JP6978079B2 - ウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質を使用する組換えウイルス様粒子 - Google Patents

ウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質を使用する組換えウイルス様粒子 Download PDF

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Description

本出願は、２０１５年７月２日に出願された米国仮出願番号第６２／１８８，０８４に基づく優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書によって明示して援用され、そして本願の譲受人に譲渡される。
政府利益
本願の主題は、一部が米国国立衛生研究所の国立アレルギー・感染症研究所によって授与された認可番号ＡＩ１１１５３２−０２および米国農務省の食品・農業研究所によって授与された認可番号２０１１−３３６１０−３０４３３の下、米国政府支援でなされた。米国政府はこの主題において特定の権利を有する。
技術分野
１つまたはそれを超える異なる病原体に対する免疫応答を誘発するためのウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）ワクチンシステムまたはプラットフォーム、ならびに新規システムまたはプラットフォームを作製および使用する方法。
背景
様々なワクチンシステムまたはプラットフォームが提案されている。これらのワクチンシステムまたはプラットフォームは最適ではないので、当技術分野では、多数の病原体に対して有効であり得るシステムまたはプラットフォームを含む改善されたシステムまたはプラットフォームの必要性がある。
概要
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現または共発現するウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質（「Ｂｇａｇ」）から構成される新規ＶＬＰが本明細書に記載される。特定の実施形態では、標的病原体タンパク質は、ＶＬＰ膜に局在する膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、標的病原体タンパク質は、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、コロナウイルスおよびレトロウイルスを含む１つまたはそれを超える異なるウイルス病原体から選択される。
標的インフルエンザウイルスがインフルエンザＡウイルスである特定の実施形態では、膜貫通タンパク質は、１つまたはそれを超える異なるＨＡサブタイプ１〜１８（「Ｈ１」〜「Ｈ１８」）および／またはＮＡサブタイプ１〜１１（「Ｎ１」〜「Ｎ１１」）から構成される。例えば、特定の実施形態では、膜貫通タンパク質は、４つの異なるサブタイプのＨＡおよび１つのサブタイプのＮＡを含む。別の例として、特定の他の実施形態では、膜貫通タンパク質は、３つの異なるサブタイプのＨＡおよび１つのサブタイプのＮＡから構成されるなどである。さらなる例として、特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰにおいて共発現する４つのＨＡは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０である。
特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰにおいて発現される異なるインフルエンザＡ膜貫通タンパク質の１つまたはそれよりも多くは、鳥類宿主細胞またはヒト宿主細胞にのみ結合し得るが、特定の他の実施形態では、異なる膜貫通タンパク質の１つまたはそれよりも多くは、鳥類宿主細胞およびヒト宿主細胞の両方に結合する。
特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰにおいて共発現されるインフルエンザＡ膜貫通タンパク質は、ホモ三量体を形成し得るが、特定の他の実施形態では、膜貫通タンパク質は、ヘテロ三量体またはホモ三量体とヘテロ三量体との混合物を形成する。
本明細書に記載されるＶＬＰではいずれも、標的病原体タンパク質は、遺伝子改変され得る。例えば、特定の実施形態では、標的病原体タンパク質の可変領域は、遺伝的に除去され得る。別の例として、特定の実施形態では、標的病原体タンパク質のＣ末端は、Ｂｇａｇに対する結合効率を増加させるために改変され得る。さらなる例として、特定の実施形態では、標的病原体タンパク質は、キメラであり得る。このようなキメラの一例は、インフルエンザＨＡの膜貫通領域および／またはＣ末端領域を含むように標的エボラ糖タンパク質のＣ末端を遺伝子改変することによって調製されるキメラである。Ｂｇａｇもまた、遺伝子改変され得る。例えば、特定の実施形態では、Ｂｇａｇは、標的病原体タンパク質に対する結合効率を増加させるように改変される。
特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、被験体における１つまたはそれを超える異なる病原体から保護することができるか、またはそれらに対する免疫応答を誘発することができる。特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるタイプおよび／またはサブタイプのウイルス（異なるインフルエンザタイプおよびサブタイプを含む）から保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９および／またはＨ１０を含むインフルエンザサブタイプから保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。
特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、約１００ｎｍ超、好ましくは約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、例えば約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、それらの組み合わせなどの直径を有する。
特定の実施形態では、各Ｂｇａｇ ＶＬＰは、ＶＬＰ膜上に平均３７５個超のタンパク質スパイク、好ましくは約３７５〜約８００個のスパイク、さらに好ましくは約８００個のスパイクを含む。他の実施形態では、スパイクの数は、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、それらの組み合わせなどであり得る。
特定の実施形態では、各Ｂｇａｇ ＶＬＰは、大きい表面積、好ましくは、標的病原体タンパク質の１つが由来する病原体よりも大きい表面積を含む。
Ｂｇａｇ ＶＬＰを含む新規ワクチンであって、１つまたはそれを超える異なる病原体から保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる新規ワクチンも記載される。特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰを含む新規ワクチンは、１つまたはそれを超える異なるタイプおよび／またはサブタイプのウイルス（異なるインフルエンザサブタイプを含む）から保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰを含む新規ワクチンは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９および／またはＨ１０を含むインフルエンザサブタイプから保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製するための新規ＤＮＡベクターも記載される。特定の実施形態では、ＤＮＡベクターは、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製するためにキャリアウイルスにおいて発現され、好ましくは、キャリアウイルスは、組換えバキュロウイルス（「ｒＢＶ」）である。特定の実施形態では、ＤＮＡベクターを含むｒＢＶは、真核細胞、好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞において発現される。特定の実施形態では、各標的病原体タンパク質遺伝子は、個々のプロモーター、好ましくは個々のポリヘドリンプロモーターによって制御される。
Ｂｇａｇ遺伝子と、１つまたはそれを超える異なる標的病原体由来の少なくとも１つの遺伝子（これらはすべてタンデムに構成されており、それぞれプロモーター、好ましくはポリヘドリンプロモーターの制御下にある）とを含むＤＮＡベクター；キャリアウイルス、好ましくはｒＢＶ；および真核細胞、好ましくはＳｆ９を使用して、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰまたはワクチンを作製する方法も記載される。
Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチン接種被験体と非ワクチン接種被験体とを識別する方法も記載される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を含む、Ｂｇａｇ ＶＬＰ。
（項目２）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質がＶＬＰ膜に局在する、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目３）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質がウイルスタンパク質である、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目４）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質が、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、コロナウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択される、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目５）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質がインフルエンザウイルスである、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目６）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質が、Ｈ１〜Ｈ１８またはＮＡ１〜１１からなる群より選択される、項目５に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目７）
４つの異なる標的病原体タンパク質が、Ｈ１〜Ｈ１８およびＮＡ１〜１１からなる群より選択される、項目５に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目８）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質が、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０を含む、項目７に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目９）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質が遺伝子改変されている、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目１０）
前記１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質がＥｂｏＭａｙ ＴＭＣＴである、項目９に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目１１）
被験体における１つまたはそれを超える異なる病原体から保護することができるか、またはそれらに対する免疫応答を誘発することができる、項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
（項目１２）
項目１０に記載のＢｇａｇ ＶＬＰを含む、ワクチン。
（項目１３）
項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰを作製するための移入ベクタープラスミドであって、Ｂｇａｇ遺伝子と、異なる標的病原体タンパク質の１つまたはそれを超える遺伝子と、１つまたはそれを超えるプロモーターとを含む、移入ベクタープラスミド。
（項目１４）
前記１のＢｇａｇ ＶＬＰを作製するための方法であって、
Ｂｇａｇ遺伝子と、異なる標的病原体タンパク質の１つまたはそれを超える遺伝子とを、それぞれプロモーター、好ましくはポリヘドリンプロモーターの制御下でタンデムに、移入ベクタープラスミド、好ましくはｒＢＶ移入ベクタープラスミドにクローニングする工程；
前記移入ベクタープラスミドを使用して、キャリアウイルス、好ましくはｒＢＶを調製する工程；
前記ｒＢＶを真核細胞、好ましくはＳｆ９に感染させて、前記Ｂｇａｇ ＶＬＰを生産する工程；および
前記Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製する工程
を含む、方法。
（項目１５）
有効量の項目１２に記載のワクチンの有効量を動物、好ましくは哺乳動物または鳥、さらに好ましくはヒトに投与することによって、標的病原体が前記動物、好ましくは哺乳動物または鳥、さらに好ましくはヒトにおいて疾患を引き起こすことを予防または阻害する方法。
（項目１６）
項目１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰと、ワクチン投与に適切な１つまたはそれを超えるアジュバントとを混合することによって、項目１２に記載のワクチンを作製する方法。
（項目１７）
Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質が被験体に存在するかを測定すること、およびワクチン接種を前記Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質の存在と相関させることによって、前記被験体が項目１２に記載のワクチンを以前に投与されたかを識別する方法。
（項目１８）
１つまたはそれを超える異なる核酸を含むＢｇａｇ ＶＬＰであって、前記核酸が標的に対する被験体の免疫応答を誘導または増強する、Ｂｇａｇ ＶＬＰ。
（項目１９）
前記異なる核酸の１つまたはそれよりも多くがＲＮＡである、項目１７に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
図１は、インフルエンザ遺伝子を発現するＢｇａｇ ＶＬＰ構築物およびＭ１−ＶＬＰ構築物の概略図を示す。
図２は、七面鳥赤血球を使用した、図１の構築物から作製したＢｇａｇ ＶＬＰまたはＭ１ ＶＬＰの赤血球凝集アッセイを示す。
図３は、Ｈ１特異的モノクローナル抗体で染色した、図１の構築物から作製したインフルエンザＶＬＰのウエスタンブロットを示す。
図４は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用した、図１の構築物から作製したインフルエンザＶＬＰのタンパク質プロファイルを示す。
図５は、ＰＦＵで測定した場合の、図１の構築物から作製したインフルエンザＶＬＰ中のＮＡの酵素活性を示す。
図６は、インフルエンザＮＡおよびＨ１タンパク質を提示するＢｇａｇ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
図７は、インフルエンザＮＡおよびＨ１タンパク質を提示するＭ１ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
図８は、インフルエンザＮＡおよびＨ１０遺伝子を発現するＢｇａｇ ＶＬＰの概略図を示す。
図９は、図８の構築物から作製したインフルエンザＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの赤血球凝集アッセイを示す。
図１０は、抗Ｈ１０Ｎ７、抗Ｈ５Ｎ１、抗Ｈ７Ｎ９および抗Ｈ９Ｎ２抗体で染色した、図８の構築物から作製したインフルエンザＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰと、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰとのウエスタンブロットを示す。
図１１は、図８の構築物から作製したインフルエンザＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰと、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰとのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
図１２は、図８の構築物から作製したＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
図１３は、インフルエンザＮＡ、Ｈ９、Ｈ５、Ｈ７およびＨ１０遺伝子を発現するＢｇａｇ−ＶＬＰの概略図を示す。
図１４は、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの赤血球凝集アッセイを示す。
図１５は、ＰＦＵで測定した場合の、図８の構築物から作製したインフルエンザＨ１０ ＶＬＰと、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰとの中のＮＡの酵素活性を示す。
図１６は、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
図１７は、Ｍａｙｉｎｇａ株由来のエボラＧＰ（「ＥｂｏＭａｙ ＧＰ」）の元のタンパク質配列を示す。
図１８は、インフルエンザＨＡ膜貫通ドメインおよびＣ末端を有するキメラＥｂｏＭａｙ ＧＰ（「ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ」）のタンパク質配列を示す。
図１９は、超遠心分離によるスクロース勾配でさらに精製し、抗エボラ抗血清で染色したＥｂｏＭａｙ−ＧＰ−ＴＭＣＴ ＩＥＣＣ Ｆｘｎ１のウエスタンブロットを示す。
図２０は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＩＥＣＣ Ｆｘｎ１およびＩＥＣＣ Ｆｘｎ３のピークスクロース勾配画分のタンパク質プロファイルを示す。
図２１は、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ Ｂｇａｇ ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
図２２は、継代１（「Ｐ１」）〜継代５（「Ｐ５」）からの四サブタイプＢｇａｇの安定性を比較する赤血球凝集アッセイを示す。
図２３は、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ中のＨＡサブタイプの共局在性を示す。
図２４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデンシトメトリーおよび半定量的ウエスタンブロットを使用した、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ上のＨＡサブタイプの分布プロファイルを示す。
図２５は、アガロースゲル電気泳動を使用した、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中のＲＮＡの存在を示す。
図２６は、より高分解能のアガロースゲル電気泳動を使用した、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中のＲＮＡの存在を示し、核酸の分離を示す
図２７は、様々な試験条件下におけるＢｇａｇ ＶＬＰのＤＮＡおよびＲＮＡプロファイルを示す。
図２８は、パネルＡにおけるユニサブタイプＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰおよびパネルＢにおける四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ調製ならびに特性評価を示す。
図２９は、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、ＮＡおよびＢｇａｇ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を感染させたＳｆ９細胞の間接免疫蛍光アッセイを示す。
図３０は、ユニサブタイプＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰまたは四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰで免疫化したフェレットの免疫原性プロファイルを示す。
図３１は、免疫化後かつフェレット血清チャレンジ前のフェレットにおけるＨＡ血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価を要約したものである。
図３２は、チャレンジ２日後または４日後の免疫フェレットにおける複製ウイルス力価を要約したものである。
図３３は、Ｈ５Ｎ１ ＨＰＡＩウイルスの３つのクレード由来のＨ５ ＨＡタンパク質を含有する３つのクレードのＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製および特性評価を示す。
図３４は、精製した３つのクレードのＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰの特性評価を示す。
図３５は、ＧｙｒＦ Ｈ５Ｎ８クレード２．３．４．４（群１）、Ｃｋ／エジプトＨ５Ｎ１クレード２．２．１（群２）およびＣｋ／ＷＪクレード２．１．３（群３）に対するＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰでワクチン接種した鳥の抗体応答を示す。
図３６は、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１またはＨ５Ｎ８チャレンジに対するＨ５５５ ＶＬＰワクチン接種ニワトリの保護に関するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。
図３７は、チャレンジ前の鳥群について、チャレンジに使用すべきウイルスに対するワクチン接種５週間後の個々の赤血球凝集阻害力価（ｌｏｇ２）および標準誤差を示す。
図３８は、鳥群について、チャレンジウイルスに対するチャレンジ２週間後の個々の赤血球凝集阻害力価（ｌｏｇ２）および標準誤差を示す。
図３９は、Ａ／シロハヤブサ／ワシントン／２０１４ Ｈ５Ｎ８（クレード２．３．４．４）ウイルスによるチャレンジ後２日目および４日目の口腔スワブおよび排泄腔スワブからのウイルス力価を示す。
図４０は、Ａ／ニワトリ／エジプト／２０１０ Ｈ５Ｎ１（クレード２．２．１）ウイルスによるチャレンジ後２日目および４日目の口腔スワブおよび排泄腔スワブからのウイルス力価を示す。
図４１は、Ａ／ニワトリ／西ジャワスバン／２００７ Ｈ５Ｎ１（クレード２．１．３）ウイルスによるチャレンジ後２日目および４日目の口腔スワブおよび排泄腔スワブからのウイルス力価を示す。
詳細な説明
解釈および定義
特に指示がない限り、本明細書では、（特に本明細書に定義／記載されない限り）当業者にとって通常の意味を有する従来の化学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的および薬理学的な方法および用語が用いられる。本明細書で引用されるすべての刊行物、参考文献、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、以下の一般規則が適用される。文脈上特に明確な指示がない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、複数の指示対象を含む。遺伝子およびタンパク質の一般命名規則も適用される。すなわち、特段指定されない限り、遺伝子は斜体または下線付きであるが、タンパク質は斜体または下線付きではなく標準フォントである（例えば、Ｂｇａｇタンパク質）。生物分類のための一般命名規則も適用される。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、指定の意味を有するものとする。「約」という用語は、当業者が理解するように、「およそ」の明らかな通常の意味をとる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「限定されないが、・・・を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」は包括的または非限定的なものであり、記載されていないさらなる要素を除外するものではない。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、指定の意味を有するものとする。
「ＡＩＤＳ」は、後天性免疫不全症候群を意味する。
「Ｂｇａｇ」は、ウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質を意味する。
「Ｂｇａｇ ＶＬＰ」は、ＢｇａｇベースのＶＬＰ（すなわち、内部コアタンパク質Ｂｇａｇを有するウイルス様粒子）を意味する。
「ＢＩＶ」は、ウシ免疫不全ウイルスを意味する。
「ＣＤＣ」は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎを意味する。
「ＤＩＶＡ」は、感染動物とワクチン接種動物との区別を意味する。
「ＥｂｏＭａｙ ＧＰ」は、Ｍａｙｉｎｇａ株に属するエボラ糖タンパク質を意味し、その一例は図１７に示されている。
「ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ」は、インフルエンザＨＡ膜貫通ドメインおよびＣ末端を有するキメラＥｂｏＭａｙ ＧＰを意味し、その一例は図１８に示されている。
「ＥＮＶ」は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を意味する。
「Ｆｘｎ」は、画分を意味する。
「Ｈ１」〜「Ｈ１８」は、インフルエンザＨＡタイプ１〜１８を意味する。
「ＨＡ」は、インフルエンザ膜貫通糖タンパク質赤血球凝集素を意味する。
「ＨＩＶ」は、ヒト免疫不全ウイルスを意味する。
「ＨＫ０９」ウイルスは、Ｈ９Ｎ２インフルエンザＡ／香港／３３９８２／２００９ウイルスを意味する。
「ＨＰＡＩ」は、高病原性鳥インフルエンザを意味する。
「ＩＥＣＣ Ｆｘｎ１」は、イオン交換クロマトグラフィーカラムから収集されたピーク画分からのＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰ画分１を意味する。
「ＩＥＣＣ Ｆｘｎ３」は、イオン交換クロマトグラフィーカラムから収集されたピーク画分からのＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰ画分３を意味する。
「ｉ．ｎ．」は、ワクチンの投与に関して鼻腔内を意味する。
「ｉ．ｍ．」は、ワクチンの投与に関して筋肉内を意味する。
「ＩＮ／５」ウイルスは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／インドネシア／５／２００５ウイルスを意味する。
「ＪＸ／１３」ウイルスは、Ｈ１０Ｎ８インフルエンザＡ／江西省／ＩＰＢ１３ａ／２０１３ウイルスを意味する。
「Ｍ１」は、インフルエンザ内部コアタンパク質マトリックス１を意味する。
「Ｍ１ ＶＬＰ」は、Ｍ１ベースのＶＬＰ（すなわち、内部コアタンパク質Ｍ１を有するウイルス様粒子）を意味する。
「ＭＥＲＳ」は、中東呼吸器症候群を意味する。
「ＭＯＩ」は、感染多重度を意味する。
「Ｎ１」〜「Ｎ１１」は、インフルエンザＮＡタイプ１〜１１を意味する。
「ＮＡ」は、インフルエンザ膜貫通糖タンパク質ノイラミニダーゼを意味する。
「ｐ．ｃ．」は、被験体が標的病原体をチャレンジされた後の期間に関して、チャレンジ後を意味する。
「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
「ＰＥＤＶ」は、ブタ伝染性下痢ウイルスを意味する。
「ＰＲ８」ウイルスは、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／１９３４ウイルスを意味する。
「ｒＢＶ」は、組換えバキュロウイルスを意味する。
「ＲＦＵ」は、相対蛍光単位を意味する。
「ＳＡＲＳ」は、重症急性呼吸器症候群を意味する。
「Ｓｆ９」は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を意味する。
「ＳＨ／１３」は、Ｈ７Ｎ９インフルエンザＡ／上海／２／２０１３ウイルスを意味する。
本発明の「被験体」は、好ましくは、動物、例えばマウス、フェレット、ニワトリ、ブタなど、好ましくは哺乳動物または鳥、最も好ましくはヒトである。
「標的病原体タンパク質」は、任意の病原体由来の任意のタンパク質またはペプチドを含む。病原体は、ウイルス、細菌、プリオン、真核生物、真菌または任意の他の微生物であり得る。病原体はまた、寄生性原虫などの寄生生物であり得る。病原体はまた、ヒトを含む多細胞生物であり得る。ヒト標的病原体タンパク質の例は、タンパク質またはペプチド癌マーカーである。
「ＶＮ／０４」は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４ウイルスを意味する。
「ＶＬＰ」は、組換えウイルス様粒子を意味する。
「ＷＨＯ」は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎを意味する；
病原体に対するワクチン
ワクチン接種は、病原体によって引き起こされるエピデミックを予防または最小化／処置するための最も有効な戦略である。季節性インフルエンザエピデミックは、例えば、世界中で５００万人に深刻な影響を与える。最近では、西アフリカエボラのアウトブレイクは、大陸で数万人を不具にした。
病原体に感染した患者を処置する薬物療法とは異なり、ワクチンは、患者においてロバストな免疫応答を誘発することによって、将来の感染症から患者を保護する。伝統的なワクチン開発は、狭域かつ特異的なものであり、単一の病原体に対する免疫応答の誘発に注力していた。しかしながら、多数の病原体に対するロバストな免疫応答を誘発することができる多重特異的広域ワクチンを開発する必要性が高まっている。本明細書において、本発明者らは、１つまたはそれを超える異なる病原体に対する免疫防御を提供する新規ワクチンシステムまたはプラットフォームを初めて記載した。
インフルエンザウイルスは一般的なウイルス病原体であり、人々にとって致命的であり得、公衆衛生の深刻な脅威である（Ｍｏｒｅｎｓ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ，２０１２；Ｐａｌｅｓｅ，２００６；Ｙｅｎ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，２００９）。インフルエンザウイルスは、８つのセグメント化二本鎖ネガティブセンスＲＮＡゲノムを含有するエンベロープウイルスであり、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄｅａｅ科に属する。Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスが存在し、そのうち、インフルエンザＡウイルス、特に鳥インフルエンザＡは、その潜在的なエピデミックおよびパンデミックのアウトブレイクについて、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（「ＷＨＯ」）およびＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（「ＣＤＣ」）によって緊密にモニタリングされている。
インフルエンザＡウイルスは、とりわけ、２つの膜貫通糖タンパク質赤血球凝集素（「ＨＡ」）およびノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）ならびに内部コアタンパク質マトリックス１タンパク質（「Ｍ１」）を有する。インフルエンザＡウイルスは、１８タイプの公知のＨＡおよび１１タイプの公知のＮＡを有し、その結果、インフルエンザＡサブタイプの異なる組み合わせは合計１９８個になる。これらのインフルエンザＡサブタイプの大部分は鳥に感染し得るが、ごく一部はヒトに感染し得ると考えられている。鳥インフルエンザのサブタイプは、再集合および頻繁な遺伝子変化が可能であるので（Ｍｏｒｅｎｓ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ，２０１２；Ｐａｌｅｓｅ，２００４）、いくつかの鳥インフルエンザＡウイルスサブタイプは、ヒト−鳥の壁を乗り越え始めていることが公知である。
ヒト−鳥の壁が乗り越えられることにより、世界中で４０００万〜１億の命を奪った１９１８年のＨ１Ｎ１パンデミックと同様に、高病原性鳥インフルエンザ（「ＨＰＡＩ」）ウイルスがパンデミックを引き起こすという世界的な懸念が生じている（Ｋａｎｇら、２００９；Ｍｏｒｅｎｓ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ，２０１２）。今日では、Ｈ５Ｎ１インフルエンザは、ＨＰＡＩウイルスの例である；しかしながら、他のものが存在する。これらとしては、例えば、２０１３年のアウトブレイクを引き起こして多くの人々の命を奪ったＨ７Ｎ９インフルエンザウイルス（Ｃｈｅｎら、２０１５；Ｇａｏら、２０１３）；鳥類起源であるがヒト病原体であることが公知のＨ９Ｎ２インフルエンザウイルス（Ｂｌａｎｃｏら、２０１３；Ｐｕｓｈｋｏら、２００５；Ｙｅｎ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，２００９）；およびヒトへの感染能力を獲得していることがごく最近発見されたＨ１０Ｎ８インフルエンザウイルス（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｓｃｈｍｏｌｋｅ，２０１４；Ｔｏら、２０１４）が挙げられる。
現在では、季節性インフルエンザのワクチンが存在する。しかしながら、それらは、孵化鶏卵において別個に成長させた後に三価ワクチンとして混合したＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびインフルエンザＢウイルスからなるものである。卵を使用したワクチン生産には重大な限界がある。これらとしては、広域防御の欠如；新興ＨＰＡＩウイルスに対する非有効性；非効率的な生産；低い収率；およびスケールアップの問題が挙げられる。インフルエンザなどの多くの病原体が抗原連続変異を毎年受けるので、循環する季節性ウイルスの変化に応じて、ワクチンを継続的に開発および変更しなければならない。加えて、インフルエンザでは、３つの一価ワクチンをそれぞれ別個に調製しなければならないので、三価ブレンドワクチンの生産は、ワクチンの生産コストを大幅に増加させ、インフルエンザの脅威に対する応答時間を増加させ、投与後の有害反応の可能性を増加させる。したがって、新規広域ワクチンシステムの開発に対する強い必要性がある。
エボラウイルスはリスクグループ４の病原体であり、極めて高い死亡率を引き起こし、近年では多くの西アフリカ諸国を荒廃させた。エボラウイルスは、一本鎖ネガティブセンスＲＮＡを含有するエンベロープウイルスであり、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する。エボラウイルスは、膜貫通糖タンパク質（「ＧＰ」）および内部コアタンパク質を有する。現在では、エボラワクチンは、ヒトにおける一般的使用について承認されていない。
中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルスは、２０１２年に確認された新興ウイルスであり、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスと同様に、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属する。ＭＥＲＳコロナウイルスは、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡを含有するエンベロープウイルスである。また、ブタ伝染性下痢ウイルス（「ＰＥＤＶ」）などの他のコロナウイルスと同様に、ＭＥＲＳコロナウイルスは、膜貫通糖タンパク質を有する。現在のところ、ＭＥＲＳコロナウイルスについてはほとんど知られていない。
ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）は、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）を引き起こすことが広く公知である。ＨＩＶは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する一本鎖ポジティブセンスＲＮＡを有するエンベロープウイルスである。ＨＩＶエンベロープタンパク質（「ＥＮＶ」）は、ワクチン研究の標的となっている。しかしながら現在のところ、ＨＩＶワクチンは、ヒトにおける臨床的使用について承認されていない。
動物およびヒトに有害な病原体のリストは膨大であり、増え続けている。多数の病原体に対する免疫応答を誘発することができるロバストな広域ワクチンシステム／プラットフォームの開発に対する強い必要性がある。本明細書において、本発明者らは、１つまたは多数の（例えば、複数の）異なる病原体に対する特異的なまたは広域な免疫応答を誘発するための、Ｂｇａｇベースの新規ＶＬＰを使用した新規ワクチンプラットフォームを初めて記載した。
ワクチン候補としてのＶＬＰの使用
組換えウイルス様粒子（「ＶＬＰ」）は、有望なワクチン候補である。それらは高度に免疫原性であり、ネイティブなウイルス粒子に形態学的および抗原的に類似するが、複製不能である。ＶＬＰの免疫防御効果は、前臨床試験および臨床試験において実証されている（Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１）。加えて、生ワクチンまたは不活化ワクチンとは異なり、ＶＬＰは標的病原体の産生を伴わないが、ＶＬＰによって発現および提示される標的病原体の抗原を介して、標的病原体に対するロバストな免疫応答を誘発し得る。したがって、ＶＬＰは、インフルエンザを含む多くの病原体の安全かつ有効なワクチン候補である（Ｋｕｓｈｎｉｒら、２０１２；Ｐｕｓｈｋｏら、２０１３）。
最近、ＶＬＰは、鳥インフルエンザの有望なワクチンであることが示されている（Ｂｒｉｇｈｔら、２００７；Ｇａｌａｒｚａら、２００５；Ｋａｎｇら、２００９；Ｐｅｒｒｏｎｅら、２００９；Ｐｕｓｈｋｏら、２００５；Ｑｕａｎら；Ｒｏｓｓら、２００９）。本発明者らは、例えば、インフルエンザＨＡ、ＮＡおよびＭ１タンパク質から構成されるＶＬＰ（Ｐｕｓｈｋｏら、２００５）が非常に効率的な防御免疫応答を誘発し、いくつかの場合では、伝統的なインフルエンザワクチンによって誘発される免疫応答を上回っていたことを示した（Ｂｒｉｇｈｔら、２００７；Ｐｕｓｈｋｏら、２００７）。インフルエンザＶＬＰワクチンの観察された高い免疫原性は、ＨＡタンパク質が、インフルエンザウイルス構造に似た規則的なパターンに組織化され、それにより、宿主免疫系の活性化が促されることに起因していた（Ｋａｎｇら、２００９；Ｐｕｓｈｋｏら、２０１３）。
卵ベースの技術とは異なり、ＶＬＰは細胞培養で生産され、分子生物学の方法を使用して操作される。しかしながら、今日であっても、卵依存的な三価季節性インフルエンザワクチンと同様に、多くのＶＬＰワクチン候補は依然として株特異的ＶＬＰとして開発されており、個別に合成および生産され、その後に混合またはブレンドされる。また、これらのＶＬＰの多くは、相同ＨＡ、ＮＡおよびＭ１タンパク質（すなわち、同じウイルスに由来するＨＡ、ＮＡおよびＭ１）を使用することによって調製された（Ｐｅｒｒｏｎｅら、２００９；Ｐｕｓｈｋｏら、２０１０；Ｐｕｓｈｋｏら、２００５；Ｐｕｓｈｋｏら、２００７）。新興ウイルスの配列データは、常に容易に利用可能ではないことが非常に多いので、このアプローチは困難である。例えば、典型的には、新興インフルエンザワクチンのワクチン開発の初期段階では、新興インフルエンザウイルスのＭ１配列は利用可能ではない。このため、相同ＨＡ、ＮＡおよびＭ１タンパク質を有するＶＬＰを使用して、例えば新興ウイルスに対するワクチンを開発することは特に困難である。
これに対応して、一部では、標的インフルエンザウイルス由来のＨＡおよびＮＡと、異なるインフルエンザウイルス由来のＭ１とを使用して、ＶＬＰを開発している（Ｌｉｕら、２０１５）。また、他では、マウス白血病ウイルスｇａｇタンパク質で（Ｈａｙｎｅｓ，２００９；Ｈａｙｎｅｓら、２００９）、またはサル／ヒト免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質で（Ｇｕｏら、２００３）、Ｍ１を置き換えようとしている。最近、本発明者らは、ＮＡと、それぞれ異なるインフルエンザサブタイプに由来する３つの異なるＨＡとを有するいくつかの異なるＭ１ ＶＬＰを作製および記載した（Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１；Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａら、２０１３）。本発明者らは、電子顕微鏡によって、３つのＨＡサブタイプがすべて同じＭ１ ＶＬＰに共局在することをさらに示した（Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１；Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａら、２０１３）。本発明者らは、Ｍ１ ＶＬＰが、３つのインフルエンザ株すべてに対する高度な防御免疫応答を誘導し、有効な三価インフルエンザワクチンであることをさらに示した（Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１；Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａら、２０１３）。すなわち、単一のＶＬＰ由来のＭ１ ＶＬＰワクチンは、３つのインフルエンザウイルスすべてから保護し得る。
しかしながら、Ｍ１ ＶＬＰは、ワクチン、特にヒトワクチンの理想的な候補ではない。例えば、いくつかのインフルエンザウイルスのＭ１タンパク質は、より低いレベルで発現される。また、上記で議論されているように、新興インフルエンザウイルスについては、Ｍ１遺伝子またはＭ１タンパク質の配列は容易に利用可能ではないことが多い。さらに、ほとんどの人々はＭ１に曝露されている；したがっておそらく、人々の間には、Ｍ１を発現するＶＬＰに対する既存の宿主免疫がある。したがって、これは、ヒトにおける特異的免疫応答の誘導におけるＭ１ ＶＬＰの有効性を大きく損なうであろう。
新規Ｍ１不含Ｂｇａｇ ＶＬＰ
本明細書において、本発明者らは、ウシ免疫不全ウイルス（「ＢＩＶ」）ｇａｇタンパク質（「Ｂｇａｇ」）を使用したＭ１不含ＶＬＰ（本明細書では、Ｂｇａｇ ＶＬＰと称される）であって、１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現するＭ１不含ＶＬＰを初めて作製および記載した（例えば、実施例１を参照のこと）。本明細書に開示される新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、内部コアタンパク質としてＢｇａｇを使用する。ウイルスのＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓ属に属するＢＩＶは、ワクチン開発研究において以前に使用されており、ＢＩＶベクターの使用は以前に記載されている（Ｌｕｏ，２０１２）。しかしながら、本開示の前において、Ｂｇａｇ ＶＬＰを使用して１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質、例えば様々なインフルエンザタンパク質を発現または共発現させること；ワクチン候補としてＢｇａｇ ＶＬＰを使用すること；または診断ツールとしてＢｇａｇタンパク質もしくはＢｇａｇ遺伝子を使用することは開示されていない。
本明細書に開示されるように、本発明者らは、とりわけ、１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現および提示するＢｇａｇ ＶＬＰを初めて調製し（例えば、実施例１および実施例５〜実施例１２を参照のこと）；Ｂｇａｇ ＶＬＰが、１つまたはそれを超える異なる機能的インフルエンザタンパク質を発現および提示し得る（４つの異なるインフルエンザサブタイプに属する機能的ＨＡを同時に共発現および共提示し得ることを含む）ことを初めて示し（例えば、実施例５〜実施例７および実施例１１〜実施例１２を参照のこと）；Ｂｇａｇ ＶＬＰが、非インフルエンザ病原体タンパク質を発現および提示し得ることを初めて示し（例えば、実施例９を参照のこと）；Ｂｇａｇ ＶＬＰが、遺伝子改変キメラ病原体タンパク質を発現および提示し得ることを初めて示した（例えば、実施例１０を参照のこと）。加えて、本発明者らは、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰおよびＢｇａｇ ＶＬＰ媒介性特異的（ユニターゲット）または広域（マルチターゲット）ワクチンを調製する方法を初めて記載した（例えば、実施例１〜実施例３および実施例５〜実施例１２を参照のこと）。さらに、本発明者らは、Ｂｇａｇ ＶＬＰの使用に関連する利益（優れたワクチンとしてのその利益を含む）を記載した。またさらに、本発明者らは、Ｂｇａｇ ＶＬＰを使用することの利益（広域ワクチン候補としてのものを含む）を記載した。加えて、本発明者らは、Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムに関連してＢｇａｇタンパク質を使用する多数の診断方法を記載した。
Ｂｇａｇ ＶＬＰは、広域な標的病原体タンパク質に使用され得る
Ｂｇａｇ ＶＬＰプラットフォームによって発現および提示され得る標的病原体タンパク質のタイプは非常に広い。例えば、それは、任意のウイルス、細菌、プリオン、真核生物、真菌、寄生生物または任意の他の単細胞生物もしくは多細胞生物由来の任意のペプチドまたはタンパク質を含み得る。また、これらの標的病原体タンパク質の１つまたはそれよりも多くを発現するＢｇａｇ ＶＬＰが被験体に注射または投与される場合、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、これらの病原体の１つまたはそれよりも多くに対する免疫応答を誘発し得る。したがって、Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムまたはプラットフォームは、とりわけ、これらの病原体の病原性効果を処置、阻害および／または予防するために、ウイルスワクチン、細菌ワクチン、プリオンワクチン、真菌ワクチンおよびさらに寄生生物ワクチンとして使用され得る。本明細書に開示される原理および方法を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムまたはプラットフォームはまた、１つまたはそれを超える異なるウイルス、細菌、プリオン、真核生物、真菌、寄生生物、任意の他の微生物またはマクロ生物、それらの組み合わせなどに対するワクチンとして使用され得、被験体の脆弱性または感受性に応じて、オーダーメードワクチンまたは処置を提供するという利点を有する。例えば、２つの特定のウイルス（１つの特定の細菌および１つの特定の真菌）に対して感受性の被験体は、ウイルス、細菌および真菌の発生を阻害／予防および／または処置するためのオーダーメードワクチンを投与され得る。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰプラットフォームはまた、１つまたはそれを超える癌マーカーを発現させるために使用され得る。例えば、１つまたはそれを超える癌マーカーペプチドまたはタンパク質は、標的病原体タンパク質として使用され得る。ワクチンとして、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、被験体の免疫系を強化し、発達中の癌細胞に対する監視を増加させて、癌を有効に阻害／予防、処置または制御するために使用され得る。
標的病原体タンパク質を含有するＢｇａｇ ＶＬＰは、免疫応答を誘発してワクチンとして機能し得る。例えば、標的病原体タンパク質に対する免疫応答を誘導する目的で、標的病原体タンパク質を含有するＢｇａｇ ＶＬＰを被験体に注射または別様に投与し得る。次いで、標準的なアッセイによって、標的病原体に対するワクチン接種被験体の免疫応答を決定する。例えば、約２〜約４週間で、ワクチン接種被験体の血液を採取し、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光抗体アッセイまたは他の抗体検出アッセイによって抗標的病原体抗体を決定し、非ワクチン接種被験体の抗体プロファイルと比較する。ワクチン接種被験体における抗標的病原体抗体の存在は、Ｂｇａｇ ＶＬＰが被験体において免疫応答を誘発したので、インビボで免疫原性であることを示す。標準的なチャレンジ研究はまた、標的病原体からの被験体の保護におけるＢｇａｇ ＶＬＰの有効性を実証し得る。
コンセンサス標的病原体タンパク質または保存的エピトープを有するＢｇａｇ ＶＬＰ
特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰの標的病原体タンパク質は、免疫防御を拡大するように設計され得る。例えば、標的病原体タンパク質は、先進的遺伝子分析技術を使用して決定されたコンセンサスＨＡ配列に由来し得る（Ｄｅｎｉｓら、２００８；Ｅｂｒａｈｉｍｉら；Ｐｉｃａ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ，２０１３；Ｒａｏら、２０１０；Ｓｃｈｏｔｓａｅｒｔら、２００９；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ，２００９；Ｗｅｉら、２０１０）。別の例として、標的病原体タンパク質は、保存的インフルエンザエピトープ、例えばインフルエンザＭ２イオンチャネルタンパク質の外部ドメインに由来し得る（Ｄｅｎｉｓら、２００８；Ｅｂｒａｈｉｍｉら；Ｐｉｃａ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ，２０１３；Ｒａｏら、２０１０；Ｓｃｈｏｔｓａｅｒｔら、２００９；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ，２００９；Ｗｅｉら、２０１０）。これらの設計から得られるインフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰは、複数またはすべてのインフルエンザサブタイプからの広域な免疫防御を提供し得る。
遺伝子改変標的病原体タンパク質を有するＢｇａｇ ＶＬＰ
本発明者らは、遺伝子改変標的病原体タンパク質がＢｇａｇ ＶＬＰによって発現および提示され得ることを示した（例えば、実施例８および実施例１０を参照のこと）。例えば、特定の実施形態では、標的病原体タンパク質の一部が、Ｂｇａｇ ＶＬＰによって発現および提示される。特定の実施形態では、標的病原体タンパク質のいくつかは、特定の可変領域が除去されたものであり得る。例えば、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、ウイルス中和に関与する最も可変性のＨＡエピトープが除去された「ヘッドレス」ＨＡを使用して作製され得る。このアプローチの利点は、Ｂｇａｇ ＶＬＰによって提示されるヘッドレスＨＡが、全長ＨＡを含有する標準的なＶＬＰでは通常は隠れているＨＡエピトープに対する免疫応答を誘導し得ることである。別の例として、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、ＨＡの「ステム」領域を使用して作製され得る。ヘッドレスＨＡまたはステムＨＡに対する免疫応答は、インフルエンザウイルスの多数の株およびサブタイプから保護することができる広く保護的または普遍的なインフルエンザワクチンをもたらし得る。これらの実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、広域な免疫応答を誘発しようとして、標的病原体タンパク質の保存領域を主に提示し得る。
標的病原体由来の膜貫通タンパク質は、優れた標的病原体タンパク質として機能し、Ｂｇａｇ ＶＬＰによって発現および提示される。しかしながら、標的病原体由来の細胞質タンパク質およびペプチドならびに分泌タンパク質およびペプチドもまた、遺伝子操作によって標的病原体タンパク質として機能し得る。例えば、ウイルス、細菌、プリオン、真核生物、真菌、寄生生物、寄生性原虫またはヒト起源の細胞質および／または分泌タンパク質またはペプチド（例えば、癌マーカー）は、Ｂｇａｇ ＶＬＰによって提示され得る膜貫通タンパク質に操作され得る。このような例の１つは、標準的な遺伝子操作方法または本明細書に本質的に記載される方法を使用して、インフルエンザＨＡの膜貫通ドメインをこれらの非膜貫通タンパク質および／またはペプチドに遺伝子改変して、キメラＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴを作製することである。例えば、インフルエンザＨＡの膜貫通ドメインは、前立腺特異的抗原（前立腺細胞によって通常分泌されるタンパク質癌マーカー）のＣ末端に追加され得る。本明細書に本質的に記載される原理および方法を使用して、遺伝子改変ＰＳＡタンパク質はＢｇａｇ ＶＬＰによって発現および提示され得、癌進行を阻害、予防、処置、モニタリングおよび／または制御するために被験体において使用され得る。
特定の実施形態では、遺伝子改変は、Ｂｇａｇに対する結合効率を増加させるように標的病原体タンパク質を改変することを伴う（例えば、実施例１０を参照のこと）。例えば、Ｂｇａｇに対する結合効率を最適化するために、改変は、標的病原体のＣ末端に対して行われ得る。
特定の他の実施形態では、遺伝子改変は、キメラ標的病原体タンパク質を作製することを伴う。このようなキメラの１つは、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴタンパク質である（図１７および１８を参照のこと）。実施例１０および本明細書の他の箇所に記載されているように、キメラＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴタンパク質は、インフルエンザＨＡの膜貫通およびまたはＣ末端領域を標的エボラ糖タンパク質のＣ末端で置換することによって作製される。
特定の他の実施形態では、標的病原体タンパク質は、Ｂｇａｇ ＶＬＰによるその発現および提示を改善するように合理的に設計および／または再設計され得る。例えば、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の合理的な設計は、タンパク質の提示を１０倍増加させ得ることが示されている（Ｗａｎｇら、２００７）。
すべての場合において、上記に本質的に記載されているのと同じ原理を使用して、Ｂｇａｇタンパク質も遺伝子改変および改善され得る。例えば、Ｂｇａｇの特定の領域は、標的病原体タンパク質に対する結合効率を増加させるように改変され得る。
他のＢｇａｇ ＶＬＰのように、例えば本明細書に記載される原理および方法を使用して、遺伝子改変標的病原体タンパク質を含有するＢｇａｇ ＶＬＰは、免疫応答を誘発してワクチンとして機能し得る。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるタイプの標的病原体タンパク質を発現および提示し得る
本発明者らは、１つまたはそれを超える異なるタイプの標的病原体タンパク質を発現／共発現および提示／共提示させるための新規Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムを作製および記載した（例えば、実施例５〜実施例１２を参照のこと）。特定の実施形態では、標的病原体タンパク質は、ＶＬＰの膜に局在する（例えば、図６、７、１２、１６を参照のこと）。遺伝子改変されているか否かにかかわらず、この新規Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムによって、様々な病原体タンパク質が使用され得る。２つの例としては、インフルエンザＡ膜貫通タンパク質（例えば、実施例５〜実施例８および実施例１１〜実施例１２を参照のこと）およびエボラ糖タンパク質（例えば、実施例９〜実施例１０を参照のこと）が挙げられる。
本発明者らはまた、Ｍ１ ＶＬＰと全く同様に、Ｂｇａｇ ＶＬＰが標的病原体タンパク質を提示し得ることを示した。例えば、本発明者らは、Ｍ１ ＶＬＰと全く同様に、Ｂｇａｇ ＶＬＰがインフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質を提示することを示した（例えば、図２〜７を参照のこと）。本発明者らは、提示された標的病原体タンパク質が機能的であることをさらに示した。例えば、Ｂｇａｇ ＶＬＰ上のＨＡおよびＮＡタンパク質は、機能的な赤血球凝集およびＮＡ酵素活性を示すことが示された（例えば、図２、５、９、１４および１５を参照のこと）。
特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、約１００ｎｍ超かつ最大２００ｎｍ、好ましくは約１２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１６０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１７０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１８０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１９０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する。Ｂｇａｇ ＶＬＰは、いくつかの生来の病原体と比較して実質的に大きい。例えば、インフルエンザウイルスの平均直径は、約１００ｎｍである；ＨＩＶの平均直径は、約１２０ｎｍである；ＳＡＲＳコロナウイルスの平均直径は、約８０〜９０ｎｍである。Ｂｇａｇ ＶＬＰはまた、Ｍ１ ＶＬＰよりも実質的に大きい。例えば、インフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰの平均直径は約１５０〜約１８０ｎｍであるが、インフルエンザＭ１ ＶＬＰの平均直径は約１２０〜約１５０ｎｍである。より大きいサイズにもかかわらず、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、Ｍ１ ＶＬＰおよびインフルエンザウイルスと同様の一般的形態を有する（例えば、図６および７を参照のこと）。各ＶＬＰは、生来の病原体またはＭ１ ＶＬＰよりも実質的に多くの標的病原体タンパク質を提示し得るので、より大きいＢｇａｇ ＶＬＰは、特にワクチン候補として非常に有利である。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるタイプの標的病原体タンパク質を提示し得る汎用的なシステムである（例えば、実施例５〜実施例１２を参照のこと）。特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つの病原体から選択される標的病原体タンパク質を含むが（例えば、実施例５〜実施例１０を参照のこと）、特定の他の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つのタイプよりも多くのまたはサブタイプの病原体から選択される多数の（例えば、複数の）病原体タンパク質の標的を含む（例えば、実施例１１〜実施例１２を参照のこと）。特定の実施形態では、選択される病原体の１つは、ウイルスである。特定の実施形態では、ウイルス病原体（ｖｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ）は、オルトミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、さらに好ましくはインフルエンザＡウイルス；フィロウイルス、好ましくはエボラウイルス；コロナウイルス、好ましくはＭＥＲＳウイルス；およびレトロウイルス、好ましくはＨＩＶの組み合わせから選択される。
特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、被験体における１つまたはそれを超える異なる病原体から保護することができるか、またはそれらに対する免疫応答を誘発することができる。したがって、ユニターゲットＢｇａｇ ＶＬＰを用いて調製されたワクチンは、ロバストな標的特異的免疫防御を提供し得るが、マルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰを用いて調製されたワクチンは、広域なマルチターゲット免疫防御を提供し得る。重要なことに、広域防御は、異なるユニターゲットワクチンを一緒にブレンドすることによってではなく、単一のマルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰによって達成される。しかしながら、さらに広い免疫範囲を提供するために、異なるマルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰは確実に、さらに混合および／またはブレンドされ得る。したがって、マルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰは、異なる標的病原体に対する広域な免疫防御を誘発するために使用され得、パンデミック対策の戦略の重要な追加要素である。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるサブタイプの標的病原体タンパク質を発現および提示し得る
本発明者らは、Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムまたはプラットフォームが、１つまたはそれを超える異なるサブタイプの標的病原体タンパク質を提示させるための収容プラットフォームであることを示した（例えば、実施例５〜実施例１２を参照のこと）。ユニサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰの特定の実施形態では、本発明者らは、ＰＲ８ Ｈ１および新興インフルエンザＨ１０を含む機能的インフルエンザ貫通タンパク質ＮＡおよびＨＡを含むＢｇａｇ ＶＬＰを作製し得ることを示した（例えば、実施例５および実施例６を参照のこと）。本開示の前において、Ｂｇａｇは、インフルエンザＶＬＰの生産に以前に使用されておらず、ＢｇａｇがユニサブタイプＶＬＰの調製に使用され得ることは公知ではなかった。マルチサブタイプのＢｇａｇ ＶＬＰの特定の実施形態では、本発明者らは、多数の異なるサブタイプの標的ウイルスに対する広域な同時免疫防御を提供することができるマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ（すなわち、異なるサブタイプの標的病原体タンパク質を同時に共発現および共提示するＶＬＰ）を初めて作製および記載した（例えば、実施例１１および実施例１２を参照のこと）。本開示の前において、ＢｇａｇがマルチサブタイプＶＬＰの調製に使用され得ることは公知ではなかった。
特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるサブタイプのウイルスから保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。したがって、ユニサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを用いて調製されたワクチンは、ロバストなサブタイプ特異的免疫防御を提供し得るが、マルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを用いて調製されたワクチンは、広域なマルチサブタイプ免疫防御を提供し得る。マルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰのように、広域防御は、異なるユニサブタイプワクチンを一緒にブレンドすることによってではなく、単一のマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰによって達成される。しかし、より広い免疫範囲を提供するために、異なるマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰは確実に、混合またはブレンドされ得る。異なるタイプおよびサブタイプの病原体に対する広範な免疫防御を誘発するために使用され得るＢｇａｇ ＶＬＰシステムは、マルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰ設計と一緒に、パンデミック対策の戦略の重要な追加要素である。
一例として、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、異なるインフルエンザウイルスサブタイプを含む１つまたはそれを超える（例えば、複数の）異なるウイルスサブタイプから保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰにおいて共発現されるインフルエンザＡ膜貫通タンパク質は、鳥類宿主細胞またはヒト宿主細胞にのみ結合し得るが、特定の他の実施形態では、膜貫通タンパク質は、鳥類宿主細胞およびヒト宿主細胞の両方に結合する。特定の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、その標的病原体タンパク質として１つまたはそれを超える異なるＨＡタイプ１〜１８（「Ｈ１」〜「Ｈ１８」）およびＮＡタイプ１〜１１（「Ｎ１」〜「Ｎ１１」）を含み、タンパク質を発現および提示する。特定の他の実施形態では、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なるインフルエンザサブタイプ、例えばサブタイプＨ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０から保護することができるか、または被験体においてそれらに対する免疫応答を誘発することができる。
この新規プラットフォームを使用して、本発明者らは、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを初めて作製および記載した（例えば、図１０〜１１、１３〜１６および実施例１１を参照のこと）。特定の実施形態では、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰは、インフルエンザサブタイプ５、７、９および１０由来のインフルエンザＨＡを共発現した。これは、四サブタイプＶＬＰが、ＶＬＰの表面上で鳥インフルエンザＨ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０タンパク質を同時に発現および提示して、４つのインフルエンザウイルスサブタイプすべてに対する同時免疫防御を提供することを可能にする。実施形態はまた、同じまたは異なるタイプのＮＡを共発現および共提示し得る（または発現および提示し得ない）。特定の実施形態では、これらの四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ由来のＨＡは局在してホモ三量体を形成するが、特定の他の実施形態では、ＨＡは、ヘテロ三量体またはホモ三量体とヘテロ三量体との混合物を形成する。特定の実施形態では、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、３つの異なるタイプのＨＡと、１つのタイプのＮＡとを共発現および共提示する。
Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０サブタイプの鳥インフルエンザウイルスは、パンデミック懸念の病原体として同定されている（Ｂｅｌｓｅｒら、２００８；Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｓｃｈｍｏｌｋｅ，２０１４；Ｐａｌｅｓｅ，２００４；Ｐａｐｐａｓら、２００７；ＷＨＯ，２０１３）。特に、ＶＮ／０４（Ｈ５Ｎ１）およびＨＫ／０９（Ｈ９Ｎ２）ウイルスは両方とも、２０１２年においてＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）が推奨するパンデミック対策のワクチン候補のリストに掲載されている（ＷＨＯ，２０１２ａ）。パンデミック対策を強化するために、細胞培養物由来のインフルエンザワクチンを含む不活性化Ｈ５Ｎ１ワクチンが承認されている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ａｎｄ Ｄｏｎｉｓ，２００９）。しかしながら、有望な実験ワクチンが報告されているが（Ｃｈｅｎら、２０１４；Ｋｏｎｇら、２０１５；Ｓｍｉｔｈら、２０１３；Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａら、２０１３；Ｗｏｈｌｂｏｌｄら、２０１５）、現在のところ、Ｈ７、Ｈ９またはＨ１０サブタイプの承認されたヒトワクチンはない（ＷＨＯ，２０１２ａ）。
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現する新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なる標的病原体に対するロバストな免疫応答を誘発し得るので、優れたワクチンプラットフォームである。例えば、Ｈ１０Ｎ１ウイルス由来の赤血球凝集素を含有するＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをフェレットに注射または別様に投与することにより、フェレットにおいてロバストな抗Ｈ１０中和抗体が誘発される（例えば、図３０および３１を参照のこと）。同様に、四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをフェレットに注射または別様に投与することにより、フェレットにおいてロバストな抗Ｈ５、抗Ｈ７、抗Ｈ９およびＨ１０中和抗体が同時に誘発される（例えば、図３０および図３１を参照のこと）。誘発された中和抗体は、同じサブタイプの異なるクレード由来のウイルスを中和して、交差防御中和抗体の可能性を生じさせ得ることがさらに見出された。例えば、四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰによって誘導される抗Ｈ５中和抗体は、Ｈ５Ｎ１クレード１、クレード０、クレード１．１．２、クレード２．２およびクレード２．２．２ウイルスに対する中和抗体を誘発し得る（例えば、図３１を参照のこと）。
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現する新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、１つまたはそれを超える異なる標的病原体に対するワクチン接種被験体の免疫防御も提供し得るので、優れたワクチンプラットフォームである。例えば、Ｈ１０Ｎ１ウイルス由来の赤血球凝集素を含有するＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをフェレットに注射または別様に投与することにより、例えば鼻甲介および気管における複製ウイルス力価の有意な減少によって示されているように（例えば、図３２を参照のこと）、生インフルエンザＨ１０Ｎ１ウイルスによるその後のチャレンジにおいてフェレットが保護され得る。別の例として、四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをフェレットに注射または別様に投与することにより、例えば鼻甲介および気管における複製ウイルス力価の有意な減少によって示されているように（例えば、図３２を参照のこと）、生インフルエンザＨ１０Ｎ１ウイルスを用いたその後のチャレンジ研究においてもフェレットが保護される（例えば、図３２を参照のこと）。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、少なくとも４つのウイルスサブタイプまたは株またはクレードに対する特異的免疫防御を提供し得る優れた広域ワクチン候補である。本明細書で示されるように、この新規インフルエンザＨ５／Ｈ７／Ｈ９／１０四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰによって媒介される新規マルチサブタイプワクチン候補または四サブタイプワクチン候補は非常に有効である（ヒトにおいて使用するためのものを含む）。以前に記載されている伝統的なブレンドワクチンとは異なり、Ｂｇａｇ ＶＬＰプラットフォームを用いて達成される広域な免疫防御は、個々のワクチンを混合せずに達成され得る。
新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、同じサブタイプの１つまたはそれを超える異なるクレードの標的病原体タンパク質を発現および提示し得る
異なるタイプおよびサブタイプに属する標的病原体タンパク質を発現および提示させることに加えて、Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムはまた、同じサブタイプの異なるクレードに属する標的病原体タンパク質を発現および提示させるために使用され得る。例えば、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、３つの異なるクレード、例えばＨ５クレード２．３．４．４（Ａ／ニワトリ／ドイツ／２０１４）、Ｈ５クレード２．１．３（Ａ／ニワトリ／西ジャワ／スバン／２９／２００７）およびＨ５クレード２．２．１（Ａ／ニワトリ／エジプト／１２１／２０１２）に属するインフルエンザＨ５を発現し得る。得られたインフルエンザＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰは機能的ＨＡを発現し（例えば、図３３を参照のこと）、他のＢｇａｇ ＶＬＰの一般的形態を有する（例えば、図３４を参照のこと）。
得られたインフルエンザＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰはまた、インフルエンザＨ５に対する強力な免疫原性を示す。例えば、Ｈ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰをニワトリにワクチン接種した後、ワクチン接種ニワトリは、標準的な赤血球凝集素阻害アッセイによって示されているように（例えば、図３５、３７および３８を参照のこと）、強力な免疫原性および抗Ｈ５抗体の存在を示す。さらに、得られたインフルエンザＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、３つのクレードすべてのチャレンジからワクチン接種被験体を同時に保護する。例えば、１日目および３日目にＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰをワクチン接種し、次いで３５日目にクレード２．３．４．４ウイルス、クレード２．１．３ウイルスまたはクレード２．２．１ウイルスをチャレンジしたニワトリはすべて、チャレンジから生き残った（例えば、図３６を参照のこと）。対照的に、偽ウイルスをワクチン接種したニワトリはすべて、チャレンジの６日以内に死亡した。免疫原性研究はまた、Ｈ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチン接種ニワトリが、チャレンジ２週間後に測定した場合、３つのＨ５クレードすべてに対して高い抗体力価を有していたことを示している。ワクチンの有効性はまた、ワクチン接種被験体におけるウイルスの口腔排出および排泄腔排出の減少によって実証される。例えば、クレード２．３．４．４、クレード２．１．３またはクレード２．２．１に属するウイルスのチャレンジにかかわらず、チャレンジ２日後および４日後のＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチン接種ニワトリの口腔スワブおよび排泄腔スワブに存在するウイルス力価は、非ワクチン接種ニワトリのものよりも実質的に低い（例えば、図３９〜４１を参照のこと）。
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現するＢｇａｇ ＶＬＰを調製するための方法。
本発明者らはまた、１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現および提示するＢｇａｇ ＶＬＰを効率的に調製する新規方法を開発した（例えば、実施例１〜実施例３および実施例５〜実施例１２を参照のこと）。特定の実施形態では、ＤＮＡベクターは、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製するためにキャリアウイルスにおいて発現され、好ましくは、キャリアウイルスは、組換えバキュロウイルス（「ｒＢＶ」）である。特定の実施形態では、ＤＮＡベクターを含有するｒＢＶは、真核細胞、好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞において発現される。特定の実施形態では、各標的病原体タンパク質の遺伝子は、個々のプロモーター、好ましくは個々のポリヘドリンプロモーターによって制御される。特定の実施形態では、前記方法は、多数の異なる標的病原体タンパク質を発現および提示するＢｇａｇ ＶＬＰを調製するために使用される。特定の他の実施形態では、前記方法は、マルチサブタイプ病原体タンパク質を発現および提示するＢｇａｇ ＶＬＰを調製するために使用される。特定の他の実施形態では、前記方法は、Ｂｇａｇ遺伝子と、１つまたはそれを超える異なる標的病原体由来の遺伝子（これらはすべてタンデムに構成されており、それぞれプロモーター、好ましくはポリヘドリンプロモーターの制御下にある）とを含むＤＮＡベクター；キャリアウイルス、好ましくはｒＢＶ；および真核細胞、好ましくはＳｆ９を使用して、１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現するＢｇａｇ ＶＬＰを作製することを含む。
改善されたワクチン生産方法
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現するＶＬＰ、例えば本明細書に開示される四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰは、卵非依存的であり、多数の標的病原体タンパク質に対する広域な免疫を依然として有効に誘導しながら、ワクチンのブレンドを必要とせずに単一の製造サイクルで調製され得るので、伝統的なワクチン生産方法よりも優れている。一実施形態では、前記方法は、インフルエンザＨＡ、ＮＡおよびＢｇａｇ遺伝子を、Ｂｇａｇ ＶＬＰ生産のためのタンパク質を共発現させるための単一のｒＢＶベクターにクローニングすることを伴う。単一のｒＢＶベクターの利点は、これが、感染Ｓｆ９細胞における多数の遺伝子の共発現をもたらし、容易にスケールアップ可能なよりスリム化された方法論および設計を提供することである。さらに、この方法は、標的インフルエンザタンパク質の株特異的抗原を、標準的なＢｇａｇおよびＮＡ遺伝子を含む既成のｒＢＶ移入ベクターにクローニングして、季節性インフルエンザワクチン生産のプロセスをさらにスリム化することを可能にする。例えば、本明細書に記載される四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰは、現在の卵依存的な三価ブレンド法と比較して、季節性インフルエンザ株の優れたワクチン候補である。まとめると、この優れた設計および方法論は、ベクターの調製を容易にし、ＶＬＰの生産およびワクチンの調製を促進する。
加えて、本明細書に記載される新規Ｂｇａｇ ＶＬＰは、パンデミックウイルスまたは新興ウイルスの場合、より信頼性の高いワクチン生産システムである。例えば、パンデミックインフルエンザまたは高毒性の新興インフルエンザウイルスは、伝統的なワクチン開発および生産に深刻な負担をかけ得る。パンデミックインフルエンザウイルスまたは新興インフルエンザウイルスは、農業用家禽種において動物間流行病を引き起こし得る。したがって、ヒトの健康を脅かすことに加えて、パンデミックインフルエンザウイルスまたは新興インフルエンザウイルスは、健康なニワトリおよび卵の供給を深刻に脅かして、ワクチン生産に適切な卵の不足をもたらし得る。インフルエンザ以外の病原体、例えば黄熱病、流行性耳下腺炎および麻疹に対するワクチンの生産も卵に大きく依存するので、動物間流行病は、これらの卵依存的なワクチンの生産およびアベイラビリティにさらなる負担をかけて、公衆衛生をさらに圧迫するであろう。
少なくともこれらの理由により、これらの悲惨な状況の間および前において、本明細書に開示される新規ユニターゲットまたはマルチターゲットＢｇａｇ ＶＬＰは、重要なワクチンプラットフォームである。また、Ｂｇａｇ ＶＬＰプラットフォームは、危険なパンデミック病原体、動物間流行性病原体または新興病原体からの、ヒトおよび／または動物のための迅速、広域およびロバストな保護を提供し得る。Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９および／またはＨ１０鳥インフルエンザウイルスが関与するアウトブレイクの場合、本明細書に開示されるＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０四サブタイプインフルエンザワクチンは、特に代替ワクチンがまだ利用可能ではない場合には、有益な防御最前線であろう。
優れたワクチン候補としてのＢｇａｇ ＶＬＰ
本明細書の他の箇所に記載されている利益に加えて、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰはまた、優れたワクチン候補、特に、優れたヒトワクチン候補である。１つの理由は、内部コアタンパク質Ｂｇａｇが、ヒト病原体とかなりの相同性を有しないためである。ＢＩＶはヒト病原体ではないので、ヒトは、典型的には、ＢＩＶ由来のタンパク質、例えばＢｇａｇに対する既存の免疫性を有しないであろう。デフォルトのパラメータでＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＰソフトウェアを使用したＢｇａｇの配列分析により、最も密接な類似性は、ネコ免疫不全ウイルスとのわずか約２９％の遺伝的類似性およびウマ感染性貧血ウイルスとの約２６％の遺伝的類似性であったことが示された。さらに、本発明者らは、ＢＩＶとヒトレトロウイルスｇａｇタンパク質（ＨＩＶ ｇａｇタンパク質を含む）との間の類似性を検出しなかった。したがって、Ｂｇａｇ媒介性ＶＬＰは、宿主の既存の免疫を回避することができ、Ｍ１ ＶＬＰなどの他のＶＬＰよりも強力かつロバストな免疫応答を誘発することができるので、ヒトワクチンの候補として重大な利点を有する。
特定の実施形態では、各Ｂｇａｇ ＶＬＰは、大きい表面積、好ましくは、標的タンパク質の１つが由来する病原体よりも大きい表面積を含む。本明細書に開示されるように、より大きいサイズを有するＢｇａｇ ＶＬＰは、より小さいＭ１ ＶＬＰよりも優れている。多数の標的タンパク質を提示するＢｇａｇ ＶＬＰ、例えば実施例１１に記載されているＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ（これは、多数のＨＡサブタイプが同じＶＬＰのエンベロープに局在する）の場合、より大きい表面積は特に重要であり得る。本明細書において、本発明者らは、Ｍ１ ＶＬＰの平均約１２０ｎｍ〜約１５０ｎｍと比較して、新規Ｂｇａｇ ＶＬＰが約１５０ｎｍ〜約１８０ｎｍの平均直径を有していたことを示した（例えば、図６〜７を参照のこと）。このＶＬＰサイズの増加は、Ｍ１ ＶＬＰと比較して多くの標的病原体タンパク質がＢｇａｇ ＶＬＰによって提示されるための実質的により大きい表面積を作り出す。例えば、Ｍ１ ＶＬＰよりも多くのＨＡ三量体が局在し、Ｂｇａｇ ＶＬＰによって提示され得る。（図６〜７を参照のこと）。
特定の実施形態では、各Ｂｇａｇ ＶＬＰは、ＶＬＰ膜上に平均約３７５個超のタンパク質スパイク、好ましくは約３７５個のスパイク〜約８００個のスパイク、より好ましくは約４７５個のスパイク〜約８００個のスパイク、より好ましくは約５７５個のスパイク〜約８００個のスパイク、より好ましくは約６７５個のスパイク〜約８００個のスパイク、より好ましくは約７７５個のスパイク〜約８００個のスパイク、さらに好ましくは約８００個のスパイクを含む。平均直径１２０ｎｍの球状ビリオンは、約３７５個のスパイクを含有すると推定されている（Ｈａｒｒｉｓら、２００６）。三量体の分布が等しいと仮定すると、約１８０ｎｍの直径を有するＶＬＰは、約８００個（わずか１２０ｎｍの直径を有するＶＬＰの場合のスパイク数の２倍超）のスパイクを収容し得る。したがって、ワクチン候補としてのＢｇａｇ ＶＬＰは、宿主免疫応答の誘発においてより効率的であり得、よりロバストな宿主免疫応答を誘発し得るので、Ｍ１ ＶＬＰよりも優れている。
診断ツールとしてのＢｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質の使用
特定の実施形態では、Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質は、診断ツールとして使用される。現在のワクチンおよび他のＶＬＰワクチン、例えばＭ１ ＶＬＰワクチンの問題の１つは、ワクチン接種被験体と非ワクチン接種被験体との区別の問題である。Ｂｇａｇ ＶＬＰシステムでは、これはおそらく問題ではないであろう。例えば、本明細書に開示されるように、Ｍ１とは異なり、ヒトおよび特定の動物は、典型的には、Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質に曝露されていない。したがって、医療従事者は、Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質を使用して、被験体がＢｇａｇ ＶＬＰワクチンを以前に投与されたかを決定し得る。ヒトおよび特定の動物集団におけるＭ１遺伝子およびＭ１タンパク質の普遍性のために、例えばＭ１ ＶＬＰ媒介性ワクチンでは、この診断能力は不可能であろう。獣医学的用途において、例えば感染動物とワクチン接種動物との区別（「ＤＩＶＡ」）が重要である場合にも、これは特に重要であり得る（Ｒａｈｎら、２０１５；Ｓｕａｒｅｚ，２０１２）。
標的核酸を有するＢｇａｇ ＶＬＰ
標的の免疫応答を誘導または増強するために、核酸もＢｇａｇ ＶＬＰに組み込まれ得る。本発明者らの最近のデータは、ＲＮＡがＢｇａｇ ＶＬＰに組み込まれ得ることを示している（例えば、図２５〜２７を参照のこと）。感染性ＢＩＶ ＲＮＡおよびＢＩＶ ｅｎｖタンパク質の非存在下では、Ｂｇａｇ ＶＬＰアセンブリが達成される。したがって、ＶＬＰに見られるＲＮＡの存在はおそらく、Ｓｆ９細胞に由来する。特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、Ｂｇａｇ ＶＬＰ構造中に存在するＲＮＡが免疫応答を誘導または増強し得ると考える。Ｂｇａｇ ＶＬＰ生産中にＲＮＡがカプセル化され得るという理論に基づくと、カプセル化ＲＮＡは免疫モデュレーターであると考えられ、免疫応答を増強する可能性があり、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中のＲＮＡの存在は、被験体の免疫応答を誘導または増強し得る。別の例として、Ｃｏｆｆｍａｎら（２０１０）は、ＲＮＡがＴＬＲ７ ｔｏｌｌ様受容体の天然アゴニストであり得、ＴＬＲ７を含む先天性免疫の活性化を介してアジュバントとして作用し得る免疫刺激特性を有することを示唆している。本出願人が知る限り、Ｂｇａｇ ＶＬＰの構造中にこのタイプのＲＮＡを含むＢｇａｇ ＶＬＰの調製、およびＢｇａｇ ＶＬＰ中のこのタイプのＲＮＡの効果は公知ではなく、および／または記載されていない。
実施例１
Ｂｇａｇ ＶＬＰおよびＭ１ ＶＬＰの生産のための組換え移入ベクタープラスミドの作製
内部コアタンパク質および標的病原体タンパク質のタンパク質配列を取得した。示されているタンパク質配列に基づいて、Ｓｆ９細胞における高レベルの発現のために遺伝子をコドン最適化し（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、生化学的に合成する（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。ＶＬＰを作製するために、内部コアタンパク質Ｂｇａｇ遺伝子またはＭ１遺伝子の遺伝子と、インフルエンザＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子などの異なる標的病原体タンパク質の１つまたはそれを超える遺伝子とを、各遺伝子がそれ自体の転写カセット（これは、各遺伝子の上流にポリヘドリンプロモーターを含む）内にあるように、バキュロウイルス移入ベクタープラスミドにタンデムにクローニングする。４つの例示的な概略図が図１に示されている。構築物を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞中の組換えバキュロウイルス（「ｒＢＶ」）にクローニングする。昆虫細胞における高レベルの発現のために、内部コアタンパク質、ＮＡ遺伝子およびＨＡ遺伝子の遺伝子をコドン最適化し、示されているようにタンデムにｒＢＶにクローニングする。第１の構築物では、矢印として代表的に示されているように、各構築物は、ポリヘドリンプロモーターのセットを含有する。前記プロセスは、本質的には（Ｐｕｓｈｋｏら、２００５）（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているとおりである。示されている例では、ＨＡ遺伝子はすべてＨＡ１遺伝子（「Ｈ１」遺伝子）であり、（黒色のボックスとして示されている）同じインフルエンザＡ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（「ＰＲ８」）ウイルスに由来する。しかしながら、ここでは、このような状況は不要である。ＮＡ遺伝子と同様に、ＨＡ遺伝子は、（黒色のボックスとして示されている）同じＰＲ８ウイルスまたは異なるウイルス、例えば（灰色のボックスとして示されている）インフルエンザＡ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（「ＩＮ／５」）ウイルスから選択され得る。内部コアタンパク質ＢＩＶ ｇａｇ遺伝子（「Ｂｇａｇ」遺伝子）またはＭ１遺伝子を含有する構築物を作製する。Ｍ１ ＶＬＰは、対照として機能する。示されている例では、（破線枠で示されている）Ｍ１遺伝子は、ＩＮ／５ウイルスから選択される。
インフルエンザＶＬＰ ＨＡおよびＮＡタンパク質の発現および機能プロファイルは、図２〜５に示されている。
七面鳥赤血球を使用した赤血球凝集アッセイにおいて実証されているように、図１の４つの各構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、機能的ＨＡタンパク質を提示する（図２を参照のこと）。図１の４つの各構築物を含有するｒＢＶを使用して、Ｓｆ９細胞を感染させる。感染の３日目に、Ｓｆ９細胞からインフルエンザＶＬＰを精製し、赤血球凝集アッセイを実施する。１：５６希釈から開始して、七面鳥赤血球を２倍間隔で連続希釈する。精製ＶＬＰを各ウェルに追加する。最も右端のレーンはＰＢＳを含有し、陰性対照として使用する。このアッセイでは、ＶＬＰ由来の機能的ＨＡは七面鳥赤血球に結合し、沈殿しない赤血球の格子を作り出し、それにより、ウェル中に拡散様相を作り出す。陰性対照では、機能的ＨＡが提示されて赤血球格子が形成されることはない。したがって、溶液から赤血球が沈殿し、ウェルの中央に点として現れる。この赤血球凝集アッセイの結果は、４つの構築物すべてから作製したＶＬＰが機能的ＨＡを発現し、ＨＡがＶＬＰの膜に局在し、ＨＡがＶＬＰの表面に提示されることを示している。
Ｈ１特異的モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットで実証されているように、図１の各構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、Ｈ１タンパク質を発現する（図３を参照のこと）。マーカー（キロダルトン単位）は、最も右端に示されている。Ｈ１タンパク質の位置は、矢印によって示されている。
図１の構築物１〜２から作製したインフルエンザＶＬＰは内部コアタンパク質Ｂｇａｇを含有するが、図１の構築物３〜４から作製したインフルエンザＶＬＰは内部コアタンパク質Ｍ１を含有する（図４を参照のこと）。４つの各構築物由来のＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルにロードし、クーマシーで染色して、ＶＬＰタンパク質プロファイルを評価する。タンパク質マーカー（キロダルトン単位）は、最も右端に示されている。ＨＡ、ＢｇａｇおよびＭ１タンパク質の位置は、矢印によって示されている。
図１の各構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、機能的なＮＡを含有する（図５を参照のこと）。図１の各構築物由来のＶＬＰを連続希釈し、ＮＡ−フルオロおよびメチルウンベリフェロンＮ−アセチルノイラミン酸を含む蛍光アッセイを使用して、ＮＡの酵素活性を評価する。ＮＡの酵素活性を相対蛍光単位（「ＲＦＵ」）で測定する。示されているＶＬＰ構築物は、以下のとおりである：構築物１は黒色の四角であり、構築物２は白色の菱形であり、構築物３は白色の円であり、構築物４は実線である。ＰＢＳ陰性対照は、黒色の三角形として示されている。正規化線は、破線として示されている。この蛍光アッセイの結果は、４つの構築物すべてが機能的ＮＡを発現することを示している。
透過型電子顕微鏡下で観察した場合、内部コアタンパク質Ｂｇａｇを含むＶＬＰは、インフルエンザウイルスと同じ形態を有する（図６を参照のこと）。１％リンタングステン酸でＶＬＰを染色する。バーは、１００ｎｍを示す。
図６と同じ条件を使用して透過型電子顕微鏡下で観察した場合、内部コアタンパク質Ｍ１を含むＶＬＰは、インフルエンザウイルスと同じ形態を有する（図７を参照のこと）。
タンパク質配列供給源の例は、以下のとおりである。
ＢＩＶ Ｒ−２９ ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ４２７６３。
インフルエンザＩＮ／０５ Ｍ１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＩ３６００４。
インフルエンザＰＲ８ ＨＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＰ６４７３１、
インフルエンザＶＮ／０４ ＨＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＷ８０７１７、
インフルエンザＳＨ／１３ ＨＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００９１１８４７５、
インフルエンザＨＫ／０９ ＨＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＧＯ１７８４７、
インフルエンザＪＸ／１３ ＨＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨＫ１０７６２、
インフルエンザＰＲ８ ＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ７７６７８
インフルエンザＩＮ／０５ ＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＷ０６１０７。
エボラＥｂｏＭａｙ ＧＰ：図１７に記載されている配列。
エボラＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ：図１８に記載されている配列。
遺伝子配列供給源の例：
インフルエンザＨＡ遺伝子配列は、ＰＲ８、ＶＮ／０４、ＳＨ／１３、ＨＫ／０９およびＪＸ／１３ウイルスに由来するものであった。
実施例２
四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰの生産のための組換え移入ベクタープラスミドの作製
Ｂｇａｇおよび４つの異なる標的病原体タンパク質のタンパク質配列をコドン最適化し、実施例１のように、各タンパク質の遺伝子を単一のバキュロウイルス移入ベクタープラスミドにクローニングする。例えば、本質的には図１３に示されているように、異なるパンデミックインフルエンザＨＡおよびインフルエンザＩＮ／０５ ＮＡの４つの全長遺伝子を移入ベクタープラスミドにクローニングする。
実施例３
Ｂｇａｇ ＶＬＰおよびＭ１ ＶＬＰの生産のためのｒＢＶの作製
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰのための組換え遺伝子を有する全長感染性バキュロウイルスＤＮＡを含有するバクミドをＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌から単離し、これを使用して、Ｓｆ９細胞をトランスフェクトしてｒＢＶを作製する。続いて、ｒＢＶの調製物をプラーク精製する。標準的なプラークアッセイによって、Ｓｆ９細胞においてｒＢＶ調製物の力価を決定する。
ＳＦ９００ＩＩ−ＳＦＭ昆虫無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、懸濁培養物としてＳｆ９細胞を２７℃で維持する。ＶＬＰの生産のために、Ｓｆ９細胞を細胞２×１０６個／ｍｌで使用し、標的遺伝子を発現するｒＢＶを３．０の感染多重度（「ＭＯＩ」）で７２時間感染させる。成長培地上清からＶＬＰを回収し、０．２μ膜に通してろ過することによって清澄化し、次いで濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中の２０％（ｗ／ｖ）スクロース段階勾配を使用することによって精製する。あるいは、他の箇所に記載されているように（Ｌｉｕら、２０１５）、イオン交換クロマトグラフィーによってＶＬＰを一次精製し、次いで超遠心分離によって二次精製する。
実施例４
ＶＬＰの評価
４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いてＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で染色する。
特異的一次抗体、続いてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗フェレットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用して、ウエスタンブロットを行う。使用した一次抗体の例は、抗ＨＡクレード１インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルスＩＴ−００３−００１Ｍ１４マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、クローン１５Ｂ７；抗Ｈ５（Ｈ５Ｎ１）ＩＴ−００３−００５Ｍ６マウスＩｇＧ２ａ ＭＡｂ、クローン２６８Ｄ８；抗ＨＡ（Ｈ７Ｎ９）（Ａ／上海／１／２０１３）ＩＴ−００３−００７３Ｍ１マウスＩｇＧ１ ＭＡｂ、クローン９Ｂ１２；抗Ｈ９（Ａ／香港／３３９８２／２００９）（Ｈ９Ｎ２）ＩＴ−００３−００９４Ｍ５マウスＩｇＧ１ ＭＡｂ、クローン１７Ｄ８；および抗Ｈ１０（Ａ／ミカヅキシマアジ／ルイジアナ／Ｓｇ−０００７３／０７（Ｈ１０Ｎ７））ＩＴ−００３−０３４ウサギポリクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）である。
Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光測定法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＶＬＰのタンパク質濃度を決定する。
一般に、赤血球凝集機能的アッセイを以下のように行う。９６ウェルプレート中、ＶＬＰを５０μｌ容量で２倍ずつ連続希釈する。各ＶＬＰ希釈液に、５０μｌの１％七面鳥赤血球（ＲＢＣ）希釈標準溶液を追加し、ＶＬＰおよびＲＢＣの混合物を穏やかに撹拌し、検査前に、プレートを室温で３０〜６０分間インキュベートする。陰性の赤血球凝集結果は、ウェルの中央に点として現れた。陽性の示度をもたらした最高希釈係数として、力価を計算する。赤血球凝集アッセイの陽性結果は、ＶＬＰが機能的ＨＡを発現し、ＨＡがＶＬＰの膜に局在し、ＨＡがＶＬＰの表面に提示されることを実証する。
一般に、インフルエンザＮＡ酵素機能的アッセイを以下のように行う。製造業者の説明書にしたがって基質としてメチルウンベリフェロンＮ−アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた蛍光ベースのＮＡアッセイ（ＮＡ−Ｆｌｕｏｒ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、機能的ノイラミニダーゼ酵素活性を決定する。陰性対照として希釈剤（生理食塩水またはＰＢＳ）を使用した。
新たに放電された４００メッシュカーボンパルロジオンコーティングカッパーグリッド（Ｐｏｌｙ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）にＶＬＰサンプルを吸収させることによって、透過型電子顕微鏡検査を行う。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４および１２０ｍＭ ＫＣｌを含有する緩衝液でグリッドをリンスし、１％リンタングステン酸で陰性染色し、次いで、吸引によって乾燥させる。８０ｋＶで作動するＨｉｔａｃｈｉ Ｈ−７６００透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）上でＶＬＰを可視化し、解像度１ｋ×１ｋのＣＣＤカメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いてデジタルキャプチャする。
標準的な方法、例えばキャリア細胞におけるｒＢＶの連続継代によって、ｒＢＶの遺伝的安定性およびＢｇａｇ ＶＬＰの発現の安定性を実証し得、標的タンパク質を含有するＶＬＰの発現を評価し得る。例えば、最初に、四サブタイプインフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰを含有するｒＢＶをＳｆ９細胞において０．０１のＭＯＩで５回継代し、次いで、ＶＬＰを発現させ、血球凝集機能的アッセイにおいて機能的ＨＡの存在を測定することによって、四サブタイプインフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰの発現が安定であることを示し得る（例えば、図２２を参照のこと）。図２２に示されているように、継代Ｐ１〜Ｐ５のｒＢＶを感染させたＳｆ９細胞において調製した四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰの赤血球凝集アッセイ。ｒＢＶ感染Ｓ９細胞上清からＢｇａｇ ＶＬＰを回収し、孔径０．２２μｍの膜に通してろ過し、超遠心分離によって１００倍濃縮し、ＰＢＳに再懸濁する。１：１２８のＶＬＰ希釈から開始して、七面鳥ＲＢＣを使用して赤血球凝集アッセイを実施する。ＮＣと示されている陰性対照として、ＶＬＰに代えてＰＢＳを使用する。
標準的な方法、例えば免疫沈降または免疫電子顕微鏡検査によって、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中の標的病原体タンパク質の共局在性を実証し得る。例えば、最初にＳｕｒｅＢｅａｄｓ磁気ビーズ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および抗Ｈ５抗体を使用してＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０インフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰを免疫沈降することによって、Ｈ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０インフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰ上でＨ９、Ｈ１０およびＨ７がＨ５と共局在することを示し得る。最初に、ＳｕｒｅＢｅａｄｓを抗Ｈ５抗体に２０℃で１時間結合させ得る。未結合の抗Ｈ５抗体を洗い流し得る。次いで、抗Ｈ５抗体を有するＳｕｒｅＢｅａｄｓに対してＢｇａｇ ＶＬＰをインキュベートする。ＳｕｒｅＢｅａｄｓに結合していないＢｇａｇ ＶＬＰを洗い流す。捕捉されたＢｇａｇ ＶＬＰをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液によって７０℃で１０分間溶出し、次いで、抗Ｈ７、抗Ｈ９および／またはＨ１０抗体を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロットで分析して、ＨＡ標的タンパク質の共局在性を確認し得る（例えば、図２３を参照のこと）。また別の例として、本質的には（Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１）に記載されている免疫電子顕微鏡検査によって、共局在性を実証し得る。
図２３のパネルａに示されるように、Ｈ５特異的ＭＡｂを使用した免疫沈降と、それに続くＨ５、Ｈ７およびＨ９特異的ＭＡｂならびにＨ１０特異的ウサギ抗血清を使用したウエスタンブロットとによって実証されているように、異なるサブタイプのＨＡが同じ四サブタイプＨ５／７／９／１０ ＶＬＰに共局在する。サンプル１〜５は、それぞれｒＨ５、ｒＨ７、ｒＨ９、ｒＨ１０および四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ抗原を表す。Ｃは、免疫沈降のための陰性対照（これは、ＰＢＳＴ緩衝液である）を表す。
また、標準的な方法、例えば半定量的ウエスタンブロットによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中に存在する各タイプの標的病原体タンパク質の量を決定し得る。例えば、Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光測定法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰと精製Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ９タンパク質標準とを比較することによって、Ｈ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０インフルエンザＢｇａｇ ＶＬＰ上に存在するＨ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０の量を測定し得る。染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のそのデンシトメトリーと既知濃度のＢＳＡ標準とを比較することによって、精製ＨＡタンパク質標準の濃度を測定し得る。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＢＳＡ標準の線形標準曲線を作成し得、精製ＨＡタンパク質標準の量を決定し得る。四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ中の各ＨＡタンパク質の濃度を決定するために、デンシトメトリーによって四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰのバンド強度を測定して既知濃度のＨＡ標準と比較する半定量的ウエスタンブロットを実施し得る（例えば、図２３および図２４を参照のこと）。
図２３のパネルｂに示されているように、半定量的ウエスタンブロットによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰ上のＨＡサブタイプの分布を測定し得る。パネルｂの上のパネルに示されているように、ｒＨ５、ｒＨ７、ｒＨ９およびｒＨ１０ユニサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰならびにＨ５／７／９／１０四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、クーマシーブルーによって染色し、デンシトメトリーによって定量する。レーン５の５４ｋＤａのバンドは、クーマシーブルー染色Ｂｇａｇタンパク質を表す。下のパネルでは、示されている抗体を用いてウエスタンブロットを実施する。ウエスタンブロットを使用して、ＶＬＰレーンのバンド強度と、既知量の対応するｒＨＡ参照抗原のバンド強度とを比較することによって、ＶＬＰ内の各ＨＡサブタイプの含量を決定する。サンプル１〜７は、それぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（５μｌ）ならびに０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（５μｌ）のｒＨ５、ｒＨ７、ｒＨ９およびｒＨ１０ユニサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰならびに四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを表す。Ｍは、Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ Ｐｌｕｓ２タンパク質分子量ラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を表す。
半定量的ウエスタンブロットに基づいて、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ中のＨＡの分布を決定する（例えば、図２４を参照のこと）。
実施例５
ＰＲ８ Ｈ１ Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製
本質的には実施例１〜実施例３に記載されているように、Ｓｆ９細胞媒介性組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）発現系においてＢｇａｇおよびインフルエンザＰＲ８タンパク質を使用することによって、ＶＬＰを調製する。本質的には図１に示されているように、全長Ｂｇａｇ遺伝子およびＮＡ遺伝子と一緒に、インフルエンザＰＲ８ Ｈ１遺伝子をｒＢＶにクローニングする。ＮＡ遺伝子は、インフルエンザＰＲ８またはＩＮ／０５ウイルスに由来する。比較のために、本発明者らはまた、Ｂｇａｇ遺伝子に代えてＭ１遺伝子を有するｒＢＶを作製した。まとめると、本質的には図１に示されているように、４つのｒＢＶベクターを調製する。各ｒＢＶは、３つの遺伝子をタンデムに含有しており、各遺伝子は、それ自体のポリヘドリンプロモーターの制御下のそれ自体の発現カセット内にある。ｒＢＶを３のＭＯＩでＳｆ９細胞に感染させ、７２時間インキュベートしてＶＬＰの発現を可能にする。感染細胞の成長培地からＶＬＰを回収し、濃縮し、超遠心分離によって部分的に精製する。ＶＬＰの評価は、本質的には実施例４に記載されている方法を使用して図２〜７に示されている。
図２に示されているように、七面鳥ＲＢＣを用いたところ、４つＶＬＰ調製物はすべて、ほぼ同等の力価でＨＡ活性を示した。図３に示されているように、Ｈ１特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって、予想６３．４４キロダルトン（ｋＤａ）のＰＲ８ Ｈ１（５６５アミノ酸残基）の発現が検出されている。以前の観察結果（Ｐｅｒｒｏｎｅら、２００９；Ｐｕｓｈｋｏら、２０１１；Ｐｕｓｈｋｏら、２００５）と一致して、ＰＲ８ Ｈ１は全長ＨＡ０ポリペプチドとして発現され、ＨＡ１およびＨＡ２へのプロセシングは、ウエスタンブロットによって検出されない。図４に示されているように、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では、タンパク質ＨＡ、ｇａｇおよびＭ１のバンドは、それぞれそれらの予想分子量約６３ｋＤａ、５４ｋＤａおよび２８ｋＤａで検出される。
過去の研究と一致して、インフルエンザＮＡは、ウエスタンブロットまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されない。しかしながら、図５に示されているように、ＶＬＰは、機能的ＮＡアッセイにおいてＮＡ酵素活性を示したが、これは、ＶＬＰ中の機能的ＮＡタンパク質の存在を裏付けている。ＮＡ酵素の活性は、ＩＮ／５ ＮＡを含有するＶＬＰ調製物では、ＰＲ８ ＮＡを含有するＶＬＰと比較して高かった。ＩＮ／５ ＮＡおよびＰＲ８ ＮＡは両方ともＮ１サブタイプに属し、８３％同一のアミノ酸残基を共有する。ＮＡ活性の差異にもかかわらず、本発明者らは、図２〜４に示されているように、ほぼ同等のＨＡ発現を観察した。
最後に、電子顕微鏡検査により、ＶＬＰ調製物中のエンベロープ粒子の存在が確認された（図６〜７）。Ｂｇａｇ ＶＬＰの直径は約１５０〜２００ｎｍであるのに対して、Ｍ１ ＶＬＰの直径は約１２０〜１５０ｎｍである。
まとめると、これらの結果により、ＨＡおよびＮＡタンパク質を発現および提示するＢｇａｇ ＶＬＰの形成が確認された。
実施例６
ＪＸ／１３ Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製
本発明者らは、本質的には実施例１〜実施例３および実施例５に記載されている方法および原理を使用して、新興インフルエンザ株（例えば、ＪＸ／１３（Ｈ１０Ｎ８）鳥類起源ウイルス）を含むＢｇａｇ ＶＬＰを調製した。２０１３年に、ＪＸ／１３（Ｈ１０Ｎ８）インフルエンザウイルスはヒト感染を引き起こし、パンデミック懸念の病原体として同定された（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｓｃｈｍｏｌｋｅ，２０１４；Ｔｏら、２０１４）。当初、ＪＸ／１３（Ｈ１０Ｎ８）インフルエンザウイルスは、中国において、感染症の結果死亡した高齢患者から単離されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｓｃｈｍｏｌｋｅ，２０１４；Ｔｏら、２０１４）。
３つの遺伝子（ＪＸ／１３インフルエンザウイルス由来のＨ１０遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＢｇａｇ遺伝子）を発現するようにｒＢＶを構成する。Ｓｆ９細胞におけるＨＡ１０（「Ｈ１０」）から構成されるインフルエンザＶＬＰを発現するｒＢＶ構築物の例示的な概略図は、図１に示されている。昆虫細胞における高レベルの発現のために、内部コアタンパク質Ｂｇａｇ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＨＡ遺伝子の遺伝子をコドン最適化し、示されているようにタンデムにｒＢＶにクローニングする。各構築物は、矢印で示されているポリヘドリンプロモーターのセットを含有する。示されている例では、ＨＡ遺伝子は、（黒色のボックスとして示されている）Ａ／江西省／ＩＰＢ１３ａ／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）（「ＪＸ／１３」）ウイルスに由来し、ＮＡ遺伝子は、（灰色のボックスとして示されている）ＩＮ／５ウイルスに由来する。ＪＸ／１３ Ｈ１０ ＶＬＰを調製するために、得られたｒＢＶを使用してＳｆ９細胞を感染させる。Ｈ１０遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＢｇａｇ遺伝子を含むＶＬＰを２ＬのＳｆ９成長培地から回収し、イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。インフルエンザＶＬＰの形態ならびにＨＡおよびＮＡタンパク質の発現および機能プロファイルは、本質的には実施例４に記載されている方法を使用して、図９〜１２および１５に示されている。
赤血球凝集アッセイにおいて実証されているように、図８の構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、機能的ＨＡタンパク質を含有する。１：２１０希釈から開始して、七面鳥赤血球を２倍間隔で連続希釈する。Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰはＨＡ機能活性を示し、３．５ｍｇ／ｍｌ全タンパク質５０ｕｌ当たりの力価は１：８１９２または１：２１３である。この赤血球凝集アッセイの結果は、図８の構築物から作製したＶＬＰが機能的ＨＡを発現し、ＨＡがＶＬＰの膜に局在し、ＨＡがＶＬＰの表面に提示されることを示している。
ウエスタンブロットによって実証されているように、図８のＨ１０構築物および図１３の四サブタイプＨ５／７／９／１０から作製したインフルエンザＶＬＰは、関連ＨＡタンパク質を発現する（図１０を参照のこと）。Ｈ１０ ＶＬＰ（レーン１）、四サブタイプＨ５／７／９／１０ ＶＬＰ（レーン２）、対照Ｈ５ ＶＬＰ（レーン３）を、抗Ｈ１０Ｎ７ウサギ抗体、抗Ｈ５Ｎ１モノクローナル抗体、抗Ｈ７Ｎ９モノクローナル抗体および抗Ｈ９Ｎ２モノクローナル抗体で染色する。マーカー（キロトン単位）が示されている。ＨＡタンパク質の位置は、矢印によって示されている。結果は、ウエスタンブロットにおいて、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰがＨ１０特異的抗体と反応したが（図１０、レーン１を参照のこと）、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９特異的抗体体と交差反応しないことを示している（図１０を参照のこと）。ＨＡおよびＢｇａｇのバンドは両方とも、染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出可能である
機能的ＮＡ酵素活性も確認されている（図１５を参照のこと）。染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ｈ１０およびＢｇａｇタンパク質のバンドも検出されている（図１１、レーン１を参照のこと）。
図６に記載されている条件を使用して透過型電子顕微鏡下で観察した場合、図８の構築物から作製したＨ１０ ＶＬＰは、インフルエンザウイルスと同じ形態を有する（図１２を参照のこと）。エンベロープＨ１０ ＶＬＰは、直径約１５０〜１８０ｎｍであると測定されている。
実施例７
ＨＡまたはＮＡのみを有するＢｇａｇ ＶＬＰの調製
また、本質的には実施例１〜実施例６に記載されている方法および原理を使用して、標的病原体タンパク質としてＨＡまたはＮＡのみを使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製および評価を行い得る。
実施例８
遺伝子改変ＨＡおよび／またはＮＡを有するＢｇａｇ ＶＬＰの調製
また、本質的には実施例１〜実施例７に記載されている方法および原理を使用して、遺伝子改変ＨＡおよびまたはＮＡを使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製および評価を行い得る。
同様の原理およびアプローチを使用して、遺伝子改変ＮＡを使用したＢｇａｇ ＶＬＰ。例えば、ＮＡの部分配列のみを含むようにＢｇａｇ ＶＬＰを設計し得る。
実施例９
非インフルエンザ標的病原体タンパク質を有するＢｇａｇ ＶＬＰの調製。
また、本質的には実施例１〜実施例８に記載されている方法および原理を使用して、他の非インフルエンザ病原体の標的タンパク質を使用することによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製および評価を行い得る。例えば、エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、例えばタンパク質配列が図１７に記載されているＥｂｏＭａｙ ＧＰを使用することによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。このようなＶＬＰは、エボラ糖タンパク質に対する免疫応答を誘導し得、エボラウイルス感染症を予防するためのワクチンとして使用され得る。
さらなる例として、同じ方法および原理を使用して、他のフィロウイルス由来の標的タンパク質を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。得られたＢｇａｇ ＶＬＰは、パン・フィロウイルスワクチンとして非常に有用である。
また、さらなる例として、ＭＥＲＳスパイク糖タンパク質を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。得られたＢｇａｇ ＶＬＰは、ＭＥＲＳ感染症を予防するためのワクチンとして非常に有用である。また、さらなる例として、他のコロナウイルス由来の標的タンパク質を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。得られたＢｇａｇ ＶＬＰは、コロナウイルスのワクチンとして非常に有用である。
また、さらなる例として、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルス由来の他の抗原を使用することによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。また、例えば、ＨＩＶ ｅｎｖ糖タンパク質を使用することによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。得られたＢｇａｇ ＶＬＰは、ＨＩＶ感染症に対するワクチンとして非常に有用である。また、レトロウイルスに対するワクチンを調製するために、他のレトロウイルス由来の標的糖タンパク質を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製し得る。
実施例１０
キメラ標的病原体タンパク質を有するＢｇａｇ ＶＬＰの調製
また、本質的には実施例１〜実施例９に記載されている方法および原理を使用して、Ｂｇａｇとの相互作用を最適化するために遺伝子改変標的病原体タンパク質を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製および評価を行い得る。例えば、標的エンベロープウイルスの糖タンパク質を改変して、キメラ糖タンパク質を作製し得る。図１８に示されているように、本発明者らは、インフルエンザＨＡタンパク質ＥｂｏＭａｙ ＴＭＣＴの膜貫通ドメインおよびＣ末端を含有するようにＥｂｏＭａｙ ＧＰを遺伝子改変することによって、例示的なこのようなキメラ標的病原体タンパク質を調製した。インフルエンザＨＡの膜貫通ドメインおよびＣ末端のタンパク質配列は下線付きである。ＶＬＰの精製および評価は、本質的には実施例４に記載されている特定の方法を使用して、図１９〜２１に示されている。
ウエスタンブロットによって実証されているように、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰは、関連エボラタンパク質を発現する（図１９を参照のこと）。イオン交換クロマトグラフィーカラムから収集したピーク画分由来のＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰ画分１（「ＩＥＣＣ Ｆｘｎ１」）をスクロース勾配にロードし、超遠心分離によってさらに精製する。スクロース勾配の画分１〜２８由来の１４個のプール画分（「Ｆｘｎ」）を抗エボラ抗血清で染色する。
クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって実証されているように、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰは、Ｂｇａｇおよび関連エボラタンパク質を発現する（図２０を参照のこと）。レーン１は、ＩＥＣＣ Ｆｘｎ１由来のプールピークスクロース勾配Ｆｘｎ９〜１０である。エボラＧＰおよびＢｇａｇは、ゲルの最も左端に矢印で示されている。結果は、エボラＧＰおよびＢｇａｇが両方ともレーン１の下で共精製するので、精製ＶＬＰ中に存在することを示している。レーン２は、ＩＥＣＣ Ｆｘｎ３由来のプールピークスクロース勾配Ｆｘｎ７〜８である。バキュロウイルスタンパク質ＧＰ６４、Ｐ３９およびＰ１０は、ゲルの最も左端に矢印で示されている。この結果は、ＩＥＣＣ Ｆｘｎ３が主にバキュロウイルス夾雑物質を含有すること、およびバキュロウイルス夾雑物質からエボラＧＰ含有Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製し得ることを示している。
透過型電子顕微鏡下で観察した場合、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ ＶＬＰは、一般的な球状のエンベロープ形態を有する（図２１を参照のこと）。バーは、５００ｎｍを示す。
他の標的病原体タンパク質を発現するＢｇａｇ ＶＬＰのように、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ ＶＬＰおよびＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ Ｂｇａｇ ＶＬＰは両方とも、エボラＧＰエピトープに対する免疫応答を誘導し得、エボラウイルス感染症を予防するためのワクチンとして機能し得る。例えば、被験体において免疫応答を誘導する目的で、ＥｂｏＭａｙ ＧＰ Ｂｇａｇ ＶＬＰおよびＥｂｏＭａｙ ＧＰ−ＴＭＣＴ Ｂｇａｇ ＶＬＰを被験体に注射または別様に投与する。次いで、標準的なアッセイによって、エボラウイルスに対するワクチン接種被験体の免疫応答を決定する。例えば、２〜４週間で、ワクチン接種被験体の血液を採取し、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光抗体アッセイまたは他の抗体検出アッセイによって抗エボラ抗体（またはより具体的には、抗ＥｂｏＭａｙ ＧＰ抗体）を決定し、非ワクチン接種被験体の抗体プロファイルと比較する。ワクチン接種被験体における抗エボラ抗体の存在は、Ｂｇａｇ ＶＬＰが被験体において免疫応答を誘発したので、インビボで免疫原性であることを示す。標準的なチャレンジ研究はまた、Ｂｇａｇ ＶＬＰの有効性を実証し得る。例えば、高度封じ込め施設において、病原性エボラウイルスを血清陽性のワクチン接種被験体にチャレンジして、疾患を引き起こすエボラの予防におけるＢｇａｇ ＶＬＰワクチンの有効性を評価する。チャレンジ後のワクチン接種被験体の生存は、Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチンの防御有効性の指標である。
実施例１１
四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製
本発明者らは、本質的には実施例１〜実施例１０に記載されている方法および原理を使用して、第１の四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを調製および評価した。本発明者らは、４つの鳥由来インフルエンザウイルス、例えばＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ８サブタイプ由来のＨＡタンパク質を使用した。当初、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ウイルス（クレード１のＶＮ／０４）は、致命的なヒト症例から単離されている（Ｍａｉｎｅｓら、２００５）。Ｈ７Ｎ９ウイルス（ＳＨ／１３）は、致命的な疾患を有する入院患者から単離されている（Ｇａｏら、２０１３）。当初、Ｈ９Ｎ２ウイルス（Ｇ１クレードのＨＫ／０９）は、成人女性患者の鼻咽頭吸引液から単離されている（Ｃｈｅｎｇ，２０１０）。当初、ＪＸ／１３（Ｈ１０Ｎ８）インフルエンザウイルスは、中国において、感染症の結果死亡した高齢患者から単離されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｓｃｈｍｏｌｋｅ，２０１４；Ｔｏら、２０１４）。
四サブタイプＶＬＰを調製するために、実施例２に記載されているようにｒＢＶ移入ベクタープラスミドを調製して、ＶＮ／０５、ＳＨ／１３、ＨＫ／０９およびＪＸ／１３インフルエンザ由来のＨＡ遺伝子と、ＩＮ／０５由来のＮＡ遺伝子と、Ｂｇａｇ遺伝子とを共発現させる。Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０遺伝子は、それぞれ６４．５ｋＤａ、６２．１ｋＤａ、６２．９ｋＤａおよび６２．３ｋＤａの予測平均分子量を有する長さ５６８ａａ、５６０ａａ、５６０ａａおよび５６１ａａのポリペプチドをコードする。ＮＡおよびＢｇａｇは長さが４４９ａａおよび４７６ａａであり、それぞれ４９．１ｋＤａおよび５３．５ｋＤａの予想分子量を有する。
Ｓｆ９細胞においてインフルエンザ四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを発現するｒＢＶ構築物の例示的な概略図は、図１３に示されている。昆虫細胞における高レベルの発現のために、内部コアタンパク質Ｂｇａｇ遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＨＡ遺伝子の遺伝子をコドン最適化し、示されているようにｒＢＶにタンデムにクローニングする。各構築物は、矢印で示されているポリヘドリンプロモーターのセットを含有する。示されている例では、Ｈ１０遺伝子はＪＸ／１３ウイルスに由来し、ＨＡ９（「Ｈ９」）遺伝子はＡ／香港／３３９８２／２００９（Ｈ９Ｎ２）（「ＨＫ０９」）ウイルスに由来し、ＨＡ５（「Ｈ５」）遺伝子はＡ（Ｈ５Ｎ１）Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（「ＶＮ／０４」）ウイルスに由来し、ＨＡ７（「Ｈ７」）遺伝子はＡ／上海／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）（「ＳＨ／１３」）ウイルスに由来し、ＮＡ遺伝子はＩＮ／５ウイルスに由来する。ＨＡ遺伝子はすべて黒色のボックスとして示されており、ＮＡ遺伝子は灰色のボックスとして示されている。
ＶＬＰの調製のために、ｒＢＶを３のＭＯＩでＳｆ９細胞に感染させて、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、ＮＡおよびｇａｇ遺伝子の発現を可能にし、感染後３日目に培養上清からＶＬＰを回収する。遠心分離し、０．２μ膜に通してろ過することによって、感染Ｓｆ９細胞由来の成長培地を清澄化する。続いて、イオン交換クロマトグラフィーによって、ＶＬＰを精製する。
インフルエンザＶＬＰの形態ならびにＨＡおよびＮＡタンパク質の発現および機能プロファイルは、本質的には実施例４に記載されている方法を使用して、図１０〜１１、１４〜１６に示されている。
赤血球凝集アッセイにおいて実証されているように、図１３の構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、機能的ＨＡタンパク質を含有する（図１４を参照のこと）。赤血球凝集アッセイによって、七面鳥ＲＢＣを凝集させるＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０ ＶＬＰの機能的能力を確認する。このアッセイでは、ＶＬＰの希釈物を、動物インフルエンザの診断および監視のための試薬としてＷＨＯが推奨する七面鳥ＲＢＣと混合する（ＷＨＯ，２０１２ｂ）。具体的には、１：２１０希釈から開始して、七面鳥赤血球を２倍間隔で連続希釈した。インフルエンザＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、３．５ｍｇ／ｍｌ全タンパク質５０ｕｌ当たり１：８１９２または１：２１３の力価を有していた。この赤血球凝集アッセイの結果は、図１３の構築物から作製したＶＬＰが機能的ＨＡを発現し、ＨＡがＶＬＰの膜に局在し、ＨＡがＶＬＰの表面に提示されることを示している。
図１０〜１１のレーン２に示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、各ＨＡに特異的な抗体を使用したウエスタンブロットとによって、ＢｇａｇおよびＨＡタンパク質の存在を確認する。ＮＡはウエスタンブロットによって検出されないが、これは、ウエスタンブロットで使用した抗血清との低レベルの交差反応性を示唆している（図１０を参照のこと）。
図１１では、図８のＨ１０構築物および図１３の四サブタイプＨ５／７／９／１０から作製したインフルエンザＶＬＰは、ＨＡおよび内部コアタンパク質Ｂｇａｇを発現することが示されている。２つの各構築物由来のＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、クーマシーで染色して、ＶＬＰタンパク質プロファイルを評価する。タンパク質マーカー（キロダルトン単位）は、最も右端に示されている。ＨＡの位置は矢印によって示されており、Ｂｇａｇの位置はアスタリスクによって示されている。ＶＬＰ内のＨＡは、約６２〜６４ｋＤａの非切断ＨＡ０ポリペプチドである。図１１のレーン２に示されているように、Ｂｇａｇタンパク質に対応する約５５ｋＤａのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されている。
図１５では、図８のＨ１０構築物および図１３の四サブタイプＨ５／７／９／１０構築物から作製したインフルエンザＶＬＰは、機能的ＮＡを含有することが示されている。各構築物由来のＶＬＰを連続希釈し、蛍光ベースのインフルエンザＮＡアッセイを使用して、ＮＡの酵素活性を評価する。示されているＶＬＰ構築物は、以下のとおりである：Ｈ１０ ＶＬＰは黒色の四角であり、四サブタイプＨ５／７／９／１０ ＶＬＰは黒色の三角である。ＰＢＳ陰性対照は、黒色の円として示されている。この蛍光アッセイの結果は、両構築物が機能的ＮＡを発現することを示している。図１５では、四サブタイプＶＬＰ中の機能的ＮＡの存在が確認されている。
まとめると、これらの結果により、ＨＡタンパク質、ＮＡおよびＢｇａｇタンパク質はすべて、Ｓｆ９細胞によって産生された四サブタイプＶＬＰ中に存在し、超遠心分離またはクロマトグラフィーによって共精製されることが示唆された。
本質的には実施例４に記載されている方法を使用して透過型電子顕微鏡下で観察した場合、図１３の構築物から作製した四サブタイプＨ５／７／９／１０ ＶＬＰは、インフルエンザウイルスと同じ形態を有する（図１６を参照のこと）。図１６に示されているように、四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０ ＶＬＰは、ＶＬＰエンベロープから突出する典型的なインフルエンザＨＡスパイクを含有する直径約１５０〜２００ｎｍの大きい球状のインフルエンザ様多形エンベロープ粒子として同定されている。
実施例１２
他の四サブタイプおよびマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰの調製
本質的には実施例１〜実施例１１に記載されている方法および原理を使用して、他の四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰまたはマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰの調製および評価を行い得る。例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３および他のサブタイプを含むマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを調製し得る。
加えて、また、本質的には実施例１〜実施例１１に記載されている方法および原理を使用して、インフルエンザＢ ＨＡを含むマルチサブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを調製および評価し得る。
加えて、本質的には実施例１〜実施例１１に記載されている方法および原理を使用して、同じウイルスサブタイプの標的タンパク質変異体を含む多重変異体Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製および評価し得る。例えば、Ｈ５Ｎ１ウイルスの異なる変異体（クレード）をＢｇａｇ ＶＬＰに一緒に組み込み得る。例えば、本発明者らは、ヒトワクチンに関連するＨ５Ｎ１ ＨＡの３つの変異体をＶＬＰにおいて共発現させた多重変異体Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製した。本発明者らが調製したＨ５Ｎ１ ＨＡは、例えば、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１ウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４、Ａ／エジプト／３３００−ＮＡＭＲＵ３／２００８およびＡ／湖北省／１／２０１０（これらはすべて、ＷＨＯがＨ５Ｎ１ワクチン開発に推奨している）に由来し得る。例えば、本発明者らはまた、獣医（家禽種）用ワクチンに関連するＨ５Ｎ１ ＨＡの３つの変異体をＶＬＰにおいて共発現させた多重変異体Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製した。
実施例１３
Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチンの調製
本質的には実施例６に記載されているように、ＪＸ／１３鳥類起源インフルエンザＨ１０Ｎ８ウイルス由来のＨ１０を使用して、ワクチン接種のためにＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製する。２０１３年に、ＪＸ／１３インフルエンザウイルスは、中国において、高齢患者の致命的なヒト感染を引き起こし、パンデミック懸念の病原体として同定された。本質的には実施例１〜実施例５に記載されているように、３つの遺伝子Ｈ１０遺伝子、ＮＡ遺伝子およびＢｇａｇ遺伝子を共発現するようにｒＢＶベクターを構成する。得られたｒＢＶをＳｆ９細胞の感染に使用して、例えば、図２８のパネルＡに示されているユニサブタイプＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製する。
次いで例えば、本質的には実施例３に記載されているように、Ｓｆ９細胞から産生されたＢｇａｇ ＶＬＰを精製する。Ｂｇａｇ ＶＬＰを含有するろ液は、膜を通って移動してろ液画分となるが、ｒＢＶをベクター粒子は、膜によって分離される。陰イオン交換クロマトグラフィーによって、これを確認する。例えば、陰イオン交換クロマトグラフは、Ｂｇａｇ ＶＬＰがｒＢＶから分離され、ろ液画分中に存在することを示している（例えば、図２８のパネルＡを参照のこと）。ワクチン接種の前に、Ｂｇａｇ ＶＬＰをＰＢＳで製剤化し得る。
以前の観察結果と一致して、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ中のＨＡは、約６０〜６４ｋＤａのＨＡ０として発現され、ＨＡ１およびＨＡ２のプロセシングは検出可能ではない（例えば、図２８のパネルＡを参照のこと）。ＮＡおよびＢｇａｇの予想サイズに対応する約５５ｋＤａの顕著なバンドも検出される。本質的には実施例４に開示されているように、機能的ＮＡ酵素活性を確認する。他のＢｇａｇ ＶＬＰのように、透過型電子顕微鏡下では、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、直径約１００〜１８０ｎｍのエンベロープ多形性粒子として現れる（例えば、図２８のパネルＡを参照のこと）。
表１に示されているように、３つのロットのＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製および特性評価する。すべてのロットのＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰが血球凝集活性を有し、Ｂｇａｇ ＶＬＰ ５０ｕｌ当たりの力価は８，１９２〜６５，５３６であり、全タンパク質の濃度は約３．５ｍｇ／ｍｌである。製造または試験の条件は、ロット間変動に寄与する。
Figure 0006978079
＊Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して決定した。
＊＊ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリーによって決定した。
＊＊＊七面鳥ＲＢＣを使用してＨＡアッセイによって決定した。
実施例１４
四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチンの調製
また、本質的には実施例１１に記載されているように、ワクチン接種のために四サブタイプＨ５／７／９／１０ ＶＬＰを調製および精製する。ワクチン接種の前に、Ｂｇａｇ ＶＬＰをＰＢＳで製剤化し得る。
間接免疫蛍光アッセイによって、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０遺伝子の発現を評価する。例えば、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０サブタイプ特異的抗体を使用して、間接免疫蛍光アッセイは、各サブタイプの発現が存在することを示している（例えば、図２９を参照のこと）。
四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析する（例えば、図２８のパネルＢを参照のこと）。陰イオン交換クロマトグラフは、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰがｒＢＶから分離され、ろ液画分中に存在することを示している。
Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰのように、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ上のＨＡは、サイズ約６２〜６４ｋＤａの非切断ＨＡ０であり、それぞれＨ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０遺伝子によって予測される６４．５ｋＤａ、６２．１ｋＤａ、６２．９ｋＤａおよび６２．３ｋＤａと一致する（例えば、図２８のパネルＢを参照のこと）。図２８のパネルＢに示されているように、約５５ｋＤａの顕著なバンドは、ＮＡおよびＢｇａｇの予想分子量に対応していた。本質的には実施例４に開示されているように、機能的ＮＡ酵素活性を確認する。他のＢｇａｇ ＶＬＰのように、透過型電子顕微鏡下では、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、直径約１５０〜２００ｎｍのエンベロープ多形性粒子として現れる（例えば、図２８のパネルＢを参照のこと）。また、本質的には実施例４に記載されているように、サブタイプの共局在性と、四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０ ＶＬＰ内の各サブタイプの定量とを確認する。
表２に示されているように、３つのロットの四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを調製および特性評価する。本質的には実施例４に記載されている赤血球凝集機能アッセイによって測定した場合、すべてのロットの四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰが赤血球凝集活性を有する。
Figure 0006978079
＊Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して決定した
＊＊ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリーによって決定した
＊＊＊七面鳥ＲＢＣを使用してＨＡアッセイによって決定した
実施例１５
間接免疫蛍光アッセイ
間接免疫蛍光アッセイを実施し得る。例えば、０．３ｍｌアリコートのｒＢＶ感染Ｓｆ９細胞を８ウェルＮｕｎｃ ＬａｂＴｅｋスライドに播種する。２８℃で７２時間インキュベートした後、Ｓｆ９細胞を冷アセトンで固定し、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０特異的抗血清を使用して間接免疫蛍光顕微鏡検査を実施する。使用する抗血清の例は、本質的には実施例４に記載されているように、ウエスタンブロットに使用したのと同じものであり得る。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０を発現する細胞を可視化する。ＩＦＡでは、ヨウ化プロピジウム核対比染色液を含有する封入剤を使用して、細胞核を可視化する。
図２９に示されているように、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを有する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を感染させたＳｆ９細胞は、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、ＮＡおよびＢｇａｇタンパク質を産生する。感染細胞（上のパネル）および非感染対照（下のパネル）のアリコートをチャンバースライドに播種し、４８時間インキュベートする。細胞単層を冷アセトンで固定し、示されているＨ５、Ｈ７、Ｈ９またはＨ１０抗原特異的一次抗体でプローブする。インキュベーション後、適切な種特異的ＦＩＴＣ標識抗体（緑色）で単層をプローブして、発現されたＨＡ抗原を可視化する。ヨウ化プロピジウムを含有する封入剤で細胞核を赤色に染色する。
実施例１６
赤血球凝集阻害アッセイ
赤血球凝集阻害アッセイを実施し得る。例えば、ビブリオコレラ由来の受容体破壊酵素（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ですべての血清を処理し、次いで、示されている各抗原の４つのＨＡユニットと共に、新たに調製した０．５％七面鳥赤血球または１％ウマ赤血球（ＲＢＣ）を使用して、赤血球凝集阻害アッセイを実施する。
ＨＩ力価を決定するために使用される相同インフルエンザ抗原としては、全長相同組換え抗原、すなわちＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のｒＨ５；Ａ／香港／３３９８２／２００９（Ｈ９Ｎ２）由来のｒＨ９；Ａ／安徽省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）由来のｒＨ７（これは、Ａ／上海／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）と同一のアミノ酸配列を有する）；およびＡ／江西東湖／３４６／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）由来のｒＨ１０が挙げられる。ＢＥＶＳを使用してこれらの参照抗原を発現させ、標準的な方法にしたがってＳｆ９細胞から単離および精製する。
また、赤血球凝集阻害力価の決定のために、異種インフルエンザ抗原を使用する。それらとしては、例えば、ＢＰＬ不活性化ウイルスＡ／コガモ／エジプト／１２９０８−ＮＡＭＲＵ３／２００５（Ｈ１０Ｎ１）；Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ−１９７Ａ（Ｈ１Ｎ１）；Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）；ならびにＢＰＬ不活性化Ｈ５Ｎ１ウイルスＡ／香港／１５６／１９９７（クレード０）、Ａ／カンボジア／Ｘ０１２３３１／２０１３（クレード１．１．２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（クレード２．１．３．２）、Ａ／インドガン／青海省／１Ａ／２００５：ＰＲ８（クレード２．２）およびＡ／バングラデシュ／３２３３／２０１１（クレード２．２．２）が挙げられる。
実施例１７
被験体におけるＢｇａｇ ＶＬＰのワクチン接種
標準的な方法を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを被験体、例えば成体雄性フィッチフェレット（４〜５月齢、Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）にワクチン接種し得る。例えば、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ（３０μｇの全ＨＡ）を１つの群の４匹の動物に３回（０週目、４週目および２２週目に）筋肉内（「ｉ．ｍ．」）接種し得る。四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰ（３０μｇの各ＨＡサブタイプを含有する１２０μｇの全ＨＡ）を２つの群の５匹のフェレットに筋肉内または鼻腔内（「ｉ．ｎ．」）ワクチン接種する。プラセボとしてＰＢＳを対照群の４匹のフェレットに投与した。最初のワクチン接種の前に、現在循環中のインフルエンザウイルスに関する血球凝集阻害アッセイによって、フェレットが血清学的に陰性であることを確認する。血清の収集のために、４週目、８週目、１２週目、１６週目および２６週目にすべてのフェレットから採血して、血球凝集阻害によって特異的抗体の力価を評価する。また、Ａ／コガモ／エジプト／１２９０８−ＮＡＭＲＵ３／２００５（Ｈ１０Ｎ１）ウイルスなどのインフルエンザウイルスのチャレンジ後に、動物から採血する。
実施例１８
１つまたはそれを超える異なる標的病原体タンパク質を発現するＢｇａｇ ＶＬＰワクチンの免疫原性
Ｈ１０を発現するＢｇａｇ ＶＬＰと、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０を発現するＢｇａｇ ＶＬＰとを、ワクチン接種のためにＰＢＳで製剤化する。Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをワクチン接種したフェレットに、用量３０μｇのＨＡを投与する。四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰをワクチン接種したフェレットに、用量１２０μｇのＨＡを投与する。Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０は、約２０〜３０％で四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ上に存在するので、１２０μｇの用量は、約３０μｇの各サブタイプに対応する。この投与レジメンは、Ｈ５Ｎ１ワクチンのものと一致する。例えば、Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）ワクチンでは、健常成人に２回筋肉内投与した。２回用量の４５μｇおよび９０μｇの注射は、潜在的に防御的な中和抗体の検出をもたらした（Ｔｒｅａｎｏｒ ＪＪら、２００６）。
四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰワクチンについて、２つのワクチン接種経路（筋肉内および鼻腔内経路）を比較する。ワクチン接種レジメンは、３回のワクチン接種（０週目、４週目および２２週目における一次ワクチン接種および２回の追加免疫ワクチン接種）を含む。相同組換えＨＡ参照抗原ｒＨ５、ｒＨ７、ｒＨ９およびｒＨ１０に対する赤血球凝集阻害力価を測定する。モックワクチン接種フェレットの血清は、試験したＨＡのいずれに対してもＨＡ中和抗体を有しない（例えば、図３０を参照のこと）。対照的に、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、ｒＨ１０に対してのみＨＡ中和抗体を誘発するが、四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰは、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０抗原に対してＨＡ中和抗体を誘発する（例えば、図３０を参照のこと）。
筋肉内を介したＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰの一次ワクチン接種後、ＨＡ中和抗体が検出可能になり、１回目の追加免疫後に増加する。次いで、２回目の追加免疫まで、ＨＡ中和抗体力価は徐々に減少した。比較的少数のフェレット（４〜５匹／群）を使用するので、特に鼻腔内サンプルでは、応答のかなりの変動が観察される。
Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰを筋肉内投与した被験体の血清は、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを投与した被験体と同程度のＨＡ中和抗体力価を有し得るが（例えば、図３０を参照のこと）、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを鼻腔内ワクチン接種した被験体では、中和抗体力価がより低い。
四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチン接種群では、検出された最低の中和抗体力価はｒＨ５に対するものであり、検出可能な中和抗体力価は、少なくとも２回のワクチン接種を必要とした。これは、Ｈ５サブタイプの比較的低い免疫原性と一致する。対照的に、ｒＨ７、ｒＨ９およびｒＨ１０に対する中和抗体力価は、筋肉内群および鼻腔内群の両方において、１回のワクチン接種後に検出可能であり、追加免疫後に増加し、次いで、２回目の追加免疫前に徐々に減少する（例えば、図３０を参照のこと）。
図３０に示されているように、ユニサブタイプＨ１０ ＶＬＰおよび四サブタイプＨ５／Ｈ７／Ｈ９／Ｈ１０ ＶＬＰは両方とも、フェレットにおいてロバストな免疫応答を誘発する。０週目、４週目および２２週目に、フェレットにワクチン接種する（矢印として示されている）。ワクチン接種群は、以下のとおりである：Ｇ１は、Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰ（３０μｇの全ＨＡ）を３回（０週目、４週目および２２週目に）筋肉内接種したフェレットの群である；Ｇ４は、プラセボとしてＰＢＳを投与したモックワクチン接種群である；Ｇ２およびＧ３は、四サブタイプＶＬＰ（１２０μｇの全ＨＡ）をそれぞれ筋肉内または鼻腔内ワクチン接種したフェレットの２つの群である。０週目、４週目、８週目、１２週目、１６週目および２６週目に血液を収集し、相同参照ｒＨ５、ｒＨ７、ｒＨ９およびｒＨ１０抗原を使用して赤血球凝集阻害アッセイによって、血清を分析する。データポイントの上のバーは、標準偏差を示す。破線の横線は、検出限界を示す。
ＶＬＰワクチン接種の交差防御能力を調査するために、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ１０サブタイプを含むいくつかのインフルエンザ単離株を用いて赤血球凝集素阻害アッセイによって、チャレンジ前の血清を試験する。筋肉内または鼻腔内ワクチン接種後、Ｈ１０ ＶＬＰまたは四サブタイプＶＬＰワクチン接種フェレット由来の血清では、Ｈ１およびＨ３ウイルスに対する検出可能な交差防御中和抗体は検出されない。しかしながら、Ｈ５Ｎ１ウイルスの多分岐単離株／クレードおよびＨ１０Ｎ１ウイルスを用いて試験した場合、交差反応性中和抗体が検出される（例えば、図３０を参照のこと）。
図３１に示されているように、チャレンジ研究前のＨＡ中和抗体のプロファイルを比較する。Ｇ１〜４は示されているとおりであり、本質的には図３０のものに対応する。ＨＡ中和抗体はＹ軸上に示されており、使用したＨＡ抗原はＸ軸上に示されている。ＨＡ抗原としては、Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（クレード１ Ｈ５Ｎ１）由来のｒＨ５；Ａ／香港／３３９８２／２００９（Ｈ９Ｎ２）由来のｒＨ９；Ａ／安徽省／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）由来のｒＨ７；およびＡ／江西東湖／３４６／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）由来のｒＨ１０が挙げられる。Ｈ１０＊Ａ／コガモ／エジプト／１２９０８−ＮＡＭＲＵ３／２００５（Ｈ１０Ｎ１）、Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／０７／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ−１９７Ａ（Ｈ１Ｎ１）、Ｈ３ Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２）を含むＢＰＬ不活性化ウイルスも分析する。Ａ／香港／１５６／１９９７（クレード０）、Ａ／カンボジア／Ｘ０１２３３１／２０１３（クレード１．１．２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（クレード２．１．３．２）、Ａ／インドガン／青海省／１Ａ／２００５：ＰＲ８（クレード２．２）およびＡ／バングラデシュ／３２３３／２０１１（クレード２．２．２）を含むいくつかのＨ５Ｎ１ウイルスも分析する。データポイントの上のバーは、標準偏差を示す。破線の横線は、検出限界を示す。
実施例１９
チャレンジ研究におけるワクチン接種被験体の保護
ケタミン−キシラジン−アトロピンカクテルの筋肉内注射でフェレットを麻酔し、２７週目に、１０６ＥＩＤ５０のインフルエンザＡ／コガモ／エジプト／１２９０８−ＮＡＭＲＵ３／２００５（Ｈ１０Ｎ１）ウイルスを、ＰＢＳで希釈して総容量１ｍｌ（５００μｌ／鼻孔）で鼻腔内チャレンジする。２７週目（最後のワクチン接種の５週間後）に、ウイルスチャレンジを行い得る。Ｈ１０Ｎ１チャレンジの後、フェレットを４日間にわたって毎日モニタリングして、体重および体温の変化ならびに病気の臨床徴候を観察する。チャレンジ２日後および４日後（「ｐｃ」）に、鼻洗浄サンプルを収集する。チャレンジ４日後に動物を安楽死させ、鼻甲介、気管および肺を収集する。下気道および上気道由来のサンプル中のウイルス力価を卵において決定する。ワクチン接種被験体とＰＢＳ対照被験体との間のウイルス力価の差異の統計的有意性を、二元配置ＡＮＯＶＡ統計分析によって決定する。
Ｈ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰまたは四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰのいずれかをワクチン接種した後、生きた標的病原体、例えばＨ１０Ｎ１インフルエンザウイルスをフェレットにチャレンジする。Ａ／コガモ／エジプト／１２９０８−ＮＡＭＲＵ３／２００５（Ｈ１０Ｎ１）ウイルスは、フェレットに投与したＢｇａｇ ＶＬＰワクチン中に存在するＡ／江西省／ＩＰＢ１３ａ／２０１３（Ｈ１０Ｎ８）ウイルスのＨ１０抗原と地理的にかつ進化的に異なるので、例えば前記ウイルスを用いて異種チャレンジを実施し得る。Ｈ１０Ｎ１ウイルスの赤血球凝集阻害アッセイによって、交差反応性力価を確認する（例えば、図３１を参照のこと）。チャレンジ後４日目まで、Ｈ１０Ｎ１ウイルスチャレンジは、フェレットにおいて致命的なまたは重度の疾患を引き起こさなかったが、チャレンジ後における鼻洗浄液中の、ならびに上気道（鼻甲介および気管）および下気道（肺）組織中のウイルス力価の低下によって実証されているように、ワクチンは、Ｈ１０Ｎ１ウイルスからワクチン接種群を保護した（例えば、図３２を参照のこと）。例えば、チャレンジ後２日目または４日目の鼻洗浄液では、最高の力価は、モックワクチン接種フェレットにおいて検出されるが、最低の力価は、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを鼻腔内ワクチン接種したフェレットにおいて観察される（例えば、図３２のパネルＡを参照のこと）。四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰを筋肉内ワクチン接種したフェレットもまた、モック群と比較してウイルス力価の有意な減少を引き起こす（例えば、図３２のパネルＡを参照のこと）。これは、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰワクチンによる保護における局所粘膜免疫の潜在的役割を示唆している。
鼻甲介ならびに気管組織および肺組織では、複製ウイルス力価の減少がさらに顕著である（例えば、図３２のパネルＢを参照のこと）。気管および肺組織では、いずれかの経路によってＨ１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰまたは四サブタイプＨ５／７／９／１０ Ｂｇａｇ ＶＬＰのいずれかを投与したすべてのワクチン接種フェレットにおいて、ウイルス力価は検出可能なレベル未満に減少する。鼻甲介組織中のウイルス力価もまた、すべてのワクチン接種動物において有意に減少するが、これは、異種Ｈ１０Ｎ１チャレンジに対するこれらのＶＬＰワクチンの保護効果を実証している。
図３２のパネルＡに示されているように、チャレンジ後２日目および４日目における鼻洗浄液中の複製ウイルスの力価は、四サブタイプＢｇａｇ ＶＬＰワクチンが、その後のチャレンジから被験体を有意に保護することを示している。図３２のパネルＢに示されているように、チャレンジ後２日目および４日目における鼻甲介、気管および肺の組織中の複製ウイルスの力価は、Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチンが、その後のチャレンジから被験体を保護することを示している。統計的有意差は、アスタリスクで示されている。
実施例２０
三クレードＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰの調製
ＳＦ９００ＩＩ−ＳＦＭ昆虫無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、Ｓｆ９細胞を懸濁培養物として２７±２℃で維持する。Ｈ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰの生産のために、示されている３つのＨ５遺伝子ならびにＮＡおよびＢＩＶ ｇａｇ遺伝子を発現するｒＢＶを、３．０の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、細胞２×１０６個／ｍｌのＳｆ９細胞２Ｌに感染させる。感染７２時間後に成長培地上清からＢｇａｇ ＶＬＰを回収し、０．２μｍフィルタを使用して滅菌ろ過し、精製前に接線流ろ過（ＴＦＦ、５００，０００ ＭＷＣＯ）を使用することによって濃縮する。イオン交換クロマトグラフィー、続いて超遠心分離を使用することによって、Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製する。標準的な方法を使用して、バキュロウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡなどの主な不純物を除去するために、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した。次いで、標準的な方法を使用して、Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製および濃縮するために、超遠心分離を使用する。Ｂｇａｇ ＶＬＰ調製物を特性評価し、ワクチン接種までＰＢＳ緩衝液中に２〜８℃で保存する。本質的には本明細書のように、Ｂｇａｇ ＶＬＰの特性評価（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを含む）を実施する。
実施例２１
ニワトリにおける三クレードＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰの免疫原性および保護効果
１用量のＨ５５５ ＶＬＰ当たり１５３６個のＨＡユニットを含有するように、ワクチン接種およびウイルスチャレンジＢｇａｇ ＶＬＰ Ｈ５５５ワクチンを市販のアジュバント（ＳＥＰＰＩＣ，Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ７０／３０，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）と共に製剤化する。Ｓｆ９細胞において、３つのＨ５遺伝子はすべて同一の発現カセットから発現されるので、Ｈ５クレードは、同様のレベルでＨ５５５ ＶＬＰ中に存在すると予想される。１日齢時に、０．２ｍｌのＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰを特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリ（ｎ＝３０）に皮下ワクチン接種し、２１日齢時に０．５ｍｌを皮下ワクチン接種する。ＰＢＳを対照鳥に投与し得る。鳥を任意に１０羽の群に分け、３５日目に、以下のＨＰＡＩ単離株の１つを鼻腔内チャレンジする（１０６ＥＩＤ５０／鳥）：ＧｙｒＦ Ｈ５Ｎ８（クレード２．３．４．４）；Ｃｋ／ＷＪ Ｈ５Ｎ１（クレード２．１．３）またはＣｋ／エジプトＨ５Ｎ１（クレード２．２．１）。チャレンジ後、臨床徴候について鳥を毎日モニタリングし、チャレンジ後０日目および１４日目に血清を採取し、経口スワブを採取してウイルス排出を測定した。
ウイルス排出を決定するために、口腔咽頭スワブおよび排泄腔スワブを滅菌脳心臓注入培地に収集し、−７０℃で凍結保持する。Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＭａｇＭＡＸ ＡＩ／ＮＤ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、ウイルスＲＮＡを抽出する。標準的な方法を使用して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＲＴ−ＰＣＲ）を実施する。簡潔に言えば、ＡｇＰａｔｈ−ＩＤ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）およびＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、インフルエンザＭ遺伝子を標的とするｑＲＲＴ−ＰＣＲを行う。ウイルス定量のために、滴定したチャレンジウイルス（ＧｙｒＦ Ｈ５Ｎ８、Ｃｋ／ＷＪ Ｈ５Ｎ１またはＣｋ／エジプトＨ５Ｎ１）から抽出したウイルスＲＮＡを用いて、標準曲線を確立する。結果をＥＩＤ５０／ｍｌ当量として報告し、ニワトリ由来のサンプルでは、検出限界は１００．９ ＥＩＤ５０／ｍｌである。
Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、統計分析カプラン・マイヤー生存曲線を作成する。マンテル・コックスログランク検定を使用して、実験群間の生存曲線を比較する（Ｐｒｉｓｍ ５）。ＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ ５）を使用して、赤血球凝集素阻害力価間の平均および標準誤差の統計的差異を分析する。小文字は、比較した群間の統計的有意性を示す。口腔スワブおよび排泄腔スワブ由来のウイルス力価のペアワイズ比較のために、スチューデントｔ検定を使用する（Ｐｒｉｓｍ ５）。ｐ＜０．０５を使用して、すべての統計試験を実施する。
Ｂｇａｇ ＶＬＰのワクチン接種後かつチャレンジ前に、赤血球凝集素阻害アッセイによって、ワクチン抗原に対する抗体レベルを決定する。図３５に示されているように、アッセイにおいて同種ワクチン抗原を使用した場合、Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチンの２回目の適用の２週間後に、すべての群のワクチン接種鳥が高いＨＡ中和抗体力価（＞９ｌｏｇ２）を示した。
ワクチン接種２週間後に、３つのＨＰＡＩウイルスの１つを偽ワクチン接種鳥およびワクチン接種鳥にチャレンジする。チャレンジウイルスに対するチャレンジ前後のＨＡ中和抗体力価は、それぞれ図３６および図３８に示されている。チャレンジ前に、高いＨＡ中和抗体力価が検出されている。各ウイルス株に対する同程度のＨＡ中和抗体力価は、Ｂｇａｇ ＶＬＰ中の３つのＨ５クレードの存在を示している。チャレンジ後に、ＨＡ中和抗体力価は増加した（例えば、図３８を参照のこと）。
３つのＨ５ウイルスによるウイルスチャレンジ後のニワトリにおける生存およびウイルス排出の減少によって、ワクチン防御を測定する（例えば、図３６および３９〜４１を参照のこと）。それぞれＧｙｒＦ（Ｈ５Ｎ８）、Ｃｋ／エジプト（Ｈ５Ｎ１）およびＣｋ／ＷＪ（Ｈ５Ｎ１）チャレンジに対応するワクチン群１、２または３の鳥はすべて、チャレンジから生き残った（例えば、図３６を参照のこと）。ワクチンチャレンジ鳥ではいずれも、疾患の臨床徴候は観察されない。対照的に、偽ワクチン接種鳥はすべてチャレンジ後に死亡し、それぞれＧｙｒＦ、Ｃｋ／エジプトおよびＣｋ／ＷＪチャレンジ群における平均死亡時間は、４日間、３日間および３日間であった。したがって、Ｂｇａｇ ＶＬＰは、試験した３つの各チャレンジインフルエンザ単離株（Ｈ５Ｎ８ウイルスを含む）に対する完全な保護を提供する。偽ワクチン接種鳥はすべて、チャレンジ５日後に死亡しているが、これは、Ｂｇａｇ ＶＬＰワクチン接種鳥における保護が有意なレベルであることを示している。
ウイルス排出は、試験した３つのＨ５単離株に対して有意に減少する（例えば、図３９〜４１を参照のこと）。各チャレンジ実験において１０６ＥＩＤ５０またはＰＦＵでウイルスチャレンジした後、３つのＨ５Ｎ１ウイルスはすべて、非免疫化対照ニワトリの上気道において効率的に複製する。それと比較して、免疫化鳥は、チャレンジ後毎日、Ｈ５Ｎ１ウイルス量の有意な減少を示す。同様のデータが排泄腔スワブにおいて観察される（例えば、図３９〜４１を参照のこと）。
したがって、三クレードＨ５５５ Ｂｇａｇ ＶＬＰ免疫化は、Ｈ５Ｎ１ウイルスおよびＨ５Ｎ８ ＨＰＡＩウイルスの２つの異なる単離株によるチャレンジ後の致死的なインフルエンザに対する有意な保護を提供する。
参考文献
以下の刊行物、参考文献、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (27)

  1. １つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質を含む、ウシ免疫不全ウイルスｇａｇタンパク質（Ｂｇａｇ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記標的病原体タンパク質が、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ｇａｇ前駆タンパク質Ｐｒ５３ｇａｇとは異なるタンパク質である、Ｂｇａｇ ＶＬＰ。
  2. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質がＶＬＰ膜に局在する、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  3. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  4. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質が、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、コロナウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルス病原体に由来する、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  5. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の標的病原体タンパク質がインフルエンザウイルスに由来する、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  6. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質が、赤血球凝集素タンパク質（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８）およびノイラミニダーゼタンパク質（ＮＡ１、ＮＡ２、ＮＡ３、ＮＡ４、ＮＡ５、ＮＡ６、ＮＡ７、ＮＡ８、ＮＡ９、ＮＡ１０およびＮＡ１１）からなるインフルエンザウイルスタンパク質の群より選択される、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  7. ４つの異なる標的病原体タンパク質が、Ｈ１〜Ｈ１８およびＮＡ１〜１１からなるインフルエンザウイルスタンパク質より選択される、請求項６に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  8. 前記４つの異なる標的病原体タンパク質が、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０である、請求項７に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  9. 前記複数の異なる標的病原体タンパク質が、前記インフルエンザウイルスの同じサブタイプの異なるクレードに由来する、請求項５に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  10. ３つの異なる標的病原体タンパク質が、同じインフルエンザウイルスのサブタイプの異なるクレードに由来する、請求項５に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  11. 前記３つの異なる標的病原体タンパク質が、ＧｙｒＦ Ｈ５Ｎ８クレード２．３．４．４赤血球凝集素タンパク質、Ｃｋ／エジプトＨ５Ｎ１クレード２．２．１赤血球凝集素タンパク質および／またはＣｋ／ＷＪクレード２．１．３赤血球凝集素タンパク質である、請求項１０に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  12. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質が遺伝子改変された遺伝子に由来する、請求項１に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  13. 前記１つの標的病原体タンパク質または複数の異なる標的病原体タンパク質がＥｂｏＭａｙ ＴＭＣＴ（インフルエンザＨＡ膜貫通ドメインおよびＣ末端を有するＭａｙｉｎｇａ株に属するキメラエボラ糖タンパク質）である、請求項１２に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  14. １つの核酸または複数の異なる核酸をさらに含み、前記１つの核酸または複数の異なる核酸が、前記被験体の前記標的病原体に対する免疫応答を誘導または増強する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  15. 前記１つの核酸または複数の異なる核酸がＲＮＡである、請求項１４に記載のＢｇａｇ
    ＶＬＰ。
  16. 被験体における１つの病原体または複数の異なる病原体から保護することができるか、またはそれらに対する免疫応答を誘発することができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＢｇａｇ ＶＬＰ。
  17. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＢｇａｇ ＶＬＰを含む、ワクチン。
  18. Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製するための移入ベクタープラスミドであって、Ｂｇａｇ遺伝子と、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の標的病原体タンパク質をコードする１つまたはそれを超える遺伝子と、１つまたはそれを超えるプロモーターとを含む、移入ベクタープラスミド。
  19. 前記Ｂｇａｇ遺伝子および前記標的病原体タンパク質をコードする１つまたはそれを超える遺伝子が、タンデムであり、それぞれ前記プロモーターの制御下にある、請求項１８に記載の移入ベクタープラスミド。
  20. 前記ベクターが組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）移入ベクタープラスミドである、請求項１８に記載の移入ベクタープラスミド。
  21. 前記プロモーターが、ポリヘドリンプロモーターである、請求項１８に記載の移入ベクタープラスミド。
  22. Ｂｇａｇ ＶＬＰを作製するための方法であって、
    （ｉ）請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の移入ベクタープラスミドにクローニングする工程；
    （ｉｉ）前記移入ベクタープラスミドを使用して、キャリアウイルスを調製する工程；
    （ｉｉｉ）前記ｒＢＶを真核細胞に感染させて、前記Ｂｇａｇ ＶＬＰを生産する工程；および
    （ｉｖ）前記Ｂｇａｇ ＶＬＰを精製する工程
    を含む、方法。
  23. 標的病原体が動物おいて疾患を引き起こすことを予防または阻害するための、請求項１７に記載のワクチン。
  24. 前記動物が哺乳動物または鳥である、請求項２３に記載のワクチン。
  25. 前記動物がヒトである、請求項２３に記載のワクチン。
  26. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＢｇａｇ ＶＬＰと、ワクチン投与に適切な１つまたはそれを超えるアジュバントとを混合することによって、ワクチンを作製する方法。
  27. 被験体におけるＢｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質の存在を、前記被験体が請求項１７および２３〜２５のいずれか一項に記載のワクチンを以前に投与されたかの指標とする方法であって、Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質の存在が、前記被験体から得られた試料において測定され、ワクチン接種が、Ｂｇａｇ遺伝子またはＢｇａｇタンパク質の存在と相関される、方法。
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