TW202309289A - 嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗組合物及其表達載體與用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗組合物及其用途,該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒包含由流行性感冒病毒的基質蛋白與膜蛋白所形成類病毒顆粒骨架,以及表現在該類病毒顆粒骨架表面的嵌合棘蛋白,該嵌合棘蛋白係將新型冠狀病毒之棘蛋白的跨膜區域置換成流行性感冒病毒之血球凝集素的跨膜區域。本發明亦提供一種表達該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的重組載體,以及該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆於製備新型冠狀病毒疫苗組合物的用途。
Description
本發明係關於一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗組合物及其表達載體與用途,特別係關於一種將新型冠狀病毒的棘蛋白嵌合在流行性感冒病毒的類病毒顆粒骨架上的類病毒顆粒的疫苗組合物及其表達載體與用途。
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2,以下簡稱新型冠狀病毒)是一種具有包膜的正鏈單股RNA病毒,屬於冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒種,病毒顆粒呈圓形或橢圓形,直徑約80~120奈米,病毒顆粒被宿主細胞所提供的雙層磷脂質所包裹,主要包含外套膜蛋白(E蛋白質)、膜蛋白(M蛋白質)、核衣殼蛋白(nucleocapsid)、以及棘蛋白(S蛋白質)四種結構蛋白;新型冠狀病毒造成於2019年底爆發的嚴重特殊傳染性肺炎 (COVID-19),其可以透過人類上呼吸道入侵人體,以多種細胞表面所表現的ACE2為受體達到感染;主要感染器官則包含肺部、心臟、腎臟等多個主要器官。
目前常用的疫苗包含去活化疫苗及減毒疫苗,其是將真實病毒以外力使抗原決定位不活化或是降低其毒性,然而病毒的遺傳物質仍然存在於疫苗當中,因此並無法完全免除施打疫苗後遭受感染的機會。而類病毒顆粒(virus-like particle,VLP)是病毒外殼蛋白所組成的殼狀結構,不含病毒基因體,因此不會有傳染複製的疑慮,使用上較為安全,且相較於次單元疫苗,由於類病毒顆粒與真實病毒結構相似,因此進入個體後,可以誘發體內的免疫系統產生特定抗體以抵抗真實病毒的侵犯,進而達到良好的保護功效。因此,類病毒顆粒疫苗為極具潛力的一種疫苗形式。
然而,類病毒顆粒多半需要佐劑的搭配才能夠有效提升其誘發的免疫反應,且目前已上市或進行臨床中的各式疫苗都是針對原始未突變的病毒株做設計,並無法對於現在已出現突變的病毒株達到有效的保護效力,而需要重新設計疫苗。因此,因應未來新型冠狀病毒變異或流感化,研發能夠彈性更換或增加抗原,以有效降低研發成本與時間,且仍能夠維持有效且安全之免疫誘發反應的疫苗組合物,著實有其必要性。
為解決上述問題,本發明之一目的在提供一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗組合物,包含一嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,其中該類病毒顆粒包含:一類病毒顆粒骨架,由一流行性感冒病毒的一基質蛋白(Matrix protein 1,M1 蛋白)與一流行性感冒病毒的膜蛋白(M2 protein,M2 蛋白)形成;以及一嵌合棘蛋白,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,以一新型冠狀病毒的一棘蛋白為主體,並將該新型冠狀病毒的棘蛋白的跨膜區域(Transmembrane domain)置換成一流行性感冒病毒的血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域。
在本發明之一實施例中,該流行性感冒病毒的M2蛋白的N端進一步融合有一鞭毛蛋白 (Flagellin)。
在本發明之又一實施例中,該M2蛋白與該鞭毛蛋白之間包含一甘胺酸片段。
在本發明之又一實施例中,該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒進一步包含該流行性感冒病毒的血球凝集素,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,形成一嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒。
在本發明之又一實施例中,該疫苗組合物係為一新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒的疫苗組合物。
本發明之又一目的在提供一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒用於製備新型冠狀病毒疫苗組合物的用途,其中該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒包含:一類病毒顆粒骨架,由一流行性感冒病毒的一基質蛋白(Matrix protein 1,M1 蛋白)與一流行性感冒病毒的膜蛋白(M2 protein,M2 蛋白)形成;以及一嵌合棘蛋白,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,以一新型冠狀病毒的棘蛋白為主體,並將該新型冠狀病毒的棘蛋白的跨膜區域(Transmembrane domain)置換成一流行性感冒病毒的血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域。
在本發明之又一實施例中,該疫苗組合物誘發第一型輔助T細胞的免疫反應。
在本發明之又一實施例中,該第一型輔助T細胞的免疫反應包含免疫球蛋白IgG2a的分泌、干擾素-γ的分泌、或其任意組合之分泌。
在本發明之又一實施例中,該疫苗組合物誘發高效價之抗棘蛋白中和抗體的產生。
在本發明之又一實施例中,該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒進一步包含流行性感冒病毒的血球凝集素,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,形成一嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒。
本發明之又一目的在提供一種表達嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的重組載體,包含:一流行性感冒病毒的M1蛋白基因、一流行性感冒病毒的M2蛋白基因、以及一嵌合棘蛋白基因;其中,該嵌合棘蛋白基因係以一流行性感冒病毒的血球凝集素之跨膜區域的基因序列,置換一新型冠狀病毒的棘蛋白之跨膜區域的基因序列。
在本發明之又一實施例中,該流行性感冒病毒的M1蛋白基因、該流行性感冒病毒的M2蛋白基因、以及該嵌合棘蛋白基因各自具有一啟動子(Promoter)與一終止子(Terminator),且上游與下游分別具有相異的限制酶切位點。
在本發明之又一實施例中,該流行性感冒病毒的M2蛋白基因的5’端融合有一鞭毛蛋白基因。
在本發明之另一實施例中,該重組載體進一步包含一流行性感冒病毒的血球凝集素基因。
本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒,藉由表達建構在單一載體上的棘蛋白、M1蛋白、以及M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白,並成功組裝成具有完整結構的類病毒顆粒。本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發抗新型冠狀病毒抗體的產生,且進一步分析其中IgG抗體的亞型後,發現隨著本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒施用劑量的增加,施用個體血清中抗棘蛋白之IgG2a抗體的量會隨之上升,且IFN-
的分泌有相同的趨勢,顯示本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒傾向誘發第一型輔助T細胞的免疫反應,而能夠減緩誘發第二型輔助T細胞的免疫反應所造成的免疫反應副作用,再者,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒亦能夠產生高效價之抗新型冠狀病毒的中和抗體,且該中和抗體不僅對於原始武漢株,對於南非變異株亦具有中和的功效;因此,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,能夠有效地作為新型冠狀病毒的疫苗。
在本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒中,將新型冠狀病毒之棘蛋白的跨膜區域置換成流行性感冒病毒之血球凝集素的跨膜區域,而能夠穩定地表現於流行性感冒病毒的類病毒顆粒骨架上,且因為本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒自我搭載具佐劑功效的鞭毛蛋白,而能夠克服習知類病毒顆粒仍需搭配佐劑使用的困擾。再者,在用於表達本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒的載體中,棘蛋白基因、M1蛋白基因、以及M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白基因都具有各自的啟動子與終止子,而能夠獨立地表現以降低互相干擾的風險,且在每個目標基因的前後都設計有不同的限制酶酵素切位,使得本發明新型冠狀病毒之類病毒顆粒都能夠彈性地更換或增加抗原,而能夠有效率地降低研發成本與時間,以利於因應新型冠狀病毒發生變異、或是其演變成類流感的形式而需要每年更換抗原。藉此,本發明提供毋須額外添加佐劑,又可彈性增加或更改抗原的新型疫苗平台。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式,下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用,而非以限定本發明之範圍,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可做些許更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
所有實驗結果皆使用 GraphPad Prism v6.01軟體進行分析,其中抗棘蛋白抗體以及抗受體結合蛋白抗體的效價採用雙向變異數 (two-way ANOVA)進行分析;於分析IgG1抗體的效價、IgG2a抗體的效價、IFN-γ的濃度、及IL-5的濃度時,低劑量(即使用2
g與20
g)的組別則採用鄧恩多重比較法(Dunn’s multiple comparisons test),而高劑量(40
g與80
g)的組別則採用曼-惠特尼U考驗(Mann–Whitney U-test)。所有實驗結果之統計的顯著性表示如下:*p < 0.05; ** p < 0.01;以及*** p < 0.001。所有的實驗皆至少進行兩次。
定義
本文中所使用數值為近似值,所有實驗數據皆表示在20%的範圍內,較佳為在10%的範圍內,最佳為在5%的範圍內。
依據本發明,有關基因選殖 (Gene Cloning)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在本發明中,嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的該流行性感冒病毒的基質蛋白、該流行性感冒病毒的膜蛋白、及該流行性感冒病毒的血球凝集素,與嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒的該流行性感冒病毒的血球凝集素,可以分別來自相同或不同的流行性感冒病毒株。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis , SDS-PAGE)
SDS-PAGE之操作簡述如下。首先,將蛋白質樣品與SDS載入緩衝溶液 (包含有50 mM的三氫甲基胺基甲烷-氯化氫 (Tris-HCl),pH 6.8;100 mM的二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT);2%的SDS;0.1%的溴酚藍(bromophenol blue);以及10%的甘油)依3:1的混合後煮沸10分鐘。
與此同時,製備包含分離膠體 (以12%的分離膠體為例:包含有2.5 mL之1 M的Tris, pH 8.8;3.3 mL的去離子水;4 mL之30%的丙烯醯胺預混液(acrylamide mix);0.1 mL之10%的SDS;0.1 ml之10%的過硫酸銨(ammonium persulfate,APS);以及0.01 mL的四甲基乙二胺(TEMED))與焦集膠體(以5%的焦集膠體為例:包含有0.63 mL之1 M的Tris, pH 6.8;3.4 mL的去離子水;0.83 mL之30%的丙烯醯胺預混液;0.05 mL之10%的SDS;0.05 mL之10%的APS;以及0.005 mL的TEMED)的電泳膠體。
電泳係在電壓80V下進行焦集,並且在140V下進行分離,其中電泳的時間依待測蛋白質的分子量而定。其後,將膠體以考馬斯亮藍染劑溶液 (包含有0.1%的coomassie R250;10%的醋酸;以及50%的甲醇)染色1小時,再以脫色溶液 (包含有10%的醋酸;以及50%的甲醇)脫色。
西方墨點法 (Western blotting)
西方墨點法之操作簡述如下。在轉漬槽中,將經SDS-PAGE分離之蛋白質樣品的膠體,以電壓135V轉印至硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane,以下簡稱NC膜),再將該含有轉印蛋白質的NC膜浸泡於20 mL添加5%之脫脂奶的含Tween-20之三羥甲基胺基緩衝食鹽水(以下簡稱TBST溶液,包含有50 mM的Tris;150 mM的氯化鈉;以及0.05%的Tween-20),並震盪至少1小時以阻斷非專一性結合。
接著將該NC膜經TBST溶液清洗3次後,加入使用TBST溶液進行特定倍數稀釋的一級抗體,於4
oC震盪處理約16小時,隔天再經TBST溶液清洗3次後,以連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)之使用TBST溶液進行特定倍數稀釋的二級抗體,於室溫下震盪處理1小時,而後以TBST溶液清洗3次。檢測時,將增強的化學冷光試劑 (Western Lighting Plus ECL,PerkinElmer)添加至該膜以產生冷光訊號,並顯影至醫用感藍X射線膠片上 (Medical X-ray Film,Fujifilm)。
實施例 1 本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗之載體的設計與建構
本發明之一實施例係為本發明之內嵌鞭毛蛋白佐劑的新型冠狀病毒之類病毒顆粒疫苗的設計與建構。本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗係將新型冠狀病毒的棘蛋白 (Spike protein,又稱 S蛋白質)表現於流行性感冒病毒的類病毒顆粒上,以形成嵌合型的類病毒顆粒,並且為克服以類病毒顆粒作為疫苗時,仍需搭配佐劑才能有效地提升誘發免疫反應的能力,因此將佐劑同時搭載於該類病毒顆粒上,例如鞭毛蛋白 (Flagellin)。
在本實施例中,為了使新型冠狀病毒的棘蛋白穩定地表現於流行性感冒病毒的類病毒顆粒上,將該棘蛋白的跨膜區域(Transmembrane domain)置換成流行性感冒病毒H5之血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域,以形成嵌合棘蛋白,並將該嵌合棘蛋白的基因與形成流行性感冒病毒顆粒所必須的基質蛋白(Matrix protein 1,M1 蛋白)及膜蛋白(M2 protein,M2 蛋白)二種結構蛋白的基因,以串聯的方式建構於單一質體中,並將鞭毛蛋白的基因連接在M2蛋白的基因的5’端,使產生M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白,以使鞭毛蛋白表現於該類病毒顆粒上發揮佐劑的功效。
在本實施例中,該嵌合棘蛋白基因、該M1蛋白基因、以及該M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白基因都具有各自的啟動子(Promoter)與終止子(Terminator),使得各個基因能夠獨立地表現以降低互相干擾的風險,且在每個目標基因的前後都設計有不同的限制酶酵素切位,以利於隨時且容易地更換抗原,未來不論是新型冠狀病毒發生變異、或是其演變成類流感的形式而需要每年固定施打疫苗,本發明的新型冠狀病毒之類病毒顆粒疫苗都能夠彈性地更換或增加抗原,而能夠有效率地降低研發成本與時間。由此設計出不須額外添加佐劑且又可以彈性增加或更改抗原的新型疫苗平台。
以下將詳細描述本發明之內嵌鞭毛蛋白佐劑的新型冠狀病毒之類病毒顆粒的製備方法。首先,為了建構包含有本發明之類病毒顆粒的載體,將從GenScript獲得SARS-CoV-2(Wuhan-Hu-1分離株,登錄號為MN908947.3)之昆蟲細胞優化密碼子的棘蛋白基因(SEQ ID NO:2)、流行性感冒病毒(A/WSN/1933(H1N1),登錄號為L25818.1)的M1蛋白基因(SEQ ID NO:3)、及流行性感冒病毒(A/WSN/1933(H1N1)的M2蛋白基因(SEQ ID NO:4),登錄號為L25818.1)選殖到pFastBac1載體 (購自Invitrogen公司,美國)的
BamHI及
HindIII限制酶切位點之間;其中,利用線上資料庫(例如UniProt)確認該棘蛋白與該血凝素之跨膜區域的序列位置後,委外(例如Bio Basic Inc.公司,加拿大)進行化學合成,以將該棘蛋白的跨膜區域的基因序列(SEQ ID NO:5)置換成流行性感冒病毒(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1))HA的跨膜區域的基因序列(SEQ ID NO:6);另外,利用6個甘胺酸(Glycine)基因序列將作為佐劑的鞭毛蛋白基因(SEQ ID NO:7)與該M2蛋白基因的5’端結合,即會使該M2蛋白的N端融合有該鞭毛蛋白。
請參見圖1A及1B,分別係為本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒及其載體設計的示意圖;如圖1A所示,本發明以該M1蛋白與該M2蛋白形成一類病毒顆粒骨架,該M1蛋白位於內側而該M2蛋白位於外側以形成類球形的結構,而該嵌合棘蛋白則表現在該類病毒顆粒骨架的表面,該鞭毛蛋白則融合在該M2蛋白向外側;再者,如圖1B所示,本發明設計成能夠使用
BamHI及
EcoR1限制酶切位點置換嵌合棘蛋白基因 (圖1B中以S表示棘蛋白基因(不包含跨模區域的基因序列) (SEQ ID NO:8);並以HA TM表示流行性感冒病毒之血球凝集素的跨膜區域基因序列)、使用
Mlu1及
Kpn1限制酶切位點置換M1蛋白基因、及使用
Xho1及
HindIII限制酶切位點置換M2蛋白/鞭毛蛋白(圖1B中以FliC表示)的融合蛋白基因,以上所述的限制酶切位點僅為本實施例中的示例,本發明所屬技術領域中具通常知識者能夠依通常知識使用其他限制酶切位點。
如此一來,即可任意地更換或增加其他做為抗原蛋白的基因序列於該載體上,用以製備具有其他抗原的本發明類病毒顆粒,尤其是將該嵌合棘蛋白基因的位置(即如圖1B中所示的S或S加上HA TM)更換該其他抗原蛋白質的基因序列,以利於因應新型冠狀病毒發生變異、或是其演變成類流感的形式而需要每年更換抗原,而能夠更有效率地降低研發成本與時間。
接著為了製備本發明之類病毒顆粒,先使用Bac-to-Bac
®桿狀病毒表達系統 (Bac-to-Bac
®Baculovirus Expression System,購自Invitrogen公司,美國)製作帶有本發明類病毒顆粒之載體的重組桿狀病毒 (Baculovirus),再將該重組桿狀病毒感染昆蟲細胞,例如Sf9細胞,以使該昆蟲細胞藉由該重組桿狀病毒表達該載體中的蛋白質,以製備本發明之類病毒顆粒;詳細製備方法如下:首先,將1 ng前述植入有該嵌合棘蛋白基因、該M1蛋白基因、以及該M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白基因的pFastBac1載體與90
L勝任細胞 (Competent cell)(E. coli DH10 Bac strain,購自Invitrogen公司,美國)混合均勻,並於冰上靜置30分鐘後,置入42
oC環境中熱休克45秒,再放回冰上靜置2分鐘,以將該載體轉型(Transform)入適用於Bac-to-Bac®桿狀病毒表達系統的勝任細胞中;接著加入900
的細菌培養液(例如LB broth)於該勝任細胞中,再置入37
oC培養箱中培養4小時後,取出10
L均勻塗抹在含有50
g/mL卡納黴素、7
g/mL慶大黴素、10
g/mL四環黴素、100
g/mL X-gal、以及40
g/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB 培養盤上進行培養,以篩選有成功轉型進該載體的勝任細胞,並將此種勝任細胞進行常規的培養,使該載體與勝任細胞中的親代桿粒(Bacmid)重組以形成表達桿粒。
接著將該表達桿粒從該勝任細胞中純化出來後,取5
g的表達桿粒與16
L的轉染試劑turbofect (購自Thermo Scientific™公司,美國)及OPTI-MEM培養液 (購自Thermo Scientific™公司,美國)混合後,靜置15分鐘以待該表達桿粒與轉染試劑完全混合,再加入至已貼附於培養盤的Sf9細胞中,於28
oC定溫培養箱作用以進行轉染 (Transfection),並於6小時後將培養液更換為3 mL含有5% FBS的Sf900ⅡSFM (購自Thermo Scientific™公司,美國,含有10%青黴素/鏈黴素抗生素)新鮮培養液,以製備帶有該表達桿粒的重組桿狀病毒,供後續蛋白質的表達使用;接著,在收集該重組桿狀病毒後,以其對Sf9細胞進行感染共120小時,使Sf9細胞藉由該重組桿狀病毒,表達該載體中的該嵌合棘蛋白、該M1蛋白、以及該M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白,以組成本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,並於感染後收集該些Sf9細胞及其培養液,再以10,000 rpm的轉速離心分離Sf9細胞後收集上清液,其中即包含有本發明之類病毒顆粒,接著以100 kDa的濾膜過濾濃縮該上清液後,該濃縮液添加至不連續的蔗糖梯度(0%、20%、30%、40%、50%、及60%)中,以28,200 rpm的轉速進行超高速離心共4小時進行純化。離心完成後以磷酸鹽緩衝溶液 (Phosphate buffered saline)置換該濃度區間的分離產物的溶劑以進行保存,並取少量樣品溶液,以SDS-PAGE及西方墨點法確認本發明之類病毒顆粒所在的蔗糖濃度區間。
經蔗糖梯度純化後樣品的SDS-PAGE以及西方墨點法的詳細方法如下:首先,每個蔗糖梯度中取出15
L與5
L含有SDS載入緩衝溶液混合後加熱10分鐘,接著注入SDS-PAGE膠體(10%分離膠體)中,以80V電壓通電20分鐘進行焦集,待蛋白質樣品自上膠移入下膠後再調整電壓至140V,並持續通電約2.5~3小時以將不同大小的蛋白質分離開來,待電泳結束後,以西方墨點法確認存在有該三種蛋白質的蔗糖梯度溶液;首先,將該SDS-PAGE膠體與NC膜置於轉漬槽中,以135V電壓轉印40分鐘後,將該NC膜沿著35~55 kDa以及100~70 kDa各切一刀分成上中下三片,並分別使用抗Spike抗體(GTX135356;Genetax;稀釋倍率為1:1000)、抗M1抗體(GTX127356;Genetax;稀釋倍率為1:2000)、以及抗M2抗體(GTX125951;Genetax;稀釋倍率為1:3000)作為一級抗體,並以抗兔子IgG (anti-rabbit IgG-HRP;稀釋備率為1:10000)抗體作為二級抗體,以前述西方墨點法進行的操作,結果如圖2A所示,由於嵌合棘蛋白的大小約為180 kDa、M1蛋白約為28 kDa、 M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白則約為70 kDa,因此本發明之類病毒顆粒應位於在此三個大小皆有偵測訊號的蔗糖梯度3號(蔗糖濃度約為20%)、4號(蔗糖濃度約為30%)、5號(蔗糖濃度約為30%)、6號(蔗糖濃度約為40%)、7號(蔗糖濃度約為40%)溶液中,因此可以判定其中具有本發明的嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒。
為進一步確認在該蔗糖梯度3號、4號、5號、6號、7號溶液中,本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的大小與型態,利用穿透式電子顯微鏡 (Transmission electron microscope, TEM)確認該類病毒顆粒。結果如圖2B所示,其中可以看出本發明之類病毒顆粒的大小約為直徑100奈米,與流行性感冒病毒顆粒的大小相近,且可以觀察到該類病毒顆粒外圍有明顯的棘蛋白結構;因此,以本實施例所述之方法,確實可以獲得本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,以下將使用該類病毒顆粒作為疫苗進行功效測試。
接著,為了進一步評估本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒中棘蛋白的含量,先以西方墨點法分析序列稀釋的棘蛋白標準品(購自Sino biological,目錄編號為 40589-V08B1,起始濃度為1
g,2倍稀釋),並利用ImageJ軟體分析底片上各稀釋濃度的條帶面積,以此繪製出一線性方程式作為標準曲線,並將本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒上所含的棘蛋白量同樣以西方墨點法並搭配ImageJ軟體進行後,將其底片上的條帶面積帶入該線性方程式,以求得類病毒顆粒上所含棘蛋白重量,結果如圖2C所示,其中可見20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒含有0.4
g的棘蛋白,約是本嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒總重量的2%。
實施例 2 本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗誘發抗新型冠狀病毒抗體的產生
本發明之一實施例係為測試以本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒作為疫苗,確實能夠誘發抗新型冠狀病毒抗體的產生,且無需額外添加佐劑,其中係先將該病毒顆粒注射至小鼠體內,在經過一段時間後收取小鼠血清並測試其中是否含有抗新型冠狀病毒抗體。
首先,將本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒單獨或搭配佐劑,以磷酸緩衝鹽溶液 (將137 mM的氯化鈉、2.7 mM的氯化鉀、4.3 mM的磷酸氫二鈉、以及1.4 mM的磷酸二氫鉀溶於去離子水中,pH7.4;以下簡稱PBS溶液)為稀釋液而配製成100
L之劑型的疫苗溶液,其中在本實施例中使用鋁鹽 (Alum)及/或單磷酸脂質A (monophosphoryl lipid A, MPLA)作為佐劑,並分別配置成以下十三組:(1)僅含有PBS溶液的控制組、(2)含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (2
g S FliC-cVLP)、(3)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組 (2
g S FliC-cVLP+Alum)、(4)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (2
g S FliC-cVLP+MPLA)、(5)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組 (2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA)、(6)含有20
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (20
g S FliC-cVLP)、(7)含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組 (20
g S FliC-cVLP+Alum)、(8)含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (20
g S FliC-cVLP+MPLA)、(9) 含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組 (20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA)、(10)含有40
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (40
g S FliC-cVLP)、(11)含有40
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (40
g S FliC-cVLP+MPLA)、(12)含有80
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (80
g S FliC-cVLP)、以及(13)含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (80
g S FliC-cVLP+MPLA);接著,將該十三組溶液,在第零週及第三週時分別以肌肉注射 (intramuscularly injection)的方式免疫雌性的BALB/c小鼠 (6至8週大),並在第二次免疫後第二週收集各組小鼠的血液樣本,並以3000 rpm離心15分鐘後收集血清,以測試其中是否含有抗新型冠狀病毒的抗體。其中,所有實驗均按照國立清華大學實驗動物中心的指導進行,且動物使用規程由國立清華大學機構動物護理及使用委員會審核並批准(批准號109047)。
接著將前述所收集的各組小鼠血清以酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進行測定,以確認其中是否含有抗新型冠狀病毒的抗體。首先,將從Sino Biological Inc.獲得的重組棘蛋白(目錄編號為40589-V08B1)以1
g/mL的濃度、以及將新型冠狀病毒的受體結合蛋白(receptor binding domain,RBD,目錄編號為40592-V08H)以2
g/mL的濃度,在0.05 M碳酸緩衝溶液(即塗層緩衝溶液)中分別固定於二個96孔培養盤中,於4°C下靜置隔夜後,吸出培養盤中的塗層緩衝溶液,並以含有0.05% Tween-20的PBS溶液(以下簡稱PBST溶液)清洗三次,以將多餘的重組棘蛋白或受體結合蛋白洗掉,接著各孔中加入150
L的含1%牛血清蛋白質(bovine serum albumin,BSA) 的PBS溶液 (即阻斷緩衝溶液,Blocking buffer),在室溫下阻斷2小時以避免非專一性結合後,各孔再以100
L的PBST溶液清洗掉多餘的阻斷緩衝溶液。接著,將各組小鼠的血清由50倍開始以稀釋緩衝液 (dilution buffer,其中包含1% BSA及0.05% Tween 20的PBS溶液)進行連續稀釋,並將該些序列稀釋的血清分別加入該96孔培養盤中,於室溫作用1小時,使血清中的專一性抗體與棘蛋白或受體結合蛋白進行結合,1小時後再以PBST溶液清洗三次以洗去多餘的血清。接著,在該96孔培養盤之各孔中加入100
L連結HRP的抗小鼠IgG抗體(本實施例中係使用山羊抗老鼠IgG,稀釋倍數1:30000)於室溫下避光作用1小時後,再以PBST溶液清洗三次,以清洗掉多餘的抗體。最後,將HRP之受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine,TMB,購自BioLegend公司)依100
L的量加入該96孔培養盤中的每一孔中,並於暗處進行呈色反應15分鐘後,加入2 N的硫酸 (H
2SO
4)以終止反應,並使用ELISA分析儀(DYNEX MRX II)測定各孔在450 nm之吸光值。總IgG之終點效價(endpoint titer)定義為ELISA實驗中使吸光值超過0.2之最大血清稀釋倍數。
單獨以本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒或搭配佐劑作為疫苗,對小鼠進行免疫後其血清中抗新型冠狀病毒的棘蛋白抗體及受體結合蛋白抗體的效價測試結果分別如圖3A及圖3B所示。其中,由圖3A可以看出經免疫注射後,小鼠血清中抗棘蛋白抗體的效價會隨著施用劑量增加而上升,且相較於另外添加有佐劑的組別,單獨使用高注射劑量(即注射劑量為40
g或80
g的組別)之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發較高的針對新型冠狀病毒的棘蛋白之抗體效價;而在圖3B中則可以看出在抗受體結合蛋白抗體的效價亦有相似的功效,隨著施用劑量增加小鼠血清中抗受體結合蛋白抗體的效價亦會上升,且相較於另外添加有佐劑的組別,單獨使用高注射劑量(即注射劑量為40
g或80
g的組別)之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發較高的針對新型冠狀病毒的受體結合蛋白之抗體效價。
此些結果顯示,本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,確實能夠有效地誘發針對新型冠狀病毒的免疫反應,尤其是其棘蛋白及受體結合蛋白,以產生抗新型冠狀病毒的抗體;除此之外,相較於先前技術需額外添加佐劑進行免疫誘發,自我搭載鞭毛蛋白的本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,具有能夠誘發個體產生更高抗體效價的無法預期之優異功效;由此可以得知,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒確實能夠有效地誘發抗新型冠狀病毒抗體的產生,而具有作為新型冠狀病毒疫苗的潛力。
實施例 3 本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗傾向誘發第一型輔助 T 細胞的免疫反應
由於疫苗在誘發個體免疫力即產生抗體時,需要活化輔助型T細胞 (T helper cell),而輔助型T細胞又可以分成第一型輔助T細胞(Th1)以及第二型輔助T細胞(Th2),其中研究顯示若疫苗傾向誘發第二型輔助T細胞以產生抗體,則容易產生過敏等不良的免疫系統的副作用,因此在疫苗研發的領域中,需要留意該二種輔助T細胞之免疫反應的平衡狀態。
因此在本發明之一實施例中,進一步測試本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒於誘發第一型輔助T細胞以及第二型輔助T細胞的傾向;其中,已知IgG2a以及IgG1分別是第一型輔助T細胞以及第二型輔助T細胞之免疫反應的指標性抗體,而IFN-
以及IL-5則分別是促進第一型輔助T細胞以及第二型輔助T細胞之免疫反應的重要細胞因子 (cytokine);因此,在本實施例中,利用ELISA偵測接種本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗後,小鼠血清中該二種指標性抗體的產生量多寡,以及該些小鼠之脾臟細胞所分泌IFN-
以及IL-5之量的差異。
首先,以實施例2中所述之方式,配置本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗溶液,並同樣將小鼠分成以下十三組:(1)僅含有PBS溶液的控制組、(2)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (2
g S FliC-cVLP)、(3)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組 (2
g S FliC-cVLP+Alum)、(4)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (2
g S FliC-cVLP+MPLA)、(5)含有2
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組 (2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA)、(6)含有20
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (20
g S FliC-cVLP)、(7)含有20
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組 (20
g S FliC-cVLP+Alum)、(8)含有20
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (20
g S FliC-cVLP+MPLA)、(9) 含有20
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組 (20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA)、(10)含有40
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (40
g S FliC-cVLP)、(11)含有40
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (40
g S FliC-cVLP+MPLA)、(12)含有80
本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (80
g S FliC-cVLP)、以及(13)含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (80
g S FliC-cVLP+MPLA);接著,以實施例2中所述方式免疫小鼠收集各組小鼠的血清樣品,並將各組小鼠犧牲後收集脾臟細胞,接著將該脾臟細胞磨碎後,利用細胞過濾器將磨碎的小鼠脾臟細胞過濾至離心管中,以1500 rpm轉速離心5分鐘後,去除上清液並加入4 mL的紅血球裂解液於室溫下靜置5分鐘,再加入36 mL的RPMI細胞培養液 (購自Thermo Scientific™公司,美國)以終止紅血球裂解液的反應,並再次以1500 rpm轉速離心5分鐘,接著計數細胞後,依5×10
6個細胞/孔的量將該脾臟細胞培養於96孔盤中,並予以每孔5
g的棘蛋白 (購自Sino Biological公司,目錄編號為40589-V08B1)刺激,在37℃、5%二氧化碳之條件下培養72小時。
其中,將收集自各組小鼠的血清樣品以ELISA分別測定其中IgG2a抗體以及IgG1抗體的效價。首先,將從Sino Biological Inc.獲得的重組棘蛋白(目錄編號為40589-V08B1)以1
g/mL的濃度,在塗層緩衝溶液中固定於二個不同的96孔培養盤中,於4°C下靜置隔夜後,吸出培養盤中的塗層緩衝溶液,並以PBST溶液清洗三次,以將多餘的重組棘蛋白洗掉,接著各孔中加入150
L的阻斷緩衝溶液,在室溫下阻斷2小時以避免非專一性結合後,各孔再以100
L的PBST溶液清洗掉多餘的阻斷緩衝溶液。接著,將各組小鼠的血清由50倍開始以稀釋緩衝液進行連續稀釋,並將該些序列稀釋的血清分別加入該二個96孔培養盤中,於室溫作用1小時,使血清中的專一性抗體與重組棘蛋白進行結合,1小時後再以PBST溶液清洗三次以洗去多餘的血清。接著,分別在該二個96孔培養盤之各孔中加入100
L連結HRP的抗小鼠IgG1抗體以及IgG2a抗體(本實施例中係使用山羊抗老鼠IgG1抗體以及IgG2a抗體,稀釋倍數1:50000)於室溫下避光作用1小時後,再以PBST溶液清洗三次,以清洗掉多餘的抗體。最終,將HRP之受質TMB依100
L的量加入該二個96孔培養盤中的每一孔中,並於暗處進行呈色反應15分鐘後,加入2 N的硫酸以終止反應,並使用ELISA分析儀(DYNEX MRX II)測定各孔在450 nm之吸光值。總IgG之終點效價定義為ELISA實驗中使吸光值超過0.2之最大血清稀釋倍數。
以本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒對小鼠進行免疫後,其血清中抗新型冠狀病毒的棘蛋白之IgG2a抗體以及IgG1抗體的效價測試結果分別如圖4A及圖4B所示。其中,從圖4A中可以看出經免疫注射後,隨著施用劑量的增加,小鼠血清中抗棘蛋白之IgG2a抗體的量會隨之上升,且相較於另外添加有佐劑的組別,單獨使用高注射劑量(即注射劑量為40
或80
g的組別)之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發較高的抗棘蛋白之IgG2a抗體效價;而從圖4B中則可以看出,不論免疫注射的劑量為高或低,或者是否有額外添加佐劑,經本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫後,小鼠血清中抗棘蛋白之IgG1抗體的效價數值差異並不大。
此些結果顯示,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒傾向誘發第一型輔助T細胞的免疫反應,因此可以減少誘發第二型輔助T細胞的免疫反應所造成之過敏等不良免疫系統的副作用;且自我搭載鞭毛蛋白的本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,相較於先前技術需額外添加佐劑進行免疫誘發,具有能夠誘發個體產生更高IgG2a抗體效價的無法預期之優異功效。
再者,將收集自各組小鼠的脾臟細胞以ELISA偵測其中IFN-
的濃度,以下偵測IFN-
濃度的步驟係參見廠商 (BioLegend公司,產品編號為430801)的說明書。首先,將IFN-
捕捉抗體以原管200倍稀釋的濃度,在塗層緩衝溶液中固定在96 孔培養盤中,於4°C下靜置隔夜後,吸出培養盤中的塗層緩衝溶液,並以PBST溶液清洗三次,以將多餘的IFN-
捕捉抗體洗掉,接著各孔中加入150
L的阻斷緩衝溶液,在室溫下阻斷1小時以避免非專一性結合後,各孔再以PBST溶液清洗掉多餘的阻斷緩衝溶液。接著,將各組小鼠的脾臟細胞培養液由2倍開始以稀釋緩衝液進行連續稀釋,並將該些序列稀釋的溶液分別加入該96孔培養盤中,於室溫作用2小時,使脾臟細胞培養液中的IFN-
與IFN-
捕捉抗體進行結合,2小時後再以PBST溶液清洗四次。接著,加入以原管200倍稀釋濃度的IFN-
偵測抗體作用1小時後,以PBST洗去多餘的IFN-
偵測抗體,再加入以原管1000倍稀釋濃度的抗生物素蛋白質(avidin)作用0.5小時後,以PBST 清洗五次、每次間隔30秒;最後,在該96孔培養盤的每孔中加入100
L的TMB,並於暗處進行呈色反應15分鐘後,加入2 N的硫酸 (H
2SO
4)以終止反應,並使用ELISA分析儀(DYNEX MRX II)測定各孔在450 nm之吸光值,再利用樣品的標準曲線回推各組小鼠之脾臟細胞中IFN-
的濃度。
以本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒對小鼠進行免疫後,其脾臟細胞再以棘蛋白刺激後所產生IFN-
的濃度測試結果如圖4C所示。從圖4C中可以看出,細胞激素IFN-
濃度的結果與抗棘蛋白之IgG2a抗體效價的趨勢一致,即在使用高注射劑量之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的組別中,小鼠脾臟細胞中具有較高的IFN-
濃度,且相較於另外添加有佐劑的組別,單獨使用高注射劑量(即注射劑量為40
g或80
g的組別)之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發較高的IFN-
表現濃度。
再者,將收集自各組小鼠的脾臟細胞以ELISA偵測其中IL-5的濃度,以下偵測IL-5濃度的步驟係參見廠商的說明書。首先,將IL-5捕捉抗體以原管200倍稀釋的濃度,在塗層緩衝溶液中固定在96 孔培養盤中,於4°C下靜置隔夜後,吸出培養盤中的塗層緩衝溶液,並以PBST溶液清洗三次,以將多餘的IL-5捕捉抗體洗掉,接著各孔中加入150
L的阻斷緩衝溶液,在室溫下阻斷1小時以避免非專一性結合後,各孔再以PBST溶液清洗掉多餘的阻斷緩衝溶液。接著,將各組小鼠的脾臟細胞培養液由2倍開始以稀釋緩衝液進行連續稀釋,並將該些序列稀釋的溶液分別加入該96孔培養盤中,於室溫作用2小時,使脾臟細胞培養液中的IL-5與IL-5捕捉抗體進行結合,2小時後再以PBST溶液清洗四次。接著,加入以原管200倍稀釋濃度的IL-5偵測抗體作用1小時後,以PBST洗去多餘的IL-5偵測抗體,再加入以原管1000倍稀釋濃度的抗生物素蛋白質(avidin)作用0.5小時後,以PBST 清洗五次、每次間隔30秒;最後,在該96孔培養盤的每孔中加入100
L的TMB,並於暗處進行呈色反應15分鐘後,加入2 N的硫酸 (H2SO4)以終止反應,並使用ELISA分析儀(DYNEX MRX II)測定各孔在450 nm之吸光值,再利用樣品的標準曲線回推各組小鼠之脾臟細胞中IL-5的濃度。
以本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒對小鼠進行免疫後,其脾臟細胞再以棘蛋白刺激後所產生IL-5的濃度測試結果如圖4D所示。從圖4D中可以看出 ,不論注射的劑量為高或低、或是有無額外搭配其他佐劑,各組小鼠脾臟細胞中IL-5的濃度極其微弱且各組間無太大差異,顯示出本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒並不會誘發第二類輔助T細胞的免疫反應。
由此結果,可以更加地確定本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒能夠刺激較多IFN-
的分泌,進而誘發較強的第一型輔助T細胞的免疫反應;且自我搭載鞭毛蛋白的本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,相較於先前技術需額外添加佐劑進行免疫誘發,具有能夠誘發個體產生更高濃度IFN-γ的優異功效。
實施例 4 本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒疫苗以誘發高效價之抗棘蛋白中和抗體的產生
在本發明之一實施例中,為進一步測試本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒誘發之中和抗體的效價,利用假病毒中和抗體試驗 (pseudo-virus micro neutralization assay)測試經本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫後,誘發小鼠產生中和抗體以中和新型冠狀病毒原始武漢株(Wuhan-Hu-1)、英國變異株(Alpha,B.1.1.7)、南非變異株(Beta,B.1351)、以及印度變異株(Delta,B.1.617.2)之病毒感染能力的功效。
首先,以實施例2中所述之方式,配置本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗溶液,並同樣將小鼠分成以下五組:(1)僅含有PBS溶液的控制組、(2)含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (40
g S FliC-cVLP)、(3)含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (40
g S FliC-cVLP+MPLA)、(4)含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組 (80
g S FliC-cVLP)、以及(5)含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組 (80
g S FliC-cVLP+MPLA);接著亦以實施例2中所述方式免疫小鼠,並收集各組小鼠的血清樣品以待進行後續的測試實驗。
在開始測試該些血清樣品中和病毒的能力之前,種植10,000顆穩定表現人類血管收縮素轉換酶2 (human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)的HEK-293T細胞在96孔培養盤的每一孔中,並使用含有1%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,簡稱FBS)的DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)做為細胞培養液,於37
oC的細胞培養箱中培養一天;將前述各組的小鼠血清樣品以該細胞培養液由80倍開始進行序列稀釋,並將各稀釋過的血清分別與1,000 TU (transducing units)之原始武漢株、英國變異株、南非變異株、或印度變異株新型冠狀病毒之的假型慢病毒共同於37
oC下作用1小時,接著將該血清假型慢病毒混合溶液加入前述的96孔培養盤中,於37
oC下感染該些HEK-293T細胞16小時後,以含有10% FBS的新鮮DMEM替換培養基,並於37
oC的細胞培養箱中培養48小時後,以螢光素酶試驗 (Luciferase assay,Promega Bright-GloTM螢光素酶測定系統)計算各組小鼠血清中和病毒的能力;其中,抑制病毒感染百分比的計算方法為:血清組與沒有血清之對照組螢光素酶讀數損失(RLU)的比值,用於計算的計算公式則為 (RLU對照組-RLU血清組)/RLU對照組;而50%抑制濃度 (IC50)劑量則為導致螢光素酶活性將低>50%的最後稀釋濃度;其中,為了生產新型冠狀病毒的假型慢病毒,將螢火蟲之螢光素酶(firefly luciferase)的pLAS2W.FLuc.Ppur報導質體、表達新型冠狀病毒(Wuhan-Hu-1、B.1.1.7、B.1.351、或B.1.617.2)之全長棘蛋白基因的pcDNA3.1(+)質體、以及HIV gag-pol 質體(pCMV△R8.91)三者使用 TransIT-LT1的轉染試劑 (購自Mirus Bio公司)以共轉染進HEK293T細胞中,並在轉染後48小時收集並濃縮培養基,再藉由檢測 SARS-CoV-2-Spp轉錄的螢光素酶活性來評估該假型慢病毒的效價。
以本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒對小鼠進行免疫後,其血清與新型冠狀病毒原始武漢株的假型慢病毒的中和性試驗結果如圖5A所示,與新型冠狀病毒英國變異株的假型慢病毒的中和性試驗結果如圖5B所示,與新型冠狀病毒南非變異株的假型慢病毒的中和性試驗結果如圖5C所示,與新型冠狀病毒印度變異株的假型慢病毒的中和性試驗結果如圖5D所示,而該四者的IC50則分別顯示於如圖5E中。
由圖5A至圖5E可以看出施用高注射劑量(即注射劑量為40
g或80
g的組別)之本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,經免疫之小鼠的血清不論於新型冠狀病毒原始武漢株、英國變異株、南非變異株、或印度變異株的中和性皆顯著的高於搭配佐劑使用的組別,此結果顯示本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒無需搭配額外的佐劑,即能夠產生高效價之抗新型冠狀病毒的中和抗體,且不僅對於新型冠狀病毒原型武漢株,對於目前三種新型冠狀病毒變異株也具有優異的功效。
實施例 5 嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒疫苗的設計與建構
本發明之一實施例係為建構能夠同時產生免疫新型冠狀病毒以及流行性感冒病毒的類病毒顆粒,因此基於實施例1所建構的載體,另外將流行性感冒病毒的血球凝集素(SEQ ID NO:9)選殖到pFastBac
TMDual載體 (購自Invitrogen公司,美國)的
BamHI與
NotI限制酶切位點之間,並利用實施例1中所述之Bac-to-Bac
®桿狀病毒表達系統製作重組的桿狀病毒,接著將該重組感狀病毒與實施例1的重組感狀病毒以MOI (multiplicity of infection)為2:1之比例共同感染Sf9細胞五天後,以實施例1中所述的方法,收集、濃縮、及使用不連續的蔗糖梯度純化本發明之類病毒顆粒。
如圖6A所示,本發明以該M1蛋白與該M2蛋白形成一類病毒顆粒骨架,該M1蛋白位於內側而該M2蛋白位於外側以形成類球形的結構,而該嵌合棘蛋白則表現在該類病毒顆粒骨架的表面,該鞭毛蛋白則融合在該M2蛋白向外側。
再以實施例1中所述方法,使用SDS-PAGE以及西方墨點法測試經蔗糖梯度純化後的樣品,結果如圖6B所示,其中可以看出本發明之類病毒顆粒應位於同時偵測到嵌合棘蛋白、M1蛋白、M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白、以及血球凝集素訊號的蔗糖梯度3號及8號溶液中。
接著,進一步利用穿透式電子顯微鏡確認在該蔗糖梯度3號及8號溶液中,本發明嵌合型新型冠狀病毒及/或流行性感冒病毒的類病毒顆粒的大小與型態,結果如圖6C所示,其中可以看出該類病毒顆粒的大小約為直徑60~100奈米,與流行性感冒病毒顆粒的大小相近,且可以觀察到該類病毒顆粒外圍有明顯的棘蛋白結構。據此,以本實施例所述之方法,確實可以獲得本發明之嵌合型新型冠狀病毒及/或流行性感冒病毒的類病毒顆粒。
綜上所述, 本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒,藉由表達建構在單一載體上的棘蛋白、M1蛋白、以及M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白,並成功組裝成具有完整結構的類病毒顆粒。本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒並無需額外搭配其他佐劑,就能夠有效地誘發抗新型冠狀病毒抗體的產生,且進一步分析其中IgG抗體的亞型後,發現隨著本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒施用劑量的增加,小鼠血清中抗棘蛋白之IgG2a抗體的量會隨之上升,且IFN-
的分泌有相同的趨勢,顯示本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒傾向誘發第一型輔助T細胞的免疫反應,而能夠減緩誘發第二型輔助T細胞的免疫反應所造成的免疫反應副作用,再者,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒亦能夠產生高效價之抗新型冠狀病毒的中和抗體,且該中和抗體不僅對於原始武漢株,對於南非變異株亦具有中和的功效;因此,本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,能夠有效地作為新型冠狀病毒的疫苗。
在本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒中,將新型冠狀病毒之棘蛋白的跨膜區域置換成流行性感冒病毒之血球凝集素的跨膜區域,而能夠穩定地表現於流行性感冒病毒的類病毒顆粒骨架上,且因為本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒自我搭載具佐劑功效的鞭毛蛋白,而能夠克服習知類病毒顆粒仍需搭配佐劑使用的困擾。再者,在用於表達本發明之新型冠狀病毒的類病毒顆粒的載體中,棘蛋白基因、M1蛋白基因、以及M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白基因都具有各自的啟動子與終止子,而能夠獨立地表現以降低互相干擾的風險,且在每個目標基因的前後都設計有不同的限制酶酵素切位,使得本發明新型冠狀病毒之類病毒顆粒都能夠彈性地更換或增加抗原,而能夠有效率地降低研發成本與時間,以利於因應新型冠狀病毒發生變異、或是其演變成類流感的形式而需要每年更換抗原。藉此,本發明提供毋須額外添加佐劑,又可彈性增加或更改抗原的新型疫苗平台。
無
圖1A係為本發明之實施例中,嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的示意圖。
圖1B係為本發明之實施例中,嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的載體設計示意圖。其中,polH表示啟動子(polyhedrin promoter) (SEQ ID NO:1);S-HA TM表示新型冠狀病毒的棘蛋白基因,且其跨膜區域(Transmembrane domain, TM)基因置換成流行性感冒病毒的血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域基因;M1表示M1蛋白基因;FliC-M2則表示M2蛋白/鞭毛蛋白的融合蛋白基因;再者,
BamHI、
EcoR1、
Mlu1、
Kpn1、
Xho1以及
HindIII則表示相異的限制酶切位點。
圖2A係為以蔗糖梯度純化本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒後,各純化溶液進行SDS-PAGE之膠體經西方墨點法測試結果的底片圖。其中編號1至12代表連續的蔗糖濃度區間溶液。
圖2B係為以穿透式電子顯微鏡觀察本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒之外觀的照片。
圖2C係為藉由分析西方墨點法的結果定量本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒中棘蛋白含量的結果。其中,S表示棘蛋白。
圖3A係為以酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清中抗棘蛋白抗體的效價。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖3B係為以ELISA測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清中抗受體結合蛋白抗體的效價。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖4A係為以ELISA測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清中抗棘蛋白的IgG2a抗體的效價。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖4B係為以ELISA測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清中抗棘蛋白的IgG1抗體的效價。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2 μg本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖4C係為以ELISA測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠脾臟細胞,再以棘蛋白刺激後所產生IFN-
的濃度。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠脾臟細胞;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組脾臟細胞、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞。
圖4D係為以ELISA測定經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠脾臟細胞,再以棘蛋白刺激後所產生IL-5的濃度。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠脾臟細胞;2
g S FliC-cVLP表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、2
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有2
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+Alum表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及300
g鋁鹽的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、20
g S FliC-cVLP+Alum+MPLA表示注射含有20
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒、300
g鋁鹽、以及30
g單磷酸脂質A 的比較組脾臟細胞、40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組脾臟細胞、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組脾臟細胞。
圖5A係為經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清與新型冠狀病毒原始武漢株(Wuhan-Hu-1)的假型慢病毒之中和性試驗結果。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖5B係為經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清與新型冠狀病毒英國變異株(Alpha,B.1.1.7)的假型慢病毒之中和性試驗結果。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖5C係為經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清與新型冠狀病毒南非變異株(Beta,B.1351)的假型慢病毒之中和性試驗結果。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖5D係為經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清與新型冠狀病毒印度變異株(Delta,B.1.617.2)的假型慢病毒之中和性試驗結果。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖5E係為經本發明之嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒免疫注射之小鼠血清與新型冠狀病毒原始武漢株、英國變異株、南非變異株、及印度變異株的假型慢病毒之中和性IC50試驗結果。其中,PBS表示僅注射含有PBS溶液的控制組小鼠血清;40
g S FliC-cVLP表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、40
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有40
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清、80
g S FliC-cVLP表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的實驗組小鼠血清、以及80
g S FliC-cVLP+MPLA表示注射含有80
g本發明嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒以及30
g單磷酸脂質A的比較組小鼠血清。
圖6A係為本發明之實施例中,雙價嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的示意圖。
圖6B係為以蔗糖梯度純化之本發明雙價嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒後,各純化溶液的西方墨點法測試結果的底片圖。其中編號1至12代表連續的蔗糖濃度區間溶液。
圖6C為以穿透式電子顯微鏡觀察本發明嵌合型新型冠狀病毒及/或流行性感冒病毒的類病毒顆粒之外觀的照片。
無。
Claims (14)
- 一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的疫苗組合物,包含一嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒,其中該類病毒顆粒包含:一類病毒顆粒骨架,由一流行性感冒病毒的基質蛋白(Matrix protein 1,M1 蛋白)與一流行性感冒病毒的膜蛋白(M2 protein,M2 蛋白)形成;以及一嵌合棘蛋白,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,以一新型冠狀病毒的棘蛋白為主體,並將該新型冠狀病毒的棘蛋白的跨膜區域(Transmembrane domain)置換成一流行性感冒病毒的血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域。
- 如請求項1所述之疫苗組合物,其中該流行性感冒病毒的M2蛋白的N端進一步融合有一鞭毛蛋白 (Flagellin)。
- 如請求項2所述之疫苗組合物,其中該M2蛋白與該鞭毛蛋白之間包含一甘胺酸片段。
- 如請求項1所述之疫苗組合物,其中該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒進一步包含一流行性感冒病毒的血球凝集素,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,形成一嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒。
- 如請求項4所述之疫苗組合物,其中該疫苗組合物係為一新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒的疫苗組合物。
- 一種嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒用於製備新型冠狀病毒疫苗組合物的用途,其中該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒包含:一類病毒顆粒骨架,由一流行性感冒病毒的基質蛋白(Matrix protein 1,M1 蛋白)與一流行性感冒病毒的膜蛋白(M2 protein,M2 蛋白)形成;以及一嵌合棘蛋白,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,以一新型冠狀病毒的棘蛋白為主體,並將該新型冠狀病毒的棘蛋白的跨膜區域(Transmembrane domain)置換成一流行性感冒病毒的血球凝集素(Hemagglutinin,HA)的跨膜區域。
- 如請求項6所述之用途,其中該疫苗組合物誘發第一型輔助T細胞的免疫反應。
- 如請求項7所述之用途,其中該第一型輔助T細胞的免疫反應包含免疫球蛋白IgG2a的分泌、干擾素-γ的分泌、或其任意組合之分泌。
- 如請求項6所述之用途,其中該疫苗組合物誘發高效價之抗棘蛋白中和抗體的產生。
- 如請求項6 所述之用途,其中該嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒進一步包含一流行性感冒病毒的血球凝集素,表現在該類病毒顆粒骨架的表面,形成一嵌合型新型冠狀病毒及流行性感冒病毒的雙價類病毒顆粒。
- 一種表達嵌合型新型冠狀病毒的類病毒顆粒的重組載體,包含:一流行性感冒病毒的M1蛋白基因、一流行性感冒病毒的M2蛋白基因、以及一嵌合棘蛋白基因;其中,該嵌合棘蛋白基因係以一流行性感冒病毒的血球凝集素之跨膜區域的基因序列,置換一新型冠狀病毒的棘蛋白之跨膜區域的基因序列。
- 如請求項11所述之重組載體,其中該流行性感冒病毒的M1蛋白基因、該流行性感冒病毒的M2蛋白基因、以及該嵌合棘蛋白基因各自具有一啟動子(Promoter)與一終止子(Terminator),且上游與下游分別具有相異的限制酶切位點。
- 如請求項12所述之重組載體,其中該流行性感冒病毒的M2蛋白基因的5’端融合有一鞭毛蛋白基因。
- 如請求項12所述之重組載體,其中該重組載體進一步包含一流行性感冒病毒的血球凝集素基因。
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