CN112512565A - 抗原性流感-铁蛋白多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及抗原性流感‑铁蛋白多肽及其在引发针对流感的抗体中的用途。

Description

抗原性流感-铁蛋白多肽
本申请要求2018年4月3日提交的美国临时专利申请号62/652,204的权益，所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文中。
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2019年3月18日创建的所述ASCII副本被命名为2019-03-18_01121-0034-00PCT_SL.txt并且大小为285,731字节。
即使在疫苗学领域取得了许多成功，仍需要新的突破来保护人类免受许多威胁生命的传染性疾病的影响。当前许多已获许可的疫苗都依赖十年前的技术来产生活的减毒病原体或灭活的杀死病原体，所述病原体具有固有的安全性问题，并且在许多情况下，仅刺激短暂的弱免疫应答，从而需要给予多个剂量。虽然遗传学和生物化学工程学的进步使得开发针对具有挑战性的疾病靶标的治疗剂成为可能，但在疫苗学领域的这些应用尚未完全实现。重组蛋白技术现在允许设计最佳抗原。另外，纳米颗粒已越来越多地展示出用于最佳抗原呈递和靶向药物递送的潜力。已经显示具有多个附接抗原的纳米颗粒具有增加的结合亲合力，所述增加的结合亲合力凭借其分子货物的多价展示和由于其纳米尺寸而更有效地跨过生物屏障的能力而提供。与流感病毒血凝素(HA)蛋白融合的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori(H.pylori))铁蛋白纳米颗粒可以改善抗原稳定性并增加在小鼠流感模型中的免疫原性(参见Kanekiyo等人,Nature 499:102-106(2013))。此融合蛋白自组装成八面体对称性纳米颗粒并呈递8个三聚体HA刺突，从而在与佐剂一起使用时在各种临床前模型中产生稳健的免疫应答。
流感仍然是全球严重的健康威胁，每年感染5％-10％的成年人并且每年造成250,000-500,000人死亡。由于生产时间长，疫苗株系必须在流感季节之前半年或更长时间被选出，并且经常因遗传漂移和漂变以及出现新株系而遭受失配。即使当正确匹配时，目前的疫苗也仅有50％-60％功效。因此，非常需要通过增加疫苗接种的广度、效力和/或耐久性来改善疫苗功效，并引入现代的生产实践。
在许多季节中观察到的流感疫苗功效低的潜在实质因素在于，病毒倾向于通过易错复制而发生突变，这使得病毒可以逃避接种疫苗的个体中的中和抗体的结合。流感病毒上保守表位的存在提示了一种通向可以抵抗病毒漂变的广泛中和流感疫苗的途径。然而，为了引发针对这些保守表位的抗体，需要重组蛋白工程化以将这些表位以有利的方式呈递至免疫系统。例如，当将全长血凝素(HA)用作免疫原时，所引发的抗体主要是与据说呈免疫显性的高度可变头部结构域结合的那些抗体。已经设计出一种诱导针对次显性高度保守的茎区的抗体的策略，所述策略涉及“切断”HA的头部并通过蛋白质工程化捆绑剩余的蛋白质链(参见Yassine,Nature Medicine 21(9):1065-1071(2015))。
在此，呈现了在用于流感的疫苗治疗剂方面的一组新的进展。开发了抗原性流感-铁蛋白多肽，其中使工程化半胱氨酸置换铁蛋白中表面暴露的氨基酸。将免疫刺激部分(如佐剂)经由半胱氨酸缀合至抗原性多肽。由抗原性多肽组装的自佐剂化铁蛋白颗粒具有高度抗原性。将免疫刺激部分与铁蛋白颗粒的直接缀合与所述铁蛋白颗粒与流感多肽的融合相组合允许在单一大分子实体中靶向共递送免疫刺激部分和流感多肽，这可以大大降低全身性毒性的可能性，所述全身性毒性是在包含作为单独分子的抗原和佐剂的更传统的疫苗的情况下所担忧的。此外，免疫刺激部分与流感多肽在大分子实体中的共递送以及它们的多价呈递也可以减少所需疫苗的总剂量，从而减少生产负担和成本。
发明内容
本公开文本的目的是提供可以提供以上讨论的一个或多个优点，或者至少为公众提供有用选择的组合物、试剂盒、方法和用途。因此，本文公开了以下实施方案。
实施方案1是一种抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽包含(i)含有用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变的铁蛋白蛋白，和(ii)流感多肽。
实施方案2是一种抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽包含(i)铁蛋白蛋白，所述铁蛋白蛋白含有用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和与所述半胱氨酸缀合的免疫刺激部分，和(ii)流感多肽。
实施方案3是根据实施方案1所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含经由所述半胱氨酸缀合至所述铁蛋白蛋白的免疫刺激部分。
实施方案4是根据实施方案1-3中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述流感多肽包括血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)多肽。
实施方案5是根据实施方案4所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述HA多肽包含保守区。
实施方案6是根据实施方案5所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述保守区包含所述HA的茎区的全部或一部分。
实施方案7是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述流感抗原包括含有Y98F突变的HA抗原。
实施方案8是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变。
实施方案9是根据实施方案8所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述内部半胱氨酸在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处，任选地其中所述内部半胱氨酸突变成丝氨酸。
实施方案10是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述非天冬酰胺氨基酸是谷氨酰胺。
实施方案11是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述表面暴露的氨基酸是幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S26、S72、A75、K79、S100或S111或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似氨基酸的突变。
实施方案12是根据实施方案11所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述表面暴露的氨基酸处的所述突变是幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C或S111C或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似氨基酸。
实施方案13是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR7或TLR8的激动剂。
实施方案14是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR9的激动剂。
实施方案15是根据实施方案1或3-14中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含在所述免疫刺激部分与所述铁蛋白蛋白之间的接头。
实施方案16是根据实施方案15所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述接头包括马来酰亚胺部分、聚乙二醇(PEG)部分和二苯并环辛炔(DBCO)部分中的一种、两种或三种。
实施方案17是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含在所述铁蛋白蛋白与所述流感多肽之间的肽接头。
实施方案18是一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽。
实施方案19是一种组合物，所述组合物包含根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽或铁蛋白颗粒和药学上可接受的载体。
实施方案20是根据实施方案19所述的组合物，所述组合物进一步包含含有铁蛋白蛋白和不同的流感多肽的第二抗原性流感-铁蛋白多肽。
实施方案21是根据实施方案20所述的组合物，其中所述流感多肽来自甲型流感并且所述第二抗原性流感-铁蛋白多肽的流感多肽来自乙型流感，或其中所述流感多肽和所述第二流感-铁蛋白多肽的流感多肽来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18，或其中所述流感多肽中的一种或两种包括来自亚型H1、H3、H7或H10的工程化的稳定化茎抗原。
实施方案22是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒或组合物，用于在引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的方法中使用。
实施方案23是一种引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的方法，所述方法包括向受试者给予根据前述实施方案中任一项所述的任何一种或多种抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒或组合物。
实施方案24是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
实施方案25是一种核酸，所述核酸编码根据实施方案1-17中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，任选地其中所述核酸是mRNA。
其他目的和优点将阐述于随后的描述中，并且/或者将从所述描述中明显看出，或者可以通过实践获知。所述目的和优点将借助所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
应了解，上文的一般说明与下文的详细说明均仅是示例性和解释性的，并且对权利要求无限制性。
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图展示了某些实施方案，并且附图连同本说明一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A至1B.代表性H1N1流感病毒株系的序列比较和同源性。(图1A)使用载体NTIAlignX软件对候选抗原性HA多肽的序列比对。白底黑字：源自给定位置处的完全保守残基的共有残基。黑底白字：源自给定位置处发生率大于50％的单一残基的共有残基。白底黑字加下划线和粗体：与给定位置处的共有残基弱相似的残基。白底黑字带有双下划线和斜体：源自给定位置处的相似残基块的共有残基。白底黑字加粗：非相似残基。示出的序列是以下序列的HA部分加上C末端处的接头丝氨酸：CA09 HA-Np＝SEQ ID NO:15的残基1-519。COBRAP1 HA-Np＝SEQ ID NO:27的残基1-519。COBRA X6 HA-Np＝SEQ ID NO:29的残基1-518。NC99 HA-Np＝SEQ ID NO:1的残基1-518。HK77 HA-Np＝SEQ ID NO:18的残基1-519。FM47HA-Np＝SEQ ID NO:17的残基1-519。DV57 HA-Np＝SEQ ID NO:21的残基1-518。MAL54HA-Np＝SEQ ID NO:16的残基1-519。(图1B)用邻接法(Vector NTI)针对来自所列出流感株系的HA蛋白序列生成的系统树图。箭头指示通过从这些序列产生HA-铁蛋白纳米颗粒并在小鼠中测试其免疫原性而被选择作为用于评价的候选物的株系。
图2.铁蛋白上的工程化的表面暴露的半胱氨酸(Cys)。在铁蛋白纳米颗粒的情境下示出了由置换表面暴露的氨基酸的突变产生的半胱氨酸的位置。
图3A至图3B.Toll样受体(TLR)激动剂与铁蛋白的缀合。(图3A)在铁蛋白纳米颗粒的情境下说明了将SM7/8a小分子经由含有马来酰亚胺反应性基团的PEG4接头与由置换铁蛋白中表面暴露的氨基酸的突变产生的半胱氨酸缀合的结果。(图3B)在铁蛋白纳米颗粒的情境下说明了通过马来酰亚胺-DBCO双官能接头和叠氮化物官能化的CpG试剂，使用2步式点击化学将CpG(SEQ ID NO:230)与由置换铁蛋白中表面暴露的氨基酸的突变产生的半胱氨酸缀合的结果。
图4A至图4B.Toll样受体(TLR)激动剂与铁蛋白的缀合。(图4A)包含HA多肽和3M-012的铁蛋白纳米颗粒的模型，所述3M-012经由马来酰亚胺-DBCO双官能接头和叠氮化物官能化的3M-012试剂，使用2步式点击化学反应而与铁蛋白的表面暴露的半胱氨酸缀合。(图4B)包含HA多肽和CpG(SEQ ID NO:231)的铁蛋白纳米颗粒的模型，所述CpG用马来酰亚胺-DBCO双官能接头和叠氮化物官能化的CpG试剂，使用2步式点击化学反应而与铁蛋白的表面暴露的半胱氨酸缀合。
图5.某些铁蛋白纳米颗粒构建体的铁蛋白部分内的胰蛋白酶切割位点。一些铁蛋白纳米颗粒除了用于缀合佐剂的未配对表面暴露的半胱氨酸外还包含胰蛋白酶切割位点。图5中所呈现的氨基酸序列是“通用”序列，其示出了多个构建体共有的序列。例如，SEQ IDNO:14的残基519-694包含图5中所示的“通用”序列。“XXX”序列表示流感多肽。还指出了该序列中存在的铁蛋白S111C突变的位置。
图6A和图6B.在伴有或不伴有缀合的情况下的凝胶移位和质谱(MS)结果。(图6A)H1/茎-Np(SEQ ID NO:43)在存在(+)或不存在(-)与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a的缀合的情况下的凝胶移位和质谱结果。(图6B)H5/hCobra2-Np(SEQ ID NO:32)在存在(+)或不存在(-)与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a的缀合的情况下的凝胶移位和质谱结果。
图7A和图7B.在伴有或不伴有缀合的情况下的进一步凝胶移位结果。(图7A)在伴有或不伴有与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a或通过2步式点击化学与马来酰亚胺-PEG4-DBCO和叠氮化物-CpG的缀合的情况下，肽N-糖苷酶(PNGase)处理后的H1/茎-Np的凝胶移位结果。(图7B)在伴有或不伴有与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a或通过2步式点击化学与马来酰亚胺-PEG4-DBCO和叠氮化物-CpG的缀合的情况下，胰蛋白酶处理后的H1/茎-Np的凝胶移位结果。
图8A和图8B.在伴有或不伴有马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a与H1/茎-Np的缀合的情况下的质谱。(图8A)PNGase处理后的MS数据显示出与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a缀合之前和之后的H1/茎-Np的质量。(图8B)用胰蛋白酶处理H1/茎-Np后的MS数据显示出与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a缀合之前和之后经切割铁蛋白的质量。
图9.在伴有或不伴有马来酰亚胺-PEG4-DBCO接头与H1/茎-Np的缀合的情况下的质谱。通过在添加接头后由MS测量的质量变化来确认至H1/茎-Np的马来酰亚胺-PEG4-DBCO接头添加。
图10.通过2步式点击化学缀合CpG之前和不同阶段的H1/茎-Np的SDS-PAGE。“叠氮化物-CpG之后”是指2步式点击反应的最终产物。
图11.对包含3M-012的接头与NC99 HA-TEV-Np构建体的缀合的表征。WT和+TEV泳道中的构建体具有序列SEQ ID NO:13；S26C是指SEQ ID NO:10；S72C是指SEQ ID NO:11；A75C是指SEQ ID No:12；并且S111C是指SEQ ID NO:9。除WT外，所有样品均用烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)处理。
图12A至图12E.在伴有或不伴有还原或缀合的情况下各种构建体的质谱。(图12A)还原之前的包含S111C的H1/茎-Np。(图12B)还原之后的包含S111C的H1/茎-Np。还原之后观察到的质量下降(115Da)与去除抑制半胱氨酸反应性的翻译后修饰一致。(图12C)在伴有或不伴有与3M012的缀合的情况下NC99 HA-TEV-Np-S26C纳米颗粒(SEQ ID NO:10)的质谱。(图12D)在伴有或不伴有与3M012的缀合的情况下NC99 HA-TEV-Np-A75C纳米颗粒(SEQ IDNO:12)的质谱。(图12E)在伴有或不伴有与3M012的缀合的情况下NC99 HA-TEV-Np-S111C纳米颗粒(SEQ ID NO:9)的质谱。
图13A至图13F.在伴有或不伴有与SM7/8a、3M012或CpG的缀合的情况下H1/茎-Np或NC99 HA-Np的纳米颗粒的负染色电子显微镜(EM)图像。(图13A)未缀合的H1/茎-Np。(图13B)H1/茎-Np-SM7/8a缀合物。(图13C)H1/茎-Np-CpG缀合物。(图13D)NC99 HA-Np(SEQ IDNO:9)]。(图13E)NC99 HA-Np-3M012缀合物。(图13F).NC99 HA-Np-CpG缀合物。
图14A至图14C.H1/茎-Np-SM7/8a缀合物(图14A)、H1/茎-Np-CpG缀合物(图14B)或未缀合的H1/茎-Np(图14C)的动态光散射(DLS)分析。
图15A至图15B.对与掺合的如所指示佐剂一起配制或如图3A至图3B所示经由PEG4接头与TLR激动剂(如SM7/8a或CpG)缀合的H1/茎-Np的抗体应答。在免疫(第0周和第3周)后5周时从小鼠(n＝5)收集血清，并且通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体效价。该数据证明了H1/茎-Np-TLR-激动剂缀合物的自佐剂化特性。图15A示出了针对H1/新喀里多尼亚/20/1999HA三聚体的ELISA。PAA＝聚丙烯酸；混合等摩尔＝83.3ng SM7/8a(相当于用SM7/8缀合的铁蛋白纳米颗粒给予的剂量)；高剂量＝21.84μg(高于用SM7/8缀合的铁蛋白纳米颗粒给予的剂量)。图15B示出了针对H1/茎三聚体的ELISA。混合等摩尔＝850ng CpG(相当于用CpG缀合的铁蛋白纳米颗粒给予的剂量)；高剂量＝20μg CpG。
图16A至图16C.用伴有或不伴有缀合或分开的3M-012的NC99HA-Np(SEQ ID NO:9)获得的效价的比较。在小鼠中测试了对NC99HA-Np-3M012缀合的纳米颗粒(0.22μg/剂量)的抗体应答。掺合物对照包括HA-Np(0.22μg/剂量)和10μg 3M012(典型的文献剂量)的混合物以及HA-Np(0.22μg/剂量)和1.7ng 3M012(缀合物的等摩尔匹配物)的混合物。另外的对照包括以匹配的HA含量(0.17μg HA/剂量)投配的未缀合HA-Np和IIV。基于ELISA终点效价(图16A)、假病毒(PsV)中和IC50效价(图16B)和血凝抑制(HAI)效价(图16C)，HA-Np-3M012缀合物诱导了比等摩尔掺合物对照显著更强的抗体应答。与未缀合的纳米颗粒和IIV护理标准相比，缀合的纳米颗粒还诱导了更强的应答(ELISA)和更强的中和抗体应答(PsV)，但是该结果在HAI分析中没有统计学显著性。测定是对于加强免疫后2周的血清的。一式三份地运行所有样品。对中值+/-SEM进行作图。****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图17A至图17C.用伴有或不伴有缀合或分开的CpG的NC99HA-Np(SEQ ID NO:9)获得的效价的比较。在小鼠中测试了对HA-Np-CpG缀合的纳米颗粒(0.22μg/剂量)的抗体应答。掺合物对照包括HA-Np(0.22μg/剂量)和20μg CpG(典型的治疗性剂量)的混合物以及HA-Np(0.22μg/剂量)和21ng CpG(缀合物的等摩尔匹配物)的混合物。另外的对照包括以匹配的HA含量(0.17μg HA/剂量)投配的未缀合HA-Np和IIV。基于ELISA终点效价(图17A)和假病毒中和IC50效价(图17B)，与匹配的掺合物、未缀合的颗粒或IIV相比，缀合物诱导更强的结合和中和抗体应答。HA-Np-CpG缀合物还诱导了比等摩尔掺合物对照显著更强的HAI效价(图17C)。另外，HAI效价比未缀合的HA-Ferr和IIV高2.6和3.0倍，但是这些结果并不显著。ELISA和PsV测定是对于加强免疫后2周的血清的，并且在加强免疫后5周对血清进行HAI分析。一式三份地运行所有样品，并且对中值+/-SEM进行作图。****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
图18A至图18C.对源自六个进化上相异的H1血凝素(HA)抗原和两个计算生成的(COBRA)抗原的自组装HA-铁蛋白纳米颗粒的表征。(图18A)通过动态光散射(DLS)测量纳米颗粒大小和多分散性(“分散性”)。(图18B)通过SDS-PAGE考马斯染色评估HA纳米颗粒的纯度。(图18C)通过负染色电子显微镜在80,000x放大倍率下使纳米颗粒完整性可视化。FM47＝A/蒙茅斯堡/1-JY2/1947；MAL54＝A/马来西亚/302/1954；DV57＝A/丹佛/1957(DV57)；HK77＝A/香港/117/1977；NC99＝A/新喀里多尼亚/20/99；CA09＝A/加利福尼亚/4/2009。COBRA P1和COBRA X6是从多个序列计算生成的共有序列，最近由Carter DM等人,J Virol90:4720-4734(2016)所述。对于SEQ ID NO参见图1A至图1B的图例。
图19A至图19H.由各种HA-铁蛋白纳米颗粒(对于SEQ ID NO参见图1A至图1B的图例)引发的免疫应答的效力和广度。用所指示HA-Np疫苗免疫后6周，针对一组相异的H1N1流感病毒，对来自小鼠的血清的血凝抑制(HAI)效价(log2)进行测定。在第0周和第3周，用血凝素纳米颗粒(HA-Np)对小鼠(n＝5)进行免疫。虚线指示测定检测极限。(图19A至图19E)伴有Ribi佐剂的数据。(图19F至图19H)伴有AF03佐剂的数据。x轴线指示从1934年到2013年按参考年份测试的H1N1流感株系组。表2给出了对应于每年的完整株系名称。星号指示匹配的株系。
图20A至图20F.由HA-铁蛋白纳米颗粒诱导的HA抗体应答。(图20A)用使用SigmaAdjuvant System(目录号S6322)的指定纳米颗粒或纳米颗粒组合对小鼠[n＝5]进行免疫。IIV是指流感灭活疫苗。(图20B至图20F)通过确定对来自以下项的HA三聚体的ELISA效价来测量抗体应答：A/蒙茅斯堡/1/1947(图20B)；A/马来西亚/302/1954(图20C)；A/香港/117/1977(图20D)；A/新喀里多尼亚/20/99(图20E)；或A/加利福尼亚/4/2009(图20F)。第一次免疫后5周测量ELISA效价。测试的最低血清稀释度设定了测定检测极限，如通过虚线所指示的。空心圆圈指示给予至小鼠的纳米颗粒的起源株系与通过ELISA测定的株系之间的匹配。
图21A至图21H.如通过HAI效价的测定所测量的，对给予至小鼠的多种铁蛋白纳米颗粒的HA混合物的抗体应答。(图21A至图21B)二价组合。(图21C至图21E)三价组合。(图21F至图21H)四价组合。测定了一组相异的H1N1流感病毒的HAI效价(log2)。在伴有佐剂的情况下，在第0周和第3周用所指示HA-纳米颗粒组合对小鼠(n＝5)进行免疫。在伴有AF03佐剂的情况下测试二价组合COBRA X6+COBRA P1 HA-Np，以与单价COBRA HA-Np的评价相一致。同样，单独株系HA-铁蛋白纳米颗粒的组合使用Ribi佐剂，以与单价单独株系HA-Np的评价相一致。星号指示给予至小鼠的纳米颗粒的起源株系与通过ELISA测定的株系之间的匹配。x轴线指示从1934年到2013年按参考年份测试的H1N1流感株系组。表2给出了针对每年的完整株系名称。虚线指示测定检测极限。
图22A至图22F.如通过HAI效价的测定所测量的，对伴有Ribi或AF03佐剂的组合物的抗体应答。对于NC99和CA09 HA-Np的二价组合(图22A至图22B)，NC99、CA09和HK77 HA-Np的三价组合(图22C至图22D)和NC99、CA09和FM47 HA-Np的三价组合(图22E至图22F)，用Ribi佐剂获得的结果(图22A、图22C和图22E)相比于用AF03佐剂获得的结果(图22B、图22D和图22F)是相似的。初免剂量后6周，在小鼠血清中测定HAI效价，其中在第3周进行加强免疫。在伴有Ribi或AF03佐剂的情况下，用如所指示的HA-Np组合对小鼠[n＝5]进行免疫。星号指示给予至小鼠的纳米颗粒的起源株系与通过ELISA测定的株系之间的匹配。x轴线指示从1934年到2013年按参考年份测试的H1N1流感株系组。表2给出了针对每年的完整株系名称。虚线指示测定检测极限。
图23A至图23C.如通过HAI效价的测定所测量的，由蛋中产生的NC99和CA09灭活流感疫苗(IIV)引发的比较性抗体应答。(图23A)NC99IIV。(图23B)CA09 IIV。(图23C)NC99+CA09 IIV。用所指示IIV疫苗(作为单一组分或共同给予的)免疫后6周，针对一组相异的H1N1流感病毒的来自小鼠的血清的血凝抑制(HAI)效价(log2)。在伴有Ribi佐剂的情况下，在第0周和第3周用170ng(HA含量)的每种疫苗对小鼠(n＝5)进行免疫。x轴线指示从1934年到2013年按参考年份测试的H1N1流感株系组(也参见表2)。x轴线指示从1934年到2013年按参考年份测试的H1N1流感株系组。表2给出了针对每年的完整株系名称。虚线指示测定检测极限。
图24A至图24DE.如通过HAI效价的测定所测量的，使用HA-铁蛋白纳米颗粒组合物或IIV对雪貂进行免疫后，针对各种流感病毒的抗体应答。在使用掺合有AF03佐剂的以下项进行两次免疫后来自雪貂(n＝12/组)的血清的HAI效价(log2)：图24A：单独的PBS；图24B：A/加利福尼亚/2009IIV；图24C：NC99+CA09+HK77 HA-Np；图24D：COBRA-X6+P1+HK77HA-Np。
图24E.对用HA-铁蛋白纳米颗粒组合物、IIV或PBS免疫的雪貂的异源攻击。如对于图24A至图24E所述那样对雪貂进行免疫，并且在最后一次免疫后4周通过以下方式来用1947蒙茅斯堡病毒攻击：用1mL的A/蒙茅斯堡/1/1947病毒以50％组织培养物感染剂量(TCID50)的104.65倍进行鼻腔接种。在攻击后的七天时间历程中，在鼻洗液中定量病毒效价。虚线指示测定检测极限。根据单尾不配对t检验和单向方差分析[F(3,44)＝5.18，p＝0.00375]，与媒介物(PBS)对照相比，在用HA-Np组合但未用CA09 IIV免疫的雪貂中，病毒效价在攻击后第5天显著降低。***＝p≤0.001，根据学生t检验。
图25A至图25C.用以下项免疫后的食蟹猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))的抗体应答：50μg与掺合的AF03佐剂一起配制的H1/茎-Np、或200μg H1/茎-Np(无佐剂对照)、或200μg H1/茎-Np-SM7/8a缀合物(图3A中所示的)或200μg H1/茎-Np-CpG缀合物(图3B中所示的)。图25A示出了在所指示时间点(其中免疫在第0、4和10周进行)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在用H1/新喀里多尼亚/20/1999HA三聚体包被的板上测量的HA抗体效价。图25B示出了用H1/新喀里多尼亚/20/1999HA和NA假型化的慢病毒的中和IC50。图25C示出了用H5/越南/1203/2004HA和NA假型化的慢病毒的中和IC50。该数据证明了H1/茎-Np-TLR-激动剂缀合物在灵长类动物模型中的自佐剂化特性。
图26A至图26B.用伴有或不伴有缀合或分开的3M-012的NC99HA-Np(SEQ ID NO:9)获得的效价的比较。对以下四种剂量的与NC99HA-Np-3M012缀合的纳米颗粒的抗体应答：0.1μg、0.5μg、2.5μg和12.5μg。包括了掺合物对照和未缀合的纳米颗粒用于比较。计算用于“等摩尔”掺合物对照和“高剂量”掺合物对照的TLR激动剂的量，以维持最初的缀合研究中使用的抗原与佐剂的比率(0.22μg HA-NP，对于“等摩尔”伴有1.7ng 3M012或对于“高剂量”伴有10μg)。在NC99慢病毒报告物测定(左，图26A)和NC99HAI测定(右，图26B)中测量血清中和。箭头突出显示了2.5μg剂量，其中HA-NP-3M012缀合物尽管含有低超过5000倍的3M012佐剂，但诱导了与HA-NP+3M012相似的抗体效价。对平均值±SEM进行作图。
具体实施方式
本文提供用于针对流感免疫的抗原性流感-铁蛋白多肽。抗原性多肽包含流感多肽和铁蛋白，并且可以用于针对流感对受试者进行疫苗接种。铁蛋白允许与免疫刺激分子(如佐剂)缀合(例如，经由用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变)，从而消除了对单独给予的佐剂的需要，并且潜在地减少引发对流感多肽的免疫应答所需的总佐剂的量。还提供了包含抗原性流感-铁蛋白多肽的颗粒、组合物和试剂盒及其用途。还提供了编码本文所述多肽的核酸。
A.定义
如本文所用，“血凝素”或“HA”是指任何流感病毒的负责结合宿主细胞膜上的唾液酸的糖蛋白(示例性血凝素是UniProt登录号：P03451)。HA涵盖被抗HA抗体识别或可以引发抗HA抗体的合成多肽，如下文所述的COBRA P1、COBRA X6和COBRA X3。
如本文所用，“HA茎”是指从缺乏完整HA头部的HA胞外结构域内的HA保守区设计的工程化流感多肽。关于保守的，其意指与作为整体的HA的序列同一性相比，所述区域在来自具有不同HA亚型的不同流感株系的HA之间保持显著更高的序列同一性。HA茎抗原例如详细讨论于以下文献中：Impagliazzo等人,Science 2015年9月18日,349(6254):1301-6；Valkenburg等人,Sci Rep.2016年3月7日,6:22666；Mallajosyula等人,FrontImmunol.2015,6:329。
如本文所用，“神经氨酸酶”或“NA”是指任何流感病毒的负责催化从病毒和细胞糖缀合物中去除末端唾液酸残基的糖蛋白(示例性神经氨酸酶为UniProt登录号：P03472)。
如本文所用，“Y98F突变”是指用苯丙氨酸置换野生型HA序列中的与唾液酸直接接触的酪氨酸。由该突变产生的苯丙氨酸的位置显示在图1中。尽管在一些HA亚型中确切的位置可能有所不同，但可以通过序列比对或结构分析来鉴定。HA序列中存在Y98F突变意味着相应的野生型HA是包含与唾液酸直接接触的酪氨酸的亚型。
如本文所用，“铁蛋白”或“铁蛋白蛋白”是指与幽门螺杆菌铁蛋白(SEQ ID NO:208或209)或本文所讨论的另一种铁蛋白(如激烈火球菌(P.furiosus)铁蛋白、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)铁蛋白或人铁蛋白)具有可检测的序列同一性的蛋白质，其用于例如在细胞内或组织中存储铁或在血流中携带铁。在下文详细讨论了此类示例性铁蛋白，包括以两条多肽链(称为重链和轻链)出现的那些(例如，粉纹夜蛾和人铁蛋白)。在一些实施方案中，铁蛋白包含与本文例如在表1(序列表)中公开的铁蛋白序列具有至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。铁蛋白可以是全长天然存在的序列的片段。
如本文所用，“野生型铁蛋白”是指其序列由天然存在的序列组成的铁蛋白。铁蛋白还包括其氨基酸序列与野生型铁蛋白有一个或多个差异的全长铁蛋白或铁蛋白片段。
如本文所用，“铁蛋白单体”是指未与其他铁蛋白分子组装的单一铁蛋白分子(或，在适用时，单一铁蛋白重链或轻链)。“铁蛋白多聚体”包含多个缔合的铁蛋白单体。“铁蛋白蛋白”包括单体铁蛋白和多聚体铁蛋白。
如本文所用，“铁蛋白颗粒”是指已经自组装成球状形式的铁蛋白。铁蛋白颗粒有时被称为“铁蛋白纳米颗粒”或简称为“纳米颗粒”。在一些实施方案中，铁蛋白颗粒包含24个铁蛋白单体(或，在适用时，总共24个重链和轻链)。
如本文所用，“杂合铁蛋白”是指包含幽门螺杆菌铁蛋白与牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的铁蛋白。用作牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的示例性序列呈现为SEQ ID NO:217。在杂合铁蛋白中，可以将牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区与幽门螺杆菌铁蛋白融合，由此使得使免疫刺激部分附接位点均匀分布在铁蛋白颗粒表面。如本文所用，“牛蛙接头”是包含序列SEQ ID NO:217的接头。杂合铁蛋白有时也称为“bfpFerr”或“bfp铁蛋白”。可以在没有牛蛙序列的情况下，例如像在没有接头或在具有替代性接头的情况下提供包含牛蛙序列的任何构建体。示例性牛蛙接头序列提供于表1中。在表1示出牛蛙接头的情况下，可以在没有接头或具有替代性接头的情况下制造相同的构建体。
如本文所用，“N-聚糖”是指在蛋白质的N(天冬酰胺)残基的酰胺氮处附接至蛋白质的糖链。这样，通过N-糖基化过程形成N-聚糖。此聚糖可以是多糖。
如本文所用，“糖基化”是指将糖单元添加至蛋白质。
如本文所用，“免疫应答”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的身体的任何细胞，例如包括分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。如本文所用，“保护性免疫应答”是指保护受试者免受感染(例如，预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如通过测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。“抗体应答”是其中产生抗体的免疫应答。
如本文所用，“抗原”是指引发免疫应答的因子；和/或当暴露或给予至生物体时由T细胞受体结合的因子(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体(例如，由B细胞产生)结合的因子。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括产生抗原特异性抗体)。可替代地或另外，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。特定抗原可以在靶标生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或若干成员中引发免疫应答，但不能在靶标生物体物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合抗体和/或T细胞受体，并且在生物体中可能诱导或可能不诱导特定生理应答。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外结合抗体和/或T细胞受体，无论在体内是否发生这种相互作用。在一些实施方案中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)反应。抗原包括如本文所述的抗原性流感-铁蛋白多肽。
如本文所用，“免疫刺激部分”是指共价附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽并可以激活免疫系统的组分(单独或当附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽时)的部分。示例性免疫刺激部分包括toll样受体(TLR)例如TLR4、7、8或9的激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。
如本文所用，“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括而不限于其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；其中抗原溶液乳化在矿物油中或水中的油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG基序)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，如Toll样受体(TLR)激动剂和共刺激分子。佐剂可以作为单独分子在组合物中给予或与抗原性流感-铁蛋白多肽共价结合(缀合)。
“抗原性流感-铁蛋白多肽”在本文中用于指包含铁蛋白和流感多肽的分子，其中所述分子具有关于流感多肽的抗原性。抗原性可以是作为较大构建体的一部分的流感多肽的特征。即，所述构建体可以充当产生针对流感多肽的抗体的抗原就足够了，而不管不伴有铁蛋白的流感多肽是否可以如此。在一些实施方案中，将流感多肽和铁蛋白在基因上融合为融合蛋白。在一些实施方案中，流感多肽和铁蛋白是非基因连接的，例如通过化学缀合。
如本文所用，“自佐剂化”是指组合物或多肽包含铁蛋白和直接缀合至铁蛋白的免疫刺激部分，使得铁蛋白和免疫刺激部分在同一分子实体中。可以将抗原性流感-铁蛋白多肽与免疫刺激部分缀合以产生自佐剂化多肽。
如本文所用，“表面暴露的”氨基酸是指蛋白质(例如，铁蛋白)中具有侧链的氨基酸残基，当所述蛋白质在多聚化后(如果适用)处于其天然的三维构象时，所述侧链可以被溶剂分子接触。因此，例如，在形成24聚体的铁蛋白的情况下，当铁蛋白组装为24聚体，例如组装为铁蛋白多聚体或铁蛋白颗粒时，表面暴露的氨基酸残基是其侧链可以被溶剂接触的氨基酸残基。
如本文所用，“受试者”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“受试者”是指人。在一些实施方案中，“受试者”是指非人动物。在一些实施方案中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在某些实施方案中，非人受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/猪)。在一些实施方案中，受试者可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，术语“个体”或“患者”被使用并且旨在与“受试者”可互换。
如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination或vaccinate)”是指给予旨在例如对致病因子产生免疫应答的组合物。疫苗接种可以在暴露于致病因子和/或发生一种或多种症状之前、期间和/或之后给予，并且在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不久给予。在一些实施方案中，疫苗接种包括间隔适当时间的疫苗接种组合物的多次给予。
本公开文本描述了分别与给定核酸序列或氨基酸序列(参考序列)具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列。
两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在具体是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过以下方式进行：在最佳比对之后，关于区段或“比较窗口”比较所述序列，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动地进行或借助于Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin序列分析包(Genetics Computer Group,575Science Drive,威斯康星州麦迪逊)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLASTN和TFASTA)进行。
百分比同一性通过以下方式获得：确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用此数目除以比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)，并且然后将此结果乘以100。
在一些实施方案中，同一性程度是针对区域给出的，所述区域是参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中为连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的整个长度给出同一性程度。
分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如并且在一些情况下，在功能上等同于所述给定序列。一个重要的特性包括充当细胞因子的能力，特别是当给予受试者时。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列在功能上等同于所述给定序列。
如本文所用，术语“试剂盒”是指一组经包装的相关组分，如一种或多种化合物或组合物和一种或多种相关材料，如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。
B.抗原性流感-铁蛋白多肽
本文提供了抗原性多肽，所述抗原性多肽包含流感多肽和铁蛋白，所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。多肽在与作为单独分子的佐剂一起给予和/或作为可以自佐剂化的纳米颗粒(例如，铁蛋白颗粒)的一部分给予时可以是抗原性的。
1.HA和NA多肽
在一些实施方案中，流感多肽是包含全长或部分长度的HA或NA的HA或NA多肽。可以使用任何HA或NA多肽。HA或NA多肽可以是天然存在的或从天然改变的。在一些实施方案中，HA来自H1-H18中的任一种。在一些实施方案中，NA来自N1-N11中的任一种。
在一些实施方案中，HA多肽包含HA胞外结构域。HA胞外结构域可能来自任何流感亚型，包括H1-H18。
在一些实施方案中，HA多肽包含HA的茎区。HA的茎区可以来自任何流感亚型，包括H1-H18。
在一些实施方案中，HA多肽来自甲型流感病毒。甲型流感病毒可以是A/波多黎各/1934、A/Weiss/1/1943、A/蒙茅斯堡/1/1947(FM47)、A/马来西亚/302/54(MAL54)、A/丹佛/1/1957(DV57)、A/新泽西州/8/1976、A/USSR/90/1977、A/香港/117/1977(HK77)、A/巴西/11/1978、A/智利/1/1983、A/台湾/1/1986、A/德克萨斯州/36/1991、A/北京/262/1995、A/新喀里多尼亚/20/1999(NC99)、A/所罗门群岛/6/2006、A/布里斯班/59/2007、A/加利福尼亚/07/2009(CA09)、A/孟加拉国/2021/2012或A/越南/3050/2013。
在一些实施方案中，HA多肽来自H1流感病毒。在一些实施方案中，H1病毒是A/南卡罗来纳州/1/18。
在一些实施方案中，HA多肽来自H2流感病毒。在一些实施方案中，H2病毒是1957大流行性H2N2甲型流感病毒。
在一些实施方案中，HA多肽来自H3流感病毒。在一些实施方案中，H3流感病毒是H3N8病毒。在一些实施方案中，H3N8病毒是马俄亥俄州2003。在一些实施方案中，H3N8病毒是马巴里2005。在一些实施方案中，H3N8病毒是马阿博因2003。在一些实施方案中，H3流感病毒是H3N2病毒。在一些实施方案中，H3N2病毒是伯斯2009。在一些实施方案中，H3N2病毒是维多利亚2011。
在一些实施方案中，HA多肽来自H5流感病毒。在一些实施方案中，H5流感病毒是H5/N1病毒。在一些实施方案中，H5/N1病毒是印度尼西亚2005。在一些实施方案中，H5/N1病毒是斑头雁2005。在一些实施方案中，H5/N1病毒是大天鹅2005。在一些实施方案中，H5/N1病毒是野鸭/华东2003。
在一些实施方案中，HA多肽来自乙型流感病毒。在一些实施方案中，乙型病毒是威斯康星州2010。在一些实施方案中，乙型病毒是马萨诸塞州2012。在一些实施方案中，乙型病毒是普吉岛2013。在一些实施方案中，乙型病毒是布里斯班2008。在一些实施方案中，布里斯班2008序列包含D197N突变。发现此突变改善了此纳米颗粒的表达，并且在其他株系(如B/布里斯班/2009和B/普吉岛/2013)中是天然存在的突变。此氨基酸可参与接触唾液酸受体。
在一些实施方案中，HA多肽包含根据Giles BM和Ross TM Vaccine 29(16):3043-54(2011)或Carter DM等人,J Virol 90:4720-4734(2016)的实施例产生的计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)。
在一些实施方案中，从人H1N1流感序列产生COBRA序列。在一些实施方案中，从跨越1999-2012的人H1N1流感序列产生COBRA序列。从跨越1999-2012的人H1N1流感序列产生的示例性COBRA序列是包含在SEQ ID NO:29中的COBRA X6。在一些实施方案中，从跨越1933-1957年和2009-2011年的人H1N1株系加上来自1931-1998年的猪H1N1流感株系产生COBRA序列。从跨越1933-1957年和2009-2011年的人H1N1株系加上来自1931-1998年的猪H1N1流感株系产生的示例性COBRA序列是包含在SEQ ID NO:27中的COBRA P1。
在一些实施方案中，COBRA序列是X3。在一些实施方案中，COBRA序列是从H5N1产生的hCOBRA-2。
消除HA受体结合位点的突变(Y98F)在Whittle等人,Journal of Virology 11(8):4047-4057(2014)中进行了描述。在一些实施方案中，HA多肽包含Y98F突变。上文提出的任何HA可以被修饰为包含Y98F突变。在一些实施方案中，HA来自H1/新喀里多尼亚/1999(NC99)病毒，并且包含Y98F突变。
2.铁蛋白
铁蛋白蛋白自组装成包含多个单独单体的球状蛋白复合物。自组装的铁蛋白复合物可以称为铁蛋白颗粒或纳米颗粒。
铁蛋白基因存在于许多物种中，并且尽管有序列变异，但通常显示出高度保守的α-螺旋结构。这样，任何铁蛋白都可以用于本发明，包括细菌、昆虫和人铁蛋白，但是其与任何特别描述的铁蛋白具有序列同一性。
在一些实施方案中，铁蛋白是细菌、昆虫、真菌、鸟类或哺乳动物的。在一些实施方案中，铁蛋白是人的。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌的。在一些实施方案中，铁蛋白是幽门螺杆菌铁蛋白。
在一些实施方案中，铁蛋白是轻链和/或重链铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是任选地具有本文所述的一种或多种修饰的人重链铁蛋白(FTH1，GENE ID No:2495)或人轻链铁蛋白(FTL，GENE ID No:2512)。在一些实施方案中，铁蛋白是任选地具有本文所述的一个或多个突变的粉纹夜蛾重链铁蛋白(GenBank：AY970291.1)或粉纹夜蛾轻链铁蛋白(AY970292.1)。在一些实施方案中，铁蛋白纳米颗粒包含重链铁蛋白和轻链铁蛋白的24个总亚基，例如12个重链亚基和12个轻链亚基。在一些实施方案中，铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
在一些实施方案中，提供了包含流感多肽的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述流感多肽的长度足以使所述分子具有关于流感多肽的抗原性。
在一些实施方案中，抗原性铁蛋白多肽包含轻链铁蛋白和流感多肽。在一些实施方案中，抗原性铁蛋白多肽包含重链铁蛋白和流感多肽。在一些实施方案中，可以将轻链铁蛋白和流感多肽与不具有流感多肽的重链铁蛋白组装。在一些实施方案中，可以将重链铁蛋白和流感多肽与不具有流感多肽的轻链铁蛋白组装。不具有非铁蛋白多肽(例如，流感多肽)的铁蛋白可以称为“裸铁蛋白”。
在一些实施方案中，抗原性流感-铁蛋白多肽包含重链铁蛋白和流感多肽，或轻链铁蛋白和流感多肽。可以组合此类多肽以允许在单一铁蛋白多聚体或颗粒上表达两种相同或不同的流感多肽。在一些实施方案中，两种不同的流感多肽从两种不同的感染原(例如，不同株系或类型的流感)获得，并且附接至用于组装成纳米颗粒的重链和轻链铁蛋白。
在一些实施方案中，抗原性铁蛋白多肽包含与轻链铁蛋白和第二流感多肽一起组装的重链铁蛋白和第一流感多肽以产生二价疫苗。在一些实施方案中，铁蛋白是具有本文所述的一个或多个突变的幽门螺杆菌铁蛋白(对于示例性幽门螺杆菌铁蛋白序列参见SEQID NO:208或209)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白(或其他细菌铁蛋白)与人铁蛋白之间较低的序列同源性在用作疫苗平台时可降低自身免疫的潜力(参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，铁蛋白是具有本文所述的一个或多个突变的激烈火球菌铁蛋白(NCBI seq WP_011011871.1)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含与野生型铁蛋白具有大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％同一性的序列。
a)铁蛋白突变
在一些实施方案中，本文公开了包含一个或多个突变的铁蛋白。在一些实施方案中，一个或多个突变包括野生型铁蛋白的氨基酸序列的改变和/或例如在N或C末端的插入。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白相比，(在一些实施方案中，除了任何N末端插入)，铁蛋白中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个不同的氨基酸被突变。一个或多个突变可以改变铁蛋白的功能特性，例如，如下文详细讨论的。通常，突变简单地是指相对于相应的野生型铁蛋白的序列差异(如取代、添加或缺失的一个或多个氨基酸残基)。
(1)用于缀合的半胱氨酸
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以提供用于缀合免疫刺激部分和/或流感多肽的化学处理。这可以通过用半胱氨酸置换表面暴露的非半胱氨酸氨基酸的突变来实现。为了避免疑问，如“用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸”的语言必定意味着野生型或突变前序列中的表面暴露的氨基酸不是半胱氨酸。提供用于缀合免疫刺激部分或流感多肽的化学处理的另一种方法是包括在铁蛋白的N或C末端的氨基酸区段(如接头)，其中所述氨基酸区段包含半胱氨酸。在一些实施方案中，此半胱氨酸(无论是置换表面暴露的氨基酸还是在N或C末端接头中)是不成对的，这意指它没有合适的伴侣半胱氨酸来形成二硫键。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的二级结构。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的三级结构。
在一些实施方案中，此半胱氨酸可以用于将药剂(如免疫刺激部分)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，此半胱氨酸提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白上的此半胱氨酸缀合的药剂暴露在组装的铁蛋白颗粒的表面上。在一些实施方案中，在组装铁蛋白颗粒的同时，此半胱氨酸可以在给予后与受试者的分子和细胞相互作用。
在一些实施方案中，此半胱氨酸的存在允许缀合一个或多个免疫刺激部分，例如佐剂。在一些实施方案中，在不存在此半胱氨酸的情况下不会发生免疫刺激部分的缀合。
在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸选自幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S72、A75、K79、S100和S111。因此，在一些实施方案中，被置换为半胱氨酸的表面暴露的氨基酸是对应于幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S26、S72、A75、K79、S100或S111的氨基酸残基。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸可以选自对应于人轻链铁蛋白的S3、S19、S33、I82、A86、A102和A120的氨基酸。在一些实施方案中，基于以下理解来选择要被半胱氨酸置换的表面暴露的氨基酸：如果天然氨基酸被半胱氨酸置换，它将在组装的铁蛋白多聚体或颗粒中是反应性的和/或此半胱氨酸不会破坏铁蛋白多聚体或颗粒的稳定性和/或此半胱氨酸不会导致铁蛋白表达水平降低。
在一些实施方案中，铁蛋白包含E12C突变。在一些实施方案中，E12C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，E12C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的E12C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个E12C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S26C突变。在一些实施方案中，S26C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S26C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S26C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S26C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S72C突变。在一些实施方案中，S72C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S72C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S72C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S72C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含A75C突变。在一些实施方案中，A75C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，A75C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的A75C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个A75C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含K79C突变。在一些实施方案中，K79C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，K79C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的K79C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个K79C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S100C突变。在一些实施方案中，S100C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S100C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S100C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S100C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S111C突变。在一些实施方案中，S111C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或流感多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S111C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S111C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S111C残基(每个单体中一个)。
(2)内部半胱氨酸的去除
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变。去除天然内部半胱氨酸残基可以确保每个铁蛋白单体只有一个未配对的半胱氨酸，并且避免了不希望的反应(如二硫化物形成)，并且可以导致更稳定且高效的结果(例如，佐剂呈递)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白的C31被非半胱氨酸氨基酸置换。在一些实施方案中，用丝氨酸(C31S)置换幽门螺杆菌铁蛋白的C31，但是可以使用任何非半胱氨酸残基，例如丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，被置换为非半胱氨酸的内部半胱氨酸是与幽门螺杆菌铁蛋白的C31对齐的氨基酸残基。显示C31S突变的示例性铁蛋白序列在SEQ IDNO:201-207中示出。在一些实施方案中，当铁蛋白中存在多于一个内部半胱氨酸时，两个或更多个(例如，每个)内部半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸置换，所述非半胱氨酸氨基酸如丝氨酸或选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺的氨基酸。
(3)糖基化
人相容性糖基化可有助于重组药物产品的安全性和功效。监管批准可能取决于证明适当的糖基化是关键的质量属性(参见Zhang等人,Drug Discovery Today 21(5):740-765(2016))。N-聚糖可以由天冬酰胺侧链的糖基化产生，并且在人与其他生物体(如细菌和酵母)之间的结构可能不同。因此，可能期望减少或消除根据本公开文本的铁蛋白中的非人糖基化和/或N-聚糖形成。在一些实施方案中，控制铁蛋白的糖基化改善了组合物的功效和/或安全性，尤其是当用于人疫苗接种时。
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以抑制N-聚糖的形成。在一些实施方案中，与其相应的野生型铁蛋白相比，突变的铁蛋白具有降低的糖基化。
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变。在一些实施方案中，表面暴露的天冬酰胺是幽门螺杆菌铁蛋白的N19或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置。在一些实施方案中，使这种天冬酰胺(例如幽门螺杆菌铁蛋白的N19)突变降低了铁蛋白的糖基化。在一些实施方案中，突变是用谷氨酰胺置换了天冬酰胺。在一些实施方案中，铁蛋白是包含N19Q突变的幽门螺杆菌铁蛋白。SEQ ID NO:201-207是包含N19Q突变的示例性铁蛋白序列。
暴露于细菌或酵母中产生的糖基化蛋白的哺乳动物可能会对糖基化蛋白产生免疫应答，因为细菌或酵母中给定蛋白的糖基化模式可能与哺乳动物中相同蛋白的糖基化模式不同。因此，一些糖基化的治疗性蛋白质可能不适合在细菌或酵母中生产。
在一些实施方案中，通过氨基酸突变进行的铁蛋白糖基化减少有利于蛋白质在细菌或酵母中的产生。在一些实施方案中，减少的铁蛋白糖基化降低了在给予在细菌或酵母中表达的突变铁蛋白后在哺乳动物中产生不利影响的可能性。在一些实施方案中，因为糖基化减少，所以在细菌或酵母中产生的突变铁蛋白在人受试者中的反应原性降低。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白相比，用具有减少的糖基化的突变铁蛋白治疗后，人受试者中超敏反应的发生率较低。
在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中的降解较慢。在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中具有降低的清除率。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物具有更长的血清半衰期。
(4)突变的组合
在一些实施方案中，铁蛋白包含本文所述的多于一种类型的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含一种或多种独立地选自以下项的突变：减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。
在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和E12C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S72C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和A75C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和K79C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S100C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S111C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含对应于前述突变组中的任一种的突变，其中相应的突变在通过铁蛋白氨基酸序列与幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:208或209)的成对比对确定的位置处将N改变为Q、将C改变为S，并且将非半胱氨酸表面暴露的氨基酸改变为半胱氨酸。
包含多于一种类型的突变的示例性铁蛋白提供于SEQ ID NO:201-207中。
3.接头
流感多肽和铁蛋白可以经由接头连接以提供抗原性流感铁蛋白多肽。在一些实施方案中，接头将流感多肽的氨基酸序列与铁蛋白的氨基酸序列分开。可以使用任何接头。在一些实施方案中，铁蛋白经由肽接头连接至HA多肽。这可以有利于抗原性铁蛋白多肽作为融合蛋白的表达(例如，从单一开放阅读框)。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是GS、GGGS(SEQ ID NO:226)、2XGGGS(SEQ IDNO:227)(即，GGGSGGGS(SEQ ID NO:227))或5XGGGS(SEQ ID NO:228)。接头可以在铁蛋白的N或C末端。
在一些实施方案中，接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约2-4、2-6、2-8、2-10、2-12或2-14个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少35个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少40个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于60个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于50个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约16、28、40、46或47个氨基酸。在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头包含半胱氨酸，例如以用作用于缀合免疫刺激部分(例如，佐剂)的位点；包含半胱氨酸的示例性接头提供为SEQ ID NO:225。在一些实施方案中，接头包含与SEQID NO:225具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列，并且进一步包含对应于SEQ ID NO:225中的半胱氨酸的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含至少25个氨基酸(例如，25至60个氨基酸)，其中半胱氨酸位于在自N末端的第8个氨基酸到自C末端的第8个氨基酸范围内的位置处，或位于接头的中心残基或键的10个氨基酸之内。
在一些实施方案中，接头包含甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)氨基酸。在一些实施方案中，接头包含以下项或由以下项组成：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)和/或丙氨酸(A)氨基酸以及任选的如本文所讨论的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:222具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是GGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:220)、GGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:221)、GGSGSAS SGASASGSSNGSGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:222)或GS。在一些实施方案中，接头是FR1(SEQ ID NO:223)或FR2(S EQ ID NO:224)。
在一些实施方案中，铁蛋白包括具有牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的幽门螺杆菌铁蛋白(其将被称为杂合铁蛋白)。在一些实施方案中，此杂合铁蛋白形成具有均匀分布在表面上的流感多肽附接位点的多聚体(参见Kanekiyo 2015)。在一些实施方案中，具有杂合铁蛋白的N末端融合蛋白允许流感多肽在铁蛋白纳米颗粒表面上的呈递。在一些实施方案中，铁蛋白在对应于SEQ ID NO:208(杂合铁蛋白，其包含此谷氨酸)的位置13或在SEQ IDNO:209(野生型幽门螺杆菌铁蛋白，其中位置6是异亮氨酸)中的位置6的位置处包含谷氨酸。与牛蛙接头结合时，此谷氨酸被认为可以保留人和牛蛙铁蛋白中发现的保守盐桥(人轻链和牛蛙低级亚基铁蛋白中的6R和14E)。参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，流感多肽经由半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头连接至铁蛋白。在一些实施方案中，此接头用于经由点击化学将部分(例如，免疫刺激部分或流感多肽)直接缀合至铁蛋白。包含半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的示例性序列是SEQ ID NO:218。本文讨论了适合于涉及半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的缀合反应的点击化学。
在一些实施方案中，将包含半胱氨酸作为免疫刺激部分(如佐剂)的缀合位点的接头用于包含缺乏不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中，或用于包含含有不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中。
在一些实施方案中，构建体不包含接头。在一些实施方案中，构建体包含一个接头。在一些实施方案中，构建体包含两个或多于两个的接头。
4.结构比对
如本文所讨论，可以通过成对或结构比对来鉴定对应于关于给定多肽(例如，幽门螺杆菌铁蛋白)描述的那些的突变位置。结构比对与大型蛋白质家族(如铁蛋白)有关，在大型蛋白质家族中，尽管有相当大的序列变异，但蛋白质共享相似的结构并且家族的许多成员已在结构上进行了表征；并且还可以用于鉴定本文所述的其他多肽(如流感多肽(例如，血凝素))的不同形式中的相应位置。蛋白质数据库(PDB)包括许多铁蛋白的3D结构，包括下文用其登录号列出的那些。
2jd6、2jd7–PfFR-激烈火球菌。2jd8–PfFR+Zn。3a68–来自基因SferH4的soFR–大豆。3a9q-来自基因SferH4的soFR(突变体)。3egm、3bvf、3bvi、3bvk、3bvl–HpFR–幽门螺杆菌。5c6f–HpFR(突变体)+Fe。1z4a、1vlg–FR–海栖热袍菌(Thermotoga maritime)。1s3q、1sq3、3kx9–FR–闪烁古生球菌(Archaeoglubus fulgidus)。1krq–FR–空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。1eum-EcFR–大肠杆菌。4re u–EcFR+Fe。4xgs–EcFR(突变体)+Fe2O2。4ztt–EcFR(突变体)+Fe2O+Fe2+Fe+O2。1qgh–LiFR-英诺克李斯特菌(Listeria innocua)。3qz3-VcFR–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。3vnx–FR–孔石莼(Ulva pertusa)。4ism、4isp、4itt、4itw、4iwj、4iwk、4ixk、3e6s–PnmF R–多列拟菱形藻(Pseudo-nitschiamultiseries)。4zkh、4zkw、4zkx、4zl5、4zl6、4zlw、4zmc–PnmFR(突变体)+Fe。1z6o–FR–粉纹夜蛾。4cmy–FR+Fe–花柱绿杆菌(Chlorobaculum tepidum)。铁蛋白轻链(F TL)。1lb3、1h96–mFTL–小鼠。1rcc、1rcd、1rci–bFTL+酒石酸盐+Mg。1rce、1rcg-bFTL+酒石酸盐+Mn。3noz、3np0、3np2、3o7r–hoFTL(突变体)-马。3o7s、3u90-hoFTL。4v1w–hoFTL–低温EM。3rav、3rd0–hoFTL+巴比妥酸盐。铁蛋白轻+重链：5gn8–hFTH+Ca。
结构比对涉及通过以下方式来鉴定两个(或更多个)多肽序列中的相应残基：(i)使用第二序列的已知结构对第一序列的结构建模或(ii)比较两者均已知的第一序列和第二序列的结构，并且鉴定第一序列中与第二序列中的目的残基最相似定位的残基。在一些算法中，基于叠加结构中的α-碳距离最小化(例如，哪组成对α碳为比对提供最小的均方根偏差)鉴定出相应的残基。当鉴定非幽门螺杆菌铁蛋白中的对应于关于幽门螺杆菌铁蛋白描述的位置的位置时，幽门螺杆菌铁蛋白可以是“第二”序列。在目的幽门螺杆菌铁蛋白没有已知的可用结构，但相比于幽门螺杆菌铁蛋白与另一种具有已知结构的非幽门螺杆菌铁蛋白紧密相关的情况下，可能最有效的是使用紧密相关的非幽门螺杆菌铁蛋白的已知结构来对目的非幽门螺杆菌铁蛋白建模，然后将该模型与幽门螺杆菌铁蛋白结构进行比较，以鉴定目的铁蛋白中的期望的相应残基。关于结构建模和比对有大量文献，代表性的披露文本包括US 6859736；US 8738343；以及Aslam等人,Electronic Journal of Biotechnology20(2016)9–13中引用的内容。对于基于已知的一种或多种相关结构对结构建模的讨论，参见例如Bordoli等人,Nature Protocols 4(2009)1–13及其中引用的参考文献。
5.免疫刺激部分；佐剂；缀合的流感多肽
在一些实施方案中，将流感多肽和/或免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸或接头。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是半胱氨酸，例如，由上文讨论的突变产生的半胱氨酸。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。使用戊二醛(用于将赖氨酸与带氨基的接头或部分缀合)或碳二亚胺(例如用于将天冬氨酸或谷氨酸与带氨基的接头或部分或将赖氨酸与带羧基的接头或部分缀合的1-环己基-3-(2-吗啉-4-基-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(EDC；EDAC))的缀合程序例如描述于可从万维网springer.com获得的Holtzhauer,M.,BasicMethods for the Biochemical Lab,Springer 2006,ISBN 978-3-540-32785-1的第四章中。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将多于一个免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将二十四个免疫刺激部分附接至铁蛋白多聚体或颗粒(例如，幽门螺杆菌铁蛋白颗粒中每个单体有一个部分)。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是相同的。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是不相同的。
a)免疫刺激部分的类型；佐剂
可以附接至表面暴露的氨基酸(例如半胱氨酸)的任何免疫刺激部分都可以用于根据本公开文本的铁蛋白中。在一些实施方案中，免疫刺激部分是B细胞激动剂。
在一些实施方案中，免疫刺激部分不是疏水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是亲水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是极性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分能够进行氢键结合或离子键结合，例如包含氢键供体、氢键受体、阳离子部分或阴离子部分。如果部分在生理上相关的pH(如pH 6、7、7.4或8)下在水性溶液中将被离子化，则可以认为所述部分是阳离子或阴离子的。
在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。在一些实施方案中，佐剂包括病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，佐剂是Toll样受体(TLR)激动剂，或干扰素基因刺激物(STING)激动剂。在一些实施方案中，佐剂激活B和/或T细胞中的TLR信号传导。在一些实施方案中，佐剂调节适应性免疫应答。
(1)TLR2激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR2信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR2激动剂是PAM2CSK4、FSL-1或PAM3CSK4。
(2)TLR7/8激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8激动剂(即，TLR7和TLR8中至少一者的激动剂)。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR7和/或TLR8信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是单链的(ssRNA)。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是核苷类似物。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉胺Toll样受体(TLR)激动剂，如3M-012(3M Pharmaceuticals)。游离3M-012的结构是：
Figure BDA0002796790780000321
应当理解的是，可以通过以下方式将免疫刺激部分(如3M-012)或本文所讨论的任何部分缀合至铁蛋白：用与本文所述的铁蛋白例如在表面暴露的半胱氨酸的硫处的键或与附接至这个硫的接头的键取代所述部分的适当的外围原子(例如氢)。因此，当缀合至铁蛋白时，免疫刺激部分的结构将与游离分子的结构略有不同。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是SM 7/8a。游离SM 7/8a的结构是：
Figure BDA0002796790780000322
参见，例如Nat Biotechnol.2015年11月；33(11):1201-10.doi:10.1038/nbt.3371。
(3)TLR9激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR9信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR9激动剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是未甲基化的CpG ODN。在一些实施方案中，CpG ODN包含部分或完整的硫代磷酸酯(PS)主链，而不是普通DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)主链。
在一些实施方案中，CpG ODN是B类ODN，其包含一个或多个含有5'嘌呤(Pu)-嘧啶(Py)-C-G-Py-Pu 3'的6聚体CpG基序；具有完全硫代磷酸化(即PS改性)的主链；并且长度为18-28个核苷酸。在一些实施方案中，CpG ODN包含SEQ ID NO:210的序列，任选地包含在主链中的硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，TLR9激动剂包含免疫刺激序列(ISS)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是ISS-1018(Dynavax)(SEQ ID NO:210)。
(4)STING激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING(干扰素基因蛋白的刺激物，也称为内质网IFN刺激物)激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激STING信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，STING激动剂是环状二核苷酸(CDN)。参见，例如Danilchanka等人,Cell 154:962-970(2013)。示例性CDN包括cdA、cdG、cAMP-cGMP和2'-5',3'-5'cGAMP(对于结构，参见Danilchanka等人)。STING激动剂还包括合成激动剂，如DMXAA
Figure BDA0002796790780000331
b)缀合的流感多肽
在一些实施方案中，流感多肽缀合至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，流感多肽单独地具有抗原性，而在一些实施方案中，流感多肽由于其与铁蛋白的缔合而具有抗原性。流感多肽可以是本文所述的流感多肽中的任一种。
c)缀合
在一些实施方案中，表面暴露的半胱氨酸(例如，由本文所述的突变产生)或附接至铁蛋白(例如，在铁蛋白的N末端)的肽接头中的半胱氨酸用于将免疫刺激部分(如佐剂)或流感多肽缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，接头与这种半胱氨酸缀合，可以随后将所述接头缀合至免疫刺激部分(如佐剂)或流感多肽。在一些实施方案中，这种半胱氨酸产生用于缀合反应以附接佐剂、接头或流感多肽的化学处理。在一些实施方案中，产生了生物缀合物，其中在还原这种半胱氨酸后将免疫刺激部分(如佐剂)或流感多肽连接至铁蛋白。在一些实施方案中，半胱氨酸是不成对的表面暴露的半胱氨酸，即所述半胱氨酸缺乏适当位置的伴侣半胱氨酸来形成二硫键。在一些实施方案中，半胱氨酸是包含游离硫醇侧链的不成对半胱氨酸。
(1)缀合化学的类型
可以使用任何类型的化学，例如经由表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)或另一种氨基酸(如Lys、Glu或Asp)的反应，来将免疫刺激部分(如佐剂)或流感多肽缀合至铁蛋白。
在一些实施方案中，使用点击化学进行缀合。如本文所用，“点击化学”是指彼此快速且选择性地反应(即，“点击”)的一对官能团之间的反应。在一些实施方案中，点击化学可以在温和的水性条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应利用铁蛋白表面上的半胱氨酸(如由表面暴露的氨基酸突变产生的半胱氨酸)来使用可与所述半胱氨酸反应的官能团进行点击化学。
满足点击化学标准的多种反应在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可以使用许多公布的方法中的任何一种(参见，例如Hein等人,Pharm Res 25(10):2216-2230(2008))。可以使用众多种可商购的点击化学试剂，如来自Sigma Aldrich、JenaBioscience或Lumiprobe的那些。在一些实施方案中，如以下实施例中所述那样使用点击化学进行缀合。
在一些实施方案中，点击化学反应在铁蛋白还原之后发生。
在一些实施方案中，点击化学可以是1步式点击反应。在一些实施方案中，点击化学可以是2步式点击反应。
在一些实施方案中，一个或多个反应包括无金属点击化学。在一些实施方案中，一个或多个反应包括硫醇-马来酰亚胺和/或二硫化物交换。
无金属点击化学
可以将无金属点击化学用于缀合反应以避免蛋白质的潜在氧化。无金属点击化学已被用于形成抗体缀合物(参见van Geel等人,Bioconjugate Chem.2015,26,2233-2242)。
在一些实施方案中，在反应中使用无金属点击化学以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，在反应中使用无铜缀合以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，无金属点击化学使用双环[6.1.0]壬炔(BCN)。在一些实施方案中，无金属点击化学使用二苯并氮杂环辛炔(DBCO)。在一些实施方案中，BCN或DBCO与叠氮化物基团反应。
DBCO在不存在催化剂的情况下经由应变促进的点击反应对叠氮化物基团具有高特异性，从而产生高产率的稳定三唑。在一些实施方案中，DBCO在不存在铜催化剂的情况下与叠氮化物反应。
在一些实施方案中，在1步式点击反应中使用无金属点击化学。在一些实施方案中，在2步式点击反应中使用无金属点击化学。
硫醇-马来酰亚胺和二硫化物交换
本文所述的铁蛋白可以包含含有硫醇(也称为巯基)的半胱氨酸，其可用于与巯基反应性化学基团反应(或其可通过还原而变为可用的)。因此，半胱氨酸允许化学选择性修饰以将免疫刺激部分(如佐剂)添加至铁蛋白。在碱性条件下，半胱氨酸将被去质子化以产生硫醇盐亲核体，所述硫醇盐亲核体可以与软亲电体(如马来酰亚胺和碘乙酰胺)反应。半胱氨酸与马来酰亚胺或碘乙酰胺的反应产生碳-硫键。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的表面暴露的半胱氨酸或铁蛋白接头中的半胱氨酸反应。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物或TNB-硫醇。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过烷基化(即形成硫醚键)与半胱氨酸的巯基缀合。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过二硫化物交换(即形成二硫键)与半胱氨酸的巯基缀合。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)缀合至铁蛋白的反应是硫醇-马来酰亚胺反应。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺与半胱氨酸的反应导致形成稳定的硫酯连接，例如不可逆的硫酯连接。在一些实施方案中，马来酰亚胺不与铁蛋白中的酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。在一些实施方案中，未反应的马来酰亚胺在反应结束时通过添加例如过量的游离硫醇来淬灭。
在一些实施方案中，使免疫刺激部分(如佐剂)与铁蛋白缀合的反应是硫醇-二硫化物交换，也称为二硫化物互换。在一些实施方案中，反应涉及形成包含一部分原始二硫化物的混合二硫化物。在一些实施方案中，原始二硫化物是通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而在铁蛋白中引入的半胱氨酸。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是吡啶基二硫醇。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是TNB-硫醇基团。
(2)接头
在一些实施方案中，免疫刺激部分(如佐剂)或流感多肽经由与表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)共价结合的接头附接至铁蛋白。在一些实施方案中，接头包含聚乙二醇，例如PEG接头。在一些实施方案中，聚乙二醇(例如PEG)接头增加了与免疫刺激部分(如佐剂)连接的铁蛋白的水溶性和连接效率。PEG接头的长度在2至18个PEG之间，例如PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14、PEG15、PEG16、PEG17和PEG18。
在一些实施方案中，接头包含马来酰亚胺。在一些实施方案中，接头包含免疫刺激部分(ISM)-接头-马来酰亚胺的组分。在一些实施方案中，通过马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，以1步式点击化学反应将ISM-接头-马来酰亚胺缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，佐剂-接头-马来酰亚胺的ISM是SM7/8a。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺的接头是PEG4。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺是SM7/8a-PEG4-马来酰亚胺。
在一些实施方案中，用下述接头使用2步式点击化学方案，所述接头在一端包含巯基反应性化学基团，并且在另一端包含胺反应性基团。在这种2步式点击化学方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的半胱氨酸反应，而胺反应性基团与附接至ISM的试剂反应。以这种方式，ISM经由一组2种点击化学试剂缀合至铁蛋白。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，马来酰亚胺与通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而引入铁蛋白中的半胱氨酸反应。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，胺反应性基团是DBCO。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，DBCO与附接至ISM的叠氮化物基团反应。
在一些实施方案中，使用马来酰亚胺-接头-DBCO。在一些实施方案中，在铁蛋白还原后，将马来酰亚胺-接头-DBCO缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，通过在第一步中马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，将马来酰亚胺-接头-试剂缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，DBCO用于与附接至叠氮化物的ISM连接。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的ISM是ISS-1018。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的佐剂是3M-012或CpG。
在一些实施方案中，将具有反应性基团的接头添加至ISM。在一些实施方案中，接头是PEG4-叠氮化物接头或PEG4-马来酰亚胺接头。
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至3M-012。缀合至PEG4-叠氮化物接头的3M-012的示例性结构为：
Figure BDA0002796790780000371
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-叠氮化物接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002796790780000381
在一些实施方案中，PEG4-马来酰亚胺接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-马来酰亚胺接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002796790780000382
在一些实施方案中，叠氮化物基团缀合至ISS-1018。缀合至NHS酯-叠氮化物接头的ISS-1018的示例性结构为：
Figure BDA0002796790780000383
C.示例性组合物、试剂盒、核酸、用途和方法
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含本文所述的抗原性多肽中的任何一种或多种和药学上可接受的媒介物、佐剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本发明提供了针对流感感染免疫受试者的方法。本发明进一步提供了在受试者中引发针对流感的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本方法包括向受试者给予有效量的本文所述的抗原性流感-铁蛋白多肽或纳米颗粒。
在一些实施方案中，将本文所述的抗原性多肽或组合物给予至受试者(如人)，以产生针对将来的流感感染的保护性免疫应答。在一些实施方案中，给予了包含SEQ ID NO:1-43中任一个的抗原性多肽。
在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了住院的发生率。在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了实验室确认的流感感染的发生率。
在一些实施方案中，可以向个体给予多于一种抗原性多肽以针对多种流感株系免疫，其中抗原性多肽的HA或NA多肽部分不同。给予可以是同时的或顺序的。在一些实施方案中，给予不同流感株系的两种HA或NA多肽。在一些实施方案中，给予不同流感株系的三种HA或NA多肽。在一些实施方案中，给予不同流感株系的四种HA或NA多肽。在一些实施方案中，给予不同流感株系的五种HA或NA多肽。在一些实施方案中，给予不同流感株系的多于五种HA或NA多肽。
1.受试者
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者是成人(大于或等于18岁)。在一些实施方案中，受试者是儿童或青少年(小于18岁)。在一些实施方案中，受试者是老年人(大于60岁)。在一些实施方案中，受试者是非老年人(大于或等于18岁且小于或等于60岁)。
在一些实施方案中，向受试者给予多于一次的组合物给予。在一些实施方案中，加强免疫给予改善了免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在哺乳动物，如灵长类动物(例如，非人灵长类动物，如猴子(例如，猕猴，如恒河猴或食蟹猴)或猿)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或驯养的哺乳动物(例如，犬、兔、猫、马、绵羊、牛、山羊、骆驼或驴)中使用。在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在鸟类，如禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、豚鼠或天鹅)中使用。
2.佐剂
如本文所述，佐剂可以经由表面暴露的氨基酸例如半胱氨酸缀合至铁蛋白。非缀合的佐剂也可以与本文所述的抗原性铁蛋白多肽一起给予至受试者。在一些实施方案中，与在不伴有佐剂的情况下给予单独的流感多肽或单独的抗原性铁蛋白多肽相比，与抗原性铁蛋白多肽一起给予佐剂在受试者中产生更高效价的针对流感多肽的抗体。佐剂可以促进对抗原性多肽的更早、更强效或更持久的免疫应答。
在一些实施方案中，组合物包含一种佐剂。在一些实施方案中，组合物包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，组合物不包含佐剂。
在一些实施方案中，佐剂包含铝。在一些实施方案中，佐剂是磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂是明矾(Alyhydrogel’85 2％；Brenntag–目录号21645-51-2)。
在一些实施方案中，佐剂是有机佐剂。在一些实施方案中，佐剂是油基佐剂。在一些实施方案中，佐剂是水包油纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含角鲨烯。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是Ribi(Sigma adjuvant system目录号S6322-1vl)、AddavaxTM MF59、AS03或AF03(参见US9703095)。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含聚丙烯酸聚合物(PAA)。在一些实施方案中，包含PAA的佐剂是SPA09(参见WO 2017218819)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油。在一些实施方案中，佐剂是不完全弗氏佐剂(IFA)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油和杀死的结核分枝杆菌。在一些实施方案中，佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)。
在一些实施方案中，佐剂是脂多糖。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰A(MPL或MPLA)。
3.药物组合物
在各种实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗原性铁蛋白多肽和/或相关实体。在一些实施方案中，药物组合物是能够引发免疫应答(如针对病原体的保护性免疫应答)的免疫原性组合物(例如，疫苗)。
例如，在一些实施方案中，药物组合物可以包含以下项中的一种或多种：(1)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和(ii)流感多肽；(2)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分；和(ii)流感多肽；(3)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)表面暴露的半胱氨酸，(ii)在铁蛋白蛋白的N末端的肽接头，和(iii)在肽接头的N末端的流感多肽；(4)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含：(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分，(ii)用非半胱氨酸氨基酸置换在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处的内部半胱氨酸的突变，或用非半胱氨酸氨基酸置换如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中与位置31类似的位置处的内部半胱氨酸的突变，(iii)用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，和(iv)流感多肽；或(5)包含前述铁蛋白蛋白中的任一种的铁蛋白颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽相关的抗体或其他药剂。在一个实施方案中，药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽结合和/或竞争的抗体。可替代地，抗体可以识别包含本文所述的抗原性多肽的流感多肽组分的病毒颗粒或细菌。
在一些实施方案中，将如本文所述的药物组合物单独给予或与一种或多种增强免疫应答的药剂(例如，以上所述的佐剂)组合给予。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含如上所述的佐剂。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用，术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在示例性实施方案中，载体可以包括无菌液体，例如像水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的油，例如像花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一种或多种固体组分。药学上可接受的载体还可包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。如本文所用，赋形剂是可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所希望的稠度或稳定作用的任何非治疗剂。合适的药物赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在各种实施方案中，药物组合物是无菌的。
在一些实施方案中，药物组合物含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物可以包含多种添加剂(如稳定剂、缓冲液或防腐剂)中的任何一种。此外，可以包含辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
在各种实施方案中，可以将药物组合物配制成适合任何所期望的给予方式。例如，药物组合物可以采取以下形式：溶液、悬浮液、乳剂、滴剂、片剂、丸剂、球剂、胶囊、含有液体的胶囊、明胶胶囊、粉末、缓释配制品、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉、冷冻悬浮液、干燥粉或任何其他适合使用的形式。在药剂的配制和生产中的一般考虑可以见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿,1995(通过引用并入本文)中。
可以经由任何给予途径来给予药物组合物。给予途径包括例如口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、经直肠、通过气管内滴注、支气管滴注、吸入、或局部方式。给予可为局部或全身的。在一些实施方案中，给予是口服进行的。在另一个实施方案中，给予是通过肠胃外注射。在一些情况下，给予导致本文所述的抗原性铁蛋白多肽释放到血流中。给予方式可以由从业者决定。
在一些实施方案中，药物组合物适合于肠胃外给予(例如静脉内、肌内、腹膜内和皮下)。可以将此类组合物配制成例如溶液、悬浮液、分散体、乳剂等。它们也可以以无菌固体组合物(例如冻干的组合物)的形式生产，所述无菌固体组合物可以在临使用前溶解或悬浮于无菌可注射介质中。例如，肠胃外给予可以通过注射来实现。在此类实施方案中，注射剂以常规形式制备，即作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、或作为乳剂。在一些实施方案中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、冻干粉末或颗粒制备。
在另一个实施方案中，将药物组合物配制成用于通过吸入递送(例如，用于直接递送至肺和呼吸系统)。例如，组合物可以采取鼻喷雾剂或任何其他已知的气雾剂配制品的形式。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施方案中，此类制剂可以具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12或约13微米的平均粒度。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂被配制为干粉。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂例如通过包含润湿剂而被配制为湿粉。在一些实施方案中，润湿剂选自水、盐水或其他处于生理pH的液体。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以滴剂的形式给予至鼻腔或颊腔。在一些实施方案中，剂量可以包含多滴(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5滴等)。
可以将本发明的药物组合物以适合于实现所期望结果的任何剂量给予。在一些实施方案中，所期望的结果是诱导针对病原体的持久的适应性免疫应答，所述病原体如存在于组合物中的抗原性铁蛋白多肽中的流感多肽的来源。在一些实施方案中，所期望的结果是降低一种或多种感染症状的强度、严重程度、频率和/或延迟一种或多种感染症状的发作。在一些实施方案中，所期望的结果是抑制或预防感染。所需的剂量将根据以下而在受试者之间有所不同：受试者的物种、年龄、体重和一般状况，被预防或治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物及其给予方式。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以单一剂量或多个剂量给予。在一些实施方案中，将药物组合物在不同日期以多个剂量给予(例如初免-加强免疫策略)。在一些实施方案中，将药物组合物作为加强免疫方案的一部分给予。
在各种实施方案中，将药物组合物与一种或多种另外的治疗剂共同给予。如果治疗剂的给予的时间安排使得另外的治疗剂和药物组合物中的一种或多种活性成分的药理活性在时间上重叠，从而发挥组合的治疗作用，则共同给予不需要同时给予治疗剂。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和时间表来给予。
4.核酸/mRNA
还提供了核酸，所述核酸编码本文所述的抗原性流感-铁蛋白多肽。在一些实施方案中，核酸是mRNA。出于本公开文本的目的，任何能够经历翻译而产生多肽的核酸被认为是mRNA。
5.试剂盒
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的一种或多种抗原性多肽、核酸、抗原性铁蛋白颗粒、组合物或药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂中的一种或多种。
***
此描述和示例性实施方案不应被视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有指示，否则在说明书和权利要求中使用的所有表达数量、百分比或比例的数字和其他数值应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰至已无法将其如此修饰的程度。“约”指示实质上不影响所述主题的特性的变化程度，例如在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的所需特性而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求范围的等价范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少考虑报告的有效数字的数量和通过应用普通四舍五入技术来解读。
注意，如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地并且清楚地限于一个/种指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的详述不排除可以取代或添加到所列项目的其他类似项目。除非上下文另有指示，否则术语“或”以包括性含义使用，即等同于“和/或”。
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实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开文本的范围。
1.对HA-铁蛋白纳米颗粒的设计、纯化和表征
通过以下方式来产生HA纳米颗粒(HA-Np)：将HA胞外结构域序列(缺乏48个C端跨膜残基)融合至铁蛋白的N末端以产生在哺乳动物细胞中自组装的纳米颗粒。铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变(由相对于SEQ ID NO:208的铁蛋白序列的S26C、A75C或S111C突变产生)，以允许将佐剂缀合至HA-Np上。这种半胱氨酸的表示呈现于图2中。
由上文所述的突变产生的半胱氨酸可用于缀合免疫刺激部分。图3A说明了使用马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a点击试剂将TLR激动剂缀合至铁蛋白的示例性1步式点击化学反应的结果。在此反应中，使马来酰亚胺与不成对半胱氨酸反应，以经由中间接头将TLR7/8激动剂分子在表面暴露的半胱氨酸处共价缀合至铁蛋白，从而产生共价的TLR7/8-激动剂-铁蛋白缀合物。在此例子中，指示了在一个单体的表面上的一个半胱氨酸。铁蛋白纳米颗粒是多聚体，例如由24个单体组成。因此，铁蛋白纳米颗粒可以包含等于单体数量的表面暴露的半胱氨酸数量，并且每个表面暴露的半胱氨酸可以被缀合。
图3B和图4A至图4B说明了可以用于将佐剂缀合至铁蛋白纳米颗粒的示例性2步式点击化学，并且说明了CpG和3M-012(有时也称为3M012)也可经由中间双官能接头通过2步式点击化学反应缀合至铁蛋白的方式。示例性接头是含有马来酰亚胺和DBCO反应性基团的Sigma PEG接头(目录号760676)。在此例子中，TLR激动剂被反应性叠氮化物基团官能化。
将质谱(MS)用于以下所述的实验中，以表征伴有和不伴有缀合的免疫刺激部分的流感-铁蛋白。在一些情况下，进行MS的分析物是流感-铁蛋白的胰蛋白酶消化物。胰蛋白酶通常会在赖氨酸和精氨酸残基之后切割，除非在之后是脯氨酸时不切割。然而，结构化的纳米颗粒(在所指示的胰蛋白酶位点的C末端)是抗蛋白水解的。在图5中指示了在天然条件下牛蛙-幽门螺杆菌铁蛋白构建体(如SEQ ID NO:14)中的可以被胰蛋白酶切割的最远(C末端)胰蛋白酶位点。因此，胰蛋白酶消化物释放出适于MS分析的抗蛋白水解的铁蛋白颗粒。
因此，在接头序列是胰蛋白酶可接近的情况下，可以使用胰蛋白酶消化之后进行简化的MS分析(而不管未切割多肽中存在的N末端抗原如何)，以评价与纳米颗粒的缀合。设计此方法以克服糖蛋白抗原对MS分析造成的复杂性。例如，H1/茎-Np原本只有在PNGase处理后才可以通过MS分析(图8A)。
将来自以下流感株系的HA序列与幽门螺杆菌-牛蛙杂合铁蛋白的N末端在基因上融合，以构建HA-纳米颗粒：A/蒙茅斯堡/1-JY2/1947(Ge nBank CY147342，氨基酸1-518，Y108F)；A/马来西亚/302/1954(GenBan k CY009340.1，氨基酸1-518，Y108F)；A/丹佛/1957(GenBank CY008988，氨基酸1-517，Y108F)；A/香港/117/1977(GenBank CY009292，氨基酸1-518，Y108F)；A/新喀里多尼亚/20/99(GenBank AHJ09883.1，氨基酸1-518)；A/加利福尼亚/4/2009(GenBank AHJ09884.1，氨基酸1-518)；COBRA P1(美国专利公开案US20150017196A1中的SEQ ID NO:2，氨基酸1-518，Y 108F)和COBRA X6(美国专利公开案US20140127248A1，氨基酸1-517，Y 108F)。COBRA P1和COBRA X6是通过分层序列平均化的计算方法产生的(Carter DM,等人,J Virol 90:4720-4734(2016))。COBRA X6是从跨越1999-2012年的人H1N1流感序列产生的，并且COBRA P1是从跨越1933-1957年和2009-2011的人H1N1株系加上来自1931-1998年的猪H1N1流感株系产生的(Carter 2016)。将HA-铁蛋白基因克隆到SIB002载体的XbaI/BamHI位点中以进行哺乳动物表达，在ATG起始密码子前面具有gccacc kozak序列。对所有序列进行密码子优化以在人细胞系中表达。
将HA-Np质粒用Powerprep试剂盒(Origene目录号NP100009)纯化，并用于转染Expi293细胞(ThermoFisher目录号A14635)。将FectoPRO DNA转染试剂(Polyplus#116-100)在标准条件(0.5μg DNA/mL，0.75μl FectoPRO试剂/mL和0.45μl增强剂/mL)下使用。转染后4-6天，通过在4度下以3,488g离心15min从Expi293上清液收获纳米颗粒，并且将其通过0.45μm真空驱动的过滤器单元(Thermo Scientific目录号167-0045)进行过滤。使HA-Np通过重力流通过Q-Sepharose快速流动柱(GE目录号17051001)，并且收集流穿液并将其用水稀释3倍，并且通过添加终浓度为50mM的Tris缓冲液(pH 8.5)来调节pH；或将上清液用缓冲液A(50mM Tris pH 8.5，5mM NaCl)稀释5倍，而不使用初始Q-琼脂糖柱。然后将样品加载至Q-琼脂糖柱(HiTrap Q HP，GE目录号17115401)，并在NaCl梯度上洗脱蛋白质，其中使用缓冲液A(50mM Tris pH 8.5，5mM NaCl)和缓冲液B(50mM Tris，pH 8.5，1M NaCl)的0％-60％混合，经30个柱体积。收集HA-纳米颗粒蛋白质级分，并用Amicon Ultra-15离心过滤器装置(Millipore目录号UFC910024)浓缩，并且通过尺寸排阻色谱用Superose 6柱PG XK16/70,60-65cm(目录号：90100042)在磷酸盐缓冲液中进一步纯化。将最终的级分浓缩并通过0.22μm过滤器(Millipore SLGV004SL)过滤灭菌。使用无内毒素的溶液，并且使用带有LAL盒的Charles Rivers Endosafe PTS仪器对最终蛋白质进行测试，检测极限为0.05EU/ml。
示出了H1/茎-Np(SEQ ID NO:43，图6A)和H5/COBRA-Np(SEQ ID NO:32，图6B)的胰蛋白酶消化。在两种情况下，在胰蛋白酶消化的情况下(以“+”表示)的分子量移位对应于SM7/8a的分子量(711道尔顿)。因此，这些数据表明SM7/8a与包含表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白纳米颗粒成功缀合。
在使用PNGase去除H1/茎-Np的糖基化而未经胰蛋白酶处理的凝胶移位实验(图7A)中，与低分子量分子(如马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a)缀合后铁蛋白纳米颗粒重量变化的分辨率是不清楚的。如图7B所示，胰蛋白酶处理允许通过凝胶移位测定确认小分子如SM7/8a与H1/Stem-Np的缀合。可以通过去糖基化H1/Stem-Np的凝胶移位测定(图7A)，以及还通过在天然条件下通过胰蛋白酶消化从H1/茎-Np释放的铁蛋白纳米颗粒的凝胶移位测定观察到更高分子量的分子(例如CpG)的缀合。因此，在天然条件下使用胰蛋白酶消化铁蛋白纳米颗粒提供一种表征与TLR激动剂缀合的核心片段的方法作为平台技术，所述核心片段原本可能难以在对于具有可能干扰凝胶移位或质谱(MS)实验的特性的给定抗原上通过这些分析测定来分析。
将SM7/8a-PEG4-马来酰亚胺缀合至H1/茎-Np并仅出于分析目的进行PNGase处理之后，在MS上看到质量为42930Da的缀合产物，其比未缀合的H1/茎-Np重约715kDa(图8A)。胰蛋白酶消化后，减小的铁蛋白纳米颗粒的重量为19510Da(基于纳米颗粒的H1/茎部分的切割)(图8B)。缀合后，胰蛋白酶消化的缀合纳米颗粒的重量也更重约715kDa。因此，图8A和图8B二者均支持在将包含佐剂的接头与铁蛋白纳米颗粒缀合中约100％的缀合效率。
在2步式点击化学反应中，将马来酰亚胺-PEG4-DBCO接头缀合至H1/茎-Np，其中马来酰亚胺与铁蛋白纳米颗粒上的表面暴露的半胱氨酸反应，在胰蛋白酶消化后通过MS分析看到与接头添加的分子量(大约675Da)一致的重量增加(图9)。
接下来，将叠氮化物-CpG添加至H1/茎-Np-PEG4-DBCO中间体(在图10中标记为“Mal-PEG4-DBCO之后”)，将其通过凝胶移位测定来确认。叠氮化物-CpG从IDT订购(SEQ IDNO:45)。在SDS-PAGE之前，将缀合物和对照用PNGase处理。与接头缀合相比，由于增加的质量(约7.5kDa)，CpG缀合引起向上的凝胶移位。在图10中示出了通过对标记为“茎-Np-CpG”和“茎-Np”的两个条带的密度测定而定量的50％缀合效率的例子。茎-Np是H1/茎-Np(SEQID NO:43)。未处理是指还原前的H1/茎-Np。TCEP还原的是指在室温下用3mM TCEP处理1小时并在4℃下用PBS透析过夜的H1/茎-Np。
也将烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点(SEQ ID NO:44)用于评价缀合。使用2步式点击化学方法，将3M-012缀合至各种NC99HA-TEV-Np构建体(SEQ ID NO:9-12)。用2或10mM TCEP还原HA-TEV-Np构建体。通过透析(具有10kDa MWCO的3mL透析盒，Thermo#87730)至TRIS缓冲液(100mM TRIS pH 8.0，50mM NaCl)中来去除TCEP。添加DBCO-PEG4-马来酰亚胺接头(Sigma#760676)。在也缓冲液交换至PBS 7.4中的同时，用超滤(100kDa MWCO，Millipore Amicon#UFC810024或#UFC910096)去除过量的接头。最后，将叠氮化物官能化的TLR激动剂(CpG或3M-012)点击到分子上。通过超滤(100kDa MWCO，Millipore Amicon#UFC810024或#UFC910096)或凝胶过滤去除过量的药物。HA-TEV-Np中的TEV切割位点允许TEV选择性切割以便分析缀合。
在将3M-012(约500Da+约600Da接头)缀合至HA-TEV-Np构建体之后，用TEV处理构建体。TEV切割后，在凝胶移位SDS-PAGE上所得的HA-条带为约57kDa加上聚糖和Ferr约20kDa(图11，标记为“+TEV”的泳道)。约20和21kDa的双条带(分别标记为“S26C”、“S72C”、“A75C”和“S111C”(分别为SEQ ID NO:10、11、12和9)的泳道)指示成功的缀合。缀合效力对应于条带强度，其中较低的条带是未缀合的而上面的条带是缀合的铁蛋白。
发现包含S111C的H1/茎-Np在293Expi细胞中表达时具有109道尔顿的翻译后修饰(与半胱氨酰化一致)(图12A)，所述翻译后修饰通过以下方式而去除：在室温下用3mM浓度下的TCEP(三(2-羧乙基)膦)还原1小时以释放出反应性硫醇(图12B)。因此，可以还原修饰以将表面暴露的半胱氨酸暴露为游离硫醇，所述游离硫醇对商业接头或定制的小分子上的马来酰亚胺基团具有高反应性。
MS数据也确认了3M-012与HA-Np的成功缀合。HA-TEV-Np-S26C(SEQ ID NO:10；图12C)、A75C(SEQ ID NO:12；图12D)或S111C(SEQ ID NO:9；图12E)。包含A75C和S111C铁蛋白修饰的纳米颗粒(分别为SEQ ID NO:12和9)显示出与3M-012的大于95％缀合率。因此，MS数据指示，佐剂可以与由铁蛋白中突变产生的各种表面暴露的半胱氨酸连接，从而成功产生与佐剂连接的抗原性铁蛋白多肽。
负染色电子显微镜(EM)确认缀合不会影响纳米颗粒完整性。示出了单独的H1/茎-Np(SEQ ID NO:43)(图13A)、与马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a缀合的H1/茎-Np(图13B)、与CpG缀合的H1/茎-Np(图13C)、单独的NC99 HA-Np(SEQ ID NO:9)(图13D)，经由DBCO-马来酰亚胺接头与3M-012缀合的NC99 HA-Np(图13E)和经由DBCO-马来酰亚胺接头与CpG缀合的NC99HA-Np(图13F)。此外，与未缀合的H1/茎-Np相比(图14C)，将TLR7 8激动剂(马来酰亚胺-PEG4-SM7/8a，图14A)或经由马来酰亚胺-PEG4-DBCO接头将TLR9激动剂(CpG，图14B)缀合至H1/茎-Np不影响纳米颗粒完整性，如通过动态光散射(DLS)测量的。
这些数据证明了包含铁蛋白和HA多肽的抗原性多肽的成功制备。此外，可以将包含佐剂的接头成功地缀合至这些铁蛋白纳米颗粒。
2.对HA-铁蛋白纳米颗粒组合物的免疫原性的表征
评估了各种佐剂和将TLR激动剂与H1/茎-Np缀合对H1/茎-Np组合物的免疫原性的影响。图15A示出了通过用H1/茎-Np TLR7/8-激动剂缀合物免疫诱导的针对H1/新喀里多尼亚/1999(NC99)HA三聚体的IgG抗体效价。在第0周和第3周用10μg H1/茎-Np进行给药，将所述H1/茎-Np在不伴有佐剂的情况下、在伴有等摩尔掺合的游离SM7/8a佐剂(83.3ng)的情况下、在伴有掺合的高剂量游离SM7/8a佐剂(21.84μg)的情况下、或在伴有1:1体积比的PAA或AF03佐剂的情况下进行给予。在不存在任何其他佐剂的情况下给予H1/茎-Np-SM7/8a缀合物。在第二次剂量后2周测定血清。图15B出了通过用H1/茎-Np TLR9-激动剂缀合物免疫诱导的针对H1/茎三聚体的IgG抗体效价。在第0周和第3周用10μg H1/茎-Np进行给药，将所述H1/茎-Np在不伴有佐剂的情况下、在伴有等摩尔掺合的游离CpG佐剂(850ng)的情况下、在伴有掺合的高剂量游离CpG佐剂(20μg)的情况下、或在伴有1:1体积比的AF03佐剂的情况下进行给予。在不存在任何其他佐剂的情况下给予H1/茎-Np-CpG缀合物。在第二次剂量后2周测定血清。
图15A中的数据表明，SM7/8a-缀合的H1/茎-Np显示出与掺合有聚丙烯酸(PAA)或AF03佐剂的未缀合的纳米颗粒可比的免疫原性。直接缀合至铁蛋白纳米颗粒的SM7/8a比作为与铁蛋白纳米颗粒分开的化合物给予的等摩尔剂量的SM7/8a(“等摩尔混合”)更有效。此外，直接缀合至铁蛋白纳米颗粒的SM7/8比作为与铁蛋白纳米颗粒分开的化合物给予的更高剂量的SM7/8a(“高混合”)更有效。因此，SM7/8a与包含HA多肽和铁蛋白的抗原性多肽的缀合使得所述化合物具有免疫原性和自我佐剂化。给予自佐剂化组合物可以允许减少或消除单独的佐剂。类似地，图15B表明，与未缀合的和等摩尔掺合的对照相比，TLR9激动剂CpG与H1/茎-Np的缀合将其免疫原性改善至与给予23倍高剂量的掺合CpG分子可比的水平。
还在体外评估了血清中和H1/新喀里多尼亚/1999(NC99)HA/NA假型化慢病毒的能力。如先前所述进行假型化中和测定(Kanekiyo等人,Nature 499:102-106(2013))。简而言之，通过用Profection哺乳动物转染试剂盒(Promega目录号E1200)转染5种质粒，即400ngHA、100ng NA、50ng TMPRSS2、7μg CMVΔR8.2和7μg pHR'CMV-Luc，将慢病毒包装在HEK293T细胞中。转染后48和72小时收集病毒颗粒，并且将其通过0.45μm过滤器过滤。
以三周的间隔对小鼠(n＝5/组)免疫两次。将与3M-012缀合的NC99 HA-Np(SEQ IDNO:9)(HA-Ferr-3M-012，0.22μg/剂量)与以下掺合对照平行给予：NC99 HA-Np(0.22μg/剂量)和10μg 3M-012(典型的治疗剂量)的混合物，以及单独地，NC99 HA-Np(0.22μg/剂量)和1.7ng 3M-012(缀合物的等摩尔匹配物)的混合物。另外的对照是以匹配的HA含量(0.17μgHA/剂量)投配的未缀合NC99 HA-Np和灭活流感疫苗(IIV)。在第5周，测定来自这些小鼠的血清的连续稀释物对用来自所指示株系的HA和神经氨酸酶(NA)基因假型化的慢病毒的中和活性。将一系列稀释度下的抗血清与固定量的慢病毒一起预孵育，并用于感染靶293A细胞。72小时后用Promega萤光素酶测定系统(目录号E1500)定量感染。使用Graphpad Prism软件根据这些中和曲线计算IC50值，以确定达到50％PsV中和的血清稀释因子。还分别在第5周和第8周测定终点效价(ELISA)和血凝抑制(HAI)效价。关于示例性ELISA和HAI程序，参见以下实施例。一式三份地运行所有样品。
基于ELISA终点效价(图16A)和假病毒中和IC50效价(图16B)，与匹配的掺合物、未缀合的颗粒或IIV相比，与3M-012缀合的NC99 HA-Np诱导更强的结合和中和抗体应答。HA-Np-3M-012缀合物还诱导了比等摩尔掺合物对照显著更强的HAI效价(图16C)。另外，HAI效价比未缀合的HA-Ferr和IIV高3.7和1.6倍，但是这些结果并不显著。
与掺合对照(HA-Np(0.22μg/剂量)和20μg CpG(典型的治疗剂量)的混合物，以及HA-ferr(0.22μg/剂量)和21ng CpG(缀合物的等摩尔匹配物)的混合物)相比，还评估了与CpG缀合的NC99 HA-Np(SEQ ID NO:9)(HA-Ferr-CpG，0.22μg/剂量)的免疫原性。另外的对照是以匹配HA含量(0.17μg HA/剂量)投配的未缀合HA-Np和IIV。如上所述，在第0周和第3周给药。ELISA和PsV测定是对于加强免疫后2周的血清进行的，并且在加强免疫后5周对血清进行HAI。一式三份地运行所有样品。
基于ELISA终点效价(图17A)或假病毒中和IC50效价(图17B)，与匹配的掺合物、未缀合的颗粒或IIV相比，缀合物诱导更强的结合和中和抗体应答。HA-Np-CpG缀合物诱导了比等摩尔掺合物对照显著更强的HAI效价(图17C)。另外，HAI效价比未缀合的HA-Ferr和IIV高2.6和3.0倍，但是这些结果并不显著。
还在非人灵长类动物模型中评估了H1/茎-Np-TLR激动剂缀合物的免疫原性。将十二只食蟹猴(长尾猕猴)由Bioqual公司依照所有联邦法规(包括USDA法规和动物福利法)饲养和照管。对动物进行预筛选并且通过ELISA选择对2016-2017年Fluzone四价抗原(A/加利福尼亚/07/2009；A/香港/4801/2014X-263B；B/普吉岛/3073/2013；B/布里斯班/60/2008)缺乏反应性的动物。将5至13岁、体重3.5kg至7.8kg的NHP受试者(10只雌性，2只雄性)随机分配到每个免疫组(n＝3只动物/组)。使每个组在第0、4和10周接受三次剂量：50μg伴有AF03的H1-SS-np或200μg H1-SS-np(无佐剂对照)、或200μg H1-SS-np-SM7/8缀合物、或200μg H1-SS-np-CpG。在第0、2、4、6、8、10和12周收集10mL血液样品用于血清分离。在第0、2、5、6和12周收集10-16mL的血液样品用于PBMC分离。按照标准操作程序分离并低温保存血清和PBMC。食蟹猴被分配为在第0、4和10周用以下项免疫：50μg与掺合的AF03佐剂一起配制的H1/茎-Np、或200μg H1/茎-Np(无佐剂对照)、或200μg H1/茎-Np-SM7/8a缀合物(图3A中所示的)或200μg H1/茎-Np-CpG缀合物(图3B中所示的)。测定在各个时间点分离的血清的根据ELISA得出的抗HA抗体效价(图25A)，以及所述血清对用H1亚型HA和NA(图25B)或用H5亚型HA和NA亚型(图25C)假型化的慢病毒的中和作用。合在一起，图25A至图25C中所示的结果证明，TLR激动剂的缀合改善了H1/茎-Np在非人灵长类动物模型中的免疫原性。在此模型中，TLR7/8激动剂缀合物显现比CpG缀合物产生更高的效价，并且AF03掺合佐剂在测试条件下引发最高的效价。
接下来，确定当以较高剂量给予时3M012缀合物的免疫原性是否可以改善。为此，以0.1μg、0.5μg、2.5μg和12.5μg剂量的HA-NP测试缀合物、等摩尔掺合物、较高剂量掺合物和未缀合的纳米颗粒(图26A至图26B)。在0.1μg和0.5μg HA-NP剂量下，在中和和HAI测定中看到最小应答，除了高掺合物剂量。在2.5μg剂量下，未缀合的HA-NP以及HA-NP与3M012的等摩尔掺合物二者诱导了最小的抗体应答。与高剂量掺合物组相比，3M012缀合的HA-NP尽管含有少>5000倍的3M012，但诱导相似的抗体应答，这证明了直接缀合和TLR激动剂靶向递送的功效。
3.通过EM和DLS对包含候选多肽的纳米颗粒的表征
使用上文概述的方法表达图1A中所呈现的包含流感多肽的HA-Np，并将其释放到培养基中(在图1A中示出HA部分的序列比对和在图1B中示出系统树图)。图1B中的箭头指示候选多肽。通过阴离子交换和尺寸排阻色谱从293Expi细胞培养上清液中纯化图18A中列出的HA-Np。在图18B中示出了确认纳米颗粒的成功产物的考马斯染色结果。
电子显微镜(EM)和动态光散射(DLS)分析如下进行。
动态光散射是在25℃下在Wyatt的DynaPro板读取器II上测量的。纯化的HA-Np显示出根据动态光散射在16与18纳米之间的预期大小(图18A，通过“大小”度量指示)。还通过负染色透射电子显微镜(TEM)确认了纳米颗粒的形成(图18C)。对于EM，将HA-铁蛋白纳米颗粒样品吸附至碳涂覆网格持续1分钟，所述碳涂覆网格已通过暴露于辉光放电30秒而变得亲水。用滤纸(Whatman#1)去除过量的液体，并用0.75％甲酸铀酰将样品染色30秒。用滤纸去除多余的甲酸铀酰后，在TecnaiG2 Spirit BioTWIN中检查网格，并使用AMT 2k CCD相机记录图像。
4.单一株系HA-铁蛋白纳米颗粒针对一组代表性的相异H1N1流感病毒的免疫原性
为了研究来自特定病毒株系的HA-Np的免疫原性，用来自目的株系的纳米颗粒对小鼠免疫两次，并在第二次免疫后3周使用血凝素抑制测定(HAI)来测定血清。所有免疫均遵循用于动物处理的既定准则。在第0周和第3周，用220ng HA-铁蛋白纳米颗粒(HA含量为170ng HA)免疫Balb/C小鼠(5只/组)，并且所述HA-铁蛋白纳米颗粒在适用时在临肌内注射(每只后肢50μL)之前与佐剂1:1混合。如图例中所指示，使用Ribi(Sigma AdjuvantSystem，目录号S6322-1vl)或AF03(Sanofi Pasteur)。对于二价、三价和四价组合，在注射前将220ng的每种纳米颗粒预先混合。在加强免疫注射后2周和3周收集血清。
HA抑制测定(HAI)使用的流感种子原液来自美国疾病控制与预防中心(Centersfor Disease Control and Prevention)(美国乔治亚州亚特兰大)。通过用三份酶稀释一份血清用受体破坏酶(RDE)对免疫血清进行预处理，并且在37℃水浴中孵育过夜。通过在56℃下孵育30分钟、之后添加六份PBS至1/10的最终稀释度来使酶失活。在V型底96孔微量滴定板中进行HAI测定，所述微量滴定板具有在0.5％火鸡红细胞中的4个病毒HA单位(HAU)。将HAI效价确定为导致血凝完全抑制的最高血清稀释度。
对于所有数据，误差棒表示通过测定来自给定治疗组中每只动物的样品获得的平均值的标准误差；对于小鼠，n＝5，并且对于雪貂，n＝12。学生T检验是使用MicrosoftExcel计算的。方差分析是使用VassarStats(可通过网站在vassarstats.net/anova1u.html获得)计算的。
使用了跨越78年的病毒进化的一组16种代表性流感株系。所述组中的病毒列于表2中。
表2：用于HAI的H1N1流感株系组
H1N1 HAI流感组
A/波多黎各/1934
A/Weiss/1/1943
A/FM/1/1947
A/丹佛/1/1957
A/新泽西州/8/1976
A/USSR/90/1977
A/巴西/11/1978
A/智利/1/1983
A/台湾/1/1986
A/德克萨斯州/36/1991
A/北京/262/1995
A/新喀里多尼亚/20/1999
A/所罗门群岛/6/2006
A/布里斯班/59/2007
A/加利福尼亚/07/2009
A/孟加拉国/2021/2012
A/越南/3050/2013
在所有情况(CA09、NC99、FM47和HK77，图19A至图19D)下均观察到匹配株系的强效中和。
也通过ELISA确认了针对匹配抗原的血清学应答(图20A至图20F)。给予至每个组的免疫原列于图20A中。将三聚体用于ELISA，如通过图20B至图20F所指示的。
对于ELISA测定，将Nunc MaxiSorp 96孔板(目录号44-2404-21)在4℃下用100ng/孔三聚体HA或稳定化的茎蛋白包被过夜，并用在PBST中的5％脱脂乳封闭。如所指示那样稀释抗血清并在室温下孵育1小时，并且用也在室温下孵育1小时的在5％乳-PBST中的抗小鼠HRP抗体(目录号NA931，在1:5,000下)或抗猴HRP抗体(Southern Biotech目录号4700-05，批号A3814-P907，在1:5,000下)检测结合的抗体。用PBST洗涤5次后，用SureBlueTMB底物(目录号52-00-02)对HRP进行显色，并用0.5N硫酸终止。在450nm(Spectramax M5)下读取吸光度。终点效价是使用Graphpad prism以0.2的阈值和0.05的典型背景水平计算的。
还如上所述那样评价HA/NA假型化慢病毒的中和作用，并将结果示于表3中。在所有测试的情况下，对于匹配株系均观察到强的中和活性，并将这些值用作阈值。具有互补中和活性的HA-Np的组合以加和方式导致扩大的交叉反应性。
表3：用作为单一组分或组合给予的HA-铁蛋白纳米颗粒进行两次免疫后，小鼠中针对HA/NA假型化慢病毒(PsV)的中和IC50
Figure BDA0002796790780000691
<10,000 >10,000 >100,000
正常字体 粗字体 斜体字体
CA09 HA-Np引发了强的免疫应答，但这些限于当代(2009年后)株系和也源自猪并且与CA09具有紧密同源性的1976年分离物(图19A)(参见Gaydos等人2006.Emerg InfectDis 12:23-28(1976))。NC99 HA-Np引发了针对从1990年代末至2000年代初的流感病毒的强效中和作用(图19B)。对FM47 HA-Np的免疫应答主要扩展到匹配的株系，但是它还显示出与1977年株系的中度交叉反应性(图19C)。这种水平的交叉反应性与1977年暴发(其主要影响26岁以下的人群)具有临床相关性，这表明暴露于来自1940-50年暴发的流感病毒赋予了针对1977年株系的保护(Kilbourne 2006)。有趣的是，在HA序列中，HK77 HA-Np脱颖而出，因为其交叉反应性扩展到来自1947、1978和1983年的株系(图19D)。另一方面，对MAL54 HA-Np和DV57 HA-Np的免疫应答限于匹配的株系(图19E、图19F和表3)。
用COBRA P1和COBRA X6纳米颗粒观察到的交叉反应性与其病毒样颗粒(VLP)对应物一致(参见Carter DM等人,J Virol 90:4720-4734(2016))。由COBRA P1 HA-Np引发的免疫应答与CA09 HA-Np相似(图19A和图19G)，并且COBRA X6 HA-Np显示出与NC99 HA-Np相似的免疫概况(图19B和图19H)。
5.HA-铁蛋白纳米颗粒的单价、二价、三价和四价配制品
评价了由选择的HA-Np的组合引发的HAI交叉反应性。用通过组合单独的纳米颗粒制备的二价、三价或四价配制品如上所述那样免疫和测试小鼠。相对于任一种单价组合物，NC99和CA09 HA-Np的二价组合显示出扩大的交叉反应性(图21A)。然而，此二价组合并未引发针对来自1934-1957年和1977-1991年的较早相异株系的可检测抗体效价。COBRA X6和COBRA P1二价组合的免疫原性遵循相同趋势(图21B)。与NC99/CA09二价组合物相比，此组合显示出增加的广度，但针对若干种株系的HAI效价是中等的。对于三价组合，当第三组分是FM47 HA-Np(图21C)或HK77 HA-Np(图21E)时，将第三组分包含到NC99和CA09 HA-Np中会增加交叉反应性，但MAL54HA-Np(图21D)并未增强广度。与NC99、CA09和HK77 HA-Np的三价组合相比，在四价配制品中添加第四组分不会导致另外的可观察到的交叉反应性(图21F至图21H)。
当使用不同的佐剂(即，Ribi对比AF03，图22A至图22F)时观察到可比较结果。重要的是，没有证据表明由共同给予不同的HA-Np引起的抗原性竞争。这些数据表明，对于在其单独的HAI概况中存在高度互补性的情况，交叉反应性概况是加和性的。还测量了用作为使用归一化剂量的HA的由蛋产生的灭活流感疫苗(IIV)递送的NC99和CA09免疫原获得的HAI概况(图23A至23C)。
6.在雪貂中用纳米颗粒组合物进行的针对攻击的保护
在与人类疾病相关的动物模型雪貂中测试了某些HA-Np组合的功效。用磷酸盐缓冲液(图24A)、CA09灭活的流感疫苗(IIV，图24B)、野生型HA-Np的三价组合(NC99+CA09+HK77，图24C)或COBRA P1+CO BRA X6+HK77 HA-Np的组合(图24D)对雪貂(n＝12/组)进行免疫。肌内注射之前，将这些组合物与AF03佐剂1:1混合，实现1ml最终注射体积。
两次免疫后，观察到针对匹配的株系的显著HAI效价(图24B至图24D)。用纳米颗粒组合免疫的两组雪貂均显示出针对FM47、HK77和NC99的显著HAI效价。如在小鼠中观察到的，CA09 IIV未在雪貂中引发针对FM47和HK77株系的交叉中和效价(图24B)。
免疫后，将雪貂用不匹配的相异株系H1/蒙茅斯堡/1947病毒攻击。在第二次免疫后4周通过以下方式来进行流感攻击：用1ml的A/蒙茅斯堡/1/1947病毒以50％组织培养物感染剂量(TCID50)的104.65倍进行鼻腔接种。每日跟踪临床症状，持续2周，并且在攻击后7天内每日收集鼻洗液并且通过标准TCID50测定测试其病毒载量。攻击后，从鼻洗液中定量病毒效价。接受三价NC99+CA09+HK77或COBRA-P1+X6+HK77纳米颗粒组合的雪貂群组比对照组更快地清除病毒，从而在感染后第5天显示出显著降低的病毒效价(图24E，p≤0.001)。相比之下，CA09 IIV免疫组未比PBS免疫对照组显著更快地清除病毒。在所有组中，FM47株系成功复制，并在感染后不超出一周被清除。因此，在与人类疾病相关的感染动物模型中，三价组合刺激了也针对相异病毒攻击进行保护的有效HAI应答。
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 抗原性流感-铁蛋白多肽
<130> 01121-0034-00PCT
<140>
<141>
<150> 62/652,204
<151> 2018-04-03
<160> 231
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 1
Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
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Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
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Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
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Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
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565 570 575
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Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu
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His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala
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Ile Lys Cys Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val
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Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys
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<211> 692
<212> PRT
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
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<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
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<221> 来源
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多肽"
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Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
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多肽"
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<220>
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多肽"
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 21
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<400> 23
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<220>
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多肽"
<400> 24
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<220>
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 26
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<221> 来源
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
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<400> 32
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<220>
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Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
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<212> PRT
<213> 烟草蚀纹病毒
<400> 44
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1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 202
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
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Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 203
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 203
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 204
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
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<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 205
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
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Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
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Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
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<210> 206
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 206
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
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Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
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Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
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Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
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Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 207
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 207
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Cys Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
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Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
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Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 208
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 208
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
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Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
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Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
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Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 209
<211> 166
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 209
Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr
20 25 30
His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu
35 40 45
Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn
50 55 60
Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu
65 70 75 80
Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile
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Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp
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His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu
115 120 125
Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly
130 135 140
Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile
145 150 155 160
Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165
<210> 210
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
<400> 210
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 211
<211> 191
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）
<400> 211
Thr Gln Cys Asn Val Asn Pro Val Gln Ile Pro Lys Asp Trp Ile Thr
1 5 10 15
Met His Arg Ser Cys Arg Asn Ser Met Arg Gln Gln Ile Gln Met Glu
20 25 30
Val Gly Ala Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Met Gly Ala His Phe Ser Lys
35 40 45
Asp Val Val Asn Arg Pro Gly Phe Ala Gln Leu Phe Phe Asp Ala Ala
50 55 60
Ser Glu Glu Arg Glu His Ala Met Lys Leu Ile Glu Tyr Leu Leu Met
65 70 75 80
Arg Gly Glu Leu Thr Asn Asp Val Ser Ser Leu Leu Gln Val Arg Pro
85 90 95
Pro Thr Arg Ser Ser Trp Lys Gly Gly Val Glu Ala Leu Glu His Ala
100 105 110
Leu Ser Met Glu Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Arg Asn Val Ile Lys
115 120 125
Ala Cys Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asn Asp Tyr His Leu Val Asp Tyr
130 135 140
Leu Thr Gly Asp Phe Leu Glu Glu Gln Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Leu
145 150 155 160
Ala Gly Lys Ala Ser Thr Leu Lys Lys Leu Met Asp Arg His Glu Ala
165 170 175
Leu Gly Glu Phe Ile Phe Asp Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Val
180 185 190
<210> 212
<211> 212
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）
<400> 212
Ala Asp Thr Cys Tyr Asn Asp Val Ala Leu Asp Cys Gly Ile Thr Ser
1 5 10 15
Asn Ser Leu Ala Leu Pro Arg Cys Asn Ala Val Tyr Gly Glu Tyr Gly
20 25 30
Ser His Gly Asn Val Ala Thr Glu Leu Gln Ala Tyr Ala Lys Leu His
35 40 45
Leu Glu Arg Ser Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ala Ala Tyr Phe Asn Asn
50 55 60
Tyr Gln Thr Asn Arg Ala Gly Phe Ser Lys Leu Phe Lys Lys Leu Ser
65 70 75 80
Asp Glu Ala Trp Ser Lys Thr Ile Asp Ile Ile Lys His Val Thr Lys
85 90 95
Arg Gly Asp Lys Met Asn Phe Asp Gln His Ser Thr Met Lys Thr Glu
100 105 110
Arg Lys Asn Tyr Thr Ala Glu Asn His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Lys
115 120 125
Ala Leu Asp Thr Gln Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Phe Tyr Ile His
130 135 140
Arg Glu Ala Thr Arg Asn Ser Gln His Leu His Asp Pro Glu Ile Ala
145 150 155 160
Gln Tyr Leu Glu Glu Glu Phe Ile Glu Asp His Ala Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Thr Leu Ala Gly His Thr Ser Asp Leu Lys Lys Phe Ile Thr Ala Asn
180 185 190
Asn Gly His Asp Leu Ser Leu Ala Leu Tyr Val Phe Asp Glu Tyr Leu
195 200 205
Gln Lys Thr Val
210
<210> 213
<211> 174
<212> PRT
<213> 激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）
<400> 213
Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg
50 55 60
Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe
85 90 95
Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val
115 120 125
Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala
130 135 140
Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
165 170
<210> 214
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 214
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Gln
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Gln Glu Ser
180
<210> 215
<211> 204
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 215
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser
35 40 45
Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly
50 55 60
Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe
65 70 75 80
Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu
85 90 95
Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala
115 120 125
Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His
130 135 140
Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu
145 150 155 160
Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp
165 170 175
His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly
180 185 190
Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
195 200
<210> 216
<400> 216
000
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的描述：
牛蛙接头序列"
<400> 217
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe
1 5
<210> 218
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 218
Cys Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Glu His His His His His His
1 5 10 15
<210> 219
<400> 219
000
<210> 220
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 221
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 221
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 222
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 222
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 223
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 223
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 224
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 224
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 225
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 225
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 226
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 226
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 227
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 227
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 228
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 228
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 229
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的描述：
单碱基突变序列"
<400> 229
Pro Gln Arg Glu Thr
1 5
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
<400> 230
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 231
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
<400> 231
tgactgtgaa cgttcgagat g 21

Claims (25)

1.一种抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽包含(i)含有用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变的铁蛋白蛋白，和(ii)流感多肽。
2.一种抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽包含(i)铁蛋白蛋白，所述铁蛋白蛋白含有用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和与所述半胱氨酸缀合的免疫刺激部分；和(ii)流感多肽。
3.根据权利要求1所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含经由所述半胱氨酸缀合至所述铁蛋白蛋白的免疫刺激部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述流感多肽包括血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA)多肽。
5.根据权利要求4所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述HA多肽包含保守区。
6.根据权利要求5所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述保守区包含所述HA的茎区的全部或一部分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述流感抗原包括含有Y98F突变的HA抗原。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变。
9.根据权利要求8所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述内部半胱氨酸在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处，任选地其中所述内部半胱氨酸突变成丝氨酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述非天冬酰胺氨基酸是谷氨酰胺。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述表面暴露的氨基酸是幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S26、S72、A75、K79、S100或S111或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似氨基酸的突变。
12.根据权利要求11所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述表面暴露的氨基酸处的所述突变是幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C或S111C或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似氨基酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR7或TLR8的激动剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR9的激动剂。
15.根据权利要求1或3-14中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含在所述免疫刺激部分与所述铁蛋白蛋白之间的接头。
16.根据权利要求15所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，其中所述接头包括马来酰亚胺部分、聚乙二醇(PEG)部分和二苯并环辛炔(DBCO)部分中的一种、两种或三种。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，所述抗原性流感-铁蛋白多肽进一步包含在所述铁蛋白蛋白与所述流感多肽之间的肽接头。
18.一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽。
19.一种组合物，所述组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽或铁蛋白颗粒和药学上可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的组合物，所述组合物进一步包含含有铁蛋白蛋白和不同的流感多肽的第二抗原性流感-铁蛋白多肽。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述流感多肽来自甲型流感并且所述第二抗原性流感-铁蛋白多肽的流感多肽来自乙型流感，或其中所述流感多肽和所述第二流感-铁蛋白多肽的流感多肽来自亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18，或其中所述流感多肽中的一种或两种包括来自亚型H1、H3、H7或H10的工程化的稳定化茎抗原。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒或组合物，用于在引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的方法中使用。
23.一种引发对流感的免疫应答或保护受试者免受流感感染的方法，所述方法包括向受试者给予根据前述权利要求中任一项所述的任何一种或多种抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒或组合物。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽、铁蛋白颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
25.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-17中任一项所述的抗原性流感-铁蛋白多肽，任选地其中所述核酸是mRNA。
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