TWI817041B - 嵌合血球凝集素蛋白質及包含其之疫苗組成物 - Google Patents

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Abstract

本揭露係提供一種包含HA1次單元和HA2次單元的嵌合血球凝集素(HA)蛋白質，其中，HA1次單元係由衍生自第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第一結構域，以及衍生自第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第二結構域所組成。嵌合HA蛋白質具有改善熱穩定性，並且可以用於預防流行性感冒病毒感染的疫苗組成物。本揭露另提供一種對有此需要之個體誘導針對流行性感冒病毒之免疫反應的方法，該方法係包括對該個體施用嵌合HA蛋白質，從而賦予該個體針對流行性感冒病毒感染的保護。

Description

嵌合血球凝集素蛋白質及包含其之疫苗組成物
本揭露涉及具高穩定性及免疫原性之嵌合血球凝集素(hemagglutinin，HA)蛋白質，其可用於生產有效的疫苗。本揭露另涉及一種用於預防病毒感染(例如，流行性感冒病毒感染)的方法。
長期以來，流行性感冒病毒(influenza virus)的感染是一種人類之間的嚴重流行疾病。季節性流行性感冒病毒每年在全世界造成約300萬到500萬例的嚴重感染病例及29萬到65萬的死亡病例[1]，而偶爾出現具人類感染力的禽流行性感冒病毒(例如，H5N1和H7N9)另外威脅著人類的健康和經濟。
在流行性感冒病毒的感染期間，醣蛋白血球凝集素(HA)係為關鍵的抗原決定因子，其負責與宿主細胞表面受體(例如含唾液酸的多醣)結合，並隨後進行胞內體膜融合。流行性感冒病毒的HA蛋白質係由HA1次單元和HA2次單元組成，其中，該HA1次單元係包含與唾液酸受體結合的受體結合位點(receptor binding site，RBS)，而該HA2次單元係包含負責形成三聚體[2]的融合胜肽和跨膜(transmembrane，TM)結構域。因此，HA蛋白質已成為開發抗流行性感冒之藥物和疫苗的主要目標。
惟，由於HA蛋白質的不穩定性，開發流行性感冒疫苗的研究人員易於面臨瓶頸[3-6]。舉例來說，HA的穩定性會影響疫苗的效用，因其顯著反應了疫苗的免疫原性和保存期限[4,7]。不穩定的HA可能容易形成融合後構形，甚至分解為單體，因而誘導辨識無效表位之抗體，而非解決感染所需的功能中和抗體，從而導致不僅保護作用降低，更會縮短疫苗的儲存壽命[3-6]。
於2013年，在中國發現會導致高死亡率的致命H7N9流行性感冒病毒[9]。此病毒持續在中國傳播，並導致全國流行。H7N9病毒已被歸類為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)，因此，迫切需要用於人類和家畜之有效的H7N9流行性感冒病毒疫苗[10]。然而，H7N9流行性感冒病毒的HA蛋白質相對不穩定，因而可能降低相應疫苗之有效免疫功效。因此，亟需一種改善流行性感冒病毒HA蛋白質之穩定性且不損害其免疫原性之有效疫苗，以滿足現有之需求。
本揭露係提供一種嵌合HA蛋白質，其係穩定的嵌合抗原，同時保持適當的免疫原性，因此可用於生產對抗流行性感冒病毒的有效疫苗。於本揭露中，嵌合HA蛋白質中之HA1次單元為嵌合次單元，亦即，其蛋白結構域係衍生自不同的HA1次單元，例如，H7亞型和H3亞型。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質係包含HA1次單元和HA2次單元，其中，該HA1次單元係由衍生自第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第一結構域，以及衍生自第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第二結構域所組成。於本揭露的另一些實施態樣中，該HA1次單元中的第二 結構域係選自由融合胜肽口袋、鄰近HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋(spring-loaded long coiled-coil helix)之HA1區域、HA1-HA1界面和HA1-HA2界面所組成群組的HA結構區域之至少一部分。於本揭露的一些實施態樣中，HA2次單元係第一亞型流行性感冒病毒的HA2次單元。
於本揭露的一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒和第二亞型流行性感冒病毒係獨立地選自由H1至H18亞型流行性感冒病毒所組成的群組，且該第一亞型流行性感冒病毒係不同於第二亞型流行性感冒病毒。於另一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒和第二亞型流行性感冒病毒係獨立地選自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11至H13及H16至H18亞型流行性感冒病毒所組成之群組，且該第一亞型流行性感冒病毒和該第二亞型流行性感冒病毒是不同的。於又一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒和第二亞型流行性感冒病毒係獨立地選自由H3、H4、H7、H10、H14及H15亞型流行性感冒病毒所組成之群組，且該第一亞型流行性感冒病毒係不同於該第二亞型流行性感冒病毒。
於本揭露的一些實施態樣中，該第一亞型流行性感冒病毒係H7亞型流行性感冒病毒，且該第二亞型流行性感冒病毒係H3亞型流行性感冒病毒。
於本揭露的一些實施態樣中，該第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元係衍生自H7N9流行性感冒病毒。於另一些實施態樣中，該第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元係具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，該第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元係衍生自H3N2流行性感冒病毒。於另一些實施態樣中，該第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元係具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元相比，該嵌合HA蛋白質的HA1次單元係具有小於100%的胺基酸序列一致性。於另一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元相 比，該HA1次單元係具有至少30%的胺基酸序列一致性。於又一些實施態樣中，該第一亞型流行性感冒病毒的HA1次單元與親代HA1次單元的胺基酸序列一致性係70%至95%之間。於另一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒的HA1次單元與親代HA1次單元的胺基酸序列一致性係88%至91%之間。
於本揭露的一些實施態樣中，該嵌合HA蛋白質係包含以下至少一者：(1)嵌合HA蛋白質的融合胜肽口袋，包括Ala、Thr、Leu、Asn、Lys和Arg；(2)鄰近嵌合HA蛋白質的HA2次單元之彈簧加載長捲曲螺旋的HA1區域，包括Asp和Ser；(3)嵌合HA蛋白質的HA1-HA1界面，包括Asn和Ser；以及(4)嵌合HA蛋白質的HA1-HA2界面，包括Arg、Val、Lys、Ile、Tyr和Ala。
於本揭露的一些實施態樣中，該HA1次單元中的第二結構域係衍生自選自由SEQ ID NO：2的位置#11至#13、#21、#25、#27、#29、#31至#34、#37、#42、#44至#45、#46至#50、#53至#56、#58、#185至#189、#193、#216至#217、#219、#228、#268至#269、#271至#274、#276、#278至#280、#282至#285、#287、#289至#292、#297至#302、#304、#307、#312至#313、#315、#321和#326至#329所組成群組的至少一種胺基酸、至少一種肽或其組合；舉例來說，位置#11至#13係指於SEQ ID NO：2的第11至13號位置、具有三個連續胺基酸的肽，而#21係指SEQ ID NO：2的第21號位置的單個胺基酸。
於本揭露的一些實施態樣中，該嵌合HA蛋白質係包含以下至少一者：(1)融合胜肽口袋，包括分別位於SEQ ID NO：12中第1、2、3、303、304、306和312號位置的Ala、Thr、Leu、Asn、Thr、Lys和Arg；(2)鄰近HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋之HA1區域，且該HA1區域係包括分別位於SEQ ID NO：12中第22和35號位置的Asp和Ser；以及(3)HA1-HA1界面，係包括分別位於SEQ ID NO：12中第207和210號位置的Asn和Ser。
於本揭露的一些實施態樣中，該嵌合HA蛋白質係包含HA1-HA2界面，包括分別位於SEQ ID NO：13中第259、287、289、290、292、294和297號位置的Arg、Val、Lys、Ile、Tyr、Ala和Lys。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質的HA1次單元係包含選自SEQ ID NO：3至8所組成的群組中的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，本揭露係提供一種疫苗組成物。該疫苗組成物係包含本揭露的嵌合HA蛋白質及藥學上可接受的載體和/或佐劑。於另一些實施態樣中，該佐劑是角鯊烯(squalene)佐劑、細胞激素(cytokine)佐劑、脂質佐劑和類鐸受體(Toll-like receptor，TLR)配體中的至少一種。
於本揭露的一些實施態樣中，該疫苗組成物中之嵌合HA蛋白質係以對有此需要之個體預防流行性感冒病毒感染或誘導針對流行性感冒病毒的免疫反應之有效量存在。
於本揭露的一些實施態樣中，該疫苗組成物係適合透過鼻內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、皮下和黏膜之途徑施用。
於本揭露的一些實施態樣中，本揭露係提供一種對有此需要之個體誘導針對流行性感冒病毒之免疫反應的方法。於本揭露的一些實施態樣中，本揭露係提供一種向個體給予針對流行性感冒病毒感染的保護之方法。於本揭露的一些實施態樣中，該流行性感冒病毒係H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7或H10N8之流行性感冒病毒。於另一些實施態樣中，流行性感冒病毒係H7N9流行性感冒病毒。
於本揭露的一些實施態樣中，該方法係包括對個體施用本揭露的疫苗組成物。於另一些實施態樣中，該個體係脊椎動物。於另一些實施態樣中，該個體係哺乳動物，例如，人。
於本揭露中，本揭露所提供之嵌合HA蛋白質不僅實現了更穩定的HA抗原的構建，且有效促進疫苗的改良，以對抗流行性感冒病毒的感染。
藉由參考所附圖式並閱讀以下實施方式的敘述，可更充分理解本揭露。
圖1A和圖1B係顯示H7-HA1和H3-HA1的不連續SCHEMA重組。圖1A係顯示H7-HA1次單元和H3-HA1次單元之間的不同胺基酸，藉由SCHEMA根據已知的蛋白質結構和序列比對後，區分為六個區塊(由不同顏色表示)。圖1B係顯示H7-HA1結構中所示的六個區塊，除了區塊B係劃分為兩個於肽序列中不連續的子域，此六區塊的劃分於3D結構的各個結構域中是連貫的。該H7-HA1係表示來自H7蛋白質(即來自H7亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質)的HA1次單元，該H3-HA1係表示來自H3蛋白質(即來自H3亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質)的HA1次單元。
圖2係顯示不同HA1次單元的構建體及其3D結構，其中，H7-HA1係指來自H7亞型流行性感冒病毒的HA1次單元；H3-HA1係指來自H3亞型流行性感冒病毒的HA1次單元；H7-HA2係指來自H7亞型流行性感冒病毒的HA2次單元；H3-HA2係指來自H3亞型流行性感冒病毒的HA2次單元；rA-HA1至rF-HA1係指六個嵌合HA1次單元。
圖3A和圖3B係顯示用於全長親代和嵌合HA蛋白質表現的重組桿狀病毒(baculovirus)構建體。圖3A係顯示全長親代和嵌合HA之表現載體的構建體。所有構建體均由多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter，p-polh)驅動，與N端GP64訊號肽(signal peptide，SP)和六聚組胺酸(hexameric histidine，6H) 標籤融合，並包括一個以pag啟動子(pag promoter，p-pag)驅動的DsRed基因，該DsRed基因係作為報導基因。透過將H7亞型流行性感冒病毒的HA2次單元融合到各別的嵌合HA1次單元rA至rF的C末端，以構建六個嵌合HA蛋白質，亦即，FrA至FrF。作為陰性對照之WT-DR病毒係由僅包含DsRed報導基因之空載體所生成。圖3B係顯示全長HA構建體的西方墨點法(Western blot)分析，以表現每種HA構建體的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，病毒感染劑量(multiplicity of infection，MOI)等於1。於感染後(days post infection，d.p.i.)第2天取得細胞裂解物，然後使用抗His抗體進行西方墨點法分析。透過抗甘油醛3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體檢測之甘油醛3磷酸脫氫酶作為內參對照(loading control)。
圖4A至圖4D係顯示嵌合HA蛋白質的不同HA結構區域的3D結構。圖4A係顯示嵌合HA蛋白質FrB的融合胜肽口袋，其中，Ala 1、Thr 2、Leu 3、Asn 303、Thr 304、Lys 306和Arg 312係指HA蛋白質FrB(SEQ ID NO：12)的胺基酸及其位置。圖4B係顯示鄰近嵌合HA蛋白質FrB的HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋的HA1區域，其中Asp 22和Ser 35指HA蛋白質FrB(SEQ ID NO：12)的胺基酸及其位置。圖4C係顯示嵌合HA蛋白質FrB的HA1-HA1界面，其中Asn 207和Ser 210係指HA蛋白質FrB(SEQ ID NO：12)的胺基酸及其位置。圖4D係顯示嵌合HA蛋白質FrC的HA1-HA2界面，其中Arg 259、Val 287、Lys 289、Ile 290、Tyr 292、Ala 294和Lys 297係指嵌合HA蛋白質FrC(SEQ ID NO：13)的胺基酸及其位置。為清楚地說明多種胺基酸，圖4D所示的HA1-HA2界面係以兩個圖式表示。
圖5係顯示透過免疫螢光測定法判定HA構建體的細胞表面表現，其中，Sf21細胞受具有不同HA結構之重組病毒以MOI等於1感染，且於感染後第2天以4%之多聚甲醛固定，HA蛋白質再經一級抗His抗體和二級Alexa Fluor 488 抗體(綠色螢光)染色。4',6-二醯胺基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色(藍色螢光)用以為複染。紅色螢光係來自各個重組病毒攜帶的DsRed報導基因。
圖6係顯示透過免疫螢光測定法判定FrA、FrD、FrE和FrF之定位，其中，Sf21細胞受表現FrA、FrD、FrE或FrF之重組病毒以MOI等於1感染，於感染後第2天固定，並將半數樣品以0.2%的Triton進行滲透。HA蛋白質的定位係由一級抗His抗體和二級Alexa Fluor 488抗體(綠色螢光)進行檢測，並以DAPI(藍色螢光)進行複染。自DsRed報導基因表現的正確紅色螢光係表明成功受病毒感染。
圖7係顯示透過H7抗體識別嵌合HA的特徵，其中ELISA分析顯示以桿狀病毒感染後表現各一種HA構建體之Sf21細胞作為抗原分析之結果。數據係以平均值±標準偏差(SD)表示，其係代表來自三個獨立實驗的三個重複資料。*表示相對於FH7之值的顯著差異(p<0.05)；ns：差異不顯著。
圖8A和圖8B係顯示透過血球凝集試驗分析嵌合HA的特徵。圖8A係顯示血球凝集試驗之概念，其中，於不存在表現HA的樣品的情況下，紅血球係於V底孔中沉澱，並於每個孔的中心形成紅色的點；於表現HA的樣品存在時，紅血球與顯示HA的昆蟲細胞結塊且形成晶格，並於V底孔中產生分散的淡紅色訊號。圖8B係顯示受重組桿狀病毒感染的Sf21細胞之血球凝集試驗，其中，每個樣品的HA效價(titer)係由仍具有HA活性的最高稀釋度的倒數而定。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)係指僅有緩衝液的對照；HA：純化的H7蛋白質(第一行代表500ng)；Non：未感染的Sf21細胞。
圖9係顯示用於判定HA穩定性之熱血球凝集試驗，其中，以64之初始HA效價製備受不同重組桿狀病毒感染的Hi5細胞，並於50℃下加熱指定的 時間段(0、5、10、20、30、60、90及120分鐘)。待冷卻至4℃後，透過血球凝集測定法測量細胞樣品的HA效價。數據係以平均值±SD表示，代表來自三個獨立實驗的三個重複資料。*表示於每個時間點相對於FH7效價的顯著差異(p<0.05)。
圖10A和圖10B係顯示FrB和FrC所引發的抗體識別原始的FH7抗原並抑制H7N9病毒感染。圖10A係以純化的FH7、FrB或FrC蛋白質或PBS進行腹膜內免疫的小鼠(n=5)，於初次免疫後第6週和第8週收集血清(1：10,000)，透過針對純化的FH7蛋白質之間接式ELISA測量特異性抗HA IgG抗體的結合水平。數據係以每組五隻小鼠且技術性重複三次的平均值±SD表示。圖10B顯示FH7、FrB或FrC免疫的小鼠血清針對H7N9流行性感冒病毒(A/台灣/01/2013菌株)感染的微量中和(microneutralization)測試。將小鼠血清進行2倍序列稀釋(初始濃度為1：10)，並與10倍50%組織培養感染劑量(TCID50)的H7N9流行性感冒病毒混合，以測定MDCK細胞受感染後的微量中和效價(無CPE時最高稀釋度的倒數)。數據係以每組五隻小鼠且技術性重複四次的平均值±SD表示。*表示相對於PBS的顯著差異(p<0.05)；†表示於指定時間點相對於FH7的顯著差異(p<0.05)。
以下係藉由特定的具體實施例用於說明本揭露之實施方式。熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本揭露之優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同之實施方式加以實現或應用。本說明書中的各項細節亦 可基於不同的觀點和應用，在不悖離本揭露所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
應注意的是，如本文所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確且明白地限於一個所指對象，否則包括複數個所指對象。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。
本揭露係涉及嵌合HA蛋白質及其在用於預防病毒感染之疫苗組成物中作為穩定HA抗原的用途。
本揭露之嵌合HA蛋白質係包含嵌合HA1次單元，其包含衍生自第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第一結構域，和衍生自第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的第二結構域。
於本揭露的一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒和第二亞型流行性感冒病毒係獨立地選自由H1至H18亞型流行性感冒病毒所組成的群組，且該第一亞型流行性感冒病毒和該第二亞型流行性感冒病毒是不同的。於本揭露的另一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒和第二亞型流行性感冒病毒係獨立地選自第一型流行性感冒病毒(例如，H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11至H13和H16至H18亞型流行性感冒病毒)，或第二型流行性感冒病毒(例如，H3、H4、H7、H10、H14和H15亞型流行性感冒病毒)。
本文所使用的術語「嵌合HA蛋白質」、「嵌合蛋白質」或「嵌合次單元」係指包含透過一個或多個肽鍵連接之至少兩個異源結構域的單個多肽單元，其中，不同的結構域並非天然地存在於同一多肽單元中。關於嵌合蛋白質的胺基酸序列，每個異源結構域可以對應於非連續胺基酸或多個肽片段。此等非連續胺基酸和肽片段可組裝為整合的且於結構上相互作用的結構域。例如，此類嵌合蛋白質可透過表現cDNA構建體或透過本領域已知的蛋白質合成方法獲得。
舉例來說，本揭露的嵌合HA1次單元可包含兩個衍生自HA蛋白質亞型H7和H3的結構域(即分別來自H7亞型流行性感冒病毒和H3亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質)，這意味著嵌合次單元可包含與來自H7亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質之天然存在的HA1次單元同源的多個非連續胺基酸和/或多個肽片段，以及與HA蛋白質亞型H3之天然存在的HA1次單元同源的多個非連續胺基酸和/或多個肽片段。
如本文所使用，術語「結構域」或「蛋白質嵌段」係指蛋白質中的包含至少一個胺基酸的一組胺基酸、至少一個肽或其組合。也就是說，蛋白質的結構域可為僅包含一個胺基酸、多個非連續胺基酸、僅一個肽、多個肽或其組合。例如，本揭露之嵌合HA1次單元中的第一結構域可以由衍生自第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元的胺基酸所組成。另外，蛋白結構域中的一些胺基酸可構成蛋白結構區域的一部分。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質之HA1次單元衍生自親代HA1次單元，例如，衍生自天然存在於H7N9流行性感冒病毒和H3N2流行性感冒病毒的HA1次單元。於另一些實施態樣中，H7N9流行性感冒病毒係A/安徽/1/2013菌株，而H3N2流行性感冒病毒係A/香港/1/1968菌株。
於本揭露的一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元包括與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。於另一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元包括與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。於另一 些實施態樣中，第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元相比，嵌合HA蛋白質的HA1次單元係具有30%至小於100%的胺基酸序列一致性，且相較於含親代HA1次單元之HA蛋白質，含此HA1次單元之嵌合HA蛋白質具有更高的熱穩定性和相當的免疫原性。於一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元相比，嵌合HA蛋白質的HA1次單元具有小於95%的胺基酸序列一致性。於另一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元相比，嵌合HA蛋白質的HA1次單元具有至少70%的胺基酸序列一致性。於又一些實施態樣中，與第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元相比，嵌合HA蛋白質的HA1次單元具有71%至94%的胺基酸序列一致性，例如，75%、80%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%和94%。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質的HA1次單元包含與選自由SEQ ID NO：3至8所組成群組的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，且分別具有與SEQ ID NO：3至8相同的功能。於另一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質的HA1次單元具有選自由SEQ ID NO：3至8所組成群組的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質包括與選自SEQ ID NO：11至16所組成群組的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列，且分別具有與SEQ ID NO：11至16相同的功能。於另一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質具有選自由SEQ ID NO：11至16所組成群組的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA1次單元中的第二結構域係選自由融合胜肽口袋、鄰近HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋之HA1區域、HA1-HA1界面和HA1-HA2界面所組成群組的HA結構區域的至少一部分。
舉例來說，HA結構區域可以包括：(1)融合胜肽口袋，亦即，鄰近圍繞著融合胜肽之HA1次單元的「F結構域」的區域；(2)鄰近HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋的HA1區域；(3)HA1-HA2界面，亦即，HA1受體結合結構域原聚體(protomer)之間的界面區域；或(4)HA1-HA1界面，即受體結合結構域、酯酶子結構域、螺旋C和環B之間的區域。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質可包含以下至少一者：(1)嵌合HA蛋白質的融合胜肽口袋，係包括Ala、Thr、Leu、Asn、Lys和Arg；(2)鄰近嵌合HA蛋白質的HA2次單元之彈簧加載長捲曲螺旋的HA1區域，係包括Asp和Ser；(3)嵌合HA蛋白質的HA1-HA1界面，係包括Asn和Ser；(4)嵌合HA蛋白質的HA1-HA2界面，係包括Arg、Val、Lys、Ile、Tyr和Ala。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA1次單元中的一部分胺基酸殘基經第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元於相應位置的胺基酸殘基取代，以於嵌合HA1次單元中形成第二結構域。於另一些實施態樣中，第二結構域係衍生自SEQ ID NO：2的位置#11至#13、#21、#25、#27、#29、#31至#34、#37、#42、#44至#45、#46至#50、#53至#56、#58、#185至#189、#193、#216至#217、#219、#228、#268至#269、#271至#274、#276、#278至#280、#282至#285、#287、#289至#292、#297至#302、#304、#307、#312至#313、#315、#321和#326至#329所組成群組中的至少一種胺基酸、至少一種肽或其組合。
如本文所使用，術語「序列一致性」、「胺基酸序列一致性」或「同源性」係描述兩個或多個核苷酸序列或胺基酸序列之間的序列關係。藉由於比較窗口中比較兩個最佳比對的序列以測定兩個序列之間的「序列一致性」百分 比，其中，相較於參考序列(不包含添加或刪除)，比較窗口中序列的部分可包括添加或刪除(例如，間隔)，以最佳比對兩個序列。透過確定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數以產生匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗口中的位置總數，以計算百分比，然後將結果乘以100可得出序列一致性的百分比。與參考序列相比，於每個位置都相同的序列係稱為與參考序列相同，反之亦然。所包含之核苷酸或多肽係具有與任何一個本文所述的參考序列(請參閱本案之序列表)具有至少約70%、75%、80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%的一致性，其中，多肽變異體維持參考多肽的至少一種生物學活性或功能。
於本揭露的一些實施態樣中，係提供一種疫苗組成物用於個體之初次免疫(primary immunization)以對抗流行性感冒。於本揭露中，該疫苗組成物可包含本揭露的嵌合HA蛋白質作為用於降低流行性感冒感染之嚴重性或用於預防流行性感冒感染的主要抗原。於其它實施態樣中，還提供一種透過使用本揭露的疫苗組成物降低嚴重性或預防流行性感冒感染的方法。
於本揭露的一些實施態樣中，疫苗組成物中的嵌合HA蛋白質係以對有此需要之個體中預防流行性感冒病毒感染或誘導針對流行性感冒病毒的免疫反應之有效量存在。於另一些實施態樣中，該疫苗組成物係以足以於有此需要之個體中引起針對流行性感冒病毒(例如，H7N9亞型)之免疫反應的量進行施用。
於本揭露的一些實施態樣中，疫苗組成物可進一步包含藥學上可接受的載體和/或佐劑。於另一些實施態樣中，該佐劑係角鯊烯佐劑、細胞激素佐劑、脂質佐劑和類鐸受體(TLR)配體中的至少一種。TLR配體的實例係包括但不限於3-脫醯基單磷醯基脂質A(3-deacylated monophoshoryl lipid A，3D-MPL)、脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、胞壁醯基二肽(muramyl dipeptide， MDP)和CpG基序。於又一些實施態樣中，施用於個體的疫苗組成物包含作為抗原之嵌合HA蛋白質和佐劑的混合物，且該嵌合HA蛋白質和佐劑之重量比為10：1至1：10。
如本文所使用，術語「藥學上可接受的載體」係指可能適合於施用本揭露的疫苗組成物的任何和所有溶劑、分散介質、抗菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。可用於本揭露的藥學上可接受的載體可包括但不限於防腐劑、懸浮劑、增黏劑、等滲劑、緩衝劑、保濕劑及其組合。
於本揭露的一些實施態樣中，疫苗組成物可透過任何合適的遞送途徑施用，例如，鼻內、肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、皮下和黏膜途徑。於另一些實施態樣中，本揭露的疫苗組成物於足以預防個體中流行性感冒感染的條件下對個體進行施用。
於本揭露的一些實施態樣中，提供一種於有此需要之個體中誘導針對流行性感冒病毒的免疫反應的方法。於另一些實施態樣中，流行性感冒病毒係H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、H5N6、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7或H10N8亞型流行性感冒病毒。於又一些實施態樣中，個體係脊椎動物。於再一些實施態樣中，個體係哺乳動物，例如，人。
於本揭露的一些實施態樣中，所述方法包括對有此需要之個體施用包含嵌合HA蛋白質的疫苗組成物，其中，該嵌合HA蛋白質包含由第一結構域和第二結構域組成的HA1次單元，且其中，該第一結構域係衍生自第一亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元，而該第二結構域係衍生自第二亞型流行性感冒病毒之親代HA1次單元。於另一些實施態樣中，第一亞型流行性感冒病毒的親代HA1次單元衍生自H7N9亞型流行性感冒病毒，例如A/安徽/1/2013菌株，且可具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列。於又一些實施態樣中，來自第二亞型流行性感 冒病毒的HA蛋白質之親代HA1次單元係衍生自H3N2流行性感冒病毒，例如A/香港/1/1968菌株，且可具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，與來自第一亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質之親代HA1次單元相比，嵌合HA蛋白質的HA1次單元係具有70%至95%的胺基酸序列一致性。於另一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質的HA1次單元包含選自SEQ ID NO：3至8所組成群組的胺基酸序列。
於本揭露的一些實施態樣中，嵌合HA蛋白質另包含HA2次單元，其可為來自第一亞型流行性感冒病毒(例如，H7N9亞型流行性感冒病毒)的HA2次單元。
於本揭露的一些實施態樣中，與天然存在於流行性感冒病毒(例如，H7N9亞型流行性感冒病毒)中的HA蛋白質相比，嵌合HA蛋白質係具有良好的穩定性和增強的免疫原性，故本揭露的嵌合HA蛋白質可作為更佳的疫苗抗原。
透過許多實施例說明本揭露。以下實施例僅為示例性，而不應視為對本揭露的範圍之限制。
實施例
材料和方法
以下係針對實施例1至5所使用之材料和方法進行詳細描述。於本揭露中未進一步註記的材料係為市售品。
(1)非連續的SCHEMA重組
H7-HA1(即H7蛋白質的HA1次單元)和H3-HA1(即H3蛋白質的HA1次單元)的胺基酸序列係透過ROMALS3D進行比對[17]。H7-HA1和H3-HA1的比對結果和蛋白質結構係用作非連續SCHEMA重組的輸入，以建立SCHEMA接觸圖，其中，SCHEMA算法認為，如果兩個胺基酸中的任何原子(不包括氫)之間的距離於4.5Å之內，則兩個胺基酸係彼此接觸。H7-HA1的結構衍生自蛋白質數據庫(Protein Data Bank，PDB)登記號4LN6鏈A[18]。對於H3-HA1，其為PDB登記號4WE4鏈A[19]。SCHEMA將這兩個HA1的不同殘基分為兩個區塊，並計算每個嵌合體相對於最接近的親代蛋白質於區塊交換時裂解的接觸數量(表示為E值)。
(2)病毒DNA和質體DNA
美國GenScript公司合成全長A/安徽/1/2013(H7N9)和A/香港/1/1968(H3N2)HA以及六個嵌合HA1的cDNA序列。分別自A/安徽/1/2013(H7N9)和A/香港/1/1968(H3N2)HA的cDNA中擴增FH7和FH3編碼區，其包括胞外結構域、跨膜結構域和細胞質尾端結構域，之後將AcMNPV GP64訊號肽和位於N端的六聚組胺酸標籤插入桿狀病毒轉移載體pBacPAK8(Clontech)。由pag啟動子驅動的DsRed基因[11,12]也被插入載體中作為報導基因。嵌合的HA1蛋白質序列係各別地選殖到FH7的轉移載體中以取代HA1部分。僅具有pag-dsRed報導基因的空載體pBacPAK8係作為WT-DR病毒的轉移載體。
(3)細胞與病毒
草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)IPLB-Sf21(Sf21)細胞係於26℃以含10%之胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的TC100昆蟲培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)培養。透過Cellfectin(Life Technologies)將帶有HA構 建體的轉移載體質體與FlashBAC(Mirus，經修飾的AcMNPV桿狀病毒基因組)共同轉染(co-transfect)到Sf21細胞中以產生重組AcMNPV。將所得重組桿狀病毒如前所述於Sf21中繁殖，並透過終點稀釋(end-point dilution)法進行分離[20,21]。粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-TN-5B1-4(Hi5)細胞係於26℃以不添加FBS的ESF無血清昆蟲細胞培養基(Expression Systems)培養。狗腎臟上皮(Madin-Darby canine kidney，MDCK)細胞以具有10%FBS的達爾伯克氏必需基本培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)(Sigma,St.Louis,MO)於37℃和5%的CO2中單層培養。
(4)重組HA蛋白質的表現及西方墨點法分析
將MOI等於1的重組病毒感染Sf21細胞並培育2天，以表現重組蛋白質。細胞於收集後以杜式磷酸鹽緩衝鹽溶液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)洗滌，以除去培養基，接著以RIPA蛋白質裂解萃取緩衝液(Thermo Scientific)進行裂解。等量的細胞裂解液以10%之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠(Omic Bio)進行電泳分離，並使用小鼠抗His抗體(1：5,000，GeneTex GTX628914)進行西方墨點法分析，以確定蛋白質表現。每個樣品的GAPDH表現則使用兔抗GAPDH(10,000，GeneTex GTX100118)測定以作為添加量的內參對照。
(5)以免疫螢光法檢測HA的表現
將Sf21細胞(1×104)接種到8孔(well)Millicell EZ載玻片(Millipore)中，並以MOI等於1的重組桿狀病毒進行感染，於感染後第2天以4%之多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞。對於需要進一步進行通透性處理的細胞，添加0.2%之Triton(於DPBS中製備)至細胞中反應5分鐘。細胞以3%之牛 血清白蛋白質(bovine serum albumin，BSA，以DPBS製備)阻斷1小時後，加入小鼠抗His標籤抗體(1：5000，GeneTex GTX628914)於4℃反應過夜。接著，以DPBST(DPBS添加0.1%之Tween 20)洗滌細胞3次，並與1：200稀釋的Alexa Fluor山羊抗小鼠IgG二級抗體(Invitrogen)一起反應。使用Zeiss雷射共聚焦顯微鏡(LSM780)獲得圖像，並透過ZEN 2010軟體(Zeiss)進行分析。
(6)細胞型酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)
於96孔盤中培養Sf21細胞，並使用MOI等於1的重組桿狀病毒進行感染，以於細胞表面展示HA蛋白質抗原。於感染後第3天除去培養基，並以DPBS洗滌細胞。然後，以4%之多聚甲醛固定細胞，並透過0.2%之Triton進行通透性處理。將通透性處理的細胞與阻斷緩衝液(以DPBS配置的3%BSA)於室溫下反應1小時。將H7N9 H7特異性中和單株抗體(11082-R002，Sino Biological Inc.)以該阻斷緩衝液進行1：5,000稀釋，並添加到細胞樣品中，於4℃下反應隔夜。以具有0.1%之Tween 20之PBS(PBST)洗滌3次，於室溫下將結合辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的山羊抗兔IgG抗體(以1：10,000稀釋；Merck Millipore)添加到每個孔中並反應1小時。以PBST洗滌樣品3次，接著加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3'5,5'-tetramethylbenzidine，TMB)基質。以2M之硫酸終止呈色反應，並以450nm測量ELISA吸光度。僅含有細胞的平均讀數作為其他樣品的空白對照組。
(7)血球凝集試驗
血球凝集試驗中使用Hi5細胞以確保更多量的重組蛋白表現。細胞表面表現的HA所具有的最佳血球凝集活性條件，經測定為於MOI等於0.5的重 組病毒感染後之第5天。單層培養的Hi5細胞於感染後收集，並離心以去除培養基。將沉澱的細胞懸浮於添加有0.01%之BSA的PBS(pH值為7.2)中，並透過短暫的音波處理將其裂解。將50微升之經裂解的細胞懸浮液置於V底96孔盤孔洞中，並連續2倍稀釋至最終256倍之稀釋度。將50微升之1%的火雞紅血球(懸浮於含有0.01%之BSA的PBS中)添加至每個孔中，並於室溫下培育1小時。血球凝集效價係定義為可凝集火雞紅血球的最高稀釋度的倒數。
(8)透過血球凝集效價損失測定熱穩定性
將感染後顯現HA表現之Hi5細胞樣品製備為每50μL具有HA效價為64之溶液，並於50℃下加熱反應0、5、10、20、30、60、90和120分鐘。冷卻至4℃後，測定樣品之血球凝集活性，以測定血球凝集效價的損失。
(9)用於小鼠免疫之蛋白質純化
為純化用於小鼠免疫的HA蛋白質，分別以MOI等於5的vFH7、vFrB和vFrC感染Hi5細胞。於感染後第4天透過低速離心收集細胞。以I-PER昆蟲細胞蛋白質萃取試劑(Thermo Scientific)(添加1%之Triton)於冰上處理細胞沉澱物10分鐘，以萃取重組HA。藉由於10,000×g離心30分鐘移除細胞裂解物，並將上清液加載到裝有Ni Sepharose 6 Fast Flow樹脂(GE Healthcare)的離子親和層析管柱上。以碳酸鹽洗滌緩衝液(50mM之NaHCO3、300mM之NaCl、20mM之咪唑，pH值為8)洗滌層析管柱，重組HA係以洗出緩衝液(50mM之NaHCO3、300mM之NaCl、300mM之咪唑，pH值為8)洗出。將純化的蛋白質於PBS緩衝液中進行透析，接著透過離心過濾器(Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit，Merck Millipore)進行濃縮。蛋白質濃度係以蛋白質定量分析試劑盒(Coomassie Plus(Bradford)Assay Kit，Thermo Scientific)進行測定。
(10)小鼠免疫
所有用於免疫測定的小鼠均購自台灣國家實驗動物中心，且實驗程序已獲台灣中央研究院之實驗動物照護及使用委員會(IACUC)批准。經弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，CFA或FCA)均勻化的各個純化後全長重組蛋白以30μg之各別量對一組五隻雌性BALB/c小鼠(6至8週大)進行腹膜內免疫。陰性對照組僅以PBS免疫。於初次免疫後2週和4週分別進行兩次追加注射(booster shots)，追加注射時係使用於弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)均勻化30μg之抗原。小鼠血清於初次免疫後第6和8週收集。
(11)以間接式ELISA法檢測血清H7特異性IgG
根據過往文獻所述方法[22]，透過針對FH7抗原之間接式ELISA法測定每個血清樣品的血清IgG特異性抗體的水平。將純化的FH7(20ng/孔)於4℃下塗佈於96孔盤上反應隔夜。以3%之BSA(以DPBS配製)阻斷1小時後，將小鼠血清(1：10,000之稀釋度)一次三份加入孔中，並於室溫下反應2小時。然後，以DPBST洗滌孔3次，然後加入綴合有HRP(Merck Millipore)的山羊抗小鼠IgG並反應1小時。以PBST洗滌3次後，將TMB基質添加到每個孔中。以2M之硫酸終止呈色反應，並使用ELISA盤式測讀儀於450nm下測量ELISA吸光度。
(12)血清微量中和試驗
首先，A/台灣/01/2013(H7N9)流行性感冒病毒，以MDCK細胞擴增並測定其TCID50。使用0.22μm之過濾器過濾所收集的小鼠血清後，進行2倍連續稀釋(自1：10至1：1,280)，與TCID50為10的H7N9病毒混合並於4℃下反應1小時。然後將混合物轉移到96孔盤的單層MDCK細胞中，並於37℃下培養。中 和活性於感染後第3天透過觀察病毒誘導的細胞病變作用(cytopathic effect，CPE)測定，微量中和效價係定義為完全阻止CPE的最高稀釋度的倒數。為了進行統計分析，每個血清樣品皆進行四重複測試。
(13)統計分析
對於細胞型ELISA、熱血球凝集試驗、間接式ELISA及血清微量中和試驗，每種條件均進行至少3次重複分析(對於微量中和試驗則重複4次)。所有定量數據均以平均值±SD(誤差線)表示。使用非成對t檢定(unpaired t-test，Excel 2016軟體；Microsoft)進行兩組比較之統計分析，P值<0.05係視為顯著的。
實施例1：嵌合HA1次單元的構建
為提高H7蛋白質(即來自A/安徽/1/2013菌株的HA蛋白質(H7N9亞型))的穩定性，選擇來自A/香港/1/1968菌株(H3N2亞型)中的H3蛋白質與該H7蛋白質重組，其原因為此二亞型均屬於第二型流行性感冒病毒，且H3蛋白質(即來自H3亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質)與H7蛋白質(即來自H7亞型流行性感冒病毒的HA蛋白質)係親緣關係(phylogenetically)相關。
SCHEMA為蛋白質工程中用於識別可重組而不會破壞標的蛋白質三維結構完整性之蛋白質片段(稱為蛋白質區塊或結構域)的計算法，其係用於嵌合蛋白的構建之實施例中。
所選之H7和H3蛋白質彼此具有49%的一致性，其中，HA1次單元具有38%的一致性，而HA2次單元具有68%的一致性。由於HA蛋白質的HA1次單元是序列歧異性(sequence divergence)的主要來源並具有大部分的抗原位點，故H7蛋白質的HA1次單元(H7-HA1；SEQ ID NO：1)和H3蛋白質的HA1次單元(H3-HA1；SEQ ID NO：2)被用以提供不相同胺基酸作為嵌段分配。SCHEMA 算法係根據結構鄰接關係，將這些不同的殘基分配到不同的嵌段中，並計算出E值，該值係表示兩種蛋白質之間發生嵌段交換時，於嵌段中斷裂之殘基-殘基接觸(接觸係指兩個胺基酸中至少一個非氫原子距於4.5Å以內)的數量。
將H7和H3蛋白質的HA1次單元分為六個區塊(區塊A到區塊F)，這六個區塊幾乎均勻地分配了兩個HA1次單元的201個不同胺基酸。這些區塊的劃分於肽序列之上是不連續的(圖1A)，但每個區塊中的胺基酸可被組裝為整合、且結構上相互關連的結構域(圖1B)。唯一的例外為區塊B(圖1B中所示之綠色區塊)，SCHEMA進一步將其分為兩個子區塊；一者代表N和C末端連接在一起之子嵌段(圖1B所示之下方部分)，另一者包含位於HA頂部結構域的剩餘胺基酸(圖1B所示之上方部分)。
每種嵌合蛋白係設計為僅具有一種與H3蛋白質交換之區塊，其餘的蛋白質區塊則源自H7蛋白質，依此產生六個單獨的殖株(稱為rA至rF，表1和圖2)。嵌合HA1次單元rA至rF的胺基酸序列係分別以SEQ ID NO：3至8表示。
表1：親代和SCHEMA衍生的嵌合HA1次單元
Figure 109132363-A0202-12-0023-1
繼承區塊：數字「7」和「3」代表區塊的來源親代蛋白。例如，rA包含來自H3蛋白質的區塊A，其餘全部來自H7蛋白質。
E：相對於最接近的親代蛋白質，由SCHEMA計算出於交換時裂解的殘基-殘基接觸的數量。
m：相對於最接近的親代蛋白質的胺基酸變化數量。
實施例2：全長HA表現系統的建立
由於HA蛋白質的生物活性主要取決於其三聚體構形，故透過將嵌合HA1次單元與HA2次單元融合以形成全長嵌合HA構建體。使用來自H7蛋白質的HA2次單元，並將其接合到六個嵌合HA1次單元的C末端，以形成全長構建體(分別命名為FrA至FrF)。全長親代構建體(FH7和FH3)係分別使用其原始的HA1和HA2序列進行構建(圖3A)。親代構建體FH7和FH3以及嵌合HA構建體FrA至FrF中的HA1和HA2序列的全長胺基酸序列係分別以SEQ ID NO：9至16表示。
此外，帶有各自的表現構建體(包括6H(組胺酸)標籤)之重組桿狀病毒vFH7、vFH3和vFrA至vFrF係透過感染昆蟲Sf21細胞產生，並表現親代或六個嵌合全長HA之一之蛋白。僅表現DsRed螢光蛋白的野生型(WT)桿狀病毒WT-DR亦建立以作為陰性對照組(圖3A)。
透過西方墨點法分析感染的Sf21細胞裂解物以判定重組蛋白的表現，所有的重組蛋白(分子量約為70kDa)均可為抗His抗體所檢測。未感染的細胞或經WT-DR病毒感染的細胞則未有HA蛋白質的表現(圖3B)。
請參閱圖4A至圖4D，嵌合HA蛋白質上帶有與嵌合後功能相關的胺基酸殘基的結構區域係定義於此。圖4A至圖4C係說明FrB嵌合蛋白中的融合胜肽口袋、鄰近HA2次單元的彈簧加載長捲曲螺旋之HA1區域以及HA1-HA1界 面。圖4D係顯示FrC嵌合蛋白的HA1-HA2界面。有助於改善HA穩定性的關鍵胺基酸係顯示並標記於如圖4A至圖4D所示之蛋白質結構上。
透過免疫螢光染色測定嵌合HA蛋白質於細胞中的位置，並發現除兩個親代HA之外，FrB和FrC亦可於昆蟲細胞膜上檢測到(圖5)。此外，以0.2%之Triton使細胞進行通透性處理後，可透過使用抗His抗體於細胞內檢測到FrA、FrD、FrE和FrF嵌合蛋白質(圖6)。
實施例3：親代和嵌合HA蛋白質的特徵和生物活性評估
為確定嵌合HA蛋白質是否保留HA構形和生物活性，於細胞型ELISA分析中判定一H7-特異性之中和單株抗體(11082-R002，Sino Biological Inc.,，中國)與各蛋白的識別[13]。由於該單株抗體可中和H7N9流行性感冒病毒的感染，故其可辨識病毒的結構表位。因此，H7-特異性中和單株抗體與嵌合蛋白質之反應性係表示嵌合HA極可能保留HA的功能性結構，更可能於免疫後引發功能性抗體反應。
透過0.2%之Triton進行Sf21細胞樣品的膜通透處理，其顯示H7-特異性單株抗體識別FH7，並與FH3部分交互反應(圖7)。此外，可觀察到該抗體以相當於針對FH7的程度辨識FrB和FrC(圖7)。
又，測定HA構建體的血球凝集活性(HA蛋白質的關鍵特徵)。首先，透過短暫的音波處理裂解受重組病毒感染的Sf21細胞，從而暴露出胞質HA。然後，將裂解的細胞懸浮液以連續2倍稀釋並與火雞紅血球混合。倘若裂解的細胞懸浮液中存在功能性三聚體HA，則其將與紅血球表面的唾液酸受體結合並形成紅血球晶格[14,15](圖8A)。除了表現FrB的細胞之外，FrC亦被發現可凝集火雞紅血球(圖8B)。這些結果表明FrB和FrC重組後係保留HA之構形和功能。
實施例4：熱穩定性分析
為分析細胞表現HA的熱穩定性，採用了其他文獻的熱血球凝集試驗方案[8,16]，該方案係使用加熱過程中的血球凝集效價(HA效價)損失以評估HA蛋白質的熱穩定性。
首先，判定各感染細胞的HA效價，然後將細胞數量調整為具有64的HA效價。使細胞於50℃下進行不同時間的加熱反應，然後冷卻至4℃進行血球凝集試驗。
FH7被發現於開始加熱過程後，立即顯示HA效價的逐漸喪失，並於加熱20分鐘後完全喪失其血球凝集活性。另一個親代樣品FH3於加熱的最初30分鐘內顯示出血球凝集活性逐漸降低，但仍保持HA效價直至120分鐘之實驗期結束。對於表現FrB或FrC的細胞，於加熱的最初10到20分鐘內，其HA效價下降，但於加熱過程結束時，HA效價保持接近恆定。WT-DR感染的細胞係作為陰性對照，於實驗期間未顯示HA效價(圖9)。這些結果表明，與親代FH7蛋白質相比，FrB和FrC蛋白質於50℃下表現出顯著增強的穩定性。
實施例5：引發針對H7N9病毒的中和抗體之試驗
為探索嵌合HA蛋白質是否仍可用作觸發針對H7N9病毒的中和抗體的有效抗原，自受感染的昆蟲細胞中萃取FH7、FrB和FrC蛋白質以免疫小鼠，並進一步分析其免疫反應。
分別以30μg之經純化的FH7、FrB或FrC蛋白質對三組五隻雌性BALB/c小鼠進行腹膜內免疫。五隻小鼠單獨注射PBS作為陰性對照組。每隻小鼠於初次免疫後的第2週和第4週接受兩次追加注射，然後於第6週和第8週採集血樣。血清H7-特異性IgG之水平透過使用純化的FH7作為抗原之間接式ELISA測定(圖10A)。與僅用PBS免疫的組相比，以FH7蛋白質進行免疫的小鼠於第6週 和第8週均顯示出明顯更高的H7-特異性IgG抗體反應。相似地，以FrB或FrC進行免疫的組於這兩個時間點顯示與FH7組相當的H7-特異性IgG反應水平(圖10A)。
此外，進行微量中和試驗以判定免疫血清是否可以中和真實的H7N9流行性感冒病毒感染(圖10B)。將H7N9流行性感冒病毒(A/台灣/01/2013菌株)與連續稀釋的小鼠血清混合反應，然後將其用於感染狗腎臟上皮(MDCK)細胞。微量中和效價係於感染後第3天進行測定，其定義為無病毒誘導的細胞病變作用(CPE)之最高稀釋度的倒數。以FrB或FrC進行免疫之小鼠的血清於第6週的微量中和效價較FH7免疫的血清更高，於第8週的效價則相當於FH7免疫的血清。此些數據係表明嵌合的HA蛋白質可引發能抑制H7N9病毒感染之H7-特異性抗體。
由上所述，可知透過不連續的SCHEMA重組，自不同流行性感冒病毒所形成之本揭露的重組嵌合蛋白質係具有增強的熱穩定性，同時保持適當的抗原性和高中和效率。
本揭露所屬技術領域已知的是，於SCHEMA方法中使用的親代蛋白之同源性會影響可衍生的功能嵌合體的數量。然而，即使本揭露使用的H7-HA1和H3-HA1序列僅具有38%的序列一致性，仍可表現嵌合HA蛋白質(圖3B)並表現出原本的HA功能(即唾液酸受體的結合)，如透過血球凝集測定法所測定的(圖8B)，此係表明嵌合HA蛋白質可作為針對H7N9病毒之更佳的疫苗抗原。
此外，由於本揭露的嵌合HA蛋白質具有較FH7更高的熱穩定性，因而較能作為擔負長期儲存和運輸的疫苗產品。
雖然已詳細說明本揭露之實施例，但對所屬技術領域中具有通常知識者而言，於不實質上脫離本揭露的教示和優點的情況下，對所示的實施例進 行各種修改和變更仍係落於本揭露之精神及範圍內。因此，所述修改和變更係涵蓋於本揭露所述之申請專利範圍闡述的範圍內。
參考文獻：
[1] WHO. (2018) Influenza (seasonal), World Health Organization.
[2] Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., and Sieben, C. (2014) Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection, Biochim. Biophys. Acta 1838, 1153-1168.
[3] Farnsworth, A., Cyr, T. D., Li, C., Wang, J., and Li, X. (2011) Antigenic stability of H1N1 pandemic vaccines correlates with vaccine strain, Vaccine 29, 1529-1533.
[4] Nakowitsch, S., Waltenberger, A. M., Wressnigg, N., Ferstl, N., Triendl, A., Kiefmann, B., Montomoli, E., Lapini, G., Sergeeva, M., Muster, T., and Romanova, J. R. (2014) Egg- or cell culture-derived hemagglutinin mutations impair virus stability and antigen content of inactivated influenza vaccines, Biotechnol. J. 9, 405-414.
[5] Nakowitsch, S., Wolschek, M., Morokutti, A., Ruthsatz, T., Krenn, B. M., Ferko, B., Ferstl, N., Triendl, A., Muster, T., Egorov, A., and Romanova, J. (2011) Mutations affecting the stability of the haemagglutinin molecule impair the immunogenicity of live attenuated H3N2 intranasal influenza vaccine candidates lacking NS1, Vaccine 29, 3517-3524.
[6] Weldon, W. C., Wang, B. Z., Martin, M. P., Koutsonanos, D. G., Skountzou, I., and Compans, R. W. (2010) Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin, PLoS One 5, e12466.
[7] Cotter, C. R., Jin, H., and Chen, Z. (2014) A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity, PLoS Pathog. 10, e1003831.
[8] Hanson, A., Imai, M., Hatta, M., McBride, R., Imai, H., Taft, A., Zhong, G., Watanabe, T., Suzuki, Y., Neumann, G., Paulson, J. C., and Kawaoka, Y. (2015) Identification of Stabilizing Mutations in an H5 Hemagglutinin Influenza Virus Protein, J. Virol. 90, 2981-2992.
[9] Gao, R., Cao, B., Hu, Y., Feng, Z., Wang, D., Hu, W., Chen, J., Jie, Z., Qiu, H., Xu, K., Xu, X., Lu, H., Zhu, W., Gao, Z., Xiang, N., Shen, Y., He, Z., Gu, Y., Zhang, Z., Yang, Y., Zhao, X., Zhou, L., Li, X., Zou, S., Zhang, Y., Li, X., Yang, L., Guo, J., Dong, J., Li, Q., Dong, L., Zhu, Y., Bai, T., Wang, S., Hao, P., Yang, W., Zhang, Y., Han, J., Yu, H., Li, D., Gao, G. F., Wu, G., Wang, Y., Yuan, Z., and Shu, Y. (2013) Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus, N. Engl. J. Med. 368, 1888-1897.
[10]Hu, Z., Jiao, X., and Liu, X. (2017) Antibody immunity induced by H7N9 avian influenza vaccines: evaluation criteria, affecting factors, and implications for rational vaccine design, Front. Microbiol. 8, 1898.
[11]Chao, Y. C., Lee, S. T., Chang, M. C., Chen, H. H., Chen, S. S., Wu, T. Y., Liu, F. H., Hsu, E. L., and Hou, R. F. (1998) A 2.9-kilobase noncoding nuclear RNA functions in the establishment of persistent Hz-1 viral infection, J. Virol. 72, 2233-2245.
[12]Naik, N. G., Lo, Y. W., Wu, T. Y., Lin, C. C., Kuo, S. C., and Chao, Y. C. (2018) Baculovirus as an efficient vector for gene delivery into mosquitoes, Sci. Rep. 8, 17778.
[13]Sun, X., Belser, J. A., and Tumpey, T. M. (2016) A novel eight amino acid insertion contributes to the hemagglutinin cleavability and the virulence of a highly pathogenic avian influenza A (H7N3) virus in mice, Virology 488, 120-128.
[14]Khurana, S., Verma, S., Verma, N., Crevar, C. J., Carter, D. M., Manischewitz, J., King, L. R., Ross, T. M., and Golding, H. (2011) Bacterial HA1 vaccine against pandemic H5N1 influenza virus: evidence of oligomerization, hemagglutination, and cross-protective immunity in ferrets, J. Virol. 85, 1246-1256.
[15]Matrosovich, M., and Klenk, H. D. (2003) Natural and synthetic sialic acid-containing inhibitors of influenza virus receptor binding, Rev. Med. Virol. 13, 85-97.
[16]Xu, S., Zhou, J., Liu, K., Liu, Q., Xue, C., Li, X., Zheng, J., Luo, D., and Cao, Y. (2013) Mutations of two transmembrane cysteines of hemagglutinin (HA) from influenza A H3N2 virus affect HA thermal stability and fusion activity, Virus Genes 47, 20-26.
[17]Pei, J., Kim, B. H., and Grishin, N. V. (2008) PROMALS3D: a tool for multiple protein sequence and structure alignments, Nucleic Acids Res. 36, 2295-2300.
[18]Yang, H., Carney, P. J., Chang, J. C., Villanueva, J. M., and Stevens, J. (2013) Structural analysis of the hemagglutinin from the recent 2013 H7N9 influenza virus, J. Virol. 87, 12433-12446.
[19]Yang, H., Carney, P. J., Chang, J. C., Guo, Z., Villanueva, J. M., and Stevens, J. (2015) Structure and receptor binding preferences of recombinant human A (H3N2) virus hemagglutinins, Virology 477, 18-31.
[20]Tung, H., Wei, S. C., Lo, H. R., and Chao, Y. C. (2016) Baculovirus IE2 stimulates the expression of heat shock proteins in insect and mammalian cells to facilitate its proper functioning, PLoS One 11, e0148578.
[21]Wei, S. C., Tsai, C. H., Hsu, W. T., and Chao, Y. C. (2019) Baculovirus IE2 interacts with viral DNA through Daxx to generate an organized nuclear body structure for gene activation in Vero cells, J. Virol. 93, e00149-00119.
[22]Bright, R. A., Carter, D. M., Crevar, C. J., Toapanta, F. R., Steckbeck, J. D., Cole, K. S., Kumar, N. M., Pushko, P., Smith, G., Tumpey, T. M., and Ross, T. M. (2008) Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle, PLoS One 3, e1501.
<110> 中央研究院
<120> 嵌合血球凝集素蛋白質及包含其之疫苗組成物
<140> 109132363
<141> 2020-09-18
<150> US 62/903,011
<151> 2019-09-20
<150> US 62/904,014
<151> 2019-09-23
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 321
<212> PRT
<213> A型流行性感冒病毒
<400> 1
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<212> PRT
<213> A型流行性感冒病毒
<400> 2
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<212> PRT
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<213> A型流行性感冒病毒
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<213> A型流行性感冒病毒
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Claims (5)

  1. 一種嵌合血球凝集素蛋白質，係包含HA1次單元和HA2次單元，其中，該嵌合血球凝集素蛋白質之該HA1次單元係包含SEQ ID NO：4或5的胺基酸序列，且該HA2次單元係衍生自H7亞型流行性感冒病毒之親代HA2次單元。
  2. 一種疫苗組成物，係包含如請求項1所述之嵌合血球凝集素蛋白質及其藥學上可接受的載體，其中，該嵌合血球凝集素蛋白質係以預防流行性感冒病毒感染的有效量存在。
  3. 如請求項2所述之疫苗組成物，更包含佐劑。
  4. 一種如請求項2所述之疫苗組成物於製備對有此需要之個體誘導針對流行性感冒病毒之免疫反應的疫苗的用途，係包括對該個體施用該疫苗組成物。
  5. 如請求項4所述之用途，其中，該流行性感冒病毒係H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H5N2、HSN6、H6N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7或H10N8流行性感冒病毒。
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WO (1) WO2021055679A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2522678A1 (en) * 2006-05-15 2012-11-14 Sea Lane Biotechnologies, LLC Neutralizing antibodies to influenza viruses
CA2761648C (en) * 2009-05-11 2019-03-12 Crucell Holland B.V. Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h3n2 and uses thereof
MX349924B (es) * 2009-06-24 2017-08-21 Medicago Inc * Partículas similares al virus de la influenza quiméricas que comprenden hemaglutinina.
EP3812397A1 (en) * 2011-07-18 2021-04-28 Institute for Research in Biomedicine Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
US10131695B2 (en) * 2011-09-20 2018-11-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
KR20150104117A (ko) * 2012-12-18 2015-09-14 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도
KR101835989B1 (ko) * 2016-08-31 2018-03-08 충북대학교 산학협력단 인플루엔자 바이러스의 다중 아형 h3 및 h7 에 대한 다중 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Russell, "Acid-Induced Membrane Fusion by the Hemagglutinin Protein and Its Role in Influenza Virus Biology" Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 385, Springer, 2014, p. 93–116

Also Published As

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