CN112512567A - 抗原性呼吸道合胞病毒多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及抗原性呼吸道合胞病毒(RSV)多肽，用于在引发针对RSV的抗体中使用。还公开了包含RSV多肽和铁蛋白蛋白的抗原性多肽。

Description

抗原性呼吸道合胞病毒多肽
本申请要求2018年4月3日提交的美国临时专利申请号62/652,199的权益，所述临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2019年3月27日创建的所述ASCII副本被命名为2019-03-27_01121-0031-00PCT_SL_ST25.txt，并且大小为187,354字节。
即使在疫苗学领域取得了许多成功，仍需要新的突破来保护人类免受许多威胁生命的传染性疾病的影响。当前许多已获许可的疫苗都依赖十年前的技术来产生活的减毒病原体或灭活的杀死病原体，所述病原体具有固有的安全性问题，并且在许多情况下，仅刺激短暂的弱免疫应答，从而需要给予多个剂量。虽然遗传学和生物化学工程学的进步使得开发针对具有挑战性的疾病靶标的治疗剂成为可能，但在疫苗学领域的这些应用尚未完全实现。重组蛋白技术现在允许设计最佳抗原。另外，纳米颗粒已越来越多地展示出用于最佳抗原呈递和靶向药物递送的潜力。已经显示具有多个附接抗原的纳米颗粒具有增加的结合亲合力，所述增加的结合亲合力凭借其分子货物的多价展示和由于其纳米尺寸而更有效地跨过生物屏障的能力而提供。与流感病毒血凝素(HA)蛋白融合的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori(H.pylori))铁蛋白纳米颗粒可以改善抗原稳定性并增加在小鼠流感模型中的免疫原性(参见Kanekiyo等人,Nature 499:102-106(2013))。此融合蛋白自组装成八面体对称性纳米颗粒并呈递8个三聚体HA刺突，从而在与佐剂一起使用时在各种临床前模型中产生稳健的免疫应答。
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿中严重呼吸系统疾病的主要原因，并且是老年人中呼吸系统疾患的主要原因。尽管进行了几十年的研究，但仍未满足疫苗需求。虽然对疫苗的需求是明确的，但是在20世纪60年代，当时使用福尔马林灭活的RSV病毒进行的临床试验在婴儿中在RSV感染后使疾病更加严重，使RSV疫苗的开发受到阻碍。参见，Hurwitz(2011)Expert Rev Vaccines 10(10):1415-1433。最近，使用处于其融合后构象的RSV F抗原的临床项目未能在成人中引发足够的功效。参见，Faloon等人(2017)JID 216:1362-1370。然而，在融合前构象稳定化的RSV F抗原可引发的中和应答优于已在临床上失败的融合后抗原所引发的中和应答。
在此，提出了一组涉及RSV多肽的新多肽、纳米颗粒、组合物、方法和用途。产生了新型RSV F多肽，其包括这样的多肽，其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断，例如由在通过突变添加的糖基化位点处的N-聚糖阻断。还产生了包含这些新型RSV多肽和铁蛋白的抗原性多肽和纳米颗粒。还产生了包含RSV G多肽的抗原性铁蛋白多肽。此外，开发了包含RSV多肽和铁蛋白的自佐剂化抗原性多肽，其中免疫刺激部分(如佐剂)直接化学附接至抗原性多肽。将免疫刺激部分直接缀合至抗原性多肽允许在单一大分子实体中靶向共递送免疫刺激部分和RSV多肽，这可以大大降低全身性毒性的可能性，所述全身性毒性是在包含作为单独分子的抗原和免疫刺激分子(如佐剂)的传统的疫苗的情况下所担忧的。免疫刺激部分与RSV多肽在大分子实体中的共递送以及它们的多价呈递也可以减少引发保护所需的总剂量，从而减少生产负担和成本。
发明内容
本公开文本的目的是提供可以提供以上讨论的一个或多个优点，或者至少为公众提供有用选择的组合物、试剂盒、方法和用途。因此，本文公开了以下实施方案。
实施方案1是一种包含RSV F多肽的抗原性RSV多肽，其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断。
实施方案2是一种包含RSV F多肽的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含SEQID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209以及对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺。
实施方案3是根据实施方案2所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断。
实施方案3b是根据实施方案1或3所述的抗原性RSV多肽，其中所阻断的表位是RSVF的抗原性位点1的表位。
实施方案3c是根据实施方案1或3-3b所述的抗原性RSV多肽，其中融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的两个或更多个表位被阻断。
实施方案3d是根据实施方案1或3-3c所述的抗原性RSV多肽，其中RSV F的抗原性位点1的两个或更多个表位被阻断。
实施方案3e是根据实施方案1或3-3d所述的抗原性RSV多肽，其中与所阻断表位在拓扑上重叠的一个或多个或全部表位也被阻断。
实施方案3f是根据实施方案3e所述的抗原性RSV多肽，其中所阻断的表位是RSV F的抗原性位点1的表位。
实施方案4是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含融合前RSV F。
实施方案5是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽被选自D25或AM14的融合前RSV F特异性抗体识别。
实施方案6是根据实施方案4或5所述的抗原性RSV多肽，其中所述融合前RSV F包含在融合后RSV F上未发现的表位。
实施方案7是根据实施方案1-3中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含融合后RSV F。
实施方案8是根据实施方案1或3-6中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述表位被附接至天冬酰胺的N聚糖阻断。
实施方案9是根据实施方案7所述的抗原性RSV多肽，其中所述天冬酰胺对应于野生型RSV F序列(SEQ ID NO:26)中的非天冬酰胺残基，任选地其中所述非天冬酰胺残基对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507。
实施方案10是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽进一步包含铁蛋白蛋白。
实施方案11是根据实施方案11所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
实施方案12是一种抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含RSV F多肽和铁蛋白蛋白，其中所述铁蛋白蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
实施方案13是根据实施方案11-12中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C和S111C突变中的一种或多种或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的一种或多种相应突变。
实施方案14是根据实施方案10-13中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含经由表面暴露的氨基酸连接至所述铁蛋白的一个或多个免疫刺激部分，任选地其中所述表面暴露的氨基酸是由突变产生的半胱氨酸。
实施方案15是根据实施方案10-14中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述天冬酰胺是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置19处，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似位置处。
实施方案16是根据实施方案10-15中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变，任选地其中所述内部半胱氨酸是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处。
实施方案17是根据实施方案12-16中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSVF多肽包含在融合后RSV F上未发现的为位点0表位的表位，任选地其中所述位点0表位包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209。
实施方案18是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置328对应的位置处的天冬酰胺。
实施方案19是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置348对应的位置处的天冬酰胺。
实施方案20是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置507对应的位置处的天冬酰胺。
实施方案21是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置赖氨酸498对应的位置处的亮氨酸。
实施方案22是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置异亮氨酸217对应的位置处的脯氨酸。
实施方案23是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:26的位置155对应的位置处的除半胱氨酸之外的氨基酸和/或与SEQID NO:26的位置290对应的位置处的除半胱氨酸之外的氨基酸。
实施方案24是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含与SEQ ID NO:26的位置155对应的位置处的丝氨酸和/或与SEQ ID NO:26的位置290对应的位置处的丝氨酸。
实施方案25是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽缺乏弗林蛋白酶切割位点，任选地其中存在接头以代替所述弗林蛋白酶切割位点。
实施方案26是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
实施方案27是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
实施方案28是根据实施方案20或21所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-478。
实施方案29是根据实施方案1-19中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
实施方案30是根据实施方案1-19或23中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
实施方案31是根据实施方案23或24所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-478。
实施方案32是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:3-23中任一个的序列。
实施方案32a是根据实施方案32所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:17的序列。
实施方案32b是根据实施方案32所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:23的序列。
实施方案33是一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据实施方案10-32b中任一项所述的抗原性RSV多肽。
实施方案34是一种组合物，所述组合物包含根据前述实施方案中任一项所述的抗原性RSV多肽或铁蛋白颗粒和RSV G多肽。
实施方案34b是根据实施方案34所述的组合物，其中所述组合物包含所述铁蛋白颗粒，并且所述铁蛋白颗粒包含所述RSV G多肽，任选地其中所述RSV G多肽化学缀合至所述铁蛋白颗粒。
实施方案34c是根据实施方案34或34b所述的组合物，其中所述RSV G多肽是未糖基化的。
实施方案35是一种包含根据实施方案1-33中任一项所述的抗原性RSV多肽或铁蛋白颗粒的组合物，或根据实施方案34-34c中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案36是根据实施方案1-35中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒或组合物，用于在引发对RSV的免疫应答或保护受试者免受RSV感染的方法中使用。
实施方案37是一种引发对RSV的免疫应答或保护受试者免受RSV感染的方法，所述方法包括向受试者给予根据实施方案1-36中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒或组合物中的任何一种或多种。
实施方案38是根据实施方案36-37中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
实施方案39是一种核酸，所述核酸编码根据实施方案1-32b中任一项所述的抗原性RSV多肽，任选地其中所述核酸是mRNA。
实施方案39b是一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包含根据实施方案39所述的核酸和编码RSV G多肽的核酸，任选地其中一种或两种核酸是mRNA。
其他目的和优点将部分阐述于随后的描述中，并且部分将从所述描述中明显看出，或者可以通过实践获知。所述目的和优点将借助所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
应了解，上文的一般说明与下文的详细说明均仅是示例性和解释性的，并且对权利要求无限制性。
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图展示了若干实施方案，并且附图连同本说明一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A至图1D示出了示例性RSV Pre-F-NP多肽结构。(图1A)列出了对应于每个区段的N末端的残基数的线性图。编号是根据SEQ ID NO:26的。结构域1-3分别用DI、DII和DIII指示，并且还标记了七肽重复区A(HRA)和七肽重复区B(HRB)。C末端铁蛋白被标记(铁蛋白纳米颗粒)。RSV F部分的F1和F2片段标记在图片下方。F1与F2片段之间的区域被描绘为一条线并在图片上方标记，在所述区域中，肽27片段(p27)融合肽(FP)和弗林蛋白酶切割位点(弗林蛋白酶位点)缺失并被柔性接头置换以形成单链F构建体。图上方的星号指示工程化糖基化位点E328N、S348N和R507N的大致位置。(图1B)融合前RSV F部分的结构模型，其指示出D25、AM14、101F和帕利珠单抗抗体的关键中和(Nab)表位。共享的融合前和融合后结构表位的大致区域用白色三角形指示。示例性的工程化糖基化位点E328N、S348N和R507N的位置被标记。将工程化糖基化位点映射到融合前构象与融合后构象之间结构上共享的区域，并且远离被抗体(如D25、AM14、101F和帕利珠单抗)识别的关键中和表位。这样，含有这些工程化聚糖位点的构建体仍然结合以上的中和抗体(数据未显示)。(图1C)RSV融合前F蛋白纳米颗粒(Pre-F-NP)的结构模型，其中HRA和HRB区域阴影更深。所得的折叠的Pre-F-NP构建体可以形成24聚体，其展示了图1B中列出的关键表位。(图1D)RSV Pre-F-NP构建体RF8085(SEQ ID NO:1)的电子显微照片的2D类别平均值，其显示出RSV F三聚体部分在24聚体铁蛋白纳米颗粒上的对称性。
图2示出了如通过D25抗体蛋白质印迹所测量的，在293细胞条件培养基中表达的若干种Pre-F-NP构建体的小规模表达。RF8090是SEQ ID NO:2，其是在CHO表达中使用的克隆变体，具有与RF8085即SEQ ID NO:1相同的序列。RF8085和RF8090是含有DS-CAV的二硫化物和空腔填充突变的Pre-F-NP构建体，具有图1A中所述的缺失和单链接头，融合至铁蛋白的N末端。RF8100-RF8105和RF8108-RF8112分别具有序列SEQ ID NO:3-8和11-14。scF-pFerr＝RSV F多肽和铁蛋白的融合蛋白。将显现相对于RF8090基准改善构建体表达的突变指出在蛋白质印迹下方。值得注意的突变包括经由E328N、S348N和R507N突变添加聚糖位点以及中心螺旋加帽突变I327P，如通过蛋白质印记所测量的，所述突变增加RSV F纳米颗粒在条件培养基中的表达和分泌。
图3示出了如通过293表达的条件培养基的蛋白质印迹分析所测量的，RF8085(SEQID NO:1；对照构建体)和RF8106(SEQ ID NO:9；包含如RF8108中的I217P突变并且缺乏DS-CAV1的二硫化物(DS)突变)的表达。用中心螺旋加帽突变I217P置换DS显著增加表达。用中心螺旋加帽突变置换DS不影响构建体与融合前特异性抗体D25和AM14的结合。
图4示出了RF8106构建体(SEQ ID NO:9)的尺寸排阻色谱纯化的结果。在Superose6制备性SEC柱上RF8106纳米颗粒的大约65ml的保留体积与折叠的24聚体纳米颗粒一致，这表明RF8106中的突变并不妨碍纳米颗粒形成。
图5A至图5B示出了未还原的(5A)和还原的(5B)RF8106的动态光散射(DLS)分析。与SEC分析一样，DLS证明RSV Pre-F-NP形成了预期的折叠纳米颗粒。还原的数据进一步显示，颗粒没有被还原破坏，所述还原是在通过突变将佐剂与铁蛋白上引入的表面暴露的半胱氨酸进行缀合之前进行的(参见图6)。
图6示出了伴有和不伴有与TLR9激动剂CpG的缀合的RF8106的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶分析。CpG处理的纳米颗粒的增加的凝胶移位证明CpG佐剂可以添加至RSV F纳米颗粒上至大约40％-50％完成率。CpG或其他免疫刺激部分(如TLR7/8激动剂SM7/8)的缀合不会抑制颗粒结合融合前特异性抗体D25和AM14的能力。
图7示出了包含具有(RF8117，SEQ ID NO:17)和不具有附加聚糖(RF8085，SEQ IDNO:1；和RF8113，SEQ ID NO:16)的RSV F的纳米颗粒的蛋白质印迹。RF8113与RF8106相似，但是来自RF8106的S111C表面暴露的半胱氨酸(使用铁蛋白残基编号，即对应于SEQ ID NO:208的铁蛋白序列中的位置)已被K79C表面暴露的半胱氨酸(也使用铁蛋白残基编号)置换以使缀合位点远离Pre-F部分。与RF8106一样，RF8113与基准分子RF8085相比保留了改善的表达。RF8117与RF8113类似，但进一步包含图2中鉴定的三个糖基化突变，即E328N、S348N和R507N，以进一步改善表达并阻断如图1B中所述的融合前F构象与融合后F构象之间共享的非中和表位。
图8示出了在潜在的胰蛋白酶样蛋白酶切割位点具有不同取代的RSV F构建体的表达。在RF8090(与RF8085相同的蛋白质序列，具有适于CHO表达载体的不同DNA序列)的CHO细胞系表达中观察到，在F部分与铁蛋白部分之间的多肽被剪切，导致表达降低。通过F部分的所得质量，估计蛋白水解可能在Pre-F-NP构建体的HRB、牛蛙接头区域附近发生。研究了该区域(残基约450-550)内的赖氨酸和精氨酸残基的突变，以消除构建体的潜在的胰蛋白酶样蛋白水解。相对于RF8117的RF8122(SEQ ID NO:18)中的突变(K498L和K508Q)在293细胞中提供了改善的表达，并可减少或消除在CHO细胞中的蛋白水解。替代性突变限制了表达。
图9A-B.RF8090、RF8117和RF8140在稳定转染的CHO细胞中的表达。观察到RF8090(SEQ ID NO:2)的表达产量在低水平下。如上所述，向克隆到稳定表达的CHO细胞中的构建体RF8117(SEQ ID NO:17)和RF8140(SEQ ID NO:23)中引入置换DS-CAV1的二硫化物的突变以及对F部分与铁蛋白部分之间的接头的突变(以消除潜在胰蛋白酶切割位点)。(图9A)通过D25-蛋白质印迹分析，将分别来自三个和四个CHO细胞池的RF8117和RF8140在CHO条件培养基中的表达与RF8090在CHO条件培养基中的产量进行比较。RF8117的所有三个CHO池和RF8140的所有四个CHO池比RF8090具有更高的产量。(图9B)如通过Octet通过D25融合前F特异性抗体所测量的，RF8117在CHO条件培养基中的表达。左图片示出了相对于与蛋白A尖端上D25的结合的反应绘制的从已知浓度的293培养基中纯化的RF8140反应，从而提供标准曲线。单独的点表示针对来自RF8117 CHO条件培养基的D25结合的反应。右图片示出了基于D25结合反应，CHO池条件培养基中RF8117或RF8140的计算产量。如通过D25和AM14结合所测量的，RF8117和RF8140均在培养基中表达，这证明与293细胞一样，CHO细胞能够以折叠的方式表达Pre-F-NP，其保留融合前F三聚体结构。
图10A-B.对Pre-F-NP RF8117的中和抗体应答。(图10A)如通过VERO细胞测定所测量的由以下项的高剂量(1μg)和低剂量(0.1μg)免疫引发的RSV中和效价的比较：DS-CAV1(Pre-F三聚体，SEQ ID NO:25)、融合后F三聚体(Post-F三聚体；SEQ ID NO:24)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(Pre-F-NP；RF8117，SEQ ID NO:17)。将所有RSV多肽与如本文所述的佐剂AF03一起给予。自始至终，除非另有说明，否则将AF03与RSV多肽或纳米颗粒一起给予，但不与之缀合。RSV多肽和剂量标记在x轴线下方。指示了相对于Pre-F-NP免疫的高剂量应答的统计分析。(图10B)如通过VERO细胞测定所测量的由用以下项的高剂量(1μg)和低剂量(0.1μg)免疫引发的RSV中和效价的比较：DS-CAV1(Pre-F三聚体)、不伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8113，SEQ ID NO:16)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8117，SEQ ID NO:17)。将所有RSV多肽与如本文所述的佐剂AF03(不与任何多肽或纳米颗粒缀合)一起给予。RSV多肽和剂量标记在x轴线下方。
图11A-D.在小鼠或非人灵长类动物模型中由用融合后F三聚体(SEQ ID NO:24)或Pre-F-NP(RF8140 SEQ ID NO:23)免疫引发的RSV融合前F三聚体(DS-CAV1)结合抗体和RSV中和抗体的比较。(图11A)比较了在小鼠中由融合后F与Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)之间的免疫引发的融合前F三聚体结合抗体应答。(图11B)示出了在小鼠中由用融合后F和Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)免疫引发的中和抗体应答。(图11C)比较了在伴有或不伴有佐剂(AF03，在下面的括号中指示)的情况下由Pre-F-NP在非人灵长类动物中引发的融合前F三聚体结合抗体应答。(图11D)比较了在伴有和不伴有AF03佐剂的情况下，由用Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)免疫引发的RSV中和效价。在小鼠中，与融合后三聚体相比，Pre-F-NP引发更高的融合前F结合应答和RSV中和应答。在非人灵长类动物中，Pre-F-NP引发强效的中和应答。
图12A至图12B显示工程化糖基化位点阻断融合后表位。(图12A)示出了如通过Octet所测量的，由用高(1μg)和低(0.1μg)剂量下的不伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8113)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(工程化Gly颗粒)免疫引发的对融合前F(DS-CAV1)的抗体应答。(图12B)示出了如通过Octet所测量的，由用高(1μg)和低(0.1μg)剂量下的不伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8113)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8117)免疫引发的对融合后三聚体的抗体应答。如上，在免疫期间将所有RSV多肽与AF03混合。虽然RF8113和RF8117均引发对融合前F的稳健抗体应答，但由RF8117引发的融合后F抗体应答大大降低。这是由于映射到共享的融合前和融合后表位的工程化聚糖(图2B)。
图13A-C示出了工程化糖基化位点对非中和性表位的阻断。(图13A)如通过VERO细胞测定所测量的，在小鼠研究中，由用0.1μg剂量下的具有野生型糖基化位点的Pre-F NP(“Wt聚糖颗粒”；RF8113，SEQ ID NO:16)与具有另外的工程化糖基化位点的Pre-F NP(“+聚糖颗粒”；RF8117，SEQ ID NO:17)免疫引发的RSV中和效价的比较。(图13B)在小鼠研究中由用0.1μg剂量下的Wt聚糖颗粒(RF8113，SEQ ID NO:16)与+聚糖颗粒(RF8117，SEQ ID NO:17)免疫引发的RSV融合后F三聚体结合抗体应答的比较。(图13C)所测量的中和效价与图片A和B中的结合效价的比率，其证明工程化聚糖没有降低功能性中和抗体应答，但确实降低了针对共享的融合前/融合后表位(图1B)引发的非中和抗体，由此提高了中和/结合抗体比率。
图14A-D.对与铁蛋白纳米颗粒缀合的RSV G中心结构域肽(Gcc)的表征。(图14A)考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，其显示出RSV G中心结构域(SEQ ID NO.29)与铁蛋白纳米颗粒的点击缀合，从而形成Gcc-NP抗原。(图14B)Gcc-NP的结构模型。(图14C)在小鼠研究中由用单独的Gcc肽(Gcc肽，SEQ ID NO.29)与缀合至纳米颗粒的Gcc肽(Gcc-NP)进行免疫引发的Gcc结合抗体的对比。将来自幼稚态血清(
Figure BDA0002803750830000111
serum)的代表性应答示出在白色框中，而将来自第二次免疫后的应答示出在浅灰色框中，并且将来自第三次免疫后的应答示出在深灰色框中。(图14D)如通过HAE细胞测定所测量的，在第三次注射后的小鼠研究中，由用Gcc肽(SEQ ID NO.29)与Gcc-NP进行免疫引发的RSV中和效价的比较。合并来自幼稚态动物的血清和来自用Gcc肽免疫的动物的血清，并且将效价示出为条。
图15A-C.RSV Pre-F-NP(RF8140)和Gcc-NP的共同给予引发中和应答。用单独的Pre-F-NP(RF8140)、单独的Gcc-NP或组合的Pre-F-NP和Gcc-NP以1μg剂量/抗原对小鼠进行免疫。如上将所有免疫用AF03佐剂化。(图15A)用单独的RF8140(Pre-F-NP)或RF8140和Gcc-NP(Pre-F-NP+Gcc-NP)对小鼠进行免疫引发结合融合前F三聚体的抗体。(图15B)用单独的Gcc-NP(Gcc-NP)或RF8140和Gcc-NP(Pre-F-NO+Gcc-NP)对小鼠进行免疫引发结合Gcc肽的抗体。(图15C)用单独的Pre-F-NP、单独的Gcc-NP或Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予免疫的动物在第二次免疫后和第三次免疫后引发中和应答，如通过HAE中和测定所测量的。Pre-F-NP+Gcc-NP的共同给予引发的中和应答优于由仅用Pre-F-NP免疫引发的中和应答。
图16A-B.Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予不干扰结合融合前F三聚体或Gcc-纳米颗粒的抗体的引发。通过F-敏感性VERO细胞测定所测量的中和效价在图16A的左侧，而通过F-和G-敏感性HAE测定所测量的中和效价示于图16B的右侧。动物免疫如图15中。免疫中使用的RSV多肽在水平轴线下方。黑条表示从图15中所述的免疫组合并的血清，并且被类似地标记。幼稚态动物的血清也示出为黑色条并进行标记以便比较。用融合前F三聚体耗尽的血清为白色，正好位于相应黑色条的右侧。用G胞外结构域耗尽的血清呈对角条纹条，正好位于相应黑条的右侧。用融合前F三聚体耗尽之后用G胞外结构域耗尽的血清呈竖直条纹条。(图16A)在VERO细胞测定中对于来自RF8140免疫和RF8140+Gcc-NP共同给予的血清观察到中和效价，但对于幼稚态血清或来自单独的Gcc-NP免疫的血清没有观察到。用融合前F三聚体耗尽来自RF8140或RF8140+Gcc-NP组的血清降低了可测量中和效价。(图16B)在HAE细胞测定中对于来自用RF8140、Gcc-NP或与Gcc-NP共同给予的RF8140免疫的动物的血清观察到中和效价。来自幼稚态动物的血清没有中和应答。来自用RF8140免疫的动物的、用融合前F三聚体耗尽的血清具有可测量中和效价的降低。来自用Gcc-NP免疫的动物的、用G胞外结构域耗尽的血清具有可测量中和效价的降低。来自用RF8140和Gcc-NP的共同给予免疫的动物的血清在用单独的融合前F三聚体耗尽时没有降低的可测量中和效价，但是在用融合前F三聚体和G胞外结构域两者耗尽时具有降低的可测量中和效价。总之，这些数据表明用Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予不会干扰抗原各自引发对融合前F或G的中和抗体的能力。
图17A-B.相对于未佐剂化RF8117，用AF03、SPA09或明矾佐剂化RF8117或RF8140在小鼠中引发优越的中和应答。(图17A)示出了如通过VERO细胞测定所测量的，来自用以下情况下的RF8117免疫的小鼠的血清的中和效价：未佐剂化(无佐剂)、用明矾佐剂化、或用AF03佐剂化。(图17B)示出了如通过VERO细胞测定所测量的，来自用以下项免疫的小鼠的血清的中和效价：未佐剂化(无佐剂)的RF8117、用SPA09佐剂化的RF8117、或用AF03佐剂化的RF8140。在RF8117或RF8140的所有情况下，在幼稚态小鼠中，佐剂化组比未佐剂化组引发更高的中和效价。
图18A-B.相对于未佐剂化RF8140免疫，用AF03或SPA09佐剂化RF8140在非人灵长类动物(NHP)中引发优越的中和应答。(图18A)如通过ELISA所测量的，在用以下情况下的RF8140免疫之后，在NHP血清中测量的融合前F三聚体应答：未佐剂化(无佐剂)、用AF03佐剂化、或用SPA09(使用两种剂量的SPA09，如在下方所指示的)佐剂化。在所有时间点，用AF03或SPA09佐剂化引发优越的中和应答。(图18B)如通过VERO细胞测定所测量的，来自用以下情况下的RF8140免疫的NHP的血清的中和效价：未佐剂化(无佐剂)、用AF03佐剂化或用SPA09(使用两种剂量的SPA09，如在下方所指示的)佐剂化。在所有情况下，用伴有佐剂的RF8140进行的免疫在所有时间点均比未佐剂化组引发更高的中和效价。
图19A-B.相比于单独的未佐剂化RF8140，RF8140与TLR7/8激动剂SM7/8或TLR9激动剂CpG的缀合引发优越的融合前F结合效价。(图19A)示出了在来自以下项的血清中测量的融合前F三聚体结合应答：幼稚态小鼠，用未佐剂化RF8140免疫的小鼠，用与SM7/8佐剂缀合的RF8140、用130ng SM7/8佐剂化的RF8140或用20μg SM7/8佐剂化的RF8140免疫的小鼠。与未佐剂化或SM7/8佐剂化组相比，与SM7/8缀合的RF8140引发更高的融合前F三聚体结合效价。(图19B)示出了在来自以下项的血清中测量的融合前F三聚体结合应答：幼稚态小鼠，用未佐剂化RF8140免疫的小鼠，用与CpG佐剂缀合的RF8140、用680ng CpG佐剂化的RF8140或用20μg SM7/8佐剂化的RF8140免疫的小鼠。与未佐剂化或SM7/8佐剂化组相比，与SM7/8缀合的RF8140引发更高的融合前F三聚体结合效价。
图20A-G.在MIMIC系统中F亚单位疫苗候选物引发pre-F定向的中和抗体和Th1CD4+T细胞应答。(图20A)在以关于10ng/ml pre-F NP的F的摩尔当量浓度用每种Ag初免之后，通过AF测量MIMIC系统中的抗pre-F效价(n＝48-49个供体/组)。(图20B)测量微中和效价，并以国际单位/ml(IU/ml)表示。(图20C)抗pre-F与post-F之间的比率>1表示pre-F结合抗体相对于post-F结合抗体的水平更高，而比率值<1表示对post-F的Ab应答更大。(图20D)使用流式细胞术测量用载有F蛋白的靶细胞再刺激的激活CD154+/CD4+T细胞中TNFα的产生(n＝48)。经由Tukey-Kramer-HSD多重比较确定统计显著性(图20E)人受试者中先前存在的抗体效价(血清状态)与MIMIC系统中RSV免疫应答的强度高度相关。通过软件或算法生成显示来自每个供体的血清中的抗pre-F IgG与总抗pre-F IgG应答的关系的线性回归图，并且通过统计方法分析了共同斜率的p值(n＝50)。Y轴线表示在用RSV初免后获得的抗pre-FIgG水平。(图20F)如在图20E中，显示在用F亚单位疫苗候选物(post-F呈正方形，pre-F-NP呈圆圈并且DC-Cav1呈菱形)初免后来自每个供体的血清中的抗-pre-F IgG与总抗-pre-FIgG的关系的线性回归图。抗pre-F IgG的先前存在的循环效价的范围为199,800至3,037,600,000。每个点代表每个单独供体的IgG值。(图20G)在人B细胞中由用单独的Gcc肽(Gcc肽)与缀合至纳米颗粒的Gcc肽(Gcc-NP)处理引发的Gcc结合抗体应答的比较。对于如上的比较，示出了未处理组。
图21A-C.由低剂量(0.5μg)的RSV Gcc-铁蛋白纳米颗粒(“Gcc-NP”)引发的中和抗体效价。示出了在第二次免疫后两周(2wp2)(图21A)或第三次免疫后两周(2wp3)(图21B)获取的血清中，由用含RSV A2Gcc序列的RSV Gcc-NP(与AF03一起配制)免疫引发的RSV A株系HAE中和效价，其中幼稚态血清和超免疫血清作为阴性对照和阳性对照。还示出了在第三次免疫后两周(2wp3)获取的血清中，由用含RSV A2 Gcc序列的RSV Gcc-NP(与AF03一起配制)免疫引发的RSV B株系HAE中和效价(图21C)。
图22A-B.由RSV Gcc-NP引发的RSV A2株系抗原结合抗体应答。(图22A)由高剂量(5μg)的RSV Gcc-NP引发，在第二次注射后两周(浅灰色框)和第三次注射后两周(深灰色框)测量的针对Gcc A2株系引发的Gcc结合抗体应答。幼稚态小鼠血清应答作为阴性对照示出。(图22B)由低剂量(0.5μg)的RSV Gcc-NP引发，在第二次注射后两周(浅灰色框)和第三次注射后两周(深灰色框)测量的针对Gcc A2株系引发的Gcc结合抗体应答。
图23A-B.由RSV Gcc-NP引发的RSV B1株系抗原结合抗体应答。(图23A)由高剂量(5μg)的RSV Gcc-NP引发，在第二次注射后两周(浅灰色框)和第三次注射后两周(深灰色框)测量的针对Gcc B1株系引发的Gcc结合抗体应答。幼稚态小鼠血清应答作为阴性对照示出。(图23B)由低剂量(0.5μg)的RSV Gcc-NP引发，在第二次注射后两周(浅灰色框)和第三次注射后两周(深灰色框)测量的针对Gcc B1株系引发的Gcc结合抗体应答。
具体实施方式
提供了RSV多肽，RSV多肽在单独给予、与作为单独分子的佐剂一起给予和/或作为可以自佐剂化的纳米颗粒(例如，铁蛋白颗粒或2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒)的一部分给予时可以是抗原性的。在一些实施方案中，抗原性RSV多肽包含RSV F多肽和铁蛋白，和/或其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断的RSV F多肽。与融合后RSV F相比，引导针对RSV F的融合前构象的抗体的生产的RSV F多肽诱导了对融合前RSV F的更高的体内抗体应答。本文还描述了包含全部或部分RSV G的RSV G多肽，并且可以进一步包含铁蛋白。RSV G和RSV F蛋白对于RSV与宿主细胞的附着和融合至关重要。
RSV F以两种构象状态，即融合前构象和融合后构象存在。在其天然融合前状态下，RSV F是由3个原体构成的三聚体。因此，用处于融合前构象的RSV F多肽免疫可以具有改善的特性。在一些实施方案中，RSV F多肽被设计成诱导针对处于融合前构象的RSV F的免疫。RSV G是负责使RSV与人气道上皮细胞关联的附着蛋白。
A.定义
如本文所用，“抗原位点0”或“位点0表位”是指位于融合前RSV F三聚体顶点的位点，其包含野生型RSV F(SEQ ID NO:26)的氨基酸残基62-69和196-209。位点0表位是对融合前RSV F具有特异性的抗体(如D25和AM14)的结合位点，并且抗体与位点0表位的结合阻断了RSV的细胞表面附接(参见McLellan等人,Science 340(6136):1113-1117(2013))。
如本文所用，“抗原稳定性”是指抗原随时间或在溶液中的稳定性。
如本文所用，“空腔填充取代”是指用于填充存在于融合前RSV F三聚体中的空腔的工程化疏水性取代。
“F蛋白”或“RSV F蛋白”是指在病毒进入过程中负责驱动病毒包膜与宿主细胞膜融合的RSV蛋白。
“RSV F多肽”或“F多肽”是指包含F蛋白的至少一个表位的多肽。
如本文所用，“聚糖添加”是指引入野生型RSV F中不存在的糖基化位点的突变的添加，其可以被工程化以增加构建体表达、增加构建体稳定性或阻断融合前构象与融合后构象之间共享的表位。包含聚糖添加的修饰蛋白质将具有更多的糖基化，因此具有更高的分子量。聚糖添加可以降低RSV F多肽引发针对RSV F的融合后构象的抗体的程度。
如本文所用，“G蛋白”或“RSV G蛋白”是指负责使RSV与人气道上皮细胞缔合的附着蛋白。示例性的野生型RSV G氨基酸序列提供为SEQ ID NO:27。RSV G蛋白包含位于细胞外的胞外结构域(大致为RSV G(SEQ ID NO:27)的氨基酸66-297)。在RSV G的胞外结构域内是中心保守区(Gcc或CCR，大致为SEQ ID NO:27的氨基酸151-193)。RSV G的CCR包含CX3C基序。CX3C基序介导G蛋白与CX3CR1受体的结合。
如本文所用，“螺旋PRO加帽”或“螺旋脯氨酸加帽”是指螺旋帽包含可稳定化螺旋形成的脯氨酸的情况。
如本文所用，“原体内稳定化取代”描述了RSV F中的氨基酸取代，所述氨基酸取代通过稳定化RSV F三聚体的原体内的相互作用来稳定化融合前构象。
如本文所用，“原体间稳定化取代”描述了RSV F中的氨基酸取代，所述氨基酸取代通过稳定化RSV F三聚体的原体彼此的相互作用来稳定化融合前构象。
如本文所用，“蛋白酶切割”是指多肽序列中易感残基(例如，赖氨酸或精氨酸)的蛋白水解(在本领域中有时也称为“剪切”)。
如本文关于RSV F所用的，“融合后”是指RSV F的在病毒和细胞膜融合之后发生的稳定构象。
如本文关于RSV F所用的，“融合前”是指RSV F的在病毒-细胞相互作用之前所采用的构象。
如本文所用，“原体”是指寡聚蛋白质的结构单元。在RSV F的情况下，RSV F三聚体的单独单元是原体。
如本文所用，“铁蛋白”或“铁蛋白蛋白”是指与幽门螺杆菌铁蛋白(SEQ ID NO:208或209)或本文所讨论的另一种铁蛋白(如激烈火球菌(P.furiosus)铁蛋白、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)铁蛋白或人铁蛋白)具有可检测的序列同一性的蛋白质，其用于例如在细胞内或组织中存储铁或在血流中携带铁。在下文详细讨论了此类示例性铁蛋白，包括以两条多肽链(称为重链和轻链)出现的那些(例如，粉纹夜蛾和人铁蛋白)。在一些实施方案中，铁蛋白包含与本文例如在表1(序列表)中公开的铁蛋白序列具有至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。铁蛋白可以是全长天然存在的序列的片段。
如本文所用，“野生型铁蛋白”是指其序列由天然存在的序列组成的铁蛋白。铁蛋白还包括其氨基酸序列与野生型铁蛋白有一个或多个差异的全长铁蛋白或铁蛋白片段。
如本文所用，“铁蛋白单体”是指未与其他铁蛋白分子组装的单一铁蛋白分子(或，在适用时，单一铁蛋白重链或轻链)。“铁蛋白多聚体”包含多个缔合的铁蛋白单体。“铁蛋白蛋白”包括单体铁蛋白和多聚体铁蛋白。
如本文所用，“铁蛋白颗粒”是指已经自组装成球状形式的铁蛋白。铁蛋白颗粒有时被称为“铁蛋白纳米颗粒”或简称为“纳米颗粒”。在一些实施方案中，铁蛋白颗粒包含24个铁蛋白单体(或，在适用时，总共24个重链和轻链)。
如本文所用，“杂合铁蛋白”是指包含幽门螺杆菌铁蛋白与牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的铁蛋白。用作牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的示例性序列呈现为SEQ ID NO:217。在杂合铁蛋白中，可以将牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区与幽门螺杆菌铁蛋白融合，由此使得使免疫刺激部分附接位点均匀分布在铁蛋白颗粒表面。如本文所用，“牛蛙接头”是包含序列SEQ ID NO:217的接头。杂合铁蛋白有时也称为“bfpFerr”或“bfp铁蛋白”。可以在没有牛蛙序列的情况下，例如像在没有接头或在具有替代性接头的情况下提供包含牛蛙序列的任何构建体。示例性牛蛙接头序列提供于表1中。在表1示出牛蛙接头的情况下，可以在没有接头或具有替代性接头的情况下制造相同的构建体。
如本文所用，“N-聚糖”是指在蛋白质的N(天冬酰胺)残基的酰胺氮处附接至蛋白质的糖链。这样，通过N-糖基化过程形成N-聚糖。此聚糖可以是多糖。
如本文所用，“糖基化”是指将糖单元添加至蛋白质。
如本文所用，“免疫应答”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的身体的任何细胞，例如包括分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。如本文所用，“保护性免疫应答”是指保护受试者免受感染(例如，预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如通过测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。“抗体应答”是其中产生抗体的免疫应答。
如本文所用，“抗原”是指引发免疫应答的因子；和/或当暴露或给予至生物体时由T细胞受体结合的因子(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体(例如，由B细胞产生)结合的因子。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括产生抗原特异性抗体)。可替代地或另外，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。特定抗原可以在靶标生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或若干成员中引发免疫应答，但不能在靶标生物体物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合抗体和/或T细胞受体，并且在生物体中可能诱导或可能不诱导特定生理应答。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外结合抗体和/或T细胞受体，无论在体内是否发生这种相互作用。在一些实施方案中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)反应。抗原包括如本文所述的抗原性铁蛋白蛋白，其包含铁蛋白(例如，包含一个或多个突变)和非铁蛋白多肽(例如，RSV多肽)。
如本文所用，“免疫刺激部分”是指共价附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽并可以激活免疫系统的组分(单独或当附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽时)的部分。示例性免疫刺激部分包括toll样受体(TLR)例如TLR 4、7、8或9的激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。
如本文所用，“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括而不限于其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；其中抗原溶液乳化在矿物油中或水中的油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG基序)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，如Toll样受体(TLR)激动剂和共刺激分子。佐剂可以作为单独分子在组合物中给予或与铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽共价结合(缀合)。
“抗原性RSV多肽”在本文中用于指包含全部或部分RSV氨基酸序列的多肽，所述RSV氨基酸序列的长度足以使所述分子具有关于RSV的抗原性。抗原性可以是作为进一步包含异源序列(如铁蛋白和/或免疫刺激部分)的构建体的一部分的RSV序列的特征。即，如果RSV序列是进一步包含异源序列的构建体的一部分，则所述构建体可以充当产生抗RSV抗体的抗原就足够了，而不管不伴有异源序列的RSV序列是否可以如此。
“抗原性铁蛋白多肽”和“抗原性铁蛋白蛋白”在本文中可互换用于指包含铁蛋白和非铁蛋白多肽(例如，RSV多肽)的多肽，所述非铁蛋白多肽的长度足以使所述分子具有关于非铁蛋白多肽的抗原性。抗原性铁蛋白多肽可以进一步包含免疫刺激部分。抗原性可以是作为较大构建体的一部分的非铁蛋白序列的特征。即，所述构建体可以充当针对非铁蛋白多肽的抗原就足够了，而不管不伴有铁蛋白(如果适用，和免疫刺激部分)的非铁蛋白多肽是否可以如此。在一些实施方案中，非铁蛋白多肽是RSV多肽，在这种情况下，抗原性铁蛋白多肽也是“抗原性RSV多肽”。然而，要清楚的是，抗原性RSV多肽不需要包含铁蛋白。“抗原性多肽”在本文中用于指为抗原性铁蛋白多肽和抗原性RSV多肽中的任一者或两者的多肽。
如本文所用，“自佐剂化”是指组合物或多肽包含铁蛋白和直接缀合至铁蛋白的免疫刺激部分，使得铁蛋白和免疫刺激部分在同一分子实体中。可以将包含非铁蛋白多肽的抗原性铁蛋白多肽与免疫刺激部分缀合以产生自佐剂化多肽。
如本文所用，“表面暴露的”氨基酸是指蛋白质(例如，铁蛋白)中具有侧链的氨基酸残基，当所述蛋白质在多聚化后(如果适用)处于其天然的三维构象时，所述侧链可以被溶剂分子接触。因此，例如，在形成24聚体的铁蛋白的情况下，当铁蛋白组装为24聚体，例如组装为铁蛋白多聚体或铁蛋白颗粒时，表面暴露的氨基酸残基是其侧链可以被溶剂接触的氨基酸残基。
如本文所用，“受试者”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“受试者”是指人。在一些实施方案中，“受试者”是指非人动物。在一些实施方案中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在某些实施方案中，非人受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/猪)。在一些实施方案中，受试者可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，术语“个体”或“患者”被使用并且旨在与“受试者”可互换。
如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination或vaccinate)”是指给予旨在例如对致病因子产生免疫应答的组合物。疫苗接种可以在暴露于致病因子和/或发生一种或多种症状之前、期间和/或之后给予，并且在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不久给予。在一些实施方案中，疫苗接种包括间隔适当时间的疫苗接种组合物的多次给予。
本公开文本描述了分别与给定核酸序列或氨基酸序列(参考序列)具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列。
两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在具体是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过以下方式进行：在最佳比对之后，关于区段或“比较窗口”比较所述序列，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动地进行或借助于Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin序列分析包(Genetics Computer Group,575Science Drive,威斯康星州麦迪逊)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLASTN和TFASTA)进行。
百分比同一性通过以下方式获得：确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用此数目除以比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)，并且然后将此结果乘以100。
在一些实施方案中，同一性程度是针对区域给出的，所述区域是参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中为连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的整个长度给出同一性程度。
分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如并且在一些情况下，在功能上等同于所述给定序列。一个重要的特性包括充当细胞因子的能力，特别是当给予受试者时。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列在功能上等同于所述给定序列。
如本文所用，术语“试剂盒”是指一组经包装的相关组分，如一种或多种化合物或组合物和一种或多种相关材料，如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。
B.包含在某些位置含有一个或多个天冬酰胺的RSV F多肽的抗原性RSV多肽
本文提供了包含RSV F多肽的抗原性RSV多肽。RSV F多肽可以包含RSV F的整个序列或RSV F的一部分。在一些实施方案中，RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断。当将抗原性RSV多肽给予至受试者时，阻断表位减少或消除了针对表位的抗体的产生。这可以增加靶向于F的特定构象(如融合前构象)所特有的表位的抗体的比例。因为F在尚未进入细胞的病毒中具有融合前构象，所以靶向于融合前F的抗体的比例增加可以提供更大的中和度(例如，如本文所述，表示为中和与结合比率)。可以通过在共享表位附近工程化大体积部分(如N-聚糖)来实现阻断。例如，可以例如通过将适当的残基突变为天冬酰胺来添加野生型F中不存在的N-糖基化位点。在一些实施方案中，阻断的表位是RSV F的抗原性位点1的表位。在一些实施方案中，融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的两个或更多个表位被阻断。在一些实施方案中，RSV F的抗原性位点1的两个或更多个表位被阻断。在一些实施方案中，与被阻断的表位在拓扑上重叠的一个或多个、或全部表位也被阻断，任选地其中被阻断的表位是RSV F的抗原性位点1的表位。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺。在一些实施方案中，多肽包含对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507中的至少两个的天冬酰胺。在一些实施方案中，多肽包含对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺。如实施例中所述，已发现此类天冬酰胺可充当糖基化位点。此外，不希望受任何特定理论的束缚，当将多肽给予至受试者时，这些位点处的聚糖可以抑制针对附近表位的抗体的产生，所述附近表位包括融合前和融合后RSV F蛋白共有的表位。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺的糖基化阻断融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的至少一个表位，如抗原性位点1的表位。抑制针对融合前和融合后RSV F蛋白共有的表位的抗体的产生可能是有益的，因为它可以引导针对融合前RSV F蛋白所特有的表位(如位点0表位)的抗体产生，所述抗体产生可能比针对其他RSV F表位的抗体具有更有效的中和活性。位点0表位涉及SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209。因此，在一些实施方案中，RSV F多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69或196-209。
应当指出的是，本文所述的构建体可以具有相对于野生型RSV F不同长度的缺失或取代。例如，在SEQ ID NO:23等的构建体中，野生型序列(SEQ ID NO:26)的位置98-144被置换为GSGNVGL(SEQ ID NO:23的位置98-104；也为SEQ ID NO:31)，导致净去除40个氨基酸，由此使得SEQ ID NO:26的328、348或507对应于SEQ ID NO:23的位置288、308和467。通常，本文所述的构建体中的位置可以通过成对比对，例如使用具有标准参数(EBLOSUM62矩阵，空位罚分10，空位延伸罚分0.5)的Needleman-Wunsch算法映射到SEQ ID NO:26的野生型序列上。还参见作为用于鉴定相应位置的替代性方法的如本文提供的结构比对的讨论。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含突变，所述突变为添加聚糖以阻断融合前抗原上的在结构上与融合后RSV F表面上的那些表位相似的表位。在一些实施方案中，添加聚糖以特异性地阻断可能存在于RSV F的融合后构象中的表位。在一些实施方案中，添加聚糖，所述聚糖阻断可能存在于RSV F的融合后构象中的表位，但不影响存在于RSV F的融合前构象上的一个或多个表位(如位点0表位)。
在一些实施方案中，与其他构建体相比，在上文讨论的一个或多个糖基化位点处添加的聚糖增加了在表达系统(如哺乳动物细胞)中的分泌。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含与SEQ ID NO:17的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。在一些实施方案中，RSV F多肽包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。在一些实施方案中，RSV F多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-478。在一些实施方案中，RSV F多肽包含SEQ ID NO:17的序列。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。在一些实施方案中，RSV F多肽包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。在一些实施方案中，RSV F多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-478。在一些实施方案中，RSV F多肽包含SEQ ID NO:23的序列。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含DS-CAV1序列(如例如在McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):592-598(2013)中所述)(SEQ ID NO:25)，其中进行了进一步的修饰，包括以上所述的至少一个、两个或三个天冬酰胺。
在一些实施方案中，多肽进一步包含铁蛋白蛋白。铁蛋白蛋白可以进一步包含下面在关于铁蛋白的章节中所述的任何特征，或其组合。
RSV F多肽可另外包含以下讨论中阐述的任何附加特征，或此类特征的任何可行组合。
单链构建体
在一些实施方案中，RSV多肽是单链构建体，例如缺少弗林蛋白酶切割位点的RSV多肽。在一些实施方案中，RSV F缺乏一个或多个弗林蛋白酶切割位点。缺乏弗林蛋白酶切割位点的构建体表达为不会切割成天然F蛋白的生物学F1/F2片段的单一多肽。
氨基酸取代
在一些实施方案中，RSV F包含相对于野生型序列的单一氨基酸取代。在一些实施方案中，RSV F包含相对于野生型序列的多于一个的单一氨基酸取代，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个取代。示例性野生型序列是SEQ ID NO:26。
在一些实施方案中，氨基酸取代或氨基酸取代对是一个或多个原体间稳定化取代。可以是原体间稳定化的示例性取代是V207L；N228F；I217V和E218F；I221L和E222M；或Q224A和Q225L(使用SEQ ID NO:26的位置编号)。
在一些实施方案中，氨基酸取代或氨基酸取代对是原体内稳定化的。可以是原体内稳定化的示例性取代是V220I；和A74L和Q81L(使用SEQ ID NO:26的位置编号)。
在一些实施方案中，氨基酸取代是螺旋稳定化的，即被预测为其稳定化RSV F的螺旋结构域。螺旋结构域的稳定化通常可以有助于位点0表位和RSV F的融合前构象的稳定性。可以是螺旋稳定化的示例性取代是N216P或I217P(使用SEQ ID NO:26的位置编号)。
在一些实施方案中，氨基酸取代是螺旋加帽。在一些实施方案中，氨基酸取代是螺旋PRO加帽。螺旋加帽是基于以下的生物物理观察结果：虽然α螺旋中的脯氨酸残基突变放置可能破坏螺旋的形成，但螺旋区N末端处的脯氨酸可以通过稳定化PHI/PSI键角来帮助诱导螺旋形成。可以是螺旋加帽的示例性取代是N216P或I217P(使用SEQ ID NO:26的位置编号)。
在一些实施方案中，氨基酸取代置换了DS-CAV1的二硫化物突变。在一些实施方案中，将DS-CAV1的工程化二硫化物回复为DS-CAV1的野生型(C69S和/或C212S突变)(使用SEQID NO:26的位置编号)。在一些实施方案中，DS-CAV1的一个或多个C残基被置换为S残基以消除二硫键。在一些实施方案中，使用SEQ ID NO:26的位置编号的C69S或C212S取代消除了二硫键。在一些实施方案中，RSV F多肽包含使用SEQ ID NO:26的位置编号的C69S和C212S二者。在一些实施方案中，置换此类半胱氨酸并由此消除二硫键阻止了RSV F多肽的还原(即，接受来自还原剂的电子)。在一些实施方案中，在抗原中包含使用SEQ ID NO:26的位置编号的I217P取代而不是在C69和/或C212处的取代。SEQ ID NO:26中的位置217对应于SEQID NO:23中的位置177。
在一些实施方案中，氨基酸取代防止胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，防止这种蛋白水解的氨基酸取代是在RSV F的七肽重复区B(HRB)区域中。与包含野生型HRB区域的RSV F-铁蛋白构建体的蛋白水解相一致的片段的出现表明此区域中的赖氨酸或精氨酸被靶向用于蛋白水解。用以去除K或R残基的氨基酸取代可称为敲除(KO)。在一些实施方案中，K或R被L或Q取代。在一些实施方案中，K被L或Q取代。在一些实施方案中，RSV F多肽包含使用SEQ ID NO:26的位置编号的K498L和/或K508Q。SEQ ID NO:23中的相应位置分别是458和468。在一些实施方案中，RSV F多肽包含K498L和K508Q二者。
在一些实施方案中，氨基酸取代添加了聚糖。在一些实施方案中，氨基酸取代通过向RSV F多肽添加聚糖来增加糖基化。与天然糖基化(没有附加的聚糖)相比，用以添加聚糖的取代也可以称为工程化糖基化。
在一些实施方案中，用以添加聚糖的氨基酸取代是被N取代。在一些实施方案中，被N取代氨基酸允许N-连接的糖基化。在一些实施方案中，被N取代伴随着被在N的C末端的第二个氨基酸位置处的T或S取代，从而形成NxT/S糖基化基序。在一些实施方案中，N是表面暴露的。如以下实施例中所示，增加了糖基化的突变可以提供包含RSV F多肽的多肽的增加表达。基于修饰对RSV F多肽的特性的改变
对RSV F的氨基序列的修饰可以改变RSV F多肽的特性。RSV F多肽的特性可以包括RSV F多肽的任何结构或功能特征。
在一些实施方案中，对氨基酸序列的单一修饰改变了RSV F多肽的多种特性。在一些实施方案中，RSV F多肽可以包含改变RSV F多肽的不同特性的多种修饰。在一些实施方案中，多种修饰产生了RSV F多肽的特性的更大变化。
在一些实施方案中，多种修饰可以对特定特性具有累加作用。例如，与任一单一氨基酸取代相比，用于添加聚糖的两个氨基酸取代可以产生RSV F多肽的糖基化的更大增加。
在一些实施方案中，多种修饰影响RSV F多肽的不同特性。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代以增加糖基化，同时进行一个或多个氨基酸取代以阻止还原。
在一些实施方案中，对RSV F多肽的修饰使得融合前构象稳定化。
在一些实施方案中，修饰使得融合前RSV F的位点0表位(也称为抗原性位点0)稳定化，如例如在McLellan等人,Science 340(6136):111 3-1117(2013)中所述。在一些实施方案中，使得位点0表位稳定化的修饰是原体间稳定化的。在一些实施方案中，使得位点0表位稳定化的修饰使得融合前F稳定化，如通过位点0和位点V结合所测量的，所述位点0和位点V结合如分别通过与抗体D25或AM14的结合而测量。
在一些实施方案中，修饰增加了RSV F在表达系统中的表达。在一些实施方案中，修饰增加了RSV F在表达系统中的分泌。在一些实施方案中，修饰增加了重组RSV F在表达后的稳定性。这种变化可以存在于任何类型的表达系统，如细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中。
在一些实施方案中，与其他构建体相比，引入脯氨酸的氨基酸取代增加了表达。在一些实施方案中，与其他构建体相比，添加聚糖的氨基酸取代增加了表达。在一些实施方案中，与其他构建体相比，将K或R取代为其他氨基酸的氨基酸取代增加了表达。表达的可观察到的增加可以由增加发酵运行或其他产生过程的产量的任何机制导致，包括相对抑制蛋白酶切割或降解和/或增加在宿主细胞或细胞外环境中的稳定性。在一些实施方案中，与其他构建体相比，将RSV F的HRB区域中的一个或多个K残基取代为其他氨基酸的氨基酸取代增加了表达。
在一些实施方案中，将K取代为其他氨基酸的氨基酸取代增加了RSV F多肽的稳定性。在一些实施方案中，将RSV F的HRB区域中的一个或多个K残基取代为其他氨基酸的氨基酸取代增加了RSV F多肽的稳定性。在一些实施方案中，这种增加的稳定性归因于蛋白酶切割的减少。
在一些实施方案中，RSV F包含去除二硫化物(例如以防止还原后的缀合)的一个或多个突变。在一些实施方案中，I217P取代阻止了RSV F多肽的减少。在一些实施方案中，将K取代为其他氨基酸的氨基酸取代阻止了在还原剂的存在下RSV F多肽的还原。
在一些实施方案中，与其他构建体相比，单链构建体增加了表达。
在一些实施方案中，RSV F多肽包含DS-CAV1序列(SEQ ID NO:25)(如在McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):592-598(2013)中所述)。在一些实施方案中，RSV F多肽包含其中进行进一步修饰(例如，包括以上所述的至少一个、两个或三个天冬酰胺)的DS-CAV1的序列。
C.RSV G多肽
如本文所用，RSV G多肽可以包含RSV G的整个序列或RSV G的一部分。与野生型序列相比，RSV G多肽可以包含修饰。在一些实施方案中，RSV G多肽是与野生型RSV G(SEQ IDNO:27)相比经修饰的RSVG。
在一些实施方案中，这些修饰是与野生型RSV G相比对RSV G多肽的氨基酸的改变。
在一些实施方案中，RSV G多肽包含RSV G的胞外结构域(SEQ ID NO:28或对应于其的位置)的全部或一部分。在一些实施方案中，RSV G多肽包含Gcc区域(RSV G(SEQ IDNO:27)的氨基酸151-193)的全部或一部分。在一些实施方案中，RSV G多肽包含CX3C基序。在一些实施方案中，RSV G多肽结合CX3CR1受体。Gcc区域既是保守的又是免疫原性的，因此可以用于引发对RSV株系具有广泛活性的抗体。在一些实施方案中，提供了RSV Gcc株系A，如SEQ ID NO:32中所示。在一些实施方案中，提供了RSV Gcc株系B，如SEQ ID NO:33中所示。
在一些实施方案中，RSV G多肽未被糖基化。例如，RSV G多肽可以由于N或S/T残基的截短或突变(例如分别变为Q或A)或其组合而缺乏NXS/TX糖基化位点。
在一些实施方案中，RSV G多肽是抗原性铁蛋白多肽的一部分。例如，RSV G多肽可以缀合至如本文所述的铁蛋白，如经由铁蛋白上的表面暴露的半胱氨酸进行。在一些实施方案中，此铁蛋白纳米颗粒是还包含RSV F多肽的融合蛋白，如上文所述的包含RSV F多肽和铁蛋白蛋白的任何多肽。
D.包含铁蛋白的抗原性RSV多肽
本文还提供了包含铁蛋白和RSV多肽的抗原性RSV多肽。RSV多肽可以是RSV F多肽，如本文所述的任何RSV F多肽。RSV F多肽可以包含RSV F的整个序列或RSV F的一部分。与野生型序列相比，RSV F多肽可以包含一个或多个修饰(例如氨基酸取代)。RSV多肽可以是RSV G多肽，如本文所述的任何RSV G多肽。
在一些实施方案中，多肽中的铁蛋白是野生型铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌、昆虫、真菌、鸟类或哺乳动物的。在一些实施方案中，铁蛋白是人的。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌的。
在一些实施方案中，铁蛋白是轻链和/或重链铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是昆虫铁蛋白，如粉纹夜蛾重链铁蛋白(SEQ ID NO:211)或粉纹夜蛾轻链铁蛋白(SEQ IDNO:212)。在一些实施方案中，铁蛋白是人铁蛋白，如人重链铁蛋白(SEQ ID NO:214或FTH1，GENE ID No:2495)或人轻链铁蛋白(SEQ ID NO:215或FTL，GENE ID No:2512)。在一些实施方案中，铁蛋白纳米颗粒包含重链铁蛋白和轻链铁蛋白的总共24个亚基，如在人或粉纹夜蛾铁蛋白纳米颗粒中。粉纹夜蛾铁蛋白纳米颗粒可以包含12个重链铁蛋白亚基和12个轻链铁蛋白亚基。
在一些实施方案中，抗原性RSV多肽包含轻链铁蛋白和RSV多肽。在一些实施方案中，抗原性RSV多肽包含重链铁蛋白和RSV多肽。在一些实施方案中，可以将包含轻链铁蛋白和RSV多肽的抗原性RSV多肽与未与RSV多肽连接的重链铁蛋白组装。在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和RSV多肽的抗原性RSV多肽与未与RSV多肽连接的轻链铁蛋白组装。未与RSV多肽(或更一般地，非铁蛋白多肽)连接的铁蛋白可以称为“裸铁蛋白”。
在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和多肽的抗原性多肽与包含轻链铁蛋白和RSV多肽的抗原性多肽组装，以允许在单一铁蛋白纳米颗粒上呈递两种相同或不同的非铁蛋白多肽。在一些实施方案中，两种不同的非铁蛋白多肽是RSV多肽。在一些实施方案中，两种不同的非铁蛋白多肽由RSV和不同的感染原编码。在一些实施方案中，来自不同感染原的不同非铁蛋白多肽来自病毒或细菌。
在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和非铁蛋白多肽的抗原性多肽与包含轻链铁蛋白和非铁蛋白多肽的多肽组装，以产生二价组合物，其中非铁蛋白多肽中的一者或二者是RSV多肽，如RSV F或G多肽，例如本文所述的RSV F或G多肽。
在一些实施方案中，铁蛋白是任选地具有一个或多个突变(如本文所述的那些)的幽门螺杆菌铁蛋白(对于示例性幽门螺杆菌铁蛋白序列，参见SEQ ID NO:208或209)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白(或其他细菌铁蛋白)与人铁蛋白之间较低的序列同源性在用作疫苗平台时可降低自身免疫的潜力(参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，铁蛋白是具有本文所述的一个或多个突变的激烈火球菌铁蛋白(NCBI seq WP_011011871.1)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含与野生型铁蛋白具有大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，提供了纳米颗粒，所述纳米颗粒包含如本文公开的含有RSV多肽和铁蛋白的抗原性RSV多肽。
在一些实施方案中，将能够形成纳米颗粒的不同蛋白质取代铁蛋白。在一些实施方案中，此蛋白质是2,4-二氧四氢喋啶合酶(参见Ra等人,Clin Exp Vaccine Res 3:227-234(2014))。在一些实施方案中，此蛋白质是2,4-二氧四氢喋啶合酶血清型1、2、3、4、5、6或7。示例性2,4-二氧四氢喋啶合酶序列提供为SEQ ID NO:216和219。在一些实施方案中，2,4-二氧四氢喋啶合酶包含与SEQ ID NO:216或219具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
1.用于缀合的半胱氨酸
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以提供用于缀合免疫刺激部分和/或RSV多肽的化学处理。这可以通过用半胱氨酸置换表面暴露的非半胱氨酸氨基酸的突变来实现。为了避免疑问，如“用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸”的语言必定意味着野生型或突变前序列中的表面暴露的氨基酸不是半胱氨酸。提供用于缀合免疫刺激部分或RSV多肽的化学处理的另一种方法是包括在铁蛋白的N或C末端的氨基酸区段(如接头)，其中所述氨基酸区段包含半胱氨酸。在一些实施方案中，此半胱氨酸(无论是置换表面暴露的氨基酸还是在N或C末端接头中)是不成对的，这意指它没有合适的伴侣半胱氨酸来形成二硫键。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的二级结构。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的三级结构。
在一些实施方案中，此半胱氨酸可以用于将药剂(如免疫刺激部分)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，此半胱氨酸提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白上的此半胱氨酸缀合的药剂暴露在组装的铁蛋白颗粒的表面上。在一些实施方案中，在组装铁蛋白颗粒的同时，此半胱氨酸可以在给予后与受试者的分子和细胞相互作用。
在一些实施方案中，此半胱氨酸的存在允许缀合一个或多个免疫刺激部分，例如佐剂。在一些实施方案中，在不存在此半胱氨酸的情况下不会发生免疫刺激部分的缀合。
在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸选自幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S72、A75、K79、S100和S111。因此，在一些实施方案中，被置换为半胱氨酸的表面暴露的氨基酸是对应于幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S26、S72、A75、K79、S100或S111的氨基酸残基。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸可以选自对应于人轻链铁蛋白的S3、S19、S33、I82、A86、A102和A120的氨基酸。在一些实施方案中，基于以下理解来选择要被半胱氨酸置换的表面暴露的氨基酸：如果天然氨基酸被半胱氨酸置换，它将在组装的铁蛋白多聚体或颗粒中是反应性的和/或此半胱氨酸不会破坏铁蛋白多聚体或颗粒的稳定性和/或此半胱氨酸不会导致铁蛋白表达水平降低。
在一些实施方案中，铁蛋白包含E12C突变。在一些实施方案中，E12C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，E12C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的E12C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个E12C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S26C突变。在一些实施方案中，S26C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S26C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S26C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S26C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S72C突变。在一些实施方案中，S72C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S72C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S72C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S72C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含A75C突变。在一些实施方案中，A75C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，A75C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的A75C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个A75C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含K79C突变。在一些实施方案中，K79C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，K79C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的K79C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个K79C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S100C突变。在一些实施方案中，S100C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S100C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S100C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S100C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S111C突变。在一些实施方案中，S111C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或RSV多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S111C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S111C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S111C残基(每个单体中一个)。
2.内部半胱氨酸的去除
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变。去除天然内部半胱氨酸残基可以确保每个铁蛋白单体只有一个未配对的半胱氨酸，并且避免了不希望的反应(如二硫化物形成)，并且可以导致更稳定且高效的结果(例如，佐剂呈递)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白的C31被非半胱氨酸氨基酸置换。在一些实施方案中，用丝氨酸(C31S)置换幽门螺杆菌铁蛋白的C31，但是可以使用任何非半胱氨酸残基，例如丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，被置换为非半胱氨酸的内部半胱氨酸是与幽门螺杆菌铁蛋白的C31对齐的氨基酸残基。显示C31S突变的示例性铁蛋白序列在SEQ IDNO:201-207中示出。在一些实施方案中，当铁蛋白中存在多于一个内部半胱氨酸时，两个或更多个(例如，每个)内部半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸置换，所述非半胱氨酸氨基酸如丝氨酸或选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺的氨基酸。
3.糖基化
人相容性糖基化可有助于重组药物产品的安全性和功效。监管批准可能取决于证明适当的糖基化是关键的质量属性(参见Zhang等人,Drug Discovery Today 21(5):740-765(2016))。N-聚糖可以由天冬酰胺侧链的糖基化产生，并且在人与其他生物体(如细菌和酵母)之间的结构可能不同。因此，可能期望减少或消除根据本公开文本的铁蛋白中的非人糖基化和/或N-聚糖形成。在一些实施方案中，控制铁蛋白的糖基化改善了组合物的功效和/或安全性，尤其是当用于人疫苗接种时。
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以抑制N-聚糖的形成。在一些实施方案中，与其相应的野生型铁蛋白相比，突变的铁蛋白具有降低的糖基化。
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变。在一些实施方案中，表面暴露的天冬酰胺是幽门螺杆菌铁蛋白的N19或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置。在一些实施方案中，使这种天冬酰胺(例如幽门螺杆菌铁蛋白的N19)突变降低了铁蛋白的糖基化。在一些实施方案中，突变是用谷氨酰胺置换了天冬酰胺。在一些实施方案中，铁蛋白是包含N19Q突变的幽门螺杆菌铁蛋白。SEQ ID NO:201-207是包含N19Q突变的示例性铁蛋白序列。
暴露于细菌或酵母中产生的糖基化蛋白的哺乳动物可能会对糖基化蛋白产生免疫应答，因为细菌或酵母中给定蛋白的糖基化模式可能与哺乳动物中相同蛋白的糖基化模式不同。因此，一些糖基化的治疗性蛋白质可能不适合在细菌或酵母中生产。
在一些实施方案中，通过氨基酸突变进行的铁蛋白糖基化减少有利于蛋白质在细菌或酵母中的产生。在一些实施方案中，减少的铁蛋白糖基化降低了在给予在细菌或酵母中表达的突变铁蛋白后在哺乳动物中产生不利影响的可能性。在一些实施方案中，因为糖基化减少，所以在细菌或酵母中产生的突变铁蛋白在人受试者中的反应原性降低。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白相比，用具有减少的糖基化的突变铁蛋白治疗后，人受试者中超敏反应的发生率较低。
在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中的降解较慢。在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中具有降低的清除率。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物具有更长的血清半衰期。
4.突变的组合
在一些实施方案中，铁蛋白包含本文所述的多于一种类型的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含一种或多种独立地选自以下项的突变：减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。
在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和E12C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S72C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和A75C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和K79C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S100C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S111C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含对应于前述突变组中的任一种的突变，其中相应的突变在通过铁蛋白氨基酸序列与幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:208或209)的成对比对确定的位置处将N改变为Q、将C改变为S，并且将非半胱氨酸表面暴露的氨基酸改变为半胱氨酸。
包含多于一种类型的突变的示例性铁蛋白提供于SEQ ID NO:201-207中。
5.结构比对
如本文所讨论，可以通过成对或结构比对来鉴定对应于关于给定多肽(例如，幽门螺杆菌铁蛋白)描述的那些的突变位置。结构比对与大型蛋白质家族(如铁蛋白)有关，在大型蛋白质家族中，尽管有相当大的序列变异，但蛋白质共享相似的结构并且家族的许多成员已在结构上进行了表征；并且还可以用于鉴定本文所述的其他多肽(如RSV多肽(例如，RSV F或G))的不同形式中的相应位置。蛋白质数据库(PDB)包括许多铁蛋白的3D结构，包括下文用其登录号列出的那些。
2jd6、2jd7–PfFR-激烈火球菌。2jd8–PfFR+Zn。3a68–来自基因SferH4的soFR–大豆。3a9q-来自基因SferH4的soFR(突变体)。3egm、3bvf、3bvi、3bvk、3bvl–HpFR–幽门螺杆菌。5c6f–HpFR(突变体)+Fe。1z4a、1vlg–FR–海栖热袍菌(Thermotoga maritime)。1s3q、1sq3、3kx9–FR–闪烁古生球菌(Archaeoglubus fulgidus)。1krq–FR–空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。1eum-EcFR–大肠杆菌。4reu–EcFR+Fe。4xgs–EcFR(突变体)+Fe2O2。4ztt–EcFR(突变体)+Fe2O+Fe2+Fe+O2。1qgh–LiFR-英诺克李斯特菌(Listeriainnocua)。3qz3-VcFR–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。3vnx–FR–孔石莼(Ulva pertusa)。4ism、4isp、4itt、4itw、4iwj、4iwk、4ixk、3e6s–PnmFR–多列拟菱形藻(Pseudo-nitschiamultiseries)。4zkh、4zkw、4zkx、4zl5、4zl6、4zlw、4zmc–PnmFR(突变体)+Fe。1z6o–FR–粉纹夜蛾。4cmy–FR+Fe–花柱绿杆菌(Chlorobaculum tepidum)。铁蛋白轻链(FTL)。1lb3、1h96–mFTL–小鼠。1rcc、1rcd、1rci–bFTL+酒石酸盐+Mg。1rce、1rcg-bFTL+酒石酸盐+Mn。3noz、3np0、3np2、3o7r–hoFTL(突变体)-马。3o7s、3u90-hoFTL。4v1w–hoFTL–低温EM。3rav、3rd0–hoFTL+巴比妥酸盐。铁蛋白轻+重链：5gn8–hFTH+Ca。
结构比对涉及通过以下方式来鉴定两个(或更多个)多肽序列中的相应残基：(i)使用第二序列的已知结构对第一序列的结构建模或(ii)比较两者均已知的第一序列和第二序列的结构，并且鉴定第一序列中与第二序列中的目的残基最相似定位的残基。在一些算法中，基于叠加结构中的α-碳距离最小化(例如，哪组成对α碳为比对提供最小的均方根偏差)鉴定出相应的残基。当鉴定非幽门螺杆菌铁蛋白中的对应于关于幽门螺杆菌铁蛋白描述的位置的位置时，幽门螺杆菌铁蛋白可以是“第二”序列。在目的幽门螺杆菌铁蛋白没有已知的可用结构，但相比于幽门螺杆菌铁蛋白与另一种具有已知结构的非幽门螺杆菌铁蛋白紧密相关的情况下，可能最有效的是使用紧密相关的非幽门螺杆菌铁蛋白的已知结构来对目的非幽门螺杆菌铁蛋白建模，然后将该模型与幽门螺杆菌铁蛋白结构进行比较，以鉴定目的铁蛋白中的期望的相应残基。关于结构建模和比对有大量文献，代表性的披露文本包括US 6859736；US 8738343；以及Aslam等人,Electronic Journal of Biotechnology20(2016)9–13中引用的内容。对于基于已知的一种或多种相关结构对结构建模的讨论，参见例如Bordoli等人,Nature Protocols 4(2009)1–13及其中引用的参考文献。
6.免疫刺激部分；佐剂；缀合的RSV多肽
在一些实施方案中，将RSV多肽和/或免疫刺激部分(如佐剂)附接至表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是半胱氨酸，例如，由上文讨论的突变产生的半胱氨酸。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。使用戊二醛(用于将赖氨酸与带氨基的接头或部分缀合)或碳二亚胺(例如用于将天冬氨酸或谷氨酸与带氨基的接头或部分或将赖氨酸与带羧基的接头或部分缀合的1-环己基-3-(2-吗啉-4-基-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(EDC；ED AC))的缀合程序例如描述于可从www.springer.com获得的Holtzhauer,M.,Basic Methods for theBiochemical Lab,Springer 2006,ISBN 978-3-540-32785-1的第四章中。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将多于一个免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将二十四个免疫刺激部分附接至铁蛋白多聚体或颗粒(例如，幽门螺杆菌铁蛋白颗粒中每个单体有一个部分)。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是相同的。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是不相同的。
a)免疫刺激部分的类型；佐剂
可以附接至表面暴露的氨基酸(例如半胱氨酸)的任何免疫刺激部分都可以用于根据本公开文本的铁蛋白中。在一些实施方案中，免疫刺激部分是B细胞激动剂。
在一些实施方案中，免疫刺激部分不是疏水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是亲水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是极性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分能够进行氢键结合或离子键结合，例如包含氢键供体、氢键受体、阳离子部分或阴离子部分。如果部分在生理上相关的pH(如pH 6、7、7.4或8)下在水性溶液中将被离子化，则可以认为所述部分是阳离子或阴离子的。
在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。在一些实施方案中，佐剂包括病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，佐剂是Toll样受体(TLR)激动剂，或干扰素基因刺激物(STING)激动剂。在一些实施方案中，佐剂激活B和/或T细胞中的TLR信号传导。在一些实施方案中，佐剂调节适应性免疫应答。
(1)TLR2激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR2信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR2激动剂是PAM2CSK4、FSL-1或PAM3CSK4。
(2)TLR7/8激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8激动剂(即，TLR7和TLR8中至少一者的激动剂)。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR7和/或TLR8信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是单链的(ssRNA)。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是核苷类似物。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉胺Toll样受体(TLR)激动剂，如3M-012(3M Pharmaceuticals)。游离3M-012的结构是：
Figure BDA0002803750830000381
应当理解的是，可以通过以下方式将免疫刺激部分(如3M-012)或本文所讨论的任何部分缀合至铁蛋白：用与本文所述的铁蛋白例如在表面暴露的半胱氨酸的硫处的键或与附接至这个硫的接头的键取代所述部分的适当的外围原子(例如氢)。因此，当缀合至铁蛋白时，免疫刺激部分的结构将与游离分子的结构略有不同。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是SM 7/8a。游离SM 7/8a的结构是：
Figure BDA0002803750830000391
参见，例如Nat Biotechnol.2015年11月；33(11):1201-10.doi:10.1038/nbt.3371。
(3)TLR9激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR9信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR9激动剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是未甲基化的CpG ODN。在一些实施方案中，CpG ODN包含部分或完整的硫代磷酸酯(PS)主链，而不是普通DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)主链。
在一些实施方案中，CpG ODN是B类ODN，其包含一个或多个含有5'嘌呤(Pu)-嘧啶(Py)-C-G-Py-Pu 3'的6聚体CpG基序；具有完全硫代磷酸化(即PS改性)的主链；并且长度为18-28个核苷酸。在一些实施方案中，CpG ODN包含SEQ ID NO:210的序列，任选地包含在主链中的硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，TLR9激动剂包含免疫刺激序列(ISS)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是ISS-1018(Dynavax)(SEQ ID NO:210)。
(4)STING激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING(干扰素基因蛋白的刺激物，也称为内质网IFN刺激物)激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激STING信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，STING激动剂是环状二核苷酸(CDN)。参见，例如Danilchanka等人,Cell 154:962-970(2013)。示例性CDN包括cdA、cdG、cAMP-cGMP和2'-5',3'-5'cGAMP(对于结构，参见Danilchanka等人)。STING激动剂还包括合成激动剂，如DMXAA
Figure BDA0002803750830000401
b)缀合的RSV多肽
在一些实施方案中，RSV多肽缀合至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，RSV多肽使铁蛋白蛋白具有抗原性。在一些实施方案中，RSV多肽单独地具有抗原性，而在一些实施方案中，RSV多肽由于其与铁蛋白的缔合而具有抗原性。在一些实施方案中，RSV多肽是本文所述的RSV F或G多肽中的任何一种。
c)缀合
在一些实施方案中，表面暴露的半胱氨酸(例如，由本文所述的突变产生)或附接至铁蛋白(例如，在铁蛋白的N末端)的肽接头中的半胱氨酸用于将免疫刺激部分(如佐剂)或RSV多肽缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，接头与这种半胱氨酸缀合，可以随后将所述接头缀合至免疫刺激部分(如佐剂)或RSV多肽。在一些实施方案中，这种半胱氨酸产生用于缀合反应以附接佐剂、接头或RSV多肽的化学处理。在一些实施方案中，产生了生物缀合物，其中在还原这种半胱氨酸后将免疫刺激部分(如佐剂)或RSV多肽连接至铁蛋白。在一些实施方案中，半胱氨酸是不成对的表面暴露的半胱氨酸，即所述半胱氨酸缺乏适当位置的伴侣半胱氨酸来形成二硫键。在一些实施方案中，半胱氨酸是包含游离硫醇侧链的不成对半胱氨酸。
(1)缀合化学的类型
可以使用任何类型的化学，例如经由表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)或另一种氨基酸(如Lys、Glu或Asp)的反应，来将免疫刺激部分(如佐剂)或RSV多肽缀合至铁蛋白。
在一些实施方案中，使用点击化学进行缀合。如本文所用，“点击化学”是指彼此快速且选择性地反应(即，“点击”)的一对官能团之间的反应。在一些实施方案中，点击化学可以在温和的水性条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应利用铁蛋白表面上的半胱氨酸(如由表面暴露的氨基酸突变产生的半胱氨酸)来使用可与所述半胱氨酸反应的官能团进行点击化学。
满足点击化学标准的多种反应在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可以使用许多公布的方法中的任何一种(参见，例如Hein等人,Pharm Res 25(10):2216-2230(2008))。可以使用众多种可商购的点击化学试剂，如来自Sigma Aldrich、JenaBioscience或Lumiprobe的那些。在一些实施方案中，如以下实施例中所述那样使用点击化学进行缀合。
在一些实施方案中，点击化学反应在铁蛋白还原之后发生。
在一些实施方案中，点击化学可以是1步式点击反应。在一些实施方案中，点击化学可以是2步式点击反应。
在一些实施方案中，一个或多个反应包括无金属点击化学。在一些实施方案中，一个或多个反应包括硫醇-马来酰亚胺和/或二硫化物交换。
无金属点击化学
可以将无金属点击化学用于缀合反应以避免蛋白质的潜在氧化。无金属点击化学已被用于形成抗体缀合物(参见van Geel等人,Bioconjugate Chem.2015,26,2233-2242)。
在一些实施方案中，在反应中使用无金属点击化学以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，在反应中使用无铜缀合以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，无金属点击化学使用双环[6.1.0]壬炔(BCN)。在一些实施方案中，无金属点击化学使用二苯并氮杂环辛炔(DBCO)。在一些实施方案中，BCN或DBCO与叠氮化物基团反应。
DBCO在不存在催化剂的情况下经由应变促进的点击反应对叠氮化物基团具有高特异性，从而产生高产率的稳定三唑。在一些实施方案中，DBCO在不存在铜催化剂的情况下与叠氮化物反应。
在一些实施方案中，在1步式点击反应中使用无金属点击化学。在一些实施方案中，在2步式点击反应中使用无金属点击化学。
硫醇-马来酰亚胺和二硫化物交换
本文所述的铁蛋白可以包含含有硫醇(也称为巯基)的半胱氨酸，其可用于与巯基反应性化学基团反应(或其可通过还原而变为可用的)。因此，半胱氨酸允许化学选择性修饰以将免疫刺激部分(如佐剂)添加至铁蛋白。在碱性条件下，半胱氨酸将被去质子化以产生硫醇盐亲核体，所述硫醇盐亲核体可以与软亲电体(如马来酰亚胺和碘乙酰胺)反应。半胱氨酸与马来酰亚胺或碘乙酰胺的反应产生碳-硫键。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的表面暴露的半胱氨酸或铁蛋白接头中的半胱氨酸反应。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物或TNB-硫醇。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过烷基化(即形成硫醚键)与半胱氨酸的巯基缀合。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过二硫化物交换(即形成二硫键)与半胱氨酸的巯基缀合。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)缀合至铁蛋白的反应是硫醇-马来酰亚胺反应。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺与半胱氨酸的反应导致形成稳定的硫酯连接，例如不可逆的硫酯连接。在一些实施方案中，马来酰亚胺不与铁蛋白中的酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。在一些实施方案中，未反应的马来酰亚胺在反应结束时通过添加例如过量的游离硫醇来淬灭。
在一些实施方案中，使免疫刺激部分(如佐剂)与铁蛋白缀合的反应是硫醇-二硫化物交换，也称为二硫化物互换。在一些实施方案中，反应涉及形成包含一部分原始二硫化物的混合二硫化物。在一些实施方案中，原始二硫化物是通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而在铁蛋白中引入的半胱氨酸。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是吡啶基二硫醇。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是TNB-硫醇基团。
(2)缀合接头
在一些实施方案中，免疫刺激部分(如佐剂)或RSV多肽经由与表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)共价结合的接头附接至铁蛋白。在一些实施方案中，接头包含聚乙二醇，例如PEG接头。在一些实施方案中，聚乙二醇(例如PEG)接头增加了与免疫刺激部分(如佐剂)连接的铁蛋白的水溶性和连接效率。PEG接头的长度在2至18个PEG之间，例如PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14、PEG15、PEG16、PEG17和PEG18。
在一些实施方案中，接头包含马来酰亚胺。在一些实施方案中，接头包含免疫刺激部分(ISM)-接头-马来酰亚胺的组分。在一些实施方案中，通过马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，以1步式点击化学反应将ISM-接头-马来酰亚胺缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，佐剂-接头-马来酰亚胺的ISM是SM7/8a。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺的接头是PEG4。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺是SM7/8a-PEG4-马来酰亚胺。
在一些实施方案中，用下述接头使用2步式点击化学方案，所述接头在一端包含巯基反应性化学基团，并且在另一端包含胺反应性基团。在这种2步式点击化学方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的半胱氨酸反应，而胺反应性基团与附接至ISM的试剂反应。以这种方式，ISM经由一组2种点击化学试剂缀合至铁蛋白。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，马来酰亚胺与通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而引入铁蛋白中的半胱氨酸反应。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，胺反应性基团是DBCO。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，DBCO与附接至ISM的叠氮化物基团反应。
在一些实施方案中，使用马来酰亚胺-接头-DBCO。在一些实施方案中，在铁蛋白还原后，将马来酰亚胺-接头-DBCO缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，通过在第一步中马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，将马来酰亚胺-接头-试剂缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，DBCO用于与附接至叠氮化物的ISM连接。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的ISM是ISS-1018。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的佐剂是3M-012或CpG。
在一些实施方案中，将具有反应性基团的接头添加至ISM。在一些实施方案中，接头是PEG4-叠氮化物接头或PEG4-马来酰亚胺接头。
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至3M-012。缀合至PEG4-叠氮化物接头的3M-012的示例性结构为：
Figure BDA0002803750830000441
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-叠氮化物接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002803750830000442
在一些实施方案中，PEG4-马来酰亚胺接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-马来酰亚胺接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002803750830000443
在一些实施方案中，叠氮化物基团缀合至ISS-1018。缀合至NHS酯-叠氮化物接头的ISS-1018的示例性结构为：
Figure BDA0002803750830000451
E.接头
在一些实施方案中，接头将RSV多肽的氨基酸序列与铁蛋白的氨基酸序列分开。可以使用任何接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，其可以有利于抗原性铁蛋白多肽作为融合蛋白的表达(例如，从单一开放阅读框)。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是GS、GGGS(SEQ ID NO:226)、2XGGGS(SEQ IDNO:227)(即，GGGSGGGS(SEQ ID NO:227))或5XGGGS(SEQ ID NO:228)。接头可以在铁蛋白的N或C末端。
在一些实施方案中，接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约2-4、2-6、2-8、2-10、2-12或2-14个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少35个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少40个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于60个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于50个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约16、28、40、46或47个氨基酸。在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头包含半胱氨酸，例如以用作用于缀合免疫刺激部分(例如，佐剂)的位点；包含半胱氨酸的示例性接头提供为SEQ ID NO:225。在一些实施方案中，接头包含与SEQID NO:225具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列，并且进一步包含对应于SEQ ID NO:225中的半胱氨酸的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含至少25个氨基酸(例如，25至60个氨基酸)，其中半胱氨酸位于在自N末端的第8个氨基酸到自C末端的第8个氨基酸范围内的位置处，或位于接头的中心残基或键的10个氨基酸之内。
在一些实施方案中，接头包含甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)氨基酸。在一些实施方案中，接头包含以下项或由以下项组成：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)和/或丙氨酸(A)氨基酸以及任选的如上所讨论的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:222具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含GGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:220)、GGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:221)、GGSGSASSGASASGSSNGSGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:222)或GS。在一些实施方案中，接头包含FR1(SEQ ID NO:223)或FR2(SEQ ID NO:224)。
在一些实施方案中，铁蛋白包括具有牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的幽门螺杆菌铁蛋白(其将被称为杂合铁蛋白)。在一些实施方案中，此杂合铁蛋白形成具有均匀分布在表面上的RSV多肽附接位点的多聚体(参见Kanekiyo 2015)。在一些实施方案中，具有杂合铁蛋白的N末端融合蛋白允许RSV多肽在铁蛋白纳米颗粒表面上的呈递。在一些实施方案中，铁蛋白在对应于SEQ ID NO:208(杂合铁蛋白，其包含此谷氨酸)的位置13或在SEQ IDNO:209(野生型幽门螺杆菌铁蛋白，其中位置6是异亮氨酸)中的位置6的位置处包含谷氨酸。与牛蛙接头结合时，此谷氨酸被认为可以保留人和牛蛙铁蛋白中发现的保守盐桥(人轻链和牛蛙低级亚基铁蛋白中的6R和14E)。参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，RSV多肽经由半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头连接至铁蛋白。在一些实施方案中，此接头用于经由点击化学将部分(例如，免疫刺激部分或RSV多肽)直接缀合至铁蛋白。包含半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的示例性序列是SEQ ID NO:218。上文讨论了适合于涉及半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的缀合反应的点击化学。
在一些实施方案中，将包含半胱氨酸作为免疫刺激部分(如佐剂)的缀合位点的接头用于包含缺乏不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中，或用于包含含有不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中。
在一些实施方案中，构建体不包含接头。在一些实施方案中，构建体包含一个接头。在一些实施方案中，构建体包含两个或多于两个的接头。
F.用于疫苗接种的组合物；用途和方法
在一些实施方案中，本发明提供了针对RSV感染免疫受试者的方法。本发明进一步提供了在受试者中引发针对RSV的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的抗原性RSV多肽、抗原性铁蛋白多肽或纳米颗粒。
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含本文所述的多肽、纳米颗粒或融合蛋白中的任何一种或多种和药学上可接受的媒介物、佐剂或赋形剂。
在一些实施方案中，将本文所述的多肽、纳米颗粒或组合物给予至受试者(如人)，以针对由RSV引起的感染免疫。在一些实施方案中，将本文所述的多肽或融合蛋白给予至受试者(如人)，以产生针对将来的RSV感染的保护性免疫应答。在一些实施方案中，提供了本文所述的多肽、纳米颗粒或组合物中的任何一种或多种，用于在针对由RSV引起的感染免疫中使用。在一些实施方案中，提供了本文所述的多肽、纳米颗粒或组合物中的任何一种或多种，用于在产生针对将来的RSV感染的保护性免疫应答中使用。在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了RSV感染、肺炎、细支气管炎或哮喘的发生率。
在一些实施方案中，组合物包含本文所述的RSV F多肽。在一些实施方案中，组合物包含本文所述的RSV G多肽。在一些实施方案中，组合物包含本文所述的RSV F多肽和RSVG多肽。在一些实施方案中，组合物包含本文所述的RSV G多肽和RSV F多肽。在一些实施方案中，组合物包含本文所述的RSV F多肽和本文所述的RSV G多肽。
在一些实施方案中，与用融合后RSV F多肽免疫相比，包含本文所述的RSV F多肽的组合物引发优越的对RSV的中和应答。在一些实施方案中，与用融合后RSV F免疫相比，用本文所述的RSV F多肽(例如，包含本文所述的RSV F多肽的多肽或纳米颗粒)免疫引发更高效价的针对融合前RSV F的抗体。在一些实施方案中，与用融合后RSV F免疫相比，用本文所述的RSV F多肽免疫引发更低效价的针对融合后RSV F的抗体。在一些实施方案中，与用融合后RSV F免疫相比，用本文所述的RSV F多肽免疫引发更高比率的针对融合前RSV F的总抗体。与用融合后RSV F免疫相比，用本文所述的RSV抗原免疫可提供更好的针对RSV的保护。存在于融合后RSV F中并与融合前F共享的表位可能是非中和性的，并且已经提出在一些情况下可引发增加RSV感染的抗体。在一些实施方案中，包含本文所述的RSV F多肽的组合物引发对RSV的更高中和应答，同时减少针对融合后RSV F的抗体。因此，在一些实施方案中，相对于融合后F结合应答，包含本文所述的RSV F多肽的组合物引发更高的RSV中和效价。
在一些实施方案中，与用融合后RSV F免疫相比，用本文所述的RSV抗原免疫产生了改善的安全性概况。这种改善的安全性概况可能与阻断在融合后构象上存在的非中和性表位或中和性差的表位相关。据报道，结合融合后构象的抗体可通过抗体介导的病毒感染增加RSV感染。因此，不显著中和RSV病毒的融合后抗体可增加RSV感染，所述融合后抗体如识别融合前构象和融合后构象二者的那些抗体。
在一些实施方案中，包含本文所述的RSV G多肽的组合物引发对RSV的中和应答。
在一些实施方案中，包含本文所述的RSV F和RSV G多肽的组合物引发对RSV的中和应答。在一些实施方案中，包含本文所述的RSV F和RSV G多肽的组合物提供了改善的针对RSV的保护，例如，与不包含两种抗原的组合物相比更高的中和效价。
1.受试者
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者是成人(大于或等于18岁)。在一些实施方案中，受试者是儿童或青少年(小于18岁)。在一些实施方案中，受试者是老年人(大于60岁)。在一些实施方案中，受试者是非老年人(大于或等于18岁且小于或等于60岁)。
在一些实施方案中，向受试者给予多于一次的组合物给予。在一些实施方案中，加强免疫给予改善了免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在哺乳动物，如灵长类动物(例如，非人灵长类动物，如猴子(例如，猕猴，如恒河猴或食蟹猴)或猿)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或驯养的哺乳动物(例如，犬、兔、猫、马、绵羊、牛、山羊、骆驼或驴)中使用。在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在鸟类，如禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、豚鼠或天鹅)中使用。
2.佐剂
如本文所述，佐剂可以经由表面暴露的氨基酸例如半胱氨酸缀合至铁蛋白。非缀合的佐剂也可以与本文所述的抗原性铁蛋白多肽一起给予至受试者。在一些实施方案中，与在不伴有佐剂的情况下给予单独的RSV多肽或单独的抗原性铁蛋白多肽相比，与抗原性铁蛋白多肽一起给予佐剂在受试者中产生更高效价的针对RSV多肽的抗体。佐剂可以促进对抗原性多肽的更早、更强效或更持久的免疫应答。
在一些实施方案中，组合物包含一种佐剂。在一些实施方案中，组合物包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，组合物不包含佐剂。
在一些实施方案中，佐剂包含铝。在一些实施方案中，佐剂是磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂是明矾(Alyhydrogel’85 2％；Brenntag–目录号21645-51-2)。
在一些实施方案中，佐剂是有机佐剂。在一些实施方案中，佐剂是油基佐剂。在一些实施方案中，佐剂是水包油纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含角鲨烯。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是Ribi(Sigma adjuvant system目录号S6322-1vl)、AddavaxTM MF59、AS03或AF03(参见US9703095)。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含聚丙烯酸聚合物(PAA)。在一些实施方案中，包含PAA的佐剂是SPA09(参见WO 2017218819)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油。在一些实施方案中，佐剂是不完全弗氏佐剂(IFA)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油和杀死的结核分枝杆菌。在一些实施方案中，佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)。
在一些实施方案中，佐剂是脂多糖。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰A(MPL或MPLA)。
3.药物组合物
在各种实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗原性铁蛋白多肽和/或相关实体。在一些实施方案中，药物组合物是能够引发免疫应答(如针对病原体的保护性免疫应答)的免疫原性组合物(例如，疫苗)。
例如，在一些实施方案中，药物组合物可以包含以下项中的一种或多种：(1)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和(ii)RSV多肽；(2)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分，和(ii)RSV多肽；(3)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)表面暴露的半胱氨酸，(ii)在铁蛋白蛋白的N末端的肽接头，和(iii)在肽接头的N末端的RSV多肽；(4)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含：(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分，(ii)用非半胱氨酸氨基酸置换在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处的内部半胱氨酸的突变，或用非半胱氨酸氨基酸置换如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中与位置31类似的位置处的内部半胱氨酸的突变，(iii)用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，和(iv)RSV多肽；或(5)包含前述铁蛋白蛋白中的任一种的铁蛋白颗粒。在一些实施方案中，药物组合物包含含有RSV F多肽的抗原性RSV多肽，其中RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断，和/或药物组合物包含含有RSVF多肽的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209和对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺，任选地其中所述抗原性RSV多肽进一步包含铁蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽相关的抗体或其他药剂。在一个实施方案中，药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽结合和/或竞争的抗体。可替代地，抗体可以识别包含本文所述的抗原性多肽的RSV多肽组分的病毒颗粒。
在一些实施方案中，将如本文所述的药物组合物单独给予或与一种或多种增强免疫应答的药剂(例如，以上所述的佐剂)组合给予。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含如上所述的佐剂。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用，术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在示例性实施方案中，载体可以包括无菌液体，例如像水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的油，例如像花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一种或多种固体组分。药学上可接受的载体还可包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。如本文所用，赋形剂是可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所希望的稠度或稳定作用的任何非治疗剂。合适的药物赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在各种实施方案中，药物组合物是无菌的。
在一些实施方案中，药物组合物含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物可以包含多种添加剂(如稳定剂、缓冲液或防腐剂)中的任何一种。此外，可以包含辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
在各种实施方案中，可以将药物组合物配制成适合任何所期望的给予方式。例如，药物组合物可以采取以下形式：溶液、悬浮液、乳剂、滴剂、片剂、丸剂、球剂、胶囊、含有液体的胶囊、明胶胶囊、粉末、缓释配制品、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉、冷冻悬浮液、干燥粉或任何其他适合使用的形式。在药剂的配制和生产中的一般考虑可以见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿,1995(通过引用并入本文)中。
可以经由任何给予途径来给予药物组合物。给予途径包括例如口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、经直肠、通过气管内滴注、支气管滴注、吸入、或局部方式。给予可为局部或全身的。在一些实施方案中，给予是口服进行的。在另一个实施方案中，给予是通过肠胃外注射。在一些情况下，给予导致本文所述的抗原性铁蛋白多肽释放到血流中。给予方式可以由从业者决定。
在一些实施方案中，药物组合物适合于肠胃外给予(例如静脉内、肌内、腹膜内和皮下)。可以将此类组合物配制成例如溶液、悬浮液、分散体、乳剂等。它们也可以以无菌固体组合物(例如冻干的组合物)的形式生产，所述无菌固体组合物可以在临使用前溶解或悬浮于无菌可注射介质中。例如，肠胃外给予可以通过注射来实现。在此类实施方案中，注射剂以常规形式制备，即作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、或作为乳剂。在一些实施方案中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、冻干粉末或颗粒制备。
在另一个实施方案中，将药物组合物配制成用于通过吸入递送(例如，用于直接递送至肺和呼吸系统)。例如，组合物可以采取鼻喷雾剂或任何其他已知的气雾剂配制品的形式。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施方案中，此类制剂可以具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12或约13微米的平均粒度。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂被配制为干粉。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂例如通过包含润湿剂而被配制为湿粉。在一些实施方案中，润湿剂选自水、盐水或其他处于生理pH的液体。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以滴剂的形式给予至鼻腔或颊腔。在一些实施方案中，剂量可以包含多滴(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5滴等)。
可以将本发明的药物组合物以适合于实现所期望结果的任何剂量给予。在一些实施方案中，所期望的结果是针对在存在于组合物中的抗原性铁蛋白多肽中存在的RSV多肽的来源诱导持久的适应性免疫应答。在一些实施方案中，所期望的结果是降低一种或多种感染症状的强度、严重程度、频率和/或延迟一种或多种感染症状的发作。在一些实施方案中，所期望的结果是抑制或预防感染。所需的剂量将根据以下而在受试者之间有所不同：受试者的物种、年龄、体重和一般状况，被预防或治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物及其给予方式。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以单一剂量或多个剂量给予。在一些实施方案中，将药物组合物在不同日期以多个剂量给予(例如初免-加强免疫疫苗接种策略)。在一些实施方案中，将药物组合物作为加强免疫方案的一部分给予。
在各种实施方案中，将药物组合物与一种或多种另外的治疗剂共同给予。如果治疗剂的给予的时间安排使得另外的治疗剂和药物组合物中的一种或多种活性成分的药理活性在时间上重叠，从而发挥组合的治疗作用，则共同给予不需要同时给予治疗剂。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和时间表来给予。
4.核酸/mRNA
还提供了核酸，所述核酸编码本文所述的抗原性多肽。在一些实施方案中，核酸是mRNA。出于本公开文本的目的，任何能够经历翻译而产生多肽的核酸被认为是mRNA。
5.试剂盒
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的一种或多种抗原性多肽、核酸、抗原性铁蛋白颗粒、抗原性2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒、组合物或药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂中的一种或多种。
Figure BDA0002803750830000541
Figure BDA0002803750830000551
Figure BDA0002803750830000561
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Figure BDA0002803750830000601
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Figure BDA0002803750830000651
此描述和示例性实施方案不应被视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有指示，否则在说明书和权利要求中使用的所有表达数量、百分比或比例的数字和其他数值应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰至已无法将其如此修饰的程度。“约”指示实质上不影响所述主题的特性的变化程度，例如在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的所需特性而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求范围的等价范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少根据报吿的有效数字的数量和通过应用普通四舍五入技术来解读。
注意，如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地并且清楚地限于一个/种指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的详述不排除可以取代或添加到所列项目的其他类似项目。
实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开文本的范围。
1.对RSV F多肽的修饰的设计和表征
像其他副粘病毒F蛋白一样，RSV F被表达为前体蛋白，所述前体蛋白具有N末端信号肽和将蛋白质锚定在病毒表面的C末端跨膜区。RSV F经历通过蛋白酶弗林蛋白酶进行的细胞内切割以释放疏水性融合肽(图1A中的“FP”)，其作用是在感染过程中附着于靶细胞。与融合肽相邻的是七肽重复区A(HRA)，而七肽重复区B(HRB)与跨膜结构域相邻。
呈融合前和融合后构象的RSV F胞外结构域三聚体的晶体结构展示了HRA和HRB区如何进行重要的重排以驱动细胞融合事件(图1B)(参见Swanson,K.A.等人,Proc NatlAcad Sci U S A 108(23):第9619-24页(2011)；McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):592-598(2013)；McLellan,J.S.等人,J Virol 85(15):7788-96(2011)；和McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):第592-8页(2013))。在融合前构象中，七肽重复序列A(HRA)区与球状头部缔合，并且融合肽的尖端大部分包埋在蛋白质的中心中。融合前构象含有多个螺旋，并且包括原体之间的某些接触以形成融合前三聚体。
一系列氨基酸取代被设计为原体间稳定化的。示例性取代包括V207L；N228F；I217V和E218F；I221L和E222M；或Q224A和Q225L。实施例中的所有RSV F氨基酸序列编号均使用SEQ ID NO:26的编号。
氨基酸取代被设计为螺旋稳定化的。这样，预计这些取代将稳定化RSV F的螺旋结构域。示例性取代包括N216P或I217P。
氨基酸取代被设计为原体内稳定化的。示例性取代包括V220I；或A74L和Q81L。
氨基酸取代被设计为螺旋加帽的。示例性取代包括N216P或I217P。
设计氨基酸取代以减少聚集。示例性取代包括V192E和L61Q。
将其他氨基酸取代设计为通过引入疏水性氨基酸(如N228F)进行的空腔填充。
设计氨基酸取代E328N、S348N和R507N以通过用天冬酰胺置换非天冬酰胺残基来添加糖基化位点。假设添加非天然聚糖可用于阻断融合前F蛋白表面上的在融合后RSV F(图1B)中暴露的表位。
将目的RSV F构建体产生为单链(scF)融合蛋白，所述单链融合蛋白具有包含N末端牛蛙铁蛋白接头和幽门螺杆菌铁蛋白(pFerr)的杂合铁蛋白(图1A)。铁蛋白包含由K79C或S111C突变产生的表面暴露的半胱氨酸(铁蛋白序列编号对应于SEQ ID NO:208)。
使用本领域已知的标准克隆实践来产生各种RSV Pre-F-NP和铁蛋白编码序列。一般而言，由Genscript合成具有所述取代的RSV F构建体的DNA并克隆到哺乳动物表达载体中。RSV F DS-CAV1和融合后F三聚体的产生类似于先前公布的方案(参见McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):592-598(2013))。DS-CAV1构建体保留了RSV F的C末端三聚化结构域，并将其与填充空腔的疏水取代组合。RSV F DS-CAV1包含S155C-S290C二硫化物突变(DS)和S190F-V207L(CAV1)。
将编码RSV F-铁蛋白纳米颗粒、裸铁蛋白(即，未与RSV F偶联)和RSV F三聚体的载体转染到293EXPI细胞中，并在4天后从条件培养基中收获表达产物。通过以下方式纯化RSV F纳米颗粒：使用常规色谱方法，在pH 7.0和8.5下进行一系列阴离子Q柱纯化(GEHealthcare，目录号17-1154-01)，之后在PBS中进行Superose 6SEC纯化(GE Healthcare目录号90-1000-42)。将DS-CAV1融合前三聚体和融合后三聚体储存在-80℃下，并且将RSV F纳米颗粒储存在4℃下。
为了确定RSV F纳米颗粒的构象，进行电子显微镜检查。将RSV F纳米颗粒制剂(30μg/mL，在25mM Tris、50mM NaCl中)吸收到400目碳涂覆网格(Electron MicroscopySciences)上，并用0.75％甲酸铀酯染色。使用在80kV下操作的JEOL 1200EX显微镜分析样品。通过EM公司Nanoimaging Services,INC(加利福尼亚州圣地亚哥)以65,000×放大倍率获取显微照片并且使用本领域的常规方法制备2D类别平均值(图1D)。
通过抗RSV F蛋白质印迹评价由瞬时转染的293EXPI细胞(Invitrogen)对包含这些RSV F多肽和铁蛋白的多肽(SEQ ID NO:1-8和11-15)的表达和分泌。所有抗RSV F蛋白质印迹均使用McLellan等人,Science 340(6136):1113-1117(2013)和美国专利8,562,996中描述的位点0特异性D25抗体。如图2中所示，许多构建体被成功表达和分泌。
RF8085多肽(SEQ ID NO:1)表示融合至铁蛋白纳米颗粒N末端的公布的DS-CAV1RSV F的单链突变体(参见McLellan,J.S.等人,Science 342(6158):592-598(2013))。此构建体包含保留抗原性位点0的RSV F的S155C-S290C双突变体(DS)。
RF8106多肽(SEQ ID NO:9)具有I217P取代，而不是取代到DS-CAV1中的2个半胱氨酸。如图3中所示，如通过抗RSV F蛋白质印迹从4天后的条件培养基中评估的，RF8106构建体在瞬时转染的293EXPI细胞中具有显著更好的表达。
RF8106的尺寸排阻色谱(SEC)显示主峰在与融合至RSV抗原的组装铁蛋白颗粒一致的保留时间处洗脱，这与融合蛋白纳米颗粒一致(Pre-F-NP，图4)。RF8106的动态光散射(DLS)分析是在还原状态(图5B)和非还原状态(图5A)下进行的。通过用2mM TCEP处理来还原。RF8106具有大约15nm的半径，这与在还原状态和非还原状态二者下掺入纳米颗粒(24聚体)中一致。融合蛋白对还原剂的稳定性有利于佐剂与融合蛋白的缀合以形成自佐剂化纳米颗粒，如下所述。
接下来，评估佐剂与RSV F多肽和铁蛋白的融合蛋白(Pre-F-NP)的缀合。发现铁蛋白上的游离表面半胱氨酸可用于将另外的部分附接至scF-pFerr融合蛋白。图6示出了具有序列T*G*A*C*T*G*T*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*G*A*T*G*A(SEQ ID NO:30；星号指示硫代磷酸酯连接)的CpG寡脱氧核苷酸(ODN)与RF8106的成功缀合，如通过如由考马斯染色的SDS-PAGE凝胶评估的分子量增加所证明。
将使用E328N、S348N和R507N取代添加糖基化位点(RF8117，SEQ ID NO:17)的作用在用作为具有铁蛋白的融合蛋白的此构建体(即Pre-F-NP构建体)瞬时转染的293EXPI细胞中进行评估。与在RF8113中一样，RF8117也包含I217P取代。如图7中所示，与RF8085对照构建体和RF8113构建体(SEQ ID NO:16，其包含I217P的脯氨酸取代但不包含E328N、S348N和R507N取代)二者相比，对于RF8117看到增加的表达。RF8113与先前描述的RF8106相似，不同之处在于工程化的铁蛋白半胱氨酸位于铁蛋白残基K79C上而不是S111C上。RF8117构建体还显示出RF8113和RF8117的分子量增加，这表明聚糖的成功添加。
图8汇总了增加Pre-F-NP的蛋白水解稳定性的对RSV F纳米颗粒的修饰。起始构建体是RF8117(上文)。当与RF8090一样将较早的构建体RF8085克隆到CHO载体中并转染到CHO细胞中时，观察到在F部分与铁蛋白部分之间的一些材料被剪切。怀疑HRB区域或F部分与铁蛋白部分之间的接头中的精氨酸或赖氨酸残基被胰蛋白酶样蛋白酶切割。就在293细胞中的表达而言测试了所述区域内赖氨酸和精氨酸残基的突变。图8将突变K498L和R508Q(在RF8122中，SEQ ID NO:18)鉴定为相对于RF8117不影响或不增加表达。将具有R523Q的这些突变与本文提及的RF8117的突变组合以形成构建体RF8140(SEQ ID NO:23)。
在293细胞表达中，关于单链和脯氨酸(I217P)修饰的组合(具有这些取代的示例性构建体包括RF8106(SEQ ID NO:9)和RF8113(SEQ ID NO:16))观察到表达的更大改善(大约5倍)，并且由于RSV F的添加的糖基化位点修饰而导致表达和溶解性的进一步改善(示例性构建体RF8117(SEQ ID NO:17)和RF8140(SEQ ID NO:23)。这些构建体全部具有融合肽和被序列GSGNVGL(SEQ ID NO:31)置换的p27肽区(SEQ ID NO:26的氨基酸98-144)。然而，当将RF8090在CHO生产细胞系中表达时，在蛋白质印迹中观察到另外的RSV F条带，这表明所述构建体易受蛋白水解的影响，所述蛋白水解可能是在精氨酸或赖氨酸残基处的胰蛋白酶样切割。
还研究了蛋白酶易感性的潜在作用。进行对HRB区域中以及在F部分与铁蛋白部分之间的接头中的K残基的取代(敲除或KO)，因为预测所述K残基是最初在CHO生产细胞系中观察到的K介导的切割的可能位点。如图9A和图9B中所示，在CHO生产细胞系中，RF8117和RF8140二者均表达至相对于RF8090较高的水平，如通过D25蛋白质印迹或D25和AM14 Octet分析所测量的。
这些数据表明，单链构建体和用于螺旋加帽、增加糖基化以及消除易受蛋白酶切割的赖氨酸或精氨酸的氨基酸修饰可以改善RSV F多肽(包括RSV Pre-F-NP抗原)的表达。
2.对RSV F和铁蛋白纳米颗粒的融合蛋白的表征
在进行动物研究之前，使用Octet通过结合分析DS-CAV1和RSV F纳米颗粒的浓度。还使用FortéBio Octet仪器测量融合前抗原与融合前特异性抗体D25和AM14的结合。所有测定均在30℃下在PBS中进行。将抗体加载至蛋白A(ProA)传感器尖端(fortéBio#18-5013)上400秒，以允许捕获达到接近饱和。然后将生物传感器尖端在PBS中平衡90秒，之后以已知浓度在PBS中进行抗原缔合300秒，之后在PBS中解离抗原。使用已知浓度的纯化Pre-F-NP的结合的外标曲线，使用Octet数据分析HT10.0软件进行数据分析和曲线拟合(假定1:1相互作用)。确定CHO条件培养基中的Pre-F-NP浓度的示例性测定结果示于图9B中。
3.对RSV F多肽的免疫应答的体内表征
为了在小鼠中评估对RSV抗原的体内应答，在第0周、第3周和第6周用指定剂量的RSV抗原肌内免疫雌性BALBc小鼠。除非另有说明，否则用床边混合策略将RSV抗原(例如，尤其在图10A-B和图12A-B的实验中)用AF03佐剂化。即，在临将50μl注射至每条后肢中之前，将50μl的相关蛋白质溶液与50μl的Sanofi佐剂AF03(基于角鲨烯的乳剂；参见Klucker等人,J Pharm Sci.2012年12月；101(12):4490-500)混合。对于未佐剂化组，如上那样混合抗原，但是将AF03置换为等体积的PBS。对于与SPA09或明矾混合的抗原，在分别用等体积的SPA09或明矾置换AF03的情况下进行以上程序。对于任何配制品，均未观察到来自免疫的不利影响。在首次免疫前1天和在每次注射后至少2周(即第2、5和8周)采集血液。除非另有说明，否则示出的数据是关于第三次注射后2周(第8周，也表示为2wp3)的。典型地，对来自免疫前动物(表示为幼稚态)、第二次注射后两周(第2次后或2wp2)或第三次注射后两周(第3次后或2wp3)的血清进行分析。
对于Vero细胞中和测定，将血清在56℃下热灭活30分钟。在补充有2％胎牛血清(FBS)、1％GlutaMAX和1％抗生素-抗有丝分裂剂的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中制备灭活血清的四倍系列稀释系列。将RSV病毒原液与血清稀释液1:1合并，并在37℃下孵育1.5小时。然后将病毒-血清混合物以100μL/孔添加至含有汇合Vero细胞单层的24孔板中，并在37℃、5％CO2下孵育1.5小时。然后将接种物覆盖1mL/孔的在补充有2％FBS和2％GlutaMAX和2％抗生素-抗有丝分裂剂的DMEM中的0.75％甲基纤维素。在37℃、5％CO2下孵育5天后，去除覆盖层，并将单层用冰冷的甲醇固定20分钟。
然后将板在水中洗涤一次，并在室温下在轻轻搅拌下用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％脱脂乳粉封闭30分钟。然后用200μL/孔的在PBS中的2％乳粉置换封闭溶液，所述PBS含有与辣根过氧化物酶(Abcam AB20686)缀合的抗RSV抗体的1:2000稀释物。在室温下孵育3小时后，将板用水洗涤2次，用TrueBlue HRP底物显色，再在水中洗涤两次并风干。
使用解剖显微镜对染色的空斑进行计数。使用以下公式在模拟的中和病毒对照的60％减少终点处确定中和抗体效价：60％空斑减少效价＝(C/V x 0.4-低)/(高-低)x(HSD-LSD)+LSD，其中C/V＝模拟的中和病毒对照孔中RSV空斑的平均值，低和高是血清样品的两种稀释物中RSV空斑的平均数目(将C/V x 0.4值括上)，并且HSD和LSD是较高和较低的血清稀释度。
对于HAE中和测定，将血清在56℃下热灭活30分钟。在补充有PneumaCultTM-ALI10X补充剂(Stem Cell Technologies；05003)和1％抗生素/抗真菌剂的PneumaCultTM-ALI基础培养基(Stem Cell Technologies；05002)(从此称为培养基)中制备灭活血清的四倍系列稀释系列。将RSV病毒原液与血清稀释液1:1合并，并在37℃下孵育1.5小时。然后将病毒-血清混合物以50μL/孔添加至含有完全分化的HAE细胞的24孔板中，并在37℃、5％CO2下孵育1.5小时。孵育后，去除接种物，用培养基洗涤孔两次以去除未结合的病毒，并在37℃、5％CO2下再孵育20小时。用荧光显微镜计数用表达mKate(TagFP635)报告物的RSV感染的培养物中的感染事件。
为了检测用不表达mKate报告物的RSV进行的感染，用培养基充分洗涤假复层上皮以去除粘液，然后在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，用0.25％Triton X-100透化30分钟，并且用补充有2％FBS的DMEM在37℃下封闭1小时。用在补充有2％FBS的DMEM中1:200稀释的100μL/孔小鼠抗RSV单克隆Ab混合物(Millipore；MAB 858-4)置换封闭溶液，并将板在37℃下孵育2小时。然后将板用补充有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次。每孔添加100μL的在补充有2％FBS的DMEM中1:200稀释的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen；A11001)，并将板在4℃下孵育过夜。第二天早晨，将板用补充有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次，用具有DAPI的ProLong Gold AntiFade(Thermo Fisher Scientific；P36935)稳定化荧光信号，并用荧光显微镜计数。如上在60％减少终点处确定中和抗体效价。
对于抗F结合，使融合前F(DS-CAV1)或融合后F与Octet上的抗-HIS抗体尖端结合。除非另有说明，否则所有抗F结合均是指抗融合前F三聚体(DS-CAV1)结合。将带有His6标签(SEQ ID NO:230)的RSV F三聚体(DS-CAV1或融合后F)预加载至抗Penta-HIS(HIS1K)传感器尖端(FortéBio#18-5122)上400秒以允许捕获达到接近饱和。然后将生物传感器尖端在Octet洗涤缓冲液中平衡90秒，之后使稀释血清缔合300秒。使用Octet数据分析HT10.0软件测量缔合曲线最终响应，并将所述响应乘以稀释倍数(100或300)以获得最终报告的响应。
对于抗Gcc结合，在类似于上述的Octet尖端上使用具有C末端HIS标签的Gcc肽的三聚化二聚体。将带有His6标签(SEQ ID NO:230)的Gcc(A2株系)预加载至抗Penta-HIS(HIS1K)传感器尖端(FortéBio#18-5122)上400秒以允许捕获达到接近饱和。然后将生物传感器尖端在Octet洗涤缓冲液中平衡90秒，之后使稀释血清缔合300秒。使用Octet数据分析HT10.0软件测量缔合曲线最终响应，并将所述响应乘以稀释倍数(100或300)以获得最终报告的响应。
对于非人灵长类动物(NHP)研究，针对RSV响应预筛选NHP(发现基线低于所有测定的检测极限)。在伴有所指示佐剂的情况下用50μg RF8140免疫NHP，与以上小鼠方案相似，但使用更大的佐剂体积(图11C-D和图18)。
对于非人灵长类动物研究，如上所述那样进行VERO中和测定。通过下面的ELISA测定评估Pre-F结合。
将NHP血清样品连续稀释2倍(初始稀释度为1:100)，并在37℃下在封闭的RSV可溶性F(Sinobiological#11049-V08B)包被的板(1μg/mL，100μL/孔)上孵育1h。在37℃下使用辣根过氧化物酶缀合的抗猴IgG(BioRad AAI42P，1:10,000稀释度)检测RSV F特异性IgG90分钟。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB Tebu-Bio)对板进行显色，并用1N盐酸(Prolabo#30024290)终止。用微板读取器(SpectraMax)在450nm-650nm下测量光密度(OD)。从滴定曲线(每个板上放有标准的小鼠超免疫血清)，使用SoftmaxPro软件针对0.2至3.0的OD值范围计算RSV sF特异性IgG效价。
此参考的IgG效价(以任意ELISA单位(EU)表示)对应于给出1.0OD值情况下的倒数稀释度的log10。抗体检测的阈值为20(1.3log10)EU。所有最终效价均以log10表示，以便绘图。对于每个<1.3log10的效价，分配1.0log10的任意效价。
为了在NHP研究中评估细胞介导的免疫，按照制造商的说明书使用IFNγ/IL-2FluoroSpot试剂盒(FS-2122-10，Mabtech)。简而言之，将IPFL板的膜用35％乙醇预湿，并且将捕获抗体(抗IFNγ和抗IL-2)在4℃下包被过夜。
然后将板在37℃下用200μL/孔的含有10％胎牛血清(FCS)的细胞孵育培养基封闭2小时。去除培养基，并在孔中添加刺激物：全长F抗原(抗原特异性刺激)、抗CD3(阳性对照)或细胞培养基(未刺激对照)。将猕猴外周血单核细胞(PBMC)解冻并计数。每孔添加400,000个细胞，并在37℃下在具有5％CO2的潮湿培养箱中孵育24h。
为了检测，去除细胞，并且添加检测抗体(缀合的抗-IFNγ和抗IL-2)并在室温下孵育2h。然后添加荧光团缀合的试剂并在室温下孵育1h。将板清空、干燥并在室温下黑暗中储存直至分析。将抗CD3 mAb用作阳性对照，并且在所有样品中发现>500个斑点形成计数(SFC)/百万个PBMC的响应，验证了可接受的样品质量。对于F抗原刺激的细胞，应减去在未刺激孔(细胞培养基)中检测到的斑点。
对于人细胞(或B细胞)分析，进行的实验与参考实验-Dauner等人Vaccine 2017年10月4日；35(41):5487-5494(图20)类似。细胞是未处理的(用PBS处理)或用100ng剂量的如指示的RSV F或RSV G多肽处理。使用文献中所述的luminex测定，分别用包被有pre-F-三聚体(DS-CAV1)或G胞外结构域的珠进行F-结合和G-结合应答。
RF8117(SEQ ID NO:17)包含在E328N、S348N和R507N处的工程化糖基化位点，如上所提及，所述工程化糖基化位点不防止D25或AM14结合。为了证明此融合前纳米颗粒对其他融合前抗原(DS-CAV1)引发类似的免疫应答，我们用1μg或0.1μg剂量的pre-F三聚体(DS-CAV1)、融合后F或RF8117(全部均用AF03佐剂化)免疫组中小鼠(每组5只)三次，在注射之间有3周。在第三次免疫后两周使用VERO细胞测定测试血清的中和效价。较高剂量下的RF8117引发的中和效价与融合前对照相似，且优于融合后对照。在较低剂量下，RF8117引发的中和效价高于融合前对照和融合后对照二者(图10A)。
RSV Pre-F-NP含有糖基化位点，所述糖基化位点经工程化以阻断融合前构象与融合后构象之间共享的表位。评价了这些聚糖是否抑制中和应答。将具有工程化聚糖(SEQ IDNO:17)的RF8117与RF8113(类似于RF8117，但缺乏工程化聚糖；SEQ ID NO:16)和融合前三聚体对照(DS-CAV1)进行比较。用1μg或0.1μg剂量(全部均用AF03佐剂化)免疫组中小鼠(每组5只)三次，在注射之间有三周。在第三次免疫后两周使用VERO细胞测定测试血清的中和效价。如通过中和效价判断的，在RF8113与RF8117构建体之间，在任一剂量下均无显著差异(图10B)。
为了证明本文提及的RF8140(SEQ ID NO:23)的赖氨酸和精氨酸敲除不会破坏抗原引发中和应答的能力，我们在小鼠中将RF8140(SEQ ID NO:25)的免疫原性与融合后F三聚体(SEQ ID NO:24)的免疫原性进行了比较(图11A和B)。在低剂量(0.1μg)下，RF8140(SEQID NO:25)引发优于融合后三聚体(SEQ ID NO:24)的中和效价。为了证明RF8140(SEQ IDNO:23)在NHP中引发免疫应答，我们在伴有或不伴有佐剂(AF03)的情况下用RF8140(SEQ IDNO:25)免疫NHP。图11C示出了RSV F结合应答(ELISA效价)，同时图11D比较了通过用Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)免疫引发的RSV中和效价。未佐剂化的和佐剂化的RF8140(SEQID NO:25)二者均在NHP中引发免疫应答。
在显示RF8117(SEQ ID NO:17)和RF8140(SEQ ID NO:23)的工程糖基化位点不会防止这些抗原引发中和应答后，我们想证明它们确实阻断了融合前构象与融合后构象之间共享的非中和表位或弱中和表位(图12)。通过Octet测量由用高(1μg)和低(0.1μg)剂量下的不伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8113，SEQ ID NO:16)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(工程化Gly颗粒，RF8117 SEQ ID NO:17)免疫引发的对融合前F(DS-CAV1，SEQ ID NO:25)的抗体应答(图12A)。由任一Pre-F-NP引发的应答是相似的。通过Octet测量由用高(1μg)和低(0.1μg)剂量下的不伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8113，SEQ ID NO:16)或伴有工程化糖基化的Pre-F-NP(RF8117，SEQ ID NO:17)免疫引发的对融合后三聚体的抗体应答(图12B)。由RF8117(SEQ ID NO:17)引发的融合后F结合应答显著低于由RF8113(SEQ IDNO:16)引发的那些。因此，虽然RF8113和RF8117均引发对融合前F的稳健抗体应答，但由RF8117引发的融合后F抗体应答被大大阻遏。这是由于映射到共享的融合前和融合后表位的工程化聚糖(图2B)。
为了进一步证明工程化糖基化位点阻断非中和性表位，但使中和抗体效价偏倚向非中和抗体效价，我们以不同的方式分析了以上数据(图13)。测量了在小鼠研究中由用具有野生型糖基化位点的Pre-F NP(Wt聚糖颗粒；RF8113，SEQ ID NO:16)与具有另外的工程化糖基化位点的Pre-F NP(+聚糖颗粒；RF8117，SEQ ID NO:17)免疫引发的如通过VERO细胞测定测量的RSV中和效价的比较，并且未显示出显著差异(图13A)。在小鼠研究中，由用Wt聚糖颗粒(RF8113，SEQ ID NO:16)与+聚糖颗粒(RF8117，SEQ ID NO:17)免疫引发的RSV融合后F三聚体结合抗体应答的比较显示对于具有工程化聚糖的Pre-F-NP的融合后F结合应答受阻遏(图13B)。为了证明工程化聚糖不会降低功能性中和抗体应答，但减少针对共享的融合前/融合后表位所引发的非中和抗体，从而提高了由工程化聚糖构建体引发的中和抗体与总抗体比率，绘制了中和效价与F结合应答的比率(图13C)。因此，在小鼠研究中，具有工程化聚糖的Pre-F-NP引发优于结合抗体概况的中和抗体概况。
为了证明铁蛋白纳米颗粒可以用于改善RSV G中央结构域抗原的免疫原性，我们开发了一种将Gcc肽(SEQ ID NO:29)化学缀合至铁蛋白纳米颗粒的方法。可以将含有本文所述的S111C突变的铁蛋白与Gcc肽(SEQ ID NO:29)缀合，所述Gcc肽被合成为在PEG4接头上具有经由NHS基团附接至N末端的马来酰亚胺基团。合成具有N末端马来酰亚胺的Gcc肽，并通过Peptides International(美国肯塔基州路易斯维尔)进行HPLC纯化。当将马来酰亚胺-Gcc抗原添加至铁蛋白S111C颗粒时，马来酰亚胺缀合至游离半胱氨酸并形成Gcc-NP，其可通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶观察到(图14A)。虽然缀合典型地是50％至90％有效的，但在图14B中示出了Gcc肽铁蛋白纳米颗粒(100％缀合)的模型。
为了确定Gcc-NP是否引发优于Gcc肽(SEQ ID NO:29)的免疫应答，用Gcc肽或Gcc-NP(对于每种免疫1.3μg剂量，与RIBI 1:1混合)免疫每组的5只小鼠。将第二次免疫后两周和第三次免疫后两周的Gcc结合应答(Octet)与代表性组的幼稚态小鼠血清进行比较(图14C)。还在HAE中和测定中比较了在第三次注射后的小鼠研究中，由用Gcc肽(SEQ IDNO.29)与Gcc-NP免疫引发的中和应答(图14D)。如通过Gcc结合应答和中和应答所判断，Gcc-NP引发比单独Gcc肽优越的免疫应答。
为了证明RSV Pre-F-NP(RF8140)和Gcc-NP的共同给予不会干扰任一抗原引发免疫应答的能力，用单独的Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)、Gcc-NP(与Gcc肽(SEQ ID NO:29)缀合的铁蛋白)、或Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)与Gcc-NP的组合对小鼠进行免疫(图15A-C)。将所有免疫用AF03佐剂化。用单独的RF8140(Pre-F-NP)或RF8140和Gcc-NP(Pre-F-NP+Gcc-NP)免疫的小鼠产生了结合融合前F三聚体(DS-CAV1，SEQ ID:25)的抗体，而用Gcc-NP免疫的小鼠并没有。用单独的Gcc-NP(Gcc-NP)或RF8140和Gcc-NP免疫的小鼠产生了结合Gcc肽的抗体，而仅用RF8140免疫的小鼠并没有。用单独的Pre-F-NP、单独的Gcc-NP、或Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予免疫的动物全部在第二次免疫后和第三次免疫后产生了中和应答，如通过HAE中和测定所测量的。
为了确定RSV Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予是否干扰任一抗原引发中和抗体的能力，在耗尽测定中研究了针对F和G二者的中和抗体(图16A-B)。为了证明添加Gcc-NP不会干扰Pre-F-NP引发中和应答的能力，通过F敏感性VERO细胞测定测量上文提及组的中和效价(图16A)。还对来自幼稚态动物的血清进行了测试，以判断抗原耗尽的质量。在VERO测定中，来自用单独的RF8140(SEQ ID NO:23)或与Gcc-NP混合的RF8140免疫的小鼠的血清引发相似的中和应答，而Gcc-NP在F抗体敏感性VERO测定中显现未引发中和应答。当从来自用单独的RF8140(SEQ ID NO:23)免疫或用RF8140(SEQ ID:23)和Gcc-NP免疫的动物的合并血清中耗尽结合融合前三聚体(DS-CAV1，SEQ ID:25)的抗体时，在VERO测定中观察到可测量中和效价的降低。当在HAE细胞测定中测量以上组的中和效价时，在F和G敏感性测定中观察到所有免疫组均产生中和应答(图16B)。来自用单独的RF8140(SEQ ID NO:23)免疫的动物的合并血清在HAE测定中引发中和应答，所述中和应答可以用融合前F三聚体(DS-CAV1，SEQID NO:25)清除。来自用单独的Gcc-NP免疫的动物的合并血清在HAE测定中引发中和应答，所述中和应答可以用G胞外结构域(SEQ ID NO:28)清除。来自用Pre-F-NP(RF8140，SEQ IDNO:23)和Gcc-NP二者免疫的动物的合并血清在HAE测定中引发中和应答，所述中和应答并未被DS-CAV1(SEQ ID NO:25)完全清除，但通过用DS-CAV1然后用G胞外结构域(SEQ ID NO:28)进行的随后耗尽而被完全清除。总之，这些数据表明用Pre-F-NP和Gcc-NP的共同给予不会干扰任一抗原分别引发对融合前F或G的中和抗体的能力。
为了证明佐剂化RF8117(SEQ ID NO:17)或RF8140(SEQ ID NO:23)的作用，向小鼠给药这些与AF03、SPA09或明矾混合的构建体。在图17A中，用10μg与佐剂混合的抗原对小鼠进行免疫，而在图17B中，用1μg与佐剂混合的抗原对小鼠进行免疫。在图17A中，在第三次免疫后两周时间点通过VERO细胞测定测量中和效价。示出了来自用以下情况下的RF8117(SEQID NO:17)免疫的小鼠的血清：未佐剂化(无佐剂)、用明矾佐剂化或用AF03佐剂化。在图17B中，通过VERO细胞测定测量来自用以下项免疫的小鼠的血清的中和效价：用AF03佐剂化的RF8117(SEQ ID NO:17)、用SPA09佐剂化的RF8117(SEQ ID NO:17)或用AF03佐剂化的RF8140。在RF8117(SEQ ID NO:17)或RF8140(SEQ ID NO:23)的所有情况下，在幼稚态小鼠中，佐剂化组比未佐剂化组引发更高的中和效价。用与AF03混合的RF8117(SEQ ID NO:17)或RF8140(SEQ ID NO:23)免疫的小鼠引发相似的中和应答，这表明RF8140(SEQ ID NO:23)中添加的赖氨酸和精氨酸突变不会干扰Pre-F-NP引发中和应答的能力。
为了进一步探究AF03和SPA09的佐剂化作用，用以下情况下的RF8140免疫非人灵长类(NHP)：未佐剂化、用AF03佐剂化或用两种剂量的SPA09佐剂化(图18A)。在第0天和第29天，用50μg的与所指示佐剂混合的抗原免疫NHP，并在所指示时间点通过ELISA或VERO中和应答测量免疫应答。在用以下情况下的RF8140免疫后，在NHP血清中测量融合前F三聚体ELISA应答：未佐剂化(无佐剂)、用AF03佐剂化或用SPA09佐剂化(使用500μg和2000μg剂量的SPA09)。在所有时间点，用AF03或SPA09佐剂化引发优越的中和应答。也通过VERO细胞测定来测量针对以上NHP组的血清的中和效价(图18B)。在所有情况下，用伴有佐剂的RF8140进行的免疫在所有时间点均比未佐剂化组引发更高的中和效价。
测试了RF8140(SEQ ID NO:23)与TLR7/8激动剂SM7/8或TLR9激动剂CpG直接缀合的作用。将抗原与小分子SM7/8或CpG缀合，并向小鼠给药10μg剂量。RF8140在其铁蛋白序列中含有用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变(K79C)，所述半胱氨酸可以用于通过点击化学进行的缀合。为了进行比较，向小鼠给药未佐剂化(无佐剂)或通过与小分子以高剂量或低剂量混合(未缀合)而佐剂化的RF8140，如图19中所指示。测试了在第二次免疫和第三次免疫后来自动物的血清的融合前F三聚体结合。
在图19A中，在来自以下项的血清中测量融合前F三聚体结合应答：幼稚态小鼠，用未佐剂化RF8140(SEQ ID NO:23)免疫的小鼠，用与SM7/8佐剂缀合的RF8140(SEQ ID NO:23)、用130ng SM7/8佐剂化的RF8140(SEQ ID NO:23)或用20μg SM7/8佐剂化的RF8140(SEQID NO:23)免疫的小鼠。与未佐剂化或SM7/8佐剂化组相比，与SM7/8缀合的RF8140(SEQ IDNO:23)引发更高的融合前F三聚体结合效价。
在图19B中，还在来自以下项的血清中测量融合前F三聚体结合应答：幼稚态小鼠，用未佐剂化RF8140(SEQ ID NO:23)免疫的小鼠，用与CpG佐剂缀合的RF8140(SEQ ID NO:23)、用680ng CpG佐剂化的RF8140(SEQ ID NO:23)或用20μg CpG佐剂化的RF8140(SEQ IDNO:23)免疫的小鼠。与未佐剂化或SM7/8佐剂化组相比，与SM7/8缀合的RF8140(SEQ ID NO:23)引发更高的融合前F三聚体结合效价。
为了证明Pre-F-NP抗原和Gcc-NP抗原在人细胞中引发应答的能力，用MIMIC平台进行了实验(图20A-D)。MIMIC平台仅由自体人免疫细胞构成，所述自体人免疫细胞能够在激发时快速且可再现地产生抗原特异性先天性应答和适应性应答。先前的工作证明了MIMIC系统再现针对如HBV、破伤风类毒素、单克隆抗体、YF-VAX和流感B细胞应答的不同靶标的体内免疫概况的能力。在人B细胞中比较了由用Pre-F-NP RF8140(SEQ ID NO:23)与融合后F三聚体(SEQ ID NO:24)处理引发的RSV融合前F三聚体结合抗体应答，并且示出了代表性基线应答以进行比较(未处理)(图20A)。在图20C中示出了所测量的在人B细胞中由用Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)与融合后F(SEQ ID NO:24)处理引发的对融合前F三聚体(DS-CAV1，SEQ ID NO:25)与融合后F三聚体(SEQ ID NO:24)的结合应答的比率。使用VERO细胞测定测量由用不同的F抗原处理引发的来自MIMIC的抗体(图20B)。将在人B细胞中由用Pre-F NP(RF8140，SEQ ID NO:23)与融合后F三聚体(SEQ ID NO:24)处理引发的中和效价与未处理组进行比较，显示RF8140(SEQ ID NO:23)在人细胞中引发优越的中和应答。
基于在MIMIC研究中研究的人受试者的血清状态确定对RSV感染或对F亚单位疫苗候选物的Ab应答的大小，并通过线性回归分析对其进行评估。在RSV处理后(图20E，p＝0.0041)和在F后初免后(图20F，p＝0.0019)，具有更高的抗pre-F IgG的预先存在的循环效价的供体产生显著更多的抗pre-F IgG。尽管相关性没有达到统计学显著性，但pre-F还显示出诱导的Ab水平与预先存在的Ab水平之间的关系。值得注意的是，与其他处理不同的是，pre-F-NP从具有低预先存在的抗pre-F-IgG的供体中诱导了与具有高预先存在的Ab的供体可比的高水平的抗pre-F-IgG(图20F)。这表明，pre-F-NP甚至从具有低预先存在的IgG水平的供体中也能够有效挽救(或增强)Ab应答。
为了证明Gcc-NP与单独的Gcc肽(SEQ ID NO:29)相比引发优越的G抗体应答，在人B细胞中用单独的Gcc肽(SEQ ID NO:29)或与纳米颗粒缀合的Gcc肽(Gcc-NP)处理人B细胞。Gcc-NP引发了优越的G结合抗体应答(图20G)。综合起来，这些数据表明Pre-F-NP和Gcc-NP将在人类免疫中引发免疫应答。
4.对RSV Gcc-铁蛋白纳米颗粒的免疫应答的体内表征
如上所述制备RSV Gcc-NP。为了在小鼠中评估对RSV Gcc-NP的体内应答，在第0周、第3周和第6周用指定剂量的RSV抗原以高剂量(5μg)或低剂量(0.5μg)的抗原肌内免疫雌性BALBc小鼠。除非另有说明，否则用床边混合策略将RSV Gcc-NP用AF03佐剂化。即，在临将50μl注射至每条后肢中之前，将50μl的蛋白质溶液与50μl的Sanofi佐剂AF03(基于角鲨烯的乳剂；参见Klucker等人,J Pharm Sci.2012年12月；101(12):4490-500)混合。未观察到来自免疫的不利影响。在首次免疫前1天和在每次注射后至少2周(即第2、5和8周)采集血液。除非另有说明，否则示出的数据是关于第三次注射后2周(第8周，也表示为2wp3)的。典型地，对来自免疫前动物(表示为幼稚态)、第二次注射后两周(第2次后或2wp2)或第三次注射后两周(第3次后或2wp3)的血清进行分析。
对于HAE中和测定，将血清在56℃下热灭活30分钟。在补充有PneumaCultTM-ALI10X补充剂(Stem Cell Technologies；05003)和1％抗生素/抗真菌剂的PneumaCultTM-ALI基础培养基(Stem Cell Technologies；05002)(从此称为培养基)中制备灭活血清的四倍系列稀释系列。将RSV病毒原液与血清稀释液1:1合并，并在37℃下孵育1.5小时。然后将病毒-血清混合物以50μL/孔添加至含有完全分化的HAE细胞的24孔板中，并在37℃、5％CO2下孵育1小时。孵育后，去除接种物，用培养基洗涤孔两次以去除未结合的病毒，并在37℃、5％CO2下再孵育20小时。用荧光显微镜计数用表达mKate(TagFP635)报告物的RSV感染的培养物中的感染事件。
为了检测用不表达mKate报告物的RSV进行的感染(RSV B株系中和)，用培养基充分洗涤假复层上皮以去除粘液，然后在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，用0.25％TritonX-100透化30分钟，并且用补充有2％FBS的DMEM在37℃下封闭1小时。用在补充有2％FBS的DMEM中1:200稀释的100μL/孔小鼠抗RSV单克隆Ab混合物(Millipore；MAB 858-4)置换封闭溶液，并将板在37℃下孵育2小时。然后将板用补充有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次。每孔添加100μL的在补充有2％FBS的DMEM中1:200稀释的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen；A11001)，并将板在4℃下孵育过夜。第二天早晨，将板用补充有0.05％Tween 20的PBS洗涤3次，用具有DAPI的ProLong Gold AntiFade(Thermo Fisher Scientific；P36935)稳定化荧光信号，并用荧光显微镜计数。在60％减少终点处确定中和抗体效价。
为了证明更高的多价性改善了RSV G抗原对中和应答的引发，用RSV F抗原对小鼠进行免疫。将所有免疫用AF03佐剂化。用与AF03一起配制的RSV Gcc-NP对小鼠进行免疫，在第二次注射后2周和第三次注射后2周测量和中和效价(图21A-C)。RSV Gcc-NP引发了相对于幼稚态小鼠血清的中和应答。在第二次免疫后2周(图21A)和第三次免疫后2周(图21B)，用含有来自A2株系的Gcc的Gcc-NP免疫的小鼠显示出对RSV A株系的中和应答。在第三次注射后2周，Gcc-NP也引发了对RSV B1株系的中和应答(图21C)。
对于抗Gcc结合，在Octet尖端上使用具有C末端HIS标签的Gcc肽的三聚化二聚体。将带有His6标签的Gcc(A2株系)六聚体或带有His6标签的Gcc(B1株系)六聚体预加载至抗Penta-HIS(HIS1K)传感器尖端(FortéBio#18-5122)上400秒以允许捕获达到接近饱和。然后将生物传感器尖端在Octet洗涤缓冲液中平衡90秒，之后使稀释血清缔合300秒。使用Octet数据分析HT10.0软件测量缔合曲线最终响应，并将所述响应乘以稀释倍数(100或300)以获得最终报告的响应。
为了确定RSV Gcc-NP是否引发Gcc结合免疫应答，测试了来自上文所述的免疫的血清结合Gcc A2六聚体或Gcc B1六聚体的能力。在第二次免疫后2周和第三次免疫后2周测试高剂量(图22A和图23A)和低剂量(图22B和图23B)下的Gcc结合应答。对于A2株系(图22A-B)和B1株系(图23A-B)，相对于幼稚态小鼠血清而言RSV Gcc-NP引发了结合应答。
5.在人细胞中对Pre-F-NP和Gcc-NP的应答
为了证明Pre-F-NP和Gcc-NP在人细胞中引发应答的能力，用MIMIC平台进行了实验。MIMIC平台仅由自体人免疫细胞构成，所述自体人免疫细胞能够在激发时快速且可再现地产生抗原特异性先天性应答和适应性应答。先前的工作证明了MIMIC系统再现针对如HBV、破伤风类毒素、单克隆抗体、YF-VAX和流感B细胞应答的不同靶标的体内免疫概况的能力。在人B细胞中比较了由用Pre-F-NP RF8140(SEQ ID NO:23)与融合后F三聚体(SEQ IDNO:24)处理引发的RSV融合前F三聚体结合抗体应答，并且将其与代表性基线应答进行比较。确定了所测量的在人B细胞中由用Pre-F-NP(RF8140，SEQ ID NO:23)与融合后F(SEQ IDNO:24)处理引发的对融合前F三聚体(DS-CAV1，SEQ ID NO:25)与融合后F三聚体(SEQ IDNO:24)的结合应答的比率。使用VERO细胞测定测量由用不同的F抗原处理引发的来自MIMIC的抗体。将在人B细胞中由用Pre-F NP(RF8140，SEQ ID NO:23)与融合后F三聚体(SEQ IDNO:24)处理引发的中和效价与未处理组进行比较，显示RF8140(SEQ ID NO:23)在人细胞中引发优越的中和应答。为了证明Gcc-NP与单独的Gcc肽(SEQ ID NO:29)相比引发优越的G抗体应答，在人B细胞中用单独的Gcc肽(SEQ ID NO:29)或与纳米颗粒缀合的Gcc肽(Gcc-NP)处理人B细胞。Gcc-NP引发了优越的G结合抗体应答。因此，Pre-F-NP和Gcc-NP将在人类免疫中引发免疫应答。
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 抗原性呼吸道合胞病毒多肽
<130> 01121-0031-00PCT
<150> 62/652,199
<151> 2018-04-03
<160> 230
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gly Ser Gly Asn Val Gly Leu Gly Gly Ala Ile Ala Ser Gly Val
100 105 110
Ala Val Cys Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys
115 120 125
Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly
130 135 140
Val Ser Val Leu Thr Phe Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp
145 150 155 160
Lys Gln Leu Leu Pro Ile Leu Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn
165 170 175
Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu
180 185 190
Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser
195 200 205
Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met
210 215 220
Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Cys Ile Ile Lys Glu Glu Val
245 250 255
Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro
260 265 270
Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu
275 280 285
Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp
290 295 300
Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val
305 310 315 320
Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Arg Thr Leu Pro
325 330 335
Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp
340 345 350
Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr
355 360 365
Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala
370 375 380
Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp
385 390 395 400
Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu
405 410 415
Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu
420 425 430
Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe
435 440 445
Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala
450 455 460
Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
465 470 475 480
Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu Asn Glu
485 490 495
Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser
500 505 510
Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe
515 520 525
Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe
530 535 540
Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro
545 550 555 560
Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu
565 570 575
His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala
580 585 590
Ile Lys Cys Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val
595 600 605
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610 615 620
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<210> 2
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
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435 440 445
Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Leu Ile Asn Gln Ser Leu Ala
450 455 460
Phe Ile Asn Gln Ser Asp Glu Leu Leu Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser
465 470 475 480
Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Asn Asp Ile Glu Asn Leu Leu Asn Glu
485 490 495
Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser
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Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe
515 520 525
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530 535 540
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580 585 590
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Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
645 650
<210> 21
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
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645 650
<210> 22
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
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645 650
<210> 23
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
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<213> 人工序列
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Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp
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Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr
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Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser Gly
675 680 685
Ser
<210> 26
<211> 574
<212> PRT
<213> 人呼吸道合胞病毒
<400> 26
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450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
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Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn
485 490 495
Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr
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Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser
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Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
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<213> 人呼吸道合胞病毒
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Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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275 280 285
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290 295
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<213> 人呼吸道合胞病毒
<400> 28
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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<223> 合成多肽
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<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
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Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
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<210> 204
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
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Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 205
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Cys Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 206
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Cys Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 207
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Cys Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 208
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 209
<211> 166
<212> PRT
<213> 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 209
Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr
20 25 30
His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu
35 40 45
Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn
50 55 60
Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu
65 70 75 80
Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile
85 90 95
Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp
100 105 110
His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu
115 120 125
Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly
130 135 140
Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile
145 150 155 160
Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165
<210> 210
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 210
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 211
<211> 191
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)
<400> 211
Thr Gln Cys Asn Val Asn Pro Val Gln Ile Pro Lys Asp Trp Ile Thr
1 5 10 15
Met His Arg Ser Cys Arg Asn Ser Met Arg Gln Gln Ile Gln Met Glu
20 25 30
Val Gly Ala Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Met Gly Ala His Phe Ser Lys
35 40 45
Asp Val Val Asn Arg Pro Gly Phe Ala Gln Leu Phe Phe Asp Ala Ala
50 55 60
Ser Glu Glu Arg Glu His Ala Met Lys Leu Ile Glu Tyr Leu Leu Met
65 70 75 80
Arg Gly Glu Leu Thr Asn Asp Val Ser Ser Leu Leu Gln Val Arg Pro
85 90 95
Pro Thr Arg Ser Ser Trp Lys Gly Gly Val Glu Ala Leu Glu His Ala
100 105 110
Leu Ser Met Glu Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Arg Asn Val Ile Lys
115 120 125
Ala Cys Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asn Asp Tyr His Leu Val Asp Tyr
130 135 140
Leu Thr Gly Asp Phe Leu Glu Glu Gln Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Leu
145 150 155 160
Ala Gly Lys Ala Ser Thr Leu Lys Lys Leu Met Asp Arg His Glu Ala
165 170 175
Leu Gly Glu Phe Ile Phe Asp Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Val
180 185 190
<210> 212
<211> 212
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)
<400> 212
Ala Asp Thr Cys Tyr Asn Asp Val Ala Leu Asp Cys Gly Ile Thr Ser
1 5 10 15
Asn Ser Leu Ala Leu Pro Arg Cys Asn Ala Val Tyr Gly Glu Tyr Gly
20 25 30
Ser His Gly Asn Val Ala Thr Glu Leu Gln Ala Tyr Ala Lys Leu His
35 40 45
Leu Glu Arg Ser Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ala Ala Tyr Phe Asn Asn
50 55 60
Tyr Gln Thr Asn Arg Ala Gly Phe Ser Lys Leu Phe Lys Lys Leu Ser
65 70 75 80
Asp Glu Ala Trp Ser Lys Thr Ile Asp Ile Ile Lys His Val Thr Lys
85 90 95
Arg Gly Asp Lys Met Asn Phe Asp Gln His Ser Thr Met Lys Thr Glu
100 105 110
Arg Lys Asn Tyr Thr Ala Glu Asn His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Lys
115 120 125
Ala Leu Asp Thr Gln Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Phe Tyr Ile His
130 135 140
Arg Glu Ala Thr Arg Asn Ser Gln His Leu His Asp Pro Glu Ile Ala
145 150 155 160
Gln Tyr Leu Glu Glu Glu Phe Ile Glu Asp His Ala Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Thr Leu Ala Gly His Thr Ser Asp Leu Lys Lys Phe Ile Thr Ala Asn
180 185 190
Asn Gly His Asp Leu Ser Leu Ala Leu Tyr Val Phe Asp Glu Tyr Leu
195 200 205
Gln Lys Thr Val
210
<210> 213
<211> 174
<212> PRT
<213> 激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400> 213
Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg
50 55 60
Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe
85 90 95
Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val
115 120 125
Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala
130 135 140
Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
165 170
<210> 214
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人( Homo sapiens)
<400> 214
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Gln
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Gln Glu Ser
180
<210> 215
<211> 204
<212> PRT
<213> 智人( Homo sapiens)
<400> 215
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser
35 40 45
Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly
50 55 60
Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe
65 70 75 80
Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu
85 90 95
Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala
115 120 125
Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His
130 135 140
Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu
145 150 155 160
Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp
165 170 175
His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly
180 185 190
Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
195 200
<210> 216
<211> 154
<212> PRT
<213> 风产液菌(Aquifex aeolicus)
<400> 216
Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu Arg Phe Gly
1 5 10 15
Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg Leu Val Glu
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg Glu Glu Asp Ile
35 40 45
Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro Val Ala Ala Gly
50 55 60
Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ala Ile Gly Val
65 70 75 80
Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala Ser Glu Val
85 90 95
Ser Lys Gly Leu Ala Asn Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys Pro Ile Thr
100 105 110
Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile Glu Arg Ala
115 120 125
Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ile
130 135 140
Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg
145 150
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 牛蛙接头序列
<400> 217
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe
1 5
<210> 218
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 218
Cys Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Glu His His His His His His
1 5 10 15
<210> 219
<211> 156
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 219
Met Asn Ile Ile Glu Ala Asn Val Ala Thr Pro Asp Ala Arg Val Ala
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ala Arg Phe Asn Asn Phe Ile Asn Asp Ser Leu Leu Glu
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Ala Leu Lys Arg Ile Gly Gln Val Lys Asp Glu Asn
35 40 45
Ile Thr Val Val Trp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Leu Pro Leu Ala Ala
50 55 60
Gly Ala Leu Ala Lys Thr Gly Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Gly
65 70 75 80
Thr Val Ile Arg Gly Gly Thr Ala His Phe Glu Tyr Val Ala Gly Gly
85 90 95
Ala Ser Asn Gly Leu Ala His Val Ala Gln Asp Ser Glu Ile Pro Val
100 105 110
Ala Phe Gly Val Leu Thr Thr Glu Ser Ile Glu Gln Ala Ile Glu Arg
115 120 125
Ala Gly Thr Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Ala Ala Leu Thr Ala
130 135 140
Leu Glu Met Ile Asn Val Leu Lys Ala Ile Lys Ala
145 150 155
<210> 220
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 221
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 221
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 222
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 223
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 223
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 224
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 225
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 226
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 226
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 227
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 227
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 228
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 228
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 229
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 229
Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 230
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6xHis标签
<400> 230
His His His His His His
1 5

Claims (39)

1.一种包含RSV F多肽的抗原性RSV多肽，其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断。
2.一种包含RSV F多肽的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209以及对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507的天冬酰胺。
3.根据权利要求2所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV多肽中的由融合前RSV F与融合后RSV F之间共享的表位被阻断。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含融合前RSV F。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽被选自D25或AM14的融合前RSV F特异性抗体识别。
6.根据权利要求4或5所述的抗原性RSV多肽，其中所述融合前RSV F包含在融合后RSVF上未发现的表位。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含融合后RSV F。
8.根据权利要求1或3-6中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述表位被附接至天冬酰胺的N聚糖阻断。
9.根据权利要求8所述的抗原性RSV多肽，其中所述天冬酰胺对应于野生型RSV F序列(SEQ ID NO:26)中的非天冬酰胺残基，任选地其中所述非天冬酰胺残基对应于SEQ ID NO:26的位置328、348或507。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽进一步包含铁蛋白蛋白。
11.根据权利要求10所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
12.一种抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含RSV F多肽和铁蛋白蛋白，其中所述铁蛋白蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C和S111C突变中的一种或多种或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的一种或多种相应突变。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含经由表面暴露的氨基酸连接至所述铁蛋白的一个或多个免疫刺激部分，任选地其中所述表面暴露的氨基酸是由突变产生的半胱氨酸。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述天冬酰胺是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置19处，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似位置处。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变，任选地其中所述内部半胱氨酸是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含在融合后RSV F上未发现的为位点0表位的表位，任选地其中所述位点0表位包含SEQ ID NO:26的氨基酸残基62-69和196-209。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:26的位置328对应的位置处的天冬酰胺。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:26的位置348对应的位置处的天冬酰胺。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:26的位置507对应的位置处的天冬酰胺。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中RSV F多肽包含与SEQ IDNO:26的位置赖氨酸498对应的位置处的亮氨酸。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:26的位置异亮氨酸217对应的位置处的脯氨酸。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:26的位置155对应的位置处的除半胱氨酸之外的氨基酸和/或与SEQ ID NO:26的位置290对应的位置处的除半胱氨酸之外的氨基酸。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含与SEQID NO:26的位置155对应的位置处的丝氨酸和/或与SEQ ID NO:26的位置290对应的位置处的丝氨酸。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽缺乏弗林蛋白酶切割位点，任选地其中存在接头以代替所述弗林蛋白酶切割位点。
26.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:17的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
27.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:17的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
28.根据权利要求26或27所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-478。
29.根据权利要求1-19中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQID NO:23的氨基酸1-478具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
30.根据权利要求1-19或29中任一项所述的抗原性RSV多肽，其中所述RSV F多肽包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。
31.根据权利要求29或30所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-478。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽，所述抗原性RSV多肽包含SEQID NO:3-23中任一个的序列。
33.一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据权利要求10-32中任一项所述的抗原性RSV多肽。
34.一种组合物，所述组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原性RSV多肽或铁蛋白颗粒和RSV G多肽。
35.一种包含根据权利要求1-33中任一项所述的抗原性RSV多肽或铁蛋白颗粒的组合物，或根据权利要求34所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒或组合物，用于在引发对RSV的免疫应答或保护受试者免受RSV感染的方法中使用。
37.一种引发对RSV的免疫应答或保护受试者免受RSV感染的方法，所述方法包括向受试者给予根据权利要求1-36中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒或组合物中的任何一种或多种。
38.根据权利要求36-37中任一项所述的抗原性RSV多肽、铁蛋白颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
39.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-32中任一项所述的抗原性RSV多肽，任选地其中所述核酸是mRNA。
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