ES2393492T3 - Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza - Google Patents

Abstract

Un virus influenza con reagrupamiento 6:2, en donde dicho virus comprende 6 regiones codificantes degenes que codifican para segmentos de genoma internos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 regiones codificantes degenes que codifican para un polipéptido de hemaglutinina y un polipéptido de neuraminidasa, en el que elpolipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, el gen quecodifica para el polipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y elpolipéptido de neuraminidasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

Description

Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza.

Antecedentes de la invención

Las vacunas contra diversas cepas en evolución de influenza son importantes desde un punto de vista de salud pública, así como comercialmente, puesto que cada año numerosos individuos se infectan con diferentes cepas y tipos de virus influenza. Los lactantes, ancianos y aquellos que tienen una atención sanitaria inadecuada y personas inmunocomprometidas corren un riesgo especial de muerte por tales infecciones. El problema de las infecciones por influenza se agrava porque las cepas de influenza novedosas evolucionan rápidamente y pueden propagarse entre diversas especies, necesitando de ese modo la producción continua de nuevas vacunas.

Se han producido numerosas vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para tales cepas de virus/virus influenza diferentes durante más de 50 años e incluyen vacunas de virus completo, vacunas de virus dividido, vacunas de antígeno de superficie y vacunas de virus atenuado vivo. Sin embargo, aunque formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacunas pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus atenuado vivo tienen la ventaja de también poder estimular la inmunidad mucosa local en el aparato respiratorio. Se ha realizado un considerable trabajo por los presentes inventores y colaboradores en la producción de virus influenza, y fragmentos de los mismos, para la producción de vacunas; véanse, por ejemplo, los documentos US 2004 029251 y US 2005 042229.

Debido a la continua aparición (o reaparición) de cepas de influenza diferentes, se desean continuamente nuevas vacunas contra influenza. Normalmente, tales vacunas se crean usando restos antigénicos de las cepas de virus recién aparecidas, por tanto, se desean altamente polipéptidos y polinucleótidos de cepas de virus novedosas, recién aparecidas o recién reaparecidas (especialmente secuencias de genes antigénicos).

El documento por Subbarao K et al (2003), Virology, vol. 305, págs. 192-200 describe la evaluación de un candidato a vacuna contra el virus influenza A H5N1 reagrupado genéticamente modificado.

El documento por Li S et al (1999), J. Infect. Dis., vol. 179, págs. 1132-1138 describe virus influenza con reagrupamiento 6:2 como vacunas candidatas para los virus A/Hong Kong/97 (H5N1) humanos patógenos.

La presente descripción proporciona variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza nuevas y/o recién aisladas que son útiles en la producción de numerosos tipos de vacunas así como en investigación, diagnóstico, etc. Otros numerosos beneficios resultarán evidentes tras la revisión de lo siguiente.

Sumario de la invención

La invención en su sentido más amplio es tal como se define en las reivindicaciones independientes. Se describe en el presente documento un polipéptido aislado o recombinante que se selecciona de: los polipéptidos codificados por una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:10, uno cualquiera de los polipéptidos codificados por SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:10; uno cualquiera de los polipéptidos de SEQ ID NO:11 a SEQ ID NO:20; sólo los marcos de lectura abiertos de los polipéptidos de SEQ ID NO:11 de SEQ ID NO:20; formas alternativas (por ejemplo, la forma madura sin el péptido señal, o sin las secuencias 5’ y 3’ fuera del marco de lectura abierto, o las secuencias tal como se expresan en la superficie de un virus (por ejemplo, influenza)) de los polipéptidos de SEQ ID NO:11-20 Los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden opcionalmente proteínas de fusión, proteínas con una secuencia líder, un polipéptido precursor, proteínas con una señal de secreción o una señal de localización, o proteínas con una etiqueta de epítopo, una etiqueta de E o una etiqueta de epítopo de His. Las secuencias descritas en el presente documento también se muestran en el apéndice 1 y en las listas de secuencias en el presente documento. Las secuencias de hemaglutinina descritas en el presente documento comprenden secuencias con sitios de escisión polibásicos modificados (que permiten de ese modo el crecimiento de los virus en huevos). Las secuencias de polipéptido de hemaglutinina de SEQ ID NOS:11-20 comprenden las secuencias de péptido señal amino terminal endógenas, sin embargo, las secuencias de polipéptido de hemaglutinina descritas en el presente documento también incluyen la forma madura (péptido señal amino terminal escindido) de los polipéptidos de hemaglutinina. Los sitios de escisión de cualquier secuencia de polipéptido de hemaglutinina de cualquier cepa de influenza pueden predecirse o medirse rutinariamente usando cualquiera de varios métodos en la técnica.

También se describe en el presente documento una composición con uno o más polipéptidos enumerados anteriormente, o fragmentos de los mismos. Se describen además en el presente documento polipéptidos a los que se une específicamente un antisuero policlonal generado contra al menos 1 antígeno que comprende al menos una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente, o un fragmento de la misma. Tales anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos anteriormente también se describen en el presente documento. Los polipéptidos descritos en el presente documento son opcionalmente inmunogénicos.

Se describen además composición inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de uno

o más de cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente así como métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora contra virus influenza administrando al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos anteriores en un vehículo fisiológicamente aceptable.

La invención incluye virus influenza recombinante tal como se caracteriza mediante las reivindicaciones adjuntas que comprende uno o más de los polipéptidos o polinucleótidos anteriores, además de composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de tal virus influenza recombinante. El virus influenza recombinante de la invención para su uso para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora contra virus influenza, a través de la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de tal virus influenza recombinante en un vehículo fisiológicamente aceptable también es parte de la invención.

También se describe en el presente documento una composición de materia que tiene dos o más ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, una biblioteca que comprende al menos aproximadamente 2, 5, 10, 50 o más ácidos nucleicos). Tales composiciones pueden producirse opcionalmente escindiendo uno o más ácido(s) nucleico(s) descrito(s) anteriormente, (por ejemplo, de manera mecánica, química, enzimática con una endonucleasa de restricción/ARNasa/ADNasa, etc.). Otras composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones producidas incubando uno o más de los ácido(s) nucleico(s) descrito(s) anteriormente en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato y un ácido nucleico polimerasa termoestable.

También se describen en el presente documento células que comprenden al menos uno de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, o un producto o fragmento amplificado o escindido de los mismos. Tales células pueden expresar opcionalmente un polipéptido codificado por tal ácido nucleico. Se describen además en el presente documento vectores (por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, fragmentos de virus, etc.) que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Tales vectores pueden comprender opcionalmente un vector de expresión. Los vectores de expresión preferidos incluyen, pero no se limitan a, vectores que comprenden el promotor de pol I y secuencias terminadoras o vectores que usan los promotores tanto de pol I como de pol II “el sistema de promotores de pol I/pol II” (por ejemplo, Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993,21:3607; documento US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; y documento US20030035814). También se describen células transducidas por tales vectores.

En algunas realizaciones, la invención abarca un virus (por ejemplo, un virus influenza) que comprende uno o más ácidos nucleicos descritos anteriormente (por ejemplo, que codifican para hemaglutinina y/o neuraminidasa) tal como se caracteriza mediante las reivindicaciones adjuntas. Composiciones inmunogénicas que comprenden tal virus también son parte de la presente invención tal como se caracteriza mediante las reivindicaciones adjuntas. Un virus de este tipo es un virus con reagrupamiento 6:2 (por ejemplo, que comprende 6 regiones codificantes de genes que codifican para segmentos de genoma internos de A/AA/6/60 que codifican para una hemaglutinina que comprende SEQ ID NO. 45 y codificada por SEQ ID NO. 5 y una neuraminidasa que comprende SEQ ID NO. 16). Un virus influenza reagrupado de la invención incluye un virus influenza con reagrupamiento 6:2, comprendiendo dicho virus 6 regiones codificantes de genes que codifican para segmentos de genoma internos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 regiones codificantes de genes, en el que las 2 regiones codificantes de genes son HA que comprende SEQ ID NO. 15 y codificada por SEQ ID NO. 5 o NA que comprende SEQ ID NO. 16. Métodos tal como se caracterizan mediante las reivindicaciones adjuntas de producción de virus influenza recombinante a través del cultivo de una célula huésped que alberga un virus influenza en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico y el aislamiento del virus influenza recombinante de una o más de la(s) célula(s) huésped o el medio también son parte de la invención.

En otras realizaciones en el presente documento, la invención comprende composiciones inmunogénicas que tienen una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los virus influenza recombinantes descritos anteriormente tal como se caracterizan mediante las reivindicaciones adjuntas. Otras realizaciones incluyen el virus influenza reagrupado de la invención para su uso en métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora contra virus influenza administrando al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de los virus influenza recombinantes descritos anteriormente (opcionalmente en un vehículo fisiológicamente eficaz).

También se describen en el presente documento métodos de producción de un polipéptido aislado o recombinante cultivando cualquier célula huésped anterior, en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de ácido nucleico, y aislando el polipéptido de una o más de las células huésped o el medio en el que se hacen crecer las células.

Composiciones inmunogénicas tal como se caracterizan mediante las reivindicaciones adjuntas también son características de la invención. Por ejemplo, composiciones inmunogénicas que comprenden uno cualquiera o más virus descritos anteriormente tal como se caracterizan mediante las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, junto con uno o más componente(s) de administración farmacéuticamente aceptables.

El virus influenza reagrupado de la invención para su uso en un método de tratamiento profiláctico de una infección viral (por ejemplo, gripe viral) en un sujeto a través de la administración de uno cualquiera o más virus descritos anteriormente o composiciones inmunogénicas tal como se mencionan en las reivindicaciones en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica contra la infección viral también es parte de la presente invención. Los sujetos para tal tratamiento pueden incluir mamíferos (por ejemplo, seres humanos). Tal virus reagrupado de la invención para su uso en tales métodos también puede ser para la administración in vivo al sujeto así como para la administración in vitro o ex vivo a una o más célula(s) del sujeto. Adicionalmente, tal virus reagrupado de la invención para su uso en tales métodos también puede comprender una composición del virus y un excipiente farmacéuticamente aceptable para su administración al sujeto en una cantidad eficaz para tratar profilácticamente la infección viral.

También se describen en el presente documento composiciones de materia que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos de hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepa(s) de influenza pandémica(s) y secuencias de ácido nucleico que codifican para uno o más polipéptido(s) de A/Ann Arbor/6/60. Se describen además composiciones de materia que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos de hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepa(s) de influenza pandémica(s) y secuencias de ácido nucleico que codifican para uno o más polipéptido(s) de PR8 o A/Ann Arbor/6/60. Tales secuencias pueden incluir las enumeradas en la lista de secuencias en el presente documento. Adicionalmente, estas composiciones incluyen composiciones de materia que comprende secuencias que codifican para hemaglutinina y/o neuraminidasa de una o más cepa(s) de influenza pandémica(s) y secuencias de ácido nucleico que codifican para una cepa de estructura principal seleccionada en un reagrupamiento 6:2. Tales composiciones descritas en el presente documento incluyen secuencias que codifican para la hemaglutinina y neuraminidasa seleccionada de la lista de secuencias en el presente documento y una cepa de estructura principal, siendo la cepa de estructura principal PR8

o A/Ann Arbor/6/60. También se describen composiciones tal como se describió anteriormente en las que la hemaglutinina comprende un sitio de escisión polibásico modificado. La invención también incluye una vacuna contra influenza atenuada viva que comprende tales composiciones anteriores tal como se caracterizan mediante las reivindicaciones adjuntas.

Estos y otros objetos y características de la invención resultarán más completamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada conjuntamente con el apéndice y las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Muestra modificaciones por ingeniería genética en el gen de HA de VN/1203/2004 para eliminar el sitio de escisión polibásico.

Figura 2: Presenta resultados que muestran que virus reagrupados H5N1 ca administrados por vía intranasal no se replican en pollos.

Figura 3: Ilustra que los candidatos a vacuna H5N1/AA ca no son letales para ratones.

Figura 4: Ilustra que los virus reagrupados H5N1 ca 1997 y 2004 están restringidos en la replicación en ratones.

Figura 5: Ilustra que los virus influenza H5N1/AA ca reagrupados están restringidos en la replicación en pulmones de ratones.

Figura 6: Muestra los títulos de Ac HAI séricos producidos en ratones tras una única dosis i.n. de vacuna.

Figura 7: Muestra los títulos de Ac neutralizantes séricos producidos en ratones tras una única dosis i.n. de vacuna.

Figura 8: Ilustra que virus reagrupados H5N1 ca protegen a ratones de exposiciones letales con 50, 500 o 5000 DL50 de virus H5N1 de tipo natural.

Figura 9: Ilustra la eficacia de protección frente a la replicación pulmonar de virus de exposición H5N1 homólogos y heterólogos en ratones.

Figura 10: Ilustra la eficacia de protección frente a la replicación de virus de exposición H5N1 homólogos y heterólogos en el aparato respiratorio superior de ratones.

Figura 11: Ilustra la eficacia de protección conferida por la vacuna H5N1 ca 2004 frente a la exposición a alta dosis (105DICT50) con virus wt H5N1 homólogos o heterólogos en ratones.

Figura 12: Ilustra la eficacia de protección conferida por las vacunas H5N1 ca 1997 y 2003 frente a exposiciones a alta dosis (105DICT50) con virus de tipo natural H5N1 homólogos o heterólogos en ratones.

Figura 13: Ilustra la eficacia de protección conferida por la vacuna H5N1 ca 2004 frente a dosis bajas o altas de exposiciones a virus de tipo natural H5N1 homólogos en ratones.

Descripción detallada

DEFINICIONES

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que se refiere la invención. Las siguientes definiciones complementan aquéllas en la técnica y se refieren a la presente solicitud y no deben atribuirse necesariamente a ningún caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a ninguna solicitud o patente de propiedad conjunta. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la puesta en práctica para someter a prueba la presente invención, se describen en el presente documento los materiales y métodos preferidos. Por consiguiente, la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones particulares sólo, y no pretende ser limitativa.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un virus” incluye una pluralidad de virus; la referencia a una “célula huésped” incluye mezclas de células huésped y similares.

Una “secuencia de aminoácidos” es un polímero de residuos de aminoácido (una proteína, polipéptido, etc.) o una cadena de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, dependiendo del contexto.

Los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, “secuencia de polinucleótido” y “secuencia de ácido nucleico” se refieren a polímeros de desoxirribonucleótiodos o ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, quimeras o análogos de los mismos, o una cadena de caracteres que representan tales, dependiendo del contexto. Tal como se usa en el presente documento, el término incluye opcionalmente polímeros de análogos de nucleótidos que se producen de manera natural que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales porque hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular abarca opcionalmente secuencias complementarias además de la secuencia explícitamente indicada. A partir de cualquier secuencia de polinucleótido especificada, puede determinarse o bien el ácido nucleico dado o bien la secuencia de polinucleótido complementaria (por ejemplo, el ácido nucleico complementario).

El término “ácido nucleico” o “polinucleótido” también abarca cualquier cadena física de unidades de monómero que puede hacerse corresponder con una cadena de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero de ADN o ARN típico), PNA, oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas para ADN o ARN biológico en disolución, tales como oligonucleótidos 2’-Ometilados) y similares. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenario o bicatenario.

Una “subsecuencia” es cualquier parte de una secuencia entera, hasta e incluyendo la secuencia completa. Normalmente, una subsecuencia comprende menos de la secuencia de longitud completa. Una “subsecuencia única” es una subsecuencia que no se encuentra en ninguna secuencia de polinucleótido o polipéptido de influenza determinada previamente.

El término “variante” con respecto a un polipéptido se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada en uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios “conservativos”, cuando un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares, por ejemplo, la sustitución de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, la sustitución de una glicina por un triptófano. La variación menor análoga también puede incluir deleción o inserción de aminoácidos, o ambos. Puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin eliminar la actividad biológica o inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR. También se describen ejemplos de sustituciones conservativas en el presente documento.

El término “gen” se usa de manera amplia para referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras requeridas para su expresión. El término “gen” se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o un ARNm codificado por esa secuencia genómica.

Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen “promotores” y “potenciadores”, a los que se unen proteínas reguladoras tales como factores de transcripción, dando como resultado la transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor o potenciador “específico de tejido” es uno que regula la transcripción en un tipo de célula o tipo de tejido específico, o tipos.

“Expresión de un gen” o “expresión de un ácido nucleico” significa la transcripción de ADN en ARN (incluyendo opcionalmente la modificación del ARN, por ejemplo, corte y empalme alternativo), la traducción del ARN en un polipéptido (incluyendo posiblemente la modificación posterior del polipéptido, por ejemplo, modificación postraduccional), o tanto la transcripción como la traducción, según indique el contexto.

Un “marco de lectura abierto” u “ORF” es un posible marco de lectura traduccional de ADN o ARN (por ejemplo, de un gen), que puede traducirse en un polipéptido. Es decir, el marco de lectura no está interrumpido por codones de terminación. Sin embargo, debe indicarse que el término ORF no indica necesariamente que el polinucleótido se traduzca de hecho en un polipéptido.

El término “vector” se refiere a los medios mediante los cuales puede propagarse y/o transferirse un ácido nucleico entre organismos, células o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales y similares, que se replican de manera autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto por tanto ADN como ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con polilisina, un ADN o ARN conjugado con péptidos, un ADN conjugado con liposomas o similares, que no se replica de manera autónoma. En muchos, pero no todos los casos comunes, los vectores son plásmidos.

Un “vector de expresión” es un vector, tal como un plásmido que puede promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Normalmente, el ácido nucleico que va a expresarse está “operativamente unido” a un promotor y/o potenciador, y se ve sometido a control regulatorio de la transcripción por el promotor y/o potenciador.

Un “vector de expresión bidireccional” se caracteriza por dos promotores alternativos orientados en la dirección opuesta en relación con un ácido nucleico situado entre los dos promotores, de manera que puede iniciarse la expresión en ambas orientaciones dando como resultado, por ejemplo, la transcripción de tanto ARN de hebra positiva (+) o sentido, como de hebra negativa (-) o antisentido.

Un “polipéptido” es un polímero que comprende dos o más residuos de aminoácido (por ejemplo, un péptido o una proteína). El polímero puede comprender opcionalmente modificaciones tales como glicosilación o similares. Los residuos de aminoácido del polipéptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados.

En el contexto de la invención, el término “aislado” se refiere a un material biológico, tal como un virus, un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan o interaccionan con el mismo en su entorno que se produce de manera natural. El material biológico aislado comprende opcionalmente material adicional no encontrado con el material biológico en su entorno natural, por ejemplo, un virus de tipo natural o una célula. Por ejemplo, si el material está en su entorno natural, tal como una célula, el material puede colocarse en una ubicación en la célula (por ejemplo, genoma o elemento genético) no nativa para tal material encontrado en ese entorno. Por ejemplo, un ácido nucleico que se produce de manera natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) se aísla si se introduce por medios que no se producen de manera natural en un locus del genoma (por ejemplo, un vector, tal como un vector de virus o plásmido, o amplicón) no nativo para ese ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos se denominan también ácidos nucleicos “heterólogos”. Un virus aislado, por ejemplo, está en un entorno (por ejemplo, un sistema de cultivo celular, o purificado del cultivo celular) distinto del entorno nativo del virus de tipo natural (por ejemplo, la nasofaringe de un individuo infectado).

El término “quimérico” o “quimera”, cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o de polipéptido derivados de más de una fuente o cepa viral original. De manera similar, el término “quimérico” o “quimera”, cuando se refiere a una proteína viral, indica que la proteína incluye componentes de polipéptido (es decir, subsecuencias de aminoácidos) derivados de más de una fuente o cepa viral original.

El término “recombinante” indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína) se ha alterado de manera artificial o sintética (de manera no natural) por la intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro de, o extraído de, su estado o entorno natural. Específicamente, por ejemplo, un virus influenza es recombinante cuando se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante. Por ejemplo, un “ácido nucleico recombinante” es uno que se prepara recombinando ácidos nucleicos, por ejemplos, durante la clonación, transposición del ADN u otros procedimientos, o por mutagénesis química u otra; un “polipéptido recombinante” o “proteína recombinante” es un polipéptido o proteína que se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante; y un “virus recombinante”, por ejemplo un virus influenza recombinante, se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante.

El término “reagrupado”, cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o de polipéptido derivados de más de una fuente o cepa viral original. Por ejemplo, un reagrupamiento 7:1 incluye 7 segmentos genómicos virales (o segmentos génicos) derivados de un primer virus original, y un único segmento genómico viral complementario, por ejemplo, que codifica para una hemaglutinina o neuraminidasa. Un reagrupamiento 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, lo más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus original, y dos segmentos complementarios, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, de un virus original diferente.

El término “introducido” cuando se refiere a un ácido nucleico heterólogo o aislado, se refiere a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en la que el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo

o expresarse de manera transitoria (por ejemplo ARNm transfectado). El término incluye métodos tales como “infección”, “transfección”, “transformación” y “transducción”. En el contexto de la invención, puede emplearse una variedad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células, incluyendo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por lípidos (lipofección), etc.

El término “célula huésped” significa una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector, y soporta la replicación y/o expresión del ácido nucleico. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levaduras, insectos, anfibios, aves o mamíferos, incluyendo células humanas. Las células huésped a modo de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, células Vero (riñón de mono verde africano), células BHK (riñón de cría de hámster), células de riñón de pollo primarias (PCK), células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK), células 293 (por ejemplo, células 293T) y células COS (por ejemplo, células COS1, COS7), etc.

Una “cantidad inmunológicamente eficaz” de virus influenza es una cantidad suficiente para potenciar la propia respuesta inmunitaria de un individuo (por ejemplo, de un ser humano) frente a una exposición posterior a virus influenza. Pueden monitorizarse los niveles de inmunidad inducida, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos séricos y/o secretores neutralizantes, por ejemplo, mediante ensayo de neutralización de placas, de fijación del complemento, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o de microneutralización.

Una “respuesta inmunitaria protectora” frente a virus influenza se refiere a una respuesta inmunitaria presentada por un individuo (por ejemplo, un ser humano) que es protectora frente a la enfermedad cuando el individuo se expone posteriormente a y/o se infecta con tal virus influenza. En algunos casos, el virus influenza (por ejemplo, que circula de manera natural) puede provocar todavía infección, pero no puede provocar una infección grave. Normalmente, la respuesta inmunitaria protectora da como resultado niveles detectables de anticuerpos secretores y séricos engendrados por el huésped que pueden neutralizar el virus de la misma cepa y/o subgrupo (y posiblemente también de un subgrupo y/o cepa que no es de vacuna, diferente), in vitro e in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como miríadas de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como o bien kappa o bien lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kD) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab)’2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)’2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra convirtiendo de ese modo el dímero (Fab’)2 en un monómero Fab’. El monómero Fab’ es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (véase, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpos en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos Fab’ pueden sintetizarse de novo o bien químicamente

o bien utilizando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos o fragmentos o bien producidos mediante la modificación de anticuerpos completos

o bien sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla o múltiple, incluyendo anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que se unen entre sí una cadena pesada variable y una ligera variable (directamente o a través de un ligador peptídico) para formar un polipéptido continuo, y anticuerpos humanizados o quiméricos.

VIRUS INFLUENZA

Los polipéptidos y polinucleótidos descritos en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1-20, son variantes de secuencias de HA y NA de influenza. En general, los virus influenza están constituidos por un núcleo de ribonucleoproteína interno que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta lipoproteica externa revestida por una proteína de la matriz. El genoma de virus influenza está compuesto por ocho segmentos de ácido ribonucleico de hebra (-) lineal (ARN), que codifica para las proteínas inmunogénicas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), y seis polipéptidos de núcleo interno: la nucleoproteína de la nucleocápsida (NP); proteínas de la matriz (M); proteínas no estructurales (NS); y 3 proteínas de ARN polimerasa (PA, PB1, PB2). Durante la replicación, el ARN viral genómico se transcribe en ARN mensajero de hebra (+) y ARNc genómico de hebra (-) en el núcleo de la célula huésped. Cada uno de los ocho segmentos genómicos se empaqueta en complejos de ribonucleoproteína que contienen, además del ARN, NP y un complejo de polimerasa (PB1, PB2 y PA).

Influenza se agrupa comúnmente en las categorías influenza A e influenza B. Los virus influenza A e influenza B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. El genoma de influenza A codifica para once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican para tres polipéptidos, que constituyen una ARN polimerasa dependiente de ARN. El segmento 1 codifica para la proteína PB2 del complejo de polimerasa. Las proteínas de polimerasa restantes PB1 y PA están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Además, el segmento 1 de algunas cepas de influenza codifica para una proteína pequeña, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la región que codifica para PB1. El segmento 4 codifica para la glicoproteína de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la unión y entrada en la célula durante la infección. El segmento 5 codifica para el polipéptido de nucleoproteína de la nucleocápsida (NP), el principal componente estructural asociado con ARN viral. El segmento 6 codifica para una glicoproteína de la envuelta, neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica para dos proteínas de la matriz, denominadas M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm cortados y empalmados de manera diferencial. El segmento 8 codifica para NS1 y NS2, dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes de ARNm cortadas y empalmadas de manera alternativa. Los ocho segmentos del genoma de influenza B codifican para 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica para la proteína HA. El segmento 5 codifica para NP. El segmento 6 codifica para la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de influenza B también codifica para dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica para dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm cortada y empalmada.

VACUNAS CONTRA VIRUS INFLUENZA

Las secuencias, composiciones y métodos en el presente documento se refieren principalmente, pero no únicamente, a la producción de virus influenza para vacunas. Históricamente, las vacunas contra el virus influenza se han producido principalmente en huevos de gallina embrionados usando cepas de virus seleccionadas o basadas en predicciones empíricas de cepas relevantes. Más recientemente, se han producido virus reagrupados que incorporan antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa maestra sensible a la temperatura, atenuada, aprobada. Tras el cultivo del virus a través de múltiples pases en huevos de gallina, se recuperan virus influenza y, opcionalmente, se inactivan, por ejemplo, usando formaldehído y/o 1propiolactona (o alternativamente se usan en vacunas atenuadas vivas). Por tanto, se apreciará que las secuencias de HA y NA (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-20) son bastante útiles en la construcción de vacunas contra influenza. La presente descripción incluye virus/vacunas que comprenden secuencias de HA y/o NA de cepas de influenza pandémicas (incluyendo cuando las secuencias de HA comprenden sitios de escisión polibásicos modificados tales como las modificaciones descritas en el presente documento); e incluyendo cuando los virus/vacunas comprenden una estructura principal de ca tal como A/AA/6/60 o la estructura principal de PR8.

Los intentos de producir vacunas reagrupadas y recombinantes en cultivo celular se han visto dificultados por la incapacidad de algunas de las cepas aprobadas para la producción de vacunas para crecer eficazmente en condiciones de cultivo celular convencionales. Sin embargo, el trabajo previo por los inventores y sus colaboradores proporcionó un sistema de vector y métodos para producir virus reagrupados y recombinantes en cultivo, haciendo posible por tanto producir rápidamente vacunas correspondientes a una o muchas cepas antigénicas seleccionadas de virus, por ejemplo, cepas o bien A o bien B, diversos subtipos o subcepas, etc., por ejemplo, que comprenden las secuencias de HA y/o NA en el presente documento. Véase el sistema de múltiples plásmidos para la producción de virus influenza, documento US20044029251. Normalmente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como un incubador de cultivo celular, bajo CO2 y humedad controlados, a temperatura constante usando un regulador de temperatura, tal como un termostato para garantizar que la temperatura no supera 35ºC. Pueden obtenerse fácilmente virus influenza reagrupados introduciendo un subconjunto de vectores que corresponden a segmentos genómicos de un virus influenza maestro, en combinación con segmentos complementarios derivados de cepas de interés (por ejemplo, variantes antigénicas de HA y/o NA en el presente documento). Normalmente, las cepas maestras se seleccionan basándose en propiedades deseables relevantes para la administración de vacunas. Por ejemplo, para la producción de vacunas, por ejemplo, para la producción de una vacuna atenuada viva, la cepa de virus donadora maestra puede seleccionarse para un fenotipo atenuado, adaptación al frío y/o sensibilidad a la temperatura. Tal como se explica en otra parte en el presente documento, y, por ejemplo, en el documento US20044029251, la invención utiliza la cepa de influenza A/Ann Arbor (AA)/6/60 como “estructura principal” sobre la que añadir genes de HA y/o NA (por ejemplo, tal como las secuencias enumeradas en el presente documento, etc.) para crear virus reagrupados deseados tal como se menciona en las reivindicaciones. Por tanto, por ejemplo, en un reagrupamiento 6:2, 2 genes (es decir, NA y HA) serían de la(s) cepa(s) de influenza frente a la(s) que se desea una reacción inmunogénica, mientras que los otros 6 genes serían de la cepa Ann Arbor, u otra cepa de estructura principal, etc. El virus Ann Arbor es útil por sus atributos adaptados al frío, atenuados y sensibles a la temperatura. Por supuesto, se apreciará que las secuencias de HA y NA en el presente documento pueden reagruparse con varios otros genes de virus o tipos de virus (por ejemplo, varias “estructuras principales” diferentes tales como PR8, etc., que contienen los otros genes de influenza presentes en un reagrupamiento, concretamente, los genes que no son HA ni NA).

Diversas realizaciones en el presente documento pueden comprender vacunas atenuadas vivas tal como se menciona en las reivindicaciones, que tienen las secuencias de HA y NA que comprenden respectivamente SEQ ID No: 15 y SEQ ID No. 16 en el presente documento, para gripe pandémica. Un problema que surge del crecimiento de cepas de virus de vacuna (por ejemplo, reagrupados) en huevos es que las cepas aviares (que pueden estar implicadas en pandemias) pueden destruir los huevos en los que van a producirse las vacunas y, por tanto, son difíciles de manipular, producir, etc. a través del uso de producción reagrupada tradicional (sin rescate con plásmidos). Tales cepas aviares son de interés puesto que las pruebas indican que pueden dar como resultado gripe en seres humanos y posibles pandemias. Por tanto, el uso de sistemas de rescate con plásmidos para crear/manipular reagrupados de influenza con cepas pandémicas tales como diversas secuencias aviares (por ejemplo, las secuencias de HA y NA en el presente documento) son bastante deseables. Se apreciará, sin embargo, que las secuencias actuales también pueden usarse con sistemas no plasmídicos o tradicionales.

Pueden infectarse aves acuáticas (entre otras) por virus influenza A de los subtipos hemaglutinina 15 (HA) y neuraminidasa 9 (NA). Tales aves pueden servir como reservorio a partir del que pueden introducirse subtipos de influenza novedosos en poblaciones humanas y provocar pandemias. La observación de que virus influenza A H7N7 aviares infectaron a seres humanos en los Países Bajos en 2003 y que virus H5N1 y H9N2 aviares infectaron a seres humanos en Hong Kong y China anteriormente, suscita la inquietud de que estos (y otros) subtipos tengan el potencial de provocar pandemias. Por tanto, se necesitan vacunas para prevenir infecciones humanas con virus influenza A aviares. Recientemente, se autorizaron en los Estados Unidos vacunas de virus influenza A atenuado, vivo contra virus influenza humanos. Véase anteriormente. Tales vacunas son virus H1N1 y H3N2 reagrupados en los que los genes de proteínas internos de virus adaptado al frío (ca) de A/Ann Arbor (AA)/6/60 (H2N2) confieren los fenotipos adaptado al frío, de atenuación y sensible a la temperatura de virus AA ca en los virus reagrupados (es decir, los que tienen los genes de hemaglutinina y neuraminidasa de la cepa distinta de Ann Arbor). Se han aplicado técnicas de genética inversa basada en plásmidos y reagrupamiento genético clásico para generar virus reagrupados que contienen los genes de hemaglutinina y neuraminidasa de virus influenza A aviares (subtipos H4-H14) y seis segmentos génicos internos del virus AA ca. Tales virus reagrupados tal como se menciona en las reivindicaciones son características de la invención. Véanse las secuencias de genes de HA y NA a continuación. Estos virus portan propiedades biológicas que son deseables en vacunas candidatas porque los fenotipos asociados con los virus AA ca están presentes en los virus reagrupados. La generación y evaluación de estos virus reagrupados como virus simiente para vacunas son etapas importantes en la preparación pandémica. Se contempla que ensayos clínicos puedan establecer la seguridad, infectividad e inmunogenicidad de tales vacunas pandémicas atenuadas vivas. También se incluyen métodos de construcción y uso de tales virus y vacunas. “Cepas de virus pandémicas” tal como se usa en el presente documento se define como un subtipo de virus influenza cepa A que no está circulando en la población humana, que se declara que es una cepa pandémica por los Centros para el Control de Enfermedades o la Organización Mundial de la Salud o se reconocen generalmente como tales dentro de la comunidad científica.

Tal como se describe en el presente documento, las secuencias antigénicas (por ejemplo, las secuencias de HA) así como virus y vacunas de tales virus comprenden sitios de escisión polibásicos modificados. Algunas cepas de influenza pandémicas aviares altamente patogénicas comprenden múltiples sitios de escisión de aminoácidos básicos dentro de secuencias de hemaglutinina. Véase, por ejemplo, Li et al., J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999. Tales sitios de escisión, en realizaciones típicas en el presente documento, por ejemplo, están modificados o alterados en sus secuencias en comparación con las secuencias de tipo natural de las que se derivan las secuencias actuales (por ejemplo, para inutilizar la escisión o reducir la escisión en las mismas, etc.). Tales modificaciones/alteraciones pueden ser diferentes en diferentes cepas debido a las diversas secuencias de los sitios de escisión en las secuencias de tipo natural. Por ejemplo, se eliminan normalmente en secuencias en el presente documento 4 residuos polibásicos (RRKK) en 326-329 de H5 madura (en comparación con wt). Véase la lista de secuencias y la figura 1. Los sitios de escisión polibásicos pueden modificarse de varios modos. Por ejemplo, el sitio de escisión polibásico puede eliminar un aminoácido de una vez (por ejemplo un R eliminado, dos R eliminados, RRK eliminados o RRKK eliminados). Adicionalmente, el residuo de aminoácido directamente en el sentido de 5’ del sitio de escisión también puede eliminarse o alterarse (por ejemplo, de un R a un T, etc.); además, también pueden modificarse los nucleótidos que codifican para el residuo de aminoácido directamente tras el sitio de escisión. Véase, por ejemplo, la figura 1 para una ilustración de la modificación del sitio de escisión. Además, secuencias de polipéptido de hemaglutinina de virus influenza comprenden secuencias de péptido señal amino terminal, por tanto, las secuencias de polipéptido de hemaglutinina incluyen tanto la forma madura (péptido señal amino terminal escindido) de los polipéptidos de hemaglutinina como la forma pre-escindida de hemaglutinina. Los sitios de escisión de cualquier secuencia de polipéptido de hemaglutinina de cualquier cepa de influenza pueden medirse o predecirse rutinariamente usando cualquiera de varios métodos en la técnica.

Los términos “sensible a la temperatura”, “adaptado al frío” y “atenuado” tal como se aplican a virus (normalmente usados como vacunas o para la producción de vacunas) que abarcan opcionalmente las presentes secuencias, se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el término “sensible a la temperatura” (ts) indica, por ejemplo, que el virus presenta una reducción de 100 veces o más en el título a 39ºC en relación con 33ºC para cepas de influenza A, o que el virus presenta una reducción de 100 veces o más en el título a 37ºC en relación con 33ºC para cepas de influenza B. El término “adaptado al frío” (ca) indica que el virus presenta crecimiento a 25ºC dentro de 100 veces de su crecimiento a 33ºC, mientras que el término “atenuado” (att) indica que el virus se replica en las vías respiratorias superiores de hurones pero no es detectable en sus tejidos pulmonares, y no provoca enfermedad de tipo gripe en el animal. Se entenderá que virus con fenotipos intermedios, es decir, virus que presentan reducciones en el título inferiores a 100 veces a 39ºC (para virus de la cepa A) o 37ºC (para virus de la cepa B), o que presentan crecimiento a 25ºC que es mayor de 100 veces su crecimiento a 33ºC (por ejemplo, dentro de 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces menos), y/o presentan crecimiento reducido en los pulmones en relación con el crecimiento en las vías respiratorias superiores de hurones (es decir, parcialmente atenuados) y/o enfermedad de tipo gripe en el animal, también son virus útiles y pueden usarse conjuntamente con las secuencias de HA y NA en el presente documento.

De nuevo, las secuencias de HA y NA descritas en el presente documento se utilizan en tales vacunas reagrupadas con plásmidos (y/o en otros virus y vacunas ts, cs, ca y/o att).

FLUMIST™

Tal como se mencionó anteriormente, existen numerosos ejemplos y tipos de vacunas contra influenza. Una vacuna contra influenza a modo de ejemplo es FluMist™ que es una vacuna viva, atenuada que protege a niños y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44).

Las cepas de la vacuna FluMist™ contienen, por ejemplo, segmentos de genes de HA y NA derivados de las cepas (por ejemplo, cepas de tipo natural) a las que se dirige la vacuna junto con seis segmentos de genes, PB1, PB2, PA, NP, M y NS, de un virus donador maestro común (MDV). El MDV para las cepas de influenza A de FluMist™ (MDV-A) se creó mediante pase en serie de la cepa A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) de tipo natural en cultivo tisular de riñón de pollo primario a temperaturas sucesivamente inferiores (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4). MDV-A se replica eficazmente a 25ºC (ca, adaptado al frío), pero su crecimiento se restringe a 38 y 39ºC (ts, sensible a la temperatura). Adicionalmente, este virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att, atenuación). Se cree que el fenotipo ts contribuye a la atenuación de la vacuna en seres humanos restringiendo su replicación en todas excepto las regiones más frías del aparato respiratorio. La estabilidad de esta propiedad se ha demostrado en modelos animales y estudios clínicos. En contraposición al fenotipo ts de cepas de influenza creadas mediante mutagénesis química, la propiedad ts de MDV-A no se revierte tras el pase a través de hámsteres infectados o en aislados extraídos de niños (para una revisión reciente, véase Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated coldadapted influenza A y B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323).

Estudios clínicos en más de 20.000 adultos y niños que implicaban 12 cepas con reagrupamiento 6:2 separadas han mostrado que estas vacunas están atenuadas, son seguras y eficaces (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Los reagrupados que portan los seis genes internos de MDV-A y los dos segmentos de genes de HA y NA de un virus de tipo natural (es decir, un reagrupamiento 6:2) mantienen de manera constante los fenotipos ca, ts y att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis. 146:780-900).

La producción de tales virus reagrupados usando cepas B de influenza es más difícil, sin embargo, el trabajo reciente (véase, por ejemplo, Sistema de múltiples plásmidos para la producción de virus Influenza, documento US 20044029251) ha mostrado un sistema de ocho plásmidos para la generación de virus influenza B completamente a partir de ADNc clonado. También se mostraron métodos para la producción de virus influenza A y B vivos atenuados adecuados para formulaciones de vacuna, tales como formulaciones de vacuna de virus vivos útiles para administración intranasal.

El sistema y los métodos descritos anteriormente son útiles para la producción rápida en cultivo celular de virus influenza A y B recombinantes y reagrupados, incluyendo virus adecuados para su uso como vacunas, incluyendo vacunas atenuadas vivas, tales como vacunas adecuadas para administración intranasal. Las secuencias (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-10 y los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 11-20), los métodos, etc. descritos en el presente documento opcionalmente se usan conjuntamente con, o en combinación con, tal trabajo previo que implica, por ejemplo, virus influenza reagrupados para la producción de vacunas para producir virus para vacunas.

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA ADMINISTRACIÓN PROFILÁCTICA DE VACUNAS

Los virus recombinantes y reagrupados descritos en el presente documento (por ejemplo, los que comprenden los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-10 o los polipéptidos de SEQ ID NO: 11-20, o fragmentos de los mismos), en particular los citados en las reivindicaciones, pueden administrarse profilácticamente en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un vehículo o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepa(s) de virus influenza tal como se determina mediante la secuencia de HA y/o NA. Normalmente, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas tamponadas acuosas, disoluciones de dextrosa acuosas, disoluciones de glicerol acuosas, etanol o combinaciones de los mismos. La preparación de tales disoluciones que garantizan la esterilidad, el pH, la isotonicidad y la estabilidad se efectúa según protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un vehículo o excipiente para minimizar efectos alérgicos y otros efectos no deseados, y para adecuarse a la vía de administración particular, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc.

Un aspecto relacionado de la invención proporciona el virus influenza reagrupado tal como se menciona en las reivindicaciones para su uso en métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora frente al virus influenza. En los métodos, se administra una cantidad inmunológicamente eficaz de un virus influenza recombinante (por ejemplo, que comprende una molécula de HA y/o NA tal como se describe en el presente documento) al individuo en un vehículo fisiológicamente aceptable.

Generalmente, los virus influenza de la invención se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepa(s) de virus influenza (es decir, contra las cepas de HA y/o NA descritas en el presente documento). Preferiblemente, la administración de los virus influenza provoca una respuesta inmunitaria protectora frente a tales cepas. Los expertos en la técnica conocen dosificaciones y métodos para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra una o más cepa(s) de influenza. Véanse, por ejemplo, el documento USPN 5.922.326; Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al., Pediatrics 52:56-63 (1973); y Wright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976). Por ejemplo, se proporcionan virus influenza en el intervalo de aproximadamente 1-1000 HID50 (dosis infecciosa humana), es decir, aproximadamente 105 - 108 ufp (unidades formadoras de placa) por dosis administrada. Normalmente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo basándose, por ejemplo, en la edad, el estado físico, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento de administración y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra sistémicamente, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y jeringuilla, o un dispositivo de inyección sin aguja. Alternativamente, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, mediante o bien gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de aproximadamente 10 micrómetros) o bien pulverización en el aparato respiratorio superior. Aunque cualquiera de las vías anteriores de administración da como resultado una respuesta inmunitaria sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de provocar inmunidad mucosa en el sitio de entrada del virus influenza. Para la administración intranasal, se prefieren a menudo vacunas de virus vivos atenuados, por ejemplo, un virus influenza recombinante o reagrupado atenuado, adaptado al frío y/o sensible a la temperatura. Véase anteriormente. Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, mediante la misma vía o diferente, para lograr el efecto profiláctico deseado.

Normalmente, el virus influenza recombinante atenuado de esta invención tal como se usa en una vacuna está suficientemente atenuado de manera que no se producirán síntomas de infección, o al menos síntomas de infección grave, en la mayoría de los individuos inmunizados (o infectados de otra forma) con el virus influenza atenuado. En algunos casos, el virus influenza atenuado todavía puede producir síntomas de enfermedad leve (por ejemplo, enfermedad respiratoria superior leve) y/o diseminación a individuos no vacunados. Sin embargo, su virulencia está lo suficientemente suprimida de manera que no se producen infecciones del aparato respiratorio inferior graves en el huésped vacunado o accidental.

Alternativamente, puede estimularse una respuesta inmunitaria seleccionando como diana ex vivo o in vivo células dendríticas con virus influenza que comprenden las secuencias en el presente documento. Por ejemplo, se exponen células dendríticas en proliferación a virus en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la captura de los antígenos de influenza por las células dendríticas. Las células se transfieren entonces a un sujeto que va a vacunarse mediante métodos de trasplante intravenoso convencional.

Mientras que se prefiere la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, mediante la misma o diferente vía, para lograr el efecto profiláctico deseado. En neonatos y lactantes, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos durante toda la infancia, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección frente a la infección por influenza de tipo natural. De manera similar, adultos que son particularmente susceptibles a infección por influenza repetida o grave, tales como, por ejemplo, trabajadores de atención sanitaria, trabajadores de guarderías, miembros de la familia de niños jóvenes, los ancianos e individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden monitorizarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos séricos y secretores neutralizantes, y ajustarse las dosificaciones o repetirse las vacunaciones según sea necesario para provocar y mantener niveles deseados de protección.

Opcionalmente, la formulación para administración profiláctica de los virus influenza también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria frente a los antígenos de influenza. Los adyuvantes adecuados incluyen: adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite o hidrocarburos, bacilo Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum y el adyuvante sintético QS-21.

Si se desea, puede realizarse la administración de vacuna profiláctica de virus influenza conjuntamente con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen diversas citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante (CSF) de colonias de granulocitos-macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como tal como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que los virus influenza, o pueden administrarse por separado.

Aunque la vacunación de un individuo con un virus de influenza atenuado de una cepa particular de un subgrupo particular puede inducir protección cruzada contra virus influenza de diferentes cepas y/o subgrupos, la protección cruzada puede potenciarse, si se desea, vacunando al individuo con virus influenza atenuados de al menos dos cepas, por ejemplo, cada una de las cuales representa un subgrupo diferente. Adicionalmente, las combinaciones de vacunas pueden incluir opcionalmente mezclas de vacunas pandémicas (por ejemplo, aquéllas contra cepas de influenza pandémicas tales como diversas cepas aviares, véanse, por ejemplo, las secuencias en el presente documento, u otras cepas pandémicas) y cepas no pandémicas. Las mezclas de vacunas (o vacunaciones múltiples) pueden comprender componentes de cepas humanas y/o cepas de influenza no humanas (por ejemplo, aviares y humanas, etc.). De manera similar, las vacunas de virus influenza atenuados de esta invención pueden combinarse opcionalmente con vacunas que inducen respuestas inmunitarias protectoras contra otros agentes infecciosos.

POLINUCLEÓTIDOS

Se sabe bien en la técnica que los segmentos de polinucleótido de HA y NA de virus influenza comprenden tanto una región codificante (que codifica para el ORF) como regiones no codificantes (NCR), tanto en 5’ como en 3’ de la secuencia que codifica para HA y NA. Se muestran ejemplos de estas NCR en SEQ ID NOS: 1-9 (fuera de los ORF). También se sabe que pueden prepararse cebadores para estas NCR para facilitar la amplificación de los segmentos de HA y NA completos de virus influenza. (Véase, por ejemplo, Hoffmann et al. Arch Virol. Diciembre de 2001; 146(12): 2275-89). Además, se sabe que las NCR de la HA y NA de influenza pueden aumentar la eficacia de lograr reagrupamientos. Por tanto, las secuencias de polinucleótido de estas NCR se describen en el presente documento. Cuando se amplifican los segmentos de HA y NA de cualquiera cepa pandémica, podrían prepararse y usarse cebadores de polinucleótido para unirse a regiones conservadas (por ejemplo, entre cepas relacionadas) de las NCR de HA y NA para la amplificación (por ejemplo, mediante RT-PCR).

Los polinucleótidos de HA y NA del virus de la invención, SEQ ID NO: 5 o por ejemplo SEQ ID NO: 6, se usan opcionalmente en varias capacidades diferentes alternativamente a, o además de, las vacunas descritas anteriormente. Se describen en el presente documento otros usos a modo de ejemplo en el presente documento para fines ilustrativos y no como limitaciones en la gama actual de usos. También se describen en el presente documento diferentes métodos de construcción, purificación y caracterización de las secuencias de nucleótidos de la descripción. Se describe en el presente documento que ácidos nucleicos incluyendo una o más secuencia(s) de polinucleótido(s) descritas anteriormente se usan favorablemente como sondas para la detección de ácidos nucleicos correspondientes o relacionados en una variedad de contextos, tal como en experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, por ejemplo, para encontrar y/o caracterizar variantes de influenza homólogas (por ejemplo, homólogos para las secuencias en el presente documento, etc.) que infectan a otras especies o en brotes de gripe diferentes, etc. Las sondas pueden ser moléculas de o bien ADN o bien ARN, tales como fragmentos de restricción de ADN genómico o clonado, ADNc, productos de amplificación por PCR, transcriptos y oligonucleótidos, y pueden variar en longitud desde oligonucleótidos tan cortos como aproximadamente 10 nucleótidos de longitud hasta secuencias de longitud completa o ADNc en exceso de 1 kb o más. Por ejemplo, una sonda incluye una secuencia o subsecuencia de polinucleótido seleccionada, por ejemplo, de entre SEQ ID NO: 5 o por ejemplo SEQ ID NO: 6, o secuencias complementarias a las mismas. Alternativamente, se usan como sondas secuencias de polinucleótido que son variantes de una de las secuencias designadas anteriormente. Lo más normalmente, tales variantes incluyen una o unas cuantas variaciones de nucleótidos conservativas. Por ejemplo, pueden seleccionarse pares (o conjuntos) de oligonucleótidos, en los que las dos (o más) secuencias de polinucleótido son variaciones conservativas entre sí, en las que una secuencia de polinucleótido corresponde idénticamente a una primera variante o/y la(s) otra(s) corresponden idénticamente a variantes adicionales. Tales pares de sondas oligonucleotídicas son particularmente útiles, por ejemplo, para experimentos de hibridación específicos para detectar nucleótidos polimórficos o, por ejemplo, para detectar variantes de HA y NA de influenza homólogas, por ejemplo, homólogas a las secuencias de HA y NA actuales, que infectan a otras especies o están presentes en brotes de gripe diferentes (por ejemplo, o bien temporalmente y/o bien geográficamente diferentes). En otras aplicaciones, se seleccionan sondas que son más divergentes, es decir, se seleccionan sondas que son al menos aproximadamente el 91% (o aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 98,5%, aproximadamente el 98,7%, aproximadamente el 99%, aproximadamente el 99,1%, aproximadamente el 99,2%, aproximadamente el 99,3%, aproximadamente el 99,4%, aproximadamente el 99,5%, o aproximadamente el 99,6% o más aproximadamente el 99,7%, aproximadamente el 99,8%, aproximadamente el 99,9% o más) idénticas.

Las sondas descritas en el presente documento por ejemplo, tal como se muestra modo de ejemplo mediante secuencias derivadas de las secuencias en el presente documento, también pueden usarse para identificar secuencias de polinucleótido útiles adicionales según procedimientos rutinarios en la técnica. Se utilizan una o más sondas, tal como se describió anteriormente, para examinar bibliotecas de productos de expresión o segmentos cromosómicos (por ejemplo, bibliotecas de expresión o bibliotecas genómicas) para identificar clones que incluyen secuencias idénticas a, o con similitud de secuencia significativa con, por ejemplo, una o más sonda(s) de las secuencias en el presente documento, es decir, variantes, homólogos, etc. Se entenderá que además de métodos físicos tales como examen de bibliotecas, también pueden usarse enfoques bioinformáticos asistidos por ordenador, por ejemplo, BLAST y otros algoritmos de búsqueda de homología de secuencia, y similares, para identificar secuencias de polinucleótido relacionadas.

Se producen opcionalmente sondas oligonucleotídicas mediante una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Lo más normalmente, se producen mediante métodos sintéticos bien conocidos, tales como el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22(20): 1859-1862, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, o tal como se describe en Needham-Van Devanter et al. (1984) Nucl Acids Res, 12: 6159-6168. También pueden prepararse oligonucleótidos a medida y pedirse de una variedad de fuentes comerciales conocidas por los expertos. La purificación de oligonucleótidos, cuando sea necesario, se realiza normalmente mediante o bien electroforesis en gel de acrilamida nativa o bien mediante HPLS de intercambio aniónico tal como se describe en Pearson y Regnier (1983) J Chrom 255: 137-149. La secuencia de los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, Nueva York, Methods in Enzymology 65: 499-560. También pueden pedirse fácilmente oligonucleótidos a medida de una variedad de fuentes comerciales conocidas por los expertos.

En otras circunstancias, por ejemplo, que se refieren a atributos de células u organismos que expresan los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento (por ejemplo, los que albergan virus que comprenden las secuencias descritas en el presente documento), se utilizan favorablemente sondas que son polipéptidos, péptidos o anticuerpos. Por ejemplo, se usan favorablemente polipéptidos aislados o recombinantes, fragmentos de polipéptido y péptidos derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 15-16) y/o codificados por secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento, por ejemplo, seleccionadas de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, para identificar y aislar anticuerpos, por ejemplo, a partir de bibliotecas de presentación en fago, bibliotecas combinatorias, sueros policlonales y similares. Los fragmentos de polipéptido incluyen un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 10 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 15 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 20 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 25 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 40 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 50 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 60 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 70 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 80 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 90 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 100 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 125 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 150 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 175 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 200 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 350 residuos de aminoácido contiguos, o al menos 400 contiguos, o al menos 450 contiguos, o al menos 500 contiguos, o al menos 550 contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de HA o NA descrito en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID Nos: 11-20). También se describen en el presente documento polinucleótidos que codifican para dichos fragmentos de polipéptido y anticuerpos que se unen específicamente a dichos polipéptidos.

Anticuerpos específicos para cualquier secuencia o subsecuencia de polipéptido, por ejemplo, de SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 20, y/o codificados por secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento, por ejemplo, seleccionadas de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 10, son así mismo valiosos como sondas para evaluar productos de expresión, por ejemplo, a partir de células o tejidos. Además, los anticuerpos son particularmente adecuados para evaluar la expresión de proteínas que comprenden subsecuencias de aminoácidos, por ejemplo, de las que se facilitan en el presente documento, o codificadas por secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento, por ejemplo, seleccionadas de las mostradas en el presente documento, in situ, en un alineamiento de tejido, en una célula, tejido u organismo, por ejemplo, un organismo infectado por un virus influenza no identificado o similar. Los anticuerpos pueden marcarse directamente con un reactivo detectable, o detectarse indirectamente marcando un anticuerpo secundario específico para la región constante de cadena pesada (es decir, isotipo) del anticuerpo específico). Se proporcionan a continuación detalles adicionales referentes a la producción de anticuerpos específicos.

Ensayos de diagnóstico

Las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar influenza (y/o hemaglutinina y/o neuraminidasa) en una muestra, para detectar secuencias similares a hemaglutinina y/o similares a neuraminidasa, y para detectar diferencias de cepas en aislados clínicos de influenza usando fragmentos de polinucleótido o bien químicamente sintetizados o bien recombinantes, por ejemplo, seleccionados de las secuencias en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos de las secuencias de hemaglutinina y/o neuraminidasa que comprenden al menos entre 10 y 20 nucleótidos como cebadores para amplificar ácidos nucleicos usando métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR con transcripción inversa) y como sondas en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos para detectar material genético diana tal como ARN de influenza en muestras clínicas.

Las sondas descritas en el presente documento, por ejemplo, tal como se muestra a modo de ejemplo mediante subsecuencias únicas seleccionadas de las facilitadas en el presente documento, también pueden usarse para identificar secuencias de polinucleótido útiles adicionales (tal como para caracterizar cepas de influenza adicionales) según procedimientos de rutina en la técnica. Una o más sondas, tal como se describió anteriormente, se utilizan para examinar bibliotecas de productos de expresión o ácidos nucleicos virales clonados (es decir, bibliotecas de expresión o bibliotecas genómicas) para identificar clones que incluyen secuencias idénticas a, o con identidad de secuencia significativa con las secuencias en el presente documento. A su vez, cada una de estas secuencias identificadas puede usarse para preparar sondas, incluyendo pares o conjuntos de sondas variantes tal como se describió anteriormente. Se entenderá que además de tales métodos físicos tales como examen de bibliotecas, también pueden usarse enfoques bioinformáticos asistidos por ordenador, por ejemplo, BLAST y otros algoritmos de búsqueda de homología de secuencia, y similares, para identificar secuencias de polinucleótido relacionadas.

Las sondas descritas en el presente documento son particularmente útiles para detectar la presencia y para determinar la identidad de ácidos nucleicos de influenza en células, tejidos u otras muestras biológicas (por ejemplo, un lavado nasal o lavado bronquial). Por ejemplo, las sondas descritas en el presente documento se utilizan favorablemente para determinar si una muestra biológica, tal como un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) o sistema modelo (tal como una muestra celular cultivada) se ha expuesto a, o se ha infectado con influenza, o cepa(s) particular(es) de influenza. La detección de la hibridación de la sonda seleccionada con ácidos nucleicos que se originan en (por ejemplo, aislados de) la muestra biológica o sistema modelo es indicativa de exposición a o infección con el virus (o un virus relacionado) del que se selecciona el polinucleótido sonda.

Se apreciará que el diseño de la sonda se ve influido por la aplicación prevista. Por ejemplo, cuando van a detectarse varias interacciones sonda-diana específicas de alelo en un único ensayo, por ejemplo, en un único chip de ADN, es deseable tener temperaturas de fusión similares para todas las sondas. Por consiguiente, las longitudes de las sondas se ajustan de modo que las temperaturas de fusión para todas las sondas en el alineamiento sean estrechamente similares (se apreciará que pueden necesitarse diferentes longitudes para diferentes sondas para lograr una Tm particular cuando diferentes sondas tienen diferentes contenidos en GC). Aunque la temperatura de fusión es una consideración primaria en el diseño de la sonda, se usan opcionalmente otros factores para ajustar adicionalmente la construcción de sondas, tales como seleccionar frente a la autocomplementariedad de cebadores y similares.

Vectores, promotores y sistemas de expresión

También se describen en el presente documento constructos recombinantes que incorporan una o más de las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Tales constructos incluyen opcionalmente un vector, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), etc., en el que una o más de las secuencias de polinucleótido de SEQ ID NO: 5 o por ejemplo, SEQ ID NO: 6, o una subsecuencia de las mismas, etc., se ha insertado, en una orientación directa o inversa. Por ejemplo, el ácido nucleico insertado puede incluir una secuencia cromosómica viral o ADNc que incluye toda o parte de al menos una de las secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento. En un aspecto, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operativamente unido a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen grandes números de promotores y vectores adecuados, y están disponibles comercialmente.

Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden incluirse en uno cualquiera de una variedad de vectores adecuados para generar ARN sentido o antisentido, y opcionalmente, productos de expresión de polipéptido (o péptido) (por ejemplo, una molécula de hemaglutinina y/o neuraminidasa tal como se describe en el presente documento). Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y muchos otros (por ejemplo, pCDL). Puede usarse cualquier vector que pueda introducir material genético en una célula y, si se desea replicación, que pueda replicarse en el huésped relevante.

En un vector de expresión, la secuencia de polinucleótido de HA y/o NA de interés está físicamente dispuesta en proximidad y orientación con una secuencia de control de la transcripción apropiada (por ejemplo, promotor, y opcionalmente uno o más potenciadores) para dirigir la síntesis de ARNm. Es decir, la secuencia de polinucleótido de interés está operativamente unida a una secuencia de control de la transcripción apropiada. Los ejemplos de tales promotores incluyen: promotor de SV40 o LTR, promotor lac o trp de E. coli, promotor PL de fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas y sus virus.

Una variedad de promotores son adecuados para su uso en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos de genoma de virus influenza. En determinadas realizaciones, se utiliza el promotor de la ARN polimerasa II (Pol II) dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV). Si se desea, por ejemplo, para regular la expresión condicional, pueden sustituirse otros promotores que inducen transcripción de ARN en las condiciones especificadas, o en las células o tejidos especificados. Están disponibles numerosos promotores virales y de mamíferos, por ejemplo, humanos, o pueden aislarse según la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, los promotores alternativos obtenidos de los genomas de virus animales y humanos incluyen promotores tales como el adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma, virus de la hepatitis B, virus del polioma y virus del simio 40 (SV40), y diversos promotores retrovirales. Los promotores de mamíferos incluyen, entre muchos otros, el promotor de actina, promotores de inmunoglobulina, promotores de choque térmico y similares.

La transcripción se aumenta opcionalmente incluyendo una secuencia potenciadora. Los potenciadores son normalmente elementos de ADN de actuación en cis normalmente cortos, por ejemplo, de 10-500 pb, que actúan en concierto con un promotor para aumentar la transcripción. Se han aislado muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina), y virus de células eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5’ o 3’ con respecto a la secuencia codificante heteróloga, pero normalmente se inserta en un sitio en 5’ con respecto al promotor. Normalmente, el promotor, y si se desea, secuencias que potencian la transcripción adicionales, se eligen para optimizar la expresión en el tipo de célula huésped en el que el ADN heterólogo va a introducirse (Scharf et al. (1994) Heat stress promoters and transcription factors, Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 51227). Opcionalmente, el amplicón también puede contener un sitio de unión al ribosoma o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para la iniciación de la traducción.

Los vectores descritos en el presente documento también incluyen favorablemente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm, tal como un sitio de poliadenilación o una secuencia terminadora. Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones no traducidas en 5’ y, ocasionalmente en 3’, de ADN o ADNc virales o eucariotas. Las secuencias de señal de poliadenilación de SV40 pueden proporcionar un sitio de poliadenilación bidireccional que protege la transcripción de las moléculas de ARNm de hebra (+) de la replicación iniciada por el promotor de PolI del genoma viral de hebra (-).

Además, tal como se describió anteriormente, los vectores de expresión incluyen opcionalmente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, además de los genes enumerados anteriormente, marcadores tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina son adecuados para la selección en cultivo de células eucariotas.

El vector que contiene las secuencias de ácido nucleico apropiadas tal como se describió anteriormente, así como una secuencia de control o promotor apropiado, puede emplearse para transformar una célula huésped permitiendo la expresión de la proteína. Aunque los vectores descritos en el presente documento pueden replicarse en células bacterianas, lo más frecuentemente será deseable introducirlos en células de mamífero, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293, células COS o similares, para el fin de expression.

Tal como se describe en otra parte, las secuencias de HA y NA en el presente documento pueden estar comprendidas dentro de plásmidos implicados en reagrupamiento por rescate con plásmidos. Véanse, por ejemplo, los documentos US2004029251 y US2005042229. Por ejemplo, los vectores de expresión preferidos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, vectores que comprenden el promotor de pol I y secuencias terminadoras o vectores que usan los promotores tanto de pol I como de pol II, “el sistema de promotores de polI/polII” (por ejemplo, Zobel et al., Nucl. Acids Res. 1993, 21: 3607; documento US20020164770; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9345; Fodor et al., J. Virol. 1999, 73:9679; y documento US20030035814). Los reagrupados producidos incluyen los genes de HA y NA dispuestos con los otros 6 genes de influenza de la cepa donadora A/Ann Arbor/6/60 (y/o derivados y modificaciones de los mismos), la estructura principal de cepa donadora PR8, la estructura principal de cepa donadora A/Leningrad/17, etc. Se describen otras cepas de estructura principal, por ejemplo, en los documentos US20040137013 y US0030147916.

Elementos de expresión adicionales

Lo más comúnmente, el segmento de genoma que codifica para la proteína HA y/o NA de virus influenza incluye cualquier secuencia adicional necesaria para su expresión, incluyendo traducción en una proteína viral funcional. En otras situaciones, puede emplearse un minigen, u otro constructo artificial que codifica para las proteínas virales, por ejemplo, una proteína de HA y/o NA. De nuevo, en tal caso, a menudo es deseable incluir señales de iniciación específicas que ayudan en la traducción eficaz de la secuencia codificante heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Para garantizar la traducción de todo el inserto, el codón de iniciación se inserta en el marco de lectura correcto en relación con la proteína viral. Los elementos transcripcionales exógenos y codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso.

Si se desea, pueden incorporarse en el vector secuencias de polinucleótido que codifican para elementos expresados adicionales, tales como secuencias señal, secuencias de secreción o localización, y similares, habitualmente en marco con la secuencia de polinucleótido de interés, por ejemplo, para seleccionar como diana la expresión del polipéptido en un orgánulo, membrana o compartimento celular deseado, o para dirigir la secreción del polipéptido al espacio periplásmico o al medio de cultivo celular. Tales secuencias las conocen los expertos, e incluyen péptidos líder de secreción, secuencias de direccionamiento a orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención en el RE, secuencias de tránsito mitocondrial), secuencias de anclaje/localización en la membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia de terminación, secuencias de anclaje GPI) y similares.

Cuando se desea la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, señales de iniciación específicas de traducción adicionales pueden mejorar la eficacia de traducción. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, un codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes, una región de IRES, etc. En algunos casos, por ejemplo, se insertan moléculas de ADNc de longitud completa o segmentos cromosómicos que incluyen una secuencia codificante que incorpora, por ejemplo, una secuencia de polinucleótido tal como se describe en el presente documento, un codón de iniciación de la traducción y elementos de secuencia asociados, en el vector de expresión apropiado simultáneamente con la secuencia de polinucleótido de interés. En tales casos, no se requieren frecuentemente señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en casos en los que sólo se inserta una secuencia que codifica para el polipéptido, o una parte de la misma, a menudo se proporcionan señales de control de la traducción exógenas, incluyendo, por ejemplo, un codón de iniciación ATG, para la expresión de la secuencia relevante. El codón de iniciación se pone en el marco de lectura correcto para garantizar la transcripción de la secuencia de polinucleótido de interés. Los elementos transcripcionales exógenos y codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, ScharfD. et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).

Producción de virus recombinante

Pueden modificarse por ingeniería genética virus de ARN de hebra negativa y recuperarse usando un enfoque de genética inversa recombinante (véase, por ejemplo, el documento USPN 5.166.057 concedido a Palese et al.). Tal método se aplicó originalmente para modificar por ingeniería genética genomas virales de influenza (Luytjes et al. (1989) Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567), y se ha aplicado satisfactoriamente a una amplia variedad de virus de ARN de hebra negativa segmentados y no segmentados, por ejemplo, rabia (Schnell et al. (1994) EMBO J. 13: 4195-4203); VSV (Lawson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

92: 4477-4481); virus de las paperas (Radecke et al. (1995) EMBO J. 14:5773-5784); virus de la peste bovina (Baron & Barrett (1997) J. Virol. 71: 1265-1271); virus parainfluenza humano (Hoffman & Banerjee (1997) J. Virol. 71: 32723277; Dubin et al. (1997) Virology 235:323-332); SV5 (He et al. (1997) Virology 237:249-260); virus del moquillo canino (Gassen et al. (2000) J. Virol. 74:10737-44); y virus Sendai (Park et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al. (1996) Genes to Cells 1:569-579). Los expertos en la técnica estarán familiarizados con estas y otras técnicas similares para producir virus influenza que comprenden las secuencias de HA y NA descritas en el presente documento. Los virus influenza recombinantes producidos según tales métodos son una característica de la descripción ya que son virus influenza recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos y/o polipéptidos descritos en el presente documento.

Cultivo celular y huéspedes de expresión

También se describen en el presente documento células huésped que se introducen (transducen, transforman o transfectan) con vectores descritos en el presente documento, y la producción de polipéptidos descritos en el presente documento mediante técnicas recombinantes. Las células huésped se modifican por ingeniería genética (es decir, transducen, transforman o transfectan) con un vector, tal como un vector de expresión. Tal como se describió anteriormente, el vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Los ejemplos de huéspedes de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; o células de insecto tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda.

Lo más comúnmente, se usan células de mamífero para cultivar las moléculas de HA y NA descritas en el presente documento. Las células huésped adecuadas para la replicación de virus influenza incluyen, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T, células COS7 o similares. Comúnmente, se emplean cocultivos que incluyen dos de las líneas celulares anteriores, por ejemplo, células MDCK y o bien células 293T o bien COS a una razón, por ejemplo, de 1:1, para mejorar la eficacia de replicación. Normalmente, se cultivan las células en un medio de cultivo comercial convencional, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero (por ejemplo, suero bovino fetal al 10%), o en medio libre de suero, bajo humedad controlada y concentración de CO2 adecuada para mantener el pH tamponado neutro (por ejemplo, a pH entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibióticos para prevenir el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc., y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, complementos adicionales para promover características de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, 1-mercaptoetanol y similares.

Las células huésped modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar las secuencias de polinucleótido insertadas. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son normalmente las usadas anteriormente con la célula huésped particular seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos en la técnica y en la bibliografía mencionada en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3ª edición, Wiley-Liss, Nueva York y la bibliografía mencionada en la misma. Otra bibliografía útil incluye, por ejemplo, Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5ª ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work y Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Los detalles adicionales referentes a procedimientos de cultivo tisular de particular interés en la producción de virus influenza in vitro incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. En Cohen y Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Adicionalmente, se determinan fácilmente variaciones en tales procedimientos adaptados a la presente descripción a través de experimentación rutinaria y serán familiares para los expertos en la técnica.

Pueden cultivarse células para la producción de virus influenza (por ejemplo, que tiene las secuencias de HA y/o NA de la descripción) en medio libre de suero o que contiene suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, normalmente es deseable hacer crecer las células huésped en condiciones libres de suero. Las células pueden cultivarse a pequeña escala, por ejemplo, menos de 25 ml de medio, tubos de cultivo o matraces o en matraces grandes con agitación, en frascos rotatorios, o en perlas microportadoras (por ejemplo, perlas microportadoras de DEAE-dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copolímero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en matraces, frascos o cultivos en reactor. Las perlas microportadoras son pequeñas esferas (en el intervalo de 100-200 micrómetros de diámetro) que proporcionan una gran área superficial para crecimiento celular adherente por volumen de cultivo celular. Por ejemplo, un único litro de medio puede incluir más de 20 millones de perlas microportadoras que proporcionan más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de crecimiento. Para la producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, a menudo es deseable cultivar las células en un biorreactor o fermentador. Están disponibles biorreactores en volúmenes de desde menos de 1 litro hasta en exceso de 100 litros, por ejemplo, biorreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); biorreactores a escala de laboratorio y comercial de B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania).

Independientemente del volumen de cultivo, en muchos aspectos deseados de la presente descripción, es importante que los cultivos se mantengan a una temperatura apropiada, para garantizar una recuperación eficaz de virus influenza recombinante y/o reagrupado usando sistemas de múltiples plásmidos dependientes de temperatura (véase, por ejemplo, Sistema de múltiples plásmidos para la producción de virus influenza, documento US2004029251), calentamiento de disoluciones de virus para la filtración, etc. Normalmente, se emplea un regulador, por ejemplo, un termostato, u otro dispositivo para detectar y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular y/u otra disolución, para garantizar que la temperatura está al nivel correcto durante el periodo apropiado (por ejemplo, replicación del virus, etc.).

En la descripción en el presente documento (por ejemplo, cuando van a producirse virus reagrupados a partir de segmentos en vectores), se introducen (por ejemplo, transfectan) vectores que comprenden segmentos de genoma de influenza en células huésped según métodos bien conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células eucariotas, incluyendo, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. Por ejemplo, pueden transfectarse vectores, por ejemplo, plásmidos en células huésped, tales como células COS, células 293T o combinaciones de células COS o 293T y células MDCK, usando el reactivo de transfección de poliamina TransIT-LT1 (Mirus) según las instrucciones del fabricante con el fin de producir virus reagrupados, etc. Por tanto, en un ejemplo, se introduce aproximadamente 1 !g de cada vector en una población de células huésped con aproximadamente 2 !l de TransIT-LT1 diluidos en 160 !l de medio, preferiblemente medio libre de suero, en un volumen total de 200 !l. Se incuban las mezclas de ADN:reactivo de transfección a temperatura ambiente durante 45 minutos seguido por adición de 800 !l de medio. Se añade la mezcla de transfección a las células huésped, y se cultivan las células tal como se describe mediante otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, para la producción de virus recombinantes o reagrupados en cultivo celular, se mezclan vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos de genoma (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) con aproximadamente 20 !l de TransIT-LT1 y se transfectan en células huésped. Opcionalmente, se sustituye el medio que contiene suero antes de la transfección por medio libre de suero, por ejemplo, Opti-MEM I, y se incuba durante 4-6 horas.

Alternativamente, puede emplearse electroporación para introducir tales vectores que incorporan segmentos de genoma de influenza en células huésped. Por ejemplo, vectores de plásmido que incorporan un virus influenza A o influenza B se introducen favorablemente en células Vero usando electroporación según el siguiente procedimiento.

En resumen, se resuspenden aproximadamente 5 x 106 células Vero, por ejemplo, hechas crecer en medio de Eagle modificado (MEM) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), en 0,4 ml de OptiMEM y se colocan en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 !l a las células en la cubeta, que entonces se mezclan suavemente dando golpecitos. Se realiza la electroporación según las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microfaradios con un tiempo constante de entre 28-33 mseg. Las células vuelven a mezclarse dando golpecitos suaves y aproximadamente 1-2 minutos tras la electroporación se añaden 0,7 ml de MEM con FBS al 10% directamente a la cubeta. Entonces se transfieren las células a dos pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos convencional que contiene 2 ml de MEM, FBS al 10%. Se lava la cubeta para recuperar cualquier célula restante y se divide la suspensión de lavado entre los dos pocillos. El volumen final es de aproximadamente 3,5 ml. Entonces se incuban las células en condiciones permisivas para el crecimiento viral, por ejemplo, a aproximadamente 33ºC para cepas adaptadas al frío.

En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión, tales como sistemas a base de virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, se liga opcionalmente una secuencia codificante en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral dará como resultado un virus viable que puede expresar los polipéptidos de interés en células huésped infectadas (Logan y Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.

Se elige opcionalmente una cepa de célula huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseado. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional de la proteína, que escinde una forma precursora para dar una forma madura, es algunas veces importante para corregir la inserción, el plegamiento y/o la función. Adicionalmente, también es importante la ubicación apropiada dentro de una célula huésped (por ejemplo, en la superficie de la célula). Diferentes células huésped tales como COS, CHO, BHK, MDCK, 293, 293T, COS7, etc. tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para garantizar el procesamiento y la modificación correctos de la presente proteína foránea introducida.

Para la producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes codificadas por, o que tienen subsecuencias codificadas por, los polinucleótidos descritos en el presente documento, se usan opcionalmente sistemas de expresión estable. Por ejemplo, se transfectan líneas celulares, que expresan de manera estable un polipéptido descrito en el presente documento, usando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Por ejemplo, tras la introducción del vector, se deja que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a medios selectivos. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Por tanto, pueden proliferar grupos resistentes de células transformadas de manera estable, por ejemplo, derivadas de un único tipo de célula, usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula.

Las células huésped transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento se cultivan opcionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. Las células que expresan dicha proteína pueden clasificarse, aislarse y/o purificarse. La proteína o fragmento de la misma producido por una célula recombinante puede secretarse, unirse a la membrana o retenerse intracelularmente, dependiendo de la secuencia (por ejemplo, dependiendo de proteínas de fusión que codifican para una señal de retención en la membrana o similar) y/o el vector usado.

Los productos de expresión que corresponden a los ácidos nucleicos descritos en el presente documento también pueden producirse en células no animales tales como plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, todos citados a continuación, pueden encontrarse detalles referentes al cultivo celular en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para el producto expresado. Por ejemplo, cuando se necesitan grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos del mismo para la producción de anticuerpos, se emplean favorablemente vectores que dirigen la expresión a alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión y clonación de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia codificante de interés, por ejemplo, secuencias que comprenden las encontradas en el presente documento, etc., puede ligarse en el vector en marco con secuencias para la traducción amino terminal que se inicia con metionina y los 7 residuos posteriores de beta-galactosidasa que producen una proteína de fusión de beta-galactosidasa catalíticamente activa; vectores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison WI); y similares. De manera similar, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, véase Ausubel, citado a continuación, y Grant et al., (1987); Methods in Enzymology 153:516-544.

Hibridación de ácidos nucleicos

Puede usarse hibridación comparativa para identificar ácidos nucleicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 5-6) incluyendo variaciones conservativas de ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Este método de hibridación comparativa es un método preferido de distinción de ácidos nucleicos. Además, ácidos nucleicos diana que hibridan con los ácidos nucleicos representados por los mostrados en el presente documento en condiciones de alta, ultra alta y ultra-ultra alta rigurosidad, son características de la descripción. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen aquellos con una o unas cuantas sustituciones de ácido nucleico silenciosas o conservativas en comparación con una secuencia de ácido nucleico dada.

Se dice que un ácido nucleico diana de prueba hibrida específicamente con un ácido nucleico sonda cuando hibrida al menos la mitad de bien con la sonda que con la diana complementaria perfectamente apareada, es decir, con una razón señal - ruido al menos la mitad de alta que la hibridación de la sonda y la diana en condiciones en las que una sonda perfectamente apareada se une a una diana complementaria perfectamente apareada con una razón señal ruido que es al menos aproximadamente 5x-10x tan alta como la observada para la hibridación con cualquiera de los ácidos nucleicos no apareados.

Los ácidos nucleicos “hibridan” cuando se asocian, normalmente en disolución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tales como puentes de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para la hibridación de ácidos nucleicos. Se encuentra una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” (Elsevier, Nueva York), así como en Ausubel, Sambrook, y Berger y Kimmel, todos citados a continuación. Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Harnes y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Harnes y Higgins 2) proporcionan detalles sobre la síntesis, el marcaje, la detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo oligonucleótidos.

Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia de tipo Southern o Northern es un 50% de formalina con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas comprende un lavado con 0,2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, citado a continuación, para una descripción del tampón de SSC y otros parámetros de hibridación de ácidos nucleicos). A menudo, al lavado de alta rigurosidad le precede un lavado de baja rigurosidad para eliminar la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad es 2x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una razón señal - ruido de 5x (o superior) a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica.

Tras la hibridación, pueden eliminarse los ácidos nucleicos no hibridados mediante una serie de lavados, cuya rigurosidad puede ajustarse dependiendo de los resultados deseados. Las condiciones de lavado de baja rigurosidad (por ejemplo, usando concentración de sal superior y temperatura inferior) aumentan la sensibilidad, pero pueden producir señales de hibridación no específicas y señales de fondo altas. Las condiciones de rigurosidad superior (por ejemplo, usando concentración de sal inferior y temperatura superior que está más cerca de la Tm) disminuyen la señal de fondo, normalmente con la señal específica restante específicamente. Véase, también, Rapley, R. y Walker, J.M. eds., Molecular Biomethods Handbook (Humana Press, Inc. 1998).

“Condiciones de lavado de hibridación rigurosa” en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de tipo Southern y Northern dependen de la secuencia, y son diferentes bajo parámetros medioambientales diferentes. Se encuentra una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), citado anteriormente, y en Hames y Higgins, 1 y 2. Las condiciones de lavado e hibridación rigurosas pueden determinarse fácilmente de manera empírica para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, al determinar las condiciones de lavado e hibridación altamente rigurosas, las condiciones de lavado e hibridación se aumentan gradualmente (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración de sal, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos tales como formalina en la hibridación y el lavado), hasta que se cumple un conjunto seleccionado de criterios. Por ejemplo, las condiciones de lavado e hibridación se aumentan gradualmente hasta que una sonda se une a una diana complementaria perfectamente apareada con una razón señal - ruido que es al menos 5x tan alta como la observada para la hibridación de la sonda con una diana no apareada.

En general, una razón señal - ruido de al menos 2x (o superior, por ejemplo, al menos 5x, 10x, 20x, 50x, 100x, o más) la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica. La detección de hibridación al menos rigurosa entre dos secuencias en el contexto de la presente descripción indica similitud estructural relativamente fuerte con, por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en las listas de secuencias en el presente documento.

Se seleccionan condiciones “muy rigurosas” para que sean iguales al punto de fusión térmica (Tm) para una sonda particular. La Tm es la temperatura (a pH y fuerza iónica definidos) a la que el 50% de la secuencia de prueba hibrida con una sonda perfectamente apareada. Para los fines de la presente descripción, generalmente, se seleccionan condiciones de hibridación y lavado “altamente rigurosas” para que sean aproximadamente 5ºC inferiores a la Tm para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos (tal como se indica a continuación, también puede hacerse referencia a condiciones altamente rigurosas en términos comparativos). Pueden identificarse secuencias diana que están estrechamente relacionadas o son idénticas a la secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, “sonda”) en condiciones rigurosas o altamente rigurosas. Condiciones de rigurosidad inferior son apropiadas para secuencias que son menos complementarias.

Condiciones de hibridación y lavado de “ultra alta rigurosidad” son aquéllas en las que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la razón señal - ruido para la unión de una sonda a un ácido nucleico diana complementario es al menos 10x tan alta como la observada para la hibridación con cualquier ácido nucleico diana no apareado. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en tales condiciones, con una razón señal - ruido de al menos la mitad de la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado se dice que se une a la sonda en condiciones de ultra alta rigurosidad.

Al determinar las condiciones de hibridación y lavado rigurosas o altamente rigurosas (o incluso hibridación más rigurosa), las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración de sal, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos, tales como formamida, en la hibridación o el lavado), hasta que se cumple un conjunto seleccionado de criterios. Por ejemplo, las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente hasta que una sonda que comprende una o más secuencias de polinucleótido de la descripción, por ejemplo, secuencias o subsecuencias únicas seleccionadas de las facilitadas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 5-6) y/o secuencias de polinucleótido complementarias, se unen a una diana complementaria perfectamente apareada (de nuevo, un ácido nucleico que comprende una o más secuencias o subsecuencias de ácido nucleico seleccionadas de las facilitadas en el presente documento y/o secuencias de polinucleótido complementarias de las mismas), con una razón señal - ruido que es al menos 2x (y opcionalmente 5x, 10x o 100x o más) tan alta como la observada para la hibridación de la sonda con una diana no apareada (por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que comprende una o más secuencias o subsecuencias seleccionadas de secuencias de influenza conocidas presentes en bases de datos públicas tales como GenBank en el momento de la presentación, y/o secuencias de polinucleótido complementarias de las mismas), según se desee.

Usando los polinucleótidos descritos en el presente documento, o subsecuencias de los mismos, pueden obtenerse ácidos nucleicos diana novedosos. Por ejemplo, tales ácidos nucleicos diana incluyen secuencias que hibridan en condiciones rigurosas con una sonda oligonucleotídica única correspondiente a cualquiera de los polinucleótidos de SEQ ID NO: 5-6).

De manera similar, pueden determinarse niveles de rigurosidad incluso superiores aumentando gradualmente las condiciones de hibridación y/o lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, aquellos en los que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la razón señal - ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos 10X, 20X, 50X, 100X o 500X

o más tan alta como la observada para la hibridación con cualquier ácido nucleico diana no apareado. La señal particular dependerá del marcador usado en el ensayo relevante, por ejemplo, un marcador fluorescente, un marcador colorimétrico, un marcador radiactivo o similar. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en tales condiciones, con una razón señal - ruido de al menos la mitad de la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado, se dice que se une a la sonda en condiciones de ultra-ultra alta rigurosidad.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético.

Clonación, mutagénesis y expresión de biomoléculas de interés

Textos generales que describen técnicas de biología molecular, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 (“Sambrook”) y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (complementadas hasta 2002) (“Ausubel”)). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes relacionados con, por ejemplo, la generación de moléculas de HA y/o NA, etc.

También se describen en el presente documento diversos tipos de mutagénesis, por ejemplo, para producir y/o aislar, por ejemplo, moléculas de HA y/o NA novedosas o recién aisladas y/o para modificar/mutar adicionalmente los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de HA y/o NA como en la SEQ ID NO: 15-16 descrita en el presente documento. Incluyen, pero no se limitan, mutagénesis puntual aleatoria, dirigida al sitio, recombinación homóloga (intercambio de ADN), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificada por fosforotioato, mutagénesis usando ADN bicatenario incompleto, o similares. Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de apareamientos erróneos puntuales, mutagénesis usando cadenas de huésped con reparación deficiente, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis por deleción, mutagénesis mediante síntesis génica total, reparación de rotura de cadena doble y similares. También se describe en el presente documento la mutagénesis, por ejemplo, que implica constructos quiméricos. La mutagénesis puede guiarse mediante información conocida de la molécula que se produce de manera natural o la molécula que se produce de manera natural alterada o mutada, por ejemplo, mediante comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina o similares.

Los textos anteriores y los ejemplos encontrados en el presente documento describen estos procedimientos, al igual que las siguientes publicaciones (y bibliografía citada dentro de ellas): Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol Biol 57:369374 (1996); 1. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acid Res 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in presence of ethidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín) (1987); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-siranded DNA template, Methods in Enzymol 154: 329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large delections, Nucl Acids Res 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83: 7177-7181 (1986); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423 (1986); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ’shot-gun’ gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotidedirected mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 9441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); y Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:64876500 (1982). Detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymol Volumen 154, que también describe controles útiles para problemas de corrección de errores con diversos métodos de mutagénesis, aislamiento de genes, expresión y otros.

Los oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en mutagénesis por ejemplo mutando bibliotecas de moléculas de HA y/o NA o alterándolas, normalmente se sintetizan químicamente según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, (1981) por ejemplo usando un sintetizador automatizado, tal como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acid Res, 12:6159-6168 (1984).

Además, esencialmente puede adaptarse o encargarse de manera convencional cualquier ácido nucleico a partir de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchas otras. De manera similar, también pueden encargarse a medida péptidos y anticuerpos a partir de cualquiera de una variedad de fuentes, tales como PeptidoGenic (disponible en pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.com), BMA Biomedicals Ltd. (R.U.), Bio.Synthesis, Inc., y muchas otras.

También se describen en el presente documento células huésped y organismos que comprenden una molécula de HA y/o NA u otro polipéptido y/o ácido nucleico de por ejemplo, SEQ ID NO 5-6. Las células huésped se modifican mediante ingeniería genética (por ejemplo, se transforman, transducen o transfectan) con los vectores descritos en el presente documento, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos mediante métodos convencionales que incluyen electroporación (véase, From et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824 (1985)), infección mediante vectores virales, penetración balística a alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico

o bien dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas, o bien sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook y Ausubel proporcionan una variedad de métodos de transformación adecuados. Véase anteriormente.

Están disponibles varios métodos bien conocidos de introducción de ácidos nucleicos diana en células bacterianas, pudiendo usarse cualquiera de ellos en la presente invención. Éstos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo con proyectiles e infección con vectores virales, etc. Pueden usarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen constructos de ADN de esta invención. Las bacterias se hacen crecer hasta fase logarítmica y pueden aislarse los plásmidos dentro de las bacterias mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, están disponibles comercialmente una multitud de kits para la purificación de plásmidos procedentes de bacterias (véase, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y, QIAprep™ de Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados se manipulan entonces adicionalmente para producir otros plásmidos, se usan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen secuencias terminadoras de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas, o procariotas, o ambos, (por ejemplo, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación y la integración en procariotas, eucariotas, u opcionalmente ambos. Véanse, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos citados anteriormente). Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para la clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophages (1992) Ghema et al. (eds.) publicado por la ATCC. Procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA, Segunda edición, Scientific American Books, NY. Véase, anteriormente. Vectores adicionales útiles con las secuencias en el presente documento se ilustran anteriormente en la sección relativa a la producción de virus influenza para vacunas y la bibliografía citada en ella.

PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE POLIPÉPTIDOS

Tras la transducción de una cepa o línea celular huésped adecuada y el crecimiento de las células huésped hasta una densidad celular apropiada, se induce el promotor seleccionado mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. En algunas realizaciones, se recupera entonces un producto polipeptídico secretado, por ejemplo, un polipéptido de HA y/o NA en forma de proteína de fusión secretada, etc., del medio de cultivo. En otras realizaciones, se produce una partícula de virus de la invención que contiene un polipéptido de HA y/o NA procedente de la célula. Alternativamente, las células pueden recogerse mediante centrifugación, alterarse mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante puede retenerse para su purificación adicional. Las células eucariotas o microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden alterarse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisis celular, u otros métodos que conocen bien los expertos en la técnica. Adicionalmente, pueden utilizarse células que expresan un producto polipeptídico de HA y/o NA descrito en el presente documento sin separar el polipéptido de la célula. En tales situaciones, el polipéptido se expresa opcionalmente sobre la superficie celular y se examina por tanto (por ejemplo, teniendo moléculas de HA y/o NA por ejemplo, que comprenden proteínas de fusión o similares) sobre la superficie celular, etc.

Los polipéptidos expresados pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando cualquiera de los sistemas de marcaje conocidos por los expertos en la técnica), cromatografía en hidroxilapatita y cromatografía en lectina.

Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Además, puede emplearse cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en las etapas de purificación finales. Además de la bibliografía mencionada en el presente documento, se conocen bien en la técnica una variedad de métodos de purificación, incluyendo, por ejemplo, los explicados en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2ª Edición Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª Edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications. Segunda edición, Wiley-VCH, NY; y Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Cuando los polipéptidos expresados se producen en virus, los virus se recuperan normalmente del medio de cultivo, en el que se han hecho crecer las células infectadas (transfectadas). Normalmente, el medio bruto se aclara antes de la concentración de los virus influenza. Métodos comunes incluyen ultrafiltración, adsorción sobre sulfato de bario y elución, y centrifugación. Por ejemplo, el medio bruto procedente de cultivos infectados puede aclararse en primer lugar mediante centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para eliminar desechos celulares y otra materia particulada grande, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. Opcionalmente, luego se centrifuga el sobrenadante del medio aclarado para que sedimenten los virus influenza, por ejemplo, a 15.000 x g, durante aproximadamente 3-5 horas. Tras la suspensión del sedimento de virus en un tampón apropiado, tal como STE (Tris-HCl 0,01 M; NaCl 0,15 M; EDTA 0,0001 M) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, se concentra el virus mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre sacarosa (60%-12%) o tartrato de potasio (50%-10%). Son adecuados gradientes o bien continuos o bien escalonados, por ejemplo, un gradiente de sacarosa de entre el 12% y el 60% en cuatro etapas del 12%. Los gradientes se centrifugan a una velocidad y durante un tiempo suficientes para que los virus se concentren en una banda visible para su recuperación. Alternativamente, y para aplicaciones comerciales a mayor escala, el virus se somete a elutriación a partir de gradientes de densidad usando un rotor de centrífuga zonal en modo continuo. Detalles adicionales suficientes para guiar a un experto a través de la preparación de virus influenza procedentes de cultivo tisular se proporcionan, por ejemplo, en Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza, págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines págs. 141-151, y patente de Estados Unidos n.º 5.690.937. Si se desea, los virus recuperados pueden almacenarse a -80ºC en presencia de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) como estabilizador.

Alternativamente, pueden emplearse sistemas de transcripción/traducción libres de células para producir polipéptidos que comprenden una secuencia o subsecuencia de aminoácidos o de, por ejemplo, las secuencias facilitadas en el presente documento tal como SEQ ID NO: 15-16, o codificarse mediante secuencias de polinucleótido, por ejemplo, SEQ ID NO: 5-6. Están comercialmente disponibles varios sistemas de transcripción y traducción in vitro. Una guía general para protocolos de transcripción y traducción in vitro se encuentra en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translación Protocols: Methods in Molecular Biology, Volumen 37, Garland Publishing, NY.

Además, los polipéptidos, o subsecuencias de los mismos, por ejemplo, subsecuencias que comprenden péptidos antigénicos, pueden producirse manualmente o usando un sistema automatizado, mediante síntesis de péptidos directa usando técnicas en fase sólida (véase, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Los sistemas automatizados a modo de ejemplo incluyen el sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA). Si se desea, pueden sintetizarse químicamente subsecuencias por separado, y combinarse usando métodos químicos para proporcionar polipéptidos de longitud completa.

Aminoácidos modificados

Los polipéptidos expresados descritos en el presente documento pueden contener uno o más aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa en, por ejemplo, (a) el aumento de la semivida en suero del polipéptido, (b) la reducción/aumento de la antigenicidad del polipéptido, (c) el aumento de la estabilidad en almacenamiento del polipéptido, etc. El(los) aminoácido(s) se modifican, por ejemplo, conjuntamente con la traducción o tras la traducción durante la producción recombinante (por ejemplo, glicosilación asociada al extremo N-terminal en motivos N-XS/T durante la expresión en células de mamífero) o se modifican mediante medios sintéticos (por ejemplo, a través de pegilación).

Los ejemplos no limitativos de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilado), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carboxilado, un aminoácido fosforilado, y similares, así como aminoácidos modificados mediante conjugación con, por ejemplo, restos lipídicos u otros agentes de derivatización orgánicos. Hay multitud de referencias bibliográficas adecuadas para guiar a un experto en la modificación de aminoácidos en la bibliografía. Los protocolos ejemplo se encuentran en Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJ.

Proteínas de fusión

También se describen en el presente documento proteínas de fusión que comprenden fusiones de las secuencias descritas en el presente documento (por ejemplo, que codifican para polipéptidos de HA y/o NA tal como se facilita a modo de ejemplo mediante las SEQ ID NO: 15-16) con, por ejemplo, inmunoglobulinas (o partes de las mismas), secuencias que codifican para, por ejemplo, GFP (proteína fluorescente verde), u otros marcadores similares, etc. Las proteínas de fusión se usan opcionalmente para, por ejemplo, aplicaciones similares (incluyendo, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas, profilácticas, diagnósticas, experimentales, etc., tal como se describe en el presente documento) a las de las proteínas de no fusión descritas en el presente documento. Además de la fusión con secuencias de inmunoglobulina y secuencias de marcador, las proteínas descritas en el presente documento también se fusionan opcionalmente con, por ejemplo, secuencias que permiten la clasificación de las proteínas de fusión y/o el direccionamiento de las proteínas de fusión hacia regiones, tipos celulares específicos, etc.

Anticuerpos

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden usarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos facilitados en el presente documento y/o polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos en el presente documento y variantes conservativas de los mismos. Anticuerpos específicos para los polipéptidos mencionados anteriormente son útiles, por ejemplo, para fines de diagnóstico y terapéuticos, por ejemplo, relacionados con la actividad, distribución y expresión de polipéptidos diana.

Pueden generarse anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en el presente documento mediante métodos bien conocidos en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab.

Los polipéptidos no requieren actividad biológica para la producción de anticuerpos (por ejemplo, no se requiere hemaglutinina o neuraminidasa funcionales de longitud completa). Sin embargo, el polipéptido u oligopéptido debe ser antigénico. Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos normalmente tienen una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 4 aminoácidos, y a menudo de al menos 5 ó 10 aminoácidos. Pueden fusionarse extensiones cortas de un polipéptido con otra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana y un anticuerpo producido frente a la molécula quimérica.

Los expertos en la técnica conocen numerosos métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales y pueden adaptarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en el presente documento y/o codificarse por la secuencia de polinucleótido descrita en el presente documento etc. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, Cuarta Edición, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y bibliografías citadas en ellos; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véanse, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Los antisueros y anticuerpos monoclonales y policlonales específicos se unirán habitualmente con una KD de, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 !M, al menos aproximadamente 0,01 !M o mejor y normalmente al menos aproximadamente 0,001 !M o mejor.

Para ciertas aplicaciones terapéuticas, son deseables anticuerpos humanizados. Métodos detallados para la preparación de anticuerpos quiméricos (humanizados) pueden encontrarse en la patente estadounidense 5.482.856. Detalles adicionales sobre la humanización y otras técnicas de producción y modificación por ingeniería genética de anticuerpos pueden encontrarse en Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2ª Edición, Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL en Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty), y Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul). Detalles adicionales en cuanto a procedimientos específicos pueden encontrarse, por ejemplo, en Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, patente estadounidense n.º 4.634.664, y Engelman et al., patente estadounidense n.º 4.634.666.

Definición de polipéptidos mediante inmunorreactividad

También se describen en el presente documento la generación de antisueros que se unen específicamente a los polipéptidos descritos en el presente documento así como los polipéptidos que se unen mediante tales antisueros.

Por ejemplo, se describen polipéptidos (por ejemplo, moléculas de HA y/o NA) que se unen específicamente a o que son específicamente inmunorreactivos con un anticuerpo o antisueros generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las secuencias facilitadas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 15-16), etc. Para eliminar la reactividad cruzada con otros homólogos, el anticuerpo o antisuero se extraen con las moléculas de HA y/o NA encontradas en bases de datos públicas en el momento de presentar, por ejemplo, el(los) polipéptido(s) “control”. Cuando las otras secuencias control corresponden a un ácido nucleico, se genera un polipéptido codificado por el ácido nucleico y se usa para fines de extracción de anticuerpo/antisueros.

En un formato típico, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se produjo contra uno o más polipéptidos que comprenden una o más de las secuencias correspondientes a las secuencias en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 15-16), etc. o una subsecuencia sustancial del mismo (es decir, al menos aproximadamente el 30% de la secuencia de longitud completa proporcionada). El conjunto de inmunógenos polipeptídicos potenciales derivados de las presentes secuencias se denomina colectivamente en lo sucesivo “polipéptidos inmunogénicos”. El antisuero resultante se selecciona opcionalmente para que tenga baja reactividad cruzada contra homólogos de hemaglutinina y/o neuraminidasa control y se elimina cualquier reactividad cruzada de este tipo, por ejemplo, mediante inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos de hemaglutinina y neuraminidasa control, antes del uso del antisuero policlonal en el inmunoensayo.

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, se produce y se purifica uno o más de los polipéptidos inmunogénicos tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede producirse una proteína recombinante en una célula recombinante. Se inmuniza una variedad endógama de ratones (usada en este ensayo porque los resultados son más reproducibles debido a la identidad genética virtual de los ratones) con la(s) proteína(s) inmunogénica(s) en combinación con un adyuvante convencional, tal como el adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones convencional (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción convencional de generación de anticuerpos, formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica). Pueden encontrarse bibliografía y comentarios adicionales de anticuerpos en el presente documento y pueden aplicarse en este caso para definir polipéptidos mediante inmunorreactividad. Alternativamente, uno o más polipéptido(s) sintético(s) o recombinante(s) derivados de las secuencias dadas a conocer en el presente documento se conjuga(n) con una proteína portadora y se usa(n) como inmunógeno.

Se recogen sueros policlonales y se titulan contra el polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con una o más de las proteínas inmunogénicas inmovilizadas sobre un soporte sólido. Se seleccionan antisueros policlonales con un título de 106 o mayor, se reúnen y se extraen con el(los) polipéptido(s) de hemaglutinina y/o neuraminidasa control para producir antisueros policlonales titulados, reunidos, extraídos.

Los antisueros policlonales titulados, reunidos, extraídos, se someten a prueba para determinar la reactividad cruzada contra el(los) homólogo(s) control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan condiciones de unión discriminatorias para los antisueros policlonales, titulados, extraídos, lo que da como resultado al menos aproximadamente una razón de señal con respecto a ruido de 5-10 veces superior para la unión de los antisueros policlonales titulados a los polipéptidos inmunogénicos, en comparación con la unión a los homólogos control. Es decir, la rigurosidad de la reacción de unión se ajusta mediante la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leche desnatada en polvo y/o mediante el ajuste de las condiciones salinas, la temperatura y/o similares. Estas condiciones de unión se usan en ensayos posteriores para determinar si un polipéptido de prueba (un polipéptido que se compara con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos control) se une específicamente mediante los antisueros policlonales extraídos reunidos. En particular, los polipéptidos de prueba que muestran al menos una razón de señal con respecto a ruido de 2-5x superior que los homólogos receptores control en condiciones de unión discriminatorias, y al menos aproximadamente un ½ de razón de señal con respecto a ruido en comparación con el(los) polipéptido(s) inmunogénico(s), comparten una similitud estructural sustancial con el polipéptido inmunogénico en comparación con el receptor conocido, etc.

En otro ejemplo, se usan inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la detección de un polipéptido de prueba. Por ejemplo, tal como se ha observado, se eliminan los anticuerpos de reactividad cruzada de la mezcla de antisueros reunidos mediante inmunoabsorbción con los polipéptidos control. El(los) polipéptido(s) inmunogénico(s) se inmoviliza(n) entonces a un soporte sólido que se expone a los antisueros reunidos extraídos. Las proteínas de prueba se añaden al ensayo para competir por unirse a los antisueros extraídos reunidos. La capacidad de la(s) proteína(s) de prueba para competir por unirse a los antisueros extraídos reunidos en comparación con la(s) proteínas(s) inmovilizada(s) se compara con la capacidad del(de los) polipéptido(s) inmunogénico(s) añadido(s) al ensayo para competir por unirse (los polipéptidos inmunogénicos compiten eficazmente con los polipéptidos inmunogénicos inmovilizados por unirse a los antisueros reunidos). Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas de prueba, usando cálculos convencionales.

En un ensayo paralelo, se determina opcionalmente la capacidad de la(s) proteína(s) control para competir por unirse a los antisueros extraídos reunidos en comparación con la capacidad del(de los) polipéptido(s) inmunogénico(s) para competir por unirse a los antisueros. De nuevo, se calcula el porcentaje de reactividad cruzada para el(los) polipéptido(s) control, usando cálculos convencionales. Cuando el porcentaje de reactividad cruzada es al menos 5-10x tan alto para los polipéptidos de prueba en comparación con el(los) polipéptido(s) control y/o cuando la unión de los polipéptidos de prueba está aproximadamente en el intervalo de la unión de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos de prueba se unen específicamente a los antisueros extraídos reunidos.

En general, los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos pueden usarse en un inmunoensayo de unión competitiva

tal como se describe en el presente documento para comparar cualquier polipéptido de prueba con el(los) poliéptido(s) inmunogénico(s) y/o control. Con el fin de realizar esta comparación, se someten a ensayo los polipéptidos inmunogénicos, de prueba y control en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada polipéptido requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros extraídos a, por ejemplo, una proteína inmovilizada inmunogénica, de prueba o control, usando técnicas convencionales. Si la cantidad del polipéptido de prueba requerida en el ensayo competitivo es menos de dos veces la cantidad del polipéptido inmunogénico que se requiere, entonces se dice que el polipéptido de prueba se une específicamente a un anticuerpo generado frente a la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 510x tan alta como para el polipéptido control.

Como una determinación adicional de la especificidad, el antisuero reunido se inmunoabsorbe opcionalmente de manera completa con el(los) polipéptido(s) inmunogénico(s) (en lugar de con el(los) polipéptido(s) control) hasta que se detecte poca o ninguna unión de los antisueros reunidos extraídos con polipéptido inmunogénico resultantes al(a los) polipéptido(s) inmunogénico(s) usado(s) en la inmunoabsorción. Este antisuero completamente inmunoabsorbido se somete entonces a prueba para determinar la reactividad con el polipéptido de prueba. Si se observa poca o ninguna reactividad (es decir, no más de 2x la razón de señal con respecto a ruido observada para la unión de los antisueros completamente inmunoabsorbidos al polipéptido inmunogénico), entonces el polipéptido de prueba se une específicamente mediante los antisueros provocados por la proteína inmunogénica.

VARIANTES DE SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO Y POLIPÉPTIDO

Variaciones silenciosas

Debido a la degeneración del código genético, se produce opcionalmente cualquiera de una variedad de secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos descritos en el presente documento, pudiendo portar algunas de las ellas niveles inferiores de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de HA y NA en el presente documento. A continuación se facilita una tabla de codones típicos que especifica el código genético, encontrada en muchos textos de biología y bioquímica.

Tabla 1

Tabla de codones

Aminoácidos

Codón

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

Ácido aspártico

Asp D GAC GAU

Ácido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

La tabla de codones muestra que muchos aminoácidos están codificados por más de un codón. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos para el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición en los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en los que una arginina está especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN se corresponde con T en una secuencia de ADN.

Tales “variaciones silenciosas” son una especie de “variaciones modificadas de manera conservativa” comentadas a continuación. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, que normalmente es el único codón para metionina, y TTG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse mediante técnicas convencionales de manera que codifique para un polipéptido funcionalmente idéntico. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido está implícita en cualquier secuencia descrita. La descripción, por tanto, proporciona explícitamente todas y cada una de la las posibles variaciones de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido descrito en el presente documento que podrían realizarse seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones. Estas combinaciones se realizan según el código genético de tripletes convencional (por ejemplo, tal como se expone en la tabla 1, o tal como está comúnmente disponible en la técnica) tal como se aplica a la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de hemaglutinina o neuraminidasa descrito en el presente documento. Todas estas variaciones de cada ácido nucleico en el presente documento se proporcionan específicamente y se describen teniendo en cuenta la secuencia en combinación con el código genético. Un experto en la técnica es completamente capaz de realizar estas sustituciones silenciosas usando los métodos en el presente documento.

Variaciones conservativas

Debido a la degeneración del código genético, las “sustituciones silenciosas” (es decir, sustituciones en una secuencia de ácido nucleico que no dan como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento que codifica para un aminoácido.

Las “variaciones conservativas” de una secuencia de ácido nucleico particular se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas. Finalmente, la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservativa del ácido nucleico básico.

Subsecuencias únicas de polipéptido y polinucleótido

También se describe en el presente documento un ácido nucleico que comprende una subsecuencia única en un ácido nucleico seleccionada de la secuencia de moléculas de HA y/o NA dada a conocer en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 5-6. La subsecuencia única es única en comparación con un ácido nucleico correspondiente a ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, los encontrados en GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación. La alineación puede realizarse usando, por ejemplo, la herramienta BLAST configurada con parámetros por defecto. Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, como sonda para identificar los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Véase anteriormente.

De manera similar, se describe en el presente documento un polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionada de la secuencia de moléculas de HA y/o NA dada a conocer en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 15-16. En este caso, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a, por ejemplo, el aminoácido correspondiente a las secuencias de polinucleótido encontradas en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación.

Además se describen ácidos nucleicos diana que hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido codificante único que codifica para una subsecuencia única en un polipéptido seleccionada de las secuencias de moléculas de HA y/o NA descritas en el presente documento, siendo la subsecuencia única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquiera de los polipéptidos de control (secuencias de, por ejemplo, los ácidos nucleicos correspondientes a los encontrados en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación). Las secuencias únicas se determinan tal como se indicó anteriormente.

Comparación, identidad y homología de secuencias

Los términos “idéntico” o “identidad” en porcentaje, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, tal como se mide usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos más adelante (u otros algoritmos disponibles para los expertos) o mediante inspección visual.

El término “sustancialmente idéntico,” en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, ADN que codifican para una molécula de HA o NA, o la secuencia de aminoácidos de una molécula de HA o NA) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de residuos de nucleótido o aminoácido de al menos aproximadamente el 90%, preferiblemente el 91%, lo más preferiblemente el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o más, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Normalmente se considera que tales secuencias “sustancialmente idénticas” son homólogas, sin hacer referencia a los ancestros reales. Preferiblemente, existe “identidad sustancial” a lo largo de una región de las secuencias de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 200 residuos de longitud, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 250 residuos, y lo más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 300 residuos, 350 residuos, 400 residuos, 425 residuos, 450 residuos, 475 residuos, 480 residuos, 490 residuos, 495 residuos, 499 residuos, 500 residuos, 502 residuos, 559 residuos, 565 residuos, o 566 residuos, o a lo largo de la longitud completa de las dos secuencias que van a compararse.

Para la comparación de secuencias y la determinación de la homología, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces la identidad de secuencias en porcentaje para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados del programa.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J Mol Biol 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de algoritmos tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o mediante inspección visual (véase generalmente, Ausubel et al., citado anteriormente).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia e identidad de secuencia en porcentaje es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990). El software para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que o bien corresponden o bien satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabras vecinas (véase, Altschul et al., citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye por debajo de la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un punto de corte de 100, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915).

Además de calcular la identidad de secuencia en porcentaje, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produciría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

Otro ejemplo de un algoritmo de alineación de secuencias útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas, por parejas. También puede representarse gráficamente un árbol que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS5:151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación puede alinearse entonces con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias pueden alinearse mediante una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas, por parejas. El programa también puede usarse para representar gráficamente un dendograma o representación en árbol de relaciones de agrupación. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias.

Un ejemplo adicional de un algoritmo que es adecuado para múltiples alineaciones de secuencias de aminoácidos o ADN es el programa CLUSTALW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW realiza múltiples comparaciones por parejas entre grupos de secuencias y las reúne en una alineación múltiple basada en la homología. Las penalizaciones por apertura de hueco y extensión de hueco pueden ser, por ejemplo, de 10 y 0,05, respectivamente. Para alineaciones de aminoácidos, puede usarse el algoritmo BLOSUM como matriz de pesos de proteínas. Véase, por ejemplo, Henikoffand Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1091510919.

SISTEMAS DIGITALES

Se describen adicionalmente sistemas digitales, por ejemplo, ordenadores, medios legibles por ordenador y sistemas integrados que comprenden cadenas de caracteres correspondientes a la información de secuencia en el presente documento para los ácidos nucleicos y polipéptidos aislados o recombinantes en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, las secuencias mostradas en el presente documento, y las diversas sustituciones silenciosas y sustituciones conservativas de las mismas. Los sistemas integrados pueden incluir además, por ejemplo, equipo de síntesis de genes para obtener genes correspondientes a las cadenas de caracteres.

Pueden usarse diversos métodos conocidos en la técnica para detectar homología o similitud entre diferentes cadenas de caracteres (véase anteriormente), o pueden usarse para realizar otras funciones deseables tales como para controlar archivos de salida, proporcionar la base para realizar presentaciones de información incluyendo las secuencias y similares. Los ejemplos incluyen BLAST, comentado anteriormente. Los sistemas informáticos pueden incluir tales programas, por ejemplo, conjuntamente con uno o más archivo(s) de datos o base(s) de datos que comprende(n) una secuencia tal como se indica en el presente documento.

Por tanto, pueden detectarse y reconocerse diferentes tipos de homología y similitud de diversa rigurosidad y longitud entre diversas secuencias o fragmentos de HA o NA, etc. en los sistemas integrados en el presente documento. Por ejemplo, se han diseñado muchos métodos de determinación de la homología para el análisis comparativo de secuencias de biopolímeros, para la “corrección ortográfica” en el procesamiento de textos y para la recuperación de datos de diversas bases de datos. Con comprensión de las interacciones complementarias por parejas de la doble hélice entre 4 nucleobases principales en los polinucleótidos naturales, también pueden usarse modelos que simulan la hibridación de cadenas de polinucleótidos homólogos complementarios como base de la alineación de secuencias u otras operaciones realizadas normalmente en las cadenas de caracteres correspondientes a las secuencias en el presente documento (por ejemplo, manipulaciones del procesamiento de palabras, construcción de figuras que comprenden cadenas de caracteres de secuencia o subsecuencia, tablas de salida, etc.).

Por tanto, pueden adaptarse aplicaciones de sobremesa convencionales tales como software de procesamiento de textos (por ejemplo, Microsoft Word™ o Corel WordPerfect™) y software de bases de datos (por ejemplo, software de hojas de cálculo tal como Microsoft Excel™, Corel Quattro Pro™, o programas de bases de datos tales como Microsoft Access™, Paradox™, GeneWorks™, o MacVector™ u otros programas similares) introduciendo una cadena de caracteres correspondiente a uno o más polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento (o bien ácidos nucleicos o bien proteínas, o ambos). Por ejemplo, un sistema puede incluir el software anterior que tiene la información de cadena de caracteres apropiada, por ejemplo, usado conjuntamente con una interfaz de usuario (por ejemplo, una GUI en un sistema operativo convencional tal como un sistema de Windows, Macintosh o LINUX) para manipular cadenas de caracteres correspondientes a las secuencias en el presente documento. Tal como se ha indicado, también pueden incorporarse programas de alineación especializados tales como BLAST en los sistemas descritos en el presente documento para la alineación de ácidos nucleicos o proteínas (o cadenas de caracteres correspondientes).

Los sistemas descritos en el presente documento incluyen normalmente un ordenador digital con conjuntos de datos introducidos en el sistema de software que comprenden cualquiera de las secuencias en el presente documento. El ordenador puede ser, por ejemplo, un PC (máquina basada en DOS™, OS2™ WINDOWS™, WINDOWSNT™, WINDOWS95™, WINDOWS2000™, WINDOWS98™, LINUX compatible con un procesador Intel x86 o Pentium, una máquina basada en MACINTOSH™, Power PC o UNIX (por ejemplo, la estación de trabajo SUN™) u otro ordenador disponible comercialmente que conozca el experto. Se dispone del software para alinear o manipular de otro modo secuencias, o puede construirse fácilmente por un experto usando un lenguaje de programación convencional tal como Visualbasic, PERL, Fortran, Basic, Java o similares.

Cualquier controlador u ordenador incluye opcionalmente un monitor que a menudo es una pantalla de tubo de rayos catódicos (“CRT”), una pantalla de panel plano (por ejemplo, pantalla de cristal líquido de matriz activa, pantalla de cristal líquido), u otras. El conjunto de circuitos del ordenador a menudo se coloca en una caja que incluye numerosos chips de circuito integrado, tales como un microprocesador, memoria, circuitos de interfaz y otros. La caja también incluye opcionalmente una unidad de disco duro, una unidad de disco flexible, una unidad extraíble de alta capacidad tal como un CD-ROM grabable, y otros elementos periféricos comunes. Dispositivos de entrada tales como un teclado o un ratón proporcionan opcionalmente la introducción por parte de un usuario y que el usuario compare la selección de secuencias o las manipule de otro modo en el sistema informático relevante.

El ordenador incluye normalmente software apropiado para recibir instrucciones del usuario, o bien en forma de entrada de usuario en un campo de parámetros fijados, por ejemplo, en una GUI, o bien en forma de instrucciones programadas previamente, por ejemplo, programadas previamente para una variedad de operaciones específicas diferentes. El software convierte entonces estas instrucciones en lenguaje apropiado para instruir el funcionamiento, por ejemplo, de mecanismos o controladores de transporte apropiados para llevar a cabo la operación deseada. El software también puede incluir elementos de salida para controlar la síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, basándose en una secuencia o una alineación de secuencias en el presente documento); comparaciones de muestras para la expresión génica diferencial, u otras operaciones.

KITS Y REACTIVOS

También se describe un kit. Por ejemplo, un kit contiene uno o más ácido(s) nucleico(s), polipéptido(s), anticuerpo(s)

o línea(s) celular(es) descritos en el presente documento (por ejemplo, que comprenden, o con, una molécula de HA y/o NA descrita en el presente documento). El kit puede contener un ácido nucleico o polipéptido de diagnóstico, por ejemplo, un anticuerpo, conjunto de sonda, por ejemplo, como un microalineamiento de ADNc empaquetado en un envase adecuado, u otro ácido nucleico tal como uno o más vector(es) de expresión. El kit también puede comprender adicionalmente uno o más reactivos adicionales, por ejemplo, sustratos, marcadores, cebadores, para marcar productos de expresión, tubos y/u otros accesorios, reactivos para recoger muestras, tampones, cámaras de hibridación, cubreobjetos, etc. El kit comprende opcionalmente además un conjunto de instrucciones o manual de usuario que detalla los métodos preferidos de uso de los componentes del kit para el descubrimiento o la aplicación de conjuntos de diagnóstico, etc.

Cuando se usa según las instrucciones, el kit puede usarse, por ejemplo, para evaluar un estado o patología, para evaluar los efectos de un agente farmacéutico u otra intervención del tratamiento en la progresión de un estado o patología en una célula u organismo, o para su uso como vacuna, etc.

Se describen adicionalmente kits de sistema que incorporan los métodos, la composición, los sistemas y el aparato en el presente documento. Los kits de sistema comprenden opcionalmente uno o más de los siguientes: (1) un aparato, sistema, componente de sistema o componente de aparato; (2) instrucciones para poner en práctica los métodos descritos en el presente documento, y/o para hacer funcionar el aparato o componentes del aparato en el presente documento y/o para usar las composiciones en el presente documento. También se describe el uso de cualquier aparato, componente del aparato, composición o kit en el presente documento, para la puesta en práctica de cualquier método o ensayo en el presente documento, y/o para el uso de cualquier aparato o kit para poner en práctica cualquier ensayo o método en el presente documento.

Adicionalmente, los kits pueden incluir uno o más sistema(s) de traducción tal como se indicó anteriormente (por ejemplo, una célula) con material de empaquetamiento apropiado, envases para contener los componentes del kit, materiales de instrucciones para poner en práctica los métodos en el presente documento y/o similares. De manera similar, pueden proporcionarse productos de los sistemas de traducción (por ejemplo, proteínas tales como moléculas de HA y/o NA) en forma de kit, por ejemplo, con envases para contener los componentes del kit, materiales de instrucciones para poner en práctica los métodos en el presente documento y/o similares.

Para facilitar el uso de los métodos y las composiciones de la invención, pueden empaquetarse en forma de kit cualquiera de los componentes y/o composiciones de vacuna, por ejemplo, virus reagrupado en líquido alantoico, etc., y componentes adicionales, tales como, tampón, células, medio de cultivo, útiles para el empaquetamiento y la infección de los virus influenza para fines de vacuna experimental o terapéutica. Normalmente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para realizar los métodos de la invención, material de empaquetamiento y un envase.

Ejemplos

Construcción y análisis de vacunas y virus H5N1 ca

Se usaron diversas secuencias en el presente documento que comprenden las secuencias de HA/NA H5N1 para crear vacunas y virus influenza. Se alteraron las secuencias de HA en tales vacunas con respecto al tipo natural mediante la eliminación del sitio de escisión polibásico dentro de la HA. Se reagruparon las secuencias de HA/NA (en un reagrupamiento 6:2) con A/AA/6/60 (un virus att, ca, véase anteriormente).

Se usaron tres cepas de influenza HSN1 en este ejemplo: A/VN/1203/2004, A/HK/491/97 y A/HK/213/2003. Tales cepas también se denominan dentro de este ejemplo las cepas del 97, 03 y 04 basándose en las designaciones de sus años. La similitud en porcentaje de los genes de HA de estas tres cepas es del 95-96%. La figura 1 ilustra la modificación del sitio de escisión polibásico de una secuencia de HA a modo de ejemplo, las secuencias de HA del 04, usadas para construir los virus/vacunas. Tal como se estableció anteriormente, diversas realizaciones de la invención comprenden secuencias que tienen diferentes regiones del sitio de escisión polibásico eliminadas. Véase anteriormente.

Tal como se ha establecido, se usaron las secuencias de H5N1 modificadas (es decir, los genes del 97, 03 y 04 modificados) para construir virus con reagrupamiento 6:2 con A/AA/6/60. Se apreciará y se señala en otra parte en el presente documento que también podrían haberse usado otras estructuras principales deseables (por ejemplo, PR8, etc.).

En los reagrupamientos 6:2 de este ejemplo, las secuencias de genes de HA y NA se derivaron del virus original de tipo natural y los genes restantes se caracterizaron mediante análisis de secuencia derivado del virus original A/AA/6/60 ca. Los virus reagrupados se replicaron hasta 8,0-8,5 log10DICT50 en huevos. Sin embargo, se apreciará que un virus tal como se reivindica en el que el log10 DICT50 está comprendido entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 9,0, entre aproximadamente 7,5 y 8,5, o entre aproximadamente 8,0 y 8,5 también forma parte de la invención. Se limitó la capacidad de escisión de la HA modificada en los virus construidos por proteasas endógenas in vitro y los virus eran dependientes de tripsina (por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 ug/ml hasta aproximadamente 1,0 ug/ml) para el crecimiento. Los virus construidos eran sensibles a la temperatura in vitro.

Los virus reagrupados H5N1 ca (que tienen los genes de HA del 97, 03 o 04 modificados) no fueron altamente patógenos para pollos. Por ejemplo, cuando se inocularon pollos Plymouth Rock blancos SPF de 4 semanas de edad por vía intravenosa con una dilución 1:10 de virus de reserva (108-8,75 DICT50/ml) y se observaron durante 10 días, se observó que 8 de 8 pollos murieron en el plazo de 1-2 días cuando se usaron H5N1 97, 03 y 04 de tipo natural, mientras que murieron 0 de 8 pollos cuando se usaron virus reagrupados H5N1 ca. Tal como puede observarse en la figura 2, los virus reagrupados H5N1 ca administrados por vía intranasal no se replicaron en pollos.

Los virus reagrupados H5N1/AA ca tampoco fueron letales para los ratones. Véase la figura 3, que también muestra la DICT50 para las cepas de tipo natural H5N1. La figura 4 muestra que los virus reagrupados H5N1 ca 1997 y 2004 estaban restringidos en la replicación en ratones. La figura 5 muestra que los virus reagrupados H5N1 ca estaban restringidos en la replicación en pulmones de ratones.

En la figura 6 se muestra una comparación de los títulos de anticuerpos HAI séricos producidos en ratones tras una única dosis intranasal de vacuna (2003 ca en comparación con 2003 de tipo natural).

La figura 7 muestra mediciones similares, pero usando títulos de anticuerpos neutralizantes séricos.

La figura 8 muestra que los virus reagrupados H5N1 ca protegen a ratones de la exposición letal con 50, 500 ó 5.000 DL50 del virus H5N1 de tipo natural. La figura 9 muestra la eficacia de protección frente a la replicación pulmonar de virus de exposición H5N1 homólogos y heterólogos en ratones. Tal como puede observarse, los virus reagrupados ca se replicaron peor que los virus de tipo natural. La figura 10 muestra datos relacionados usando aparatos respiratorios superiores de ratones. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con exposiciones de homólogos y heterólogos (por ejemplo, someter a prueba si la vacuna del 2003 protege frente a una exposición del 2003 de tipo natural (homólogo) o si una vacuna del 2003 protege frente a una exposición del 1997 de tipo natural (heterólogo), etc.).

La figura 11 muestra la eficacia de protección conferida por la vacuna H5N1 ca 2004 frente a la exposición a alta dosis (105DICT50) con virus H5N1 de tipo natural homólogos o heterólogos en ratones. La figura 12 muestra la eficacia de protección conferida por las vacunas H5N1 ca 1997 y 2003 frente a la exposición a alta dosis (105DICT50) con virus de tipo natural H5N1 homólogos o heterólogos en ratones. La figura 13 muestra la eficacia de protección conferida por la vacuna H5N1 ca 2004 frente a dosis bajas o altas de exposición a virus de tipo natural H5N1 homólogos en ratones. Las figuras 11-13 demuestran que las vacunas sometidas a prueba podrían proteger frente a otros virus relacionados.

El ejemplo actual demuestra varios puntos relativos a vacunas/virus reagrupados H5N1 ca a modo de ejemplo de la invención. Se demostró que los virus reagrupados ca 97, 03 y 04 tienen fenotipo ts in vitro, pérdida de patogenicidad en pollos y atenuación en ratones. Se espera que la atenuación también esté presente en hurones. También se demostró la eficacia de protección y protección cruzada frente a la exposición letal y la propagación sistémica con virus de tipo natural en ratones. También se espera eficacia de protección y protecciones cruzadas frente a la replicación de virus de exposición de tipo natural en el aparato respiratorio de ratones.

Se contempla usar estos virus/vacunas (y similares) para determinar si la inmunogenicidad y la eficacia mejoran tras 2 dosis de vacuna; para evaluar la inmunogenicidad en primates no humanos; para evaluar la atenuación y la eficacia de la vacuna en hurones; para determinar la contribución de la inmunidad humoral y celular a la eficacia observada de las vacunas producidas en ratones; para determinar qué residuos de la HA 2003 contribuyen a la inmunogenicidad potenciada e introducirlos en las HA 1997 y 2004; y para determinar los efectos de delecionar el sitio de escisión de aminoácidos multibásico y de la constelación de genes.

SECUENCIAS

A/Vietnam/1203/04

Secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1203/04 H5 (SEQ ID NO:1)

Longitud de molécula completa: 1767 nt Secuencia de aminoácidos de A/Vietnam/1203/04 H5 (SEQ ID NO: 11) Longitud de molécula completa: 564 aa

Secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1203/04 N1 (SEQ ID NO: 2) Longitud de molécula completa: 1398 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Vietnam/1203/04 N1 (SEQ ID NO: 12) Longitud de molécula completa: 449 aa

A/Hong Kong/213/03

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/213/03 H5 (SEQ ID NO: 3) Longitud de molécula completa: 1767 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/213/03 H5 (SEQ ID NO: 13) Longitud de molécula completa: 564 aa

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/213/03 N1 (SEQ ID NO: 4) Longitud de molécula completa: 1458 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/213/03 N1 (SEQ ID NO: 14)

Longitud de molécula completa: 469 aa

A/Hong Kong/491/97 (HA) + A/Hong Kong/486/97 (NA)

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/491/97 H5 (SEQ ID NO: 5) Longitud de molécula completa: 1767 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/491/97 H5 (SEQ ID NO: 15) Longitud de molécula completa: 564 aa

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID NO: 6) Longitud de molécula completa: 1401 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID NO: 16) Longitud de molécula completa: 450 aa

A/Hong Kong/491/97 (Ser211) (HA) + A/Hong Kong/486/97 (NA)

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5 (SEQ ID NO: 7) Longitud de molécula completa: 1767 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/491/97 (Ser211) H5 (SEQ ID NO: 17) Longitud de molécula completa: 564 aa

Secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID NO: 8) Longitud de molécula completa: 1401 nt

Secuencia de aminoácidos de A/Hong Kong/486/97 N1 (SEQ ID NO: 18) Longitud de molécula completa: 450 aa

ca A/ck/Hong Kong/G9/97

Secuencia de nucleótidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 (SEQ ID NO: 9) Longitud de molécula completa: 1690 pb

Secuencia de aminoácidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 H9 (SEQ ID NO: 19) Longitud de molécula completa: 558 aa

Secuencia de nucleótidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2 (SEQ ID NO: 10) Longitud de molécula completa: 1428 pb

Secuencia de aminoácidos de ca A/ck/Hong Kong/G9/97 N2 (SEQ ID NO: 20) Longitud de molécula completa: 469 aa

RESUMEN DE DESIGNACIONES DE SEQ ID NO

SEQ ID NO

HA o NA NOMBRE DE LA CEPA Aminoácido o nucleótido

SEQ ID NO: 1

HA (H5) ca A/Vietnam/1203/04 Nucleótido

SEQ ID NO: 2

NA (N1) ca A/Vietnam/1203/04 Nucleótido

SEQ ID NO: 3

HA (H5) ca A/Hong Kong/213/03 Nucleótido

SEQ ID NO: 4

NA (N1) ca A/Hong Kong/213/03 Nucleótido

SEQ ID NO: 5

HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 Nucleótido

SEQ ID NO: 6

NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Nucleótido

SEQ ID NO: 7

HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) Nucleótido

SEQ ID NO: 8

NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Nucleótido

SEQ ID NO: 9

HA (H9) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Nucleótido

SEQ ID NO: 10

NA (N2) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Nucleótido

SEQ ID NO:11

HA (H5) ca A/Vietnam/1203/04 Aminoácido

SEQ ID NO: 12

NA (N1) ca A/Vietnam/1203/04 Aminoácido

SEQ ID NO: 13

HA (H5) ca A/Hong Kong/213/03 Aminoácido

SEQ ID NO: 14

NA (N1) ca A/Hong Kong/213/03 Aminoácido

SEQ ID NO: 15

HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 Aminoácido

SEQ ID NO: 16

NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Aminoácido

SEQ ID NO: 17

HA (H5) ca A/Hong Kong/491/97 (Ser211) Aminoácido

SEQ ID NO: 18

NA (N1) ca A/Hong Kong/486/97 Aminoácido

SEQ ID NO: 19

HA (H9) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Aminoácido

SEQ ID NO: 20

NA (N2) ca A/ck/Hong Kong/G9/97 Aminoácido

Lista de secuencias

5 <110> MedImmune Vaccines, Inc et al.

<120> VARIANTES DE HEMAGLUTININA Y NEURAMINIDASA DE INFLUENZA

<130> FL260

<150> 60/574.553

<151>

<150> 60/657.554 15 <151>

<160> 20

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1767

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 1

<210> 2

<211> 1398

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 2

<210> 3

<211> 1767

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 3

<210> 4

<211> 1458

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 4

<210> 5

<211> 1767

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 5

<210> 6

<211> 1401

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 6

<210> 7

<211> 1767

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 7

<210> 8

<211> 1401

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 8

<210> 9

<211> 1690

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 9

<210> 10

<211> 1428

<212> ADN

<213> Virus influenza

<400> 10

<210> 11

<211> 564

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 11

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 12

<210> 13

<211> 564

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 13

<210> 14

<211> 469

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 14

<210> 15

<211> 564

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 15

<210> 16

<211> 450

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 16

<210> 17

<211> 564

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 17

<210> 18

<211> 450

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 18

<210> 19

<211> 558

<212> RRT

<213> Virus influenza

<400> 19

<210> 20

<211> 469

<212> PRT

<213> Virus influenza

<400> 20

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un virus influenza con reagrupamiento 6:2, en donde dicho virus comprende 6 regiones codificantes de genes que codifican para segmentos de genoma internos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 regiones codificantes de genes que codifican para un polipéptido de hemaglutinina y un polipéptido de neuraminidasa, en el que el polipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, el gen que codifica para el polipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y el polipéptido de neuraminidasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

2. 2.

   Una composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza reagrupado según la reivindicación 1.

3. 3.

   Una vacuna contra influenza atenuada viva que comprende la composición según la reivindicación 2.

4. 4.

   Una vacuna de virus dividido o virus inactivado que comprende la composición inmunogénica según la reivindicación 2.

5. 5.

   Virus influenza reagrupado según la reivindicación 1 o composición inmunogénica según la reivindicación 2, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario de un sujeto para producir una respuesta inmunitaria protectora contra el virus influenza, en donde el virus influenza reagrupado se administra al sujeto en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un vehículo fisiológicamente eficaz.

6. 6.

   Virus influenza reagrupado según la reivindicación 1 o composición inmunogénica según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento profiláctico de una infección viral en un sujeto, en donde el virus influenza reagrupado se administra al sujeto en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica contra la infección viral.

7. 7.

   Un método para producir virus influenza en cultivo celular, comprendiendo el método:

   i) introducir en una población de células huésped, población de células huésped que puede soportar la replicación de virus influenza, una pluralidad de vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden a:

   al menos 6 segmentos internos de genoma de la cepa de influenza A/Ann Arbor/6/60;

   y al menos 2 regiones codificantes de genes que codifican para un polipéptido de hemaglutinina y un polipéptido de neuraminidasa,

   en el que el polipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, el gen que codifica para el polipéptido de hemaglutinina comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y el polipéptido de neuraminidasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16;

   ii) cultivar la población de células huésped en presencia de tripsina a una temperatura inferior o igual a 35ºC; y,

   iii) recuperar una pluralidad de virus influenza.