KR20230038416A

KR20230038416A - 키메릭 인플루엔자 백신

Info

Publication number: KR20230038416A
Application number: KR1020227043205A
Authority: KR
Inventors: 치-휴이 웡; 신-우 리아오; 시-치 왕; 이-안 코; 쿠오-아이 린; 체 마; 팅-젠 청
Original assignee: 아카데미아 시니카
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-03-20
Also published as: US20230302114A1; JP2023525050A; BR112022022558A2; CA3182526A1; US11918641B2; CN116075315A; AU2021268212A1; TW202208421A; WO2021226533A1; US20240100147A1; EP4146241A1; IL298035A; MX2022014013A

Abstract

본 개시는 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드로서, H1 서브타입 HA(H1 HA) 또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 구형 헤드 도메인 공통 서열과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 구형 헤드 도메인 서열과 융합된, H1 서브타입 HA(H1 HA) 및/또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 줄기 도메인 공통 서열과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 줄기 도메인 서열을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

키메릭 인플루엔자 백신

관련 출원의 참조

본원은 2020년 5월 8일자 출원된 미국 가출원 일련번호 제63/022.328호의 우선권을 주장하며, 본원에서는 모든 목적으로 이의 전체를 참조로 포함한다.

서열 목록

본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되는 서열목록을 함유하며, 본원에서는 이의 전체가 참조로 포함한다. 2021년 5월 6일자 생성된 상기 ASCII 사본은 G4590-08600PCT_SeqListing.txt로 명명되며, 크기가 28 킬로바이트이다.

발명의 분야

본 개시는 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(chimeric influenza virus hemagglutinin: HA) 폴리펩티드, 이를 함유하는 면역원성/백신 조성물 및 이의 적용에 관한 것이다.

인플루엔자 백신 생산을 위한 전통전인 방법은 특이-병원체-비함유(SPF) 부화 계란에서 바이러스를 배양하는 것이고, 그러한 공정은 흔히 대량 생산을 위해서 6 개월 초과가 요구된다. 그러나, 일부 백신 바이러스 균주는 계란에서 불량하게 성장하였고, 계란에 알레르기가 있는 사람들은 안전 우려를 유발시킬 수 있다. 바이러스의 세포 배양을 기반으로 하는 새로운 접근법이 계란-기반 방법을 대체하기 위해서 개발되었지만; 세포-배양 방법은 여전히 잠재적으로 해로운 바이러스를 생성시킬 위험이 있다. 이들 문제를 극복하기 위해서, 대안적인 전략의 탐구는 재조합 HA-기반 백신이 인플루엔자 바이러스 감염증에 대항한 중화 항체를 유도할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 특이 인플루엔자 바이러스 서브타입에 의해서 유도된 항체는 일반적으로는 다른 인플루엔자 서브타입을 효과적으로 중화시킬 수 없다. 또한, 그러한 백신은 바이러스의 끊임없는 돌연변이 때문에 매년 업데이트되어야 한다.

따라서, 광범위한 범위의 인플루엔자 바이러스 균주에 대항한 범용 백신을 개발할 필요가 여전하다.

일 양태에서, 본 개시는 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(chimeric influenza virus hemagglutinin: HA) 폴리펩티드로서, H1 서브타입 HA(H1 HA) 또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 구형 헤드 도메인 공통 서열(globular head domain consensus sequence)과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 구형 헤드 도메인 서열(globular head domain sequence)과 융합된, 서브타입 HA(H1 HA) 및/또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 줄기 도메인 공통 서열과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 줄기 도메인 서열을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드를 제공한다.

일부 구체예에서, HA는 인플루엔자 A HA, 인플루엔자 B HA, 또는 인플루엔자 C HA이다.

일부 구체예에서, 상동성은 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

일부 구체예에서, 줄기 도메인 서열은 H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1 HA의 C-말단 줄기 분절; H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절; 또는 H5 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절이다.

일부 구체예에서, H1 HA 및/또는 H5 HA의 줄기 도메인 공통 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, H1 HA 또는 H5 HA의 구형 헤드 도메인 공통 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구체예에서, 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, HA 상의 하나 이상의 글리코사이트(glycosite)는 모노글리코실화된다. 추가의 구체예에서, 모노글리코실화된 HA는 각각의 글리코사이트 상에 단지 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는다.

일 구체예에서, 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드는 면역원으로서 사용된다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드 및 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 애주번트는 당지질 애주번트이다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열 및 임의로 시그널 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 시그널 펩티드는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 본 개시의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 본 개시의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 인플루엔자 바이러스에 대항하여 대상체를 면역시키는 방법으로서, 대상체에 유효량의 본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 인플루엔자 바이러스 질환을 예방하는 방법으로서, 대상체에 유효량의 본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물을 투여함을 포함하는, 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T-세포 면역 반응을 유발시킨다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 더 높은 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC), 더 우수한 중화 및 H1, H3, H5 및 H7 균주 및 서브타입에 대항한 더 강한 교차-방어 활성을 갖는 줄기-특이적 항체를 유도한다.

일 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 CD8+ 기억 T 세포를 생산하는 백신 효능을 향상시킨다.

도 1a 내지 도 1i. 공통 H5 구형 헤드 및 공통 H1 줄기(cHA) 및 cHA _mg 면역원에 의한 백신 접종에 의해서 유발된 광범위한 교차-방어 줄기-특이적 항체를 갖는 키메릭 H5/1 구성물. (도 1a) 스왑 H1/5 (H1 구형 헤드 및 H1+H5[HA2] 줄기), 스왑 H5/1 (H5 구형 헤드 및 H5+H1[HA2] 줄기) 및 키메릭 H5/1 (cHA: H5 구형 헤드 및 H1 줄기)의 구성물. (도 1b) H1N1 California/07/2009 및 H5N1 Vietnam/1194/ 2004 바이러스에 대항안 중화 활성. (도 1c) PBS(대조군), HA+Alu, 또는 HA+C34로 백신 처리된 마우스에서의 2일 동안의 HA(검은 색 막대) 또는 PBS (흰 색 막대) 대조군으로 자극된 비장 세포에서 CD8⁺ T 세포를 생성시키는 그랜자임 B(GrzB)의 수가 유세포 분석에 의해서 평가되었다. (도 1d 내지 도 1i) Al(OH)₃로 보조된 cHA_fg 및 cHA_mg 대 C34로 보조된 cHA_fg 및 cHA_mg에 의해서 백신 처리된 마우스로부터의 항체 역가가 코팅 항원으로서 A/California/07/2009 H1N1 HA 단백질(도 1d), A/Brisbane/59/2007 H1N1 HA 단백질(도 1e), A/Brisbane/10/2007 H3N2 HA 단백질(도 1f), A/Vietnam/1194/2004 H5N1 HA 단백질(도 1g), A/Shanghai/2/2013 H7N9 HA 단백질 (도 1h) 및 A/Brisbane/59/2007 (Bris/07) 줄기 HA(no. 4900) 단백질(도 1i)에 의한 ELISA에 의해서 42일째에 측정되었다. 종점 항체 역가는 음성 대조군(면역전 혈청)에 의해서 생산된 광학적 흡광도보다 2.5 배 더 높은 흡광도를 생성시키기 위한 항혈청의 마지막 희석액으로서 정의되었다. 데이터는 Prism으로부터의 스튜던트 t-테스트(Student's t test) 및 이원분산분석(two-way ANOVA)을 사용함으로써 검사되었고; 차이는 *P <0.05; **P <0.01에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균 ± SEM를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c. H1N1, H3N2 또는 H5N1 및 서브타입의 HA를 발현하는 표적 세포에 대항한 cHA-백신 처리된 마우스로부터의 항혈청의 ADCC 리포터 분석. 암모늄 하이드록사이드 또는 C34로 보조된 cHA_fg 또는 cHA_mg 단백질로 면역된 마우스로부터 수거한 항혈청이 (도 2a) H1N1 바이러스, (도 2b) H5N1 바이러스, 또는 (도 2c) H3N2 바이러스로 감염된 MDCK 세포와 함께 인큐베이션되었다. 후속하여, ADCC 리포터 분석은 마우스 FcγRIII를 발현하는 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 수행되었고, 상대적 발광 단위(relative luminescence unit: RLU)가 측정되었고, 값은 평균 ± SEM이다. ***P < 0.001. P 값은 이원분산분석을 사용한 Prism 소프트웨어로 계산되었다.
도 3a 내지 도 3e. 더 많은 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T-세포 반응 및 광범위한 중화 항체가 유발되어 애주번트 C34를 갖는 cHA _mg 에 의해서 더 넓은 교차-방어를 부여하였다. BALB/c 마우스를 애주번트 Al(OH)₃ 또는 C34를 갖는 cHA_fg 및 cHA_mg로 면역시켰고; 면역된 마우스의 비장으로부터의 세포를 3회 면역 후에 얻었고, IFN-γ (도 3a), IL-4 (도 3b) 및 GzB (도 3c)-분비 세포를 특이적 펩티드를 사용하여 ELISpot 분석에 의해서 측정하였다. 스폿-형성 세포(spot-forming cell: SFC)의 수를 평균 ± SEM로서 표현된다. cHA_fg 및 cHA_mg 백신 처리된 마우스로부터의 항혈청의 중화 활성을 (도 3d) H1N1 바이러스, 및 (도 3e) H5N1 바이러스에 대해서 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM로서 표현된다. 결과는 스튜던트 t-테스트 및 이원분산분석을 이용한 Prism 소프트웨어에 의해서 계산하였고; 유의한 차이를 *P < 0.05; **P <0.01; ***P < 0.001로서 표시하였다.
도 4a 내지 도 4f. 치사량의 H1N1 및 H5N1 바이러스로 도전된 마우스에서의 교차-방어 효능. BALB/c 마우스를 2-주일 간격으로 애주번트 Al(OH)₃ 또는 C34를 갖는 cHA_fg 및 cHA_mg의 3회 투여량에 의해서 면역시켰다. 면역된 마우스를 H1N1 A/California/07/2009 (도 4a), H1N1 A/New Caledonia/1999 (도 4b), H1N1 A/WSN/1933 (도 4c) H1N1 A/Solomon Islands/03/2006 (도 4d) H5N1 A/Vietnam/1194/2004/NIBRG14 (도 4e), 또는 H5N1 A/Turkey/1/2005/NIBRG23 (도 4f)로 도전시키고, 효능을 감염후 14일 동안 생존율을 기록함으로써 평가하였다. **P < 0.01. 생존율에서의 유의한 차이를 log-rank (Mantel-Cox) 시험에 의해서 분석하였다.
도 5a 내지 도 5e. 키메릭 HA 단백질의 설계 및 제조. (도 5a) 설계된 인플루엔자 HA 서열을 공통 H1N1 서열 및 공통 H5N1 서열 pCHA5-II을 사용하여 구성시켜 키메릭 HA를 생성시켰다. 구형 헤드 도메인은 잔기 C52과 C277(H3 번호 부여) 사이의 아미노산 서열로 구성된다. 줄기 영역은 HA1 및 HA2 서브단위의 부분으로 구성된다. 단백질 구조를 Protein Data Bank ID code 2IBX (VN1194 H5 HA) 및 3LZG (A/California/04/2009)로부터 다운로드 받았다. 최종 이미지를 PyMol에 의해서 생성시켰다. 공통 HA의 구조가 공개되지 않았기 때문에, 조류 flu H5 (Vietnam/1194/2004)의 헤드 도메인 및 팬더믹 H1N1 (California/07/2009)의 줄기 영역의 이미지를 키메릭 HA 구성물을 위해서 사용하였다. (도 5b 내지 도 5d) 키메릭 HA 단백질의 정제 및 겔-열과 크로마토그래피 분석. (도 5b) 정제된 HA 단백질을 SDS/PAGE에 의해서 분석하였다. M: 분자량 마커. 우측: cHA_fg, HEK293T 세포로부터 직접적으로 정제된 완전히 글리코실화된 cHA; (도 5c) cHA_mg, HEK293S 세포로부터 정제되고 엔도글리코시다제 H(endoglycosidase H)에 의해서 소화된 모노글리코실화된 cHA. (도 5d) 정제되고 분비된 HA 단백질의 겔 여과 분석. HEK293T 세포로부터의 완전히 글리코실화된 cHA 및 모노글리코실화된 cHA는 크로마토그래프에서 나타낸 바와 같이 삼량체(>200 kDa)로서 존재하였다. 도면은 보정 표준(점선)이 오버레이된(overlaid) HEK293T 세포-발현된 cHA 단백질의 겹쳐진 용리 프로필(superimposed elution profile)을 나타낸다. (도 5e) LC-MS/MS에 의해서 측정된 cHA_fg 및 cHA_mg의 글리코사이트 상의 주된 글리칸을 표시하기 위한 개략적 도면. 일반적인 글리칸 부호는 수반된다.
도 6a 및 도 6b. 분비된 HA의 구성물 및 정제. (도 6a) HA의 에코도메인을 인코딩하는 서열을 발현 벡터 pcDNA에서 제조하고 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 단백질을 안정화/삼량체와 신호, 폴든(foldon) 뿐만 아니라 정제를 위한 C-말단 (His)6 태그를 함유하도록 조작하였다. (도 6b) 정제된 HA 단백질을 SDS/PAGE에 의해서 분석하였다. M: 분자량 마커. 레인(lane) 1: H1N1 (A/Brisbane/59/2007) HA 단백질; 레인 2: H1N1(A/California/07/2009) HA 단백질; 레인 3: H3N2 (Brisbane/10/2007) HA 단백질; 레인 4: H5N1(Vietnam/1194/2004) HA 단백질; 레인 5: H7N9(A/Shanghai/2/2013) HA 단백질.
도 7a 내지 도 7f. cHA _fg 및 cHA _mg 로 백신처리된 마우스로부터의 항혈청의 HA 결합 활성. BALB/c 마우스(그룹 당 n=10)를 Al(OH)₃ 또는 C34로 보조된 cHA_fg 또는 cHA_mg로 2-주일 간격으로 면역시켰다. Al(OH)₃-보조된 cHA_fg 및 cHA_mg 대 C34-보조된 cHA_fg 및 cHA_mg로 백신 처리된 마우스로부터의 항체 역가를 코팅 항원으로서의 A/California/07/2009 H1N1 HA 단백질(도 7a), A/Brisbane/59/2007 H1N1 HA 단백질 (도 7b), A/Brisbane/10/2007 H3N2 HA 단백질(도 7c), A/Vietnam/1194/2004 H5N1 HA 단백질(도 7d), A/Shanghai/2/2013 H7N9 HA 단백질(도 7e) 및 the A/Brisbane/59/2007(Bris/07) 줄기 HA(#4900) 단백질(도 7f)에 의해 ELISA에 의해서 28일째에 측정하였다. 종점 항체 역가는 음성 대조군(면역전 혈청)에 의해서 생성된 광학적 흡광도(OD)보다 2.5배 더 높은 흡광도를 생성시키기 위한 혈청의 최고 희석액으로서 정의되었다. 데이터는 Prism으로부터의 이원분산분석을 이용하여 검사되었고; 차이는 **P <0.01; ***P < 0.001에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다.
도 8a 및 도 8b. 재조합 H1, H5 및 cHA에 대한 스토크-반응성 항체 (F10 IgG)의 결합. (도 8a) 정제된 F10을 SDS/PAGE에 의해서 분석하였다. M: 분자량 마커. 레인 1: F10 항체. (도 8b) F10 IgG 및 다양한 HA의 결합 친화성을 ELISA를 이용하여 측정하였다. x-축은 다양한 HA 단백질의 농도를 나타내고 y-축은 OD405 nm에서의 흡광도 값을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d. 항체 역가에 대한 C34의 투여량-의존 효과. BALB/c 마우스 (그룹 당 n=10)에게 0.5 μg, 2 μg 또는 10 μg의 C34로 보조된 20 μg cHA를 2-주일 간격으로 주사하였다. 마우스 혈청을 두 번째(D28) 및 세 번째(D42) 면역 2주일 후에 수거하였다. 항체 역가를 H1N1 A/California/07/2009 (도 9a 및 도 9c) 및 H5N1 Vietnam/1194/2004 (도 9b 및 도 9d)의 HA 단백질로 ELISA를 이용하여 측정하였다. 항체 역가의 P 값을 Prism으로부터의 이원분산분석을 이용하여 계산하였고; 차이는 *P <0.05; **P <0.01에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다.
도 10a 내지 도 10c. 항원-특이 사이토카인-분비 세포에 대한 C34의 투여량-의존 효과. BALB/c 마우스(그룹 당 n=5)에게 0.5, 2 및 10 μg으로의 C34의 세가지 상이한 투여량으로 보조된 20 μg의 정제된 cHA를 2-주일 간격으로 주사하였다. cHA 면역된 마우스의 비장 세포를 제2 (D28) 및 제3 (D42) 면역 후에 얻었다. (도 10a) IFN-γ 및 (도 10b) IL4-분비 세포를 Elispot 분석에 의해서 분석하였다. (도 10c) 비장 세포 내에서 CD8⁺ T 세포를 생성시키는 그랜자임 B의 수를 특이적 펩티드를 사용하여 Elispot 분석에 의해서 측정하였다. ***P < 0.001. P 값을 이원분산분석을 이용하여 Prism 소프트웨어로 계산하였다.
도 11a 내지 도 11f. 치사량에서의 H1N1 및 H5N1 바이러스에 의해서 도전된 cHA _fg 또는 cHA _mg 백신 처리된 마우스의 체중. H1N1 A/California/07/2009 (A), H1N1 A/New Caledonia/1999 (B), H1N1 A/WSN/1933 (C), H1N1 A/Solomon Islands/03/2006 (D), H5N1 A/Vietnam/1194/2004 (E), 또는 H5N1 A/Turkey/1/2005 (F) 바이러스로 도전된 면역된 마우스의 체중 변화를 감염후 14일 동안 모니터링하였다. 체중 변화를 평균 ± SEM로 나타낸다.

본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 본 기술분야의 기술 내에 있는 통상의 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 참조예, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lane s (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]

정의

명세서 및 청구범위에서 사용된 단수 형태는, 문맥에서 달리 명확히 나타내지 않는 한, 복수의 언급대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "키메릭 경막 수용체"는 복수의 키메릭 경막 수용체를 포함한다.

본원에서 사용된 용어, "혈구 응집소" 및 "HA"는 본 기술분야에서 통상의 기술자에게는 공지된 어떠한 혈구 응집소를 나타낸다. 특정 구체예에서, 혈구 응집소는 인플루엔자 혈구 응집소, 예컨대, 인플루엔자 A 혈구 응집소, 인플루엔자 B 혈구 응집소, 또는 인플루엔자 C 혈구 응집소이다. 전형적인 혈구 응집소는, 시그널 펩티드, 줄기 도메인, 구형 헤드 도메인, 루미날 도메인(luminal domain), 경막 도메인 및 세포질 도메인을 포함한, 본 기술분야에서 통상의 기술자에게는 공지된 도메인을 포함한다.

본원에서 사용된 용어, "줄기 도메인 폴리펩티드," "HA 줄기 도메인," "인플루엔자 바이러스 혈구 응집소 줄기 도메인 폴리펩티드" 및 "HA 스토크 도메인(HA stalk domain)"은 인플루엔자 혈구 응집소의 줄기 도메인을 형성시키는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 나타낸다. 줄기 도메인 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 사슬, 두 개의 폴리펩티드 사슬 또는 그 초과의 폴리펩티드 사슬일 수 있다.

본원에서 사용된 용어, "인플루엔자 바이러스 혈구 응집소 헤드 도메인 폴리펩티드," "인플루엔자 바이러스 혈구 응집소 헤드 도메인," "HA 구형 헤드 도메인," 및 "HA 헤드 도메인"은 인플루엔자 혈구 응집소 폴리펩티드의 구형 헤드 도메인을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어, "항원"은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 어떠한 물질로서 정의된다.

본원에서 사용된 용어, "면역원성"은 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원, 또는 백신의 능력을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어, "에피토프(epitope)"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 일부로서 정의된다.

본원에서 사용된 용어, "백신"은 유기체가 유발시키는 질환에 대항하는 면역성을 부여하기 위해서 사용되는 전체 질환-유발 유기체(치사됨 또는 약화됨) 또는 그러한 유기체의 성분, 예컨대, 단백질, 글리코단백질, 펩티드, 글리코펩티드, 당지질, 폴리사카라이드, 또는 이들의 어떠한 조합물로 이루어지는 항원을 함유하는 제제(preparation)를 나타낸다. 백신 제제는 천연이거나, 합성이거나, 재조합 DNA 기술에 의해서 유도될 수 있다.

본원에서 사용된 용어, "항원 특이적"는 특정의 항원 또는 항원의 단편의 공급이 특이적 세포 증식을 생성시키는 세포 집단의 성질을 나타낸다.

"유효량"은 요망되는 치료 또는 예방 결과를 달성시키기에 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다.

본 발명의 물질/분자의 "치료 유효량"은, 질환 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중 및 개체에서 요망되는 반응을 유발시키기 위한 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라서 다양할 수 있다. 치료 유효량은 또한 물질/분자의 어떠한 독성 또는 유해한 효과가 치료 이익 효과보다 더 큰 양이다. "예방 유효량"은 요망되는 예방 결과를 달성시키기에 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 전형적으로는, 반드시 그러한 것은 아니지만, 예방적 투여는 질환의 조기 상태 전에 또는 그 때에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 수 있다.

조류인플루엔자 H5(pCHA5-II)의 공통 DNA 서열이 마우스에서의 투여를 위한 백신으로서 아용되었고, 결과는 다양한 H5 서브타입에 대항한 넓은 방어를 갖는 것으로 입증되었다[Chen, M.W. et al. Broadly neutralizing DNA vaccine with specific mutation alters the antigenicity and sugar-binding activities of influenza hemagglutinin. Proc.Natl Acad. Sci. USA 108, 3510-3515 (2011)]. 본 개시는 가장 일반적인 조류인플루엔자 H5 및 인간인플루엔자 H1 서열을 기반으로 한 다양한 키메릭 백신의 설계 및 평가를 보고하고 있다. 이들 구성물 중에, 줄기로서 구형 헤드 및 공통 H1과의 공통 H5를 갖는 키메릭 HA(cHA) 백신이 최상이었고, 강한 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 면역 반응을 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 각각의 글리코사이트 상에 단지 GlcNAc을 갖는 모노글리코실화된 cHA(cHA_mg) 백신이 더 높은 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 더 우수한 중화 및 H1, H3, H5 및 H7 균주 및 서브타입에 대항한 더 강한 교차-방어 활성을 갖는 줄기-특이적 항체를 유도하였다. 더욱이, 클래스 스위치(class switch)를 위해서 설계된 당지질 애주번트와 조합된 cHA_mg 백신은 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 CD8⁺ 기억 T 세포를 생성시키는 백신 효능을 추가로 향상시켰다.

키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드

본 개시는 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 면역 반응을 유발시키기 위한 면역원 또는 백신으로서 사용되는 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드는 대상체에서의 인플루엔자 바이러스 질환을 예방할 수 있다.

본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드는, H1 서브타입 HA(H1 HA) 또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 구형 헤드 공통 서열과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 구형 헤드 도메인 서열과 융합된, H1 서브타입 HA(H1 HA) 및/또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 줄기 도메인 공통 서열와 적어도 60% 상동성를 각각 갖는 하나 이상의 줄기 도메인 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 용어, "상동성"은 폴리머 분자들 사이, 예를 들어, 핵산 분자들(예, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전체적인 관련성을 나타낸다. 매칭 잔기(matching residue)의 정렬에 의해서 측정되는 유사성 또는 상동성의 한계 수준(threshold level)을 공유하는 폴리머 분자(예, 핵산 분자(예, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자)는 상동성으로 일컬어진다. 상동성은 분자들 사이의 관계를 설명하며 정량적 유사성 또는 동일성을 기반으로 할 수 있는 정성적인 용어이다. 유사성 및 동일성은 두 개의 비교 서열 사이의 서열 매칭의 정도를 규정하는 정량적인 용어이다. 일부 구체예에서, 폴리머 분자는, 이들의 서열이 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일 또는 유사하면, 서로 "상동성"인 것으로 여겨진다.

일부 구체예에서, 본 개시에 따른 폴리펩티드는 공지된 인간 및 조류인플루엔자 바이러스 균주에 비한 H1 HA 또는 H5 HA의 공통 서열과 적어도 60% 상동성을 갖는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상동성은 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 일부 구체예에서, 줄기 도메인 서열은 H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 N-말단 줄기 분절의 C-말단 줄기 분절; H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절; 또는 H5 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절이다.

SEQ ID NO: 1 (H1 줄기)

DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKL

SEQ ID NO: 2 (H1 줄기)

NTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQ

SEQ ID NO: 5 (H1 줄기)

DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKL

SEQ ID NO: 6 (H1+H5 줄기)

NTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGV

SEQ ID NO: 9 (H5 줄기)

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL

SEQ ID NO: 10 (H5+H1 줄기)

NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKR GLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGV

일 구체예에서, H1 HA 또는 H5 HA의 구형 헤드 도메인 공통 서열은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO: 3 (H5 구형 헤드)

CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANP및LCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC

SEQ ID NO: 7 (H1 구형 헤드)

CKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDC

SEQ ID NO: 11 (H5 구형 헤드)

SEQ ID NO: 4 (키메릭 H5/1)

DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANP및LCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQ

SEQ ID NO: 8 (스왑 H1/5)

DTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGV

SEQ ID NO: 12 (스왑 H5/1)

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANP및LCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGV

일부 구체예에서, 면역원성을 향상시키기 위해서, HA 상의 하나 이상의 글리코사이트가 모노글리코실화된다. 바람직하게는, 모노글리코실화된 HA는 각각의 글리코사이트 상에 단지 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는다.

키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드는 어떠한 적합한 방법에 의해서 생산될 수 있고, 이들 중 대부분은 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 (예, 박테리아 세포에서, 세포 배양액(포유동물, 효모 또는 곤충 세포)에서, 식물 또는 식물 세포에서, 또는 세포-비함유 원핵 또는 진핵-기반 발현 시스템에 의해서, 그 밖의 시험관내 시스템에 의해서, 등등) 화학적으로 합성되거나 생산될 수 있다. 따라서, 본 개시는 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 임의로 시그널 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시는 본 개시의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시의 폴리펩티드의 구체예가 본원에서 기재된다. 일 구체예에서, 시그널 펩티드는 SEQ ID NO: 13 (MEKIVLLLAIVSLVKS) 또는 SEQ ID NO: 14 (MKAILVVLLYTFATANA)의 서열을 포함한다. 본 개시의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.

면역원성 조성물

면역원성 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 애주번트를 포함한다. 일 구체예에서, 애주번트는 당지질 애주번트이다. 애주번트의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, Al(OH)₃, AlPO₄, C34, 스쿠알렌 및 QS21을 포함한다.

본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 제형화되거나 투여될 수 있다. 면역원성 /백신 조성물은 무균성이거나, 무-발열원(pyrogen-free)이거나, 무균성 및 무-발열원 둘 모두일 수 있다. 약제학적 제제, 예컨대, 백신 조성물의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에서 전체가 참조로 통합됨)에서 찾아볼 수 있다.

면역원성 조성물은 용량형 제형과 상용성인 방식으로, 그리고 치료학적으로 효과적이고 방어적이고 면역원성인 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 항체를 합성하고, 필요한 경우, 세포-매개된 면역 반응을 생성시키기 위한 개체의 면역계의 용량을 포함한, 치료된느 대상체에 의존한다. 투여될 필요가 있는 활성 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 좌우된다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 본 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 초기 투여 및 추가 투여량에 적합한 요법은 또한 다양할 수 있지만, 초기 투여에 이어진 후속 투여를 포함할 수 있다. 백신의 투여량은 또한 투여 경로에 좌우될 수 있으며, 숙주의 크기에 따라서 다양하다.

본원에서 기재된 백신 조성물의 제형은 제약 분야에서 공지되었거나 이후 개발되는 어떠한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 일반적으로는, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연관시키고, 이어서, 필요에 따라 및/또는 바람직한 경우, 생성물을 요망되는 단일- 또는 복수-투여 단위로 분할하고/거나, 성형하고/거나, 포장하는 단계를 포함한다.

적용

세포독성 T 림프구(CTL)는 인플루엔자 바이러스 균주에 대항하는 면역 반응을 제공할 수 있는 것으로 꽤 오랜 기간 동안 공지되어 왔다. 최근의 연구는 인간에서의 CTL 반응이 복수의 에피토프(epitope)에 대해서 유도될 수 있는 것으로 알려졌다.

인간 및 그 밖의 포유동물에서의 인플루엔자 바이러스 질환의 예방을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 또한, 인플루엔자 바이러스에 대항하는 대상체에서의 면역 반응을 유발시키는 방법이 제공된다. 그러한 방법은 대상체에게 유효량의 본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물/백신을 투여하여, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 균주(예컨대, H1, H3, H5 및 H7 균주 및 서브타입)에 특이적인 면역 반응을 유도함을 포함한다. 바람직하게는, 그러한 방법은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, 그러한 방법은 더 높은 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 더 우수한 중화 및 H1, H3, H5 및 H7 균주 및 서브타입에 대항하는 더 강한 교차-방어 활성을 갖는 줄기-특이적 항체를 유도한다. 그러한 방법은 또한 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 CD8⁺ 기억 T 세포 생산되게 하면서 백신 효능을 향상시킨다.

대상체에서의 항체 역가는 백신 접종 후에 증가된다. 예시적인 양태에서, 본 개시의 면역 조성물 또는 백신은 인플루엔자로부터의 예방적 방어를 제공하기 위해서 사용된다. 인플루엔자로부터의 예방적 방어는 본 개시의 백신 또는 조합 백신의 투여 후에 달성될 수 있다. 백신(조합 백신을 포함함)은 한번, 두번, 세번, 네번 또는 그 초과로 투여될 수 있지만, 백신을 한번(임의로, 이어지는 단일 부스터(single booster)) 투여하는 것이 충분한 듯하다. 그에 따라서, 투여는 조절될 필요가 있을 수 있다.

예방 유효 투여량은 임상적으로 허용되는 수준에서 인플루엔자 바이러스에 대항하여 방어하는 치료 유효 투여량이다. 일부 구체예에서, 치료 유효 투여량은 백신을 위한 패키지 인서트(package insert)에 열거된 투여량이다.

본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물/백신은 치료학적으로 효과적인 결과를 생성시키는 어떠한 경로에 의해서 투여될 수 있다. 이들은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 내부내, 근육내, 및/또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물/백신은 본 기술분야에서 공지된 불활성화된 백신의 투여와 유사하게 근육내 또는 피부내 투여될 수 있다.

본 발명은 이의 적용이 이하 상세한 설명에 기재되거나 도면에 예시된 구성 및 성분의 배열의 상세사항으로 한정되지 않는다. 본 발명은 그밖의 구체예가 있을 수 있고, 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다.

실시예

방법

백신 및 플라스미드 구성. 초기 2009~2013에 이용 가능한 H1N1 바이러스로부터의 모든 102 전장 HA 서열을 NCBI 데이터베이스로부터 다운로드하였고, BioEdit 프로그램으로부터의 ClustalW 알고리즘에 의해서 정렬시켰다. 각각의 위치에서의 대부분의 보존된 아미노산을 선택하여 공통 H1 서열을 생성시켰다. 공통 혈구 응집소 H5(pCHA5-II) 서열을 앞서 기재된 바와 같이 생성시켰다. 공통 혈구 응집소 H5 (pCHA5-II) 및 공통 H1의 뉴클레오티드 서열을 pcDNA 발현 벡터내로 클로닝시키고, 생성되는 플라스미드를 스왑 및 키메릭 HA 구성을 위한 주형으로서 사용하였다. 스왑 H1/5은 HA1으로서의 H1(SEQ ID NO: 8의 아미노산 1~327) 및 HA2로서의 H5(SEQ ID NO: 8의 아미노산 328~503)로 구성되어, 구형 헤드로서의 H1 및 H1+H5(HA2) 줄기를 생성시킨다. 스왑 H5/1은 HA1으로서의 H5(SEQ ID NO: 12의 아미노산 1~330) 및 HA2로서의 H1(SEQ ID NO: 12의 아미노산 331~506)로 구성되어, 구형 헤드로서의 H5 및 H5+H1(HA2) 줄기를 생성시킨다. 키메릭 H5/1 구성물의 경우에, 구형 헤드 도메인은 SEQ ID NO: 4의 잔기 C42와 C274(H3 번호 부여) 사이의 아미노산 서열로 구성되고, 줄기 영역은 HA1 및 HA2 서브단위의 부분들(SEQ ID NO: 4의 아미노산 1~41 및 SEQ ID NO: 4의 4 및 275~511)로 구성된다. 경막 도메인은 HA의 C-말단에서 박테리오파아지 T4 피브리틴 폴던 삼량체화 서열(bacteriophage T4 fibritin foldon trimerization sequence), 트롬빈 분해 부위(thrombin cleavage site) 및 (His)6-tag로부터의 추가의 잔기들로 대체되었다. 공통 HA의 DNA 서열 둘 모두가 인간-우선 코돈(human-preferred codon)을 사용하여 발현되기에 최적화되었고, 다양한 영역이 PCR에 의해서 증폭되었고, 후속하여, 발현을 위해서 pcDNA 벡터내로 클로닝되었다. 더욱이, 인플루엔자 바이러스 계절성 H1N1 Brisbane/59/2007, 팬더믹 H1N1 California/07/2009, H3N2 Brisbane/10/2007, H7N9 A/Shanghai /2/2013 및 조류 flu H5N1 Vietnam/1194/2004로부터의 HA 유전자를 또한 최적화시키고, 합성하고, pcDNA 발현 벡터내로 클로닝시켰다. 서열을 DNA 서열화에 의해서 확인하였고, 단백질 발현 및 정제를 위한 높은 품질로 제조하였다.

발현된 세포로부터의 재조합 분비된 HA의 발현. 인간 상피 신장(HEK) 293T 및 HEK293S 세포를 10% 소 태아 혈청(Gibco)으로 보충된 DMEM(Gibco)에 통상적으로 유지시켰다. 일시적인 형질 감염을 위해서, 293T 또는 293S 세포를 10 cm 디쉬(dish)(Nunc, Roskilde, Denmark)에 씨딩하였고, 모든 절차는 제조자 원안에 따라서 수행되었다. 요약하면, 80% 컨플루언시(confluency)의 293T 또는 293S 세포를 3:1 비율의 시약 대 플라스미드 DNA를 사용하여 Mirus TransIT®-LT1 (Mirus Bio) 형질 감염 시약으로 형질 감염시켰다. TransIT®-LT1 시약을 Opti-MEM (Gibco)로 희석시켰고, 혼합물을 실온에서 5-20 분 동안 인큐베이션시켰다. 용액에 플라스미드 DNA를 첨가하였고, 완전히 혼합한 다음, 15-30 분 동안 인큐베이션시켰다. 형질 감염 전에, 세포를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 신선한 DMEM (Gibco) 배지로 대체하였다. TransIT®-LT1 시약/DNA 복합물을 세포에 첨가하였과, 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈구 응집소의 발현을 항-(his)6 항체(Qiagen) 또는 특이적 항-혈구 응집소 항체 및 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)-컨주게이티드 이차 항체(PerkinElmer)를 사용한 면역블롯으로 확인하였다.

재조합 분비된 혈구 응집소의 정제. 인간 293T 세포에서의 발현을 위해서, 관심 유전자를 갖는 pcDNA를 높은 품질로 제조하였고, Mirus TransIT®-LT1(Mirus Bio)로 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후에, 배지를 수거하고, 세포를 1,000 x g에서 10 분 동안 원심분리에 의해서 정화시켰다. 상청액을 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 친화성 컬럼(GE Healthcare)에 의해서 정제하였다. 상청액을 20 mM Tris-HCl pH 8.0 및 300 mM NaCl에서 사전-평형된 Ni-NTA 친화성 컬럼 상에 부하시켰다. 미결합된 단백질을 20 mM Tris-HCl pH 8.0 및 300 mM NaCl(완충액 A) 중의 25 내지 50 mM의 이미다졸 구배로 세척해 냈다. 이어서, HA 단백질을 완충액 A 중의 100 내지 300 mM 이미다졸 구배로 용리시켰다. 정제된 HA 단백질을 PBS, pH 7.4 중의 Amicon Ultrafiltration Unit(MW30K cutoff)(Millipore)에 의해서 농축시켰다. 순도를 SDS-PAGE를 사용하여 모니터링하였고, 단백질을 항-(his)6 항체(Qiagen) 또는 특이적 항-혈구 응집소 항체 및 겨자무 과산화효소-컨주게이티드 이차 항체(PerkinElmer)로 Western blot을 사용하여 확인하였다. 마지막으로, HA 단백질의 삼량체 형태를 크기-배제 컬럼, Superdex 200 Increase 10/300 GL 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 얻었다.

모노-글리코실화된 HA 단백질의 제조. N-아세틸글루코사미닐트렌스페라제 I(N-acetylglucosaminyltransferase I)이 결핍된 HEK293S 세포를 사용하여 고--만노오스 글리칸³¹을 갖는 HA를 생성시켰다. HEK293S 세포로부터의 정제된 HA 단백질을 20℃에서 밤새 Endo H(NEB)로 처리하여 모노글리코실화된 HA_mg를 생성시켰다. 단백질 대 Endo H의 비율은 HA의 경우에 3 대 1 (w/v)이었다. 이어서, Endo H 및 모노-글리코실화된 HA 단백질을 Superdex 200 Increase 10/300 GL 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)에 의해서 분리하였다. HA_mg 단백질을 PBS, pH 7.4 중의 Amicon Ultrafiltration Unit(MW30K cutoff)에 의해서 농축시키고, SDS-PAGE 및 LC-MS/MS 분석에 의해서 확인하였다.

HA 단백질 상의 N-연결된 글리코실화의 확인. 10 마이크로그램의 단백질을 SDS-PAGE 상에서 진행시켰고, 겔 중 소화를 위해서 준비하였다. 요망되는 단백질 밴드를 예리한 메스(sharp scalpel)로 잘라내고, 1 mm 조각으로 다이싱(dicing)하고, 1.3 ml 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣었다. 50% ACN(아세토니트릴) 중의 500 μl의 25mM 암모늄 바이카르보네이트로 3 분 동안 2회 세척한 후에, 겔 조각을 SpeedVac 증발기(Thermo)를 사용하여 건조시켰다. 건조된 샘플을 37℃에서 1 시간 동안 25 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH 8.5) 중의 100 μl의 50 mM 디티오트레이톨(DTT)의 첨가에 의해서 환원시킨 다음, 10,000 g에서 1 분 동안 원심분리하였다. 용액을 제거하고, 겔 샘플을 25 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH 8.5) 중의 100 μl의 100 mM 요오도아세타미드(IAA)의 첨가에 의해서 알킬화 단계를 진행시키고, 실온에서 1 시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 25mM 암모늄 바이카르보네이트 (pH 8.5) 중의 500 μl의 50% 아세토니트릴 및 500 μl의 100% 아세토니트릴로 세척한 후에, 샘플을 10,000 g에서 1 분 동안 원심분리하고, 상청액을 완전히 제거하였다. 겔 샘플을 SpeedVac 증발기에서 건조시키고, 200 μl의 25 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH 8.5)로 재용해시켰다. 이어서, 겔 샘플을 0.5 μg 트립신(Promega, Madison, WI, USA) 및 1 μg 키모트립신(Promega, Madison, WI, USA)으로 밤새 처리하였다. 밤새 소화 후에, 샘플에 5 % TFA 중의 100 μl의 50% 아세토니트릴을 첨가하였다. 샘플을 10 초 동안 음파처리하고, 이어서, 10 초 동안 정지시켰다. 고정을 10회 반복하였다. 펩티드 혼합물을 함유하는 상청액을 샘플 튜브로부터 제거하고, 새로운 튜브에 옮겼다. 절차를 2회 반복하였다. 합한 상청액을 SpeedVac 농축기에서 건조시키고, LC-MS/MS 분석을 수행하였다.

내독소 측정. 내독소 수준을 Pierce^® LAL 발색 내독소 정량화 키트(Pierce^® LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit)(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플을 10, 20, 100, 및 1000-배로 희석시키면서, 내독소 표준을 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.31, 0.15, 및 0 ng/ml로서 제조하였다. 마이크로플레이트가 37℃에서 10 분 동안 열 쇼크에서 평형화된 후에, 단백질 샘플 또는 표준을 37℃에서 10 분 동안 무-내독소 웰 내에서 Limulus Amebocye Lasate(LAL) Pyrochrome 시약(최종 부피 100 μl)(1:1)과 혼합하였다. 100 μl의 기질 용액(substrate solution)을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 6 분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 50 μl 정지 시약(25% 아세트산)의 첨가에 의해서 정지시켰다. 웰의 흡광도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 흡광도 대 표준의 상응하는 농도를 블로팅함으로써 얻었다. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 내독소 농도를 측정하였다. 모든 정제된 단백질의 내독소 값은 < 0.5 ng/ml이었다.

마우스 백신 처리. 애주번트 C34를 기재된 바와 같이 화학적으로 합성하였고, DMSO에 용해시켰다. 주령 6- 내지 8-주의 자성 BALB/c 마우스(그룹 당 n=10)를 PBS, pH 7.4 중의 20 μg의 정제된 키메릭 HA_fg 또는 HA_mg 단백질로 근육내 면역시키고, 50 μg의 암모늄 하이드록사이드 (Alum; Sigma) 또는 2 μg의 C34와 혼합하였다. 대조군 마우스에는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 주사하였다. 3회의 백신 접종이 2-주일 간격으로 주어졌다. 혈액을 제2 또는 제3 면역 후 14일에 수거하였다. 혈액을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였고, 1,2000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 혈청을 수거하였다. 백신처리된 마우스로부터 수거된 혈청 중의 HA-특이적 항체를 효소-결합된 면역 흡착 분석(ELISA) 및 중화 분석에 의해서 분석하였다.

ELISA에 의한 HA-특이적 항체의 측정. HA-특이적 항체 역가를 기질로서 H1N1 A/Brisbane/59/2007, H1N1 A/California/07/2009, H3N2 Brisbane/10/2007, H7N9 A/Shanghai/2/2013 및 H5N1 Vietnam/1194/2004 HA 단백질을 사용하여 ELISA에 의해서 검출하였다. 96 웰 ELISA 플레이트(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)를 웰 당 5 μg/ml의 농도로 ELISA 코팅 완충액, 100 mM 중탄산 나트륨(pH 8.8) 중에 희석된 100 μl의 단백질로 코팅하고, 4℃에서 밤새 플라스틱 밀봉기로 덮었다. 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 TBST(137 mM NaCl, 20 mM Tris-base, 0.05% Tween 20, pH 7.4) 중의 1% BSA로 블로킹하고 TBST로 3회 세척한 후에, 플레이트를 37℃에서 2 시간 동안 2-배 일련의 희석액 중의 200 μl의 마우스 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 혈청을 제거하고 플레이트를 6회 세척한 후에, HA-특이적 IgG를 200 μl의 이차 HRP-표지된 항-마우스 항체(1:8000) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 모니터링하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 플레이트를 TBST로 6회 세척하고, 1분 동안 100 μl의 Super Aquablue ELISA 기질(eBioscience, San Diego, CA, USA)로 전개시켰다. 반응을 100 μl의 0.625 M 옥살산의 첨가에 의해서 정지시켰다. 웰의 흡광도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 종점 항체 역가는 음성 대조군(면역전 혈청)에 의해서 생산된 광학적 흡광도(OD)보다 2.5배 더 높은 흡광도를 생성시키기 위한 최고 혈청 희석액으로서 정의되었다. 배경 종점 항체 역가는 1:50 미만으로서 할당되었다.

골수-유래된 수지상 세포의 수확. The GM-CSF-배양된 골수-유래된 수지상 세포(bone marrow-derived dendritic cell: BMDC)를 앞서 기재된 바와 같이 제조하였다. 요약하면, 골수 단일 세포 현탁액을 RBC 용해에 가하여 적혈구(red blood cell: RBC)를 제거하였다. 남아있는 세포를 20 ng/mL 쥐 GM-CSF(eBioscience), 10% FBS(BenchMark), 50 μM 2-ME, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 10 ml의 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 세포를 각각의 페트리 디쉬(petri dish) 내로 플레이팅하여 2 x 10⁶ 세포/페트리 디쉬의 최종 세포 밀도를 달성하였다. 배양을 3일째에 20 ng/mL 쥐 GM-CSF를 함유하는 10 ml의 신선한 배양 배지를 첨가함으로써 보충하고, 6일째에 상기 기재된 바와 같은 1/2 부피의 완전 배양 배지로 다시채웠다. 8일째에, 미성숙 BMDC를 비부착 세포를 부드럽게 피펫팅(pipetting)함으로써 수거하여 수확하였고, 세포를 10⁶/ml의 밀도로 재플레이팅하였다. CD8+ T 세포 분석을 위해서, 미성숙 BMDC를 48 시간 동안 CD8+ T 세포 및 키메릭 HA 단백질(0.1 mg/100 μL의 웰)과 함께 공동-배양하였다. CD8+ T 세포를 생성시키는 그랜자임 B의 수를 세척 후에 유세포 분석에 의해서 측정하였다.

효소-결합된 면역점(enzyme-linked immunospot: ELISpot) 분석. ELISPOT 플레이트를 제조자의 지시에 따라서 항-마우스 IFN-γ, IL-4(Mabtech AB, Stockholm, Sweden) 또는 그랜자임 B(R&D Systems)로 코팅하였다. 플레이트를 4회 세척하고, 10 % 소 태아 혈청(Gibco)으로 보충된 RPMI-1640로 30분 동안 인큐베이션하였다. 키메라-면역된 마우스로부터의 IFN-γ, IL-4 및 그랜자임 B-분비 세포의 검출을 위해서, 비장 세포를 수거하고, 재자극을 위한 HA로부터의 특이적 펩티드와 함께 5% CO2 중의 37℃에서 24 시간 동안 웰 당 5 X 10⁵에서 배양하였다. 세포를 제거하고, 비오티닐화된 항-마우스 IFN-γ, IL-4(Mabtech AB) 또는 그랜자임 B(R&D Systems) 특이적 항체와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 스트렙타비딘-ALP 컨주게이트의 첨가 전에 5회 세척하였고, 사용 준비된 BCIP/NPT 기질로 전개시켰다. 건조 후에, 생성되는 스폿(spot)의 수를 Immune Spot Reader (Cellular Technology Ltd.)로 분석하였다. 데이터는 삼중의 웰로부터 얻었다.

중화 분석. 바이러스의 100 TCID₅₀를 함유하는 배양 상청액을 동일한 부피의 일련의 2배 희석된 혈청과 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내의 MDCK 세포에 첨가하고, 37℃에서 3일 동인 인큐베이션하였다. 세포에 30 μl의 CellTiter-Glo (Promega)를 첨가하여 존재하는 ATP의 양을 기반으로 하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 혈청의 중화 활성을 바이러스-유도된 치사로부터 세포를 유의하게 보호하는 최대 희석 배수로서 측정하였다.

미세중화 분석(Microneutralization assay). 100 TCID₅₀의 바이러스를 함유하는 감염 배지(0.3 %BSA, 2 μg/ml TPCK-트립신으로 보충된 DMEM)을 동일한 부피로 일련의 2-배 혈청 희석액과 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내의 MDCK 세포(웰 당 1.5x10⁴ 세포)에 첨가하고, 37℃에서 16-20 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 아세톤/메탄올 용액(vol/vol 1:1)에 고정시키고, 5% 탈지유로 블로킹하였다. 37℃에서 1 시간의 인큐베이션 후에, 웰을 PBST로 6회 세척하고, 바이러스 역가를 인플루엔자 A NP(1:2500)에 대항하는 100 μl의 mAb를 사용하여 모니터링하였다. 37℃에서 1 시간의 인큐베이션 후에, 웰을 PBST로 6회 세척하고, 100 μl의 이차 HRP-표지된 항-토끼 항체(1:5000)(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 첨가하였다. 37℃에서 1 시간의 인큐베이션 후에, 웰을 다시 PBST로 6회 세척하고, 50 μl의 1-Step Ultra TMB 기질(Thermo)로 1분 동안 전개시켰다. 반응을 50 μl의 1 M H₂SO₄의 첨가에 의해서 정지시켰다. 웰의 흡광도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

항체 의존성 세포 매개 세포독성 리포터 분석. 96-웰 평탄-바닥 플레이트의 각각의 웰 내의 MDCK 세포 (웰 당 1x10⁴ 세포)를 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 다음날, 1x10⁴ MDCK 세포를 1의 감염 다중도(multiplicity of infection)에서 24 시간 동안 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 이어서, 배지를 4% 낮은 IgG 혈청으로 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지 1640로 대체한 다음, 키메릭 HA 단백질-백신 처리된 마우스로부터의 일련의 항혈청 희석액을 첨가하고, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 마우스 FcγRIII (Promega)를 발현하는 Jurkat 이펙터 세포를 4% 낮은 IgG FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁시키고, 1:5 비율의 표적 세포:이펙터 세포를 감염된 MDCK 세포에 첨가하였다. 37℃에서 6 시간 동안 인큐베이션 후에, 분석 플레이트를 37℃ 인큐베이터로부터 제거하고, 주위 온도에서 15 분 동안 평형시킨 후에, Bio-Glo™ 루시페라제 분석 완충액(Promega)을 1:1 비율로 첨가하였다. CLARIOstar 플레이트-판독기 상에서 발광을 측정하였다.

바이러스 도전 실험. 2 주일 간격으로 3회의 백신 접종 2 주일 후에, 면역된 마우스를 10 LD₅₀(50%의 마우스 치사를 유도하는 바이러스 투여량)의 H1N1 California/07/2009, H1N1 A/New Caledonia/1999, H1N1 A/WSN/1933, H1N1 A/Solomon Islands/03/2006 및 재배열 H5N1 바이러스 A/Vietnam/1194/2004/NIBRG14 및 H5N1 A/Turkey/1/2005/NIBRG23로 비강내 도전시켰다. 감염 후에, 마우스를 14일 동안 매일 관찰하였고, 생존율 및 체중을 기록하였다. 체중의 백분율을 매일 매일의 체중을 도전전의 체중과 비교함으로써 그룹 당 각각의 개별적인 동물에 대해서 계산하고, 이들의 초기 체중의 25% 초과 손실한 마우스를 희생시키고 사망으로 점수를 매겼다. 마우스 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica에 의해서 승인되었다. 모든 동물 실험은 생물안전 수준(biosafety level)-3 향상 조건 하에 수행되었다.

재조합 F10 항체의 발현 및 정제. F10 항체를 인코딩하는 플라스미들 폴리에틸렌이민을 사용하여 혈청-비함유 조절된 FreeStyleTM 293F 세포 내로 형질감염시키고, 궤도 셰이커 플랫폼(orbital shaker platform) 상에서 135 rpm으로 회전하는 125 ml 무균 Erlenmeyer 플라스크 내의 FreeStyleTM 293 발현 배지(Gibco)에서 배양하였다. 상청액을 형질감염 72 시간 후에 수거하고, 세포를 1,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 상청액을 5 컬럼 부피(Column Volume: CV)의 포스페이트 완충된 염수(PBS) 세척 완충액(pH 7.0)에 사전-평형시킨 다음, 5 CV의 세척 완충액으로 세척하였다. F10 항체를 0.2 M 글리신 완충액(pH 2.5)으로 용리시키고, 분획들을 중화를 위한 0.5 mL 1 M Tris-HCl pH 9.0를 함유하는 튜브내로 수거하였다. SDS-PAGE를 사용하여 정제를 모니터링하였다.

통계적 분석. 면역 반응의 평가를 위해서 사용된 동물 실험을 적어도 3회(그룹 당 n=5) 반복하고, 바이러스 도전 연구를 적어도 2회(그룹 당 n=10) 수행하였다. 각각의 마우스의 반응을 통계적 분석을 위한 개별적인 데이터 점으로서 계수하엿다. 동물 연구로부터 얻은 데이터를 Prism으로부터의 이원분산분석을 이용하여 검사하였고; 데이터를 평균 ± SEM로 나타내고, 차이는 *P < 0.05; **P <0.01; ***P < 0.001에서 유의한 것으로 여겼다.

실시예 1: 모노글리코실화된 키메릭 HA의 제조 및 특성화

범용 백신을 설계하기 위해서, 먼저, 인플루엔자 A 바이러스 그룹 1(H1 및 H5가 주요 서브타입이면서, H2, H6, 및 H9가 소수임)에 대항한 광범위한 방어를 갖는 백신을 얻는 것을 목적으로 하였다. 따라서, 초기 2009년 내지 2013년에 이용 가능한 H1N1 바이러스로부터의 HA 서열을 사용하여 공통 H1 서열을 생성시켰다. 이어서, 공통 H5 및 공통 H1을 백신 설계를 위한 주형으로서 사용하였다. 인플루엔자 바이러스 복제에서, HA 전구체(HA precursor: HA0)는 두 서브단위, HA1 및 HA2로 단백질 분해 방식으로 분해되고; HA1 서브단위는 5-N-아세틸뉴라민산(시알산) 결합 부위를 보유하고, HA2 서브단위는 숙주 세포 막과의 바이러스 융합에 원인이 된다(도 5a). 다른 한편으로, HA는, 3-차원(3D) 구조를 기반으로 하여, 2개의 구조적 도메인, 구형 헤드 및 줄기로 구분될 수 있다. 줄기 영역은 HA2 도메인, N-말단 36~50 잔기 및 HA1 도메인의 C 말단의 짧은 스트레치(stretch)를 함유한다. 그에 따라서, H1 및 H5로부터의 도멘인들의 다양한 조합을 기반으로 한 백신을 설계하였다. 먼저, 비교를 위한 스왑 H1/5 (H1 구형 헤드 및 [H1+H5(HA2) 줄기], 스왑 H5/1(H5 구형 헤드 및 [H5+H1(HA2) 줄기], 및 키메릭 H5/1(H5 구형 헤드 및 H1 줄기)를 생성시켰다(도 1a 및 도 5a). 결과는 공통 H1N1 및 스왑 H1/5에 의한 면역은 교차-방어 활성을 유도하지 않지만, 스왑 H5/1 및 키메릭 H5/1는 H1N1 및 H5N1 바이러스에 대항한 교차-중화 활성을 유발시켰음을 나타냈다(도 1b). 다음으로, 이러한 교차-방어가 CD8⁺ T 세포 반응으로부터 기여되었는지를 조사하였고, 그랜자임 B가 키메릭 H5/1-면역된 마우스에서 더 많이 분비되었음을 발견하였고, 이는 키메릭 H5/1 백신이 스왑 H5/1 백신과 비교하여 더 강한 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하였음을 암시한다(도 1c).

실시예 2: 키메릭 H5/1(cHA)의 면역 반응에 대한 글리코실화의 효과

상이한 글리코실화 상태를 갖는 키메릭 H5/1 (cHA) 백신의 면역원성을 탐구하기 위해서, 모노글리코실화된 cHA(cHA_mg) 및 완전히 글리코실화된 cHA(cHA_fg) 백신을 비교하였다(도 5). Endo-H가 고 만노오스에 특이적이지만 복합체-타입 글리칸에는 그렇지 않음이 공지되어 있다. N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 I이 결핍되어 있고 고-만노오스-타입 N-글리칸을 갖는 글리코단백질을 생성시키는, HEK293S 세포에서 발현된 HA 글리코단백질을 Endo-H로 처리하여 N-글리칸을 단일의 GlcNAc 잔기로 분열시켰다. cHA_mg를 생성시키기 위해서, cHA를 인간 세포(HEK293S)로부터 생성시키고, 고-만노오스 글리칸을 갖는 정제된 cHA를 Endo-H로 처리하여 N-글리칸의 외부 부분을 제거하여 각각의 글리코사이트의 아스파라긴 잔기에 연결된 단지 하나의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 HA를 생성시켰다. Endo-H 처리 후에, 혼합물을 겔 여과에 통과시켜 삼량체 cHA_mg로부터 Endo-H를 분리하였다. 농축 후에, cHA_mg 단백질을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS/PAGE) 및 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 가하여 순도 및 글리칸 조성을 확실히 하였다(도 5c). 인플루엔자 HA는 바이러스 표면 상에 삼량체로서 존재하기 때문에, 겔 여과를 수행하여 cHA_fg 및 cHA_mg가 삼량체(>200 kDa)로서 존재하였음을 확인하였다(도 5d). 또한 비교를 위한 인간 세포(HEK293T)로부터의 또 다른 완전히 글리코실화된 cHA_fg를 생성시키고(도 5b), 세포 배양하여 ~6 mg/L의 cHA_fg를 생성시켰다.

재조합 cHA_fg 및 cHA_mg의 N-연결된 글리코실화 부위 및 글리칸 프로파일을 7개의 글리코실화 부위(N28, N40, N171, N182, N292, N303, 및 N497)를 나타내는 LC-MS/MS에 의해서 분석하였고; cHA_fg의 N-글리칸은 대체로 복합체 유형이었고, cHA_mg는 이의 N-글리코실화 부위의 각각에서 단지 GlcNAc을 갖는 단일 클리코폼(glycoform)으로서 ~ 99%로 얻어질 수 있다(도 5e 및 표 1).

표 1: LC-MS/MS에 의해서 분석된 완전--글리코실화된 및 모노-글리코실화된 단백질의 N-연결된 글리칸 구조

실시예 3: 완전 글리코실화된 키메릭 H5/1(cHA _fg ) 및 모노글리코실화된 키메릭 H5/1(cHA _mg )으로 면역된 마우스로부터의 항혈청의 교차-반응성

cHA 구성물에 의해서 유발된 항체의 결합 활성을 평가하기 위해서, BALB/c 마우스를 α-갈락토실세라미드(α-GalCer)의 유사체인 Al(OH)₃ 또는 C34로 보조된 20 μg의 cHA_fg 또는 cHA_mg 단백질로 근육내 면역시켰다. 마우스를 0, 2, 및 4 주일에서 면역시키고, HA-유도된 혈청을 28일 및 42일에 얻었고, 다양한 재조합 HA로 효소-결합된 면역 흡착 분석 (ELISA)을 사용하여 측정하였다(도 6). 2회의 면역 후의 항혈청의 최대 희석액과 비교하면, 3회의 면역은 사실 더 높은 HA-특이적 항체 역가를 갖는 항혈청을 생성시켰고(도 1d 내지 도 1i 및 도 7), cHA_mg에 의한 백신 접종은 cHA_fg에 비해서 더 우수한 항체 반응을 유도하였다(도 1d, 도 1e 및 도 1g). 또한, cHA_mg로부터의 항혈청은 H3 및 H7 HA 단백질에 대한 약간 더 우수한 결합을 나타냈고(도 1f 및 도 1h), Al(OH)₃과 C34 애주번트 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 cHA 백신이 H1N1, H3N2, H5N1 뿐만 아니라 H7N9 균주로부터의 HA를 인식하는 교차-반응성 항체를 유도할 수 있음을 나타낸다.

F10은, 인플루엔자 바이러스의 다양한 서브타입 중에 고도로 보존되는, HA의 표적 줄기에 대한 공지된 광범위한 중화 IgG 항체이다. F10의 결합을 재조합 H1, H5, 및 cHA과 비교하기 위해서, 다양한 HA에 대한 F10의 결합 활성을 측정하였고, 결과는 F10이 H1, H5, 및 cHA 단백질을 결합시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 8). F10-유사 항체가 cHA 백신 접종에 의해서 유발되었는지를 조사하기 위해서, HA 줄기 번호 4900에 대한 cHA-유도된 혈청의 결합을 ELISA를 사용하여 측정하였다. 결과는 cHA_mg 백신이 cHAfg보다 더 높은 줄기-특이적 항체 역가를 유도할 수 있음을 나타냈고(도 1i 및 도 7f), 더 우수한 결과가 더 많은 줄기-특이적 항체를 유도하는 C34-보조된 cHA 백신(도 1i)에 의해서 관찰되었다.

실시예 4: H1, H3, H5 바이러스 뿐만 아니라 이들의 서브타입에 대항한 강한 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T-세포 반응 및 항체-의존 이펙터 기능, 및 중화 활성을 유도하는 cHA _mg 및 애주번트 C34에 의한 마우스의 백신 접종

항체-매개된 중화 외에, Fc-매개된 이펙터 기능은 또한 인플루엔자 감염에 대항하는 방어에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 항체가 Fc 수용체-매개된 면역 반응을 유도할 수 있는지를 검사하였다. 마우스-조절된 ADCC 분석을 FcγRIII를 발현하는 Jurkat 이펙터 세포를 사용하여 수행하여, cHA_fg- 및 cHA_mg-면역된 마우스로부터의 혈청의 ADCC 활성을 평가하였다(도 2). 예상된 바와 같이, cHA_fg- 또는 cHA_mg-백신 처리된 마우스는 H5N1 NIBRG14(A/Vietnam/1194/2004), NIBRG23 (A/Turkey/1/2005), RG5(A/Anhui/1/2005), 또는 RG2(A/Indonesia/5/ 2005) 바이러스에 대항한 비견할만한 ADCC 활성 수준을 유도하였다. 흥미롭게도, Al(OH)3로 보조된 cHA_mg 그룹에서 더 우수한 ADCC 활성이 관찰되었고(도 2b), 유사한 결과가 H1N1 A/California/07/2009, A/Brisbane/59/2007, A/Solomon Islands/3/2006, A/New Caledonia/20/1999(도 2a), H3N2 A/Wisconsin/67/2005, 및 A/Victoria/361/2011 바이러스(도 2c)에서 관찰되었다.

cHA-면역된 마우스에서의 항원-특이적 사이토카인-분비 세포의 역할을 평가하기 위해서, 비장 세포를 2 및 3회 면역 후에 수거하고, IFN-γ, IL-4, 및 그랜자임 B(GzB)-분비 세포를 자극을 위한 HA로부터의 특이적 펩티드로 효소-결합된 면역 흡착점(ELISpot) 분석에 의해서 산정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, Al(OH)₃로 보조된 cHA_fg 및 cHA_mg 백신이 유사한 수준의 사이토카인-분비 세포를 생성시켰다. 그러나,

더 많은 CD4⁺/IFN-γ⁺ Th1 세포(Fig. 3A), CD4⁺/IL-4⁺ Th2(Fig. 3B), 및 CD8⁺ GzB-분비 세포(도 3c)가 Al(OH)₃보다 C34로 보조된 cHA_mg 백신 접종에서 유발되었다. 이러한 결과는 C34로 보조된 cHA_mg가 cHA_fg에 비해서 더 많은 CD4⁺ T 헬퍼 반응 및 더 강한 CD8⁺ 세포독성 효과를 자극할 수 있다.

항체 역가 및 세포-매개된 면역성에 대한 C34의 투여량 의존을 평가하기 위해서, 마우스를 0.5, 2, 및 10 μg의 C34의 세 가지 상이한 투여량으로 보조된 cHA_fg로 근육내 면역시켰다. 결과는 2 μg의 C34로 보조된 cHA_fg가 2 또는 3회 면역 후에 0.5 및 10 μg의 C34에 의한 것보다 더 강한 역가를 유도하였음을 나타냈다(도 9). 또한, 2 μg의 C34으로 보조된 cHA_fg 백신은 0.5 및 10 μg의 C34에 의한 것보다 더 많은 IFN-γ를 유도하였고(도 10a), 2 및 10 μg의 C34는 세 번의 면역 후에 0.5 μg의 C34에 의한 것보다 더 많은 IL-4를 유도하였다(도 10b). 다른 한편으로, 2 또는 3회 면역 후에, cHA_fg 백신이 0.5, 2, 또는 10 μg의 C34로 보조된 때의 CD8⁺ GzB-분비 세포에서의 증가와 관련하여 차이가 없었다(도 10c). 이들 관찰을 기반으로 하여, 2 μg의 C34가 실험 전체에 걸쳐서 사용되었다.

cHA-유도된 항혈청의 중화 활성을 추가로 조사하였다. cHA_mg 백신 접종으로부터의 항혈청은 균질 바이러스 H1N1 A/California/07/2009(도 3d) 및 균질 H5N1 NIBRG14(A/Vietnam/1194/2004), NIBRG23(A/Turkey/1/2005), RG5(A/Anhui/1/2005), 또는 RG2 (A/Indonesia/5/2005)(도 3e)에 대항하는 더 우수한 중화 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, cHA_mg으로 백신 처리된 마우스로부터의 항혈청은 이질성 바이러스 H1N1 A/Brisbane/59/2007, A/New Caledonia/20/1999, 및 A/Solomon Islands/3/2006(도 3d)에 대항하는 유의한 중화 활성을 나타낸다. cHA-면역된 마우스로부터의 항혈청은 명확하게는 H1N1 및 H5N1 바이러스의 감염을 차단할 수 있었으며, cHA_mg의 중화 활성은, 일반적으로 cHA_fg보다 더 우수하였으며, 특히, 이질성 바이러스에 대항해서 더 우수하였다.

실시예 5: 도전 연구에서의 H1N1 및 H5N1 뿐만 아니라 이들의 서브타입에 대항하는 교차-방어를 제공하는 cHA _mg /C34를 갖는 마우스의 백신 접종

cHA_mg 백신 접종이 다양한 H1N1 및 H5N1 바이러스에 대항하는 광범위한 교차-방어 면역성을 제공하는지를 분석하기 위해서, 백신 처리된 마우스를 치사량의 복수의 H1N1 및 H5N1 바이러스로 비강내 접종함으로써 도전시켰고, 백신 방어의 효능을 생존율 및 체중 변화를 측정함으로써 14일 동안 평가하였다(도 4 및 도 11). H1N1 A/California/07/2009 바이러스로 도전된 마우스의 경우에, 모든 cHA 백신이 100% 방어를 제공하였다(도 4a). 또한, C34-보조된 cHA_mg로 면역된 마우스는 cHAfg와 비교하여 최소의 질량 손실량을 나타냈다(도 11a). 단지 C34-보조된 cHAfg로 면역된 마우스는 A/New Caledonia/1999 도전에 대항하여 30% 방어를 부여했지만, C34로 보조된 cHA_mg 백신은 교차-균주 A/New Caledonia/1999 바이러스에 대항하여 90% 방어를 제공하였고, 유사한 결과가 Al(OH)₃-보조된 cHA 백신 접종에서 관찰되었다(도 4b). 교차-균주 A/WSN/1933 바이러스로 도전된 마우스의 경우에, Al(OH)₃-보조된 cHA로 면역된 모든 마우스가 살아남았지만; 단지 C34-보조된 cHA_fg로 면역된 마우스는 80% 방어를 부여했다(도 4c). 치사 도전을 또한 A/Solomon Islands/03/2006로 수행하였다. Al(OH)₃-보조된 cHA로 면역된 모든 마우스가 더 낮은 방어를 나타냈지만; C34-보조된 cHA_mg로 면역된 마우스는 교차-균주 A/Solomon Islands/03/2006 바이러스에 대항하여 더 우수한 방어를 나타냈다(도 4d). H5N1 NIBRG14(A/Vietnam/1194/2004) 및 NIBRG23(A/Turkey/1/2005)로 도전된 마우스의 경우에, 모든 면역된 마우스가 살아남았다(도 4e 및 도 4f). 바이러스 도전 후의 체중 변화가 또한 평가되었다(도 11). 데이터는 cHA가 다양한 H1N1 및 H5N1 바이러스에 대항하는 유의한 방어 면역을 유발시키는데 효과적이었고, cHA_mg는 cHA_fg에 비해서 더 넓은 교차-방어 능력을 제공하고 있는 것으로 나타났다.

인플루엔자 바이러스의 다중의 균주 및 서브타입에 대항한 방어를 제공하기 위한 범용 인플루엔자 백신의 개발이 현재 관심사이고, 범용 백신 개발을 위해서 사용된 에피토프는 24개의 비글리코실화된 아미노산을 함유하는 M2의 고도로 보존된 엑토도메인(ectodomain), 뉴클레오프로테인 NP, 및 광범위한 중화 항체의 더 높은 역가를 유도하여 HA-줄기 영역을 표적하거나 바이러스 진입을 차단하는 것으로 밝혀진 다얗나 HA 구성물을 포함한다. 예를 들어, 재정렬된 줄기 서브단위를 갖는 가용성 삼량체 HA(mini-HA) 백신은 이질성 및 헤테로서브타입 바이러스(heterologous and heterosubtypic virus)에 의한 치사량 도전으로부터 마우스를 완전히 방어하는 것으로 밝혀졌고, 동일한 줄기 영역 및 분기성 엑조틱 헤드 도메인(divergent exotic head domain)에 대한 DNA 프라임-단백질 부스트 및 노출(DNA prime-protein boost and exposure)에 의한 키메릭 HA 백신 접종은 광범위한 방어적 줄기-특이적 항체를 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 결과는 CD8⁺ T 세포가 교차-방어 활성에서 주요 역할을 하지 않았음을 나타냈다. 비록, DNA 백신이 유망하지만, 이들은 초기 개발 단계에 있다. 본 연구에서는, 구형 헤드의 공통 H5 및 줄기 영역의 공통 H1을 발현하는 cHA 구성물은 조류 바이러스로부터 인간으로 전이하는 인플루엔자 바이러스의 실제 상태를 의태(mimic)하도록 설계되었다. 완전히 글리코실화된 cHA_fg 및 모노글리코실화된 cHA_mg 둘 모두를 비교를 위해서 제조하였고, 결과는 cHA_mg 백신이 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 반응(도 3a 내지 도 3c)을 통한 H1, H3, H5, 및 H7 서브타입(도 1d 내지 도 1h)에 대항한 교차-반응 항체의 더 높은 역가를 유발시켰음을 나타냈다.

HA의 글리코실화는 단백질 폴딩(protein folding) 및 안정성에서 그리고, 중화 항체로부터의 항원 부위를 차폐시켜 면역원성을 감소시킴을 포함한, 이의 생물학적 활성을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 과글리코실화된 HA는 고도의 가변성 헤드 도메인에서의 항원 부위를 가리도록 진화되었고, 그에 따라서, 면역 반응은 보존된 줄기 영역을 향해서 재유도되었다. 본 발명의 발명자들의 결과에서, cHA_mg 항혈청의 중화 활성은, 특히, 이종 H1N1 A/Brisbane/59/2007, A/Solomon Islands/03/2006, 및 A/New Caledonia/20/1999(도3d)에 대항한, cHA_fg-유도된 항혈청에 비해서 유의하게 우수하였다. cHA_mg 백신의 더 넓은 중화 활성은 가능하게는 앞서 보고된 바와 같은 더 많은 항체 변이체의 이의 유도에 기인한다. IgG는 마우스에 존재하는 우세한 항체이고, ADCC를 유도하기 위한 면역 세포 상의 FcγRIII 수용체에 대한 높은 활성을 갖는 HA-특이적 항체의 주요 서브타입이다. 본 발명의 발명자들은, ADCC가 생체내 인플루엔자 방어에 필요함을 나타내는 연구와 일치되게, cHA_mg에 의한 면역이 더 높은 ADCC 및 더 우수한 방어 활성을 갖는 더욱 많은 줄기-특이적 할체를 유도하였음을 확인하였다(도 1i 및 도 2). 암모늄 하이드록사이드(Alum)는 Th2 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있으며, 백신 애주번트로서의 사용에 대해서 FDA에 의해서 승인되었지만; 이의 작용 방식은 잘 연구되지 않았다. 당지질 C34는, 불변 천연 킬러 T(invariant natural killer T: iNKT) 세포 상의 수용체와 상호작용하여, iNKT 세포의 자극을 유도하여 애주번트 효과를 갖는 Th1 사이토카인(예, IFN-γ) 및 클래스-스위치 활성(class-switch activity)을 갖는 Th2 사이토카인(예, IL-4)을 생성시키기 위한, 수지상 세포 상의 CD1d에 대한 리간드이고 그에 의해서 표현된다. 본 발명의 발명자들의 결과에서, IFN-γ(Th1 사이토카인), IL-4(Th2 사이토카인)-분비 세포, 및 그랜자임 B-생산 CD8⁺ T 세포의 수는 Al(OH)₃에 의한 것보다는 C34에 의해서 보조된 cHA_mg에 의한 면역에 의해서 유의하게 증가되었다(도 3a 내지 도 3c).

요약하면, 넓은-방어 면역 반응을 갖는 차세대 인플루엔자 백신의 개발이 현재의 관심사이고, 범용 백신의 개발을 가능 범위 내에 있게 하는, 일부 유망한 결과가 보고되었다. 이러한 목적을 향한 노력에서, 본 발명의 발명자들은 본 연구에서 공통 H5 헤드 및 공통 H1 줄기를 갖는 모노글리코실화된 cHA 백신이, 중화 연구에서 H1, H3, H5, 및 H7 바이러스 및 서브타입 및 도전 연구에서 H1N1, H5N1, 및 서브타입을 포함한 이종 인플루엔자 바이러스에 대항하는 넓은 방어 활성을 나타내는, 효과적인 인플루엔자 백신이라는 원리의 증거를 성공적으로 입증하였다. 인플루엔자 A 바이러스의 상이한 균주 및 서브타입에 대항한 넓은 방어 백신의 개발에서의 성공으로, 본 발명의 발명자들은 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대항한 더 넓은 범용 백신을 설계하기 위한 본 연구에서 개발된 전략을 사용하는 것을 겨냥하고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ACADEMIA SINICA WONG, CHI-HUEY <120> CHIMERIC INFLUENZA VACCINES <130> 63/022,328 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu 35 40 <210> 2 <211> 237 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro 1 5 10 15 Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr Val 20 25 30 Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser 35 40 45 Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 50 55 60 Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn 65 70 75 80 Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala 85 90 95 Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn 100 105 110 Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg 115 120 125 Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp 130 135 140 Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu 145 150 155 160 Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Asn 165 170 175 Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 180 185 190 Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr 195 200 205 Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu 210 215 220 Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln 225 230 235 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val 1 5 10 15 Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val 20 25 30 Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu 35 40 45 Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 50 55 60 Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr 85 90 95 Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys 100 105 110 Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln 115 120 125 Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala 130 135 140 Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser 165 170 175 Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu 180 185 190 Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala 195 200 205 Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met 210 215 220 Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys 225 230 <210> 4 <211> 511 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric influenza virus HA polypeptide <400> 4 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr Ser 275 280 285 Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln 355 360 365 Asn Ala Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys 370 375 380 Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu 385 390 395 400 Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val 435 440 445 Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe 450 455 460 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln 500 505 510 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 5 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu 35 40 <210> 6 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> stem domain consensus sequence of H1 HA and H5 HA <400> 6 Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro 1 5 10 15 Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr Val 20 25 30 Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser 35 40 45 Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 50 55 60 Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn 65 70 75 80 Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala 85 90 95 Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn 100 105 110 Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg 115 120 125 Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp 130 135 140 Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu 145 150 155 160 Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu 165 170 175 Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe 180 185 190 Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr 195 200 205 Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu 210 215 220 Ile Ser Gly Val 225 <210> 7 <211> 234 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 7 Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile 1 5 10 15 Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr 35 40 45 Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser 65 70 75 80 Ser Trp Pro Asn His Asp Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro 85 90 95 His Ala Gly Ala Lys Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys 100 105 110 Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys 115 120 125 Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Thr 130 135 140 Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val 145 150 155 160 Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg 165 170 175 Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu 180 185 190 Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val 195 200 205 Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile 210 215 220 Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val His Asp Cys 225 230 <210> 8 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric influenza virus HA polypeptide <400> 8 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala 35 40 45 Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser 115 120 125 Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe 130 135 140 Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 165 170 175 Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Thr Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr 180 185 190 Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Lys 195 200 205 Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 210 215 220 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile 225 230 235 240 Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 245 250 255 Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val 260 265 270 His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr 275 280 285 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro 290 295 300 Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 305 310 315 320 Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 325 330 335 Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 340 345 350 His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr 355 360 365 Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp 370 375 380 Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu 385 390 395 400 Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu 405 410 415 Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu 420 425 430 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys 435 440 445 Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys 450 455 460 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg 465 470 475 480 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys 485 490 495 Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val 500 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 9 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu 35 40 <210> 10 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> stem domain consensus sequence of H1 HA and H5 HA <400> 10 Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro 1 5 10 15 Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val 20 25 30 Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln 35 40 45 Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 50 55 60 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 65 70 75 80 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 85 90 95 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 100 105 110 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 115 120 125 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 130 135 140 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 145 150 155 160 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 165 170 175 Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 180 185 190 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 195 200 205 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 210 215 220 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val 225 230 <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 11 Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val 1 5 10 15 Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val 20 25 30 Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu 35 40 45 Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 50 55 60 Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ser Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr 85 90 95 Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys 100 105 110 Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln 115 120 125 Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala 130 135 140 Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser 165 170 175 Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu 180 185 190 Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala 195 200 205 Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met 210 215 220 Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys 225 230 <210> 12 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric influenza virus HA polypeptide <400> 12 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 325 330 335 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350 Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu 355 360 365 Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Lys Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe 385 390 395 400 Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp 405 410 415 Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu 420 425 430 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 435 440 445 Tyr Glu Lys Val Arg Asn Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly 450 455 460 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu 465 470 475 480 Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala 485 490 495 Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val 500 505 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 13 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 14 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala

Claims

키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(chimeric influenza virus hemagglutinin: HA) 폴리펩티드로서, H1 서브타입 HA(H1 HA) 또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 구형 헤드 도메인 공통 서열(globular head domain consensus sequence)과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 구형 헤드 도메인 서열(globular head domain sequence)과 융합된, H1 서브타입 HA(H1 HA) 및/또는 H5 서브타입 HA(H5 HA)의 줄기 도메인 공통 서열(stem domain consensus sequence)과 적어도 60% 상동성을 각각 갖는 하나 이상의 줄기 도메인 서열(stem domain sequence)을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
HA가 인플루엔자 A HA, 인플루엔자 B HA, 또는 인플루엔자 C HA인, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
상동성이 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
줄기 도메인 서열이 H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1 HA의 C-말단 줄기 분절; H1 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절; 또는 H5 HA의 N-말단 줄기 분절 또는 H1+H5 HA 서열의 C-말단 줄기 분절인, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
H1 HA의 줄기 도메인 공통 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
H5 HA의 구형 헤드 도메인 공통 서열이 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
HA 상의 하나 이상의 글리코사이트(glycosite)가 모노글리코실화되고, 모노글리코실화된 HA가 각각의 글리코사이트 상에 단지 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서,
키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드가 면역원으로서 사용되는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한항의 키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩티드 및 애주번드를 포함하는 면역원성 조성물.
청구항 10에 있어서,
애주번트가 당지질 애주번트인, 면역원성 조성물.
인플루엔자 바이러스에 대항하여 대상체를 면역시키거나 인플루엔자 바이러스 질환을 예방하는 방법으로서, 유효량의 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 키메릭 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 폴리펩티드 또는 청구항 10의 면역원성 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서,
방법이 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 면역 반응을 유발시키는, 방법.
청구항 12에 있어서,
방법이 H1, H3, H5 및 H7 균주 및 서브타입에 대항한 더 높은 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC), 더 우수한 중화 및 더 강한 교차-방어 활성을 갖는 줄기-특이적 항체를 유도하는, 방법.
청구항 12에 있어서,
방법이 더 많은 IFN-γ, IL-4 및 CD8+ 기억 T 세포를 생성시키는 백신 효능을 향상시키는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열 및 임의로 시그널 펩티드(signal peptide)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 16에 있어서,
시그널 펩티드가 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
청구항 17의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(vector).
청구항 18의 벡터를 포함하는 숙주 세포.