとの実質的な構造類似性を共有し、それ故に、本発明のポリペプチドである。
別の例において、競合的結合形式における免疫アッセイを、試験ポリペプチドを検出するために用いる。例えば、示したように、交差反応抗体を、プールした抗血清混合物から、対照ポリペプチドを用いた免疫吸収によって取り除く。次に、免疫原性ポリペプチドを、固体支持体上に固定し、かかる固体支持体を、サブトラクション・プールした抗血清に曝した。試験タンパク質を、アッセイに添加し、プール・サブトラクションした抗血清への結合を競合する。固定したタンパク質と比べて、プール・サブトラクションした抗血清への結合を競合する試験タンパク質の能力を、結合を競合するためにアッセイに加えられた免疫原性ポリペプチドの能力と比較する（免疫原性ポリペプチドは、プールした抗血清への結合に関して、固定した免疫原性ポリペプチドと効果的に競合する）。試験タンパク質の％交差反応を、標準的な計算を用いて算出する。
平行アッセイにて、プール・サブトラクションされた抗血清への結合を競合する対照タンパク質の能力を場合によって、抗血清への結合を競合する免疫原性ポリペプチドの能力と比較して決定する。さらに、対照ポリペプチドの％交差反応を、標準的な計算を用いて算出する。％交差反応が、対照ポリペプチドと比べて試験ポリペプチドについて少なくとも5〜10倍高いか、または試験ポリペプチドの結合が、およそ免疫原性ポリペプチドの結合範囲である場合、試験ポリペプチドは、プール・サブトラクションされた抗血清に特異的に結合するといわれる。
一般的に、免疫吸収・プールされた抗血清を、本明細書中に記載される競合的結合免疫アッセイに用いて、免疫原性および／または対照ポリペプチドと任意の試験ポリペプチドを比較することができる。この比較を行うために、免疫原性ポリペプチド、試験ポリペプチドおよび対照ポリペプチドを、広範な濃度でそれぞれアッセイし、そして例えば、固定した対照タンパク質、試験タンパク質または免疫原性タンパク質へのサブトラクションした抗血清の結合を50％阻害するのに必要とされる各ポリペプチドの量を、標準的な技術を用いて決定する。競合アッセイにて結合に必要とされる試験ポリペプチドの量が、必要とされる免疫原性ポリペプチドの量の2倍未満であり、試験ポリペプチドが、免疫原性タンパク質に対して製造された抗体に特異的に結合するといわれる場合、与えられた量は、対照ポリペプチドの少なくとも約5〜10倍高い。
特異性をさらに決定する場合、プールした抗血清は場合によって、（対照ポリペプチドよりもむしろ）免疫原性ポリペプチドを用いて完全に免疫吸収し、その免疫吸収は、検出される、免疫原性ポリペプチドへの得られた免疫原性ポリペプチドのサブトラクション・プールした抗血清の結合が、わずかであるかまたは無くなるまで行う。次に、この完全に免疫吸収した抗血清を、試験ポリペプチドとの反応性について検査する。みられる反応性がわずかであるか、または無い場合（すなわち、完全に免疫吸収した抗血清の免疫原性ポリペプチドへの結合について見られる、シグナル対ノイズの比率が2倍未満）、試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質によって誘発された抗血清に特異的に結合される。
核酸およびポリペプチド配列変異体
本明細書中に記載されるように、本発明は、核酸ポリヌクレオチド配列およびポリペプチドアミノ酸配列（例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ配列）ならびに、例えば、その配列を含む組成物および方法を提供する。この配列の例は、本明細書中に開示される（例えば、配列番号1〜20）。しかし、当業者は、本発明が本明細書中に開示されるこれらの配列に必ずしも限定されず、そして本発明がまた、本明細書中に記載される機能を有する多数の関連配列および無関連の配列（例えば、HA分子および／またはNA分子をコードするもの）を提供することがわかる。
当業者はまた、開示された配列の多数の変異体が、本発明に含まれることがわかるであろう。例えば、機能的に同一である配列を生じる、開示された配列の同類的なバリエーションが、本発明に含まれる。開示された配列の少なくとも1つにハイブリダイズする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体は、本発明に含まれると考えられる。例えば、標準的な配列比較技術によって決定されるような、本明細書中に開示される配列の特有配列もまた、本発明中に含まれる。
サイレントなバリエーション
遺伝暗号の縮重により、本発明のポリペプチドおよび／またはウイルスをコードする種々の核酸配列を場合によって製造し、そのうちのいくつかは、HAおよびNA核酸ならびに本明細書中のポリペプチド配列に対して低レベルの配列同一性を保有できる。以下は、多くの生物学および生化学の教科書に見られる、遺伝子暗号を特定する典型的なコドン表を与える。
Figure 0004980896
コドン表は、多数のアミノ酸が、1以上のコドンでコードされていることを示す。例えば、コドン（AGA、AGG、CGA、CGC、CGGおよびCGU）の全ては、アミノ酸アルギニンをコードする。コドンによって、アルギニンが特定される、本発明の核酸の全ての位置にて、コドンを、コードされるポリペプチドを変えることなく、対応する上記コドンのいずれかに変えることができる。RNA配列中のUは、DNA配列中のTに対応することがわかる。
このような「サイレントなバリエーション」は、以下に記載される「同類的に改変されたバリエーション」のうちの1種である。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンについての唯一のコドンであるATGおよび通常トリプトファンについての唯一のコドンであるTTGは除く）は、機能的に同一であるポリペプチドをコードするように、標準的な技術によって改変できることがわかる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントなバリエーションは、記載した配列のいずれかを示す。したがって、本発明は明示的に、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の生じうるバリエーションのそれぞれおよび全てを提供し、かかるバリエーションは、可能性のあるコドン選択に基づいて組合せを選択することによって製造することができる。これらの組合せを、本発明の赤血球凝集素またはノイラミニダーゼポリペプチドをコードする核酸配列に用いられるように、標準的な3組遺伝暗号（例えば、表1に示したもの、または当該分野で商業的に利用可能であるもの）にしたがって製造される。本明細書中の全ての核酸の上記のような全てのバリエーションは、遺伝暗号と組み合わせて配列を考慮することによって、特異的に提供および記載される。当業者は、本明細書中の方法を用いて、これらのサイレントな置換を十分に行うことが可能である。
保存的バリエーション
遺伝暗号の縮重により、「サイレントな置換体」（すなわち、コードされたポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換体）は、アミノ酸をコードする本発明の全ての核酸配列の特徴を示す。同様に、アミノ酸配列中の1または数個のアミノ酸が、高度に類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換されている「保存的アミノ酸置換体」はまた、開示された構築物（例えば、本明細書中の置換体）に高度に類似しているために容易に同定される。開示された配列それぞれのこのような保存的バリエーションは、本発明の特徴である。
特定の核酸配列の「保存的バリエーション」とは、それらの核酸が同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、またはその中の核酸が、本質的に同一配列となるように、アミノ酸配列をコードしないものをいう（以下の表2を参照のこと）。当業者は、コード配列中の単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸（一般的に5％未満、より一般的に4％、3％、2％または1％未満）を、変化、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加が、「保存的に改変されたバリエーション」であり、その変化によって、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸置換を生じることがわかる。したがって、リストに挙げた本発明のポリペプチド配列の「保存的バリエーション」は、同一の保存的置換基を有する保存的に選択したアミノ酸を用いた小さな割合（ポリペプチド配列のアミノ酸の、一般的に5％未満、より一般的に4％、3％、2％または1％未満）の置換を含む。最後に、コードされた核酸分子の活性を変化させない配列の付加（例えば、非機能的配列の付加）は、基本的核酸の保存的バリエーションである。
Figure 0004980896
特有のポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列
1態様において、本発明は、本明細書中に開示されるHAおよびNA分子の配列（例えば、配列番号1〜10）より選択される核酸中の特有の配列を含む核酸を提供する。特有の配列は、例えば、出願時のGenBankまたは他の同様の公開データベースに見出される核酸に相当する核酸と比べて特有である。アライメントを、例えば、デフォルトパラメータにセットしたBLASTを用いて実施できる。任意の特有配列は、本発明の核酸を同定するために、例えば、プローブとして有用である。上記参照のこと。
同様に、本発明は、本明細書中に開示されるHAおよびNA分子の配列（例えば、配列番号11〜20）より選択されるポリペプチド中に特有の配列を含むポリペプチドを含む。ここで、特有の配列は、例えば、出願時のGenBankまたは他の同様の公開データベースなどに見出されるポリヌクレオチド配列に対応するアミノ酸に相当するポリペプチドと比べて特有である。
本発明はまた、ストリンジェンシーな条件下で特有のコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする標的核酸を提供し、かかるオリゴヌクレオチドは、本発明のHAおよびNA分子の配列より選択されたポリペプチド中に特有の配列をコードし、かかる特有の配列は、任意の対照ポリペプチド（例えば、出願時のGenBankまたは他の同様の公開データベースなどに見出される核酸に相当する核酸配列）に相当するポリペプチドと比べて特有である。特有の配列は、上記のように決定する。
配列の比較、同一性、および相同性
2またはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、用語「同一」または％「同一性」とは、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する2もしくはそれ以上の配列または部分配列をいう（最大一致（maximum correspondence ）で比較および整列させて、下記の配列比較アルゴリズム（もしくは当業者が利用可能である他のアルゴリズム）のうちの1つを用いるか、または見比べて検査することによって測定した場合）。
2つの核酸またはポリペプチド（例えば、HAもしくはNA分子をコードするDNAまたはHAまたはNA分子のアミノ酸配列）との関係において、「実質的に同一」という表現は、少なくとも約90％、好ましくは91％、最も好ましくは92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する、2またはそれ以上の配列または部分配列をいう（最大一致で比較および整列させ、配列比較アルゴリズムを用いるか、または見比べて検査することによって測定した場合）。このような「実質的に同一」配列は一般的に、実際の祖先を参照することなく、「相同」であると考えられる。好ましくは、「実質的な同一性」は、アミノ酸配列の領域にわたって存在し、それは少なくとも約200残基の長さ、より好ましくは少なくとも約250残基の領域にわたっており、そして最も好ましい配列は、少なくとも約300残基、350残基、400残基、425残基、450残基、475残基、480残基、490残基、495残基、499残基、500残基、502残基、559残基、565残基もしくは566残基にわたって、または比較される2つの配列の全長にわたって実質的に同一である。
配列比較および相同性決定のために、一般的に1の配列は、基準配列として作用し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列および基準配列をコンピューターにインプットし、必要な場合、部分配列座標を示し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを示す。次に、配列比較アルゴリズムは、示したプログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。
比較のための配列の最適アライメントを、例えば、局所的な相同性アルゴリズム（Smith & Waterman, Adv Appl Math 2:482（1981））、相同性アライメントアルゴリズム（Needleman & Wunsch, J Mol Biol 48:443（1970））、類似方法（Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85:2444（1988））を検索すること、アルゴリズム（例えば、GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）の実行をコンピューター処理すること、または見比べて検査すること（一般的に、Ausubelら（上記）を参照のこと）によって、行うことができる。
％配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、Altschulら、J Mol Biol 215:403-410（1990）に記載される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアが、National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/）より公開されており利用可能である。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列中の短いワード長W（データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、一致するかまたはポジティブな値をもつ閾値スコアを満たす）を同定することによって、ハイスコア配列対（HSP）を同定することを含む。Tとは、近傍ワードスコアの閾値といわれる（Altschulら（上記）を参照のこと）。これらの最初の近傍ワードヒットは、検索を開始し、それらを含む長いHSPを見つけるためのシードとして機能する。次に、ワードヒットを、累積的アライメントスコア（cumulative alignment score）が増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積的スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターM（一致する残基対の報酬スコア；常に0よりも大きい）およびN（不一致残基のペナルティスコア；常に0よりも小さい）を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積的スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積的アライメントスコアが、得られた最大値から量Xだけ減少するとき；累積的スコアが、1もしくは複数のネガティブスコア残基アライメントの蓄積により、0またはそれ以下となるとき；またはいずれかの配列が末端に到達したとき。BLASTアルゴリズムのパラメーター（W、TおよびX）は、アライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列について）デフォルトとして、ワード長（W）11、期待値（E）10、カットオフ100、M=5、N=−4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長（W）3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff & Henikoff（1989） Proc Natl Acad Sci USA 89:10915を参照のこと）。
％配列同一性を算出することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性を統計学的に分析する（例えば、Karlin & Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787（1993）を参照のこと）。類似性の1測定は、最小合計確率（smallest sum probability）（P（N））であるBLAST アルゴリズムによって与えられ、かかる最小合計確率は、偶然に生じる2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致する確率の指標を与える。例えば、核酸は、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合、基準配列と類似すると考えられる。
有用な配列アライメントアルゴリズムの別の例は、PILEUPである。PILEUPは、累積的な、対アライメントを用いて関連配列の群から複数の配列アライメントを生じる。これはまた系統樹をプロットでき、かかる系統樹は、アライメントを生じるのに用いられたクラスター形成の関連性を示す。PILEUPは、Feng & Doolittle（1987） J. Mol. Evol. 35:351-360の累積的アライメント法を単純化したものを使用する。用いられた方法は、Higgins & Sharp（1989） CABIOS5:151-153に記載される方法に類似する。このプログラムは、例えば、最長で5,000文字からなる300配列までを整列することができる。多重アライメント法は、整列した2つの配列のクラスターを生じる、最も類似する2つ配列の対アライメントを用いて開始する。次にこのクラスターを、次に最も関連する配列または整列させた配列のクラスターと整列させるこことができる。2つ配列クラスターを、2つの個々の配列の対アライメントを単純に伸長することによって、整列させることができる。最終アライメントは、一連の累積的な、対アライメントによって達成する。このプログラムはまた、クラスター形成の関係を示す樹状図または系統樹をプロットするために用いることができる。プログラムを、特定の配列および配列比較の領域についてのそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を示すことによって行う。
複数のDNAまたはアミノ酸の配列アライメントに好適であるアルゴリズムのさらなる例は、CLUSTALWプログラムである（Thompson, J. D.ら、（1994） Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680）。CLUSTALWは、配列群間の多重対比較を行い、それらを相同性に基づく多重アライメントに構築する。ギャップオープンおよびギャップ伸長ペナルティーは、例えば、それぞれ10および0.05でありうる。アミノ酸アライメントについては、BLOSUMアルゴリズムを、タンパク質重量マトリックスとして用いることができる。例えば、HenikoffおよびHenikoff（1992） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915−10919を参照のこと。
デジタルシステム
本発明は、本明細書中の核酸および単離したまたは組換えポリペプチド（例えば、本明細書中に示した配列を含む）ならびに様々なサイレント置換体およびそれらの同類置換体についての本明細書中の配列情報に対応する文字列を含むデジタルシステム（例えば、コンピューター、コンピューターで読み取り可能なメディアおよび統合システム）を提供する。統合システムはさらに、例えば、文字列に対応する遺伝子を作製するための遺伝子構成装置を含むことができる。
当該分野で公知である様々な方法を用いて、異なる文字列間の相同性または類似性を検出することができ（上記参照のこと）またはそれらの方法を用いて、アウトプットファイルを制御するためなどの他の望ましい機能を実施することができ、かかる機能は、配列などを含む情報を提示するための基盤を与える。例としては、上で考察したBLASTが挙げられる。本発明のコンピューターシステムは、このようなプログラムを、例えば、本明細書中に示されるような配列を含む1または複数のデータファイルまたはデータベースと一緒に含むことができる。
従って、様々なHAもしくはNA配列または断片間の様々なストリンジェンシーおよび長さについての相同性および類似性の異なる型を、本明細書中の統合システムにて検出および認識することができる。例えば、多数の相同性決定法が、生ポリマーの配列を比較分析するため、ワードプロセシングにてスペルチェックを行うため、および様々なデータベースからデータを回収するために設計されている。天然ポリヌクレオチドにおける4つの主要な核酸塩基間の二重らせん対での相補的相互作用を理解することにより、相補的な相同ポリヌクレオチド鎖のアニーリングを刺激するモデルはまた、配列アライメントまたは、本明細書中の配列に対応する文字列にて一般に行われる他の操作（例えば、ワードプロセシング操作、配列または部分配列の文字列を含む図面の構築、アウトプット表など）の基盤として用いることができる。
従って、ワードプロセシングソフトウェア（例えば、Microsoft WordTMまたはCorel WordPerfectTM）およびデータベースソフトウェア（例えば、表計算ソフトウェア（Microsoft ExcelTM、Corel Quattro ProTMなど）またはデータベースプログラム（Microsoft AccessTM、ParadoxTM、GeneWorksTMもしくはMacVectorTMまたは他の同様のプログラム）などの標準的なデスクトップアプリケーションを、1または複数の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（核酸もしくはタンパク質、またはその両方のいずれか）に対応する文字列をインプットすることによって、本発明に適合できる。例えば、本発明のシステムは、例えば、本明細書中の配列に対応する文字列を操作するためにユーザインターフェース（例えば、Windows、MacintoshまたはLINUXシステムなどの標準的な操作システムにおけるGUI）と一緒に用いる適切な文字列情報を有する前述のソフトウェアを含むことができる。示したように、特殊化したアライメントプログラム（例えば、BLAST）はまた、核酸またはタンパク質（または対応する文字列）のアライメントを行うために本発明のシステムに統合することができる。
本発明のシステムは一般に、本明細書中のいずれかの配列を含むソフトウェアシステムに入力されたデータセットを備えるデジタルコンピューターを備える。このコンピューターは、例えば、PC（Intel x86もしくはPentiumチップ互換性DOSTM、OS2TM、 WINDOWSTM、 WINDOWSNTTM、WINDOWS95TM、WINDOWS2000TM, WINDOWS98TM、LINUXベースの装置、MACINTOSHTM、Power PC、もしくはUNIXベースの（例えば、SUNTMワークステーション）装置）または当業者に公知である他の商業的に利用可能であるコンピューターでありうる。配列を整列させるか、そうでなければ操作するためのソフトウェアが利用可能であり、標準的なプログラミング言語（例えば、Visualbasic、PERL、Fortran、Basic、Javaなど）を用いて当業者は容易に構築できる。
任意のコントローラーまたはコンピューターは場合によって、モニターを備え、かかるモニターはしばしば、陰極線管（「CRT」）ディスプレイ、フラットパネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス方式液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）などである。コンピューター回路網はしばしば、ボックス内に配置され、かかるボックスは、非常に多くの統合型回路チップ（例えば、マイクロプロセッサー、メモリー、インターフェース回路など）を備える。このボックスはまた場合によって、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、高容量の取り外し可能なドライブ（書き込み可能なCD-ROM）、および他の共通末端エレメントを備える。キーボードまたはマウスなどのインプット装置が場合によって、ユーザーの入力のために、および関連コンピューターシステムにて、比較されるか、そうでなければ操作される配列をユーザーが選択するために与えられる。
コンピューターは一般的に、ユーザーの指示を受けるための適切なソフトウェアを備え、かかる指示は、セットパラメーターフィールド（例えば、GUI）へのユーザーの入力またはプログラムされた指示（例えば、種々の異なる特定の操作のためにプログラムされたもの）の形式である。次に、ソフトウェアはこれらの指示を、例えば、適切なメカニズムの操作を指示するか、または所望の操作を実施するためにコントローラーをトランスポートするのに適切な言語に変換する。ソフトウェアはまた、（例えば、本明細書中の配列または配列アライメントに基づく）核酸合成、示差的な遺伝子発現について試料を比較すること、または他の操作を制御するためのアウトプットエレメントを備えることができる。
キットおよび試薬
本発明は場合によって、キットとして使用者に提供する。例えば、本発明のキットは、本明細書中に記載される1または複数の核酸、ポリペプチド、抗体または細胞系統（例えば、本発明のHAおよび／またはNA分子を含むか、または有するもの）を含む。このキットは、診察用の核酸またはポリペプチド（例えば、抗体）、プローブセット（例えば、好適な容器に詰めたcDNA マイクロアレイ）または他の核酸（例えば、1または複数の発現ベクター）を含むことができる。キットはまたさらに、発現産物、チューブおよび／または他の副成分を標識するための1または複数の付加的な試薬（例えば、基質、標識、プライマー）、試料を回収するための試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーションチャンバー、カバーガラスなどを含む。キットは場合によってさらに、発見のためにキットの構成要素を用いる好ましい方法、または診断セットの用途などを詳細に述べる指示セットまたは使用者マニュアルを含む。
指示書に従って用いる場合、キットを例えば、疾患状態または症状を評価するため、細胞または生物体における疾患状態または症状の進行に対する製剤または他の治療処置の効果を評価するため、あるいはワクチンとして使用するためなどに用いることができる。
さらなる態様において、本発明は、本明細書中の方法、組成物、システムおよび装置を具現化するシステムキットを提供する。本発明のシステムキットは場合によって、以下の1または複数を含む：（1）装置、システム、システム構成要素、もしくは装置構成要素；（2）本明細書中に記載される方法を実施するため、および／もしくは本明細書中の装置または装置構成要素を操作するため、および／もしくは本明細書中の組成物を使用するための指示書。さらなる態様において、本発明は、本明細書中の装置、装置構成要素、組成物もしくはキットを使用するため、本明細書中の方法もしくはアッセイを実施するため、および／または本明細書中のアッセイもしくは方法を実施するための装置もしくはキットを使用するために提供される。
さらに、キットは、1または複数の上記のような翻訳系（例えば、細胞）を、適切なパッケージング材料、キットの構成要素を収納するための容器、本明細書中の方法を実施するための指示材料などと共に含むことができる。同様に、翻訳系の産物（例えば、HAおよび／またはNA分子などのタンパク質）をキットの形態で、例えば、キットの構成要素を収納する容器、本明細書中の方法を実施するための指示材料などと共に与えることができる。
本発明の方法および組成物の使用を容易にするために、ワクチン成分および／または組成物（例えば、尿膜液中のリアソータントウイルスなど）ならびに、実験または治療ワクチン目的のためのインフルエンザウイルスのパッケージングおよび感染に有用な付加的成分（例えば、緩衝液、細胞、培養培地）のいずれかを、キットの形態で詰めることができる。一般的に、キットは、上記構成要素に加えて、さらなる材料を含み、かかる材料は、例えば、本発明の方法を実施するための指示書、パッケージング材料、および容器を含むことができる。
H5N1 caウイルスおよびワクチンの構築および分析
H5N1 HA/NA配列を含む本明細書中の様々な配列を用いて、インフルエンザウイルスおよびワクチンを製造した。このようなワクチン中のHA配列を、HA内の多塩基性切断部位を除去することによって、野生型より変化させた。HA/NA配列を、A/AA/6/60（att, caウイルス（上記参照のこと））と組み合わせた（6:2リアソートメント）。
H5N1インフルエンザの3種の株を、本実施例に用いた（A/VN/1203/2004、A/HK/491/97およびA/HK/213/2003）。これらの株をまた、それらの年に基づいて’97、’03および’04株と本実施例内では示す。これら3種の株のHA遺伝子の％類似性は、95〜96％である。図1は、ウイルス/ワクチンを構築するために用いた例示的なHA配列（’04 HA配列）の多塩基性切断部位の改変を示す。前述したように、本発明の様々な実施形態は、除去される多塩基性切断部位からなる異なる領域を有する配列を含む。上記参照のこと。
前述したように、改変したH5N1配列（すなわち、改変した’97、’03および’04遺伝子）を用いて、A/AA/6/60と共に6:2リアソータントウイルスを構築した。このことは、また本明細書中のどこかでも指摘しており、そして他の望ましいバックボーンもまた、使用できることがわかる（例えば、PR8など）。
本実施例の6:2リアソータントにおいて、HAおよびNA遺伝子配列は、野生型親ウイルスに由来し、そして残りの遺伝子は、配列分析によって、A/AA/6/60 ca 親ウイルス由来のものと特徴付けられた。リアソータントウイルスを、卵にて8.0〜8.5 log10TCID50まで複製した。しかし、log10TCID50が、約7.0〜約9.0、約7.5〜8.5または約8.0〜8.5を含む他の実施形態もまた、本発明に主張されることがわかるであろう。構築されたウイルスの改変されたHAの内在性プロテアーゼによる開裂は、in vitroにて制限されており、ウイルスは、増殖に関して、トリプシン（例えば、約0.1μg/ml〜約1.0μg/ml）に依存していた。構築されたウイルスは、in vitroにて温度感受性であった。
H5N1 caリアソータントウイルス（改変された’97、’03または’04 HA遺伝子を有する）は、ニワトリに対して高い病原性ではなかった。例えば、4週齢のSPF白色Plymouth Rockニワトリに、ストックウイルス（108-8.75 TCID50/ml）の10倍希釈を用いて静脈内接種し10日間観察したところ、野生型’97、’03および’04 H5N1を用いた場合は、8匹中8匹のニワトリが1〜2日以内に死亡したのに対して、H5N1 caリアソータントウイルスを用いた場合は、8匹中1匹のニワトリも死ななかった。図2からわかるように、鼻腔内投与したH5N1 caリアソータントウイルスは、ニワトリで複製しなかった。
H5N1/AA caリアソータントはまた、マウスに対しても致死的ではなかった。図3を参照のこと、かかる図はまた、H5N1野生型株のTCID50を示す。図4は、1997および2004 H5N1 caリアソータントウイルスが、マウスにて複製が制限されたことを示す。図5は、H5N1 caリアソータントウイルスが、マウスの肺にて複製が制限されることを示す。
ワクチンの単回鼻腔内投与後に、マウスで誘発された血清HAI抗体タイターの比較（2003 caと2003 野生型との比較）を、図6に示す。
図7は同様の測定を示すが、血清中和抗体タイターを用いている。
図8は、H5N1 caリアソータントウイルスが、50、500、または5,000 LD50の野生型H5N1ウイルスを用いた致死的な誘発からマウスを保護すること示す。図9は、マウスにおける同種および異種のH5N1誘発ウイルスの肺における複製からの保護効力を示す。見てわかるように、caリアソータントは、野生型ウイルスよりも、良好に複製しない。図10は、マウスの上気道を用いた関連データを示す。当業者は、同種チャレンジおよび異種チャレンジをよく知っている（例えば、2003ワクチンが、2003野生型チャレンジを防御するか否か（同種）、または2003ワクチンが、1997野生型チャレンジを防御するか否か（異種）などを試験する）。
図11は、マウスにおける、同種または異種のH5N1野生型ウイルスを用いた高用量(105TCID50）チャレンジに対して、2004 H5N1 caワクチンによって与えられた保護効力を示す。図12は、マウスにおける、同種または異種のH5N1野生型ウイルスを用いた高用量(105TCID50）チャレンジに対して、1997および2003 H5N1 caワクチンによって与えられた保護効力を示す。図13は、マウスにおいて、同種のH5N1野生型ウイルスを用いた低用量または高用量のチャレンジに対する、2004 H5N1 caワクチンによって与えられた保護効力を示す。図11〜13は、試験したワクチンが、他の関連ウイルスを防御できることを示す。
本実施例は、本発明の例示的なH5N1 caリアソータントウイルス／ワクチンに関するいくつかのポイントを示す。改変したcaリアソータント’97、’03および’04ウイルスは、in vitroにおいてts表現型、ニワトリにおいて病原性の低下、およびマウスおいて弱毒化を示した。弱毒化はまたフェレットにおいても生じると思われる。マウスにおける、野生型ウイルスによる致死的なチャレンジおよび全身感染に対する保護効力および交差的防御(cross-protection)も示された。マウスの気道における、野生型チャレンジウイルスの複製に対する保護効力および交差的防御もまた期待される。
これらの（および類似の）ウイルス／ワクチンを用いて、免疫発生および効力が、2回のワクチン投与の後、改善されたか否かを決定する；非ヒト霊長類における免疫原性を評価する；フェレットにおける弱毒化およびワクチン効果を評価する；マウスにおいて、製造したワクチンの認められた効力に対する体液性および／または細胞性免疫の関与を決定する； 2003 HAのどの残基が、増強された免疫原性および、それら残基を1997および2004 HAに導入することに関与しているのかを決定する;ならびに多重塩基性アミノ酸切断部位を欠失することおよびその遺伝子配列の効果を決定することが考えられる。
前述の発明は、明瞭性と理解を目的とするために詳細に記載されているが、当業者は、この開示を読むことによって、形態および細部において様々な変更が、本発明の真の目的から離れることなくなされることが明らかとなるであろう。例えば、上記の全ての技術および装置は、様々な組合せで用いることができる。全ての出版物、特許、特許出願、または本出願に引用される他の文献は、あたかも個々の出版物、特許、特許出願、または他の文献のそれぞれが、あらゆる目的のために参考として援用されるように示されているかのごとく、同等の程度まで、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用される。特に、米国仮出願第60/574,553号（2004年5月24日提出）および同上第60/657,554号（2005年2月28日提出）は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に援用される。
配列
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図１は、VN/1203/2004のHA遺伝子を操作して、多塩基性切断部位を除去した改変体を示す。 図２は、鼻腔内投与した H5N1 caリアソータントウイルスが、ニワトリでは複製しないことを示す結果を示す。 図３は、H5N1/AA caワクチン候補が、マウスにとって致死的ではないことを示す。 図４は、1997および2004 H5N1 caリアソータントウイルスが、マウスにて複製が制限されることを示す 図５は、リアソータントH5N1/AA ca インフルエンザウイルスが、マウスの肺にて複製が制限されることを示す。 図６は、ワクチンの単回投与（i.n.）後に、マウスで誘発された血清HAI Abタイターを示す。 図７は、ワクチンの単回投与（i.n.）後に、マウスで誘発された血清中和Abタイターを示す。 図８は、H5N1 caリアソータントウイルスが、50、500または5000 LD50の野生型H5N1ウイルスによる致死的チャレンジからマウスを保護することを示す。 図９は、同種のおよび異種のH5N1チャレンジウイルスのマウスの肺での複製から保護する効能を示す。 図１０は、同種のおよび異種のH5N1チャレンジウイルスのマウス上気道における複製から保護する効能を示す。 図１１は、同種のおよび異種のH5N1 wtウイルスを用いたマウスでの高用量（105TCID50）のチャレンジに対する2004 H5N1 caワクチンによって付与される保護効能を示す。 図１２は、同種のおよび異種のH5N1野生型ウイルスを用いたマウスでの高用量（105TCID50）チャレンジに対する1997および2003 H5N1 caワクチンによって付与される効能を示す。 図１３は、マウスにおける低用量または高用量の同種のH5N1野生型ウイルスに対する2004 H5N1 caワクチンによって与えられる保護効能を示す。

Claims (5)

  1. A/Ann Arbor/6/60由来の6個の内部ゲノムセグメントと、ウイルス株A/VN/1203/04由来のHAポリペプチドをコードするゲノムセグメント、又はウイルス株A/VN/1203/04由来のHAポリペプチドをコードするゲノムセグメント及びNAポリペプチドをコードするゲノムセグメントとを含むリアソータントインフルエンザウイルスであって、該HAポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含み、且つ該NAポリペプチドが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、上記リアソータントインフルエンザウイルス。
  2. 請求項１に記載のリアソータントインフルエンザウイルスを免疫学的に有効量含む免疫原性組成物。
  3. 請求項２に記載の組成物を含む生弱毒性インフルエンザワクチン。
  4. 請求項２に記載の免疫原性組成物を含む、スプリットウイルス又は死滅したウイルスワクチン。
  5. 細胞培養中でインフルエンザウイルスを製造するための方法であって、
    i）宿主細胞の集団に、第1のインフルエンザ株の少なくとも6個の内部ゲノムセグメントと、A/VN/1203/04の免疫原性インフルエンザ表面抗原をコードする少なくとも1個のゲノムセグメントとに対応する核酸配列を含む複数個のベクターを導入すること、ここで、該宿主細胞の集団はインフルエンザウイルスの複製を支持することができるものであり、該第1のインフルエンザ株はA/Ann Arbor/6/60であり、且つ該少なくとも1個のゲノムセグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むHAポリペプチドをコードするゲノムセグメント、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むHAポリペプチドをコードするゲノムセグメント及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むNAポリペプチドをコードするゲノムセグメントを含むものである、
    ii）宿主細胞の集団を、35℃未満か又は35℃の温度で培養すること、及び
    iii）複数のインフルエンザウイルスを回収すること、
    を含む、上記方法。
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