ES2953393T3 - Vacunas contra el virus de la influenza y sus usos - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina de la gripe, incluidos polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe quiméricos, y polipéptidos de hemaglutinina de la gripe que comprenden sitios de glicosilación modificados y sitios de glicosilación no naturales, composiciones que los comprenden, vacunas que los comprenden y métodos de su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el virus de la influenza y sus usos
1. Introducción
En el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina de la gripe, por ejemplo, polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quiméricos, y composiciones que los comprenden, vacunas que los comprenden y métodos para su uso.
2. Antecedentes
Los virus de la influenza son virus de ARN envueltos que pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae (Palese y Shaw (2007)) Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication, 5a ed. Fields' Virology, editado por B.N. Fields, D. M. Knipe y P.M. Howley. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, EE. UU., pág. 1647-1689). El anfitrión natural de los virus de la influenza A son principalmente las aves, pero los virus de la influenza A (incluidos los de origen aviar) también pueden infectar y causar enfermedades en seres humanos y otros anfitriones animales (murciélagos, cánidos, cerdos, caballos, mamíferos marinos y mustélidos). Por ejemplo, el virus de la influenza aviar A H5N1 que circula en Asia se ha encontrado en cerdos en China e Indonesia y también ha ampliado su rango de anfitriones para incluir gatos, leopardos y tigres, que generalmente no se han considerado susceptibles a la influenza A (CIDRAP - Avian Influenza: Agricultural and Wildlife Considerations). La aparición de infecciones por el virus de la influenza en animales podría potencialmente dar lugar a cepas de influenza pandémica humana.
Los virus de la influenza A y B son los principales patógenos humanos y causan una enfermedad respiratoria cuya gravedad varía de una infección subclínica a una neumonía viral primaria que puede causar la muerte. Los efectos clínicos de la infección varían según la virulencia de la cepa de influenza y la exposición, los antecedentes, la edad y el estado inmunitario del anfitrión. La morbilidad y mortalidad acumuladas causadas por la influenza estacional son sustanciales debido a la tasa de ataque relativamente alta. En una temporada normal, la influenza puede causar entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave y hasta 500000 muertes en todo el mundo (Organización Mundial de la Salud (2003) Influenza: Overview; marzo de 2003). En los Estados Unidos, los virus de la influenza infectan a 10-15% estimado de la población (Glezen y Couch RB (1978) Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76. N Engl J Med 298: 587-592; Fox et al. (1982) Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern of infection in invaded households and relation of age and prior antibody to occurrence of infection and related illness. Am J Epidemiol 116: 228-242) y están asociados con aproximadamente 30.000 muertes cada año (Thompson WW et al. (2003) Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syncytial Virus in the United States. JAMA 289: 179-186; Belshe (2007) Translational research on vaccines: influenza as an example. Clin Pharmacol Ther 82: 745-749).
Además de las epidemias anuales, los virus de la influenza son la causa de pandemias poco frecuentes. Por ejemplo, los virus de influenza A pueden causar pandemias tales como las que ocurrieron en 1918, 1957, 1968 y 2009. Debido a la falta de inmunidad preformada contra el principal antígeno viral, la hemaglutinina (HA), la influenza pandémica puede afectar a más de 50% de la población en un solo año y a menudo causa una enfermedad más grave que la influenza epidémica. Un claro ejemplo es la pandemia de 1918, en donde se estima que murieron entre 50 y 100 millones de personas (Johnson and Mueller (2002) Updating the Accounts: Global Mortality of the 1918-1920 "Spanish" Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76: 105-115). Desde la aparición del virus de la influenza aviar altamente patógeno H5N1 a fines de la década de 1990 (Claas et al. (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351: 472-7), ha habido preocupaciones de que pueda ser el próximo virus pandémico. Adicionalmente, las cepas H7 y H9 son candidatas para nuevas pandemias ya que estas cepas infectan a seres humanos en ocasiones.
Una forma eficaz de protegerse contra la infección por el virus de la influenza es a través de la vacunación; sin embargo, los enfoques de vacunación actuales se basan en lograr una buena coincidencia entre las cepas circulantes y los productos aislados incluidos en la vacuna. Tal coincidencia es a menudo difícil de lograr debido a una combinación de factores. En primer lugar, los virus de la influenza están en constante cambio: cada 3 a 5 años, la cepa predominante del virus de la influenza A es reemplazada por una variante que ha experimentado suficiente deriva antigénica para evadir las respuestas de anticuerpos existentes. Por lo tanto, los productos aislados que se incluirán en las preparaciones de vacunas deben seleccionarse cada año en función de los esfuerzos intensivos de vigilancia de los centros colaboradores de la Organización Mundial de la Salud (OMS). En segundo lugar, para permitir suficiente tiempo para la fabricación y distribución de vacunas, las cepas deben seleccionarse aproximadamente seis meses antes del inicio de la temporada de influenza. A menudo, las predicciones del comité de selección de cepas de vacunas son inexactas, lo que da como resultado una caída sustancial en la eficacia de la vacunación. El documento WO 2010/148511 se refiere a partículas similares a virus (VLP) que comprenden hemaglutinina (HA). Las VLP se fabrican en plantas y proporcionan una reacción inmunitaria más fuerte en comparación con las vacunas de virus vivos atenuados. El documento WO 2010/148511 no proporciona un virus que codifique un polipéptido de HA recombinante. Horimoto et al. J VIROL, vol. 77, núm. 14 de julio de 2003 proporciona construcciones quiméricas de HA que consisten en la HA1 completa de un virus de influenza B y la HA2 completa de un virus de influenza A. Horimoto et al. muestran que los virus quiméricos que portan HA1 y HA2 heterólogos no logran inducir la fusión celular y son biológicamente inactivos.
La posibilidad de que un nuevo subtipo del virus de la influenza A ingrese a la población humana también presenta un desafío importante para las estrategias de vacunación actuales. Dado que es imposible predecir qué subtipo y cepa del virus de la influenza causarán la próxima pandemia, los enfoques actuales específicos de la cepa no se pueden utilizar para preparar una vacuna contra la influenza pandémica.
3. Compendio
En el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe que inducen una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra el dominio de tallo de HA conservado (a veces denominado en el presente documento dominio de "tronco") de los virus de la influenza. En un aspecto, la invención se refiere al diseño y la construcción de polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza que tienen un tronco de HA estable que muestra una cabeza de HA globular heteróloga con respecto al tronco (es decir, polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento). Los inmunógenos de HA diseñados para la vacunación comparten la región del tronco de HA, pero son muy divergentes en sus cabezas globulares. Tales construcciones se modifican en formulaciones de vacunas tales como virus de influenza vivos, virus de influenza muertos, virus/partículas similares a virus ("VLP"), vacunas de subunidades, vacunas divididas, etc., que provocan anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el tronco de HA conservado. Tales vacunas "universales" se pueden utilizar para inducir y/o potenciar respuestas inmunitarias de protección cruzada entre los subtipos del virus de la influenza.
A modo de antecedente, los anticuerpos neutralizantes contra los virus de la influenza se dirigen a la glicoproteína HA y previenen el paso de unión o fusión involucrado en la entrada viral. La exposición a los virus de la influenza provoca dos subconjuntos básicos de anticuerpos neutralizantes: los dirigidos a la cabeza globular específica de la cepa (un dominio que no está conservado en las diversas cepas y subtipos del virus de la influenza) y los dirigidos al tallo altamente conservado de la glicoproteína HA. La cabeza globular de HA no conservada porta los epítopos inmunodominantes. Sin vincularse a ninguna teoría, se cree que los anticuerpos anti-cabeza globular específicos de la cepa son más potentes que los anticuerpos anti-tallo, lo que explica la inmunidad en gran medida específica de la cepa conferida por la infección con las vacunas actuales.
La invención se basa, en parte, en las estrategias de diseño racional de los autores de la presente invención para las vacunas contra el virus de la influenza que provocan anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el tallo de HA. A este respecto, el inmunógeno quimérico de HA está diseñado para compartir un dominio de tronco relativamente bien conservado de exposiciones/vacunaciones anteriores, pero contiene una cabeza globular de HA heteróloga, preferiblemente una a la que el individuo que se desea vacunar no ha sido expuesto previamente. La exposición a esta construcción debería potenciar principalmente los anticuerpos dirigidos al tallo de HA conservado. Las inmunizaciones repetidas con el tallo de HA conservado y el cambio de la cabeza globular deberían inducir anticuerpos robustos de neutralización cruzada contra la región del tallo común de HA.
Al diseñar las construcciones quiméricas de HA, se debe tener cuidado de mantener la estabilidad de la proteína resultante. En este sentido, se recomienda que se mantengan los restos de cisteína identificados como Ap y Aq en la Fig. 1, ya que contribuyen a la estabilidad del tronco de HA, como se analiza con más detalle en la Sección 5.1 más abajo. Para obtener la mejor estabilidad, se prefiere "intercambiar" el dominio globular de HA como un todo (entre los restos de cisteína Ap y Aq como se muestra en la Fig. 1) ya que la conformación resultante sería la más cercana a la estructura nativa. En otras palabras, el "conector" al que se hace referencia en la Sección 5.1.2 puede ser el dominio de cabeza globular completo de una HA heteróloga.
En lugar de "intercambiar" la cabeza globular nativa del tronco de HA, la cabeza globular puede hacerse heteróloga con respecto al tronco conservado alterando los bucles que contribuyen a los epítopos de la cabeza globular de la HA. Es posible que este enfoque no funcione tan bien para generar la respuesta inmunitaria deseada contra el tronco conservado, a menos que la cabeza globular alterada esté diseñada para ser muy diferente de la cabeza de HA globular nativa, especialmente cuando se utiliza una HA a la que la población ha estado expuesta. Sin embargo, tales alteraciones pueden lograrse, p. ej., alterando la mayoría de los cinco bucles que contribuyen a los epítopos de cabeza globular de HA. En un enfoque útil, los cinco bucles se pueden modificar. Alternativamente, o, además, los epítopos en los cinco bucles se pueden enmascarar introduciendo sitios de glicosilación en el dominio de cabeza globular.
Las construcciones utilizadas para la vacunación se pueden diseñar ventajosamente para los sujetos/población particular que se vayan a vacunar. Hay tres subtipos de influenza a los que los seres humanos que viven hoy en día han estado expuestos: los subtipos H1, H2 y H3. Los virus de influenza del subtipo H2 desaparecieron de la población en 1968, mientras que los virus de influenza de los subtipos H1 y H3 persisten en la población hasta el día de hoy. Como resultado, los adultos que viven hoy que nacieron antes de 1968 probablemente hayan estado expuestos a cada uno de los subtipos H1, H2 y H3. En contraste, los adultos que viven hoy que nacieron después de 1968 probablemente solo hayan estado expuestos a los subtipos H1 y H3.
Por lo tanto, en realizaciones preferidas para la vacunación de adultos, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza quiméricos no poseen un dominio de cabeza globular de HA de un virus de la influenza de subtipo H1, H2 o H3, pero poseen un dominio de tallo de la HA de uno de estos tres subtipos. La cabeza globular heteróloga se puede seleccionar entre la HA de cualquier subtipo no H1, no H2 o no H3. Asimismo, las construcciones quiméricas separadas elaboradas
utilizando tallos H1/H2, por un lado, y tallos H3 por el otro se pueden utilizar beneficiosamente en un programa de vacunación -- los subtipos H1 y H2 son subtipos de HA del Grupo 1 que comparten un dominio de tronco conservado; mientras que H3 es un subtipo del Grupo 2 que tiene un dominio de tronco que es estructuralmente diferente del tronco del Grupo 1. El uso de construcciones H1 y H3 garantizaría la generación/potenciación de una respuesta inmunitaria contra cada dominio de tallo. La inmunización de sujetos adultos con tales polipéptidos de hemaglutinina de influenza quiméricos aumentará la respuesta inmunitaria de memoria del sujeto, lo que dará como resultado la producción a gran escala de anticuerpos de dominio anti-tallo ampliamente neutralizantes y con reacción cruzada que brindan inmunidad duradera al virus de la influenza al sujeto.
Los lactantes que no han estado expuestos, por supuesto, no han tenido contacto con ninguno de los subtipos del virus de la influenza. Como resultado, se puede construir una amplia gama de combinaciones de tallo/cabeza globular de HA para su uso en vacunas para lactantes. En una realización preferida, se pueden vacunar lactantes sin exposición previa con construcciones preparadas utilizando el tronco de HA de una cepa del Grupo 1 (H1 o H2) o del Grupo 2 (H3) y una cabeza globular de una cepa heteróloga; es decir, cepas no H1, no H2 y/o no H3. Se pueden utilizar ventajosamente tres construcciones de HA quiméricas diferentes para cada tronco de HA en tres vacunaciones secuenciales para inducir una respuesta de protección cruzada.
Los polipéptidos de hemaglutinina de la influenza quiméricos utilizados para la vacunación también pueden diseñarse ventajosamente para provocar eficazmente anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el dominio de tallo de HA en un sujeto mediante la adición o modificación de sitios de glicosilación en estos polipéptidos. Se cree que la glicosilación del dominio de cabeza globular y tallo de HA puede enmascarar sitios antigénicos, permitiendo así que un virus de la influenza evada una respuesta inmunitaria dentro de un sujeto. Sin embargo, dentro del contexto de un polipéptido de HA del virus de la influenza, la glicosilación dentro del dominio de tallo del polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza puede obstaculizar o prevenir las respuestas inmunitarias deseadas contra las regiones antigénicas dentro de este dominio que están protegidas por la glicosilación. Por lo tanto, en ciertas realizaciones preferidas, el polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza comprende uno o más sitios de glicosilación modificados que interrumpen la unión de glicano al dominio de tallo, haciendo así que el dominio de tallo sea más accesible para provocar una respuesta inmunitaria. Para aumentar aún más la inmunogenicidad del dominio de tallo, las construcciones pueden comprender adicionalmente sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular que, cuando se glicosilan, protegen las regiones antigénicas inmunodominantes que se encuentran en el dominio de cabeza globular para que no provoquen una respuesta inmunitaria. Un ejemplo de sitios de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación al dominio de cabeza globular de un virus de la influenza HA de un subtipo, en donde el sitio de glicosilación se encuentra naturalmente en el dominio de cabeza globular de una HA de un virus de la influenza de otro subtipo. Otro ejemplo de un sitio de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación al dominio de cabeza globular de un virus de influenza HA de una cepa, en donde el sitio de glicosilación se encuentra naturalmente en la cabeza globular de una HA de otra cepa del virus de la influenza. Otro ejemplo más de un sitio de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación a la cabeza globular de una HA de una cepa, en donde el sitio de glicosilación no se encuentra naturalmente en la cabeza globular de una HA de otro subtipo o cepa de virus de la influenza. Aunque no se desea vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que la glicosilación adicional dentro del dominio de cabeza globular aumentará la respuesta inmunitaria al dominio de tallo conservado, al tiempo que reduce la respuesta inmunitaria al dominio de cabeza globular.
Debe entenderse que el uso de los polipéptidos de hemaglutinina de influenza quiméricos divulgados en el presente documento es ventajoso porque (i) dichos polipéptidos son altamente estables (debido a que poseen un dominio de cabeza globular intacto) y (ii) los sistemas inmunológicos de los sujetos a los que se les administran dichos polipéptidos no han estado expuestos previamente a los dominios de cabeza globular de la hemaglutinina quimérica de la influenza, pero han estado expuestos a los epítopos conservados de los dominios del tallo de hemaglutinina quimérica de la influenza.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza y polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza no quiméricos) que comprende un dominio de tallo que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados que interrumpen la unión de glicano al dominio de tallo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza y polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza no quiméricos) que comprende un dominio de cabeza globular que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporciona un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza y polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza no quiméricos) que comprende (1) un dominio de tallo que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados que interrumpen la unión de glicano al dominio de tallo; y (2) un dominio de cabeza globular que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA, en donde: (1) el dominio de cabeza globular de HA es heterólogo con respecto al dominio de tallo de HA; y (2) el dominio de tallo de HA comprende uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, y en donde Xaa es cualquier aminoácido. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza globular de HA comprende adicionalmente uno o más sitios de glicosilación de origen no natural que tienen una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza no quimérico que comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA, en donde: (1) el dominio de cabeza globular de HA es homólogo al dominio de tallo de HA, y (2) el dominio de tallo de HA comprende uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, en donde Xaa es cualquier aminoácido.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende: un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el dominio polipeptídico del dominio de tallo de HA del virus de la influenza comprende adicionalmente uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, y en donde Xaa es cualquier aminoácido.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende: un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el dominio polipeptídico del dominio de tallo de HA del virus de la influenza comprende adicionalmente uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, y en donde Xaa es cualquier aminoácido.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende: un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el dominio polipeptídico del dominio de tallo de HA del virus de la influenza comprende adicionalmente uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, y en donde Xaa es cualquier aminoácido.
En otra realización, se proporciona en el presente documento un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende: un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende, conectados en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un primer conector de 1 a 50 restos heterólogos, un segmento de tallo intermedio de HA1, un segundo conector de 1 a 50 restos heterólogos y un segmento de tallo C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el dominio polipeptídico del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza comprende adicionalmente uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación que interrumpe/interfiere en la unión de un glicano al sitio de glicosilación en el dominio de tallo. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene una secuencia de
aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, y en donde Xaa es cualquier aminoácido.
Los Ejemplos de trabajo (p. ej., Sección 6, Ejemplos) demuestran, entre otras cosas, la construcción de un polipéptido de HA quimérica de influenza que comprende un tallo de HA y que muestra una cabeza de HA heteróloga, y la producción de una proteína de HA quimérica estable a partir de este polipéptido que reacciona de forma cruzada con anticuerpos contra el dominio de tallo y el dominio de cabeza. Los ejemplos de trabajo también ilustran el uso de tales construcciones en la generación de una respuesta inmunitaria protectora en sujetos frente a múltiples cepas y subtipos diferentes del virus de la influenza, es decir, los ejemplos demuestran que los polipéptidos quiméricos de HA de la influenza divulgados en el presente documento pueden utilizarse como una vacuna universal contra la influenza. Además, los Ejemplos de trabajo (p. ej., Sección 6.11, Ejemplo 11) demuestran la construcción de polipéptidos de HA de la gripe que comprenden un dominio de tallo de HA con uno o más sitios de glicosilación modificados y/o un dominio de cabeza globular de HA con uno o más sitios de glicosilación de origen no natural, en donde los sitios de glicosilación modificados son modificaciones de uno o más sitios de glicosilación que se producen de forma natural que interrumpen la capacidad de un glicano para anclarse a los sitios de glicosilación. Los Ejemplos de trabajo (véase la Sección 6.11, Ejemplo 11) también demuestran la capacidad de estos polipéptidos de HA de influenza para provocar un aumento de la respuesta inmunitaria frente al dominio de tronco conservado de un virus de la influenza.
3.1 Terminología
Los términos "alrededor de" o "aproximado", cuando se emplean en referencia a una posición de aminoácido, se refieren a la posición particular de aminoácido en una secuencia o cualquier aminoácido que se encuentre a cinco, cuatro, tres, dos o un resto de esa posición de aminoácido, ya sea en una dirección N-terminal o en una dirección C-terminal.
Como se emplea en el presente documento, los términos "alrededor de" o "aproximadamente" cuando se emplean junto con un número se refieren a cualquier número a 1,5 o 10% del número de referencia. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" abarca el número exacto mencionado.
El término "identidad de secuencia de aminoácidos" se refiere al grado de identidad o similitud entre un par de secuencias de aminoácidos alineadas, normalmente expresado como un porcentaje. El porcentaje de identidad es el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos (es decir, los restos de aminoácidos en una posición dada en el alineamiento son el mismo resto) o similares (es decir, la sustitución de aminoácidos en una posición dada en el alineamiento es una sustitución conservativa, como se analiza a continuación), al resto de aminoácido correspondiente en el péptido después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología de secuencia. La homología de secuencias, incluidos los porcentajes de identidad y similitud de secuencias, puede determinarse utilizando mecanismos de alineamiento de secuencias bien conocidos en la técnica, preferiblemente algoritmos informáticos diseñados para este fin, utilizando los parámetros predeterminados de dichos algoritmos informáticos o los paquetes de soporte lógico que los contienen. Los ejemplos no limitantes de algoritmos informáticos y paquetes de soporte lógico que incorporan tales algoritmos incluyen los siguientes. La familia de programas BLAST ilustra un ejemplo particular, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias (p. ej., Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:2264-2268 (modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5873-5877), Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410, (que describen NBLAST y XBLAST), Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (que describen Gapped BLAST y PSI-Blast). Otro ejemplo particular es el algoritmo de Myers y Miller (1988 CABIOS 4:11-17) que está incorporado en el programa ALlGN (versión 2.0) y está disponible como parte del paquete de soporte lógico de alineamiento de secuencias GCG. También es particular el programa FASTA (Pearson W.R. y Lipman D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:2444-2448, 1988), disponible como parte del Wisconsin Sequence Analysis Package. Los ejemplos adicionales incluyen BESTFIT, que utiliza el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981) para encontrar la mejor región única de similitud entre dos secuencias, y cuál es preferible cuando las dos secuencias que se comparan tienen una longitud diferente; y GAP, que alinea dos secuencias encontrando una "similitud máxima" según el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J. Mol. Biol.48:443-354, 1970), y es preferible cuando las dos secuencias tienen aproximadamente la misma longitud y se espera un alineamiento en toda la longitud.
Sustitución conservativa se refiere al reemplazo de un aminoácido de una clase por otro aminoácido de la misma clase. En realizaciones particulares, una sustitución conservativa no altera la estructura o función, o ambas, de un polipéptido. Las clases de aminoácidos para fines de sustitución conservativa incluyen hidrófobos (Met, Ala, Val, Leu, Ile), hidrófilos neutros (Cys, Ser, Thr), ácidos (Asp, Glu), alcalinos (Asn, Gln, His, Lys, Arg), disruptores de conformación (Gly, Pro) y aromáticos (Trp, Tyr, Phe).
Como se emplea en el presente documento, el término "fragmento" en el contexto de una secuencia de ácido nucleico se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende una porción de nucleótidos consecutivos de una secuencia parental. En una realización específica, el término se refiere a una secuencia de nucleótidos de 5 a 15, 5 a 25, 10 a 30, 15 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia parental. En otra realización, el término se refiere a una secuencia de nucleótidos de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 o 475
nucleótidos consecutivos de una secuencia parental.
Como se emplea en el presente documento, el término "fragmento" en el contexto de una secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende una porción de restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental. En una realización específica, el término se refiere a una secuencia de aminoácidos de 2 a 30, 5 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 o más restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental. En otra realización, el término se refiere a una secuencia de aminoácidos de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175 o 200 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental.
Como se emplea en el presente documento, los términos "enfermedad" y "trastorno" se utilizan indistintamente para referirse a una afección en un sujeto. En algunas realizaciones, la afección es una infección viral. En realizaciones específicas, el término "enfermedad" se refiere al estado patológico resultante de la presencia del virus en una célula o sujeto, o la invasión de una célula o sujeto por el virus. En ciertas realizaciones, la afección es una enfermedad en un sujeto, cuya gravedad disminuye al inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto mediante la administración de una composición inmunogénica.
Como se emplea en el presente documento, el término "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de una terapia a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que tiene efectos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas realizaciones, una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de una terapia a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) reducir o mejorar la gravedad de una infección por virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (ii) reducir la duración de una infección por virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (iii) prevenir la progresión de una infección por virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (iv) causar la regresión de una infección por el virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (v) prevenir el desarrollo o la aparición de una infección por virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (vi) prevenir la recurrencia de una infección por virus de la influenza, enfermedad o síntoma asociados con la misma; (vii) reducir o prevenir la propagación de un virus de influenza de una célula a otra célula, de un tejido a otro tejido o de un órgano a otro órgano; (ix) prevenir o reducir la propagación de un virus de influenza de un sujeto a otro sujeto; (x) reducir el fallo orgánico asociado con una infección por el virus de la influenza; (xi) reducir la hospitalización de un sujeto; (xii) reducir la duración de la hospitalización; (xiii) aumentar la supervivencia de un sujeto con una infección por el virus de la influenza o una enfermedad asociada con la misma; (xiv) eliminar una infección por el virus de la influenza o una enfermedad asociada con la misma; (xv) inhibir o reducir la replicación del virus de la influenza;
(xvi) inhibir o reducir la entrada de un virus de la influenza en una o varias células anfitrionas; (xviii) inhibir o reducir la replicación del genoma del virus de la influenza; (xix) inhibir o reducir la síntesis de proteínas del virus de la influenza;
(xx) inhibir o reducir el ensamblaje de partículas del virus de la influenza; (xxi) inhibir o reducir la liberación de partículas del virus de la influenza desde una o varias células anfitrionas; (xxii) reducir el título del virus de la influenza; y/o (xxiii) aumentar o mejorar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
En ciertas realizaciones, la cantidad eficaz no da como resultado una protección completa frente a una enfermedad por el virus de la influenza, pero da como resultado un título más bajo o un número reducido de virus de la influenza en comparación con un sujeto no tratado. En ciertas realizaciones, la cantidad eficaz da como resultado una reducción de 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 125 veces reducción de 150 veces, 175 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 750 veces o 1.000 veces o más en el título del virus de la influenza con respecto a un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz da como resultado una reducción en el título del virus de la influenza con respecto a un sujeto no tratado de aproximadamente 1 log o más, aproximadamente 2 log o más, aproximadamente 3 log o más, aproximadamente 4 log o más, aproximadamente 5 log o más más, aproximadamente 6 registros o más, aproximadamente 7 registros o más, aproximadamente 8 registros o más, aproximadamente 9 registros o más, aproximadamente 10 registros o más, de 1 a 3 log, de 1 a 5 log, de 1 a 8 log, de 1 a 9 log, de 2 a 10 log, de 2 a 5 log, de 2 a 7 log, de 2 a 8 log, de 2 a 9 log, de 2 a 10 log, de 3 a 5 log, de 3 a 7 log, de 3 a 8 log, de 3 a 9 log, de 4 a 6 log, de 4 a 8 log, de 4 a 9 log, de 5 a 6 log, de 5 a 7 log, de 5 a 8 log, de 5 a 9 log, de 6 a 7 log, de 6 a 8 log, de 6 a 9 log, de 7 a 8 log, de 7 a 9 registros o de 8 a 9 registros. Los beneficios de una reducción en el título, el número o la carga total del virus de la influenza incluyen, pero sin limitarse a, síntomas menos graves de la infección, menos síntomas de la infección y una reducción en la duración de la enfermedad asociada con la infección.
Como se emplea en el presente documento, los términos "polipéptido de hemaglutinina de la gripe" y "polipéptido de HA de la gripe" se refieren a (i) los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) de influenza divulgados en el presente documento; y (ii) cualquiera de los polipéptidos divulgados en el presente documento que comprenda un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y/o un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza o un fragmento del mismo, en donde el dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende uno o más sitios de glicosilación modificados; el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza comprende uno o más sitios de glicosilación que no se producen de forma natural; o ambos. Los polipéptidos de HA de la gripe incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza, polipéptidos no quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza, polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En una realización específica, el polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus
de la influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza que interrumpe la unión de glicano al dominio de tallo; un dominio de cabeza globular de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural; o ambos. En otra realización, el polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido de hemaglutinina de influenza (de o procedente de cualquier cepa, subtipo o tipo de virus de la influenza) que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza que interrumpe la unión de glicanos al dominio de tallo, un dominio de cabeza globular de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural; o ambos. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 11, más adelante, para tal polipéptido de la gripe.
"Hemaglutinina" y "HA" se refieren a cualquier hemaglutinina conocida por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la hemaglutinina es hemaglutinina de influenza, tal como una hemaglutinina de influenza A, una hemaglutinina de influenza B o una hemaglutinina de influenza C. Una hemaglutinina típica comprende dominios conocidos por los expertos en la técnica que incluyen un péptido señal (opcional en el presente documento), un dominio de tallo, un dominio de cabeza globular, un dominio luminal (opcional en el presente documento), un dominio transmembrana (opcional en el presente documento) y un dominio citoplásmico (opcional en el presente documento). En ciertas realizaciones, una hemaglutinina consiste en una única cadena polipeptídica, tal como HA0. En ciertas realizaciones, una hemaglutinina consiste en más de una cadena polipeptídica en asociación cuaternaria, p. ej., HA1 y HA2. Los expertos en la técnica reconocerán que una HA0 inmadura podría escindirse para liberar un péptido señal (aproximadamente 20 aminoácidos) produciendo una hemaglutinina HA0 madura. Una hemaglutinina HA0 podría escindirse en otro sitio para producir el polipéptido de HA1 (aproximadamente 320 aminoácidos, incluido el dominio de cabeza globular y una parte del dominio de tallo) y el polipéptido de HA2 (aproximadamente 220 aminoácidos, incluido el resto del dominio de tallo, un dominio luminal, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico). En ciertas realizaciones, una hemaglutinina comprende un péptido señal, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. En ciertas realizaciones, una hemaglutinina carece de un péptido señal, es decir, la hemaglutinina es una hemaglutinina madura. En ciertas realizaciones, una hemaglutinina carece de un dominio transmembrana o un dominio citoplásmico, o ambos. Como se emplean en el presente documento, los términos "hemaglutinina" y "HA" abarcan polipéptidos de hemaglutinina que se modifican mediante procesamiento postraduccional, tal como la escisión del péptido señal, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación (p. ej., glicosilación ligada a N), escisión de proteasas y modificación de lípidos (p. ej., S-palmitoilación).
Como se emplea en el presente documento, los términos "polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza", "polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza", "polipéptido quimérico de hemaglutinina" y "polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza" se refieren a una hemaglutinina de influenza que comprende un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza y un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo con respecto al dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza es de una cepa o subtipo diferente de virus de la influenza que el dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, en el contexto de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza divulgados en el presente documento, un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza heterólogo se refiere a una cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza que es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 5-10%, al menos 10-15%, al menos 10-20%, al menos 15-20%, o al menos 20-25% diferente de la cabeza homóloga (es decir, el dominio de cabeza que normalmente estaría asociado con el dominio de tallo del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). Los expertos en la técnica reconocerán que tal diferencia se puede medir utilizando enfoques conocidos en la técnica y divulgados en el presente documento, por ejemplo, comparando la identidad de secuencia o la homología de secuencia de los dominios de cabeza. En ciertas realizaciones, en el contexto de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza divulgados en el presente documento, un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza heterólogo se refiere a una cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza que, en un ensayo de inhibición de la hemaglutinación, da como resultado antisueros con al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 veces menos títulos de inhibición de la hemaglutinación con respecto a los títulos de inhibición de la hemaglutinación de los antisueros generados contra las cabezas homólogas (es decir, el dominio de cabeza que normalmente estaría asociado con el dominio de tallo del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). Los expertos en la técnica reconocerán que tal diferencia se puede medir utilizando enfoques conocidos en la técnica y divulgados en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.14, más abajo).
“Segmento de tallo N-terminal de HA1” se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción aminoterminal del dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 de influenza. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos HA1N-term a Ap de un dominio HA1. HA1N-term es el aminoácido N-terminal de HA1 como reconocen los expertos en la técnica. Ap es el resto de cisteína en el segmento de tallo N-terminal de HA1 que forma o es capaz de formar un enlace disulfuro con un resto de cisteína en un segmento de tallo C-terminal de HA1. El resto Ap se identifica en polipéptidos de hemaglutinina de influenza A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo N-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 1 -52 de HA1 de una hemaglutinina H3.
Téngase en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal. Los expertos en la técnica podrán reconocer fácilmente los restos de aminoácidos que corresponden al segmento de tallo N-terminal de HA1 de otros polipéptidos de influenza HA, p. ej., los restos de aminoácidos que corresponden al segmento de tallo N-terminal de HA1 de HA1 de una hemaglutinina H1 (véase, por ejemplo, la Figura 1).
"Segmento de tallo C-terminal de HA1" se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción carboxiterminal del dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 de influenza. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos Aq a HA1o-term de un dominio HA1. HA1o-term es el aminoácido C-terminal del dominio HA1 como reconocen los expertos en la técnica. El residuo Aq se identifica en polipéptidos de hemaglutinina de influenza A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 277-329 de HA1 de una hemaglutinina H3. Téngase en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal. Los expertos en la técnica podrán reconocer fácilmente los restos de aminoácidos que corresponden al segmento de tallo C-terminal de HA1 de otros polipéptidos de HA de influenza, p. ej., los restos de aminoácidos que corresponden al segmento de tallo C-terminal de HA1 de HA1 de una hemaglutinina H1 (véase, p. ej., la Figura 1).
"Segmento de tallo corto C-terminal de HA1" se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción carboxilo-terminal del dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 de influenza. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos Bq a HA1C-term de un dominio HA1. El resto Bq se identifica en polipéptidos de hemaglutinina de influenza A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo corto C-terminales de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 305-329 de HA1 de una hemaglutinina H3. Téngase en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal.
“Segmento de tallo largo N-terminal de HA1” se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción amino-terminal del dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 de influenza. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos HA1 N-term a Cp de un dominio HA1. Cp es un resto de cisteína en el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 que está o puede estar conectado a un resto de alanina en un segmento de tallo largo C-terminal de HA1. El resto Cp se identifica en polipéptidos de hemaglutinina de influenza A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo largo N-terminales de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 1-97 de HA1 de una hemaglutinina H3. Téngase en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal.
"Segmento de tallo largo C-terminal de HA1" se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción carboxilo-terminal del dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 de influenza. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos Cq a HA1C-term de un dominio HA1. Cq es un resto de alanina en el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 que está o puede estar conectado a un resto de cisteína en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1. El resto Cq se identifica en polipéptidos de hemaglutinina de influenza A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo largo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 consiste en restos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 253-329 de HA1 de una hemaglutinina H3. Téngase en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal.
"HA2" se refiere a un dominio polipeptídico que corresponde al dominio HA2 de un polipéptido de hemaglutinina de influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, una HA2 consiste en un dominio de tallo, un dominio luminal, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico (véase, p. ej., Scheiffle et al., 2007, EMBO J. 16(18):5501-5508, cuyo contenido se incorpora como referencia en su totalidad). En ciertas realizaciones, una HA2 consiste en un dominio de tallo, un dominio luminal y un dominio transmembrana. En ciertas realizaciones, una HA2 consiste en un dominio de tallo y un dominio luminal; en tales realizaciones, la HA2 podría ser soluble. En ciertas realizaciones, una HA2 consiste en un dominio de tallo; en tales realizaciones, la HA2 podría ser soluble.
Como se emplea en el presente documento, el término "heterólogo" en el contexto de un polipéptido, ácido nucleico o virus se refiere a un polipéptido, ácido nucleico o virus, respectivamente, que normalmente no se encuentran en la naturaleza o que normalmente no están asociados en la naturaleza con un polipéptido, ácido nucleico o virus de interés. Por ejemplo, un "polipéptido heterólogo" puede referirse a un polipéptido derivado de un virus diferente, p. ej., una cepa o subtipo de influenza diferente, o un virus no relacionado o una especie diferente. En realizaciones específicas, cuando se utiliza en el contexto de un dominio de cabeza globular de una hemaglutinina quimérica del virus de la influenza descrito en el presente documento, el término heterólogo se refiere a un dominio de cabeza globular de HA de influenza que está asociado con un dominio de tallo de HA de influenza que normalmente no se
encontraría asociado (p. ej., los dominios de cabeza y tallo de la HA no se encontrarían juntos en la naturaleza). Como se describió anteriormente, en ciertas realizaciones, un dominio heterólogo de cabeza globular de HA de influenza de una hemaglutinina del virus de la influenza quimérica descrita en el presente documento es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 5-10%, al menos 10-15%, al menos 10-20%, al menos 15-20%, o al menos 20-25% diferente de la cabeza homóloga de hemaglutinina (es decir, el dominio de cabeza que normalmente estaría asociado con el dominio de tallo del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza).
Como se emplea en el presente documento, el término "combinado", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia (p. ej., más de un agente profiláctico y/o agente terapéutico). El uso del término "combinado" no restringe el orden en el que se administran las terapias a un sujeto. Por ejemplo, una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) se puede administrar antes de (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), de forma concomitante o posterior a (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de una segunda terapia a un sujeto.
Como se emplea en el presente documento, el término "infección" significa la invasión, multiplicación y/o presencia de un virus en una célula o un sujeto. En una realización, una infección es una infección "activa", es decir, una en la que el virus se replica en una célula o un sujeto. Tal infección se caracteriza por la propagación del virus a otras células, tejidos y/u órganos, desde las células, tejidos y/u órganos inicialmente infectados por el virus. Una infección también puede ser una infección latente, es decir, una en la que el virus no se replica. En ciertas realizaciones, una infección se refiere al estado patológico resultante de la presencia del virus en una célula o sujeto, o por la invasión de una célula o sujeto por el virus.
Como se emplea en el presente documento, el término "enfermedad por el virus de la influenza" se refiere al estado patológico que resulta de la presencia de un virus de la influenza (p. ej., virus de la influenza A o B) en una célula o sujeto o la invasión de una célula o sujeto por un virus de la influenza. En realizaciones específicas, el término se refiere a una dolencia respiratoria provocada por un virus de la influenza.
Como se emplea en el presente documento, las frases "sistema deficiente en IFN" o "sustrato deficiente en IFN" se refieren a sistemas, p. ej., células, líneas celulares y animales, tales como cerdos, ratones, pollos, pavos, conejos, ratas, etc., que no producen IFN o producen niveles bajos de IFN (es decir, una reducción en la expresión de IFN de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o más cuando se comparan con sistemas competentes para IFN en las mismas condiciones), no responden o responden de manera menos eficiente a IFN, y/o tienen una actividad deficiente de uno o más genes antivirales inducidos por IFN.
Como se emplea en el presente documento, el término numérico "log" se refiere a log10.
Como se emplea en el presente documento, el término "sitio de glicosilación modificado" se refiere a un sitio de glicosilación de origen natural en un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza que se ha modificado mediante la adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado no puede unirse al glicano. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado interrumpe o interfiere en la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado no interfiere en el plegamiento adecuado de un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene el motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido. En realizaciones particulares, el sitio de glicosilación modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene el motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido.
Como se emplea en el presente documento, la frase "multiplicidad de infección" o "MOI" es el número promedio de partículas de virus infecciosas por célula infectada. El MOI se determina dividiendo el número de partículas virales infecciosas añadidas (ml añadido x UFP/ml) por el número de células añadidas (ml añadido x células/ml).
Como se emplea en el presente documento, el término "polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza" se refiere a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza de HA del mismo subtipo o cepa, y en donde el polipéptido comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural como se discute en la Sección 5.4.2, más abajo, y/o uno o más sitios de glicosilación modificados como se discute en la Sección 5.4.1, más abajo. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza no quimérico comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA del mismo subtipo de virus de la influenza. En realizaciones específicas, el subtipo del virus de la influenza es un subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17. En ciertas realizaciones, el polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA de la misma cepa del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la
cepa del virus de la influenza es AN/etherlands/602/2009.
Como se emplea en el presente documento, el término "sitio de glicosilación de origen no natural" se refiere a un sitio de glicosilación que está ubicado en cualquier posición de aminoácido dentro de un dominio de cabeza globular particular, en el que no se encuentra localizado un sitio de glicosilación de origen natural, con respecto a un subtipo o cepa de HA particular. Un ejemplo de un sitio de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación al dominio de cabeza globular de una hemaglutinina del virus de la influenza de un subtipo, en donde la glicosilación se encuentra naturalmente en el dominio de cabeza globular de una hemaglutinina de un virus de la influenza de otro subtipo. Otro ejemplo de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación al dominio de cabeza globular de una hemaglutinina del virus de la influenza de una cepa, en donde el sitio de glicosilación se encuentra naturalmente en la cabeza globular de una hemaglutinina de otra cepa del virus de la influenza. Otro ejemplo más de un sitio de glicosilación de origen no natural es la adición de un sitio de glicosilación al dominio de cabeza globular de una hemaglutinina del virus de la influenza de una cepa, en donde el sitio de glicosilación no se encuentra naturalmente en la cabeza globular de una hemaglutinina de otro subtipo o cepa del virus de la influenza. En realizaciones preferidas, el sitio de glicosilación de origen no natural tiene el motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro.
Como se emplea en el presente documento, se pretende que el término "ácido nucleico" incluya moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. El ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra.
"Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos conectados por enlaces amida como saben los expertos en la técnica. Como se emplea en el presente documento, el término puede referirse a una única cadena polipeptídica conectada por enlaces amida covalentes. El término también puede referirse a múltiples cadenas polipeptídicas asociadas por interacciones no covalentes tales como contactos iónicos, enlaces de hidrógeno, contactos de Van der Waals y contactos hidrófobos. Los expertos en la técnica reconocerán que el término incluye polipéptidos que han sido modificados, por ejemplo, mediante procesamiento postraduccional tal como escisión de péptido señal, formación de enlaces disulfuro, glicosilación (p. ej., glicosilación ligada N), escisión de proteasas y modificación de lípidos (p. ej., S-palmitoilación).
Como se emplean en el presente documento, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" en el contexto de la administración de una o varias terapias a un sujeto para prevenir una enfermedad por el virus de la influenza se refieren a uno o más de los efectos profilácticos/beneficiosos resultantes de la administración de una terapia o una combinación de terapias. En una realización específica, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" en el contexto de la administración de una o varias terapias a un sujeto para prevenir una enfermedad por el virus de la influenza se refieren a uno o más de los siguientes efectos resultantes de la administración de una terapia o una combinación de terapias: (i) la inhibición del desarrollo o inicio de una enfermedad por el virus de la influenza o un síntoma de la misma; (ii) la inhibición de la recurrencia de una enfermedad por el virus de la influenza o un síntoma asociado con la misma; y (iii) la reducción o inhibición de la infección y/o replicación del virus de la influenza.
Como se emplean en el presente documento, los términos "purificado" y "aislado" cuando se utilizan en el contexto de un polipéptido (incluido un anticuerpo) que se obtiene de una fuente natural, p. ej., células, se refieren a un polipéptido que está sustancialmente libre de materiales contaminantes de la fuente natural, p. ej., partículas del suelo, minerales, agentes químicos del medio ambiente y/o materiales celulares de origen natural, tales como, pero sin limitarse a, desechos celulares, materiales de la pared celular, membranas, orgánulos, la mayor parte de los ácidos nucleicos, carbohidratos, proteínas y/o o lípidos presentes en las células. Por lo tanto, un polipéptido que se aísla incluye preparaciones de un polipéptido que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2% o 1 % (en peso seco) de materiales celulares y/o materiales contaminantes. Como se emplean en el presente documento, los términos "purificado" y "aislado" cuando se utilizan en el contexto de un polipéptido (incluido un anticuerpo) que se sintetiza químicamente se refieren a un polipéptido que está sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. En una realización específica, se sintetiza químicamente un polipéptido de HA de gripe (p. ej., un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza, un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza y/o un polipéptido no quimérico de hemaglutinina de influenza). En otra realización específica, se aísla un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza y/o un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza.
Como se emplea en el presente documento, los términos "replicación", "replicación viral" y "replicación de virus" en el contexto de un virus se refieren a una o más, o todas, las etapas de un ciclo de vida viral que dan como resultado la propagación del virus. Las pasos de un ciclo de vida viral incluyen, pero sin limitarse a, el anclaje del virus a la superficie de la célula anfitriona, la penetración o entrada en la célula anfitriona (p. ej., a través de endocitosis mediada por receptores o fusión de membranas), eliminación de la cubierta (el proceso mediante el cual las enzimas virales o las enzimas del anfitrión eliminan y degradan la cápside viral, liberando así el ácido nucleico genómico viral), replicación del genoma, síntesis de ARN mensajero viral (ARNm), síntesis de la proteína viral y ensamblaje de complejos de ribonucleoproteínas virales para la replicación del genoma, ensamblaje de partículas virales, modificación postraduccional de las proteínas virales y liberación de la célula anfitriona mediante lisis o gemación y adquisición de
una envoltura de fosfolípidos que contiene glicoproteínas virales embebidas. En algunas realizaciones, los términos "replicación", "replicación viral" y "replicación de virus" se refieren a la replicación del genoma viral. En otras realizaciones, los términos "replicación", "replicación viral" y "replicación de virus" se refieren a la síntesis de proteínas virales.
Como se emplean en el presente documento, los términos "polipéptido del dominio de tallo" y "polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza" se refieren a un derivado, p. ej., un derivado modificado genéticamente de un polipéptido de hemaglutinina que comprende una o más cadenas polipeptídicas que forman un dominio de tallo de hemaglutinina. Un polipéptido de dominio de tallo puede ser una sola cadena polipeptídica, dos cadenas polipeptídicas o más cadenas polipeptídicas. Típicamente un polipéptido de dominio de tallo es una sola cadena polipeptídica (es decir, correspondiente al dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA0) o dos cadenas polipeptídicas (es decir, correspondiente al dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina HA1 asociado con un polipéptido de hemaglutinina HA2). En ciertas realizaciones, un polipéptido de dominio de tallo se obtiene de una hemaglutinina de influenza. En realizaciones específicas, un polipéptido de dominio de tallo se obtiene de una hemaglutinina del virus de la influenza H1 o H3. Los polipéptidos de dominio de tallo modificados genéticamente pueden comprender uno o más conectores como se describe a continuación.
Como se emplean en el presente documento, los términos "polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza", "dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza", "dominio de cabeza globular de HA" y "dominio de la cabeza de HA" se refieren al dominio de cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. Un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza o un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza pueden comprender o consistir en un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza conocido (p. ej., de tipo salvaje) o pueden comprender o consistir en un derivado, p. ej., un derivado modificado genéticamente, de un dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza conocido (p. ej., de tipo salvaje).
Como se emplean en el presente documento, los términos "sujeto" o "paciente" se utilizan indistintamente para referirse a un animal (p. ej., aves, reptiles y mamíferos). En una realización específica, el sujeto es un ave. En otra realización, el sujeto es un mamífero que incluye un no primate (p. ej., un camello, un burro, una cebra, una vaca, un cerdo, un caballo, una cabra, una oveja, un gato, un perro, una rata y un ratón) y un primate (p. ej., un mono, un chimpancé y un ser humano). En ciertas realizaciones, el sujeto es un animal no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal de granja o una mascota. En otra realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un lactante humano. En otra realización, el sujeto es un niño humano. En otra realización, el sujeto es un adulto humano. En otra realización, el sujeto es un humano de edad avanzada. En otra realización, el sujeto es un lactante humano prematuro.
Como se emplea en el presente documento, el término "lactante humano prematuro" se refiere a un lactante humano nacido con menos de 37 semanas de edad gestacional.
Como se emplea en el presente documento, el término "lactante humano" se refiere a un ser humano recién nacido a 1 año de edad.
Como se emplea en el presente documento, el término "niño humano" se refiere a un ser humano que tiene entre 1 año y 18 años.
Como se emplea en el presente documento, el término "adulto humano" se refiere a un ser humano que tiene 18 años o más.
Como se emplea en el presente documento, el término "ser humano de edad avanzada" se refiere a un ser humano de 65 años o más.
Los términos "estructura terciaria" y "estructura cuaternaria" tienen los significados entendidos por los expertos en la técnica. La estructura terciaria se refiere a la estructura tridimensional de una sola cadena polipeptídica. La estructura cuaternaria se refiere a la estructura tridimensional de un polipéptido que tiene múltiples cadenas polipeptídicas.
Como se emplea en el presente documento, el término "cepa del virus de la influenza estacional" se refiere a una cepa del virus de la influenza a la que una población de sujetos está expuesta de forma estacional. En realizaciones específicas, el término cepa del virus de la influenza estacional se refiere a una cepa del virus de la influenza A. En realizaciones específicas, el término cepa del virus de la influenza estacional se refiere a una cepa del virus de la influenza que pertenece al subtipo H1 o H3, es decir, los dos subtipos que actualmente persisten en la población de sujetos humanos. En otras realizaciones, el término cepa del virus de la influenza estacional se refiere a una cepa del virus de la influenza B.
Como se emplean en el presente documento, los términos "terapias" y "terapia" pueden referirse a cualquier protocolo, método, compuesto, composición, formulación y/o agente que se pueden utilizar en la prevención o tratamiento de una infección viral o una enfermedad o síntoma asociado con la misma. En ciertas realizaciones, los términos "terapias" y "terapia" se refieren a terapia biológica, terapia de apoyo y/u otras terapias útiles en el tratamiento o prevención de una infección viral o una enfermedad o síntoma asociados con la misma conocidos por un experto en la técnica. En
algunas realizaciones, el término "terapia" se refiere a (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), (ii) un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), o (iii) un vector o composición que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) o que comprende un polipéptido de HA de la gripe. En algunas realizaciones, el término "terapia" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza.
Como se emplean en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren en el contexto de la administración de una o varias terapias a un sujeto para tratar una enfermedad o infección por el virus de la influenza para obtener un efecto beneficioso o terapéutico de una terapia o una combinación de terapias. En realizaciones específicas, tales términos se refieren a uno, dos, tres, cuatro, cinco o más de los siguientes efectos que resultan de la administración de una terapia o una combinación de terapias: (i) la reducción o mejora de la gravedad de una infección por virus de la influenza o una enfermedad o un síntoma asociados con la misma; (ii) la reducción en la duración de una infección por el virus de la influenza o una enfermedad o un síntoma asociados con la misma; (iii) la regresión de una infección por el virus de la influenza o una enfermedad o un síntoma asociados con la misma; (iv) la reducción del título de un virus de influenza; (v) la reducción del fallo orgánico asociado con una infección por el virus de la influenza o una enfermedad asociada con la misma; (vi) la reducción de la hospitalización de un sujeto; (vii) la reducción del tiempo de hospitalización; (viii) el aumento de la supervivencia de un sujeto; (ix) la eliminación de una infección por el virus de la influenza o una enfermedad o síntoma asociados con la misma; (x) la inhibición de la progresión de una infección por el virus de la influenza o una enfermedad o un síntoma asociados con la misma; (xi) la prevención de la propagación de un virus de influenza desde una célula, tejido, órgano o sujeto a otra célula, tejido, órgano o sujeto; (xii) la inhibición o reducción de la entrada de un virus de la influenza en una o varias células anfitrionas; (xiii) la inhibición o reducción de la replicación de un genoma del virus de la influenza; (xiv) la inhibición o reducción de la síntesis de proteínas del virus de la influenza; (xv) la inhibición o reducción de la liberación de partículas del virus de la influenza desde una o varias células anfitrionas; y/o (xvi) la potenciación o mejora del efecto terapéutico de otra terapia.
Como se emplea en el presente documento, en algunas realizaciones, la frase "de tipo salvaje" en el contexto de un virus se refiere a los tipos de virus que prevalecen, que circulan de forma natural y que producen brotes típicos de enfermedad. En otras realizaciones, el término "de tipo salvaje" en el contexto de un virus se refiere a un virus parental.
4. Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 presenta un alineamiento de secuencias por CLUSTALW de secuencias representativas de 16 subtipos de hemaglutinina del virus de la influenza A (SEQ ID NO:1-16, respectivamente). El resto designado Ap es el resto de cisteína en el segmento del tallo N-terminal de HA1 que forma o es capaz de formar un enlace disulfuro con el resto designado Aq, un resto de cisteína en un segmento de tallo C-terminal de HA1. El resto designado Bq representa el aminoácido N-terminal aproximado de los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 descritos en el presente documento. El resto designado Cq representa el aminoácido N-terminal aproximado de los segmentos de tallo largo C-terminal de HA1 descritos en el presente documento. El resto designado Cp representa el aminoácido C-terminal aproximado de los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 descritos en el presente documento.
La Fig. 2 presenta un alineamiento de secuencias por CLUSTALW de una secuencia representativa de hemaglutinina del virus de influenza B (SEQ ID NO:558) alineada con hemaglutininas de influenza A HK68-H3N2 (SEQ ID NO:3) y PR8-H1N1 (SEQ ID NO:1).
La Fig. 3 presenta una lista de secuencias de hemaglutinina del virus de la influenza B (SEQ ID NO:17), señalando los aminoácidos que constituyen los límites para varios segmentos de tallo N- y C-terminal y segmentos de tallo intermedios descritos en el presente documento.
La Fig.4 proporciona supuestas estructuras de polipéptidos de dominio de tallo de HA de influenza A basados en una proteína hemaglutinina HK68-H3N2. La Fig. 4A proporciona la supuesta estructura de un polipéptido de dominio de tallo de HA de influenza A basado en una proteína hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tallo N-terminal de HA1 de SEQ ID NO:36 y segmento de tallo C-terminal de SEQ ID NO:52. La Fig. 4B proporciona la supuesta estructura de un polipéptido del dominio de tallo corto de HA de influenza A basado en una proteína hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tallo N-terminal de HA1 de SEQ ID NO:36 y segmento de tallo corto C-terminal de SEQ ID NO:352. La Fig. 4C proporciona la supuesta estructura de un polipéptido del dominio de tallo largo HA de influenza A basado en una proteína hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tallo largo N-terminal de HA1 de SEQ ID NO:417 y segmento de tallo largo C-terminal de SEQ ID NO:433.
La Fig.5 proporciona supuestas estructuras de polipéptidos de dominio de tallo de HA de influenza A basados en una proteína hemaglutinina PR8-H1N1. La Fig. 5A proporciona la supuesta estructura de un polipéptido de dominio de tallo de HA de influenza A basado en una proteína hemaglutinina PR8-H1N1, segmento de tallo N-terminal de HA1 de SEQ ID NO:18 y segmento de tallo C-terminal de SEQ ID NO:34. La Fig. 5B
proporciona la supuesta estructura de un polipéptido del dominio de tallo corto de HA de influenza A, segmento de tallo N-terminal de HA1 de s Eq ID NO:18 y segmento de tallo corto C-terminal de SEQ ID NO:350. La Fig. 5C proporciona la supuesta estructura de un polipéptido del dominio de tallo largo de HA de influenza A basado en una proteína hemaglutinina PR8-H1N1, segmento de tallo largo N-terminal de HA1 de SEQ ID NO:414 y segmento de tallo largo C-terminal de SEQ ID NO:430.
La Fig.6 proporciona supuestas estructuras de polipéptidos de dominio de tallo de HA de influenza B. La Fig. 6A proporciona una molécula de HA parcialmente sin cabeza basada en la proteína hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, en la que se conservan los primeros 94 aminoácidos del dominio HA1 de la HA (SEQ ID NO:550), y donde Cys94 está conectada directamente a Cys143 del dominio HA1 (SEQ ID NO:553), por medio de un puente conector. La Fig. 6B representa una molécula de HA parcialmente sin cabeza basada en la proteína hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, en la que se conservan los primeros 178 aminoácidos del dominio HA1 de la HA (SEQ ID NO:551), y donde Cys178 está conectada directamente a Cys272 del dominio HA1 (SEQ ID NO:554), por medio de un puente conector. La Fig. 6C representa una molécula de HA sin cabeza basada en la proteína hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, en la que se conservan los primeros 94 aminoácidos del dominio HA1 de la HA (SEQ ID NO:555), y donde Cys94 está conectada directamente a Cys143 del dominio HA1, mediante un puente conector. Además, se conservan los aminoácidos 143 a 178 del dominio HA1 (SEQ ID NO:556), y Cys178 se conecta directamente a Cys272 del dominio HA1 (SEQ ID NO:557), por medio de un puente conector. La Fig. 6D representa una molécula de HA sin cabeza basada en la proteína hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, en la que se conservan los primeros 54 aminoácidos del dominio HA1 de la HA (SEQ ID NO:552), y donde Cys54 está unido directamente a Cys272 del dominio HA1 (SEQ ID NO:554), mediante un puente conector.
La Fig. 7 proporciona un esquema de HA quiméricas con un dominio de tronco H1 conservado y diferentes dominios de cabeza globular de distintos subtipos de HA.
La Fig.8 proporciona una nueva vacuna contra la influenza y una plataforma de herramientas de diagnóstico para inducir y analizar anticuerpos y sueros reactivos. A) Expresión de HA quiméricas. Las HA quiméricas que consisten en el dominio de tronco de HA AP/R8/34 y el dominio de cabeza globular de A/California/4/09 (HA quimérica), así como HA de tipo salvaje (PR8-HA y CAL09-HA) y un control de GFP se expresaron en células 293T. La transferencia Western superior se sondeó con un anticuerpo específico de PR8 (PY102), mientras que la transferencia del lado inferior se sondeó con un anticuerpo específico para Cal09 (39C2). B) Dibujo esquemático de construcciones de HA expresadas en A. La HA quimérica está compuesta por el dominio de tronco de HA AP/R/8/34 y el dominio de cabeza globular 2009 A/California/04/09.
La Fig. 9 proporciona un esquema de las HA quiméricas. A) Estructura básica de una HA quimérica. La cabeza globular se puede intercambiar convenientemente en el enlace disulfuro Cys 52-Cys 277. B) Régimen de cebado-refuerzo con administración secuencial de HA quiméricas que consisten en un dominio de tronco completamente conservado y un dominio de cabeza globular variable.
La Fig. 10 describe la generación de una HA quimérica con el tronco de una HA H1 y la cabeza globular de un HA H3. Una HA quimérica que consiste en el dominio de tronco de HA AP/R8/34 y el dominio de cabeza globular de HK/68 (H3 quimérico), así como HA de tipo salvaje (PR8-HA y HK68 HA) se expresaron en células 293T. La transferencia Western superior se sondeó con un anticuerpo específico de PR8, mientras que la transferencia de la parte inferior se sondeó con un anticuerpo específico para H3.
La Fig. 11 representa una comparación de secuencias de las secuencias de la proteína hemaglutinina de AH/ong Kong/1/1968 (H3), AP/erth/16/2009 (H3), AP/R/8/34 (H1), A/Cal/4/09 (H1), A/Vietnam/1203/04 (H5) y Am/allard/Alberta/24/01 (H7). Se especifican los restos de aminoácidos Cys52 y Cys277 (basados en la numeración de H3). La sombra de color negro indica aminoácidos conservados. La línea ondulada de color negro representa la región de la cabeza globular de las HA. Se indican los puntos de partida de HA1 y HA2.
La Fig. 12 representa un esquema de hemaglutininas quiméricas. (A) Diagrama de construcción de la HA quimérica PR8-cH1. La HA quimérica se construyó intercambiando el dominio de cabeza globular ubicado entre Cys52 y Cys277 de HA AP/R/8/34(H1) con el de HA A/California/4/09(H1). La HA quimérica resultante tiene la región de tronco de HA AP/R8/34 (H1) con un dominio de cabeza globular de HA A/California/4/09 (H1) designado PR8-cH1. (B) Esquema de las estructuras plegadas de las diferentes HA de tipo salvaje y quiméricas, tales como la HA PR8 de tipo salvaje, la HA PR8-cH1 quimérica, la HA PR8-cH5 quimérica, la Ha Perth de tipo salvaje y la HA Perth cH7 quimérica (de izquierda a derecha). Las estructuras de HA de longitud completa se descargaron de Protein Database (PDB): HA PR8 (PDB ID 1RU7) y HA Perth (representada por HA HK68, PDB ID 1MQN). Las imágenes finales se generaron con PyMol (Delano Scientific).
La Fig. 13 representa la expresión superficial y el análisis funcional de construcciones quiméricas de HA. (A) Se evaluó la expresión superficial de construcciones quiméricas de HA en células transfectadas transitoriamente. A las 24 h de la transfección, las células 293T se tripsinizaron y la expresión de la superficie celular de las proteínas HA quiméricas se analizó mediante citometría de flujo. En los paneles superiores, las
células transfectadas de forma simulada (región sombreada de la izquierda) se comparan con células transfectadas con HA PR8 (derecha) o células transfectadas con PR8-cH1 (derecha) o PR8-cH5 (derecha). En los paneles inferiores, las células transfectadas de forma simulada (región sombreada a la izquierda) se comparan con las células transfectadas con construcciones Perth y Perth-cH7 (derecha). (B) Se utilizaron pseudopartículas que codifican luciferasa que expresan HA quiméricas para infectar células MDCK. Las unidades relativas de luz (URL) generadas en el ensayo de luciferasa indican que las pseudopartículas que expresan HA quiméricas pudieron ingresar a las células.
La Fig. 14 describe la generación de virus recombinantes que portan hemaglutininas quiméricas. (A) Análisis de transferencia Western de los virus recombinantes. Se prepararon extractos de células MDCK infectadas simuladamente o infectadas con los virus indicados (16 hpi) a una MOI de 2 y se sondearon con anticuerpos: anti-AP/R8/HA(H1) (PY102), anti-A/Cal/09/ HA(H1) (29C1), anti-A/VN/HA(H5) (M08), anti-H3/HA (12D1), anti-H7 (NR-3125), anti-AN/P (HT103) y anti-GAPDH como control de carga interna. (B) Análisis de inmunofluorescencia de las células MDCK infectadas con virus recombinantes utilizando anticuerpos: anti-AN/P (HT103), anti-AH/1 HA (6F12), anti-AP/R8/HA (PY102), anti-A/Cal/09/HA (29C1), anti-A/VN/HA (M08), anti-H3/HA (12D1) y anti-AH/7 (NR-3152).
La Fig. 15 describe la cinética de crecimiento y los fenotipos de placas de virus recombinantes. (A) Se infectaron huevos de gallina embrionados de 10 días con virus de tipo salvaje o recombinante con 100 ufp por huevo y se controló el crecimiento viral durante 72 horas después de la infección. (B) El fenotipo de placa de virus recombinantes se evaluó mediante ensayo en placa. Las células MDCK se infectaron con un virus de tipo salvaje o recombinante y, 48 horas después de la infección, se inmunotiñeron para revelar el fenotipo de la placa utilizando el anticuerpo contra AN/P (HT 103).
La Fig. 16 representa un análisis de inmunofluorescencia de células transfectadas con hemaglutinina H6 quimérica. Se transfectaron células 293T con 1 gg de plásmido pCAGGS que expresa hemaglutinina H6 quimérica. Se añadieron a las células transfectadas sueros de animales que recibieron ADN (Fig. 16A), infección por Cal/09 (Fig. 16B), ADN e infección por Cal/09 (Fig. 16C) o vacuna fraccionada Cal/09 (Fig. 16D) y se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia después de la incubación con anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 594.
La Fig. 17 demuestra que el cebado de ADN y el refuerzo de virus quimérico confieren protección a los animales sensibilizados con la sensibilización letal del virus de la influenza. Los animales se trataron con ADN solo, virus H9 quimérico solo, cebado de ADN y refuerzo con virus H9 quimérico, o con virus PR8 inactivado. A continuación, los ratones fueron sensibilizados con 5 x 104 UFP de virus PR8, instiladas por vía intranasal, y se controló el peso de los animales durante 14 días.
La Fig. 18 demuestra la reactividad de los anticuerpos específicos del tronco a la proteína cH6 según lo determinado por ELISA.
La Fig. 19 representa la estructura del trímero de hemaglutinina H1 AP/R/8/34 que tiene un dominio de tallo y un dominio de cabeza globular. El trímero de hemaglutinina se representa sin glicanos (A), en forma de tipo salvaje, con estructuras de glicanos (B) y en forma mutante en donde las estructuras de glicanos se eliminan del dominio de tronco y se añaden al dominio de cabeza globular (C).
La Fig. 20 representa las secuencias de hemaglutinina (HA) AP/R/8/34 (PR8) y AH/K/1/68 (HK68). Los aminoácidos que forman el dominio de tallo están recuadrados. Las cisteínas ("C") que forman el límite entre el dominio de tronco y de cabeza globular son las que se muestran después del primer cuadro de aminoácidos que forman el dominio de tallo y antes del segundo cuadro de aminoácidos que forman el dominio de tallo. El resto de aminoácidos (los aminoácidos que no están recuadrados, sin incluir las cisteínas presentes después del primer recuadro de aminoácidos que forman el dominio de tallo y antes del segundo recuadro de aminoácidos que forman el dominio de tallo) son los que forman el dominio de cabeza globular. Los sitios de glicosilación de origen natural se indican con letras oscuras en las secciones de aminoácidos correspondientes al dominio de cabeza globular. El dominio transmembrana y el ectodominio están representados por el tramo resaltado de aminoácidos al final de cada secuencia. Se indican los sitios de glicosilación que se pueden mutar para interrumpir la unión de los glicanos al dominio de tallo; estos incluyen las siguientes secuencias: NNST, NVT, NSS, NGT (en HA PR8) y NST, NGT, NAT, NGS, NGT (en HA HK68).
La Fig. 21 representa un dibujo esquemático de sitios antigénicos inmunodominantes en el dominio de cabeza globular de un monómero de hemaglutinina (H1) de influenza (A). Mutaciones ilustrativas que introducen sitios de glicosilación de origen no natural en los sitios antigénicos de hemaglutinina H1 AP/r/8/34 (B). Estos sitios de glicosilación de origen no natural se indican mediante el motivo de aminoácido N-Xaa-S/T, en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.
La Fig. 22 representa la adquisición de sitios de glicosilación en HA del subtipo H1 humano a lo largo del tiempo (hasta e incluyendo el virus 2009 H1N1 y otros virus de influenza 2009). Alineamiento de aminoácidos de sitios antigénicos en HA1 de cepas H1N1 estacionales que circulan en seres humanos desde 1918 y antes
de la aparición del virus pandémico 2009 H1N1 (A). Para simplificar, el alineamiento se realizó con cepas de referencia prototípicas seleccionadas y cepas de vacunas obtenidas de Influenza Research Database e Influenza Virus Resource Database (los números de acceso se enumeran en los métodos). Los años no representados corresponden a la falta de una secuencia aislada para ese año o a una secuencia prototipo poco clara debido a las pocas secuencias disponibles. Las regiones sombreadas representan los sitios antigénicos conocidos enumerados en la parte superior. Los recuadros de texto en las regiones designadas 1, 2 y 3 representan glicosilación conservada; los recuadros de texto en las regiones designadas 4, 5, 6 y 7 representan glicosilaciones que aparecen con el paso del tiempo. La línea de tiempo que representa el año de adquisición de glicosilaciones en la cabeza globular de la proteína HA (B). Los números indican la posición del aminoácido del sitio de glicosilación que aparece en los años específicos que se muestran en la parte inferior. Las flechas indican la persistencia del sitio de glicosilación a lo largo del tiempo y los círculos representan la desaparición de sitios de glicosilación específicos. Las líneas discontinuas muestran el período de tiempo durante el cual H1N1 no circuló en seres humanos. Representación estructural de la posición específica de cada glicosilación tal como aparecen con el paso del tiempo desde 1918 hasta la aparición del virus 2009 pH1N1 (C). La HA se representa como cintas que forman la molécula trimérica de HA. La posición se refiere a la nomenclatura H1 (71, 142, 144, 172 y 177 corresponden a la numeración de H358, 128, 130, 158 y 163, respectivamente).
La Fig.23 representa la caracterización fenotípica de los virus mutantes de glicosilación de HA 2009 pH1 N1. Fenotipo de tamaño de placa de virus mutantes de glicosilación HA A/Netherlands/602/2009 rescatados en células MDCK (A). Análisis de transferencia Western de productos lisados de células completas obtenidos de células MDCK infectadas a una MOI de 5 durante 12 h (B). Los productos lisados se realizaron en condiciones no reductoras y las transferencias se detectaron con un anticuerpo policlonal de conejo 3851 producido contra un virus PR8 que carecía de H1, que había sido eliminada mediante tratamiento con ácido y DTT. Cinética de crecimiento de virus rescatados en células epiteliales traqueobronquiales humanas diferenciadas infectadas a una MOI de 0,001 (C). Las titulaciones de virus se realizaron para cada punto de tiempo mostrado por el ensayo en placas convencional en células MDCK.
La Fig.24 muestra que los virus 2009 pH1 N1 con glicosilaciones adicionales en la HA se atenúan en ratones y hurones. (A - E) Infección de ratones hembra C57B/6 de 9 semanas de edad con virus mutantes de glicosilación Neth/09. Los grupos de n = 5 ratones por virus recombinante se infectaron i.n. con las dosis de virus indicadas. El peso corporal representa el promedio de cada grupo y las barras de error indican la desviación típica (d.t.) en cada punto de tiempo. (F) Los títulos de pulmones de ratones infectados con 1 x 103 ufp de cada virus mutante se obtuvieron los días 2 (círculo), 3 (cuadrado) y 7 (triángulo) p.i. como se muestra. La barra de color negro representa el título viral promedio para 2 (flechas) o 3 ratones por grupo en cada punto de tiempo en comparación con el virus rNeth/09 WT. (G) Cambios de peso corporal en hurones infectados (n=3 por grupo) con los virus indicados. Los pesos se muestran como el promedio y las barras de error representan la d.t. de cada punto de tiempo. (H) Títulos virales en lavados nasales obtenidos cada dos días de los hurones que se muestran en (G). (I) Carga viral en tejidos de hurones (n=3) el día 3 p.i. con los virus indicados. Los valores se representan como en (F). Las diferencias estadísticamente significativas del peso corporal de los hurones se estimaron con la prueba de pares emparejados de Wilcoxon (G).
La Fig. 25 representa que los virus que contienen deleciones de glicosilación en la HA de Tx/91 exhiben una mayor virulencia en ratones y protección cruzada contra la cepa pH1N1 2009. Caracterización fenotípica del virus de la influenza A recombinantes que portan HA de tipo salvaje o el mutante por deleción de glicosilación de AT/exas/36/1991 y los 7 genes restantes de PR8 (los virus son rPR8 7:1 Tx/91 HA). (A) Análisis de transferencia Western de productos lisados obtenidos de células MDCK infectadas a una MOI de 5 durante 12 h con los respectivos virus mutantes por deleción de glicosilación. Los productos lisados se realizaron en condiciones reductoras y las transferencias se detectaron con el anticuerpo policlonal 3951. (B) Ratones hembra C57B/6 de 8 semanas de edad infectados con 1x104 ufp de cada virus mostrado. Peso corporal medio de los ratones n=5 por grupo. Las barras de error denotan la d.t. para cada punto de tiempo. (C) Se permitió que los ratones infectados en (B) se seroconvirtieran durante 27 días, momento en el que se expusieron a una DL50 de 100 de Neth/09. El peso corporal representa el promedio de cada grupo con su respectiva d.t. (D) El porcentaje de supervivencia se muestra para los ratones en (C). Se utilizó la prueba t de Student para determinar la importancia en la pérdida de peso corporal y la prueba de rango logarítmico para evaluar la importancia (* P<0,05) para el resultado de supervivencia.
La Fig. 26 muestra una representación esquemática de proteínas HA quiméricas (cHA) (A) y expresión de cHA en células MDCK (B). Proteínas quiméricas HA (cHA) y virus quimérico recombinante. (A) Representación esquemática de las cHA. El dominio de cabeza globular se define como la secuencia de aminoácidos intermedia entre los restos C52 y C277 (numeración H3). Utilizando este enlace disulfuro como demarcación entre la cabeza y el tronco, se introdujeron cabezas exóticas de HA sobre troncos heterólogos. El dominio de tronco se define como las porciones restantes de las subunidades HA1 y HA2. CT, cola citoplasmática; SP, péptido señal; TM, dominio transmembrana. Las estructuras completas de HA se descargaron de Protein Database (p Db ): HA PR8 (H1) (PDB ID 1RU7) y HA A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 [representada por A/swine/Hong Kong/9/98 (H9; PDB ID 1JSD)]. Las imágenes finales se generaron con PyMol (Delano Scientific). Debido a que no se ha publicado la estructura de un HA H6, la
imagen del pliegue de la cabeza del PR8 HA se utiliza para la construcción cH6/1. (B) Inmunofluorescencia para confirmar la expresión de cHA. Las células MDCK se infectaron con el virus PR8 WT o cH9/1 N3, o se infectaron de forma simulada. Se utilizaron anticuerpos específicos para la cabeza y el tronco del virus PR8, así como un anticuerpo con reactividad H9 para confirmar la expresión de cHA. (Barra de aumento: 40x).
La Fig. 27 muestra que los pacientes adultos infectados con el virus pandémico H1N1 tienen títulos altos de anticuerpos neutralizantes que son reactivos con el tronco de HA. Reactividad de sueros de adultos infectados con pH1N1 (n = 9), niños no infectados con pH1N1 (n = 5) y adultos no infectados con el virus pH1N1 (n = 11) con proteína cH6/1 (A), proteína cH9/1; (B), la lAh de la proteína HA2 (se utilizó anticuerpo anti-LAH como control positivo; (C), proteína HA H5 (se utilizó suero policlonal de ratón producido contra HA H5 como control positivo y se utilizó un anticuerpo pan-H3, 12D1, como control negativo; (D) (13), o proteína HA H3 (se utilizó 12D1 como control positivo y se utilizó suero policlonal de ratón producido contra HA H5 como control negativo; (E). Todos fueron evaluados mediante ELISA; los puntos de datos representan títulos promedio con ET o reactividad de muestras agrupadas.
La Fig. 28 muestra que los pacientes adultos infectados con el virus H1N1 pandémico tienen títulos altos de anticuerpos neutralizantes que son específicos para el tronco de HA (A y B). Los sueros de pH1N1 infectados (n = 14) y adultos no infectados con pH1N1 (n = 5) se combinaron por separado y se purificó la IgG total de ambos grupos. La capacidad de neutralización de los anticuerpos del tronco se evaluó mediante un ensayo de reducción de placas utilizando el virus cH9/1 N3. Los puntos de datos representan la media y el ET de dos experimentos. Las placas se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-H9 G1-26. (B) muestra la reducción de placa de las cuatro diluciones de suero que se muestran en la parte superior. (C) El ensayo de neutralización de partículas pseudotipo mide la actividad de anticuerpos neutralizantes de las preparaciones de IgG purificadas humanas (sueros de adultos infectados con pH1N1 y adultos no infectados con pH1N1). Las concentraciones de IgG total fueron 50, 10 y 2 μg/mL. Como control positivo se utilizó el anticuerpo monoclonal específico de tronco 6F12.
La Fig. 29 muestra la expresión y función de la proteína cH6/1 y cH9/1. A) Gel de Coomasie de 2 μg de proteína cH6/1 y cH9/1. M, proteínas marcadoras. (B) Análisis de transferencia Western de proteínas cHA expresadas en baculovirus. Calle 1, proteína cH6/1; calle 2, proteína cH9/1; calle 3, HA PR8 Wt ; calle 4, HA H3 WT. Se sondearon transferencias con anticuerpos que se sabe que reaccionan con el tronco del virus PR8 (anti-HA2 policlonal de conejo) o virus H3 (mAb 12D1 de ratón) y la cabeza globular de H6 (anti-H6 policlonal de cabra) o virus H9 (mAb G1-26 de ratón) para confirmar la identidad de las cHA expresadas en baculovirus. mAb 12D1 reacciona tanto con HA0 como con HA2 (la preparación de proteína H3 se escinde, lo que da como resultado dos bandas distintas). (C) Ensayo en placa del virus reordenado cH9/1 N3. El fenotipo de la placa del virus cH9/1 N3 reordenado es similar a las placas producidas por el virus PR8 WT. Las placas se inmunotiñeron con PY102 y anticuerpo anti-H9 G1-26.
La Fig.30 muestra que los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el tronco de HA del virus de la influenza se unen y neutralizan las cHA. (A) Se utilizó el anticuerpo contra el tronco C179 para probar la reactividad a la proteína expresada por baculovirus cH6/1 mediante ELISA. C179 reaccionó con cH9/1 de forma dependiente de la dosis. (B) Se utilizó el anticuerpo contra el tronco C179 para probar la reactividad a la proteína expresada por baculovirus cH9/1 mediante ELISA. C179 reaccionó con cH9/1 de forma dependiente de la dosis (C y D). El anticuerpo 6F12 neutraliza la replicación del virus cH9/1 N3. Se utilizó 6F12 para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales específicos del tronco para neutralizar el virus cH9/1 N3 mediante un ensayo de reducción de placa. D muestra la reducción de placa del virus cH9/1 N3 utilizando cinco diluciones de mAb 6F12 (100, 20, 4, 0,8 y 0,16 μg/mL). Las placas se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-H9 G1-26.
La Fig. 31 representa esquemas de hemaglutininas quiméricas. La Fig. 31A muestra un diagrama de virus de tipo salvaje y cH1/1. La HA quimérica se construyó intercambiando el dominio de cabeza globular ubicado entre Cys52 y Cys277 de HA PR8 (H1) por el de h A A/California/4/09 (H1). La HA quimérica resultante tiene la región de tronco de HA AP/R8/34 (H1) con un dominio de cabeza globular de h A A/California/4/09 (H1) y se designa cH1/1. La Fig. 31B muestra esquemas teóricos de las estructuras plegadas de las diferentes HA quiméricas y de tipo salvaje. De izquierda a derecha: HA PR8 de tipo salvaje, HA cH1/1 quimérica, HA cH5/1 quimérica, Ha Perth de tipo salvaje, HA cH7/3 quimérica y HA cH5/3 quimérica.
La Fig. 32 representa una tabla que compara la identidad de aminoácidos entre las HA H1, H3, H5 y H7 utilizadas en este estudio. El porcentaje de identidad de aminoácidos se calculó utilizando ClustalW (excluyendo el péptido señal). El porcentaje de identidad de aminoácidos se compara para HA de longitud completa, así como para los dominios de cabeza globular y tronco. Las barras de color gris indican 100% de identidad.
La Fig. 33 muestra la expresión superficial de construcciones de HA quimérica. La expresión superficial de construcciones de HA quiméricas se evaluó en células transfectadas o infectadas de forma transitoria. A las 48 h de la transfección, las células 293T se tripsinizaron y la expresión de la superficie celular de las proteínas HA quiméricas se analizó mediante citometría de flujo. En los paneles superiores, las células transfectadas
de forma simulada (color gris) se comparan con células transfectadas con HA PR8 (línea de color negro) o células transfectadas con cH1/1 (línea de color negro) o cH5/1 (línea de color negro). En los paneles centrales, las células transfectadas de forma simulada (color gris) se comparan con las células transfectadas con construcciones Perth/09, cH7/3 (línea de color negro) y cH5/3 (línea de color negro). En los paneles inferiores, las células MDCK se infectaron con virus recombinantes que expresan Perth/09, cH7/3 y cH5/3. A las 12 h post-infección se analizó la expresión en la superficie celular de las diferentes HA mediante citometría de flujo.
La Fig. 34 demuestra la capacidad de las HA quiméricas para entrar en las células MDCK. Se utilizaron pseudopartículas que codificaban luciferasa que expresaban HA quiméricas para transducir células MDCK. Las unidades relativas de luz (URL) generadas en el ensayo de luciferasa indican que las pseudopartículas que expresan HA quiméricas pueden ingresar a las células.
La Fig. 35 muestra un análisis de transferencia Western de células infectadas con los virus recombinantes que expresan cHA. Se prepararon extractos de células MDCK con infección simulada o infectadas con los virus indicados a una MOI de 2 y se sondearon con anticuerpos a 16 hpi: anti-AP/R8/HA (H1) (PY102), anti-A/Cal/09/HA (H1) (29E3), anti-A/VN/HA (H5) (mAb #8), anti-H3/HA (12D1), anti-H7 (NR-3152), anti-AN/P (HT103) y anti-GAPDH como control de carga.
La Fig. 36 representa un análisis de inmunofluorescencia de células MDCK infectadas con virus recombinantes utilizando anticuerpos: anti-AN/P (HT103), anti-AH/A H1 (6F12), anti-AP/R8/HA (PY102), anti-A/Cal/09/HA (29E3), anti-A/VN/HA (mAb #8), anti-H3/HA (12D1) y anti-AH/7 (NR-3152).
La Fig. 37 representa la cinética de crecimiento y los fenotipos de placa de virus recombinantes y de tipo salvaje. (A) Se infectaron huevos de gallina embrionados de 10 días con 100 ufp por huevo de virus de tipo salvaje o recombinante y se controló el crecimiento viral durante 72 horas después de la infección. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación típica de las réplicas experimentales. (B) Los fenotipos de placa de virus recombinantes se evaluaron mediante ensayo en placa. Las células MDCK se infectaron con un virus de tipo salvaje o recombinante. Las células se fijaron 48 horas después de la infección y se inmunotiñeron para revelar los fenotipos de la placa utilizando el anticuerpo contra AN/P (HT103).
La Fig. 38 representa que el anticuerpo monoclonal específico del tronco neutraliza virus que expresan cHA y partículas pseudotipo. La capacidad de un mAb (KΒ2) para neutralizar virus que expresan cHA o partículas pseudotipo se evaluó mediante un ensayo de reducción de placas o un ensayo de inhibición de partículas pseudotipo. Las células MDCK se infectaron o se transdujeron con virus o partículas pseudotipo que expresaban cHA en presencia de la cantidad indicada (ug/mL) del mAb o sin anticuerpo. Se utilizó la formación de placa o la actividad luciferasa como lectura para determinar el grado de inhibición por el mAb(A). El mAb neutraliza la replicación del virus cH1/1 (recuadros de color negro) y cH5/1 (triángulos de color negro) de manera dependiente de la dosis, con 100% de inhibición a concentraciones superiores a 100 ug/mL. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación típica de las réplicas experimentales. (B) El mAb también inhibe la entrada de partículas pseudotipo cH1/1 (recuadros de color negro) de manera dependiente de la dosis, con una inhibición completa por encima de 4 ug/mL. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación típica de las réplicas experimentales. Los ensayos de inhibición de pseudotipo se procesaron de forma independiente.
La Fig. 39 demuestra que los receptores de la vacuna NJ/76 tenían anticuerpos anti-tronco de HA elevados antes de la vacunación con Cal/09. Se analizaron diluciones en serie de suero de vacunados con NJ/76 (n = 20) o sujetos de control de la misma edad (n = 15) para determinar su reactividad a A) HA cH6/1 o B) HA NC/99 mediante ELISA y se calcularon los títulos finales de IgG. Debido a las cantidades limitadas de suero disponible, también se determinaron los títulos finales de IgG antes de la vacunación con Cal/09 para los vacunados con NJ/76 agrupados (N=5) y los sujetos de control (n=7) contra C) cH6/1 y D) NC/ 99. Cada grupo consistía en todos los individuos de cada grupo para los que se disponía de muestras de vacunación antes y después de Cal/09. Se realizaron pruebas T de Student no pareadas y los valores de p de dos colas <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. N.D. = no detectado. N.S = no significativo. *Estadísticamente significativo.
La Fig. 40 demuestra que los receptores de la vacuna NJ/76 tenían títulos elevados de HAI contra Cal/09 antes de la vacunación con Cal/09. A) Se determinaron los títulos de HAI para muestras de suero agrupadas antes de la vacunación con Cal/09 de vacunados con NJ/76 (n=5) y sujetos de control (n=7) contra Cal/09 y France/76 utilizando cRBC. B) También se realizaron ensayos de HAI contra Cal/09 utilizando muestras de suero correspondientes a los sujetos individuales de cada grupo para garantizar que los resultados agrupados fueran representativos del grupo en su conjunto. Se realizaron pruebas T de Student no pareadas y los valores de p de dos colas <0,05 se consideraron estadísticamente significativos. N.D. = no detectado.
•Estadísticamente significativo.
La Fig. 41 demuestra que las vacunas de NJ/76 y Cal/09 potenciaron anticuerpos ampliamente neutralizantes. Se realizaron ensayos de microneutralización en MDCK contra virus A) cH5/1 N3 y B) Cal/09 utilizando muestras de suero agrupadas tratadas con TPCK-tripsina recolectadas de vacunados con NJ/76 (n = 5) y sujetos de control (n = 7) antes y después de la vacunación con Cal/09. Después de la infección, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-NP y un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Los títulos de neutralización se definieron como la dilución de suero más baja que dio como resultado una reducción de al menos 50% de la señal específica.
La Fig. 42 demuestra que la vacunación secuencial con construcciones de cHA provoca anticuerpos específicos de tronco de HA y proporciona protección contra la sensibilización letal. Los ratones se cebaron con 20 μg de proteína cH9/1 y se les administró adyuvante por vía intranasal e intraperitoneal. Tres semanas más tarde, los ratones se reforzaron con 20 μg de proteína cH6/1 y se les administró adyuvante por vía intranasal e intraperitoneal. Como controles, los ratones se cebaron y reforzaron de manera similar utilizando BSA, o se les administró el virus FM1 inactivado por vía intramuscular. Los animales fueron desangrados y expuestos tres semanas después de la última vacunación con 5DL50 del virus AF/ort Monmouth/1/1947 (FM1). (A) Las placas de ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reactividad del tronco provocado por la vacunación. (B) Los ratones se pesaron diariamente durante 14 días para evaluar la protección frente a la sensibilización. (C) Curva de Kaplan Meier que representa la tasa de supervivencia después de la sensibilización. Los ratones vacunados con cH9/1 cH6/1 tuvieron una tasa de supervivencia estadísticamente mayor en comparación con los controles de BSA (p = 0,0003)
La Fig. 43 demuestra que la vacunación con cH6/1 provoca inmunidad específica del tronco que media la protección contra la sensibilización viral con cH9/1 N1. A los animales se les inoculó el virus YAM-HA para simular una infección previa o una vacunación contra el virus de la influenza. Tres semanas más tarde, los animales fueron vacunados con cH6/1 o BSA con adyuvante, por vía intranasal e intraperitoneal. A los animales de control se les inoculó B/Yamagata/16/1988 de tipo salvaje y se vacunaron de manera similar con BSA, o se les administró el virus cH9/1 N1 inactivado por vía intramuscular. Los animales fueron desangrados y sensibilizados con DL50 de 250 de virus cH9/1 N1 tres semanas después de la vacunación. (A) Los animales se pesaron durante 8 días para evaluar la protección contra la sensibilización. Los días 3-5, los animales YAM-HA cH6/1 demostraron una pérdida de peso estadísticamente menor en comparación con la cohorte YAM-HA BSA (p < 0,05). (B) Curva de Kaplan Meier que representa la supervivencia. Se observaron tasas de supervivencia estadísticamente diferentes en el grupo YAM-HA cH6/1 en comparación con la cohorte YAM-HA BSA (p = 0,038), así como en animales sin tratamiento previo y YAM WT BSA (p < 0,0001). La tasa de supervivencia de la cohorte YAM-HA BSA no fue estadísticamente diferente de la de la cohorte YAM WT BSA (p = 0,058). (C) Las placas de ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reactividad del tronco provocado por la vacunación. (D) Se representan los resultados de un ensayo de reducción de placa utilizando el virus cH5/1. (E) Los animales se vacunaron, se extrajo sangre y se cosechó la IgG total para el ensayo de inhibición de entrada de pseudopartículas basado en H5. El porcentaje de inhibición se evaluó como una disminución en la expresión de luciferasa en comparación con los controles.
La Fig. 44 demuestra que la vacunación con cH6/1 protege a los ratones de la sensibilización letal con virus de la influenza H5. A los animales se les inoculó el virus YAM-HA para simular una infección previa o una vacunación contra el virus de la influenza. Tres semanas más tarde, los animales fueron vacunados con cH6/1 o BSA con adyuvante, por vía intranasal e intraperitoneal. A los animales de control se les inoculó B/Yamagata/16/1988 de tipo salvaje y se vacunaron de manera similar con BSA o se les administró el virus cH5/1 N1 inactivado por vía intramuscular. Los animales fueron desangrados y sensibilizados con DL50 de 10 del reordenamiento 2:6 H5 en el fondo PR8 (véase, p. ej., Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). (A) Curva de Kaplan Meier que representa la supervivencia. Las diferencias en las tasas de supervivencia se acercaron a la significación estadística al comparar el grupo YAM-HA+cH6/1 con la cohorte YAM-HA+BSA (p = 0,06). (B) La duración de la supervivencia fue como promedio mayor en los animales a los que se había inoculado YAM-HA y vacunados con cH6/1 que en los animales vacunados con BSA (p = 0,037), así como en los controles sin tratamiento previo y YAM WT /BSA (p < 0,001). (C) Las placas ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reactividad del tronco provocado por la vacunación. Las diluciones de suero 1:50 se representaron frente al % de pérdida máxima de peso. Se determinó que un valor era un valor atípico y se omitió del análisis. Para la regresión lineal, R2 = 0,56 y p = 0,02.
La Fig. 45 demuestra que la vacunación con cHA provoca inmunidad específica del tronco que media la protección contra la sensibilización con el virus H1N1. (A-F) Los animales se cebaron con ADN que codificaba cH9/1 y a continuación, se vacunaron con cH6/1 y se reforzaron con proteína soluble cH5/1 (n=10) o BSA (n=5), mientras que los ratones de control positivo recibieron el virus inactivado por vía intramuscular (n=5). (A) Los animales fueron vacunados y sensibilizados con el virus FM1; los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como cambio en el porcentaje del peso inicial. (B) Gráfico que representa la supervivencia de los ratones sensibilizados en (A). (C) Los animales fueron vacunados y sensibilizados con el virus pH1N1; los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como cambio en el porcentaje del peso inicial. (D) Gráfico que representa la supervivencia de ratones sensibilizados en (C). (E) Los animales fueron vacunados y sensibilizados con el virus PR8; los
ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como cambio en el porcentaje del peso inicial. (F) Gráfico que representa la supervivencia de los ratones sensibilizados en (E). (G) Reactividad a HA H1 de suero de animales vacunados como se describe arriba en A-F y abajo en H-I y sensibilizados con DL50 de 5 de AF/M/1/1947 (A, B), DL50 de 10 de AN/etherland/602/2009 (C, D), o DL50 de 5 de AP/R/8/1934 (E, F, H, I). (H) Los animales se vacunaron como se describe anteriormente en A-F (cuadrado, n = 4) o no habían recibido tratamiento previo (triángulo, n = 3), mientras que los ratones de control positivo recibieron el virus PR8 inactivado por vía intramuscular (marca X, n = 5). Las células T CD8 se agotaron antes de la sensibilización con el virus PR8. Los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como un cambio en el porcentaje del peso inicial. (I) Gráfico que representa la supervivencia de ratones sensibilizados en (H). (J) Los animales se vacunaron como se describe para A-F. La IgG total se purificó para su uso en el ensayo de inhibición de la entrada de pseudopartículas basado en H2. El porcentaje de inhibición se evaluó como una disminución en la expresión de luciferasa en comparación con los controles. El fragmento Fab CR6261 se utilizó como control positivo.
La Fig. 46 demuestra que los anticuerpos contra el tronco de hemaglutinina se producen después de una infección replicativa. Los animales fueron infectados con 104 UFP del virus A/California/04/09 (Cal09), AN/ew Caledonia/20/99 (NC99) o AS/alomon Islands/3/06 (SI06). Se recogieron los sueros de los ratones cuatro semanas después de la infección y se analizaron los anticuerpos específicos del tronco de hemaglutinina mediante ELISA utilizando proteína cH6/1.
La Fig. 47 demuestra que los anticuerpos contra el tronco de hemaglutinina se refuerzan después de una segunda sensibilización con el virus de la influenza. Los animales fueron infectados con 104 UFP de NC99 y a continuación, se reforzaron cuatro semanas más tarde con 105 o 106 UFP del virus SI06 o 103 o 104 UFP del virus Cal09. Se recogieron sueros de los ratones cuatro semanas después de la segunda infección y se analizaron los anticuerpos específicos de tronco de hemaglutinina mediante ELISA utilizando proteína cH6/1. Los valores que se muestran en la Fig. 46 para los animales que solo recibieron una inoculación del virus NC99 se incluyeron para que sirvieran como comparación.
La Fig. 48 demuestra que el suero de ratones infectados secuencialmente protege a los animales no sometidos a tratamiento previo frente a la sensibilización letal con el virus H5. Los animales fueron infectados con 104 UFP de NC99 y a continuación, se reforzaron cuatro semanas más tarde con 106 UFP de SI06 o 104 UFP del virus Cal09. El suero recogido de estos animales se transfirió por vía intraperitoneal a animales no sometidos a tratamiento previo que fueron sensibilizados con una dosis letal del virus H5 recombinante. Los animales que recibieron suero de animales que solo experimentaron una infección por NC99 no estaban protegidos contra la sensibilización y murieron con una cinética similar a la de los controles. El suero de animales expuestos a los virus NC99 y SI06 protegió a 60% de los animales sensibilizados, mientras que el suero de animales infectados con los virus NC99 y Cal09 protegió a 80% de los ratones sensibilizados de la muerte. Las tasas de supervivencia entre los grupos NC99-SI06 y NC99-Cal09 fueron similares (p=0,575), mientras que las diferencias en las tasas de supervivencia en comparación con los grupos con solo NC99 fueron estadísticamente significativas (NC99-SI06 frente a NC99 p=0,018, NC99-Cal09 frente a NC99 p=0,0023).
La Fig. 49 demuestra que los mutantes de glicosilación del virus de la influenza se expresan y se glicosilan apropiadamente. Se transfectaron células 293 T con virus HA AP/R/8/34 de tipo salvaje (PR8) o construcciones de PR8 que tenían sitios de glicosilación introducidos en el dominio de cabeza de PR8 y/o sitios de glicosilación eliminados por mutación del dominio de tronco de PR8. El análisis de transferencia Western se realizó con el anticuerpo anti-HA2 de virus de la influenza A NR-4539 y se visualizó con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las proteínas virales mutantes que tenían sitios de glicosilación introducidos migraron a un peso molecular más alto que PR8 de tipo salvaje; aquellas que tenían sitios de glicosilación eliminados migraron a un peso molecular más bajo que PR8 de tipo salvaje. Todas las proteínas virales mutantes migraron al peso molecular esperado, lo que indica que los glicanos se habían añadido o eliminado con éxito in vitro en los sitios de glicosilación relevantes. Los sitios de glicosilación introducidos se indican para los mutantes 42-1,42-4 y 42-5.
La Fig. 50 demuestra que la adición de sitios de glicosilación y la eliminación de sitios de glicosilación en PR8 no tiene efecto sobre la expresión de las proteínas virales o su capacidad para plegarse a la conformación adecuada. Se transfectaron células 293 T con PR8 de tipo salvaje o mutantes de glicosilación de hemaglutinina PR8 o cH5/1. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se fijaron y tiñeron con el anticuerpo anti-dominio de cabeza (PY102) o el dominio anti-tronco (KΒ2, C179 y 6F12) apropiado y se incubaron con un anticuerpo anti-ratón de burro fluorescente. La reactividad de la fluorescencia se visualizó utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. (A) La introducción de sitios de glicosilación en el dominio de cabeza de PR8 no afectó la expresión de la proteína viral ni la unión del anticuerpo contra el tronco (6F12). (B) La tinción inmunofluorescente de proteínas virales en las que se habían introducido sitios de glicosilación en el dominio de cabeza tuvieron una reducción de la unión del anticuerpo anti-cabeza, lo que indica que la hiperglicosilación del dominio de cabeza enmascaraba el sitio de unión del anticuerpo. No hubo cambios en la unión de los anticuerpos anti-dominio de tronco que se unieron a los epítopos de conformación del dominio de tronco, lo que indica que los mutantes virales se plegaron correctamente. (C)
La inmunofluorescencia de mutantes virales PR8 con sitios de glicosilación introducidos en el dominio de cabeza y eliminados del dominio de tronco utilizando anticuerpos específicos anti-cabeza y anti-tronco demostraron que las proteínas se expresaron y plegaron correctamente. No hubo diferencia en la capacidad de los anticuerpos anti-tronco para unirse al dominio de tronco de las construcciones mutantes en las que los sitios de glicosilación se habían introducido en el dominio de cabeza (42-1,42-4 y 42-5) y se habían eliminado del dominio de tronco (A33/289) en comparación con PR8 de tipo salvaje.
La Fig. 51 demuestra mutantes de glicosilación virales que pueden unirse a receptores sialilados y virus mutantes viables rescatados. Las células transfectadas se incubaron con neuraminidasa (sialidasa) a 37°C durante 1 hora, a continuación, con una suspensión al 2% de glóbulos rojos de pollo. Los glóbulos rojos unidos se lisaron y la absorbancia del producto lisado se midió a 540 nm. Para rescatar el virus mutante de influenza A, se cotransfectaron células 293T con 1 |ug de 8 plásmidos de rescate pDZ PR8. Veinticuatro horas después de la transfección, se inoculó el sobrenadante que contenía el virus en huevos de gallina embrionados de 8 días. Se recogió fluido alantoideo después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó la presencia de virus por hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo y por formación de placa en células MDCK. Los mutantes virales de tronco de influenza A A289, A483 y A33/289 se unieron a los glóbulos rojos de pollo y pudieron ser rescatados.
Fig. 52. Esquema de HA de tipo salvaje y construcciones de expresión. (A) Hemaglutinina del virus de la influenza de longitud completa no escindida. El péptido señal es el componente más a la izquierda, el ectodominio HA es el componente medio y el dominio transmembrana y el endodominio son el componente más a la derecha. (B) Construcción de expresión con dominio de trimerización. El dominio transmembrana y el endodominio se intercambiaron por un sitio de escisión de trombina (tercer componente desde la izquierda), un dominio de trimerización T4 (cuarto componente desde la izquierda) y una etiqueta de hexahistidina (etiqueta 6xhis, quinto componente desde la izquierda) en la posición V503 (numeración H3). (C) Construcción de expresión sin dominio de trimerización. El dominio transmembrana y el endodominio se intercambiaron por una etiqueta de hexahistidina (etiqueta 6xhis, componente más a la derecha) en la posición de aminoácido 509 (H1, H2 y H5) o 508 (H3) respectivamente (numeración H3).
Fig. 53. La introducción de un dominio de trimerización influye en la estabilidad y formación de oligómeros en HA recombinantes. (A) Análisis de HA recombinantes con y sin dominio de trimerización mediante SDS-PAGE reductora y desnaturalizante. Las HA recombinantes que se expresan con el dominio de trimerización (+) muestran una mayor estabilidad que las HA expresadas sin (-). La HA no escindida (HA0) y los productos de escisión (HA1/producto de deg.; HA2) se indican con flechas. (B) Análisis SDS-PAGE reductor y desnaturalizante de HA entrecruzadas. En la transferencia se indican diferentes especies de HA. Los multímeros de alto peso molecular están indicados por H, los trímeros por T, los dímeros por D y los monómeros por M. (C) Panel izquierdo (recuadros 1-4): análisis de transferencia Western de HA del grupo 1 reducidas, desnaturalizadas y entrecruzadas de B sondeadas con un anticuerpo anti-etiqueta hexahistidina. Panel derecho (recuadro más a la derecha): control de entrecruzamiento (IgG) con BS3 analizado en una SDS-PAGE. Las diferentes especies (anticuerpo completo, cadena pesada, cadena ligera) se indican mediante flechas. Los pesos moleculares de las bandas marcadoras se indican a la izquierda de cada panel.
Fig. 54. Unión de anticuerpos reactivos contra el tronco a HA recombinantes PR8 (H1) y Cal09 (H1). (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco C179, CR6261 y 6F12 y anticuerpo reactivo con la cabeza PY102 y antisuero contra PR8 a HA de PR8 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización. (B) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco C179, CR6261 y 6F12 y anticuerpo reactivo con la cabeza 7B2 y antisuero Cal09 a HA Cal09 soluble recombinante sin (sin dominio trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio de trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización.
Fig. 55. Unión de anticuerpos reactivos con el tronco a HA recombinantes JAP57 (H2) y VN04 (H5). (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco C179 y CR6261 y anticuerpo reactivo con la cabeza 8F8 y antisuero H2 a HA JAP57 recombinante soluble sin (sin dominio trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización. (B) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco C179 y CR6261 y anticuerpo reactivo con la cabeza mAb#8 y antisuero H5 a HA VN04 recombinante soluble sin (sin dominio trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización.
Fig. 56. Unión de anticuerpos reactivos con el tronco a HA del grupo 2. (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco 12D1 y CR8020 y anticuerpo reactivo con la cabeza XY102 y antisuero H3 a HA HK68 recombinante soluble sin (sin dominio trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización. (B) Unión de anticuerpos reactivos con el tronco 12D1 y CR8020 y antisuero H3 a HA Wisc05 recombinante soluble sin (sin dominio trim. T4, líneas de color negro) o con (con dominio trim. T4, línea de color rojo) dominio de trimerización.
5. Descripción detallada
La divulgación se refiere a inmunógenos de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza (es decir, polipéptidos de HA de la gripe), que inducen una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra el dominio de tallo de HA conservado (a veces denominado en el presente documento dominio de "tronco") de los virus de influenza.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza. Tales polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza comprenden un dominio de tallo de HA que muestra un dominio de cabeza de HA globular heterólogo con respecto al dominio de tallo. Los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza diseñados para la vacunación comparten el mismo dominio de tallo de HA, pero son muy divergentes en sus cabezas globulares. Tales construcciones son modificadas genéticamente en formulaciones de vacunas tales como virus de influenza vivos, virus de influenza muertos, partículas similares a virus ("VLP"), vacunas de subunidades, vacunas divididas, etc., que provocan anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el tallo de HA conservado. Tales vacunas "universales" se pueden utilizar para inducir y/o potenciar respuestas inmunitarias de protección cruzada entre los subtipos de virus de la influenza.
A modo de antecedente, los anticuerpos neutralizantes contra los virus de la influenza se dirigen a la glicoproteína HA y previenen el paso de unión o fusión involucrado en la entrada viral. La exposición a los virus de la influenza provoca dos subconjuntos básicos de anticuerpos neutralizantes: los dirigidos a la cabeza globular específica de la cepa (un dominio que no está conservado en las diversas cepas y subtipos del virus de la influenza) y los dirigidos al tallo altamente conservado de la glicoproteína HA. La cabeza globular de HA no conservada porta los epítopos inmunodominantes: se cree que los anticuerpos anti-cabeza globular específicos de la cepa son más potentes que las especificidades de los anticuerpos anti-tallo, lo que explica la inmunidad en gran medida específica de la cepa conferida por la infección con las vacunas actuales.
Los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza divulgados en el presente documento se basan, en parte, en las estrategias de diseño racional de los autores de la presente invención para las vacunas del virus de la influenza que provocan anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el tallo de HA. En este sentido, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza está diseñado para compartir un dominio de tallo relativamente bien conservado de exposiciones/vacunaciones previas, pero contiene un dominio de cabeza globular de HA heterólogo, preferiblemente uno al que el sujeto vacunado previsto no ha sido expuesto previamente. La exposición a esta construcción debería potenciar principalmente los anticuerpos dirigidos al tallo de HA conservado. Las inmunizaciones repetidas con el tallo de HA conservado y el cambio de la cabeza globular deberían inducir anticuerpos robustos de neutralización cruzada contra la región del tallo común de HA.
Al diseñar los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, se debe tener cuidado de mantener la estabilidad de la proteína resultante. En este sentido, se recomienda que se mantengan los restos de cisteína identificados como Ap y Aq en la Fig. 1, ya que contribuyen a la estabilidad del tronco de HA, como se analiza con más detalle en la Sección 5.1 más abajo. Para obtener la mejor estabilidad, se prefiere "intercambiar" el dominio globular de HA como un todo (entre los restos de cisteína Ap y Aq como se muestra en la Fig. 1) ya que la conformación resultante sería la más cercana a la estructura nativa. En otras palabras, el "conector" al que se hace referencia en la Sección 5.1.2 puede ser el dominio de cabeza globular completo de una HA heteróloga.
En lugar de "intercambiar" la cabeza globular nativa del tronco de HA, la cabeza globular puede hacerse heteróloga con respecto al tronco conservado alterando los bucles que contribuyen a los epítopos de cabeza globular de HA. Es posible que este enfoque no funcione tan bien para generar la respuesta inmunitaria deseada contra el tronco conservado, a menos que la cabeza globular alterada esté diseñada para ser muy diferente de la cabeza de HA globular nativa, especialmente cuando se utiliza una HA a la que la población ha estado expuesta. Sin embargo, tales alteraciones pueden lograrse, por ejemplo, alterando la mayoría de los cinco bucles que contribuyen a los epítopos de cabeza globular de HA. En un enfoque útil, los cinco bucles se pueden modificar.
Las construcciones utilizadas para la vacunación se pueden diseñar ventajosamente para los sujetos/población particular que se vayan a vacunar. Hay tres subtipos de influenza a los que los seres humanos que viven hoy en día han estado expuestos: los subtipos H1, H2 y H3. Los virus de influenza del subtipo H2 desaparecieron de la población en 1968, mientras que los virus de influenza de los subtipos H1 y H3 persisten en la población hasta el día de hoy. Como resultado, los adultos que viven hoy que nacieron antes de 1968 probablemente hayan estado expuestos a cada uno de los subtipos H1, H2 y H3. En contraste, los adultos que viven hoy que nacieron después de 1968 probablemente solo hayan estado expuestos a los subtipos H1 y H3.
Por lo tanto, en realizaciones preferidas para la vacunación de adultos, los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina de influenza no poseen un dominio de cabeza globular de HA de un virus de influenza de subtipo H1, H2 o H3, pero poseen un dominio de tallo de HA de uno de estos tres subtipos. La cabeza globular heteróloga se puede seleccionar entre la HA de cualquier subtipo no H1, no H2 o no H3. Además, las construcciones quiméricas separadas preparadas utilizando tallos H1/H2, por un lado, y tallos H3 por el otro se pueden utilizar beneficiosamente en un programa de vacunación -- los subtipos H1 y H2 son subtipos de HA del Grupo 1 que comparten un dominio de tronco conservado; mientras que H3 es un subtipo del Grupo 2 que tiene un dominio de tronco que es estructuralmente diferente del tronco
del Grupo 1. El uso de construcciones H1 y H3 garantizaría la generación/potenciación de una respuesta inmunitaria contra cada dominio de tallo. La inmunización de sujetos adultos con tales polipéptidos quiméricos de hemaglutinina de influenza aumentará la respuesta inmunitaria de memoria del sujeto, lo que dará como resultado la producción a gran escala de anticuerpos de dominio anti-tallo ampliamente neutralizantes y con reacción cruzada que brindan inmunidad duradera al virus de la influenza en el sujeto.
Los lactantes que no han estado expuestos, por supuesto, no han tendido contacto con ningún subtipo del virus de la influenza. Como resultado, se puede construir una amplia gama de combinaciones de tallo/cabeza globular de HA para su uso en vacunas para lactantes. En una realización preferida, se pueden vacunar lactantes que no han tenido contacto previo con construcciones preparadas utilizando el tallo de HA de una cepa del Grupo 1 (H1 o H2) o del Grupo 2 (H3) y una cabeza globular de una cepa heteróloga; es decir, cepas no H1, no H2 y/o no H3. Se pueden utilizar ventajosamente tres construcciones de HA quiméricas diferentes para cada tallo de HA en tres vacunaciones secuenciales para inducir una respuesta de protección cruzada.
Debe entenderse que el uso de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento es ventajoso porque (i) dichos polipéptidos son altamente estables (debido a que poseen un dominio de cabeza globular intacto) y (ii) los sistemas inmunológicos de los sujetos a los que se les administran dichos polipéptidos no han estado expuestos previamente a los dominios de cabeza globular de la hemaglutinina quimérica de la influenza, pero han estado expuestos a los epítopos conservados de los dominios del tallo de hemaglutinina quimérica de la influenza.
El polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza se ilustra mediante los Ejemplos de trabajo (p. ej., Sección 6.2) que demuestran la construcción de un polipéptido quimérico de HA de influenza que comprende un tallo de HA y muestra una cabeza de HA heteróloga, y la producción de una proteína HA quimérica estable de este polipéptido que reacciona de forma cruzada con anticuerpos contra el dominio de tallo y el dominio de cabeza.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza que comprenden un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo con respecto a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (p. ej., el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza se obtienen de diferentes subtipos de hemaglutinina del virus de la influenza). Los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionados en el presente documento pueden generarse combinando un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza (véase la Sección 5.2) con un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (Sección 5.3). Es decir, utilizando los principios de la divulgación, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento (véase la Sección 5.1.1, más abajo) y los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento (Sección 5.1.2, más abajo) se pueden mezclar y emparejar para generar un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza) que comprenden uno o más sitios de glicosilación modificados y/o uno o más sitios de glicosilación de origen no natural. Como se muestra en la Fig. 19B, la glicosilación de la hemaglutinina de tipo salvaje se produce tanto en el dominio de cabeza globular como en el del tallo. Se cree que la glicosilación dentro de estos dominios puede enmascarar regiones antigénicas, lo que permite que un virus de la influenza evada la respuesta del sistema inmunitario del anfitrión. Por ejemplo, se sabe que las cepas del virus de la influenza estacional (p. ej., H1N1 y H3N2) adquieren sitios de glicosilación adicionales con el tiempo en las regiones antigénicas inmunodominantes del dominio de cabeza globular. Sin embargo, dentro del contexto de un polipéptido de HA del virus de la influenza descrito en el presente documento, la glicosilación dentro del dominio de tallo del polipéptido puede dificultar o prevenir las respuestas inmunitarias deseadas contra las regiones antigénicas conservadas que se encuentran en este dominio. Véase la Fig. 19C. En una realización, se proporciona en el presente documento un polipéptido de HA de la gripe que comprende un dominio de tallo que tiene al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En otra realización, en el presente documento se proporciona un polipéptido de HA de la gripe que comprende un dominio de cabeza globular de HA, en donde el dominio de cabeza globular de HA comprende al menos un sitio de glicosilación de origen no natural que tiene una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, y en donde Xaa es cualquier aminoácido. En otra realización, el polipéptido de HA de la gripe comprende (1) un dominio de tallo que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde los uno o más sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural, en donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado; y (2) un dominio de cabeza globular de HA que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural que tienen una secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido. En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado en el dominio de tallo del polipéptido de HA de la gripe comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido.
Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que una respuesta inmunitaria a las regiones antigénicas conservadas dentro del dominio de tallo del polipéptido de Ha del virus de la influenza proporcionado en el presente documento puede incrementarse modificando uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio de tallo de una manera que interrumpe la glicosilación (es decir, el anclaje de un glicano) en los sitios. Además, se cree que el enmascaramiento de las regiones antigénicas inmunodominantes del dominio de cabeza globular de HA mediante la adición de uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en estas regiones inmunodominantes también puede aumentar la inmunogenicidad de las regiones antigénicas subinmunodominantes conservadas dentro del dominio de tallo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para su uso los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento para prevenir y/o tratar y/o inmunizar contra la enfermedad y/o infección del virus de la influenza en un sujeto, es decir, los polipéptidos de HA de la gripe se pueden utilizar para vacunar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza o para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o infección por el virus de la influenza. En una realización, el método de uso del polipéptido de HA de la gripe es para la prevención de una enfermedad del virus de la influenza en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido de HA de la gripe. En otra realización, el método de uso del polipéptido de HA de la gripe es para el tratamiento de una enfermedad y/o infección por el virus de la influenza en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido de HA de la gripe. En otra realización más, el método de uso del polipéptido de HA de la gripe es para la inmunización contra la enfermedad y/o infección por el virus de la influenza en un sujeto.
En una realización, en el presente documento se proporcionan virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento. Tales virus se pueden utilizar como vacunas contra el virus de la influenza, p. ej. los virus de la influenza proporcionados en el presente documento que expresan uno o más de los polipéptidos de HA de la gripe (polipéptidos quiméricos de hemaglutinina HA de virus de la influenza) en el presente documento se pueden utilizar en una vacuna de subunidades, una vacuna dividida, una vacuna inactivada y/o una vacuna de virus vivo atenuado.
En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza) descritos en el presente documento comprenden una neuraminidasa (NA), o un fragmento de la misma, que es de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la influenza) que aquella de la que deriva el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de los polipéptidos de HA de la gripe. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza) comprenden una neuraminidasa de una cepa diferente del virus de la influenza que el dominio de cabeza globular y/o el dominio de tallo del polipéptido de HA de la gripe. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de HA de influenza comprenden una neuraminidasa de un virus de la influenza diferente con respecto a las otras proteínas codificadas por los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de HA de la gripe.
En una realización, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.5, más abajo).
En otra realización, en el presente documento se proporcionan vectores, p. ej., vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.6, más abajo). En una realización específica, el vector es un vector plasmídico. En otra realización específica, el vector es un vector viral (véanse, p. ej., las Secciones 5.7 y 5.8, más abajo), p. ej., un vector del virus de la influenza en el que un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza) descrito en el presente documento se ha incorporado a los viriones o un vector del virus de la influenza que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En otra realización específica, el vector es un vector bacteriano (véase, p. ej., la Sección 5.10, más abajo). En otra realización específica, el vector es un baculovirus. Los vectores proporcionados en el presente documento pueden diseñarse para la expresión de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza usando células procarióticas (p. ej., bacterianas) o células eucarióticas (p. ej., células de insectos, células de levadura, células vegetales, algas y células de mamíferos). Como tales, también se proporcionan en el presente documento células (es decir, células procarióticas y eucarióticas) que comprenden los vectores proporcionados en el presente documento y capaces de producir uno o más polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento.
En otra realización, se proporcionan en el presente documento partículas similares a virus (VLP) y virosomas en donde se han incorporado polipéptidos de HA de influenza (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento (véase la Sección 5.9, más abajo).
En otra realización, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento, y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP, bacterias o virosomas descritos en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.14). En una realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En otra realización específica, una composición proporcionada en el presente documento comprende un virus de la influenza o un virus que no es de influenza que tiene un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento.
En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de HA de la gripe descritos en el presente documento (véase, p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos, y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento, se administran a un sujeto para inmunizar al sujeto frente a múltiples cepas o subtipos del virus de la influenza. En una realización específica, dicha administración es suficiente para generar una respuesta inmunitaria del anfitrión en dicho individuo contra uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete subtipos cualesquiera de hemaglutinina de influenza A conocidos o un subtipo de hemaglutinina de influenza A identificado posteriormente. En otra realización específica, dicha administración es suficiente para generar una respuesta inmunitaria del anfitrión en dicho individuo contra cualquier subtipo de hemaglutinina de influenza B ahora conocido o identificado posteriormente.
En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de HA de la gripe descritos en el presente documento (véase, p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, véase la Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento, se administran a un sujeto una vez como una sola dosis. En una realización específica, el sujeto es un niño humano. En otra realización específica, el sujeto es un adulto humano. En otra realización específica, el sujeto es un ser humano de edad avanzada. En ciertas realizaciones, un primer polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento o una composición de ácido nucleico, vector, VLP o virosoma descrita en el presente documento se administra a un sujeto como una dosis única, seguido de la administración de un segundo polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento o una composición de ácido nucleico, vector, VLP o virosoma descrita en el presente documento de 3 a 6 semanas más tarde.
En ciertas realizaciones, se administran uno o más polipéptidos de HA de la gripe descritos en el presente documento (véase, p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento. a un sujeto como una dosis única, seguido de la administración de una segunda dosis de 3 a 6 semanas después, en donde el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) utilizado en la primera dosis es de una cepa o subtipo diferente al dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de los polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) utilizado en la segunda dosis. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse al sujeto a intervalos de 6 a 12 meses después de la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de HA de la gripe utilizado en el refuerzo es de una cepa o subtipo diferentes al dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de HA de la gripe utilizado en la primera y segunda dosis. En una realización específica, el sujeto es un niño humano. En otra realización específica, el sujeto es un adulto humano. En otra realización específica, el sujeto es un ser humano de edad avanzada.
En una realización específica, para la administración a lactantes humanos, dos dosis de polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento (véase, p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento se administran a un lactante, en donde el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de HA de la gripe utilizado en la primera dosis es de una cepa o subtipo diferentes al del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de los polipéptidos de HA de influenza utilizados en la segunda dosis.
En una realización específica, para la administración a lactantes humanos, se administran a un lactante tres dosis de polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza, Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento, en donde los dominios de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de HA de la gripe utilizados en la primera, segunda y tercera dosis son de diferentes cepas o subtipos del virus de la influenza.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende exponer al sujeto a una hemaglutinina de un virus de la influenza con la que no ha tenido contacto previo el sujeto, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente al virus de la influenza y/o la hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, la hemaglutinina es un polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento. En una realización específica, la hemaglutinina es un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza.
En una realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende administrar a dicho sujeto uno o más virus de la influenza, en donde cada uno de dichos uno o más virus de la influenza comprende un polipéptido de hemaglutinina con el que el sujeto no ha tenido contacto previamente, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente a los uno o más virus de influenza. En una realización específica, los uno o más virus de influenza son un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y/o H17. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 y (ii) una segunda administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 en donde el virus de influenza de la primera administración es de un subtipo diferente al virus de la influenza de la segunda administración. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17; (ii) una segunda administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17; y (iii) una tercera administración de un virus de influenza del subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde los virus de influenza de las administraciones primera, segunda y tercera son de diferentes subtipos.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende administrar a dicho sujeto uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente a los uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, dichos uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en una composición (p. ej., una composición que comprende una vacuna). En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en un vector, p. ej., un vector del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en una VLP. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en un virosoma. En una realización específica, los uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza son un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza del subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y/o H17. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o H17 y (ii) una segunda administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de la primera administración es de un subtipo diferente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de la segunda administración. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, h 4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o H17; (ii) una segunda administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17; y (iii) una tercera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, h 6, h 7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza de la primera, segunda y tercera administración son de diferentes subtipos de virus de la influenza.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende (i) cebar dicho sujeto mediante la administración a dicho sujeto de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de hemaglutinina, un virus que expresa dicho polipéptido de hemaglutinina, una VLP que expresa dicho polipéptido de hemaglutinina, etc.) de un subtipo de influenza (p. ej., una hemaglutinina H1), y después de un período de tiempo, (ii) reforzar dicho sujeto con un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En una realización específica, el polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina HA del virus de la influenza que comprende un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) con el que el sujeto no ha tenido contacto previo y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) que es igual o similar (p. ej., de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza) al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza en el polipéptido de hemaglutinina utilizado en el cebado del paso (i). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un segundo refuerzo, que comprende una segunda administración del mismo o diferente polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido HA
de la gripe, etc.). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un tercer refuerzo, que comprende una tercera administración del mismo o diferente polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo, o entre los refuerzos si se administra más de un refuerzo, de dicho sujeto puede ser, por ejemplo, de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o más. En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo (o entre el primer y el segundo refuerzo) de dicho sujeto puede, por ejemplo, oscilar entre 3-5 días, 7-10 días, 7-14 días, 14-21 días, 14-28 días, 21-28 días, 21 días a 1 mes, 1 mes a 2 meses, 1 mes a 3 meses, 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses o 4 meses a 6 meses.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende (i) cebar dicho sujeto mediante la administración a dicho sujeto de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza sin cabeza (es decir, polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de hemaglutinina, un virus que expresa dicho polipéptido de hemaglutinina, una VLP que expresa dicho polipéptido de hemaglutinina, etc.) tales como los descritos en el presente documento de un subtipo de influenza (p. ej., una hemaglutinina H1) y, después de un período de tiempo, (ii) reforzar dicho sujeto con un polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En una realización específica, el polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) con el que el sujeto no ha tenido contacto previo y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) que es igual o similar (p. ej., de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza) al polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza en el polipéptido de hemaglutinina sin cabeza (es decir, polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza) utilizado en el cebado del paso (i). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un segundo refuerzo, que comprende una segunda administración del mismo polipéptido de HA de la gripe o uno diferente descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un tercer refuerzo, que comprende una tercera administración del mismo o diferente polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En realizaciones específicas, el polipéptido de HA de la gripe (que en realizaciones específicas es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) utilizado en el segundo y/o tercer refuerzo comprende un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza que es igual o similar al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de la HA sin cabeza y puede comprender o no una cabeza diferente. En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo, o entre los refuerzos si se administra más de un refuerzo, de dicho sujeto puede ser, por ejemplo, de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o más. En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo (o entre el primer y el segundo refuerzos) de dicho sujeto puede, por ejemplo, oscilar entre 3-5 días, 7-10 días, 7-14 días, 14-21 días, 14-28 días, 21-28 días, 21 días a 1 mes, 1 mes a 2 meses, 1 mes a 3 meses, 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses o 4 meses a 6 meses.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende (i) cebar dicho sujeto mediante la administración a dicho sujeto de un primer polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.) y, después de un período de tiempo, (ii) reforzar dicho sujeto con un segundo polipéptido de HA de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En una realización específica, el segundo polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) con el que el sujeto no ha tenido contacto previo y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (o una parte del mismo) que es igual o similar (p. ej., de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza) al polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del primer polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza utilizado en la preparación del paso (i). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un segundo refuerzo, que comprende una segunda administración del primer o segundo polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), o un polipéptido de HA de la gripe diferente (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En ciertas realizaciones, al sujeto se le puede administrar un tercer refuerzo, que comprende la administración de uno de los mismos polipéptidos de HA de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) administrado previamente o un polipéptido de HA de la gripe diferente (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza ) descrito en el
presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de HA de la gripe, un virus que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, una VLP que expresa dicho polipéptido de HA de la gripe, etc.). En realizaciones específicas, el polipéptido de HA de la gripe utilizado en el segundo y/o tercer refuerzos es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza que es igual o similar al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del primer polipéptido de HA de la gripe (que en realizaciones específicas, es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) y puede comprender o no una cabeza diferente. En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo, o entre los refuerzos si se administra más de un refuerzo, de dicho sujeto puede ser, por ejemplo, de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses o más. En ciertas realizaciones, el período de tiempo entre el cebado y el refuerzo (o entre el primer y el segundo refuerzos) de dicho sujeto puede, por ejemplo, oscilar entre 3-5 días, 7-10 días, 7-14 días, 14-21 días, 14-28 días, 21-28 días, 21 días a 1 mes, 1 mes a 2 meses, 1 mes a 3 meses, 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses o 4 meses a 6 meses.
5.1 Polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza
En el presente documento se proporcionan polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenzas que comprenden o consisten en un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza (p. ej., el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza y el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza se derivan de diferentes subtipos de hemaglutinina del virus de la influenza). Los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza se describen en la Sección 5.2, más abajo. Los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza, que son capaces de formar dominios de tallo sin cabeza, estables, se describen en la Sección 5.3, más adelante.
Una hemaglutinina de influenza de longitud completa típicamente comprende un dominio HA1 y un dominio HA2. El dominio de tallo está formado por dos segmentos del dominio HA1 y la mayor parte o la totalidad del dominio HA2. Los dos segmentos del dominio HA1 están separados, en secuencia primaria, por el dominio de cabeza globular (véase, p. ej., los restos de aminoácidos entre los restos designados Ap y Aq en la figura 1). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico descritos en el presente documento mantienen dicha estructura. Es decir, en ciertas realizaciones, los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comprenden una estructura de tallo estable compuesta por un dominio HA1 y un dominio HA2, y un dominio de cabeza globular que separa los dos segmentos del dominio HA1 (en secuencia primaria), donde dicho dominio cabeza globular es heterólogo con respecto al dominio tallo formado por los otros segmentos del dominio HA1 y el dominio HA2.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.1.2, más abajo) o un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje, como el dominio de tallo de hemaglutinina de un virus de la influenza descrito en la Sección 5.4, más abajo) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véanse, p. ej., las Secciones 5.2 y 5.4.2, más abajo) o un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje), en donde dicho el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, y dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del subtipo H1 o H3 del virus de la influenza A.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., Sección 5.3 y 5.4.1, más abajo) o un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., las Secciones 5.2 y 5.4.2, más adelante) o un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje), en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, y en el que dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del subtipo H2 del virus de la influenza A.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véanse, p. ej., las Secciones 5.3 y 5.4.1, más abajo) o un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., las Secciones 5.2 y 5.4.2, más adelante) o un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje), en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, y en el que dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del subtipo H5 del virus de la influenza A.
En una realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véanse, p. ej., las Secciones 5.3 y 5.4.1, más abajo) o un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A subtipo H1, H2, H3, h 4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.3 y 5.4.1, más adelante) o un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A subtipo H4, h 6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.3 y 5.4.1, más adelante) o un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del subtipo H1, H2 o H3 del virus de la influenza aviar, en donde dicho el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento (véase, p. ej., la Sección 5.3 y 5.4.1, más adelante) o un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de hemaglutinina del virus de la influenza de cualquier cepa o subtipo conocido del virus de la influenza (p. ej., cualquier polipéptido de dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de tipo salvaje) y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del subtipo H3 del virus de la influenza equina, en donde dicho dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de influenza A de subtipo H1 y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de influenza Un virus del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 o H17. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2 o H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza A de subtipo H3 y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza Un virus del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 en el que dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho Polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2 o H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza A de subtipo H2 y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza Un virus del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 en el que dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho Polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2 o H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza B, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho virus de la influenza polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza B y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho virus de la influenza polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2 o H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica que se proporciona en el presente documento, se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza B y (ii) un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza B, en donde dicho polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A A/California/7/2009 (H1) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 o H16. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A A/California/7/2009 (H1) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de influenza A de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10,
H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H4. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza proviene de un virus de la influenza A del subtipo H5. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H6. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza proviene de un virus de la influenza A del subtipo H7. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H8. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza proviene de un virus de la influenza A del subtipo H9. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H10. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza proviene de un virus de la influenza A del subtipo H11. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H12. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H13. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H14. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H15. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H16.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A similar a ABrisbane/59/2007 (H1) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 o H16. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A/Carolina del Sur/1918 (H1) y (ii) una cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido de dominio es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 o H16. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A AL/TSSR/92/1977 (H1) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 o H16. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A A/California/04/2009 (H1) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 o H16. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3.
En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A AP/erth/16/2009 (H3) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el pólipo del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H5. En otra realización específica, el pólipo del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de A/Viet Nam/1203/04 (H5).
En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H7. En otra realización específica, el pólipo del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de AA/lberta/24/01 (H7). En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A A/Brisbane/10/2007 similar (H3) y (ii) un virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A AH/ong Kong/1/1968 (H3) y (ii) un virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A A/California/1/1988 (H3) y (ii) un polipéptido de hemaglutinina del virus de la
influenza polipéptido del dominio de cabeza de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicha hemaglutinina del virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A AA/nn Arbor/6/60 (H2) y (ii) un virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende o consiste en (i) un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza del virus de la influenza A AP/uerto Rico/8/1934 (H1) y (ii) un virus de la influenza polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde dicho virus de la influenza el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina es heterólogo a dicho polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A de subtipo H1, H2, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H14 o H15. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H1, H2, H5, H6 o H9. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H1. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H2. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H3. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza no es de un virus de la influenza A del subtipo H5. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H5. En otra realización específica, el pólipo del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de A/Viet Nam/1203/04 (H5). En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H6. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de Am/allard/Sweden/81/02 (H6). En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de un virus de la influenza A del subtipo H9. En otra realización específica, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es de Ag/allina de Guinea/Hong Kong/WF10/99 (H9).
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza y un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza, y en el que el polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza tiene una estructura primaria de, en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y una HA2. La secuencia primaria de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionada en el presente documento podría estar formada por un solo polipéptido, o podría estar formada por múltiples polipéptidos. Normalmente, un único polipéptido se expresa mediante cualquier técnica que un experto en la materia considere adecuada.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento es monomérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento es multimérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento es trimérico.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un péptido señal. Normalmente, el péptido señal se escinde durante o después de la expresión y traducción del polipéptido para producir un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico maduro. En ciertas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza maduro que carecen de un péptido señal. En realizaciones en las que un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un péptido señal, el péptido señal podría basarse en cualquier péptido señal del virus de la influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en los péptidos señal de influenza A. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en el péptido señal de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el péptido señal podría ser cualquier péptido señal que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el péptido señal se selecciona entre SEQ ID NO:18-33.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un dominio luminal. En realizaciones en las que un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico proporcionado en el presente documento comprende un dominio luminal, el dominio luminal podría basarse en cualquier dominio luminal de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios luminales se basan en los dominios luminales de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios luminales se basan en el dominio luminal de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio luminal puede ser cualquier dominio luminal que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio luminal se selecciona entre SEQ ID NO:98-113. En ciertas realizaciones, los dominios luminales son de la misma hemaglutinina que el dominio de tallo. En ciertas realizaciones, los dominios luminales son de la cepa o subtipo del virus de la influenza como la subunidad HA2 del dominio de tallo.
En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico proporcionado en el presente documento comprende un dominio transmembrana. En realizaciones en las que un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico proporcionado en el presente documento comprende un dominio transmembrana, el dominio transmembrana podría basarse en cualquier dominio transmembrana de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana se basan en los dominios transmembrana de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana se basan en un dominio transmembrana de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana podría ser cualquier dominio transmembrana que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona entre SEQ ID NO:114-129. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana son de la misma hemaglutinina que el dominio de tallo. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana son de la cepa o subtipo del virus de la influenza como la subunidad HA2 del dominio de tallo.
En ciertas realizaciones, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un dominio citoplásmico. En realizaciones en las que un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento comprende un dominio citoplásmico, el dominio citoplásmico podría basarse en cualquier dominio citoplásmico de la influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos se basan en los dominios citoplásmicos de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos se basan en un dominio citoplásmico de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico podría ser cualquier dominio citoplásmico que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico se selecciona entre SEQ ID NO:130-145. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos son de la misma hemaglutinina que el dominio de tallo. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos son de la cepa o subtipo del virus de la influenza como la subunidad HA2 del dominio de tallo.
En ciertas realizaciones, uno o más de los sitios de glicosilación en un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento se modifican (p. ej., mediante la adición, eliminación o sustitución de aminoácidos). En realizaciones específicas, uno o más sitios de glicosilación se modifican de manera que la glicosilación en estos sitios no se produzca durante el procesamiento y la maduración del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que la HA de la influenza normalmente comprende uno o más sitios de glicosilación (p. ej., Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, o, en ciertas realizaciones, en las que Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro). En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado está ubicado en el dominio de tallo del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen de forma conservativa con un resto de aminoácido que interrumpe el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen con cualquier resto de aminoácido que interrumpa el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de asparragina en un sitio de glicosilación se sustituyen con alanina. En una realización particular, la asparragina en la posición 38 de una hemaglutinina H3 se cambia a una alanina. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico comprende uno o más sitios de glicosilación que no se producen de forma natural en su dominio de cabeza globular. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico comprende uno o más sitios de
glicosilación modificados y/o sitios de glicosilación de origen no natural, como se describe en la Sección 5.4, más adelante.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionados en el presente documento son capaces de formar una estructura tridimensional que es similar a la estructura tridimensional de una hemaglutinina de influenza nativa. La similitud estructural podría evaluarse basándose en cualquier técnica que los expertos en la materia consideren adecuada. Por ejemplo, reacción, p. en condiciones no desnaturalizantes, de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza con un anticuerpo o antisuero neutralizante que reconoce una hemaglutinina de influenza nativa podría indicar una similitud estructural. Antisueros o anticuerpos neutralizantes útiles se describen en, p. ej. Sui, et al., 2009, Nat. Struct. Mol. Biol. 16(3):265-273, Ekiert et al., 26 de febrero de 2009, Science [DOI: 10.1126/science.1171491], y Kashyap et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o antisuero es un anticuerpo o antisuero que reacciona con un epítopo no contiguo (es decir, no contiguos en secuencia primaria) que está formado por la estructura terciaria o cuaternaria de una hemaglutinina.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico proporcionados en el presente documento comprenden además uno o más dominios polipeptídicos. Los dominios polipeptídicos útiles incluyen dominios que facilitan la purificación, el plegamiento y la escisión de porciones de un polipéptido. Por ejemplo, una etiqueta His (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO:166), epítopo FLAG u otra etiqueta de purificación puede facilitar la purificación de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la etiqueta His tiene la secuencia, (Hís)n , donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mayor. Un dominio foldon, o trimerización, de la fibritina del bacteriófago T4 puede facilitar la trimerización de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. El dominio de foldon puede tener cualquier secuencia de foldon conocida por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Papanikolopoulou et al., 2004, J. Biol. química 279(10):8991 -8998, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Los ejemplos incluyen GSGYIp Ea PRDGQAYVRKDGeWv LLSTFL (SEQ ID NO:167). Un dominio foldon puede ser útil para facilitar la trimerización de polipéptidos solubles proporcionados en el presente documento. Los sitios de escisión se pueden utilizar para facilitar la escisión de una parte de un polipéptido, p. ej., la escisión de una etiqueta de purificación o un dominio de pliegue o ambos. Los sitios de escisión útiles incluyen un sitio de escisión de trombina, p. ej., uno con la secuencia LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)).
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de hemaglutinina de influenza quiméricos son polipéptidos solubles, tales como los descritos en los Ejemplos 6 y 9, más adelante.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza de los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quiméricos descritos en el presente documento mantienen los restos de cisteína identificados en los polipéptidos de hemaglutinina de influenza como Ap y Aq en la Fig. 1, es decir, los restos de cisteína identificados en los polipéptidos de hemaglutinina de influenza como Ap y Aq en la Fig. 1 se mantienen en los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico descritos en el presente documento. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, en la secuencia primaria de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento: (i) el segmento N-terminal de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza termina en el resto de cisteína identificado como Ap en la Fig. 1, (ii) el segmento C-terminal de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comienza en el resto de cisteína identificado como Aq en la Fig. 1; y (iii) el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza. Los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se describen en detalle en la Sección 5.1.2, más adelante.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento no termina exactamente en Ap (p. ej., Cys52 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), pero en un resto en la secuencia y proximidad estructural a Ap. Por ejemplo, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenzas descritos en el presente documento termina en Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-g, Ap-10, Ap-11, Ap-12, Ap-13, Ap-14, Ap-15, Ap-16, Ap-17, Ap-18, Ap-19, Ap-20, Ap-21, Ap-22, Ap-23, Ap-23, Ap-24, Ap-25, Ap-26, Ap-27, Ap-28, Ap-29, Ap-30. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento termina en el rango de Ap-1 a Ap-3, Ap-3 a Ap-5, Ap-5 a Ap-8, Ap-8 a Ap-10, Ap-10 a Ap-15, Ap-15 a Ap-20, Ap-20 a Ap-30, Ap-30 a Ap-40. Por ejemplo, Leu un segmento de tallo N-terminal de HA1 que termina en Ap-10 terminaría en Leu42 de una hemaglutinina H3. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenzas descritos en el presente documento termina en Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7, Ap+8, Ap+9, Ap+10, Ap+11, Ap+12, Ap+13, Ap+14, Ap+15, Ap+16, Ap+17, Ap+18, Ap+19, Ap+20, Ap+21, Ap+22, Ap+23, Ap+24, Ap+25, Ap+26, Ap+27, Ap+28, Ap+29, Ap+30, Ap+31, Ap+32, Ap+33, Ap+34, Ap+35, Ap+36, Ap+37,
Ap+38, Ap+39, Ap+40. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento termina en el rango de Ap+1 a Ap+5, Ap+5 a Ap+10, Ap+10 a Ap+15, Ap+15 a Ap+20, Ap+20 a Ap+25, Ap+25 a Ap+30, Ap+30 a Ap+35, Ap+35 a Ap+40, o unp+40 a Ap+50. Por ejemplo, un segmento de tallo N-terminal de HA1 que termina en Ap+38 terminaría en Arg90 de una hemaglutinina H3. El extremo de un segmento de tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el extremo del segmento de tallo C-terminal de HA1 y el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza de modo que el polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza resultante sea capaz de formar un polipéptido de hemaglutinina tridimensional. estructura similar a una hemaglutinina de influenza de tipo salvaje. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento no comienza en Aq (p. ej., Cys277 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), pero en un resto en la secuencia y proximidad estructural a Aq. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comienza aproximadamente en Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8,
Aq-9, Aq-10, Aq-11, Aq-12, Aq-13, Aq-14, Aq-15, Aq-20, Aq-25, Aq-30, Aq-35, Aq-40, Aq-45, Aq-50, Aq-55, Aq-60, Aq-65, Aq-70, Aq-75, o unq-80.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comienza en el rango de Aq-1 a Aq-5, Aq-5 a Aq-10, Aq-10 a Aq-15,
Aq-15 a Aq-20, Aq-20 a Aq-25, Aq-25 a Aq-30, Aq-30 a Aq-35, Aq-35 a Aq-40, Aq-40 a Aq-45, Aq-45 a Aq-50, Aq-50 a Aq-55, Aq-55 a Aq-60, Aq-60 a Aq-65, Aq-65 a Aq-70, Aq-75 a Aq-80. Por ejemplo, un segmento de tallo C-terminal de HA1 que termina en Aq-77 comenzaría en Gly200 de una hemaglutinina H3; y un segmento de tallo C-terminal de HA1 que termina en Aq-10 comenzaría en Isoleucine267 de una hemaglutinina H3. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de
HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comienza en Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9, Aq+10, Aq+11, Aq+12, Aq+13, Aq+14, Aq+15, Aq+1 Aq+19, Aq+20, Aq+21, Aq+22, Aq+23, Aq+24, Aq+25, Aq+26, Aq+27, Aq+28, Aq+29, Aq+30. En ciertas realizaciones, tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comienza en el rango de Aq+1 a Aq+3, Aq+3 a Aq+5, Aq+5 a Aq+8, Aq+8 a Aq+10, Aq+10 a Aq+15, o unq+15 a Aq+20. El extremo de un segmento de tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el comienzo del segmento de tallo C-terminal de HA1 y el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza de modo que el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico resultante sea capaz de formar un polipéptido de hemaglutinina tridimensional estructura similar a una hemaglutinina de influenza de tipo salvaje. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En un ejemplo, un segmento de tallo N-terminal de HA1 de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento puede terminar en cualquiera de las posiciones de aminoácidos de hemaglutinina 45-48 (usando la numeración de H3) y un segmento de tallo C-terminal de HA1 del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. el polipéptido de hemaglutinina del virus puede comenzar en cualquiera de las posiciones de aminoácidos de hemaglutinina 285-290 (usando la numeración de H3); y el dominio de cabeza heterólogo puede comenzar en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 46-49 y terminar en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 284-289 (usando la numeración de H3). En otro ejemplo, un segmento de tallo N-terminal de HA1 de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito aquí termina en la posición 90 del aminoácido de hemaglutinina (usando la numeración de H3) y un segmento de tallo C-terminal de HA1 del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comienza con el aminoácido de hemaglutinina. posición ácida 200 (usando la numeración de H3); y el dominio de cabeza heterólogo comienza en la posición de aminoácido 91 y termina en la posición de aminoácido 199 (usando la numeración de H3).
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-1, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-2, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-3, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-4, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-5, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-5. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del
dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+1, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal es de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento Aq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+2, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+3, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal es de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento Aq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+4, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+5, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+5. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-1, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-2, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-3, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal es de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento Aq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-4, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap-5, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq+5. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+1, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+2, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+3, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+4, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Ap+5, y el comienzo del segmento de tallo C-terminal de un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento es Aq-5. En tales realizaciones, un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (que es heterólogo con respecto al polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos de hemaglutinina de influenza quiméricos que comprenden una subunidad HA2 y una subunidad HA1 quimérica. En ciertas realizaciones, la subunidad quimérica HA1 comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la subunidad quimérica HA1 son de un segundo virus de la influenza cepa o subtipo. En ciertas realizaciones, la subunidad quimérica HA1 comprende 110, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 amino los ácidos de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la subunidad quimérica HA1 son de una segunda cepa o subtipo del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, los aminoácidos de la primera cepa o subtipo del virus de la influenza pueden ser consecutivos o pueden representar porciones de los extremos N y/o C de un dominio quimérico HA1. En realizaciones específicas, la subunidad quimérica HA1 comprende un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende aminoácidos de dos o más subtipos o cepas diferentes del virus de la influenza. En realizaciones específicas, la subunidad quimérica HA1 comprende una cabeza globular con aminoácidos de dos o más subtipos o cepas diferentes del virus de la influenza.
Los expertos en la técnica entenderán que los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico proporcionados en el presente documento se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica conocida y considerada adecuada por los expertos en la técnica, incluidas las técnicas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, se aíslan los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quimérico.
5.2 Polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza
En el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza para uso en la generación de polipéptidos de HA de la gripe, incluidos los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza, descritos en el presente documento.
En general, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento son polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en el dominio de cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. El dominio de cabeza de un polipéptido de hemaglutinina de influenza es el dominio de cabeza que generalmente reconocen los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza conocido por los expertos en la técnica.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden aminoácidos de dos o más cepas o subtipos del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, una subunidad HA1 quimérica comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la subunidad HA1 quimérica son de un segunda cepa o subtipo de virus de la influenza. En ciertas realizaciones, una subunidad HA1 quimérica comprende 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 aminoácidos de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la subunidad HA1 quimérica son de una segunda cepa o subtipo del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, los aminoácidos de la primera cepa o subtipo del virus de la influenza pueden ser consecutivos y/o pueden representar porciones de los extremos N y/o C de un dominio quimérico HA1.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza conocido, en donde hasta aproximadamente 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan del dominio de cabeza. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden formas eliminadas de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza conocido, en donde aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140 o 140-150 restos de aminoácidos se eliminan del dominio de cabeza. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza conocido, en donde hasta aproximadamente 80, 75, 7065, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos del dominio de cabeza están sustituidos (p. ej., sustituidos de forma conservativa) por otros aminoácidos. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza conocido, en donde hasta aproximadamente 1 -10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 restos de aminoácidos del dominio de cabeza están sustituidos (p. ej., sustituidos de forma conservativa) por otros aminoácidos. En ciertas realizaciones, se eliminan hasta 50, 60 o más aminoácidos del extremo N-terminal de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (como se observa desde la secuencia de aminoácidos primaria) y se eliminan hasta 70, 80 o más aminoácidos del extremo C-terminal de un dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza (como se observa a partir la secuencia de aminoácidos primaria).
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden una deleción de una o más de las regiones antigénicas (p. ej., una región del dominio de cabeza que se sabe que comprende o consiste en un epítopo) asociada con el dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza
(p. ej., sitios antigénicos A, B, C y D, en donde el dominio de cabeza es del subtipo H3 o sitios antigénicos Sa, Sb, Ca y Cb, en donde el dominio de cabeza es del subtipo H1). En una realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una deleción de una región antigénica (p. ej., una región del dominio de cabeza que se sabe que comprende o consiste en un epítopo). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una deleción de dos regiones antigénicas (p. ej., dos regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una deleción de tres regiones antigénicas (p. ej., tres regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una deleción de cuatro regiones antigénicas (p. ej., cuatro regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una deleción de cinco regiones antigénicas (p. ej., cinco regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las regiones antigénicas (p. ej., epítopos) de los dominios de cabeza de influenza conocidos en la técnica o identificados posteriormente utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica y descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comprenden (i) una, dos, tres o más regiones antigénicas de un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que son homólogas con respecto al dominio de tallo (es decir, derivadas de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza) y (ii) una, dos, tres o más regiones antigénicas de un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que son heterólogas con respecto al dominio de tallo (es decir, derivadas de una cepa o subtipo del virus de la influenza diferente). En una realización específica, el sitio/región antigénico C del dominio de cabeza es homólogo con respecto al dominio de tallo (es decir, se obtiene de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza). En otra realización específica, el sitio/región antigénico D del dominio de cabeza es homólogo con respecto al dominio de tallo (es decir, derivado de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza). En otra realización específica, los sitios/regiones antigénicos C y D del dominio de cabeza son homólogos con respecto al dominio de tallo (es decir, derivados de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza). En otra realización específica más, los sitios/regiones antigénicos Ca y/o Cb del dominio de cabeza son homólogos con respecto al dominio de tallo (es decir, derivados de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza).
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprenden un reemplazo de una o más de las regiones antigénicas (p. ej., una región del dominio de cabeza que se sabe que comprende o consiste en un epítopo) asociado con el dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza con una secuencia polipeptídica no antigénica (p. ej., una secuencia polipeptídica que se sabe que no induce una respuesta inmunitaria o se sabe que genera una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). En una realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende un reemplazo de una región antigénica (p. ej., una región del dominio de cabeza que se sabe que comprende o consiste en un epítopo) con una secuencia polipeptídica no antigénica (p. ej., un secuencia polipeptídica que se sabe que no induce una respuesta inmunitaria o se sabe que genera una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende un reemplazo de dos regiones antigénicas (p. ej., dos regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo) con secuencias polipeptídicas no antigénicas (p. ej., secuencias polipeptídicas que se sabe que no inducen una respuesta inmunitaria o que se sabe que generan una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende un reemplazo de tres regiones antigénicas (p. ej., tres regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo) con secuencias polipeptídicas no antigénicas (p. ej., secuencias polipeptídicas que se sabe que no inducen una respuesta inmunitaria o que se sabe que generan una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende un reemplazo de cuatro regiones antigénicas (p. ej., cuatro regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo) con secuencias polipeptídicas no antigénicas (p. ej., secuencias polipeptídicas que se sabe que no inducen una respuesta inmunitaria o que se sabe que generan una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende un reemplazo de cinco regiones antigénicas (p. ej., cinco regiones del dominio de cabeza que se sabe que comprenden o consisten en un epítopo) con secuencias polipeptídicas no antigénicas (p. ej., que se sabe que no inducen una respuesta inmunitaria o que se sabe que generan una respuesta inmunitaria que no es específica de influenza). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las regiones antigénicas (p. ej., epítopos) de los dominios de cabeza de influenza conocidos en la técnica o identificados posteriormente utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica y descritos en el presente documento.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza que comprende una, dos, tres o más regiones antigénicas heterólogas, es decir, una, dos, tres o más regiones antigénicas de hemaglutinina de una cepa o subtipo del virus de la influenza diferente (p. ej., una cepa o subtipo del virus de la influenza a la que toda o parte de la población no ha sido expuesta previamente). En otra realización específica, las regiones antigénicas heterólogas del polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza comprenden uno o más sitios de glicosilación que no se producen de forma natural, como se describe más adelante en la Sección 5.4.2. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que la inmunogenicidad de las regiones antigénicas subinmunodominantes conservadas dentro del dominio de tallo puede incrementarse mediante la adición de uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en estas regiones inmunodominantes en el dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza. En realizaciones específicas, el polipéptido del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza comprende una, dos, tres o más regiones antigénicas heterólogas en donde las regiones antigénicas heterólogas comprenden uno o más sitios de glicosilación que no se producen de forma natural.
Los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento podrían basarse en (es decir, podrían tener identidad de secuencia con) el dominio de cabeza de cualquier hemaglutinina de influenza conocida por los expertos o descubierta posteriormente. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A (p. ej., el dominio de cabeza de hemaglutinina de un virus de influenza A descrito en la Sección 5.4, más abajo). En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza B (p. ej., el dominio de cabeza de hemaglutinina de un virus de influenza B descrito en la Sección 5.4, más abajo). En algunas realizaciones, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de B/Seal/Netherlands/1/99. En una realización específica, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A seleccionada de un grupo H5, H6 y/o H9. En otra realización específica, los polipéptidos del dominio de cabeza de hemaglutinina de influenza se basan en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A seleccionada de un grupo H5, H7 y/o H9.
5.3 Polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza
En el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza para su uso en la generación de polipéptidos de hemaglutinina de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza). Aunque sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que, en el contexto de los polipéptidos de hemaglutinina de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) proporcionados en el presente documento, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de la gripe son útiles para presentar una o más regiones antigénicas relativamente conservadas a un sistema inmunitario del anfitrión con el fin de generar una respuesta inmunitaria que sea capaz de reaccionar de forma cruzada con una pluralidad de cepas de influenza. Dado que las una o más regiones antigénicas están bien conservadas en los subtipos de hemaglutinina de influenza, tal respuesta inmunitaria podría reaccionar de forma cruzada con varios subtipos de polipéptidos de hemaglutinina de influenza de longitud completa.
En general, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento son polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en el dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. El dominio de tallo de un polipéptido de hemaglutinina de influenza es el dominio de tallo que generalmente reconocen los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden poco o ningún dominio de cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza es una hemaglutinina de influenza de la que se ha suprimido su dominio de cabeza globular mediante cualquier mecanismo que un experto en la técnica considere adecuado.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento mantienen los restos de cisteína identificados en los polipéptidos de hemaglutinina de influenza como Ap y Aq en la FIG. 1. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento tienen una mayor estabilidad a un pH más bajo que la hemaglutinina de un virus de influenza de tipo salvaje (p. ej., un pH inferior a 5,2, inferior a 5,1, inferior a 5,0 o inferior a 4,9, como 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4., 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, etc.). En realizaciones particulares, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento experimentan cambios conformacionales desde la conformación previa a la fusión hasta la conformación de fusión a un pH más bajo que la hemaglutinina de los virus de influenza de tipo salvaje. En algunas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento comprenden una o más sustituciones de aminoácidos, tales como H17Y de HA1 (numeración de H3) que aumenta la estabilidad de los polipéptidos a un pH bajo (p. ej., un pH entre 4,9 a 5,2, 4,5 a 3,5, 3,5 a 2,5, 2,5 a 1,5, 1,5 a 0,5). La estabilidad de los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se puede evaluar
utilizando mecanismos conocidos en la técnica, tales como la sensibilidad de las moléculas de hemaglutinina a la digestión con tripsina, como describen, p. ej., Thoennes et al., 2008, en Virology 370: 403-414.
Los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se pueden preparar de acuerdo con cualquier mecanismo que se considere adecuado para un experto en la técnica, incluidos los mecanismos que se describen a continuación. En ciertas realizaciones, se aíslan los polipéptidos del dominio de tallo.
En algunas realizaciones, la estructura primaria de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y una HA2. En algunas realizaciones, la estructura primaria de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 y una HA2. En algunas realizaciones, la estructura primaria de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo largo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 y una HA2. En algunas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo intermedio HA1, un segundo conector, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y una HA2.
La secuencia primaria podría estar formada por un solo polipéptido o podría estar formada por múltiples polipéptidos. Típicamente, un único polipéptido se expresa mediante cualquier mecanismo que un experto en la técnica considere adecuado. En realizaciones de un solo polipéptido, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación terciaria. Como es sabido por los expertos en la técnica, un único polipéptido de HA podría escindirse, por ejemplo, mediante una proteasa, en condiciones de expresión apropiadas para producir dos polipéptidos en asociación cuaternaria. La escisión es típicamente entre el segmento del tallo C-terminal de HA1 y la HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos múltiples, por ejemplo, dos polipéptidos, dominios de tallo de hemaglutinina de influenza. En realizaciones polipeptídicas múltiples, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación cuaternaria.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es monomérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es multimérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es trimérico. Los expertos en la técnica reconocerán que los polipéptidos de hemaglutinina de influenza nativos son susceptibles de trimerización in vivo y que ciertos polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento son susceptibles de trimerización. En realizaciones particulares descritas a continuación, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden dominios de trimerización para facilitar la trimerización.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende un péptido señal. Típicamente, el péptido señal se escinde durante o después de la expresión y traducción del polipéptido para producir un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza maduro. El péptido señal podría ser ventajoso para la expresión de los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza. En ciertas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza maduros que carecen de un péptido señal.
La hemaglutinina HA2 de influenza comprende típicamente un dominio de tallo, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. Tales polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podrían expresarse como antígenos unidos a membrana. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2 y un dominio transmembrana de HA2 pero que carecen de parte o la totalidad del dominio citoplásmico típico. Tales polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podrían expresarse como antígenos unidos a membrana. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2 y un dominio luminal de HA2, pero carecen tanto de un dominio transmembrana de HA2 como de un dominio citoplásmico de HA2. Tales polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podrían expresarse ventajosamente como polipéptidos solubles. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, pero carecen de un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. Tales polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podrían expresarse ventajosamente como polipéptidos solubles. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprenden un dominio de tallo de HA2 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de tallo de HA2 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las siguientes tablas se proporcionan ejemplos de dominios de tallo de HA2 conocidos de hemaglutininas conocidas de influenza A e influenza B.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza
que comprenden formas con deleciones de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del dominio de tallo de HA2. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden dominios de tallo de HA2 con deleciones y alteraciones. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprenden un dominio de tallo HA2 que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, como se describe en la Sección 5.4.1, más abajo. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las regiones antigénicas de inmunogenicidad y accesibilidad dentro del dominio de tallo se pueden aumentar modificando uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio de tallo de una manera que interrumpa la glicosilación (es decir, el anclaje de un glicano) en los sitios.
En algunas realizaciones, la estructura primaria de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y una HA2. El segmento de tallo N-terminal de HA1 podría ser cualquier segmento de tallo N-terminal de HA1 reconocido por un experto en la técnica basándose en la definición proporcionada en el presente documento. Típicamente, un segmento de tallo N-terminal de HA1 corresponde a un polipéptido que consiste en el aminoácido N-terminal de una HA1 madura (es decir una HA1 que carece de un péptido señal) a través del resto de cisteína ubicado en secuencia en aproximadamente el resto 52° de HA1. Este resto de cisteína, denominado Ap en el presente documento, generalmente es capaz de formar un puente disulfuro con un resto de cisteína en el segmento de tallo C-terminal de HA1. Las secuencias de 16 hemaglutininas de influenza A representativas se presentan en la FIG. 1 y el resto Ap se identifica en cada una.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 no termina exactamente en Ap (p. ej., Cys52 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), sino en un resto en proximidad de secuencia y estructural con Ap. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 termina en Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-10, Ap-11, Ap-12, Ap-13, Ap-14, Ap-15, Ap-16, Ap-17, Ap-18, Ap-19, Ap-20, Ap-21, Ap-22, Ap-23, Ap-23, Ap-24, Ap-25, Ap-26, Ap-27, Ap-28, Ap-29, Ap-30. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos de hemaglutinina de la gripe descritos en el presente documento termina en el rango de Ap-1 a Ap-3, Ap-3 a Ap-5, Ap-5 a
Ap-8, Ap-8 a Ap-10, Ap-10 a Ap-15, Ap-15 a Ap-20, Ap-20 a Ap-30, Ap-30 a Ap-40. En otras realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 termina en Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+a, Ap+7, Ap+8, Ap+9, Ap+10, Ap+11, Ap+12, Ap+13, Ap+14, Ap+15, Ap+16, Ap+17, Ap+18, Ap+19, Ap+20, Ap+21, Ap+22, Ap+23, Ap+24, Ap+25, Ap+26, Ap+27, Ap+28, Ap+29, Ap+30, Ap+31, Ap+32, Ap+33, Ap+34, Ap+35, Ap+36, Ap+37, Ap+38, Ap+39, Ap+40. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de los polipéptidos de hemaglutinina de la gripe descritos en el presente documento termina en el rango de Ap+1 a Ap+5, Ap+5 a Ap+10, Ap+10 a Ap+15, Ap+15 a Ap+20, Ap+20 a Ap+25, Ap+25 a Ap+30, Ap+30 a Ap+35, Ap+35 a Ap+40, o Ap+40 a Ap+50. El extremo de un segmento de tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el extremo del segmento de tallo C-terminal de HA1 y el conector de modo que el dominio de tallo de HA1 conectado resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar, como se describe a continuación, a un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprenden un segmento de tallo N-terminal de HA1 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un segmento de tallo N-terminal de HA1 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo N-terminal de HA1 conocidos.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de segmentos de tallo N-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del segmento de tallo N-terminal de HA1. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza conocido, en donde aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 restos de aminoácidos se eliminan del dominio de tallo. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas expandidas de segmentos de tallo N-terminales de HA1 en donde se añaden 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos al extremo C-terminal de los segmentos de tallo N-terminales de HA1; estos restos añadidos podrían obtenerse de la secuencia de aminoácidos de un dominio de cabeza globular adyacente a un segmento de tallo N-terminal de HA1. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo N-terminales de HA1 en donde hasta 80, 75, 70 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza conocido, en donde hasta aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 restos de aminoácidos del dominio de tallo están sustituidos (p. ej., sustituidos de forma conservativa) por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que
comprenden segmentos de tallo N-terminales de HA1 con deleciones y alteraciones. En ciertas realizaciones, se eliminan hasta 50, 60 o más aminoácidos del extremo N de un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza (como se observa a partir de la secuencia de aminoácidos primaria) y se eliminan hasta 70, 80 o más aminoácidos del extremo C-terminal de un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza (como se observa a partir la secuencia de aminoácidos primaria).
El segmento de tallo C-terminal de HA1 podría ser cualquier segmento de tallo C-terminal de HA1 reconocido por un experto en la técnica basándose en la definición proporcionada en el presente documento. Típicamente, un segmento de tallo C-terminal de HA1 corresponde a un polipéptido que consiste en el resto de cisteína ubicado en la secuencia aproximadamente en el resto 277° de una HA1 (usando la numeración de H3) hasta el aminoácido C-terminal de la HA1. Este resto de cisteína, denominado Aq en el presente documento, generalmente es capaz de formar un puente disulfuro con el resto de cisteína Ap en el segmento de tallo N-terminal de HA1. Las secuencias de 17 hemaglutininas de influenza A representativas se presentan en la FIG. 1 y el resto Aq se identifica en cada una.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 no comienza en Aq (p. ej., Cys277 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), sino en un resto en proximidad de secuencia y estructural con Aq. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 comienza aproximadamente en Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4,
Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10, Aq-11, Aq-12, Aq-13, Aq-14, Aq-15, Aq-20, Aq-25, Aq-30, Aq-35, Aq-40, Aq-45, Aq-50, Aq-55, Aq-60, Aq-65, Aq-70, Aq-75, o Aq-80. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 comienza en el rango de Aq-1 a Aq-5, Aq-5 a Aq-10, Aq-10 a Aq-15, Aq-15 a Aq-20, Aq-20 a Aq-25, Aq-25 a Aq-30, Aq-30 a Aq-35, Aq-35 a Aq-40, Aq-40 a Aq-45, Aq-45 a
Aq-50, Aq-50 a Aq-55, Aq-55 a Aq-60, Aq-60 a Aq-65, Aq-65 a Aq-70, Aq-75 a Aq-80. En otras realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 comienza en Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9, o Aq+10. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos de hemaglutinina de la gripe descritos en el presente documento comienza en el rango de Aq+1 a Aq+3, Aq+3 a Aq+5, Aq+5 a Aq+8, Aq+8 a Aq+10, Aq+10 a Aq+15, o Aq+15 a Aq+20. El extremo de un segmento de tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el comienzo del segmento de tallo C-terminal de HA1 y el conector para que el dominio de tallo de HA1 resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar, como se describe a continuación, a una hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprenden un segmento de tallo C-terminal de HA1 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un segmento de tallo C-terminal de HA1 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las siguientes tablas se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo C-terminales de HA1 conocidos.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-1, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-2, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-3, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-4, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-5, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+1, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+2, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+3, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+4, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+5, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-1, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-2, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-3, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-4, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-5, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+1, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+2, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+3, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+4, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+5, y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq-5.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de segmentos de tallo C-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del segmento de tallo C-terminal de HA1. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de un dominio
de tallo de hemaglutinina de influenza conocido, en donde aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 restos de aminoácidos se eliminan del dominio de tallo. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas expandidas de segmentos de tallo C-terminales de HA1 en donde se añaden 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos al extremo N-terminal de los segmentos de tallo C-terminal de HA1; estos restos añadidos podrían obtenerse de la secuencia de aminoácidos de un dominio de cabeza globular adyacente a un segmento de tallo C-terminal de HA1. En realizaciones particulares, si se añade un resto al segmento del tallo C-terminal, se añade un resto al segmento del tallo N-terminal; si se añaden dos restos al segmento del tallo C-terminal, se añaden dos restos al segmento del tallo N-terminal; si se añaden tres restos al segmento del tallo C-terminal, se añaden tres restos al segmento del tallo N-terminal. En el presente documento se proporcionan adicionalmente polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo C-terminales de HA1 en donde hasta aproximadamente 80, 75, 7065, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo C-terminales de HA1, en donde hasta aproximadamente 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90 o 90-100 restos de aminoácidos del segmento de tallo C-terminal de HA1 están sustituidos (p. ej., sustituidos de forma conservativa) por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden segmentos de tallo C-terminales de HA1 con deleciones y alteraciones. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal comprende uno o más sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal comprende uno o más sitios de glicosilación modificados. En otras realizaciones, el segmento de tallo C-terminal y el segmento de tallo N-terminal comprenden uno o más sitios de glicosilación modificados.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden una quimera/híbrido del dominio de tallo de la subunidad HA1. La quimera del dominio de tallo de la subunidad HA1 puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 aminoácidos del dominio de tallo de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la quimérica del dominio de tallo de la subunidad HA1 puede ser de una segunda cepa o subtipo del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la quimera del dominio de tallo de la subunidad HA1 comprende 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, o 90-100 aminoácidos del dominio de tallo de la subunidad HA1 de una primera cepa o subtipo del virus de la influenza y el resto de los aminoácidos de la quimera del dominio de tallo de la subunidad HA1 es de una segunda cepa o subtipo del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden una subunidad HA2 y una quimérica del dominio de tallo de la subunidad HA1. En ciertas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende una quimera/híbrido del dominio de tallo de una subunidad HA1 en la que se han modificado uno o más sitios de glicosilación de origen natural de tal manera que la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado, como se describe en la Sección 5.4.1, más abajo. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las regiones antigénicas de inmunogenicidad y accesibilidad de las dentro del dominio de tallo se pueden aumentar modificando uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio de tallo de una manera que interrumpa la glicosilación (es decir, el anclaje de un glicano) en los sitios.
Los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podrían basarse en (es decir, podría tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier hemaglutinina de influenza conocida por los expertos o descubierta posteriormente. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina B de influenza, como se describe en detalle a continuación.
Los segmentos de tallo N-terminales de HA1 podrían basarse en fes decir podrían tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo N-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 se basan en segmentos de tallo N-terminales de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona
entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:177-224. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 es o se basa en el segmento de tallo N-terminal HA-1 de un virus de influenza Ann Arbor/6/60, AP/uerto Rico/8/34 o A/Perth/16/2009.
Los segmentos del tallo C-terminales de HA1 podrían basarse en (es decir podría tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo C-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo C-terminales de HA1 se basan en segmentos de tallo C-terminales de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos del tallo C-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:50-65, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:226-273. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 es o se basa en el segmento de tallo N-terminal de HA-1 de un virus de influenza Ann Arbor/6/60, AP/uerto Rico/8/34 o A/Perth/16/2009.
Los dominios de tallo de HA2 podrían basarse en (es decir podrían tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier dominio de tallo de HA2 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en los dominios de tallo de HA2 de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA2 se selecciona entre SEQ ID NO:66-97. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA2 es o se basa en el dominio de tallo de HA de un virus de influenza similar a AA/nn Arbor/6/60, similar a AP/uerto Rico/8/1934, similar a AP/erth/16/2009, similar a A/Califomia/07/2009, similar a A/Brisbane/59/07, similar a AN/ew Caledonia/20/1999 o similar a A/Victoria/361/201. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo HA2 es o se basa en un dominio de tallo de HA2 descubierto posteriormente.
En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA1.
En realizaciones que comprenden un péptido señal, el péptido señal podría basarse en cualquier péptido señal del virus de la influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en los péptidos señal de influenza A. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. En ciertas realizaciones, el péptido señal podría ser cualquier péptido señal que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el péptido señal se selecciona entre SEQ ID NO:18-33.
En realizaciones que comprenden un dominio luminal, el dominio luminal podría basarse en cualquier dominio luminal de influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios luminales se basan en los dominios luminales de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios luminales de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio luminal puede ser cualquier dominio luminal que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio luminal se selecciona entre SEQ ID NO:98-113. En ciertas realizaciones, el dominio luminal es de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA2.
En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmico, transmembrana y luminal son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA2. En otras realizaciones, los dominios citoplásmico y transmembrana son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA2. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmico y luminal son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA2.
En realizaciones que comprenden un dominio transmembrana, el dominio transmembrana podría basarse en cualquier dominio transmembrana de influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana se basan en los dominios transmembrana de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana podría ser cualquier dominio transmembrana que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona entre SEQ ID NO:114-129. En ciertas realizaciones, los dominios transmembrana son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la
subunidad HA2.
En realizaciones que comprenden un dominio citoplásmico, el dominio citoplásmico podría basarse en cualquier dominio citoplásmico de influenza conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos se basan en los dominios citoplásmicos de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico podría ser cualquier dominio citoplásmico que se considere útil para un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico se selecciona entre SEQ ID NO:130-145. En ciertas realizaciones, los dominios citoplásmicos son de la misma cepa o subtipo del virus de la influenza que el dominio de tallo de la subunidad HA2.
En ciertas realizaciones, uno o más de los sitios de glicosilación en el dominio de tallo de hemaglutinina se modifican (p. ej., por adición, deleción o sustitución de aminoácidos) de modo que la glicosilación en estos sitios no se produzca durante el procesamiento y la maduración del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que la HA de la influenza típicamente comprende uno o más sitios de glicosilación (p. ej., Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro). En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen de forma conservativa por un resto de aminoácido que interrumpe el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen por cualquier resto de aminoácido que interrumpa el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de asparragina en una secuencia de glicosilación se sustituyen por alanina. En una realización particular, la asparragina en la posición 38 de una hemaglutinina H3 se cambia a una alanina. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de hemaglutinina comprende uno o más sitios de glicosilación modificados como se describe en la Sección 5.4.1, más abajo.
La Tabla 1, a continuación, identifica péptidos señal, segmentos de tallo N-terminales de HA1, segmentos de tallo C-terminales de HA1 y dominios de HA2 de polipéptidos de hemaglutinina de influenza A. Estos péptidos señal, segmentos de tallo y dominios son útiles en los polipéptidos y métodos descritos en el presente documento.
Tabla 1. Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza A
La Tabla 1A, a continuación, identifica segmentos de tallo N-terminales de HA1 y segmentos de tallo C-terminales de HA1 útiles para los polipéptidos y los métodos descritos en el presente documento.
Tabla 1A. Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza A
La Tabla 2, a continuación, identifica supuestos dominios de tallo, dominios luminales, dominios transmembrana y dominios citoplásmicos de polipéptidos de HA2.
Tabla 2. Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza A
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprenden uno o más epítopos inmunogénicos en la estructura terciaria o cuaternaria de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 comprende la secuencia de aminoácidos A17-A18-(Xaa)n-A38 (SEQ ID NO:146), en donde
A17 es Y o H;
A18 es H, L o Q;
(Xaa)n representa una secuencia de 18-20 restos de aminoácidos; y
A38 es H, S, Q, T o N.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 comprende la secuencia de aminoácidos A291-A292 (SEQ ID NO:147), en donde
A291 es T, S, N, D, P o K; y
A292 es L, M, K o R.
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A18-A19-A20-A21 (SEQ ID NO:148), en donde
A18 es V o I;
A19 es D, N o A;
A20 es G, y
A21 es W
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56 (SEQ ID NO:149), en donde
A38 es K, Q, R, L o Y;
A39 es cualquier resto de aminoácido;
A40 es cualquier resto de aminoácido;
A41 es T;
A42 es Q;
A43 es cualquier resto de aminoácido;
A44 es A;
A45 es I;
A46 es D;
A47 es cualquier resto de aminoácido
A48 es I, V o M;
A49 es T, Q o N;
A50 es cualquier resto de aminoácido
A51 es K;
A52 es V o L;
A53 es N;
A54 es cualquier resto de aminoácido
A55 es V, I o L; y
A56 es V o I.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden dos secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden tres secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden cuatro secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149.
En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza B. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:154-157, presentados en la Tabla 3 a continuación.
En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo C-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza B. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:158-159 y 553-554, presentados en la Tabla 3 a continuación.
En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza B. Los restos ilustrativos para el extremo de un segmento de tallo N-terminal y el extremo de un segmento de tallo C-terminal de una hemaglutinina de influenza B se indican en la FIG. 2. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA2 es conforme a SEQ ID NO:160, presentado en las Tablas 3 y 4 a continuación.
En realizaciones particulares, los límites del segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de influenza B y el segmento C-terminal de HA1 del virus de influenza B se definen con respecto a seis pares de restos de aminoácidos: Arg50 y Ser277; Ala66 y Trp271; Lyss0 y Ser277; Cys94 y Cysm; Cys178 y Cys272 y Cys54 y Cys272. Las posiciones de estos seis pares de restos también se destacan en la FIG. 3. Los números de restos se basan en la numeración de B-HA del virus de la influenza B como se describe en el número de acceso 3BT6 del Protein Data Bank. La secuencia de aminoácidos correspondiente a la estructura cristalina de rayos X de la proteína B-HA en el número de acceso 3BT6 del Protein Data Bank está alineada con la secuencia de aminoácidos de H1 y H3 representativa y se muestra en la FIG. 2.
En ciertas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B comienza en el resto 1 (basándose en la numeración de una subunidad HA1 del virus de la influenza B como en el archivo 3BT6 del PDB) y termina en Arg50. En ciertas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Ala66. En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Lys80. En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Arg80. En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Cys54. En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Cys94. En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal del virus de la influenza B comienza en el resto 1 y termina en Cys178.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos según uno cualquiera de SEQ ID NO:154-157 y 550-552, como se ilustra en la TABLA 3. En algunas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 de un virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos según uno cualquiera de SEQ ID NO:154-157 o 550-552.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:154, que corresponde a los restos 1 -50 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:155, que corresponde a los restos 1 -66 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:156, que corresponde a los restos 1 -80 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:157, que corresponde a los restos 1-80 de HA1 del virus de la influenza B en el que la lisina en la posición 80 se reemplaza con una arginina.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:550, que corresponde a los restos 1 -94 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:551, que corresponde a los restos 1 -178 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo N-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:552, que corresponde a los restos 1 -54 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que comienza en Ser277, Trp271, Cys143, Cys272 o restos correspondientes en otros subtipos de HA del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos según uno cualquiera de SEQ ID NO:158-159 o 553-554, como se ilustra en la TABLA 3. En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de la influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:158, que corresponde a los restos 277-344 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:159, que corresponde a los restos 271-344 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:553, que corresponde a los restos 137-344 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de influenza B tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:554, que corresponde a los restos 272-344 de HA1 del virus de la influenza B.
En algunas realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de la influenza B comienza en el resto 276, resto 275, resto 274, resto 273 o resto 272. En otras realizaciones, un segmento de tallo C-terminal de HA1 del virus de la influenza B comienza en el resto 278, resto 279, resto 280, resto 281 o resto 282.
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 del virus de la influenza B está en asociación terciaria o cuaternaria con el dominio HA1 del virus de la influenza B a través del segmento N-terminal de HA1 del virus de la influenza B, el segmento C-terminal de HA1 del virus de la influenza B, o ambos.
En algunas realizaciones, el segmento C-terminal de HA1 del virus de la influenza B y la subunidad HA2 del virus de la influenza B están conectados covalentemente. Por ejemplo, en su extremo C (p. ej., en el resto final de la segunda secuencia), el segmento C terminal de HA1 del virus de la influenza B está conectado covalentemente al dominio HA2 del virus de la influenza B en tales realizaciones. En algunas realizaciones, el segmento C-terminal de HA1 del virus de la influenza B y el dominio HA2 del virus de la influenza B forman una cadena polipeptídica continua.
En algunas realizaciones, el dominio HA2 del virus de la influenza B tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:160 o 161, como se ilustra en la TABLA 3 o 4. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio HA2 es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a uno cualquiera de SEQ ID NO:160-161.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza B comprenden un péptido señal. El péptido señal puede ser cualquier péptido señal que se considere adecuado para los expertos en la técnica, incluido cualquier péptido señal descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el péptido señal es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntico a cualquiera de SEQ ID NO:150-153. En ciertas realizaciones, el péptido
señal es conforme a cualquiera de SEQ ID NO:150-153.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza B comprenden un dominio luminal. El dominio luminal puede ser cualquier dominio luminal que se considere adecuado para los expertos en la técnica, incluido cualquier dominio luminal descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio luminal es al menos 60% u 80%, idéntico a SEQ ID NO:162. En ciertas realizaciones, el dominio luminal es conforme a SEQ ID NO:162.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza B comprenden un dominio transmembrana. El dominio transmembrana puede ser cualquier dominio transmembrana que se considere adecuado para los expertos en la técnica, incluido cualquier dominio transmembrana descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntico a SEQ ID NO:163. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana es conforme a SEQ ID NO:163.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza B comprenden un dominio citoplásmico. El dominio citoplásmico puede ser cualquier dominio citoplásmico que se considere adecuado para los expertos en la técnica, incluido cualquier dominio citoplásmico descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntico a SEQ ID NO:164. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico es conforme a SEQ ID NO:164.
Tabla 3: Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza B
La Tabla 4 proporciona supuestos dominios de tallo, dominios luminales, dominios transmembrana y dominios citoplásmicos de HA de influenza B.
Tabla 4: Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza B
Como se ilustra en las FIG. 1 y 2, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 comparten identidad de secuencia entre influenza A e influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. De manera similar, los segmentos de tallo C-terminales de HA1 también comparten la identidad de secuencia entre influenza A e influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. Adicionalmente, los dominios HA2 también comparten la identidad de secuencia entre influenza A e influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A.
En algunas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza comprende en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo intermedio de HA1, un segundo conector, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y una HA2. En algunas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:555, como se ilustra en la Tabla 5. SEQ ID NO:555 corresponde a los restos 1-94 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, el segmento de tallo C-terminal de HA1 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:557, como se ilustra en la Tabla 5. SEQ ID NO:557 corresponde a los restos 272-344 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, el segmento intermedio de HA1 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:556, como se ilustra en la Tabla 5. SEQ ID NO:556 corresponde a los restos 143-178 de HA1 del virus de la influenza B. En algunas realizaciones, el dominio HA2 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% idéntica a SEQ ID NO:160, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el primer y el segundo conectores pueden ser cualquier conector conocido por los expertos en la técnica, incluidos, pero sin limitarse a, los conectores descritos en el presente documento.
Tabla 5. Secuencias ilustrativas de hemaglutinina de influenza B
En algunas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza es un polipéptido híbrido que comprende o consiste esencialmente en segmentos y/o dominios de una pluralidad de cepas o subtipos de influenza. Por ejemplo, un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza podría comprender segmentos de tallo N-terminales de HA1 y C-terminales de HA1 de diferentes subtipos de HA del virus de la influenza A. En algunas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 es del virus de la influenza A mientras que el segmento de tallo C-terminal de HA1 es del virus de la influenza B. De manera similar, HA2 también puede ser del
virus de la influenza A, mientras que el segmento de tallo N-terminal y/o C-terminal de HA1 es del virus de la influenza B.
Se entenderá que se puede utilizar cualquier combinación de los elementos de secuencia enumerados en las Tablas 1 -4 o sus variantes para formar los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina HA.
En un polipéptido del dominio de tallo de influenza proporcionado en el presente documento, un conector conecta covalentemente el segmento de tallo N-terminal de HA1 con el segmento de tallo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, el conector es un enlace directo. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA2 de una hemaglutinina quimérica del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA1 y/o HA2 de una hemaglutinina quimérica del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una región Fab de anticuerpo o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, el conector es una glicoproteína viral distinto de influenza o un fragmento de la misma. En ciertas realizaciones, el conector es un péptido que comprende un resto de aminoácido, dos o menos restos de aminoácidos, tres o menos restos de aminoácidos, cuatro o menos restos de aminoácidos, cinco o menos restos de aminoácidos, diez o menos restos de aminoácidos, 15 o menos restos de aminoácidos, 20 o menos restos de aminoácidos, 30 o menos restos de aminoácidos, 40 o menos restos de aminoácidos o 50 o menos restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el péptido conector comprende 50 o más restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el conector carece sustancialmente de un dominio de cabeza globular. En otras palabras, el conector comprende no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 restos de aminoácidos secuenciales contiguos de la secuencia de aminoácidos de un dominio de cabeza globular de influenza. En ciertas realizaciones, el conector es distinto de Lys-Leu-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Met-Lys-Thr-Glu-Gly-Thr-Leu-Glu-Asn (SEQ ID NO:542). En ciertas realizaciones, el conector es distinto de Asn-Asn-Ile-Asp-Thr (SEQ ID NO:546) o Lys-Leu-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Met-Lys-Thr-Glu-Gly- Thr-Leu-Glu-Asn (SEQ ID NO:559). En ciertas realizaciones, el conector es distinto de Asn-Asn-Ile-Asp-Thr (SEQ ID NO:546).
En ciertas realizaciones, el conector está conectado covalentemente, en un extremo, al extremo C-terminal del segmento de tallo N-terminal de HA1. El péptido conector también está conectado covalentemente, en el otro extremo, al extremo N-terminal del segmento de tallo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, una de las conexiones covalentes es un enlace amida. En ciertas realizaciones, ambas conexiones covalentes son enlaces amida.
El conector puede ser cualquier conector que un experto en la técnica considere adecuado. En ciertas realizaciones, el conector se selecciona basándose en el segmento de tallo N-terminal de HA1 y el segmento de tallo C-terminal de HA1. En estas realizaciones, el conector podría seleccionarse con programas de modelado molecular tales como InsightII y Quanta, ambos de Accelrys. En ciertas realizaciones, el conector es un motivo estructural que permite el alineamiento estructural del segmento de tallo N-terminal de HA1 y el segmento de tallo C-terminal de HA1 que es compatible con la estructura de un dominio de tallo de hemaglutinina como reconocen los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, el conector se selecciona entre una biblioteca de conectores candidatos. En ciertas realizaciones, la biblioteca incluye estructuras polipeptídicas tridimensionales en una base de datos disponible públicamente, tal como Protein Data Bank (PDB) o Macromolecular Structure Database en European Molecular Biology Laboratory (EMBL) o European Bioinformatics Institute (EBI). En ciertas realizaciones, la biblioteca incluye estructuras polipeptídicas tridimensionales patentadas asociadas con programas comerciales tales como InsightII y Quanta, ambos de Accelrys. Adicionalmente, se puede utilizar cualquier base de datos o colección de estructuras de proteínas o elementos estructurales para seleccionar el conector. Las bases de datos o colecciones ilustrativas de elementos estructurales de proteínas incluyen, pero no se limitan a, Structural Classification of Proteins (SCOP, mantenida y disponible a través de la Universidad de Cambridge); la base de datos de familias de proteínas (Pfam, mantenida y disponible a través del Wellcome Trust Sanger Institute); Universal Protein Resource (UniProt, mantenido y disponible a través del UniProt Consortium); el recurso integrado para familias de proteínas (InterPro; mantenido y disponible a través de EMBL-EBI); la superfamilia Class Architecture Topology Homologous (CATH, mantenida y disponible a través del Institute of Structural and Molecular Biology at the University College London); y las familias de proteínas estructuralmente similares (FSSP, mantenidas y disponibles a través de EBI). Se puede utilizar cualquier algoritmo que un experto en la técnica considere adecuado para seleccionar el conector, incluidos, pero sin limitarse a, los utilizados por SCOP, CATH y FSSP. Los ejemplos útiles incluyen, pero sin limitarse a, Pymol (Delano Scientific LLC), InsightII y Quanta (ambos de Accelrys), MIDAS (University of California, San Francisco), visor SwissPDB (Swiss Institute of Bioinformatics), TOPOFIT (Northeastern University), CBSU LOOPP (Cornell University) y SuperPose (University of Alberta, Edmonton).
En ciertas realizaciones, el conector es un enlace directo. En ciertas realizaciones, el conector se selecciona del grupo que consiste en Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly y Gly-Gly-Gly-Gly-Gly. En ciertas realizaciones, el conector se selecciona del grupo que consiste en Gly-Pro y Pro-Gly. En ciertas realizaciones, el conector es un bucle de 281 vueltas, p. ej. que tiene la secuencia ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165).
En ciertas realizaciones, el conector comprende una secuencia de glicosilación. En ciertas realizaciones, el conector comprende una secuencia de aminoácidos según Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro y Ser/Thr/Cys es serina, treonina o cisteína.
En ciertas realizaciones, el conector comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Ser. En ciertas realizaciones, el conector es una secuencia de glicosilación. En ciertas realizaciones, el conector es una secuencia de aminoácidos según Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro y Ser/Thr/Cys es serina, treonina o cisteína. En ciertas realizaciones, el conector es la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza son capaces de formar una estructura tridimensional que es similar a la estructura tridimensional del dominio de tallo de una hemaglutinina de influenza nativa. La similitud estructural podría evaluarse basándose en cualquier mecanismo que los expertos en la materia consideren adecuado. Por ejemplo, la reacción, p. ej., en condiciones no desnaturalizantes, de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza con un anticuerpo o antisuero neutralizante que reconoce una hemaglutinina de influenza nativa podría indicar una similitud estructural. Los antisueros o anticuerpos neutralizantes útiles se describen, p. ej., por Sui, et al., 2009, Nat. Struct. Mol. Biol. 16(3):265-273, Ekiert et al., 26 de febrero de 2009, Science [DOI: 10.1126/science.1171491], y Kashyap et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o antisuero son un anticuerpo o antisuero que reaccionan con un epítopo no contiguo (es decir, no contiguos en secuencia primaria) que está formado por la estructura terciaria o cuaternaria de una hemaglutinina.
En ciertas realizaciones, la similitud estructural podría evaluarse mediante técnicas espectroscópicas tales como dicrαsmo circular, espectroscopia Raman, RMN, RMN 3D y cristalografía de rayos X. Las estructuras conocidas de hemaglutinina de influenza determinadas por cristalografía de rayos X se describen en coordenadas estructurales en los archivos del Protein Data Bank, que incluyen, pero sin limitarse a, 1HGJ (una cepa H3N2 de HA) y 1RUZ (una cepa H1N1 de HA).
En ciertas realizaciones, la similitud estructural se evalúa mediante la desviación RMS entre las partes superpuestas correspondientes de dos estructuras. Para crear una superposición significativa, en ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de al menos 20 átomos correspondientes, 25 átomos correspondientes, 30 átomos correspondientes, 40 átomos correspondientes, 50 átomos correspondientes, 60 átomos correspondientes, 70 átomos correspondientes, 80 átomos correspondientes, 90 los átomos correspondientes, 100 átomos correspondientes, 120 átomos correspondientes, 150 átomos correspondientes, 200 átomos correspondientes o 250 átomos correspondientes para calcular una desviación RMS.
En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos los átomos correspondientes en los esqueletos de aminoácidos para calcular una desviación RMS. En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos los átomos de carbono alfa correspondientes en los esqueletos de aminoácidos para calcular una desviación RMS. En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos los restos idénticos correspondientes, incluidas las cadenas laterales, para calcular una desviación RMS.
En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos o una parte de los átomos correspondientes en un segmento N-terminal de HA1 para calcular una desviación RMS. En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos o una parte de los átomos correspondientes en un segmento C-terminal de HA1 para calcular una desviación RMS. En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos o una parte de los átomos correspondientes tanto en un segmento N-terminal de HA1 como en un segmento C-terminal para calcular una desviación RMS. En ciertas realizaciones, se utilizan las coordenadas de todos o una parte de los átomos correspondientes en los dominios HA2 para calcular una desviación RMS.
En ciertas realizaciones, la desviación RMS entre las estructuras de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza y las porciones correspondientes de un dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza A conocido (p. ej., de 1HGJ o 1RUZ) es de 5 Á o menos, 4 Á o menos, 3 Á o menos, 2,5 Á o menos, 2 Á o menos, 1,5 Á o menos, 1 Á o menos, 0,75 Á o menos, 0,5 Á o menos, 0,3 Á o menos, 0,2 Á o menos, o 0,1 Á o menos. Se puede utilizar soporte lógico disponible comercialmente o de código abierto para realizar las superposiciones estructurales y/o los cálculos de desviación RMS. Los ejemplos útiles incluyen, pero sin limitarse a, Pymol (Delano Scientific LLC), InsightlI y Quanta (ambos de Accelrys), MIDAS (University of California, San Francisco), visor SwissPDB (Swiss Institute of Bioinformatics), TOPOFIT (Northeastern University), CBSU Lo Op P (Cornell University) y SuperPose (University of Alberta, Edmonton).
En ciertas realizaciones, cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento puede comprender adicionalmente uno o más dominios polipeptídicos que se consideren adecuados para los expertos en la técnica. Los dominios polipeptídicos útiles incluyen dominios que facilitan la purificación, el plegamiento y la escisión de porciones de un polipéptido. Por ejemplo, una etiqueta His (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO:166), un epítopo FLAG u otra etiqueta de purificación pueden facilitar la purificación de un polipéptido proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la etiqueta His tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más. Un dominio foldon, o de trimerización, de la fibritina del bacteriófago T4 puede facilitar la trimerización de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que
permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. El dominio foldon puede tener cualquier secuencia de foldon conocida por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Papanikolopoulou et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991-8998, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Los ejemplos incluyen GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:167). Un dominio foldon puede ser útil para facilitar la trimerización de polipéptidos solubles proporcionados en el presente documento. Los sitios de escisión se pueden utilizar para facilitar la escisión de una porción de un polipéptido, por ejemplo, la escisión de una etiqueta de purificación o un dominio foldon o ambos. Los sitios de escisión útiles incluyen un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, uno con la secuencia LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)).
En ciertas realizaciones, se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden un sitio de escisión de elastasa. Los expertos en la técnica reconocerán que el sitio de escisión de tripsina en la conexión entre HA1 y HA2 se puede mutar a un sitio de escisión de elastasa sustituyendo arginina o lisina por valina en el sitio de escisión de HA1-HA2 en una secuencia de hemaglutinina (véase, p. ej., Stech et al., 2005, Nature Med. 11 (6):683-689). Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que tienen una sustitución de valina en el extremo C-terminal del segmento de tallo C-terminal (es decir, el extremo C-terminal del dominio HA1). En realizaciones particulares, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que comprenden cualquiera de SEQ ID NO:50-65 o 158-159 en donde el resto de aminoácido C-terminal, p. ej., arginina o lisina, de SEQ ID NO:50-65 o 158-159 se sustituye por un resto de valina.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que se prevé que sean resistentes a la escisión por proteasa en la unión entre HA1 y HA2. Los expertos en la técnica deberían reconocer que la secuencia Arg-Gly que abarca HA1 y HA2 es un sitio de reconocimiento para la tripsina y normalmente se escinde para la activación de la hemaglutinina. Dado que los polipéptidos del dominio de tallo descritos en el presente documento no necesitan ser activados, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que se prevé que sean resistentes a la escisión por proteasa. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el sitio de proteasa que abarca HA1 y HA2 está mutado a una secuencia que es resistente a la escisión por proteasa. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo C-terminal de HA1 es cualquier resto distinto de Lys o Arg. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto N-terminal del dominio HA2 es prolina. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo C-terminal de HA1 es Ala y el resto N-terminal del dominio HA2 también es Ala.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de
tallo de HA2 que está conectado covalentemente a, en secuencia, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión de proteasa, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado
covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:81),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (en donde n indica cualquier número de restos de glicina siempre que haya flexibilidad en el conector peptídico; en ciertas realizaciones, n es 2, 3, 4, 5, 6 o 7 restos de glicina), Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:108)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:61 )-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:62)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:110)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:111 )-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:64)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:112)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:113)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:177)-LL-(SEQ ID NO:226)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:178)-LL-(SEQ ID NO:227)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:179)-LL-(SEQ ID NO:228)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:180)-LL-(SEQ ID NO:229)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:181 )-LL-(SEQ ID NO:230)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:182)-LL-(SEQ ID NO:231 )-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:183)-LL-(SEQ ID NO:232)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:184)-LL-(SEQ ID NO:233)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:185)-LL-(SEQ ID NO:234)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:186)-LL-(SEQ ID NO:235)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:187)-LL-(SEQ ID NO:236)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:188)-LL-(SEQ ID NO:237)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:189)-LL-(SEQ ID NO:238)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:190)-LL-(SEQ ID NO:239)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:191 )-LL-(SEQ ID NO:240)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:192)-LL-(SEQ ID NO:241 )-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:193)-LL-(SEQ ID NO:242)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:194)-LL-(SEQ ID NO:243)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:195)-LL-(SEQ ID NO:244)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:196)-LL-(SEQ ID NO:245)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:197)-LL-(SEQ ID NO:246)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:198)-LL-(SEQ ID NO:247)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:199)-LL-(SEQ ID NO:248)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:200)-LL-(SEQ ID NO:249)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:201)-LL-(SEQ ID NO:250)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:202)-LL-(SEQ ID NO:251)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:203)-LL-(SEQ ID NO:252)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:204)-LL-(SEQ ID NO:253)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:205)-LL-(SEQ ID NO:254)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:206)-LL-(SEQ ID NO:255)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:207)-LL-(SEQ ID NO:256)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:208)-LL-(SEQ ID NO:257)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:209)-LL-(SEQ ID NO:258)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:210)-LL-(SEQ ID NO:259)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:211 )-LL-(SEQ ID NO:260)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:212)-LL-(SEQ ID NO:261)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:213)-LL-(SEQ ID NO:262)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:214)-LL-(SEQ ID NO:263)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:215)-LL-(SEQ ID NO:264)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:216)-LL-(SEQ ID NO:265)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:217)-LL-(SEQ ID NO:266)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:218)-LL-(SEQ ID NO:267)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:219)-LL-(SEQ ID NO:268)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:220)-LL-(SEQ ID NO:269)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:221)-LL-(SEQ ID NO:270)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:222)-LL-(SEQ ID NO:271)-(SEQ ID NO:81),
(SEQ ID NO:223)-LL-(SEQ ID NO:272)-(SEQ ID NO:81),
(SEQ ID NO:224)-LL-(SEQ ID NO:273)-(SEQ ID NO:81),
(SEQ ID NO:312)-LL-(SEQ ID NO:313)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:314)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:315)-LL-(SEQ ID NO:316)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:308)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:309)-(SEQ ID NO:68), y
(SEQ ID NO:310)-LL-(SEQ ID NO:311)-(SEQ ID NO:68),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:551 )-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:160), y
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:160),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:551 )-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161),
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161), y
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)-(SEQ ID NO:161),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:551 )-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), y
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Thr-Gly-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO:544) o Gly-Ile-Thr-Asn-Lys-Val-Asn-Ser-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:545). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia
de aminoácidos de Thr-Gly-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO:544) y Gly-Ile-Thr-Asn-Lys-Val-Asn-Ser-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:545). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) o Gln-Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Leu-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:548). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) y Gln-Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Leu-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:548). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) o Gln-Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:549). En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no comprenden polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) y Gln-Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:549).
En ciertas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina de influenza descritos en el presente documento no son reconocidos por el anticuerpo CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, h 98, C179 (producido por hibridoma FERM BP-4517, clones comercializados por Takara Bio, Inc. (Otsu, Shiga, Japón)), AI3C (FERM BP-4516), cualquier otro anticuerpo descrito por Ekiert DC et al. (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicado en Science Express el 26 de febrero de 2009); Kashyap et al. (2008), o cualquier otro anticuerpo similar.
5.3.1 Polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza
En ciertas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza es un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza. La estructura primaria típica de un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 y una HA2. La secuencia primaria puede estar formada por un solo polipéptido o puede estar formada por múltiples polipéptidos. Típicamente, un único polipéptido se expresa mediante cualquier mecanismo que un experto en la técnica considere adecuado. En realizaciones de un solo polipéptido, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación terciaria. Como es sabido por los expertos en la técnica, un solo polipéptido de HA se puede escindir, por ejemplo, mediante una proteasa, en condiciones de expresión apropiadas para producir dos polipéptidos en asociación cuaternaria. La escisión es típicamente entre el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 y la HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan múltiples polipéptidos. En realizaciones de múltiples polipéptidos, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación cuaternaria.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es monomérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es multimérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es trimérico. Los expertos en la técnica reconocerán que los polipéptidos de hemaglutinina de influenza nativos son susceptibles de trimerización in vivo y que ciertos polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento son susceptibles de trimerización. En realizaciones particulares descritas a continuación, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden dominios de trimerización para facilitar la trimerización.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza comprende un péptido señal. Típicamente, el péptido señal se escinde durante o después de la expresión y traducción del polipéptido para producir un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza maduro. El péptido señal puede ser ventajoso para la expresión de los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza. En ciertas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza maduros que carecen de un péptido señal.
La hemaglutinina HA2 de influenza típicamente comprende un dominio de tallo, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2 y un dominio transmembrana de HA2, pero carecen de parte o la totalidad del dominio citoplásmico típico. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2 y un dominio luminal de HA2, pero carecen tanto de un dominio transmembrana de HA2 como de un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, pero carecen de un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza comprenden un dominio de tallo de HA2 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de tallo de HA2 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas anteriores se proporcionan ejemplos de dominios
de tallo de HA2 conocidos de hemaglutininas conocidas de influenza A e influenza B.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80,
75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del dominio de tallo de HA2. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5,
4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden dominios de tallo de
HA2 con deleciones y alteraciones.
El segmento de tallo N-terminal de HA1 puede ser cualquier tallo N-terminal de HA1 proporcionado en el presente documento. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo N-terminales de HA1 conocidos.
El segmento de tallo corto C-terminal de HA1 puede ser cualquier segmento de tallo corto C-terminal de HA1 reconocido por un experto en la técnica basándose en la definición proporcionada en el presente documento.
Típicamente, un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 corresponde a un polipéptido que consiste en el resto de cisteína ubicado en secuencia aproximadamente en el resto 305° de una HA1 (usando la numeración de H3) hasta el aminoácido C-terminal de la HA1. Este resto de cisteína, denominado Bq en el presente documento, es capaz de conectarse a un resto de cisteína Ap en el segmento de tallo N-terminal de HA1. Las secuencias de 17 hemaglutininas de influenza A representativas se presentan en la FIG. 1 y el resto Bq se identifica en cada una.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 no comienza en Bq (p. ej., Cys305 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), sino en un resto en proximidad de secuencia y estructural a Bq. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto del C-terminal de HA1 comienza en Bq-1, Bq-2, Bq-3, Bq-4, Bq-5, Bq-6,
Bq-7, Bq-8, Bq-9, Bq-10, Bq-11, Bq-12, Bq-13, Bq-14, Bq-15, Bq-20, Bq-25, Bq-30, Bq-35, Bq-40, Bq-45, Bq-50, Bq-55, Bq-60 o Bq-80. En otras realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 comienza en Bq+1, Bq+2, Bq+3, Bq+4, Bq+5,
Bq+6, Bq+7, Bq+8, Bq+9, o Bq+10. El extremo de un segmento de tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal de HA1 y el conector para que el dominio de tallo de HA1 resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar, como se describe a continuación, a una hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza comprenden un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 conocidos.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-1, y el comienzo del segmento de tallo corto
C-terminal es Bq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-2, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es
Ap-3, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-3, En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-4, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-5, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-5,
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+1, y el comienzo del segmento de tallo corto
C-terminal es Bq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+2, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es
Ap+3, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+4, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+5, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-1, y el comienzo del segmento de tallo corto
C-terminal es Bq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-2, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es
Ap-3, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-4, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap-5, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap (es decir, el final del segmento del tallo N-terminal es cisteína), y el comienzo del segmento del tallo C-terminal es Aq (es decir, el comienzo del segmento del tallo C-terminal es cisteína). En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+1, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es
Ap+2, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-2, En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+3, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-3, En ciertas realizaciones, el
extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+4, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo N-terminal es Ap+5, y el comienzo del segmento de tallo corto C-terminal es Bq-5,
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 resto de aminoácido, se eliminan de uno o ambos extremos del segmento de tallo corto C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden formas expandidas de segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 en donde se añaden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos al extremo N-terminal de los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1. En realizaciones particulares, si se añade un resto al segmento de tallo corto C-terminal, se añade un resto al segmento de tallo N-terminal; si se añaden dos restos al segmento de tallo corto C-terminal, se añaden dos restos al segmento de tallo N-terminal; si se añaden tres restos al segmento de tallo corto C-terminal, se añaden tres restos al segmento de tallo N-terminal. En el presente documento se proporcionan adicionalmente polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 con deleciones y alteraciones.
Los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza pueden basarse en (es decir, pueden tener identidad de secuencia, como se describió anteriormente) cualquier hemaglutinina de influenza conocida por los expertos o descubierta posteriormente. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza B, como se describe en detalle a continuación.
Los segmentos de tallo N-terminales de HA1 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo N-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo N-terminal de HA1 se basan en segmentos de tallo N-terminal de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:34-49, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:177-224.
Los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo corto C-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 se basan en segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:350-365, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:366-413.
Los dominios de tallo de HA2 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier dominio de tallo de HA2 conocido por los expertos, descubierto posteriormente o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en los dominios de tallo de HA2 de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza
A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA2 se selecciona entre SEQ ID NO:66-97.
En realizaciones que comprenden un péptido señal, el péptido señal puede basarse en cualquier péptido señal de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en los péptidos señal de influenza A.
En realizaciones que comprenden un dominio luminal, el dominio luminal puede basarse en cualquier dominio luminal de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento.
En realizaciones que comprenden un dominio transmembrana, el dominio transmembrana puede basarse en cualquier dominio transmembrana de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento.
En realizaciones que comprenden un dominio citoplásmico, el dominio citoplásmico puede basarse en cualquier dominio citoplásmico de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento.
En ciertas realizaciones, uno o más de los sitios de glicosilación en el dominio de tallo corto de hemaglutinina se modifican (p. ej., mediante adición, deleción o sustitución de aminoácidos) de modo que la glicosilación en estos sitios no se produzca durante el procesamiento y la maduración del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que la HA de la influenza típicamente comprende uno o más sitios de glicosilación (p. ej., Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido, o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa no es Pro). En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en una secuencia de glicosilación se sustituyen de forma conservativa por un resto de aminoácido que interrumpe el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen por cualquier resto de aminoácido que interrumpa el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de asparragina en una secuencia de glicosilación se sustituyen por alanina. En una realización particular, la asparragina en la posición 38 de una hemaglutinina H3 se cambia a alanina. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo corto de hemaglutinina comprende uno o más sitios de glicosilación modificados como se describe en la Sección 5.4.1, más abajo.
La Tabla 6, a continuación, identifica péptidos señal, segmentos de tallo terminales de HA1, segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 y dominios HA2 de polipéptidos de hemaglutinina de influenza A. Estos péptidos señal, segmentos de tallo y dominios son útiles en los polipéptidos y métodos descritos en el presente documento.
Tabla 6. Secuencias de péptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza A ilustrativos
La Tabla 6A, a continuación, identifica segmentos de tallo N-terminales de HA1 y segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 útiles para los polipéptidos y métodos descritos en el presente documento.
Tabla 6A. Secuencias de péptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza A ilustrativas
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza comprenden uno o más epítopos inmunogénicos en la estructura terciaria o cuaternaria de un polipéptido de hemaglutinina de influenza. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 comprende la secuencia de aminoácidos A17-A18-(Xaa)n-A38 (SEQ ID NO:146), en donde
A17 es Y o H;
A18 es H, L o Q;
(Xaa)n representa una secuencia de 18-20 restos de aminoácidos; y
A38 es H, S, Q, T o N.
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A18-A19-A20-A21 (SEQ ID NO:148), en donde
A18 es V o I;
A19 es D, N o A;
A20 es G, y
A21 es W
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56 (SEQ ID NO:149), en donde
A38 es K, Q, R, L o Y;
A39 es cualquier resto de aminoácido;
A40 es cualquier resto de aminoácido;
A41 es T;
A42 es Q;
A43 es cualquier resto de aminoácido;
A44 es A;
A45 es I;
A46 es D;
A47 es cualquier resto de aminoácido;
A48 es I, V o M;
A49 es T, Q o N;
A50 es cualquier resto de aminoácido;
A51 es K;
A52 es V o L;
A53 es N;
A54 es cualquier resto de aminoácido;
A55 es V, I o L; y
A56 es V o I.
Como se ilustra en las FIG. 1 y 2, los segmentos de tallo N-terminales de HA1 comparten identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. De manera similar, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 también comparten identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. Adicionalmente, los dominios HA2 también comparten identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A.
En algunas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza es un polipéptido híbrido que comprende o consiste esencialmente en segmentos y/o dominios de una pluralidad de cepas o subtipos de influenza. Por ejemplo, un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza puede comprender segmentos de tallo corto de N-terminales de HA1y C-terminales de HA1 de diferentes subtipos de HA del virus de la influenza A. En algunas realizaciones, el segmento de tallo N-terminal de HA1 es del virus de la influenza B mientras que el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 es del virus de la influenza A. De manera similar, la HA2 y el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 también pueden provenir del virus de la influenza A, mientras que el extremo N de HA1 es del virus de la influenza B.
Se entenderá que cualquier combinación de los elementos de secuencia enumerados en las Tablas 2, 4, 5 y las secuencias enumeradas en las columnas "Péptido señal", "Segmento de tallo N-terminal de HA1" y "Dominio HA2" de la Tabla 3 o sus variantes puede utilizarse para formar los polipéptidos de dominio de tallo de hemaglutinina HA.
En un polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento, un conector conecta covalentemente el segmento de tallo N-terminal de HA1 con el segmento de tallo corto C-terminal de HA1. El conector puede ser cualquier conector que un experto en la técnica considere adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, los conectores descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza son capaces de formar una estructura tridimensional que es similar a la estructura tridimensional del dominio de tallo de una hemaglutinina de influenza nativa. La similitud estructural puede evaluarse basándose en cualquier mecanismo que los expertos en la técnica consideren adecuado, incluidas, entre otros, los mecanismos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, cualquier polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento puede comprender adicionalmente uno o más dominios polipeptídicos que se consideren adecuados para los expertos en la técnica. Los dominios polipeptídicos útiles incluyen dominios que facilitan la purificación, el plegamiento y la escisión de porciones de un polipéptido. Por ejemplo, una etiqueta His (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO:166), un epítopo FLAG u otra etiqueta de purificación pueden facilitar la purificación de un polipéptido proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más. Cualquier dominio de trimerización, incluido un foldon de fibritina del bacteriófago T4, puede facilitar la trimerización de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. El dominio foldon puede tener cualquier secuencia de foldon conocida por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Papanikolopoulou et al., 2004, J. Biol. Chem.
279(10):8991 -8998, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Los ejemplos incluyen GSGYIPeA p Rd GQAYVRKDGEw Vl LSt Fl (SEQ ID NO:167). Un dominio foldon puede ser útil para facilitar la trimerización de polipéptidos solubles proporcionados en el presente documento. Los sitios de escisión se pueden utilizar para facilitar la escisión de una porción de un polipéptido, por ejemplo, la escisión de una etiqueta de purificación o un dominio foldon o ambos. Los sitios de escisión útiles incluyen un sitio de escisión de trombina, p. ej., uno con la
secuencia LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)).
En ciertas realizaciones, se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden un sitio de escisión de elastasa como se describe en el presente documento. En realizaciones particulares, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que comprenden cualquiera de SEQ ID NO:350-365 en las que el resto de aminoácido C-terminal, p. ej. la arginina o lisina, de SEQ ID NO:350-365 se sustituye por un resto de valina.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos de dominio corto de tallo de hemaglutinina de influenza que se prevé que sean resistentes a la escisión por proteasa en la unión entre HA1 y HA2. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el sitio de proteasa que abarca HA1 y HA2 está mutado a una secuencia que es resistente a la escisión por proteasa. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo corto C-terminal de HA1 es cualquier resto distinto de Lys o Arg. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto N-terminal del dominio HA2 es prolina. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo corto C-terminal de HA1 es Ala y el resto N-terminal del dominio HA2 también es Ala.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio
foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo corto de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de
influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:80), y
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:81),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (en donde n es cualquier número de restos de glicina siempre que haya flexibilidad en el conector peptídico; en ciertas realizaciones, n es 2, 3, 4, 5, 6 o 7 restos de glicina), Gly-Pro, ITp Ng SIPNDKPFQNVNKITYGA (SeQ ID NO:165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91),
(SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:92),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94),
(S E Q ID N O :47 )-L L -(S E Q ID N O :363 )-(S E Q ID N O :95),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96), y
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351 )-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID N O :87 )-(S E Q ID N O :168 )-(S E Q ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:41 )-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:98)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:99)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:100)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:101)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:102)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:103)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:104)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:41 )-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:105)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:106)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:107)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(S E Q ID N O :44 )-L L -(S E Q ID N O :360 )-(S E Q ID N O :92 )-(S E Q ID N O :108 )-(S E Q ID N O :168 )-(S E Q ID
NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:110)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:111)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:112)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:113)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 se pueden unir covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) y Asn-Ala-Ser. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido de tallo corto de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:177)-LL-(SEQ ID NO:366)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:178)-LL-(SEQ ID NO:367)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:179)-LL-(SEQ ID NO:368)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:180)-LL-(SEQ ID NO:369)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:181 )-LL-(SEQ ID NO:370)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:182)-LL-(SEQ ID NO:371)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:183)-LL-(SEQ ID NO:372)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:184)-LL-(SEQ ID NO:373)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:185)-LL-(SEQ ID NO:374)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:186)-LL-(SEQ ID NO:375)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:187)-LL-(SEQ ID NO:376)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:188)-LL-(SEQ ID NO:377)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:189)-LL-(SEQ ID NO:378)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:190)-LL-(SEQ ID NO:379)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:191 )-LL-(SEQ ID NO:380)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:192)-LL-(SEQ ID NO:381)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:193)-LL-(SEQ ID NO:382)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:194)-LL-(SEQ ID NO:383)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:195)-LL-(SEQ ID NO:384)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:196)-LL-(SEQ ID NO:385)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:197)-LL-(SEQ ID NO:386)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:198)-LL-(SEQ ID NO:387)-(SEQ ID NO:73),
(S E Q ID N O :199 )-L L -(S E Q ID N O :388 )-(S E Q ID N O :73),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo corto C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
5.3.2 Polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza
En ciertas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza es un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza. La estructura primaria típica de un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento comprende, en el siguiente orden: un segmento de tallo largo N-terminal de HA1, un conector, un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 y una HA2. La secuencia primaria puede estar formada por un solo polipéptido o puede estar formada por múltiples polipéptidos. Típicamente, un único polipéptido es expresado mediante cualquier mecanismo que un experto en la técnica considere adecuado. En realizaciones de un solo polipéptido, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación terciaria. Como es sabido por los expertos en la técnica, un solo polipéptido de HA se puede escindir, por ejemplo, mediante una proteasa, en condiciones de expresión apropiadas para producir dos polipéptidos en asociación cuaternaria. La escisión es típicamente entre el segmento de tallo corto C-terminal de HA1 y la HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan múltiples polipéptidos. En realizaciones de polipéptidos múltiples, los segmentos HA1 y HA2 están en asociación cuaternaria.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es monomérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es multimérico. En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento es trimérico. Los expertos en la técnica reconocerán que los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza nativa son susceptibles de trimerización in vivo y que ciertos polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento son susceptibles de trimerización. En realizaciones particulares descritas a continuación, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionados en el presente documento comprenden dominios de trimerización para facilitar la trimerización.
En ciertas realizaciones, un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza comprende un péptido señal. En ciertas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza madura que carecen de un péptido señal.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, un dominio luminal de HA2 y un dominio transmembrana de HA2 pero que carecen de parte o la totalidad del dominio citoplásmico típico. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2 y un dominio luminal de HA2, pero carecen tanto de un dominio transmembrana de HA2 como de un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden un dominio de tallo de HA2, pero carecen de un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza comprenden un dominio de tallo de HA2 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de tallo de HA2 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de dominios de tallo de HA2 conocidos de hemaglutininas de influenza A conocidas.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del dominio de tallo de HA2. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de dominios de tallo de HA2 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden dominios de tallo de HA2 con deleciones y alteraciones.
El segmento de tallo largo N-terminal de HA1 puede ser cualquier segmento de tallo largo N-terminal de HA1 reconocido por un experto en la técnica basándose en la definición proporcionada en el presente documento. Típicamente, un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 corresponde a un polipéptido que consiste en el aminoácido N-terminal de una HA1 madura (es decir una HA1 que carece de un péptido señal) hasta el resto de cisteína ubicado en secuencia en aproximadamente el resto 97° de la HA1 (usando la numeración de H3). Este resto de cistina, denominado Cp en el presente documento, generalmente es capaz de conectarse a un resto de cisteína Cq en el segmento de tallo largo C-terminal de HA1. Las secuencias de 17 hemaglutininas de influenza A representativas se presentan en la FIG. 1 y resto Cp se identifica en cada una.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 no termina exactamente en Cp (p. ej., Cysgz de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), sino en un resto en proximidad de secuencia y estructural a Cp. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 termina en Cp-1, Cp-2, Cp-3, o Cp-4. En otras realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 termina en Cp+1, Cp+2, Cp+3, Cp+4 o Cp+5. El extremo de un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el extremo del segmento de tallo largo C-terminal de HA1 y el conector de modo que el dominio de tallo de HA1 conectado resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar como se describe a continuación, a un dominio de tallo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza comprenden un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 conocidos.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de segmentos de tallo largo N-terminales de HA1, en donde hasta
100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se eliminan de uno o ambos extremos del segmento de tallo largo N-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas expandidas de segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 en donde se añaden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos al extremo C-terminal de los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1; estos restos añadidos se pueden obtener de la secuencia de aminoácidos de un dominio de cabeza globular adyacente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1. En el presente documento se proporcionan adicionalmente polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 con deleciones y alteraciones.
El segmento de tallo largo C-terminal de HA1 puede ser cualquier segmento de tallo largo C-terminal de HA1 reconocido por un experto en la técnica basándose en la definición proporcionada en el presente documento. Típicamente, un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 corresponde a un polipéptido que consiste en el resto de alanina ubicado en secuencia aproximadamente en el resto 253° de una HA1 (usando la numeración de H3) hasta el aminoácido C-terminal de la HA1. Este resto de alanina, denominado Cq en el presente documento, generalmente es capaz de conectarse a un resto de cisteína Cp en el segmento de tallo largo N-terminal de HA1. Las secuencias de 16 hemaglutininas de influenza A representativas se presentan en la FIG. 1 y resto Cq se identifica en cada una.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 no comienza en Cq (p. ej., Ala253 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), sino en un resto en proximidad de secuencia y estructural a Cq. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 comienza en Cq-1, Cq-2, Cq-3, o Cq-4. En otras realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 comienza en Cq+1, Cq+2, Cq+3, Cq+4 o Cq+5. El extremo de un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal de HA1 y el conector para que el dominio de tallo de HA1 resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar, como se describe a continuación, a una hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza comprenden un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 de influenza conocido por los expertos en la técnica. En las tablas siguientes se proporcionan ejemplos de segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 conocidos.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-1, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Ap-2, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-3, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-4, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-5, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+1, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+2, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+3, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+4, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+5, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-1, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-2, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-3, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-4, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp-5, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq+5.
En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+1, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-1. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+2, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-2. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+3, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-3. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+4, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-4. En ciertas realizaciones, el extremo del segmento de tallo largo N-terminal es Cp+5, y el comienzo del segmento de tallo largo C-terminal es Cq-5.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas con deleciones de segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 resto de aminoácido se eliminan de uno o ambos extremos del segmento de tallo largo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas expandidas de segmentos de tallo largo C-terminales de HA1, en donde se añaden 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos al extremo N-terminal de los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1; estos restos añadidos se pueden obtener de la secuencia de aminoácidos de un dominio de cabeza globular adyacente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1. En realizaciones particulares, si se añade un resto al segmento de tallo largo C-terminal, se añade un resto al segmento de tallo largo N-terminal; si se añaden dos restos al segmento de tallo largo C-terminal, se añaden dos restos al segmento de tallo largo N-terminal; si se añaden tres restos al segmento de tallo largo C-terminal, se añaden tres restos al segmento de tallo largo N-terminal. Adicionalmente, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden formas alteradas de segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 en donde hasta 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos se sustituyen de forma conservativa por otros aminoácidos. Adicionalmente se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 con deleciones y alteraciones.
Los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza pueden basarse en (es decir, pueden tener identidad de secuencia, como se describió anteriormente) cualquier hemaglutinina de influenza conocida por los expertos o descubierta posteriormente. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza se basan en una hemaglutinina B de influenza, como se describe en detalle a continuación.
Los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 se basan en segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:414-429, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo C-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:446-493.
Los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier segmento de tallo largo C-terminal de HA1 conocido por los expertos o descubierto posteriormente. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 se basan en segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 de influenza A. En ciertas realizaciones, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445, cada uno con un aminoácido eliminado de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445, cada uno con dos aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445, cada uno con tres aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445, cada uno con cuatro aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:430-445, cada uno con cinco aminoácidos eliminados de su extremo N-terminal. En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 se selecciona entre SEQ ID NO:494-541.
Los dominios de tallo de HA2 se pueden basar en (es decir puede tener identidad de secuencia, como se describe anteriormente) cualquier dominio de tallo de HA2 conocido por los expertos, descubierto posteriormente o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en los dominios de tallo de HA2 de influenza A. En ciertas realizaciones, los dominios de tallo de HA2 se basan en una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA2 se selecciona entre SEQ ID NO:66-97.
En realizaciones que comprenden un péptido señal, el péptido señal puede basarse en cualquier péptido señal de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el péptido señal se selecciona entre SEQ ID NO:18-33.
En realizaciones que comprenden un dominio luminal, el dominio luminal puede basarse en cualquier dominio luminal de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio luminal se selecciona entre SEQ ID NO:98-113.
En realizaciones que comprenden un dominio transmembrana, el dominio transmembrana puede basarse en cualquier dominio transmembrana de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio transmembrana se selecciona entre SEQ ID NO:114-129.
En realizaciones que comprenden un dominio citoplásmico, el dominio citoplásmico puede basarse en cualquier dominio citoplásmico de influenza conocido por los expertos en la técnica o descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el dominio citoplásmico se selecciona entre SEQ ID NO:130-145.
En ciertas realizaciones, uno o más de los sitios de glicosilación en el dominio de tallo de hemaglutinina se modifican (p. ej., por adición, deleción o sustitución de aminoácidos) de modo que la glicosilación en estos sitios no se produzca durante el procesamiento y la maduración del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que la HA de influenza típicamente comprende uno o más sitios de glicosilación (p. ej., Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier otro aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro). En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen de forma conservativa por un resto de aminoácido que interrumpe el sitio de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación se sustituyen por cualquier resto de aminoácido que interrumpa la secuencia de glicosilación. En ciertas realizaciones, uno o más restos de asparragina en una secuencia de glicosilación se sustituyen por alanina. En una realización particular, la asparragina en la posición 38 de una hemaglutinina H3 se cambia a una alanina. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de hemaglutinina comprende uno o más sitios de glicosilación modificados como se describe en la Sección 5.4.1, más abajo.
La Tabla 7, a continuación, identifica péptidos señal, segmentos de tallo largo N-terminales de HA1, segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 y dominios HA2 de polipéptidos de hemaglutinina de influenza A. Estos péptidos señal, segmentos de tallo y dominios son útiles en los polipéptidos y métodos descritos en el presente documento.
Tabla 7. Secuencias de péptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza A ilustrativas
La Tabla 7A, a continuación, identifica segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 y segmentos de tallo largo C-terminal de HA1 útiles para los polipéptidos y métodos descritos en el presente documento.
Tabla 7A. Secuencias ilustrativas del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza A
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza comprenden uno o más epítopos inmunogénicos en la estructura terciaria o cuaternaria de un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 comprende la secuencia de aminoácidos A17-A18-(Xaa)N-A38 (SEQ ID NO:146), en donde
A17 es Y o H;
A18 es H, L o Q;
(Xaa)n representa una secuencia de 18-20 restos de aminoácidos; y
A38 es H, S, Q, T o N.
En ciertas realizaciones, el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 comprende la secuencia de aminoácidos A291-A292 (SEQ ID NO:147), en donde
A291 es T, S, N, D, P o K; y
A292 es L, M, K o R.
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A18-A19-A20-A21 (SEQ ID NO:148), en donde
A18 es V o I;
A19 es D, N o A;
A20 es G, y
A21 es W
En ciertas realizaciones, el dominio HA2 comprende la secuencia de aminoácidos A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56 (SEQ ID NO:149), en donde
A38 es K, Q, R, L. o Y;
A39 es cualquier resto de aminoácido
A40 es cualquier resto de aminoácido
A41 es T;
A42 es Q;
A43 es cualquier resto de aminoácido
A44 es A;
A45 es I;
A46 es D;
A47 es cualquier resto de aminoácido
A48 es I, V o M;
A49 es T, Q o N;
A50 es cualquier resto de aminoácido
A51 es K;
A52 es V o L;
A53 es N;
A54 es cualquier resto de aminoácido
A55 es V, I o L; y
A56 es V o I.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden dos secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden tres secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149. En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo de influenza comprenden cuatro secuencias de aminoácidos seleccionadas entre SEQ ID NO:146-149.
Como se ilustra en las FIG. 1 y 2, los segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 comparten la identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. De manera similar, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 también comparten la identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A. Adicionalmente, los dominios HA2 también comparten la identidad de secuencia entre la influenza A y la influenza B y, además, entre los subtipos de influenza A.
En algunas realizaciones, el polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza es un polipéptido híbrido que comprende o consiste esencialmente en segmentos y/o dominios de una pluralidad de cepas o subtipos de influenza. Por ejemplo, un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza puede comprender segmentos de tallo largo N-terminales de HA1 y C-terminales de HA1 de diferentes subtipos de HA del virus influenza A. En algunas realizaciones, el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 es del virus de la influenza A mientras que el segmento de tallo largo C-terminal de HA1 es del virus de la influenza B. De manera similar, HA2 también puede ser del virus de la influenza A, mientras que el segmento de tallo largo N-terminal y/o C-terminal de HA1 es del virus
de la influenza B.
Se entenderá que se puede utilizar cualquier combinación de los elementos de secuencia enumerados en las Tablas 2-4, 6, 6a o sus variantes para formar los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina HA.
En un polipéptido del dominio de tallo de influenza proporcionado en el presente documento, un conector conecta covalentemente el segmento de tallo largo N-terminal de HA1 con el segmento de tallo largo C-terminal de HA1. El conector puede ser cualquier conector que un experto en la técnica considere adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, los conectores descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza son capaces de formar una estructura tridimensional que es similar a la estructura tridimensional del dominio de tallo de una hemaglutinina de influenza nativa. La similitud estructural puede evaluarse basándose en cualquier mecanismo que los expertos en la técnica consideren adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, los mecanismos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza proporcionado en el presente documento puede comprender adicionalmente uno o más dominios polipeptídicos que se consideren adecuados para los expertos en la técnica. Los dominios polipeptídicos útiles incluyen dominios que facilitan la purificación, el plegamiento y la escisión de porciones de un polipéptido. Por ejemplo, una etiqueta His (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO:166), un epítopo FLAG u otra etiqueta de purificación pueden facilitar la purificación de un polipéptido proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más. Cualquier dominio de trimerización, incluido un foldon de fibritina del bacteriófago T4, puede facilitar la trimerización de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. El dominio foldon puede tener cualquier secuencia de foldon conocida por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Papanikolopoulou et al., 2004, J. Biol. Chem.
279(10):8991 -8998, cuyo contenido se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Los ejemplos incluyen GSGYIPeA p Rd GQAYVRKDGEw Vl LSt Fl (SEQ ID NO:167). Un dominio foldon puede ser útil para facilitar la trimerización de polipéptidos solubles proporcionados en el presente documento. Los sitios de escisión se pueden utilizar para facilitar la escisión de una porción de un polipéptido, p. ej., la escisión de una etiqueta de purificación o un dominio foldon o ambos. Los sitios de escisión útiles incluyen un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, uno con la secuencia LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)).
En ciertas realizaciones, se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden un sitio de escisión de elastasa como se describe en el presente documento. En realizaciones particulares, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que comprenden cualquiera de SEQ ID NO:430-445 en donde el resto de aminoácido C-terminal, p. ej., arginina o lisina, de SEQ ID NO:430-445 se sustituye por un resto de valina.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que se prevé que sean resistentes a la escisión por proteasa en la unión entre HA1 y HA2. Los expertos en la técnica deben reconocer que la secuencia Arg-Gly que abarca HA1 y HA2 es un sitio de reconocimiento para la tripsina y normalmente se escinde para la activación de la hemaglutinina. Dado que no es necesario activar los polipéptidos del dominio de tallo descritos en el presente documento, se proporcionan en el presente documento polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que se prevé que sean resistentes a la escisión por proteasa. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el sitio de proteasa que abarca HA1 y HA2 está mutado a una secuencia que es resistente a la escisión por proteasa. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo largo C-terminal de HA1 es cualquier resto distinto de Lys o Arg. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto N-terminal del dominio HA2 es prolina. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto C-terminal del segmento de tallo largo C-terminal de HA1 es Ala y el resto N-terminal del dominio HA2 también es Ala. En ciertas realizaciones, se proporciona cualquier polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza descrito en el presente documento en donde el resto N-terminal del dominio HA2 es cualquier resto distinto de glicina.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos
del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA2 del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA1 y/o HA2 de la hemaglutinina del virus de la influenza quimérico.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de influenza. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA2 de la hemaglutinina. En ciertas realizaciones, el conector es una cabeza globular, o un fragmento de la misma, de un virus de la influenza heterólogo con respecto al dominio de tallo de la subunidad HA1 y/o HA2 de la hemaglutinina.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a una dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, en a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio
luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que está conectado covalentemente, en secuencia, a un sitio de escisión, un dominio de trimerización y una etiqueta de purificación. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión de trombina. En ciertas realizaciones, el sitio de escisión tiene la secuencia de aminoácidos LVPRGSP (SEQ ID NO:168). En ciertas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (p. ej., secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). En ciertas realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio foldon. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII de tipo salvaje o una repetición de héptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de hélices superenrolladas triméricas o tetraméricas. Véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. En algunas realizaciones, la etiqueta de purificación es una etiqueta His, que tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1 en asociación de unión con un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, a su vez conectado covalentemente a una dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan polipéptidos del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que consisten en un péptido señal conectado covalentemente a un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector, a su vez conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1, en a su vez conectado covalentemente a un dominio de tallo de HA2 que está conectado covalentemente a un dominio luminal de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio transmembrana de HA2 que a su vez está conectado covalentemente a un dominio citoplásmico de HA2.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:71),
(S E Q ID N O :420 )-L L -(S E Q ID N O :436 )-(S E Q ID N O :72),
(S E Q ID N O :421 )-L L -(S E Q ID N O :437 )-(S E Q ID N O :73),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:80), y
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:81),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (en donde n es cualquier número de restos de glicina siempre que haya flexibilidad en el conector peptídico; en ciertas realizaciones, n es 2, 3, 4, 5, 6 o 7 restos de glicina), Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:82),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88),
(SEQ ID NO:421 )-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96), y
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(S E Q ID N O :414 )-L L -(S E Q ID N O :430 )-(S E Q ID N O :82 )-(S E Q ID N O :98),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:99),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:100),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:101),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:102),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:103),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:104),
(SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:105),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:106),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:107),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:108),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:110),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:111),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:112), y
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:113),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441 )-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina de influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:98)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:99)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:100)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:101)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:102)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:103)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:104)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:421 )-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:105)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:106)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:107)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:108)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:1 10)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:1 11)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:1 12)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), y
(S E Q ID N O :429 )-L L -(S E Q ID N O :445 )-(S E Q ID N O :97 )-(S E Q ID N O :113 )-(S E Q ID N O :168 )-(S E Q ID
N O :167 )-(S E Q ID N O :166),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polipéptido del dominio de tallo largo de hemaglutinina ide influenza que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
(SEQ ID NO:446)-LL-(SEQ ID NO:494)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:447)-LL-(SEQ ID NO:495)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:448)-LL-(SEQ ID NO:496)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:449)-LL-(SEQ ID NO:497)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:450)-LL-(SEQ ID NO:498)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:451 )-LL-(SEQ ID NO:499)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:452)-LL-(SEQ ID NO:500)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:453)-LL-(SEQ ID NO:501 )-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:454)-LL-(SEQ ID NO:502)-(SEQ ID NO:68),
(SEQ ID NO:455)-LL-(SEQ ID NO:503)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:456)-LL-(SEQ ID NO:504)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:457)-LL-(SEQ ID NO:505)-(SEQ ID NO:69),
(SEQ ID NO:458)-LL-(SEQ ID NO:506)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:459)-LL-(SEQ ID NO:507)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:460)-LL-(SEQ ID NO:508)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:461 )-LL-(SEQ ID NO:509)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:462)-LL-(SEQ ID NO:510)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:463)-LL-(SEQ ID NO:511 )-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:464)-LL-(SEQ ID NO:512)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:465)-LL-(SEQ ID NO:513)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:466)-LL-(SEQ ID NO:514)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:467)-LL-(SEQ ID NO:515)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:468)-LL-(SEQ ID NO:516)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:469)-LL-(SEQ ID NO:517)-(SEQ ID NO:73),
(SEQ ID NO:470)-LL-(SEQ ID NO:518)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:471)-LL-(SEQ ID NO:519)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:472)-LL-(SEQ ID NO:520)-(SEQ ID NO:74),
(SEQ ID NO:473)-LL-(SEQ ID NO:521 )-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:474)-LL-(SEQ ID NO:522)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:475)-LL-(SEQ ID NO:523)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:476)-LL-(SEQ ID NO:524)-(SEQ ID NO:76),
(S E Q ID N O :477 )-L L -(S E Q ID N O :525 )-(S E Q ID N O :76),
(SEQ ID NO:478)-LL-(SEQ ID NO:526)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:479)-LL-(SEQ ID NO:527)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:480)-LL-(SEQ ID NO:528)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:481 )-LL-(SEQ ID NO:529)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:482)-LL-(SEQ ID NO:530)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:483)-LL-(SEQ ID NO:531)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:484)-LL-(SEQ ID NO:532)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NO:485)-LL-(SEQ ID NO:533)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:486)-LL-(SEQ ID NO:534)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:487)-LL-(SEQ ID NO:535)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:488)-LL-(SEQ ID NO:536)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:489)-LL-(SEQ ID NO:537)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:490)-LL-(SEQ ID NO:538)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:491 )-LL-(SEQ ID NO:539)-(SEQ ID NO:81),
(SEQ ID NO:492)-LL-(SEQ ID NO:540)-(SEQ ID NO:81), y
(SEQ ID NO:493)-LL-(SEQ ID NO:541)-(SEQ ID NO:81),
en donde cada secuencia anterior está conectada a la secuencia adyacente como se describe en el presente documento y en donde LL es un conector como se describe en el presente documento. En particular, los segmentos de tallo largo C-terminales de HA1 pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a los dominios HA2. En ciertas realizaciones, LL se selecciona del grupo que consiste en un enlace directo, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO :165) y Asn-Ala-Ser.
5.4 Variantes de glicosilación
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe que comprenden uno o más sitios de glicosilación modificados y/o uno o más sitios de glicosilación de origen no natural. En realizaciones específicas, el polipéptido de HA de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados y/o uno o más sitios de glicosilación de origen no natural. Como se muestra en las Fig. 19C y B, la glicosilación de la hemaglutinina de tipo salvaje se produce tanto en la cabeza globular como en los dominios del tallo. Se cree que la glicosilación dentro de estos dominios puede enmascarar regiones antigénicas, lo que permite que un virus de la influenza evada la respuesta del sistema inmunitario del anfitrión. Por ejemplo, se sabe que las cepas del virus de la influenza estacional (p. ej., H1N1 y H3N2) adquieren sitios de glicosilación adicionales con el tiempo en las regiones antigénicas inmunodominantes del dominio de cabeza globular. Sin embargo, dentro del contexto de un polipéptido de HA del virus de la influenza descrito en el presente documento, la glicosilación dentro del dominio de tallo del polipéptido puede dificultar o prevenir las respuestas inmunitarias deseadas contra las regiones antigénicas conservadas que se encuentran en este dominio. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que una respuesta inmunitaria a las regiones antigénicas conservadas dentro del dominio de tallo del polipéptido de Ha del virus de la influenza proporcionado en el presente documento puede incrementarse modificando uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio de tallo de una manera que interrumpa la glicosilación (es decir, el anclaje de un glicano) en los sitios. Adicionalmente, se cree que el enmascaramiento de las regiones antigénicas inmunodominantes del dominio de cabeza globular de HA mediante la adición de uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en estas regiones inmunodominantes también puede aumentar la inmunogenicidad de las regiones antigénicas subinmunodominantes conservadas dentro del dominio de tallo. Véase la Figura 19C.
Los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe que comprenden uno o más sitios de glicosilación modificados y/o uno o más sitios de glicosilación de origen no natural se pueden utilizar según uno los métodos de vacunación descritos en el presente documento, es decir, tales polipéptidos de HA mutantes pueden administrarse a un sujeto para provocar anticuerpos específicos del dominio de tronco/tallo del virus de la influenza en el sujeto. Para evaluar la capacidad de los polipéptidos de HA mutantes para provocar dichos anticuerpos dirigidos al tronco, los sujetos (p. ej., ratones) pueden inmunizarse con los polipéptidos de HA mutantes descritos en el presente documento, o con virus (p. ej., virus
de la influenza) que expresan los polipéptidos de HA mutantes descritos en el presente documento y la capacidad de tales polipéptidos de HA mutantes o virus que expresan dichos polipéptidos de HA mutantes para provocar la producción de anticuerpos específicos del dominio de tallo/tronco puede evaluarse y compararse con la capacidad de la contraparte HA de tipo salvaje o virus de tipo salvaje para provocar la producción de anticuerpos específicos del dominio de tallo/tronco en el sujeto. Por ejemplo, para evaluar la capacidad de los polipéptidos de HA mutantes para provocar anticuerpos dirigidos al tronco, los ratones pueden inmunizarse con una cepa o subtipo del virus de la influenza de tipo salvaje, virus de la influenza que expresa mutantes de HA que tienen sitios de glicosilación añadidos al dominio de cabeza y virus de la influenza que expresan mutantes de HA con sitios de glicosilación eliminados del dominio de tronco y combinaciones de los mismos. Tales ratones se pueden cebar a continuación con ADN del virus de la influenza o inocular con proteína viral. Tres semanas más tarde, tales ratones pueden recibir un refuerzo de proteína viral. Tres semanas después de recibir el refuerzo de proteína viral, los ratones pueden ser sensibilizados con varias cepas del virus de la influenza y controlados para determinar la pérdida de peso y la supervivencia. Los títulos séricos de anticuerpos anti-cabeza y anti-tronco en ratones infectados pueden evaluarse mediante ELISA como se describe a continuación.
5.4.1 Sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo
En una realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionado en el presente documento comprende un dominio de tallo de HA que comprende al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las regiones antigénicas conservadas dentro del dominio de tallo del polipéptido de HA de la gripe están protegidas del sistema inmunitario de un sujeto (p. ej., una respuesta de anticuerpos) por glicanos que se anclan a estas regiones antigénicas. Por lo tanto, se cree que la inmunogenicidad de, y la accesibilidad a, las regiones antigénicas dentro del dominio de tallo se pueden aumentar modificando uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio de tallo de una manera que interrumpa la glicosilación (es decir, el anclaje de un glicano) en los sitios.
Los sitios de glicosilación modificados en los que un sitio de glicosilación de origen natural se modifica de una manera que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado se pueden preparar mediante cualquier mecanismo evidente para un experto en la técnica, incluidos los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, p. ej., los mecanismos de mutagénesis dirigida al sitio discutidos en el Ejemplo 5, más abajo.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de tallo de HA que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o veinte o más sitios de glicosilación modificados, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 sitios de glicosilación modificados. En otras realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende 1 -5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25 sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dos sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende tres sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cuatro sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cinco sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende seis sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende siete sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende ocho sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende nueve sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende diez sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende once sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende doce sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende trece sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende catorce sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende quince sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dieciséis sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende diecisiete sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dieciocho sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende diecinueve sitios de glicosilación modificados. En ciertas realizaciones, el dominio de tallo de HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende veinte o más sitios de glicosilación modificados.
Los sitios de glicosilación modificados incluyen, pero no se limitan a, sitios de glicosilación conectados a N y conectados a O. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado es un sitio de glicosilación conectado a N. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación modificado es un sitio de glicosilación conectado a O. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado es un sitio de glicosilación conectado a N modificado que tiene el motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro.
El sitio de glicosilación modificado puede comprender cualquier modificación que pueda alterar la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En realizaciones preferidas, la modificación no interfiere en el plegamiento adecuado del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y/o la capacidad del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una deleción de uno o más restos de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural.
En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro, y en donde la modificación interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. El sitio de glicosilación modificado puede comprender cualquier sustitución de aminoácido conocida por un experto en la técnica que pueda alterar la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En realizaciones preferidas, las una o más sustituciones de aminoácidos no interfieren en la capacidad del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe para plegarse adecuadamente o provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En ciertas realizaciones, los uno o más aminoácidos de un sitio de glicosilación de origen natural se sustituyen por un resto de aminoácido de Asn (N), Ser (S), Thr (T) o Asp (D). Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, la sustitución de un resto de aminoácido de Lys (K) por Asn (N); la sustitución de un resto de Asn (N) por Ser (S); y la sustitución de un resto de Thr (T) por Asp (D). En realizaciones específicas, el sitio de glicosilación modificado comprende una sustitución de un resto de Lys (K) de un sitio de glicosilación de origen natural por un resto de Asn (N). En otras realizaciones, el sitio de glicosilación modificado comprende una sustitución de un resto de Asn (N) de un sitio de glicosilación de origen natural por un resto de aminoácido de Ser (S). En otras realizaciones más, el sitio de glicosilación modificado comprende una sustitución de un resto de aminoácido de Asp (D) de un sitio de glicosilación de origen natural por un resto de aminoácido de Thr (T).
En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asp-Ser. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Arg-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asn-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Cys-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Glu-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gln-Ser. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gly-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-His-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ile-Ser. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Lys-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Leu-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Met-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Phe-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Pro-Ser. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ser-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Thr-Ser. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Trp-Ser. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Ser.
En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Val-Ser.
En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asp-Thr. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Arg-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asn-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Cys-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Glu-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gln-Thr. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gly-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-His-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ile-Thr. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Lys-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Leu-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Met-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Phe-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Pro-Thr. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ser-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Thr-Thr. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-T rp-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Thr. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Val-Thr.
En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asp-Cys. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Arg-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Asn-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Cys-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Glu-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gln-Cys. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Gly-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-His-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ile-Cys. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Lys-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Leu-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Met-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Phe-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Pro-Cys. En algunas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ser-Cys. En ciertas realizaciones, la
modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Thr-Cys. En otras realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Trp-Cys. En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Tyr-Cys.
En ciertas realizaciones, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Val-Cys.
Los sitios de glicosilación de origen natural conservados en el dominio de tallo de HA incluyen los que se muestran en la Fig. 20. Los sitios de N-glicosilación de origen natural ilustrativos en las hemaglutininas del grupo 1 (H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16) se pueden encontrar en, pero no se limitan a, las posiciones de aminoácidos 20 22 (falta en H9), 21 -23, 33-35 (falta en H8, H9, H12, H13, H16), 46-48 (falta en H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12), 289-291 (falta en H6, H11, H13, H16), 290-292 (falta en H1, H2, H5, H8, H9, H12), 296-298 (falta en H1, H2, H5, H11, H13, H16) y 481-483, en donde las posiciones de los aminoácidos están según la numeración de H3. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 20-22, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 21-23, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 33-35, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 46-48, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 289-291, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 290-292, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 296-298, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 481-483, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dos sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende tres sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21 -23, 33-35, 46-48, 289-291,290 -292, 296-298 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cuatro sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cinco sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21 -23, 33-35, 46-48, 289-291,290-292, 296-298 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende seis sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21 -23, 33-35, 46-48, 289-291,290-292, 296-298 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende siete sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21 -23, 33-35, 46-48, 289-291,290-292, 296-298 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En otras realizaciones más, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende sitios de glicosilación modificados en las posiciones de aminoácidos 20-22, 21-23, 33-35, 46 48, 289-291,290-292, 296-298 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada sitio de glicosilación modificado
comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado.
Los sitios de N-glicosilación conservados ilustrativos en las hemaglutininas del grupo 2 (H3, H4, H7, H10, H14, H15), se pueden encontrar en, pero no se limitan a, las posiciones de aminoácidos, 8-10, 22-24, 38-40 (falta en H4, H14), 46-48 (falta en H3, H4, H7, H10, H14) 285-287 (falta en H4, H7, H10, H14, H15), 296-298 (falta en H3, H7, H15), 410 412 (falta en H3, H4, H14) y 481-483, en donde las posiciones de los aminoácidos son según la numeración de H3. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 8-10, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 22-24, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 38-40, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 46-48, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 285-287, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 296-298, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 410-412, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación modificado en las posiciones de aminoácidos 481-483, según la numeración de H3, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dos sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende tres sitios de glicosilación modificados en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cuatro sitios de glicosilación modificados en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende cinco sitios de glicosilación modificados en las posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende seis sitios de glicosilación modificados en las posiciones de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en las posiciones de los aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende siete sitios de glicosilación modificados en posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 y 481 -483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende sitios de glicosilación modificados en las posiciones de aminoácidos 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285 287, 296-298, 410-412 y 481-483, según la numeración de H3, en donde cada uno de los sitios de glicosilación modificados comprende una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende uno, dos o más sitios de glicosilación modificados en los restos de aminoácidos 20-23, 33-35, 289-291 y 483-485, según la numeración de H3, en donde los sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en los sitios de glicosilación modificados. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende dos sitios de glicosilación modificados en los restos de aminoácidos 33-35 y 289-291, según la numeración de H3, en
donde los sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en los sitios de glicosilación modificados.
El polipéptido de hemaglutinina de la gripe que comprende un dominio de tallo de HA que comprende al menos un sitio de glicosilación modificado puede ser cualquier polipéptido de hemaglutinina de la gripe (HA) que comprende un dominio de tallo de HA descrito en el presente documento, incluidos, pero sin limitarse a, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, un polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza (es decir, un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza que comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza de HA del mismo subtipo o cepa), y un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En realizaciones específicas, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA, en donde el dominio de cabeza globular de HA es heterólogo con respecto al dominio de tallo de HA, y en donde el dominio de tallo de HA comprende al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En realizaciones específicas, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe es un polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En realizaciones específicas, el polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA, en donde el dominio de cabeza globular de HA es homólogo con respecto al dominio de tallo de HA (es decir, el dominio de cabeza globular y el dominio de tallo son del misma cepa o subtipo del virus de la influenza), y en donde el dominio de tallo de HA comprende al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En realizaciones específicas, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro. En ciertas realizaciones, el polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA del mismo subtipo de virus de la influenza. En realizaciones específicas, el subtipo del virus de la influenza es un subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17. En realizaciones específicas, el polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA de la misma cepa del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la cepa del virus de la influenza es AN/etherlands/602/2009.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe es un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza. Los ejemplos de polipéptidos del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza se divulgan en la Sección 5.2, más arriba.
En una realización específica, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende: (a) un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo corto C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con (b) un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende adicionalmente al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En una realización específica, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro. En otra realización, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende: (a) un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo largo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo largo C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con (b) un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende adicionalmente al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En otra realización, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro. En otra realización, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende: (a) un dominio de hemaglutinina HA1 de influenza que comprende un segmento de tallo N-terminal de HA1 conectado covalentemente a un conector de 1 a 50 restos heterólogos que a su vez está conectado covalentemente a un segmento de tallo C-terminal de HA1; dicho dominio
HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con (b) un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende adicionalmente al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En una realización específica, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro. En otra realización, el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende: (a) un dominio HA1 de hemaglutinina de influenza que comprende, conectados en el siguiente orden: un segmento de tallo N-terminal de HA1, un primer conector de 1 a 50 restos heterólogos, un segmento de tallo intermedio de HA1, un segundo conector de 1 a 50 restos heterólogos y un segmento de tallo C-terminal de HA1; dicho dominio HA1 en asociación terciaria o cuaternaria con (b) un dominio HA2 de hemaglutinina de influenza, en donde el polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina del virus de la influenza comprende adicionalmente al menos un sitio de glicosilación modificado, en donde el sitio de glicosilación modificado comprende una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. En una realización específica, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en un sitio de glicosilación de origen natural que tiene la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro.
5.4.2 Sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular
En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionado en el presente documento comprende un dominio de cabeza globular de HA que comprende al menos un sitio de glicosilación de origen no natural. Sin vincularse a ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que el enmascaramiento de las regiones antigénicas inmunodominantes del dominio de cabeza globular de HA mediante la adición de uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en estas regiones inmunodominantes también puede aumentar la inmunogenicidad a las regiones antigénicas subinmunodominantes conservadas en el dominio de tallo del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
Pueden añadirse sitios de glicosilación de origen no natural al dominio de cabeza globular HA del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento utilizando cualquier mecanismo conocido por un experto en la técnica, incluidas, p. ej., las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio descritas en Ejemplo 5, más abajo. En realizaciones preferidas/específicas, el sitio de glicosilación de origen no natural no interfiere en el plegamiento adecuado del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y/o interfiere en la capacidad del dominio de tallo del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe para provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de anticuerpos) en un sujeto.
En ciertas realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural se pueden añadir a un dominio de cabeza globular de HA basado en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza globular de HA se basa en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y H17. En ciertas realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural pueden añadirse a un dominio de cabeza globular de HA basado en el dominio de cabeza de una hemaglutinina de influenza B. En algunas realizaciones, el dominio de cabeza globular de HA se basa en el dominio de cabeza de B/Seal/Netherlands/1/99.
En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, en donde Xaa es cualquier aminoácido o, en ciertas realizaciones, en donde Xaa es cualquier aminoácido excepto Pro. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asp-Ser. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Arg-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asn-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Cys-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Glu-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gln-Ser. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gly-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-His-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ile-Ser. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Lys-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Leu-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Met-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Phe-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Pro-Ser. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ser-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Thr-Ser. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Trp-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Tyr-Ser. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Val-Ser.
En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asp-Thr. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Arg-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asn-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Cys-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Glu-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gln-Thr. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gly-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-His-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ile-Thr. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Lys-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Leu-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Met-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Phe-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Pro-Thr. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ser-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Thr-Thr. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Trp-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Tyr-Thr. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Val-Thr.
En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende la secuencia de aminoácidos Asn-Ala-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asp-Cys. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Arg-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Asn-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Cys-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Glu-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gln-Cys. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Gly-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-His-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ile-Cys. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Lys-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Leu-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Met-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Phe-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Pro-Cys. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Ser-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Thr-Cys. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Trp-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Tyr-Cys. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural comprende Asn-Val-Cys.
El polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede comprender un dominio de cabeza globular de HA con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte o más sitios de glicosilación de origen no natural. En algunas realizaciones, el polipéptido de HA de la gripe comprende de 2 a 5, de 4 a 6, de 5 a 10 o de 10 a 15 sitios de glicosilación de origen no natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con un sitio de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con dos sitios de glicosilación de origen no natural. En realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con tres sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con cuatro sitios de glicosilación de origen no natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con cinco sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con seis sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con siete sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con ocho sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con nueve sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con diez sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe tiene un dominio de cabeza globular de HA con once sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con doce sitios de glicosilación de origen no natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con trece sitios de glicosilación de origen no natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con catorce sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con quince sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con dieciséis sitios de glicosilación de origen no natural. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con diecisiete sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el
polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con dieciocho sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con diecinueve sitios de glicosilación de origen no natural. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un dominio de cabeza globular de HA con veinte o más sitios de glicosilación de origen no natural.
Los uno o más sitios de glicosilación de origen no natural pueden ubicarse en cualquier posición de aminoácido dentro de un dominio de cabeza globular donde no se encuentra un sitio de glicosilación de origen natural con respecto a un subtipo o cepa particular del virus de la influenza. En la Fig. 21B se muestran mutaciones ilustrativas que introducen sitios de glicosilación de origen no natural en un dominio de cabeza globular. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en las posiciones de aminoácidos 59-61, 128-130, 130-132, 158-160 y/o 163 165 según el sistema de numeración de H3. En ciertas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en las posiciones de aminoácidos 59-61, 81-83, 129-131, 143-145, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189, 193-195, 197-199 y/o 208-210 según el sistema de numeración de H3. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en las posiciones de aminoácidos 59-61, según la numeración de H3. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en la posición de aminoácido 129-131, según la numeración de H3. En otras realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 129-131 y 158-160, según la numeración de H3. En algunas realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 59-61, 129-131 y 165-167, según la numeración de H3. En algunas realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 59-61, 129-131, 158-160 y 165 167, según la numeración de H3. En algunas realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 81 -83, 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3. En otras realizaciones, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 81 83, 129-131, 158-160, 170-172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3. En otras realizaciones más, los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3.
En realizaciones preferidas, el sitio de glicosilación de origen no natural está ubicado en una región antigénica en el dominio de cabeza globular, evitando así que la región antigénica provoque una respuesta inmunitaria. Las regiones antigénicas ilustrativas en el dominio globular incluyen, pero no se limitan a, el sitio antigénico Sa, Sb, Ca y Cb, Fig. 21A en el subtipo H1 y las regiones antigénicas A, B, C, D en el subtipo H3. En algunas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en la región antigénica Sa de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en la región antigénica Sb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otras realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en la región antigénica Ca de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otras realizaciones más, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en la región antigénica Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sa y Sb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sa y Ca de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sa y Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sb y Ca de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sb y Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Ca y Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sa, Sb y Ca de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sb, Ca y Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas Sa, Sb, Ca y Cb de un dominio de cabeza globular del subtipo H1.
En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en la región antigénica A de un dominio de cabeza globular de subtipo H3. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en la región antigénica B de un dominio de cabeza globular de subtipo H3. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en la región antigénica C de un dominio de cabeza globular de subtipo H3. En algunas realizaciones, el sitio de glicosilación de origen no natural está en la región antigénica D de un dominio de cabeza globular de subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas A y B de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas A y C de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra
realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas A y D de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas B y C de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas B y D de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas C y D de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas A, B y C de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas B, C y D de un dominio de cabeza globular del subtipo H3. En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende un sitio de glicosilación de origen no natural ubicado en las regiones antigénicas A, B, C y D de un dominio de cabeza globular del subtipo H3.
En otras realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en una o más regiones antigénicas de un dominio de cabeza globular de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11., H12, H13, H14, H15, H16 o H17.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe que comprende un dominio de cabeza globular de HA con uno o más sitios de glicosilación de origen no natural es un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe que comprende un dominio de cabeza globular de HA con uno o más sitios de glicosilación de origen no natural es un polipéptido no quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza.
5.4.3 Sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular y sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo
En otra realización, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionado en el presente documento comprende un dominio de tallo de HA con uno, dos o más sitios de glicosilación modificados y una cabeza globular de HA con uno, dos o más sitios de glicosilación de origen no natural, en donde los sitios de glicosilación modificados comprenden una modificación de un sitio de glicosilación de origen natural que interrumpe la capacidad de un glicano para anclarse al sitio de glicosilación modificado. Los sitios de glicosilación modificados y los sitios de glicosilación de origen no natural se pueden producir utilizando mecanismos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento. En realizaciones específicas, los uno o más sitios de glicosilación modificados y los uno o más sitios de glicosilación de origen no natural no interfieren en el plegamiento adecuado del polipéptido de HA de la gripe y/o interfieren en la capacidad del polipéptido del dominio de tallo de HA de la gripe para provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., una respuesta de anticuerpos) en un sujeto. Véanse las Secciones 5.4.1 y 5.4.2, más arriba, para obtener una descripción de los sitios de glicosilación modificados y los sitios de glicosilación de origen no natural. Los sitios de glicosilación modificados y los sitios de glicosilación de origen no natural descritos en la Sección 5.4.1 y 5.4.2, más arriba, pueden incorporarse ambos a un polipéptido de HA de la gripe.
En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionado en el presente documento comprende un dominio de tallo de HA con sitios de glicosilación modificados en las posiciones 33-35 y 289-291 según la numeración de H3; y un dominio de cabeza globular de HA que comprende sitios de glicosilación de origen no natural en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de las siguientes posiciones: 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 y 208-210 según numeración de H3.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular y uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo, en donde dichos sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular y uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo, en donde dichos sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado, y en donde (i) los sitios de glicosilación de origen no natural están en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más de las posiciones de aminoácidos 81 -83, 129-131,158-160, 165-167, 170-172, 187-189 y 208 210, según la numeración de H3 y (ii) los sitios de glicosilación modificados están en una, dos, tres o más posiciones de aminoácidos 20-23, 33-35, 271-273, 289-291 y/o 483-485 según numeración de H3. En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular y que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo, en donde dichos sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado, y en donde (i) los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 81-83, 129-131, 158-160, 170-172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3 y (ii) los sitios de glicosilación modificados están en las posiciones de aminoácidos 33-35 y 289-291, según la numeración de H3. En otra realización específica, en el presente
documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo, en donde dichos sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado, y en donde (i) los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 81 -83, 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3 y (ii) los sitios de glicosilación modificados están en las posiciones de aminoácidos 33-35 y 289-291, según la numeración de H3. En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un polipéptido quimérico de hemaglutinina de influenza que comprende uno o más sitios de glicosilación de origen no natural en el dominio de cabeza globular que comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo, en donde dichos sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo comprenden una modificación que interrumpe la glicosilación en el sitio de glicosilación modificado, y en donde (i) los sitios de glicosilación de origen no natural están en las posiciones de aminoácidos 129-131, 158-160, 165-167, 170 172, 187-189 y 208-210, según la numeración de H3 y (ii) los sitios de glicosilación modificados están en las posiciones de aminoácidos 33-35 y 289-291, según la numeración de H3. En la Sección 6.11 (Ejemplo 11) se describen polipéptidos quiméricos de hemaglutinina de influenza ilustrativos que comprenden sitios de glicosilación modificados.
5.5 Ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe
En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento. Debido a la degeneración del código genético, se incluye en el presente documento cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos correspondientes a los ácidos nucleicos del virus de la influenza de origen natural que codifican un segmento de tallo N-terminal de HA1, un segmento de tallo C-terminal de HA1, un dominio HA2, un dominio luminal, un dominio transmembrana y/o un dominio citoplásmico se utilizan para producir un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza).
También se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos capaces de hibridar con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos capaces de hibridar con un fragmento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). En otras realizaciones, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos capaces de hibridar con la longitud completa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un quimérico polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza). Los parámetros generales para las condiciones de hibridación de ácidos nucleicos son descritos por Sambrook et al., en Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)), y por Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, Nueva York (1994)). La hibridación se puede realizar en condiciones de alta rigurosidad, condiciones de rigurosidad media o condiciones de baja rigurosidad. Los expertos en la técnica comprenderán que las condiciones de rigurosidad baja, media y alta dependen de múltiples factores, todos los cuales interactúan y también dependen de los ácidos nucleicos en cuestión. Por ejemplo, las condiciones de alta rigurosidad pueden incluir temperaturas dentro de los 5°C de temperatura de fusión del ácido o los ácidos nucleicos, una baja concentración de sal (p. ej., menos de 250 mM) y una alta concentración de codisolvente (p. ej., 1-20% de codisolvente, p. ej., DMSO). Las condiciones de baja rigurosidad, por otra parte, pueden incluir temperaturas superiores a 10°C por debajo de la temperatura de fusión del ácido o los ácidos nucleicos, una alta concentración de sal (p. ej., superior a 1000 mM) y la ausencia de codisolventes.
En algunas realizaciones, se aísla un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). En ciertas realizaciones, un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. En otras palabras, el ácido nucleico aislado puede comprender ácidos nucleicos heterólogos que no están asociados con él en la naturaleza. En otras realizaciones, un ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de ácido nucleico en las que el ácido nucleico se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, el ácido nucleico que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de otros ácidos nucleicos. El término "sustancialmente libre de medio de cultivo" incluye preparaciones de ácido nucleico en las que el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 50%, 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación. El término "sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos" incluye preparaciones en las que el ácido nucleico se separa de los precursores químicos u otros agentes químicos que están implicados en la síntesis del ácido nucleico. En realizaciones específicas, tales preparaciones del ácido nucleico tienen menos de aproximadamente 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del ácido nucleico de interés.
Además, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los componentes individuales de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza. En realizaciones específicas, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican un segmento de tallo N-terminal de HA1, un segmento de tallo C-terminal de HA1 y/o dominio HA2. Los ácidos nucleicos que codifican componentes de un polipéptido del dominio de tallo de hemaglutinina de influenza pueden ensamblarse utilizando mecanismos de biología molecular convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
5.6 Expresión del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe
En el presente documento se proporcionan vectores, incluidos los vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En una realización específica, el vector es un vector de expresión que es capaz de dirigir la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un quimérico polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza). Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y baculovirus de replicación defectuosa. Los vectores de expresión también pueden incluir, sin limitación, animales transgénicos y células/organismos no mamíferos, p. ej., células/organismos de mamíferos que han sido modificados genéticamente para realizar la glicosilación ligada a N de mamíferos.
En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan vectores de expresión que codifican componentes de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. (p. ej., el dominio de tallo y el dominio de cabeza, o porciones de cualquiera de los dominios). Tales vectores se pueden utilizar para expresar los componentes en una o más células anfitrionas y los componentes pueden aislarse y conjugarse junto con un conector utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica.
Un vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona. En una realización específica, un vector de expresión incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células anfitrionas que se vayan a utilizar para la expresión, que está conectado operablemente al ácido nucleico que se vaya a expresar. Dentro de un vector de expresión, se pretende que "conectado operablemente" signifique que un ácido nucleico de interés está conectado a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión del ácido nucleico (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula anfitriona cuando el vector se introduce en la célula anfitriona). Las secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de un ácido nucleico en muchos tipos de células anfitrionas, aquellas que dirigen la expresión del ácido nucleico solo en ciertas células anfitrionas (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido), y aquellas que dirigen la expresión del ácido nucleico tras la estimulación con un agente particular (p. ej., secuencias reguladoras inducibles). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se vaya a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Se pretende que el término "célula anfitriona" incluya una célula sujeto particular transformada o transfectada con un ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de tal célula. La progenie de tal célula puede no ser idéntica a la célula parental transformada o transfectada con el ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas o la integración del ácido nucleico en el genoma de la célula anfitriona.
Los vectores de expresión se pueden diseñar para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento utilizando células procarióticas (p. ej., E. coli) o células eucarióticas (p. ej., células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus, véase, p. ej., Treanor et al., 2007, JAMA, 297(14):1577-1582 incorporada como referencia en el presente documento en su totalidad), células de levadura, células vegetales, algas o células de mamífero). Los ejemplos de células anfitrionas de levadura incluyen, pero sin limitarse a, S. pombe y S. cerevisiae y ejemplos, más abajo. Los ejemplos de células anfitrionas de mamífero incluyen, pero sin limitarse a, células Crucell Per.C6, células Vero, células CHO, células VERY, células BHK, células HeLa, células COS, células MDCK, células 293, células 3T3 o células WI38. En ciertas realizaciones, las células anfitrionas son células de mieloma, p. ej., Células NS0, células 45.6 TG1.7, células 9B5 clon AF-2 , células 9B5 clon AF-2 , células J558L, células MOPC 315, células MPC-11, células NCI-H929, células NP, células NS0/1, células P3 NS1 Ag4, células P3/NS1/1-Ag4-1, células P3U1, células P3X63Ag8, células P3X63Ag8.653, células P3X63Ag8U.1, células RPMI 8226, células Sp20-Ag14, células U266B1, células X63AG8.653, células Y3.Ag.1.2.3 y células YO. Los ejemplos no limitantes de células de insecto incluyen S.f.9, S.f.21, Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda y Bombyx mori. En una realización particular, se utiliza un sistema de cultivo de células de mamífero (p. ej., células de ovario de hámster chino o de riñón de cría de hámster) para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En otra realización, se utiliza un sistema de cultivo de células vegetales para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 7.504.560; 6.770.799; 6.551.820; 6.136.320; 6.034.298; 5.914.935; 5.612.487 y 5.484.719, y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos Núm. 2009/0208477, 2009/0082548, 2009/0053762, 2008/0038232, 2007/0275014 y 2006/0204487 para células vegetales y métodos para la producción de proteínas utilizando sistemas de cultivo de células vegetales. En realizaciones específicas, los sistemas de cultivo de células vegetales no se utilizan para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Las células anfitrionas que comprenden los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de hemaglutinina
(HA) de la gripe (p. ej., polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza quiméricos) descritos en el presente documento pueden aislarse, es decir, las células están fuera del cuerpo de un sujeto. En ciertas realizaciones, las células se modifican genéticamente para expresar ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento.
Un vector de expresión se puede introducir en las células anfitrionas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección y electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York y otros manuales de laboratorio. En ciertas realizaciones, una célula anfitriona se transfecta transitoriamente con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En otras realizaciones, una célula anfitriona se transfecta de manera estable con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, según el vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable (p. ej., para la resistencia a los antibióticos) en las células anfitrionas junto con el ácido nucleico de interés. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (p. ej., las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
Como alternativa a la expresión recombinante de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizando una célula anfitriona, se puede transcribir y traducir un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe in vitro utilizando, p. ej., secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. En una realización específica, se pueden utilizar un sistema acoplado de transcripción/traducción, tal como Promega TNT®, o un producto lisado celular o extracto celular que comprenda los componentes necesarios para la transcripción y traducción para producir un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
Una vez que se ha producido un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, se puede aislar o purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para el aislamiento o la purificación de una proteína, p. ej., mediante cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, en particular mediante afinidad por el antígeno específico, mediante Proteína A, y cromatografía en columna por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para el aislamiento o purificación de proteínas. En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede conjugarse con proteínas heterólogas, p. ej., un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) con o sin proteínas de choque térmico (p. ej., Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, o Hsp100). En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede conjugarse con moléculas inmunomoduladoras, tales como proteínas que dirigirían el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a células inmunitarias tales como las células B (p. ej., C3d) o las células T. En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede conjugarse con proteínas que estimulan el sistema inmunitario innato, tales como interferón tipo 1, interferón alfa, beta o gamma, factores estimulantes de colonias, tales como factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF)-p, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de c D40 (CD40L) y CD40 inducible por fármacos (iCD40).
Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para producir un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza). En una realización, el método comprende cultivar una célula anfitriona que contiene un ácido nucleico que codifica el polipéptido en un medio adecuado de manera que se produzca el polipéptido. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente aislar el polipéptido del medio o de la célula anfitriona.
5.7 Vectores del virus de la influenza
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan virus de la influenza que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se incorpora a los viriones del virus de la influenza. Los virus de la influenza pueden conjugarse con radicales que dirigen los virus a tipos de células particulares, tales como las células inmunitarias. En algunas realizaciones, los viriones del virus de la influenza se han incorporado a ellos o expresan un polipéptido heterólogo además de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que tenga actividad inmunopotenciadora o que dirija el virus de la influenza a un tipo de célula particular, tal como un anticuerpo que se une a un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se une a un receptor específico en un tipo celular específico.
Los virus de la influenza que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se pueden producir suministrando en trans el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe durante la producción de viriones utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, tales como genética inversa y rescate de plásmidos sin agentes auxiliares. Alternativamente, la replicación de un virus de influenza parental que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en células susceptibles a la infección con el virus en donde se proporciona la función de hemaglutinina en trans producirá virus de influenza progenie que contienen el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan virus de la influenza que comprenden un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En una realización específica, el genoma de un virus de la influenza parental se modifica genéticamente para codificar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, que es expresado por virus de la influenza progenie. En otra realización específica, el genoma de un virus de la influenza parental se modifica genéticamente para codificar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, que se expresa e incorpora a los viriones del virus de la influenza progenie. Por lo tanto, el virus de la influenza progenie resultante de la replicación del virus de la influenza parental contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Los viriones del virus de la influenza parental pueden tener incorporado un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe que contiene un dominio de tallo o cabeza del mismo tipo, subtipo o cepa del virus de la influenza o de uno diferente. Alternativamente, los viriones del virus de la influenza parental pueden tener incorporado un radical que es capaz de reemplazar funcionalmente una o más de las actividades del polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza (p. ej., la unión al receptor y/o las actividades fusogénicas de la hemaglutinina del virus de la influenza). En ciertas realizaciones, una o más de las actividades del polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza es proporcionada por una proteína de fusión que comprende (i) un ectodominio de un polipéptido heterólogo con respecto al virus de la influenza fusionado con (ii) un dominio transmembrana, o un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, los viriones del virus de la influenza parental pueden tener incorporada una proteína de fusión que comprende (i) un ectodominio de un polipéptido de unión al receptor/fusogénico de un agente infeccioso distinto del virus de la influenza fusionado con (ii) un dominio transmembrana, o un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de una hemaglutinina del virus de la influenza. Para obtener una descripción de las proteínas de fusión que proporcionan una o más actividades de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza y métodos para la producción de virus de la influenza modificados genéticamente para expresar tales proteínas de fusión, véanse, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2007/064802, publicada el 7 de junio de 2007 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 11/633,130, presentada el 1 de diciembre de 2006; cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento comprenden una neuraminidasa (NA), o un fragmento de la misma, que es de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la influenza) que aquella de la que deriva la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza descritos en el presente documento comprenden una neuraminidasa (NA), o un fragmento de la misma, que es de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la influenza) que aquella de la que deriva la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde la cabeza globular es heteróloga con respecto al dominio de tallo de las subunidades HA1 y/o HA2 del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza.
En algunas realizaciones, los viriones del virus de la influenza parental tienen incorporado un polipéptido heterólogo. En ciertas realizaciones, el genoma de un virus de la influenza parental se modifica genéticamente para codificar un polipéptido heterólogo y un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, que son expresados por virus de la influenza progenie. En realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, el polipéptido heterólogo o ambos se incorporan a viriones del virus de la influenza progenie.
El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que dirija el virus de la influenza a un tipo de célula particular, tal como un anticuerpo que reconozca un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se una a un receptor específico en un tipo de célula específico. En algunas realizaciones, el polipéptido de direccionamiento reemplaza la función de reconocimiento de células diana del virus. En una realización específica, el polipéptido heterólogo dirige el virus de la influenza a los mismos tipos de células que el virus de la influenza infecta en la naturaleza. En otras realizaciones específicas, el polipéptido heterólogo dirige el virus de la influenza progenie a células inmunitarias, tales como células B, células T, macrófagos o células dendríticas. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo reconoce y se une a marcadores específicos de células de células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas (p. ej., tales como CD44). En una realización, el polipéptido heterólogo es DC-SIGN que dirige el virus a las células dendríticas. En otra realización, el polipéptido heterólogo es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de hebra sencilla) que dirige el virus a una célula inmunitaria, que puede fusionarse con un dominio transmembrana de otro polipéptido para que se incorpore al virión del virus de la influenza. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo CD20, un anticuerpo CD34 o un anticuerpo contra DEC-205. Los mecanismos para modificar genéticamente virus para expresar polipéptidos con funciones de direccionamiento son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Yang et al., 2006, PNAS 103: 11479-11484 y Publicación de Solicitud de Patente de estados Unidos Núm. 20080019998, publicada el 24 de enero de 2008, y Núm. 20070020238, publicada el 25 de enero de 2007, cuyo
contenido se incorpora al presente documento en su totalidad.
En otra realización, el polipéptido heterólogo es una proteína de anclaje viral. Los ejemplos no limitantes de virus cuyas proteínas de anclaje se pueden utilizar en este aspecto son virus seleccionados del grupo de: virus de la fiebre Lassa, virus de la Hepatitis B, virus de la Rabia, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un retrovirus tal como el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus vaccinia, herpesvirus, poliovirus, alfavirus como el virus del Bosque de Semliki, el virus del Río Ross y el virus Aura (que comprenden glicoproteínas de superficie como E1, E2 y E3), virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaan, foamyvirus y virus SARS-CoV.
En una realización, puede utilizarse una glicoproteína de superficie de flavivirus, tal como la proteína E del virus del Dengue (DV). En algunas realizaciones, se utiliza una glicoproteína del virus Sindbis de la familia de los alfavirus (K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol. 66, 4992 (1992)). En ciertas realizaciones, el polipéptido heterólogo se obtiene de una proteína HN o F de NDV; gp160 de un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (o un producto del mismo, tal como gp41 o gp120); un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg); una glicoproteína de herpesvirus (p. ej., gD, gE); o VP1 de poliovirus.
En otra realización, el polipéptido heterólogo se obtiene de cualquier sistema de direccionamiento no viral conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, se utiliza una proteína de un patógeno no viral tal como una bacteria intracelular o un protozoo. En algunas realizaciones, el polipéptido bacteriano es proporcionado por, p. ej., Chlamydia, Rikettsia, Coxelia, Listeria, Brucella o Legionella. En algunas realizaciones, el polipéptido protozoario es proporcionado por, p. ej., especies de plasmodios, Leishmania spp., Toxoplasma gondii, o Trypanosoma cruzi. Otros sistemas de direccionamiento ilustrativos son descritos por Waehler et al., 2007, en "Engineering targeted viral vectors for gene therapy," Nature Reviews Genetics 8: 573-587, que se incorpora al presente documento en su totalidad.
En ciertas realizaciones, el polipéptido heterólogo expresado por un virus de la influenza tiene actividad inmunopotenciadora (inmunoestimuladora). Los ejemplos no limitantes de polipéptidos inmunopotenciadores incluyen, pero sin limitarse a, moléculas de estimulación, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes tales como ligandos de Flt-3. Los ejemplos específicos de polipéptidos con actividad inmunopotenciadora incluyen: interferón tipo 1, interferón alfa, beta o gamma, factores estimulantes de colonias tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (g M-CSF), interleucina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF)-p, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L) y CD40 inducible por fármacos (iCD40) (véase, p. ej., Hanks, B. A., et al. 2005. Nat Med 11:130-137, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad).
Dado que el genoma de los virus de la influenza A y B consiste en ocho (8) segmentos de hebra sencilla de sentido negativo (los virus de la influenza C consisten en siete (7) segmentos de hebra sencilla de sentido negativo), el genoma de un virus de influenza parental puede ser modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (y cualquier otro polipéptido, tal como un polipéptido heterólogo) utilizando un segmento recombinante y mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, tale scomo la genética inversa y el rescate de plásmidos sin agentes auxiliares. En una realización, el segmento recombinante comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, así como las señales de incorporación 3' y 5' que se requieren para la replicación, transcripción y empaquetamiento adecuados de los ARNv (Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng, et al., 1996, Virology 217:242-251, ambas incorporadas al presente documento como referencia en su totalidad). En una realización específica, el segmento recombinante utiliza las secuencias 3' y 5' no codificantes y/o no traducidas de segmentos de virus de la influenza que son de un tipo, subtipo o cepa diferentes o iguales que el virus de la influenza parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante comprende la región 3' no codificante de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza, las regiones no traducidas de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza y la región 5' no codificante de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza. En realizaciones específicas, el segmento recombinante comprende las secuencias 3' y 5' no codificantes y/o no traducidas del segmento HA de un virus de la influenza que es del mismo tipo, subtipo o cepa que el tipo, subtipo o cepa del virus de la influenza que el segmento de tallo N-terminal de HA1, el segmento de tallo C-terminal de HA1, el dominio de cabeza globular y/o la HA2 de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En ciertas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede reemplazar el segmento HA de un virus de la influenza parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede reemplazar el gen NS1 del virus de la influenza parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe puede reemplazar el gen NA del virus de la influenza parental. Las cepas del virus de la influenza ilustrativas que se pueden utilizar para expresar los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la influenza incluyen Ann Arbor/1/50, AA/nn Arbor/6/60, AP/uerto Rico/8/34, AS/outh Dakota/6/2007, AU/ruguay/716/2007, A/California/07/2009, A/Perth/16/2009, A/Brisbane/59/2007, A/Brisbane/10/2007 y B/Brisbane/60/2008.
En algunas realizaciones, un segmento del gen de la hemaglutinina de la gripe codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En realizaciones específicas, el segmento del gen de la hemaglutinina (HA) de la gripe y al menos otro segmento del gen del virus de la influenza comprenden señales de empaquetamiento que permiten que el segmento del gen de la hemaglutinina (HA) de la gripe y el al menos otro segmento del gen se segreguen juntos durante la replicación de un virus de la influenza recombinante (véanse, Gao & Palese 2009, PNAS 106:15891 -15896;
y Publicación de Solicitud Internacional Núm. WO11/014645).
En algunas realizaciones, el genoma de un virus de la influenza parental puede modificarse genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizando un segmento recombinante que es bicistrónico. Las técnicas bicistrónicas permiten la modificación genética de secuencias codificantes de múltiples proteínas en un solo ARNm mediante el uso de secuencias del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Las secuencias IRES dirigen el reclutamiento interno de los ribosomas a la molécula de ARN y permiten la traducción aguas abajo de manera independiente de la caperuza. Brevemente, una región codificante de una proteína se inserta en el marco de lectura abierto (ORF) de una segunda proteína. La inserción está flanqueada por un IRES y cualquier secuencia señal no traducida necesaria para una expresión y/o función adecuadas. La inserción no debe interrumpir el ORF, la poliadenilación o los promotores transcripcionales de la segunda proteína (véanse, p. ej., García-Sastre et al., 1994, J. Virol. 68:6254-6261 y García-Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246, cada una de los cuales se incorpora al presente como referencia en su totalidad). Véanse también, p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.887.699, Patente de Estados Unidos Núm. 6.001.634, Patente de Estados Unidos Núm. 5.854.037 y Patente de Estados Unidos Núm. 5.820.871, cada una de los cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Cualquier IRES conocido en la técnica o descrito en el presente documento puede utilizarse según la divulgación (p. ej., el IRES del gen BiP, nucleótidos 372 a 592 de la entrada de la base de datos GenBank HUMGRP78; o el Ir Es del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), nucleótidos 1430-2115 de la entrada de la base de datos GenBank CQ867238.). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un virus de la influenza parental se modifica genéticamente para que contenga un segmento de ARN bicistrónico que expresa el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y otro polipéptido, tal como un gen expresado por el virus de la influenza parental. En algunas realizaciones, el gen del virus de la influenza parental es el gen HA. En algunas realizaciones, el gen del virus de la influenza parental es el gen NA. En algunas realizaciones, el gen del virus de la influenza parental es el gen NS1.
Se pueden utilizar mecanismos conocidos por un experto en la materia para producir un virus de la influenza que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y un virus de la influenza que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Por ejemplo, se pueden utilizar mecanismos de genética inversa para generar tal virus de la influenza. Brevemente, los mecanismos de genética inversa implican generalmente la preparación de ARN virales recombinantes sintéticos que contienen las regiones no codificantes del ARN viral de hebra negativa que son esenciales para el reconocimiento por las polimerasas virales y para empaquetar las señales necesarias para generar un virión maduro. Los ARN recombinantes se sintetizan a partir de un molde de ADN recombinante y se reconstituyen in vitro con complejo de polimerasa viral purificada para formar ribonucleoproteínas (RNP) recombinantes que se pueden utilizar para transfectar células. Se logra una transfección más eficaz si las proteínas de la polimerasa viral están presentes durante la transcripción de los ARN sintéticos in vitro o in vivo. Las RNP recombinantes sintéticas se pueden rescatar en partículas de virus infecciosas. Las técnicas anteriores se describen en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.166.057 presentada el 24 de noviembre de 1992; en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.854.037 presentada el 29 de diciembre de 1998; en la Publicación de Patente Europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero de 1996; en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Núm. de Serie 09/152.845; en las Publicaciones de Patente Internacional PCT WO 97/12032 publicada el 3 de abril de 1997; documento WO 96/34625 publicado el 7 de noviembre de 1996; en la Publicación de Patente Europea EP A780475; el documento WO 99/02657 publicado el 21 de Enero de 1999; el documento WO 98/53078 publicado el 26 de noviembre de 1998; el documento WO 98/02530 publicado el 22 de enero de 1998; el documento WO 99/15672 publicado el 1 de abril de 1999; el documento WO 98/13501 publicado el 2 de abril de 1998; el documento WO 97/06270 publicado el 20 de febrero 1997; y el documento EPO 780475A1 publicado el 25 de junio de 1997, cada uno de los cuales se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad.
Alternativamente, la tecnología de plásmidos sin agentes auxiliares se puede utilizar para producir un virus de la influenza que contenga un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y un virus de la influenza que comprenda un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Brevemente, los ADNc completos de segmentos virales se amplifican mediante PCR con cebadores que incluyen sitios de restricción únicos, que permiten la inserción del producto de PCR en el vector plasmídico (Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123; Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873; ambas incorporadas al presente documento como referencia en su totalidad). El vector plasmídico está diseñado para que se exprese un transcrito negativo exacto (ARNv efector). Por ejemplo, el vector plasmídico se puede diseñar para colocar el producto de PCR entre un promotor de ARN polimerasa I humano truncado y una secuencia de ribozima del virus de la hepatitis delta de manera que se produzca un transcrito negativo exacto (ARNv efector) a partir del promotor de polimerasa I. Los vectores plasmídicos separados que comprenden cada segmento viral, así como los vectores de expresión que comprenden las proteínas virales necesarias pueden transfectarse a células que conducen a la producción de partículas virales recombinantes. En otro ejemplo, se pueden utilizar vectores plasmídicos a partir de los cuales se expresan tanto el ARN genómico viral como el ARNm que codifica las proteínas virales necesarias. Para obtener una descripción detallada de la tecnología de plásmidos sin agentes auxiliares, véanse, p. ej., la Publicación Internacional Núm. WO 01/04333; las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.951.754, 7.384.774, 6.649.372, y 7.312.064; Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Quinlivan et al., 2005, J. Virol. 79:8431-8439; Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113; y Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350, que se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad.
Los virus de influenza descritos en el presente documento pueden propagarse en cualquier sustrato que permita que el virus crezca hasta títulos que permitan su uso según uno los métodos descritos en el presente documento. En una realización, el sustrato permite que los virus crezcan hasta títulos comparables a los determinados para los virus de tipo salvaje correspondientes. En ciertas realizaciones, el sustrato es uno que es biológicamente relevante para el virus de la influenza o para el virus del que se obtiene la función de HA. En una realización específica, un virus de influenza atenuado en virtud de, p. ej., una mutación en el gen NS1, puede propagarse en un sustrato con deficiencia de IFN. Por ejemplo, un sustrato con deficiencia de IFN adecuado puede ser uno que tenga una capacidad defectuosa para producir o responder al interferón, o uno en el que un sustrato con deficiencia de IFN se pueda utilizar para el crecimiento de cualquier número de virus que puedan requerir un entorno de crecimiento con deficiencia de interferón. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.573.079, presentada el 3 de junio de 2003, 6.852.522, presentada el 8 de febrero de 2005, y 7.494.808, presentada el 24 de febrero de 2009, cuyo contenido completo se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. En una realización específica, el virus se propaga en huevos embrionados (p. ej., huevos de pollo). En una realización específica, el virus se propaga en huevos embrionados (p. ej., huevos de gallina) de 8 días, 9 días, 8-10 días, 10 días, 11 días, 10-12 días o 12 días. En ciertas realizaciones, el virus se propaga en células MDCK, células Vero, células 293T u otras líneas celulares conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, el virus se propaga en células derivadas de huevos embrionados.
Los virus de la influenza descritos en el presente documento pueden aislarse y purificarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. En una realización, el virus se extrae del cultivo celular y se separa de los componentes celulares, típicamente mediante procedimientos de clarificación bien conocidos, p. ej., tales como centrifugación en gradiente y cromatografía en columna, y puede purificarse adicionalmente según se desee utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., ensayos de placa.
En ciertas realizaciones, los virus de la influenza o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un virus de la influenza A. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un solo subtipo o cepa del virus de la influenza A. En otras realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de dos o más subtipos o cepas del virus de la influenza A. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento comprenden un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento y una neuraminidasa (NA), o un fragmento de la misma, en donde la NA proviene de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la influenza) que aquella de la que deriva la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza modificados genéticamente para expresar uno o más de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenzas descritos en el presente documento comprenden una neuraminidasa (NA), o un fragmento de la misma, que es de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la influenza) que aquella de la que deriva la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, en donde la cabeza globular es heteróloga con respecto al dominio de tallo de las subunidades HA1 y/o HA2 del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza.
En algunas realizaciones, los virus de la influenza o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un virus de la influenza B. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un solo subtipo o cepa del virus de la influenza B. En otras realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de dos o más subtipos o cepas del virus de la influenza B. En otras realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de una combinación de subtipos o cepas del virus de la influenza A y de la influenza B.
En algunas realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un virus de la influenza C. En ciertas realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de un solo subtipo o cepa del virus de la influenza C. En otras realizaciones, los virus de la influenza, o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la influenza para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de dos o más subtipos o cepas del virus de la influenza C. En otras realizaciones, los virus de influenza, o polipéptidos del virus de la influenza, genes o segmentos de genoma para su uso como se describe en el presente documento se obtienen o derivan de una combinación de subtipos o cepas del virus de la influenza C y virus de influenza A y/o virus de influenza B.
Los ejemplos no limitantes de los virus de la influenza A incluyen subtipo H10N4, subtipo H10N5, subtipo H10N7, subtipo H10N8, subtipo H10N9, subtipo H11N1, subtipo H11N13, subtipo H11N2, subtipo H11N4, subtipo H11N6, subtipo H11N8, subtipo H11N9, subtipo H12N1, subtipo H12N4, subtipo H12N5, subtipo H12N8, subtipo H13N2, subtipo H13N3, subtipo H13N6, subtipo H13N7, subtipo H14N5, subtipo H14N6, subtipo H15N8, subtipo H15N9,
subtipo H16N3, subtipo H1N1, subtipo H1N2, subtipo H1N3, subtipo H1N6, subtipo H1N9, subtipo H2N1, subtipo H2N2, subtipo H2N3, subtipo H2N5, subtipo H2N7, subtipo H2N8, subtipo H2N9, subtipo H3N1, subtipo H3N2, subtipo H3N3, subtipo H3N4, subtipo H3N5, subtipo H3N6, subtipo H3N8, subtipo H3N9, subtipo H4N1, subtipo H4N2, subtipo H4N3, subtipo H4N4, subtipo H4N5, subtipo H4N6, subtipo H4N8, subtipo H4N9, subtipo H5N1, subtipo H5N2, subtipo H5N3, subtipo H5N4, subtipo H5N6, subtipo H5N7, subtipo H5N8, subtipo H5N9, subtipo H6N1, subtipo H6N2, subtipo H6N3, subtipo H6N4, subtipo H6N5, subtipo H6N6, subtipo H6N7, subtipo H6N8, subtipo H6N9, subtipo H7N1, subtipo H7N2, subtipo H7N3, subtipo H7N4, subtipo H7N5, subtipo H7N7, subtipo H7N8, subtipo H7N9, subtipo H8N4, subtipo H8N5, subtipo H9N1, subtipo H9N2, subtipo H9N3, subtipo H9N5, subtipo H9N6, subtipo H9N7, subtipo H9N8, y subtipo H9N9.
Los ejemplos específicos de cepas del virus de la influenza A incluyen, pero no se limitan a: A/Victoria/361/2011 (H3N2); A/Califomia/4/2009 (H1N1); A/California/7/2009 (H1N1); AP/erth/16/2009 (H3N2); A/Brisbane/59/2007 (H1N1); A/Brisbane/10/2007 ((H3N2); A/sw/Iowa/15/30 (H1N1); AW/ SN/33 (H1N1); Ae/q/Prague/1/56 (H7N7); AP/R/8/34; Am/allard/Potsdam/178-4/83 (H2N2); Ah/erring gull/DE/712/88 (H16N3); A/sw/Hong Kong/168/1993 (H1N1); Am/allard/Alberta/211/98 (H1N1); A/shorebird/Delaware/168/06 (H16N3); A/sw/Netherlands/25/80 (H1N1); A/sw/Germany/2/81 (H1N1); A/sw/Hannover/1/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/1/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/15/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/268/81 (H1N1); A/sw/Finistere/2899/82 (H1N1); A/sw/Potsdam/35/82 (H3N2); A/sw/Cote d'Armor/3633/84 (H3N2); A/sw/Gent/1/84 (H3N2); A/sw/Netherlands/12/85 (H1N1); A/sw/Karrenzien/2/87 (H3N2); A/sw/Schwerin/103/89 (H1N1); A/turkey/Germany/3/91 (H1N1); A/sw/Germany/8533/91 (H1N1); A/sw/Belgium/220/92 (H3N2); A/sw/Gent/V230/92 (H1N1); A/sw/Leipzig/145/92 (H3N2); A/sw/Re220/92hp (H3N2); A/sw/Bakum/909/93 (H3N2); A/sw/Schleswig-Holstein/1/93 (H1N1); A/sw/Scotland/419440/94 (H1N2); A/sw/Bakum/5/95 (H1N1); A/sw/Best/5C/96 (H1N1); A/sw/England/17394/96 (H1N2); A/sw/Jena/5/96 (H3N2); A/sw/Oedenrode/7C/96 (H3N2); A/sw/Lohne/1/97 (H3N2); A/sw/Cote d'Armor/790/97 (H1N2); A/swBakum/1362/98 (H3N2); A/sw/Italy/1521/98 (H1N2); A/sw/Italy/1553-2/98 (H3N2); A/sw/Italy/1566/98 (H1N1); A/sw/Italy/1589/98 (H1N1); A/sw/Bakum/8602/99 (H3N2); A/sw/Cotes d'Armor/604/99 (H1N2); A/sw/Cote d'Armor/1482/99 (H1N1); A/sw/Gent/7625/99 (H1N2); AH/ong Kong/1774/99 (H3N2); A/sw/Hong Kong/5190/99 (H3N2); A/sw/Hong Kong/5200/99 (H3N2); A/sw/Hong Kong/5212/99 (H3N2); A/sw/Ille et Villaine/1455/99 (H1N1); A/sw/Italy/1654-1/99 (H1N2); A/sw/Italy/2034/99 (H1N1); A/sw/Italy/2064/99 (H1N2); A/sw/Berlin/1578/00 (H3N2); A/sw/Bakum/1832/00 (H1N2); A/sw/Bakum/1833/00 (H1N2); A/sw/Cote d'Armor/800/00 (H1N2); A/sw/Hong Kong/7982/00 (H3N2); A/sw/Italy/1081/00 (H1N2); A/sw/Belzig/2/01 (H1N1); A/sw/Belzig/54/01 (H3N2); A/sw/Hong Kong/9296/01 (H3N2); A/sw/Hong Kong/9745/01 (H3N2); A/sw/Spain/33601/01 (H3N2); A/sw/Hong Kong/1144/02 (H3N2); A/sw/Hong Kong/1197/02 (H3N2); A/sw/Spain/39139/02 (H3N2); A/sw/Spain/42386/02 (H3N2); AS/witzerland/8808/2002 (H1N1); A/sw/Bakum/1769/03 (H3N2); A/sw/Bissendorf/IDT 1864/03 (H3N2); A/sw/Ehren/IDT2570/03 (H1N2); A/sw/Gescher/IDT2702/03 (H1N2); A/sw/Haselünne/2617/03hp (H1N1); A/sw/Loningen/IDT2530/03 (H1N2); A/sw/IVD/IDT2674/03 (H1N2); A/sw/Nordkirchen/IDT1993/03 (H3N2); A/sw/Nordwalde/IDT2197/03 (H1N2); A/sw/Norden/IDT2308/03 (H1N2); A/sw/Spain/50047/03 (H1N1); A/sw/Spain/51915/03 (H1N1); A/sw/Vechta/2623/03 (H1N1); A/sw/Visbek/IDT2869/03 (H1N2); A/sw/Waltersdorf/IDT2527/03 (H1N2); A/sw/Damme/IDT2890/04 (H3N2); A/sw/Geldern/IDT2888/04 (H1N1); A/sw/Granstedt/IDT3475/04 (H1N2); A/sw/Greven/IDT2889/04 (H1N1); A/sw/Gudensberg/IDT2930/04 (H1N2); A/sw/Gudensberg/IDT2931/04 (H1N2); A/sw/Lohne/IDT3357/04 (H3N2); A/sw/Nortrup/IDT3685/04 (H1N2); A/sw/Seesen/IDT3055/04 (H3N2); A/sw/Spain/53207/04 (H1N1); A/sw/Spain/54008/04 (H3N2); A/sw/Stolzenau/IDT3296/04 (H1N2); A/sw/Wedel/IDT2965/04 (H1N1); A/sw/Bad Griesbach/IDT4191/05 (H3N2); A/sw/Cloppenburg/IDT4777/05 (H1N2); A/sw/Dotlingen/IDT3780/05 (H1N2); A/sw/Dotlingen/IDT4735/05 (H1N2); A/sw/Egglham/IDT5250/05 (H3N2); A/sw/Harkenblek/IDT4097/05 (H3N2); A/sw/Hertzen/IDT4317/05 (H3N2); A/sw/Krogel/IDT4192/05 (H1N1); A/sw/Laer/IDT3893/05 (H1N1); A/sw/Laer/IDT4126/05 (H3N2); A/sw/Merzen/IDT4114/05 (H3N2); A/sw/Muesleringen-S./IDT4263/05 (H3N2); A/sw/Osterhofen/IDT4004/05 (H3N2); A/sw/Sprenge/IDT3805/05 (H1N2); A/sw/Stadtlohn/IDT3853/05 (H1N2); A/sw/Voglarn/IDT4096/OS (H1N1); A/sw/Wohlerst/IDT4093/05 (H1N1); A/sw/Bad Griesbach/IDT5604/06 (H1N1); A/sw/Herzlake/IDT5335/06 (H3N2); A/sw/Herzlake/IDT5336/06 (H3N2); A/sw/Herzlake/IDT5337/06 (H3N2); y A/wild boar/Germany/R169/2006 (H3N2).
Otros ejemplos específicos de cepas del virus de la influenza A incluyen, pero no se limitan a: A/Toronto/3141/2009 (H1N1); A/Regensburg/D6/2009 (H1N1); A/Bayern/62/2009 (H1N1); A/Bayern/62/2009 (H1N1); A/Bradenburg/19/2009 (H1N1); A/Bradenburg/20/2009 (H1N1); A/Distrito Federal/2611/2009 (H1N1); A/Mato Grosso/2329/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/1454/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/2233/2009 (H1N1); A/Stockholm/37/2009 (H1N1); A/Stockholm/41/2009 (H1N1); A/Stockholm/45/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-1/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-14/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-2/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-21/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-22/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-23/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-24/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-25/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-3/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-7/2009 (H1N1); A/Beijing/502/2009 (H1N1); A/Firenze/10/2009 (H1N1); A/Hong Kong/2369/2009 (H1N1); A/Italy/85/2009 (H1N1); A/Santo Domingo/572N/2009 (H1N1); A/Catalonia/385/2009 (H1N1); A/Catalonia/386/2009 (H1N1); A/Catalonia/387/2009 (H1N1); A/Catalonia/390/2009 (H1N1); A/Catalonia/394/2009 (H1N1); A/Catalonia/397/2009 (H1N1); A/Catalonia/398/2009 (H1N1); A/Catalonia/399/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/2303/2009 (H1N1); A/Akita/1/2009 (H1N1); A/Castro/JXP/2009 (H1N1); A/Fukushima/1/2009 (H1N1); A/Israel/276/2009 (H1N1); A/Israel/277/2009 (H1N1); A/Israel/70/2009 (H1N1); A/Iwate/1/2009 (H1N1); A/Iwate/2/2009 (H1N1); A/Kagoshima/1/2009 (H1N1); A/Osaka/180/2009 (H1N1); A/Puerto Montt/Bio87/2009 (H1 N1); A/Sao Paulo/2303/2009 (H1N1); A/Sapporo/1/2009 (H1N1); A/Stockholm/30/2009 (H1N1); A/Stockholm/31/2009 (H1N1); A/Stockholm/32/2009 (H1N1); A/Stockholm/33/2009 (H1N1); A/Stockholm/34/2009 (H1N1);
A/Stockholm/35/2009 (H1N1); A/Stockholm/36/2009 (H1N1); A/Stockholm/38/2009 (H1N1); A/Stockholm/39/2009 (H1N1); A/Stockholm/40/2009 (H1N1;) A/Stockholm/42/2009 (H1N1); A/Stockholm/43/2009 (H1N1); A/Stockholm/44/2009 (H1N1); A/Utsunomiya/2/2009 (H1N1); A/WRAIR/0573N/2009 (H1N1); y A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2009 (H1N1).
Los ejemplos no limitantes del virus de la influenza B incluyen la cepa Aichi/5/88, cepa B/Brisbane/60/2008; Akita/27/2001, cepa Akita/5/2001, cepa Alaska/16/2000, cepa Alaska/1777/2005, cepa Argentina/69/2001, cepa Arizona/146/2005, cepa Arizona/148/2005, cepa Bangkok/163/90, cepa Bangkok/34/99, cepa Bangkok/460/03, cepa Bangkok/54/99, cepa Barcelona/215/03, cepa Beijing/15/84, cepa Beijing/184/93, cepa Beijing/243/97, cepa Beijing/43/75, cepa Beijing/5/76, cepa Beijing/76/98, cepa Belgium/WV106/2002, cepa Belgium/WV107/2002, cepa Belgium/WV109/2002, cepa Belgium/WV114/2002, cepa Belgium/WV122/2002, cepa Bonn/43, cepa Brazil/952/2001, cepa Bucharest/795/03, cepa Buenos Aires/161/00), cepa Buenos Aires/9/95, cepa Buenos Aires/SW16/97, cepa Buenos Aires/VL518/99, cepa Canada/464/2001, cepa Canada/464/2002, cepa Chaco/366/00, cepa Chaco/R113/00, cepa Cheju/303/03, cepa Chiba/447/98, cepa Chongqing/3/2000, producto aislado clínico de la cepa SA1 Thailand/2002, producto aislado clínico de la cepa SA10 Thailand/2002, producto aislado clínico de la cepa SA100 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA101 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA110 Philippines/2002), producto aislado clínico de la cepa SA112 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA113 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA114 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA2 Thailand/2002, producto aislado clínico de la cepa SA20 Thailand/2002, producto aislado clínico de la cepa SA38 Philippines/2002, producto aislado clínico de la cepa SA39 Thailand/2002, producto aislado clínico de la cepa SA99 Philippines/2002, cepa CNIC/27/2001, cepa Colorado/2597/2004, cepa Cordoba/VA418/99, cepa Czechoslovakia/16/89, cepa Czechoslovakia/69/90, cepa Daeku/10/97, cepa Daeku/45/97, cepa Daeku/47/97, cepa Daeku/9/97, cepa B/Du/4/78, cepa B/Durban/39/98, cepa Durban/43/98, cepa Durban/44/98, cepa B/Durban/52/98, cepa Durban/55/98, cepa Durban/56/98, cepa England/1716/2005, cepa England/2054/2005), cepa England/23/04, cepa Finland/154/2002, cepa Finland/159/2002, cepa Finland/160/2002, cepa Finland/161/2002, cepa Finland/162/03, cepa Finland/162/2002, cepa Finland/162/91, cepa Finland/164/2003, cepa Finland/172/91, cepa Finland/173/2003, cepa Finland/176/2003, cepa Finland/184/91, cepa Finland/188/2003, cepa Finland/190/2003, cepa Finland/220/2003, cepa Finland/WV5/2002, cepa Fujian/36/82, cepa Geneva/5079/03, cepa Genoa/11/02, cepa Genoa/2/02, cepa Genoa/21/02, cepa Genova/54/02, cepa Genova/55/02, cepa Guangdong/05/94, cepa Guangdong/08/93, cepa Guangdong/5/94, cepa Guangdong/55/89, cepa Guangdong/8/93, cepa Guangzhou/7/97, cepa Guangzhou/86/92, cepa Guangzhou/87/92, cepa Gyeonggi/592/2005, cepa Hannover/2/90, cepa Harbin/07/94, cepa Hawaii/10/2001, cepa Hawaii/1990/2004, cepa Hawaii/38/2001, cepa Hawaii/9/2001, cepa Hebei/19/94, cepa Hebei/3/94), cepa Henan/22/97, cepa Hiroshima/23/2001, cepa Hong Kong/110/99, cepa Hong Kong/1115/2002, cepa Hong Kong/112/2001, cepa Hong Kong/123/2001, cepa Hong Kong/1351/2002, cepa Hong Kong/1434/2002, cepa Hong Kong/147/99, cepa Hong Kong/156/99, cepa Hong Kong/157/99, cepa Hong Kong/22/2001, cepa Hong Kong/22/89, cepa Hong Kong/336/2001, cepa Hong Kong/666/2001, cepa Hong Kong/9/89, cepa Houston/1/91, cepa Houston/1/96, cepa Houston/2/96, cepa Hunan/4/72, cepa Ibaraki/2/85, cepa ncheon/297/2005, cepa India/3/89, cepa India/77276/2001, cepa Israel/95/03, cepa Israel/WV187/2002, cepa Japan/1224/2005, cepa Jiangsu/10/03, cepa Johannesburg/1/99, cepa Johannesburg/96/01, cepa Kadoma/1076/99, cepa Kadoma/122/99, cepa Kagoshima/15/94, cepa Kansas/22992/99, cepa Khazkov/224/91, cepa Kobe/1/2002, cepa, cepa Kouchi/193/99, cepa Lazio/1/02, cepa Lee/40, cepa Leningrad/129/91, cepa Lissabon/2/90), cepa Los Angeles/1/02, cepa Lusaka/270/99, cepa Lyon/1271/96, cepa Malaysia/83077/2001, cepa Maputo/1/99, cepa Mar del Plata/595/99, cepa Maryland/1/01, cepa Memphis/1/01, cepa Memphis/12/97-MA, cepa Michigan/22572/99, cepa Mie/1/93, cepa Milano/1/01, cepa Minsk/318/90, cepa Moscow/3/03, cepa Nagoya/20/99, cepa Nanchang/1/00, cepa Nashville/107/93, cepa Nashville/45/91, cepa Nebraska/2/01, cepa Netherland/801/90, cepa Netherlands/429/98, cepa New York/1/2002, cepa NIB/48/90, cepa Ningxia/45/83, cepa Norway/1/84, cepa Oman/16299/2001, cepa Osaka/1059/97, cepa Osaka/983/97-V2, cepa Oslo/1329/2002, cepa Oslo/1846/2002, cepa Panama/45/90, cepa Paris/329/90, cepa Parma/23/02, cepa Perth/211/2001, cepa Peru/1364/2004, cepa Philippines/5072/2001, cepa Pusan/270/99, cepa Quebec/173/98, cepa Quebec/465/98, cepa Quebec/7/01, cepa Roma/1/03, cepa Saga/S172/99, cepa Seoul/13/95, cepa Seoul/37/91, cepa Shangdong/7/97, cepa Shanghai/361/2002), cepa Shiga/T30/98, cepa Sichuan/379/99, cepa Singapore/222/79, cepa Spain/WV27/2002, cepa Stockholm/10/90, cepa Switzerland/5441/90, cepa Taiwan/0409/00, cepa Taiwan/0722/02, cepa Taiwan/97271/2001, cepa Tehran/80/02, cepa Tokyo/6/98, cepa Trieste/28/02, cepa Ulan Ude/4/02, cepa United Kingdom/34304/99, cepa USSR/100/83, cepa Victoria/103/89, cepa Vienna/1/99, cepa Wuhan/356/2000, cepa WV194/2002, cepa Xuanwu/23/82, cepa Yamagata/1311/2003, cepa Yamagata/K500/2001, cepa Alaska/12/96, cepa GA/86, cepa NAGASAKI/1/87, cepa Tokyo/942/96, cepa B/Wisconsin/ 1 /20 10; y cepa Rochester/02/2001.
Los ejemplos no limitantes del virus de la influenza C incluyen la cepa Aichi/1/81, cepa Ann Arbor/1/50, cepa Aomori/74, cepa California/78, cepa England/83, cepa Crreece/79, cepa Hiroshima/246/2000, cepa Hiroshima/252/2000, cepa Hyogo/1/83, cepa Johannesburg/66, cepa Kanagawa/1/76, cepa Kyoto/1/79, cepa Mississippi/80, cepa Miyagi/1/97, cepa Miyagi/5/2000, cepa Miyagi/9/96, cepa Nara/2/85, cepa NewJersey/76, cepa pig/Beijing/115/81, cepa Saitama/3/2000), cepa Shizuoka/79, cepa Yamagata/2/98, cepa Yamagata/6/2000, cepa Yamagata/9/96, cepa BERLIN/1/85, cepa ENGLAND/892/8, cepa GREAT LAKES/1167/54, cepa JJ/50, cepa PIG/BEIJING/10/81, cepa PIG/BEIJING/439/82), cepa TAYLOR/1233/47, y cepa C/YAMAGATA/10/81.
En ciertas realizaciones, los virus de la influenza proporcionados en el presente documento tienen un fenotipo atenuado. En realizaciones específicas, el virus de la influenza atenuado se basa en el virus de la influenza A. En otras realizaciones, el virus de la influenza atenuado se basa en el virus de la influenza B. En otras realizaciones más, el virus de la influenza atenuado se basa en el virus de la influenza C. En otras realizaciones, el virus de la influenza atenuado puede comprender genes o segmentos del genoma de una o más cepas o subtipos del virus de la influenza A, influenza B y/o influenza C. En algunas realizaciones, el virus troncal atenuado comprende genes de un virus de influenza A y un virus de influenza B.
En realizaciones específicas, se desea la atenuación del virus de la influenza de modo que el virus permanezca, al menos parcialmente, infeccioso y pueda replicar in vivo, pero solo genere títulos bajos que dan como resultado niveles subclínicos de infección que no son patogénicos. Tales virus atenuados son especialmente adecuados para las realizaciones descritas en el presente documento en donde el virus o una composición inmunogénica del mismo se administran a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria. La atenuación del virus de la influenza se puede lograr según cualquier método conocido en la técnica, tal como, p. ej., la selección de mutantes virales generados por mutagénesis química, la mutación del genoma por ingeniería genética, la selección de virus reordenados que contienen segmentos con función atenuada, o la selección de mutantes de virus condicionales (p. ej., virus adaptados al frío). Alternativamente, los virus de la influenza atenuados que se producen de forma natural se pueden utilizar como cadenas principales del virus de la influenza para los vectores del virus de la influenza.
En una realización, un virus de la influenza puede atenuarse, al menos en parte, en virtud de la sustitución del gen HA del virus de la influenza parental por un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un virus de la influenza puede atenuarse, al menos en parte, modificando genéticamente el virus de la influenza para que exprese un gen NS1 mutado que altera la capacidad del virus para suscitar antagonismo de la respuesta del interferón celular (IFN). Los ejemplos de los tipos de mutaciones que se pueden introducir en el gen NS1 del virus de la influenza incluyen deleciones, sustituciones, inserciones y combinaciones de las mismas. Se pueden introducir una o más mutaciones en cualquier parte del gen NS1 (p. ej., el extremo N-terminal, el extermo C-terminal o algún punto intermedio) y/o el elemento regulador del gen NS1. En una realización, un virus de la influenza atenuado comprende un genoma que tiene una mutación en un gen NS1 del virus de la influenza que da como resultado una deleción que consiste en 5, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 restos de aminoácidos del extremo C-terminal de NS1, o una deleción de entre 5-170, 25-170, 50-170, 100-170, 100-160 o 105-160 restos de aminoácidos del extremo C-terminal. En otra realización, un virus de la influenza atenuado comprende un genoma que tiene una mutación en un gen NS1 del virus de la influenza tal que codifica una proteína NS1 de restos de aminoácidos 1-130, restos de aminoácidos 1-126, restos de aminoácidos 1-120, restos de aminoácidos restos de aminoácidos 1-115, restos de aminoácidos 1-110, restos de aminoácidos 1-100, restos de aminoácidos 1-99, restos de aminoácidos 1-95, restos de aminoácidos 1-85, restos de aminoácidos 1-83, restos de aminoácidos restos 1 -80, restos de aminoácidos 1 -75, restos de aminoácidos 1 -73, restos de aminoácidos 1 -70, restos de aminoácidos 1-65, o restos de aminoácidos 1-60, en donde el aminoácido N-terminal es el número 1. Para ver ejemplos de mutaciones de NS1 y virus de influenza que comprenden un NS1 mutado, véanse, p. ej., las Patente de Estados Unidos Núm. 6.468.544 y 6.669.943; y Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138, cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
5.8 Vectores de virus distintos de influenza
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan virus distintos de influenza que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza). En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se incorpora a los viriones de virus distintos de influenza. En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) está contenido en/expresado por un virus purificado (p. ej., purificado en placa) o aislado. Los virus distintos de influenza pueden conjugarse con radicales que dirigen los virus a tipos de células particulares, tales como las células inmunitarias. En algunas realizaciones, los viriones de virus distintos de influenza tienen incorporado o expresan un polipéptido heterólogo además de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que tenga actividad inmunopotenciadora o que dirija el virus distinto de influenza a un tipo de célula particular, tal como un anticuerpo que reconoce un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se une a un receptor específico en un tipo de célula específico. Véase la Sección 5.4 más arriba para ejemplos de tales polipéptidos heterólogos.
Los virus distintos de influenza que contienen/expresan un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe pueden producirse utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica. Los virus distintos de influenza que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se pueden producir suministrando en trans el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe durante la producción de viriones utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, la replicación de un virus distinto de influenza parental que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en células susceptibles a la infección con el virus en donde la función de hemaglutinina se proporciona en trans producirá virus progenie que contengan el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
Se puede utilizar como vector de virus distinto de influenza cualquier tipo, subtipo o cepa de virus, incluidas, pero sin limitarse a, cepas, variantes o mutantes de origen natural, virus mutagenizados, reordenados y/o virus modificados genéticamente. En una realización específica, el virus distinto de influenza parental no es un virus de origen natural. En otra realización específica, el virus distinto de influenza parental es un virus modificado genéticamente. En ciertas realizaciones, se prefiere un virus envuelto para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe unido a membrana descrito en el presente documento.
En una realización ilustrativa, el vector de virus distinto de influenza es un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). En otra realización, el vector de virus distinto de influenza es un virus vaccinia. En otras realizaciones ilustrativas, no limitantes, el vector de distinto de influenza es adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus de la hepatitis B, retrovirus (tales como, p. ej., un gammaretrovirus tal como el genoma del Virus de Células Madre de Ratón (MSCV) o el Virus de la Leucemia Murina (MLV), p. ej., virus de la leucemia murina de Moloney, oncoretrovirus o lentivirus), un alfavirus (p. ej., virus de la encefalitis equina Venezolana), un rabdovirus, tal como virus de la estomatitis o virus del papiloma, poxvirus (tal como, p. ej., virus vaccinia, un vector MVA-T7 o viruela aviar), metapneumovirus, virus del sarampión, herpesvirus, tal como el virus del herpes simple, o foamyvirus. Véanse, p. ej., Lawrie y Tumin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (vectores retrovirales); Bett et al., 1993, J. Virol. 67, 5911 (vectores adenovirales); Zhou et al., 1994, J. Exp. Med. 179, 1867 (vectores de virus adenoasociados); Dubensky et al., 1996, J. Virol. 70, 508-519 (vectores virales de la familia de la viruela que incluyen el virus vaccinia y los virus de la viruela aviar y vectores virales del género de alfavirus alfa tales como los derivados de Virus Sindbis y del Bosque Semliki); Patente de Estados Unidos Núm. 5.643.576 (virus de la encefalitis equina venezolana); documento WO 96/34625 (Vs V); Ohe et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 325-333; Woo et al., documento WO 94/12629; Xiao y Brandsma, 1996, Nucleic Acids. Res.
24, 2630-2622 (virus del papiloma); y Bukreyev y Collins, 2008, Curr Opin Mol Ther. 10:46-55 (n Dv ), cada uno de los cuales se incorpora como referencia en el presente documento en su totalidad.
En una realización específica, el vector de virus distinto de influenza es NDV. Cualquier tipo, subtipo o cepa de NDV puede servir como la cadena principal que está modificada genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, incluyendo, pero sin limitarse a, cepas, variantes o mutantes de origen natural, virus mutagenizados, reordenados y/o modificados genéticamente. En una realización específica, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa de origen natural. En ciertas realizaciones, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa lítica. En otras realizaciones, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa no lítica. En ciertas realizaciones, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa lentogénica. En algunas realizaciones, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa mesogénica. En otras realizaciones, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es una cepa velogénica. Los ejemplos específicos de cepas de NDV incluyen, pero sin limitarse a, la cepa 73-T, la cepa Ulster, la cepa MTH-68, la cepa Italien, la cepa Hickman, la cepa PV701, la cepa Hitchner B1, la cepa La Sota, la cepa YG97, la cepa MET95, y cepa F48E9. En una realización específica, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es la cepa Hitchner B1. En otra realización específica, el NDV que sirve como cadena principal para la modificación genética es la cepa La Sota.
En una realización, el NDV utilizado como cadena principal para un vector de virus distinto de influenza se modifica genéticamente para expresar una proteína F modificada en la que el sitio de escisión de proteína F se reemplaza por uno que contiene uno o dos restos de arginina adicionales, lo que permite que el sitio de escisión del mutante se active por medio de proteasas expresadas ubicuamente de la familia de las furinas. Los ejemplos específicos de NDV que expresan tal proteína F modificada incluyen, pero sin limitarse a, rNDV/F2aa y rNDV/F3aa. Para obtener una descripción de las mutaciones introducidas en una proteína F de NDV para producir una proteína F modificada con un sitio de escisión mutado, véase, p. ej., Park et al. (2006) "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease." PNAS USA 103: 8203-2808, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
En una realización, el vector de virus distinto de influenza es un poxvirus. Un vector de poxvirus puede basarse en cualquier miembro de los poxviridae, en particular, un virus vaccinia o un virus de la viruela aviar (p. ej., tal como la viruela del canario, la viruela aviar, etc.) que proporcione secuencias adecuadas para vectores de vacunas. En una realización específica, el vector poxviral es un vector del virus vaccinia. Los virus vaccinia adecuados incluyen, pero no se limitan a, la cepa Copenhagen (VC-2) (Goebel, et al., Virol 179: 247-266, 1990; Johnson et al., Virol. 196: 381 401, 1993), cepa Copenhague modificada (NYVAC) (Patente de Estados Unidos Núm. 6.265.189), la cepa WYETH y la cepa Ankara modificada (MVA) (Antoine et al., Virol. 244: 365-396, 1998). Otros poxvirus adecuados incluyen cepas de viruela aviar tales como los vectores ALVAC y TROVAC que proporcionan propiedades deseables y son altamente atenuadas (véanse, p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.265.189; Tartaglia et al., en AIDS Research Reviews, Koff et al., eds., vol. 3, Marcel Dekker, Nueva York, 1993; y Tartaglia et al., 1990, Reviews in Immunology 10: 13-30, 1990).
Los métodos de modificación genética de virus distintos de influenza para expresar polipéptidos de influenza son bien conocidos en la técnica, al igual que los métodos para atenuar, propagar y aislar y purificar tales virus. Para tales técnicas con respecto a los vectores NDV, véanse, p. ej., Publicación Internacional Núm. WO 01/04333; Patentes de Estados Unidos Núm. 7.442.379, 6.146.642, 6.649.372, 6.544.785 y 7.384.774; Swayne et al. (2003). Avian Dis.
47:1047-1050; y Swayne et al. (2001). J. Virol. 11868-11873, cada una de las cuales se incorpora como referencia en
su totalidad. Para tales técnicas con respecto a los poxvirus, véanse, p. ej., Piccini, et al., Methods of Enzymology 153: 545-563, 1987; Publicación Internacional Núm. w O 96/11279; Patente de Estados Unidos Núm. 4.769.330; Patente de Estados Unidos Núm. 4.722.848; Patente de Estados Unidos Núm. 4.769.330; Patente de Estados Unidos Núm.
4.603.112; Patente de Estados Unidos Núm. 5.110.587; Patente de Estados Unidos Núm. 5.174.993; documento EP 83 286; documento EP 206920; Mayr et al., Infección 3: 6-14, 1975; y Sutter y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851, 1992. En ciertas realizaciones, el virus que distinto de influenza está atenuado.
Las consideraciones ilustrativas para la selección de un vector de virus distinto de influenza, particularmente para su uso en composiciones para administración a un sujeto, son seguridad, baja toxicidad, estabilidad, especificidad de tipo celular e inmunogenicidad, particularmente, antigenicidad del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe expresado por el vector de virus distinto de influenza.
5.9 Partículas similares a virus y virosomas
Los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza) descritos en el presente documento pueden incorporarse en vectores de partículas similares a virus (VLP), p. ej., VLP purificadas/aisladas. Las VLP generalmente comprenden uno o varios polipéptidos virales derivados típicamente de una o varias proteínas estructurales de un virus. En algunas realizaciones, las VLP no son capaces de replicar. En ciertas realizaciones, las VLP pueden carecer del genoma completo de un virus o comprender una porción del genoma de un virus. En algunas realizaciones, las VLP no son capaces de infectar una célula. En algunas realizaciones, las VLP expresan en su superficie uno o más radicales de direccionamiento virales (p. ej., glicoproteína de superficie del virus) o no virales (p. ej., anticuerpo o proteína) conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las VLP comprenden un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y una proteína estructural viral, tal como gag de VIH. En una realización específica, las VLP comprenden un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y un polipéptido gag de VIH.
Se han descrito métodos para producir y caracterizar VLP producidas de forma recombinante basándose en varios virus, incluido el virus de la influenza (Brigth et al. (2007) Vaccine. 25:3871), virus del papiloma humano tipo 1 (Hagnesee et al. (1991) J. Virol. 67:315), virus del papiloma humano tipo 16 (Kirnbauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1992)89:12180), VIH-1 (Haffer et al., (1990) J. Virol. 64:2653), y hepatitis A (Winokur (1991) 65:5029), cada una de las cuales se incorpora al presente documento en su totalidad. Los métodos para expresar VLP que contienen proteínas NDV son proporcionados por Pantua et al. (2006) en J. Virol. 80:11062-11073, y en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20090068221, publicada el 12 de marzo de 2009, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en el presente documento. En una realización específica, las VLP que comprenden el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento se generan utilizando baculovirus, como se describe en la sección de Ejemplos a continuación. En otras realizaciones, las VLP que comprenden polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento se generan utilizando células 293T, como se describe en la sección de Ejemplos a continuación.
En realizaciones específicas, las VLP, p. ej., las VLP que comprenden un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, se expresan en células (p. ej., células 293T). En ciertas realizaciones, las VLP se expresan en células que expresan glicoproteínas de superficie que comprenden ácido siálico. Según tales realizaciones, las células se cultivan en presencia de neuraminidasa (p. ej., neuraminidasa viral o bacteriana). En ciertas realizaciones, las VLP, p. ej., las VLP que comprenden un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, se expresan en células que no expresan glicoproteínas de superficie que comprenden ácido siálico.
En una realización específica, se puede incorporar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a un virosoma. Se puede producir un virosoma que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede producir un virosoma al romper un virus purificado, extraer el genoma y volver a ensamblar partículas con las proteínas virales (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe) y lípidos para formar partículas lipídicas que contienen proteínas virales.
5.10 Vectores bacterianos
En una realización específica, las bacterias se pueden modificar genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. Las bacterias adecuadas para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe incluyen, pero sin limitarse a, Listeria, Salmonella, Shigella sp., Mycobacterium tuberculosis, E. coli, Neisseria meningitides, Brucella abortus, Brucella melitensis, Borrelia burgdorferi, Lactobacillus, Campylobacter, Lactococcus, Bifidobacterium, y Francisella tularensis. En una realización específica, las bacterias modificadas genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se atenúan. Los mecanismos para la producción de bacterias modificadas genéticamente para expresar un polipéptido heterólogo se conocen en la técnica y se pueden aplicar a la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Véanse, p. ej., Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20080248066, publicada el 9 de octubre 2008, y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20070207171, publicada el 6 de septiembre 2007, cada una de los cuales se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad. En ciertas realizaciones, los vectores bacterianos utilizados en el presente documento poseen la capacidad de realizar la glicosilación ligada a N, p. ej., tales bacterias poseen naturalmente
maquinaria de N-glicosilación (p. ej., Campylobacter) o han sido modificadas genéticamente para poseer maquinaria de N-glicosilación.
5.11 Vectores de plantas y algas
En ciertas realizaciones, las plantas (p. ej., plantas del género Nicotiana) se pueden modificar genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento. En realizaciones específicas, las plantas se modifican para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento a través de un procedimiento de agroinfiltración utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un gen de interés, p. ej., un gen que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, se introducen en una cepa de Agrobacterium. Posteriormente, la cepa se cultiva en un cultivo líquido y las bacterias resultantes se lavan y suspenden en una solución tampón. A continuación, las plantas se exponen (p. ej., mediante inyección o inmersión) a Agrobacterium que comprende los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de hemaglutinina (HA) de gripe descrito en el presente documento de manera que Agrobacterium transforma el gen de interés en una parte de las células vegetales. A continuación, la planta expresa transitoriamente el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y se puede aislar utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. (Para ejemplos específicos véanse Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23):2930-2934; y D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940). En una realización específica, la planta es una planta de tabaco (es decir, Nicotiana tabacum). En otra realización específica, la planta es un pariente de la planta del tabaco (p. ej., Nicotiana benthamiana). En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento se expresan en una especie de soja. En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento se expresan en una especie de maíz. En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento se expresan en una especie de arroz
En otras realizaciones, las algas (p. ej., Chlamydomonas reinhardtii) se pueden modificar genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento (véase, p. ej., Rasala et al., 2010, Plant Biotechnology Journal (Publicada en línea el 7 de marzo de 2010)).
En ciertas realizaciones, las plantas utilizadas para expresar los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento se modifican genéticamente para expresar componentes de un sistema de N-glicosilación (p. ej., un sistema de N-glicosilación bacteriano o de mamífero), es decir, las plantas pueden realizar N-glicosilación.
Las células vegetales que se pueden utilizar para expresar los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe y los métodos para la producción de proteínas que utilizan sistemas de cultivo de células vegetales se describen, p. ej., en, las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.929.304; 7.504.560; 6.770.799; 6.551.820; 6.136.320; 6.034.298; 5.914.935; 5.612.487; y 5.484.719, Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2009/0208477, 2009/0082548, 2009/0053762, 2008/0038232, 2007/0275014 y 2006/0204487, y Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23):2930-2934, y D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940 (que se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad).
5.12 Generación de anticuerpos contra polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe
Los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos o los vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en el presente documento se pueden utilizar para provocar anticuerpos neutralizantes contra la influenza, por ejemplo, contra la región de tronco de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza. En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos o los vectores que comprenden tales ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto no humano (p. ej., un ratón, conejo, rata, cobaya, etc.) para inducir una respuesta inmunitaria que incluye la producción de anticuerpos que pueden aislarse utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.).
Alternativamente, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento puede utilizarse para escrutar anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, un polipéptido aislado de hemaglutinina (HA) de la gripe puede inmovilizarse en un soporte sólido (p. ej., un gel de sílice, una resina, una película de plástico derivatizada, una cuenta de vidrio, algodón, una cuenta de plástico, una cuenta de poliestireno, un gel de alúmina o un polisacárido, una cuenta magnética) y escrutarse para determinar la unión a anticuerpos. Como alternativa, los anticuerpos pueden inmovilizarse en un soporte sólido y escrutarse para determinar la unión a los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe aislados. Se puede utilizar cualquier ensayo de escrutinio, tal como un ensayo de inmunopurificación, ELISA, resonancia de plasmones de superficie u otro ensayo de escrutinio de anticuerpos conocido en la técnica para escrutar anticuerpos que se unen al polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. La biblioteca de anticuerpos escrutada puede ser una biblioteca de anticuerpos comercialmente disponible, una biblioteca generada in vitro, o una biblioteca obtenida identificando y clonando o aislando anticuerpos de un individuo infectado con influenza. En realizaciones particulares, la biblioteca de anticuerpos se genera a partir de un superviviente de un
brote del virus de la influenza. Las bibliotecas de anticuerpos se pueden generar según métodos conocidos en la técnica. En una realización particular, la biblioteca de anticuerpos se genera clonando los anticuerpos y usándolos en bibliotecas de presentación en fagos o en una biblioteca de presentación en fagémidos.
Los anticuerpos identificados en los métodos descritos en el presente documento pueden someterse a prueba para determinar la actividad neutralizante y la falta de autorreactividad utilizando los ensayos biológicos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento. En una realización, un anticuerpo aislado de un animal no humano o una biblioteca de anticuerpos neutraliza un polipéptido de hemaglutinina de más de un subtipo de influenza. En algunas realizaciones, un anticuerpo provocado o identificado utilizando un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido o un vector que codifica tal ácido nucleico o polipéptido neutraliza un virus de la influenza H3. En algunas realizaciones, un anticuerpo provocado o identificado utilizando un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido o un vector que comprende tal ácido nucleico o polipéptido neutraliza 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 o más subtipos o cepas del virus de la influenza. En una realización, el anticuerpo neutralizante neutraliza uno o más virus de influenza A y uno o más virus de influenza B. En realizaciones particulares, el anticuerpo neutralizante no es o no se une al mismo epítopo que CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (producido por hibridoma FERM BP-4517; clones comercializados por Takara Bio, Inc. (Otsu, Shiga, Japón)), y/o AI3c (FERM BP-4516); o cualquier otro anticuerpo descrito por Ekiert DC et al. (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicada en Science Express 26 de febrero de 2009); Kashyap et al. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Sui et al. (2009) Structural and functional bases for broadspectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273; Patentes de Estados Unidos Núm. 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070, y 6.720.409; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2007/068983 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2007/134237; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/075998 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/036157; Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2007/059356 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2008/028946; y Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/085876 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/079259. En otras realizaciones, el anticuerpo neutralizante no es un anticuerpo descrito por Wang et al. (2010) en "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9. En realizaciones particulares, el anticuerpo neutralizante no utiliza el segmento Ig VH1-69. En algunas realizaciones, la interacción del anticuerpo neutralizante con el antígeno no está mediada exclusivamente por la cadena pesada.
Los anticuerpos identificados o provocados utilizando un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido o un vector que comprende tal ácido nucleico o polipéptido incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un polipéptido de hemaglutinina. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv conectados por disulfuro (sdFv) y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti-Id contra anticuerpos provocados o identificados utilizando un método descrito en el presente documento), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.
Los anticuerpos provocados o identificados utilizando polipéptidos de hemaglutinina (HA) de gripe, ácidos nucleicos que codifican tal polipéptido o un vector que comprende tal ácido nucleico o polipéptido se pueden utilizar en inmunoensayos de diagnóstico, inmunoterapia pasiva y generación de anticuerpos antiidiotípicos. Los anticuerpos antes de utilizarse en inmunoterapia pasiva pueden modificarse, p. ej., los anticuerpos pueden quimerizarse o humanizarse. Véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.444.887 y 4.716.111; y las Publicaciones Internacionales Núm. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741, cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad, para revisiones sobre la generación de anticuerpos quiméricos y humanizados. Adicionalmente, la capacidad de los anticuerpos para neutralizar los polipéptidos de hemaglutinina y la especificidad de los anticuerpos para los polipéptidos pueden probarse antes de utilizar los anticuerpos en inmunoterapia pasiva. Véase la Sección 5.11 más abajo para una discusión sobre el uso de anticuerpos neutralizantes para la prevención o el tratamiento de enfermedades causadas por la infección por el virus de la influenza.
Los anticuerpos provocados o identificados utilizando un polipéptido de hemaglutinina (HA) de gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido o un vector que comprende tal ácido nucleico o polipéptido se pueden utilizar para verificar la eficacia de una terapia y/o la progresión de la enfermedad. Se puede utilizar cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica para este fin, incluidos, pero sin limitarse a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas), inmunoensayos "sándwich", reacciones de precipitación, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, por nombrar solo algunos.
Los anticuerpos provocados o identificados utilizando un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido o un vector que comprende tal ácido nucleico o polipéptido se pueden utilizar en la producción de anticuerpos antiidiotípicos. A su vez, el anticuerpo antiidiotípico se puede utilizar para la inmunización, con el fin de producir una subpoblación de anticuerpos que se unan a un antígeno particular de la influenza, p. ej., un epítopo neutralizante de un polipéptido de hemaglutinina (Jerne, 1974, Ann. inmunol. (París) 125c:373; Jerne et al., 1982, EMBO J. 1:234, incorporadas al presente documento como referencia en su totalidad).
5.13 Estimulación de las células con polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para estimular células ex-vivo con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. Tales células, p. ej., células dendríticas se pueden utilizar in vitro para generar anticuerpos contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o se pueden administrar a un sujeto por sí mismas, p. ej., un mecanismo de transferencia adoptiva conocido en la técnica. Véase, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 20080019998, publicada en January 24, 2008, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad, para una descripción de los mecanismos de transferencia adoptiva. En ciertas realizaciones, cuando las células que han sido estimuladas ex-vivo con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento se administran a un sujeto, las células no son células de mamífero (p. ej., células CB-1).
En un ejemplo no limitante, se puede utilizar un vector, p. ej., un vector del virus de la influenza, modificados genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, para generar células dendríticas (CD) que expresan el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y muestran propiedades inmunoestimuladoras dirigidas contra un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza. Tales CD se pueden utilizar para expandir las células T de memoria y son potentes estimuladores de las células T, incluidos los clones de linfocitos T citotóxicos específicos del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Véase Strobel et al., 2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento se puede suministrar a una célula diana de cualquier manera que permita que el polipéptido entre en contacto con la célula diana, p. ej., una CD, y suministrar el polipéptido a la célula diana. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se suministra a un sujeto, como se describe en el presente documento. En algunas de tales realizaciones, las células en contacto con el polipéptido se pueden aislar y propagar.
En ciertas realizaciones, se suministra un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a una célula diana in vitro. Se pueden utilizar mecanismos conocidos por los expertos en la técnica para suministrar el polipéptido a las células diana. Por ejemplo, las células diana se pueden poner en contacto con el polipéptido en una placa, tubo u otro recipiente de cultivo de tejidos. El polipéptido se puede suspender en medios y añadir a los pocillos de una placa, tubo u otro recipiente de cultivo. El medio que contiene el polipéptido se puede añadir antes de sembrar las células o después de que se hayan sembrado las células. Las células diana se incuban preferiblemente con el polipéptido durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el polipéptido entre en contacto con las células. En ciertas realizaciones, las células se incuban con el polipéptido durante aproximadamente 1 hora o más, aproximadamente 5 horas o más, aproximadamente 10 horas o más, aproximadamente 12 horas o más, aproximadamente 16 horas o más, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 12 horas, aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas o aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas. En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe está en un virus, el contacto de las células diana comprende infectar las células con el virus.
Las células diana pueden ser de cualquier especie, incluidos, p. ej., seres humanos, ratones, ratas, conejos y cobayas. En algunas realizaciones, las células diana son CD obtenidas de un sujeto sano o un sujeto que necesita tratamiento. En ciertas realizaciones, las células diana son CD obtenidas de un sujeto en el que se desea estimular una respuesta inmunitaria al polipéptido. Los métodos para obtener células de un sujeto son bien conocidos en la técnica.
5.14 Composiciones
Los ácidos nucleicos, vectores, polipéptidos, bacterias, anticuerpos o células descritos en el presente documento (a veces denominados en el presente documento "compuestos activos") pueden incorporarse a las composiciones. En una realización específica, las composiciones son composiciones farmacéuticas, tales como composiciones inmunogénicas (p. ej., formulaciones de vacunas). Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un sujeto. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para administración veterinaria y/o humana. Las composiciones se pueden utilizar en métodos para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza.
En una realización, una composición farmacéutica comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, mezclado con un portador farmacéuticamente
aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende un virus de la influenza o un virus que distinto de influenza que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende un virus de la influenza o un virus que distinto de influenza que tienen un genoma modificado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende una partícula similar a un virus o virosoma que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezclados con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende una bacteria que expresa o está modificada genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezclada con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, mezcladas con un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica puede comprender una o más terapias diferentes además de una terapia que utiliza un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento.
Como se emplea en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE. UU. u otras farmacopeas generalmente reconocidas para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con los cuales se administra la composición farmacéutica. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En una realización específica, las composiciones farmacéuticas se formulan para que sean adecuadas para la vía de administración prevista para un sujeto. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede formular para que sea adecuada para la administración parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorrectal, intraperitoneal y rectal. En una realización específica, la composición farmacéutica puede formularse para administración intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica o pulmonar.
En ciertas realizaciones, se pueden utilizar polímeros biodegradables, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, polietilenglicol (PEGilación), polímeros de polimetilmetacrilato, polilactidas, poli(lactida-co-glicólidos), ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico como portadores. En algunas realizaciones, los compuestos activos se preparan con portadores que aumentan la protección del compuesto contra la eliminación rápida del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. También se pueden utilizar liposomas o micelas como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según uno métodos conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.522.811. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más adyuvantes.
En realizaciones específicas, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones monovalentes. En otras realizaciones, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes. En un ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un vector que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En ciertas realizaciones, una formulación multivalente puede comprender uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe diferentes expresados utilizando un solo vector.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además un conservante, p. ej., el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden de 0,001% a 0,01% de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden conservantes. En una realización específica, el timerosal se utiliza durante la fabricación de una composición farmacéutica descrita en el presente documento y el timerosal se elimina mediante etapas de purificación posteriores a la producción de la composición farmacéutica, es decir, la composición farmacéutica contiene cantidades traza de timerosal (<0,3 μg de mercurio por dosis) después de la purificación; tales composiciones farmacéuticas se consideran productos libres de timerosal).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además proteína de huevo (p. ej., ovoalbúmina u otras proteínas de huevo). La cantidad de proteína de huevo en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede oscilar entre aproximadamente 0,0005 y aproximadamente 1,2 μg de proteína de huevo por 1 ml de composición farmacéutica. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden proteína de huevo.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además uno o más agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos) que incluyen, pero sin limitarse a, gentamicina, neomicina, polimixina (p. ej., polimixina B) y kanamicina, estreptomicina. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden ningún antibiótico.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además uno o más componentes utilizados para inactivar un virus, p. ej., formalina o formaldehído o un detergente tal como desoxicolato de sodio, octoxinol 9 (Triton X-100) y octoxinol 10. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden ningún componente utilizado para inactivar un virus.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además gelatina. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden gelatina.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además uno o más tampones, p. ej., tampón de fosfato y tampón de sacarosa/fosfato/glutamato. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden tampones.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden además una o más sales, p. ej., cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, glutamato monosódico y sales de aluminio (p. ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de aluminio y potasio) o una mezcla de tales sales de aluminio). En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden sales.
En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son vacunas contra el virus de la influenza con bajo contenido de aditivos, es decir, las composiciones farmacéuticas no comprenden uno o más aditivos que se encuentran comúnmente en las vacunas contra el virus de la influenza. Se han descrito vacunas antigripales con bajo contenido de aditivos (véase, p. ej., la Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2008/002238 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 09/001217 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad).
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden almacenar antes de su uso, p. ej., las composiciones farmacéuticas se pueden almacenar congeladas (p. ej., a aproximadamente -20°C o a aproximadamente -70°C); almacenar en condiciones de refrigeración (p. ej., a aproximadamente 4°C); o almacenar a temperatura ambiente (véase la Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2007/001149 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 07/110776, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad, para métodos de almacenamiento de composiciones que comprenden vacunas contra la influenza sin refrigeración).
En ciertas realizaciones, cuando el compuesto activo en una composición farmacéutica descrita en el presente documento es una célula modificada genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, las células en la composición farmacéutica no son células de mamífero (p. ej., células CB-1).
5.14.1 Vacunas de subunidades
En una realización específica, en el presente documento se proporcionan vacunas de subunidades que comprenden un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una vacuna de subunidades comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y una o más glicoproteínas de superficie (p. ej., neuraminidasa del virus de la influenza), otros radicales de direccionamiento o adyuvantes. En realizaciones específicas, una vacuna de subunidades comprende un solo polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En otras realizaciones, una vacuna de subunidades comprende dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe. En realizaciones específicas, los uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizados en una vacuna de subunidades no están unidos a la membrana, es decir, son solubles.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan vacunas de subunidades que comprenden de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 60 μg de uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento, de aproximadamente 0,001% a 0,01% de timerosal, de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 1,0 μg de proteína de huevo de gallina, de aproximadamente 1,0 μg a aproximadamente 5,0 μg de polimixina, de aproximadamente 1,0 μg a aproximadamente 5,0 μg de neomicina, de aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 0,5 μg de betapropiolactona y de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05% p/v de etoxilato de nonilfenol por dosis.
En una realización específica, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento comprende o consiste en una dosis de 0,5 ml que comprende 45 μg de uno o varios polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionados en el presente documento, ≤ 1,0 μg de mercurio (de timerosal), ≤ 1,0 μg proteína de huevo de gallina (es decir, ovoalbúmina), ≤ 3,75 μg de polimixina y ≤ 2,5 μg de neomicina. En algunas realizaciones, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento comprende adicionalmente o consiste en no más de 0,5 μg de betapropiolactona y no más del 0,015% p/v de etoxilato de nonilfenol por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna de subunidades de dosis de 0,5 ml se envasa en una jeringa precargada.
En una realización específica, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento consiste en un vial multidosis de 5,0 ml (0,5 ml por dosis) que comprende 45 μg de uno o varios polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionados en el presente documento, 25,0 μg de mercurio (de timerosal), ≤ 1,0 μg de proteína de huevo de gallina (es decir, ovoalbúmina), ≤ 3,75 μg de polimixina y ≤ 2,5 μg de neomicina. En algunas realizaciones, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento comprende adicionalmente o consiste en no más de 0,5 μg de betapropiolactona y no más de 0,015% p/v de etoxilato de nonilfenol por dosis.
En una realización específica, la vacuna de subunidades se prepara utilizando el virus de la influenza que se propagó en huevos de gallina embrionados (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe) se aíslan del virus que se propagó en huevos de gallina embrionados). En otra realización específica, la vacuna de subunidades se prepara utilizando el virus de la influenza que no se propagó en huevos de gallina embrionados (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe) se aíslan del virus que no se propagó en huevos de gallina embrionados). En otra realización específica, la vacuna de subunidades se prepara utilizando el virus de la influenza que se propagó en células de mamíferos, p. ej., células humanas inmortalizadas (véase, p. ej., la solicitud internacional Núm. PCT/EP2006/067566 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 07/045674 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) o células de riñón canino tales como células MDCK (véase, p. ej., Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 08/032219 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe) se aíslan del virus que se propagó en células de mamífero). En otra realización específica, los uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe en una vacuna de subunidades se preparan utilizando un vector de expresión, p. ej., un vector viral, un vector vegetal o un vector bacteriano (es decir, los uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe en la vacuna de subunidades se obtienen/aíslan de un vector de expresión).
5.14.2 Vacunas de virus vivos
En una realización, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden virus vivos que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). En otra realización, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden virus vivos que está modificado genéticamente para codificar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, que es expresado por el virus progenie producido en los sujetos a los que se administran las composiciones. En realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe está unido a la membrana. En otras realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe no está unido a la membrana, es decir, es soluble En realizaciones particulares, el virus vivo es un virus de influenza, tal como se describe en la Sección 5.7, más arriba. En otras realizaciones, el virus vivo es un virus distinto de influenza, tal como se describe en la Sección 5.8, más arriba. En algunas realizaciones, el virus vivo se atenúa. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende dos, tres, cuatro o más virus vivos que contienen o están modificados genéticamente para expresar dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe diferentes.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 unidades formadoras de foco (UFF) del virus de la influenza atenuado vivo que contiene uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 mg de glutamato monosódico, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de gelatina de porcina hidrolizada, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de arginina, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 mg de sacarosa, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de fosfato de potasio dibásico, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 mg de fosfato de potasio monobásico, y de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05 μg/ml de sulfato de gentamicina por dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como pulverizadores precargados que contienen dosis únicas de 0,2 ml.
En una realización específica, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden de 106,5 a 107,5 UFF del virus de la influenza atenuado vivo que contiene uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento, 0,188 mg de glutamato monosódico, 2,0 mg de gelatina porcina hidrolizada, 2,42 mg de arginina, 13,68 mg de sacarosa, 2,26 mg de fosfato de potasio dibásico, 0,96 mg de fosfato de potasio monobásico, y ≤ 0,015 μg/ml de sulfato de gentamicina por dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como pulverizadores precargados que contienen dosis únicas de 0,2 ml.
En una realización específica, el virus vivo que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se propaga en huevos de gallina embrionados antes de su uso en una composición inmunogénica descrita en el presente documento. En otra realización específica, el virus vivo que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe no se propaga en huevos de gallina embrionados antes de su uso en una composición inmunogénica descrita en el presente documento. En otra realización específica, el virus vivo que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se propaga en células de mamífero, p. ej., células humanas inmortalizadas (véase, p. ej., la Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2006/067566 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 07/045674 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) o células de riñón canino tales como células MDCK (véase, p. ej., la Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 08/032219 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) antes de su uso en una composición inmunogénica descrita en el presente documento.
Puede preferirse una composición inmunogénica que comprenda un virus vivo para la administración a un sujeto ya que la multiplicación del virus en el sujeto puede conducir a un estímulo prolongado de tipo y magnitud similar al que ocurre en las infecciones naturales y, por lo tanto, conferir una inmunidad sustancial y duradera.
5.14.3 Vacunas de virus inactivados
En una realización, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden un virus inactivado que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza). En realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe está unido a la membrana. En realizaciones particulares, el virus inactivado es un virus de la influenza, tal como se describe en la Sección 5.7, más arriba. En otras realizaciones, el virus inactivado es un virus distinto de influenza, tal como se describe en la Sección 5.8, más arriba. En algunas realizaciones, una composición inmunogénica comprende dos, tres, cuatro o más virus inactivados que contienen dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de virus inactivados comprenden uno o más adyuvantes.
Se pueden utilizar mecanismos conocidos por un experto en la técnica para inactivar virus que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Los métodos comunes utilizan formalina, calor o detergente para la inactivación. Véase, p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.635.246, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Otros métodos incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.891.705; 5.106.619 y 4.693.981, que se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden virus de la influenza inactivado de manera que cada dosis de la composición inmunogénica comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 μg de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg cloruro de sodio, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 μg de fosfato monobásico de sodio, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 μg de fosfato dibásico de sodio, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 μg de fosfato monobásico de potasio, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 μg de cloruro de potasio y de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 μg cloruro de calcio. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como dosis únicas de 0,25 ml o únicas de 0,5 ml. En otras realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) que comprenden virus de la influenza inactivado de manera que cada dosis de la composición inmunogénica comprende de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 μg de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, de aproximadamente 0,001% a 0,01% de timerosal, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de cloruro de sodio, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 μg de fosfato monobásico de sodio, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 μg de fosfato dibásico de sodio, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 μg de fosfato monobásico de potasio, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 μg de cloruro de potasio, y de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 μg de cloruro de calcio por dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como dosis únicas de 0,25 ml o únicas de 0,5 ml. En otras realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) proporcionadas en el presente documento se envasan como dosis únicas de 0,25 ml y comprenden 22,5 μg de un polipéptido de hemaglutinina (HA) contra la gripe descrito en el presente documento, 2,05 mg de cloruro de sodio, 40 μg de fosfato monobásico de sodio, 150 μg de fosfato dibásico de sodio, 10 μg de fosfato monobásico de potasio, 10 μg de cloruro de potasio y 0,75 μg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) proporcionadas en el presente documento se envasan como dosis únicas de 0,5 ml y comprenden 45 gg de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, 4,1 mg de cloruro de sodio, 80 gg de fosfato monobásico de sodio, 300 gg de fosfato dibásico de sodio, 20 gg de fosfato monobásico de potasio, 20 gg de cloruro de potasio y 1,5 gg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis que comprenden o consisten en 5,0 ml de vacuna (0,5 ml por dosis) y comprenden 24,5 gg de mercurio (de timerosal), 45 gg de polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, 4,1 mg de cloruro de sodio, 80 gg de fosfato monobásico de sodio, 300 gg de fosfato dibásico de sodio, 20 gg de fosfato monobásico de potasio, 20 gg de cloruro de potasio y 1,5 gg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, el virus inactivado que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se propagó en huevos de gallina embrionados antes de su inactivación y posterior uso en una composición inmunogénica descrita en el presente documento. En otra realización específica, el virus inactivado que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe no se propagó en huevos de gallina embrionados antes de su inactivación y posterior uso en una composición inmunogénica descrita en el presente documento. En otra realización específica, el virus inactivado que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se propagó en células de mamífero, p. ej., células humanas inmortalizadas (véase, p. ej., la Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2006/067566 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 07/045674 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) o células de riñón canino tales como células MDCK (véase, p. ej., Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 08/032219 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) antes de su inactivación y uso posterior en una composición inmunogénica descrita en el presente documento.
5.14.4 Vacunas de virus fraccionados
En una realización, una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) es una vacuna de virus fraccionado. En algunas realizaciones, la vacuna de virus fraccionado contiene dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe está/estaba unido a la membrana. En ciertas realizaciones, las vacunas de virus fraccionados comprenden uno o más adyuvantes.
Los mecanismos para producir vacunas de virus fraccionados son conocidos por los expertos en la técnica. A modo de ejemplo no limitante, se puede preparar una vacuna fraccionada del virus de la influenza utilizando partículas inactivadas disgregadas con detergentes. Un ejemplo de una vacuna de virus fraccionado que se puede adaptar para su uso según los métodos descritos en el presente documento es la vacuna contra Virus de Influenza Fluzone® (Zonal Purified, Subvirion) para uso intramuscular, que se formula como una suspensión estéril preparada a partir de virus de la influenza propagados en huevos de gallina embrionados. Los fluidos que contienen virus se recolectan y se inactivan con formaldehído. El virus de la influenza se concentra y purifica en una solución de gradiente de densidad de sacarosa lineal utilizando una centrífuga de flujo continuo. A continuación, el virus se disgrega químicamente utilizando un tensioactivo no iónico, octoxinol-9, (Triton® X-100: una marca comercial registrada de Union Carbide, Co.) que produce un "virus fraccionado". A continuación, el virus fraccionado se purifica adicionalmente por medios químicos y se suspende en una solución isotónica de cloruro de sodio tamponada con fosfato de sodio.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento vacunas de virus fraccionados que comprenden de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 60 gg de uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 mg de octoxinol-10 (TRITON X-100®, de aproximadamente 0,5 a 0,5 mg de hidrogeno succinato de a-tocoferilo, de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg de polisorbato 80 (Tween 80), de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,003 gg de hidrocortisona, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,3 gg de sulfato de gentamicina, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 gg de proteína de huevo de gallina (ovoalbúmina), de aproximadamente 25 a 75 gg de formaldehído y de aproximadamente 25 a 75 gg de desoxicolato de sodio.
En una realización específica, una vacuna de virus fraccionado proporcionada en el presente documento comprende o consiste en una dosis de 0,5 ml que comprende 45 gg de uno o varios polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe proporcionados en el presente documento, ≤ 0,085 mg de octoxinol-10 (TRITON X-100®, ≤ 0,1 mg de hidrogeno succinato de a-tocoferilo, ≤ 0,415 mg de polisorbato 80 (Tween 80), ≤ 0,0016 gg de hidrocortisona, ≤ 0,15 gg de sulfato de gentamicina, ≤ 1,0 de proteína de huevo de gallina (ovoalbúmina), ≤ 50 gg de formaldehído y ≤ 50 gg desoxicolato de sodio. En algunas realizaciones, la vacuna de subunidades de dosis de 0,5 ml se envasa en una jeringa precargada.
En una realización específica, la vacuna de virus fraccionados se prepara utilizando virus de la influenza que se propagó en huevos de gallina embrionados. En otra realización específica, la vacuna de virus fraccionados se prepara utilizando virus de la influenza que no se propagó en huevos de gallina embrionados. En otra realización específica, la vacuna de virus fraccionado se prepara utilizando virus de la influenza que se propagó en células de mamífero, p. ej., células humanas inmortalizadas (véase, p. ej., PCT/EP2006/067566 publicada como documento WO 07/045674 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad) o células de riñón canino tales como células
MDCK (véase, p. ej., PCT/IB2007/003536 publicada como documento WO 08/032219 que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad).
5.14.5 Adyuvantes
En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden, o se administran combinadas con, un adyuvante. El adyuvante para la administración combinado con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento, aumenta, mejora y/o refuerza la respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al polipéptido. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria al polipéptido y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen, p. ej., reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T y estimulación de macrófagos.
En ciertas realizaciones, un adyuvante aumenta la respuesta intrínseca al polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe sin causar cambios conformacionales en el polipéptido que afecten la forma cualitativa de la respuesta. Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, pero sin limitarse a, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado (MPL) (véase el documento Gb 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional Núm. PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional Núm. WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional Núm. PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional Núm. WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); la Patente de Estados Unidos Núm. 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente combinados con inmunoestimulantes, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Tales adyuvantes se pueden utilizar con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, tales como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos, tales como ácido poliglutámico o polilisina, u otros agentes inmunopotenciadores descritos en la Sección 5.4, más arriba. Debe entenderse que diferentes formulaciones de polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe pueden comprender diferentes adyuvantes o pueden comprender el mismo adyuvante.
5.15 Usos profilácticos y terapéuticos
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que utiliza un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento. En una realización específica, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un vector viral que contiene o expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización más, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento o una composición farmacéutica del mismo. En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento utilizado en el método es un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe purificado descrito en el presente documento derivado de una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de insecto.
En una realización específica, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades descrita en el presente documento. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus vivo descrita en el presente documento. En realizaciones particulares, la vacuna de virus vivo comprende un virus atenuado. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus inactivado descrita en el presente documento. En otra realización, un método para inducir una respuesta
inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus fraccionado descrita en el presente documento. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de partículas similares a virus descrita en el presente documento. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina de influenza comprende administrar a un sujeto que lo necesita un virosoma descrito en el presente documento. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria a un polipéptido de hemaglutinina de influenza comprende administrar a un sujeto que lo necesita una bacteria que expresa o modificada genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina de influenza (HA) descrito en el presente documento o una composición del mismo. En ciertas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento utilizado en el método es un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe purificado descrito en el presente documento derivado de una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de insecto.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por cualquier subtipo o cepa del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por un subtipo de virus de la influenza que pertenece a un grupo de HA (p. ej., el Grupo 1, que comprende H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16) y no el otro grupo de HA (p. ej., el Grupo 2, que comprende H3, H4, H7, H10, H14 y H15). Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por un virus de la influenza que pertenece al grupo de HA que consiste en H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 y H2. Alternativamente, la respuesta inmunitaria inducida puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por un virus de la influenza que pertenece al grupo HA que consiste en H3, H4, H14, H10, H15 y H7. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por uno, dos, tres, cuatro o cinco subtipos del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince subtipos del virus de la influenza. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por una o más variantes dentro del mismo subtipo del virus de la influenza.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por los subtipos H1N1 y H2N2. En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento no es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por los subtipos H1N1 y H2N2. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por los subtipos H3N2. En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento no es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza causada por los subtipos H3N2.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por cualquier subtipo o cepa del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por un subtipo de virus de la influenza que pertenece a un grupo de HA y no al otro grupo de HA. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por un virus de la influenza que pertenece al grupo de HA que consiste en H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 y H2. Alternativamente, la respuesta inmunitaria inducida puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por un virus de la influenza que pertenece al grupo de Ha que consiste en H3, H4, H14, H10, H15 y H7. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por cualquiera de uno, dos, tres, cuatro o cinco subtipos del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o
tratar una enfermedad por el virus de la influenza causada por cualquiera de seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince subtipos del virus de la influenza. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza causada por una o más variantes dentro del mismo subtipo del virus de la influenza.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento es eficaz para reducir los síntomas resultantes de una enfermedad/infección por el virus de la influenza. Los síntomas de la enfermedad/infección por el virus de la influenza incluyen, pero sin limitarse a, dolores en el cuerpo (especialmente en las articulaciones y la garganta), fiebre, náuseas, dolores de cabeza, ojos irritados, fatiga, dolor de garganta, ojos o piel enrojecidos y dolor abdominal.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento es eficaz para reducir la hospitalización de un sujeto que padece una enfermedad/infección por el virus de la influenza. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es eficaz para reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que padece una enfermedad/infección por el virus de la influenza.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una infección por el virus de la influenza en un sujeto que utiliza un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición descrita en el presente documento. En una realización, un método para prevenir o tratar una infección por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector que contiene o expresa tal polipéptido, o una composición de uno cualquiera de los anteriores. En una realización específica, un método para prevenir o tratar una infección por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades, una vacuna de virus vivo, una vacuna de virus inactivado, una vacuna de virus fraccionado o una vacuna de partículas similares a virus.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto que utiliza un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector que contiene o expresa tal polipéptido, o células estimuladas con tal polipéptido. En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un vector viral que contiene o expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización más, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o una composición farmacéutica del mismo.
En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades descrita en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus vivo descrita en el presente documento. En realizaciones particulares, la vacuna de virus vivo comprende un virus atenuado. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus inactivado descrita en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus fraccionado descrita en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de partículas similares a virus descrita en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita un virosoma descrito en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una bacteria que expresa o está modificada para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o una composición del mismo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende exponer la hemaglutinina de un virus de la influenza con el que el sujeto no ha tenido contacto previo, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente al virus de la influenza y/o la hemaglutinina del virus de la influenza.
En una realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende administrar a dicho sujeto uno o más virus de la influenza, en donde cada uno de dichos uno o más virus de la influenza comprende un polipéptido de hemaglutinina con el que el sujeto no ha tenido contacto previo, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente a uno o más virus de influenza. En una realización específica, los uno o más virus de influenza son un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y/o H17. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 y (ii) una segunda administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde el virus de influenza de la primera administración es de un subtipo diferente al virus de la influenza de la segunda administración. La primera y la segunda administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, h 15, H16 o H17; (ii) una segunda administración de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17; y (iii) una tercera administración de un virus de influenza del subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde los virus de influenza de las primera, segunda y tercera administración son de diferentes subtipos. La primera, segunda y tercera administración pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
En otra realización, en el presente documento se proporciona un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección por el virus de la influenza que comprende administrar a dicho sujeto uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo, es decir, el sujeto no ha estado expuesto previamente a los uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, dichos uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en una composición (p. ej., una composición que comprende una vacuna). En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en un vector, p. ej., un vector del virus de la influenza. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en una VLP. En ciertas realizaciones, uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza con los que el sujeto no ha tenido contacto previo están en un virosoma. En una realización específica, los uno o más polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza son un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de un virus de la influenza del subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 y/o H17. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o H17 y (ii) una segunda administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde el polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de la primera administración es de un subtipo diferente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de la segunda administración. La primera y segunda administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En otra realización específica, el método comprende (i) una primera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o H17; (ii) una segunda administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17; y (iii) una tercera administración de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, en donde el los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la influenza de la primera, segunda y tercera administración son de diferentes subtipos de virus de la influenza. La primera, segunda y tercera administración pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
En otra realización, el método comprende (i) una primera administración de un primer polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector que contiene o expresa tal polipéptido; y (ii) una segunda administración de un segundo polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), en donde el primer y el segundo polipéptido de HA de la gripe tienen el mismo dominio de tallo. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza globular del primer y segundo polipéptido de HA de la gripe es diferente. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza globular del primer y segundo polipéptidos de HA de la gripe es de la misma cepa. La primera y la segunda administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse al sujeto a intervalos de 6 a 12 meses después de la segunda inoculación.
En otra realización, el método comprende (i) una primera administración de un virus de la influenza; y (ii) una segunda administración de un polipéptido de HA de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), en donde el virus de la influenza y los polipéptidos de HA de la gripe tienen el mismo dominio de tallo. En ciertas realizaciones, el dominio de cabeza globular del virus de la influenza y los polipéptidos de HA de influenza son diferentes. La primera y segunda administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse al sujeto a intervalos de 6 a 12 meses después de la segunda inoculación.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la influenza en un sujeto mediante la administración de anticuerpos neutralizantes descritos en el presente documento. En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo neutralizante descrito en el presente documento, o una composición farmacéutica del mismo. En realizaciones particulares, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo monoclonal. En ciertas realizaciones, el anticuerpo neutralizante no es CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (FERM BP-4517), AI3C (FERM b P-4516) o cualquier otro anticuerpo descrito por Ekiert Dc et al. (2009) en Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicada en Science Express 26 de febrero de 2009); Kashyap et al. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Sui et al. (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273; Patentes de Estados Unidos Núm. 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070, y 6.720.409; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2007/068983 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2007/134237; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/075998 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/036157; Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2007/059356 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2008/028946; y Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/085876 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/079259. En otras realizaciones, el anticuerpo neutralizante no es un anticuerpo descrito por Wang et al. (2010) en "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins", PLOS Pathogens 6(2):1-9.
En ciertas realizaciones, los métodos para prevenir o tratar una enfermedad o infección por el virus de la influenza en un sujeto (p. ej., un animal humano o no humano) proporcionados en el presente dan como resultado una reducción en la replicación del virus de la influenza en el sujeto, medida por ensayos in vivo e in vitro conocidos por los expertos en la técnica y descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la replicación del virus de la influenza se reduce en aproximadamente 1 log o más, aproximadamente 2 log o más, aproximadamente 3 log o más, aproximadamente 4 log o más, aproximadamente 5 log o más, aproximadamente 6 log o más, aproximadamente 7 registros o más, aproximadamente 8 log o más, aproximadamente 9 log o más, aproximadamente 10 log o más, de 1 a 3 log, de 1 a 5 log, de 1 a 8 log, de 1 a 9 log, de 2 a 10 log, de 2 a 5 log, de 2 a 7 log, de 2 log a 8 log, de 2 a 9 log, de 2 a 10 log, de 3 a 5 log, de 3 a 7 log, de 3 a 8 log, de 3 a 9 log, de 4 a 6 log, de 4 a 8 log, de 4 a 9 log, de 5 a 6 log, de 5 a 7 log, de 5 a 8 log, de 5 a 9 log, de 6 a 7 log, de 6 a 8 log, de 6 a 9 log, de 7 a 8 log, de 7 a 9 log, o de 8 a 9 log.
El Ejemplo 9, a continuación, establece cómo se pueden utilizar los polipéptidos quiméricos de HA del virus de la influenza para vacunar sujetos contra la infección por el virus de la influenza.
5.15.1 Terapias combinadas
En diversas realizaciones, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido o un anticuerpo neutralizante se pueden administrar a un sujeto combinados con una o más terapias (p. ej., terapias antivirales, antibacterianas o inmunomoduladoras). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica (p. ej., una composición inmunogénica) descrita en el presente documento se puede administrar a un sujeto combinada con una o más terapias. La una o más terapias diferentes pueden ser beneficiosas en el tratamiento o prevención de una enfermedad por el virus de la influenza o pueden mejorar un síntoma o afección asociados con una enfermedad por el virus de la influenza. En algunas realizaciones, las una o más terapias diferentes son analgésicos, medicamentos contra la fiebre o terapias que alivian o ayudan a la respiración. En ciertas realizaciones, las terapias se administran con menos de 5 minutos de diferencia, con menos de 30 minutos de diferencia, con 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 hora de diferencia, con aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de diferencia, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, con aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, con aproximadamente 12 horas a 18 horas de diferencia, con 18 horas a 24 horas de diferencia, con 24 horas a 36 horas de diferencia, con 36 horas a 48 horas de diferencia, con 48 horas a 52 horas de diferencia, con 52 horas a 60 horas de diferencia, con 60 horas a 72
horas de diferencia, con 72 horas a 84 horas de diferencia, con 84 horas a 96 horas de diferencia, o con 96 horas a 120 horas de diferencia. En realizaciones específicas, se administran dos o más terapias dentro de la misma visita de pacientes.
Se puede utilizar cualquier agente antiviral bien conocido por un experto en la técnica combinado con un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición farmacéutica descrita en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de agentes antivirales incluyen proteínas, polipéptidos, péptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas y moléculas pequeñas que inhiben y/o reducen el anclaje de un virus a su receptor, la internalización de un virus en una célula, la replicación de un virus o la liberación de virus de una célula. En particular, los agentes antivirales incluyen, pero sin limitarse a, análogos de nucleósidos (p. ej., zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina), foscarnet, amantadina, peramivir, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferones alfa y otros interferones, AZT, zanamivir (Relenza®), y oseltamivir (Tamiflu®). Otros agentes antivirales incluyen vacunas contra el virus de la influenza, p. ej., Fluarix® (GlaxoSmithKline), FluMist® (MedImmune Vaccines), Fluvirina® (Chiron Corporation), Flulaval® (GlaxoSmithKline), Afluria® (CSL Biotherapies Inc.), Agriflu® (Novartis) o Fluzone® (Aventis Pasteur).
En realizaciones específicas, el agente antiviral es un agente inmunomodulador que es específico para un antígeno viral. En realizaciones particulares, el antígeno viral es un polipéptido del virus de la influenza distinto de un polipéptido de hemaglutinina. En otras realizaciones, el antígeno viral es un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza.
Se puede utilizar cualquier agente antibacteriano conocido por un experto en la técnica combinado con un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o una composición farmacéutica descrita en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de agentes antibacterianos incluyen Amikacina, Amoxicilina, Amoxicilina-ácido clavulánico, Anfotericina-B, Ampicilina, Ampicilina-sulbactam, Apramicina, Azitromicina, Aztreonam, Bacitracina, Bencilpenicilina, Caspofungina, Cefaclor, Cefadroxilo, Cefalexina, Cefalotina, Cefazolina., Cefdinir, Cefepima, Cefixima, Cefmenoxima, Cefoperazona, Cefoperazona-sulbactam, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpiroma, Cefpodoxima, Cefpodoxima-ácido clavulánico, Cefpodoxima-sulbactam, Cefprozil, Cefquinoma, Ceftazidima, Ceftibutina, Ceftiofur, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cloranfenicol, Florfenicol, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clinafloxacina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Cotrimoxazol (Trimtoprima/sulfametoxazol), Dalbavancina, Dalfopristina/Quinopristina, Daptomicina, Dibekacina, Dicloxacilina, Doripenemo, Doxiciclina, Enrofloxacina, Ertapenemo, Eritromicina, Flucloxacilina, Fluconazol, Flucitosina, Fosfomicina, Ácido fusídico, Garenoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Gentamicina, Imipenemo, Itraconazol, Kanamicina, Ketoconazol, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolid, Loracarbef, Mecillnam (amdinocilina), Meropenemo, Metronidazol, Mezlocilina, Mezlocilina-sulbactam, Minociclina, Moxifloxacina, Mupirocina, Ácido nalidíxico, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantαna, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Pefloxacina, Penicilina V, Piperacilina, Piperacilina-sulbactam, Piperacilina-tazobactam, Rifampicina, Roxitromicina, Esparfloxacina, Espectinomicina, Espiramicina, Estreptomicina, Sulbactam, Sulfametoxazol, Teicoplanina, Telavancina, Telitromicina, Temocilina, Tetraciclina, Ticarcilina, Ticarcilina-ácido clavulánico, Tigeciclina, Tobramicina, Trimetoprima, Trovafloxacina, Tilosina, Vancomicina, Virginamicina y Voriconazol.
En algunas realizaciones, una terapia combinada comprende la inmunización activa con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, o uno o más vectores descritos en las Secciones 5.2- 5.7 y la inmunización pasiva con uno o más anticuerpos neutralizantes descritos en la Sección 5.9. En algunas realizaciones, una terapia combinada comprende la inmunización con uno o más vectores descritos en las Secciones 5.2- 5.7 y la administración de células (p. ej., mediante transferencia adoptiva) descrita en la Sección 5.9.
En algunas realizaciones, una terapia combinada comprende la administración de dos o más vectores diferentes descritos en las Secciones 5.2-5.7.
En algunas realizaciones, una terapia combinada comprende la inmunización activa con un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) que induce una respuesta inmunitaria a uno, dos, tres o más subtipos de HA en un grupo de HA (p. ej., Grupo 1) combinado con un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) que induce una respuesta inmunitaria a uno, dos, tres o más subtipos de HA en el otro grupo de HA (p. ej., Grupo 2).
En algunas realizaciones, una terapia combinada comprende la inmunización activa con dos o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento.
5.15.2 Poblaciones de pacientes
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento se pueden administrar a un sujeto que no ha sido sometido a tratamiento previo, es decir, un sujeto que no tiene una enfermedad causada por una infección por el virus de la influenza o que no ha estado ni está actualmente infectado con una infección por el virus de la influenza. En una realización, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un sujeto que no ha sido sometido a tratamiento previo que corre el riesgo de contraer una infección por el virus de la influenza. En una realización, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un sujeto que no tiene una enfermedad causada por el virus de la influenza específico, o que no ha sido y no está infectado con el virus de la influenza específico frente al que el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe induce una respuesta inmunitaria. También se pueden administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento a un sujeto que está y/o ha estado infectado con el virus de la influenza u otro tipo, subtipo o cepa del virus de la influenza frente al que el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe induce una respuesta inmunitaria.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento se administran a un paciente al que se le ha diagnosticado una infección por el virus de la influenza. En algunas realizaciones, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un paciente infectado con un virus de la influenza antes de que los síntomas se manifiesten o los síntomas se vuelvan graves (p. ej., antes de que el paciente requiera hospitalización). En algunas realizaciones, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un paciente que está infectado o ha sido diagnosticado con un tipo de virus de la influenza diferente al del virus de la influenza a partir del cual se obtuvo el dominio de cabeza del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe del compuesto activo o composición.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento se administran a un paciente que puede estar o está infectado con un virus de influenza que pertenece al mismo grupo de HA que ese del dominio de cabeza del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. En ciertas realizaciones, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un paciente que puede estar o está infectado con un virus de la influenza del mismo subtipo que el del dominio de cabeza del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
En algunas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un ave. En ciertas realizaciones, el animal es un cánido. En ciertas realizaciones, el animal es un félido. En ciertas realizaciones, el animal es un caballo. En ciertas realizaciones, el animal es una vaca. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero, p. ej., un caballo, cerdo, ratón o primate, preferiblemente un ser humano.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es un adulto humano. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es un adulto humano de más de 50 años. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es un sujeto humano de edad avanzada.
En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es un niño humano. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es un lactante humano. En ciertas realizaciones, el sujeto al que se administra un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento no es un lactante de menos de 6 meses de edad. En una realización específica, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento tiene 2 años o menos.
En realizaciones específicas, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal
polipéptido) o composición descrita en el presente documento es cualquier lactante o niño de más de 6 meses de edad y cualquier adulto de más de 50 años de edad. En otras realizaciones, el sujeto es una persona que está embarazada. En otra realización, el sujeto es un individuo que puede estar o estará embarazado durante la temporada de influenza (p. ej., de noviembre a abril). En realizaciones específicas, el sujeto al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es una mujer que ha dado a luz 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas antes.
En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es cualquier individuo con mayor riesgo de infección por el virus de la influenza o enfermedad resultante de la infección por el virus de la influenza (p. ej., un individuo inmunocomprometido o inmunodeficiente). En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es cualquier individuo en contacto cercano con un individuo con mayor riesgo de infección por el virus de la influenza o enfermedad resultante de la infección por el virus de la influenza (p. ej., individuos inmunocomprometidos o inmunodeprimidos).
En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es un individuo afectado por cualquier afección que aumenta la susceptibilidad a la infección por el virus de la influenza o complicaciones o enfermedades resultantes de la infección por el virus de la influenza. En otras realizaciones, un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento se administran a un sujeto en el que una infección por el virus de la influenza tiene el potencial de aumentar las complicaciones de otra afección que afecta al individuo o por la que está en riesgo. En realizaciones particulares, tales afecciones que aumentan la susceptibilidad a las complicaciones del virus de la influenza o para las cuales el virus de la influenza aumenta las complicaciones asociadas con la afección son, p. ej., afecciones que afectan los pulmones, tales como fibrosis quística, enfisema, asma o infecciones bacterianas (p. ej., infecciones causadas por Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, y Chlamydia trachomatus); enfermedades cardiovasculares (p. ej., enfermedad cardíaca congénita, insuficiencia cardíaca congestiva y enfermedad de las arterias coronarias); trastornos endocrinos (p. ej., diabetes), afecciones neurológicas y del desarrollo de las neuronas (p. ej., trastornos del cerebro, la médula espinal, los nervios periféricos y músculos (tales como parálisis cerebral, epilepsia (trastornos convulsivos), accidente cerebrovascular, discapacidad intelectual (p. ej., retraso mental), distrofia muscular y lesión de la médula espinal)).
En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento es un individuo que reside en un hogar grupal, tal como una residencia de ancianos. En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento trabaja o pasa una cantidad significativa de tiempo en un hogar grupal, p. ej., una residencia de ancianos. En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es un trabajador de la salud. (p. ej., un médico o una enfermera). En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento es un fumador. En una realización específica, el sujeto humano al que se le va a administrar un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento está inmunocomprometido o inmunodeprimido.
Además, los sujetos con mayor riesgo de desarrollar complicaciones por la influenza a quienes se les puede administrar un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento incluyen: cualquier individuo que pueda transmitir virus de influenza a aquellos con alto riesgo de complicaciones, tales como, p. ej., miembros de hogares con individuos de alto riesgo, incluidos los hogares que incluirán lactantes menores de 6 meses, individuos que entren en contacto con lactantes menores de 6 meses o individuos que entren en contacto con personas que viven en residencias de ancianos u otros centros asistenciales a largo plazo; individuos con trastornos a largo plazo de los pulmones, el corazón o la circulación; individuos con enfermedades metabólicas (p. ej., diabetes); individuos con trastornos renales; individuos con trastornos de la sangre (incluyendo anemia o enfermedad de células falciformes); individuos con sistemas inmunitarios debilitados (incluida la inmunosupresión causada por medicamentos, enfermedades malignas tales como cáncer, trasplante de órganos o infección por VIH); niños que reciben terapia con aspirina a largo plazo (y, por lo tanto, tienen una mayor probabilidad de desarrollar el síndrome de Reye si están infectados con influenza).
En otras realizaciones, los sujetos para la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente incluyen individuos sanos de seis meses de edad o más, que:
planean viajar a países extranjeros y zonas donde pueden surgir brotes de gripe, tales como, p. ej., los trópicos y el Hemisferio Sur de abril a septiembre; viajan como parte de grandes grupos turísticos organizados que pueden incluir personas de zonas del mundo donde circulan los virus de la influenza; asisten a la escuela o la universidad y residen en dormitorios, o residir en entornos institucionales; o desean reducir su riesgo de enfermarse de influenza.
En algunas realizaciones, el sujeto para el que la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contenga o exprese tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento está contraindicada incluye cualquier individuo para el que esté contraindicada la vacunación contra la influenza, tal como: lactantes menores de seis meses de edad; e individuos que han tenido una reacción anafiláctica (reacciones alérgicas que provocan dificultad para respirar, que a menudo va seguida de choque) a los huevos, productos de huevo u otros componentes utilizados en la producción de la formulación inmunogénica. En ciertas realizaciones, cuando la administración de un compuesto activo o una composición descritos en el presente documento está contraindicada debido a uno o más componentes utilizados en la producción de la formulación inmunogénica (p. ej., debido a la presencia de huevo o productos de huevo), el compuesto activo o la composición pueden ser producidos de una manera que no incluya el componente que hace que la administración de un compuesto activo o composición esté contraindicada (p. ej., el compuesto activo o composición pueden ser producidos sin el uso de huevos o productos de huevo).
En algunas realizaciones, puede ser aconsejable no administrar una vacuna de virus vivo a una o más de las siguientes poblaciones de pacientes: seres humanos de edad avanzada; lactantes menores de 6 meses; individuos embarazados; lactantes menores de 1 año; niños menores de 2 años; niños menores de 3 años; niños menores de 4 años; niños menores de 5 años; adultos menores de 20 años; adultos menores de 25 años; adultos menores de 30 años; adultos menores de 35 años; adultos menores de 40 años; adultos menores de 45 años; adultos menores de 5 años; seres humanos de edad avanzada mayores de 70 años; seres humanos de edad avanzada años; seres humanos de edad avanzada
mayores de 80 años; seres humanos de edad avanzada años; seres humanos de edad avanzada mayores de 90 años; seres humanos de edad avanzada años; niños y adolescentes (de 2 a 17 años de edad) que reciben aspirina o medicamentos que contienen aspirina, debido a las complicaciones asociadas con la aspirina y las infecciones por el virus de la influenza de tipo salvaje en este grupo de edad; individuos con antecedentes de asma u otras enfermedades reactivas de las vías respiratorias; individuos con afecciones médicas subyacentes crónicas que pueden predisponerles a infecciones graves por influenza; individuos con antecedentes de síndrome de Guillain-Barré; individuos con enfermedad grave aguda con fiebre; o personas que están moderada o gravemente enfermas. Para tales individuos, puede preferirse la administración de vacunas de virus inactivados, vacunas de virus fraccionados, vacunas de subunidades, virosomas, partículas similares a virus o los vectores no virales descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, los sujetos a los que se les administra preferiblemente una vacuna de virus vivo pueden incluir niños y adolescentes sanos, de 2 a 17 años de edad, y adultos sanos, de 18 a 49 años de edad.
En ciertas realizaciones, una formulación inmunogénica que comprende un vector de virus vivo no se administra simultáneamente con otras vacunas de virus vivo.
5.16 Modos de administración
5.16.1 Vías de suministro
Un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento
(p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o la composición descrita en el presente documento se pueden suministrar a un sujeto por una variedad de vías. Estas incluyen, pero no se limitan a, vías intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, conjuntival y subcutánea. En algunas realizaciones, se formula una composición para administración tópica, por ejemplo, para la aplicación sobre la piel. En realizaciones específicas, la vía de administración es nasal, p. ej., como parte de una pulverización nasal. En ciertas realizaciones, se formula una composición para administración intramuscular. En algunas realizaciones, se formula una composición para administración subcutánea. En ciertas realizaciones, una composición no se formula para administración por inyección.
En realizaciones específicas para vacunas de virus vivos, la vacuna se formula para su administración por una vía distinta a la inyección.
En los casos en que el antígeno sea un vector viral, un vector de partículas similar a un virus o un vector bacteriano, por ejemplo, puede ser preferible introducir una composición inmunogénica a través de la vía natural de infección del virus o bacteria troncales de los que proviene el vector. Alternativamente, puede ser preferible introducir un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a través de la vía natural de infección del virus de la influenza del que se deriva el polipéptido. Se puede utilizar ventajosamente la capacidad de un antígeno, en particular un vector viral, para inducir una vigorosa respuesta inmunitaria secretora y celular. Por ejemplo, la infección del tracto respiratorio por un vector viral puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria secretora, por ejemplo, en el sistema urogenital, con protección concomitante contra el virus de la influenza. Adicionalmente, en una realización preferida, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas en los pulmones por cualquier vía adecuada. También puede emplearse
la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante para uso como pulverización.
En una realización específica, se administra por vía intramuscular una vacuna de subunidades. En otra realización, se administra por vía intranasal una vacuna viva contra el virus de la influenza. En otra realización, se administra por vía intramuscular una vacuna de virus de la influenza inactivada o una vacuna de virus de la influenza fraccionada. En otra realización, se administran por vía intramuscular una partícula similar a un virus o una composición de la misma.
En algunas realizaciones, las células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento in vitro pueden introducirse (o reintroducirse) en un sujeto utilizando mecanismos conocidos por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, las células pueden introducirse en la dermis, debajo de la dermis o en el torrente sanguíneo periférico. En algunas realizaciones, las células introducidas en un sujeto son preferiblemente células derivadas de ese sujeto, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. En otras realizaciones, también se pueden utilizar células que derivan de un anfitrión donante que tiene antecedentes inmunitarios similares.
También se pueden utilizar otras células, incluidas las diseñadas para evitar una respuesta inmunogénica adversa.
5.16.2 Dosificación y frecuencia de administración
La cantidad de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o composición que será eficaz en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la influenza o una enfermedad por el virus de la influenza dependerá de la naturaleza de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.
La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la gravedad de la infección o enfermedad que provoca, y deberá decidirse a juicio del facultativo y de las circunstancias de cada sujeto. Por ejemplo, las dosis eficaces también pueden variar según el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente (incluida la edad, el peso corporal, la salud), si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico. o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, incluidos los mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento se titulan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.
En ciertas realizaciones, se emplea un ensayo in vitro para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba en modelos animales o in vitro.
Las dosis ejemplares para los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento oscilan entre aproximadamente 10 ng y 1 g, entre 100 ng y 100 mg, entre 1 gg y 10 mg o entre 30 y 300 gg de ácido nucleico, p. ej., ADN, por paciente.
En ciertas realizaciones, las dosis ilustrativas para un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., como se proporciona en vacunas de virus fraccionados y vacunas de subunidades) oscilan entre aproximadamente 5 gg y 100 mg, entre 15 gg y 50 mg, entre 15 gg y 25 mg, 15 gg y 10 mg, 15 gg y 5 mg, 15 gg y 1 mg, 15 gg y 100 gg, 15 gg y 75 gg, 5 gg y 50 gg, 10 gg y 50 gg, 15 gg y 45 gg, 20 gg y 40 gg, o entre 25 y 35 gg por kilogramo de paciente. En otras realizaciones, las dosis ilustrativas para el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe oscilan entre aproximadamente 1 gg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 5 gg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 gg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 5 gg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 25 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 10 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 5 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 1 mg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 100 gg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 75 gg, entre aproximadamente 5 gg y aproximadamente 50 gg, entre aproximadamente 10 gg y aproximadamente 50 gg, entre aproximadamente 15 gg y aproximadamente 45 gg, entre aproximadamente 20 gg y aproximadamente 40 gg, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 35 gg de polipéptido de hemaglutinina (HA) de gripe por dosis, y se puede administrar a un sujeto una, dos, tres o más veces con intervalos tan a menudo como sea necesario.
Las dosis para vectores virales infecciosos pueden variar de 10 a 100 o más viriones por dosis. En algunas realizaciones, las dosificaciones adecuadas de un vector de virus son 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 o 1012 ufp, y se puede administrar a un sujeto una, dos, tres o más veces con intervalos tan a menudo como sea necesario.
En ciertas realizaciones, las dosis ilustrativas para las VLP varían de aproximadamente 0,01 gg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 5 gg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 1 mg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 100 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 75 gg, de aproximadamente 5 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 45 gg, de
aproximadamente 20 gg a aproximadamente 40 gg, o aproximadamente 25 a aproximadamente 35 gg por kilogramo del paciente.
En una realización, una vacuna inactivada se formula de manera que contiene de aproximadamente 5 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 100 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 75 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 15 gg a aproximadamente 30 gg, de aproximadamente 20 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 25 gg a aproximadamente 40 gg, de aproximadamente 25 gg a aproximadamente 35 gg de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo, es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido o composición se administran a un sujeto una vez como una sola dosis.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo o composición se administran a un sujeto como una dosis única seguida de una segunda dosis de 3 a 6 semanas más tarde. En ciertas realizaciones, un compuesto activo o composición se administran a un sujeto como una dosis única seguida de una segunda dosis de 3 a 6 semanas más tarde, que es seguida por la administración de una tercera dosis de 3 a 6 semanas más tarde. En ciertas realizaciones, la segunda y/o la tercera administración pueden utilizar un compuesto activo o una composición diferentes. Según estas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse al sujeto a intervalos de 6 a 12 meses después de la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar un compuesto activo o composición diferentes. En ciertas realizaciones, la primera administración (cebado) comprende una hemaglutinina de longitud completa o un fragmento de la misma (o un ácido nucleico que la codifica) y la segunda administración (refuerzo) comprende la administración de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica el mismo, una VLP que comprende el mismo, o un virus o bacteria que expresan el mismo). En algunas realizaciones, la administración del mismo compuesto activo o composición puede repetirse y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En ciertas realizaciones, un compuesto activo o composición se administran a un sujeto como una dosis única una vez al año.
En realizaciones específicas para la administración a niños, se administran dos dosis de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o composición, administrados al menos con un mes de diferencia, a un niño. En realizaciones específicas para la administración a adultos, se administra una sola dosis. En otra realización, se administran a un adulto dos dosis de un compuesto activo o composición, administradas con al menos un mes de diferencia. En otra realización, a un niño pequeño (de seis meses a nueve años) se le puede administrar un compuesto activo o una composición por primera vez en dos dosis administradas con un mes de diferencia. En una realización particular, un niño que recibió solo una dosis en su primer año de vacunación debe recibir dos dosis en el año siguiente. En algunas realizaciones, se prefieren dos dosis administradas con 4 semanas de diferencia para niños de 2 a 8 años de edad a quienes se les administra una vacuna contra la influenza, p. ej., una formulación inmunogénica descrita en el presente documento, por primera vez. En ciertas realizaciones, para niños de 6 a 35 meses de edad, puede preferirse media dosis (0,25 ml), en contraste con 0,5 ml, que puede preferirse para sujetos mayores de tres años.
En una realización específica, para la administración a lactantes humanos, se administran a un lactante dos dosis de polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento (véase la Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento, en donde el dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizado en la primera dosis es de una cepa o subtipo diferentes al dominio de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizado en la segunda dosis. La primera y segunda administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
En una realización específica, para la administración a lactantes humanos, se administran a un lactante tres dosis de polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento (véase la Sección 5.1, más abajo) o una composición de los mismos y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLP o virosomas descritos en el presente documento, en donde los dominios de cabeza de hemaglutinina del virus de la influenza de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizados en la primera, segunda y tercera dosis son de diferentes cepas o subtipos del virus de la influenza. La primera, segunda y tercera administración pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
En realizaciones particulares, un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica tal polipéptido, un vector (p. ej., un vector viral, o una bacteria) que contiene o expresa tal polipéptido, células estimuladas con tal polipéptido) o composición se administran a un sujeto en otoño o invierno, es decir, antes o durante la temporada de influenza en cada hemisferio. En una realización, a los niños se les administra su primera dosis al principio de la temporada, p. ej., finales de septiembre o
principios de octubre en el hemisferio Norte, para que la segunda dosis pueda administrarse antes del pico de la temporada de influenza.
Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más normalmente entre 0,01 y 5 mg/kg, del peso corporal del paciente. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg o dentro del rango de 70-700 mg respectivamente, para un paciente de 70 kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses durante un período de un año o durante varios años, o durante intervalos de varios años. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los rangos indicados. El anticuerpo generalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como lo indica la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpos contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en el paciente.
5.17 Ensayos biológicos
5.17.1 Ensayos para probar la actividad de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza
Los ensayos para probar la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en un vector divulgado en el presente documento pueden realizarse utilizando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, un ensayo para determinar la incorporación en un vector viral comprende el cultivo del virus como se describe en esta sección o en las Secciones 5.4 o 5.5, la purificación de las partículas virales por centrifugación a través de un lecho de sacarosa y el posterior análisis de la expresión del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe por medio de un inmunoensayo, tal como transferencia Western, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos para determinar si un polipéptido de hemaglutinina es quimérico son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en el presente documento (véanse, p. ej., los Ejemplos 3 y 4 a continuación).
En una realización, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe divulgado en el presente documento se analiza para determinar el plegamiento y la funcionalidad adecuados probando su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo neutralizante dirigido a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza, tal como la región de tronco del polipéptido, utilizando cualquier ensayo para determinar la interacción anticuerpo-antígeno conocido en la técnica. Los anticuerpos neutralizantes para su uso en tales ensayos incluyen, por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes descritos por Ekiert et al., 2009, Science Express, 26 de febrero de 2009; Kashyap et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105: 5986-5991; Sui et al. 2009, Nature Structural and Molecular Biology, 16: 265-273; Wang et al., 2010, PLOS Patogens 6(2):1-9; Patentes de Estados Unidos Núm. 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070, y 6.720.409; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2007/068983 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2007/134237; Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/075998 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/036157; Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2007/059356 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2008/028946; y Solicitud Internacional Núm. PCT/US2008/085876 publicada como Publicación Internacional Núm. WO 2009/079259. Estos anticuerpos incluyen CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (FERM BP-4517), AI3C (FERM BP-4516), entre otros.
En otra realización, se analiza el plegamiento adecuado de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe divulgado en el presente documento mediante la determinación de la estructura o conformación del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe utilizando cualquier método conocido en la técnica, tal como, p. ej., RMN, métodos cristalográficos de rayos X o métodos de predicción de estructuras secundarias, p. ej., dicrαsmo circular.
5.17.2 Ensayos para probar la actividad de los anticuerpos generados utilizando polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza
Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden caracterizar en una variedad de formas conocidas por los expertos en la técnica (p. ej., ELISA, visualización de resonancia de Plasmones de Superficie (BIAcore), transferencia Western, inmunofluorescencia, inmunotinción y/o ensayos de microneutralización). En algunas realizaciones, se analiza la capacidad de los anticuerpos para unirse específicamente a un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o a un vector que comprende dicho polipéptido. Tal ensayo se puede realizar en solución (p. ej., Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421), sobre cuentas (Lam, 1991, Nature 354:82 84), sobre chips (Fodor, 1993, Nature 364:555556), sobre bacterias (Patente de Estados Unidos Núm. 5.223.409), sobre esporas (Patente de Estados Unidos Núm. 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), sobre plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869) o sobre fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386 390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310) (cada una de estas referencias se incorpora al presente documento en su totalidad como referencia).
La unión específica de un anticuerpo al polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y la reactividad cruzada con otros antígenos pueden evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden utilizar para analizar la unión específica y la reactividad cruzada incluyen, pero sin limitarse a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo algunos. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad).
La afinidad de unión de un anticuerpo a un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y la tasa de disociación anticuerpo-antígeno pueden determinarse mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado (p. ej., 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo por un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y las tasas de disociación de unión pueden determinarse a partir de los datos mediante análisis de gráfico de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo también se puede determinar utilizando radioinmunoensayos. En este caso, se incuba un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe con el anticuerpo de prueba conjugado con un compuesto marcado (p. ej., 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no marcado.
En ciertas realizaciones, la afinidad de unión del anticuerpo y las constantes de velocidad se miden utilizando el Sistema KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). En algunas realizaciones, se utiliza el análisis de resonancia de plasmones de superficie (p. ej., cinética BIAcore) para determinar las tasas de asociación y disociación de la unión de los anticuerpos a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y la disociación de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe de chips con anticuerpos inmovilizados contra un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en su superficie. Un estudio cinético BIAcore típico implica la inyección de 250 μL de un reactivo de anticuerpo (mAb, Fab) a una concentración variable en tampón HBS que contiene Tween-20 al 0,005% sobre la superficie de un chip sensor, sobre el que se ha inmovilizado el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. El caudal se mantiene constante a 75 μl/min. Los datos de disociación se recopilan durante 15 minutos o más, según sea necesario. Después de cada ciclo de inyección/disociación, el anticuerpo unido se elimina de la superficie del polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza utilizando pulsos breves de 1 min de ácido diluido, típicamente HCl 10-100 mM, aunque se emplean otros regenerantes según lo justifiquen las circunstancias. Más específicamente, para la medición de las tasas de asociación, kon, y disociación, koff, el polipéptido se inmoviliza directamente sobre la superficie del chip sensor mediante el uso de químicas de acoplamiento de amina convencionales, a saber, el método EDC/NHS (EDC = N-dietilaminopropil)-carbodiimida). Brevemente, se prepara una solución 5-100 nM del polipéptido en NaOAc 10 mM, pH 4 o pH 5 y se pasa sobre la superficie activada por EDC/NHS hasta que se inmovilizan aproximadamente 30-50 UR de polipéptido. Después de esto, se "elimina la protección terminal" de los ésteres activos sin reaccionar con una inyección de Et-NH21M. Se prepara una superficie de blanco, que no contiene polipéptido, en condiciones de inmovilización idénticas con fines de referencia. Una vez que se ha preparado una superficie adecuada, se prepara una serie de diluciones adecuadas de cada uno de los reactivos de anticuerpos en HBS/Tween-20, y se pasa sobre las superficies del polipéptido y de la célula de referencia, que se conectan en serie. El rango de concentraciones de anticuerpos que se preparan varía, dependiendo de la que se estime que es la constante de unión en equilibrio, Kd . Como se describió anteriormente, el anticuerpo unido se elimina después de cada ciclo de inyección/disociación utilizando un regenerante apropiado.
La actividad neutralizante de un anticuerpo se puede determinar utilizando cualquier ensayo conocido por los expertos en la técnica. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden someter a ensayo para determinar su capacidad para inhibir la unión de un virus de la influenza, o cualquier otra composición que comprenda un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., una VLP, liposoma o extracto de detergente), a su receptor de la célula anfitriona (es decir, ácido siálico) utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células que expresan receptores del virus de la influenza pueden ponerse en contacto con una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en presencia o ausencia del anticuerpo y se puede medir la capacidad del anticuerpo para inhibir la unión del antígeno, p. ej., mediante citometría de flujo o un ensayo de centelleo. La composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe o el anticuerpo se puede marcar con un compuesto detectable tal como una marca radiactiva (p. ej., 32P, 35S, 125I) o un marcador fluorescente (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre la composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y un receptor celular. Alternativamente, se puede determinar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a su receptor en ensayos libres de células. Por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza se puede poner en contacto con un anticuerpo y se puede determinar la capacidad del anticuerpo para inhibir la unión de la composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a un receptor celular. En una realización específica, el anticuerpo se inmoviliza sobre un soporte sólido y la composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza se marca con un compuesto detectable. Alternativamente, se inmoviliza sobre un soporte sólido una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y el anticuerpo se
marca con un compuesto detectable. En ciertas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la unión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe a un receptor celular se determina evaluando el porcentaje de inhibición de la unión del anticuerpo con respecto a un control (p. ej., un anticuerpo que se sabe que inhibe la unión del péptido de hemaglutinina (HA) de la gripe al receptor celular).
En otras realizaciones, un anticuerpo adecuado para su uso en los métodos descritos en el presente documento no inhibe la unión del receptor del virus de la influenza, pero aún se encuentra que es neutralizante en un ensayo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo adecuado para su uso según los métodos descritos en el presente documento reduce o inhibe la fusión virus-membrana del anfitrión en un ensayo conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
En una realización, la fusión virus-membrana del anfitrión se analiza en un ensayo in vitro utilizando un virus de la influenza que contiene un informador y una célula anfitriona capaz de infectarse con el virus. Un anticuerpo inhibe la fusión si la actividad informadora se inhibe o se reduce en comparación con un control negativo (p. ej., actividad informadora en presencia de un anticuerpo de control o en ausencia de anticuerpo).
En una realización, la fusión virus-membrana del anfitrión se detecta utilizando un sistema modelo de fusión celular. En un ensayo de fusión celular ilustrativo, las células (p. ej., células HeLa) se transfectan con un plásmido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe y se ponen en contacto y se exponen a un tampón que permite la función de fusión del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., tampón de pH 5,0) en presencia de un anticuerpo. Un anticuerpo es neutralizante si reduce o inhibe la formación de sincitios en comparación con un control negativo (p. ej., formación de sincitios en presencia de un anticuerpo de control o en ausencia de anticuerpo).
En otras realizaciones, la fusión virus-membrana del anfitrión se analiza usando un ensayo in vitro basado en liposomas. En un ensayo ilustrativo, el receptor de la célula anfitriona se reconstituye en liposomas que contienen la mitad de un informador. Un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se reconstituye en otro conjunto de liposomas que contienen otra mitad de un informador. Cuando las dos poblaciones de liposomas se mezclan, la fusión se detecta mediante la reconstitución del informador, p. ej., una reacción enzimática que se puede detectar colorimétricamente. El anticuerpo inhibe la fusión si la actividad informadora se reduce o inhibe en comparación con la actividad informadora en un ensayo realizado en ausencia de anticuerpo o en presencia de un anticuerpo de control. En ciertas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la fusión se determina evaluando el porcentaje de fusión en presencia del anticuerpo con respecto al porcentaje de fusión en presencia de un control.
5.17.3 Ensayos para probar la actividad de las células estimuladas
Las células estimuladas según los métodos descritos en el presente documento pueden analizarse, por ejemplo, para determinar la integración, transcripción y/o expresión del polinucleótido o el gen o genes de interés, el número de copias del gen integrado y la ubicación de la integración. Tal análisis se puede realizar en cualquier momento y se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. En otras realizaciones, la estimulación satisfactoria de la célula diana con un polipéptido de hemaglutinina (HA) de gripe descrito en el presente documento se determina detectando la producción de anticuerpos neutralizantes contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) de gripe utilizando métodos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, los sujetos en los que se administran las células estimuladas, p. ej., CD, se pueden analizar para determinar la ubicación de las células, la expresión de un polinucleótido suministrado por el vector o el gen que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe, la estimulación de una respuesta inmunitaria (p. ej., la producción de anticuerpos neutralizantes contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe) y/o controlar los síntomas asociados con la infección por el virus de la influenza o una enfermedad asociada a la misma mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
Los ensayos de informador se pueden utilizar para determinar la especificidad del direccionamiento del polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe. Por ejemplo, se puede obtener una población mixta de células de médula ósea de un sujeto y cultivarlas in vitro. El polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe se puede administrar a la población mixta de células de médula ósea, y se puede analizar la expresión de un gen informador asociado con el polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe en las células cultivadas. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente 60%, 70%, 80% o 90%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de las células estimuladas en la población de células mixtas son células dendríticas.
5.17.4 Ensayos de actividad antiviral
Los anticuerpos descritos en el presente documento o sus composiciones pueden evaluarse in vitro para determinar la actividad antiviral. En una realización, los anticuerpos o sus composiciones se prueban in vitro para determinar su efecto sobre el crecimiento de un virus de la influenza. El crecimiento del virus de la influenza puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento (p. ej., en cultivo celular). En una realización específica, las células se infectan a una MOI de 0,0005 y 0,001,0,001 y 0,01,0,01 y 0,1, 0,1 y 1, o 1 y 10, o una MOI de 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 y se incuban con medio libre de suero complementado. Los títulos virales se determinan en el sobrenadante mediante placas de hemaglutinina o cualquier otro ensayo viral descrito en el presente documento. Las células en las que se pueden evaluar los títulos virales
incluyen, entre otras, células EFK-2, células Vero, células MDCK, células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVEC), línea celular epitelial humana H292 y células HeLa. Los ensayos in vitro incluyen aquellos que miden la replicación viral alterada (según lo determinado, p. ej., por la formación de placa) o la producción de proteínas virales (según lo determinado, p. ej., por análisis de transferencia Western) o ARN viral (según lo determinado, p. ej., por RT-PCR o análisis de transferencia northern) en células cultivadas in vitro utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica o descritos en el presente documento.
En un ejemplo no limitante, una monocapa de la línea celular de mamífero diana se infecta con diferentes cantidades (p. ej., multiplicidad de 3 unidades formadoras de placa (ufp) o 5 ufp) de virus (p. ej., influenza) y posteriormente se cultiva en presencia o ausencia de varias diluciones de anticuerpos (p. ej., 0,1 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml o 10 μg/ml). Los cultivos infectados se cosechan 48 horas o 72 horas después de la infección y se titulan mediante ensayos de placa convencionales conocidos en la técnica sobre la línea celular diana adecuada. (p. ej., células Vero).
En un ejemplo no limitante de un ensayo de hemaglutinación, las células se ponen en contacto con un anticuerpo y se infectan simultáneamente o posteriormente con el virus (p. ej., a una MOI de 1) y el virus se incuba en condiciones que permitan la replicación del virus (p. ej., 20-24 horas). Los anticuerpos están preferiblemente presentes durante todo el curso de la infección. A continuación, se determina la replicación viral y la liberación de partículas virales mediante ensayos de hemaglutinación utilizando glóbulos rojos de pollo al 0,5%. Véase, p. ej., Kashyap et al., PNAS USA 105: 5986-5991. En algunas realizaciones, un compuesto se considera un inhibidor de la replicación viral si reduce la replicación viral en al menos 2 pocillos de HA, lo que equivale aproximadamente a una reducción de 75% en el título viral. En realizaciones específicas, un inhibidor reduce el título viral en este ensayo en 50% o más, en 55% o más, en 60% o más, en 65% o más, en 70% o más, en 75% o más, en 80% o más, en 85% o más, en 90% o más, o en 95% o más. En otras realizaciones específicas, un inhibidor da como resultado una reducción de aproximadamente 1 log o más, aproximadamente 2 log o más, aproximadamente 3 log o más, aproximadamente 4 log o más, aproximadamente 5 log o más, aproximadamente 6 log o más, aproximadamente 7 log o más, aproximadamente 8 log o más, aproximadamente 9 log o más, aproximadamente 10 log o más, de 1 a 3 log, de 1 a 5 log, de 1 a 8 log, de 1 a 9 log, de 2 a 10 log, de 2 a 5 log, de 2 a 7 log, de 2 log a 8 log, de 2 a 9 log, de 2 a 10 log, de 3 a 5 log, de 3 a 7 log, de 3 a 8 log, de 3 a 9 log, de 4 a 6 log, de 4 a 8 log, de 4 a 9 log, de 5 a 6 log, de 5 a 7 log, de 5 a 8 log, de 5 a 9 log, de 6 a 7 log, de 6 a 8 log, de 6 a 9 log, de 7 a 8 log, de 7 a 9 log, de o 8 a 9 log en el título del virus de la influenza en el sujeto. La reducción logarítmica en el título del virus de la influenza puede compararse con un control negativo, compararse con otro tratamiento o compararse con el título del paciente antes de la administración del anticuerpo.
5.17.5 Ensayos de citotoxicidad
Se pueden utilizar muchos ensayos bien conocidos en la técnica para evaluar la viabilidad de células (infectadas o no infectadas) o líneas celulares después de la exposición a un compuesto activo o una composición del mismo y, por lo tanto, determinar la citotoxicidad del compuesto o composición. Por ejemplo, la proliferación celular se puede analizar midiendo la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) (Véanse, p. ej., Hoshino et al., 1986, Int. J. Cáncer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79), la incorporación de timidina (3H) (Véanse, p. ej., Chen, J., 1996, Oncogen 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73), mediante recuento celular directo o mediante la detección de cambios en la transcripción, traducción o actividad de genes conocidos tales como protooncogenes (p. ej., fos, myc) o marcadores del ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, D1, D2, D3, E, etc). Los niveles de tal proteína y ARNm y la actividad pueden determinarse mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína se puede cuantificar mediante métodos de inmunodiagnóstico conocidos tales como ELISA, transferencia Western o inmunoprecipitación utilizando anticuerpos, incluidos los disponibles comercialmente. El ARNm se puede cuantificar utilizando métodos que son bien conocidos y rutinarios en la técnica, por ejemplo, utilizando análisis northern, protección de RNasa o reacción en cadena de la polimerasa con respecto a la transcripción inversa. La viabilidad celular se puede evaluar utilizando tinción con azul de tripano u otros marcadores de viabilidad o muerte celular conocidos en la técnica. En una realización específica, el nivel de ATP celular se mide para determinar la viabilidad celular.
En realizaciones específicas, la viabilidad celular se mide en períodos de tres y siete días utilizando un patrón de ensayo en la técnica, como el kit de ensayo CellTiter-Glo (Promega) que mide los niveles de ATP intracelular. Una reducción del ATP celular es indicativa de un efecto citotóxico. En otra realización específica, la viabilidad celular se puede medir en el ensayo de captación de rojo neutro. En otras realizaciones, la observación visual de los cambios morfológicos puede incluir agrandamiento, granularidad, células con bordes irregulares, apariencia pelicular, redondeo, desprendimiento de la superficie del pocillo u otros cambios. A estos cambios se les da una designación de T (100% tóxico), PVH (parcialmente tóxico-muy pesado-80%), PH (parcialmente tóxico-pesado-60%), P (parcialmente tóxico-40%), Ps (parcialmente tóxico-leve-20%), o 0 (ninguna toxicidad-0%), conforme al grado de citotoxicidad observado. La concentración inhibidora de células (citotóxica) de 50% (CI50) se determina mediante el análisis de regresión de estos datos.
En una realización específica, las células utilizadas en el ensayo de citotoxicidad son células animales, incluidas células primarias y líneas celulares. En algunas realizaciones, las células son células humanas. En ciertas realizaciones, la citotoxicidad se evalúa en una o más de las siguientes líneas celulares: U937, una línea celular de monocitos humanos; células mononucleares primarias de sangre periférica (PBMC); Huh7, una línea celular de
hepatoblastoma humano; 293T, una línea celular de riñón embrionario humano; y THP-1, células monocíticas. En ciertas realizaciones, la citotoxicidad se evalúa en una o más de las siguientes líneas celulares: MDCK, MEF, Huh 7.5, Detroit o células epiteliales traqueobronquiales humanas (HTBE).
Los compuestos activos o sus composiciones se pueden probar para determinar la toxicidad en vivo en modelos animales. Por ejemplo, los modelos animales, descritos en el presente documento y/u otros conocidos en la técnica, utilizados para probar las actividades de los compuestos activos también se pueden utilizar para determinar la toxicidad in vivo de estos compuestos. Por ejemplo, a los animales se les administra un rango de concentraciones de compuestos activos. Posteriormente, los animales son controlados a lo largo del tiempo en cuanto a letalidad, pérdida de peso o falta de aumento de peso, y/o niveles de marcadores séricos que pueden ser indicativos de daño tisular (p. ej., nivel de creatina fosfocinasa como indicador de daño tisular general, nivel de transaminasa de ácido glutámico oxálico o transaminasa de ácido pirúvico como indicadores de posible daño hepático). Estos ensayos in vivo también pueden adaptarse para probar la toxicidad de varios modos y/o regímenes de administración además de las dosificaciones.
La toxicidad y/o eficacia de un compuesto activo pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La razón de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la razón DL50/DE50. Se prefiere un compuesto activo que muestre grandes índices terapéuticos. Si bien se puede utilizar un compuesto activo que muestre efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de suministro que dirija dichos agentes al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden utilizar para formular un rango de dosificación de un compuesto activo para su uso en seres humanos. La dosificación de tales agentes se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto activo utilizado en un método descrito en el presente documento, la dosis eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. En el presente documento se proporciona información adicional sobre la determinación de la dosificación.
Adicionalmente, se puede utilizar cualquier ensayo conocido por los expertos en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de los compuestos activos y las composiciones descritos en el presente documento, p. ej., midiendo la infección viral o una afección o síntomas asociados con la misma.
5.17.6 Actividad antiviral in vivo
Los compuestos activos y sus composiciones se analizan preferiblemente in vivo para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, se pueden utilizar análisis in vivo para determinar si es preferible administrar un compuesto activo o una composición del mismo y/u otra terapia. Por ejemplo, para evaluar el uso de un compuesto activo o una composición del mismo para prevenir una enfermedad por el virus de la influenza, la composición se puede administrar antes de que el animal se infecte con el virus de la influenza. Como alternativa, o, además, se puede administrar al animal un compuesto activo o una composición del mismo al mismo tiempo que el animal está infectado con el virus de la influenza. Para evaluar el uso de un compuesto activo o una composición del mismo para tratar una infección por el virus de la influenza o una enfermedad asociada con el mismo, el compuesto o la composición pueden administrarse después de infectar al animal con el virus de la influenza. En una realización específica, un compuesto activo o una composición del mismo se administran al animal más de una vez.
Los compuestos activos y las composiciones de los mismos pueden probarse para determinar la actividad antiviral en sistemas de modelos animales que incluyen, pero sin limitarse a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, hurones, cabras, ovejas, perros, conejos, cobayas, etc. En una realización específica, los compuestos activos y las composiciones de los mismos se prueban en un sistema modelo de ratón. Tales sistemas modelo son ampliamente utilizados y bien conocidos por los expertos en la técnica. En una realización específica, los compuestos activos y las composiciones de los mismos se prueban en un sistema modelo de ratón. En esta sección se proporcionan ejemplos no limitantes de modelos animales para el virus de la influenza.
En general, los animales se infectan con el virus de la influenza y, al mismo tiempo o posteriormente, se tratan con un compuesto activo o una composición del mismo, o un placebo. Alternativamente, los animales se tratan con un compuesto activo o una composición del mismo o un placebo y posteriormente se infectan con el virus de la influenza. Las muestras obtenidas de estos animales (p. ej., suero, orina, esputo, semen, saliva, plasma o muestra de tejido) se pueden probar para determinar la replicación viral a través de métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., aquellos
que miden títulos virales alterados (según lo determinado, p. ej., por la formación de placa), la producción de proteínas virales (según lo determinado, p. ej., por transferencia Western, ELISA o análisis de citometría de flujo) o la producción de ácidos nucleicos virales (según lo determinado, p. ej., por RT-PCR o análisis de transferencia northern). Para la cuantificación de virus en muestras de tejido, las muestras de tejido se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y las diluciones de los productos homogeneizados clarificados se adsorben durante 1 hora a 37 °C sobre monocapas de células (p. ej., células Vero, CEF o MDCK). En otros ensayos, las evaluaciones histopatológicas se realizan después de la infección, preferiblemente evaluaciones del órgano u órganos que se sabe que el virus elige como diana para la infección. La inmunohistoquímica del virus se puede realizar utilizando un anticuerpo monoclonal específico del virus.
El efecto de un compuesto activo o composición del mismo sobre la virulencia de un virus también se puede determinar utilizando ensayos in vivo en los que se evalúan el título del virus en un sujeto infectado al que se administró un compuesto activo o una composición del mismo, la duración de la supervivencia de un sujeto infectado al que se administró un compuesto activo o una composición del mismo, la respuesta inmunitaria en un sujeto infectado al que se administró un compuesto activo o una composición del mismo, el número, la duración y/o la gravedad de los síntomas en un sujeto infectado al que se le administró un compuesto activo o una composición del mismo, y/o el período de tiempo antes de la aparición de uno o más síntomas en un sujeto infectado al que se le administró un compuesto activo o una composición del mismo. Se pueden utilizar mecanismos conocidos por un experto en la técnica para medir tales efectos. En ciertas realizaciones, un compuesto activo o una composición del mismo da como resultado una cantidad de 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces de 125 veces, 150 veces, 175 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 750 veces o 1.000 veces o más de reducción en el título del virus de la influenza con respecto a un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, un compuesto activo o una composición del mismo da como resultado una reducción en el título del virus de la influenza con respecto a un sujeto no tratado de aproximadamente 1 log o más, aproximadamente 2 log o más, aproximadamente 3 log o más, aproximadamente 4 log o más, aproximadamente 5 log o más, aproximadamente 6 log o más, aproximadamente 7 log o más, aproximadamente 8 log o más, aproximadamente 9 log o más, aproximadamente 10 log o más, 1 a 3 log, 1 a 5 log, 1 a 8 log, 1 a 9 log, 2 a 10 log, 2 a 5 log, 2 a 7 log, 2 log a 8 log, 2 a 9 log, 2 a 10 log, 3 a 5 log, 3 a 7 log, 3 a 8 log, 3 a 9 log, 4 a 6 log, 4 a 8 log, 4 a 9 log, 5 a 6 log, 5 a 7 log, 5 a 8 log, 5 a 9 log, 6 a 7 log, 6 a 8 log, 6 a 9 log, 7 a 8 log, 7 a 9 log o 8 a 9 log.
Se han descrito modelos animales del virus de la influenza, tales como hurones, ratones, cobayas, monos ardilla, macacos y pollos, desarrollados para probar agentes antivirales contra el virus de la influenza. Véanse, p. ej., Sidwell et al., Antiviral Res., 2000, 48:1-16; Lowen AC et al. PNAS., 2006, 103: 9988-92; y McCauley et al., Antiviral Res., 1995, 27:179-186 y Rimmelzwann et al., Avian Diseases, 2003, 47:931-933. Para modelos de influenza en ratones, los ejemplos no limitantes de parámetros que se pueden utilizar para analizar la actividad antiviral de los compuestos activos administrados a los ratones infectados con influenza incluyen muerte asociada a neumonía, aumento de la glicoproteína ácida a1 en suero, peso del animal, virus pulmonar analizado por hemaglutinina, virus pulmonar analizado mediante ensayos de placa y cambio histopatológico en el pulmón. Se lleva a cabo un análisis estadístico para calcular la significación (p. ej., un valor de P de 0,05 o menos).
En otros ensayos, las evaluaciones histopatológicas se realizan después de la infección de un sujeto modelo animal. Los cornetes nasales y la tráquea pueden examinarse en busca de cambios epiteliales e inflamación subepitelial. Los pulmones pueden examinarse en busca de cambios epiteliales bronquiolares e inflamación peribronquiolar en bronquiolos grandes, medianos y pequeños o terminales. Los alvéolos también se evalúan en busca de cambios inflamatorios. Los bronquiolos medianos se clasifican en una escala de 0 a 3+ de la siguiente manera: 0 (normal: revestido por células epiteliales cilíndricas medianas a altas con bordes apicales ciliados y núcleos seudoestratificados basales; inflamación mínima); 1+ (capa epitelial cilíndrica e incluso en contorno con proliferación ligeramente aumentada; cilios todavía visibles en muchas células); 2+ (cambios prominentes en la capa epitelial que van desde la atenuación hasta la proliferación marcada; células desorganizadas y contorno de la capa irregular en el borde luminal); 3+ (capa epitelial marcadamente rota y desorganizada con células necróticas visibles en el lumen; algunos bronquiolos atenuados y otros en marcada proliferación reactiva).
La tráquea se califica en una escala de 0 a 2,5+ de la siguiente manera: 0 (normal: revestida por células epiteliales cilíndricas medianas a altas con borde apical ciliado, núcleos basales y seudoestratificados. Citoplasma evidente entre el borde apical y el núcleo. Foco pequeño ocasional con células escamosas); 1+ (metaplasia escamosa focal de la capa epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa de gran parte de la capa epitelial, los cilios pueden ser evidentes focalmente); 2,5+ (metaplasia escamosa difusa con muy pocos cilios evidentes).
La inmunohistoquímica del virus se realiza utilizando un anticuerpo monoclonal específico del virus (p. ej. anticuerpos monoclonales específicos de NP, N o HN). La tinción se clasifica de 0 a 3+ como sigue: 0 (sin células infectadas); 0,5+ (pocas células infectadas); 1+ (pocas células infectadas, como células individuales muy separadas); 1,5+ (pocas células infectadas, individuales muy separadas y en pequeños grupos); 2+ (cantidades moderadas de células infectadas, que generalmente afectan grupos de células adyacentes en porciones de la capa epitelial que recubre los bronquiolos, o en pequeños focos sublobulares en los alvéolos); 3+ (numerosas células infectadas, que afectan a la mayor parte de la capa epitelial de los bronquiolos, o diseminadas en grandes focos sublobulares de los alvéolos).
En un ejemplo, se compara la capacidad de inducir lesiones pulmonares y causar infección en un modelo animal de
infección por virus utilizando virus de tipo salvaje y virus simulado. Las lesiones pulmonares se pueden evaluar como un porcentaje de lóbulos pulmonares que están sanos mediante inspección visual. Los animales se sacrifican 5 días p.i. por administración intravenosa de pentobarbital, y sus pulmones se extirpan en su totalidad. El porcentaje de la superficie de cada lóbulo pulmonar que está afectado por lesiones macroscópicas se estima visualmente. Los porcentajes se promedian para obtener un valor medio para los 7 lóbulos pulmonares de cada animal. En otros ensayos, se pueden probar hisopos nasales para determinar la carga o el título del virus. Se pueden tomar hisopos nasales durante la necropsia para determinar la carga viral posterior a la infección.
En una realización, el virus se cuantifica en muestras de tejido. Por ejemplo, las muestras de tejido se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las diluciones de productos homogeneizados clarificados se adsorben durante 1 h a 37°C sobre monocapas de células (p. ej., células MDCK). A continuación, las monocapas infectadas se superponen con una solución de Medio Esencial Mínimo que contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%, DEAE-dextrano al 0,01%, NaHCO3 al 0,1% y agar al 1%. Las placas se incuban de 2 a 3 días hasta que se pueden visualizar las placas. Los ensayos de dosis infecciosa de cultivo tisular (DICT) para titular el virus de muestras infectadas con PR8 se llevan a cabo de la siguiente manera. Las monocapas confluentes de células (p. ej., células MDCK) en placas de 96 pocillos se incuban con diluciones logarítmicas de productos homogeneizados de tejido clarificado en medios. Dos o tres días después de la inoculación, se evalúa el crecimiento viral en alícuotas de 0,05 ml de cada pocillo mediante un ensayo de hemaglutinación (ensayo HA).
5.17.6.1.1 Ensayos en seres humanos
En una realización, se evalúan un compuesto activo o una composición del mismo que modulan la replicación de un virus de la influenza en sujetos humanos infectados. Según esta realización, se administran un compuesto activo o una composición del mismo al sujeto humano, y se determina el efecto del compuesto activo o la composición sobre la replicación viral mediante, p. ej., analizando el nivel del virus o de los ácidos nucleicos virales en una muestra biológica (p. ej., suero o plasma). Se pueden identificar un compuesto activo o una composición del mismo que alteran la replicación del virus comparando el nivel de replicación del virus en un sujeto o grupo de sujetos tratados con un control con el de un sujeto o grupo de sujetos tratados con un compuesto activo o una composición del mismo. Alternativamente, las alteraciones en la replicación viral pueden identificarse comparando el nivel de replicación del virus en un sujeto o grupo de sujetos antes y después de la administración de un compuesto activo o una composición del mismo. Se pueden utilizar mecanismos conocidos por los expertos en la técnica para obtener la muestra biológica y analizar la expresión de ARNm o proteína.
En otra realización, se evalúa en un sujeto infectado el efecto de un compuesto activo o una composición del mismo sobre la gravedad de uno o más síntomas asociados con una infección/enfermedad por el virus de la influenza. Según esta realización, se administran un compuesto activo o una composición del mismo o un control a un sujeto humano que padece infección por el virus de la influenza y se determina el efecto del compuesto activo o la composición sobre uno o más síntomas de la infección por el virus. Un compuesto activo o una composición del mismo que reducen uno o más síntomas puede identificarse comparando los sujetos tratados con un control con los sujetos tratados con el compuesto activo o la composición. En una realización específica, la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento) o una composición del mismo da como resultado una disminución de la hospitalización de un ser humano o una población de seres humanos causada por una enfermedad o infección por el virus de la influenza. En otra realización específica, la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento) o una composición del mismo da como resultado una reducción de la necesidad de asistencia respiratoria celular/respiratoria pulmonar en un ser humano o población de seres humanos con una enfermedad o infección por el virus de la influenza. En otra realización específica, la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento) o una composición del mismo da como resultado una reducción de la duración de la enfermedad de un ser humano o una población de seres humanos con una enfermedad o infección por el virus de la influenza. En otra realización específica, la administración de un compuesto activo (es decir, un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento) o una composición del mismo da como resultado una mejora (p. ej., un aumento) en el volumen pulmonar evaluado, p. ej., mediante pletismografía pulmonar o de cuerpo entero. En otra realización, se administran un compuesto activo o una composición del mismo a un sujeto humano sano y se controla su eficacia como vacuna (p. ej., se controla el inicio de los síntomas de infección por el virus de la influenza en el sujeto; la capacidad del virus de la influenza y/o una reducción/ausencia de uno o más síntomas asociados con la infección por el virus de la influenza). Se pueden utilizar técnicas conocidas por médicos familiarizados con enfermedades infecciosas para determinar si un compuesto activo o una composición del mismo reducen uno o más síntomas asociados con la enfermedad por virus de la influenza.
5.18 Evaluación de anticuerpos en un sujeto
En otro aspecto, se puede utilizar un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento, o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento para evaluar la respuesta de anticuerpos de un sujeto (p. ej., un sujeto sin tratamiento previo o un sujeto inmunizado/vacunado) o una población de sujetos a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de HA de la gripe, tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la
influenza (véase, p. ej., el Ejemplo 8, a continuación). En realizaciones específicas, un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza o un virus que expresa un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza se pueden utilizar para evaluar la presencia de anticuerpos específicos del tallo en el sujeto o población de sujetos. En realizaciones específicas, el polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza comprende uno o más sitios de glicosilación modificados en el dominio de tallo de HA y/o uno o más sitios de glicosilación que no se producen de forma natural en el dominio de cabeza globular.
En una realización específica, la respuesta de anticuerpos de un sujeto o una población de sujetos que han sido inmunizados/vacunados con un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza (p. ej., uno o varios polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento, tales como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe descrito en el presente documento, tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), se evalúa para identificar los tipos de anticuerpos específicos del tronco en el sujeto o población de sujetos. Tal evaluación puede permitir la identificación de marcadores/puntos finales sustitutos importantes para determinar la respuesta clínica a la administración de uno o varios polipéptidos de HA del virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de HA de la gripe tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento o un virus que expresa uno o varios polipéptidos de HA del virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de HA de la gripe tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza) descrito en el presente documento. En tal enfoque, se puede aislar y probar directamente una muestra biológica, p. ej., sangre, del sujeto o población de sujetos para detectar la presencia de anticuerpos, o se puede procesar (p. ej., para obtener sueros) y posteriormente probar la presencia de anticuerpos.
En otra realización específica, el perfil de anticuerpos de un sujeto no tratado previamente (es decir, un sujeto que no ha sido inmunizado/vacunado con uno o varios polipéptidos de HA del virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de HA de la gripe tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento), o un virus que expresa uno o varios polipéptidos de HA del virus de la influenza (p. ej., un polipéptido de HA de la gripe tal como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza)) o una población de sujetos no tratados previamente se evalúa para determinar si tal sujeto o población de sujetos poseen anticuerpos específicos de la cabeza globular y/o específicos de tallo contra varias cepas o subtipos del virus de la influenza. Tal evaluación puede permitir la generación de un polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), o virus que expresan polipéptido de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza), que son adecuados para la administración a dicho sujeto o población de sujetos, p. ej., polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe, tales como un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza, que comprende un dominio de cabeza para el que dicho sujeto o población de sujetos no ha sido tratado previamente (no tiene anticuerpos contra el mismo). Tal evaluación puede determinar una estrategia de inmunización para el paciente.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un método para evaluar/detectar la presencia de anticuerpos en un sujeto que son específicos para un dominio de tallo de una cepa o subtipo particular del virus de la influenza que comprende poner en contacto in vitro una muestra biológica (p. ej., sangre, suero) de dicho sujeto con un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento, en donde dicho polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de la cepa o subtipo de interés. Véanse los ejemplos 6-8, más abajo, para métodos para evaluar/detectar la presencia de anticuerpos específicos para un dominio de tallo de una cepa o subtipo particular del virus de la influenza. En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un método para evaluar/detectar la presencia de anticuerpos en un sujeto que son específicos para un dominio de tallo de una cepa o subtipo particular del virus de la influenza que comprende poner en contacto in vitro una muestra biológica (p. ej., sangre, suero) de dicho sujeto con un virus que expresa/contiene un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento, en donde dicho polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza comprende un dominio de tallo de la cepa o subtipo de interés.
5.19 Kits
En el presente documento se proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas/inmunogénicas descritas en el presente documento, tales como uno o más compuestos activos proporcionados en el presente documento. Asociado opcionalmente con tal o tales recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para administración a seres humanos.
Los kits incluidos en el presente documento se pueden utilizar según los métodos descritos en el presente documento. En una realización, un kit comprende un compuesto activo descrito en el presente documento, preferiblemente uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe (p. ej., uno o más polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza), en uno o más recipientes. En ciertas realizaciones, un kit comprende una vacuna descrita en el presente documento, p. ej., una vacuna de virus fraccionado, una vacuna de subunidades, una vacuna del virus de la influenza inactivado o una vacuna del virus de la influenza vivo, en donde dicha vacuna comprende uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) de la gripe descritos en el presente documento (p. ej., uno o más polipéptidos
quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza). En una realización específica, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento e instrucciones para el uso del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza para evaluar los anticuerpos presentes en un sujeto. En otra realización específica, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden un polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza descrito en el presente documento para su uso en métodos de ensayo de la presencia de anticuerpos específicos del dominio de tallo de HA en una muestra.
6. Ejemplos
6.1 Ejemplo 1: Polipéptidos del dom inio de tallo de hemaglutinina de influenza
Tabla 8. Compendio de construcciones
El presente ejemplo proporciona polipéptidos útiles en la Tabla 8 que se pueden preparar según los métodos descritos en el presente documento.
6.2 Ejemplo 2: Polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza
Este ejemplo describe polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza y métodos para inducir altos niveles de anticuerpos de tronco de HA de neutralización cruzada en un sujeto que comprende la administración de dichos polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza. Como se describe en este ejemplo, se generó hemaglutinina quimérica del virus de la influenza que fue expresada con éxito por el virus de la influenza y por células modificadas genéticamente para expresar la hemaglutinina quimérica del virus de la influenza. La hemaglutinina quimérica del virus de la influenza se recuperó con éxito en su conformación adecuada, como lo demuestra el reconocimiento de anticuerpos de los dominios del tallo y cabeza de hemaglutinina quimérica del virus
de la influenza.
La Figura 7 representa hemaglutininas (HA) quiméricas del virus de la influenza, que comprenden el dominio de tallo/tronco de un subtipo H1 del virus de la influenza y los dominios heterólogos de cabeza globular de otros subtipos del virus de la influenza (H2, H3 y H5). Siguiendo el esquema de estrategia de la Figura 7, se generó un virus de influenza que comprendía una HA quimérica compuesta por un dominio de tallo derivado de un virus de influenza H1N1 (PR8-H1N1) y el dominio de cabeza globular de la h A H1 pandémica de 2009 (Cal/09). Los dominios de cabeza globular de las HA de los dos virus son muy distintos (~70% de identidad de aminoácidos), mientras que los dominios del tallo están muy conservados, pero siguen siendo divergentes ((~89% de identidad de aminoácidos). Como se demuestra en la Figura 8, se expresaron las HA quiméricas con el mismo dominio de tallo, pero cabezas de HA muy diferentes dentro del mismo subtipo.
Además, se expresó en células 293T una HA quimérica que consistía en el dominio de tronco de HA A/PR8/34 y el dominio de cabeza globular de HK/68 (H3 quimérico), así como HA de tipo salvaje (PR8-HA y HA HK68). La Fig. 10 demuestra que también es posible expresar HA quiméricas estables con el mismo dominio de tallo (derivado del subtipo H1 de HA) y con una cabeza globular de un subtipo diferente (H3).
Por lo tanto, se diseñaron inmunógenos de HA que compartían completamente el dominio de tallo de HA pero que eran muy divergentes en sus cabezas globulares. Las inmunizaciones repetidas con estas construcciones deberían dar como resultado altos niveles de anticuerpos de neutralización cruzada contra el dominio de tallo común de la HA. Por lo tanto, una estrategia de vacuna mejorada utiliza HA quiméricas con un dominio de tallo/tronco constante y una cabeza globular cambiante para inducir anticuerpos de dominio anti-tallo de neutralización cruzada robustos. Se puede utilizar un dominio de tallo constante de, p. ej., HA H1 de A/PR/8/34 junto con cabezas globulares de diferentes HA del grupo 1 (H1, H2, H5, H9) para elaborar un panel de virus recombinantes inactivados, virus atenuados recombinantes o HA recombinantes (Figura 9). Un panel similar para HA del grupo 2 basado en el dominio de tallo de, p. ej., HA H3 de un virus X31, combinado con cabezas globulares de H3, H4 y H7 puede proporcionar la base para una vacuna universal de HA del grupo 2. Los virus recombinantes se pueden rescatar en una cadena principal de vacuna contra el virus de la influenza, tal como PR/8 o virus de la influenza adaptados al frío, cultivar mediante técnicas convencionales y utilizar como vacunas inactivadas o atenuadas. Las HA recombinantes se pueden expresar en células de insecto que pueden realizar una glicosilación similar a la de los mamíferos (MIMIC Sf9) o mediante una transfección transitoria, p. ej., de células 293 T o Vero, y a continuación, se pueden purificar mediante cromatografía de Ni-quelato con la ayuda de una etiqueta His C-terminal. Otras estrategias pueden incluir el uso de vacunas de ADN que expresan las HA quiméricas u otros vectores, tales como vectores de adenovirus, que expresan las HA quiméricas.
6.3 Ejemplo 3: Virus que expresan polipéptidos quimérica de hemaglutinina del virus de la influenza
Este ejemplo describe varias hemaglutininas quiméricas del virus de la influenza funcionales que abarcan una variedad de combinaciones de cabeza globular y tronco de diferentes subtipos de hemaglutinina, así como virus de influenza recombinantes que expresan estas hemaglutininas quiméricas, que tenían propiedades de crecimiento similares a las de los virus de influenza de tipo salvaje.
6.3.1 Materiales y métodos
6.3.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) o en MEM (Gibco, Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone; Thermo Scientific) y penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen).
Todos los virus recombinantes A/PR/8/34 se cultivaron en huevos de gallina embrionados de 10 días a 37°C durante 2 días.
6.3.1.2 Construcción de plásmidos
Los plásmidos que codifican las diferentes hemaglutininas quiméricas se construyeron mediante una estrategia similar adaptada de la construcción de plásmidos de genética inversa para generar virus recombinantes como se describió anteriormente (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Brevemente, los diferentes segmentos de HA quimérica se amplificaron mediante PCR con cebadores que contenían sitios SapI, se digirieron con SapI y se clonaron en los sitios SapI del vector pDZ que contiene el promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa I de ratón (véase, p. ej. Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439), mediante ligación multisegmentaria.
6.3.1.3 Análisis de citometría de flu jo
Para evaluar los niveles de proteínas de hemaglutinina en la superficie celular, se transfectaron células 293T con 1 μg del plásmido apropiado utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. A las 24 h de la transfección, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2% antes de teñirlas con el anticuerpo monoclonal (mAb) 6F12 contra HA H1 a una dilución 1/1000 o con el mAb 12D1 contra HA H3 (ver
Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796) a una dilución 1/400. Las células teñidas se enumeraron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytomics FC 500 y los resultados se analizaron utilizando el soporte lógico FlowJo.
6.3.1.4 Generación de pseudopartículas y ensayo de entrada
El procedimiento para la producción de pseudopartículas se adaptó de estudios previos (véanse, p. ej., Evans et al., 2007, Nature 446:801-805; y Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009). Brevemente, las células 293-T se cotransfectaron con cuatro plásmidos que codificaban (i) un provirus que contenía el informador deseado (V1-GLuc), (ii) Gag-Pol de VIH, (iii) la proteína hemaglutinina quimérica diferente y (iv) neuraminidasa (NA) de influenza A PR8. Los sobrenadantes se recogieron 72 h después de la transfección y, posteriormente, se filtraron (tamaño de poro de 0,45 gm). Todas las transducciones y ensayos de infección con pseudopartículas se realizaron en presencia de 1 gg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (véase Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009).
El ensayo de entrada se realizó mediante la infección de células MDCK con pseudopartículas con diferentes hemaglutininas quiméricas que contenían el informador G-Luc. Veinticuatro horas después de la infección, las células se lavaron tres veces con medio de nueva aportación para eliminar la proteína G-Luc que estaba presente en el inóculo de pseudopartículas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se realizaron ensayos de luciferasa (véase Evans et al., 2007, Nature 446:801-805).
6.3.1.5 Rescate de virus de la influenza A quiméricos recombinantes
El rescate de los virus de influenza A del ADN plásmido se realizó como se describió anteriormente (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Para generar el virus PR8 recombinante de tipo salvaje (rWT), se cotransfectaron células 293T con 1 gg de cada uno de los 8 plásmidos de rescate pDZ PR8 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los virus que expresaban diferentes HA quiméricas se generaron de la misma forma, pero sustituyendo el plásmido HA por el quimérico correspondiente para recuperar los virus quiméricos correspondientes. A las 6 h de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 gg de tripsina tratada con TPCK (L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona)/ml. A las 24 horas de la transfección, se inoculó sobrenadante que contenía virus en huevos de gallina embrionados de 8 días. Se recogió fluido alantoideo después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó la presencia de virus por hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo y por formación de placa en células MDCK.
6.3.1.6 Ensayo de cinética de crecim iento de virus
Para analizar las características de replicación de los virus recombinantes, se inocularon huevos de gallina embrionados de 10 días con 100 ufp de cada virus respectivo. Se recogió líquido alantoideo y posteriormente se analizó el crecimiento viral a las 0, 9, 24, 48 y 72 h de la infección (hpi). Los títulos de virus presentes en el líquido alantoideo se determinaron mediante ensayo en placas en células MDCK.
6.3.1.7 Inmunotinción de placas
Las placas se visualizaron mediante inmunotinción con el mAb (HT103) contra la proteína NP de influenza A.
6.3.1.8 Transferencia Western y análisis de inmunofluorescencia indirecta
Se infectó un pocillo de una placa de 12 pocillos de células MDCK confluentes (multiplicidad de infección [MOI] de 2) con los virus de la influenza recombinantes indicados o se infectó de forma simulada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 37°C. A las 12 h de la infección (hpi), las células se lisaron en tampón de carga de proteínas 1X como se describió anteriormente (véase, p. ej., Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los productos lisados celulares reducidos se analizaron mediante análisis de transferencia Western utilizando mAb contra virus A/NP (HT 103), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (29C1), A/VN/HA (M08) (20), A/H3/HA (12D1). La detección de Perth-cH7 utilizó un suero policlonal de cabra, NR-3152, contra el virus A/FPV/Dutch/27 (H7), que se obtuvo de BEI Resources. El anticuerpo de control de carga de mAb anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) era de Abcam. Todas las proteínas de interés se visualizaron utilizando un sistema mejorado de detección de proteínas por quimioluminiscencia (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).
Para el análisis de inmunofluorescencia, se infectaron monocapas confluentes de células MDCK en cubreobjetos de 15 mm con virus recombinantes a una MOI de 2. A las 15 hpi, las células se fijaron y permeabilizaron con metanolacetona (razón 1:1) a -20 °C. durante 20 min. Después de bloquearlas con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con el anticuerpo dirigido contra virus A/NP (HT103), A/H1/HA (6F12), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (29C1), A/VN/HA (M08) (20), A/H3/HA (12D1) y A/H7 (NR-3152) como se mencionó anteriormente. Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con anti-inmunoglobulina G de ratón conjugado con Alexa Fluor 594 (IgG; Invitrogen, Carlsbad, CA) o anti-inmunoglobulina G de cabra conjugado con Alexa Fluor 594 (IgG, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de los últimos tres lavados, las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.3.2 Resultados
6.3.2.1 Generación de hemaglutininas quiméricas
Para obtener información sobre la conservación de los restos de cisteína que forman el enlace disulfuro Cys52-Cys277, se generó un alineamiento de las secuencias de HA del virus de la influenza A de los subtipos H1, H3, H5 y H7 (véase la Fig. 11). Las secuencias de las subunidades HA1 están menos conservadas que las de las subunidades HA2, principalmente debido a la presencia de sitios antigénicos inmunodominantes en el dominio de cabeza globular. Las cadenas de HA2 más conservadas comprenden las regiones del tronco que anclan las moléculas de HA a la envoltura viral. El alineamiento demuestra que Cys52 y Cys277 y los aminoácidos hacia ambos extremos se conservan en los subtipos seleccionados. De ahora en adelante, las secuencias de hemaglutinina N-terminal a Cys52 y C-terminal a Cys277 se definen como el dominio de tronco (Fig. 11). La secuencia intermedia se considera en este ejemplo como el dominio de cabeza.
Primero se generó una construcción de hemaglutinina quimérica (PR8-cH1) que contenía el dominio de cabeza globular pandémica de HA H1 Cal/09 con la región de tronco de HA PR8 (H1) (Fig. 12A). También se generó una HA quimérica (PR8-cH5) que contenía la cabeza globular de la HA VN1203 (H5) con el tronco de la HA PR8 (H1) (Fig. 12B). Dado que los 16 subtipos de HA de la influenza se agrupan en dos grupos filogenéticos (grupos 1 y 2) (véase, p. ej., Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273) y las h A H1 y H5 pertenecen ambas al grupo 1, se aplicó una estrategia similar para generar una HA quimérica con el dominio de cabeza A/Alberta/24/01 (H7) con la región del tronco de HA A/Perth/16/2009 (H3) (Perth-cH7) (Fig. 12B). Tanto H7 como H3 son miembros del grupo filogenético del grupo 2 (véase, p. ej., Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273).
A continuación, se probó si las diferentes construcciones quiméricas de HA se expresaban y transportaban a la superficie celular. El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células 293T transfectadas transitoriamente se realizó después de la tinción superficial con anticuerpos específicos del dominio de tronco de PR8 y H3, respectivamente (Fig. 13A). Como se muestra en la Figura 13A, se detectó la expresión de las tres construcciones quiméricas. Esta detección indica que no se interrumpe el transporte de las HA quiméricas a través del complejo de Golgi hasta la superficie celular.
A continuación, se examinaron las características de entrada de las diferentes HA quiméricas a través de la infección de células MDCK con partículas pseudotipificadas de HA retrovirales que contenían la HA quimérica, NA PR8 de influenza A de tipo salvaje y la luciferasa basada en VIH. La eficiencia de entrada mediada por las proteínas HA quiméricas se detectó mediante lectura de luciferasa. Se observaron niveles comparables de suministro de luciferasa mediado por partículas pseudotipificadas para las HA quiméricas PR8-cH5 y Perth-cH7 y las correspondientes proteínas de tipo salvaje (Fig. 13B). La HA PR8-cH1 mostró un nivel de luciferasa más bajo en comparación con las otras construcciones de HA.
6.3.3 Generación de virus de la influenza recombinantes portadores de hemaglutininas quiméricas.
A la luz de los resultados anteriores, se determinó si una HA quimérica es funcional en el contexto de una partícula de virus completa y, en última instancia, permitiría el rescate de un virus de influenza A recombinante que sólo expresara una HA quimérica. Utilizando protocolos previamente publicados (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590), se generaron con éxito virus que contenían todas las diferentes HA quiméricas. Los virus resultantes se purificaron en placa, se amplificaron en huevos embrionados de 10 días y los segmentos quiméricos se analizaron mediante RT-PCR y se secuenciaron. En todos los casos, se encontró que el virus tenía el segmento de HA quimérica esperado y ningún otro segmento de HA.
La identidad de los virus quiméricos se demostró adicionalmente mediante transferencia Western e inmunofluorescencia indirecta de células infectadas (Fig. 14A y 14B). Las células MDCK se infectaron con virus rWT A/PR8, A/Perth de tipo salvaje, PR8-cH1, PR8-cH5 y Perth-cH7 (Fig. 14A y 14B). Las proteínas HA quiméricas PR8-cH1 y PR8-cH5 se detectaron en las muestras correspondientes utilizando anticuerpos contra HA Cal/09 (29C1) o HA VN/04 (M08) (véase Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753), respectivamente (Fig. 14A). Utilizando 12D1, un mAb de tronco pan H3 (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796), se observaron niveles de expresión comparables entre HA Perth-cH7 y HA Perth de tipo salvaje. Solo se detectó una banda positiva para la muestra de infección PerthcH7 cuando se utilizaron anticuerpos anti-H7 (NR-3152).
Para el estudio de inmunofluorescencia, las condiciones de infección fueron similares a las del análisis Western. Las células infectadas se tiñeron con los anticuerpos correspondientes como se indica en la Figura 14B. Todas las células infectadas mostraron la expresión esperada de las HA, así como de la proteína A/NP (Fig. 14B).
6.3.4 Características de replicación de virus recombinantes
Las propiedades de crecimiento de los virus se evaluaron en huevos de gallina embrionados de 10 días a 37°C (Fig. 15A). El virus PR8 rWT se incluyó para comparar la cinética de crecimiento de los virus recombinantes que expresan HA quiméricas. Con respecto al virus PR8-cH5, se observó un patrón de replicación similar al del virus PR8. En cuanto al virus Perth-cH7, hubo una reducción de 2 veces en el título viral en comparación con el virus PR8 rWT a las 9 hpi. No obstante, alcanzó un título máximo similar al del virus de tipo salvaje (1X109 UFP/ml) a las 48 hpi. El virus PR8
cH1 se atenuó en comparación con el virus PR8 rWT, como se muestra por la reducción de los títulos en todos los puntos de tiempo. No obstante, incluso este virus quimérico alcanzó un título máximo respetable de aproximadamente 108 UFP/ml. El fenotipo de placa de cada uno de los virus quiméricos también se evaluó en células MDCK. Todos los virus formaron placas de tamaño comparable como se muestra en la Figura 15B. Estos resultados confirman que las construcciones quiméricas de HA se pliegan correctamente in vivo y son biológicamente funcionales.
6.3.5 Conclusión
Se desarrolló una estrategia novedosa para generar virus de influenza con proteínas HA quiméricas que portan diferentes dominios de cabeza globular de HA aprovechando el enlace disulfuro conservado Cys52-Cys277 que delimita el límite entre los dominios de cabeza y tronco. Así, mediante la sustitución del dominio de cabeza parental por el dominio de cabeza de otra HA, se generó un panel de HA quiméricas con el mismo tronco, pero diferentes cabezas globulares. El diseño se probó en varios subtipos, incluido el dominio de tronco de PR8 con cabezas globulares H5 Cal/09 y VN. Adicionalmente, se colocó una cabeza globular H7 en un dominio de tronco H3. Estas construcciones cubren ambos grupos filogenéticos de la proteína HA de influenza. Cada construcción se expresó en la superficie celular y conservó la actividad de fusión, como se muestra en la Figura 12. La generación de virus recombinantes que portan las HA quiméricas validó adicionalmente que las HA se pliegan correctamente y conservan las funciones biológicas.
6.4 Ejemplo 4: Aplicaciones de diagnóstico de polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza y vacunación de ratones con polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza
Este ejemplo demuestra que los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza se pueden utilizar con fines de diagnóstico y que los virus que expresan polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza se pueden utilizar en vacunas.
6.4.1 Materiales y métodos
6.4.1.1 Células y plásmidos
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (ambos de Gibco), respectivamente, cada uno complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina-100 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). Se utilizaron TNM-FH (Sigma-Aldrich) complementado con suero de ternero fetal al 10% y medios de cultivo de insectos Hyclone SFX (ThermoScientific) para el cultivo de células Sf9 y BTI-TN5B1-4 (High Five).
Las construcciones quiméricas de hemaglutinina con el tronco de A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) que contenía el dominio de cabeza globular del virus A/Mallard/Sweden/81/02 ("cH6") o A/Guinea fowl/Hong Kong/WF 10/99 ("cH9") se generaron utilizando técnicas similares. Para la construcción H6 quimérica, se amplificaron diferentes componentes mediante PCR y se clonaron en el plásmido pDZ utilizando una estrategia de clonación descrita anteriormente (véase, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82; y Hai et al., 2008, Journal of Virology 82:10580-90). Brevemente, diferentes componentes de la hemaglutinina quimérica (cHA) se amplificaron mediante PCR con cebadores que contenían sitios Sap I, se digirieron con Sap I y se clonaron en los sitios Sap I del plásmido pDZ. Para la generación del plásmido de transferencia de baculovirus, se amplificó cH6 por PCR, se cortó con BamHI y NotI, y se clonó en marco en un vector de transferencia de baculovirus pBacPAK8 modificado (Gentech) que alberga un foldon de fago T4 C-terminal y una etiqueta 6-his (véase Meier et al., 2004, J Mol Biol 344:1051-69). Las secuencias de todos los plásmidos se confirmaron mediante secuenciación de Sanger.
6.4.1.2 Rescate del virus cH9 recombinante
Para rescatar el virus de la vacuna recombinante, se utilizaron ocho plásmidos de genética inversa que codificaban el ARNv y el ARNm de los siete segmentos virales de tipo salvaje de PR8 y cH9, como se describió anteriormente (Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82; y Pleschka et al., 1996, J Virol 70:4188-92). Brevemente, se transfectaron células 293T con 1 μg de cada uno de los ocho plásmidos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A las 12 horas de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM que contenía albúmina de suero bovino al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 μg/ml de tripsina tratada con TPCK (L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona). Dos días después de la transfección, se inoculó sobrenadante que contenía virus en huevos de gallina embrionados de 10 días. El líquido alantoideo se recogió después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó para detectar la presencia de virus por hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo. El virus cH9 rescatado a continuación, se propagó en huevos de 10 días después de una incubación de 48 horas a 37°C. Las reservas de virus se titularon mediante un ensayo en placa como se describió anteriormente (véase, p. ej., Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53). La secuencia de cH9 se confirmó mediante secuenciación de productos de PCR de transcripción inversa.
6.4.1.3 Generación de baculovirus recombinantes, expresión y purificación de proteínas
Para generar baculovirus recombinantes (rBV) portadores de cH6, se cotransfectaron plásmidos y ADN Baculogold (BDBiosciences) en células Sf9 con Cellfectin II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El baculovirus recombinante se amplificó en células Sf9 cultivadas en medio TNM-FH (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA) y los títulos se determinaron mediante ensayo en placa como se describió previamente (véase, p. ej., Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53).
Se infectaron células High Five (véase Krammer et al., 2010, Mol Biotechnol 45:226-34) cultivadas en medios de células de insecto HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con rBV que expresaba cH6 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y una densidad celular de 1 x 106 células/ml en matraces agitadores de 500 ml. Las células se recolectaron 96 horas después de la infección y se separaron del sobrenadante mediante centrifugación a baja velocidad durante 10 minutos a 2000 x g a temperatura ambiente. Para la purificación de la proteína cH6, se recogió el sobrenadante y se incubó con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas a 4°C. La suspensión se cargó en columnas y se lavó tres veces con tampón de lavado (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). La proteína se eluyó en etapas de 0,5 ml con tampón de elución (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8), el contenido de proteína se probó con reactivo de Bradford y se agruparon las fracciones que contenían proteína. La pureza y la identidad de la proteína se probaron mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. La concentración de proteína se determinó con el reactivo de Bradford.
6.4.1.4 Experimentos con ratones
Para todos los procedimientos, los ratones se anestesiaron con inyecciones intraperitoneales de 0,1 ml de mezclas de ketamina/xilazina (1,5 mg de ketamina y 0,3 mg de xilazina).
Se determinaron las dosis letales del 50% (DL50) en ratón en ratones BALB/c (Charles River Laboratories) infectando grupos de cuatro ratones con diluciones seriadas 1:10 del virus de la influenza. Se controlaron los pesos corporales durante un período de dos semanas. Se consideró que los ratones que perdieron más de 25% de su peso corporal habían alcanzado el punto final experimental y se sacrificaron. Los valores DL50 fueron calculados por el método de Reed y Meunch (véase Reed y Meunch. 1938, Am. J. Hig. 27:493-497).
Para los experimentos destinados a evaluar los anticuerpos del tallo producidos después de la infección por el virus A/Califomia/04/09 (Cal/09), se cebaron primero ratones hembra BALB/c de 8-10 semanas de edad con la administración intramuscular de 80 μg de un plásmido de expresión que codificaba HA de longitud completa del virus PR8, junto con la aplicación de estimulación eléctrica como se describió anteriormente (sistema de suministro TriGrid, Ichor Medical Systems) (véase, p. ej., Luxembourg et al., 2007, Expert Opinion on Biological Therapy 7:1647-64). Tres semanas más tarde, los ratones recibieron un refuerzo con una dosis subletal de 104 UFP de Cal/09 en un volumen de 50 μl, por vía intranasal. Los animales de control recibieron ADN solo o virus Cal/09 solo, o una inyección intramuscular de la vacuna 2009-2010 (vacuna fraccionada de Cal/09). Tres semanas después del refuerzo, o el punto de tiempo equivalente para los animales de control, se extrajo sangre de los ratones y se recolectó el suero para probar la reactividad frente a cH6 por inmunofluorescencia como se describe a continuación.
Para los experimentos que probaron la eficacia del virus cH9 como construcción de vacuna, se administró ADN de longitud completa de PR8 como se describe anteriormente. Tres semanas después del cebado, a los ratones se les inocularon 103 UFP de virus cH9 instilado por vía intranasal. Los animales de control recibieron ADN solo o virus Cal/09 solo o virus PR8 inactivado purificado por vía intramuscular. T res semanas después del refuerzo, o el punto de tiempo equivalente para los animales de control, los ratones fueron sensibilizados con una inoculación intranasal de 5 x 104 DL50 del virus PR8. Los ratones se pesaron durante 14 días después de la sensibilización. Los animales que perdieron más de 27,5% de su peso corporal inicial fueron sacrificados y clasificados como muertos.
6.4.1.5 Inmunofluorescencia para confirmar la expresión de la hemaglutinina quimérica
Se transfectaron monocapas confluentes de células 293T con 1 μg de plásmido pDZ cH6. A las 48 horas de la transfección, las células se fijaron y bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%. A continuación, las células se incubaron con sueros combinados de los animales de cada uno de los cuatro grupos experimentales descritos anteriormente (ADN de PR8 solo, Cal/09 solo, infección con ADN de PR8 y Cal/09, o vacuna fraccionada de Cal/09 sola). Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 hora con anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.4.1.6 Elisa
Se recubrieron placas ELISA de noventa y seis pocillos (Nunc, MaxiSorp) con 50 ml de cH6 expresado en baculovirus y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con leche al 3%/PBS y a continuación, se lavaron con PBS/Tween al 0,1% (PBST). El suero de los ratones vacunados se diluyó en serie en PBS y se añadió a la placa, seguido de una incubación de 1 hora a 37°C. A continuación, las placas se lavaron con PBST y se incubaron con una dilución 1:2500 de anti-IgG ratón ligado a peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare). Después de un lavado adicional con PBST, se añadió sustrato SigmafastOPD (Sigma). La reacción se detuvo con H2SO43M y las medidas
de densidad óptica se tomaron a 490 nm.
6.4.2 Resultados
6.4.2.1 Los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico
Se generó una construcción de hemaglutinina quimérica que comprendía el dominio de cabeza globular de la hemaglutinina de un subtipo del virus de la influenza H6 y el dominio de tallo/tronco de hemaglutinina del virus PR8 para que sirviera como herramienta analítica para evaluar la producción de anticuerpos por parte de los ratones inmunizados contra el dominio de tallo de H6. Debido a que los ratones inmunizados solo fueron expuestos a la cabeza globular de los virus H1, los anticuerpos que se generaron en los animales de experimentación solo serían reactivos a la hemaglutinina H6 quimérica (cH6) si se dirigieran hacia su tallo de H1.
Como se muestra en las Figuras 16A y 16D, el tratamiento con ADN solo o vacuna fraccionada pandémica no provocó ningún anticuerpo reactivo contra el tallo en los ratones vacunados. Por el contrario, la infección con Cal/09 solo generó anticuerpos reactivos contra el tallo (Figura 16B), aunque no en la medida provocada por electroporación e infección con ADN (Figura 16C). Se utilizó un anticuerpo contra el tallo de H1 con reacción cruzada, C179, como control para la transfección (Figura 16E). Como se esperaba, PY102, un anticuerpo dirigido contra la cabeza globular de PR8, no reaccionó a la HA cH6 transfectada (Figura 16F).
Como se muestra en la Figura 18, la utilidad del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la influenza cH6 como herramienta para detectar la unión del anticuerpo del tallo se confirmó mediante ELISA.
6.4.2.2 Los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza se pueden utilizar en vacunas
Como se muestra en la Figura 17, los animales que fueron vacunados con el virus PR8 inactivado estaban protegidos de la sensibilización letal, mientras que los animales que recibieron ADN solo sucumbieron completamente a la infección el día 5 después de la sensibilización. Los animales que recibieron solo el virus cH9 tampoco estaban protegidos contra la infección, con una tasa de supervivencia de solo 25%. Por el contrario, los animales que primero fueron cebados con ADN y a continuación, reforzados con el virus cH9 estaban protegidos de la sensibilización, con una tasa de supervivencia que fue estadísticamente la misma que la de los animales vacunados con la preparación de virus inactivado.
6.5 Ejemplo 5: La glicosilación en el dom inio de cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza modula la virulencia y las propiedades antigénicas de los virus de la influenza
Este ejemplo demuestra los efectos de la glicosilación del dominio de cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la influenza sobre la virulencia y la reactividad cruzada antigénica de los virus de la influenza.
6.5.1 Materiales y métodos
6.5.1.1 Secuencias y Alineamiento de HA del virus H1N1
La secuencia de HA de todos los virus humanos H1N1 disponibles a través de la Base de Datos de Investigación de Influenza (www.fludb.org) se descargó y alineó utilizando ClustalW y se editó manualmente con el soporte lógico BioEdit Sequence Alignment Editor. Se seleccionaron secuencias de HA1 que contenían patrones de glicosilación representativos basados en al menos dos productos aislados originales por año para análisis adicionales. Los números de acceso de GenBank de las HA representadas en la Fig. 22A son: a F117241.1, CY034132, AF389118, CY009324, CY020445, CY013271, CY020285, CY021709, CY009612, CY019947, CY019971, CY009332, CY021821, CY009340, CY021053, DQ508897, CY011296, CY021909, CY020181, CY021029, CY010364, CY020437, CY021725, DQ508873, CY019779, CY033655, CY012872, CY017011, DQ415317, EU103824, CY025026, CY010332, CY006675, CY019883, CY007467, CY016675, CY027875, CY058487.1, CY040114, FJ984355, GQ150342, GQ149654, GQ117044, FJ966974, CY039527.2. Los sitios de glicosilación fueron predichos por el motivo N-X-S/T.
6.5.1.2 Líneas celulares y virus
Se mantuvieron células de riñón embrionario humano (293T) en DMEM complementado con FBS al 10% y 1000 U/ml de penicilina/estreptomicina. Las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) se mantuvieron en MEM complementado con FBS al 10% y penicilina/estreptomicina. Los reactivos para el cultivo celular se adquirieron de Gibco Life Technologies. Las cepas de virus H1N1 A/Texas/36/1991 (Texas/91), H1N1A/Brisbane/59/2007 (Bris/59) y H3N2 A/Brisbane/10/2007 (Bris/10) se cultivaron en huevos embrionados de 10 días. Los productos aislados de A/Califomia/04/2009 (Cal/09) y A/Netherlands/602/2009 (Neth/09) y todas las reservas de virus recombinantes se cultivaron en células MDCK.
6.5.1.3 Generación de virus recombinantes
6.5.1.3.1 Plásmidos de rescate de producto aislado de A/Netherlands/602/2009
El análisis de secuencia mostró que los segmentos que codificaban las proteínas PB2, PB1, M y NS eran idénticos entre los productos aislados de A/California/04/2009 y A/Netherlands/602/2009. Así, se utilizaron los plásmidos pDZ-PB1, -PB2, -M y -NS de la cepa A/California/04/2009 descritos previamente (Hai et al., 2010, Journal of Virology 84: 4442-4450; Quinlivan et al., 2005, Journal of Virology 79, 8431-8439). Los segmentos restantes se clonaron aislando ARN viral de sobrenadantes obtenidos de células MDCK infectadas con el producto aislado del virus A/Netherlands/602/2009 utilizando el mini kit de ARN viral QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemania) y se utilizaron los cebadores específicos de segmento que contenían los sitios de restricción SapI para clonar NP, HA y NA en el plásmido pPolI como se describió anteriormente (Quinlivan et al., 2005, Journal of Virology 79, 8431-8439). Para PA, la mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando el plásmido pPolI-PA de A/California/04/2009 como molde y se mutaron 3 nt para obtener el gen PA de Neth/09 WT. A continuación, los segmentos PA y NP se subclonaron del vector pPolI en el vector bidireccional pDZ utilizando sitios de restricción SapI. Las construcciones que codificaban los mutantes de glicosilación se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio de pPol-HA de Neth/09 WT utilizando el Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Los cambios de aminoácidos realizados en cada caso para añadir sitios de glicosilación fueron los siguientes: K71N y N73S para el sitio 71, D144T para el sitio 142, D144N y N146T para el sitio 144, G172S para el sitio 172 y K177N para el sitio 177.
6.5.1.3.2 Rescate de A/Netherlands/602/2009 WT y los respectivos virus mutantes de glicosilación
Los virus de influenza A recombinantes basados en Neth/09 se generaron transfectando células 293T con 0,5 gg de cada uno de diez plásmidos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. La mezcla de plásmidos contenía los seis vectores pDZ que codifican los genes PB2, PB1, PA, NP, M y NS y dos vectores pPolI que codificaban los genes HA y NA. Los plásmidos de expresión de A/WSN/33 pCAGGS-HA y pCAGGS-NA se incluyeron para mejorar la eficacia del rescate. A las 16-20 horas de la transfección, se añadieron células MDCK a las células 293T y se cambió el medio a DMEM con penicilina/estreptomicina, albúmina bovina al 0,3% y 1 ug/ml de tripsina tratada con TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los sobrenadantes se recogieron 24-36 h después de la adición de las células MDCK. Los virus rescatados se purificaron en placa y se volvieron a cultivar en células MDCK durante 48 horas para preparar reservas del pase 1, que se utilizaron para todos los experimentos mostrados. Los títulos de las reservas de virus se determinaron por triplicado mediante ensayo en placas en células MDCK. Las secuencias correctas de cada virus recombinante se confirmaron secuenciando el genoma completo.
6.5.1.3.3 Generación y rescate de virus de deleción por g licosilación de HA de A/PR8/347:1 Tx/91
La PCR de fusión se realizó para generar plásmidos pDZ-HA que contenían mutantes de glicosilación de HA de Tx/91 para eliminar 1, 2 o 3 sitios de glicosilación ubicados en la cabeza globular de esta HA de H1N1 estacional contemporánea. Se realizaron los siguientes cambios de aminoácidos para eliminar cada sitio de glicosilación para que coincidiera con los restos encontrados en el producto aislado de Neth/09: N71K y S73N para eliminar el sitio 71, T144D para eliminar el sitio 142 y N177K para eliminar el sitio 177. Los 7 genes restantes de A/PR8/34 (PR/34) se clonaron en el plásmido pDZ para rescatar virus recombinantes tipo salvaje y mutantes de HA de PR/34 7:1 TX/91 como se describe anteriormente.
6.5.1.4 Fenotipo de placa y análisis de crecim iento de virus in vitro
El fenotipo del tamaño de placa se evaluó realizando un ensayo en placa después de infectar células MDCK con ~ 100 ufp de cada virus recombinante, como se muestra. A las 48 h p.i. las células se fijaron con formaldehído al 4% y las placas se visualizaron mediante inmunotinción con el anticuerpo monoclonal de ratón, E10, que reconoce el péptido amino-terminal que es común a las proteínas M1 y M2. Las curvas de crecimiento se realizaron en células epiteliales traqueobronquiales humanas primarias diferenciadas (HTBE) (Lonza, MD). Aproximadamente 1x105 células HTBE se sembraron sobre insertos Transwell de membrana permeable de 12 mm recubiertos con colágeno (0,4 gm) en una placa de 12 pocillos (Corning, MA). Las células se cultivaron sumergidas en Medio de Crecimiento de Células Epiteliales Bronquiales BEGM (Lonza, MD) durante 4 días hasta que se logró la confluencia y a continuación, se estableció la diferenciación retirando el medio de la superficie apical y cultivando adicionalmente las células durante 4 semanas en esta interfase de aire-líquido. Durante este tiempo, el medio del lado basolateral se reemplazó cada 2 días. Antes de la infección por el virus, las monocapas celulares se lavaron minuciosamente con PBS para eliminar la mucosidad acumulada en el lado apical de las células. Se inocularon pocillos por triplicado con cada virus mostrado a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001 ufp/célula. El virus se recogió en los puntos de tiempo indicados añadiendo 100 gl de PBS a cada pocillo durante 30 minutos a 37°C. Los títulos virales se realizaron mediante ensayo en placas convencional utilizando células MDCK.
6.5.1.5 Ensayos de transferencia Western
Las células MDCK infectadas a una MOI de 5 durante 12 h con los virus indicados se lisaron en tampón de lisis NP-40 (Tris 50 nM, NaCl 150 nM, EDTA 5 mM, NaF 30 mM, p-glicerofosfato 40 mM, glicerol al 10% y Np -40 al 0,25%) que contenía el inhibidor de la proteasa Complete Mini (Roche, IN). Los productos lisados clarificados se hirvieron durante 5 minutos y las proteínas se separaron en un gel con gradiente Bis-Tris 4-12% NuPAGE (Invitrogen, CA) en
condiciones no reductoras para los virus Neth/09 WT y muíante, o en condiciones reductoras para el Tx/91 WT y los respectivos virus mutantes de deleción por glicosilación. Se realizaron transferencias Western para detectar proteínas transferidas a membranas de PVDF, mediante incubación con el anticuerpo policlonal de conejo 3951 producido contra un virus PR8 que carecía de H1, que se eliminó mediante tratamiento con ácido y DTT (Steel et al., 2010, mBio 1).
6.5.1.6 Experimentos con ratones
6.5.1.6.1 Infecciones, pérdida de peso corporal y supervivencia
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo según las pautas institucionales del Comité de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) y han sido aprobados por la IACUC de la Escuela de Medicina de Mount Sinai. Se anestesiaron ratones hembra C57BL/6 de 7 a 9 semanas de edad (Jackson Laboratories, ME) mediante inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina y se infectaron por vía intranasal con el virus indicado a dosis de 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106 ufp del virus diluido en 50 gl de PBS. El peso corporal y la supervivencia se controlaron diariamente durante 14 días. Se consideró que los ratones que mostraban más de 25% de pérdida de peso corporal habían alcanzado el punto final experimental y se sacrificaron de forma humanitaria.
6.5.1.6.2 Títulos virales pulmonares
Los pulmones de los ratones infectados se extirparon asépticamente en los días indicados después de la infección y se almacenaron a -80°C hasta su posterior procesamiento. Para las titulaciones, los tejidos se homogeneizaron en 1 ml de PBS utilizando un homogeneizador mecánico (MP Biochemicals, OH). Los títulos virales en los productos homogeneizados sobrenadantes clarificados se cuantificaron mediante un ensayo en placas convencional en células MDCK.
6.5.1.6.3 Sensibilización con Neth/09
Se infectaron ratones de 8 semanas de edad con los virus rTx/91 indicados. Se permitió que los ratones se seroconvirtieran durante 27 días, momento en el que se sensibilizaron con 100 veces la dosis letal del 50% (DL50%) de A/Netherlands/602/2009. Se controlaron la supervivencia y la pérdida de peso corporal durante 13 días p.i.
6.5.1.7 Experimentos con hurones
La investigación con animales se llevó a cabo bajo las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades en una instalación para animales acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio en el ámbito International.
6.5.1.7.1 Infecciones, pérdida de peso corporal y títu los de lavado nasal
Se utilizaron hurones Fitch macho, de 8 a 12 meses de edad (Triple F Farms, PA) que fueron serológicamente negativos por inhibición de la hemaglutinación para los virus de influenza A H3N2 estacional que circula actualmente, el H1N1 estacional que circulaba anteriormente y H1N1 pandémico de 2009, para evaluar la virulencia de los virus indicados. Se anestesiaron tres hurones por grupo con una inyección intramuscular de un cóctel de hidrocloruro de ketamina (24 mg/kg)-xilazina (2 mg/kg)-atropina (0,05 mg/kg) y se infectaron por vía intranasal con HA Neth/09 WT o virus mutante de glicosilación de HA 144-172 a 106 ufp en un volumen final de 500 gl de PBS. Los pesos corporales se midieron diariamente durante 12 días y se representan como peso porcentual en comparación con el peso inicial. Las cavidades nasales de los hurones se lavaron con 1 ml de PBS en días alternos desde el día 1 hasta el 7. Los títulos virales en los lavados nasales se determinaron mediante ensayo en placa convencional en células MDCK.
6.5.1.7.2 Títulos virales tisulares
Se infectaron tres hurones por grupo indicado con 106 ufp de cada virus como se describe anteriormente. El día 3 p.i. los hurones se sacrificaron y los pulmones, la tráquea, los cornetes nasales y el bulbo olfatorio se recogieron asépticamente. Los especímenes de tejido se congelaron inmediatamente en hielo seco y se almacenaron a -70°C hasta que se procesaron. Los especímenes de tejido congelados se descongelaron, se pesaron y a continuación, se homogeneizaron en PBS frío utilizando trituradores de tejido estériles desechables (Kendall, MA). Se clarificaron los productos homogeneizados de tejido y se determinaron los títulos de virus en los sobrenadantes claros mediante un ensayo en placas convencional en células MDCK.
6.5.1.8 Especímenes humanos
Los estudios que implicaban el uso de especímenes de suero humano fueron revisados y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Saint Louis y de la Facultad de Medicina de Mount Sinai. Las muestras de suero antes y después de la vacunación obtenidas de sujetos que tenían 18 años de edad o más (adultos) y de individuos de 1 a 17 años (pediátricos), que se inscribieron en pruebas clínicas, se utilizaron para probar la seguridad y la inmunogenicidad de una cepa de vacuna contra la influenza H1N1 2009 inactivada realizada en la Unidad de Evaluación de Vacunas y Tratamiento del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Saint Louis. Los experimentos realizados para evaluar la reactividad de estos sueros humanos contra H3N2 estacional, H1N1, H1N1 2009 y las HA mutantes de glicosilación se realizaron de forma ciega.
6.5.1.9 Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) de sueros de ratón y humano
Se obtuvieron sueros de ratón de animales infectados con los virus indicados el día 28 p.i. Los experimentos realizados con sueros de ratones se realizaron con sueros combinados de 3 animales infectados por virus que se seleccionaron para contener al menos 160 unidades HI contra el virus homólogo. Los ensayos HAI se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Medina et al., 2010, Nat Commun 1, doi: 10.1038). Brevemente, se utilizó el tratamiento con tripsina-calor-peryodato para inactivar los sueros de ratón, hurón y humano mezclando medio volumen de tripsina de 8 mg/ml (Sigma-Aldrich) en tampón de fosfato 0,1 M, pH 8,2, con un volumen de suero y las muestras se incubaron durante 30 min a 56°C. Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se mezclaron con tres volúmenes de peryodato de metapotasio 0,11 M y se incubaron adicionalmente a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, las muestras se mezclaron con tres volúmenes de solución salina de glicerol al 1% y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Finalmente, las muestras se mezclaron y se incubaron con 2,5 volúmenes de solución salina al 85% para diluir las muestras a una concentración de 1:10. Los ensayos HAI de sueros se realizaron siguiendo protocolos convencionales (Yu et al., 2008, Nature 455, 532-536). Brevemente, se mezclaron y preincubaron diluciones en serie 1:2 de suero de ratón o humano en placas de 96 pocillos con 8 unidades de HA de virus por pocillo durante 30 min a 4°C. Se añadieron glóbulos rojos de Pavo (para Bris/10 y Neth/09) o Pollo (para Bris/59) a una concentración final de 0,25%, y la placa se incubó a 4°C durante 30 min. Los títulos de HAI se determinaron como la dilución más alta que mostró actividad hemaglutinante.
6.5.1.10 Análisis estadístico
Para los estudios con ratones, las diferencias estadísticamente significativas (P < 0,05) en la pérdida de peso corporal se evaluaron mediante una prueba t de Student no pareada de dos colas, y para establecer diferencias estadísticas para las curvas de supervivencia se utilizó la prueba de rangos logarítmicos. Para los experimentos con hurones la significación estadística (P < 0,05) de la pérdida de peso a lo largo del tiempo se realizó mediante el análisis del área bajo la curva (AUC), interpretada como la pérdida de peso total del grupo de animales (n=3) en función del tiempo, utilizando la prueba de pares emparejados de Wilcoxon.
6.5.2 Introducción
Las infecciones por el virus de la influenza A siguen siendo una preocupación importante que causa una gran carga para la salud pública (Molinari et al., 2007, Vaccine 25, 5086-5096). La aparición del virus pandémico H1N1 (pH1 N1) de 2009 proporcionó la primera evidencia directa de que los subtipos que circulaban anteriormente, si se les da suficiente tiempo, pueden causar una nueva pandemia debido a que una gran proporción de la población humana no ha sido expuesta a la hemaglutinina (HA) de esta nueva cepa (Medina y García-Sastre, 2011, Nature Reviews 9, 590 603). Por lo tanto, el nivel y la calidad de los anticuerpos contra HA de protección cruzada juegan un papel importante en la determinación del potencial pandémico de una nueva cepa del virus de la influenza A.
Anteriormente se demostró que la HA de la cepa pH1N1 de 2009 comparte similitudes antigénicas con la HA de los virus humanos H1N1 que circulaban antes de 1950, incluida una gran homología con el virus de 1918 (Kash et al., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121-127; Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Skuntzou et al., 2010), específicamente en torno al sitio antigénico Sa (Krause et al., 2010, J Virol 84, 3127-3130; Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Xu et al., 2010). Por el contrario, la vacunación (Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745) o infección (Kash et al., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121 127) con cepas H1N1 estacionales contemporáneas indujeron poca o ninguna reactividad cruzada con el virus pH1 N1 de 2009, lo que se correlaciona con una mayor diferencia a nivel de aminoácidos observada en o cerca de los sitios antigénicos conocidos que se encuentran en la cabeza globular de la HA (Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745).
Se ha demostrado que los virus de influenza H1N1 y H3N2 estacionales anteriores que circulan en seres humanos experimentan una deriva antigénica (una acumulación gradual de cambios de aminoácidos en o alrededor de los sitios antigénicos de HA con el tiempo) debido a la presión de selección inmunitaria. Algunos de estos cambios de restos dan como resultado la adquisición de sitios de glicosilación en la HA, algunos de los cuales se mantienen, mientras que otros se reemplazan o desaparecen con el tiempo, lo que sugiere que la glicosilación de la HA juega un papel evolutivo importante en los virus de la influenza A humana (Das et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001211; Igarashi et al., 2008, Virology 376, 323-329; Sun et al., 2011, PloS one 6, e22844). Estudios recientes han demostrado que la glicosilación de HA afecta las propiedades antigénicas y de unión al receptor de esta proteína viral. Wang et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18137-18142), así como la virulencia de los virus de la influenza (Tate et al., 2011a, J Immunol 187, 1884-1894; Tate et al., 2011b, Virology 413, 84-92). Resulta de interés que varios sitios de glicosilación en la cabeza globular de la HA han sido adquiridos temporalmente desde 1918 hasta 2009 por los virus estacionales H1N1 y la mayoría de estos están ubicados dentro o cerca del sitio antigénico Sa (Das et al., 2010, (Das et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001211; Igarashi et al., 2008, Virology 376, 323-329; Sun et al., 2011, PloS one 6, e22844). Por el contrario, el virus pH1N1 de 2009 carece de estas glicosilaciones adicionales y comparte el mismo estado de glicosilación que el virus pandémico H1N1 de 1918.
No se ha abordado el papel específico que tiene cada uno de los sitios de glicosilación de H1 en la virulencia y las propiedades antigénicas de pH1N1 2009.
La cepa pH1 N1 de 2009 se ha propagado a nivel mundial desde su brote original en América del Norte y ahora circula estacionalmente en los hemisferios Norte y Sur, reemplazando a los virus H1N1 anteriores. En ese caso, es probable que el virus pH1N1 comience a sufrir una deriva antigénica impulsada por la presión de selección inmunitaria. La adquisición de glicosilaciones podría contribuir a la aparición de variantes de deriva de H1N1. En este ejemplo, se investigaron los efectos específicos de la adquisición de glicosilaciones en la cabeza globular de HA de H1N1 sobre la virulencia y las propiedades antigénicas de los virus H1N1. Los resultados indican que la glicosilación de HA juega un papel crucial tanto en la patogénesis como en el escape de la inmunidad preexistente, así como en la inducción de respuestas de anticuerpos policlonales de reacción cruzada.
6.5.3 Resultados
6.5.3.1 Los virus humanos H1N1 adquirieron sitios de glicosilación en la cabeza globular de la proteína HA con el tiempo
Un análisis general de la secuencia de aminoácidos de los virus pandémicos H1N1 de 1918 y 2009 reveló que la HA1 de estos virus está glicosilada en los mismos sitios. Para comprender mejor las diferencias que podrían ser responsables de las distintas propiedades antigénicas de la proteína HA de H1N1 2009 en comparación con las cepas del virus H1N1 estacional que circulaban justo antes de la pandemia, se centró especial atención en las secuencias de aminoácidos en torno a los sitios antigénicos conocidos. Los alineamientos de secuencias revelaron que desde la introducción en 1918 de los virus H1N1 en seres humanos, se han adquirido varios sitios de glicosilación como predice el motivo N-X-S/T en la cabeza globular de HA con el tiempo (Fig. 22A y 22B). Resulta de interés que estos sitios de glicosilación aparecieron predominantemente cerca o dentro del sitio antigénico Sa (Fig. 22A). Aunque no hay secuencias disponibles de los virus de la influenza humana entre 1918 y 1933, y con la salvedad de que la mayoría de las secuencias de los primeros virus H1N1 son de cepas que se han pasado extensamente en huevos, parece que durante los años 1935 a 1957, se adquirieron secuencialmente tres glicosilaciones de HA diferentes (en los restos de aminoácidos 144, 172 y 177 [numeracion de H3130, 158 y 163, respectivamente]) y se encontraron constantemente en productos aislados humanos. La aparición del virus de la influenza pandémica H2N2 en 1957 desplazó los virus H1N1, que desaparecieron de la circulación humana. La cepa del virus H1N1 resurgió en seres humanos en 1977 y contenía los mismos sitios de glicosilación que los virus H1N1 que circulaban en la década de 1950. En 1986, el sitio de glicosilación 144 fue reemplazado por una glicosilación en la posición 142 (numeración de H3: 128; estos sitios de glicosilación son incompatibles) y se adquirió casi simultáneamente una glicosilación adicional en el sitio 71 (numeración de H3: 59). Sin embargo, en 1987 se perdió el sitio de glicosilación 172 y, desde entonces, los virus H1N1 contemporáneos, incluidos los virus estacionales que circulaban justo antes de la aparición de pH1N1 en 2009, contenían los sitios de glicosilación 71, 142 y 177 en la cabeza globular de HA (Fig. 22B y 22C). Dado que el estado de glicosilación del pH1N1 de 2009 es el mismo que el del virus pandémico H1N1 de 1918, el virus pH1N1 de 2009 podría adquirir las mismas o similares glicosilaciones con el tiempo como resultado de la presión de selección inmunitaria (Wei et al., 2010, Sci Transí Med 2, 24ra21). A continuación, se evaluó el efecto específico de glicosilaciones adicionales sobre la virulencia y las propiedades antigénicas del virus pH1 N1 2009.
6.5.3.2 Las glicosilaciones adicionales en la cabeza globular de HA atenúan el virus pH1N1 in vivo, pero no in vitro
Se generaron virus recombinantes pH1N1 2009 (cepa Neth/09), que se diferencian únicamente por la adición secuencial de glicosilaciones de HA para imitar la aparición temporal de estos sitios en los H1N1 estacionales. A pesar de varios intentos, no fue posible el rescate de un virus que contenía los sitios de glicosilación de HA 144, 172 y 177 en el fondo Neth/09, lo que sugiere que la combinación de estas glicosilaciones específicas podría requerir mutaciones compensatorias adicionales. No obstante, todos los demás virus mutantes se rescataron con éxito in vitro. El análisis fenotípico de estos virus recombinantes mostró que solo el virus que contenía 4 glicosilaciones adicionales (Neth/09 HA 71-142-172-177) tenía un fenotipo de placa más pequeño en las MDKC (Fig. 23A). La adición de sitios de glicosilación de HA dio como resultado una movilidad más lenta de la HA en SDS-PAGE, compatible con el uso de estos sitios (Fig. 23B). Se realizaron cinéticas de crecimiento para evaluar los efectos de las glicosilaciones sobre la capacidad del virus para replicar en células epiteliales traqueobronquiales humanas diferenciadas primarias (HTBE). Todos los virus replicaron a niveles altos (>107 ufp/ml), similares a los del virus aislado Neth/09 WT original (Fig. 23C), lo que indica que estas glicosilaciones adicionales no afectaron a la infección de células humanas. A continuación, se evaluó el potencial patogénico de los virus glicosilados recombinantes en ratones C57BL/6. A partir de este ejemplo, se encontró una atenuación dependiente de la glicosilación en la virulencia de los virus en ratones (es decir, cuantos más sitios de glicosilación hay en la HA, menos patógeno), según se evaluó mediante la pérdida de peso corporal (Fig. 24A-E). Sólo el sitio de glicosilación 144 que contenía el virus mostró patrones de pérdida de peso similares a los observados en ratones infectados con el virus Neth/09 WT (Fig. 24B). Todos los virus con dos o más sitios de glicosilación adicionales estaban severamente atenuados (Figs. 24C-E). La morbilidad se correlacionó con los títulos virales pulmonares en ratones durante los primeros 7 días de infección. Los animales infectados con 144-172, 71-142 177 y 71-142-172-177 tenían títulos significativamente más bajos en comparación con Neth/09 WT. Para determinar si este también es el caso en un modelo animal diferente, se evaluó la virulencia del virus glicosilado 144-172 en comparación con el virus WT en hurones, que es ampliamente aceptado como uno de los mejores modelos animales para estudiar la patogénesis de los virus de la influenza. Hubo una disminución estadísticamente significativa en la pérdida de peso total observada en los animales infectados con el virus 144-172 (Fig. 24G). Curiosamente, los títulos de lavado nasal obtenidos de ambos grupos hasta el día 7 y los títulos de los cornetes nasales el día 3 no mostraron
diferencias (Fig. 24H e I). Sin embargo, la tráquea y los pulmones de los hurones en el día 3 mostraron una disminución de la infección en el virus 144-172 en comparación con Neth/09 WT (Fig. 24I). Esto sugiere que mientras que los virus H1N1 glicosilados pueden replicar a niveles similares en las vías respiratorias superiores (en la nariz), son menos capaces de infectar y replicar en las vías respiratorias inferiores (tráquea y pulmones).
6.5.3.3 El sitio 144 de glicosilación de HA evade la respuesta de anticuerpos policlonales contra HA WT mientras induce una respuesta policlonal más amplia en ratones
Para comprender mejor los efectos de la glicosilación sobre las propiedades antigénicas de los virus H1N1, se probó la actividad HAI de sueros obtenidos de ratones infectados con cada uno de los virus mutantes de glicosilación entre sí (Tabla 9, más abajo). La infección de ratones con el virus rWT o los virus glicosilados 71-142-177 o 71-142-172-177 dio como resultado HAI en sueros baja o no detectable para los virus glicosilados 144 y 144-172, mientras que se mantuvo cierto nivel de reactividad cruzada contra los otros virus. Sorprendentemente, la infección con virus que contenían las glicosilaciones 144 o 144-172 provocó respuestas de anticuerpos capaces de reaccionar de forma cruzada con todos los virus mutantes de glicosilación de HA y el virus Neth/09 WT. En conjunto, esto indica que la mayor parte de la actividad HAI policlonal inducida por los virus, con la excepción de aquellos que contienen el sitio de glicosilación 144, está dirigida contra un sitio, probablemente Sa, enmascarado de manera eficaz por la glicosilación 144. Por el contrario, la glicosilación en la posición 144 cambia el patrón de inducción de las respuestas de anticuerpos policlonales, que parecen ser contra múltiples regiones antigénicas en la HA y no está enmascarada por eventos de glicosilación únicos o múltiples. Por el contrario, la infección con virus que contenían glicosilaciones en las posiciones 71-142-177 o 71-142-172-177 indujo un patrón de reactividad cruzada más estrecho, lo que sugiere que la respuesta humoral policlonal cambia ligeramente, pero permanece enfocada, posiblemente en torno al sitio Sa.
Tabla 9. Títulos de HAI de sueros de ratones después de la infección con mutantes de glicosilaciones pH1N1 2009
6.5.3.4 El sitio 144 de glicosilación de HA evade la respuesta de anticuerpos policlonales contra la vacuna inactivada de pH1N1 en seres humanos
A continuación, se probó la capacidad de la vacuna inactivada de pH1N1 2009 para provocar respuestas de anticuerpos en seres humanos con actividad inhibidora contra los virus H1N1 2009 que contienen las Ha glicosiladas. Se encontró que la mayoría de los individuos adultos que recibieron la vacuna monovalente de pH1N1 2009 tenían respuestas de anticuerpos detectables a todos los virus mutantes de glicosilación (Tabla 10, más abajo). No obstante, la reactividad cruzada más baja se observó con virus que contenían los sitios de glicosilación 144 (y 144-172), y un individuo mostró niveles de actividad HAI indetectables cuando se probó contra estos dos virus. Esto concuerda estrechamente con los resultados de la serología en ratones, lo que enfatiza los efectos de enmascaramiento de la glicosilación en el sitio 144. Como se esperaba, la vacuna estacional trivalente de 2009 que contenía un virus H1N1 estacional previamente circulante, no indujo títulos significativos de HAI contra los virus pH1N1, independientemente de su nivel de glicosilación (Tabla 10, más abajo). Dado que el nivel de exposición previa al virus de la influenza en seres humanos podría afectar sus respuestas de anticuerpos policlonales, también se realizó una evaluación de los títulos séricos de HAI en una población con menos exposición (niños <18 años de edad) que fueron inmunizados con la vacuna inactivada monovalente pH1N1 2009. La actividad de los sueros de estos individuos tenía un patrón de reactividad cruzada similar al de los adultos, mostrando una actividad HAI más baja contra los virus mutantes de glicosilación 144 y 144-172 (Tabla 11, más abajo). Por el contrario, algunos de los sueros pediátricos y de adultos mostraron una actividad considerable contra los virus glicosilados 71-142-177 y 71-142-172-177 (Tablas 10 y 11, más
abajo).
Tabla 10. Títulos de HAI de sueros humanos adultos después de la vacunación con la vacuna inactivada pH1N1 2009.
a Los recuadros en negrita indican el título de reacción cruzada más bajo para cada individuo.
b Muestras de suero humano obtenidas los días 0 (Pre) y 21 (Post) después de la vacunación, respectivamente. c Muestras de suero humano obtenidas los días 0 (Pre) y 63 (Post) después de la vacunación, respectivamente. d TIV 2009: vacuna contra el virus de la influenza inactivada trivalente que incluía las cepas A/Brisbane/57/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) y B/Brisbane/60/2008.
Tabla 11. Títulos de HAI de sueros humanos pediátricos después de la vacunación con la vacuna inactivada pH1N1 2009.
6.5.3.5 Las deleciones de glicosilación en un virus H1N1 estacional reciente aumentan su virulencia in vivo y provocan protección cruzada contra la sensibilización por el virus pH1N1 2009
Para dilucidar adicionalmente el papel de las glicosilaciones de HA en las propiedades patogénicas y antigénicas de los virus H1N1, se generó un conjunto de virus de eliminación de glicosilación, basado en la cepa estacional contemporánea Tx/91 que contiene tres sitios de glicosilación adicionales en su HA, en los sitios 71, 142 y 177. La eliminación de los sitios de glicosilación de HA dio como resultado una movilidad de HA más rápida en SDS-PAGE, como se esperaba (Fig. 25A). La infección con una dosis subletal del virus Tx/91 WT (a 1x103 ufp) no dio como resultado morbilidad en ratones, sin embargo; la infección con virus que contenían las deleciones de 2 o 3 glicosilaciones (A71-177 y A71-142-177) dio como resultado un nivel significativo de pérdida de peso en comparación con el virus rWT (Fig. 25B). La mayor morbilidad se observó en el virus A71-142-177, un virus que se parece al pH1 N1 de 2009 ya que no tiene sitios de glicosilación en la cabeza globular de HA. Esto nuevamente confirmó que la glicosilación de HA afecta negativamente al potencial patogénico in vivo de los virus H1N1. Para investigar si la infección con estos virus de deleción de la glicosilación podría provocar respuestas humorales de protección cruzada frente al virus H1N1 2009 WT antigénicamente muy diverso, estos animales se sensibilizaron el día 27 p.i. con 100 veces la dosis letal del 50% (DL50) del virus Neth/09 WT. Todos los ratones previamente infectados con Tx/91 rWT sucumbieron a la sensibilización con Neth/09, y los ratones infectados con el virus que contenía una sola glicosilación eliminada en el sitio 71 (A71) mostraron una pérdida de peso sustancial y solo una tasa de supervivencia de 20% (Figs. 25 C y D). Por el contrario, aunque los animales infectados con virus con deleciones de glicosilación en los sitios 71-177 (A71 -177) y 71-142-177 (A71 -142-177) mostraron una pérdida sustancial de peso corporal (hasta ~20%), todos sobrevivieron a la sensibilización letal con Neth/09 (Fig. 25D) y los animales infectados con A71-142-177 mostraron un nivel de morbilidad general más bajo (Fig. 25C). Estos datos muestran que las glicosilaciones de HA desempeñan un papel importante en el enmascaramiento de sitios antigénicos y en la obtención de respuestas inmunitarias protectoras contra cepas del virus de la influenza H1N1 antigénicamente diversas.
6.5.4 Discusión
En este ejemplo, se evaluó el efecto de las glicosilaciones en la proteína HA sobre la virulencia y la reactividad cruzada antigénica en el contexto de la cepa pH1 N1 2009 actual. Utilizando un conjunto de virus pH1 N1 2009 recombinantes modificados genéticamente para imitar la adquisición temporal de glicosilaciones en la proteína HA como las observadas para los virus H1N1 estacionales en el pasado, se demostró que las glicosilaciones juegan un papel importante en la modulación de la patogénesis y las propiedades antigénicas de estos virus.
El análisis de secuencia inicial del virus pH1N1 de 2009 reveló una diferencia drástica en comparación con los virus H1N1 estacionales (tipo Bris/59) que circulaban en todo el mundo en el momento del brote (Dawood et al., 2009, N Engl J Med 360, 2605-2615; Garten et al., 2009, Science 325, 197-201; Smith et al., 2009, Nature 459, 1122-1125). El análisis detallado de la proteína HA y estudios experimentales de los autores de la presente invención y otros (Kash et al., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121 -127; Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Skountzou et al., 2010, J. Immunol. 1895(3), 1642-1649), mostraron que el virus pandémico de 2009 estaba más estrechamente relacionado con los virus H1N1 más antiguos que circulaban en seres humanos antes de la década de 1950. La HA de los virus estacionales H1N1 ha adquirido sitios de glicosilación durante su evolución en seres humanos, probablemente como resultado de la presión de selección inmunitaria. Resulta de interés que hayan surgido una serie de glicosilaciones, pero finalmente desaparecieran y algunas se hayan fijado en el tiempo (Fig. 22). Esto sugiere que, durante la evolución viral, algunas de estas glicosilaciones pueden ser perjudiciales para el virus, mientras que otras pueden proporcionar una ventaja de aptitud y/o escape inmunológico para la aparición de variantes de deriva en seres humanos. Debido a que los virus pandémicos pH1N1 2009 y H1N1 1918 tienen el mismo patrón de glicosilación en HA1, existe la posibilidad de que la cepa pH1N1 2009 experimente un patrón evolutivo similar y adquiera glicosilaciones similares en HA con el tiempo, como se observó anteriormente con el H1N1 estacional. (Fig. 22). Por lo tanto, los virus pH1N1 2009 se modificaron genéticamente con motivos de glicosilaciones adicionales que se produjeron naturalmente en los virus H1N1 humanos desde su aparición en 1918. Esto también permitió el estudio de la importancia potencial de tales mutaciones en el contexto de las respuestas protectoras de anticuerpos provocadas por la vacuna pH1N1 2009 en seres humanos.
Los virus recombinantes Neth/09 que contenían sitios de glicosilación adicionales en la HA se atenuaron en ratones y hurones (Fig. 24). No obstante, la capacidad de infección y replicación de los virus glicosilados en células MDCK y HTBE primarias no se vio significativamente afectada (Fig. 23). Entre los virus WT y 144-172, se observaron diferencias en la carga viral en los pulmones y la tráquea de los animales infectados con 144-172, pero no en los cornetes nasales. La infección en estos modelos animales con virus pH1 N1 glicosilados recuerda en gran medida a la infección con virus estacionales H1N1, que generalmente no producen enfermedad en modelos de ratones (Bouvier & Lowen, 2010, Viruses 2, 1530-1563; Pica et al., 2011, Journal of Virology 85(23), 12825-9) y en hurones replican a títulos altos en las vías respiratorias superiores pero no en las vías respiratorias inferiores (Maines et al., 2009, Science 325, 484 487; Munster et al., 2009, Science 325, 481-483). No solo disminuyó la virulencia al añadir sitios de glicosilación en los virus pH1 N1, sino que también aumentó la virulencia al eliminar las glicosilaciones en el contexto del virus H1N1 Tx/91. Por tanto, la adquisición de glicosilaciones en la HA parece reducir la virulencia de los virus H1N1.
La caracterización antigénica de los virus mutantes de glicosilación Neth/09 sugirió que el sitio Sa en la HA es una región antigénica predominante para ratones, hurones (datos no mostrados) y seres humanos, ya que la adición de 1 o 2 glicosilaciones en los restos en torno a este sitio (p. ej., sitios 144 y 144-172) fue suficiente para reducir significativamente la actividad HAI de la respuesta policlonal provocada por el virus no glicosilado WT. De estos dos sitios, 144 parece ser el responsable de este efecto, ya que no se observó una reducción drástica de HAI en el virus
71-142-172-177. La inmunización de seres humanos con la actual cepa de vacuna pH1 N1 2009 inactivada indujo una respuesta inmunitaria de anticuerpos policlonales general que recuerda a la de los ratones y hurones inmunizados con pH1 N1 (Tabla 10, más arriba), ya que la glicosilación en el sitio 144 fue la más eficaz para evadir la reactividad HAI. Del mismo modo, los sueros pediátricos posvacunales analizados muestran una actividad considerable frente a los virus 71-142-177 y 71-142-172-177, pero menor frente a los virus 144 y 144-172. En general, esto indica que la glicosilación de los virus humanos H1N1 afecta en gran medida a sus propiedades antigénicas. También es posible que, como consecuencia de la presión antigénica mediada por el sistema inmunitario, evolucionen nuevos cambios en la HA e impulsen la aparición de nuevos sitios de glicosilación en la cepa pH1 N12009 que modulen sus propiedades antigénicas a medida que continúe circulando estacionalmente en todo el mundo. De ser así, será interesante analizar su impacto en la virulencia y antigenicidad.
De manera importante, la infección con virus que albergan los sitios de glicosilación 144 y 144-172 indujo una respuesta policlonal más amplia capaz de reaccionar de forma cruzada con todos los virus glicosilados WT y Neth/09 generados (Tabla 9, más arriba). El aumento de la respiración en la respuesta policlonal probablemente se deba a la protección del sitio inmunodominante Sa, lo que da como resultado un cambio del foco antigénico que redirige la respuesta humoral a otros epítopos. Sorprendentemente, la protección cruzada contra el virus Neth/09 Wt observada en los ratones infectados con una dosis subletal de los mutantes de deleción de Tx/91 A71-177 y A71-142-177 enfatizan la importancia de las glicosilaciones para "distraer" o redirigir la respuesta humoral. Estos resultados también apuntan al papel evolutivo crucial de la aparición de glicosilaciones en torno al sitio Sa, ya que la eliminación de glicosilaciones dentro o cerca de esta región tiene un profundo efecto en la reactividad cruzada. En conjunto, estos hallazgos destacan los efectos inmunomoduladores de glicosilaciones específicas en las propiedades antigénicas de HA, y también los efectos de las glicosilaciones sobre la respiración en la respuesta inmunitaria a la infección y la vacunación.
6.6 Ejemplo 6: Anticuerpos contra el tronco de hemaglutinina producidos por infección con el virus de la influenza H1N1 pandémico de 2009
Este ejemplo describe polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza que se utilizaron para estudiar anticuerpos específicos del dominio de tallo. Utilizando estos polipéptidos, se determinó que la infección con el virus H1N1 pandémico de 2009 provocó un aumento en el título de anticuerpos neutralizantes de virus dirigidos contra el tallo de hemaglutinina. Además de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza, también se describen ensayos que se pueden utilizar para medir los anticuerpos neutralizantes del virus de la influenza que no se detectan en el ensayo tradicional de inhibición de la hemaglutinación.
6.6.1 Materiales y métodos
6.6.1.1 Células y plásmidos
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (ambos de Gibco), respectivamente, cada uno complementado con suero de ternera fetal al l0% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina-100 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). Se utilizaron medios TNM-FH (Gemini Bioproducts) complementados con suero de ternera fetal al 10% y medios de cultivo de insectos Hyclone SFX (Thermo Scientific) para el cultivo de células Sf9 y BTI-TN5B1-4 (High Five).
Las construcciones de hemaglutinina quimérica (cHA) con el tronco de A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) que contenían el dominio de cabeza globular del virus A/Mallard/Sweden/81/02 (cH6/1) o el virus A/Guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 (cH9/1) se generaron utilizando métodos descritos anteriormente (Hai et al., 2008, J Viro!82, 10580; Fodor et al., 1999, J Virol73, 9679). En resumen, se amplificaron diferentes componentes de la hemaglutinina quimérica (cHA) mediante PCR con cebadores que contenían sitios Sap I, se digirieron con Sap I y se clonaron en los sitios Sap I del plásmido pDZ (Quinlivan et al., 2005, J Virol79, 8431). Para la generación de los plásmidos de transferencia de baculovirus, se amplificaron cH6/1 y cH9/1 mediante PCR, se cortaron con BamHI y NotI y se clonaron en marco en un vector de transferencia de baculovirus pFastBac (Invitrogen) modificado que albergaba un foldon de fago T4 C-terminal y una etiqueta 6-his (Meier et al., 2004, J Mol Biol 344, 1051). Las secuencias de todos los plásmidos se confirmaron mediante secuenciación de Sanger.
6.6.1.2 Generación de baculovirus recombinantes, expresión y purificación de proteínas
Para generar las proteínas de cH6/1 y cH9/1 recombinantes, los vectores de transferencia de baculovirus se transformaron en la cepa de E. coli DH10Bac (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se recogieron colonias de DH10Bac que mostraban el fenotipo correcto, se cultivaron y se prepararon bácmidos utilizando un Plasmid Midi Kit (Qiagen).
Los bácmidos que portan los genes de cH6/1 o cH9/1 se transfectaron en células Sf9 con Cellfectin II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El baculovirus recombinante se amplificó en células Sf9 cultivadas en medio TNM-FH (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA) y los títulos se determinaron mediante ensayo en placa (King et al., 2007, Methods Mol Biol 388, 77).
Las células High Five cultivadas en medios de células de insecto HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific) se infectaron con baculovirus recombinantes que expresan cH6/1 o cH9/1 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y una densidad celular de 1x106 células/ml en matraces agitadores de 500 ml (Krammer et al., 2010, Mol Biotechnol 45, 226). Las células se recogieron 96 horas después de la infección y se separaron del sobrenadante mediante centrifugación a baja velocidad durante 10 minutos a 2000 g y temperatura ambiente. Para la purificación de las proteínas cHA, se recogió el sobrenadante y se incubó con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas a 4°C. La suspensión se cargó en columnas y se lavó 3 veces con tampón de lavado (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). La proteína se eluyó en etapas de 0,5 ml con tampón de elución (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8), se probó para determinar el contenido de proteína con reactivo de Bradford y se agruparon las fracciones que contenían proteína. Las fracciones agrupadas se sometieron a cambio de tampón en PBS y se concentraron utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) con un corte de peso molecular de 10 kD en un rotor de cubeta oscilante. La pureza y la identidad de las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para confirmar la expresión de cHA: antisuero de cabra anti-H6 (BEI, #NR-663), G1-26 (anti-H9, ratón; BEI# NR-9485), 3951 (conejo, anti-HA2 PR8) (Graves et al., 1983, Virology 126, 106), PY102 (anti-cabeza de PR8, ratón) y 12D1 (anti-tronco de H3, ratón) (Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796). Las concentraciones finales de proteína se determinaron con el reactivo de Bradford.
6.6.1.3 Rescate de virus recombinantes que expresan cHA
Para rescatar el virus recombinante que expresa cH9/1, se utilizaron los plásmidos de genética inversa que codificaban el ARNv y el ARNm de los seis segmentos virales de tipo salvaje de PR8, así como los plásmidos que codificaban la NA de N3 del virus A/mallard/Alberta/24/01 y cH9/1, como se describió previamente (Hai et al., 2008, J Virol82, 10580; Fodor et al., 1999, J Virol73, 9679, 27). Brevemente, se transfectaron células 293T con 1 μg de cada uno de los ocho plásmidos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. A las 12 horas de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM que contenía albúmina de suero bovino al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 μg de tripsina tratada con TPCK (L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona)/mL (Sigma T1426). Dos días después de la transfección, se inoculó sobrenadante que contenía virus en huevos de gallina embrionados de 10 días. El líquido alantoideo se recogió después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó para detectar la presencia de virus por hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo. El virus cH9/1 rescatado a continuación, se propagó en huevos de 10 días después de una incubación de 48 horas a 37°C. Las reservas de virus se titularon mediante un ensayo en placa como se describió previamente en células MDCK en presencia de tripsina TPCK (Steel et al., 2009, J Virol 83, 1742). La secuencia del ARN de cH9/1 se confirmó mediante secuenciación de productos de PCR de transcripción inversa.
6.6.1.4 Inmunofluorescencia para confirmar la expresión de hemaglutinina quimérica
Se infectaron monocapas confluentes de células MDCK con el virus cH9/1N3 a una MOI de 2. A las 48 horas de la infección, las células se fijaron y bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%. A continuación, las células se incubaron con mAb de ratón: anticuerpo anti-NP HT103, PY102, anti-H9 (BEI NR#9485), o un anticuerpo específico de tronco pan-H1 (6F12). Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 hora con anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.6.1.5 Muestras de suero humano
Las muestras de sueros humanos se recolectaron y utilizaron según uno los protocolos institucionales. Se recogieron sueros de tres cohortes de pacientes: adultos no infectados con pH1N1, niños no infectados con pH1N1 y adultos infectados con el virus pH1N1. Se recolectaron sueros de pacientes infectados con pH1N1 dentro de las primeras 3 semanas de infección sintomática. Para los experimentos que utilizan suero combinado, se mezcló un volumen igual de cada muestra para generar un conjunto. La confirmación de la infección fue realizada por Wrammert et al. por RT-PCR y por ensayos serológicos (Wrammert et al., 2011, J Exp M ed208, 181 -193).
6.6.1.6 Ensayos de inhibición de hemaglutinina
Los sueros recolectados se inactivaron primero mediante tratamiento con tripsina-calor-peryodato o mediante tratamiento con RDE para eliminar los inhibidores no específicos de la hemaglutinación (Coleman, Dowdle, 1969, Bull World Health Organ 41, 415 (1969). Se realizaron ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) para probar la reactividad con virus cH9/1 N3 y A/duck/France/MB42/76 (HA H6) (Desselberger et al., 1978, Proc Natl Acad Sci U S A 75, 3341 (julio, 1978)) como se describió anteriormente (Lowen et al., 2009, J Virol 83, 2803). Una muestra se considera negativa si no se observa actividad de HI con una dilución 1:10 del suero.
6.6.1.7 ELISA
Se recubrieron placas ELISA de noventa y seis pocillos (Qiagen HisSorb o Nunc Immulon 2) con 50 ul de proteínas cH6/1, cH9/1 expresadas en baculovirus o hemaglutinina de longitud completa (HA H5, b Ei NR#660; H3 HA, BEI NR#15171) o secuencia H1 (PR8) hélice alfa larga (LAH) (Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979) diluida en PBS y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con leche al 0,5%/suero de cabra al 2%/PBS y a continuación, se lavaron 3X con PBS/Tween al 0,1% (PBST). Los anticuerpos monoclonales, los sueros de sujetos humanos y los sueros de ratones utilizados como controles se diluyeron en serie en PBS o tampón de bloqueo y a continuación, se añadieron a la placa, seguido de una hora de incubación a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron 3X con PBST y se incubaron con una dilución 1:5000 de anti-IgG [Fc] humana de cabra acoplada a fosfatasa alcalina (AP) (Meridian Life Science) o anti-AP de ratón (Invitrogen) durante una hora adicional. Después de lavar 3X con PBST, se añadió sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma). La reacción se detuvo con NaOH después de 10 minutos y se tomaron medidas de densidad óptica a 405 nm.
6.6.1.8 Ensayo de reducción de placa
Los sueros de pacientes adultos infectados y sin tratamiento previo (no infectados con el virus pH1N1) se agruparon primero y se cargaron en una columna de flujo por gravedad con proteína G acoplada a Sefarosa (GE Healthcare) para la purificación de proteínas IgG. La columna se lavó con PBS. Los anticuerpos policlonales se eluyeron con un tampón de glicina 0,1 M (pH 2,7). Se añadió inmediatamente un tampón Tris-HCl 2 M (pH 10) a una razón 1:10 para restaurar el pH. El eluato se sometió a cambió de tampón en PBS y se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore) con un corte de peso molecular de 50 kD en un rotor de cubeta oscilante. Las concentraciones de proteína se midieron en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 utilizando el método A280. La eliminación de los inhibidores séricos no específicos se confirmó mediante pruebas de HI utilizando múltiples cepas de virus que demostraron una ausencia de actividad de HI en las preparaciones de IgG purificadas (datos no mostrados). La capacidad de neutralización de los anticuerpos reactivos contra el tronco se evaluó como se describió anteriormente (Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796). Primero se diluyó el virus a una concentración que produjera 100 unidades formadoras de placa por pocillo. A continuación, se incubaron conjuntamente diferentes concentraciones de IgG de los sueros agrupados con el virus a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron placas de seis pocillos sembradas con células MDCK con PBS y a continuación, se infectaron con 200 ul de mezclas de virus-IgG. Después de una incubación de cuarenta y cinco minutos a 37°C, se aspiraron el virus y la IgG de las células y se añadió a cada pocillo una capa de agar que contenía la concentración adecuada de anticuerpo y tripsina TPCK. Las placas se incubaron durante 2 días a 37°C. Las placas se visualizaron mediante inmunotinción (Bouvier et al., 2008, J Virol82, 10052) utilizando el anticuerpo anti-H9 G1-26.
6.6.1.9 Ensayo de neutralización de partículas pseudotipo
El procedimiento para la producción de partículas pseudotipo se adaptó de estudios previos (Evans et al., 2007, Nature 446, 801). Brevemente, las células 293-T se cotransfectaron con cuatro plásmidos que codificaban (i) un provirus que contenía el informador deseado (V1-GLuc), (ii) Gag-Pol de VIH, (iii) la proteína hemaglutinina quimérica cH9/1 y (iv) neuraminidasa (NA) de influenza B/Yamagata/16/88 (Tscheme et al., 2010, J VirolMethods 163, 336). El plásmido V1-GLuc codifica una proteína luciferasa que es secretada por las células y puede detectarse en el sobrenadante celular. Los sobrenadantes se recogieron 48 h después de la transfección y posteriormente se filtraron (tamaño de poro de 0,45 μm) para purificar las preparaciones de partículas de cH9/1. A continuación, las partículas se incubaron (en la cantidad determinada para proporcionar actividad de luciferasa dentro del rango lineal después de la infección) con diferentes concentraciones (50 μg/ml, 10 μg/ml y 2 μg/ml) de IgG humanas purificadas y se añadieron a células MDCK. Las infecciones prosiguieron durante 6 horas antes de que se lavaran las células y se pusiera sobrenadante de nueva aportación sobre las células. Todas las infecciones con partículas pseudotipo se realizaron en presencia de 1 μg/ml de Polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (Tscheme et al., 2010, J Virol Methods 163, 336). Se realizaron ensayos de luciferasa cuarenta y ocho horas después de la infección.
6.6.2 Resultados
6.6.2.1 Desarrollo de reactivos basados en hemaglutinina quimérica
Se generaron construcciones de hemaglutinina quimérica (cHA) para que sirvieran como herramientas analíticas para evaluar la presencia de anticuerpos de tronco en sueros humanos. Aprovechando un enlace disulfuro que existe entre C52 y C277, y que delinea el límite entre el tronco y la cabeza de HA, se diseñaron plásmidos de expresión que codificaban el dominio de cabeza globular de una hemaglutinina H6 o H9 sobre el dominio de tronco de la HA de Virus PR8 (Fig. 26A). Se planteó la hipótesis de que las muestras de suero humano que contenían anticuerpos contra el tronco probablemente serían negativas para la actividad de inhibición de la hemaglutinación (HI) contra los virus H6 o H9 (debido a la falta de exposición previa a estos subtipos de virus), pero serían reactivas con las construcciones cH6/1 o cH9/1 debido a la exposición previa al tronco de hemaglutinina H1. Estas herramientas, las proteínas cHA expresadas de forma recombinante y los virus que expresan las cHA, podrían utilizarse para evaluar cantidades relativas de anticuerpos de tronco en muestras de suero humano y para medir cualquier actividad neutralizante mediada por esos anticuerpos específicos de tronco.
Con el fin de generar proteína cH6/1 y cH9/1 para ensayos analíticos, se generaron plásmidos que codificaban las HA quiméricas y se expresaron como proteínas solubles en un sistema de expresión de baculovirus. La tinción con Coomassie de 2 μg de proteína total sugiere un alto grado de pureza en estas preparaciones (Fig. 29A). Se cree que la migración ligeramente retrasada de cH9/1 es el resultado de un mayor número de sitios de glicosilación ocupados en la cabeza de cH9/1. Las proteínas cHA se caracterizaron adicionalmente por análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos reactivos con varias partes de la HA. Como se muestra en la Fig. 29B, sólo cH6/1, cH9/1 y HA de longitud completa de PR8 reaccionaron con un antisuero policlonal de conejo específico para el tronco de PR8. Los anticuerpos monoclonales contra los dominios de cabeza de H6, H9 y PR8 confirmaron que las construcciones quiméricas expresaban cabezas exóticas sobre un tronco de PR8. La proteína H3 se utilizó como control negativo y solo se detectó cuando se utilizó el anticuerpo pan-H3 12D1 (Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796).
También se rescataron virus recombinantes que expresaban las moléculas quiméricas con el fin de detectar anticuerpos contra el tronco neutralizantes. Debido a que todos los virus de la influenza humana durante el último siglo han codificado NA del subtipo N1 o N2, se razonó que el rescate del virus cH9/1 N3 reordenado permitiría la evaluación de la capacidad de neutralización de los anticuerpos específicos del tronco, sin medir cualquier actividad de anticuerpo de neuraminidasa (N1 o N2). El virus cH9/1N3 (que expresa el tronco H1 con cabeza globular de HA H9 con una neuraminidasa de subtipo N3) se rescató utilizando genética inversa y se cultivó a títulos altos en huevos de gallina embrionados. El fenotipo del ensayo en placa de este virus fue similar al del virus PR8 de tipo salvaje (Fig. 29C). Para confirmar la presencia de la cabeza H9 después del pase del virus, las células se infectaron con el virus cH9/1 N3. A continuación, las células infectadas se sondaron con mAb G1-26 de ratón, un anticuerpo específico para las proteínas de hemaglutinina del subtipo H9. Se utilizó un anticuerpo específico de tronco pan-H1, 6F12, para detectar células infectadas con virus PR8 de tipo salvaje y cH9/1 N3 (Fig. 26B).
6.6.2.2 Los anticuerpos específicos de tronco se unen y neutralizan cHA
Para confirmar que las proteínas cH6/1 y cH9/1 podían utilizarse como herramientas para detectar anticuerpos contra el tallo, primero se validó el uso de estas cHA con un anticuerpo que se sabe que reacciona con el tronco de HA. De hecho, el mAb C179 de ratón, un anticuerpo reactivo con el tronco de HA H1 (Okuno et al., 1993, J Virol67, 2552), se unió a las proteínas cH6/1 y cH9/1 expresadas en baculovirus mediante ELISA de una manera dependiente de la dosis (Figs. 30A y B).
A continuación, se comprobó si la replicación del virus cH9/1N3 podía inhibirse mediante el anticuerpo monoclonal 6F12, que tiene actividad neutralizante frente a los virus de la influenza H1 (datos no mostrados). El anticuerpo 6F12 fue capaz de unirse y neutralizar el virus cH9/1N3 en un ensayo de reducción de placas (Fig. 30C y D), de manera dependiente de la dosis, observándose una inhibición de cien por cien a concentraciones superiores a 4 μg/ml. Estos
resultados validaron la hipótesis de que las proteínas quiméricas y el virus cH9/1N3 recombinante podrían utilizarse para detectar anticuerpos contra el tronco con actividad neutralizante.
6.6.2.3 Los pacientes infectados con pH1N1 tienen títulos altos de anticuerpos que se unen y neutralizan cHA
Antes del uso de las proteínas solubles cH6/1 y cH9/1 para cuantificar los anticuerpos reactivos con el tronco en muestras de sangre de pacientes, se analizó la actividad HI de los sueros frente a virus que expresaban estos dos subtipos de HA. Utilizando los virus A/duck/France/MB42/76 (H6) y cH9/1N3, se confirmó que todas las muestras de suero pediátricas y adultas recolectadas eran negativas para HI (resultados no mostrados).
A continuación, se probó mediante ELISA la reactividad de los sueros con las proteínas cH6/1 y cH9/1. Los sueros recolectados de sujetos adultos y pediátricos no infectados con virus pH1 N1 mostraron poca reactividad con cualquiera de las proteínas. Sin embargo, los sueros recolectados de pacientes infectados con el virus de la influenza pH1N1 mostraron una mayor unión a ambas construcciones de cHA, con una diferencia de más de 30 veces en la reactividad de IgG (comparando las diluciones que proporcionaron lecturas de densidad óptica equivalentes) al comparar grupos de suero de pH1 N1 infectados con los de adultos y niños no infectados (Fig. 27A y B). Por lo tanto, se razonó, teniendo en cuenta los datos de HI negativos, que la reactividad con las proteínas cHA se produce en el dominio de tronco.
Utilizando muestras agrupadas de sueros humanos, también se probó la unión de IgG a una porción del tronco de HA, la hélice alfa larga (LAH). Se había demostrado previamente que estas IgG median la inmunidad protectora en ratones (Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979). Los sueros de pacientes infectados con pH1N1 contenían anticuerpos reactivos con LAH de H1, mientras que los pacientes no expuestos al virus pandémico tenían un mínimo de anticuerpos séricos específicos de LAH (Fig. 27C).
El subtipo de hemaglutinina H5 está dentro del mismo grupo filogenético que el de la HA H1 y comparte una estructura de tronco muy similar (Ekiert et al., 2009, Science 324, 246). Curiosamente, los pacientes expuestos al pH1 N1 habían reforzado las especificidades de los anticuerpos séricos reactivos con la proteína H5. (Fig. 27D), mientras que no tenían ninguna actividad de HI en suero contra el virus del subtipo H5 homólogo (datos no mostrados). Este resultado sugirió que la exposición al virus pH1N1 puede haber conferido un grado de inmunidad anti-H5 mediada por anticuerpos específicos del tronco.
Es importante destacar que los pacientes infectados con pH1N1 no tenían anticuerpos séricos reforzados específicos para una proteína hemaglutinina H3 (H3 está en un grupo filogenético separado de las HA H1 y H5) (Fig. 27E). Este resultado demuestra que el título mejorado de anticuerpos específicos del tronco en sueros de pacientes infectados con pH1 N1 no es una función de la estimulación inmunitaria general; más bien, las especificidades del anticuerpo del tronco H1 se vieron reforzadas selectivamente por la infección con la cepa del virus pandémico.
A continuación, se evaluó si estos anticuerpos reactivos contra el tronco encontrados en estas muestras humanas tenían capacidad neutralizante. Se agruparon muestras de suero de adultos infectados y no infectados y se purificó la IgG total para eliminar los inhibidores no específicos (p. ej., moléculas que contienen ácido siálico y lectinas) que se unirían a la cabeza de hemaglutinina. Utilizando estas preparaciones de IgG pura, se logró la formación de placa de inhibición completa a concentraciones de anticuerpo por encima de 55,5 μg/mL de IgG sérica total (Fig. 28A y B). Según los datos de ELISA, se observó una diferencia de aproximadamente 30 veces en la capacidad de neutralización al comparar sueros de pH1N1 infectados con los de adultos no infectados. Utilizando mAb 6F12 como patrón, se pudo realizar una comparación entre las actividades neutralizantes mediadas por 6F12 y la preparación de IgG humana policlonal. Al comparar las concentraciones de 6F12 e IgG humana que produjeron una neutralización de 100% del virus cHA, se estimó que 7% del total de IgG humana de pacientes infectados con pH1 N1 durante los últimos 30 días comprendía anticuerpos contra el tronco neutralizantes.
Finalmente, se evaluó la capacidad de neutralización de los anticuerpos reactivos contra el tronco, utilizando un ensayo de infección de partículas pseudotipo que tiene una lectura de la actividad luciferasa que se genera tras la entrada del virus en las células anfitrionas. Las partículas pseudotipificadas que expresaban la proteína cH9/1 se incubaron con IgG humana purificada y se midió la actividad neutralizante mediante la inhibición de la entrada de partículas, lo que dio como resultado la ausencia de actividad enzimática de luciferasa en los sobrenadantes celulares (véanse métodos). Conforme al ensayo de reducción de placa, el ensayo de partículas pseudotipificadas también mostró una neutralización de 100% de las partículas a concentraciones de IgG total superiores a 10 μg/ml (Fig. 28C).
6.6.3 Conclusión
Se desarrollaron nuevas herramientas analíticas, en forma de proteínas de hemaglutinina quiméricas y virus que expresaban esas proteínas quiméricas, que permitieron la detección selectiva de anticuerpos específicos del tronco en preparaciones que también incluían anticuerpos que se unen a la cabeza globular de las proteínas hemaglutinina. Estas nuevas construcciones de hemaglutinina tienen un tronco de subtipo H1 constante, con dominios de cabeza globulares de distintos subtipos de hemaglutinina (por ejemplo: tronco H1 con cabeza H6). Esto se logró aprovechando un enlace disulfuro que existe entre las cisteínas 52 y 277 en la proteína hemaglutinina (19) para intercambiar la secuencia intermedia por la de un subtipo diferente de HA.
Utilizando estas construcciones de hemaglutinina quimérica (cHA), se demostró que una pequeña cohorte de seres humanos con infección confirmada por el virus pH1N1 generó un alto título de anticuerpos neutralizantes específicos del tronco en comparación con los controles adultos y pediátricos no infectados con los virus pH1 N1. Estos hallazgos respaldan la hipótesis de que los anticuerpos reactivos con el tronco de hemaglutinina, generados en respuesta a la infección por pH1 N1, probablemente contribuyeron a la extinción de los virus H1N1 estacionales que circulaban antes de la pandemia de influenza de 2009.
6.7 Ejemplo 7: virus de la influenza que expresan hemaglutininas quiméricas: dominios de cabeza globular y tronco derivados de diferentes subtipos y grupos filogenicos
Este ejemplo describe varias hemaglutininas quiméricas del virus de la influenza funcionales que abarcan una variedad de combinaciones de cabeza globular y tronco de diferentes subtipos de hemaglutinina y diferentes grupos filogénicos, así como virus de influenza recombinantes que expresan estas hemaglutininas quiméricas, que tenían propiedades de crecimiento similares a las de los virus de influenza de tipo salvaje. Estos virus recombinantes quiméricos poseen propiedades de crecimiento similares a las de los virus de influenza de tipo salvaje y se pueden utilizar como reactivos para medir anticuerpos específicos de dominio en ensayos virológicos e inmunológicos.
6.7.1 Materiales y métodos
6.7.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) o en MEM (Gibco, Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone; Thermo Scientific) y penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). Los virus de tipo salvaje A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) y A/Perth/16/2009 (Perth/09) (amablemente proporcionados por Alexander Klimov, CDC) y recombinantes se cultivaron en huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos de 10 días. (Charles River) a 37°C durante 2 días.
6.7.1.2 Construcción de plásmidos.
Los plásmidos que codificaban las diferentes hemaglutininas quiméricas se construyeron utilizando una estrategia similar a la descrita anteriormente (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Viro!73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Viro! 82:10580-10590). Brevemente, los diferentes segmentos de HA quimérica se amplificaron por PCR con cebadores que contenían sitios SapI, se digirieron con SapI, y se clonaron en los sitios SapI del vector de expresión pDZ ambisense en el que la transcripción de ARNv está controlada por el promotor de ARN polimerasa I humana y el terminador de ARN polimerasa I de ratón, y la transcripción de ARNm/ARNc está controlada por el promotor de beta actina polimerasa II de pollo (véase, p. ej., Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439), mediante ligación multisegmentaria. Los autores de la presente invención agradecen amablemente a Daniel Pérez (Universidad de Maryland) el plásmido de HA H7 (Genbank ID: DQ017504). Los plásmidos que codificaban los genes A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) se utilizaron como se describió previamente (Hai et al., 2008, J Virol82:10580-10590).
6.7.1.3 Número de acceso de la secuencia de nucleótidos
Todos los genes cHA construidos utilizados en este estudio se han depositado en la Base de Datos de Investigación de Influenza con el número de acceso IRD-RG-684014, IRD-RG-684022, IRD-RG-684030 e IRD-RG-684038. Los cH1/1, cH5/1, cH7/3 y cH5/3 quiméricos se enumeran como A/Puerto Rico/8-RGcH1-1/34, A/Puerto Rico/8-RGcH5-1/34, A/Perth/16-RGcH7-3/09 y A/Perth/16-RGcH5-3/09, respectivamente.
6.7.1.4 Análisis de citometría de flu jo
Para evaluar los niveles de expresión de la proteína hemaglutinina en la superficie celular, se transfectaron células 293T con 1 gg del plásmido apropiado utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante o se infectaron células MDCK con virus recombinantes que expresaban cHA. A las 48 h de la transfección, las células 293T se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2% antes de teñirlas con el anticuerpo monoclonal (mAb) 6F12 (5 gg/ml), un mAb generado en el laboratorio de los autores de la presente invención que es ampliamente reactivo con el dominio de tronco de las HA de grupo 1 (datos no mostrados) o con el mAb 12D1 (5 gg/mL) contra las HA H3 (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e 1000796). A las 12 h de la infección, las células MDCK se resuspendieron mediante tripsinización y se tiñeron con mAb 12D1. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytomics FC 500 y los resultados se analizaron utilizando el soporte lógico FlowJo.
6.7.1.5 Generación y ensayo de entrada de pseudopartículas
El procedimiento para la producción de pseudopartículas fue adaptado de estudios previos (véanse, p. ej., Evans et al., 2007, Nature 446:801-805 y Tscheme et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43). Brevemente, los autores de la presente invención cotransfectaron células 293T con cuatro plásmidos que codificaban (i) un pro-virus que contenía el informador deseado (luciferasa V1 de Gaussia) (Evans et al., 2007, Nature 446:801-805), (ii) Gag-Pol de VIH (Evans et al., 2007, Nature 446:801-805), (iii) proteína hemaglutinina quimérica y (iv) neuraminidasa (NA) del virus B/Yamagata/16/88. Los sobrenadantes se recogieron 72 h después de la transfección y posteriormente se filtraron
(tamaño de poro de 0,45 μm). La presencia de partículas similares a virus (VLP) de pseudotipo se evaluó mediante un ensayo de hemaglutinación. Se ajustaron diferentes preparaciones de VLP a las mismas 4 unidades de hemaglutinación antes de la inoculación de células MDCK. Todos los siguientes ensayos con pseudopartículas se realizaron en presencia de 1 μg/mL de Polibreno (Sigma) para aumentar la eficacia de la transducción (Véanse, p. ej., Evans et al., 2007, Nature 446:801-805 y Tscheme et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43).
El ensayo de entrada se realizó transduciendo células MDCK con pseudopartículas que expresaban diferentes hemaglutininas quiméricas y contenían el informador de luciferasa de Gaussia. Veinticuatro horas después de la transducción, las células se lavaron tres veces con medio de nueva aportación para eliminar cualquier proteína luciferasa de Gaussia residual presente en el inóculo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se realizaron ensayos de luciferasa (Evans et al., 2007, Nature 446:801-805).
6.7.1.6 Rescate de virus de influenza A quiméricos recombinantes
El rescate de los virus de influenza A del ADN del plásmido se realizó como se describió anteriormente (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Para generar el virus PR8 recombinante de tipo salvaje (rWT), se cotransfectaron células 293T con 1 μg de 8 plásmidos de rescate pDZ PR8 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El plásmido HA de tipo salvaje se sustituyó por un plásmido que codificaba la HA quimérica deseada para generar virus recombinantes que expresan cHA. A las 6 h de la transfección, el medio se reemplazó por DMEM que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 μg/ml de tripsina tratada con TPCK (L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona) (Sigma). A las 24 horas de la transfección, se inocularon huevos de gallina embrionados de 8 días con sobrenadante que contenía virus. Se recogió líquido alantoideo después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó la presencia de virus mediante hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo. Las reservas de virus se titularon mediante un ensayo en placa en células MDCK como se describió anteriormente (Fodor et al., 1999, J Virol73:9679-9682, Hai et al., 2008, J Virol82:10580-10590).
6.7.1.7 Ensayo de cinética de crecim iento de virus
Para analizar las características de replicación de los virus recombinantes, se inocularon huevos de gallina embrionados de 10 días con 100 unidades formadoras de placa (ufp) de virus recombinantes de tipo salvaje o que expresaban cHA. Se recogió líquido alantoideo y posteriormente se analizó el crecimiento viral a las 0, 9, 24, 48 y 72 h de la infección (hpi). Los títulos de virus presentes en el líquido alantoideo se determinaron mediante ensayo en placa en células MDCK como se indica anteriormente.
6.7.1.8 inm unotinción de placas
Las placas se visualizaron mediante inmunotinción con mAb HT103 contra la nucleoproteína (NP) de influenza A, utilizando un protocolo que se ha descrito previamente (Bouvier et al., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; y Steel et al, 2009, J Virol83:1742-53).
6.7.1.9 Transferencia Western y análisis de inmunofluorescencia indirecta
Las células MDCK confluentes se infectaron (multiplicidad de infección [MOI] de 2) con los virus de la influenza recombinantes indicados o se infectaron de forma simulada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 h a 37°C. A las 12 hpi, las células se lisaron en tampón de carga 1X SDS como se describió anteriormente (véase, p. ej., Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los productos lisados celulares reducidos se analizaron mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales (mAb) contra la nucleoproteína (NP) del virus de la influenza A (HT103), dominio de cabeza de h A de PR8 (PY102), dominio de cabeza de HA de Cal/09 (29E3), dominio de cabeza de HA de VN/04 (mAb #8) y 12D1, un anticuerpo pan-H3 reactivo contra el tronco de HA. Para detectar los dominios de cabeza H7, se utilizó suero policlonal de cabra NR-3152 (originado contra el virus A/FPV/Dutch/27 (H7), BEI Resources). Se utilizó un anticuerpo anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Abcam) para el control de carga. Las proteínas se visualizaron utilizando un sistema mejorado de detección de proteínas por quimioluminiscencia (PerkinElmer Life Sciences).
Para el análisis de inmunofluorescencia, se infectaron monocapas confluentes de células MDCK en cubreobjetos de 15 mm con virus recombinantes a una MOI de 2. A las 15 hpi, las células se fijaron y permeabilizaron con metanolacetona (razón 1:1) a -20°C. durante 20 minutos. Después de ser bloqueadas con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con los anticuerpos descritos anteriormente, así como con mAb 6F12. Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con anti-IgG ratón conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen) o anti-IgG de cabra conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Después de los últimos tres lavados, las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.7.1.10 Ensayo de reducción de placas
El ensayo de reducción de placa se realizó como se describió anteriormente (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). Se incubaron aproximadamente de 60 a 80 ufp de virus recombinantes que expresaban cHA formadas por dominios de cabeza globular Cal/09 o VN/04 sobre un tronco de PR8 con o sin diferentes concentraciones (100, 20, 4, 0,8, 0,16 y 0,032 ug/ml) de mAb KΒ2, un anticuerpo anti-tronco de HA ampliamente neutralizante generado en el laboratorio de los autores de la presente invención (datos no mostrados) durante 60 minutos en un volumen total de 240 uL a temperatura ambiente. Una capa confluente de células MDCK en placas de 6 pocillos se lavó dos veces con PBS y a continuación, se incubó con la mezcla de anticuerpo y virus durante 40 minutos a 37°C. A continuación, se añadió una capa de agar TPCK-tripsina complementada con anticuerpo a las concentraciones descritas anteriormente o sin anticuerpo a cada pocillo después de que el inóculo se hubiera aspirado. Las placas se incubaron durante 2 días a 37°C. A continuación, las placas se visualizaron mediante inmunotinción (Bouvier et al., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; y Steel et al, 2009, J Virol83:1742-53) con anticuerpo anti-NP de influenza A Ht 103.
6.7.1.11 Ensayo de neutralización de partículas pseudotipo
El procedimiento para la producción de partículas pseudotipo fue el mismo que se describió anteriormente, utilizando la construcción de cHA que se compone de una cabeza de VN/04 (H5) o Cal/09 (H1) y un tronco de PR8 (H1) con la NA del virus influenza B/Yamagata/16/88. A continuación, las partículas se incubaron con diferentes concentraciones de mAb KΒ2 a diluciones 1:5 veces desde 100 hasta 0,032 gg/ml. A continuación, estas mezclas se añadieron a las células MDCK. Las transducciones prosiguieron durante 6 horas antes de que se lavaran las células y se colocara medio de nueva aportación sobre las células. Todas las transducciones con partículas pseudotipo se realizaron en presencia de 1 gg/mL de Polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (Tscheme et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43). Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se realizaron ensayos de luciferasa para evaluar el grado en que el mAb KΒ2 bloqueaba la entrada.
6.7.2 Resultados:
6.7.2.1 Generación de hemaglutininas quiméricas
Para ver si los restos de cisteína que forman el enlace disulfuro Cys52-Cys277 se conservaban, en este estudio se utilizó un alineamiento de las secuencias de HA del virus influenza A de los subtipos H1, H3, H5 y H7. Debido a que estos restos de cisteína están altamente conservados en los subtipos de HA, para las HA tanto del grupo 1 del grupo 2, se utilizó el enlace disulfuro Cys52-Cys277 como un punto de delimitación entre los dominios de cabeza y tronco. Al definir la secuencia entre Cys52 y Cys277 como la región de cabeza, y el resto de la molécula como tronco, se racionalizó que se podrían preparar construcciones que codificaran nuevas combinaciones de cabeza y tronco a partir de una variedad de subtipos de HA (Fig. 31A y B)).
El grado de identidad de aminoácidos que existe entre las regiones del tronco de los subtipos de hemaglutinina animó adicionalmente a los autores de la presente invención a pensar que el intercambio de dominios de cabeza podría ser posible. Se observaron porcentajes más altos de identidad de aminoácidos en los dominios de tronco en todos los subtipos, en comparación con los dominios de cabeza (Fig. 32).
Los 16 subtipos de HA de la influenza se clasifican en dos grupos filogenéticos (Palese y Shaw, 2006, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, Fields virology, 5a ed., 1647-1690). Debido a que se observaron porcentajes más altos de identidad de aminoácidos dentro de las regiones del tronco de un grupo en particular (Fig. 32) y debido a que se había generado con éxito un virus con cHA que contenía dominios de cabeza y tronco de virus del grupo 1 (Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-8), se intentaron generar cHA intragrupo. Para el grupo 1, se generaron dos construcciones quiméricas de hemaglutinina que codificaban el dominio de cabeza globular de HA Cal/09 H1 o VN/04 pandémicos con la región del tronco de HA PR8 (H1) (cH1/1 y cH5/1, respectivamente) (Fig. 31B). Se aplicó una estrategia similar para generar una HA quimérica que expresaba dominios de cabeza y tronco de diferentes cepas de influenza del grupo 2: la cabeza de HA (cH7/3) Alb/01 (H7, grupo 2) y la región del tronco de Perth/09 (H3, grupo 2) (Figura 1B). Finalmente, se evaluó si los dominios de cabeza y tronco podrían intercambiarse para crear una HA quimérica entre grupos que contuviera el dominio de cabeza de HA VN/05 (H5, grupo 1) sobre un tronco de HA Perth/09 (H3, grupo 2) (cH5/3) (Figura 31B).
Después de la construcción de estos plásmidos, se realizaron experimentos para determinar si las diferentes construcciones de HA quiméricas podrían expresarse y transportarse a la superficie celular como HA de tipo salvaje. El análisis del clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) de las células 293T transfectadas transitoriamente se realizó después de la tinción de la superficie con anticuerpos específicos del dominio de tronco H1 y H3, respectivamente. Utilizando este método, se detectó la expresión en la superficie celular de las cuatro construcciones quiméricas (Fig. 33). Sin embargo, en comparación con HA de PR8 de tipo salvaje, se detectó menos expresión de proteína de superficie para la construcción cH1/1, lo que podría atribuirse al carácter inherente asociado con el dominio de cabeza de HA de Cal/09 o a una menor eficacia de transfección para esta construcción de ADN quimérico. Adicionalmente, cabe señalar que hubo diferencias en el patrón de expresión de la superficie celular para las construcciones cH7/3 y cH5/3. Este patrón de expresión de "doble pico" se observó solo en condiciones de transfección y fue reproducible. No se detectó tras la infección con virus recombinantes que expresaban cH7/3 o cH5/3
(Fig. 33). Por lo tanto, estos datos indican que las cHA pueden transportarse a través del complejo de Golgi a la superficie celular.
A continuación, se examinaron las características de entrada de las diferentes cHA a través de la transducción de células MDCK utilizando partículas pseudotipo retroviral que contenían una construcción informadora de luciferasa y expresaban la cHA y la NA del virus B/Yamagata/16/88 de tipo salvaje en la superficie de la partícula. La eficacia de entrada mediada por las proteínas cHA fue detectada por la lectura de luciferasa. Se observaron niveles comparables de expresión de luciferasa mediada por partículas pseudotipo para las HA quiméricas cH5/1, cH7/3 y cH5/3 y las correspondientes proteínas de tipo salvaje (Fig. 34). Las partículas que codificaban la HA cH1/1 expresaron niveles más bajos de luciferasa en comparación con las otras construcciones de HA, lo que podría deberse a la menor expresión de cH1/1 en la línea celular productora y, por lo tanto, a menos trímeros de HA por partícula o a las propiedades de entrada menos eficaces de la HA cH1/1. También es posible que al normalizar las partículas pseudotipo a 4 unidades de hemaglutinina, la cantidad real de partículas pseudotipo varíe debido a las diferencias en la unión a los glóbulos rojos.
6.7.2.2 Generación de virus de la influenza recombinantes portadores de hemaglutininas quiméricas
Debido a que se había determinado que las construcciones de cHA de los autores de la presente invención se expresaban y transportaban eficazmente a la superficie celular, se realizó un estudio para evaluar si se podía rescatar un virus de influenza recombinante que codificara una cHA. Los virus que contenían las diferentes cHA se generaron con éxito utilizando protocolos publicados previamente (véanse, p. ej., Fodor et al., 1999, J Virol73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los virus resultantes se purificaron en placa, se amplificaron en huevos embrionados de 10 días y los segmentos quiméricos se analizaron mediante RT-PCR y se secuenciaron. En todos los casos, se encontró que el virus tenía el segmento de HA quimérica esperado y ningún otro segmento de HA (datos no mostrados).
La presencia de las cHA en los virus rescatados se confirmó adicionalmente mediante transferencia Western e inmunofluorescencia indirecta de las células infectadas (Figuras 35 y 36). Las células MDCK se infectaron con virus PR8 rWT, Perth/09 de tipo salvaje, cH1/1, cH5/1, cH7/3 y cH5/3 (Figuras 35 y 36). Las proteínas HA quiméricas cH1/1 y cH5/1 se detectaron en las muestras correspondientes utilizando anticuerpos reactivos contra los dominios de cabeza de HA de Cal/09 (H1) (29E3) (Medina et al., 2010, Nature Communications 1:28) o HA de VN/04 (H5) (mAb #8) (Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-53) respectivamente (Figura 35). Se obtuvieron niveles de expresión comparables entre HA cH7/3, cH5/3 y Perth de tipo salvaje utilizando 12D1, un mAb anti-tronco pan-H3 (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). La HA Perth de tipo salvaje mostró una migración más lenta en el gel que probablemente se deba a un mayor número de sitios de glicosilación en el dominio de cabeza globular. Se confirmó que el dominio de cabeza de HA correcto se expresó encima de un tronco H3 mediante el uso de anticuerpos policlonales anti-H7 (NR-3152) o monoclonales anti-H5 (mAb #8) en muestras de infección por cH7/3 o cH5/3, respectivamente. Se detectaron bandas positivas en ambos casos.
Para el estudio de inmunofluorescencia, las condiciones de infección fueron similares a las utilizadas para el análisis de transferencia Western. Las células infectadas se tiñeron con los anticuerpos correspondientes utilizados en la Fig. 35. Todas las células infectadas mostraron la expresión esperada de las HA quiméricas y de tipo salvaje, así como de la NP del virus de la influenza A (Fig. 36).
6.7.2.3 Características de replicación de virus recombinantes
Las propiedades de crecimiento de los virus recombinantes y de tipo salvaje se evaluaron en huevos de gallina embrionados de 10 días a 37°C (Fig. 37A). El virus PR8 rWT se incluyó para comparar la cinética de crecimiento de los virus recombinantes que expresaban HA quiméricas. Los virus cH5/1 y cH5/3 mostraron una cinética de replicación comparable a la del virus PR8 rWT. El virus cH7/3 creció hasta títulos máximos similares a los de PR8 rWT a las 48 hpi (1x109 UFP/mL), aunque hubo una reducción de 2 log en el título viral en comparación con el virus PR8 rWT a las 9 hpi. El virus cH1/1 se atenuó en comparación con el virus PR8 rWT, como lo muestran los títulos virales reducidos en todos los puntos de tiempo. No obstante, el virus cH1/1 alcanzó un título máximo respetable de aproximadamente 108 UFP/mL. El virus de tipo salvaje Perth/09 crece hasta títulos máximos comparables en huevos embrionados (datos no mostrados).
El fenotipo de placa de cada uno de los virus quiméricos también se evaluó en células MDCK. Todos los virus formaron placas de tamaño comparable como se muestra en la Fig. 37B. Estos datos juntos confirman que las construcciones quiméricas de HA se pliegan correctamente y son biológicamente funcionales.
6.7.2.4 Los anticuerpos específicos del tronco pueden neutralizar virus y pseudopartículas que expresan cHA
Finalmente, se probaron los anticuerpos específicos del tronco para determinar la capacidad de neutralizar los virus recombinantes recién generados de los autores de la presente invención que expresaban cHA. Los ensayos de reducción de placa se realizaron en presencia de mAb KΒ2, un anticuerpo específico del tronco de HA con amplia reactividad del grupo 1 o sin anticuerpo. Se demostró que mAb KΒ2 neutraliza todos los virus que expresan cHA con una eficacia similar y de forma dependiente de la dosis. A 100 ug/mL, el mAb KΒ2 fue capaz de neutralizar completamente los virus cH1/1 y cH5/1 con una eficacia de 100%, con cierta actividad neutralizante a concentraciones
tan bajas como 4 ug/mL (Fig. 38A).
Para confirmar estos resultados, se realizó un ensayo de inhibición de partículas pseudotipo con mAb KΒ2. Se añadieron partículas pseudotipo que expresaban cH1/1 o cH5/1 y NA del virus de la influenza B a células MDCK en presencia de mAb KΒ2, o sin anticuerpo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se recogió el sobrenadante y se analizó la actividad luciferasa. Como era de esperar, el mAb KΒ2 bloqueó la entrada de partículas pseudotipo cH1/1 y cH5/1 de manera dependiente de la dosis a concentraciones superiores a 4 ug/mL. Si bien una concentración más baja de mAb KΒ2 fue suficiente para inhibir la entrada de partículas pseudotipo en comparación con las concentraciones utilizadas en el ensayo de reducción de placa, este era un resultado esperado debido a la supuesta menor incorporación de trímeros de HA en la superficie de las partículas pseudotipo (Corti et al., 2010, The Journal of Clínical Investigation 120:1663-73). Este fenómeno de diferentes potencias neutralizantes de mAb en ensayos que implican virus completo versus partículas pseudotipo se ha apreciado en otros estudios (Corti et al., 2010, The Journal of Clínical Investigation 120:1663-7321; Sui et al., 2009, Nature Structural & Molecular Biology 16:265-73).
6.7.3 Conclusión
Se desarrolló una estrategia novedosa para generar virus de influenza con proteínas HA quiméricas que portaban diferentes dominios de cabeza globular de HA aprovechando el enlace disulfuro conservado Cys52-Cys277 que delimita el límite entre los dominios de cabeza y tronco. Así, mediante la sustitución del dominio de cabeza parental por el dominio de cabeza de otra HA, se generó un panel de HA quiméricas con el mismo tronco, pero diferentes cabezas globulares. El diseño se probó en varios subtipos, incluido el dominio de tronco de PR8 con cabezas globulares Cal/09 y VN H5. Adicionalmente, se colocó una cabeza globular H7 en un dominio de tronco H3. Estas construcciones cubren ambos grupos filogenéticos de la proteína HA de influenza. Cada construcción se expresó en la superficie celular y conservó la actividad de fusión, como se muestra en la Figura 12. La generación de virus recombinantes que portan las HA quiméricas validó adicionalmente que las HA se pliegan correctamente y conservan las funciones biológicas.
6.8 Ejemplo 8: Las vacunas contra el virus de la influenza H1N1 de 1976 y 2009 refuerzan los anticuerpos anti tronco de hemaglutinina en seres humanos
Este ejemplo demuestra que los individuos que habían recibido la vacuna contra el virus de la influenza A/Nueva Jersey/1976 mostraron títulos elevados de anticuerpos contra el tronco de hemaglutinina con respecto a los controles de la misma edad. Estos sujetos de control experimentaron un refuerzo en los anticuerpos de anti-tronco de hemaglutinina después de recibir la vacuna A/Califomia/04/09, mientras que los individuos que recibieron la vacuna A/New Jersey/1976 no lo hicieron. Esto demuestra la utilidad de los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina del virus de la influenza para detectar la presencia de anticuerpos anti-tallo/tronco en sueros.
6.8.1 Materiales y métodos
6.8.1.1 Muestras de suero humano
Se recolectaron sueros humanos en octubre de 2009 de sujetos que habían recibido la vacuna NJ/76 (n=20, edad promedio = 62) y de controles de la misma edad (n=15, edad promedio = 57). Se excluyeron los sujetos que habían experimentado una enfermedad similar a la influenza dentro de los cuatro meses anteriores al comienzo del estudio. A todos los sujetos se les administró la vacuna monovalente similar a Cal/09 entre octubre de 2009 y enero de 2010. De seis a ocho meses después de recibir la vacuna Cal/09, a los sujetos se les volvió a extraer sangre después de la vacunación (5 de 20 vacunados NJ/76; 7 de 15 sujetos de control). Debido a las cantidades limitadas de suero disponibles, se agruparon volúmenes iguales de sueros previos y posteriores a la vacunación con Cal/09 de individuos para quienes ambas muestras estaban disponibles (vacunados con NJ/76 = 5; sujetos de control = 7) y estos grupos se probaron a continuación, en ensayos múltiples.
6.8.1.2 Células y virus
Se obtuvieron células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) de la ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) complementado con suero de ternera fetal al 10% (FCS, Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Gibco). Cal/09 se propagó en células MDCK en DMEM que contenía 1 gg/ml de tripsina tratada con L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona (TPCK) (Sigma-Aldrich). El virus A/duck/France/MB42/1976 (France/76) se propagó en huevos de gallina embrionados de 10 días. El virus cH5/1 N3 se generó utilizando un sistema de genética inversa descrito anteriormente (véase, p. ej., Fodor et al., J Virol 1999; 73:9679-82; Neumann et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:9345-50). Los plásmidos de genética inversa que codificaban ARNv y ARNm incluían los seis segmentos virales WT de A/Puerto Rico/8/34 (PR8), así como plásmidos que codificaban HA cH5/1 y NA N3 de virus A/Swine/Missouri/4296424/06 (señorita/06). La secuencia del a Rn de cH5/1 y N3 se confirmó mediante la secuenciación de los productos de RT-PCR. Todas las infecciones se realizaron utilizando DMEM complementado con 1 μg/ml de TPCK-tripsina (medio de infección).
6.8.1.3 Expresión y purificación de proteínas recombinantes del virus de la influenza
Secuencias codificantes para el ectodominio N-terminal de HA de PR8, virus A/New Caledonia/20/99 (NC/99) y cH6/1 (véase, p. ej., Pica et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-80). Los HA se clonaron en marco en un vector pFastBac modificado (Invitrogen) con una etiqueta de hexahistidina C-terminal y un dominio de trimerización de T4. Se generó baculovirus recombinante (rBV) según las recomendaciones del fabricante. Se infectaron células BTI-TN5B1-4 (High Five) (Krammer et al., Mol Biotechnol 2010; 45:226-34) cultivadas en medios de células de insecto HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific) con rBV que expresaba HA a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y una densidad celular de 1 x 106 células/ml en matraces agitadores de 500 ml. Las células se recolectaron de 72 a 96 h después de la infección y se separaron del sobrenadante mediante centrifugación a baja velocidad durante 10 min a 2000 x g a temperatura ambiente (RT). Se recogió el sobrenadante (250 ml) y se incubó con 3 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 h a 4°C. La suspensión se cargó en columnas y se lavó tres veces con tampón de lavado (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). La proteína se eluyó en etapas de 0,5 ml con tampón de elución (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8) y se analizó el contenido de proteína con el reactivo de Bradford. Las fracciones que contenían proteína se agruparon y concentraron utilizando unidades de centrifugación Amicon Ultracell (Millipore) con un corte de 30 kDa y el tampón se intercambió por solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4. La pureza y la identidad de la proteína se probaron mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. La concentración de proteína se determinó con el reactivo de Bradford.
6.8.1.4 Determinación del títu lo de punto final de inmunoglobulina G (IgG)
Los títulos de punto final de IgG se determinaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Immulon 2; Nunc) con 2 μg/ml de HA recombinante purificada o con albúmina de suero bovino (BSA) en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9, durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con leche desnatada al 5% y se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,025% (PBS-T). El suero se diluyó seriadamente en leche desnatada al 5% y se añadió a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, después de lo cual se lavaron tres veces con PBS-T. El anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Meridian Life Science Inc.) se diluyó 1:5000 en leche desnatada al 5% antes de añadirlo a los pocillos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente tres veces con PBS-T antes de la adición del sustrato de peroxidasa (SigmaFAST OPD, Sigma-Aldrich). La incubación con sustrato tuvo lugar durante 5 min a temperatura ambiente antes de que las reacciones se detuvieran mediante la adición de HCl 3M. Las medidas de densidad óptica se tomaron a 490 nm. Las densidades ópticas reunidas frente a HA se restaron de las medidas frente a BSA para cada dilución de suero individual, para normalizar frente a la señal no específica. La señal de fondo se calculó para cada antígeno específico en función de la reactividad del anticuerpo secundario solo. Los títulos de punto final se definieron como aquellos que tenían una densidad óptica de al menos tres desviaciones típicas por encima del fondo después de restar la señal no específica (BSA).
6.8.1.5 Ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI)
Los inhibidores no específicos de la hemaglutinación se eliminaron tratando los sueros con 0,5 volúmenes de 8 mg/ml de TPCK-tripsina (Sigma-Aldrich) a 56°C durante 30 min. A continuación, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente antes de añadir tres volúmenes de solución de peryodato de potasio 11 mM (Sigma-Aldrich). Después de la incubación de las muestras con peryodato de potasio durante 15 min a temperatura ambiente, se añadieron tres volúmenes de solución salina de glicerol al 1% a las muestras que se incubaron de nuevo durante 15 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 1,5 volúmenes de solución salina al 0,85% a las muestras antes de su uso. Todos los volúmenes son con respecto al volumen inicial de suero. Los ensayos de hemaglutinación se realizaron primero en placas de 96 pocillos con fondo en V (Nunc) utilizando glóbulos rojos de pollo al 0,5% (cRBC, Lampire Biological Laboratories) para determinar la dilución del virus que produciría tres pocillos de hemaglutinación. El virus y los anticuerpos se mezclaron y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron cRBC a los pocillos y las placas se incubaron en hielo durante aproximadamente 30 min antes de la lectura.
6.8.1.6 Ensayos de m icroneutralización
Brevemente, se determinaron las dosis infecciosas del 50% en cultivo de tejidos (DICT50) para los virus cH5/1 N3 y Cal/09 mediante dilución en serie en células MDCK. Después de la infección, las células se incubaron durante 20 h a 37 °C, CO2 al 5%. Las células se fijaron con acetona al 80% y se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3% y leche desnatada al 5%. Las células se sondearon con una dilución 1:2000 de anti-NP de ratón conjugado con biotina (Millipore) seguido de una dilución 1:5000 de estreptavidina secundaria conjugada con HRP (Millipore). Se añadió sustrato de peroxidasa (SigmaFAST, Sigma-Aldrich) a los pocillos durante 20 min a temperatura ambiente antes de detener las reacciones con HCl 3M. Para ensayos de microneutralización, se añadieron 200 DICT50/100 μl a pocillos de suero diluido en serie (en medios de infección) que habían sido pretratados con TPCK-tripsina como se ha descrito anteriormente. El suero y los virus (cH5/1 N3 o Cal/09) se incubaron durante 1 h a 37°C. Las mezclas de suero/virus se transfirieron a placas de 96 pocillos de células MDCK confluentes que se incubaron durante 1 hora a 37°C, CO2 al 5% para permitir la adsorción. Las placas se lavaron dos veces con PBS y se reincubaron durante 20 h con medio de infección que contenía concentraciones equivalentes de suero diluido. Los tratamientos de fijación y anticuerpos fueron idénticos a los utilizados durante la determinación de DICT50. Los títulos de neutralización se definieron como la
dilución de suero que dio como resultado al menos 50% de inhibición de la infectividad.
6.8.2 Resultados
6.8.2.1 Los vacunados con NJ/76 tenían títu los elevados de anticuerpos de tronco de HA antes de la vacunación con Cal/09
Se cree que los anticuerpos contra el tronco de HA se refuerzan de manera más eficaz en el contexto de la infección cuando los individuos están expuestos a HA cuyos dominios de cabeza difieren sustancialmente de exposiciones anteriores, pero cuyos dominios de tronco permanecen conservados (véase, p. ej., Palese y Wang, MBio 2011; 2). Una comparación de la secuencia de aminoácidos de HA0 de A/Fort Warren/1/50 (FW/50, estacional), NJ/76 (origen porcino), NC/99 (estacional) y Cal/09 (origen porcino) ilustra este punto (Tabla 12). Las HA Cal/09 y NJ/76 comparten una identidad de secuencia de aminoácidos global de 79,9% y 82,5%, respectivamente, en comparación con la HA de la cepa NC/99 estacional. Asimismo, el grado de identidad entre NJ/76 y la cepa precirculante FW/50 estacional fue de 83,0%. Sin embargo, cuando se analiza más a fondo, se hace evidente que el mayor grado de identidad entre estas proteínas está presente en el dominio de tronco de HA (Cal09 frente a NC/99 = 88,9% de identidad; NJ/76 frente a NC/99 = 91,6% de identidad; NJ /76 frente a FW/50 = 90,9% de identidad), mientras que los dominios de cabeza de H1 de origen porcino difieren sustancialmente de los de H1 estacional (Cal/09 frente a NC/99 = 67,1% de identidad; NJ/76 frente a NC/99 = 69,7% de identidad; NJ/76 frente a FW/50 = 69,8% de identidad). A pesar de una brecha de más de 30 años entre su aparición en seres humanos, los H1 de origen porcino exhiben un grado mucho más alto de identidad entre sí que con los H1 estacionales (HA0 total = 91,0% de identidad; dominio de cabeza = 85,9% de identidad; dominio de tronco = 94,6% de identidad). Por lo tanto, es posible que de manera análoga a la infección con Cal/09 (véase, p. ej., Pica et al., Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109:2573-8), los receptores de la vacuna NJ/76 pueden haber experimentado un refuerzo en los anticuerpos del tronco de HA antes de la exposición a Cal/09.
Tabla 12:
Dada la similitud de la HA de NJ/76 con la HA de Cal/09 (y el grado de diferencia entre HA de NJ/76 y HA de FW/50), se determinó si los sujetos que recibieron la vacuna NJ/76 tendrían mayores títulos de anticuerpos reactivos con el tronco que los que no, antes de la vacunación con Cal/09. Se compararon sueros de individuos que recibieron la vacuna de 1976 (n=20) con sueros de individuos de la misma edad que no recibieron la vacuna (n=15). Los títulos de IgG de punto final contra cH6/1 y NC/99 se determinaron mediante ELISA. La proteína HA de cH6/1 contiene un tronco H1, pero una cabeza H6. Dado que la exposición de los seres humanos a los IAV H6 es poco probable, esta proteína sirve como una herramienta útil para la detección de anticuerpos de unión al tronco de HA del grupo 1, como se ha demostrado recientemente (véase, p. ej., Pica et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-8). Sorprendentemente, los vacunados con NJ/76 tenían títulos de punto final de IgG significativamente elevados en comparación con los sujetos de control frente a HA de cH6/1 (Fig. 39A). No existió una diferencia significativa entre los dos grupos en los títulos de punto final de IgG frente a la HA estacional NC/99, lo que demuestra que este fenómeno era específico para los anticuerpos de tronco de HA (Fig. 39B). Debido a la escasez de muestras disponibles, se generaron grupos de suero de vacunación antes y después de Cal/09 de todos los pacientes en ambos grupos para los que ambas muestras estaban disponibles (vacunados con NJ/76 = 5/20; sujetos de control = 7/15). Los títulos de punto final de IgG de los grupos de vacunación anteriores a Cal/09 de cada grupo se determinaron a continuación, contra HA de cH6/1 y NC/99, para garantizar que reflejaran con precisión los datos recopilados de pacientes individuales (Fig. 39A y 39B) y, por lo tanto, podrían utilizarse para aplicaciones posteriores. De hecho, el grupo de vacunados con NJ/76 mostró un título de punto final sustancialmente elevado frente a HA de cH6/1 en comparación con el grupo de control (Fig. 39C). Sin embargo, no existieron diferencias en los títulos de punto final de IgG frente a HA de NC/99 entre los dos grupos (Fig. 39D). Estos datos demuestran que los vacunados con NJ/76 tenían títulos elevados de anticuerpos anti-tronco de HA
antes de recibir la vacuna Cal/09.
6.8.2.2 Los vacunados con NJ/76 tenían títulos protectores de HAI contra Cal/09 antes de la vacunación con Cal/09
Solo los receptores de la vacuna NJ/76 tenían títulos protectores de HAI contra Cal/09, mientras que los sujetos no vacunados no los tenían (Fig. 40A). Para garantizar nuevamente la confiabilidad de los resultados de HAI combinados, se realizaron ensayos de HAI contra Cal/09 con suero de cada individuo incluido en los grupos. Como fue el caso con los títulos de punto final, los resultados fueron uniformes y significativos, lo que demuestra que el suero agrupado proporcionó una representación precisa de la población (Fig. 40B). No se observó actividad HAI contra el virus France/76 (H6N4) en ninguna de las muestras, lo que confirma que ninguno de los sujetos había estado expuesto previamente a los virus H6 (Fig. 40A). En conjunto, estos resultados confirman que los vacunados con NJ/76 experimentaron un refuerzo en los anticuerpos HAI que se unían a la cabeza globular de HA de Cal/09 antes de la vacunación con Cal/09.
6.8.2.3 Los títu los de anticuerpos anti-tronco de HA se reforzaron en sujetos de control después de la vacunación con Cal/09
La observación de que los individuos infectados con el IAV p2009 tenían títulos elevados de anticuerpos anti-tronco de HA (véase, p. ej., Pica et al., Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109:2573-8), al igual que los inmunizados con la vacuna NJ/76, llevó a investigar si la vacunación con Cal/09 también reforzaría los títulos de anticuerpos anti-tronco de HA. Con este fin, tanto a los sujetos de control como a los vacunados NJ/76 se les administró la vacuna monovalente Cal/09 entre octubre de 2009 y enero de 2010. A los sujetos se les extrajo sangre después de la vacunación de seis a ocho meses después. Los títulos de IgG de punto final contra HA de NC/99 y HA de cH6/1 se determinaron para el suero posvacunación combinado de ambos grupos mediante ELISA. Estos se compararon con los valores previos a la vacunación determinados en las Fig. 39B y 39D para calcular la multiplicidad de cambio en los títulos de IgG frente a cada proteína HA después de la vacunación con Cal/09 (Tabla 13). Los títulos de punto final de IgG de los sujetos de control aumentaron más del doble frente a cH6/1, mientras que los títulos de punto final de IgG de los vacunados con NJ/76 no aumentaron. No se observó refuerzo frente a HA de NC/99 en ninguno de los grupos, como era de esperar. Estos datos indican que la vacunación con Cal/09 también es capaz de reforzar los títulos de anticuerpos anti-tronco de HA, pero solo en individuos que no habían estado expuestos previamente a NJ/76.
Tabla 13:
6.8.2.4 La vacunación con NJ/76 o Cal/09 reforzó los anticuerpos neutralizantes contra el virus que contenía un tronco de HA homólogo y una cabeza de HA heteróloga
A continuación, determinó si el refuerzo en los anticuerpos anti-tronco de HA experimentado después de la vacunación con NJ/76 o Cal/09 correspondía a títulos de neutralización mejorados contra virus que contenían un tronco de HA homólogo y un dominio de cabeza de HA heterosubtípico. Para probar esto, se realizó un ensayo de microneutralización contra un virus cH5/1 N3 utilizando los sueros agrupados. El virus cH5/1 N3 se utilizó para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes del tronco de HA, ya que contiene un dominio de cabeza de HA H5, un tronco de HA de PR8 y una N3 de Miss/06. Según los datos de títulos de punto final de IgG contra cH6/1, los sueros de vacunados con NJ/76 también mostraron títulos de neutralización notablemente más potentes contra cH5/1 N3 que los sujetos de control antes de la vacunación con Cal/09 (2430 frente a 90). Sin embargo, solo los sujetos de control experimentaron un refuerzo en los anticuerpos neutralizantes después de la vacunación (810, frente a 90) (Fig. 41A). Los vacunados con NJ/76 tenían títulos de neutralización contra Cal/09 que eran 3 veces más potentes que los sujetos de control antes de la vacunación con Cal/09 (90 frente a 30). Ambos grupos experimentaron un refuerzo en los títulos de anticuerpos neutralizantes contra Cal/09 después de la vacunación con Cal/09 (Fig. 41B). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que los anticuerpos anti-tronco de HA potenciados por la vacunación con los virus H1N1 de 1976 y 2009 corresponden a una mayor capacidad para neutralizar virus que albergan un tronco de HA homólogo y un dominio de cabeza de HA heterosubtípico.
6.8.3 Conclusión
Este ejemplo demuestra que las vacunas contra H1N1 de 1976 y 2009, que contienen HA H1 porcina clásica, son capaces de aumentar los títulos de anticuerpos de tronco de HA. Además, los anticuerpos de tronco anti-HA provocados por la vacunación parecen ser de larga duración y pueden proporcionar una protección parcial contra diversas cepas de IAV.
6.9 Ejemplo 9: Construcciones de hemaglutinina quimérica como vacuna universal contra la influenza
Este ejemplo demuestra la eficacia protectora de una respuesta inmunitaria específica del tronco que puede provocarse mediante la vacunación con construcciones de hemaglutinina quimérica (cHA), proteínas que contienen combinaciones únicas de cabeza y tronco de hemaglutinina.
6.9.1 Materiales y métodos
6.9.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (ambos de Gibco). Cada uno se complementó con suero bovino fetal al 10% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina-100 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco).
Los virus de la influenza A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) y A/Netherlands/602/2009 se pasaron en pulmones de ratón y a continuación, se cultivaron en huevos de gallina embrionados de 10 días durante 48 horas. El virus reordenado de baja patogenicidad A/Vietnam/1203/04 (VN04):PR8 2:6 con el sitio de escisión polibásico eliminado (véase, p. ej., Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753) y el virus B/Yamagata/16/1988 se cultivaron en huevos embrionados de 10 días durante 48 horas a 37°C o 72 horas a 33°C, respectivamente.
Los virus de influenza recombinantes se produjeron mediante un sistema de genética inversa como se describió anteriormente y como se expuso anteriormente (véase, p. ej., Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439). El virus cH9/1 N1, un virus que expresa el dominio de cabeza globular de HA de un virus H9 sobre un tronco H1 (del virus PR8), y virus cH5/1 (cabeza H5 (VN04), tronco H1) N1 se rescataron de una manera similar a la descrita anteriormente (véase, p. ej., Pica et al., 2012, pNAS USA 109:2573-2578). Para generar el virus YAM-HA, el dominio extracelular de la HA B/Yamagata/16/1988 (YAM WT) se sustituyó por el dominio correspondiente de la HA del virus A/Puerto Rico/8/1934 (véase, p. ej., Hai et al., 2011, Journal of Virology 85:6832-6843). Los plásmidos de genética inversa que codifican los otros 7 segmentos virales de YAM WT se construyeron en un estudio previo (véase, p. ej., Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Después del rescate, los virus recombinantes que expresaban cHA se propagaron en huevos de gallina embrionados de 10 días durante 48 horas a 37°C. El virus YAM-HA se cultivó en huevos de gallina embrionados de 8 días de edad durante 72 horas a 33°C.
Los virus recombinantes y de tipo salvaje se titularon en células MDCK (ATCC) en presencia de tripsina TPCK como se describe anteriormente. El virus cH5/1 N1 se purificó parcialmente sobre un lecho de sacarosa al 30% para su uso en ensayos ELISA. Los virus cH9/1 N1, cH5/1 N1 y FM1 se purificaron mediante centrifugación en gradiente y se inactivaron con formaldehído diluido (1:4000) en PBS para ser utilizados como vacunas de control positivo.
6.9.1.2 Generación de construcciones de proteína cH6/1 y cH9/1
Las proteínas cH6/1 y cH9/1 solubles se generaron utilizando un sistema de expresión de baculovirus como se describió anteriormente y como se expuso anteriormente (véase, p. ej., Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Brevemente, se generaron primero los vectores de transferencia de baculovirus, seguido de la transfección de bácmidos en células Sf9. A continuación, se utilizaron baculovirus recombinantes para infectar células High Five a una MOI de 10. Los sobrenadantes se recolectaron 96 h después de la infección y a continuación, se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 h a 4°C para purificar las proteínas cHA recombinantes etiquetadas con His. La suspensión se cargó en columnas y, después de los lavados, se eluyó en tampón de elución de pH 8 (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM). Las fracciones agrupadas que contenían proteína se sometieron a cambio de tampón en PBS y se concentraron utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) con un corte de masa molecular de 10 kDa en un rotor de cubeta oscilante. La pureza y la identidad de la proteína se analizaron mediante SDS/PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. Las concentraciones finales de proteína se determinaron con el reactivo de Bradford.
6.9.1.3 Animales
A los animales se les permitió acceso a comida y agua ad libitum y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se anestesiaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) para todos los procedimientos intranasales con inyección intraperitoneal (IP) de 0,1 ml de ketamina/xilazina (0,15 mg de ketamina y 0,03 mg de xilazina).
6.9.1.4 Experimentos de vacunación y sensibilización
Se vacunaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad sin tratamiento previo con proteína cH9/1, por vía intranasal (10 ug) en presencia del adyuvante R848 (Invitrogen) y por vía intraperitoneal (10 ug) con Addavax, un adyuvante similar a MF59 (Invitrogen). Los animales recibieron un refuerzo de proteína cH6/1 o BSA (BioRad) tres semanas después del cebado. También se administraron vacunas de refuerzo por vía intranasal (10 ug) e intraperitoneal (10 ug), aunque con poli I:C como adyuvante (Invitrogen). Se administró virus FM1 inactivado (1 ug) por vía intramuscular en un volumen de 50 ul como control positivo. Tres semanas después del refuerzo, se extrajo sangre de los animales y se recogieron los sueros, y los animales se sensibilizaron con 5 DL50 del virus FM1. Se controlaron los pesos durante 14 días después de la sensibilización.
En otros experimentos, los animales fueron cebados con ADN plasmídico que codificaba cH9/1 (80 ug, sistema de suministro TriGrid; Ichor Medical Systems) y a continuación, se reforzaron tres semanas más tarde con proteína cH6/1 o cH9/1 (control) administrada con poli I:C por vía intranasal (10 ug) e intramuscular (10 ug). El refuerzo se repitió tres semanas más tarde con la proteína cH5/1 o cH9/1 (control). El ADN de los animales de control también se sometió a electroporación de ADN con ADN codificante de cH9/1, pero se reforzaron dos veces con BSA (de manera similar al grupo de tratamiento). Los animales de control positivo recibieron virus FM1 o PR8 inactivados (1 μg) o 1 μg de vacuna fraccionada monovalente pH1N1 por vía intramuscular (BEI). Después, los animales se expusieron 3-5 semanas después del refuerzo con 5 DL50 de PR8 o FM1 o 10 DL50 de virus pH1 N1. Los animales utilizados para la depleción de células T CD8+ se trataron 48 y 24 horas antes de la sensibilización con 300 μg de un anticuerpo anti-células T CD8+ (véase, p. ej., ML Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707) (de la línea de hibridoma 2.43, adquirida de ATCC) y se sensibilizaron con 5 DL50 del virus PR8. Se controlaron los pesos durante 14 días después de la sensibilización. Se utilizó un corte de 20% para todos los virus.
Para otros experimentos, a los ratones se les inoculó virus YAM-HA o YAM WT y a continuación, se vacunaron con BSA o proteína cH6/1 en presencia de poli I:C por vía intramuscular e intraperitoneal tres semanas después. Los animales no sometidos a tratamiento previo sirvieron como control adicional. Todos los animales fueron sangrados y sensibilizados 3-5 semanas después de la vacunación con 250 DL50 de virus cH9/1 N1, o 10 DL50 de virus h 5 reordenado 2:6 con el sitio de escisión polibásico eliminado en el fondo de PR8 (véase, p. ej., Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). El virus cH9/1 N1 inactivado con formaldehído (1 ug) y el virus cH5/1 N1 se administraron por vía intramuscular a un volumen de 50 ul como control positivo para la sensibilización viral apropiada. Los animales fueron sacrificados si perdían más del 30% de su peso corporal inicial después de la sensibilización, según las pautas institucionales. Se utilizó un corte del 20% para la infección con los virus cH9/1 N1 y A/Netherlands/602/2009 menos patogénicos. Para las sensibilizaciones con estos dos virus, se utilizaron dosis más estrictas para apreciar la muerte o pérdidas de peso sustanciales de todos los controles (250 o 10 DL50).
6.9.1.5 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
Las placas Immulon 4HBX (Thermo Scientific) se recubrieron durante la noche con un virus cH5/1 N1 parcialmente purificado diluido a 5 ug/mL en PBS. Las placas se bloquearon durante 1 hora con Tween 20-PBS al 0,1% (TPBS) que contenía leche en polvo desnatada al 3% y a continuación, se incubaron con sueros de ratón diluidos en serie en TPBS que contenía leche en polvo al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anti-IgG de ratón unida a fosfatasa alcalina (AP) (específica de cadena y, Invitrogen). A continuación, las placas se lavaron tres veces con TPBS, se revelaron con sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) (Zymed), se detuvieron con NaOH 0,5 M y se leyeron a una densidad óptica de 405 nm. Para todos los experimentos se utilizó un lector de placas Synergy 4 (BioTek).
Los títulos de anticuerpos específicos del tronco se detectaron mediante ELISA como se describe anteriormente. Se utilizaron antígenos contra PR8 para recubrir las placas ELISA con el fin de cuantificar la reactividad específica del tronco. Para detectar la capacidad de neutralización de los anticuerpos específicos del tronco en ratones vacunados, se agruparon los sueros y se purificó la IgG sérica total.
Se utilizaron pseudopartículas que expresaban HA H5 en un ensayo de entrada de pseudopartículas como se describió previamente (véanse, p. ej., Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Al entrar, las pseudopartículas expresan un informador de luciferasa. La inhibición de esta entrada por IgG se cuantificó como el porcentaje de expresión en comparación con los controles no tratados con IgG. Debido a que los animales no habían estado expuestos a los dominios de cabeza globular H5, estos ensayos determinaron el grado en que los anticuerpos específicos del tronco producidos por la vacunación neutralizan el virus. El anticuerpo monoclonal CR6261 y la IgG purificada de ratones infectados con influenza B de tipo salvaje se utilizaron como controles.
6.9.1.6 Ensayo de neutralización por reducción de placa (PRNA)
Primero se preincubaron diluciones de mAb con 60 a 80 unidades formadoras de placas (ufp) de virus (virus de influenza A cH9N1) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. A continuación, la mezcla de virus e IgG purificada se utilizó para infectar una monocapa de células MDCK por duplicado en un formato de 12 pocillos y se incubó a 37°C durante 1 hora con balanceo intermitente cada 10 minutos. La superposición de agar se complementó con las correspondientes diluciones de IgG. Dos días después de la infección (dpi), la monocapa se fijó con PFA al
4%/1X PBS durante 30 minutos. Las células se bloquearon con leche NF al 5%/1X PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y se incubaron en consecuencia con un anticuerpo monoclonal específico de H9 (5 μg/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó un secundario anti-ratón conjugado con HRP como secundario a una dilución de 1:1000. Las placas se visualizaron utilizando sustrato de peroxidasa True Blue (KPL Inc.) y la reacción se detuvo con agua del grifo. Se contaron las placas para cada anticuerpo y se calculó el porcentaje de inhibición sobre el grupo sin mAb.
6.9.1.7 Pruebas estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba T de Student de una cola (Prism4, GraphPad). Para la Fig. 44C, todos los valores se representan como promedios con el error típico de la media. Las diferencias en la supervivencia se calcularon con el análisis de supervivencia de Kaplan Meier con la prueba de significación de rango logarítmico.
Para los análisis con valores de P, los valores de P iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos. Se utilizó la corrección de Welch si se determinaba que las varianzas eran estadísticamente diferentes. Los valores de p iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos. Al comparar la reactividad del suero del tronco con la pérdida máxima de peso en la Fig. 3, se detectó un valor como atípico (puntuación Z modificada > 3,5 desviaciones típicas por encima de la media) según los métodos de Iglewicz y Hoaglin (véase Iglewicz, B. a. H., D. 1993. Volumen 16: How to detect and handle outliers. En E. Mykytka (ed.), The ASQC Basic References in Quality Control: Statistical Techniques. Sociedad Americana de Control de Calidad), y se omitió de los análisis.
6.9.2 Resultados
6.9.2.1 La vacunación secuencial con construcciones de cHA provoca anticuerpos específicos del tronco de HA y brinda protección contra la sensibilización letal de la influenza
Se planteó la hipótesis de que las construcciones que expresaban dominios de cabeza globular de virus con diferentes antigenicidades podrían estimular respuestas policlonales hacia el dominio de tronco de la HA. Para probar esto, los ratones se vacunaron primero con proteína soluble cH9/1 con adyuvante, siendo el tronco de la HA del virus A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) y la cabeza de un producto aislado de H9. T res semanas después del cebado, los ratones recibieron un refuerzo con una segunda cHA soluble, cH6/1 (cabeza del virus H6, tronco del virus PR8), con la intención de estimular las respuestas humorales hacia el dominio de tronco de la molécula. (Los ratones vacunados con el virus FM1 inactivado sirvieron como control positivo). Tres semanas después del refuerzo, se extrajo sangre de los ratones para evaluar la reactividad del suero con el dominio de tronco de H1 y a continuación, se sensibilizaron virus A/Fort Mounmoth/1/1947 (FM1) adaptado a ratones. Como se muestra en la Figura 42A, los ratones vacunados produjeron respuestas de anticuerpos séricos hacia el dominio de tronco de HA. Después de la sensibilización con FM1, los animales perdieron una cantidad considerable de peso (Figura 42B), aunque se recuperaron después del día 7 para una tasa de supervivencia global de 90% (Figura 42C). Aunque los ratones solo habían estado expuestos a los dominios de cabeza globular de los virus H9 y H6, se verificó que todos los ratones eran negativos para HI al virus FM1 y, por lo tanto, se confirmó que la protección provocada por la vacunación era el resultado de una respuesta inmunitaria específica para el dominio de tronco. Por lo tanto, la vacunación con cHA basadas en PR8 proporciona inmunidad específica del tronco que protege frente a una sensibilización con el virus FM1.
6.9.2.2 La vacunación con proteína cH6/1 provoca inmunidad específica del tronco que media la protección contra la sensibilización por el virus cH9/1 N1
Aunque se generaron respuestas de anticuerpos hacia el tronco mediante la administración de dos construcciones de cHA solubles diferentes, se observó un grado sustancial de morbilidad después de la sensibilización con FM1. Debido a que los ratones no han sido sometidos a tratamiento inmunológico previo contra el virus de la influenza, era posible que se requirieran múltiples exposiciones al virus de la influenza seguidas de la introducción de una cabeza antigénicamente distinta para inducir títulos altos de anticuerpos séricos contra el tronco de HA. La estimulación mejorada de los títulos de anticuerpos séricos con especificidad para el tronco de hemaglutinina también puede requerir infección y puede explicar por qué no se observó una protección sólida después del cebado y el refuerzo con proteínas cHA solas.
Con el fin de estimular respuestas inmunitarias hacia la hemaglutinina viral, pero no generar inmunidad protectora a otras proteínas virales, se construyó un virus recombinante B/Yamagata/16/1988 que expresaba el ectodominio de la HA del virus PR8 (YAM-HA) (véase, p. ej., Hai et al., 2011, Journal of Virology 85:6832-6843). A los ratones se les inoculó YAM-HA para imitar exposiciones previas al virus de la influenza y a continuación, se vacunaron 3 semanas más tarde con BSA o proteína cH6/1. Como control adicional, los ratones se infectaron con el virus B/Yamagata/16/1988 de tipo salvaje (YAM WT) y se vacunaron con BSA. A continuación, se utilizó como virus de sensibilización un virus de la influenza A que expresaba el cH9/1 (cabeza de H9, tronco de H1) para demostrar definitivamente el carácter protector de una respuesta inmunitaria dirigida únicamente hacia el tronco de HA. Nuevamente, debido a que los animales estuvieron expuestos a los dominios de cabeza globular de los virus H1 y H6, la protección observada después de la sensibilización con un virus que expresaba HA cH9/1 probablemente fue el
resultado de la inmunidad hacia el dominio de tronco de H1.
Como se muestra en la Figura 43A, los animales que recibieron la vacuna de proteína cH6/1 después de la exposición a YAM-HA estaban completamente protegidos de la exposición a 250 DL50 con un virus que expresaba cH9/1 en el fondo de PR8. Los animales vacunados con la proteína soluble cH6/1 perdieron estadísticamente menos peso los días 3, 4 y 5 en comparación con los animales vacunados con BSA. Esta protección frente a la pérdida de peso dio como resultado una mayor supervivencia en el grupo vacunado con cH6/1, en comparación con la cohorte vacunada con BSA (p = 0,038; Figura 43B). Los animales sin tratamiento previo y aquellos a los que se había inoculado YAM WT no estaban protegidos de la infección, lo que demuestra que cualquier protección que se observó en los otros grupos de vacunación no fue el resultado de la replicación viral, sino una respuesta específica al dominio de tronco de H1. Debido a que los animales estuvieron expuestos a los dominios de cabeza globular de los virus H1 y H6, y fueron negativos para HI para el virus de sensibilización cH9/1, se cree que la protección que se observa aquí es el resultado de la inmunidad hacia el dominio de tronco de H1.
Cabe señalar que se han aislado anticuerpos monoclonales con especificidades para el tronco de HA de individuos infectados con, o vacunados contra, los virus H1N1 estacionales (véanse, p. ej., Corti et al., 2010, The journal of clinical investigation 120:1663-1673; Corti et al., 2011, Science 333:850-856; Ekiert et al., 2011, Science 333: 843-850; Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273; Throsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942), y se han apreciado títulos contra el tronco en individuos no infectados con el virus pH1N1, aunque a niveles más bajos (véase, p. ej., Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Como tal, no sorprende que los animales a los que se les había inoculado YAM-HA fueran capaces de generar cierto grado de título contra el tronco. Sin embargo, la vacunación con la construcción cH6/1 aumentó los títulos séricos contra el tronco en 4 veces (recíproco de las diluciones que produjeron valores de DO equivalentes) (Fig. 43C), y protegió a los animales de una pérdida de peso sustancial y de la muerte (Fig. 43A y 43B). La vacunación con la construcción cH6/1 provocó la producción de IgG específica del tronco que neutralizó el virus con una eficacia de 100% (YAM-HA+BSA) (Figura 43D), mientras que el suero de los animales cebados solamente exhibió niveles de neutralización apenas por encima del fondo (YAM-HA+BSA). De hecho, los animales a los que se les había inoculado YAM-HA y a continuación, se habían vacunado con BSA tuvieron tasas de supervivencia estadísticamente similares a aquellos a los que se les había inoculado el virus YAM WT y se habían vacunado con BSA (p = 0,058). En contraste, el uso de la proteína cH6/1 como vacuna produjo una supervivencia de 100% frente a la sensibilización, una tasa que fue muy significativa en comparación con la de los animales a los que se había inoculado YAM WT (p < 0,0001). La supervivencia también mejoró en comparación con la de los ratones a los que se había inoculado YAM-HA y se habían vacunado con BSA (p = 0,038). Estas diferencias no se reflejaron en el ensayo de entrada de pseudopartículas, ya que la IgG de ratones YAM-HA BSA y ratones YAM-HA cH6/1 inhibieron la entrada de pseudopartículas que codificaban una HA H5 con una eficacia similar (Fig. 43E). Es importante señalar que este último ensayo solo detecta la capacidad de los anticuerpos para bloquear la entrada de pseudopartículas. Por lo tanto, los efectos de los anticuerpos contra el tronco aguas abajo de la entrada y/o su interacción con las células infectadas (inmunitarias) no se detectarían en este ensayo. Esto podría explicar por qué no se observaron diferencias en la neutralización entre los dos grupos y no reflejaron los descubrimientos in vivo. No obstante, los anticuerpos provocados por estos protocolos de infección eran específicos del tronco y eran ampliamente neutralizantes. Debido a que el virus de sensibilización solo codifica el dominio de tronco de un virus H1, se puede concluir que la protección observada fue el resultado de la respuesta inmunitaria del anfitrión al dominio de tronco de HA que se estimuló mediante la vacunación con cH6/1.
6.9.2.3 La vacunación con la proteína cH6/1 protege a los ratones de la sensibilización letal con el virus de la influenza H5
A continuación, se comprobó si la vacunación con la proteína cH6/1 podría proteger a los ratones de la exposición a un virus H5. Los ratones recibieron inoculacion y vacunación como se describió anteriormente, y se sensibilizaron con 10 DL50 de un virus reordenado 2:6 que expresaba HA y NA del virus ANietnam/1203/2004 en el fondo de PR8 (véase, p. ej., Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). Como era de esperar, los animales no sometidos a tratamiento previo y los que recibieron la inoculación con el virus WT YAM no estaban protegidos de la sensibilización y sucumbieron a la infección el día 8. Los animales a los que se había inoculado el virus YAM-HA y se habían vacunado con BSA estaban marginalmente protegidos de la sensibilización, con una tasa de supervivencia de 40%. Se observó una mayor protección cuando los animales fueron vacunados con la proteína cH6/1, con una supervivencia de 90%. La diferencia en las tasas de supervivencia entre los dos grupos de vacunas se acercó a la significación estadística (p = 0,06), aunque los ratones vacunados con proteína cH6/1 sobrevivieron durante un tiempo estáticamente mayor (p = 0,037) (Figura 44A y 44B). Al comparar la reactividad con el tronco de HA con el % de pérdida de peso máxima durante el período de seguimiento después de la exposición a H5, se detectó una correlación inversa, por la cual los animales con títulos séricos contra el tronco más altos tendieron a perder menos peso después de la sensibilización (Figura 44C), lo que respalda la idea de que cH6/1 puede aumentar la inmunidad basada en el tronco de HA.
Utilizando virus de sensibilización con dominios de cabeza globular de HA con los que los ratones vacunados no habían tenido contacto inmunológico previo y eran negativos para HI, los resultados indican que la protección contra la sensibilización después de la vacunación se basó únicamente en una respuesta inmunitaria hacia el tronco de HA. Para excluir la posibilidad de que los anticuerpos de reacción cruzada hacia el sitio de unión del receptor puedan desempeñar un papel en la protección que se ve aquí, todos los ratones se sometieron a prueba para para determinar la HI y se encontró que eran negativos para HI para sus respectivos virus de sensibilización.
6.9.2.4 La vacunación con cHA provoca inmunidad específica del tronco que media la protección contra las sensibilizaciones por virus H1N1
Se han detectado anticuerpos específicos del tronco en sueros humanos (véanse, p. ej., las Fig.27A y 27B; M. Thorsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942, DC Ekiert et al., 2009, Science 324:246-251, DC Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850, J. Wrammert et al., 2011, J. Exp. Med. 208:181-193 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Debido a que es posible que la exposición previa a la HA del virus de la influenza sea fundamental para la producción robusta de una respuesta inmunitaria específica del tronco, se determinó si se podía recapitular la inmunidad preexistente al virus de la influenza en ratones. Se planteó la hipótesis de que esto protegería más eficazmente contra la morbilidad después de la sensibilización con el virus. Para lograr esto, los ratones fueron cebados con un vector de expresión de ADN (véase, p. ej., J. Steel et al, 2010, MBio 1 (1), pii:e00018-10) que codificaba cH9/1, a continuación, recibieron un refuerzo con proteína cH6/1 soluble, seguido de proteína cH5/1 (cabeza de H5, tronco de H1) y finalmente se sensibilizaron con un panel de virus H1N1 (Fig. 45A-45F). Después de la infección con los virus FM1 (Fig. 45A y 45B), A/Netherlands/602/2009 (pH1N1) (Fig. 45C y 45D) y PR8 (Fig. 45E y 45F), todos los animales vacunados con cHA estaban protegidos de la sensibilización y mostraron solo cantidades mínimas de pérdida de peso, si las hubo. Por el contrario, los animales de control negativo que recibieron BSA después del cebado con ADN de cH9/1 perdieron cantidades considerables de peso y, con la excepción de un animal, sucumbieron a la infección el día 9 (Figs. 45A-45F). La supervivencia de los animales vacunados con cHA en cada uno de los experimentos de sensibilización fue significativamente diferente de la de los controles (Figs. 45B, 45D y 45F). Para confirmar que la protección provocada fue el resultado de la inmunidad humoral específica del tronco, se confirmó que todos los ratones eran negativos para HI para cada virus de sensibilización, aunque los sueros eran capaces de unirse a HA de H1 mediante ELISA (Fig. 45G), lo que confirma la producción de anticuerpos específicos del tronco mediante el protocolo de vacunación de los autores de la presente invención. Debido a que es posible que las células T CD8 dirigidas hacia los epítopos dentro del tronco de HA puedan desempeñar un papel en la protección que se ve aquí (véase, p. ej., M. Tamura et al., J. Virol. 72:9404-9406), los ratones se vacunaron y se produjo el agotamiento de las células T CD8 mediante la administración del anticuerpo monoclonal 2.43 antes de la exposición a PR8 (ML Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707-718). El agotamiento no afectó la pérdida de peso ni los resultados de supervivencia, lo que implica una respuesta humoral en la protección provocada por la vacunación (Fig. 45H y 45I). Por lo tanto, una respuesta inmunitaria humoral adaptativa hacia el tronco de HA, y no hacia la cabeza, brindaba protección contra los tres virus H1N1 diferentes.
Para validar adicionalmente los anticuerpos específicos del tronco inducidos por el protocolo de vacunación basado en cHA con capacidad neutralizante contra otros subtipos, se probó la capacidad de IgG purificada de ratones vacunados para bloquear la entrada de pseudopartículas que albergan una HA H2. Debido a que las pseudopartículas expresan un gen informador de luciferasa después de la entrada, la actividad neutralizante se midió por la ausencia de actividad enzimática de luciferasa en los sobrenadantes celulares (R. Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Conforme a la protección observada después de la sensibilización, la IgG purificada de ratones vacunados inhibió la entrada de pseudopartículas de manera dependiente de la dosis y con una eficacia similar a la de CR6261, un anticuerpo monoclonal con especificidad para el tronco de HA que se utilizó como control positivo (Fig. 45J). El protocolo de vacunación, por lo tanto, provocó anticuerpos contra el tronco con amplias especificidades, capaces de neutralizar otras HA del grupo 1 como H2.
6.9.3 Conclusión
Este ejemplo demuestra el efecto protector de una respuesta inmunitaria específica del tronco que puede provocarse mediante la vacunación con HA quiméricas. Se demostró que una respuesta inmunitaria dirigida hacia el tronco de HA fue suficiente para la protección contra la sensibilización viral, y que este protocolo de vacunación proporcionó protección heterosubtípica. Se podría desarrollar una estrategia similar en seres humanos para brindar protección contra una amplia gama de virus de la influenza, eliminando la necesidad de vacunación anual y mejorando la preparación para una pandemia.
6.10 Ejemplo 10: Los anticuerpos reactivos con el tronco de hemaglutinina se refuerzan después de la infección sucesiva de virus de la influenza H1N1 estacional y pandémico en ratones
Este ejemplo demuestra que la infección con un virus de la influenza estacional seguida de una infección con una cepa de influenza pandémica estimula la producción de anticuerpos específicos del tronco en ratones, lo que valida un modelo de ratón de infección por influenza humana y una respuesta inmunitaria concomitante de anticuerpos contra el tronco.
6.10.1 Material y métodos
6.10.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (ambos de Gibco), respectivamente, cada uno complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina-100 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). Se cultivaron en huevos embrionados de 10 días durante 48 horas cepas del virus de la influenza A/New Caledonia/20/99 (NC99)
(H1N1), A/Solomon Islands/3/2006 (SI06) (H1N1), A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) (H1N1), A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) (H1N1), A/California/04/2009 (Cal09) (93 H1N1) y un virus reordenado A/Vietnam/1203/04 (VN04): PR8 2:6 (H5N1) de baja patogenicidad. (véase, p. ej., J. Steel et al., 2009, J. Virol. 83:1742-1753).
Para construir un virus adaptado al frío con antigenicidad de PR8, se generó un sistema de rescate basado en A/Ann Arbor/6/60 mediante transcripción inversa de genes virales (Transcriptor RT, Roche) a partir de ARN de virión purificado, amplificación por PCR (UFP turbo, Stratagene) y la clonación en el vector pPOL1 (véase, p. ej., E. Fodor et al., 1999, J. Virol 73:9679-9682) siguiendo el protocolo de recombinación descrito por Wang et al. (véase, p. ej., S. Wang et al., 2008, J. Virol. Methods 151:74-78). Se utilizaron plásmidos A/Ann Arbor/6/60 que codificaban p B1, Pb 2, PA, NP, M y NS con aquellos que codificaban HA y NA de la cepa PR8 para rescatar un virus adaptado al frío basado en PR8. El virus adaptado al frío se cultivó en huevos de gallina embrionados de 10 días durante 48 horas. Para construir un virus PR8 con una deleción en la proteína no estructural 1 (NS1), se utilizó un plásmido que solo codificaba los primeros 73 aminoácidos de NS1 además de los otros siete plásmidos de rescate basados en PR8. Después de su rescate, el virus se propagó en huevos de gallina embrionados de 8 días durante 48 horas (véase, p. ej., S.A. Kopecky-Bromberg, 2009, Vaccine 27:3766-3774).
Los virus recombinantes y de tipo salvaje se titularon en células MDCK (ATCC) en presencia de tripsina TPCK como se describió previamente (6). Los virus se inactivaron después del tratamiento con formaldehído durante 72 horas a 4°C.
6.10.1.2 Generación de baculovirus recombinantes, expresión y purificación de proteínas
Para generar NC99, Cal09, cH6/1 (dominio de cabeza globular de H6N1 A/mallard/Sweden/81/02, dominio de tronco de PR8) o HA de VN04 y NA de VN04, se empleó un sistema de expresión basado en baculovirus como se describió anteriormente. (N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Brevemente, los vectores de transferencia de baculovirus se transformaron en la cepa de Escherichia coli DHIOBac (Invitrogen), y las colonias se recogieron y se cultivaron. Los bácmidos se prepararon utilizando un Plasmid 116 Midi Kit (Qiagen) y a continuación, se transfectaron en células Sf9 con Cellfectin II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El baculovirus recombinante se amplificó en células Sf9 cultivadas en medio TNM-FH (Gemini Bioproducts), y a continuación, se utilizó para infectar células High Five cultivadas en medio de células de insecto HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific) a una MOI de 10. Los sobrenadantes se recolectaron 96 horas después de la infección y a continuación, se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas a 4°C para purificar las proteínas HA recombinantes etiquetadas con His122. La suspensión se cargó en columnas y se lavó tres veces con tampón de lavado (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). La proteína se eluyó en etapas de 0,5 ml con tampón de elución (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8) y se analizó el contenido de proteína con el reactivo de Bradford, y se agruparon las fracciones que contenían proteína. Las fracciones agrupadas se sometieron a cambio de tampón en PBS y se concentraron utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) con un corte de masa molecular de 10 kDa en un rotor de cubeta oscilante. La pureza y la identidad de la proteína se analizaron mediante SDS/PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. Las concentraciones finales de proteína se determinaron con el reactivo de Bradford.
6.10.1.3 Animales
Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Mount Sinai. A los animales se les permitió acceso a comida y agua ad libitum y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se anestesiaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) para todos los procedimientos intranasales con inyección intraperitoneal (IP) de 0,1 ml de ketamina/xilazina (0,15 mg de ketamina y 0,03 mg de xilazina).
6.10.1.4 Infección y vacunación
Se anestesiaron grupos de cinco ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad y se les inocularon por vía intranasal 50 ul de 104 UFP de los virus NC99, SI06 o Cal09, 103 o 104 UFP de virus PR8 adaptado al frío o 103 o 104 UFP de un virus PR8 con NS1 truncada diluido en PBS. Los ratones también recibieron 1 μg de virus PR8 o FM1 inactivado con formaldehído o la vacuna fraccionada trivalente comercial que contenía 1 μg de HA H1 A/Brisbane/57/07 (TIV) (la dosis también contenía 1 μg del componente H3 de A/Uruguay/ 716/07 y el componente B de B/Brisbane/60/08) administrados por vía intramuscular en un volumen de 50 ul. Adicionalmente, se vacunaron dos grupos de ratones con 80 μg de plásmido pCAGGS que codificaba HA de PR8 o NC99 usando un dispositivo de electroporación TriGrid (Ichor Medical Systems) (véase, p. ej., J. Steel, 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10). Cuatro semanas después de la infección o vacunación, se extrajo sangre retroorbital de los animales y se recogió el suero de sangre completa.
Después de la infección con el virus NC99, a los ratones se les inocularon por vía intranasal 105 o 106 UFP del virus SI06 o 103 o 104 UFP del virus Cal09 diluido en PBS. Tres días después del refuerzo, se sacrificaron tres animales por grupo con CO2 y los pulmones se recolectaron y homogeneizaron con un homogeneizador FastPrep-24 (MP). Los títulos de virus de pulmón se midieron por titulación en células MDCK. Cuatro semanas después de la segunda infección, se extrajo sangre retroorbital de los animales y se recogió suero de sangre completa.
6.10.1.5 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y ensayo de entrada de pseudopartículas
Las placas Immulon 4HBX (Thermo Scientific) se recubrieron durante la noche con baculovirus purificado que expresaba HA de NC99, Cal09, cH6/1 o VN04 (todos con un foldon de T4 C-terminal) o NA de VN04 (con un dominio de tetramerización N-terminal) en tampón de recubrimiento (Na2CO3/NaHCO30,1 M, pH 9,2, 50 μl/pocillo) o PBS (N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Las placas se bloquearon durante 1 hora con Tween 20-PBS al 0,1% (TPBS) que contenía leche en polvo desnatada al 3% y a continuación, se incubaron con sueros de ratón diluidos en serie en TPBS que contenía leche en polvo al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano de picante (HRP) (Sigma) o un anticuerpo anti-IgG de ratón conectado a fosfato alcalino (AP) (específico de la cadena y, Invitrogen). A continuación, las placas se lavaron tres veces con TPBS y se revelaron. Cuando se utilizó el secundario conjugado con HRP, las placas se revelaron utilizando sustrato SigmaFAST OPD (Sigma) (100 ul/pocillo), se detuvieron con HCl 3 M y se leyeron a 490 nm. Cuando se utilizó un anticuerpo secundario conectado a AP, las placas se revelaron con sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) (Zymed), se detuvieron con NaOH 0,5 M y se leyeron a la densidad óptica de 405 nm. Para todos los experimentos se utilizó un lector de placas Synergy 4 (BioTek). Para experimentos de ELISA que detectaban reactividad a HA H5, se utilizaron sueros de ratones infectados con 105 UFP de un virus A/Vietnam/1203/2004 con NS1 truncada como control positivo.
6.10.1.6 Purificación de IgG de ratón a partir de sueros policlonales
Los sueros de ratón se diluyeron en PBS (pH 7,4) y se pasaron a través de una unidad de filtro estéril de 0,45 um. Los sueros filtrados se cargaron en una columna que contenía 3 ml de 4 FastFlow Sepharose G (GE Healthcare). La columna se lavó con 60 ml de PBS y la IgG total se eluyó con un tampón de glicina HCl 0,1 M (pH 2,7) y se neutralizó inmediatamente con un tampón TRIS-HCl 2 M (pH 10) (A. Jungbauer et al., 1989, J. Chromatogr 476:257-268). A continuación, la IgG eluida se concentró y se sometió a cambio de tampón (a PBS) utilizando unidades de centrifugación Amicon Ultracell (Millipore) con un corte de 30 kDa. La concentración de proteína se midió en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 utilizando el método A280.
6.10.1.7 Ensayo de neutralización de partículas pseudotipificadas
El procedimiento para la producción de partículas pseudotipo se adaptó 185 de estudios previos y se ha descrito previamente (véanse, p. ej., MJ Evans, 2007, Nature 446: 801 -805, R. Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Brevemente, se cotransfectaron células 293 T con cuatro plásmidos que codificaban un provirus que contenía un gen informador de luciferasa, Gag-Pol de HIV, la proteína hemaglutinina quimérica cH5/1 (dominio de cabeza de H5 de A/Viet Nam/1203/04 y dominio de tronco de PR8) y una neuraminidasa del virus de influenza B B/Yamagata/16/88. Los sobrenadantes se recogieron 48 horas después de la transfección y posteriormente se filtraron (tamaño de poro de 0,45 μm) para purificar las preparaciones de partículas de cH5/1. A continuación, las partículas se incubaron con diferentes concentraciones de IgG de ratón purificadas y se añadieron a las células MDCK. Las transducciones continuaron durante 6 horas antes de que se lavaran las células y se colocaran medios de nueva aportación sobre las células. Todas las transducciones se realizaron en presencia de 1 μg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO). Los ensayos de luciferasa se realizaron 48 horas después de la transducción.
6.10.1.8 Experimento de transferencia pasiva
A los ratones (n = 5 por grupo) se les inocularon por vía intraperitoneal 200 ul de sueros de grupos que estaban infectados con el virus NC99, NC99 seguido por el virus Cal09 o SI06, o con sueros de animales sin exposición previa. Dos horas después de la inoculación, los ratones fueron anestesiados y sensibilizados con 5 MDL50 de VN04:PR8 2:6 reordenado (véase, p. ej., J. Steel et al., 2009, J. Virol. 83:1742-1753). La pérdida de peso se controló diariamente durante 14 días y los ratones que perdieron más de 30% de su peso corporal inicial se clasificaron como muertos y se sacrificaron. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism4 (GraphPad). Las diferencias en la supervivencia se calcularon con el análisis de supervivencia de Kaplan Meier con la prueba de significación de rango logarítmico. Los valores de p iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos.
6.10.2 Resultados
6.10.2.1 Los anticuerpos reactivos contra el tronco se inducen tras la infección por el virus H1N1 estacional o pandémico, pero no por la vacunación.
Se infectaron subletalmente grupos de cinco ratones con 104 UFP de virus NC99, SI06 o Cal09 y se tomaron muestras de sangre cuatro semanas más tarde para la evaluación del título de anticuerpos contra el tronco en suero. Para determinar el grado de anticuerpos contra el tronco inducidos por la infección, se utilizó la proteína cH6/1, una construcción de HA soluble que contiene el tronco de un virus H1 y la cabeza de un virus H6 (véase, p. ej., N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Este reactivo permite la detección directa de anticuerpos específicos de tronco en sueros policlonales. Todos los ratones infectados con un virus estacional o pandémico produjeron anticuerpos con reactividad contra al tronco de HA (Fig. 46). Por el contrario, los animales que fueron cebados con ADN que codificaba HA de PR8 o NC99, o aquellos que recibieron la vacuna inactivada de PR8 o FM1 o la vacuna comercial fraccionada por vía intramuscular no tuvieron ninguna reactividad a cH6/1 por ELISA, a pesar de su seroconversión al antígeno contra el que fueron vacunados. Cuando los animales fueron vacunados con 103 o 104 de un virus vivo o adaptado al
frío atenuado a través del truncamiento de NS1, los títulos de anticuerpos específicos del tronco estaban apenas por encima del fondo. Los sueros de ratones vacunados con una construcción de hemaglutinina sin cabeza (véase, p. ej., J. Steel et al., 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10) y el anticuerpo monoclonal 6F12 específico del tronco se utilizaron como controles positivos (véase, p. ej., G. S. Tan et al., 2012, J. Virol. 86:6179-6188). Debido a que el nivel de replicación de los virus atenuados fue más bajo que el de los virus de tipo salvaje, y las vacunas inactivadas/de ADN no indujeron anticuerpos reactivos contra el tronco, se supone que la inducción inicial de estos anticuerpos fue mucho mayor por el virus de replicación competente.
6.10.2.2 Un refuerzo con H1N1 pandémico provoca títulos más altos de anticuerpos reactivos contra el tronco que con un producto aislado de H1N1 estacional con deriva
Los animales cebados con 104 UFP del virus NC99 recibieron un refuerzo cuatro semanas después del cebado con dos dosis diferentes de SI06 (105, 106 UFP; "NC/SI") o Cal09 (103, 104 UFP; "NC/Cal"). Cuatro semanas más tarde, se extrajo sangre terminal de los ratones y se analizó el suero para detectar la presencia de anticuerpos reactivos contra el tronco utilizando la proteína cH6/1 recombinante. Todos los animales que recibieron una segunda inoculación de virus tenían títulos de tronco elevados en comparación con los ratones que solo habían sido infectados con NC99 (Fig. 47). De hecho, el efecto fue dependiente de la dosis, ya que los animales que recibieron la dosis más baja (103 de Cal09 o 105 UFP del virus SI06) tuvieron un refuerzo más débil que aquellos que recibieron una dosis más alta (104 UFP de Cal09 o 106 del virus SI06). Se debe observar, sin embargo, que los animales infectados con NC/Cal exhibieron una mayor inducción del título del tronco en comparación con el grupo infectado con NC/SI. De hecho, para generar títulos de tronco sérico comparables al grupo NC/Cal, se requirió 1.000 veces más virus estacional SI06 (Fig. 47). Para confirmar la seroconversión a infecciones primarias y secundarias, se analizó la reactividad de todos los sueros a la proteína HA recombinante NC99 y Cal09 mediante ELISA.
Basándose en el hallazgo de que la replicación mejora fuertemente la obtención de anticuerpos dirigidos al tronco, se determinó si el aumento en el del refuerzo en el título anti-tronco observado en animales infectados con Cal09 podría ser el resultado de una mayor capacidad de replicación del virus. Tres días después del refuerzo, se sacrificaron animales NC/Cal y NC/SI y se recogieron tejidos pulmonares. Aunque no se detectó el virus SI en los pulmones de ratones infectados secuencialmente, el virus Cal09 creció hasta 105 UFP/mL en este punto de tiempo.
6.10.2.3 Los anticuerpos reactivos contra el tronco provocados tienen actividad neutralizante in vitro
Para evaluar la capacidad de neutralización de estos anticuerpos específicos del tronco, se utilizó un ensayo de neutralización de partículas pseudotipificadas. Se modificaron mediante ingeniería genética pseudopartículas que expresaban HA con un tronco de H1 y una cabeza de H5 (cH5/1) para albergar un gen informador de luciferasa 253 que se expresaría después de la entrada satisfactoria de la pseudopartícula en las células. Por tanto, la entrada se midió en función de la expresión de luciferasa. Debido a que los animales solo estuvieron expuestos a los virus H1N1, cualquier inhibición de la entrada sería el resultado de anticuerpos neutralizantes dirigidos hacia el tronco de HA (H1). Debido a la cantidad limitada de suero disponible, se probó sólo la eficacia de neutralización relativa de las preparaciones de IgG purificadas de suero de ratones que fueron cebados con el virus NC99, pero a continuación, fueron reforzados con 103 virus Cal09 o 105 virus SI06. El suero de ratones que estaban infectados con Cal09 solo se utilizó como un punto de comparación adicional. Se utilizó como control positivo el anticuerpo monoclonal 6F12 (véase, p. ej., G. S. Tan et al., 2012, J. Virol. 86:6179-6188), un anticuerpo específico del tronco con una amplia especificidad del grupo 1.
Se observó una inhibición superior a 90% con tan solo 50 ug/ml de IgG purificada de ratones NC/Cal o NC/SI. Cabe señalar que la IgG aislada de ratones NC/Cal y ratones NC/SI fue capaz de inhibir la entrada de pseudopartículas que expresaban cH5/1 con eficacias similares a 50 o 10 ug/ml. La IgG de ratones infectados solo con el virus Cal09 mostró niveles bajos de inhibición de la entrada, que fue similar a los niveles observados en ratones sin tratamiento previo. Nuevamente, esto refleja los títulos relativos de anticuerpos contra el tronco en este grupo, como se muestra en la Fig. 47.
6.10.2.4 Los anticuerpos reactivos contra el tronco protegen de la sensibilización heteróloga en un experimento de transferencia pasiva
Para evaluar la eficacia protectora in vivo de tales anticuerpos, se administraron sueros de animales infectados secuencialmente por vía intraperitoneal a ratones no sometidos a tratamiento previo, seguido de sensibilización con un virus reordenado H5N1 en el fondo de PR8 (VN04). Los animales que recibieron sueros de ratones infectados secuencialmente con virus estacionales y pandémicos (NC99 104 UFP - Cal09 104 UFP) estaban parcialmente protegidos de la sensibilización, con una tasa de supervivencia de 80%. Los ratones que solo estuvieron expuestos a cepas estacionales con deriva (NC99 104 UFP - SI06 106 UFP) también estaban parcialmente protegidos de la sensibilización (60% de supervivencia). Los ratones que sólo recibieron una única inoculación del virus NC99 (104 UFP) no estaban protegidos de la sensibilización, y todos sucumbieron a la infección el día 9 (Fig. 48).
Las diferencias en la supervivencia entre los dos grupos de cebado-refuerzo no fueron estadísticamente significativas (p = 0,575). Sin embargo, la supervivencia de los ratones infectados secuencialmente fue estadísticamente diferente a la de los ratones solo cebados (NC99/SI06 p=0,018, NC99/Cal09 p=0,0023) y los ratones de control (NC99/SI06
p=0,0031, NC99/Cal09 p=0,0031), lo que indica que los niveles elevados de anticuerpos reactivos contra el tronco pueden proteger de la sensibilización heterosubtípica.
Debido a que los hallazgos se correlacionaron bien con el grado de reactividad sérica al tronco de HA para cada uno de los grupos experimentales, se evaluó la reactividad de HA del virus VN04. Como era de esperar, la reactividad a la HA de H5 fue la más alta en el grupo que experimentó infecciones por virus tanto estacionales como pandémicos. Mientras que los ratones infectados con cepas estacionales con deriva mostraron un mayor grado de reactividad a la HA del virus VN04 en comparación con los ratones a los que se habían sólo una vez 104 UFP del virus NC99, este título fue aún más bajo que el del grupo NC99/Cal09, donde se utilizó 100 veces menos virus para el refuerzo. Para descartar la contribución potencial de los anticuerpos específicos de N1 al grado de protección que se observa aquí, se evaluaron los títulos de anticuerpos séricos mediante ELISA. Los títulos fueron equivalentes independientemente del virus utilizado para el refuerzo de la infección inicial por el virus NC99. El refuerzo con un virus H1N1 estacional o pandémico potenció de manera similar el título de anticuerpos contra NA sobre la respuesta observada después de una infección por el virus.
6.10.3 Conclusión
Este ejemplo recapitula en ratones los hallazgos de que los individuos infectados con el virus pH1 N1 tienen títulos de anticuerpos específicos del tronco más altos en comparación con los individuos no infectados (véase, p. ej., el Ejemplo 6.8). En este modelo de ratón de infección por influenza, la infección de ratones con un virus H1N1 estacional seguida de la exposición a la cepa H1N1 pandémica reforzó los títulos de anticuerpos contra el tronco de HA en mayor medida que la infección secuencial con virus H1N1 estacionales con deriva.
6.11 Ejemplo 11: Direccionamiento de la respuesta inmunológica humoral contra la hemaglutinina de influenza hacia el dom inio de tronco conservado al cambiar la glicosilación
Este ejemplo demuestra que se puede guiar al sistema inmunitario para que produzca anticuerpos contra el dominio de tronco conservado de los virus de la influenza enmascarando los sitios antigénicos en el dominio de cabeza de la influenza mediante la introducción de sitios de glicosilación y haciendo que los sitios antigénicos sean más accesibles en el dominio de tronco mediante la eliminación de sitios de glicosilación.
6.11.1 Materiales y métodos
6.11.1.1 Generación y clonación de mutantes de deleción e hiperglicosilación
La glicosilación ligada a N está programada por el motivo de secuencia Asn-X-Ser/Thr dentro de las proteínas, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. La eliminación de sitios de glicosilación individuales o combinaciones de los mismos de HA de A/PR/8/34, se realizó mutando el resto de Asn a Gln estrechamente relacionado, utilizando mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, Santa Clara, CA). Se utilizó la estrategia inversa para introducir sitios de glicosilación ligados a N adicionales en el dominio de cabeza globular de HA mediante la creación de motivos de secuencia Asn-X-Ser/Thr adicionales en los sitios antigénicos variables. Los genes mutados se introdujeron en el plásmido de expresión de proteínas pCAGGS o en el plásmido pDZ para el rescate del virus (véanse, p. ej., E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682 y R. Hai et al., 2008, J. Virol. 82:10580-10590)
6.11.1.2 Ensayos de inmunofluorescencia
Las células 293 T se transfectaron con el plásmido pCAGGS que codificaba mutantes de tipo salvaje y de glicosilación de hemaglutinina A/PR/8/34 o cH5/1. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se fijaron con PFA al 0,5%/1X PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) y se bloquearon con leche NF al 5%/1X PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los MAb se diluyeron en leche NF al 5%/1X PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora a una concentración final de 5 μg/ml. Los sueros de control positivo se diluyeron 1:100. La monocapa de células se lavó tres veces con 1X PBS y a continuación, se incubó con anti-IgG de ratón de burro - Alexa Fluor 488 (Invitrogen) a una dilución de 1:1000 durante 1 hora a temperatura ambiente. La reactividad de la fluorescencia se visualizó utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX70.
6.11.1.3 Transferencia Western
Se realizaron SDS-PAGE (Biorad) y análisis de transferencia Western con productos lisados celulares reducidos de células transfectadas, utilizando el anticuerpo NR-4539 y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón (Santa Cruz Biotechnology). El anticuerpo monoclonal anti-HA2 del virus de la influenza A NR-4539 se obtuvo a través del NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository, NIAID.
6.11.1.4 Ensayos de hemadsorción
Las células transfectadas se incubaron con neuraminidasa (Sialidasa) de Vibrio cholera (Roche) durante 1 hora a 37°C y se lavaron 3 veces con 1X PBS que contenía CaCl2 al 0,01% y MgCl2. A continuación, la monocapa celular se incubó durante 30 minutos en hielo con una suspensión de glóbulos rojos de pollo al 2% en PBS/CaCl2/MgCl2 y se lavó nuevamente 3 veces con PBS/CaCl2/MgCl2. Los glóbulos rojos adheridos se lisaron añadiendo NH4Cl 50 mM y
agitando las células durante 15 minutos. Se eliminó el producto lisado de las células y se midió la absorbancia a 540 nm.
6.11.1.5 Rescate de virus
El rescate de los virus de influenza A del ADN plasmídico se realizó como se describió anteriormente (véanse, p. ej., E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682, R. Hai et al., 2008, J. Virol. 82:10580-10590 y G. Neumann et al., 1999, PNAS 96:9345-9350). Para generar el virus PR8 recombinante de tipo salvaje (rWT), se cotransfectaron células 293T con 1 gg de cada uno de los 8 plásmidos de rescate pDZ PR8 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los virus que expresaban diferentes HA glicomutantes se generaron de la misma manera, pero sustituyendo el plásmido de HA por el correspondiente plásmido que codificaba la secuencia de HA mutante para recuperar los virus mutantes correspondientes. Al cabo de 24 horas de la transfección, se inoculó sobrenadante que contenía virus en huevos de gallina embrionados de 8 días. El líquido alantoideo se recogió después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó para determinar la presencia de virus mediante hemaglutinación de glóbulos rojos de pollo y mediante formación de placas en células MDCK (véanse, p. ej., E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682 y R. Hai et al., 2008, J. Virol. 82:10580-10590).
6.11.2 Resultados
6.11.2.1 Los mutantes de glicosilación de la influenza se expresan y se hiperglicosilan o hipoglicosilan apropiadamente
Se introdujeron hasta 7 sitios de glicosilación adicionales en el dominio de cabeza globular de PR8 (véase la Tabla 3). Adicionalmente, se crearon deleciones en los sitios de glicosilación 31 y 289 en el dominio de tronco de PR8. Se crearon y analizaron mutantes de HA que portaban tales mutaciones del dominio de cabeza globular solas, así como combinadas con las mutaciones del dominio de tronco.
Tabla 3. Mutantes de glicosilación del dom inio de cabeza de PR8
Para determinar si las proteínas HA mutadas se expresaban y los sitios de glicosilación introducidos se habían glicosilado in vitro, se transfectaron células 293 T con las construcciones mutantes de HA y se realizó un análisis de transferencia Western en los productos lisados celulares. La sonda de la transferencia Western con un anticuerpo anti-HA2 de influenza A mostró que se expresaban todas las construcciones virales (Fig. 49). La migración diferencial de la proteína de la influenza en la transferencia Western indicó que se habían añadido glicanos de una manera correspondiente al número de sitios de glicosilación introducidos. Las construcciones en las que se habían añadido uno o varios sitios de glicosilación migraron a un peso molecular más alto en comparación con PR8 de tipo salvaje, mientras que aquellas en las que se había eliminado uno o varios sitios de glicosilación migraron a un peso molecular más bajo con respecto a PR8 de tipo salvaje (Fig. 49). La unión de antisueros de ratones infectados con PR8 de tipo salvaje a las construcciones se redujo, lo que sugiere que los sitios de unión para los anticuerpos en los sueros estaban cubiertos por los sitios de glicanos adicionales añadidos.
Se utilizó inmunofluorescencia para comparar los niveles de expresión de las construcciones mutantes de HA in vitro y para determinar si las proteínas HA mutantes de glicosilación se habían plegado correctamente en su conformación nativa. La introducción de sitios de glicosilación individuales en el dominio de cabeza globular de HA en los cuatro sitios antigénicos aún permitía la expresión de proteínas y la unión de anticuerpos específicos del dominio de tronco de HA (Fig. 50A). La adición de sitios de glicosilación en el dominio de cabeza globular de HA dio como resultado una disminución de la señal de inmunofluorescencia del anticuerpo específico del dominio de cabeza (anticuerpo PY102) en comparación con HA de PR8 de tipo salvaje, lo que indica que los sitios antigénicos en el dominio de cabeza de HA estaban enmascarados por la glicosilación en los sitios introducidos (Fig. 50B y Tabla 4).
Tabla 4. Expresión y unión de anticuerpos a mutantes de glicosilación de influenza
La tinción de fluorescencia del dominio de tronco con anticuerpos que se unen específicamente a epítopos conformacionales en el tronco (anticuerpos KΒ2, C179 y 6F12) fue comparable a la de PR8 de tipo salvaje, lo que demuestra que las proteínas virales mutantes se plegaron correctamente en su conformación nativa a pesar de la adición de sitios de glicosilación en el dominio de cabeza (Fig. 50C). La tinción de inmunofluorescencia de células transfectadas con construcciones de HA de PR8 mutantes en las que se habían introducido sitios de glicosilación en el dominio de cabeza (42-1,42-4 y 42-5) y células transfectadas con construcciones mutantes en las que se habían introducido sitios de glicosilación en el dominio de cabeza y en las que se habían eliminado sitios de glicosilación del dominio de tronco (42-1, A33/289; 42-4, A33/289; 42-5, A33/289) mostró una disminución de la unión al anticuerpo del dominio anti-cabeza (PY102) en comparación con células transfectadas con construcciones de HA de PR8 de tipo salvaje y células transfectadas con construcciones de HA de PR8 con solo dos sitios de glicosilación en el dominio de tronco de HA eliminados (A33/289) (Fig. 50C). Por el contrario, no hubo diferencia en la capacidad de los anticuerpos anti-tronco para unirse al dominio de tronco de las células que expresaban estos mismos mutantes en comparación con PR8 de tipo salvaje y PR8 con sitios de glicosilación eliminados del dominio de tronco (Fig. 50C).
Para evaluar si el virus mutante viable podía recuperarse de las células infectadas, se utilizó un ensayo de hemadsorción para determinar si los mutantes virales aún podían unirse a los receptores sialilados en los glóbulos rojos de pollo. Un virus mutante que conserve la capacidad de unirse a los receptores sialilados indicaría que el virus podría entrar en las células a través de su receptor. Se pudieron rescatar virus de la influenza que expresaban mutantes de HA en los que se habían eliminado ciertos sitios de glicosilación del tronco de HA (Fig. 51). A continuación, se evaluó la capacidad del virus para ser rescatado utilizando un ensayo de hemaglutinina en huevos de embrión de pollo, como se describió anteriormente. En particular, los virus de la influenza que expresan mutantes de HA en los que se habían eliminado los sitios de glicosilación en las posiciones 289 y 483, o 33, 289 y 483 se unieron a los glóbulos rojos, así como al virus PR8 de tipo salvaje (Fig. 51). Por el contrario, la adición de sitios de glicosilación en el dominio de cabeza de HA parecía interferir sustancialmente en la capacidad de los virus que expresaban las proteínas HA mutantes para unirse a los glóbulos rojos (Fig. 51).
6.12 Ejemplo 12: Un dom inio de trimerización carboxi-term inal estabiliza epítopos conformacionales en el dom inio de tronco de sustratos de hemaglutinina recombinante soluble
Este ejemplo demuestra que un dominio de trimerización carboxi-terminal es importante para la integridad estructural de los epítopos del tronco en la hemaglutinina del virus de la influenza soluble recombinante.
6.12.1 Materiales y métodos
6.12.1.1 Células
Se cultivaron células de insecto Sf9 (ATCC Num. CRL-1711) en medio TMN-FH (Gemini Bio-Products) complementado con FBS al 10% (Atlanta Biologicals), Pluronic F68 al 0,1% (Sigma) y una mezcla de antibióticos de Penicilina-Estreptomicina (Gibco). Se cultivaron células BTI-TN-5B1-4 (High Five - subclón del Instituto de Biotecnología de Viena) en medio libre de suero HyClone SFX (Fisher Scientific) complementado con una mezcla de antibióticos de Penicilina-Estreptomicina (Gibco).
6.12.1.2 Clonación y generación de baculovirus recombinantes
Las secuencias que codificaban las HA de las cepas de H1 A/Puerto Rico/8/34 (PR8), A/Califomia/04/09 (Cal09), la cepa de H2 A/Japón/305/57 (JAP57), las cepas de H3 A/Hong Kong/ 1/68 (HK68), A/Wisconsin/67/05 (Wisc05) y la cepa de H5 A/Viet Nam/1203/04 (VN04 - con sitio de escisión polibásico eliminado; véase Steel et al., 2009, J Virol 83: 1742-1753) se amplificaron a partir de plásmidos pCAGGS mediante reacción en cadena de la polimerasa y se clonaron en un vector pFastBac modificado (Invitrogen) utilizando las endonucleasas de restricción (NEB) BamHI o
StuI y Notl. Las secuencias de los cebadores están disponibles bajo petición. Se clonaron dos conjuntos de construcciones, HA sin y con dominio de trimerización: las construcciones de HA sin dominio de trimerización se diseñaron de modo que el dominio C-terminal transmembrana y el endodominio de la HA se reemplazaron por una etiqueta de hexahistidina (la secuencia de HA termina con 1509 para H1, V509 para H2 y H5 y G508 para H3; numeración de H3); el otro conjunto de construcciones, HA con un dominio de trimerización, también carece del dominio transmembrana C-terminal y del endodominio (la secuencia HA termina con la numeración V503 - H3) pero incluye un sitio de escisión de trombina y un dominio de trimerización foldon de T4 (véase, p. ej., Meier et al., 2004, J Mol Biol 344: 1051-1069) además de la etiqueta de hexahistidina C-terminal (Figura 52). Los clones de pFastBac recombinantes generados se transformaron en bacterias DH10Bac (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante y los bácmidos recombinantes se prepararon con un kit PureLink Plasmid Filter Midiprep (Invitrogen). Los bácmidos recombinantes se transformaron en células Sf9 utilizando Cellfectin II (Invitrogen) para el rescate de baculovirus recombinantes. Todas las secuencias fueron confirmadas por secuenciación de Sanger.
6.12.1.3 Expresión, purificación y caracterización de proteínas
El baculovirus se amplificó en células Sf9 hasta una reserva de pase 3 y a continuación, se utilizó para infectar células BTI-TN-5B1-4 (High Five) a 1 x 106 células/ml en medio libre de suero HyClone SFX (Fisher Scientific) a una multiplicidad de infección de 10. La expresión se llevó a cabo en matraces agitadores de 1.000 ml durante 96 horas a 28°C. Después de 96 horas, los sobrenadantes se aclararon mediante centrifugación a baja velocidad (5.000 g, 4°C, 20 min) y se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) (3 ml de suspensión para 250 ml de sobrenadante de cultivo) durante dos horas a temperatura ambiente (RT). A continuación, la mezcla de resina y sobrenadante se pasó a continuación por columnas de polipropileno de 10 ml (Qiagen). La resina retenida se lavó cuatro veces con 15 ml de tampón de lavado (Na2HCÜ3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8) y la proteína se eluyó con tampón de elución (Na2HCÜ3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, pH 8). El eluato se concentró utilizando unidades de centrifugación Amicon Ultracell (Millipore) con un corte de 30 kDa y el tampón se cambió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4. La concentración de proteína se cuantificó utilizando Quickstart Bradford Dye Reagent (Bio-Rad) con una curva patrón de albúmina de suero bovino. La pureza, integridad e identidad de la proteína se evaluaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (geles de poliacrilamida al 4-20% - Mini PROTEAN TGX, Bio-Rad), tinción de Coomassie y transferencia Western o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El grado de trimerización y/o multimerización se probó mediante entrecruzamiento de HA con suberato de bis-[sulfosuccinimidilo] (BS3 - Fisher Scientific) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 3 μg de HA en 30 μl de PBS en presencia de un exceso molar de 25 veces de agente de entrecruzamiento BS3. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y a continuación, se extinguió BS3 añadiendo tampón Tris-HCl 1 M (pH 8) hasta una concentración final 50 mM. Posteriormente se realizaron SDS-PAGE y/o análisis de transferencia Western con un anticuerpo primario anti-his de ratón (Sigma) y un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology) o fosfatasa alcalina (Santa Cruz Biotechnology).
6.12.1.4 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
Las placas Immunolon 4HBX (Fisher Scientific) se recubrieron con HA recombinante con y sin dominio de trimerización a una concentración de 5 μg/ml en tampón de recubrimiento (Na2CO3/NaHCO30,1 M, pH 9,2, 50 μl/pocillo) durante la noche a 4°C. A continuación, las placas se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente con PBS (pH 7,4) que contenía Tween 20 al 1% (TBPS) y leche en polvo desnatada al 3%. Después del bloqueo, las placas se lavaron una vez con TPBS y a continuación, se incubaron con diluciones triples de anticuerpo monoclonal o sueros (100 μl por pocillo en TPBS con leche en polvo al 1% - concentración inicial de anticuerpo monoclonal 30 μg/ml; dilución 1:100 para sueros) durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron tres veces con 100 μl de TPBS y se incubaron durante otra hora a temperatura ambiente con anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpo secundario anti-Fab humano (Sigma) a una dilución de 1:3.000 (50 μl por pocillo). Después de tres lavados más, las placas se revelaron utilizando sustrato SigmaFAST OPD (Sigma) (100 μl/pocillo), se detuvieron con HCl 3M (50 μl/pocillo) y se leyeron a una absorción de 490 nm en un lector de placas Synergy 4 (BioTek). A la lectura obtenida se le restó el fondo con los valores de los pocillos incubados solo con anticuerpos secundarios.
Para los estudios de estabilidad, la HA del virus PR8 con dominio de trimerización se almacenó a 4°C durante 60 días, o a -80°C y se pasó por uno (patrón), dos, tres o cuatro ciclos de congelación y descongelación. La estabilidad de los anticuerpos que se unen a la cabeza frente al tronco se comparó utilizando anticuerpos monoclonales PY102 y C179. Las combinaciones de anticuerpo HA en ELISA se realizaron por triplicado excepto para los estudios de estabilidad donde se utilizaron duplicados.
6.12.2 Resultados
6.12.2.1 Un dom inio de trimerización C-terminal estabiliza las HA e induce la formación de trímeros
El dominio extracelular de varias HA del grupo 1 y del grupo 2 se expresó en forma soluble con o sin un dominio de trimerización del fago T4 C-terminal (Figura 52) en el sistema de expresión baculoviral. Las proteínas se recolectaron 96 horas después de la infección y se purificaron a través de una etiqueta de hexahistidina C-terminal utilizando una columna Ni-NTA. La proteína purificada se concentró utilizando columnas giratorias de ultrafiltración, se evaluó la integridad de la proteína y las impurezas mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie y se cuantificó con reactivo de Bradford. Basándose en la secuencia de aminoácidos y en el hecho de que los baculovirus que expresan HA de longitud completa sin un sitio de escisión polibásico generalmente no se escinden, el dominio extracelular de HA tendría una masa molecular esperada de aproximadamente 60 kDa por monómero (o 180 kDa por trímero) sin tener en cuenta la glicosilación. La HA de Cal09 (H1), JAP57 (H2) y VN04 (H5 sin sitio de escisión polibásico) sin dominio de trimerización parecía estar parcialmente escindida en HA1 y HA2 como lo indica la presencia de bandas a aproximadamente 40 kDa (HA1) y 25 kDa (HA2) además de la banda de HA no escindida a 60 kDa (HA0). Basándose en la presencia exclusiva de una banda de 60 kDa para las HA de Cal09, JAP57 y VN04 con dominios de trimerización en la SDS-PAGE desnaturalizante y no reductora, se puede suponer que estas proteínas se expresan principalmente como una HA0 no escindida (Figura 53A). Adicionalmente, las preparaciones de HA de Wisc05 (H3) sin un dominio de trimerización mostraron un producto de degradación a 40 kDa que era reactivo cuando se sondeó con un anticuerpo anti-tronco (12D1). Por lo tanto, esta especie era probablemente un producto de escisión no específica. La HA de Wisc05 con dominio de trimerización apareció solo como una banda HA0 (Figura 53A). La HA de PR8 y HK68 parecía ser muy estable (presente como HA0) incluso en ausencia de un dominio de trimerización.
Las HA se entrecruzaron con y sin el dominio de trimerización T4 utilizando BS3, un agente de entrecruzamiento químico hidrófilo de 11 Angstrom que se utilizó recientemente para mostrar la trimerización de las HA (véase, p. ej., Weldon et al., 2010, PLoS One 5). Después del entrecruzamiento, las muestras se diluyeron en un colorante de carga desnaturalizante y reductor y se resolvieron en un gel SDS-PAGE desnaturalizante y reductor. Las HA del grupo 1 sin dominio de trimerización formaron oligómeros de alto peso molecular que apenas migraron en el gel de migración y en su mayoría se retuvieron en el gel de apilamiento (Figura 53B y 53C). El fenotipo más fuerte se detectó para VN04 y JAP57; otras HA del grupo 1 también formaron trímeros adicionales (aproximadamente 230 kDa), dímeros (130 a 150 kDa) y monómeros (60 kDa) (Figura 53B y 53C). Las HA del grupo 1 con dominio de trimerización formaron en su mayoría trímeros que migraron a aproximadamente 230 kD en el gel SDS-PAGE y formaron una banda definida en el gel de migración. Sin embargo, también formaron dímeros (aproximadamente 130 a 150 kDa, más fuertes para Cal09) y monómeros (60 kDa). Las HA del grupo 2 se comportaron de manera diferente: la HA de HK68 formó predominantemente trímeros y hasta cierto punto dímeros independientemente de la presencia de un dominio de trimerización. La HA Wisc05 mostró principalmente dimerización en ausencia de un dominio de trimerización, mientras que la HA con el dominio T4 estaba trimerizada en su mayor parte.
6.12.2.2 Un dom inio de trimerización C-terminal mejora fuertemente la unión de anticuerpos reactivos con el tronco a sustratos de HA
Se evaluó la reactividad de un panel de anticuerpos neutralizantes ampliamente reactivos frente a las construcciones de HA para determinar la unión diferencial de estos anticuerpos a sustratos de HA con y sin dominio de trimerización. Se utilizaron en el experimento anticuerpos específicos de tronco mAb C179, mAb 6F12 de ratón, mAb CR6261 humano (todos específicos del grupo 1); y mAb 12D1 de ratón y mAb CR8020 humano (ambos específicos del grupo 2). También se utilizaron en el experimento otros cuatro anticuerpos reactivos con el tronco, KΒ2, BD3, GG3 e IB11, que se habían aislado y caracterizado recientemente por tener reactividad con las HA tanto de H1 como de H5. Como control, se utilizaron anticuerpos específicos de cepa que se sabe que se unen al dominio de cabeza globular de HA. Como controles adicionales, se utilizaron sueros de ratones infectados subletalmente con cepas del virus de la influenza (PR8, Cal09, H3, VN04) o vacunados con VLP (JAP57). Los anticuerpos C179, CR6261 y 6F12 mostraron un fuerte fenotipo de unión a las dos HA de H1 que se probaron (Cal09 y PR8). Cabe señalar que se unieron exclusivamente a HA que tenían un dominio de trimerización (Figura 54A y 54B); no se observó unión a HA sin un dominio de trimerización. Se observaron características de unión similares con los otros cuatro anticuerpos contra H1-H5 ampliamente neutralizantes reactivos con el tronco. Por el contrario, los anticuerpos específicos de cabeza, tales como 7B2 (Cal09) y PY102 (PR8), reaccionaron con HA independientemente de la expresión de un dominio de trimerización y estos hallazgos se confirmaron utilizando sueros de animales infectados con Cal09 o PR8 (Figura 54A y 54B).
Este efecto no es específico del subtipo H1: al probar la unión de C179 y CR6261 a las HA de JAP57 (H2) y VN04 (H5) con y sin un dominio de trimerización, se observó un fenotipo similar, donde estos anticuerpos solo reaccionaron con formas trimerizadas de la proteína (Figura 55A y 55B). Se observó el mismo resultado cuando se evaluó la reactividad de los cuatro anticuerpos contra H1-H5. Los anticuerpos específicos de cabeza 8F8 (JAP57) y mAb#8 (VN04) o los sueros anti-H2 o anti-H5 policlonales reconocieron ambas formas de HA igualmente bien.
Para los anticuerpos de unión a HA del grupo 2 surgió un patrón diferente. Para probar los efectos de un dominio de trimerización sobre la reactividad de los anticuerpos contra el tronco con las HA del grupo 2, se utilizaron anticuerpos ampliamente reactivos CR8020 y 12D1. CR8020 se une a un epítopo conformacional en las HA del grupo 2, mientras que se cree que 12D1 se une a un epítopo lineal dentro de la hélice alfa larga (LAH) de la subunidad HA2. La unión de CR8020 a las HA de HK68 y Wisc05 con dominios de trimerización mejoró mucho con respecto a la unión a las HA sin dominio de trimerización (Figura 56A y 56B). Sin embargo, la falta del dominio de trimerización no eliminó por completo la unión como se observa con las HA del grupo 1. 12D1 no distinguió entre HA con o sin dominio de trimerización (Figura 56).
6.12.3 Conclusión
El dominio de trimerización de T4 permite la trimerización satisfactoria de moléculas de HA solubles y aumenta en gran medida la estabilidad de estas moléculas después de la expresión de baculovirus.
Claims (20)
1. Un virus que comprende (i) un genoma modificado genéticamente para expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza o (ii) el polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza, comprendiendo dicho polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza un dominio de tallo de HA y un dominio de cabeza globular de HA, en donde el dominio de cabeza globular de HA es de una cepa o subtipo de virus de la influenza diferente a la cepa o subtipo del virus de la influenza del dominio de tallo de HA, en donde
(a) el dominio de tallo de HA comprende (i) un segmento de tallo N-terminal de HA1, en donde el segmento de tallo N-terminal de HA1 consiste en los restos de aminoácidos HA1 N-term a Ap; (ii) un segmento de tallo C-terminal de HA1, en donde el segmento de tallo C-terminal de HA1 consiste en los restos de aminoácidos Aq a HA1 C-term; y (iii) un dominio de tallo HA2; y
(b) el dominio de cabeza globular de HA comprende los restos de aminoácidos entre Ap y Aq de un dominio HA1;
y en donde HA1N-term es el aminoácido N-terminal de una proteína HA0 madura que carece de un péptido señal; en donde HA1C-term es el aminoácido C-terminal de un dominio HA1; Ap es la Cys que corresponde a la posición de aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración de H3; y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición de aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración de H3.
2. El virus de la reivindicación 1, en donde la cabeza globular de HA es de un subtipo del virus de la influenza diferente al subtipo del virus de la influenza del dominio de tallo de HA.
3. El virus de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de tallo de HA es el dominio de tallo de HA de un virus de influenza de subtipo H1, opcionalmente donde el subtipo H1 es A/California/04/09.
4. El virus de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de tallo de HA es el dominio de tallo de HA de un subtipo H3 del virus de la influenza, opcionalmente en donde el subtipo H3 es A/Perth/16/2009.
5. El virus de la reivindicación 3 o 4, en donde el dominio de cabeza globular de HA es el dominio de cabeza glo de HA de un virus de influenza de subtipo H2, H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17.
6. El virus de la reivindicación 3 o 4, en donde el dominio de cabeza 
globular de HA es el dominio de cabeza glo de HA de un virus de influenza de subtipo H5.
7. El virus de la reivindicación 4, en donde el dominio de cabeza globular de HA es el dominio de cabeza globular de
HA de A/Vietnam/1203/04 (H5) o el dominio de cabeza globular de HA de A/Alberta/24/01 (H7).
8. El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio de tallo de HA es resistente a la escisión por proteasa en la unión entre HA1 y HA2.
9. El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el dominio de tallo de HA comprende adicionalmente un dominio luminal de HA2, un dominio transmembrana de HA2 y un dominio citoplásmico de HA2.
10. El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza es soluble, opcionalmente en donde el dominio de tallo de HA carece de un dominio luminal de HA2, carece de un dominio transmembrana de HA2 y carece de un dominio citoplásmico de HA2, opcionalmente en donde el polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza comprende un dominio de trimerización o foldon.
11. El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el virus es un virus de la influenza, opcionalmente en donde el virus de la influenza es un virus de la influenza A.
12. El virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el virus está inactivado, fraccionado o atenuado vivo.
13. Una composición inmunogénica que comprende el virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. La composición inmunogénica de la reivindicación 13, en donde la composición inmunogénica comprende un adyuvante, opcionalmente en donde el adyuvante es una sal de aluminio, monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado (MPL), MF59, AS03, AS04, polisorbato 80, un compuesto de imidazopiridina, un compuesto de imidazoquinoxalina, una saponina, un adyuvante de Freund, una emulsión de aceite en agua o CpG.
15. La composición inmunogénica de la reivindicación 13 o 14, en donde la composición inmunogénica se formula para administración intramuscular o intranasal.
16. Una composición inmunogénica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 para su uso en un método para (a) inmunizar a un sujeto contra la enfermedad o infección por el virus de la influenza o (b) prevenir una enfermedad por el virus de la influenza en un sujeto.
17. La composición inmunogénica para el uso de la reivindicación 16, en donde la composición inmunogénica es para el uso en un método para inmunizar a un sujeto contra la enfermedad o infección por el virus de la influenza, y en donde el método comprende (a) administrar al sujeto la composición inmunogénica; y (b) administrar al sujeto una segunda composición inmunogénica que comprende un segundo polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza o un segundo virus que comprende un segundo polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza, en donde el segundo polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza comprende un segundo dominio globular de HA y un segundo dominio de tallo de HA, en donde el segundo dominio de cabeza globular de HA es de una cepa o subtipo del virus de la influenza diferente a la cepa o subtipo del virus de la influenza del segundo dominio de tallo de HA, y en donde el segundo polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza comprende el mismo dominio de tallo que el polipéptido quimérico de HA del virus de la influenza.
18. La composición inmunogénica para el uso de la reivindicación 16, en donde la composición inmunogénica es para el uso en un método para inmunizar a un sujeto contra la enfermedad o infección por el virus de la influenza, y en donde el método comprende (a) administrar al sujeto un virus de la influenza; y (b) administrar al sujeto la composición inmunogénica, en donde el polipéptido quimérico de HA comprende el mismo dominio de tallo que el polipéptido de HA del virus de la influenza, y en donde el dominio de cabeza globular de HA del polipéptido de HA del virus de la influenza y el polipéptido quimérico de HA son diferentes.
19. La composición inmunogénica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde el sujeto es un ser humano.
20. Un método para producir el virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende: (a) propagar el virus de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en una célula, una línea celular o un huevo embrionado; y (b) aislar el virus de la célula, la línea celular o el huevo embrionado.
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