ES2689878T3 - Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento - Google Patents

Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento Download PDF

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Abstract

Una proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones por un virus H5N1 de un clado distinto, en donde dicha proteína H5 (1) comprende o consiste en la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 5, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) del virus de la gripe, en donde dicha proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 102 a 110, 116, 117, 119 a 126 y 128 a 137.

Description

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DESCRIPCION
Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento Campo de la invención
La presente divulgación se refiere al campo de la medicina, preferentemente al campo de las enfermedades infecciosas. En particular, la presente divulgación se refiere a proteínas y vacunas para la gripe. Muy particularmente, la presente divulgación se refiere al uso de cualquiera de tales proteínas o vacunas para el tratamiento y prevención de infecciones por virus de la gripe, adicionalmente para la prevención de la transmisión intra- e interespecífica del virus de la gripe.
Antecedentes de la invención
La infección por virus de la gripe sigue siendo una infección importante en animales y seres humanos. La gripe está provocada por virus que experimentan continuos cambios/modificaciones antigénicas y que poseen un reservorio animal. Por lo tanto, pueden producirse nuevas epidemias y pandemias en el futuro, y la erradicación de la enfermedad será difícil de lograr. Los virus de la gripe son bien conocidos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, n.° 12, pág. S 82 a S 86 de diciembre de 2004, con referencias adicionales. Brevemente, el genoma del virus de la gripe A consiste en ocho segmentos monocatenarios y las partículas víricas tienen dos glucoproteínas principales en su superficie: hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Con al menos 16 subtipos distintos de hemaglutinina (H1 a H16) y 9 distintos neuraminidasa (Ni a N9), existe una considerable variación antigénica entre los virus de la gripe.
Se ha demostrado que el virus de la gripe del tipo H5N1 del virus de la peste aviar infecta a las aves de corral, los cerdos y el hombre. Los virus también se pueden transmitir directamente de las especies de aves a los humanos (Claas et al., Lancet 1998, 351: 472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72: 6678; Subbarao et al., Science 1998, 279: 393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1): S26-S29). La mortalidad en casos clínicos humanos conocidos se aproxima al 50 %.
Durante el siglo pasado, los cerdos han sido un vector importante para las pandemias de gripe. Los cerdos, los camellos y las focas, preferentemente los cerdos, pueden servir como una 'cámara de mezcla' para los virus de la gripe aviar y, por lo tanto, representan un factor de riesgo potencial para superar las barreras entre especies desde las aves de corral, el reservorio natural de los virus de la gripe, hasta los mamíferos. Esto habitualmente se produce por infecciones dobles de los animales susceptibles, por ejemplo el cerdo, tanto con un virus establecido en mamífero (porcino) como con un virus de la gripe aviar. Esta doble infección puede crear nuevos virus recombinantes que pueden ser la causa de pandemias humanas o porcinas. Sin embargo, evidencias recientes indican que una recombinación de cepas H5 aviares actuales con virus de la gripe de mamífero no dará como resultado recombinantes altamente virulentos. Por otro lado, el virus de la gripe aviar puede infectar a los cerdos, y por mutaciones espontáneas, puede adaptarse a los mismos. La barrera crítica se superará tan pronto como el virus pueda provocar infecciones horizontales dentro de una población de cerdos (o de otros mamíferos).
Sin embargo, una gran parte de los cerdos del sudeste asiático han sido infectados con cepas del virus de la gripe aviar (H5) que se originan en la cría vecina de aves de corral. Dado que esas infecciones hasta ahora han sido subclínicas, solo pueden diagnosticarse mediante métodos de laboratorio y, por lo tanto, con frecuencia se pasan por alto. Existe un alto riesgo de que los cerdos infectados de forma subclínica sirvan como una oportunidad para que el virus se adapte al sistema de los mamíferos, se propague dentro de la población porcina y además infecte a los seres humanos.
Las vacunas para la gripe actuales incluyen una vacuna de subunidades (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10): 12231238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080) una vacuna atenuada (Horimoto et al., Vaccine 2004, 22(17-18):2244-2247), una vacuna de ADN (Watabe et al., Vaccine 2001, 19(31):4434-4444) y una vacuna para la gripe inactivada (Cao et al., Vaccine 1992, 10(4):238-242), siendo esta última la más utilizada a escala comercial (Lipatov et al., J Virol 2004, 78(17):8951-8959).
Las vacunas de subunidades, la hemaglutinina y la neuraminidasa recombinantes (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9- 10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073- 2080) pueden ser una alternativa atractiva a la vacuna inactivada, aunque ninguna está actualmente en uso como vacuna comercial. La preparación de tales vacunas es obviamente más segura que la preparación de una vacuna inactivada. Además, las vacunas de subunidades no generan respuestas de anticuerpos frente a las proteínas víricas internas de la gripe y, así, permiten distinguir entre animales vacunados e infectados (Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265-2274).
La proteína hemaglutinina es la glucoproteína de unión a receptor y de fusión de membrana del virus de la gripe, y la diana de anticuerpos neutralizantes de la infectividad. La proteína hemaglutinina (HA) del H5N1 completa está compuesta de 568 aminoácidos, con un peso molecular de 56 kDa. La molécula de la HA consta de las subunidades
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HA1 y HA2, mediando la subunidad HA1 el contacto inicial con la membrana celular y siendo HA2 responsable de la fusión a la membrana (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63(1-2):129-136).
Los sistemas de baculovirus/células de insecto se han usado para expresar genes de hemaglutinina aislados de subtipos de gripe aviar (Babai et al., Vaccine 1999, 17(9-10):1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17(18):2265- 2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17(15-16):2073-2080); Nwe et al., BMC Mircobiology 2006, 6(16):doi: 10.1186/1471-2180-6-16). Sin embargo, las proteínas recombinantes parecen no ser protectoras en ningún caso o ser solo menos eficaces al menos para algunas especies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19: 1732-1737).
El documento Lin et al. (J Vet Med Sci. 2008 70(11): 1147-52) divulga el uso de un sistema de baculovirus/células de insecto para la producción de proteína H5 del virus H5N1 de clado 2 A/duck/China/E319-2/03, que se puede utilizar para una vacunación de sensibilización-refuerzo para prevenir una infección con el virus de clado 2 A/duck/China/E319-2/03.
Bright et al. (PLoS One. 2008 30;3(1):e1501) describe el uso de un sistema de baculovirus/células de insecto para generar partículas similivíricas (VLP, forma siglada de virus-like partióles) que incluyen neuraminidasa, hemaglutinina y proteína de matriz 1 del virus H5N1 de clado 2, para inducir en ratones una respuesta inmunitaria protectora cruzada entre clados frente a una exposición con el virus H5N1 de clado 1 A/VN/1203/2004. Sin embargo, la producción de las VLP no está exenta de problemas, dado que para generar una VLP funcional que imite de forma eficaz a un virus real, se necesitan múltiples proteínas estructurales del virus que después deben ensamblarse correctamente en una partícula que reproduzca la confirmación de la cubierta externa (cápside) del virus infeccioso. Además, el estudio también revela que el ensamblaje in vitro de las VLP compite con la agregación (Ding et al. Biotechnology and Bioengineering 107 (3): 550-560).
El documento WO 2008/052173 A2 divulga una vacuna de subunidades, pero no divulga protección cruzada alguna frente a distintos clados de H5N1. Santiago et al 2011 (Vaccine, vol. 29, páginas 8888-8897) divulgan que la vacunación de ratones con una proteína HA H5 induce la producción de algunos anticuerpos que reaccionan de forma cruzada.
Por lo tanto, existe una necesidad de aumentar la disponibilidad de vacunas mejoradas y nuevos enfoques de vacunación para proporcionar mejores enfoques para controlar las infecciones por virus de la gripe y tener un impacto positivo en la carga de la enfermedad. En particular, existe una gran necesidad de un sistema simple, eficaz y fácil de manejar para inducir una respuesta inmunitaria protectora de forma cruzada entre clados frente a los virus de la gripe con H5N1 HA, preferentemente mediante una vacunación de una sola inyección.
Descripción de la invención
Antes de las realizaciones de la presente invención, cabe destacar que como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y “el/la” incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una preparación" incluye una pluralidad de tales preparaciones; la referencia al "vehículo" es una referencia a uno o más vehículos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Salvo que se defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que el experto en la materia a la cual pertenece la presente invención entiende comúnmente. Todos los intervalos y valores dados pueden variar en del 1 al 5 % a menos que se indique otra cosa o que el experto en la materia conozca otra cosa, por lo tanto, el término "aproximadamente" se omite de la descripción. Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferentes. Todas las publicaciones se mencionan en el presente documento por referencia, con el fin de describir y divulgar las sustancias, excipientes, vehículos y metodologías como se informa en las publicaciones que podrían usarse en relación con la invención. No debe interpretarse que nada en el presente documento sea un reconocimiento de que la invención no tenga derecho a antedatar tal divulgación en virtud de una invención anterior.
La solución al problema técnico anterior se consigue mediante la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Proteínas de la gripe y moléculas de ácido nucleico que las codifican
La presente invención supera los problemas presentes en la técnica anterior al proporcionar una proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de un clado distinto, en donde dicha proteína H5 (1) comprende o consiste en la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 5, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) del virus de la gripe, en donde dicha proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 102 a 110, 116, 117, 119 a 126 y 128 a 137.
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La presente divulgación está basada en el sorprendente hallazgo de que la proteína H5 del H5N1 de ciado 1 induce, en particular, mediante una vacunación de una sola inyección, una respuesta inmunitaria protectora de forma cruzada entre clados frente a los virus de la gripe con H5N1 HA. Como característica, la proteína H5 del virus H5N1 de clado 1, que por razones de claridad también se denomina "proteína H5 (1)" en el presente documento, comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica expuesta en la SEQ ID NO: 1.
Identidad de secuencia con una secuencia, como se menciona en el presente documento, significa en particular identidad de secuencia a lo largo de la longitud de dicha secuencia o identidad de secuencia a lo largo de toda la longitud de dicha secuencia, respectivamente.
Una "vacunación de una sola inyección" se refiere a una composición inmunogénica que es eficaz para reducir la incidencia o la gravedad de la infección después de una sola dosis de la misma, sin necesidad de un refuerzo.
Preferentemente, la divulgación se dirige así a una proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de un clado distinto, es decir, de un clado distinto del clado 1 o de cualquier clado, con la excepción del clado 1, respectivamente, en donde dicha proteína H5 (1) comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1.
El término "clado" o "clados", como se usa en el presente documento, se refiere al clado (o clados) del Sistema de Nomenclatura de la OMS para el Virus de la Gripe Aviar altamente patógeno (H5N1), que se resume en la URL del sitio de internet de la OMS:
who.int/csr/disease/avianjnfluenza/guidelines/nomenclature/en/ (12.08.2011).
Se definen 10 clados de virus iniciales distintos (numerados 0-9) (Grupo de trabajo sobre la evolución del H5N1 de OMS/OMSA/OAA, 2008), que se llaman clados de primer orden. Los clados están estrictamente definidos al nivel de nucleótidos como que cumplen los siguientes tres criterios específicos de definición de clados desarrollados por el Grupo de trabajo sobre la evolución del H5N1 de la OMS/OMSA/OAA:
• compartir un nodo común (definidor de clado);
• agrupación monofilética con un valor de impulso (bootstrap) de >60 en el nodo definidor de clado (después de 1000 repeticiones de impulso de neighbor-joining); y
• porcentaje promedio de distancias de nucleótidos por parejas entre y dentro de los clados de >1,5 % y <1,5 %, respectivamente.
A medida que los virus dentro de estos 10 clados continúan evolucionando, surgen periódicamente nuevos sublinajes (posibles clados de H5N1). Una vez que estos sublinajes cumplen los mismos tres criterios específicos de definición de clados que los 10 clados iniciales (numerados 0-9), se designan como clados distintos (WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008). Estos nuevos clados se definen como clados de segundo orden (o tercero, etc.) y se les asigna una 'dirección' numérica que los vincula con su clado original, utilizando un sistema de numeración decimal jerárquica. Por ejemplo, dentro del clado 2.3 antigénicamente distinto, los clados de tercer orden que cumplen la definición de clado se designan como clados 2.3.1 y 2.3.2, y así sucesivamente. Este sistema de numeración jerárquico lógico está relacionado objetivamente con la filogenia de la HA.
Los criterios utilizados para la designación de clados de acuerdo con el Sistema de Nomenclatura de la OMS para el H5N1 son:
1 Cuando sea posible mantener los números de clado previamente designados (es decir, el clado 2.2 sigue siendo 2.2 y el clado 1 sigue siendo 1)
2 Las nuevas designaciones de clado basadas en la topología del árbol filogenético obtenido de todas las secuencias disponibles (el árbol grande) de los progenitores de H5N1 (más cercanos a Gs/Guangdong/1/96) se redesignan como clado 0
Los clados posteriores se numeran comenzando en el clado 3 (es decir, clados 3-9)
Las clados se designan por la presencia de un nodo común distinto compartido por al menos 4 aislamientos (en un grupo monofilético) Las ramas adicionales se designan como un único clado que evoluciona en más de un linaje distinto (es decir, clado 2.2 o clado 2.3.1; basado en compartir un nodo común y una agrupación monofilética)
3 Porcentaje promedio de distancias por pares entre y dentro de los clados (usando Kimura 2-parámetros) Distintos clados deben tener > 1,5 % de distancia promedio entre otros clados
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Distintos ciados deben tener <1,5 % de distancias promedio dentro del ciado (puede ser un poco más alto en ciados con valores extremos altamente desarrollados; es decir, Ck/Shanxi/2/2006 en el clado 7)
4 Impulso (basado en 1000 repeticiones de impulso de neighbor-joining) > 60 % de valor de impulso en el nodo definidor de clado (tomado de la Tabla 1 de: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008)).
La cepa prototipo para cada clado se enumera en la siguiente Tabla:
Clado
Cepa prototipo
0
Gs/Guangdong/1/96
3
Ck/Hong Kong/YU562/2001
4
Gs/Guiyang/337/2006
5
Gs/Guangxi/914/2004
6
Ck/Hunan/01/2004
7
Ck/Shanxi/2/2006
8
Ck/Hong Kong/YU777/2002
9
Dk/Guangxi/2775/2005
1
Vietnam/1203/2004
2.1.1
Ck/Indonesia/BL/2003
2.1.2
Indonesia/538H/2006
2.1.3
Indonesia/5/2005
2,2
BHGs/Qinghai/1A/2005
2.3.1
Dk/Hunan/303/2004
2.3.2
Ck/Guangxi/2461/2004
2.3.3
Ck/Guiyang/3055/2005
2.3.4
Dk/Fujian/1734/2005
2.4
Ck/Yunnan/115/2004
2.5
Ck/Korea/ES/2003
2.5
Ck/Korea/ES/2003
(tomado de la Tabla 2 de: WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008)).
La publicación WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group Emerg. Inf. Dis. 14, 7 (2008) se encuentra en el sitio en internet del CDC URL: cdc.gov/EID/content/14/7/e1.htm (12.08.2011).
El árbol filogenético en el sitio web de la OMS URL: who.int/csr/disease/avian_influenza/H5CompleteTree.pdf (15.08.2011) proporciona una visión de conjunto de la clasificación de los clados de los virus H5N1 conocidos.
Para determinar el clado de una proteína H5 de H5N1, por ejemplo, se puede utilizar la herramienta alojada en internet "Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 HA clade prediction" (predicción de clados del virus de la gripe aviar altamente patógeno (HPAI) H5N1 HA), que se describe en Lu, Davis, Rowley y Donis: "A Web-based tool for the clade designation of highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses" en Options for the Control of Influenza VI. J.M. Katz, N. Cox y A.W. Hampson (Ed.) Londres: Blackwell, 2007 y que se encuentra en el sitio en internet URL: h5n1.flugenome.org/grouping.php (12.08.2011).
Por ejemplo, una proteína H5 del virus H5N1 de clado 1 (proteína H5 (1)) es, así, una HA con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de un clado 1, de acuerdo con el sistema de nomenclatura para H5N1 de la OMS mencionado anteriormente.
Un virus H5N1 de clado 2.3.1, por ejemplo, es, por tanto, un H5N1 que está incluído en los criterios de un clado 2.3.1 de acuerdo con el Sistema de nomenclatura para H5N1 de la OMS mencionado anteriormente.
Preferentemente, la proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación, es decir, la proteína H5 del virus H5N1 de clado 1 como se describe en el presente documento, comprende o consiste en una secuencia polipeptídica que tiene al menos el 98,1 %, preferentemente al menos el 98,2 %, más preferentemente al menos el 98,3 % y muy preferentemente al menos el 98,4 % de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1.
Identidad de secuencia en el contexto de la invención se entiende que se basa en la similitud por parejas determinada entre secuencias de proteínas. La determinación del porcentaje de similitud entre dos secuencias se lleva a cabo preferentemente usando un algoritmo computacional, en particular el bien conocido Basic Local
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Alignment Search Tool (Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990, 215(3):403-410). A efectos de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de aminoácidos se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología BLAST blastp usando los siguientes parámetros: un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 3, matriz BLOSUM62, penalización de apertura de hueco de 11, penalización de extensión de hueco de 1 y un ajuste condicional de la matriz de puntuación constitutiva. La base de datos para realizar la búsqueda es el conjunto de secuencias de proteínas no redundantes (nr). El algoritmo de búsqueda de homologías BLaSt se describe en Altschul SF (1990),J Mol Biol 1990, 215(3):403- 410.
Un variante puede, por ejemplo, diferir de la molécula con número de acceso de referencia BAE07201 sin péptido señal (los 16 restos de aminoácidos N-terminales no se muestran en la SEQ ID NO: 1) en tan solo 1 a 15 restos de aminoácido, tan solo 1 a 10 restos de aminoácido, tal como 6-10, tan solo 5, tan solo 4, 3, 2 o incluso 1 resto de aminoácido.
Preferentemente, la proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación, es decir, la proteína H5 (1) del virus H5N1 de clado 1 para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de un clado distinto, es preferentemente una proteína H5 del virus de la gripe, en donde la proteína H5 tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+). Dicha proteína H5 (1) preferente también se denomina a continuación Mut k + o mutK+. Preferentemente, tal proteína H5 y cualquier proteína H5 adicional de acuerdo con la divulgación es una proteína H5 aislada.
El término "proteína H5 (1) del H5N1 de clado 1", como se usa en el presente documento, significa preferentemente "proteína H5 (1) como único antígeno del virus H5N1 de clado 1" o en particular "proteína H5 (1) como único antígeno".
Las expresiones "hemaglutinina 5 (H5)" o "H5 del virus de la gripe aviar", o "proteína H5", como se usan en el presente documento, son equivalentes y significan, pero sin limitación, cualquier proteína H5 de origen natural y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier deleción, sustitución y/o mutante de inserción de la proteína H5.
La numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 (1) Mut k +, como se usa en el presente documento, se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia amino de la hemaglutinina de la cepa duck/China/E319-2/03, pero que carece del péptido señal amino terminal. En otras palabras, si se hace referencia al aminoácido en la posición 223 (aminoácido 223), se entiende que el resto de aminoácido corresponde al aminoácido 223 de la SEQ ID NO: 2. Sin embargo, esto no significa que la proteína H5 Mut k+ de acuerdo con la divulgación tenga la secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 2. Solo dice que los aminoácidos correspondientes de las proteínas H5 de acuerdo con la divulgación codifican el resto de aminoácido, como se menciona explícitamente. En el caso actual, el aminoácido 223 sería Serina (S). Los términos "223N" o "155N" significan, de forma ejemplar, que el aminoácido en las posiciones 223 y 155, respectivamente - numeración de acuerdo con las posiciones de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 -, codificarán para el aminoácido Asparagina (N). En otras palabras, si se hace referencia a "proteína H5 (1) que tiene el aminoácido 223N", en una molécula de aminoácido de H5 que habitualmente codifica para Serina en la posición de aminoácido 223 - numeración de acuerdo con las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 - ese aminoácido se sustituirá por una Asparagina (N). El término "328K+" o "modificación 328K+" significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 - numeración de acuerdo con las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 -, se inserta una segunda lisina (K+). En los casos en que las secuencias de aminoácidos en las posiciones 328 y 329 codifican de forma natural lisina-lisina, no se insertará más lisina (K). Sin embargo, la mayoría de las secuencias de H5 conocidas codifican en las posiciones de aminoácidos 328 y 329 para lisina-arginina. En cualquiera de tales casos, el término modificación 328K+ significa que estará insertada una segunda lisina (K) entre la lisina en la posición 328 y la arginina en la posición 329. Entonces, la secuencia modificada se leería Lisina-Lisina- Arginina (KKR).
Con respecto al presente ejemplo, la hemaglutinina de la cepa duck/China/E319-2/03 se cambia a una proteína H5 (1) del H5N1 de clado 1, dado que se asemeja a la secuencia H5 del virus H5N1 de clado 1 A/HongKong/213/2003, el año/ubicación/hospedador de este aislado de HK, y muestra reactividad con anticuerpos específicos de clado 1. Por tanto, la secuencia Mut K+ se clasifica como una secuencia H5 de un H5N1 de clado 1. Dentro del contexto de la divulgación, la secuencia de Mut K+ designada se entiende y define así como una proteína H5 del virus H5N1 de clado 1.
Por lo tanto, en particular, también se entiende y define cualquier proteína H5 designada como una proteína H5 del virus H5N1 de clado 1 de acuerdo con la descripción, si está codificada por una secuencia de nucleótidos que cumple los criterios de una secuencia de nucleótidos de un clado 1 de acuerdo con el Sistema de nomenclatura para H5N1 de la OMS mencionado anteriormente.
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Se divulga una proteína H5 y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier deleción, sustitución y/o mutante de inserción de la proteína H5, en donde las proteínas H5 tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+). Se explica por sí mismo que cualquiera de las proteínas H5 que se proporcionan por la presente es antigénica, lo que significa que muestran propiedades antigénicas en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional para virus de la gripe.
La presente divulgación también se refiere a cualquier parte de la proteína H5 (1), lo que significa cualquier fragmento de péptido que muestra propiedades antigénicas en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, que tenga en un aspecto al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328k+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+).
Una proteína H5 (1) muestra propiedades antigénicas si inhibe la hemaglutinación en un ensayo de inhibición de la hemaglutinina convencional, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2. Habitualmente, dicha parte antigénica de la proteína H5 (1) comprende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 o muy preferentemente 105 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína H5 como se mencionó anteriormente, modificada o no modificada, que muestre propiedades antigénicas en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional como se describe en el Ejemplo 2. También se describe un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, por ejemplo, en Stephenson et al., Virus Research vol. 103, pág. 91-95 (2004) con referencias adicionales. Sin embargo, el ensayo IH como se describe en el Ejemplo 2 se debe entender como el ensayo de referencia relevante en conexión con todos los aspectos de la divulgación como se describe en el presente documento:
Brevemente, el ensayo IH se realizó para detectar la presencia de anticuerpos específicos para HA. En el ensayo de IH se utilizó un virus H5N2 heterólogo, A/chicken/Mexico/232/94, a una concentración de cuatro unidades de hemaglutinación [4 unidades HA]. En placas de microtitulación de fondo en U, se mezclaron posteriormente diluciones de suero seriadas con factor dos en PBS con volúmenes iguales (25 jl) que contenían 4 unidades de HA de virus, y se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante 30 min. Se añadieron a los pocillos que contenían suero-virus glóbulos rojos de pollo, a una concentración del 0,5 % en PBS, y se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente. Los títulos de IH se determinaron como las recíprocas de las diluciones de suero más altas en las que se observó inhibición de la hemaglutinación.
Cabe destacar que, Haesebrouck and Pensaert (1986) encontraron "que puede existir una correlación entre los títulos de IH frente al virus de exposición y la protección frente a la exposición". Haesebrouck and Pensaert (1986) también determinaron que los cerdos con títulos de IH de >40 eran "completamente resistentes a la exposición y no se produjo replicación del virus en las vías respiratorias en el momento de la exposición". Por lo tanto, el desarrollo de títulos de IH >40 en los cerdos vacunados se correlacionaría con la protección. (F. Haesebrouck y M.B. Pensaert, 1986). Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H1N1 vaccine (Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239--249. Debe suponerse que títulos equivalentes o al menos casi equivalentes IH de H5 también darán como resultado una protección inmunitaria completa de los cerdos frente al virus de la gripe aviar. Títulos más bajos al menos dan como resultado una seroconversión de los animales vacunados y dan como resultado una protección inmunitaria parcial de los animales, lo que también puede reducir drásticamente el riesgo de pandemia.
Además, una parte antigénica de la proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación incluye, pero sin limitación, mutantes de deleción de la proteína H5, que comprende:
i. al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o muy preferentemente 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que rodea e incluye el aminoácido 223N; y
ii. al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o muy preferentemente 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que rodea e incluye la modificación de aminoácido 328K+, y
iii. en donde cualquiera de tal parte antigénica de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, como se describe en el Ejemplo 2.
Preferentemente, los aminoácidos circundantes del aminoácido 223N y/o 328K+ están codificados por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 5.
Adicionalmente, las proteínas H5 (1) preferentes de acuerdo con la divulgación son:
i. cualquiera de las mencionadas anteriormente que tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+;
ii. cualquiera de las mencionadas anteriormente que tienen el 94N/223N y la modificación 328K+;
iii. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de un ave de corral infectada con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
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iv. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene los aminoácidos 94N/223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
v. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene los aminoácidos 155N/223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
vi. cualquier proteína H5 de origen aviar que tiene el aminoácido 120N/155N/223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
vii. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+; o
viii. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+; o;
ix. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+; o
x. cualquier proteína H5 que tiene las modificaciones 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: GSS
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL; o
xi. cualquier proteína H5 que tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS; o
xii. cualquier proteína H5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
Adicionalmente, las proteínas H5 (1) preferentes como se divulga por la presente incluyen las proteínas H5 como se describe en Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, pág. 12915-12920 de 6 de septiembre de 2005, en donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones descritas anteriormente, al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+).
Además, las proteínas H5 (1) preferentes como se divulga en el presente documento incluyen proteínas H5 que comprenden un péptido que comprende el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+), y:
i. las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 o;
ii. cualquier péptido que tenga al menos el 85 % de homología de secuencia, más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % de homología de secuencia, aún más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de homología de secuencia, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97 % de homología de secuencia, aún incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98 % de homología de secuencia, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99 % de homología de secuencia con el polipéptido de i) que comprende inhibición de la hemaglutinina en una inhibición de hemaglutinina convencional como se describe anteriormente; o
iii. cualquier parte antigénica de los polipéptidos de i) o ii) que comprenda al menos 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 o muy preferentemente 8 aminoácidos contiguos de cualquiera de los péptidos de i) o ii).
iv. cualquiera de los péptidos de i), ii) o iii) que tengan los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156A,156T, 189R, 189K, 212K, 212R, 212E, 223N, 223N o 120N/155N.
v. cualquier péptido de i), ii), iii) o iv) que tenga uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: GSS
e. aa 226 - 228: MDF
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f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL; o
vi. cualquier péptido de i), ii), Ni) o iv) que tenga uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS.
"Homología de secuencia", como se usa en el presente documento, se refiere a un método para determinar la relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, dos o más secuencias se alinean de forma óptima y se introducen huecos si es necesario. En contraste con la identidad de secuencia, cuando se determina la homología de secuencia las sustituciones de aminoácidos conservativas se cuentan como una coincidencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tiene el 95 % de homología de secuencia con una secuencia de referencia, el 85 %, preferentemente el 90 %, incluso más preferentemente el 95% de los restos de aminoácido o nucleótidos de la secuencia de referencia deben coincidir o comprender una sustitución conservativa con otro aminoácido o nucleótidos, o con una serie de aminoácidos o nucleótidos de hasta el 15 %, preferentemente hasta el 10 %, incluso más preferentemente hasta el 5 % del total de restos de aminoácido o nucleótido, sin incluir las sustituciones conservativas, en la secuencia de referencia, puede estar insertados en la secuencia de referencia. Preferentemente, la secuencia homóloga comprende al menos un tramo de 50, incluso más preferente de 100, incluso más preferente de 250, incluso más preferente de 500 nucleótidos. Tras el alineamiento, la homología de secuencia se determina posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "homologas" en una posición particular si, en esa posición, los nucleótidos o restos de aminoácido son idénticos. El número total de tales identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o restos de aminoácidos de la secuencia de referencia para dar el % de homología de secuencia. La homología de secuencia puede calcularse fácilmente por métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., ed., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferentes para determinar la homología de secuencia están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la homología de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles de forma pública, que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de tales programas incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX está disponible de forma pública en el NCBI y otras fuentes (Manual BLAST, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). Estos programas alinean de manera óptima las secuencias usando pesos de hueco predeterminados para producir el mayor nivel de homología de secuencia entre las secuencias dadas y las de referencia.
Además, las proteínas H5 (1) preferentes incluyen proteínas H5 que comprenden la modificación 328K+ como se menciona anteriormente y la secuencia de aminoácidos proporcionada en la TABLA 1, o cualquier parte inmunogénica de la misma:
TABLA 1 Antígenos de H5
Nombre de la secuencia
Secuencia básica Posiciones de aminoácido #
36
83 86 120 155 156 189 212 223 263
223N/328K+
cualquier HA H5 - - - - - - - - N -
36T/223N/328K+
cualquier HA H5 T - - - - - - - N -
36K/223N/328k+
cualquier HA H5 K - - - - - - - N -
83A/223N/328k+
cualquier HA H5 - A - - - - - - N -
83T/223N/328k+
cualquier HA H5 - T - - - - - - N -
83D/223N/328k+
cualquier HA H5 - D - - - - - - N -
86A/223N/328k+
cualquier HA H5 - - A - - - - - N -
Nombre de la secuencia
Secuencia básica Posiciones de aminoácido #
36
83 86 120 155 156 189 212 223 263
86V/223N/328k+
cualquier HA H5 - - V - - - - - N -
120N/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - N - - - - N -
120S/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - S - - - - N -
155N/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - N - - - N -
155S/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - S - - - N -
156A/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - A - - N -
156T/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - T - - N -
189R/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - R - N -
189K/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - K - N -
212K/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - - K N -
212R/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - - R N -
212E/223N/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - - E N -
223N/263A/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - - - N A
223N/263T/328k+
cualquier HA H5 - - - - - - - - N T
120N/155N/223N/328k +
cualquier HA H5 - - - N N - - - N -
A/duck/China/E319- 2/03/328k+
AAR99628 T A A S D A R K N A
A/duck/China/E319- 2/03_223N/328k+
AAR99628 T A A S D A R K N A
A/duck/China/E319- 2/03_120N/223N/328k +
AAR99628 T A A N D A R K N A
A/duck/China/E319- 2/03_155N/223N/328k +
AAR99628 T A A S N A R K N A
A/duck/China/E319- 2/03 120N/155N/223N /32 8k+
AAR99628 T A A S N N R K N A
HA/HK/213/03/328k+
AY518362 T A A N N A R K N A
HA/Vietnam/1203/04
K T V S S T K R N T
HA/Vietnam/1203/04 2 23N/328k+
K T V S S T K R N T
HA//Vietnam/3046/04 223N/328k+
T A V S S T K R N T
HA/Vietnam/3062/04 2 23N/328k+
T A V S S T K R N T
HA/chicken/Vietnam/3 9/04_223N/328k+
T A V S S T K R N T
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Nombre de la secuencia
Secuencia básica Posiciones de aminoácido #
36
83 86 120 155 156 189 212 223 263
HA/falcon/HK- D0028/04_223N/328k+
T A A S S A K E N A
HA/duck/Singapore/3/9 7223N/328k+
T D V S N A K E N A
HA/HK/156/97/328k+
T A A S S A K E N T
# las posiciones de aminoácido dadas en la TABLA 1 se refieren a las posiciones definidas de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2. En otras palabras, el aminoácido 223 de la TABLA 1 se refiere al aminoácido 223 de la secuencia de SEQ ID NO: 2.
- significa que los aminoácidos en estas posiciones son variables en comparación con la secuencia de referencia.
Adicionalmente, la presente divulgación también se refiere a proteínas H5 (1) que tienen al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+), y comprende:
i. un péptido que tiene las secuencias con Número de referencia NCBI AAT65209, CAJ32556, ABC47656,
CAF21874, CAF21870, AAC58998, AAC58997, AAC58996, AAC58994, AAC58993, AAC58992, AAC58991, AAC58990, AAC58995, AAS45134, AAN 17270, AAN 17269, AAN 17268, AAN 17267, AAN 17266, AAN 17265, AAN 17264, AAN 17263, AAN 17262, AAN 17261, AAN 17260, AAN 17259, AAN 17257, AAN 17256, AAN 17255, AAN 17254, AAA43083, AAA43082, AAB19079, BAE48696, BAE48693, BAE48696, BAE48695, BAE48694, BAE48692, BAE48691, BAE48690, BAE48689, BAE48688, BAE48687, BAE48686, BAE48685,
BAE48684, BAE48683, AAC58999, ABC72082, AAV91149, AAP71993, AAP71992, AAP71991, AAP71990,
AAP71989, AAP72011, AAP72010, AAP72009, AAP72008, AAP72007, AAP72006, AAP72005, AAP72004,
AAP72003, AAP72002, AAP72001, AAP72000, AAP71999, AAP71998, AAP71997, AAP71996, AAP71995,
AAP71994, AAF99718, ABF58847, AAG38534, AAC32102, AAC32099, AAL75847, AAC32101, AAC32098,
AAC32088, AAC32078, AAR99628, AAC32100, AAM49555, AAL75843, AAL75839, AAD13573, AAD13568,
AAF04720, AAF04719, AAC34263, AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569,
AAD13567, AAD13566, AAK57506, AAG01225, AAG01215, AAG01205, AAG01195 o ABD83813 modificadas de un modo descrito anteriormente, lo que significa que esas secuencias incluyen las modificaciones 223N y 328 K+ mencionadas anteriormente, que no son parte de las secuencias de tipo silvestre; o
ii. cualquier péptido que tenga al menos el 85 % de homología de secuencia, más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % de homología de secuencia, aún más preferentemente al menos aproximadamente el 95 % de homología de secuencia, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 97 % de homología de secuencia, aún incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 98 % de homología de secuencia, e incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 99 % de homología de secuencia con el polipéptido de i) y que muestran inhibición de la hemaglutinina en una inhibición de hemaglutinina convencional como se describe anteriormente;
iii. cualquiera de los péptidos de i) o ii) que tienen los aminoácidos 36T, 36K, 83A, 83T, 83D, 86A, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S,156A,156T, 189R, 189K, 212K, 212R,212E,263A,263T o 120N/155N; o
iv. cualquiera de tales péptidos de i), ii) o iii) que tenga uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125 SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: GSS
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL; o
v. cualquier péptido de i), ii) iii) o iv) que tenga uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS
Preferentemente, la proteína H5 (1) para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con virus H5N1 de un clado distinto se expresa de forma recombinante y/o se produce mediante un sistema de expresión de baculovirus, preferentemente en células de insecto cultivadas.
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La expresión "proteína H5 (1)" como se menciona en el presente documento es, por lo tanto, en particular, equivalente la expresión "proteína H5 recombinante" usada en el presente documento.
Con respecto al virus H5N1 de un clado distinto, como se menciona en el presente documento, dicho virus H5N1 de un clado distinto se selecciona preferentemente del grupo que consiste en el virus H5N1 de clado 0, el virus H5N1 del clado 2, el virus H5N1 del clado 3, el virus H5N1 del clado 4, el virus H5N1 del clado 5, el virus H5N1 del clado 6, el virus H5N1 del clado 7, el virus H5N1 del clado 8 y el virus H5N1 del clado 9.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto es el virus H5N1 del clado 2.2 o el virus H5N1 del clado 2.3.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 del clado 2.2.1 o el virus H5N1 del clado 2.3.2.
Por razones de claridad, la proteína H5 del virus H5N1 de un clado distinto se denomina en lo sucesivo en el presente documento "proteína H5 (2)". Por tanto, La proteína H5 (2) como se menciona en el presente documento es en particular una proteína H5 codificada por el genoma de un H5N1 de cualquier clado con la excepción del clado 1.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 de origen norteafricano o de origen vietnamita, en donde dicho virus H5N1 de origen norteafricano es preferentemente un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) del virus de la gripe, en donde dicha proteína H5 (2) tiene
(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, en donde la modificación 145(-) significa que la posición de aminoácido 145 de H5 está delecionada, o
(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 145L, 172T y 254V,
y en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 (2) se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8;
o en donde dicha proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente al menos el 96 %, más preferentemente al menos del 97 %, aún más preferentemente al menos el 98 %, aún más preferentemente al menos el 99 %, o preferente en particular el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 de origen norteafricano o de origen vietnamita, en donde dicho virus H5N1 de origen norteafricano es preferentemente un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) del virus de la gripe, en donde dicha proteína H5 (2) tiene
(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, en donde la modificación 145(-) significa que la posición de aminoácido 145 de H5 está delecionada, o
(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 145L, 172T y 254V,
y en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 (2) se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8;
o en donde dicha proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente al menos el 96 %, más preferentemente al menos del 97 %, aún más preferentemente al menos el 98 %, aún más preferentemente al menos el 99 %, o preferente en particular el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46.
En contexto de la divulgación, tal proteína H5 (2) de acuerdo con (a) es una proteína de Subclado A y tal proteína H5 de acuerdo con (b) o (c) es una proteína de Subclado B.
Por lo tanto, se entiende que tal proteína H5 (2) de origen norteafricano podría ser, por ejemplo, una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 140, que corresponde a la SEQ ID NO: 8 sin péptido señal (los 16 restos de aminoácido N-terminales de la SEQ ID NO: 8 no están incluidos en la SEQ ID NO: 140) y, por lo tanto, comienza con el aminoácido N-terminal D17, pero en donde dicha secuencia tiene
(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, en donde la modificación 145(-) significa que la posición de aminoácido 145 de H5 está delecionada, o
(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 145L, 172T y 254V,
en donde se usa la numeración como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8.
Como se describe en el presente documento, se entiende que la expresión "virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2)" es equivalente a "virus H5N1 que comprende un polinucleótido que
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comprende una secuencia que codifica una proteína H5 (2)" o a "virus H5N1 que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína H5 (2) ", respectivamente.
Dentro del contexto de la invención, se entiende que el término "aminoácido" se refiere en particular a un resto de aminoácido o, respectivamente, a un aminoácido que se ha unido covalentemente a través de enlaces peptídicos a dos aminoácidos adicionales o, si el aminoácido está emplazado de forma N- o C-terminal en la secuencia del péptido, a un aminoácido adicional.
La proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, en particular consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 %, o en particular preferentemente el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 9 a 47. Preferentemente, la proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 %, o en particular preferentemente el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 15, 20 o 47. En particular, son preferentes las proteínas H5 (2) que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20.
Preferentemente, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, tiene el aminoácido 239N. El término "239N" significa, de forma ejemplar, que el aminoácido en la posición 239 - numeración de acuerdo con las posiciones de aminoácido de la SEQ ID NO: 8 codificará para el aminoácido Asparagina (N). En otras palabras, si se hace referencia a "proteína H5 (2) que tiene el aminoácido 239N", en una molécula de aminoácido de H5 que habitualmente codifica para Serina en la posición de aminoácido 239 - numeración de acuerdo con las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 - ese aminoácido se sustituirá por una Asparagina (N).
Preferentemente, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, no comprende la secuencia señal de la hemaglutinina de la gripe A H5N1, en donde la secuencia señal de la hemaglutinina de la gripe A H5N1 proteína H5 (2) preferentemente comprende o consiste en los primeros 16 aminoácidos N-terminales (código de una letra) MEKIVLLLAIVSLVKS (SEQ ID NO:51) o M1 E2 K3 I4 V5 L6 L7 L8 A9 I10 V11 S12 L13 V14 K15 S16, respectivamente, en donde la numeración de dichas primeras posiciones de 16 aminoácidos N-terminales se refiere a la posiciones de aminoácido 1 a 16, como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 8, a saber, en referencia a la secuencia (código de tres letras) Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser (SEQ ID NO: 51) como se expone en la SEQ ID NO: 8.
Preferentemente, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, por lo tanto, consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 %, o en particular preferentemente el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 9 a 47, en donde las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 9 a 47 comienzan con el aminoácido D17 y en donde la numeración de la primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 8.
La tabla B proporciona las respectivas SEQ ID NO: 62 a 99 de las secuencias que corresponden a variantes de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 9 a 46, en donde las SEQ ID NO: 62 a 99 comienzan con el respectivo aminoácido D17 de las SEQ ID NO: 9 a 46, como se menciona en el presente documento, y la Tabla D proporciona la variante respectiva de la secuencia SEQ ID NO: 47, es decir, la SEQ ID NO: 138, en donde la secuencia variante comienza con el aminoácido D17, como se menciona en el presente documento.
En un ejemplo, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, por lo tanto, consiste en o comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 % o en particular preferentemente el 100 % homóloga con la secuencia polipeptídica
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSY IVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYP TIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSN DAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGL RNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQF EAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEF YHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMV (SEQ ID NO:52), en donde este secuencia corresponde a una variante de la SEQ ID NO: 15, en donde la variante comienza con el aminoácido D17 de la SEQ ID NO: 15, en donde la numeración de la posición del aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 8.
En otro ejemplo, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, por lo tanto, consiste en o comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 % o en particular
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preferentemente el 100 % homóloga con la secuencia polipeptídica
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLGGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFPNVSEWSY IVEKINPANDLCYPGNFNNYEELKHLLSRINRFEKIQIIPKSSWPDHEASLGVSSACPYQGGPSFYRNVVWLIKKNDTYP TIKESYHNTNQEDLLVLWGIHHPNNEEEQKRIYKNPTTYVSVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRVEFFWTILKSND TINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCSTKCQTPIGAINTSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLR NSPQGEGRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFE AVGREFNNLEKRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVRNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFY HRCDNECME
SVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI, (SEQ ID NO: 53) en donde la secuencia corresponde a la SEQ ID NO: 20 comenzando con el aminoácido D17 y en donde la numeración de la primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8.
Por lo tanto, se entiende que la expresión "variantes de las SEQ ID NO: 9 a 47" preferentemente también se dirige a las secuencias variantes que comienzan con el aminoácido D17 de las SEQ ID NO: 9 a 47, y en donde las secuencias variantes de las SEQ ID NO 9 a 46 comenzando con el aminoácido D17 se proporcionan en la Tabla B y corresponden a las SEQ ID NO: 62 a 99, y en donde la secuencia de la SEQ ID NO: 47 comenzando con el aminoácido D17 tiene la secuencia
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGW LLGNPMCDEFPNVSEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNNYEELKHLLSRINRFEKIQIIPKS SWPDHEASLGVSSACPYQGGPSFYRNWWLIKKNNTYPTIKESYHNTNQEDLLVLWGIHH PNDEEEQTRIYKNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRVEFFWTILKSNDTIN FESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIG ECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQGEGRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQ GSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLEKRIENLNKKMEDGFLD VWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECME SVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWM CSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 54).
Preferentemente, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, comprende una secuencia C- terminal de longitud completa, en donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde preferentemente a los aminoácidos 527 a 568, en donde la numeración de dichas posiciones de aminoácido se refiere a la posiciones de aminoácido 527 a 568, como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 47. La secuencia C-terminal de longitud completa es, por lo tanto, preferentemente la secuencia IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 55), en donde en un aspecto preferente adicional el resto Fenilalanina (F) es un resto Serina (S) o en donde en otro aspecto preferente la secuencia IMVA (SEQ ID NO: 56) se sustituye por la secuencia ImMa (SEQ ID NO: 57). Por tanto, la secuencia C-terminal de longitud completa es, por lo tanto, preferentemente la secuencia
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 58) o la secuencia
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 59) o la secuencia
IGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 60).
Preferentemente, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, por lo tanto, consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 %, o en particular preferentemente el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 9 a 47, las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 54, 100-137 que corresponden a las variantes de las SEQ ID NO: 9 a 47 que comienzan con el aminoácido D17 y adicionalmente comprenden una secuencia C-terminal de longitud completa, en donde la numeración de la primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 8, y en donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde a los aminoácidos 527 a 568, en donde la numeración de estas posiciones de aminoácido se refiere a la posiciones de aminoácido 527 a 568, como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO 47.
La Tabla C proporciona las respectivas secuencias SEQ ID NO 100 a 137, en donde las secuencias comienzan con el aminoácido D17 y comprenden una secuencia C-terminal de longitud completa, como se describe en el presente documento, y la Tabla D proporciona la secuencia respectiva SEQ ID NO: 138, en donde la secuencia comienza con
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el aminoácido D17 de la SEQ ID NO: 47 y comprende una secuencia C-terminal de longitud completa, como se describe en el presente documento.
En un ejemplo, la proteína H5 (2), como se describe en el presente documento, por lo tanto, consiste en o comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente el 96 %, más preferentemente el 97 %, aún más preferentemente el 98 %, aún más preferentemente el 99 % o en particular preferentemente el 100 % homóloga con la secuencia polipeptídica
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSY IVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYP TIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSN DAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGL RNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQF EAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEF YHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQC RICI (SEQ ID NO:52), en donde dichas secuencias corresponden a la SEQ ID NO: 15 comenzando con el aminoácido D17 y, adicionalmente, que comprende una secuencia C-terminal de longitud completa, en donde la numeración de dicha primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8, y en donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde a los aminoácidos 527 a 568, más en particular a los aminoácidos 534 a 568, en donde la numeración de dichas posiciones de aminoácido se refiere a la posiciones de aminoácido 527 a 568, o más en particular a las posiciones de aminoácido 534 a 568, como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 47. En el presente documento, esta secuencia, la SEQ ID NO: 52, y las secuencias que tienen distintas secuencias C- terminales, se pueden denominar una "variante de la SEQ ID NO: 15".
Por lo tanto, se entiende adicionalmente que la expresión "variantes de las SEQ ID NO 9 a 47" también se dirige preferentemente a las secuencias SEQ ID NO: 9 a 47 comenzando con el aminoácido D17 y que tienen la secuencia C-terminal de longitud completa, y en donde dichas secuencias SEQ ID NO 9 a 46 comenzando con el aminoácido D17 y que tienen la secuencia C terminal de longitud completa se proporcionan en la Tabla C, y dicha secuencia SEQ ID NO: 47 comenzando con el aminoácido D17 y que tiene la secuencia C-terminal de longitud completa se proporciona en la Tabla D.
Las expresiones "secuencias variantes como se exponen en las SEQ ID NO: 9 a 47" o "secuencias variantes de las SEQ ID NO: 9 a 47", como se usa en el presente documento, preferentemente también se relacionan con las secuencias como se expone en la Tabla B o la Tabla C, respectivamente, y, adicionalmente la secuencia expuesta en la Tabla D, respectivamente.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto comprende una proteína H5 (2) que tiene
(a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
(b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V,
y/o
en donde tal proteína H5 (2) comprende un péptido que comprende:
i. una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46;
ii. cualquier péptido que tenga al menos el 85 %, preferentemente al menos el 95 %, incluso más preferentemente al menos el 96 %, incluso más preferentemente al menos el 97 %, incluso más preferentemente al menos el 98 %, incluso más preferentemente al menos el 99 %, muy preferentemente el 100 % de homología de secuencia con el polipéptido de i) y que comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional; o
iii. cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprenda al menos 334 aminoácidos contiguos de cualquiera de tales péptidos de i) o ii), y en donde cualquiera de tales péptidos comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional,
y/o
en donde tal proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene al menos el 95 %, incluso más preferentemente al menos el 96 %, incluso más preferentemente al menos el 97 %, incluso más preferentemente al menos el 98 %, incluso más preferentemente al menos el 99 %, muy preferentemente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene:
(a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
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(b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
(c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V,
y/o
en donde tal proteína H5 (2) comprende un péptido que comprende:
i. una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46;
ii. cualquier péptido que tenga al menos el 85 %, preferentemente al menos el 95 %, incluso más preferentemente al menos el 96 %, incluso más preferentemente al menos el 97 %, incluso más preferentemente al menos el 98 %, incluso más preferentemente al menos el 99 %, muy preferentemente el 100 % de homología de secuencia con el polipéptido de i) y que comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional; o
iii. cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprenda al menos 334 aminoácidos contiguos de cualquiera de tales péptidos de i) o ii), y en donde cualquiera de tales péptidos comprende inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional,
y/o
en donde tal proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene al menos el 95 %, incluso más preferentemente al menos el 96 %, incluso más preferentemente al menos el 97 %, incluso más preferentemente al menos el 98 %, incluso más preferentemente al menos el 99 %, muy preferentemente el 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 62 a 137 o 9 a 46.
Más particularmente, el virus H5N1 de un clado distinto comprende preferentemente la proteína H5 (2) que consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente al menos el 96 %, más preferentemente al menos del 97 %, aún más preferentemente al menos el 98 %, aún más preferentemente al menos el 99 %, o preferente en particular el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID nO: 68, 73, 106, 111, 15 o 20, y en donde tal proteína H5 (2) que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73, 111 o 20 es en particular más preferente.
Preferentemente, el virus H5N1 de un clado distinto comprende en particular un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 %, preferentemente al menos el 96 %, más preferentemente al menos del 97 %, aún más preferentemente al menos el 98 %, aún más preferentemente al menos el 99 %, o preferente en particular el 100 % homóloga con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 68, 73, 106, 111, 15 o 20, y en donde tal proteína H5 (2) que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73, 111 o 20 es en particular más preferente.
En particular, la presente divulgación está dirigida a la proteína H5 (1) descrita en el presente documento para uso en un método para tratar o prevenir infecciones
(A) por el virus H5N1 de Subclado A de origen norteafricano, a saber, una infección con un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con la alternativa (a) como se describe en el presente documento, en particular de acuerdo con (a) de la reivindicación 15 o 16, o que comprende una proteína H5 de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17 en relación con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 62 a 72, 100 a 110, 9 a 19, o 95 o 96, 133 o 134, 42 o 43,
o
(B) por el virus H5N1 de Subclado B de origen norteafricano, a saber, una infección con un virus H5N1 que comprende una proteína H5 que tiene los aminoácidos de acuerdo con la alternativa (b) o (c) como se describe en el presente documento, en particular de acuerdo con (b) o (c) de la reivindicación 15 o 16, o que comprende una proteína H5 de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17 en relación con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 82 a 94, 111 a 132, 20 a 41, o 97 a 99, 135 a 137, o 44 a 46.
En particular, la presente divulgación está dirigida a la proteína H5 (1) descrita en el presente documento para uso en un método para tratar o prevenir infecciones
(A) por el virus H5N1 de Subclado A de origen norteafricano, a saber, una infección con un virus H5N1 que comprende polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con la alternativa (a) como se describe en el presente documento, en particular de acuerdo con (a) de la reivindicación 15 o 16, o una infección con un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17 en relación con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 62 a 72, 100 a 110, 9 a 19, o 95 o 96, 133 o 134, 42 o 43,
o
(B) por el virus H5N1 de Subclado B de origen norteafricano, a saber, una infección con un virus H5N1 que comprende polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con la alternativa (b) o (c) como se describe en el presente documento, en particular de acuerdo con (b) o (c) de la
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reivindicación 15 o 16, o una infección con un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 15, 16 o 17 en relación con una cualquiera de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 82 a 94, 111 a 132, 20 a 41, o 97 a 99, 135 a 137, o 44 a 46.
Preferentemente, la presente divulgación se refiere también a moléculas de ácido nucleico, que codifican cualquiera de las proteínas H5 (1) como se describe anteriormente, para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de un clado distinto. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico son moléculas de ARN, ADN o ADNcopia (c). Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc que codifica una proteína H5 o cualquiera de las formas modificadas de la proteína H5, incluyendo cualquier deleción, sustitución y/o mutante de inserción de la proteína H5, en donde las proteínas H5 tienen el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+).
Preferentemente, la presente divulgación se refiere también a una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc que codifica cualquier parte de la proteína H5 (1), lo que significa que codifica cualquier fragmento peptídico que muestre propiedades antigénicas en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, como se describe anteriormente, y que tenga al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+). Habitualmente, tales moléculas de ácido nucleico que codifican una parte antigénica de la proteína H5, comprenden 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 o muy preferentemente 315 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína H5 como se mencionó anteriormente, modificada o no modificada, y que muestra propiedades antigénicas en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, como se describe en el presente documento.
Anteriormente se describen partes antigénicas adicionales de la proteína H5 (1). Es del conocimiento común de un experto en la materia la construcción de tales moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ADNc que codifican la parte antigénica de la proteína H5 como se describe anteriormente. Esto también incluye, pero sin limitación, la construcción de moléculas de ácido nucleico, preferentemente de moléculas de ADNc, que codifican las partes antigénicas de la proteína H5 como se menciona anteriormente, incluyendo los mutantes de deleción de la proteína H5, que comprende:
i. al menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 o muy preferentemente 24 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que rodea e incluye la secuencia codificante que codifica el aminoácido 223N; y
ii. al menos 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 o muy preferentemente 24 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que rodea e incluye la secuencia codificante que codifica la modificación 328K+, y
iii. en donde cualquiera de tal parte antigénica de la proteína H5 muestra inhibición de la hemaglutinina en un ensayo de inhibición de hemaglutinina convencional, como se describe en el Ejemplo 2.
Preferentemente, los nucleótidos circundantes de los nucleótidos que codifican los aminoácidos 223N y/o 328K+, que codifican la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5.
Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico preferentes que codifican la proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación son:
i. cualquiera de las mencionadas anteriormente que codifican el aminoácido 223N y la modificación 328K+; i. cualquiera de las mencionadas anteriormente que codifican el aminoácido 94N/223N y la modificación 328K+;
iii. cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de origen aviar que codifican el aminoácido 223N, y la
modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que
se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
iv. cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de origen aviar que codifican los aminoácidos 94N/223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
v. cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de origen aviar que codifican los aminoácidos 155N/223N y la
modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que
se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
vi. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 de origen aviar que tiene el aminoácido 120N/155N/223N y la modificación 328K+, en donde origen aviar significa que la secuencia de H5 procede de un aislado de virus que se aisló originalmente de aves de corral infectadas con el virus de la gripe aviar de tipo 5; o
vii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/223N y la modificación 328K+; o
viii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/155N/223N y la modificación 328K+; o;
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ix. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene las modificaciones 94N/120N/155N/223N y la modificación 328K+; o
x. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene las modificaciones 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 123 - 125: SDH
c. aa 128 - 130: SSG
d. aa 138 - 140: GSS
e. aa 226 - 228: MDF
f. aa 270 - 272: EVE
g. aa 309 - 311: NKL; o
xi. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene el aminoácido 223N, la modificación 328K+ y uno o más de los siguientes agrupamientos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:
a. aa 93 - 95: GNF
b. aa 128 - 130: SSG
c. aa 138 - 140: GSS; o
xii. cualquier molécula de ácido nucleico que codifica la proteína H5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
Adicionalmente, las proteínas H5 (1) preferentes como se divulga por la presente incluyen las proteínas H5 como se describe en Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, pág. 12915-12920 de 6 de septiembre de 2005, en donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones descritas anteriormente, al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+). La presente divulgación se refiere también a cualquier molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADNc que codifica cualquiera de tales proteínas descritas por Hoffmann et al, PNAS, vol. 106, no.36, pág. 1291512920 de 6 de septiembre de 2005, en donde las proteínas H5 incluyen una o más de las modificaciones descritas anteriormente, al menos el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+).
Los métodos de cómo introducir cualquiera de las modificaciones mencionadas anteriormente dentro de la secuencia de nucleótidos, incluyendo la secuencia codificante de la proteína H5 de un virus de la gripe, son bien conocidos en la técnica. Puede modificarse de acuerdo con la divulgación la secuencia genómica de todo el virus de la gripe, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en el documento US 6.951.754, con referencias adicionales.
Adicionalmente, para modificar una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno como se describe en el presente documento se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante, que están dentro de las habilidades en la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, ed. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994).
La presente divulgación también se refiere a un vector que comprende cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico como se describe anteriormente. En otras palabras, la presente divulgación se refiere a un vector, que incluye la secuencia codificante de cualquiera de tales proteínas H5 (1) o parte de las mismas como se describe anteriormente. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión, que permita la expresión de cualquiera de tales proteínas H5 (1) o parte de las mismas como se describe anteriormente. Los vectores de acuerdo con la divulgación son los que son adecuados para la transfección o infección de bacterias, levaduras o células animales, in vitro o in vivo.
Los vectores y métodos para fabricar y/o usar vectores (o recombinantes) para expresión pueden ser por, o análogos a, los métodos divulgados en: las patentes de Estados Unidos N.° 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235, 382.425, las
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publicaciones PCT WO 94/16716, documento WO 96/39491, documento WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, Octubre de 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, Octubre de 1996, Smith et al., Patente de Estados Unidos n.° 4.745.051, (baculovirus recombinante), Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dic., 1983, Vol. 3, n.° 12, pág. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology May. de 1984, Vol. 4, n.° 3, pág. 399-406; documento EPA0 370 573, Solicitud de Estados Unidos n.° 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986, Publicación de patente EP N.° 265785, Patente de Estados Unidos n.° 4.769.331 (herpesvirus recombinante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, Octubre de 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, Octubre de 1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, Octubre de 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, Octubre de 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991; Patentes de Estados Unidos n.° 5.591.439, 5.552.143, documento WO 98/00166, solicitudes de Estados Unidos permitidas N.° de serie 08/675.556 y 08/675.566, ambas presentadas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors", Seminars in Virology (Vol. 3) pág. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, pág. 3861-65, Graham, Tibtech 8,85-87, abril de 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434, documento PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 y McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, octubre de 1996 y Patentes de Estados Unidos N.° 5.591.639, 5.589.466 y 5.580.859, así como los documentos WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang et al., Nature y Furth et al. Analytical Biochemistry, con respecto a los vectores de expresión de ADN, entre otros. Véase también el documento WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739,1998 (sistema de expresión de lentivirus); Sanford et al., Patente de Estados Unidos n.° 4.945.050; Fischbach et al. (Intracel), documento WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, pág. 271-283 (1997), (sistemas de vectores de ADN); Szoka et al., Patente de Estados Unidos N.° (método de inserción de ADN en células vivas); McCormick et al., Patente de Estados Unidos n.° 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y la Patente de Estados Unidos N.° 5.928.913 (vectores para el suministro de genes), así como otros documentos citados en el presente documento.
Un vector vírico, por ejemplo, seleccionado de virus del herpes porcino, tales como el virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, poxvirus, en especial virus de la variolovacuna, avipoxvirus, virus de la viruela del canario y virus de la viruela porcina, así como los vectores de ADN (plásmidos de ADN), se emplean ventajosamente en la práctica de la divulgación.
Métodos de producción de las proteínas H5 (1) de acuerdo con la presente invención
La presente divulgación proporciona métodos de producción y/o recuperación de grandes cantidades de proteína H5 recombinante: i) permitiendo la infección de células susceptibles en cultivo con un vector vírico recombinante que contiene secuencias de ADN codificantes de H5, en donde la proteína H5 se expresa mediante el vector vírico recombinante, y ii) recuperando después de eso la proteína H5 del cultivo celular. Altas cantidades de proteína H5 significa, pero sin limitación, más de aproximadamente 20 pg/ml de cultivo celular, preferentemente más de aproximadamente 25 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 30 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 40 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 50 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 60 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 80 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 100 pg/ml, incluso más preferente más de aproximadamente 150 pg/ml, muy preferente, más de aproximadamente 190 pg/ml.
Preferentemente, la proteína H5 (1) se recupera recogiendo las células SF+ que expresan la proteína H5 enteras (es decir, intactas).
Las células preferentes son las susceptibles a la infección con un vector vírico recombinante apropiado, que contiene un ADN de H5 y que expresa la proteína H5 (1). Preferentemente, las células son células de insecto, y más preferentemente, incluyen las células de insectos vendidas bajo la marca comercial células de insecto SF+ (Protein Sciences Corporation), Meriden6 CT). Los cultivos celulares preferentes tienen un recuento de células de entre aproximadamente 0,3 - 2,0 x 106 células/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,35 - 1,9 x 106 células/ml, aún más preferentemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 células/ml, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/ml, y muy preferentemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/ml.
Los vectores víricos preferentes incluyen baculovirus tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), en particular, siempre que las células de producción sean células de insecto. Aunque es preferente el sistema de expresión de baculovirus, los expertos en la materia entenderán que otros sistemas de expresión funcionarán para los fines de la presente divulgación, a saber, la expresión de H5 en el sobrenadante de un cultivo celular.
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Dichos otros sistemas de expresión pueden precisar el uso de una secuencia señal para provocar la expresión de H5 en los medios.
Los expertos en la materia podrán determinar los medios de cultivo apropiados, siendo los medios de cultivo preferentes los medios de células de insectos sin suero, tales como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y similares.
El vector vírico recombinante que contiene las secuencias de ADN de H5 tiene una multiplicidad de infección (MOI) preferente de entre aproximadamente 0,03 - 1,5, más preferentemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, aún más preferentemente de aproximadamente 0,09 - 1,1, y muy preferentemente de aproximadamente 0,1 - 1,0, cuando se usa para la infección de las células susceptibles. Preferentemente, las MOI mencionadas anteriormente se refieren a un ml de fluido de cultivo celular. Preferentemente, el método descrito en el presente documento comprende la infección de 0,35 - 1,9 x 106 células/ml, aún más preferentemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 células/ml, aún más preferentemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/ml y muy preferentemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/ml con un vector vírico recombinante que contiene un ADN de H5 y que expresa la proteína H5 que tiene una MOI (multiplicidad de infección) de entre aproximadamente 0.03 - 1.5, más preferentemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, aún más preferentemente de aproximadamente 0,09 - 1,1, y muy preferentemente de aproximadamente 0,1 - 1,0.
Después, las células infectadas se incuban durante un período de hasta diez días, más preferentemente de aproximadamente dos días hasta aproximadamente diez días, aún más preferentemente de aproximadamente cuatro días a aproximadamente nueve días, y muy preferentemente de aproximadamente cinco días a aproximadamente ocho días. Las condiciones de incubación preferentes incluyen una temperatura de entre aproximadamente 22 - 32 °C, más preferentemente de aproximadamente 24 - 30 °C, aún más preferentemente de aproximadamente 25 - 29 °C, incluso más preferentemente de aproximadamente 26 - 28 °C, y muy preferentemente de aproximadamente 27 °C. Preferentemente, las células SF + se observan después de la inoculación en cuanto a los cambios característicos inducidos por baculovirus. Dicha observación puede incluir el control de las tendencias de densidad celular y la disminución de la viabilidad durante el período posinfección. Se encontró que el título vírico máximo se observa 3-5 días después de la infección y la expresión de la proteína H5 máxima en las células se obtiene entre los días 5 y 8, y/o cuando la viabilidad celular disminuye a menos del 10 %.
Por lo tanto, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método de producción y/o recuperación de proteína H5 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un número de células susceptibles (véase más arriba) en cultivo, con un vector vírico recombinante, con una MOI como se definió anteriormente, ii) expresando proteína H5 mediante el vector vírico recombinante y iii) recuperando después de eso la proteína H5 de las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección, y/o cuando la viabilidad celular disminuya a menos del 10 %. Preferentemente, el vector vírico recombinante es un baculovirus recombinante que contiene secuencias de ADN codificantes de H5 y las células son células SF+. Adicionalmente, es preferente que el cultivo se examine periódicamente en cuanto a evidencia macroscópica y microscópica de contaminación o cambios atípicos de la morfología celular durante el período posinfección. Cualquier cultivo que presente contaminación debe descartarse.
Para la recuperación de la proteína H5 (1) que se usará en una composición inmunogénica o inmunológica, tal como una vacuna, es preferente la inclusión de una etapa de inactivación para inactivar el vector vírico.
Una "composición inmunogénica o inmunológica" se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno que suscita una respuesta inmunológica en el hospedador, una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos frente a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, linfocitos T supresores y/o linfocitos T citotóxicos, y/o linfocitos T gamma-delta, dirigido específicamente frente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el hospedador presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de forma que se potenciará la resistencia frente a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o la falta de los síntomas habitualmente presentados por un hospedador infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título vírico reducido en el hospedador infectado.
Como se usa en el presente documento, "vacuna" se refiere al término tal como lo usan los expertos en la materia. Más particularmente, "vacuna" se refiere a una composición inmunogénica que, cuando se administra a un animal que lo necesita, da como resultado una reducción de la incidencia o gravedad de los signos clínicos de la infección por virus de la gripe, hasta la inclusión de la prevención completa de tales signos clínicos. Preferentemente, la reducción de la incidencia o gravedad es al menos del 10 %, más preferentemente al menos del 20 %, aún más preferentemente al menos el 30 %, incluso más preferentemente al menos el 40 %, más preferentemente al menos del 50 %, aún más preferentemente al menos el 60 %, incluso más preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos del 80 %, aún más preferentemente al menos el 90 %, incluso más preferentemente al menos del 95 %, y muy preferentemente del 100 % en comparación con un animal o grupo de animales que no recibieron las composiciones de la presente divulgación, pero que estuvieron expuestos a niveles infecciosos de
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virus de la gripe que normalmente darían como resultado una infección por virus de la gripe que da como resultado presentar signos clínicos.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un método de producción y/o recuperación de proteína H5 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un número de células susceptibles (véase más arriba) en cultivo, con un vector vírico recombinante, con una MOI como se definió anteriormente, ii) expresando proteína H5 mediante el vector vírico recombinante, iii) recuperando la H5 expresada en células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección, y/o cuando la viabilidad celular disminuya a menos del 10 % y iv) inactivando el vector vírico recombinante.
Preferentemente, esta inactivación se hace justo antes o justo después de la etapa de filtración, y siendo el tiempo preferente para la inactivación después de la etapa de filtración. Para los fines de la presente invención se puede usar cualquier método de inactivación convencional. Por lo tanto, la inactivación puede realizarse mediante tratamientos químicos y/o físicos. En formas preferentes, se determina el volumen de los fluidos de recolección y la temperatura se lleva a entre aproximadamente 32 - 42 °C, más preferentemente entre aproximadamente 34 - 40 °C, y muy preferentemente entre aproximadamente 35 - 39 °C. Los métodos de inactivación preferentes incluyen la adición de etilenimina binaria ciclada (BEI), preferentemente en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, aún más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, aún más preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM, muy preferentemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición a los fluidos de una solución de bromhidrato de 2-bromoetilenamina, preferentemente de aproximadamente 0,4 M, que se ha ciclado a etilenimina binaria (BEI) 0,2 M en NaOH 0,3 N, para obtener una concentración final de BEI de aproximadamente 5 mM. Preferentemente, a continuación los fluidos se agitan de forma continua durante 72 - 96 horas y los fluidos de recolección inactivados se pueden reservar congelados a - 40 °C o menos, o entre aproximadamente 1 - 7 °C. Después de acabada la inactivación, se añade una solución de tiosulfato de sodio preferentemente a 1,0 M, para neutralizar cualquier BEI residual. Preferentemente, el tiosulfato de sodio se añade en una cantidad equivalente en comparación con el BEI añadido antes de la inactivación. Por ejemplo, en el caso en que se añada BEI a una concentración final de 5 mM, se añade una solución de tiosulfato de sodio 1,0 M para dar una concentración final mínima de 5 mM, para neutralizar cualquier BEI residual.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un método de producción de proteína H5 recombinante, preferentemente en las cantidades descritas anteriormente, i) permitiendo la infección de un número de células susceptibles (véase más arriba) en cultivo, con un vector vírico recombinante, con una MOI como se definió anteriormente, ii) expresando proteína H5 mediante el vector vírico recombinante, iii) recuperando la H5 expresada en células las obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección, y/o cuando la viabilidad celular disminuya a menos del 10 % y iv) inactivando el vector vírico recombinante. Preferentemente, el vector vírico recombinante es un baculovirus que contiene secuencias de ADN codificantes de H5 y las células son células SF+. Las etapas de inactivación preferentes son las descritas anteriormente. Preferentemente, la inactivación se realiza entre aproximadamente 35 - 39 °C y en presencia de BEI 2 a 8 mM, aún más preferente, en presencia de BEI aproximadamente 5 mM.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgación, el método descrito anteriormente también incluye una etapa de neutralización después de la etapa iv). Esta etapa v) comprende la adición de una cantidad equivalente de un agente que neutraliza el agente de inactivación dentro de la solución. Preferentemente, si el agente de inactivación es BEI, es preferente la adición de tiosulfato de sodio en una cantidad equivalente. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la etapa v) comprende la adición de una solución de tiosulfato de sodio a una concentración final de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM, preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, aún más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, aún más preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM, muy preferentemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es BEI.
En formas preferentes y especialmente en formas que usarán la proteína H5 recombinante en una composición inmunogénica, tal como una vacuna, se analizará la inactivación de cada lote de proteína H5 recogida por pasaje en células de insecto susceptibles a baculovirus dependientes de anclaje, tales como las células Sf9. En una forma preferente de este análisis, se inoculan 150 cm2 de una monocapa de cultivo celular apropiada con 1,0 ml de fluidos H5 inactivados y se mantienen a 25 - 29 °C durante 14 días con al menos dos pasajes. Al final del periodo de mantenimiento, las monocapas de células se examinan en cuanto al efecto citopático (ECP) típico del baculovirus de H5. Preferentemente, también se usan controles de virus positivos. Dichos controles pueden consistir en un cultivo de células Sf9 inoculadas con un baculovirus de H5 de referencia no inactivado y un matraz de células Sf9 que queda sin inocular. Después de la incubación y el pasaje, la ausencia de células infectadas por virus en los fluidos víricos tratados con BEI constituiría una prueba de inactivación satisfactoria. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar el ECP típico de baculovirus de H5 y el matraz no inoculado no debería presentar evidencia de ECP de baculovirus de H5. Como alternativa, al final del periodo de mantenimiento, las muestras de sobrenadante podrían recogerse e inocularse en una placa de 96 pocillos de Sf9, que se han cargado con células Sf9, y después mantenerse a 25 - 29 °C durante 5 - 6 días. Después, la placa se fija y se tiñe con anticuerpo anti-H5 conjugado con FITC, o con cualquier anticuerpo marcado dirigido a proteínas específicas de
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baculovirus (es decir, gp64). La ausencia de ECP, de expresión de H5 o de expresión proteínas específicas de baculovirus (es decir, gp64) en los fluidos víricos tratados con BEI, constituye una prueba de inactivación satisfactoria. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar actividad de ECP y de EIF, y el matraz no inoculado no debería presentar ninguna evidencia de ECP de baculovirus de H5 y no contener actividad de EIF.
Por lo tanto, un aspecto adicional descrito en el presente documento, se refiere a una prueba de inactivación para determinar la eficacia de la inactivación del vector vírico de recombinación que expresa la proteína H5 (1), que comprende las etapas: i) poner en contacto al menos una porción del fluido de cultivo que contiene el vector vírico recombinante con un agente inactivante, preferentemente como se describe anteriormente, ii) añadir un agente de neutralización para neutralizar el agente inactivante, preferentemente como se describe anteriormente, y iii) determinar la infectividad residual mediante los ensayos como se describe anteriormente.
Después de la inactivación, la cantidad relativa de proteína H5 recombinante en una muestra se puede determinar de varias maneras. Los métodos de cuantificación preferentes incluyen densitometría por SDS-PAGE, ELISA y estudios de vacunación animal que correlacionan cantidades conocidas de vacuna con los resultados clínicos (serología, etc.). Cuando se utiliza SDS-PAGE para la cuantificación, el material de muestra que contiene una cantidad desconocida de proteína H5 recombinante se procesa en un gel, junto con muestras que contienen distintas cantidades conocidas de proteína H5 recombinante. Después, se puede producir una curva patrón basada en las muestras conocidas y se puede determinar la cantidad de H5 recombinante en la muestra desconocida por comparación con esta curva patrón. Debido a que los ELISA son generalmente reconocidos como el criterio de la industria para la cuantificación del antígeno, estos se prefieren para la cuantificación.
Vacunas que comprenden proteínas H5 (1) o moléculas de ácido nucleico o vectores que las codifican
Se divulga una combinación de
(a) la proteína H5 (1) descrita en el presente documento y
(b) un virus de la enfermedad de Newcastle inactivado
para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de un clado distinto, en particular para su uso en cualquier método para tratar o prevenir infecciones por un virus H5N1 de un clado distinto, como se describe en el presente documento.
En lo sucesivo en el presente documento, tal combinación también se denomina "la combinación descrita en el presente documento".
De acuerdo con la divulgación, se entiende que la combinación descrita en el presente documento preferentemente se incluye en una vacuna de combinación multivalente o que la combinación descrita en el presente documento está dirigida en particular a una vacunación combinada, más particularmente a una administración de la proteína H5 (1) descrita en el presente documento y del virus de la enfermedad de Newcastle inactivado en un máximo de 24 horas a un animal, en particular aves de corral, o un ser humano que lo necesite.
Preferentemente, el virus de la enfermedad de Newcastle inactivado es un virión de la enfermedad de Newcastle completo inactivado.
Preferentemente, el virus de la enfermedad de Newcastle inactivado es un virus de la enfermedad de Newcastle inactivado obtenido por inactivación de un virus de la enfermedad de Newcastle que comprende un polinucleótido de ARN que tiene al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos del 90 %, aún más preferentemente al menos el 95 % o en particular el 100 % de identidad de secuencia con una copia de ARN del polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO: 139 (secuencia de ADNc del virus de la cepa LaSota), que se ha inactivado.
En particular, el virus de la enfermedad de Newcastle inactivado es un virus de la enfermedad de Newcastle de la cepa LaSota inactivado.
Preferentemente, el virus de la enfermedad de Newcastle inactivado es un virus de la enfermedad de Newcastle que se ha inactivado con un reactivo seleccionado del grupo que consiste en formaldehído, etilenimina binaria (BEI), beta-propio-lactona (BPL) y combinaciones de los mismos.
La cantidad de virus de la enfermedad de Newcastle inactivado en la combinación descrita en el presente documento es preferentemente de entre 102 y 1010 equivalentes de dosis infecciosa de huevo (DIH50), preferentemente entre 106 y 109 DIH50, en particular, preferentemente entre 107 y 109 DIH50. La cantidad de la proteína H5 (1) en la combinación descrita en el presente documento es preferentemente la misma que se menciona en lo sucesivo en el presente documento.
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La cantidad de proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación es preferentemente de entre 10 y 1000 unidades de hemaglutinación (UHA) por dosis, más preferentemente de entre 50 y 950 UHA por dosis, incluso más preferentemente de entre 100 y 900 UHA por dosis, incluso más preferentemente de entre 200 y 800 UHA por dosis, incluso más preferentemente de entre 300 y 700 UHA por dosis, aún más preferentemente de entre 300 y 500 UHA por dosis.
De acuerdo con aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas en general, que comprenden,
i. una o más de las proteínas H5 (1) como se describe en el presente documento o la combinación descrita en el
presente documento;
ii. una o más de las moléculas de ácido nucleico como se describe en el presente documento, que codifican
cualquiera de tales proteínas H5 (1); y/o
iii. uno o más de los vectores como se describe en el presente documento, incluyendo cualquiera de tales
moléculas de ácido nucleico y que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1) como se describe en el presente
documento; y
iv. un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La expresión "composición farmacéutica", "composición de vacuna/producto farmacéutico" como se describe en el presente documento, incluye, pero sin limitación, vacunas para la reducción o prevención de una infección o una composición de materia para el tratamiento y la disminución de una infección.
La preparación de vacunas basadas en ácido nucleico, preferentemente vacunas de ADNc, que codifican la hemaglutinina del virus de la gripe, se describen, por ejemplo, en Deck et al, Vaccine 1997; 15(1):71-78/ Ulmer et al., Science 1993; 259:1745-1749; Ulmer et al., Vaccine 1994; 12(16):1541-1544. Cualquiera de esos métodos puede usarse para la producción de vacunas basadas en ácidos nucleicos, preferentemente vacunas de ADNc, que codifiquen una proteína H5 del virus de la gripe como se describe en el presente documento.
Además, una vacuna que comprende la proteína H5 (1) o partes de la misma como se describe en el presente documento, puede producirse mediante enfoques convencionales, por ejemplo mediante técnicas de expresión recombinante o mediante técnicas de purificación y separación bioquímica. Las técnicas de expresión recombinante, incluyendo la expresión en células de insectos, son bien conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, ed. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Ejemplos adicionales de sistemas de expresión recombinante bien establecidos son los sistemas de expresión bacterianos tales como de E. coli o B. subtilis, los sistemas de expresión basados en levaduras tales como S. cerevisiae o S. pombe, o los sistemas de expresión en células de mamífero, tales como los sistemas de expresión basados en BHK, CHO y/o basados en NS0. Tales sistemas son bien conocidos en la técnica y disponibles de forma general, por ejemplo, en el mercado, a través de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, EE.UU. Se describen estrategias de expresión adicionales por ejemplo en Lüschow et al., Vaccine n.° 19 (2001), pág. 4249-4259, o Veit et al., PNAS vol. 103 (2006), pág. 8197-8202. Adicionalmente, los sistemas de virus adeno- asociados recombinantes están bien establecidos y se describen, por ejemplo, en el documento US 5.436.146 o WO200203872 con referencias adicionales. Además, los sistemas de expresión basados en (pox)virus de la variolovacuna, por ejemplo, como se describe en el documento US 6.265.183, con referencias adicionales, también están bien establecidos y son adecuados para producir antígeno recombinante (o antígenos recombinantes), una composición antigénica (o composición antigénicas), como se usa de acuerdo con la descripción. Sistemas de expresión adecuados adicionales hacen uso de papovavirus recombinantes, tales como SV40, virus de la viruela aviar, virus de la seudorrabia y retrovirus.
Las composiciones farmacéuticas/de vacuna relevantes como se describen en el presente documento, también puede comprender virus un inactivado que comprenda proteína H5 (1) como se describe en el presente documento, una versión no patógena de un virus vivo que comprenda proteína H5 (1) como se describe en el presente documento, una preparación de y/o fragmentos de un virus, en donde dicha preparación y/o fragmento comprenden la proteína H5 (1) como se describe en el presente documento.
El experto en la materia conoce componentes adicionales que pueden estar comprendidos en dichas composiciones/vacunas junto con antígeno (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton). El experto puede usar soluciones estériles inyectables, fisiológicamente aceptables conocidas. Para preparar una solución lista para usar, están fácilmente disponibles soluciones isotónicas acuosas, tales como, por ejemplo, solución salina o las soluciones de proteínas plasmáticas correspondientes. La composición farmacéutica/vacuna puede estar presente como liofilizados o preparaciones secas, que se pueden reconstituir con
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una solución inyectable conocida directamente antes del uso, en condiciones estériles, por ejemplo como un kit de partes.
Además, las composiciones farmacéuticas/vacunas de la presente divulgación pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables. Como se usa en el presente documento, "un vehículo veterinariamente aceptable" incluye, pero sin limitación, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción y similares.
Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.
Un conservante, como se usa en el presente documento, se refiere a un agente activo antimicrobiológico, tal como por ejemplo Gentamicina, Merthiolate, y similares. En particular, la adición de un conservante es lo más preferente para la preparación de una composición multidosis. Los agentes activos antimicrobiológicos se añaden en concentraciones eficaces para evitar la contaminación microbiológica de la composición de interés o para la inhibición de cualquier crecimiento microbiológico dentro de la composición de interés.
Los "adyuvantes", como se usa en el presente documento, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua.
La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquida ligero (del tipo de la Farmacopea Europea); un aceite isoprenoide tal como escualano o escualeno; el aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos ramificados o alcoholes, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular, ésteres sorbitán, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de oleico, isosteárico, ricinoleico y ácido hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pág. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Ejemplos de emulsiones de aceite en agua adecuadas son los adyuvantes basados en Emulsigen, tales como EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, EE. UU.). Sorprendentemente, se ha descubierto que las composiciones farmacéuticas/vacunas que comprenden la proteína H5, preferentemente la proteína H5 recombinante como se describe en el presente documento, se han adyuvado de manera eficaz con emulsiones de aceite en agua, preferentemente con tales adyuvantes basados en Emulsigen, más preferentemente con EMULSIGEN® y EMULSIGEN-D®.
Además, es posible usar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.
Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos por el término carbomer (Phameuropa Vol. 8, n.° 2, junio de 1996). Los expertos en la materia también pueden referirse a la Patente de Estados Unidos N.° 2.909.462, que describe tales polímeros de acrílico reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, estando reemplazados los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferentes son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilenicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden ellos mismos contener otros sustituyentes, tal como metilo. Los productos vendidos con el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EE. UU.) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Entre ellos, pueden mencionarse Carbopol 974P, 934P y 971P. Es muy preferente el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto), que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferiblemente a pH fisiológico, para proporcionar la solución adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna.
Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímero de bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil lípido A, adyuvante de amina lipoidal
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Avridine, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o no), toxina colérica o dipéptido de muramilo entre muchos otros.
Preferentemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 |jg a aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 750 jg a aproximadamente 2,5 mg por dosis. Muy preferente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.
Las composiciones farmacéuticas/de vacuna, puede incluir adicionalmente uno o más agentes inmunomoduladores tales como, por ejemplo, interleucinas, interferones y otras citocinas. Las composiciones farmacéuticas/de vacunas también pueden incluir Gentamicina y Merthiolate. Aunque un experto en la materia puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos útiles, preferentemente las composiciones comprenden de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 2000 jg de adyuvante y preferentemente aproximadamente 250 ug/1 ml de dosis de la composición de vacuna. La presente divulgación contempla composiciones de vacuna que comprenden de aproximadamente 1 jg/ml hasta aproximadamente 60 jg/ml de antibióticos, y más preferentemente menos de aproximadamente 30 jg/ml de antibióticos.
La presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica/de vacuna que comprende
i. una cantidad terapéuticamente eficaz de una cualquiera de las proteínas H5 del virus de la gripe como se describe en el presente documento, en donde la proteína H5 tiene el aminoácido 223N y la modificación 328K+, en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 2 y en donde la modificación 328K+ significa que en la posición de aminoácido 328 de la proteína H5 se inserta una segunda lisina (K+); y
ii. adyuvantes farmacéuticamente aceptables como se describe anteriormente.
Preferentemente, el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en:
a) EMULSIGEN®, una emulsión de aceite en agua (a/a);
b) EMULSIGEN-D®, un aceite en agua (a/a) con bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA);
c) a Polygen, un copolímero
d) EMULSIGEN-P®, un aceite en agua (a/a) con un inmunoestimulante patentado
e) Carbigen es un polímero reticulado
f) EMULSIGEN-75®, un doble adyuvante, comprende un aceite en agua (a/a) con un polímero reticulado
g) ISA 70 es uno de agua en aceite (a/a)
Muy preferentemente, los adyuvantes son una emulsión de aceite en agua tal como un adyuvante basado en emulsigen seleccionado del grupo que consiste en EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®, EMULSIGEN® y eMuLSIGEN-P®. Muy preferentemente se usan en la formulación de la presente invención EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P®.
De acuerdo con aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas/de vacuna como se divulgan por la presente, comprenden uno o más antígenos. Preferentemente, el antígeno adicional es un antígeno de un patógeno de aves de corral o de mamífero. Preferentemente, el antígeno adicional es un antígeno de virus de la gripe adicional, tal como la hemaglutinina H5, H7, H9 o cualquier otra hemaglutinina del virus de la gripe, en donde H5 es preferentemente una proteína H5 de un virus H5N1 de un clado distinto al clado 1, en particular de un virus H5N1 de origen norteafricano, tal como la proteína H5 (2) descrita en el presente documento. El antígeno adicional (o los antígenos adicionales) se pueden añadir en una forma purificada, como parte de una preparación antigénica, en forma de un microorganismo destruido o en forma de un microorganismo vivo modificado.
El término "antígeno", como se usa en el presente documento significa, pero sin limitación, péptidos, polipéptidos, glucopéptidos o polisacáridos que tienen la capacidad de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento antigénico del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígeno de linfocitos T, para suscitar, activar o estimular una respuesta inmunitaria dirigida a dicho antígeno, en un hospedador al que se le administra dicho antígeno. El término "antígeno" también se refiere también a moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ADN o ARN, cada una de las cuales codifica y expresa un péptido, polipéptido o glucopéptido que tiene la capacidad de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento antigénico del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígeno de linfocitos T, para suscitar, activar o estimular una respuesta inmunitaria frente al antígeno que codifica la molécula de ácido nucleico. El antígeno usado para la preparación de la composición farmacéutica que se usa de acuerdo con la invención es un microorganismo o una parte antigénica y/o preparación de dicho microorganismo. A este respecto, el término "inmunización", como se usa en el presente documento, significa, pero sin limitación, cualquier causa o potenciación del sistema inmunitario. La expresión "respuesta inmunitaria" ya se ha descrito anteriormente.
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Las estrategias de administración para vacunas para la gripe son bien conocidas en la técnica. Se contemplan estrategias de vacunación en las mucosas para vacunas de virus inactivados y atenuados. Aunque la mucosa puede ser el objetivo del suministro local de una vacuna, para suministrar proteínas inmunogénicas a la mucosa se han empleado diversas estrategias.
Preferentemente, la vacuna puede administrarse en una mezcla con, o como un conjugado o proteína de fusión quimérica con, toxina colérica, tal como B de la toxina colérica o una quimera de A/B de la toxina colérica (Hajishengallis, J Immunol., 154:4322-32, 1995; Jobling y Holmes, Infect Immun., 60:4915-24, 1992). Se han descrito vacunas para las mucosas basadas en el uso de la subunidad B de la toxina colérica (Lebens y Holmgren, Dev Biol Stand 82: 215-27, 1994). Preferentemente, se puede preparar para la vacunación de la mucosa una mezcla con enterotoxina termolábil (TL).
Otras estrategias de inmunización de la mucosa incluyen encapsular el virus en microcápsulas (documentos US 5.075.109, US 5.820.883 y US 5.853.763) y el uso de un vehículo membranoso inmunopotenciador (documento WO 98/0558). La inmunogenicidad de los inmunógenos administrados por vía oral puede potenciarse usando glóbulos rojos (gr) o acromatocitos (documento US 5.643.577) o utilizando antígeno de lengua azul (documento US 5.690.938).
De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica/de vacuna como se describe anteriormente, preferentemente un método de producción de una vacuna que comprende una proteína H5 recombinante expresada en baculovirus como se describe anteriormente. En general, este método incluye las etapas de transfectar una construcción en un virus, en donde la construcción comprende i) ADNc de H5 recombinante como se describe en el presente documento, ii) infectar células en medios de cultivo con el virus transfectado, iii) provocar que el virus exprese la proteína H5 recombinante como se describe en el presente documento, iv) recuperar la proteína H5 expresada a partir del cultivo v) y preparar la composición mezclando la proteína H5 expresada con un adyuvante adecuado y/u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes preferentes son los descritos anteriormente. Por lo tanto, de acuerdo con aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica, tal como, por ejemplo, una vacuna, para invocar una respuesta inmunitaria frente a infecciones por virus de la gripe comprende i) preparar y recuperar proteína H5, y ii) mezclar esto con un adyuvantes adecuados.
Además, la composición de vacuna de la presente divulgación también puede incluir diluyentes, agentes isotónicos, estabilizadores, y/o conservantes. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir sales orgánicas o inorgánicas, por ejemplo, cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, sacáridos, trehalosa, manitol, sacarosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros. Los adyuvantes adecuados son los descritos anteriormente.
Uso medicinal de cualquiera de tales proteínas H5 (1), moléculas de ácido nucleico, vectores, vacunas y combinaciones descritas en el presente documento
Las proteínas H5 (1), como se divulga por la presente, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1), los vectores que comprenden cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1) como se describe en el presente documento, y cualquier composición farmacéutica/de vacuna que comprenda cualquiera de tales proteínas H5 (1), molécula de ácido nucleico o vector, o la combinación descrita en el presente documento, pueden usarse como un medicamento, preferentemente para el tratamiento y la profilaxis de infecciones, provocadas por el virus de la gripe, más preferentemente por el virus de la gripe A. Las proteínas H5 (1), como se divulga por la presente, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1) como se describe en el presente documento, y cualquier composición farmacéutica/de vacuna que comprende cualquiera de tal proteína H5 (1), molécula de ácido nucleico o vector, como se describe en el presente documento, o la combinación descrita en el presente documento, pueden usarse para el tratamiento o la profilaxis de seres humanos, así como en medicina veterinaria. Cuando se usan en medicina veterinaria, el tratamiento de aves de corral, preferentemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como mamíferos, preferentemente los cerdos, ganado bovino, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámsteres, ratones y similares, es preferente.
En términos de la presente invención, "profilaxis" se refiere a la reducción de la incidencia o gravedad de los signos clínicos de la infección por virus de la gripe, hasta la inclusión de la prevención completa de tales signos clínicos. Preferentemente, la reducción de la incidencia o gravedad es al menos del 10 %, más preferentemente al menos del 20 %, aún más preferentemente al menos del 30 %, incluso más preferentemente al menos del 40 %, más preferentemente al menos del 50 %, aún más preferentemente al menos del 60 %, incluso más preferentemente al menos del 70 %, más preferentemente al menos del 80 %, aún más preferentemente al menos del 90 %, incluso más preferentemente al menos del 95 %, y muy preferentemente del 100 % en comparación con un animal o grupo
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de animales que no recibieron las composiciones de la presente invención, pero que estuvieron expuestos a niveles infecciosos de virus de la gripe que normalmente darían como resultado una infección por virus de la gripe que da como resultado presentar signos clínicos.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto la presente divulgación se refiere al uso de proteínas H5 (1) como se divulga por la presente, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1), los vectores que comprenden cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1) como se describe en el presente documento, y cualquiera de las composiciones farmacéuticas/de vacuna que comprendan cualquiera de tales proteínas H5 (1), molécula de ácido nucleico o vector, como se describe en el presente documento o la combinación descrita en el presente documento, pueden usarse como un medicamento, preferentemente como un medicamento para seres humanos y/o como un medicamento veterinario, preferentemente para aves de corral, en particular para pollos.
Además, las proteínas H5 (1), como se divulga por la presente, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de tales proteínas H5 (1), los vectores que comprenden cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier proteína H5 (1), tal como se describe en el presente documento, o la combinación descrita en el presente documento, pueden usarse para la preparación de una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, preferentemente de una vacuna de una sola inyección o una vacuna de una dosis, para la profilaxis o el tratamiento de infecciones provocadas por un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento. Como se ha mencionado anteriormente, las composiciones farmacéuticas/composiciones de vacuna pueden usarse para el tratamiento y/o la profilaxis de seres humanos, así como para el tratamiento y/o la profilaxis de animales, tales como aves de corral, preferentemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como mamíferos, preferentemente los cerdos, ganado bovino, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámsteres, ratones y similares.
De acuerdo con aspecto adicional, la presente divulgación también se refiere a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus de la gripe provocadas por el virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento, en donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína H5 (1) como se describe en el presente documento o de la combinación descrita en el presente documento, a un sujeto que necesita tal tratamiento. Además, la presente divulgación también se refiere a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus de la gripe provocadas por el virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento, en donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier molécula de ácido nucleico de H5 o un vector como se describe en el presente documento, que codifique cualquier proteína H5 (1) como se describe en el presente documento, a un sujeto que necesita tal tratamiento. Adicionalmente, la presente divulgación también se refiere a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones por virus de la gripe provocadas por el virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto descrito en el presente documento, en donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna que comprende cualquiera de tales proteína H5 (1), molécula de ácido nucleico o vector, como se describe en el presente documento, a un sujeto que necesita tal tratamiento. El sujeto que lo necesite puede ser un ser humano así como un animal, preferentemente un ave de corral, incluso más preferentemente pájaros, pollos, patos, pavos o un mamífero, preferentemente cerdos, ganado bovino, caballo, foca, camello, perro, gato, hámster, ratón y similares.
Preferentemente, la administración, como se describe en el presente documento, es una administración de una sola inyección o una administración de una dosis.
Preferentemente, cuando se vacunan pollos, la proteína H5 como se describe en el presente documento puede usarse para la vacunación en el día 1 de edad o más tarde, por ejemplo, en el día 10, o en el día 1 a 10, o en el día 10 o más tarde.
Preferentemente, la infección por virus de la gripe que puede tratarse mediante la administración de cualquier proteína H5 (1), la molécula de ácido nucleico o vector que codifica cualquiera de tal proteína H5, o cualquier composición farmacéutica/de vacuna como se describe en el presente documento, está provocada por un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento y, según sea el caso, además en combinación con otro virus de la gripe aviar, porcino o humano o cualquier combinación o híbrido del mismo.
Una ventaja adicional de la presente divulgación es que beneficia al concepto "DIVA" (forma siglada de Differentiation of Infected and Vaccinated Animals: Diferenciación de animales infectados y vacunados) con kits de Elisa específicos para diferenciar entre seres humanos o animales vacunados y seres humanos o animales infectados con el virus H5N1.
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De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit de partes, que comprende i) cualquiera de tal proteína H5 (1) como se describe en el presente documento, la molécula de ácido nucleico o vector que codifica cualquiera de tal proteína H5, o cualquier composición farmacéutica/de vacuna que comprenda cualquiera de tal proteína H5, molécula de ácido nucleico o vector como se describe en el presente documento y ii) un prospecto de envase que indica el uso de tal proteína H5, una molécula de ácido nucleico, un vector o vacuna para el tratamiento o la profilaxis de infecciones provocadas por el virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento. Cuando se vacunan pollos, la proteína H5 (1) como se describe en el presente documento puede usarse para la vacunación en el día 1 de edad o más tarde.
Por lo tanto, se entiende que el kit de partes como se menciona el presente documento es para el uso, o se usa, respectivamente, para el tratamiento o la profilaxis de infecciones provocadas por el virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento.
Preferentemente, el kit en partes comprende al menos un antígeno adicional de un patógeno de aves de corral o de mamífero, y la indicación de información del uso medicinal, humano o veterinario del antígeno adicional, en particular el antígeno adicional como se menciona anteriormente.
Se divulga un método para reducir la diseminación vírica en un sujeto, que comprende administrar la proteína H5 (1) descrita en el presente documento o la combinación como se describe en el presente documento, a un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica con un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento.
La divulgación también se refiere a la proteína H5 (1) descrita en el presente documento o la combinación como se describe en el presente documento para su uso en un método para reducir la diseminación vírica en un sujeto, en donde dicha proteína H5 (1) o dicha combinación se debe administrar a un sujeto infectado con o en riesgo de una infección vírica con un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, y en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento.
Se divulga el uso de la proteína H5 (1) descrita en el presente documento o la combinación como se describe en el presente documento, para la preparación de un medicamento para reducir la diseminación vírica en un sujeto infectado o en riesgo de una infección vírica con un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1 es preferentemente el virus H5N1 de un clado distinto como se describe en el presente documento.
Preferentemente, la proteína H5 (1) de acuerdo con la divulgación, la combinación descrita en el presente documento, la vacuna como se describe en el presente documento o el kit mencionado en el presente documento es para su uso como una vacuna de una sola inyección o en una vacunación de una dosis.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos exponen los materiales y procedimientos preferentes en conformidad con la presente invención. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan solo a modo de ilustración y nada en los mismos debe considerarse una limitación del alcance general de la invención.
Ejemplo 1
Construcción de un baculovirus recombinante que codifica y expresa antígenos HA H5
El baculovirus recombinante que contiene el antígeno HA H5 se generó de la siguiente manera: las secuencias codificantes de HA H5 (SEQ ID NO: 3) se sintetizaron químicamente y se subclonaron en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La HA h5 MutK+ (SEQ ID NO: 5) se generó usando cebadores oligonucleotídicos y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los plásmidos pVL1392 que contienen los genes que codifican el antígeno H5 HA (SEQ ID. El baculovirus recombinante que contiene el antígeno H5 HA se generó de la siguiente manera: las secuencias codificantes de HA H5 (SEQ ID NO: 3) se sintetizaron químicamente y se subclonaron en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La HA H5 MutK+ (SEQ ID NO: 5) se generó usando cebadores oligonucleotídicos y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA) y se subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los plásmidos pVL1392 que contienen los genes que codifican el antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 3) y HA H5 MutK+ (SEQ ID NO: 5) se cotransfectaron después con ADN de baculovirus DiamondBac® (Sigma) en células de insecto Sf9 (BD Biosciences Pharmingen), para generar el baculovirus recombinante que contiene los genes HA H5 que codifica la SEQ ID NO: 3 y HA H5 mutK+ que codifica
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la SEQ ID NO: 5. Los baculovirus recombinantes que contienen los genes que codifican HA H5 (SEQ ID NO: 3) y HA H5 MutK+ (SEQ ID NO: 5) se purificaron por placas y los virus semilla principal (VSP) se propagaron en la línea celular SF+, se alicuotaron y se reservaron a -70 °C. Las células de insecto infectadas con baculovirus de HA H5 como se describe anteriormente para generar VSP o virus semilla de trabajo, expresan antígeno HA H5 (SEQ ID NO: 3) y antígeno HA H5 MutK+ (SEQ ID NO: 5), detectado por suero policlonal o anticuerpos monoclonales en un ensayo indirecto de anticuerpos fluorescentes o de transferencia de Western.
Después de haberse sembrado con las cantidades apropiadas de baculovirus recombinantes (HA H5 y HA H5 MutK+, respectivamente), Los matraces rotativos que contenían células SF+ (Protein Sciences, Inc., Inc., Meriden, CT) se incubaron después a 27 ± 2 °C durante 7 días y con agitación a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces tenían tapas ventiladas para permitir el flujo de aire. Se recolectó el cultivo celular completo en bruto conteniendo células SF+ infectadas con baculovirus y los sobrenadantes del cultivo celular de cada cultivo.
Ejemplo 2
Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden antígenos HA H5
Se recolectaron la proteína HA H5 y la proteína HA H5 Mutk+ en bruto de las células enteras, expresadas en células de insecto mediante el sistema de expresión basado en baculovirus. Los baculovirus se inactivaron en presencia de etilenimina binaria ciclada (BEI) 5 mM (concentración final) entre aproximadamente 32 y 39 °C durante 72 a 96 horas. Una vez acabada la inactivación, se añadió una solución de tiosulfato de sodio 0,3 M a una concentración final de 5 mM, para neutralizar cualquier BEI residual. Después de la neutralización, se añadieron diversos adyuvantes y se generaron las siguientes composiciones de vacuna/farmacéuticas.
VACUNAS
Nombre genérico del producto
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Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen.
Nombre genérico del producto
502
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-D.
Nombre genérico del producto
503
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Polygen.
Nombre genérico del producto
504
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-P.
Nombre genérico del producto
505
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Carbigen.
Nombre genérico del producto
506
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-75.
Nombre genérico del producto
507
Antígeno
Proteína HA H5 de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con ISA 70.
5
Nombre genérico del producto
508
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen.
Nombre genérico del producto
509
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-D.
Nombre genérico del producto
510
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Polygen.
Nombre genérico del producto
511
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-P.
5
10
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20
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30
35
40
Nombre genérico del producto
512
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Carbigen.
Nombre genérico del producto
513
Antígeno
Proteína HA H5 mutK+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con Emulsigen-75.
Nombre genérico del producto
514
Antígeno
Proteína HA H5 K+ de célula entera en bruto expresada en células de insecto por un sistema de expresión basado en baculovirus.
Formulación
Una vacuna experimental que comprende células de insecto cultivadas y sobrenadante que expresa H5 HA recombinante. La vacuna se adyuvantó con ISA 70.
Ejemplo 3
Vacunación de pollos frente a la gripe aviar
Se ha evaluado en ensayos con animales una vacuna de combinación que comprende HA H5 Mutk+ (Fracción 1) y virus de la enfermedad de Newcastle inactivado (Fracción 2), denominada "BACULO GA + EN KV". La vacuna se formuló con la hemaglutinina H5 producida en el sistema de expresión de Baculovirus basado en la construcción MutK+ (Ejemplos 1 y 2). El origen de la fracción de virus de la enfermedad de Newcastle (EN) es el virus entero.
Fracción 1:
Hemaglutinina H5 (HA H5) del virus de la gripe aviar H5N1, recombinante, expresada en baculovirus. Fracción de gripe Aviar (GA).
La fracción GA se inactiva con etilenimina binaria (BEI). No se permite infectividad residual procedente del vector de Baculovirus.
Fracción 2:
Virión entero, virus de la enfermedad de Newcastle (EN), cepa La Sota. Fracción enfermedad de Newcastle.
La fracción EN se inactiva con formaldehído, BEI o beta-propio-lactona (BPL). No se permite infectividad residual procedente del virus EN.
Composición de las fórmulas:
El material recolectado inactivado de la proteína HA H5 y de EN se mezclan en una emulsión de agua/aceite. La mezcla incluye aceite mineral como adyuvante.
Para la evaluación de la eficacia de la vacuna se consideraron tres parámetros clínicos: 1) Morbilidad/mortalidad. 2) Niveles de anticuerpos. 3) Diseminación vírica.
En todos los estudios se vacunaron pollos libres de patógenos, la administración de la vacuna fue por vía subcutánea, en la parte posterior del cuello. Se administró una dosis de 0,5 ml a menos que se indique otra cosa.
Los pollos se mantuvieron dentro de unidades aislantes durante toda la duración de los estudios. Los estudios cumplían con las directrices internacionales de la OMSA para la evaluación de vacunas para la gripe aviar.
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Se realizó una exposición para evaluar la fracción antigénica de la gripe aviar (GA). Los pollos se inocularon 3 semanas después de la vacunación por vía intranasal (50 jl) y oral (50 jl), administrando un total de 100 jl de fluido alantoideo que contenía 106 DIH50 del virus de desafío.
Para evaluar la protección frente a la exposición con HPAI H5N1, se realizaron dos estudios:
1) Estudio de protectotipos, utilizando una vacunación única o doble (evaluación del efecto de potenciación), pollos de 1 día de edad o de 10 días de edad (evaluación del efecto de la edad), y dosis de 0,5 o 0,2 ml (evaluación del efecto de la dosis).
Para este estudio se usaron dos cepas de exposición distintas: a) Una cepa vietnamita de subclado 2.3.2 (aislada en 2006) que recientemente ha provocado la enfermedad en la producción avícola en el sudeste asiático (China, Vietnam). b) Una cepa egipcia del grupo B1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010), que recientemente provocado la enfermedad en la producción avícola egipcia. Las cepas de exposición no son genéticamente cercanas a la construcción de baculovirus de vacuna (MutK+). Los resultados se interpretan en el contexto de los protectotipos como una ampliación de la protección conferida para dos inmunizaciones con vacunas similares o distintas.
Conclusiones:
1) Se observó una protección entre el 80 y 100 %, dependiendo de la edad o la dosis. Se observó una protección del 100 % cuando se administró en una dosis de 0,5 ml de la formulación bivalente a los 10 días de edad.
2) Cuando se administra como una única inmunización de 0,5 ml de BACULO GA + EN KV a los 10 días de edad, se observa la misma protección que cuando se administran dos dosis de la vacuna Volvac AI KV comercial inactivada producida de forma tradicional.
3) Cuando se administra como una única inmunización de 0,5 ml de BACULO GA + EN KV a los 10 días de edad, se detectó un nivel similar de anticuerpos específicos frente a H5 que cuando se administran dos dosis de la vacuna Volvac AI KV comercial inactivada producida de forma tradicional.
4) Se observaron niveles bajos de diseminación vírica hasta 3 días después de la exposición, cuando la vacuna se administró como una única inmunización de 0,5 ml de BACULO GA + EN KV a los 10 días de edad.
2) Estudio de eficacia BACULO, utilizando una única vacunación individual a los 10 días de edad.
Para este estudio se usaron tres cepas de exposición distintas: a) Un cepa egipcia de subclado 2.2.1 (aislada en 2008). b) Una cepa egipcia del grupo A1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010). c) Una cepa egipcia del grupo B1 subclado 2.2.1 (aislada en 2010). Las dos últimas han provocado enfermedad recientemente en la producción avícola egipcia.
Conclusiones:
1) Se observó protección entre el 90 y el 100 %.
2) La vacuna BACULO GA + EN KV mostró un rendimiento que cumple con las directrices de la Agencia Europea del Medicamento (AEM) para vacunas frente al virus HPAI en aves.
3) Este es el primer informe disponible que demuestra la eficacia con una administración de una sola dosis para una vacuna basada en baculovirus que incluye una hemaglutinina genéticamente distante de las de los virus utilizados para la exposición.
Ejemplo 4
1. Diseño experimental.
Este experimento se diseñó y realizó de forma similar al Ejemplo 3 descrito anteriormente: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna se consideraron tres parámetros clínicos: 1) Morbilidad/mortalidad. 2) Niveles de anticuerpos.
3) Diseminación vírica.
En todos los estudios se vacunaron pollos libres de patógenos, la administración de la vacuna fue por vía subcutánea, en la parte posterior del cuello. Se usó un prototipo de vacuna que contenía una proteína H5 de clado 1(llamada Mut K+) formulada como un producto bivalente con una segunda fracción antigénica de EN (virus de la enfermedad de Newcastle).
Se administró una dosis de 0,5 ml a menos que se indique otra cosa. Los animales se vacunaron a los 10 días de edad.
Los pollos se mantuvieron dentro de unidades aislantes durante toda la duración de los estudios. Los estudios cumplían con las directrices internacionales de la OMSA para la evaluación de vacunas para la gripe aviar.
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Se realizó una exposición para evaluar la fracción antigénica de la gripe aviar (GA). Los pollos se inocularon 3 semanas después de la vacunación por vía intranasal (50 jl) y oral (50 jl), administrando un total de 100 jl de fluido alantoideo que contenía 106 DIH50 del virus de desafío.
Esto también se resume en la siguiente tabla (Tabla a) (la vacunación se realizó a los 10 días de edad, columna 1 (ID de los grupos experimentales de acuerdo con la vacuna aplicada), columna 2 (dosis de la vacuna) y columna 3 (edad a la exposición)).
El virus de exposición fue A/Chicken/Egypt/1063/2010, que se clasifica como HP AIV (forma siglada de highly pathogenic avian influenza virus, virus de la gripe aviar altamente patógeno) subtipo H5N1 de subclado 2.2.11. Esta es la cepa de exposición oficial utilizada en Egipto para la evaluación de lotes de vacunas. La dosis de exposición fue de 106 DIH50.
2. Resultados y análisis de datos.
Los resultados y análisis de satos se resumen en la siguiente tabla (Tabla a): Columna 4 (MGT (media geométrica de los títulos) de IH 3 semanas posvacunación, preexposición), columna 5 (porcentaje de supervivencia, 2 semanas posexposición) y columna 6 (detección de la diseminación vírica, muestras positivas por RT-PCR).
Tabla a: Resumen del diseño experimental y de los resultados y análisis de datos del Ejemplo 4.
Grupo experimental (10 pollos cada uno)- ID de la vacuna-
Dosis de la vacuna (edad) Dosis de exposición (edad) -Cepa 1063- MGT medida a los 31 días de edad Porcentaje de supervivencia posexposición (%) Diseminación vírica- Detección de ARN vírico usando RT-PCR- (n.° de positivos/ total)
Homólogo (cepa vacunal)
Heterólogo (cepa de desafío)
Mut K+
0,5 ml (10 días de edad) 106 DIH50 (31 días de edad) 9,1 0,9 100 2/10
Sin vacuna
- - 0 10/10
3. Conclusiones
• El grupo vacunado sobrevivió a la exposición. El prototipo de vacuna desencadenó una respuesta inmunitaria eficaz, medido como titulación por IH, usando el antígeno homólogo.
• El prototipo de vacuna Mut K+ proporcionó buena protección virológica, medido como la capacidad de reducir la
diseminación vírica. Los valores de Ct por RT-PCr fueron muy bajos como para representar virus infeccioso, solo representaron material genético residual.
Ejemplo 5
Diseño experimental.
El experimento descrito está diseñado para mostrar la eficacia de un prototipo de vacuna que solo contiene una proteína H5 de clado 1 (llamada Mut K+).
Para la evaluación de la eficacia de la vacuna se consideran tres parámetros clínicos: 1) Morbilidad/mortalidad. 2) Niveles de anticuerpos. 3) Diseminación vírica.
En todos los estudios se vacunan pollos libres de patógenos, la administración de la vacuna es por vía subcutánea, en la parte posterior del cuello. Se usa un prototipo de vacuna que contiene una proteína H5 de clado 1 (llamada Mut K+) formulada como un producto monovalente.
Se administra una dosis de 0,5 ml a menos que se indique otra cosa. Los animales se vacunan a los 10 días de edad.
Los pollos se mantienen dentro de unidades aislantes durante toda la duración de los estudios. Los estudios cumplen con las directrices internacionales de la OMSA para la evaluación de vacunas para la gripe aviar.
El desafío se realiza para evaluar la eficacia de la vacuna con respecto a la fracción antigénica de la gripe aviar (GA). Los pollos se inoculan 3 semanas después de la vacunación por vía intranasal (50 jl) y oral (50 jl), administrando un total de 100 jl de fluido alantoideo que contenía 106 DIH50 del virus de desafío.
5
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50
Esto también se resume en las siguientes tablas (Tabla b y tabla c) (la vacunación se realizó a los 10 días de edad, columna 1 (ID de los grupos experimentales de acuerdo con la vacuna aplicada), columna 2 (dosis de la vacuna) y columna 3 (edad a la exposición)).
El virus de exposición es A/Chicken/Egypt/1063/2010 (clasificado como HP AIV subtipo H5N1 subclado B o subclado 2.2.1.1) o A/chicken/Egypt/3982-8/2010 (clasificado como HP AIV subtipo H5N1 subclado A o subclado 2.2.1)
A/Chicken/Egypt/1063/2010 fue la cepa de exposición oficial utilizada en Egipto para la evaluación de lotes de vacunas hasta el final de 2012. La dosis de exposición es en cualquier caso 10° DIH50.
Tabla b Resumen del diseño experimental del Ejemplo 5.
1
2 3
Grupo experimental (10 pollos cada uno) -ID de la vacuna-
Dosis de la vacuna (edad) Dosis de exposición (edad) -Cepa 1063-
Mut K+
0,5 ml (10 días de edad) 106 DIH50 (31 días de edad)
Sin vacuna
Tabla c: Resumen del diseño experimental del Ejemplo 5.
1
2 3
Grupo experimental (10 pollos cada uno) -ID de la vacuna-
Dosis de la vacuna (edad) Dosis de exposición (edad) -Cepa 3982-8
Mut K+
0,5 ml (10 días de edad) 106 DIH50 (31 días de edad)
Sin vacuna
• Los pollos del grupo vacunado (Tabla c) sobreviven a la exposición a A/chicken/Egypt/3982-8/2010 y casi todos los pollos del grupo vacunado (Tabla b) sobreviven a la exposición a A/Chicken/Egypt/1063/2010. El prototipo de vacuna induce una respuesta inmunitaria eficaz, medido como determinación del título de IH usando el antígeno homólogo.
• El prototipo de vacuna MutK + proporciona suficiente protección con respecto a la diseminación del virus de exposición, medido como la capacidad de reducir la diseminación vírica. Los valores de Ct de RT-PCR son muy bajos y representan, en cambio, solo material genético vírico residual en lugar de virus infeccioso.
En el listado de secuencias (las SEQ ID NO: 1 a 50 y 139):
a SEQ ID NO: 1 corresponde a H5 de A/Hong Kong/213/2003 as SEQ ID NO: 2-7 corresponden a las SEQ ID NO: PCT/US2007/082699,
(H5N1) sin péptido señal,
1-6 de la solicitud internacional (PCT) número
la
SEQ ID NO 8 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 ' 1709-6",
la
SEQ ID NO 9 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 ' 1553-1/A1",
la
SEQ ID NO 10 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-15/A1",
la
SEQ ID NO 11 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-50/A1",
la
SEQ ID NO 12 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-2/A1",
la
SEQ ID NO 13 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-5/A1",
la
SEQ ID NO 14 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-7/A1",
la
SEQ ID NO 15 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-8/A1",
la
SEQ ID NO 16 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-9/A1",
la
SEQ ID NO 17 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-12/A1",
la
SEQ ID NO 18 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-20/A1",
la
SEQ ID NO 19 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-44/A1",
la
SEQ ID NO : 20 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-2/B1",
la
SEQ ID NO : 21 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-6/B1",
la
SEQ ID NO : 22 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-13/B2",
la
SEQ ID NO : 23 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-26/B2",
la
SEQ ID NO : 24 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "1553-28/B1",
la
SEQ ID NO : 25 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-39/B2",
la
SEQ ID NO : 26 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-46/B1",
la
SEQ ID NO : 27 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-49/B1",
la
SEQ ID NO : 28 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-65/B1",
la
SEQ ID NO : 29 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-68/B2",
la
SEQ ID NO 30 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-70/B2",
la
SEQ ID NO 31 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-73/B2",
la
SEQ ID NO 32 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "2095-75/B2",
10
15
20
la SEQ ID NO: 33 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-3/B1",
la SEQ ID NO: 34 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-4/B1",
la SEQ ID NO: 35 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-13/B1",
la SEQ ID NO: 36 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-14/B2",
la SEQ ID NO: 37 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-19/B3",
la SEQ ID NO: 38 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-21/B2",
la SEQ ID NO: 39 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-43/B1",
la SEQ ID NO: 40 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-50/B1",
la SEQ ID NO: 41 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-52/B1",
la SEQ ID NO: 42 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-55/A1",
la SEQ ID NO: 43 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-56/A1",
la SEQ ID NO: 44 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "3982-78/B2",
la SEQ ID NO: 45 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "4794-17/B ",
la SEQ ID NO: 46 corresponde a la secuencia de H5 de H5N1 "4794-18/B",
la SEQ ID NO: 47 corresponde a la secuencia de H5 traducida a aprtir de la SEQ ID NO: 50,
la SEQ ID NO: 48 codifica una secuencia de H5 de H5N1 "3982-8/A1" (SEQ ID NO: 15),
la SEQ ID NO: 49 codifica una secuencia de H5 de H5N1 "1553-2/B1" (SEQ ID NO: 20),
la SEQ ID NO: 50 corresponde a la secuencia consenso obtenida después del análisis de las 38 secuencias del gen HA H5 que codifican las SEQ ID NO: 9 a 46,
la SEQ ID NO: 139 corresponde al ADNc del virus de la enfermedad de Newcastle cepa LaSota.
Tabla A: El siguiente listado es un alineamiento de las secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 9 a 46, en donde se utiliza el código de aminoácidos de una letra:
1553-1/A1
1553-15/A1
2095-50/Al
3 982-2/Al
3982-5/Al
3982-7/Al
3 982 - 8/Al
3982-9/A1'
3982-12/A1
3982-20/A1
3982-44/A1
1553-2/B1
1553-6/B1
1553 -13/B2
1553-26/B2
1553-28/B1
2095-39/B2
2095-46/B1
2095-49/B1
2095-65/B1
2095-68/B2
2095-70/B2
2095-73/B2
2095-75/B2
3982-3/B1
3982-4/B1
3982 -13/B1
3982-14/B2
3982-19/B3
3982-21/B2
3982-43/B1
3982-50/B1
3982-52/B1
3982-55/A1
3982-56/Al
3982-78/B2
4794-17/B
4794-18/B
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35
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55
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KTHNGKLCDL
KTHNGKLCDL
KTHNGKLCDL

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Una proteína H5 (1) del virus H5N1 de ciado 1 para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones por un virus H5N1 de un clado distinto, en donde dicha proteína H5 (1) comprende o consiste en la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 5, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) del virus de la gripe, en donde dicha proteína H5 (2) consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 102 a 110, 116, 117, 119 a 126 y 128 a 137.
  2. 2. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 del clado 2.2.1 y/o, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto es un virus H5N1 de origen norteafricano.
  3. 3. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,
    en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene:
    (a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
    (b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
    (c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V, y en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 (2) se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8.
  4. 4. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto comprende una proteína H5 (2) que tiene:
    (a) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T y 181N, o
    (b) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o
    (c) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H y 254V
    y en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 (2) se refiere a la posición de aminoácidos como se proporciona de forma ejemplar en la SEQ ID NO: 8.
  5. 5. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto comprende una proteína H5 (2) que consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 106 o la proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho virus H5N1 de un clado distinto comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 106.
  6. 6. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5 en un método para tratar o prevenir infecciones
    (A) por el virus H5N1 de Subclado A de origen norteafricano, a saber, una infección por un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con (a) de la reivindicación 3 o 4, o una infección por un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 en relación con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 102 a 110, 133 o 134,
    o
    (B) por el virus H5N1 de Subclado B de origen norteafricano, a saber, una infección por un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con (b) o (c) de la reivindicación 3 o 4, o una infección por un virus H5N1 que comprende un polinucleótido que codifica una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 en relación con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 116, 117, 119 a 126, 128 a 132 o 135 a 137.
  7. 7. La proteína H5 (1) para su uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 6 en un método para tratar o prevenir infecciones
    (A) por el virus H5N1 de Subclado A de origen norteafricano, a saber, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con (a) de la reivindicación 3 o 4, o que comprende una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 en relación con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 102 a 110, 133 o 134,
    o
    (B) por el virus H5N1 de Subclado B de origen norteafricano, a saber, una infección por un virus H5N1 que comprende una proteína H5 (2) que tiene los aminoácidos de acuerdo con (b) o (c) de la reivindicación 3 o 4, o
    5
    10
    15
    20
    25
    que comprende una proteína H5 (2) de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 en relación con una cualquiera de las secuencias como se exponen en las SEQ ID NO: 116, 117, 119 a 126, 128 a 132 o 135 a 137.
  8. 8. Una vacuna para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones por un virus H5N1 de un clado distinto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende o que consiste en:
    a. la proteína H5 (1) de la reivindicación 1, y
    b. un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  9. 9. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el excipiente es un adyuvante basado en Emulsigen.
  10. 10. La vacuna para el uso de la reivindicación 8 o 9, en donde la vacuna es una vacuna de una sola inyección o una vacuna de una dosis.
  11. 11. La vacuna para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para reducir la diseminación vírica en un sujeto infectado por o en riesgo de una infección vírica por un virus H5N1 de un clado que no sea el clado 1.
  12. 12. Una combinación de
    la proteína H5 (1) de la reivindicación 1 y un virus de la enfermedad de Newcastle inactivado
    para su uso en un método para tratar o prevenir infecciones por un virus H5N1 de un clado distinto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  13. 13. La combinación para el uso de la reivindicación 12, en donde el virus de la enfermedad de Newcastle inactivado es un virus de la enfermedad de Newcastle inactivado obtenido por inactivación de un virus de la enfermedad de Newcastle que comprende un polinucleótido de ARN que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con una copia de ARN del polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO: 139, que se ha inactivado.
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