BRPI0617486A2 - vacina que compreende partÍculas similares a vÍrus da gripe funcionais (vlp) e uso de uma vlp de gripe - Google Patents

Abstract

<B>VACINA QUE COMPREENDE PARTÍCULAS SIMILARES A VÍRUS DA GRIPE FUNCIONAIS (VLP) E USO DE UMA VLP DE GRIPE<D>A presente invenção refere-se a partículas similares a vírus (VLPs) que expressam e/ou contêm proteínas de vírus da gripe sazonal, proteínas de vírus da gripe aviária, e/ou proteínas de vírus da gripe de viroses com potencial pandêmico. A invenção inclui constructos de vetores compreendendo referidas proteínas, células compreendendo referidos constructos, formulações e vacinas compreendendo VLPs da invenção. A invenção também inclui métodos de produção e administração de VLps em vertebrados, incluindo métodos de induzir imunidade substancial a qualquer gripe sazonal e aviária, ou pelo menos um sintoma da mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINA QUECOMPREENDE PARTÍCULAS SIMILARES A VÍRUS DA GRIPE FUNCIONAIS(VLP) E USO DE UMA VLP DE GRIPE".

Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório 60/727.513,depositado em 18 de outubro de 2005, pedido provisório 60/780.847, deposita-do em 10 de março de 2006, pedido provisório 60/800.006, depositado em15 de maio de 2006, pedido provisório 60/831.196, depositado em 17 de ju-lho de 2006, pedido provisório 60/832.116, depositado em 21 de julho de2006, e pedido provisório 60/845.495, depositado em 19 de setembro de2006, todos dos quais aqui incorporados por referência em suas totalidadespara todas as propostas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O vírus da gripe é um membro da família Orthomyxoviridae (pararevisão, vide Murphy and Webster, 1996). Existem três subtipos de vírus da gripedesignados A, B e C. O virion da gripe inclui as seguintes proteínas: proteínashemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), matriz (M1), proteína de canal de íonde próton (M2), nucleoproteína (NP), proteína básica polimerase 1 (PB1), proteí-na básica polimerase 2 (PB2), proteína ácida polimerase (PA), e proteína neuro-estrutural 2 (NS2). As HA, NA, M1 e M2 são membranas associadas, pelo queNP, PB1, PB2, PA e NS2 são proteínas associadas à nucleocapsídeo. A NS1 é aúnica proteína não-estrutural não associada com partículas de virion, mas espe-cífica para células infectadas de gripe. A proteína M1 é a proteína mais abundan-te em partículas de gripe. As proteínas HA e NA são glicoproteínas envelopes,responsáveis pela fixação e penetração do vírus das partículas de gripe na célu-la, e as fontes dos epítopes imunodominantes maiores para neutralização e imu-nidade protetora do vírus. Ambas as proteínas HA e NA são consideradas oscomponentes mais importantes para vacinas profiláticas da gripe.

A infecção por vírus da gripe é iniciada pela fixação da proteínaHA de superfície de virion a um receptor celular contendo ácido siálico (glico-proteínas e glicolipídeos). A proteína NA funciona como mediadora de pro-cessamento do receptor de ácido siálico, e a penetração de vírus na céluladepende da endocitose mediada por receptor dependente de HA. Nos limitesacídicos de endossomas internalizados contendo um virion da gripe, a prote-ína HA suporta mudanças conformacionais que conduzem a fusão de mem-branas virais e de célula hospedeira, seguido por não-revestimento de víruse liberação mediada por M2 de proteínas M1 de ribonucleoproteínas (RNPs),que migram no núcleo da célula para síntese de RNA viral. Os anticorpos àmolécula de HA podem prevenir infecção de vírus pela neutralização da in-fectividade do vírus, onde os anticorpos a proteínas NA que funcionam paramediar seu efeito nas etapas anteriores de replicação viral.

As vacinas de vírus A e B da gripe inativadas são atualmentelicenciadas como vacinas trivalentes para administração parenteral. Estasvacinas trivalentes são produzidas como volume monovalente na cavidadealantóica de ovos de píntinho embrionados, purificados por centrifugaçãozonal de classificação ou cromatografia de coluna, ínativados com firmalin ouβ-propiolactona, e formulados como uma mistura das duas cepas de tipo A etipo B de vírus da gripe em circulação entre a população humana para umdado ano. As vacinas de gripe comerciais disponíveis são vírus totais (WV)ou vacinas de vírus de subvirion (SV; antígeno de superfície dividido ou puri-ficado). A vacina de WV contém virion inativado intacto. As vacinas de SVtratadas com solventes, tal como tri-n-butila fosfato (Flu-Shield, Wyeth-Lederle), contêm aproximadamente todas as proteínas estruturais virais, ealguns dos envelopes virais. As vacinas de SV solubilizadas com Triton X-100 (Fluzone, Safoni-Aventis; Fluvirin, Novartis) contêm agregados de mo-nômeros de HA, NA e principalmente NP, embora quantidades residuais deoutras proteínas estruturais virais estejam presentes. Uma vacina de vírusadaptado a frio atenuado vivo (FluMist, Medlmmune) foi aprovada no merca-do recentemente pela FDA para uso comercial como uma vacina distribuídaintranasalmente indicada para imunização ativa e a prevenção de doençacausada pelos vírus da gripe A e B na saúde de crianças e adolescentes de5-17 anos de idade, e na saúde de adultos de 18 a 49 anos de idade.

Vários produtos recombinantes foram desenvolvidos como vaci-nas candidatas de gripe recombinante. Estas aproximações têm se focaliza-do na expressão, produção e purificação de vírus da gripe tipo A de proteí-nas HA e NA, incluindo expressão destas proteínas usando células de insetoinfectadas com baculovírus (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999; Treanoret ai, vetores virais (Pushko et al., 1997; Berglund et al., 1999), e construc-tos de vacina de DNA (Olsen et al., 1997)).

Crawford et al. (1999) demonstrou que HA da gripe influenciadaem células de inseto infectadas por baculovírus é capaz de prevenir doençade gripe letal causada por subtipos de gripe aviária H5 e H7. Ao mesmotempo, outro grupo demonstrou que as proteínas HA e NA de gripe expres-sas por baculovírus induz respostas imunes em animais superiores aquelasinduzidas por uma vacina convencional (Johansson et al., 1999). A imuno-genicidade e eficiência de hemaglutina expressa por baculovírus de vírus degripe eqüina foi comparada a uma vacina candidata de DNA homóloga (Ol-sen et al., 1977). Tomados juntas, os dados demonstraram que um alto graude proteção contra provocação do vírus da gripe pode ser induzido com pro-teínas HA ou NA recombinantes, usando-se várias aproximações experimen-tais, e em modelos de animal diferentes.

Lakey et al., (1996) mostraram que uma vacina de HA de gripederivada de baculovírus foi bem-tolerada e imunogênica em voluntários hu-manos em um estudo de segurança de escalação de dose de Fase I. Contu-do, os resultados dos estudos da Fase Il conduzidos em vários locais clíni-cos em voluntários humanos vacinados com várias doses de vacina de gripecompreendida de proteínas HA e/ou NA indicam que as vacinas de proteínade subunidade de recombinante não induzem imunidade protetora [G. Smith,Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. Estes re-sultados indicam que epítopes conformacionais revelados na superfície depeplômeros de HA e NA de virions infecciosos foram importantes na induçãode neutralização de anticorpos e imunidade protetora.

Com relação a inclusão de outras proteínas de vacinas candida-tas recombinantes, um número de estudos foi efetuado, incluindo os experi-mentos envolvendo nucleoproteína de gripe, proteína NP, sozinhas ou emcombinação com proteína M1 (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou etal., 1995; Tsui et al., 1998). Estas vacinas candidatas, que foram compostasde proteínas de virion interno quase não-variante, induzem uma imunidadede espectro amplo que era principalmente celular (ambas as células T dememória CD4+ e CD8+). Estes experimentos envolvem o uso do DNA e veto-res genéticos virais. Quantidades relativamente grandes de DNA injetadoforam necessárias, como resultados de experimentos com doses inferioresde DNA indicam pouca ou nenhuma proteção (Chen et al., 1998). Conse-qüentemente, pesquisa adicional pré-clícica e clínica pode ser requerida pa-ra avaliar se tais aproximações baseadas em DNA envolvendo NP e M1 degripe são seguras, efetivas e persistentes.

Recentemente, em uma tentativa de desenvolver vacinas maisefetivas para gripe, proteínas particuladas foram usadas como veículos deepítopes de proteína de M2 de gripe. A análise racional para desenvolvimen-to de uma vacina baseada em M2 foi que, em estudos de animal, a imunida-de contra gripe foi induzida por proteínas M2 (Slepushkin et al., 1995).Neirynck et al. (1999) usou um domínio de transmembrana M2 longa 23-aacomo um co-participante de fusão terminal amino com o antígeno de núcleode vírus B de hepatite (HBcAg) para expor o(s) epítopo(s) de M2 na superfí-cie de partículas similares a HBcAg-capsid. Contudo, apesar do fato queambas proteína de M2 de comprimento total e M2-HBcAg VLP induziremanticorpos detectáveis e proteção em camundongos, foi diferentemente quevacinas de gripe futuras seriam baseadas exclusivamente nas proteínas M2,conforme a proteína M2 estava presente em número baixo de cópia por viri-on, era fracamente antigênica, era incapaz de induzir anticorpos que se li-gam a virions livres de gripe, e era incapaz de bloquear a fixação de vírus areceptores de célula (isto é, neutralização de vírus).

Visto que pesquisa anterior tenha mostrado que glicoproteínasde gripe de superfície, HA e NA são os alvos principais para indução de i-munidade protetora contra vírus, e que M1 proporciona um alvo conservadopara imunidade celular a gripe, uma nova vacina candidata pode incluir estesantígenos virais como uma partícula macromolecular de proteína, tais comopartículas similares a vírus (VLPs). Adicionalmente, a partícula com estesantígenos de gripe pode revelar epítopes conformacionais que induzem neu-tralização de anticorpos para cepas de vírus da gripe.

Vários estudos demonstraram que proteínas de gripe recombi-nante auto-reunidas em VLPs em cultura de célula usando plasmídeos deexpressão de mamífero ou vetores de baculovírus (Gomez-Puertas et al.,1999; Neumann et al., Latham and Galarza1 2001). Gomes-Puertas et al(1999) demonstraram que formação eficiente de VLP de gripe depende dosníveis de expressão de proteínas virais. Neumann et al (2000) estabelece-ram um sistema baseado em plasmídeo de expressão de mamífero parageração de partículas similares a vírus de gripe infecciosa totalmente decDNAs clonados. Latham e Galarza (2001) reportaram a formação de VLPsde gripe em células de inseto infectadas com baculovírus recombinante co-expressando genes de HA, NA, M1 e M2. Estes estudos demonstraram queproteínas de virion de gripe se auto-reúnem sob co-expressão em célulaseucarióticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona partícula similar a vírus (VLP)compreendendo uma proteína M1 do vírus da gripe e hemaglutinina H5 e N1do vírus da gripe e proteínas neuraminidase. Em uma concretização, a pro-teína M1 é derivada de uma cepa de vírus da gripe diferente, conforme com-parada às proteínas H5 e N1. Em outra concretização, referidas H5 ou N1são de um vírus da gripe H5N1 clade 1.

A presente invenção também proporciona uma VLP expressa deuma célula eucariótica compreendendo um ou mais ácidos nucléicos quecodificam proteínas H5 e N1 da gripe e uma proteína M1 da gripe sob condi-ções que permitem a formação de VLPs. Em uma concretização, referidacélula eucariótica é selecionada a partir do grupo consistindo em levedura,inseto, anfíbio, células aviária e mamíferos. Em outra concretização, referidacélula eucariótica é uma célula de inseto.

A presente invenção também proporciona uma VLP que induzneutralização de anticorpos em um ser humano ou animal, que são protegi-dos contra infecção de gripe quando administrada aos referidos ser humanoou animal.A presente invenção também proporciona composição imunogê-nica compreendendo uma dose efetiva de uma VLP da invenção. Em umaconcretização, referida composição compreende um adjuvante.

A presente invenção também proporciona uma vacina compre-endendo uma dose efetiva de uma VLP da invenção. Em uma concretização,referida vacina compreende pelo menos uma segunda VLP que compreendeHA e NA de cepas de gripe diferentes. Em outra concretização, referida va-cina compreende um adjuvante.

A presente invenção também proporciona um método de induzirimunidade substancial a infecção de vírus de gripe em um animal, compre-endendo administrar pelo menos uma dose efetiva de uma vacina compre-endendo a VLP da invenção. Em uma concretização, referida vacina é adminis-trada a um animal oralmente, intradermalmente, intranasalmente, intramuscu-larmente, intraperitonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente.

A presente invenção também proporciona o uso de uma VLP dainvenção para a preparação de uma vacina para um animal, em que a vacinainduz imunidade substancial a infecção de vírus da gripe no referido animal.

A presente invenção também proporciona um método de produ-ção de uma VLP da invenção, compreendendo expressar proteínas M1, HAe NA em uma célula eucariótica.

A presente invenção também proporciona uma vacina compre-endendo uma VLP da gripe, em que referida VLP compreende proteínas M1,HA e NA da gripe, em que referida vacina induz imunidade substancial a in-fecção de vírus da gripe em um ser humano. Em outra concretização, referi-da vacina compreende uma VLP da gripe, em que referida VLP consiste es-sencialmente em proteínas M1, HA e NA da gripe, em que referida vacinainduz imunidade substancial a infecção de vírus da gripe em um ser huma-no. Em outra concretização, referida vacina compreende uma VLP da gripe,em que referida VLP compreende proteínas da gripe selecionadas a partir dogrupo consistindo em proteínas M1, HA e NA, em que referida vacina induzimunidade substancial a infecção de vírus da gripe em um ser humano.

A presente invenção também proporciona o uso de uma VLP dagripe, em que referida VLP compreende proteínas M1, HA e NA da gripe,para a preparação de uma vacina, em que a vacina induz imunidade subs-tancial a infecção de vírus da gripe em um ser humano.

Desse modo, a invenção proporciona uma estrutura de proteínamacromolecular contendo (a) uma primeira proteína M1 de vírus da gripe, e(b) uma proteína estrutural adicional, que pode incluir uma segunda ou maisproteína M1 de vírus de gripe; uma primeira, segunda ou mais proteínas HAde vírus da gripe; uma primeira, segunda ou mais proteínas NA de vírus dagripe; e uma primeira ou mais proteínas M2 de vírus da gripe. Se a proteínaestrutural adicional não é de uma segunda ou mais proteínas M1 de vírus dagripe, então ambos ou todos os membros do grupo, por exemplo, primeira esegunda proteínas de vírus M2 da gripe, são incluídos. Como tal, é providauma estrutura de proteína de gripe funcional, incluindo partícula subviral,VLP, ou estrutura capsômera, ou uma porção destas, uma vacina, uma vaci-na multivalente, e mistura destas, consistindo essencialmente de proteínasestruturais de vírus da gripe produzidas pelo método da invenção. Em umaconcretização particularmente preferida, a estrutura de proteína macromole-cular da gripe inclui proteínas HA, NA e M1 do vírus da gripe que são osprodutos de expressão de genes de vírus da gripe clonados como fragmen-tos sintéticos de um vírus tipo selvagem.

A estrutura de proteína macromolecular pode também incluiruma proteína estrutural adicional, por exemplo, uma nucleoproteína (NP),proteínas de membrana de espécies diferentes do vírus da gripe, e uma pro-teína de membrana de uma fonte de não-gripe, que são derivadas de ori-gens aviária ou mamíferos, e subtipos diferentes de vírus da gripe, incluindovírus da gripe de subtipo A e Β. A invenção pode incluir uma estrutura deproteína macromolecular quimérica que inclui uma porção de pelo menosuma proteína tendo uma porção não produzida pelo vírus da gripe.

A prevenção de gripe pode ser acompanhada pela provisão deuma estrutura de proteína macromolecular que pode ser auto-reunida emuma célula hospedeira de um constructo recombinante. A estrutura de prote-ína macromolecular da invenção tem a capacidade de se auto-reunir naspartículas similares a vírus homotípica e heterotípica (VLPs) que revelamepítopes conformacionais nas proteínas HA e NA, que induzem neutraliza-ção de anticorpos que são protetores. A composição pode ser uma composi-ção de vacina que também contém um veículo ou diluente e/ou um adjuvan-te. As VLPs de gripe funcionais induzem neutralização de anticorpos contrauma ou mais cepas ou tipos de vírus da gripe dependendo se as VLPs degripe funcionais contêm proteínas HA ou NA de uma ou mais cepas ou tiposvirais. A vacina pode incluir proteínas de vírus da gripe que são proteínas devírus da gripe de tipo selvagem. Preferivelmente, as proteínas estruturaiscontendo a VLP da gripe, ou uma porção destas, podem ser derivadas devárias cepas de vírus de gripe de tipo selvagem. As vacinas da gripe podemser administradas a ser humano ou animais para induzir imunidade protetoracontra uma ou mais cepas ou tipos de vírus da gripe.

As estruturas de proteínas macromoleculares da invenção po-dem exibir atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase.

A invenção proporciona um método para produção de uma VLPderivada da gripe pela constructo de um constructo recombinante que codifi-ca genes estruturais da gripe, incluindo proteína Mli HA1 e pelo menos umaproteína estrutural derivada do vírus da gripe. Um constructo recombinante éusado para transfectar, infectar ou transformar uma célula hospedeira ade-quada com o baculovírus recombinante. A célula hospedeira é cultivada sobcondições que permitem a expressão de proteína M1, HA1 e pelo menosuma proteína estrutural derivada do vírus da gripe, e a VLP é formada nacélula hospedeira. O meio de célula infectado contendo uma VLP de gripefuncional é colhido e a VLP é purificada. A invenção também caracterizauma etapa adicional de co-transfecção, co-infecção ou co-transformação dacélula hospedeira com um segundo constructo recombinante que codificauma segunda proteína da gripe, incorporando, desse modo, a segunda pro-teína da gripe dentro da VLP. Tais proteínas estruturais podem ser derivadasdo vírus da gripe, incluindo proteína NA, M2 e NP, e pelo menos uma proteí-na estrutural é derivada a partir de origens aviária e mamíferos. A proteínaestrutural pode ser um vírus da gripe de subtipo A e B. De acordo com a in-venção, a célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica. Em adição, aVLP pode ser uma VLP quimérica.

A invenção também caracteriza um método de formular umasubstância de fármaco contendo uma VLP da gripe pela introdução de cons-tructos recombinantes que codificam genes virais da gripe nas células hos-pedeiras, e permitem auto-reunião das proteínas virais de gripe recombinan-tes em uma VLP homotípica ou heterotípica funcionais nas células. A VLPda gripe é isolada e purificada, e uma substância de fármaco é formuladacontendo a VLP da gripe. A substância de fármaco pode adicionalmente in-cluir um adjuvante. Em adição, a invenção proporciona um método para for-mular um produto de fármaco pela mistura de tal substância de fármaco con-tendo uma VLP da gripe com uma vesícula de lipídeo, isto é, uma vesículade lipídeo não-iônica. Desse modo, VLPs homotípica ou heterotípica funcio-nais podem brotar como partículas envelopadas a partir das células infecta-das. As VLPs da gripe brotadas podem ser isoladas e purificadas por ultra-centrifugação ou cromatografia de coluna como substâncias de fármaco, eformuladas sozinhas ou com adjuvantes, tais como Novasomes®, um produ-to de Novavax, Inc., como produtos de fármaco, tais como vacinas. Nova-somes®, que proporciona um efeito imunológico aumentado, são adicional-mente descritos na Patente dos U.S. Ne 4.911.928, que é aqui incorporadapor referência.

A invenção proporciona um método para detecção de imunidadehumoral em infecção de vírus da gripe em um vertebrado pela provisão deum reágente de teste incluindo uma quantidade de proteína do vírus da gripetendo pelo menos um epítopo conformacional de uma estrutura macromole-cular do vírus da gripe. O reagente de teste é contactado com uma amostrade fluido corpóreo de um vertebrado a ser examinado para infecção de vírusda gripe. Os anticorpos específicos do vírus da gripe contidos na amostrasão permitidos se ligarem ao epítopo conformacional de uma estrutura ma-cromolecular do vírus da gripe para formar complexos de antígeno-anticorpo.Os complexos são separados de complexos não-ligados e contactados comum agente de ligação de imunoglobulina destacavelmente etiquetado. Aquantidade do agente de ligação de imunoglobulina destacavelmente etique-tado que é ligada aos complexos é determinada.

O vírus da gripe pode ser detectado em um espécime de um a-nimal ou ser humano suspeito de estar infectado com o vírus pela provisãode anticorpos, que têm uma etiqueta de produção de sinal detectável, ou sãofixados a um reagente destectavelmente etiquetado, tendo especificidadepara pelo menos um epítopo conformacional da partícula do vírus da gripe.O espécime é contactado com anticorpos, e os.anticorpos são permitidos seligarem ao vírus da gripe. A presença do vírus da gripe no espécime é de-terminada por meio da etiqueta detectável.

A invenção proporciona métodos para tratamento, prevenção egeração de uma resposta imune protetora pela administração a um verte-brado de uma quantidade efetiva da composição da invenção.

Alternativamente, a substância de fármaco de VLP da gripe podeser formulada como reagente de laboratório usado para estudos de estruturade vírus da gripe e ensaios diagnóstico clínicos. A invenção também propor-ciona um kit para tratamento do vírus da gripe pela administração de umaquantidade efetiva de uma composição da invenção, e direções para uso.

A invenção também proporciona uma VLP compreendendo pro-teínas HA, NA e M1 derivadas de um vírus de gripe aviária que causammorbidez ou mortalidade em um vertebrado. Em uma concretização, referi-das proteínas HA, NA e M1 são derivadas de um vírus tipo A de gripe aviá-ria. Em outra concretização, a HA é selecionada a partir do grupo consistin-do em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15eH16, e a NA é selecionada a partir do grupo consistindo em N1, N2, N3, N4,N5, N6, N7, N8 e N9. Em uma concretização adicional, referidas proteínasHA e NA são H9 e N2, respectivamente. Em outra concretização, referidaHA e/ou NA exibem atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuramini-dase, respectivamente. Em uma concretização, a VLP consiste essencial-mente em proteínas HA, NA e M1, isto é, estas são substancialmente as Cí-nicas proteínas da gripe na VLP.

A invenção também proporciona um método de produção deuma VLP compreendendo transfecção de vetores que codificam proteínasdo vírus da gripe aviária em uma célula hospedeira adequada, e expressãode referidas proteínas do vírus da gripe aviária sob condições que permitemque as VLPs sejam formadas. Em uma concretização, este método envolvetransfecção de uma célula hospedeira com moléculas de DNA recombinan-tes que codificam somente as proteínas da gripe HA, NA e M1.

A invenção também compreende uma formulação antigênicacompreendendo uma VLP compreendendo proteínas HA, NA e M1 deriva-das de um vírus de gripe aviária que pode causar morbidez ou mortalidadeem um vertebrado. Em outra concretização, a HA é selecionada a partir dogrupo consistindo em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12,H13, H14, H15 e H16, e a NA é selecionada a partir do grupo consistindo emN1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 e N9. Em uma concretização adicional, refe-ridas proteínas HA e NA são H5 e N1, respectivamente. Em outra concreti-zação, referidas proteínas HA e NA são H9 e N2, respectivamente. Em outraconcretização, referida formulação antigênica é administrada ao indivíduooralmente, intradermalmente, intranasalmente, intramuscularmente, intrape-ritonealmente, intravenosamente, ou subcutaneamente.

A invenção proporciona adicionalmente um método de vacinaçãode um vertebrado contra vírus da gripe aviária compreendendo administrar aoreferido vertebrado uma quantidade de indução de proteção de uma VLP com-preendendo proteínas HA, NA e M1 derivadas de um vírus de gripe aviária.

Esta invenção também compreende um método de induzir imu-nidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta, em um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP da gripe. Em uma concretização, referida VLP consisteessencialmente em HA, NA e M1. Em outra concretização, referida VLPcompreende proteínas da gripe, nas quais referida proteínas de gripe consis-tem de HA, NA e M1. Em outra concretização, referidas HA e/ou NA exibematividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectivamente.

Esta invenção também compreende um método de induzir imu-nidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta, em um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP da gripe aviária. Em uma concretização, referida VLP dagripe consiste essencialmente em HA, NA e M1 aviária. Em outra concreti-zação, referida VLP de gripe compreende proteínas da gripe, nas quais refe-ridas proteínas de gripe consistem de HA, NA e M1 aviária.

Esta invenção também compreende um método de induzir imu-nidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta, em-um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP da gripe sazonal. Em uma concretização, referida VLPda gripe consiste essencialmente em HA, NA e M1 sazonais. Em outra con-cretização, referida VLP da gripe compreende proteínas da gripe, nas quaisreferida proteínas de gripe consistem de HA, NA e M1 sazonais.

Esta invenção também compreende um método de induzir imu-nidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta, em um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP da gripe sazonal. Em uma concretização, referida VLPda gripe compreende HA, NA e M1 da gripe sazonais. Em outra concretiza-ção, referida VLP da gripe consiste essencialmente em HA, NA e M1 de gri-pe sazonais.

Esta invenção também compreende um método de induzir umaresposta de anticorpo substancialmente protetora a infecção de vírus da gri-pe, ou pelo menos um sintoma desta, em um indivíduo, compreendendoadministrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP da gripe.

Esta invenção compreende um método de induzir uma respostaimune celular substancialmente protetora a infecção de vírus da gripe, oupelo menos um sintoma desta, em um indivíduo, compreendendo administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP da gripe.

Esta invenção compreende adicionalmente um método de for-mular uma vacina que induz imunidade substancial a infecção de vírus dagripe, ou pelo menos um sintoma desta, em um indivíduo, compreendendoadicionar à referida formulação uma dose efetiva de uma VLP da gripe. Emuma concretização, referida imunidade substancial a infecção de vírus dagripe, ou pelo menos um sintoma desta, é distribuída em uma dose. Em ou-tra concretização, referida imunidade substancial a infecção de vírus da gri-pe, ou pelo menos um sintoma desta, é distribuída em doses múltiplas.

Esta invenção compreende adicionalmente uma vacina compre-endendo uma VLP da gripe, em que referida vacina induz imunidade subs-tancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta, quan-do administrada a um indivíduo. Em uma concretização, referida VLP da gri-pe é uma VLP da gripe aviária. Em outra concretização, referida VLP da gri-

Esta invenção compreende adicionalmente uma formulação an-tigênica compreendendo uma VLP da gripe, em que referida vacina induzimunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sin-toma desta, quando administrada a um indivíduo. Em uma concretização,referida VLP da gripe é uma VLP da gripe aviária. Em outra concretização,referida VLP da gripe é uma VLP da gripe sazonal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 representa a seqüência de nucleotídeo da gripe aviá-ria A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) do gene do vírus neuraminidase (NA)(SEQ ID NO:1).

A figura 2 representa a seqüência de nucleotídeo da gripe aviá-ria A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) do gene do vírus hemaglutinina (HA) (SEQID NO:2).

A figura 3 representa a seqüência de nucleotídeo da gripe aviá-ria A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) do gene da proteína matriz do vírus M1(M1) (SEQ ID NO:3).

A figura 4 representa os vetores de transferência para constructode baculovírus recombinantes para expressão de uma gripe aviária A/HongKong/1073/99 (H9N2) de proteínas HA, NA e M1.

A figura 4A representa um vetor de transferência para expressãode genes individuais, e a figura 4B representa o vetor de transferência paramultiexpressão dos genes.

A figura 5 representa a expressão de gripe aviária A/HongKong/1073/99 (H9N2) de proteínas de vírus HA, NA e M1 em células Sf-9S.

A figura 6 representa a purificação de gripe aviária A/HongKong/1073/99 (H9N2) de VLPs pelo método de gradiente de densidade desacarose.

A figura 7 representa a detecção da proteína de vírus da gripepor cromatografia de filtração de gel. Os anticorpos usados na análise dewestern blot são como segue: (A) coelho anti-H9N2; (b) murina anti-M1 mAb;e (C) murina anti-BACgp64.

A figura 8 representa a detecção de gripe aviária A/HongKong/1073/99 (H9N2) de proteínas incluindo partículas subvirais, VLP, ecomplexos de VLP, por microscopia de elétron.

A figura 9 representa a atividade de hemaglutinação de gripeaviária purificada A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) de VLPs.

A figura 10 representa a atividade de neuraminidase de gripeaviária purificada A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) de VLPs.

A figura 11 representa a imunização e tabela de geração para oestudo de imunogenecidade de gripe recombinante com gripe aviária purifi-cada A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) de VLPs em camundongos.

A figura 12 representa os resultados de um estudo de imunoge-necidade em camundongos imunizados com VLPs de gripe recombinanteH9N2. A figura 12A representa soros de camundongos BALB/c imunizadoscom VLPs recombinantes compreendidas de proteínas HA, NA e M1 de ví-rus de gripe aviária tipo A/Hong Kong/1073/99. A figura 12B representa so-ros de coelhos brancos da Nova Zelândia imunizados com um vírus da gripeaviária inativado tipo A H9N2 que foram reagidos com manchas de Westerncontendo vírus da gripe aviária inativado tipo A H9N2 (raias 1 e 3), ou vírusda gripe aviária adaptado ao frio tipo A H9N2 (raias 2 e 4).

A figura 13 representa as respostas de anticorpo em média ge-ométrica em camundongos BALBI/c após uma imunização primária e secun-dária.

A figura 14 representa respostas de inibição de hemaglutinina desoro (HI) em camundongos BALBI/c.A figura 15 representa perda de peso (%) em camundongosBALBI/c provocada com gripe H9N2.

A figura 16 representa titulações de vírus de pulmão em 3 e 5dias pós provocação com H9N2.

As figuras 17A, 17B e 17C representam resposta de anticorpode camundongos para A/Fujian/411/2002 quando imunizado com H3N2 VLP.

As figuras 18A e Figura 18B representam isótopos de anticorpoIgG de camundongos.

A figura 19 representa respostas de anticorpo de inibição dehemaglutinina (HI) em Ratos SD imunizados com vacina de H9N2 VLP.

A figura 20A e figura 20B representam respostas de anticorpo deinibição de hemaglutinina (HI) em doses diferentes de H9N2 VLPs com esem adjuvante em camundongos BALBI/c.

A figura 21 representa respostas de inibição de hemaglutinina desoro (HI) em camundongos BALBI/c entre doses diferentes de VLPs.

A figura 22 representa respostas de inibição de hemaglutinina desoro (HI) em furões.

A figura 23 representa respostas de inibição de hemaglutinina desoro (HI) de soro coletado nos dias 21 e 42 de furões após administração decepas diferentes de H3N2 VLPs.

A figura 24 representa Anticorpo anti-HA (Titulações de Diluiçãode Ponto Final) de camundongos inoculados intramuscularmente com H5N1(Vietnam/1203/2003) de VLPs em doses baixas.

A figura 25 representa Anticorpo anti-HA (Titulação de Diluiçãode Ponto Final) de camundongos inoculados intranasalmente com H5N1 (Vi-etnam/1203/2003) de VLPs em doses baixas.

A figura 26 representa um exemplo para fabricação, isolamentoe purificação de VLPs da invenção.

A figura 27 representa camundongos inoculados com H3N2VLPs dados intramuscularmente, e subseqüentemente provocados intrana-salmente com vírus A/Aichi/2/68x3 (H3N2).

A figura 28 representa camundongos inoculados com H3N2VLPs dados intranasalmente, e subseqüentemente provocados intranasal-mente com vírus A/Aichi/2/68x3 (H3N2).

A figura 29 representa blindagem de vírus em lavagens nasaisde furão inoculado com vacina de H9N2 VLP, e subseqüentemente provoca-do intranasalmente com vírus H9N2.

As figuras 30A, 30B, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30H representamrespostas de anticorpo de inibição de hemaglutinina (HI) em camundongos a-pós inoculação com doses diferentes de A/Fujian/411/2002(H3N2)VLPs in-tramuscularmente ou intranasalmente testados contra cepas diferentes deH3N2 de vírus da gripe.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui usado, o termo "baculovírus", também conhecidocomo baculoviridae, se refere a uma família de vírus de DNA envelopadosde artrópodes, membros dos quais podem ser usados como vetores de ex-pressão para produção de proteínas recombinantes em culturas de célula deinseto. O virion contém um ou mais nucleocapsídeos em forma de hastecontendo uma molécula de DNA de trança dupla superespiralado circular (Mr54 χ 106 - 154 χ 106). O vírus usado como um vetor é geralmente vírus depolihedrose nuclear Autographa californica (NVP). A expressão de genesintroduzidos está sob o controle do promotor forte que normalmente regula aexpressão do componente de proteína polihedrona da inclusão nucleargrande em que os vírus são embutidos nas células infectadas.

Conforme aqui usado, o termo "derivado de" se refere a origemou fonte, e podem incluir moléculas que ocorrem naturalmente, moléculasrecombinantes, moléculas não-purificadas, ou moléculas purificadas. As pro-teínas e moléculas da presente invenção podem ser derivadas de moléculasde gripe ou moléculas diferentes da gripe.

Conforme aqui usado, o termo "primeira" proteína de vírus dagripe, isto é, uma primeira proteína M1 de vírus da gripe, se refere a umaproteína, tal como M1, HA, NA e M2, que é derivada de uma cepa particularde vírus da gripe. A cepa ou tipo do primeiro vírus da gripe difere da cepa outipo da segunda proteína de vírus da gripe. Desse modo, a "segunda" prote-ína M1 de vírus da gripe, se refere a uma proteína, tal como M1, HA, NA eM2, que é derivada de uma segunda cepa de vírus da gripe, que é uma cepadiferente ou tipo do que a primeira proteína de vírus da gripe.

Conforme aqui usado, o termo "atividade de hemaglutinina" serefere a capacidade de proteínas contendo HA1 VLPs, ou porções destas,para ligar e aglutinar células sangüíneas vermelhas (eritrócitos).

Conforme aqui usado, o termo "atividade de neuraminidase" serefere a atividade enzimática de proteínas contendo NA, VLPs, ou porçõesdestas, para clivar resíduos de ácido siálico de substratos incluindo proteí-nas tal como fetuína.

Conforme aqui usado, o termo "heterotípico" se refere a um oumais tipos diferentes ou cepas de vírus.

Conforme aqui usado, o termo "homotípico" se refere a um tipoou cepa de vírus.

Conforme aqui usado, o termo "estrutura de proteína macromo-lecular" se refere a constructo ou arranjo de uma ou mais proteínas.

Conforme aqui usado, o termo vacina "multivalente" se refere auma vacina contra tipos múltiplos ou cepas de vírus da gripe.

Conforme aqui usado, o termo "não-gripe" se refere a uma prote-ína ou molécula que não é derivada do vírus da gripe.

Conforme aqui usado, o termo "vacina" se refere a uma prepara-ção de patogenias mortas ou enfraquecidas, ou de determinantes antigêni-cos derivados, que é usada para induzir formação de anticorpos ou imunida-de contra a patogenia. Uma vacina é dada para proporcionar imunidade àdoença, por exemplo, gripe, que é causada pelos vírus da gripe. A presenteinvenção proporciona composições de vacina que são imunogênicas, e pro-porcionam proteção. Em adição, o termo "vacina" também se refere a umasuspensão ou solução de um imunogen (por exemplo, VLP) que é adminis-trada a um vertebrado para produzir imunidade protetora, isto é, imunidadeque reduz a severidade da doença associada com a infecção.

Conforme aqui usado, o termo "imunidade substancial" se referea uma resposta imune em que quando VLPs da invenção são administradasa um vertebrado, existe uma indução do sistema imune no referido vertebra-do, que resulta na prevenção de infecção de gripe, melhora da infecção degripe, ou redução de pelo menos um sintoma relacionado a infecção de vírusda gripe no referido vertebrado. Imunidade substancial pode também se re-ferir a uma titulação de inibição de hemaglutinação (HI) de £ 40 em um ma-mífero em que as VLps da invenção foram administradas, e têm induzidauma resposta imune.

Conforme aqui usado, o termo "adjuvante" se refere a um com-posto que, quando usado em combinação com um imunogem específico (porexemplo, uma VLP) em uma formulação, aumenta ou, de outro modo, alteraou modifica a resposta imune resultante. A modificação da resposta imuneinclui intensificação ou ampliação da especificidade de qualquer ou ambosanticorpo e respostas imunes celulares. A modificação da resposta imunepode também significar diminuição ou supressão de certas respostas imunesespecíficas de antígeno.

Conforme aqui usado, o termo "estimulador imune" se refere aum composto que aumenta uma resposta imune via mensageiros químicosdo próprio corpo (citoquinas). Estas moléculas compreendem várias citoqui-nas, Iinfoquinas e quimioquinas com atividades imunoestimulatórias, de imu-nopotenciação e pró-inflamatórias, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, granu-lócito-macrófago (GM)-fator de estimulação de colônia (CSF)); e outras mo-léculas imunoestimulatórias, tais como fator inflamatório de macrófago, Iigan-te Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas estimuladoras imunes podem ser ad-ministradas na mesma formulação como as VLps da gripe, ou podem seradministradas separadamente. Ou a proteína ou um vetor de expressão quecodifica a proteína podem ser administrados para produzir um efeito imuno-estimulatório.

Conforme aqui usado, o termo "dose efetiva" geralmente se refe-re àquela quantidade da VLP da invenção suficiente para induzir imunidade,para prevenir e/ou melhorar infecção de vírus da gripe, ou reduzir pelo me-nos um sintoma de infecção de gripe, e/ou aumentar a eficácia de outra dosede uma VLP. Uma dose efetiva se refere a quantidade da VLP suficiente pa-ra retardar ou minimizar o começo de uma infecção de gripe. Uma dose efe-tiva pode também se referir a quantidade da VLP que proporciona um bene-fício terapêutico no tratamento, ou controle de infecção de vírus. Adicional-mente, uma dose efetiva é a quantidade com relação as VLPs da invençãosozinha, ou em combinação com outras terapias, que proporciona um bene-fício terapêutico no tratamento, ou controle de uma infecção viral de gripe.

Uma dose efetiva pode também ser a quantidade suficiente para aumentaruma resposta imune do próprio indivíduo (por exemplo, ser humano) contrauma exposição subseqüente ao vírus da gripe. Os níveis de imunidade po-dem ser monitorados, por exemplo, pela medição das quantidades de neu-tralização secretória e/ou anticorpos de soro, por exemplo, neutralização deplaca, fixação de complemento, imunossorvente ligado a enzima, ou ensaiode microneutralização. No caso de uma vacina, uma "dose efetiva" é umaque previne doença, ou reduz a severidade de sintomas.

Conforme aqui usado, o termo "vírus de gripe aviária" se refereaos vírus da gripe encontrados principalmente em pássaros que tambémpodem infectar ser humanos ou outros animais. Em alguns exemplos, vírusde gripe aviárias podem ser transmitidos ou difundidos de um ser humanopara outro. Um vírus de gripe aviária que infecta ser humanos tem o poten-cial de causar uma gripe pandêmica, isto é, morbidez e/ou mortalidade emseres humanos. Uma doença pandêmica ocorre quando uma nova cepa devírus da gripe (um vírus em que ser humano não tem imunidade natural)emerge, se difundindo além de localidades individuais, possivelmente emtorno do globo, e infectando muitos seres humanos imediatamente.

Conforme aqui usado, o termo "vírus da gripe sazonal" se referea cepas virais de gripe que foram determinadas por estarem passando den-tro da população humana para uma dada estação de gripe baseada nas vi-sões epidemiológicas conduzidas pelos Centros Nacionais de Gripe ao redordo mundo. Estes estudos epidemiológicos, e alguns vírus da gripe isolados,são enviados para um dos laboratórios de referência da Organização Mundi-al de Saúde (WHO), um dos quais está nos Centros de Prevenção e Contro-Ie de Doença (CDC) em Atlanta para teste detalhado. Estes laboratórios tes-tam como anticorpos produzidos para a vacina atual reagem ao vírus circu-lante, e novos vírus da gripe. Esta informação, junto com a informação daatividade da gripe, é resumida e apresentada a um comitê consultivo da Ad-ministração de Alimento e Fármaco dos Estados Unidos (FDA), e em umencontro da WHO. Estes encontros resultam na seleção de três vírus (doissubtipos de vírus de gripe A e um vírus de gripe B) para irem nas vacinasseguindo outono e inverno. A seleção ocorre em fevereiro para o hemisférionorte, e em setembro para o hemisfério sul. Usualmente, uma ou duas dastrês cepas de vírus na vacina mudam cada ano.

Conforme aqui usado, o termo "resposta de anticorpo substanci-almente protetora" se refere a uma resposta imune mediada por anticorposcontra um vírus da gripe, que é exibida por um vertebrado (por exemplo, serhumano), que previne ou melhora infecção da gripe, ou reduz pelo menos umsintoma desta. As VLPs da invenção podem estimular a produção de anti-corpos que, por exemplo, neutralizam anticorpos que bloqueiam vírus da gripede entrar nas células, bloqueia replicação de referido vírus da gripe pela li-gação ao vírus, e/ou protege células hospedeiras de infecção e destruição.

Conforme aqui usado, o termo "resposta celular substancialmen-te protetora" se refere a uma resposta imune que é mediada por linfócitos T,e/ou outras células sangüíneas brancas contra vírus da gripe, exibida por umvertebrado (por exemplo, ser humano), que previne ou melhora infecção degripe, ou reduz pelo menos um sintoma desta. Um aspecto importante deimunidade celular envolve uma resposta específica de antígeno por células Tcitolíticas ("CLT"s). CTLs têm especificidade para antígenos de peptídeo quesão apresentados em associação com proteínas codificadas pelo complexode histocompatibilidade maior (MHC) e expressos nas superfícies das célu-las. As CLTs ajudam a induzir e promover a destruição de micróbios intrace-lulares, ou a Iysis de células infectadas com tais micróbios. Outro aspecto deimunidade celular envolve uma resposta específica de antígeno por células Tauxiliadoras. As células T auxiliadoras agem para ajudar a estimular a fun-ção, e focalizar a atividade de células executoras não-específicas contra cé-lulas revelando antígenos de peptídeo em associação com moléculas deMHC em sua superfície. Uma "resposta imune celular" também se refere aprodução de citoquinas, qiomioquinas e outras tais moléculas produzidas porcélulas T ativadas, e/ou outras células sangüíneas brancas, incluindo aque-las derivadas de células T CD4+ e CD8+.

Conforme aqui usado, o termo "imunidade substancial em umabase ampla de população" se refere a imunidade como um resultado deVLPs da invenção administradas a indivíduos em uma população. A imuni-dade no referido indivíduo na referida população resulta na prevenção, me-lhora de infecção de gripe, ou redução de pelo menos um sintoma relacionadoa infecção de vírus da gripe, e previne a difusão de referido vírus da gripe a ou-tros na população. O termo população é definido como grupo de indivíduos(por exemplo, crianças que freqüentam a escola, pessoas idosas, indivíduossaudáveis, etc.), e pode compreender uma área geográfica (por exemplo,cidades, escolas, circunvizinhanças, local de trabalho, cidade, estado, etc).

Conforme aqui usado, o termo "formulação antigênica" ou "com-posição antigênica" se refere a uma preparação que, quando administrada aum vertebrado, especialmente um pássaro ou um mamífero, induzirá umaresposta imune.

Conforme aqui usado, o termo "vertebrado" ou "indivíduo" ou"paciente" se referem a qualquer membro do subfilo cordata, incluindo, semlimitação, humanos e outros primatas, incluindo primatas não-humanos, taiscomo chimpanzés e outras espécies de macaco. Animais de fazenda, taiscomo gado bovino, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésti-cos, tais como cães e gatos; animais de laboratório, incluindo roedores, taiscomo camundongos, ratos e porquinhos-da-índia; pássaros, incluindo do-mésticos, selvagem e de caça, tais como galinhas, perus e outros pássarosgalináceos, patos, gansos, e similares, são também exemplos não limitativos.

Os termos "mamíferos" e "animais" são incluídos nesta definição. Ambos indi-víduos adultos e recém-nascidos são pretendidos para serem cobertos.

A gripe permanece um interesse difundido de saúde pública a-pesar da disponibilidade de vacinas de vírus inativada específica que são60-80% efetiva sob condições ótimas. Quando estas vacinas são efetivas, adoença é usualmente evitada, prevenindo-se infecção viral. A falha da vaci-na pode ocorrer como um resultado de diferenças antigênicas acumuladas(alteração antigênica e curso antigênico). Por exemplo, vírus da gripe aviáriatipo A H9N2 co-circulada com vírus da gripe humana tipo A Sydney/97(H3N2) em porcos, e conduzem a reagrupamento e emergência genéticasde novas cepas de vírus da gripe humana com potencial pandêmico (Peiriset ai, 2001). No caso de tal alteração antigênica, é improvável que as vaci-nas atuais proporcionariam proteção adequada.

Outra razão para a escassez de programas de vacina de gripe éa persistência relativamente curta de imunidade induzida pelas vacinas atu-ais. A inadequação adicional de medidas de controle da gripe reflete o usorestrito das vacinas atuais devido a reatogenecidade da vacina e efeitos co-laterais em crianças jovens, pessoas de idade, e pessoas com alergia acomponentes de ovos, que são usados no fabricação de vacinas de gripeinativadas comercialmente licenciadas.

Adicionalmente, as vacinas de vírus da gripe inativadas freqüen-temente carecem ou contêm epítopes conformacionais HA e Na alterados,que induzem neutralização de anticorpos, e desempenham um papel maiorna proteção contra doença. Desse modo, vacinas virais inativadas, bem co-mo algumas vacinas de proteína de subunidade de gripe monomérica re-combinante, distribuem proteção inadequada. Por outro lado, estruturas deproteína macromolecular, tais como capsômeros, partículas subvirais, e/ouVLPs, incluem cópias múltiplas de proteínas nativas que exibem epítopesconformacionais, que são vantajosos para imunogenicidade de vacina ótima.

A presente invenção descreve a clonagem de genes HA, NA e M1de vírus da gripe aviária A/Hong Kong/107399 (H9N2) em um vetor de expres-são de baculovírus simples sozinho ou em tandem, e produção de vacinasde gripe candidatas ou reagentes compreendidos de proteínas estruturais degripe recombinantes que se auto-reunem em estruturas de proteína macro-molecular homotípica funcional e imunogênica, incluindo partículas de gripesubviral e VLP de gripe, em células de inseto infectadas de baculovírus.A presente invenção descreve a clonagem de genes HA, NA,M1, M2 e NP de vírus da gripe humana A/Sydney/5/97 e A/Fuijan/411/2002(H3N2) em vetores de expressão de baculovírus, e produção de vacinas degripe candidatas ou reagentes compreendidos de proteínas estruturais degripe que se auto-reunem em estruturas de proteína macromolecular homo-típica funcional e imunogênica, incluindo partículas de gripe subviral e VLPde gripe, em células de inseto infectadas de baculovírus.

Em adição, a presente invenção descreve a clonagem do geneHA de gripe humana A/Sydney/5/97 e A/Fuijan/411 (H3N2) e genes HA, NAe M1 de vírus da gripe aviária A/Hong Kong/107399 (H9N2) em um vetor deexpressão de baculovírus simples sozinho ou em tandem, e produção devacinas de gripe candidatas ou reagentes compreendidos de proteínas es-truturais de gripe que se auto-reunem em estruturas de proteína macromole-cular heterotípica funcional e imunogênica, incluindo partículas de gripe sub-viral e VLP de gripe, em células de inseto infectadas de baculovírus.

VLPs da Invenção

As VLPs da gripe da invenção são úteis para preparação de va-cinas contra vírus da gripe. Uma característica importante deste sistema é acapacidade de substituir as glicoproteínas de superfície com subtipos dife-rentes de proteína NA, ou outras proteínas virais, permitindo, desse modo,atualização de novas variantes antigênicas de gripe todo ano para prepararuma doença pandêmica de gripe. A medida que as variantes antigênicasdestas glicoproteínas são identificadas, as VLPs podem ser atualizadas paraincluir estas novas variantes (por exemplo, para vacinas de gripe sazonais).

Em adição, glicoproteínas de superfície de vírus potencialmente padêmicas,tais como H5N1, ou outras combinações de HA, NA com potencial pandêmi-co, podem ser incorporadas nas VLPs sem interesse de liberação de genesque não tenham circulado em ser humanos por várias décadas. Isto é por-que as VLPs não são infecciosas, não replicam, e não podem causar doen-ça. Desse modo, este sistema permite a criação de uma nova vacina de gri-pe candidata todo ano, e/ou uma vacina pandêmica de gripe sempre que énecessário.Existem 16 hemaglutininas (HA) diferentes e 9 neuraminidases(NA) diferentes, todos dos quais verificados entre pássaros selvagens. Ospássaros selvagens são os reservatórios naturais principais para todos ostipos de vírus de gripe A, e são considerados serem a fonte de todos os tiposde vírus de gripe A em todos os outros vertebrados. Estes subtipos diferemdevido as mudanças na hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) em suasuperfície. Muitas combinações diferentes de proteínas HA e NA são possí-veis. Cada combinação representa um tipo diferente de vírus da gripe A. Emadição, cada tipo pode ser adicionalmente classificado em cepas baseadas nas mutações diferentes encontradas em cada um de seus 8 genes.

Todos os tipos conhecidos de vírus da gripe A podem ser encon-trados em pássaros. Usualmente os vírus da gripe aviária não infectam se-res humanos. Contudo, alguns vírus da gripe aviária desenvolvem variaçõesgenéticas associadas com a capacidade de cruzamento da barreira de es-pécie. Tal vírus é capaz de causar uma doença pandêmica porque os sereshumanos não têm imunidade natural ao vírus, e podem facilmente se difundirde pessoa para pessoa. Em 997, o vírus da gripe aviária pulava de um pás-saro para um ser humano em Hong Kong durante deflagração de gripe depássaro em aves domésticas. Este vírus foi identificado como vírus da gripeH5N1. Este vírus causou doença respiratória severa em 8 pessoas, seis dasquais morreram. Desde este tempo, muito mais casos de infecções de H5N1conhecidas ocorreram entre seres humanos ao redor do mundo; aproxima-damente metade destas pessoas morreram.

Desse modo, a presente invenção envolve a clonagem de nu- cleotídeos de HA, NA e Ml de vírus da gripe aviária, vírus da gripe com po-tencial pandêmico e/ou vírus da gripe1 sazonal ém vetores de expressão. Apresente invenção também descreve a produção de vacinas de gripe candi-datas ou reagentes compreendidos de proteínas de gripe que se auto-reunem em VLPs funcionais. Todas as combinações de proteínas virais de-vem ser co-expressas com um nucleotídeo de M1.

As VLPs da invenção consistem ou compreendem proteínas HA,NA e M1 da gripe. Em uma concretização, referida VLP compreende umaHA de um vírus da gripe aviária, pandêmica e/ou sazonal, e uma NA de umvírus da gripe aviária, pandêmica e/ou sazonal, em que referida HA é sele-cionada a partir do grupo consistindo em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8,H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e H16, e referida NA é selecionada apartir do grupo consistindo em N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 e N9. Emoutra concretização, a invenção compreende uma VLP que consiste essen-cialmente em HA, NA e M1. Referidas HA e NA podem ser a partir da listaacima de HA e NA. Estas VLPs podem compreender proteínas de gripe adi-cionais e/ou contaminantes de proteína em concentrações desprezíveis. Emoutra concretização, referida VLP da gripe compreende proteínas da gripe,em que referidas proteínas da gripe consistem de proteínas HA, NA e M1.Estas VLPs contêm HA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares,tais como proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidra-tos, etc., mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do que frag-mentos de M1, HA e/ou NA). Em outra concretização, a HA e/ou NA podemexibir atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respecti-vamente, quando expressas na superfície das VLPs.

Em outra concretização, referida VLP compreende HA e NA dovírus H5N1 e uma proteína M1 (a proteína M1 pode ou não pode ser damesma cepa viral). Em outra concretização, referida VLP consiste essenci-almente em HA e NA do vírus H5N1 e uma proteína M1. Estas VLPs podemcompreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantes de proteínaem concentrações desprezíveis. Em uma concretização adicional, referidaVLP consiste de HA, NA do vírus H5N1 e uma proteína M1. Em outra con-cretização, referida VLP de gripe compreende proteínas de gripe, em quereferidas proteínas de gripe consistem de H5, N1 e proteínas M1. EstasVLPs contêm H5, N9 e M1, e podem conter constituintes celulares, tais co-mo proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc.,mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do que fragmentos deM1, H5 e/ou N1). Em outra concretização, o H5 e/ou N1 podem exibir ativi-dade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectivamente,quando expressos na superfície das VLPs.Em outra concretização, referida VLP compreende a HA e NA dovírus H9N2, e uma proteína M1. Em outra concretização, referida VLP con-siste essencialmente na HA e NA do vírus H9N2 e uma proteína M1. EstasVLPs podem compreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantesde proteína em concentrações desprezíveis. Em uma concretização, referidaVLP consiste na HA e NA do vírus H9N2 e uma proteína M1. Em outra con-cretização, referida VLP de gripe compreende proteínas de gripe, em quereferidas proteínas de gripe consistem de H9, N2 e proteínas M1. EstasVLPs contêm H9, N2 e M1, e podem conter constituintes celulares adicio-nais, tais como proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, car-boidratos, etc., mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do quefragmentos de M1, H9 e/ou N2). Em outra concretização, o H9 e/ou N2 po-dem exibir atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, res-pectivamente, quando expressos na superfície das VLPs.

Em outra concretização, referida VLP compreende a HA e NA deum vírus da gripe B, e uma proteína M1. Os vírus da gripe B são usualmenteencontrados somente em seres humanos. Diferentes dos vírus da gripe A,estes vírus não são classificados de acordo com o subtipo. Os vírus da gripeB podem causar morbidez e mortalidade entre seres humanos, mas, em ge-ral, estão associados com doenças epidêmicas menos severas do que osvírus da gripe A. Em outra concretização, referida VLP consiste essencial-mente na HA e NA do vírus da gripe B, e uma proteína M1. Estas VLPs po-dem compreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantes de pro-teína em concentrações desprezíveis. Em outra concretização, referida VLPda gripe compreende proteínas de gripe, em que referidas proteínas de gripeconsistem de HA, NA e proteínas M1. Estas VLPs contêm HA, NA e M1, epodem conter constituintes celulares adicionais, tais como proteínas celula-res, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc., mas não contêmproteínas de gripe adicionais (outras do que fragmentos de M1, HA e/ouNA). Em outra concretização, referida VLP consiste na HA e NA do vírus dagripe B, e uma proteína M1. Em outra concretização, a HA e/ou a NA podemexibir atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respecti-vãmente, quando expressas na superfície das VLPs.

A invenção também envolve variantes das referidas proteínas dagripe expressas em ou nas VLPs da invenção. As variantes podem conteralterações nas seqüências de aminoácido das proteínas constituintes. Otermo "variante" com relação a um polipeptídeo se refere a uma seqüênciasde aminoácido que é alterada por um ou mais aminoácidos com relação auma seqüências de referência. A variante pode ter mudanças "conservati-vas", nas quais um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ouquímicas similares, por exemplo, substituição de Ieucina com isoleucina. Al-ternativamente, uma variante pode ter mudanças "não-conservativas", porexemplo, substituição de uma glicina com uma triptofan. Variantes menoresanálogas podem também incluir retirada ou inserção de aminoácido, ou am-bas. A orientação na determinação que resíduos de aminoácido podem sersubstituídos, inseridos ou retirados sem eliminação da atividade biológica ouimunológica, pode ser encontrada usando-se programas de computadorbem-conhecidos na técnica, por exemplo, software DNASTAR.

Variantes naturais podem ocorrer devido a cursos antigênicos.Os cursos antigênicos são mudanças pequenas nas proteínas virais que o-correm continuamente com o tempo. Desse modo, uma pessoa infectadacom uma cepa de vírus da gripe particular desenvolve anticorpo contra estevírus, a medida que cepas de vírus mais recentes aparecem, os anticorposcontra as cepas mais antigas não mais reconhecem o vírus mais recente, enova infecção pode ocorrer. Isto é porque existe uma nova vacina para gripeem cada estação. Em adição, algumas mudanças em um vírus da gripe po-dem fazer com que o vírus da gripe atravesse espécies. Por exemplo, algunsvírus da gripe aviária desenvolveram variações associadas com a capacida-de de atravessarem a barreira da espécie. Tal vírus é capaz de causar umadoença pandêmica porque as pessoas não têm imunidade natural ao vírus, eo vírus pode facilmente se difundir de pessoa para pessoa. Estas variaçõesque ocorrem naturalmente das proteínas de gripe são uma concretização dainvenção.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares,que são aplicáveis à presente invenção, tais como, clonagem, mutação, cul-tura de célula, e similares, incluem Berger and Kimmel, Guide to MolecularCloning Techniques in Enzymology, volume 152, Academic Press, Inc., SanDiego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A LaboratoryManual (3rd Ed.), Vol. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-bor, N. Y., 2000 ("Sambrook"), e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Pu-blishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Estes textosdescrevem mutagênese, o uso de vetores, promotores, e muitos outros tópi-cos relacionados a, por exemplo, clonagem e mutação de moléculas de HAe/ou de NA1 etc. Desse modo, a invenção também envolve o uso de méto-dos conhecidos de projeto de proteína e tecnologia de DNA recombinantepara aperfeiçoar ou alterar as características das proteínas da gripe expres-sas em ou nas VLPs da invenção. Vários tipos de mutagênese podem serusados para produzir e/ou isolar variante de HA, NA e/ou moléculas de M1,e/ou adicionalmente modificar/efetuar mutação dos polipeptídeos da inven-ção. Eles incluem, mas não estão limitados a, mutagênese de ponto aleató-rio de local direcionado, recombinação homóloga (mistura de DNA), mutagê-nese usando gabaritos contendo uracil, mutagênese direcionada por oligo-nucleotídeo, mutagênese de DNA modificado por fosforotioato, mutagêneseusando DNA duplex com folga, ou similares. Métodos adequados adicionaisincluem reparo de desacordo de ponto, mutagênese usando cepas hospe-deiras deficientes de reparo, mutagênese de restrição-seleção e mutagêne-se de restrição-purificação, mutagênese de retirada, mutagênese por síntesede gene total, reparo de quebra de cepa dupla, e similares. A mutagênese,por exemplo, envolvendo constructos quiméricos, é também incluída na pre-sente invenção. Em uma concretização, a mutagênese pode ser guiada porinformação conhecida da molécula que ocorre naturalmente, ou molécula queocorre naturalmente alterada ou mudada, por exemplo, seqüência, compara-30ções de seqüência, propriedades físicas, estrutura de cristal, ou similares.

A invenção compreende adicionalmente variantes de proteína degripe que mostram atividade biológica substancial, por exemplo, capaz deinduzir uma resposta efetiva de anticorpo quando expressa em ou em umaVLP. Tais variantes incluem anulações, inserções, inversões, repetições, esubstituições selecionadas de acordo com as regras gerais conhecidas natécnica de modo a ter pouco efeito na atividade.

Métodos de clonagem de referidas proteínas de gripe são co-nhecidos na técnica. Por exemplo, o gene da gripe que codifica uma proteí-na de gripe específica pode ser isolado por RT-PCR de mRNA polialdenila-tado extraído de células que foram infectadas com um vírus da gripe. O geneproduto resultante pode ser clonado como um inserto de DNA em um vetor.O termo "vetor" se refere aos meios pelos quais um ácido nucléico pode serpropagado e/ou transferido entre organismo, células, ou componentes celu-lares. Os vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fage-mídeos, transposons, cromossomos artificiais, e similares, que replicam au-tonomamente, ou podem se integrar em um cromossomo de uma célulahospedeira. Um vetor pode também ser um polinucleotídeo de RNA despro-tegido, um polinucleotídeo de DNA desprotegido, um polinucleotídeo com-posto de ambos DNA e RNA dentro da mesma cepa, uma polilisina-DNA ouRNA conjugado, um peptídeo-DNA ou RNA conjugado, um Iipossomo-DNAconjugado, ou similares, que não estejam autonomamente replicando. Emmuitas, mas não todas concretizações comuns, os vetores da invenção sãoplasmídeos ou bacmídeos.

Desse modo, a invenção compreende nucleotídeos que codifi-cam as proteínas da gripe HA1 NA e/ou M1 clonadas em um vetor de ex-pressão que pode ser expresso em uma célula que induz a formação deVLPs. Um "vetor de expressão" é um vetor, tal como plasmídeo, que é capazde promover expressão, bem como a replicação de um ácido nucléico incor-porado neste. Tipicamente, o ácido nucléico a ser expresso é "operavelmen-te ligado" a um promotor e/ou intensificador, e é submetido a controle regula-tório de transcrição pelo promotor e/ou intensificador. Em uma concretiza-ção, referidos nucleotídeos que codificam para HA de um vírus da gripe aviá-ria, pandêmica e/ou sazonal são selecionados a partir do grupo consistindoem H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 eΗ16. Em outra concretização, referidos nucleotídeos que codificam para NAde um vírus da gripe aviária, pandêmica e/ou sazonal são selecionados apartir do grupo consistindo N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 e N9. Em outraconcretização, referido vetor compreende nucleotídeos que codificam a pro-teína de gripe HA, NA e/ou M1. Em outra concretização, referido vetor con-siste de nucleotídeos que codificam a proteína da gripe HA, NA e M1. Umvetor de expressão preferido é um vetor baculovírus. Após os nucleotídeosque codificam referidas proteínas da gripe tiverem sido clonados, referidosnucleotídeos podem ser adicionalmente manipulados. Por exemplo, um ver-sado na técnica pode efetuar mutação de bases específicas na região decodificação para produzir variantes. As variantes podem conter alteraçõesnas regiões de codificação, regiões de não-codificação, ou ambas. Tais vari-antes podem aumentar a imunogenicidade de uma proteína da gripe, ou re-mover um local de união de uma proteína ou RNA. Por exemplo, em umaconcretização, os locais de união doador ou receptor da proteína M da gripe(comprimento total) sofrem mutação para prevenir união da M mRNA emtranscrições de M1 e M2. Em outra concretização, a HA é projetada pararemover ou efetuar mutação no local de clivagem. Por exemplo, H5 HA tiposelvagem tem um local de clivagem que contém aminoácidos básicos múlti-pios (RRRKR). Esta seqüência tipo selvagem torna a HA mais susceptível aproteases ubiquitosas múltiplas que podem estar presentes em hospedeiroou sistemas de expressão destas HAs. Em uma concretização, a remoçãodestes aminoácidos pode reduzir a susceptibilidade da HA em várias protea-ses. Em outra concretização, o local de clivagem pode sofrer mutação para remover o local de clivagem (por exemplo, efetuar mutação para RESR).

A invenção também utiliza ácido nucléico e polipeptídeos quecodificam HA, NA e M1. Em uma concretização, um ácido nucléico ou prote-ína de NA de gripe é pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%idêntico a SEQ ID NOS 1, 11, 31, 32, 39, 38, 46, 47, 54 ou 55. Em outraconcretização, um ácido nucléico ou proteína de HA de gripe é pelo menos85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a SEQ ID NOS 2, 10, 56,57, 58, 27, 28, 29, 30, 37, 36, 33, 34, 35, 42, 43, 44, 45, 50, 51, 52 ou 53.Em uma concretização, um ácido nucléico ou proteína de M1 de gripe é pelomenos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a SEQ ID NOS 12,40, 41, 48 ou 49.

Em algumas concretizações, alterações contendo mutações queproduzem substituições, adições ou anulações tranqüilas, mas não alteramas propriedades ou atividades da proteína codificada, ou como as proteínas,são feitas. As variantes de nucleotídeo podem ser produzidas por uma vari-edade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de códon para umhospedeiro particular (os códons mudam no mRNA humano para aquelespreferidos por células de inseto, tais como células Sf9). Vide publicação depatente dos U.S. 2005/0118191, aqui incorporada por referência em sua to-talidade para todas as propostas. Exemplos de seqüências de códon otimi-zadas da invenção são revelados abaixo (por exemplo, SEQ ID 42, 44, 46,48, 50, 52 e 54).

Em adição, os nucleotídeos podem ser seqüenciados para as-segurar que as regiões de codificação corretas fossem clonadas, e não con-tivessem quaisquer mutações indesejadas. Os nucleotídeos podem ser sub-clonados em um vetor de expressão (por exemplo, baculovírus) para ex-pressão em qualquer célula. O acima é somente um exemplo de como asproteínas virais da gripe podem ser clonadas. Um versado na técnica com-preende que métodos adicionais estão disponíveis, e são possíveis.

A invenção também proporciona constructos e/ou vetores quecompreendem nucleotídeos aviários, pandêmicos e/ou sazonais que codifi-cam para genes estruturais do vírus da gripe, incluindo NA, M1 e/ou HA. Ovetor pode ser, por exemplo, um vetor de fago, plasmídeo, viral ou retroviral.Os constructos e/ou vetores que codificam genes estruturais do vírus da gri-pe aviária, pandêmica e/ou sazonal, incluindo NA, M1 e/ou HA, devem estaroperativamente ligados a um promotor apropriado, tal como promotorAcMNPV polihedrina (ou outro baculovírus), promotor fago lâmbida PL, ospromotores E. coli lac, phoA e tac, os promotores SV40 anterior e posterior,e promotores de LTRs retrovirais, são exemplos não-limitativos. Outros pro-motores adequados serão conhecidos àqueles versados na técnica, depen-dendo da célula hospedeira e/ou da taxa de expressão desejada. Os cons-tructos de expressão contêm adicionalmente locais para iniciação e termina-ção de transcrição, e, na região transcrita, um local de ligação de ribossomo.

A porção de codificação das transcrições expressas pelos constructos inclui-rã preferivelmente um códon de iniciação de translação no começo, e umcódon de terminação apropriadamente posicionado na extremidade do poli-peptídeo a ser translado.

Os vetores de expressão incluirão preferivelmente pelo menosum marcador selecionável. Tais marcadores incluem dihidrofolato reductase,G418 ou resistência à neomicin para cultura de célula eucariótica e tetraci-clina, genes de resistência à kanamicin ou ampicilina para cultura de E. colie outras bactérias. Entre os vetores preferidos estão vetores de vírus, taiscomo baculovírus, poxvírus (por exemplo, vírus de vacina, vírus avipox, víruscanarpox, vírus fowlpox, vírus raccoonpox, vírus swinepox, etc.), adenovírus(por exemplo., adenovírus canino), herpesvírus e retrovírus. Outros vetoresque podem ser usados com a invenção compreendem vetores para uso embactéria, que compreendem vetores pQE70, pQE60 e pQE-9, vetores pBlu-escript, vetores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH64A, ptrc99a,pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre os vetores eucarióticos especí-ficos estão pFastBacI pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 e pSG, pSVK3,pBPV, pMSG e pSVL. Outros vetores adequados serão prontamente aparen-tes ao versado na técnica. Em uma concretização, referido vetor que com-preende nucleotídeos que codificam para genes estruturais de vírus da gripeaviária, pandêmica e/ou sazonal, incluindo HA, M1 e/ou NA, é pFastBac. Emoutra concretização, referido vetor que compreende um inserto que consistede nucleotídeos que codificam para genes estruturais do vírus da gripe aviá-ria, pandêmica e/ou sazonal, incluindo HA, M1 e/ou NA, é pFastBac.

Em seguida, o vetor recombinante pode ser transfectado, infec-tado ou transformado em uma célula hospedeira adequada. Desse modo, ainvenção proporciona células hospedeiras que compreendem um vetor (ouvetores) que contêm ácidos nucléicos com código para HA, M1 e/ou NA, epermitem a expressão de HA, M1 e/ou NA na referida célula hospedeira sobcondições que permitem a formação de VLPs.

Em uma concretização, os constructos recombinantes acimamencionadas podem ser usadas para transfectar, infectar ou transformar, epodem expressar proteínas da gripe HA, NA e M1 e células eucarióticas e/oucélulas procarióticas. Entre as células hospedeiras eucarióticas estão leve-dura, inseto, aves, planta, C. elegans (ou nematode) e células hospedeirasde mamífero. Exemplos não-limitativos de células de inseto são, células deSpodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, Sf9, Sf21, células de Trichoplusiani, por exemplo, células High Five, e células de Drosophia. Exemplos de cé-lulas hospedeiras de fungos (incluindo levedura) são S. cerevisiae, Kluyve-romyces Iavtis (K. lactis), espécies de Cândida incluindo C: albicans e C.glabrata, Aspergillus nidulans, Achizosaccharomyces pombe (S. pombe),Piehia pastoris, e Yarrowia lipolytiea. Exemplos de células de mamífero sãocélulas COS, células de rim de hamster jovem, células de camundongo L,células LNCaP, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rimembriônico humano (HEK), e células de macaco verde da África, célulasCV1, células HeLa, células MDCK, células Vero e Hep-2. Oocitos Xenopuslaevis, ou outras células de origem anfíbia, podem também serem usadas.Células hospedeiras procarióticas incluem células bacteriais, por exemplo, E.eoli, B. subtilis, e micobactéria.

Vetores, por exemplo, vetores compreendendo polinucleotídeosde HA, NA e/ou M1, podem ser transfectados em células hospedeiras deacordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, a introduçãode ácidos nucléicos em células eucarióticas pode ser por co-precipitação defosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção e transfecção em-pregando reagentes de transfecção de poliamida. Em uma concretização, oreferido vetor é um baculovírus recombinante. Em outra concretização, refe-rido baculovírus recombinante é transfectado em uma célula eucariótica. Emuma concretização preferida, referida célula é uma célula de inseto. Em ou-tra concretização, referida célula de inseto é uma célula Sf9.

Em outra concretização, referido vetor e/ou célula hospedeiracompreendem nucleotídeos que codificam uma proteína HA de um vírus dagripe aviária, pandêmica e/ou sazonal selecionado a partir do grupo consis-tindo em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14,H15 e H16. Em outra concretização, referido vetor e/ou célula hospedeiracompreende nucleotídeos que codificam uma proteína NA que é selecionadaa partir do grupo consistindo N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 e N9. Em outraconcretização, referido vetor compreende nucleotídeos que codificam a pro-teína de gripe HA, NA e/ou M1. Em outra concretização, referido vetor e/oucélula hospedeira compreende gripe HA, M1 e/ou NA. Em outra concretiza-ção, referido vetor e/ou célula hospedeira consiste de proteína de gripecompreendendo HA, M1 e NA. Este vetor e/ou célula hospedeira contém HA,NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicionais, tais como prote-ínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc., masnão contêm proteínas da gripe adicionais (outras do que fragmentos de M1,HA e/ou NA). Em outra concretização, referidos nucleotídeos que codificampara uma HA e/ou a NA exibem atividade de hemaglutinina e/ou atividade deneuraminidase, respectivamente, quando expressas na superfície de VLPs.

Esta invenção também proporciona constructos e métodos queaumentarão a eficiência de produção de VLPs. Por exemplo, remoção delocais de clivagem de proteínas de modo a aumentar expressão de proteína(vide acima). Outro método compreende a adição de seqüências condutorasà proteína HA, NA e/ou M1 para transporte mais eficiente. Por exemplo, umaseqüência de sinal heteróloga pode ser fundida à proteína de gripe HA, NAe/ou M1. Em uma concretização, a seqüência de sinal pode ser derivada dogene de uma célula de inseto, e fundida à proteína HA da gripe (para ex-pressão em células de inseto). Em outra concretização, o peptídeo de sinal éa seqüência de sinal chitinase, que opera eficientemente em sistemas deexpressão de baculovírus. Em outra concretização, o intercâmbio de se-qüências condutoras entre proteínas da gripe pode proporcionar melhortransporte de proteína. Por exemplo, foi mostrado que H5 hemaglutinina émenos eficiente quando sendo transportada para as superfícies de partícu-las. H9 hemaglutinina, contudo, tem como alvo a superfície, e é integrada nasuperfície mais eficientemente. Desse modo, em uma concretização, a se-qüência condutora de H9 é fundida à proteína H5.

Outro método para aumentar a eficiência de produção de VLP éotimizar o códon dos nucleotídeos que codificam proteína HA, NA e/ou M1para um tipo de célula específica. Por exemplo, ácidos nucléicos de otimiza-ção de códon para expressão em célula Sf9 (vide publicação de patente dosU.S. 2005/0118191, aqui incorporada por referência em sua totalidade paratodas as propostas). Exemplos de seqüências de códon otimizado para célu-las Sf9 são reveladas abaixo (por exemplo, SEQ ID 42, 44, 46, 48, 50, 52 e54). Em uma concretização, a seqüência de ácido nucléico de proteína degripe de códon otimizado é pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% para qualquer uma de SEQ ID NOS 42, 44, 46, 48, 50, 52 e 54.

A invenção também proporciona métodos de produção de VLPs,referidos métodos compreendendo expressão de proteínas de gripe aviária,pandêmica e/ou sazonal sob condições que permitem formação de VLP.Dependendo do sistema de expressão e célula hospedeira selecionada, asVLPs são produzidas pelo desenvolvimento de células hospedeiras transfor-madas por um vetor de expressão sob condições pelas quais as proteínas re-combinantes são expressas, e VLPs são formadas. A seleção das condiçõesde crescimento apropriadas está dentro da perícia de um versado na técnica.

Métodos para desenvolver células projetadas para produzirVLPs da invenção incluem, mas não estão limitados a, técnicas de cultura decélula por batelada, alimentada por batelada, contínua, e de perfusão. A cul-tura de célula significa o crescimento e propagação de células em um bio-reator (um câmara de fermentação) onde células se propagam e expressam proteína (por exemplo, proteínas recombinantes) para purificação e isola-mento. Tipicamente, a cultura de célula é realizada sob condições de tempe-ratura e atmosféricas controladas em um bioreator. Um bioreator é uma câ-mara usada para cultivar células em que condições ambientais, tais comotemperatura, atmosfera, agitação, e/ou pH, podem ser monitoradas. Em uma concretização, referido bioreator é uma câmara de aço inoxidável. Em outraconcretização, referido bioreator é um saco plástico pré-esterilizado (por e-xemplo, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Em outra concretização,referidos sacos plásticos pré-esterilizados são sacos de cerca de 50 L a1000 L.

As VLPs são, em seguida, isoladas usando-se métodos que pre-servam a integridade destas, tal como por centrifugação de gradiente, porexemplo, cloreto de césio, sacarose e iodixanol, bem como técnicas padrõesde purificação, incluindo, por exemplo, troca de íon e cromatografia de filtra-ção de gel.

O que se segue é um exemplo de como as VLPs da invençãopodem ser produzidas, isoladas e purificadas. Usualmente as VLPs são pro-duzidas de linhas de célula recombinantes projetadas para criar uma VLPquando referidas células são crescidas na cultura de célula (vide acima). Aprodução de VLPs pode ser efetuada peto esquema ilustrado na Figura 26.Um versado na técnica compreenderia que existem métodos adicionais quepodem ser utilizados para produzir e purificar VLPs da invenção, a invenção,desse modo, não estando limitada ao método descrito.

A produção de VLPs da invenção pode começar pela semeadurade células Sf9 (não-infectadas) em frascos osciladores, permitindo que ascélulas sê expandam e se ampliem a medida que as células crescem e semultiplicam (por exemplo, de um frasco de 125 ml a um saco Wave de 50 L).O meio usado para desenvolver a célula é formulado para a linha de célulaapropriada (preferivelmente meio livre de soro, por exemplo, meio de insetoExCell-420, JRH). Em seguida, referidas células são infectadas com baculo-vírus recombinante na multiplicidade mais eficiente de infecção (por exem-plo, de cerca de 1 a cerca de 3 placas formando unidades por célula). Umavez que a infecção tenha ocorrido, as proteínas da gripe HA, NA e M1 sãoexpressas a partir do genoma do vírus, auto-reünidas em VLPs, e são secre-tadas a partir das células aproximadamente 24 a 72 horas pós-infecção. Usu-almente, a infecção é mais eficiente quando as células estão em fase de Iog-médio de crescimento (4-8 χ 106 células/ml), e são pelo menos 90% viáveis.

As VLPs da invenção podem ser colhidas aproximadamente 48a 96 horas pós-infecção, quando os níveis de VLPs no meio de cultura decélula estão perto do máximo, mas antes da Iysis de célula extensiva. Adensidade e viabilidade da célula Sf9 no tempo de colheita pode ser cercade 0,5 χ 106 células/ml a cerca de 1,5 χ 106 células/ml com pelo menos 20%de viabilidade, conforme mostrado pelo ensaio de exclusão de corante. Emseguida, o meio é removido e clareado. NaCI pode ser adicionado ao meio auma concentração de cerca de 0,4 a cerca de 1,0M, preferivelmente cercade 0,5M, para evitar agregação de VLP. A remoção de célula e resíduos ce-lulares a partir do meio de cultura de célula contendo VLPs da invenção po-de ser efetuada por filtração de fluxo tangencial (TFF) com um cartucho defiltro de 0,5 ou 100 pm de fibra oca de uso simples, pré-esterilizada, ou umdispositivo similar.

Em seguida, as VLPs no meio de cultura clareado podem serconcentradas por ultrafiltração usando-se cartucho de fibra oca de corte depeso molecular de 500.000 pré-esterilizada disponível. As VLPs concentra-das podem ser diafiltradas contra 10 volumes de salina tamponada com fos-fato, pH 7,0 a 8,0 (PBS) contendo NaCI 0,5M, para remover componentes demeio residual.

As VLPs diafiltradas concentradas podem ser adicionalmentepurificadas em 20% a 60% de um gradiente de sacarose descontínuo emtampão de PBS de pH 7,2 com NaCI 0,5M por centrifugação em 6.500 χ gpor 18 horas a cerca de 4°C a cerca de 10°C. Usualmente as VLPs formarãouma faixa visível distinta entre cerca de 30% a cerca de 40% de sacarose,ou na interface (em um gradiente de etapa de 20% e 60%) que podem sercoletadas a partir do gradiente e armazenadas. Este produto pode ser diluí-do para compreender 200 mM de NaCI na preparação para a próxima etapano processo de purificação. Este produto contém VLPs, e pode conter partí-culas intactas de baculovírus.

Purificação adicional de VLPs pode ser efetuada por cromato-grafia de troca de íon, ou centrifugação de almofada de 44% de sacaroseisopínica. Na cromatografia de troca de ânion, a amostra a partir do gradien-te de sacarose (vide acima) é carregada na coluna contendo um meio comum ânion (por exemplo, Marix Fractogel EMD TMAE), e eluída via um gradi-ente de sal (de cerca de 0,2M a cerca de 1,0 M de NaCI) que pode separar aVLP de outros contaminantes (por exemplo, baculovírus e DNA/RNA). Nométodo de almofada de sacarose, a amostra compreendendo as VLPs é a-dicionada a uma almofada de sacarose de 44%, e centrifugada por 18 horasa 30.000 g. As VLPs formam uma faixa no topo de 44% de sacarose, en-quanto o baculovírus precipita no fundo, e outras proteínas contaminantespermanecem na camada de 0% de sacarose no topo. O pico de VLP ou fai-xa é coletado.

O baculovírus intacto pode ser inativado, se desejado. A inativa-ção pode ser efetuada por métodos químicos, por exemplo, formalina ou β- propila Iactona (BPL). A remoção e/ou inativação de baculovírus intacto podetambém ser grandemente efetuada pelo uso de métodos de precipitação sele-tiva e cromatográficos conhecidos na técnica, conforme exemplificado acima.Métodos de inativação compreendem incubação da amostra contendo as VLPsem 0,2% de BPL por 3 horas a cerca de 25°C a cerca de 27°C. O baculovíruspode também ser inativado por incubação da amostra contendo as VLPs a0,05% de BLP a 4°C por 3 dias, em seguida a 37°C por uma hora.

Após a inativação/etapa de remoção, o produto compreendendoVLPs pode ser operado através de outra etapa de diafiltração para removerqualquer reagente a partir da etapa de inativação e/ou qualquer sacaroseresidual, e colocar as VLPs no tampão desejado (por exemplo, PBS). A soluçãocompreendendo VLPs pode ser esterilizada por métodos conhecidos na técnica(por exemplo, filtração estéril), e armazenada no refrigerador ou freezer.

As técnicas acima podem ser praticadas através de uma varie-dade de escalas. Por exemplo, frascos T, frascos oscilantes, garrafas giratórias,até bioreatores dimensionados industriais. Os bioreatores podem compreenderou um tanque de aço inoxidável, ou um saco plástico pré-esterilizado (porexemplo, o sistema vendido por Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Um versa-do na técnica saberá o que é mais desejável para suas propostas.

A expansão e produção de vetores de expressão de baculovírus,e infecção de células com baculovírus recombinante para produzir VLPs degripe recombinantes, pode ser efetuada em células de inseto, por exemplo,células de inseto Sf9, conforme anteriormente descrito. Em uma concretiza-ção preferida, as células são SF9 infectadas com baculovírus recombinanteprojetado para produzir VLPs de gripe.

Formulações Farmacêuticas ou de Vacina e Administração

As composições farmacêuticas úteis aqui contêm um veículofarmaceuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente ade-quado, que incluem qualquer agente farmacêutico que não induzem a pro-dução de uma resposta imune danosa ao vertebrado que recebe a composi-ção, e que pode ser administrada sem toxicidade indevida, e uma VLP dainvenção. Conforme aqui usado, o termo "farmaceuticamente aceitável signi-fica ser aprovada por uma agência reguladora do governo Federal ou de Es-tado na Farmacopéia dos Estados Unidos, Farmacopéia européia, ou outrafarmacopéia geralmente reconhecida para uso em vertebrados, e, mais par-ticularmente, em seres humanos. Estas composições podem ser úteis comouma vacina e/ou composições antigênicas para indução de uma respostaimune protetora em um vertebrado.

Referidas formulações farmacêuticas da invenção compreendemVLPs compreendendo uma proteína M1, HA e NA da gripe, e um veículo ouexcipiente farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitá-veis incluem, mas não estão limitados a, salina tamponada, dextrose, água,glicerol, tampão aquoso isotônico estéril, e combinações destes. Uma dis-cussão de veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e outros excipi-entes, é apresentada em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co. N. J, edição atual). A formulação deve se adequar ao modo de adminis-tração. Em uma concretização preferida, a formulação é adequada para ad-ministração em humanos, preferivelmente é estéril, não-particulada e/ounão-pirogênica.

A composição, se desejado, pode também conter quantidadesmenores de agentes de umedecimento ou de emulsificação, ou agentes detamponamento de pH. A composição pode ser uma forma sólida, tal comopó liofilizado adequado para reconstituição, uma solução líquida, suspensão,emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada,ou pó. Formulação oral pode incluir veículos padrões, tais como graus far-macêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina desódio, celulose, carbonatos de magnésio, etc.

A invenção também proporciona um acondicionamento farma-cêutico ou kit compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com umou mais dos ingredientes das formulações de vacina da invenção. Em umaconcretização preferida, o kit compreende dois recipientes, um contendoVLPs e o outro contendo um adjuvante. Associado com tais recipientes podeestar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regu-la a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujoaviso reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda paraadministração humana.

A invenção também prevê que a formulação de VLP seja acon-dicionada em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampolaou sache indicando a quantidade de composição. Em uma concretização, acomposição é suprida como um líquido, em outra concretização, como póseco esterilizado liofilizado, ou concentrado livre de água em um recipientehermeticamente vedado, é pode ser reconstituída, por exemplo, com águaou salina à concentração apropriada para administração a um indivíduo. Pre-ferivelmente, a composição de VLP é suprida como um pó seco estéril Iiofili-zado em um recipiente hermeticamente vedado em uma dosagem de unida-de de preferivelmente cerca de 1 μg, cerca de 5 μg, cerca de 10 μg, cerca de25 μg, cerca de 30 μg, cerca de 50 μg, cerca de 100 μg, cerca de 125 μg,cerca de 150 μg, ou cerca de 200 μg. Alternativamente, a dosagem de uni-dade da composição de VLP é menor do que cerca de 1 μg, (por exemplo,cerca de 0,08 μg, cerca de 0,04 μg; cerca de 0,2 μg, cerca de 0,4 μg, cercade 0,8 μg, cerca de 0,5 μg, cerca de 0,25 μg ou menos, ou cerca de 0,1 μgou menos), ou mais do que cerca de 125 μg, (por exemplo, cerca de 150 μgou mais, cerca de 250 μg ou mais, ou cerca de 500 μg ou mais). Estas do-ses podem ser medidas como VLPs totais, ou como μg de HA. A composi-ção de VLP deve ser administrada dentro de cerca de 12 horas, preferivel-mente dentro de cerca de 6 horas, dentro de cerca de 5 horas, dentro decerca de 3 horas, ou dentro de cerca de 1 hora após ser reconstituída a par-tir do pó liofilizado.

Em uma concretização alternativa, uma composição de VLP ésuprida na forma líquida em um recipiente hermeticamente vedado indicandoa quantidade e concentração da composição de VLP. Preferivelmente, aforma líquida da composição de VLP é suprida em um recipiente hermetica-mente vedado pelo menos cerca de 50 Mg/ml, mais preferivelmente pelomenos cerca de 100 pg/ml, pelo menos cerca de 200 pg/ml, pelo menos cer-ca de 500 pg/ml, ou pelo menos 1 mg/ml.

Geralmente, as VLPs da gripe da invenção são administradasem uma quantidade efetiva ou quantidade (conforme definido acima) sufici-ente para estimular uma resposta imune contra uma ou mais cepas de vírusda gripe. Preferivelmente, a administração da VLP da invenção induz imuni-dade substancial contra pelo menos um vírus da gripe. Tipicamente, a dosepode ser ajustada dentro desta faixa baseado na, por exemplo, idade, condi-ção física, peso corpóreo, sexo, dieta, tempo de administração, e outros fato-res clínicos. A formulação de vacina profilática é sistemicamente administra-da, por exemplo, por injeção subcutânea ou intramuscular, usando-se umaagulha ou seringa, ou um dispositivo de injeção sem agulha. Alternativamen-te, a formulação de vacina é administrada intranasalmente, ou por gotas,aerossol de partícula grande (mais do que cerca de 10 mícrons), ou pulveri-zação no trato respiratório superior. Enquanto quaisquer das rotas acima dedistribuição resultam em uma resposta imune, administração intranasal con-fere o benefício adicionado de indução de imunidade mucosal no local deentrada do vírus da gripe.

Desse modo, a invenção compreende também um método deformular uma vacina ou composição antigênica que induz imunidade subs-tancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em umindivíduo, compreendendo adicionar à referida formulação uma dose efetivade um vírus da gripe.

Enquanto a estimulação de imunidade substancial com uma do-se simples seja preferida, dosagens adicionais podem ser administradas,pela mesma ou rota diferente, para alcançar o efeito desejado. Em recémnascidos e crianças, por exemplo, administrações múltiplas podem ser re-queridas para induzir níveis suficientes de imunidade. A administração podecontinuar em intervalos através de toda infância, conforme necessário, paramanter níveis suficientes de proteção contra infecção de gripe. Similarmente,adultos que são particularmente susceptíveis a infecção de gripe repetida ouséria, tais como, por exemplo, operadores que cuidam da saúde, operadoresque cuidam do dia, membros de família de crianças jovens, as pessoas ido-sas, e indjvíduos com função cardiopulmonar comprometida podem requererimunizações múltiplas para estabelecer e/ou manter respostas imunes prote-toras. Níveis de imunidade induzida podem ser monitorados, por exemplo,pela medição das quantidades de neutralização secretória e anticorpos desoro, e dosagens ajustadas ou vacinações repetidas conforme necessáriopara induzir e manter níveis desejados de proteção.

Desse modo, em uma concretização, um método para induzirimunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sin-toma desta em um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP de gripe, em que referida VLP compreende proteínasHA, NA e M1 de gripe. Em outra concretização, um método para induzir i-munidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sinto-ma desta em um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP de gripe, em que referida VLP consiste essencialmenteem HA, NA e M1 de gripe. Referidas VLPs podem compreender proteínas degripe adicionais e/ou contaminantes de proteína em concentrações despre-zíveis. Em outra concretização, um método para induzir imunidade substan-ciai a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em umindivíduo, compreende administrar pelo menos uma dose efetiva de umaVLP de gripe, em que referida VLP consiste de HA, NA e M1 de gripe. Emoutra concretização, referida HA, NA e M1 de gripe é derivada de vírus dagripe sazonal e/ou aviária. Em outra concretização, um método para induzirimunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sin-toma desta em um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP de gripe que compreende proteínas de gripe, em quereferidas proteínas de gripe consiste de proteínas HA, NA e M1. Estas VLPscontêm HA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicionais, taiscomo proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos,etc., mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outros do que fragmen-tos de M1, HA e/ou NA). Em outra concretização, HA e/ou NA exibem ativi-dade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectivamente.Em outra concretização, referido indivíduo é um mamífero. Em outra concre-tização, referido mamífero é um ser humano. Em outra concretização, o mé-todo compreende induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe,ou pelo menos um sintoma desta, pela administração de referida formulaçãoem uma dose. Em outra concretização, o método compreende induzir imuni-dade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta, pela administração de referida formulação em doses múltiplas.

Métodos de administrar uma composição compreendendo VLPs(vacina e/ou formulações antigênicas) incluem, mas não estão limitados a,administração parenteral (por exemplo, intradermal, intramuscular, intrave-nosa e subcutânea), epidural, e mucosal (por exemplo, intranasal e oral, ourotas pulmonares, ou por supositórios). Em uma concretização específica,composições da presente invenção são administradas intramuscularmente,intravenosamente, subcutaneamente, transdermalmente ou intradermalmen-te. As composições podem ser administradas por qualquer rota conveniente,por exemplo, por infusão ou injeção de massa, por absorção através de re-vestimentos epiteliais ou mucocutâneo (por exemplo, muco oral, cólon, con-juntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, bexiga urinária e mucosa in-testinal, etc), e podem ser administradas junto com outros agentes biologi-camente ativos. Em algumas concretizações, rotas intranasais ou outras ro-tas mucosais de administração de uma composição compreendendo VLPsda invenção podem induzir um anticorpo ou outra resposta imune que ésubstancialmente mais alta do que outras rotas de administração. Em outraconcretização, rotas intranasais ou outras rotas mucosais de administraçãode uma composição compreendendo VLPs da invenção podem induzir umanticorpo ou outra resposta imune que induzirá proteção cruzada contra ou-tras cepas de vírus da gripe. A administração pode ser sistêmica ou local.

Em ainda outra concretização, a vacina e/ou formulação antigê-nica é administrada de tal maneira a ter como alvo tecidos mucosais de mo-do a induzir uma resposta imune no local de imunização. Por exemplo, teci-dos mucosais, tais como tecido linfóide associado a intestino (GALT) podemser alvejados para imunização pelo uso de administração oral de composi-ções que contêm adjuvantes com propriedades de alvo mucosal particular.Tecidos mucosais adicionais podem ser alvejados, tais como tecido linfóidenasofaringeal (NALT) e tecido linfóide associado a bronquial (BALTI).

Vacinas e/ou formulações antigênicas da invenção podem tam-bém serem administradas em uma tabela de dosagem, por exemplo, umaadministração inicial da composição de vacina com administrações de refor-ço subseqüentes. Em concretizações particulares, uma segunda dose dacomposição é administrada de duas semanas a um ano, preferivelmente decerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5 a cerca de 6 me-ses, após a administração inicial. Adicionalmente, uma terceira dose podeser administrada após a segunda dose, e de cerca de três meses a cerca dedois anos, ou ainda mais longo, preferivelmente cerca de 4, cerca de 5, oucerca de 6 meses, ou cerca de 7 meses a cerca de um ano após a adminis-tração inicial. A terceira dose pode ser opcionalmente administrada quandonenhum ou baixos níveis de imunoglobulinas específicas são detectados nassecreções de soro e/ou urina ou mucosal do indivíduo após a segunda dose.Em uma concretização preferida, uma segunda dose é administrada cerca deum mês após a primeira administração, e uma terceira dose é administradacerca de seis meses após a administração. Em outra concretização, a segundadose é administrada após seis meses após a primeira administração.

Em outra concretização, referida VLP da invenção pode ser ad-ministrada como parte de uma terapia de combinação. Por exemplo, asVLPs da invenção podem ser formuladas com outras composições imuno-gênicas e/ou antivirais (por exemplo, Amantadina, Rimantadina, Zanamivir eOsteltamivir).

A dosagem da formulação farmacêutica pode ser determinadaprontamente pelo versado na técnica, por exemplo, primeiro pela identifica-ção de doses efetivas para induzir uma resposta imune profilática ou tera-pêutica, por exemplo, pela medição da titulação de soro de imunoglobulinasespecíficas de vírus, ou por medição da razão inibitória de anticorpos emamostras de soro, ou amostras de urina, ou secreções mucosais. Referidasdosagens podem ser determinadas de estudos de animais. Uma lista não-limitativa de animais usados para estudar o vírus da gripe inclui o porquinho-da-índia, hamster Syrian, chinchila, porco-espinho, galinhas, rato, camun-dongo e furão. Muitos animais são hospedeiros não-naturais a vírus da gri-pe, mas podem ainda servir em estudos de vários aspectos da doença. Porexemplo, quaisquer dos animais acima podem ser dosados com uma vacinacandidata, por exemplo, VLPs da invenção, para caracterizar parcialmente aresposta imune induzida, e/ou para determinar se qualquer neutralização deanticorpos foi produzida. Por exemplo, muitos estudos foram conduzidos nomodelo de camundongo porque os camundongos são de tamanho pequeno, eseu custo permite que os pesquisadores conduzam estudos em uma grandeescala. Não obstante, o tamanho pequeno do camundongo também aumenta adificuldade de observar prontamente quaisquer sinais clínicos da doença, e ocamundongo não é um modelo preditivo para doença em humanos.

Tem sido extensivo o uso de furões para estudar vários aspectosde infecção viral de gripe humana e seu curso de ação. O desenvolvimentode muitos dos conceitos contemporâneos de imunidade a vírus da gripe teriasido impossível sem o uso do furão (Maher et al. 2004). Os furões têm secomprovado serem um bom modelo para estudo da gripe por várias razões:infecção de gripe no furão se assemelha proximamente aquela em humanoscom relação a sinais clínicos, patogênese, e imunidade; tipos A e B de vírusda gripe humana infectam naturalmente o furão, proporcionando, desse mo-do, uma oportunidade de estudar uma população completamente controladaem que para observar interação de transmissão de infecção, doença, e vari-ação de seqüência de aminoácidos no vírus glicoproteinado da gripe; e osfurões têm outras características físicas que os tornam um modelo ideal paradecifrar as manifestações da doença. Por exemplo, furões e seres humanosmostram sinais clínicos muito similares de infecção de gripe que parecemdepender da idade do hospedeiro, da cepa do vírus, condições ambientais,do grau de infecção bacterial secundária, e de muitas outras variáveis. Des-se modo, um versado na técnica pode facilmente correlacionar a eficácia deuma vacina de gripe e regimentos de dosagem de um modelo de furão comhumanos, conforme comparado a um camundongo, ou qualquer outro mode-lo acima descrito.

Em adição, estudos clínicos podem ser realizados para determi-nar a dose efetiva preferida para seres humanos por um versado na técnica.Tais estudos clínicos são rotina, e bem-conhecidos na técnica. A dose preci-sa a ser empregada também dependerá da rota de administração. Dosesefetivas podem ser extrapoladas de curvas de resposta de dose de sistemasde teste in vitro, ou de animal.

Conforme também bem-conhecido na técnica, a imunogeneci-dade de uma composição particular pode ser aumentada pelo uso de esti-muladores não-específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes.Adjuvantes têm sido usados experimentalmente para promover um aumentogeneralizado em imunidade contra antígenos desconhecidos (por exemplo,patente dos U.S. N0 4.877.611). Protocolos de imunização têm usado adju-vantes para estimular respostas por muitos anos, e, como tal, adjuvantessão bem-conhecidos a um versado na técnica. Alguns adjuvantes afetam omodo em que antígenos são apresentados. Por exemplo, a resposta imune éaumentada quando antígenos de proteína são precipitados por alume. Aemulsificação de antígenos também prolonga a duração de apresentação deantígeno. A inclusão de qualquer adjuvante descrita em Vogel et ai, "ACompendium of Vaccine Adjtivants and Excipients (2nd Edition),", aqui incor-porado por referência em sua totalidade para todas as propostas, é conside-rada dentro do escopo desta invenção.

Adjuvantes exemplares incluem adjuvantes de Freund completos(um estimulador não-específico da resposta imune contendo Micobacteriummorto), adjuvantes de Freund incompletos, e adjuvante de hidróxido de alu-mínio. Outros adjuvantes compreendem GMCSP, BCG, hidróxido de alumí-nio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE),lipídeo A, e monofosforil lipídeo A (MPL). RIBI, que contém três componen-tes extraídos de bactéria, MPL, trehalose dimicolato (TDM) e esqueleto deparede de célula (CWS) em 2% de esqualeno/emulsão de Tween 80, sãotambém contemplados. MF-59, Novasomes®, antígenos de MHC, podemtambém serem usados.

Em uma concretização, o adjuvante é uma vesícula de lipídeopaucilamelar tendo cerca de duas a dez bicamadas dispostas na forma deinvólucros substancialmente esféricos separados por camadas aquosas con-tendo uma cavidade central amorfa grande livre de bicamadas de lipídeo. Asvesículas de lipídeo paucilamelar podem agir para estimular a resposta imu-ne de vários modos, como estimuladores não-específicos, como veículospara o antígeno, como veículos de adjuvantes adicionais, e combinaçõesdestes. As vesículas de lipídeo paucilamelar agem como estimuladores não-específicos quando, por exemplo, uma vacina é preparada por intermisturado antígeno com as vesículas pré-formadas, tal que o antígeno permaneceextracelular às vesículas. Pelo encapsulamento de um antígeno dentro dacavidade central da vesícula, a vesícula age ambos como um estimuladorimune e um veículo para o antígeno. Em outra concretização, as vesículassão principalmente produzidas de vesículas não-fosfolipídeas. Em outraconcretização, as vesícula são Novasomes. Novasomes® são vesículasnão-fosfolipídeas paucilamelares variando de cerca de 100 nm a cerca de500 nm. Eles compreendem Brij 72, colesterol, ácido oléico, e esqualeno. OsNovasomes foram mostrados serem um adjuvante efetivo para antígenos degripe (vide, Patentes dos U.S. 5.629.021, 6.387.373 e 4.911.928, aqui incor-poradas por referência em sua totalidade para todas as propostas).

Em um aspecto, um efeito adjuvante é alcançado pelo uso deum agente, tal como alume, usado em cerca de 0,05 a cerca de 0,1% desolução em salina tamponada com fosfato. Alternativamente, as VLPs po-dem ser produzidas como uma mistura com polímeros sintéticos de açúca-res (Carbopol®) usada como uma solução 0,25%. Alguns adjuvantes, porexemplo, certas moléculas orgânicas obtidas de bactéria; agem no hospe-deiro preferivelmente do que no antígeno. Um exemplo é muramil dipeptídeo(N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), um peptidoglicano bacterial.Em outras concretizações, hemocianinas e hemoeritrinas podem tambémserem usados com VLPs da invenção. O uso de hemocianina de lapa (KLH)é preferido em certas concretizações, embora outros hemocianinas e hemo-eritrinas de moluscos e artrópodes possam ser empregados.

Vários adjuvantes de polissacarídeo podem também serem usa-dos. Por exemplo, o uso de vários adjuvantes de polissacarídeo pneumacoccalnas respostas de anticorpo de camundongos foram descritos (Yin et ai, 1989).As doses que produzem respostas ótimas, ou que, de outro modo, não produ-zem supressão, devem ser emprégadas conforme indicado (Yin et al, 1989).Variedades de poliamina são particularmente preferidas, tais como quitina equitosana, incluindo quitina deacetilatada. Em outra concretização, um deri-vado lipofílico dissacarídeo-tripeptídeo de muramil dipeptídeo que é descritopara uso em Iipossomos artificiais de fosfatidil colina e fosfatidil glicerol.

Agentes ativos antipáticos e de superfície, por exemplo, saponine derivados, tais como QS21 (Cambridge Biotech), formam ainda outro gru-po de adjuvantes para uso com as VLPs da invenção. Tensoativos de copo-límero de bloco não-iônico (Rabinovich et al., 1994) podem também seremempregados. Oligonucleotídeos são outros grupos úteis de adjuvantes (Ya-mamoto etal., 1988). Quil A e Ientinen são outros adjuvantes que podem serusados em certas concretizações da presente invenção.

Outro grupo de adjuvantes são as endotoxinas detoxificadas, talcomo a endotoxina detoxificada refinada da Patente dos U.S. N0 4.866.034.Estas endotoxinas detoxificadas refinadas são efetivas na produção de res-postas adjuvantes em vertebrados. Naturalmente, as endotoxinas detoxifica-das podem ser combinadas com outros adjuvantes para preparar formulaçãode múltiplos adjuvantes. Por exemplo, a combinação de endotoxinas detoxi-ficadas com trehalose dimicolato é particularmente contemplada, conformedescrito na Patente dos U.S. N0 4.435.386. As combinações de endotoxinasdetoxificadas com trehalose dimicolato e glicolipídeos endotóxicos são tam-bém contempladas (Patente dos U.S. N0 4.505.899), conforme é a combina-ção de endotoxinas detoxifiçadas com esqueleto de parede de célula (CWS),ou CWS, e trehalose dimicolato, conforme descrito na Patente dos U.S. N04.436.727, 4.436.728 e 4.505.900. Combinações de apenas CWS e trehalo-se dimicolato, sem endotoxinas detoxificadas, é também considerado paraser útil, conforme descrito na Patente dos U.S. N0 4.420.019.

Aqueles versados na técnica reconhecerão os tipos diferentesque podem ser conjugados a vacinas de acordo com esta invenção, e estesincluem alquila lipofosfolipídeos (ALP); BCG; e biotina (incluindo derivadosbiotinilatados), entre outros. Certos adjuvantes particularmente contempla-dos para uso são os ácidos teicóicos de Gram-células. Estes incluem os áci-dos lipoteicóicos (LTA), ácidos ribitol teicóicos (RTA), e ácido glicerol teicóico(GTA). Formas ativas de suas contrapartes sintéticas podem também seremempregadas em conjunto com a invenção (Takada et ai, 1995).

Vários adjuvantes, mesmo aqueles que não são comumente u-sados em humanos, podem ainda serem empregados em outros vertebra-dos, onde, por exemplo, se deseja elevar anticorpos ou, subseqüentemente,obter células T ativadas. A toxicidade, ou outros efeitos adversos que podemresultar de ou o adjuvante ou as células, por exemplo, conforme podem o-correr usando-se células de tumor não-irradiadas, é irrelevante em tais cir-cunstâncias.

Outro método de induzir uma resposta imune pode ser efetuadopela formulação das VLPs da invenção com "estimuladores imunes". Estessão os mensageiros químicos do próprio corpo (citoquinas) para aumentar aresposta do sistema imune. Estimuladores imunes incluem, mas não estãolimitados a, várias citoquinas, Iinfoquinas ou quimioquinas com atividadesimunoestimulatórias, de imunopotenciação e pró-inflamatórias, tais comointerleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, II-12, IL-13); fatores de cres-cimento (por exemplo, granulócito-macrófago (GM)-fator de estimulação decolônia (CSF)); e outras moléculas imunoestimulatórias, tais como fator in-flamatório de macrófago, Iigante Flt3, B.71; B7.2, etc. As moléculas imunoes-timulatórias podem ser administradas na mesma formulação com as VLPsda gripe, ou podem ser administradas separadamente. Ou a proteína ou umvetor de expressão que codifica a proteína pode ser administrado para pro-duzir um efeito imunoestimulatório.Método de Estimular uma Resposta Imune de Antigripe

As VLPs da invenção são úteis para preparação de composiçõesque estimulam uma resposta imune que confere imunidade ou imunidadesubstancial a vírus da gripe. Ambas imunidade mucosal e celular podemcontribuir para imunidade a infecção de vírus e doença. Anticorpos secreta-dos localmente no trato regulatório superior são um fator maior em resistên-cia a infecção natural. A imunoglobulina secretória A (slgA) é envolvida naproteção do trato regulatório superior IgG na proteção do trato respiratórioinferior. A resposta imune induzida por uma infecção protege contra reinfec-ção com o mesmo vírus, ou uma cepa viral antigenicamente similar. O vírusda gripe suporta mudanças freqüentes e não-prognosticáveis; portanto, apósinfecção natural, o período efetivo de proteção provido pela imunidade dehospedeiro pode somente ser uns poucos anos contra as novas cepas devírus circulando na comunidade.

As VLPs da invenção podem induzir imunidade substancial emum vertebrado (por exemplo, um ser humano) quando administradas a referidovertebrado. A imunidade substancial resulta de uma resposta imune contra aVLP da gripe da invenção que protege ou melhora infecção de gripe, ou pelomenos reduz um sintoma de infecção de vírus da gripe no referido vertebra-do. Em alguns exemplos, se o referido vertebrado é infectado, referida infec-ção será assintomática. A resposta pode ser não somente uma resposta to-talmente protetora. Neste caso, se referido vertebrado é infectado com umvírus da gripe, o vertebrado experimentará sintomas reduzidos, ou uma du-ração mais curta de sintomas comparada a um vertebrado não-imunizado.

Em uma concretização, a invenção compreende um método pa-ra induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menosum sintoma desta em um indivíduo, compreende administrar pelo menosuma dose efetiva de uma VLP de gripe. Em outra concretização, referidaindução de imunidade substancial reduz duração de sintomas da gripe. Emoutra concretização, um método para induzir imunidade substancial a infec-ção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em um indivíduo,compreende administrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe,em que referida VLP compreende proteínas HA, NA e M1 de gripe. Em outraconcretização, referida VLP da gripe compreende proteínas de gripe, em quereferidas proteínas de gripe consistem de proteínas HA, NA e M1. EstasVLPs contêm HA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicio-nais, tais como proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, car-boidratos, etc, mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do quefragmentos de M1, HA e/ou NA). Em outra concretização, um método para induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menosum sintoma desta em um indivíduo, compreende administrar pelo menosuma dose efetiva de uma VLP de gripe, em que referida VLP consiste es-sencialmente em HA, NA e M1. Referidas VLPs podem compreender proteí-nas de gripe adicionais e/ou contaminantes de proteína em concentraçõesdesprezíveis. Em outra concretização, um método para induzir imunidadesubstancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma destaem um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma dose efetiva deuma VLP de gripe, em que referida VLP consiste de HA, NA e M1. Em outraconcretização, HA e/ou NA exibem atividade de hemaglutinina e/ou atividadede neuraminidase, respectivamente. Em outra concretização, referido indiví-duo é um mamífero. Em outra concretização, referido mamífero é um serhumano. Em outra concretização, referida VLP é formulada com um adju-vante, ou estimulador imune.

Recentemente tem sido um esforço combinado criar uma vacina contra vírus da gripe aviária que tem o potencial para criar doença pandêmi-ca. Isto é porque um número de vírus da gripe aviária atravessou a barreirade espécie, e infectado diretamente seres humanos, resultando em doençae, em alguns casos, morte. Estes vírus eram H5N1, H9N2 e H7N7 (Cox etai, 2004). Um estudo recente examinou o potencial de usar vírus da gripe H5N1 inativado como uma vacina. A formulação da vacina foi similar às va-cinas inativadas licenciadas atualmente licenciadas para o mercado. O estu-do concluiu que o uso de vírus H5N1 inativado não induz uma resposta imu-ne em seres humanos; contudo, a dose dada foi muito alta (90 pg de gripeaviária comparada a 15 pg da vacina licenciada) (Treanor et ai, 2006). Estaalta quantidade de antígeno de gripe aviária é não-prática para uma campa-nha de vacinação mundial. Conforme ilustrado abaixo, as VLPs da invençãoincluem uma resposta imune em um vertebrado quando administradas a re-ferido vertebrado.

Desse modo, a invenção envolve um método para induzir imuni-dade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta em um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma doseefetiva de uma VLP de gripe aviária. Em outra concretização, referida indu-ção de imunidade substancial reduz duração de sintomas da gripe. Em outraconcretização, referida indução de imunidade é de administrar pelo menos0,2 pg de HA aviária nas VLPs da invenção. Em outra concretização, referi-da indução de imunidade é de administrar cerca de 0,2 pg de HA aviária acerca de 15 pg de HA aviária nas VLPs da invenção. A administração podeser em uma ou mais doses, mas pode ser vantajosamente em uma dosesimples. Em outra concretização, referida HA aviária de VLP é derivada deH5N1 de gripe aviária.

Em outra concretização, a invenção compreende um método deinduzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe aviária, ou pelomenos um sintoma desta em um indivíduo, compreendendo administrar pelomenos uma dose efetiva de uma VLP de gripe aviária, em que referida VLPcompreende HA, NA e M1 de gripe aviária. Em outra concretização, referidaVLP da gripe aviária compreende proteínas de gripe aviária, em que referi-das proteínas de gripe aviária consistem de proteínas HA, NA e M1. EstasVLPs contêm HA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicio-nais, tais como proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, car-boidratos, etc, mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do quefragmentos de M1, HA e/ou NA). Em outra concretização, referido métodopara induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe aviária, oupelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreende administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe aviária, em que referidaVLP consiste essencialmente em HA, NA e M1 de gripe aviária. ReferidasVLPs podem compreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantesde proteína em concentrações desprezíveis. Em outra concretização, ummétodo para induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, oupelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreende administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe, em que referida VLPconsiste de HA, NA e M1 de gripe aviária. Em outra concretização, referidasHA e NA de gripe aviária são H5N1, respectivamente. Em outra concretiza-ção, referidas HA e NA de gripe aviária são H9N2, respectivamente. Em outraconcretização, referidas HA e NA de gripe aviária são H7N7, respectivamente.Em outra concretização, referidas HA e/ou NA de gripe aviária exibem ativida-de de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectivamente. Emoutra concretização, referido indivíduo é um mamífero. Em outra concretiza-ção, referido mamífero é um ser humano. Em uma concretização adicional,referida VLP é formulada com um adjuvante, ou estimulador imune.

Em outra concretização, referidas VLPs de gripe aviária induzi-rão uma resposta imune em um vertebrado que é cerca de 2 vezes, cerca de4 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 16 vezes, cerca de 32 vezes, cerca de64 vezes, cerca de 128 vezes de aumento (ou mais alta) mais potente doque um antígeno de gripe aviária similar formulado similarmente às vacinasinativadas licenciadas atualmente licenciadas para o mercado. As formula-ções atuais compreendem vírus total inativado (por exemplo, tratado comformaldeído), vírus repartido (quimicamente rompido), e vacinas de subuni-dade (glicoproteína purificada). Métodos para determinar potência para umavacina são conhecidos e rotina na técnica. Por exemplo, ensaios de micro-neutralização e ensaios de inibição de hemaglutinação podem ser realizadospara determinar potência de uma vacina de VLP aviária comparada a antí-genos de gripe aviária formulados similar às vacinas inativadas licenciadasatualmente licenciadas para o mercado. Em uma concretização, referidoaumento na potência é realizado quando cerca de 0,2 pg, cerca de 0,4 pg,cerca de 0,6 pg, cerca de 0,8 pg, cerca de 1 pg, cerca de 2 pg, cerca de 3pg, cerca de 4 pg, cerca de 5 pg, cerca de 6 pg, cerca de 7 pg, cerca de 9pg, cerca de 10 pg, cerca de 15 pg, cerca de 20 pg, cerca de 25 pg, cercade 30 pg, cerca de 35 pg, cerca de 40 pg, cerca de 45 pg, cerca de 50 pg,ou mais alto, de VLPs1 e o antígeno formulado similarmente às vacinas inati-vadas atualmente licenciados para o mercado é administrado a um vertebra-do (isto é, quantidades equivalentes de HA e/ou Na em uma VLP com quan-tidades equivalentes de HA e/ou NA formuladas em similaridade às vacinasinativadas licenciadas e/ou qualquer outro antígeno). Quantidades podemser medidas de acordo com o teor de, HA. Por exemplo, 1 pg de uma VLP dainvenção é cerca de 1 pg de HA em uma solução de VLPs compreendendoHA, ou podem ser medidas por peso de VLPs.

Vacinas de gripe sazonal são administradas em humanos todoano para reduzir a incidência de casos de gripe todo ano. No presente, exis-tem dois subtipos de gripe A e gripe B circulando nos Estados Unidos. Asvacinas atuais são, portanto, trivalentes, para proporcionarem proteção con-tra as cepas atualmente circulantes. Cada ano uma cepa diferente ou varia-ção de uma gripe viral muda. Desse modo, por muitos anos uma nova com-posição de vacina é manufaturada e administrada. Vacinas inativadas sãoproduzidas por propagação do vírus em ovos de galinha embrionados. Ofluido alantônico é colhido, e o vírus é concentrado e purificado, em seguidainativado. Desse modo, as vacinas de vírus de gripe licenciadas atuais po-dem conter quantidades traços de proteínas de ovo residuais e, portanto,não devem ser administradas a pessoas que tem hipersensibilidade anafilá-tica a ovos. Em adição, fornecedores de ovos devem ser organizados, e ce-pas para produção de vacina devem ser selecionadas meses em avanço dapróxima estação de gripe, limitando, desse modo, a flexibilidade desta apro-ximação, e freqüentemente resultando em retardos e deficiências na produ-ção e distribuição. Em adição, algumas cepas de gripe não replicam bem emovos de galinhas embrionados que podem limitar as cepas de gripe que po-dem ser crescidas e formuladas em vacinas.

Conforme mencionado acima, a VLP da invenção não requerovos para produção. Estas VLPs são produzidas via um sistema de culturade célula. Desse modo, a invenção envolve um método de induzir imunidadesubstancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma destaem um indivíduo, compreendendo administrar pelo menos uma dose efetivade uma VLP de gripe sazonal. Conforme discutido acima, o vírus de gripesazonal se refere a cepas virais de gripe que foram determinadas para esta-rem passando dentro da população humana para uma dada estação de gri-pe baseada nas visões epidemiológiça pelos Centros Nacionais de Gripemundial. Referidos estudos e alguns vírus de gripe isolados são enviadospara uma de quatro laboratórios de referência da Organização Mundial deSaúde (WHO), um das quais estando localizado nos Centros para Preven-ção e Controle de Doença (CFC) em Atlanta. Estes laboratórios testam quãobem os anticorpos produzidos para a vacina atual reagem à circulação devírus e novos vírus da gripe. Esta informação, junto com informação sobreatividade de gripe, é resumida e apresentada a um comitê consultivo da Ad-ministração de Alimento e Fármaco dos Estados Unidos (FDA), e em umencontro da WHO. Estes encontros resultam na seleção de três vírus (doissubtipos de vírus de gripe A e um vírus de gripe B) que vão nas vacinas parao outono e inverno seguintes. A seleção ocorre em fevereiro para o hemisférionorte, e em setembro para o hemisfério sul. Usualmente, uma ou duas das trêscepas de vírus na vacina mudam cada ano. Em outra concretização, referidaindução de imunidade substancial reduz duração de sintomas de gripe.

Em outra concretização, a invenção compreende um método deinduzir imunidade substancial a uma infecção de vírus da gripe sazonal, oupelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreendendo administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe sazonal, em que referidaVLP compreende HA, NA e M1 de gripe sazonal. Em outra concretização,referida VLP da gripe sazonal compreende proteínas de gripe sazonal, emque referidas proteínas de gripe consistem de proteínas HA, NA e M1. EstasVLPs contêm HA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicio-nais, tais como proteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, car-boidratos, etc, mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outras do quefragmentos de M1, HA e/ou NA). Em outra concretização, referido métodopara induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe sazonal, oupelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreende administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe sazonal, em que referidaVLP consiste essencialmente em HA, NA e M1 de gripe sazonal. ReferidasVLPs podem compreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantesde proteína em concentrações desprezíveis. Em outra concretização, ummétodo para induzir imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, oupelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreende administrarpelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe, em que referida VLPconsiste de HA, NA e M1 de gripe sazonal. Em outra concretização, referi-das HA e/ou NA de gripe aviária exibem atividade de hemaglutinina e/ou ati-vidade de neuraminidase, respectivamente. Em outra concretização, referidoindivíduo é um mamífero. Em outra concretização, referido mamífero é umser humano. Em uma concretização adicional, referida VLP é formulada comum adjuvante, ou estimulador imune.

Geralmente, as VLPs de gripe sazonal da invenção são adminis-tradas em uma quantidade suficiente para estimular imunidade substancialpara uma ou mais cepas de vírus de gripe sazonal. Em uma concretização,as VLPs são misturadas juntas com outras VLPs compreendendo proteínasde subtipo de gripe diferentes (conforme listado acima). Em outra concreti-zação, a formulação é uma formulação trivalente que compreende uma mis-tura de VLPs com proteínas HA e/ou NA de gripe sazonal de pelo menosduas gripe A e/ou um pelo menos um subtipo B. Em outra concretização,referido subtipo B é produzido pelo mesmo método conforme descrito acima.Em outra concretização, uma formulação multivalente compreende uma oumais da VLP da invenção, conforme descrito acima.

Em outra concretização, as VLPs da invenção (VLPs aviária ousazonal) podem induzir uma resposta imune que proporcionará proteçãocontra mais do que uma cepa de vírus da gripe. Esta proteção cruzada deum vertebrado com uma VLP de gripe construída de uma cepa particular, deum subgrupo particular, pode induzir proteção cruzada contra vírus de cepase/ou subgrupos diferentes. Os exemplos abaixo mostram que as VLPs dainvenção são capazes de induzir reatividade cruzada com cepas e/ou sub-grupos diferentes.

O sistema imune humoral produz anticorpos contra antígenos degripe diferentes, dos quais o anticorpo específico de HA é o mais importantepara neutralização do vírus e, desse modo, prevenção de doença. Os anti-corpos específicos de NA são menos efetivos na prevenção de infecção,mas eles diminuem a liberação de vírus de células infectadas. Os tecidosmucosais são o principal portal de entrada de muitas patogenias, incluindogripe, e o sistema imune mucosal proporciona a primeira linha de defesacontra infecção à parte de imunidade inata. SIgA e, para alguma extensão,IgM, são os maiores anticorpos de neutralização dirigidos contra patogeniasmucosais, prevenindo entrada de patogenia, e podem funcionar intracelu-Iarmente para inibir replicação de vírus. A secreção nasal contém anticorposde neutralização, particularmente para HA e NA de gripe, que são principal-mente do isotipo de IgA, e são produzidos localmente. Durante infecção pri-mária, todas as três classes maiores de Ig (IgG, IgA e IgM) específicas paraHA podem ser detectadas por ensaio imunossorvente ligado a enzima emlavagens nasais, embora IgA e IgM sejam mais freqüentemente detectadosdo que IgG. Ambos IgA e, para alguma extensão, IgM, são ativamente se-cretados localmente, pelo que IgG é derivado como uma secreção de soro.

Em indivíduos que têm uma resposta de IgA local, uma resposta de IgA desoro também é observada. A resposta de IgA local estimulada por infecçãonatural dura pelo menos 3-5 meses, e células de memória comprometidasde IgA específico de gripe podem ser detectadas localmente. IgA também éo isotipo Ig predominante em secreções locais após infecção secundária, euma resposta de IgA é detectada no soro após infecção subseqüente. A pre-sença de anticorpos de neutralização localmente produzidos induzidos porvacina de vírus vivo se correlaciona com resistência à infecção e doençaapós provocação com vírus tipo selvagem.

A resistência à infecção de gripe ou doença está correlacionadacom o nível de anticorpo local e/ou de soro para HA e NA. Os anticorposanti-HA de soro são as medidas mais comumente correlacionadas a prote-ção contra gripe (Cox etal., 1999). Uma resposta de anticorpo de soro prote-tor (titulação de inibição de haemaglutinação 40) pode ser detectada emaproximadamente 80% de indivíduos após infecção de gripe natural. As cé-lulas B que produzem todas as três classes maiores de Ig estão presentesno sangue periférico em indivíduos normais (Cox et ai, 1994) e indivíduos que suportam infecção de gripe. Em seres humanos, os anticorpos de sorodesempenham um papel em ambas resistência a e recuperação de infecçãode gripe. O nível de anticorpo de soro para HA e NA em humanos pode serestar correlacionado com resistência a doença seguindo infecção experi-mental e infecção natural. Durante infecção primária, as três classes maiores de Ig podem ser detectadas dentro de 10-14 dias. O pico de níveis de IgA eIgM após 2 semanas e, em seguida, começam a declinar, pelo que o nívelde picos de IgG em 4-6 semanas. Onde IgG e IgM são dominantes na res-posta primária, IgG e IgA predominam na resposta imune secundária.

Desse modo, a invenção envolve um método de induzir uma resposta de anticorpo substancialmente protetora a infecção de vírus da gri-pe, ou pelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreendendo ad-ministrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe. Em outra con-cretização, referida indução de resposta de anticorpo substancialmente pro-tetora reduz a duração de sintomas de gripe. Em outra concretização, um método de induzir uma resposta de anticorpo substancialmente protetora ainfecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em um indiví-duo, compreendendo administrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLPde gripe, em que referida VLP compreende proteínas HA, NA e M1.

Em outra concretização, a invenção compreende um método de induzir resposta de anticorpo substancialmente protetora a uma infecção devírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compre-endendo administrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe, emque referida VLP consiste essencialmente em HA, NA e M1 de gripe. Referi-das VLPs podem compreender proteínas de gripe adicionais e/ou contami- nantes de proteína em concentrações desprezíveis. Em outra concretização,referida VLP de gripe compreende proteínas de gripe, em que referidas pro-teínas de gripe consistem de proteínas HA, NA e M1. Estas VLPs contêmHA, NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicionais, tais comoproteínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc,mas não contêm proteínas de gripe adicionais (outros do que fragmentos deM1, HA e/ou NA). Em outra concretização, um método para induzir imunida-de substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma destaem um indivíduo, compreende administrar pelo menos uma dose efetiva deuma VLP de gripe, em que referida VLP consiste de HA, NA e M1 de gripe.Em outra concretização, referida HA, NA e M1 de gripe é derivada de gripesazonal e/ou gripe aviária. Em outra concretização, referidas HA e/ou NA exi-bem atividade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectiva-mente. Em outra concretização, referido indivíduo é um mamífero. Em outraconcretização, referido mamífero é um humano. Em uma concretização adicio-nal, referida VLP é formulada com um adjuvante, ou estimulador imune.

Conforme aqui usado, um "anticorpo" é uma proteína compreen-dendo um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codifica-dos por genes de imunoglobulina, ou fragmentos de genes de imunoglobuli-na. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem genes kappa, lâmbi-da, alfa, gama, delta, epsilon e genes de região constante mu, bem comogenes de região variável de imunoglobulina miríade. Cadeias leves são clas-sificadas como ou kappa ou lambida. As cadeias pesadas são classificadascomo gama, mu, alfa, delta ou epsilon, que, por sua vez, definem as classesde imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidadeestrutural (anticorpo) de imunoglobulina típica compreende um tetrâmero.Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptí-deo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pe-sada" (cerca de 50-70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma regiãovariável de cerca de 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveispelo reconhecimento de antígeno. Os anticorpos existem como imunoglobu-linas intactas ou como um número de fragmentos bem-conhecidos produzi-dos por digestão com várias peptidases.

A imunidade mediada por célula também desempenha um papelna recuperação de infecção de gripe, e pode prevenir complicações associ-adas com gripe. Linfócitos celulares específicos de gripe foram detectadosno sangue e nas secreções do trato respiratório inferior de indivíduos infec-tados. Citólise de células infectadas por gripe é mediada por CLTs em com-binação com anticorpos e complemento específicos de gripe. A resposta citotó-xica primária é detectável no sangue após 6-14 dias, e desaparece pelo dia 21em indivíduos infectados ou vacinados (Ennis et al., 1981). CLTs específicasde gripe exibem especificidades reativas cruzadas em culturas in vitro] dessemodo, elas Iisam células infectadas com o mesmo tipo de gripe, mas não comoutros tipos (por exemplo, vírus de gripe A, mas não vírus de gripe B). CLTsque reconhecem as proteínas não-glicosilatadas internas, M, NP e PB2 foramisoladas (Feischer et al., 1985). A resposta de CLT é reativa cruzada entrecepas de gripe A (Gerhard et al., 2001), e é importante na minimização dedifusão viral em combinação com anticorpo (Nguyen et ai, 2001).

Imunidade mediada por célula também desempenha um papelna recuperação de infecção de gripe e pode prevenir complicações associa-das com gripe. Linfócitos celulares específicas de gripe foram detectados nosangue e nas secreções de trato respiratório inferior de indivíduos infecta-dos. A citólise de células infectadas por gripe é mediada por CLTs em com-binação com anticorpos e complementos específicos de gripe. A respostacitotóxica primária é detectável no sangue após 6-14 dia, e desaparece pelodia 21 em indivíduos infectados ou vacinados (Ennis et ai, 1981). CLTs es-pecíficas de gripe exibem especificidades reativas cruzadas em culturas in vitro;desse modo, elas Iisam células infectadas com o mesmo tipo de gripe, mas nãocom outros tipos (por exemplo, vírus de gripe A, mas não vírus de gripe B).CLTs que reconhecem as proteínas não-glicosilatadas internas, M, NP e PB2foram isoladas (Feischer et al., 1985). A resposta de CLT é reativa cruzadaentre cepas de gripe A (Gerhard et ai, 2001), e é importante na minimizaçãode difusão viral em combinação com anticorpo (Nguyen et ai, 2001).

Desse modo, a invenção envolve um método de induzir umaresposta imune celular substancialmente protetora a infecção de vírus dagripe, ou pelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compreendendoadministrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe. Em outraconcretização, um método de induzir imunidade substancial a infecção devírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta em um indivíduo, compre-endendo administrar pelo menos uma dose efetiva de uma VLP de gripe, emque referida VLP consiste de HA, NA e M1. Em outra concretização, referidaVLP de gripe compreende proteínas de gripe, em que referidas proteínas degripe consistem de proteínas HA, NA e M1. Estas VLPs contêm HA, NA e M1, epodem conter constituintes celulares adicionais, tais como proteínas celulares,proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc, mas não contêm proteínasde gripe adicionais (outros do que fragmentos de M1, HA e/ou NA). Em outraconcretização, referida HA, NA e M1 de gripe é derivada de gripe sazonale/ou gripe aviária. Em outra concretização, referidas HA e/ou NA exibem ati-vidade de hemaglutinina e/ou atividade de neuraminidase, respectivamente. Emoutra concretização, referido indivíduo é um mamífero. Em outra concretização,referido mamífero é um humano. Em uma concretização adicional, referidaVLP é formulada com um adjuvante, ou estimulador imune.

Conforme mencionado acima, as VLPs da invenção (por exem-plo, VLPs de gripe aviária e/ou sazonal) previnem ou reduzem pelo menosum sintoma de infecção de gripe em um indivíduo. Os sintomas de gripe sãobem-conhecidos na técnica. Eles incluem febre, mialgia, dor de cabeça, malestar severo, tosse não-produtiva, garganta dolorida, perda de peso e rinite.Desse modo, o método da invenção compreende a prevenção ou reduçãode pelo menos um sintoma associado com infecção viral de gripe. Uma re-dução em um sintoma pode ser determinada subjetivamente ou objetivamen-te, por exemplo, auto-avaliação por um indivíduo, por uma avaliação de umclínico, ou por condução de um ensaio ou medição apropriados (por exem-plo, temperatura do corpo), incluindo, por exemplo, uma qualidade de vida,uma progressão lenta de uma infecção de vírus ou sintomas adicionais, umaseveridade reduzida de um sintoma de gripe, ou um ensaio adequado (porexemplo, ensaio de titulação de anticorpo e/ou ativação de células Τ). A ava-liação objetiva compreende avaliação ambas de animal e humana.

A estratégia principal defendida pelo Comitê Consultor nas Práti-cas de Imunização (ACIP) para controle de gripe tem sido a vacinação depessoas em risco de complicações sérias de gripe, em particular, pessoas £65 anos de idade. As doenças epidêmicas de gripe anuais, contudo, conti-nuam não diminuídas, e são responsáveis por encargos significantes de sa-úde e financeiro em nossa sociedade (Glaser et ai, 1996). Nos últimos 20anos (1976-1999), um aumento significante ocorreu em todas as causas deexcesso de mortes associadas a gripe. De 1990 a 1999, o número anual detodas as causas de morte associadas a gripe excedeu 50.000 (Thompson etai, 2003). Apesar do aumento na cobertura de vacina de pessoas > 65 anospara 65% durante a última década, uma redução correspondente em todasas causas de mortes em excesso associadas a gripe não foi observado.

Desse modo, outra estratégia para a prevenção e controle degripe é a vacinação universal de crianças e indivíduos saudáveis. As crian-ças têm altas taxas de infecção, doenças medicamente atendidas, e hospita-lização de gripe (Neuzil et al., 2000). As crianças desempenham um papelimportante na transmissão de gripe dentro das escolas, famílias e comuni-dades. A vacinação com vacinas de gripe atual de aproximadamente 80% dealunos em uma comunidade tem diminuído doença respiratória em adultos eexcesso de mortes em pessoas idosas (Reichert et ai, 2001). Este conceitoé conhecido como imunidade de comunidade ou "imunidade popular", e éverificado desempenhar uma parte importante de proteger a comunidadecontra doença. Devido as pessoas vacinadas terem anticorpos que neutrali-zam o vírus da gripe, eles são muito menos aptos a transmitir vírus da gripepara outras pessoas. Desse modo, mesmo pessoas que não foram vacina-das (e aquelas cuja vacinação tenha se tornado enfraquecida, ou cujas vaci-nas não foram totalmente efetivas) podem freqüentemente ser blindadaspela imunidade popular porque as pessoas vacinadas em torno delas nãoestão obtendo a doença. A imunidade popular é mais efetiva a medida que apercentagem de pessoas vacinadas aumenta. É verificado que aproximada-mente 95% das pessoas na comunidade devem ser protegidas por uma va-cina para alcançar imunidade popular. As pessoas que não são vacinadasaumentam a chance que elas e outras pessoas obtenham a doença.

Desse modo, a invenção envolve um método de induzir uma i-munidade substancialmente protetora a infecção de vírus da gripe em umapopulação ou uma comunidade, de modo a reduzir a incidência de infecçõesde vírus da gripe entre indivíduos imunocomprometidos ou indivíduos vaci-nados administrando VLPs da invenção a uma população em uma comuni-dade. Em uma concretização, muitas crianças em idade escolar são imuni-zadas contra vírus da gripe pela administração das VLPs da invenção. Emoutra concretização, muitos indivíduos saudáveis em uma comunidade sãoimunizados contra vírus da gripe pela administração das VLPs da invenção.Em outra concretização, as VLPs da invenção são parte de uma estratégiade "vacinação dinâmica". A vacinação dinâmica é a produção constante deuma vacina de baixa eficiência que está relacionada a uma cepa de doençapandêmica emergente, mas devido a um curso antigênico não pode propor-cionar proteção completa em um mamífero (vide Germann et ai, 2006). De-vido a incerteza sobre a identidade futura de uma cepa pandêmica, é quaseimpossível armazenar uma cepa pandêmica bem-equiparada. Contudo, avacinação com uma vacina pobremente equiparada, mas potencialmenteeficaz, pode tornar lento a difusão do vírus pandêmico, e/ou reduzir a severi-dade de sintomas de uma cepa pandêmica de vírus da gripe.

A invenção também envolve uma vacina compreendendo umaVLP de gripe, em que referida vacina induz imunidade substancial a infecçãode vírus da gripe, ou pelo menos um sintoma desta quando administrada emum indivíduo. Em outra concretização, referida indução de imunidade subs-tancial reduz a duração de sintomas da gripe. Em outra concretização, refe-rida vacina induz imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelomenos um sintoma desta em um indivíduo, compreendendo uma VLP quecompreende proteínas HA, NA e M1. Em outra concretização, referida vaci-na induz imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menosum sintoma desta em um indivíduo, compreendendo uma VLP que consisteessencialmente em proteínas HA, NA e M1 de gripe. Referidas VLPs podemcompreender proteínas de gripe adicionais e/ou contaminantes de proteínaem concentrações desprezíveis. Em outra concretização, referida vacinainduz imunidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos umsintoma desta em um indivíduo, compreendendo uma VLP que consiste deproteínas HA, NA e M1. Em outra concretização, referida vacina induz imu-nidade substancial a infecção de vírus da gripe, ou pelo menos um sintomadesta em um indivíduo, compreendendo uma VLP em que referidas proteí-nas de gripe consiste de proteínas HA, NA e M1. Estas VLPs contêm HA,NA e M1, e podem conter constituintes celulares adicionais, tais como prote-ínas celulares, proteínas de baculovírus, lipídeos, carboidratos, etc, mas nãocontêm proteínas de gripe adicionais (outras do que fragmentos de M1, HAe/ou NA). Em outra concretização, referidas proteínas HA, NA e M1 de gripeé derivada de vírus de gripe aviária e/ou sazonal. Em outra concretização,referidas HA e/ou NA exibem atividade de hemaglutinina e/ou atividade deneuraminidase, respectivamente. Em outra concretização, referido indivíduoé um mamífero. Em outra concretização, referido mamífero é um ser huma-no. Em uma concretização adicional, referida VLP é formulada com um adju-vante, ou estimulador imune. Em outra concretização, onde referida vacina éadministrada a um mamífero. Em uma outra concretização, referido mamífe-ro é um ser humano.

Esta invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos se-guintes que não devem ser construídos como limitantes. Os conteúdos etodas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados atra-vés de todo este pedido, bem como as Figuras e Listagem de Seqüência,são incorporados aqui por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Genes HA, NA e M1 do vírus de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) foram expressos em células Spodoptra frugiperda (linha decélula Sf-9S; ATCC PTA-4047) usando-se o sistema de expressão de bacu-lovírus bacmid. Os genes de HA, NA e M1 foram sintetizados por transcriçãoreversa e reação de cadeia polimerase (PCR) usando-se RNA isolado devírus de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (figuras 1, 2 e 3). Paratranscrição reversa e PCR, prímeres de oligonucleotídeos específicos paragenes HA, NA e M1 de vírus de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)foram usados (Tabela 1). As cópias de cDNA destes genes foram clonadasinicialmente no vetor de subclonagem bacterial pCR2.1TOPO. A partir dostrês plasmídeos baseados em pCR2.1TOPO resultantes, os genes de HA,NA e M1 foram inseridos a jusante dos promotores polihedrina AcMNPV novetor de transferência de baculovírus pFastBad (In Vitrogen), resultando emtrês plasmídeos baseados em pFastBad; pHA, pNA e pM1 expressa estesgenes de vírus da gripe, respectivamente. Em seguida, um plasmídeo base-ado em pFastBad simples pHAM foi construído codificando ambos os ge-nes HA e M1, cada um a montante de um promotor polihedrina separado(figura 4). A seqüência de nucleotídeo do gene NA com as regiões 5'- e 3'-adjacentes dentro do plasmídeo pNA foi determinada (SEQ ID NO:1) (figura1). Ao mesmo tempo, as seqüências de nucleotídeo dos genes HA e M1com as regiões adjacentes foram também determinadas usando-se o plas-mídeo pHAM (SEQ ID NOS:2 e 3) (figuras 2 e 3).

Finalmente, um fragmento de DNA de restrição a partir do plasmí-deo pHAM que codificou ambos os cassetes de expressão de HA e M1 foi clona-do no plasmídeo pNA. Isto resultou no plasmídeo pNAHAM que codifica genesHA1 NA e M1 de vírus de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (figura 4).

Plasmídeo pNAHAM foi usado para construir um baculovírusrecombinante contendo genes de HA, NA e M1 de vírus da gripe integradosno genoma, cada um a jusante de um promotor polihedrina de baculovírusseparado. A infecção de células de inseto Sf-9S permissivas com o baculoví-rus recombinante resultante resultou em co-expressão destes três genes degripe em cada célula infectada Sf-9S com tal baculovírus recombinante.

Os produtos de expressão em células Sf-9S infectadas foramexpressos èm 72 horas de pós-infecção (p.i. por análise de SDS-PAGE,manchamento de proteína azul Coomassie, e análise de imunoblot de Wes-tern) usando-se anticorpos específicos de HA e NA (figura 5). Análise deimunoblot de Western foi efetuada usando-se anticorpo de coelho elevadocontra vírus da gripe tipo A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (CDC, Atlanta, Ga,USA), ou anticorpo monoclonal de camundongo para proteína M1 da gripe(Serotec, UK). As proteínas HA, NA e M1 dos pesos moleculares esperados(64 kd, 60 kd e 31 kd, respectivamente) foram detectadas por análise de i-munoblot de Western. Comparada a quantidade de proteína HA neste ensaio, aproteína NA mostrou reatividade inferior com soro de coelho para vírus da gri-pe A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Explanações para a quantidade de proteí-na NA detectável incluem níveis de expressão inferiores da proteína NA decélulas Sf-9S infectadas com baculovírus recombinante, conforme compara-do a proteína HA, reatividade inferior da NA com este soro sob condições dedesnaturação no ensaio de imunoblot de Western (devido a eliminação deepítopes de NA importantes durante eletroforese de gel de ligação de mem-brana), avidez de anticorpo de NA inferior, conforme comparado ao anticorpode HA, ou uma abundância inferior dos anticorpos de NA no soro.

O meio de cultura a partir das células Sf-9S infectadas com ba-culovírus recombinante expressando proteínas HA, NA e M1 de A/HongKong/1073/99 (H9N2) foi também sondado para proteínas de gripe. Os so-brenadantes de cultura clareados foram submetidos a ultracentrifugação a27.000 rpm de modo a concentrar complexos de proteína molecular altos devírus da gripe, tais como partículas subvirais, VLP, complexos de VLP, e,possivelmente, outros particulados auto-reunidos compreendidos de proteí-nas HA, NA e M1 da gripe. Os produtos de proteína peletizados foram res-suspensos em salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2), e adicionalmen-te purificados por ultracentrifugação em gradientes de etapa de 20-60% desacarose descontínuos. Frações a partir dos gradientes de sacarose foramcoletadas e analisadas por análise de SDS-PAGE, análise de imunoblot deWestern, e microscopia de elétron.

As proteínas HA e M1 da gripe dos pesos moleculares espera-dos foram detectadas em frações de gradiente de densidade de sacarosemúltipla por análise de manchamento azul de Coomassie e análise de imu-noblot de Western (figura 6, Tabela 1). Isto sugere que proteínas virais dagripe a partir de células Sf-9S infectadas são agregadas em complexos depeso molecular alto, tais como capsômeros, partículas subvirais, VLP, e/oucomplexos de VLP. As proteínas NA, embora inconsistentemente detectadaspor análise de manchamento azul de Coomassie e análise de imunoblot deWestern, que estavam aptas devido a inabilidade do soro de antigripe decoelho em reconhecer proteína NA desnaturada no ensaio de imunoensaiode Western, foram consistentemente detectadas em ensaio de atividade deenzima neuraminidase (figura 10).

TABELA 1

<table>table see original document page 68</column></row><table>

*Fração de 20-60% de gradiente de sacarose**Controle Negativo***Controle Positivo

A

<table>table see original document page 68</column></row><table>A presença de VLPs moleculares altas foi confirmada por croma-tografia de filtração de gel. Uma alíquota de frações de gradiente de densi-dade de sacarose contendo proteínas virais foi carregada em uma colunaSepharose CL-4B para fracionamento baseado em massa. A coluna foi cali-brada com dextrano azul 2000, dextrano amarelo, e vitamina B12 (Amer-sham Pharmacia) com pesos moleculares aparentes de 2.000.000; e 1,357dáltons, respectivamente, e o volume de vazio da coluna foi determinado.Conforme esperado, proteínas virais de gripe molecular alta migraram novolume de vazio da coluna, que era característica de proteínas macromole-culares, tais como partículas de vírus. Frações foram analisadas por análisede imunoblot de Western para detectar vírus e proteínas de baculovírus. Porexemplo, proteínas M1 foram detectadas nas frações de volume de vazio,que também continham proteínas de baculovírus (figura 7).

A morfologia de VLPs e proteínas de gripe em frações de gradi-ente de sacarose foi elucidada por microscopia de elétron. Para microscopiade elétron de manchamento negativo, as proteínas de gripe de duas fraçõesde gradiente de densidade de sacarose foram fixadas com 2% de glutaralde-ído em PBS, pH 7,2. O exame de microscopia de elétron de amostras nega-tivamente manchadas revelou a presença de complexos de proteína macro-moleculares, ou VLPs em ambas as frações. Estas VLPs revelaram tama-nhos diferentes incluindo diâmetros de aproximadamente 60 e 80 nm e mor-fologias (esferas). Complexos maiores de ambos os tipos de partículas fo-ram também detectados, bem como partículas em forma de haste (figura 8).

Todas as estruturas macromoleculares observadas têm picos (peplômeros)em suas superfícies, que é característico dos vírus da gripe. Desde que otamanho e aparência de partículas de 80 nm foi similar às partículas de vírusda gripe tipo selvagem, estas estruturas provavelmente representam VLPs1que têm similaridades distintas aos virions de gripe tipo selvagem, incluindogeometria de partícula similar, arquitetura, número de triangulação, simetria,e outras características. As partículas menores de aproximadamente 60 nmpodem representar partículas subvirais que diferem de VLPs ambos morfo-lógica e estruturalmente. Fenômeno similar de proteínas macromolecularesrecombinantes de tamanhos e morfologias diferentes foi também reportadopara outros vírus. Por exemplo, antígeno de núcleo recombinante (HBcAg)de vírus de hepatite B forma partículas de tamanhos diferentes, que têm ar-quitetura diferente e número de triangulação T=4 e T=3, respectivamente(Crowther et al., 1994).

Para caracterizar as propriedades funcionais das VLPs da gripeA/Hong Kong/1073/99 (H9N2) purificadas, amostras foram testadas em umensaio de hemaglutinação (figura 9), e um ensaio de enzima de neuramini-dase (figura 10). Para o ensaio de hemaglutinação, diluições duas vezes deVLPs de gripe purificadas foram misturadas com 0,6% de célula sangüíneavermelha de porquinho-da-índia, e incubadas a 4°C por 1 hora ou 16 horas.A extensão de hemaglutinação foi inspecionada visualmente, e a diluiçãomais alta de proteínas de gripe recombinantes capazes de aglutinar célulasde sangue vermelhas foi determinada e registrada (figura 9). Novamente,muitas frações a partir do gradiente de densidade de sacarose exibiram ati-vidade de hemaglutinação, sugerindo que formas macromoleculares múlti-plas e monoméricas de proteínas de gripe estavam presentes. A titulaçãomais alta detectada foi 1:4000. Em um experimento de controle, vírus de gri-pe tipo selvagem A/Shangdong demonstrou uma titulação de 1:2000. O en·saio de hemaglutinação revelou que as VLPs recombinantes consistindo errproteínas HA, NA e M1 de vírus de gripe A/ Hong Kong/1073/99 (H9N2) eram funcionalmente ativas. Isto sugere que a montagem, conformação e dobramento das proteínas de subunidade HA dentro das VLPs foram similareiou idênticas àquelas do vírus de gripe tipo selvagem.

Adicionalmente, um ensaio de enzima de neuraminidase foi realizado em amostras de H9N2 VLPs purificadas. A quantidade de atividade dineuraminidase em frações de gradiente de densidade de sacarose foi determinada usando-se fetuin como um substrato. No ensaio de neuraminidase, o ácido siálico cliva neuraminidase para liberar ácido siálico para medção. Reagente de arsenita foi adicionado para cessar a atividade enzimáticéA quantidade de ácido siálico liberada foi determinada quimicamente corácido tiobarbitúrico que produz uma cor rosa que foi proporcional à quantdade de ácido siálico livre. A quantidade de cor (cromóforo) foi medida es-pectrofotometricamente em comprimento de onda de 549 nm. Usando-seeste método, a atividade de neuraminidase foi demonstrada em frações degradiente de sacarose contendo VLPs de gripe (figura 10). Conforme espe-rado, a atividade foi observada em várias frações, com duas frações de pico.Como um controle positivo, o vírus da gripe tipo selvagem foi usado. O vírusda gripe tipo selvagem exibiu atividade de enzima de neuraminidase compa-rável àquela das VLPs de gripe purificadas. Estas descobertas corroboraramos resultados de HA com relação a contaminação de proteína, e sugeriramque VLPs purificadas de vírus da gripe A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) foramfuncionalmente similares a vírus de gripe tipo selvagem.

Os resultados a partir das análises e ensaios acima indicaram quea expressão de proteínas de HA, NA e M1 de gripe A/Hong Kong/1073/99(H9N2) foi suficiente para a auto-reunião e transporte de VLPs funcionais decélulas de inseto infectadas por baculovírus. Visto que estas VLPs de griperepresentam proteínas estruturais de gripe auto-reunidas, e demonstrampropriedades funcionais e bioquímicas similares àquelas do vírus da gripetipo selvagem, estas VLPs de gripe conservaram conformações importantes,incluindo epítopes de superfície necessários para vacinas de gripe efetivas.

Exemplo 2

Clonagem de RT-PCR de Genes Virais de Gripe Aviária A/Ηοηα Kona/1073/99

É um objetivo da presente invenção proporcionar seqüências deácido nucléico sintéticas capazes de direcionar produção de proteínas devírus da gripe recombinante. Tais seqüências de ácido nucléico sintéticasforam obtidas por métodos de transcrição reversa e de reação de cadeiapolimerase (PCR) usando-se RNA genômico natural de vírus da gripe isola-do do vírus. Para a proposta desta aplicação, seqüência de ácido nucléicose refere a RNA, DNA, cDNA, ou qualquer variante sintética destes, que co-dificam a proteína.

Um vírus de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) foi pro-vido pelo Dr. K. Subbarao (Centros de Controle de Doença, Atlanta, Ga.,USA). RNA genômico viral foi isolado pelo método de extração de RNA deácido fenol sob condições de contenção de Biosafety Levei 3 (BSL3) emCDC usando-se reagente Trizol LS (Invitrogen, Carlsbar, Calif, USA). Molé-culas de cDNA do RNA viral foram obtidas por transcrição reversa usando-se transcriptase reversa de MuLV (In Vitrogen), e PCR usando-se prímeresde oligonucleotídeo específicos para proteínas HA, NA e M1 e Taql DNApolimerase (In Vitrogen) (Tabela 1). Os fragmentos de PCR foram clonadosno vetor de subclonagem bacterial, pCR2.1T0P0 (In Vitrogen), entre os lo-cais Eco Rl que resultaram em três plasmídeos recombinantes, contendoclones de cDNA de HA, NA e M1.Exemplo 3

Clonagem de RT-PCR de Genes Virais de Gripe Humana A/Svdnev/5/94 (H3N2)Vírus de gripe A/Sydney/5/97 (H3N2) foi obtido pelo Dr. M. Mas-sare (Novavax, Inc., Rockville, Md). RNA genômico viral foi isolado pelo mé-todo de extração de RNA de ácido fenol sob condições de contenção BSL2em Novavax, Inc., usando-se reagente Trizol LS (Invitrogen). Moléculas decDNA do RNA viral foram obtidas por transcrição reversa e PCR usando-seiniciadores de oligonucleotídeo específicos para proteínas HA, NA, M1, M2 eNP (Tabela 1). Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor de subclo-nagem bacterial, pCR2.1T0P0 (In Vitrogen), entre os locais Eco Rl que re-sultaram em cinco plasmídeos recombinantes, contendo clones de cDNA deHA, NA, M1, M2e NP.Exemplo 4

Clonagem de cDNAs Virais de Gripe Aviária A/Honq Kong/1073/99 em Veto-res de Transferência de Baculovírus

A partir de plasmídeos baseados em pCR2.1T0P0, os genes deHA, NA e M1 foram subclonados em vetor de transferência de baculovíruspFastBad (In Vitrogen) dentro do local de polihedrona e locais de Tn7 att, e ajusante do promotor polihedrina de baculovírus, e a montante da seqüência desinal de polialdenilação. Os genes virais foram ligados com T4 DNA ligase. Pa-ra o gene HA, um fragmento de DNA Bam Hl-Kpn de pCR2.1T0P0 foi inse-rido em DNA de plasmídeo Kpn digerido pFasrBacl. Para o gene NA, umfragmento de DNA Eco Rl de pCR2.1T0P0-NA foi inserido em DNA deplasmídeo Eco Rl digerido pFastBacl. Para o gene M1, um fragmento deDNA Eco Rl de pCR2.1TOPO-M1 foi inserido em DNA de plasmídeo Eco RlpFasrBacl. Bactérias competentes de E. coli DH5a (In Vitrogen) foramtransformadas com estas reações de ligação de DNA, colônias transforma-das resultadas, e clones bacteriais isolados. Os plasmídeos baseados empFasrBacl, pFastBac-1-ΗΑ, pFast-Bac-1-ΝΑ, e pFast-Bac-1-M1 resultantesforam caracterizados por restrição de mapeamento de enzima em géis aga-rose (figura 4A). As seqüências de nucleotídeo conforme mostrado nas figu-ras 1-3 dos genes clonados foram determinadas por seqüenciamento deDNA automático. A análise de seqüência de DNA mostrou que os genes deHA, NA e M1 de gripe clonados foram idênticos às seqüências de nucleotí-deo para estes genes conforme publicado anteriormente [genes de NA, HA eM1 de gripe A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (números de acesso no Banco deGene AJ404629, AJ404626 e AJ278646, respectivamente)].

Exemplo 5

Clonagem de cDNAs Virais de Gfipe Humana A/Svdnev/5/97 em Vetores deTransferência de Baculovírus

A partir de plasmídeos baseados em pCR2.1TOPO, os genes deHA, NA, Μ1, M2 e NP foram subclonados em vetor de transferência de bacu-lovírus pFastBacl dentro do local de polihedrona e locais de Tn7 att, e a ju-sante do promotor polihedrina de baculovírus, e a montante da seqüência desinal de polialdenilação. Os genes virais foram ligados com T4 DNA ligase.Para o gene HA, um fragmento de DNA Bam Hl-Kpn de pCR2.1TOPO-hHA3foi inserido em DNA de plasmídeo BamHI-KpnI digerido pFasrBacl . Para ogene NA, um fragmento de DNA Eco Rl de pCR2.1TOPO-hNA foi inseridoem DNA de plasmídeo Eco Rl digerido pFastBacl. Para o gene M1, um frag-mento de DNA Eco Rl de pCR2.1TOPO-hM1 foi inserido em DNA de plas-mídeo Eco Rl pFasrBacl. Para o gene M2, um fragmento de DNA Eco Rl depCR2.1TOPO-hM2 foi inserido em DNA de plasmídeo Eco Rl digerido pFas-rBad. Para o gene NP, um fragmento de DNA Eco Rl de pCR2.1TOPO-hNPfoi inserido em DNA de plasmídeo Eco Rl pFasrBacl. Bactérias competen-tes de E. coli DH5a (In Vitrogen) foram transformadas com estas reações deligação de DNA, colônias transformadas resultadas, e clones bacteriais iso-lados. Os plasmídeos baseados em pFasrBad, pFastBac-1-hHA3, pFast-Bac-1-hNA2, pFast-Bac-1-hM1, pFast-Bac-1-hM2 e pFast-Bac-1-hNP resul-tantes foram caracterizados por restrição de mapeamento de enzima emgéis agarose. As seqüências de nucleotídeo dos genes clonados foram de-terminadas por seqüenciamento de DNA automático. A análise de seqüênciade DNA mostrou que os genes de HA, NA, Μ1, M2 e NP de gripe clonadosforam idênticos às seqüências de nucleotídeo para estes genes conformepublicado anteriormente.

Exemplo 6

Constructo de Vetores de Transferência de Baculovírus Multiaênico aue Co-dificam Genes Virais de Gripe Aviária A/Honq Kona/1073/99

De modo a construir vetores de transferência bacmid baseadosem pFastBacI expressando genes múltiplos de vírus da gripe A/HongKong/1073/99 (H9N2), inicialmente um fragmento de DNA Sna B1 -Hpa deplasmídeo pFastBac1-M1 contendo o gene M1 foi clonado no local Hpa I depFastBacI-HA. Isto resulta em plasmídeo pFastBacI-HAM que codifica am-bos genes de HA e M1 dentro de cassetes de expressão, e expressos sob ocontrole de promotores polihedrina separados.

Finalmente, um fragmento de DNA SnaB1-AvrII de pFastBacl-HAM contendo os cassetes de expressão HA e M1, foi transferido em plas-mídeo de DNA Hpa Mwll pFastBac1-NA digerido. Isto resulta no plasmídeopFastBacI-NAHAM que codifica três cassetes de expressão independentespara expressão de genes de HA, NA e M1 da gripe, e expressos sob o con-trole de promotores polihedrina separados (figura 4B).

Em outro exemplo, o gene H3 de pFASTBACI-hHA3 (vide e-xemplo 5) foi clonado em pFASTBACI -NAHAM como um quarto gene viralde gripe para a expressão e produção de VLPs de gripe heterotípicas.

Exemplo 7

Geração de Baculovírus Recombinante Multiqênico que Codifica Genes de NA.HA e M1 de Vírus de Gripe Aviária A/Ηοηο Kono/1073/99 em Células de Inseto

O vetor de transferência bacmid multigênico resultante pFast-Bacl -NAHAM foi usado para gerar um baculovírus recombinante multigênicoque codifica genes de HA, NA e M1 de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99para expressão em células de inseto. DNAs bacmid recombinantes foramproduzidos por recombinação específica de local em polihedrina, e seqüên-cias de DNA Tn7 att entre pFastBacI -NAHAM DNA e o genoma de baculoví-rus AcMNPC ancorado em células competentes de E. coli DH10BAC (In Vi-trogen) (figura 4B). DNA bacmid recombinante foi isolado pelo método deDNA de plasmídeo de miniprep, e transfectado em células Sf-9S usando-seo lipídio catiônico CELLFECTIN (In Vitrogen). Em seguida a transfecção, osbaculovírus recombinantes foram isolados, purificados em placa, e amplifi-cados em células de inseto Sf-9S. Estoques de vírus foram preparados emcélulas de inseto Sf-9S e caracterizados para expressão de produtos de ge-ne de HA, NA e M1 viral de gripe aviária. O baculovírus recombinante resul-tante foi designado bNAHAM-H9N2.

Exemplo 8

Expressão de Proteínas de Gripe Aviária Recombinante A/Ηοηα Konq/1073/99em Células de Inseto

Células de inseto Sf-9S mantidas como culturas de suspensãoem frascos osciladores a 28°C em meio livre de soro (HyQ SFM, HyCIone,Ogden, Utah) foram infectadas em uma densidade de célula de 2 χ 106 célu-las/ml com o baculovírus recombinante bNAHAM-H9N2, em uma multiplici-dade de infecção (MOI) de 3 pfu/célula. A infecção de vírus procede por 72 ho-ras para permitir expressão de proteínas de gripe. A expressão de proteínas HAe M1 de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) em células de inseto infec-tadas foi confirmada por análises de SDS-PAGE e de imunoblot de Western.

A análise de SDS-PAGE foi realizada em 4-12% de géis NuPAGE de gradi-ente linear (Invitrogen) sob condições reduzidas e de desnaturação. Anticor-pos primários em análise de imunoblot de Western eram anti-soro de coelhopoliclonal elevado contra gripe aviária A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) obtidode CDC, e anti-soro de murina monoclonal para proteína M1 de gripe (Sero-tec, UK). Anticorpos secundários para análise de imunoblot de Western fo-ram anti-soro IgG de cabra de fosfatase alcalina conjugada elevada contraIgG de coelho ou camundongo (H + L) (Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg, Md., USA). Os resultados destas análises (figura 5) indicaramque as proteínas HA e NA foram expressas nas células de inseto infectadaspor baculovírus.

Exemplo 9

Purificação de Partículas Similares a Vírus de Gripe Aviária RecombinanteH9N2 e Complexos de Proteína Macromoleculares

Sobrenadantes de cultura (200 ml) de células de inseto Sf-9Sinfectadas com o baculovírus recombinante bNAHAM-H9N2 que expressamprodutos de gene de HA1 NA e M1 de gripe aviária A/Hong Kong/1073/99(H9N2) foram colhidos por centrifugação de baixa velocidade. Os sobrena-dantes de cultura foram clareados por centrifugação em uma centrífuga desupervelocidade Sorval RC-5B por 1 hora a 10.000 χ g e 4°C usando-se umrotor GS-3. Os vírus e VLPs foram isolados de sobrenadantes de cultura cla-reados por centrifugação em uma ultracentrífuga Sorval OTD-65 por 3 horasa 27.000 rpm a 4°C usando-se um rotor de caçamba oscilante. O pélete devírus foi ressuspensa em 1 ml de PBS (pH 7,2), carregada em 20-60% (p/v)de gradiente de etapa de sacarose descontínua, e dissolvida por centrifuga-ção em uma ultracentrífuga Sorval OTD-65 por 16 horas a 27.000 e 4°C u-sando-se um rotor Sorval TH-641. Frações (0,5 ml) foram coletadas a partirdo topo do gradiente de sacarose.

Proteínas de gripe nas frações de gradiente de sacarose foramanalisadas por análises de SDS-PAGE e de imunoblot de Western, conformedescrito acima no Exemplo 6. As proteínas HA e M1 foram encontradas nasmesmas frações de gradiente de sacarose (figura 6), conforme mostrado poranálise de westem blot, e sugere que as proteínas HA e M1 foram associadascomo complexos de proteína macromoleculares. Também as proteínas HA eM1 foram encontradas em frações através de todo gradiente de sacarose, su-gerindo que estas proteínas virais recombinantes foram associadas comcomplexos de proteína macromoleculares de densidades e composiçõesdiferentes.Exemplo 10

Análise de VLPs e Proteínas de Gripe Aviária Recombinante de H9N2 porCromatoqrafia de Filtracão de Gel

Macromoléculas de proteína, tais como VLPs e proteínas mo-noméricas, migram diferentemente em colunas cromatográficas de filtraçãode gel ou de exclusão de tamanho baseado em seu tamanho de massa eforma. Para determinar se as proteínas de gripe recombinantes de fraçõesde gradiente de sacarose eram proteínas monoméricas ou complexos deproteína macromoleculares, tais como VLPs, uma coluna de cromatografia(7 mm χ 140 mm) com um volume de leito elevado de 14 ml de SepharoseCL-4B (Amersham) foi preparadá. A coluna de exclusão de tamanho foi equi-librada com PBS, e calibrada com Dextrano Azul 2000, Dextrano Amarelo, eVitamina B12 (Amersham Pharmacia) com pesos moleculares aparentes de2.000.000; 20.000; e 1.357, respectivamente, para determinar o volume devazio da coluna. Dextrano Azul 2000 eluiu da coluna no volume de vazio(fração de 6 ml) também. Conforme esperado, os complexos de proteína degripe recombinante eluídos da coluna no volume de vazio (fração de 6 ml).Este resultado foi característico de um complexo de proteína macromolecu-Iar de alto peso molecular, tais como VLPs. As proteínas virais nas fraçõesde coluna foram detectadas por análise de imunoblot de Western conformedescrito acima no Exemplo 6. As proteínas M1 foram detectadas nas fraçõesde volume de vazio (figura 7). Conforme esperado, proteínas de baculovírusestavam também no volume de vazio.

Exemplo 11

Microscopia de Elétron de VLPs de Gripe Recombinantes

Para determinar se os complexos de proteína macromolecularesisolados em gradientes de sacarose e contendo proteínas de gripe aviária re-combinantes têm morfologias similares a virions da gripe, exame microscópicode elétron de amostras manchadas negativamente foi realizado. Complexos deproteína de gripe aviária recombinantes A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) foramconcentrados e purificados de sobrenadantes de cultura por ultracentrifuga-ção nos gradientes de sacarose descontínuos conforme descrito no Exemplo7. Alíquotas das frações de gradiente de sacarose foram tratadas com 2%de glutaraldeído em PBS, pH 7,2, absorvidas em plástico descarregado fres-co/grades revestidas com carbono, e lavadas com água destilada. As amos-tras foram manchadas com 2% de fosfotungstato de sódio, pH 6,5, e obser-vadas usando-se um microscópio de elétron de transmissão (Philips). Micro-gráficos de elétron de amostras negativamente manchadas de complexos deproteína de gripe aviária recombinantes de H9N2 de duas frações de gradi-ente de sacarose mostraram partículas esféricas e em forma de haste (figura8) de duas frações de gradiente de sacarose. As partículas têm tamanhos60 e 80 nm) e morfologias diferentes. Complexos maiores de ambos os ti-pos de partículas foram também detectados, bem como partículas em formade haste (figura 8). Todas as estruturas de complexo de proteína observadasexibiram projeções superficiais similares a picos assemelhando-se a peplô-meros de HA e NA de vírus da gripe. Desde que o tamanho e aparência daspartículas de 80 nm foi similar aquelas partículas de vírus da gripe tipo sel-vagem, estas estruturas provavelmente representam VLPs de gripe envelo-padas. As partículas menores de aproximadamente 60 nm provavelmenterepresentam partículas subvirais que diferem das VLPs acima ambas morfo-logicamente e estruturalmente.Exemplo 12

Análise de Características Funcionais de Proteínas de Gripe por Ensaio deHemaalutinacão

Para determinar se as VLPs e proteína de gripe purificadas pos-suem atividades funcionais, tal como atividade de hemaglutinação e de neu-raminidase, que eram características para o vírus da gripe, as VLPs e prote-ínas de gripe purificadas foram testadas em ensaios dé hemaglutinação e deneuraminidase.

Para o ensaio de hemaglutinação, uma série de diluição 2 vezesde frações de gradiente de sacarose contendo VLPs de gripe ou vírus dagripe tipo selvagem de controle positivo tipo A foram preparadas. Em segui-da, elas foram misturadas com 0,6% de células de sangue vermelhas deporquinho-da-índia em PBS (pH 7,2), e incubadas a 4°C por 1 a 16 horas.Como um controle negativo, PBS foi usado. A extensão de hemaglutinaçãofoi determinada visualmente, e a diluição mais alta de fração capaz de aglu-tinar células de sangue vermelhas de porquinho-da-índia foi determinada(figura 9). A titulação de hemaglutinação mais alta observada para as VLPse proteínas de gripe purificadas foi 1:4000, que foi mais alta do que a titula-ção mostrada pelo controle de gripe tipo selvagem, que foi 1:2000.Exemplo 13

Análise de Características Funcionais de Proteínas de Gripe por Ensaio deNeuraminidase

A quantidade de atividade de neuraminidase em frações de gra-diente de sacarose contendo VLP de gripe foi determinada pelo ensaio deneuraminidase. Neste ensaio a NA (uma enzima) agiu no substrato (fetuin) eliberou ácido siálico. Reagente arsenita foi adicionado para cessar a ativida-de de enzima. A quantidade de ácido siálico liberada foi determinada quimi-camente com o ácido tiobarbitúrico que produziu uma cor rosa em proporçãoao ácido siálico livre. A quantidade de cor (cromóforo) foi medida em um es-pectrofotômetro em comprimento de onda de 594 nm. Os dados, conformerepresentados na figura 8, mostraram que uma quantidade significante deácido siálico foi produzida por frações contendo VLP dos gradientes de saca-rose, e que estas frações correspondem àquelas frações exibindo atividadede hemaglutinação.

Exemplo 14

Imunização de Camundonqos BALB/c com VLPs de H9N2 de Gripe Recom-binante Homotípica Funcional

A imunogenecidade das VLPs de gripe recombinantes foi deter-minada pela imunização de camundongos, seguido por análise de western blotde soro humano. VLPs recombinantes (1 pg/injeção) compreendidas de proteí-nas HA, NA e M1 virais de vírus da gripe aviária tipo A/Hong-Kong/1073/99 epurificadas em gradientes de sacarose, foram incubadas subcutaneamentena região deltóide de dez (10) camundongos BALB/c fêmeas no dia 0 e dia28 (figura 11). PBS (pH 7,2) foi administrado similarmente como um controlenegativo em cinco (5) camundongos. Os camundongos foram misturados apartir da cavidade supraorbital no dia -1 (mistura primária), e dia 54 (misturasecundária). Soros foram coletados de amostras de sangue seguindo coagu-lação e centrifugação por toda a noite.

Para análise de western blot, 200 ng de vírus de gripe aviáriainativado tipo A H9N2, ou vírus de gripe aviária adaptado ao frio tipo AH9N2, bem como Vide padrões de proteína pré-manchada Blue Plus 2 (inVitrogen), foi desnaturado (95°C., 5 minutos), e submetido a eletroforese sobcondições reduzidas (10 mM de β-mercaptoetanol) em 4-12% de géis degradiente de poliacrilamida NuPAGE (In Vitrogen) em tampão MES a 172volts até que corante de rastreamento de bromofenol azul desapareceu. Pa-ra géis de proteína, as proteínas de eletroforese foram visualizadas pormanchamento com reagente Coloidal Coomassie Azul (In Vitrogen). As pro-teínas foram transferidas a partir do gel para membranas de nitrocelulose emmetanol por procedimento de western blot padrão. Soros de camundongosimunizados com VLP e coelhos imunizados com vírus de gripe aviária inati-vado H9N2 (soro de controle positivo) foram diluídos 1:25 e 1:100, respecti-vamente, em solução de PBS (pH 7,2), e usados como anticorpo primário.Membranas ligadas por proteína, que foram bloqueadas com 5% de caseína,foram reagidas com anti-soro primário por 60 minutos à temperatura ambien-te com sacudimento constante. Seguindo lavagem de membranas de anti-corpo primárias com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween20, anti-soro secundário [antimurina de cabra IgG-fosfatase alcalina conju-gada (1:10.000), ou cabra anticoelho IgG-fosfatase alcalina conjugada(1:10.000)] foram reagidas 60 minutos com a membrana. Seguindo lavagemde membranas de anticorpo secundárias com solução salina tamponada porfosfato contendo Tween 20, proteínas de ligação de anticorpo nas membra-nas foram visualizadas pelo desenvolvimento com o substrato cromogênico,tal como NBT/BCIP (In Vitrogen).

Os resultados de análise de western blot (figura 12) foram queproteínas com pesos moleculares similares às proteínas HA e M1 virais (75e 30 kd, respectivamente) se ligam a soros de controle positivo (figura 12) esoros de camundongos imunizados com as VLPs de H9N2 de gripe recom-binantes sozinhas foram imunogênicos em camundongos por esta rota deadministração.

Exemplo 15

Imunoaenicidade de VLP de Kinq/1073/99 (H9N2) e Estudo Provocado emCamundongos BALB/c

Camundongos BALB/c foram imunizados com VLPs de H9N2 (1µg de HA ou 10 pg de HA/dose), com ou sem 100 pg de adjuvante Novaso-me, no dia 0 e dia 21, e provocados com vírus de infecção homólogo IN nodia 57. Os camundongos foram misturados no dia 0, 27 e 57 com o soro en-saiado para anticorpos anti-HA pelo ensaio de inibição de hemaglutinação(HI) usando-se RBCs de peru, e gripe por ELISA. Os resultados deste estu-do são mostrados na Figura 13 a Figura 16.

Titulações altas de anticorpos de H9N2 foram induzidas apósuma imunização simples (primária) com vacina de VLP H9N2 sem ou comNocasomes, e uma dose de 10 pg de VLPs contendo 1 pg de HA (Figura13). Titulações de anticorpo específicos foram aumentadas cerca da metadea um log seguindo uma imunização incentivadora.

Após imunização e um reforço com 1 pg de HA na forma deVLPs de H9N2, os níveis Hl de soro estavam em ou acima do nível geral-mente considerado protetor (log2=5) em todos os animais (Figura 14, painelesquerdo inferior). VLPs de H9N2 formuladas com adjuvante Novasomeaumentaram as respostas de Hl cerca de 2 vezes, seguindo imunização pri-mária, e cerca de 4 vezes após o reforço (Figura 14, painel direito inferior). Ahemaglutinina de H9N2 de subunidade purificada também induziu níveis pro-tetores de anticorpos de Hl após reforço, e Novasomes novamente aumen-tou as respostas de anticorpo de Hl por cerca de 2 vezes após a imunizaçãoprimária, e 4 vezes após a imunização de reforço (Figura 14, painéis superi-ores). O nível de anticorpo de Hl induzido com 10 pg de HA dado como umavacina de subunidade foi equivalente a 1 pg de HA apresentado na forma deumaVLP.

Em adição, a perda de peso foi significantemente menor noscamundongos imunizados com VLPs de H9N2, ou com VLPs mais adjuvantecomparada a animais de controle não-vacinados (Figura 15). Não existemdiferenças estatísticas na perda de peso nos grupos imunizados com VLPsde H9N2 e VLPs de H9N2 mais adjuvante Novasome.

Do mesmo modo, titulações de vírus de pulmão em 3 e 5 diaspós provocação com vírus de H9N2 foram significantemente reduzidas emcamundongos imunizados com VLPs de H9N2 (Figura 6). No dia 3 quandoas titulações de vírus da gripe atingem o pico nos tecidos do pulmão, ca-mundongos imunizados com VLPs de H9N2 mais Novasome® tem uma re-dução significantemente maior na titulação de vírus comparada a camun-dongos imunizados com VLPs sozinho, e aos camundongos de controle não-vacinados.Exemplo 16

Imunoaenecidade de VLP de A/Fuiian/411/2002 (H3N2) e Reatividade Cru-zada entre várias Cepas de Gripe

Camundongos BALB/c foram imunizados com VLPs de A/Fujian/411/2002 (3,0, 0,6, 0,12 e 0,24 pg HA/dose), duas vezes IM e IN. Os ca-mundongos foram misturados no dia 0 e 35. O soro foi, em seguida, ensaia-do para anticorpos anti-HA pelo ensaio de inibição de hemaglutinação (HI)usando-se RBCs de peru, e para anticorpos de antigripe por ELISA. Os re-sultados deste estudo são mostrados nas FIGURAS 17A, 17B e 17C. Estesresultados indicam que uma resposta imune foi montada ambos IM e IN con-tra HA e NA.Exemplo 17

Determinação dos isotipos IqG em camundonao após inoculacão com VLPsde H3N2

Camundongos foram inoculados com VLPs intramuscularmentee intranasalmente. Na semana 5, soro foi coletado e ensaiado para distinguirentre isotipos IgG.

O soro foi testado em placas revestidas com HA purificada (Pro-tein Sciences) A/Wyoming/3/2003 usando-se um ensaio ELISA. Diluições 5vezes em série de soro foram adicionadas às cavidades, e as placas foramincubadas. Em seguida, anti-camundongo Ig de cabra biotinilatado ou anti-camundongo lgG1, anti-camundongo lgG2a, anti-camundongo lgG2b e anti-camundongo lgG3. Em seguida, streptavidina-peroxidase foi adicionada àscavidades. Conjugados ligados foram detectados. Os resultados são ilustra-dos nas Figuras 18A e B. Estes resultados ilustram que lgG2a são o isotipomais abundante em uma resposta imune contra VLPs em camundongo.

Exemplo 18Estudo de variação de dose de VLP de A/Honq-Konq/1073/99 em ratos SD

Ratos SD (n=6 por dose) foram imunizados no dia 0 e dia 21com VLPs de A/Hong-Kong/1073/99 purificadas diluídas com PBS em pHneutro para 0,12, 0,6, 3,0 e 15,0 pg de HA, ou com PBS sozinho. Amostrasde sangue foram tomadas a partir dos animais no dia 0, dia 21, dia 35 e dia40, e o soro ensaiado para ensaio de inibição de hemaglutinação (Hl) paradetectar anticorpos funcionais capazes de inibir a função de ligação da HA.A dosagem foi baseada no teor de HA conforme medido usando-se SDS-PAGE e densitometria de VLPs de H9N2 purificadas. Os resultados da titu-lação de ensaio de inibição de hemaglutinação são representados na Figura19. Uma dose de HA simples de 0,6 pg de VLPs de H9N2, ou duas doses de0,12 pg de HA, produziu níveis protetores de anticorpos de Hl nos ratos. Osdados indicam que uma quantidade inferior de HA pode induzir uma respos-ta protetora quando referida HA é parte de uma VLP.

Exemplo 19Imunoaenecidade de VLP de Konq/1073/99 (H9N2)

Camundongos BALB/c foram imunizados com VLP de H9N2(0,12, 0,6 Mg de HA/dose), com ou sem 100 pg de Novasome e adjuvanteAlum, no dia 0 e dia 21, e provocados com vírus infecciosos homólogos INno dia 57. Os camundongos foram também imunizados com 3,0 e 15,0 pgde HA/dose (sem adjuvante). Os camundongos foram misturados nos dias 0,21, 35 e 49 com o soro ensaiado para anticorpos anti-HA pelo ensaio de ini-bição de hemaglutinação (Hl) usando-se RBCs de peru, e gripe por ELISA.Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 20 A e B.

Os resultados indicam que uma resposta imune total mais robus-ta foi observada quando as VLPs foram administradas com um adjuvante.Contudo, uma resposta protetora foi induzida com 0,12 pg de HA/dose nasemana 3 quando comparado à formulação de VLPs com Alum e VLPs comnenhum adjuvante. Também na semana 7, as VLPs compreendendo Nova-somes tinham um aumento de cerca de 2 Iog em titulação de Hl, conformecomparado à VLP com Alum. A robustez da resposta foi similar às VLPsadministradas em 3,0 e 15,0 pg de HA/dose sem um adjuvante. Estes resul-tados indicam que Novasomes induzem uma resposta mais robusta, confor-me comparado ap Alum. Em adição, uma resposta imune protetora pode seralcançada com 25 χ menos VLPs quando referidas VLPs são administradasem uma formulação compreendendo Navasomes.

Também, nos dados de 0,6 pg de HA/dose, a formulação de No-vasome tinha uma resposta cerca de 1,5 Iog maior do que comparada a A-lum. As respostas imunes foram similares em grandeza às VLPs administra-das em 3,0 e 15,0 pg de HA/dose sem adjuvante. Estes resultados indicamque com um adjuvante, aproximadamente 5 χ menos VLPs são necessáriaspara serem administradas para alcançar uma resposta protetora.

Também, a Figura B representa a titulação de Hl de VLPs deH9N2 usando-se formulações diferentes de Novasomes. As seguintes sãoas fórmulas usadas no experimento:

Grupo 1: VLP de H9N2 (0,1 pg)(n=5)

Grupo 2: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/DCW puro)(n=5)

Grupo 3: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/DCW 1:3)(n=5)

Grupo 4: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/DCW 1:9)(n=5)

Grupo 5: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/DCW 1:27)(n=5)

Grupo 6: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/NVAX 1 )(n=5)

Grupo 7: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/NVAX 2)(n=5)

Grupo 8: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/NVAX 3)(n=5)

Grupo 9: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/NVAX 4)(n=5)

Grupo 10: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/NVAX 5)(n=5)

G rupo 11: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/Alum-OH)(n=5)

Grupo 12: VLP de H9N2 (0,1 pg) w/CpG)(n=5)

Grupo 13: PBS (0,6 pg) (n=5)Grupo 14: VLP de H3 (0,6 pg) (n=5)

Grupo 15: VLP de H5 (0,6 pg) (n=8)

-H9: (Lot n2 11005)

-DCW: NOvasomes (LOt n2 121505-2, POIioxietileno-2-cetil éter, Colesterol,

Óleo de soja superfino, e Cetilpiridin cloreto)

-NVAX 1: B35P83, MF-59 réplica (Esqualeno, Polissorbato, e Span)-NVAX-2: B35P87 (Óleo de Soja, Brij, Colesterol, Pluronic F-68), -NVAX3: B35P88 (Óleo de Soja, Brij, Colesterol, Pluronic F-68 e Polietilenoimina)-NVAX 4: (Óleo de Soja, monoestearato de glicerila, Colesterol, Polissorbato)-NVAX 5: B31P63 (Óleo de Soja, monoestearato de glicerila, Colesterol, Po-lissorbato)

-CpG: (Lot n2 1026004)

-H5: (Lot n2 22406)

A figura 21 representa a curva de resposta de dose de VLP deH9N2. Estes dados indicam que uma dose de VLPs em 0,6 pg de HA/dose éo mínimo para induzir uma resposta imune protetora em camundongos após3 semanas.

Exemplo 20

Materiais e Métodos para Estudos de Furão

Furões foram comprados de Triple F Farms (FFF, Sayre, PA).

Todos os furões comprados tinham uma titulação de HAI de menos do que10 unidades de hemaglutinação. Aproximadamente dois dias antes da vaci-nação, animais foram implantados com um transponder de temperatura (Bi-oMedic Data Systems, Inc). Os animais (6 animais/grupo) foram vacinadosno dia 0, ou com (1) PBS (controle negativo, grupo um), (2) VLPs de gripeH3N2 @ 15 pg de H3 (grupo 2), (3) VLPs de gripe H3N2 @ 3 pg de H3(grupo 2), (4) VLPs de gripe H3N2 @ 0,6 pg de H3 (grupo 3), (5) VLPs degripe H3N2 @ 0,12 pg de H3 (grupo 5), ou (6) rH3HA @ 15 pg (grupo 6). Nodia 21, os animais foram impulsionados com vacina. Os animais foram mis-turados no dia 0 (antes da vacinação), dia 21 (antes do reforço da vacina), edia 42. Os animais foram avaliados para sinais clínicos de efeitos adversosde vacina uma vez por semana através de todo o período de estudo. Estu-dos similares foram realizados com outras VLPs de gripe.

Níveis de HAI em soros de furão

Soros de furão foram obtidos de FFF, tratados com Recptor Des-troying Enzyme (RDE), e testados em um ensaio de inibição de hemagluti-nação (HAI) por procedimentos padrões (Kendal et ai, (1982)). Todos osfurões que foram escolhidos para o estudo testados negativos (HAI=IO) parapré-existência de anticorpos para vírus de gripe humana que circulam atual-mente (A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A panama/2007/99 (H3N2),A/Wellington/01/04 (H2N3) e B/Sichuan/379/99 e H5N1).

Furões

Furões (Mustela putõrius furo) Fitch machos de aproximadamen-te 8 meses de idade, com gripe, castrados e de linhagem, foram compradosde FFF. Os animais foram alojados em gaiolas de coelho de aço inoxidável(Shor-line, KS) contendo Aparas Sani de Estratificação de Animal de Labora-tório (P.J. Murphy Forest Products, NJ). Os furões foram providos com Dietade Furão Global Teklad (Harlan Teklad, Wl), e água fresca ad libitum. Osrecipientes foram mudados três vezes cada semana, e as gaiolas foram lim-pas duas vezes por semana.

Vacinação e Coleta de Sangue de Furões

A vacina, VLPs de gripe H3N2 ou VLPs de gripe H9N2 e contro-les, por exemplo, rH3NA (A/Wyoming/3/2002) e PBS (controle negativo) fo-ram armazenados a 4°C antes de uso. Para muitos estudos, seis grupos defurões (Ν-6/grupo) foram vacinados intramuscularmente com, ou concentra-ção de vacina, ou controle em um volume de 0,5 ml.

Antes da coleta de sangue e vacinação, os animais foram anes-tesiados por injeção intramuscular no quarto traseiro interno com uma solu-ção de Katamina (25 mg/kg, Atropina (0,05 mg/kg) e Xilasina (2,0 mg/kg) de"KAX". Uma vez sob anestesia, os furões foram posicionados em repousodorsal, e sangue foi coletado (volume entre 0,5 e 1,0 ml) a partir da veia ca-va anterior usando-se uma agulha de calibre 23 de 2,54 cm (1 polegada)conectada a uma seringa tuberculim de 1cc. O sangue foi transferido paraum tubo contendo um separador de soro e ativador de coágolo, e permitidocoagular à temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados, e o soro foiremovido e congelado a -80°C. O sangue foi coletado antes da vacinação(dia 0), antes do reforço (dia 21), e dia 42, e testado por ensaio de HA.

Monitoramento de Furões

As temperaturas foram medidas semanalmente aproximadamen-te na mesma hora durante todo o período de estudo. Os valores de pré-vacinação foram classificados para obter-se uma temperatura base para ca-da furão. A mudança na temperatura (em graus Fahrenheit) foi calculada emcada ponto de tempo para cada animal. Os furões foram examinados sema-nalmente para sinais clínicos de efeitos adversos de vacina, incluindo tempe-ratura, perda de peso, perda de atividade, descarga nasal, espirro e diarréia.Um sistema de classificação baseado naquele descrito em Reuman et al(1989) foi usado para avaliar nível de atividade onde 0 = alerta e esperto; 1 =alerta, mas esperto somente quando estimulado; 2 = alerta, mas não espertoquando estimulado; 3 = nem alerta nem esperto quando estimulado. Basea-do nas classificações para cada animal em um grupo, um índice relativo deinatividade foi calculado como Σ(dia0-Dia42)[classificação de atividade +1]/Σ(dia0-Dia42), onde η é igual ao número total de observações. Um valorde 1 foi adicionado a cada classificação base de modo que uma classifica-ção de "0" pode ser dividida por um denominador, resultando em um valorde índice de 1,0.

Preparações de Soros

Os soros geralmente têm níveis baixos de inibidores não-especí-ficos em hemaglutinação. Para inativar estes inibidores não-específicos, ossoros foram tratados com (RDE) antes de serem testados. Brevemente, trêspartes de RDE foram adicionadas a uma parte de soros, e incubadas duran-te toda a noite a 37°C. RDE foi inativada por incubação a 56°C por aproxi-,madamente 30 minutos. Seguindo inativação de RDE, PBS foi adicionado àamostra para um diluição de soro final de 1:10 (RDE-Tx). O soro diluído emRDE-Tx foi armazenado a 4°C antes do teste (por 7 dias), ou armazenado a-20°C.Preparação de eritrócitos de peru:

Os vírus de gripe humana se ligam a receptores de ácido siálicocontendo ligações de ácido N-acetilneuramínico α 2,6-galactose. Os vírus dagripe aviaria se ligam a receptores de ácido siálico contendo ácido N-acetilneuramínico α 2,3-galactose (ligações α 2,3), e expressam ambas liga-ções α 2,3 e α 2,6. Eritrócitos de peru (TRBC) são usados para ensaio deHAI, visto que A/Fujin é um vírus de gripe humana. Os TRBCs ajustadoscom PBS para alcançar uma suspensão de 0,5% vol/vol. As células sãomantidas a 4°C, e usadas dentro de 72 horas de preparação.

Ensaio de H1

O ensaio de Hl foi adaptado a partir do manual de sobrevivênciade vírus baseado em laboratório CDC (Kendal etal, (1982), Conceitos e pro-cedimentos para sobrevivência de gripe baseados em laboratório, Departa-mento dos Estados Unidos de Saúde e Serviços Humanos, Serviço de Saú-de Pública, Centros para Controle de Doença, Atlanta, Geórgia, aqui incor-porados em sua totalidade para todas as propostas). Soro RDE-Tx foi seri-almente diluído duas vezes em placas de microtitulação de fundo em v. Umvolume igual de vírus ajustado, ajustado para aproximadamente 8 HAU/50ul, foi adicionado a cada cavidade. As placas foram cobertas e incubadas àtemperatura ambiente por 15 minutos, seguido pela adição de 0,5% deTBBC. As placas foram misturadas por agitação, cobertas, e os TRBCs fo-ram permitidos assentarem por 30 minutos à temperatura ambiente. A titula-ção de HAI foi determinada pela diluição recíproca da última série que conti-nha TRBC não-aglomerado. Os controles de soro positivo e negativo foramincluídos em cada placa.

Exemplo 21

Estudo de classificação de dose de VLP de A/Honq Kong/1073/99 (H9N2)em Furões

Furões, sorologicamente negativos por inibição de hemaglutina-ção para vírus da gripe, foram usados para avaliar o anticorpo e titulação deHl após uma inoculação com VLPs de H9N2. Os furões foram misturados nodia 0, e dia 21 com o soro ensaiado para anticorpos anti-HI pelo ensaio deinibição de hemaglutinação (HI) usando RBCs de peru, e para anticorposantigripe por ELISA. Os resultados são ilustrados na Figura 22. Estes resul-tados mostram titulação de Hl correspondente a níveis de anticorpo proteto-res em doses de VLP de 1,5 e 15 pg.

Exemplo 22

Vacinação de VLPs de H3N2 em Furões

Furões foram vacinados no dia O, e dado um reforço no dia 21com cepas diferentes de VLPs de H3N2 em dosagens diferentes (dosagensde HA de 0,12, 0,6, 3,0, 15,0 pg). O controle positivo foi rH3HA em 15 pg ePSB sozinho é o controle negativo. Soros, conforme descrito acima, foramtomados a partir dos furões no dia 0 antes da vacinação, dia 21 (antes doreforço) e dia 42. Um ensaio de Hl foi conduzido nas amostras de soro paradeterminar se existe uma resposta imune contra as VLPs. Estes dados sãoilustrados na Figura 23. Estes dados indicam que VLPs de H3N2, quandointroduzidas nos furões, induzem uma resposta imune. Desse modo, asVLPs de H3N2 são imunogênicas em furões.

Exemplo 23

RT-PCR e clonagem de genes de HA, NA e M1 de vírus de gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1)

Vírus da gripe de clade 2, RNA viral de cepa A/lndonésia/5/05(H5N1) foi extraído usando-se Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) sob con-dições contendo BLS-3. Transcrição reversa (RT) e PCR foram realizadasno RNA viral extraído usando-se o sistema de RT-PCR de Uma Etapa (Invi-trogen) com prímeres de oligonucleotídeo específico de gene. Os seguintespares de prímeres foram usados para a síntese de genes de hemaglutinina(HA) de H5N1, neüraminidase (NA), e matriz (M1), respectivamente.

5'-AACGGTCCGATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC-3' (SEQ ID. 4), e5'-AAAGCTTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACG-3' (SEQ ID. 5) (HA);5'-AACGGTCCGATGAATCCAAATCAGAAGATAAT-3' (SEQ ID. 6), e5'-AAAGCTTCTACTTGTCAATGGTGAATGGCAAC-3' (SEQ ID. 7) (NA); e5'-AACGGTCCGAATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3' (SEQ ID. 8); e5'-AAAGCTTTCACTTGAATCGCTGCATCTGCAC-3' (SEQ ID. 9 (M1) (oscódons ATG são sublinhados).

Seguindo RT-PCR, fragmentos de cDNA contendo genes de gri-pe HA, NA e M1 com pesos moleculares de 1,7, 1,4 e 0,7 kB, respectiva-mente, foram clonados no vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen). As seqüênciasde nucleotídeo dos genes de HA, NA e M1 foram determinadas por seqüen-ciamento de DNA. Uma estratégia similar foi seguida para clonagem de umvírus de gripe de H5N1 de clade 1 de Vietnam/1203/2003.Exemplo 24

Geração de baculovírus recombinantes compreendendo H5N1.O gene HA foi clonado como um fragmento de DNA Rsrll-Hindlll(1,7 kb) a jusante do promotor polihedrina a ,AcMNPV dentro de vetor detransferência de bacmid pFastBac (Invitrogen) digerido com Rsrll e Hindlll.Similarmente, os genes NA e M1 foram clonados como fragmentos de DNAde EcoR\-Hindlll (1,4 e 0,8 kb, respectivamente) em DNA de plasmídeo deEcoRI-Hindlll-digerido pFastBac. Os três plasmídeos de transferência debaculovírus resultante pHA, pNA e pM1 contendo genes de HA, NA e M1 devírus da gripe A/lndonésia/5/05 (H2N1), respectivamente, foram usados paragerar bacmids recombinantes.

Os bacmids foram produzidos por recombinação homologa delocal específico seguindo transformação de plasmídeos de transferência debacmid contendo genes da gripe em células competentes de E. coli DHIOBac,que contém o genoma de baculovírus >4cMNPV (Invitrogen). O DNA de bac-mid recombinante foi transfectado nas células de inseto Sf9.

Seqüências de nucleotídeo dos genes HA, NA e M1 de Indoné-sia/5/05.HA {SEQ ID. 10)

atgg agaaaat agt gct tç ttcttgc aat agtc agtctt gt taaaagtgatcagatt tgcattggttaccatgcaaacaattcaacagagcaggttgacacaatcatggaaaagaacgttact g tt ac ac atg cc ca ag ac at actg gaaaagacacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttaagagattgtagtgtagctggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtaccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccaaccaatg acctctg tt ac ccag g gagtttcaacg act atg aagaact gaaacacctattgagcagaataaaccat tttgagaaaat t caaatcatccccaaaagt tct tggt ccgatcatgaagcctcatcaggagtgagctcagcatgtccatacctgggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtggggaattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatatcaaaacccaaccacctatatttccattgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaacctaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcaacagggctcagaaatagccctcaaagagagagcagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcaatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatggaagacgggtttctagatgtctggacttataatgccgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctagactttcatgactcaaatgttaagaacctctacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtataagaaacggaacgtacaactatccgcagtattcagaagaagcaagattaaaaagagaggaaataagtggggtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatgatggctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaa

NA(SEQ ID. 11)

atgaatccaaatcagaagataataaccattggatcaatctgtatggtaattggaatagttagcttaatgttacaaattgggaacatgatctcaatatgggtcagtcattcaattcagacagggaatcaacaccaagctgaatcaatcagcaatactaaccctcttactgagaaagctgtggcttcagtaacattagcgggcaattcatctctttgccccattagaggatgggctgtacacagtaaggacaacaatataaggatcggttccaagggggatgtgtttgttattagagagccgttcatctcatgctcccacctggaatgcagaactttcttcttgactcagggagccttgctgaatgaca agc act ccaacggg actgt caaagac ag aag ccctcacag aac att aatg agttgtcctgtgggtgaggctccctctccatataactcaaggtttgagtctgttgcttggtcagcaagtgcttgccatgatggcaccagttggttgacaattggaatttctggcccagacaatgaggctgtggctgtattgaaatacaatggcataataacagacactatcaagagttggaggaacaacatactgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtaaatggctcttgctttactgtaatgactgatggaccaagtgatgggcaggcatcatataagatcttcaaaatggaaaaaggaaaagtggtcaaatcagtcgaattggatgctcctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctgatgccggcgaaatcacatgtgtttgcagggataattggcatggctcaaataggccatgggtatctttcaatcaaaatttggagtatcaaataggatatatatgcagtggagttttcggagacaatccacgccccaatgatggaacaggtagttgtggcccgatgtcccctaacggggcatatggggtaaaagggttttcatttaaatacggcaatggtgtttggatcgggagaaccaaaagcactaattccaggagcggctttgaaatgatttgggatccaaatgggtggactggaacggacagtagcttttcagtgaaacaagatatagtagcaataactgattggtcaggatatagcgggagttttgtccagcatccagaactgacaggattagattgcataagaccttgtttctgggttgagttaatcagagggcggcccaaagagagcacaatttggactagtgggagcagcatatctttttgtggtgtaaatagtgacactgtgagttggtcttggccagacggtgctgagttgccattcaccattgacaagtag

m1 (seq id. 12)

atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcatcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagaaacttgaagatgtctttgcaggaaagaacaccgatctcgaggctctcatggagtggctgaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaagggattttgggatttgtattcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatggaaatggagatccaaataatatggatagggcagttaagctatataagaagctgaaaagagaaataacattccatggggctaaagaggtttcactcagctactcaaccggtgcacttgccagttgcatgggtctcatatacaacaggatgggaacggtgactacggaagtggcttttggcctagtgtgtgccacttgtgagcagattgcagattcacagcatcggtctcacaggcagatggcaactatcaccaacccactaatcaggcatgaaaacagaatggtgct ggccagcactac agc taagg ctatg gagcagatggcgggat caagtg agcaggc agcggaagccatggaggtcgctaatcaggctaggcagatggtgcaggcaatgaggacaattggaactcatcctaactctagtgctggtctgagagataatcttcttgaaaatttgcaggcctaccagaaacgaatgggagtgcagatgcagcgattcaagtga

Uma vez clonado o gene HA1 pHA5, contém duas mudançasmoleculares, nt nº 1172 e nt nº 1508 (em massa), conforme comparado àseqüência de gene HA de tipo selvagem. Uma estratégia similar foi seguidapara constructo e criação de vírus de gripe H5N1 de clade 1 de VLPs de Vi-etnam/1203/2003 (vide abaixo). Os alinhamentos de nucleotídeos pHA5 eseqüência de aminoácidos se seguem.

Wt 1 ...................ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAG 31 seq id 10

pHA5 51 ATTCGCCCTTAACGGTCCGATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAG 100 seq id 56

32 TCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAAT 81

101 TCAGTCTTGTTAAAAGTGSTCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAAT 150

82 TCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACA 131

151 TCAACAGAGCAGGTTGACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACA 200

132 TGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCrGCGATCTAG 181

201 TGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAG 250182 ATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTC 231

IiniiitMii Iiim Ii ι muimimin ι iitiiiiniii

251 ATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTC 300

232 CTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTA 281u 11 nu η η η η ι η ι η η ηηι 11 μ η 11 η η ι η μ η u

301 CTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTC&TCAATGTACCGGAATGGTCTTA 350

282 CATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTT 331nu η ι ηιη ι μ 11 η η η ι η ι mm η 1111 η η 111 η η 11

351 CATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTT 400

332 TCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTT 381μ ι ηιη η η η ι m ι ηηι μ ι IM μ Min μ η 1111 μ 111

401 TCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTT 450

382 GAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTC 431M M 11 M 11 M I 111 Il I 11111 M Il I I M I Il 11 Il I M 11 I M 1 1 I

451 GAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTC 500

432 ATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTA 481

M 11111111 I I Il I I Il 11 I IlI1 I 111 IlIl 11 11 I 111 I 11 I U Il I501 ATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTA 550

482 GAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAG 531

IMlMlllinriniMlllliMllllMllllMlliniIIIlM

551 GAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAG 600

532 AAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAAT 581I 11 I I 111 M I Il 111 I I 11 I M I I Il 1111 Il I M I Il 1 I Il I Il M M

601 AAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAAT 650

582 TCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAA 631II Il M η 11 11I1 111iI I I I I I I I Il Il1 Il I I I Il Il U 11 I I) Il I

651 TCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAA 700

632 CCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCA 661I I Il Il 11 I 11 U I Il 11 I I I 11 I 11 I 11 I I-U 1111 I I 11 I M I 111 Il

701 CCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCA 750

682 AAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTT 731III I I 11111 I 11 I I11 I 11 I 111 I Il Il I I 111 11 1 I Il M I I 11 I 11 I

751 AAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTT 800

732 CTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATG 781IlIlIlIlMIlIl I IlIlM 1111 I Il Il Il I M If Il 11 I Il 11 Il 11

801 CTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATG 850

782 GAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGAC 831II 1111 I 11 I 11 IlIlU I I I I11 11111U11 11 Il Il 1 Il Il 11 M 11

851 GAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGAC 900

832 TCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTG 881I η I 11 Ul Il U I Ill U η U Il 11 M U IU Il U M M M 1 Il I Il

901 TCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTG 950

882 TCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATAC 931ι η ι η Ii η η ι η η η μ 11 η u η 11U η η ι η η η η μ μ

951 TCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCCACAACATAC 1000932 ACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTA 981I I I!I I I I I I )I I I I I I I I I M I I I I I I I ] I M I I I M Il I I I Il I I I M

1001 ACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTA 1050

982 GTCCTTGCAACAGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGCAGAAGAAA 1031

I 11 11 I 111 η I 11 111 111 I!t ί1 I 1 I 11 I 111 11 I I I Il 11111 (I 11

1051 GTCCT TGCAAC AG GGCT CA G AAAT AG CCCT C AAAG AG AG AGCAG A AG AAA 1100

1032 AAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGC 1081111 1111111 11 111 I I 111 I 111 111 11111 I Il 11 1111 Π 1111 I 11

1101 AAAGAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGC 1150

1082 AGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGG 1131!Il 11 11)111! 11 I I I Ill Ill 1 11 I 111 Ill I Ill I 11 Ill IIM I M

1151 AGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGG 1200

1132 AGTGGGTACGCTGCAGACAAÀGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGT 1181

1 η 11 I]11 I 11 11)I 111 I 11 11 11 I 1111 I I 111 I I I M 11111 111

1201 AGTGGGTACGCTGÇAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATGGATGGAGT 12501182 CACCAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGG 1231

11111 Il I 11 11 1111 I Il I 1111 111 11 111 I 111 I 111111 Il 11 111

1251 CACCAATAAGGTCAACTCAATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGG 1300

1232 CCGTTGGAAGGGAATTTAArAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAAC 1281

I 11 Il111 I I I I I 11 I I M I Il1111 I I I 11 I I 11 I I 111 11 Il 11 11111301 CCGTTGGAAGGGAATTTAATAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAAC 1350

1282 AAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATG TCTGGACTTATAATGCCGAACT 1331

11111 η 11 I I 1111 I 11 111 I I111 1111 1 I I 111 I 11111111111 11

1351 AAGAAGATGGAAGACGGGTTTCTAGATGTCTGGACTTATAATGCCGAACT 14001332 TCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATG 1381

II 11111 11111111 11 η I I I 11 I I I I I I I I I 11 I 1111 1111111111

1401 TCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATG 1450

1382 TTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAG 1431

1111111 111I Π 11 I 11 111 11 I I 1 I I 111l I 111 I Il I 111111 11111451 TTAAGAACCTCTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAG 1500

1432 GAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATG 1481

I 11111111 111111 I 11 11111 I 11 I I 111 I I 111 I 111 11 1111 I I I I

1501 GAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATG 1550

14 82 TATGGAAAGTATAAGAAACGGAACGTACAACTATCCGCAGTATTCAGAAG 1531

IiiiiiiiiiiiiIMIiitinin η η 1111 η 11 η ι ιι 111111

1551 TATGGAAAGTATAAGAAACGGAACGTGCAACTATCCGCAGTATTCAGAAG 1600

1532 AAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGGGTAAAATTGGAATCAATA 1581111IlIll11 I Il111 111 Il111 Il 1 M 11 M 1111 I Il 11 Il 1 Il I Il

160.1 AAGCAAGATTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGGGTAAAATTGGAATCAATA 1650

1582 GGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGC 1631

II IiIIiii ι ιι κι ιι η 11 η mm ιι η ι Iiit Iiniiiii Iii

1651 GGAACTTACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGC 1700

1632 ACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGAT 1681

11 I 111Il111IlIl11 M1111 Il I M 11 I 11 I 11 I I 111 Il I 111III1701 ACTGGCAATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGCTCCAATGGAT 1750pHA5 1 MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50 seq id 57M Il I M Il Il M I IM I i M I I I M I I ί M Il I Il Il M ! I I I ! Il Il I

wt 1 MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILE 50 seq id 58

51 KTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100

IlllinilllllllMlltlllllllllllllllllNlllIIIIIIM

51 KTHNGKLCDLDGVKP13LRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKAN 100101 PTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSA 150

I 11 11 Il 11 Il I 1 1 Ill I I Il I I I I M I I I Ml I I I Il I I I I Il I Il Ill

101 PTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSA 150

151 CPYLGSPSFFRNWTSLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200IlIl I Il 111111 11Il 1 I I 11 I I I Il I Il I 111 11 Il 111 11 M I 11 Il

151 CPYLGSPSFFRNWWLIKKNSTYPTIKKSYNWTNQEDLLVLWGIHHPNDA 200

201 AEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQR1VPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250

IlMllMlMllllMMlllllllliMlllMlMllllIIIMIII201 AEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILK 250

251 PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300

II I I IlIl I Il 11111 111 I I IlI1Il I I Il I M 111 I 11111 Il 11 Il I

251 PNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIWKSELEYGNCNTKCQTPMGA 300

301 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFG 350

11 I I 11 I11 I I Il 1111 Il I 1 I I I Il 1111 I I Il 11 11 11 M 1 11111 I I

301 INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRESRRKKRGLFG 350351 AIAG FIE G G WQGMV DGWY GY HH SNEQGSGYAADKESTQKAMDGVTNKVNS 400

Il I I I I I Il Il Il I I I I I I11 I I MI1I111 I IlIl1 I I M Il Il 11 1 I351 AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS 400

401 IIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN 450

Il I I IlIllMIl 111 11 I 111 I Il11 M1M I 1111 11 I Il I Il Ill Il

401 11DKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMEN 450451 ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRN 500

I Il111 I I I 111 I I I Il I IlI11 I I I I Il I 1 I 1 Il M I I Il I I I 11 I Il I

451 ERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESIRN 500

501 GTCNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMA 550

II 111 1111111111 I Il 111 M 1111 11 M 11 I Il Il 111 Il I 111 11

501 GTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMMA 550

551 GLSLWMCSNGSLQCRICI. 568

I I Il I I I M I I I I I I I Il551 GLSLWMCSNGSLQCRICI* 569

Exemplo 26

Geração de genes de HA1 NA e M1 de gripe A/lndonésia/5/05otimizados para expressão eficiente em células Sf9

Os seguintes polipeptídeos foram derivados de nucleotídeos o-timizados de códon correspondente ao gene HA de lndonésia/5/05 (vide e-xemplo 31). Os nucleotídeos otimizados de códon foram designados e pro-duzidos (Geneart GMBH, Regensburg1 FRG), de acordo com os métodosrevelados na publicação de patente US 2005/0118191, aqui incorporada porreferência em sua totalidade para todas as propostas. Vide Exemplo 31 paraseqüências de ácido nucléico.(seqüência aa não-modificada)(Quitinase do sinal de peptídeo modificado, sublinhado)(sinal de peptídeo modificado de H9, sublinhada)vac2-hac-opt (seqüência aa não-modificada) (seq id 27)

MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILEKTHNGKLCDL DGVKPLIlrd CSVAGWLLGN .PMCDEFINVP EWSYIVEKANPTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEASSGVSSACPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDAAEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TBSKVNGQSG RMEFFWTILKPNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGAINSSMPFHNI HfLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLENSPQRE SRRKKRGLFGAIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNSIIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSN VKNLYDKVRI, QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRNGTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMAGLSLWMCSNG SLQCRICl*

Vac2-hac-spc-opt

(Quitinase do sinal de peptídeo modificado, sublinhado) (seq id 28}Mplykllnvlwlvavsnaip dqicigyhannste qvdtimeknv tvthaqdilekthngklcdl dgvkplilrd csvagwllgn ewcdfifinvp ewsyivekanptndlcypgs fndyeelkhl lsrinhfeki qiipksswsd heassgvssacpylgspsff rnvvwlikkn styptikksy nntnqedllv lhgihhpndaaeqtrlyqnp ttyisigtst lnqrlvpkia trskvngqsg rmeffwtilkpndainfesn gnfiapeyay kivkkgdsai mkseleygnc ntkcqtpmgainssmpfhni hpltigecpk yvksnrlvla tglrnspqre srrkkrglfgaiagfieggw qgmvdgwygy hhsneqgsgy aadkestqka idg vtnkvnsiidkmntqfe avgrefnnle rrienlnkkm edgfldvwty naellvlmenertldfhdsn vknlydkvrl qlrdnakelg ngcfefyhkc dnecmesirngtynypqyse earlkreeis gvklesigty qilsiystva sslalaimmaglslwmcsng slqcricl*

vac2-hac-sph9-opt (sinal de peptídeo modificado de H9, sublinhada)(seq id 29)

metislitil lvvtasna dqicigyhannste qvdtimeknv tvthaqdilekthngklcdl dgvkplilrd csvagwllgn pmcdefinvp ewsyivekanptndlcypgs fndyeelkhl lsrinhfeki qiipksswsd heassgvssacpylgspsff rnvvwlikkn styptikksy nntnqedllv lwgihhfndftaeqtrlyqhp ttyisigtst lnqrlvpkia trskvngqsg rmeffwtilkpndainfesn gnfiapeyay kivkkgdsai mkseleygnc ntkcqtpmgainssmpfhni hpltigecpk yvksnrlvla tglrnspqre srrkkrglfgaiagfieggw qgmvdgwygy hhsneqgsgy aadkestqka idgvtnkvnsiidkmntqfe avgrefnnle rrienlnkkm edgfldvwty naellvlmenertldfhdsn vknlydkvrl qlrdnakelg ngcfefyhkc dnecmesirngtynypqyse ear1kreeis gvklesigty qilsiystva sslalaxmmaglslwmcsng slqcricl*

vac2-hac-cs-opt (-sítio de clivagem é modificado) <seq id 30)mekivlllai vslvksdqic igyhannste qvdtimeknv tvthaqdilekthngklcdl dgvkplilrd csvagwllgn pmcdefinvp ewsyivekanptndlcypgs fndyeelkhl lsrinhfeki qiipksswsd heassgvssacpylgspsff rnwmlikkn styptikksy nntnqedllv lwgihflpndaaeqtrlyqnp ttyisigtst lnqrlvpkia trskvngqsg rmeffwtilkpndainfesn gnfiapeyay kivkkgdsai mkseleygnc ntkcqtpmgftinssmpfhni hpltigecpk yvksnrlvla tglrnspqre s——!rglfgaiagfieggw qgmvdgwygy hhsneqgsgy aadkestqka idgvtnkvnsiidkmntqfe avgrefnnle rrienlnkkm edgfldvmty naellvlmenertldfhdsn vknlydkvrl qlrdnakelg ngcfefyhkc dnecmesirngtynypqyse earlkreeis gvklesigty qilsiystva sslalaimmaglslwmcsng slqcrici*

Os seguintes polipeptídeos correspondem a genes de HA e M1otimizados de códon não-modificados foram também sintetizados.

Vac2-naj-opt (neurarainldase) (SEQ ID 31)MNPNQKIITI GSICMVIGIV SLMLQIGNMI SIWVSHSIQT GNQHQAESISNTNPLTEKAV ASVTLAGNSS LCPIRGWAVH SKDNNIRIGS KGDVFVIREPFISCSHLECR TFFLTQGALL NDKHSNGTVK DRSPHRTLMS CPVGEAPSPYNSRFESVAflS ASACHDGTSW LTIGISGPDN EAVAVLKYNG IITDTIKSWRNNILRTQESE CACVNGSCFT VMTDGPSDGQ ASYKIFKMEK GKVVKSVELDAPNYHYEECS CYPDAGEITC VCRDNWHGSN RPWVSFNQNL EYQIGYICSGVFGDNPRPND GTGSCGPMSP NGAYGVKGFS FKYGNGVWIG RTKSTNSRSGFEMIWDPNGW TGTDSSFSVK QDIVAITDWS GYSGBFVQHP ELTGLDCIRPCFWVELIRGR PKESTIWTSG SSISFCGVNS DTVSWSWPDG AELPFTIDK*

Vac2-mc-opt (matrix) (SEQ IO 32)

MSLLTEVETY VLSIIPSGPL KAEIAQKLED VFAGKNTDLE ALMEWLKTRPILSPLTKGIL GFVFTLTVPS ERGLQRRRFV QNALNGNGDP NNMDRAVKLYKKLKREITFH GAKEVSLSYS TGALASCMGL IYNRMGTVTT EVAFGLVCATCEQIADSQHR SHRQMATITN PLIRHENRMV LASTTAKAHE QMAGSSEQAAEAMEVANQAR QMVQAMRTIG THPNSSAGLR DNLLENLQAY QKRMGVQMQRFK*

Os genes de HA, NA e M1 otimizados de códon sintéticos foramsubclonados em plasmídeo de transferência de pFastBad usando-se locais deBamHI e Hindlll, conforme descrito acima. Os bacmids recombinantes paraexpressão em células Sf9 de genes de HA1 NA e M1 sintéticos foram geradosconforme descrito acima, usando-se E. colicepa DHIOBac (Invitrogen).

Exemplo 24

Clonaoem de Clade 1 de vírus de gripe A/Viet Nam/1203/04 (H5N1) por RT-PCR

Os genes de HA, NA e M1 foram clonados por RT-PCR de acor-do com o método descrito acima. As seqüências abaixo são comparaçõesdo gene publicado comparadas aos genes clonados.O gene HA para Clade 1 A/Viet Nam/1203/04(H5N1)

........, . ..............................ATGGAGAAAA 10

AGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGGCGCGCCATGGAGAAAA 350

11 TAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGC 60

11I11 I I1fI I I I I I I ] I I I 1 I I 1 I 11 I I 1 1 I I I I I1 I I I1 I I I I I1 I Il

351 TAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGC 400

61 ATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGA 110

IΠ 1111]1111 Il I 111 I Il 11111 U 111111 11111 Il 1111111 11

401 ATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGA 450

111 AAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACA 160

1111111I111 I I 111 I 1 It 111111 Il 1111 11 11Il I Il I I 1111 I I I

451 AAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACA 500161 ACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGAT 210

t I 11 I I I I 1 I I I I I I1 I I I I I I Il 111111 Il I 1 111 I 11 I I I I I 11 I I I501 ACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGAT 550

211 TGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCAT· 260

11U I Il I 1111 I 11 11 I 1 Itl 11 11 1111 Ill 1111 111 I II1M11 I I

551 TGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCAT 600

261 CAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATG 310

1111 11 I I 11 I 111111 I I II 11 Il I I I I 11J11111 1111 I 111 111 I I

601 CAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATG 650

311 ACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTA 360

IIIl π I 11 I1I1 I I111 I 1 111 111 1 I I 11111 11 111 111 I 111 Il It

651 ACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTA 700

361 TTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTC 410

IltllltllllllllllllllllllllllllMllllllltlllIIlIII

701 TTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTC 750

411 TTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACC 460

1111 I 111 t Il 1 I I I I I I1 1111 I I I 111 I 11 I I Il I I 111111 I 11 t 11

751 TTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACC 800

461 AGGGAAAGTCCTCCT TTT TCAGAAAT GT GGTATGGCT TATCAAAAAGAAC 510

III π 1 I 11 I I 1111 I 11 I I 11111111111111 I 1111 I 1111It 11 11

801 AGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAAC 850

301

511

AGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA 560Itl 1111 I I 1 I i 11) Ill I t 11 Itl I Ill 1 Ill I! I I I M 1 111 I Nl I I851 AGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA 900561 TCTTTTGGTACTGXGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGA 610I I I 1111 I I Il11 Ii1 I 11 I I 1 I I ] I I I I Π 1 I 11111 M1 111l I I! I I

901 TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGA 950611 CAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACA 660

111111111 η 111 η 1111111 Ii 1111111) 1111111111111 μ η

951 CAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACA 1000

661 CTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGG 710

1 I I 11 11 111 I 11 11 I I 11 U M 111 I 11 Il1 11111 111111 1111 π I

1001 CTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGG 1050

711 GCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATG 760I I I I I I I 111 11 I I1 η 1 I I I I 11 11 Il 1 I I t11 Il I 11 I I I Il I I 11 I I

1051 GCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATG 1100

761 CAAXCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATAC 810

πι η Iii μι η 1111 κι πι 11 πι i 111 Iii ι Iii ι Iii ι μι 111

1101 CAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATAC 1150

811 AAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATA 8 60IlillllllllllllllllllllllllllMlllllllnnillIIIII1151 AAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATA 1200

861 TGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTA 910

I 11111 I I Il11 11 I 11111 1 Il 1 1 1 I I 1 IJI 11 11 11 11 I I Il I 111 Il

1201 TGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTA 1250

911 GCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAA 9601111 I 11111 I I 11 11IIH 11 I I I M I Il I Π 111111 Il 1 I I 111 I 1 I

1251 GCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATXGGGGAATGCCCCAAA 1300

961 TATGTGAAAXCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCC 1010

I I I Il I I I I I I I1 I 1 ι I I I I I I I I I I 1 I I 1 I I 1 11 I11 11 I11 I I 11 I I 11301 TATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCC 1350

1011 TCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAG 1060

IiiMimiiniimiiiMimiiimmmimmiHi

1351 TCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAG 1400 ·

1061 GTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTAC 1110Il11111IM1111 Ill Ill Ill 111111 Il 11 Ill Il 1 Ill Ill Il 111

1401 GTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTAC 1450

1111 CACCAXAGCAATGAGCa^GGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCAC 1160

1451 CACCAT AGCAATG AG CAGG GG AGXGG GX ACG C TGCAG ACAAAG A AT CCAC 1500

1161 TCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACÃ 1210

Ill 111 Ill 111 Ill I I Ill 111 Hl I Ill Ill Ill I Ill IMll m 11

1501 TCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACA 15501211 AAATGAA CACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA 1260

II Il 11 Ill 1111 Ill I Ill I Ill I Ill 111 Ill I Il I M III11 I 1111

1551 AAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA 1600

1261 AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGT 131011111111111 I I Ill Ill Il 111 I Ill 11 I Il I Ml Ill Ml 11 Il 1 111601 AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGT 1650

1311 CTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTC 1360

I I I I M I I I t Il 11 I 11 11 I I 111 11 I I 11 I 11 111111 11 I 1111 I 11 I1651 CTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTC 1700

1361 TAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTA 1410

IillllllllilllllllllllllllllMtiniiniMlllllIIll

1701 TAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTA 1750

1411 CAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTA 1460I 1 I Il 1 I 11111 I 11 I I I IiI I 111 I I I I I 11 1111 Il I 1 I I Il 11 Il 11

1751 CAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTA 1800

1461 TCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATG 1510

I I I 111 111 M I I M I Il I I H11 I I 11 I I I Π Ill 11 M I I Il1 I 11 111801 TCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTÃAGAAATGGAACGTATG 1850

1511 ACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGT 1560

I I I Il 11111 I I M 11 I 111 I 11 Il Il I I 111 I Il 1 I Il I I 111 Il Il 111851 ACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGT 1900

1561 GGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTC 1610

I I I I 1 I I I I 1 I I I I I I 11 I I I 1 11 I I 11 I I M I Il I M I 1 I Il I l I Il I I1901 GGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTC 1950

1611 TACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT 1660

I I I 11 Il 11 I 11 11 M I Il 11 I 11 I 11 I I 11111 111 I I I I Π I 111 I M1951 TACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCT 2000

1661 TATGGATGTGCTCCAATGGATCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA... 17071 I M1Il I I 111 I I M 111 I Il I I I1 I Il 11 Il Il Il I Il Il I 11 I

2001 TATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAAGCG 2050

Comparação dos genes NA

O gene NA para Clade 1 A/Viet Nam/1203/04 (H5N1) (SEQ ID 39)H5N1naLANL ISDN 38704 χ NA_Viet1203_Lark(NVAX) (SEQ ID 38)

1 .....ATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATG 45

Illlllllllllllllllltlllllllllllllllllllllllll

451 CCGGGATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATCGGATCAATCTGTATG 500

46 GTAACTGGAATAGTTAGCTTAATGTTACAAATTGGGAACATGATCTCAAT 95

1 IM I Illl I M 111 M Mi I Ill I Il I 111 111111111 Ill I Ill Ill501 GTAACTGGAATAGTTAGCTTAATGTTACAAATTGGGAACATGATCTCAAT 550

96 ATGGGTCAGTCATTCAATTCACACAGGGAATCAACACCAATCTGAACCAA 145IllllllllllllllllllllillllMlllllllllllllIlIIIItM

551 ATGGGTCAGTCATTCAATTCACACAGGGAATCAACACCAATCTGAACCAA 600

146 TCAGCAATACTAATTTTCTTACTGAGAAAGCTGTGGCTTCAGTAAAATTA 195

I I 11 I 11111 I I 111111111111 I 111 I 111111111 I I I I I I 111 I 11

601 TCAGCAATACTAATTTTCTTACTGAGAAAGCTGTGGCTTCAGTAAAATTA 650

196 GCGGGCAATTCATCTCTTTGCCCCATTAACGGATGGGCTGTATACAGTAA 245651

246

701

296

751

346

801

396

851

446

901

496

951

546

1001

596

1051

646

1101

696

1151

746

1201

796

1251

846

1301

896

1351

946

100

111111111 π I 1111111111 I Il I I 111111 111 11 I 11 I I Il I I I I I

gcgggcaattcatctctttgccccattaacggatgggctgtatacagtaa

ggacaacagtataaggatcggttccaagggggatgtgtttgttataagag

I I I I I M Il I I I I I I I I !! I Il I I I! I I I I I I I I I I I I I I I I I ! 1111 I Iggacaacagtataaggatcggttccaagggggatgtgtttgttataagag

agccgttcatctcatgctcccacttggaatgcagaactttctttttgact

Ii ι Iiii mim πι Iii ι uni πιΐΝΐηηι Iii κι um ι

agccgttcatctcatgctcccacttggaatgcagaactttctttttgact

cagggagccttgctgaatgacaagcactccaatgggactgtcaaagacagMlllllin IlllllllllllllllllllllMMllillIIlMIII

cagggagcctcgctgaatgacaagçactccaatgggactgtcaaagacag

aagccctcacagaacattaatgagttgtcctgtgggtgaggctccctccc

II I Il M I Il I I M M I I I I Il Il I III III Il Il Il Il I Il 11 Il I I Ilaagccctcacagaacattaatgagttgtcctgtgggtgaggctccctccc

catataactcaaggtttgagtctgttgcttggtcagcaagtgcttgccatIl M M M M 11 I M I Il I M M M η M Il Il M M M Il M M 1 M Il

catataactcaaggtttgagtctgttggttggtcagcaagtgcttgccat

gatggcaccagttggttgacgattggaatttctggcccagacaatggggcII 11 II I I I I I Il I 11 I Il I M Il Il I M Il I I I I Il 11 11 Il 11 I Il II

gatggcaccagttggttgacgattggaatttctggcccagacaatggggc

tgtggctgtattgaaatacaatggcataataacagacactatcaagagtt11 Il 1 Il 11 M Il I M M I I I I Il 1 Il I M II 11 I I Il I I Il Il I Il Il I

t gt ggctg tatt gaaa ta caatg g cataataacagacactatcaagag t t

ggaggaacaacatactgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtaaat

M1 I 11 1 Il I I 1 I I M Il I I IlIl I Il M I M I I Il I 111 II M 11 Il 11

ggaggaacaacat^ctgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtaaat

ggctcttgctttactgtaatgactgacggaccaagtaatggtcaggcatc

I I Ill I I I I Ill Il I 11 M I Ill I Ill Ill I Il I I I I I Ill Ill Ill Illggctcttgctttactgtaatgactgacggaccaagtaatggtcaggcatc

acataagatcttcaaaatggaaaaagggaaagtggttaaatcagtcgaat

II 11 Il 111 I M 1111 M 1 I I I Il Il I Il I Il Μ I Il 1 11 M I Il 1 Il 1 I

acataagatcttcaaaatggaaaaagggaaagtggttaaatcagtcgaat

tggatgctcctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctaatgcc1 Il I Il Il Il M 11 I Il Il Il Ill I Il IlIl111 I M Il Il 1111 M M Itggatgctcctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctaatgcc

ggagaaatcacatgtgtgtgcagggataattggcatggctcaaatcggccIIMI Illll I ΜΙΙΜΙΙΙ IMIII Il Mllll IIMM Illl IIM Il

ggagaaatcacatgtgtgtgcagggataattggcatggctcaaatcggcc

atgggtatctttcaatcaaaatttggagtatcaaataggatatatatgca

I Il I 111 Il I M 11 Il 11 Il Il 111 Il 1 I IlIl1 Il Il M 11 Il 111 Il I

atgggtatctttcaatcaaaatttggagtatcaaataggatatatatgca

gtggagttttcggagacaatccacgccccaatgatggaacaggtagttgt

II I M I Il I I I Il I IllIllIlIl I I IllIl I Ill I Ill I I I Ill I I Il Igtggagttttcggagacaatccacgccccaatgatggaacaggtagttgt

ggtccggtgtcctctaacggggcatatggggtaaaagggttttcatttaa1401 GGTCCGGTGTCCTCTAACGGGGCATATGGGGTAAAAGGGTTTTCATTTAA 1450

996 ATACGGCAATGGTGTCTGGATCGGGAGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGA 1045

1451 ATAC GG C AATG G TGTCT GGATCGGG AGA ACCAAAAGC ACT AAT TCC AGGA 1500

1046 GCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGT 1095

1501 GCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGAAACGGACAGT 1550

1096 AGCTTTTCAGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATA 1145

1551 AGCTTTTCAGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATA 1600

114 6 TAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGACTAGATTGCATAA 1195

1601 TAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGACTAGATTGCATAA 1650

1196 GACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACA 1245

1651 GACCTTGTTTCTGGGTTGAGTTGATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACA 1700

124 6 ATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACAC 1295

1701 ATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTTTTGTGGTGTAAATAGTGACAC 1750

1296 TGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCCGAGTTGCCATTCACCATTGACA 1345

1751 TGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACA 1800

1346 AGTAG............................................. 1350

1801 AGTAGGGGCCCTCGAGTAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTAC 1850

Comparações dos genes M1

O gene M1 para Clade 1 A/Viet Nam/1203/04 (H5N1) (SEQ ID 40)H5N1m1Lanl ISDN 39958 χ Mi_Viet1203_Lark(NVAX) (SEQ ID 41)

1 ..................................ATGAGTCTTCTAACCG 16

301 ATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGAATTCGACGTCATGAGTCTTCTAACCG 350

17 AGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCC 66

351 AGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCC 400

67 GAGATCGCACAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCT 116

401 GAGATCGCACAGAAACTTGAAGATGTCTTTGCAGGAAAGAACACCGATCT 450

117 C GAGGCT CTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 166

451 CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 500

167 CTAAAGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA 216501 CTAAAGGGATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA 550

217 GGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAAATGGAAATGGAGA 266

111 I I I I I I 1 I I 1 11 I I M I I I I 11 111 111! I Il I 111 I 11 111111 I I551 GGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAAATGGAAATGGAGA 600

267 TCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATATAAGAAGCTGAAAAGAG 316111 I I 111 1111Il I I 11 I I I 11)111111 1111 11 I 111 111 111 11 I I

601 TCCAAATAATATGGATAGGGCAGTTAAGCTATATAAGAAGCTGAAAAGAG 650

317 AAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCAACCGGT 366

IlllltllllllMlMllMHnillliunilllllllMIIIIIl

651 AAATAACATTCCATGGGGCTAAGGAGGTCGCACTCAGCTACTCAACCGGT 700367 GCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGAC 416

IllMllllMlMlllllllllllMllllMMtMllMllIIlIIl

701 GCACTTGCCAGTTGCATGGGTCTCATATACAACAGGATGGGAACGGTGAC 750417 TACGGAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAG 466

1 I I I Il 1 Il I I Il Il Il I Il I Il I Il M I 11 IlMIl 11 I Il I Il I Il 11751 TACGGAAGTGGCTTTTGGCCTAGTGTGTGCCACTTGTGAGCAGATTGCAG 800

467 ATTCACAGCATCGGTCTCAC&GACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTA 516

I 11 11 Il I I M I I M M I Il M Il I I M 1 I I Il I Il M M I Il I Il I Il I801 ATTCACAGCATCGGTCTCACAGACAGATGGCAACTATCACCAACCCACTA 850

517 ATCAGACATGAGAACAGAATGGTGCTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTAT 566

I I Il I I M I Il I M M 11 1111 I Il I Il Il I I 111 ί Il I M Il 1 I Il 11 I851 ATCAGACATGAGAACAGAATGGTGCTGGCCAGCACTACAGCTAAGGCTAT 900

567 GGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCGGAAGCCATGGAGATCG 616

I I M I M M 1111 Il Il 11 Il M I Il 1 Π I 1 1 I I M I M I Il Il I I Il Il901 GGAGCAGATGGCGGGATCAAGTGAGCAGGCAGCGGAAGCCATGGAGATCG 950

617 CTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCAT 666

I Il I Ill 1 Il M ! I Il I M I I IIIM Il Il I Il I III Il I M I Il I 11 11

951 CTAATCAGGCTAGGCAGATGGTGCAGGCAATGAGGACAATTGGGACTCAT 1000

667 CCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGC 716

II I I I I MIl1 I Il I Il I Il111Il1Il I M1Il I I 11 I I M 11 11 I I 11

1001 CCTAACTCTAGTGCTGGTCTGAGAGATAATCTTCTTGAAAATTTGCAGGC 1050

717 CTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA11 I Il I I M I IlI11IlIlIl 11 IlIl11111 I M 1 I 11 I Il I1051 CTACCAGAAACGAATGGGAGTGCAGATGCAGCGATTCAAGTGA

Todas as seqüências foram clonadas e analisadas de acordocom os métodos descritos acima.Exemplo 25

Geração de genes otimizados de HA, NA e M1 de Clade 1 H5N1 de gripeA/Viet Nam/1203/04 para expressão eficiente em células Sf9

Os seguintes polipeptídeos foram derivados de nucleotídeos o-timizados com códon correspondentes a A/Viet Nam/1203/04. Os nucleotí-deos foram designados e sintetizados (Geneart GMBH, Regensburg, FRG),conforme revelado acima (vide Exemplo 24).

vni203-ha-ce-opt (Sítio de clivagem modificado, sublinhado) {seq id 33)MEKIVLLFATVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAODIIiEKTHNGKIXDLDGVKPLXl^DC^VAGWIil^HPMCDEFINVPEHSYlVEKMPANDICYPGDFNDYEELKHLLSRIOT1FEK2QIIPKNSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFKNVVWLIKKNNAYPTlKRSyNNTNOEDLLVLWGlHHPNnAAEOT^STLNQRLVPKIATRSKVNGQNGRMEFFWTILKPN DAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIHKS ELEYGNCNTKCOTPMGMNSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLR

WS PQRET----RGLFGAlAGFjEGGwQGMVDGWYGYHHSKECjGSGYAADKESTQKMDGVTNKVNS2IDKMW TQFEAVGREFTJNLERR1ENLN KKNEDG FLD\TOTYN AELLVXMENERTLDFHDSNVKNliYDKVRLOLRDNAKEI^NGCFEFYHKCDMECMESVRKGTYDYPOYSEEAR LKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICl*

vki203-ha-spc-opt (peptídeo de sinal modificado, sublinhado) íseq id 34)

MplvkllnvlwlvavsnaipDQiciGYic^MsTEcfVDTIMEKWVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK»NPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSHSSHEASLGVSBACPYQGKSSFFRNVVWLI KKNNAYPTIKRSYNNTNQEDIiVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTY1SVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQHGRMEFFWTILKPMDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGKCNTKCQTPMGAIWSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSHRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGL FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSN EQGSGYAADKESTQKA1DGV ΓΝ KVNSIIDKMNTQFEAVGREFWNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYHAELLVXMEN

ertldfhdsnvknlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrhgtydypqy

SEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSlySTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRI' Cl*

vNi203-ha-sph9-opt (Peptideo de sinal e sítio clivagem são sombreados)(SEQ ID 35) -

WETISLITIIi LVVTASNA DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKHVTVTHAQDILEKTHWGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPA

ndlcypgdfndyeelkhilsrinhfekiqiipknsmssheaslgvssacpyqgkssffrn wwl ikknnay ptikrsynntnqedllvlwgihk pndaaeqtrlyqnpttyisvgt

stlnqrlvpkiatrskvngqngrmeffwtilkpndainfesngnfiapeyaykivkks

DSAIMKSELEYGNCNTKCQTPHGAINSSMPFHNIHPLTIGBCPKYVRSHRLVIATGIiRN S PQRERRRKKRGLFGAIAG Fl EGGW QGMVDGWYGYHHSNEQGSG YAADKESTQKAID

gvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtyhaellvlmen

ERTLDFHDSHVKNLYDKVRLQIiRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSIÍQCRICl*

Exemplo 26

Imunoqenecidade de VLP de H5N1 Vietnam/1203/2003 (Escassez de DoseExtrema)

Camundongos BALB/c foram imunizados intramuscularmente eintranasalmente com VLPs de H5N1 em doses muito baixas (0,2, 0,04,0,008, 0,0016 pg de HA/dose). Os camundongos foram misturados nos dias0, 21 e 35. Aos camundongos foi dado um reforço no dia 21. O soro foi en-saiado para anticorpos anti-HA pelo ensaio de inibição de hemaglutinação(HI) usando-se RBCs de peru e vírus da gripe usando-se um ELISA. Os re-sultados deste estudo são mostrados nas Figuras 24 e 25.Os resultados indicam que uma resposta imune total robusta foiobservada quando as VLPs foram administradas em doses muito baixas. Arobustez da resposta foi similar ao controle em 3,0 e 0,6 pg de HA/dose. Osdados mostram uma resposta de dose verdadeira, e a resposta de anticorpopara 0,2 pg de VLP é maior do que 3,0 pg de proteína rHA. Embora a res-posta não seja tão robusta para a administração intranasal, uma dose deVLPs em 0,2 pg de HA/dose incluiu uma resposta robusta. A titulação ELISAcom a dose de 0,2 pg neste experimento é similar a dose de 0,12 pg da va-cina de VLP H3N2 nos experimentos anteriores, vide acima.

Exemplo 27

Estudos de provocação

Após inoculação dos camundongos BALB/c com VLPs em con-centrações de 3 pg, 0,6 pg, 0,12 pg e 0,02 pg de VLPs de H3N2 intramuscu-Iarmente e intranasalmente (dose de HA total), os camundongos foram pro-vocados com vírus de gripe A/Aichi/268x31. Os resultados deste estudo sãomostrados na Figuras 27 e 28. Os dados mostram que existe uma diminui-ção no peso em todos os animais vacinados; contudo, os animais que foramvacinados com 3,0 pg e 0,12 pg de VLPs se recuperaram mais rapidamentedo que outros animais em ambas vacinações intramuscular e intranasal. Asdoses intranasais proporcionaram proteção aumentada.

Exemplo 29

Estudos de provocação (furões)

Neste estudo, furões foram vacinados com VLPs de H9N2. Exis-te um total de 18 furões no estudo de provocação: 6 vacinados falsos, 6 va-cinados com dose média (1,5 pg), e 6 vacinados com dose alta (15,0 pg)intramuscularmente. Em seguida, os furões foram provocados com 106 EID50de A/HK/1073/99 intranasalmente. Lavagens nasais foram coletadas nosdias 1, 3, 5 e 7. O vírus nas lavagens nasais foi titulado nos dias 3, 5 e 7 pa-ra todos os animais. Estes dados são representados na Tabela 2 e na Figura9. Estes dados mostram que pelo dia 7, todos os animais vacinados não ti-nham vírus detectáveis nas lavagens nasais, enquanto o grupo falso tinhatitulações virais detectáveis.TABELA 2. Titulações de Vírus Tipo Selvagem (log 10/ml) em Furões apósprovocação viral

Grupo: Controle Falso de Placebo (n=6)

<table>table see original document page 106</column></row><table> Grupo: Dose Baixa <table>table see original document page 106</column></row><table>Grupo: Dose Alta

<table>table see original document page 107</column></row><table>

Exemplo 30

Estudos de Inoculação Intramusculare Intranasal de Camundongos

Camundongos foram inoculados com VLPs de A/Fujian/411/2002(H2N3) em concentrações de 3 pg, 0,6 pg, 0,12 pg ou 0,024 pg (dose de HAtotal) intramuscularmente ou intranasalmente no dia 0, e foram impulsiona-dos 3 semanas mais tarde. Os camundongos de controle foram inoculadoscom formalina inativada A/Wyoming (Fujian-Like, cepa de vacina) ou PBS.Os soros foram coletados dos camundongos inoculados nas semanas 0, 3, 5e 8. Os soros coletados foram ensaiados para anticorpos anti-HA pelo en-saio de inibição de hemaglutinação (HI) para anticorpos antigripe por ELISA.O ensaio foi conduzido usando-se cepa de vírus da gripe A/Fujian/411/2002,A/Panama/2007/99, A/Wyoming/3/03 e A/New York/55/2004 de H3N2. Osresultados deste estudo são mostrados nas Figuras 30 A-H. Estes dadosindicam que VLPs de H3N2 induzem anticorpos contra as cepas de origemA/Fujian/411/2002 de vírus da gripe, e contra outras cepas de H3N2. Estesdados também indicam que as titulações nos camundongos inoculados in-tranasalmente ocorrem mais tarde do que camundongos inoculados intra-muscularmente. Contudo, as titulações intranasais são mais altas do quetitulações intramusculares após cerca de 8 semanas. Em adição, as titula-ções ao antígeno de vírus inativado parece ser comparável às VLPs em do-ses equivalentes, seguindo inoculação intramuscular. Contudo, o antígenoinativado não parece ser como imunogênico, seguindo inoculação intranasal,nem é como amplamente protetor, seguindo inoculação intranasal.

Exemplo 31

Geração de genes otimizados de HA. NA e M1 de gripe de Clade 2 H5N1para expressão eficiente em células Sf9

Os seguintes nucleotídeos otimizados e polipeptídeos corres-pondem a HA, NA e M1 de vírus de Clade 2 H5N1, A A/lndonésia/5/05,A/Bar head goose/Qinghai/1 A/2005 e A/Anhui/2005, foram designados e sin-tetizados (Geneart GMBH, Regensburg, FRG) conforme descrito acima. Osnucleotídeos otimizados e polipeptídeos estão listados abaixo. De modo aproduzir VLPs, HA de A/Anhui pode ser expresso com NA e M1 deA/Indonésia. Para VLPs compreendendo HA e NA de A/Quinghai, gene deA/Indonésia pode ser co-expresso com HA e NA de A/Quinghai.

ggt accg g a t cc gc cac catggagaagatcgtgct gctg ctggct atcgt gtccctggtgaagtccgaccagatctgcatcggttaccacgctaacaactccaccgagcaggtggacaccatcatggagaagaacgtcaccgtgacccacgctcaggacatcctcgaaaagacccacaacggc aagctg tgc gacct ggac ggtgt caa g ccc ctg at c ctgcgt gact gct ccgtg gctggttggctgctgggtaaccccatgtgcgacgagttcatcaacgtgcccgagtggtcctacatcgtggagaaggctaaccccaccaacgacctgtgctaccccggttccttcaacgactacgaggagctgaagcacctgctgtcccgtatcaaccacttcgagaagatccagatcatccccaagtcctcttggtccgaccacgaggcttcctccggtgtctcctccgcttgcccctacctgggttccccctccttcttccgtaacgtggtgtggctgatcaagaagaactccacctaccccaccatcaagaagtcctacaacaacaccaaccaggaggacctgctggtcctgtggggtatccaccaccccaacgacgctgccgagcagacccgtctgtaccagaaccccaccacctacatctccatcggcacctccaccctgaaccagcgtctggtgcccaagatcgctacccgttccaaggtgaacggccagtccggtcgtatggagttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgctat ca act tcgagtccaacggc aact tcatcgctcccgagt acgct tac aag at cgtg aagaagggcgactccgctatcatgaagtccgagctggagtacggtaactgcaacaccaagtgccagacccccatgggtgctatcaactcctccatgcccttccacaacatccaccccctgaccatcggcgagtgccccaagtacgtgaagtccaaccgtctggtgctggctaccggtctgcgt

aactccccccagcgcgagtcccgtcgtaagaagcgtggtctgttcggcgctatcgctggtttcatcgagggcggttggcagggcatggtggacggatggtacggttaccaccactctaacgagcagggttccggttacgctgctgacaaggagtccacccagaaggctatcgacggcgtcaccaacaaggtgaactccatcatcgacaagatgaacacccagticgaggctgtgggtcgtgagttcaacaacctcgagcgtcgtatcgagaãcctgaacaagaagatggaggacggtttc

ctggacgtgtggacctacaacgccgagctgctggtgctgatggagaacgagcgtaccctg

gacttccacgactccaacgtgaagaacctgtacgacaaggtccgcctgcagctgcgtgacaacgctaaggagctgggtaacggttgcttcgagtrctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggagtccatccgtaacggcacctacaactacccccagtactccgaggaggctcgtctgaagcgtgaggagatctccggcgtgaagctcgagtccatcggaacctaccagatcct6tccatctactccaccgtggcttcctccctggctctggctatcatgatggctgctctgtccctgtggatgtgctccaacggttccctgcagtgccgtatctgcatctaatgaaa6ctt.6agctca/indonésia Seaüência de Proteína HA {seq id 43)

MEKIVltLliAl VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILEKTHNGKI-CDL DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PWCDEFINVP EWSiTIVEKANPTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSD REASSGVSSACPYLG5PSFF RNWWLIKKN STYPTIKKSY NNTWQEDLLV LWGIHHPNDAAEQTRLYQNP TTirISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTILKPNDAIHFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGAINSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE SRRKKRGLFGAIAGF3EGGW QGMVDGWYGY HflSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNSIIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRNGTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALATMMAGLSLtfMCSNG SLQCRICI

a/indonesia otimizada HA (sítio de clivagem apagada)

ggatccgccaccatggagaagatcgtgctgctgctggctarcgxgtccctggtgaagtcc

gaccagatctgcatcggttaccacgctaacaactccaccgagcaggtggacaccatçwtg

gagaagaacgtcaccgtgacccacgctcaggacatcctcgaaaagacccacaacggcaagctgtgcgacctggacc3gtgtcaagcccctgatcctgcgtgactgctccgtggctggttggctgctgggtaaccccatgtgcgacgagttcatcaacgtgcccgagtggtcctacatcgtggagaaggctaaccccaccaacgacctgtgctaccccggttccttcaacgactacgaggagctgaagcacctgctgrcccgtatcaaccacttcgagaagatccrgatcatccccaagtcc

tcttggtccgaccacgaggcttcctccggtgtctcctccgcttgcccctacctgggttccccctccttcttccgtaacgtggtgtggctgatcaagaagaactccacctaccccaccatcaagaagtccxacaacaacaccaaccaggaggacctgctggtcctgtggggtatccaccaccccaacgacgctgccgagcagacccgtctgtaccagaaccccaccacctacatctccatcggcacctccaccctgaaccagcgtctggtgcccaagatcgctacccgttccaaggtgaacggccagtccggtcgtatggagttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgctatcaacttcgagtccaacggcaacttcatcgctcccgagtacgcttacaagatcgtgaagaagggcgactccgctatcatgaagtccgagctggagtacggtaactgcaacaccaagtgccagacccccatgggtgctatcaactcctccatgcccttccacaacatccaccccctgaccatcggcgagtgccccaagtacgtgaagtccaaccgtctggtgctggctaccggtctgcgtaactccccccagcgcgagtcccgtggtctgttcggcgctatcgctggtttcatcgagggcggttggcagggcatggtggacggatggtacggttaccaccactctaacgagcagggttccggttacgctgctgacaaggagtccacccagaaggctatcgacggcgtcaccaacaaggtgaactccatcatcgacaagatgaacacccagttcgaggctgtgggtcgtgagttcaacaacctcgagcgtcgtatcgagaacctgaacaagaagatggaggacggtttcctggacgtgtggacctac

AACGCCGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAACGAGCGTAeCCTGGACTrCCACGACTCCAACgtgaagaacctgtacgacraggtccgcctgcagctgcgtgacaacgctaaggagctgggt

aacggttgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggagtccatccgtaacggcacctacaactacccccagtactccgaggaggctcgtctgaagcgtgaggagatctccggcgtgaagctcgagtccatcggaacctaccagatcctgtccatctactccaccgtggcttcctccctggctctggctatcatgatggctggtctgtccctgtggatgtgctccaacggttccctgcagtgccgt&tctgcatctaatgaaagctt

a/indonésia Seqüência de Proteína HA (seq id 45)

MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILEKTHNGKLCDL DGVKPLILRO CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKANPTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRIHHFEKI QIIPKSSKSD HEASSGVSSACPYLGSPSFF RNVVWLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LWGIflHPKDAAEQTRLYQNP TTYISIGTSX LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFWTIIJtPNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGAINSSMPFHUI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRE SRGLFGAIAGFIEGGWQGMV DGWYGYHHSN EQGSGYAADK ESTQKAIDGV TNKVNSIIDKMNTQFEAVGR EFNNLERRIE NLNKKMEDGF LDVWTYNAEL LVLMENERTLDFHDSNVKNL YDKVRLQLRD NAKELGNGCF EFYHKCDNEC MESIRNGTYNYPQYSEEARL KREEISGVKL ESIGTYQILS IYSTVASSLA LAIMMAGLSLMMCSNGSLQC RICI

a/indonesia otimizada NA (códons de partida e chegada são sublinhados)

(seq ID 4 6)

GGTACCiSGATÇCGCCACCATGAACCCCAACCAGAAGATCATCACCATCGGCTCCATCTGCATGGTGATCGGTATCGTGTCCCTGATGCTGCAGATCGGTAACATGATC1CCATCTGGGTG

tcccactccatccagaccggtaaccagcaccaggctgagtccatctccaacaccaacccc

CTGACCGAGAAGGCTGTGGCTICCGTGACCCTGGCTGGTAACTCCTCCCTGTGCCCCATCCGTGGTTGGGCTGTGCACTCCAAGGACAACAACATCCGCATCGGTTCCAAGGGTGACGTGTTCGTGATCCGTGAGCCCTTCATCTCCTGCTCCCACCTCGAGTGCCGXACCyTCTTCCTGACCCAAGGTGCTCTGCTGAACGACAAGCACTCCAACGGCACCGTGAAGGACCGTTCCCCÇCACCGTACCCTGATGTCCTGCCCCGTGGGCGAGGCTCCCTCCCCCTACAACTCCCGTTTCGAGTCCGTGGCTTGGTCCGCTTCCGCTTGCCACGACGGCACCTCTTGGCTGACC&TCGGTATCTCCGGTCCCGACAACGAGGCTGTCGCTGTGCTGAAGTACAACGGCATCATCACCGACACCATCAAGTCCTGGCGTAACAACATCCTGCGTACCCAGGAGTCCGAGTGCGCTTGCGTG

aacggttcctgcttcaccgtgatgaccgacggtccctccgacggccaggcttcctacaagatcttcaagatggagaagggcaaggtggtgaagtccgtggagctggacgctcccaacxac

cactacgaggagtgctcttgctaccccgacgctggcgagatcacctgcgtgtgccgtgac

AACTGGCACGGTTCCAACCGTCCCTGGGTGTCCTTCAACCAGAACCTCGAGTACCAGATC

ggttacatctgctccggcgtgttcggtgacaacccccgtcccaacgacggaaccggttcctgcggtcccatgtcccccaacggtgcttacggtgtcaagggcttctccttcaagtacggt

aacggtgtctggatcggtcgtaccaagtccaccaactcccgctccggtttcgagatgatctgggaccccaacggttggaccggcaccgactcttccttctccgtgaagcaggacatcgtggctatcaccgactggtccggttactccggttccttcgtgcagcaccccgagctgaccggtctggactgcattcgtccctgcttctgggtggagctgatccgtggtcgtcccaaggagtccaccatctggacctccggctcctccatctctttctgcggtgtgaactccgacaccgtgtcctggtcctggcccgacggtgccgagctgcccttcaccatcgacaagtaatgaaagcttgag

ctc

a/ihdonesia Seaüência de Proteína NA (seq id 471

MNPHQKIITI GSICMVIGIV SLKLQIGMMI SIWSHSIQT GNQHQAESISNTNPLTEKAV ASVTLAGNSS LCPIRGWAVfl SKDNNIRIGS KGDVFVIREPFISCSHLECR TFFLTQGALL NDKHSNGTVK DRSPHRTLMS CPVGEAPSPYNSRFESVAWS ASACHDGTSW LTIGISGPDN EAVAVLKYNG IITDTIKSWRNNILRTQESE CACVNGSCFT VMTDGPSDGQ ASYKIFKMEK GKWKSVELDAPNYHYEECS CYPDAGEITC VCRDNWHGSN RPWVSFNQNL EYQIGYICSGVFGDNPRPND GTGSCGPMSP NGAYGVKGFS FKYGNGVWIG RTKSTNSRSGFEMIWDPNGW TGTDSSFSVK QDIVAITDWS GYSGSFVQHP ELTGLDCIRPCFWVELIRGR PKESXIWTSG SSISFCGVNS DTVSflSWPDG AELPFTIDK

a/indosesia Otimizada M1 (seq id 48)ggtaccggatccgccaccatgtccctgctgaccgaggtggagrcctacgtgctgt ccatcatcccctccggtcctctgaaggctgagatcgctcagaagctcgaggacgttttcgcrggcaagaacaccgacctcgaggctctgatggagtggctcaagacccgtcccatcctgtcccccctgaccaagggtatcctgggtttcgtgttcaccctgaccgtgccctccgagcgtggtctg

cagcgtcgtcgtttcgtgcagaacgctctgaacggtaacggtgaccccaacaacatggac

cgtgctgtgaagctgtacaagaagctgaagcgcgagatcaccttccacggtgct aaggag

gtgtccctgtcctactccaccggtgctctggctagctgcatgggcctçatctacaaccgt

atgggcaccgtgaccaccgaggtggccttcggtctggtctgcgctacctgcgagcagatcgctgactcccagcaccgttcccaccgtcagatggctaccatcaccaaccccctgatccgtcacgagaaccgtatggtgctggcttccaccaccgctaaggctatggagcagatggctggttcctccgagcaggctgcrgaggccatggaggtggccaaccaggctcgtcagatggtgcaggctatgcgtaccatcggcacccaccccaactcctccgctggtctgcgtgacaacctgctcgagaacctgcaggcttaccagaagcgtatgggagtccagatgcagcgcttcaagtaatga

aagcttgagctc

a/indonesia SeqüênciaTde Proteína M1 <seq id 49)

MSIiIiTEVETY VLSI IPSGPL KAEIAQKLED VFAGKNTDLE ALMEWLKTRPILSPIiTKGIL GFVFTLTVPS ERGLQRRRFV QNALHGNGDP KNMDRAVKLYKKLKREITFH GAKEVSLSYS TGALASCMGL IYNRMGTVTT BVAFGLVCATCEQIADSQflR SHRQMATITN PLIRflENRMV LASTTAKAME QWAGSSEQAAEAKEVAMQAR QMVQAMRTIG THPNSSAGLR DNLLENLQAY QKRMGVQMQRFK

a/anlmi/1/2005

a/anhui otimizada HA (códons de partida e chegada são sublinhados) ;seq id soj

GGTACCGGATCCCTCGASATGGA6AAGATCGTGCTGCTGCTGGCTATCGTGTCCCTGGTGAAGTCCGACCAGATCTGCATCGGTTACCACGCTAACAACTCCACCGAGCAGGT<3GACACCATCATGGAGAAGAACGTCACCGTGACCCACGCTCAGGACATCCTGGAAAAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCGACCrGGACGGTGTCAAGCCCCTGATCCTGCGTGACTGCTCCGTGGCT

ggttggctgctgggtaaccccatgtgcgacgagttcatcaacgtgcccgagtggtcctac

ATCGTGGAGAAGGCTAACCCCGCTAACGACCTGTGCTACCCCGGTAACTTCAACGACTACGAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCCGTATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGTCCTCTTGGTCCSACCACGAGGCTTCCTCCGGTGrCTCCTCCGCTTGCCCATACCAGGGCACCCCATCTTTCTTCCGTAACGTGGTGTGGCTGATCAAGAAGAACAACACCTACCCCACCAT CAAGCGT T CCTACAACAACACCAACCAGGAGGAC CTGCT GATCCTGTGGGGTAT CCACCACTCCAACGACGCTGCCGAGCAGACCAAGCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCTCCGTGGGCACCTCCACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCCAAGATCGCTACCCGTTCCAAGGTGAACGGCCAGTCCGGTCGTATGGACTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCTATCAACTTCGAGTCCAACGGCAACTTCATCGCTCCCGAGTACGCTTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACTCCGCTATCGTCAAGTCCGAGGTGGAGTACGGTAACTGCAACACCAAGTGCCAGACCCCCArCGGTGCTATCAACTCCTCCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGTCCAACAAGCTGGTGCTGGCTACCGGTCTGCGTAACTCCCCCCTGCGTGAGCGTGGTCTGTTCGGCGCTATCGCTGGTTTCATCGAGG GCGGTTGGCAGGGCATGGTGGACGGTTGGTACGGTTACCACCACAGCAACGAGCAGGGTTCCGGTTACGCTGCTGACAAGGAGTCCACCCAGAAGGCTATCGACGGCGTCACCAACAAGGTGAACTCCATCATCGACAAGATGAACACÇCAGTTCGAGGCTGTGGGTCGTGAGTTCAACAACCTGGAGCGTCGTATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGTTTCCTGGACGTGTGGACC

tacaacgccgagctgctggtgctgaiggagaacgagcgtaccctggacttccacgactct

AACGTGAAGARCCTGTACGACAAGGTCCGCCTGCAGCTGCGTGACAACGCTAAGGAGCTGGGTAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAGTCCGTGCGTAACGGCACCTACGACTACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCTCGTCTGAAGCGTGAGGAGATCTCCGGCGTGAAGCTGGAGTCCATCGGCACCTACCAGATCCTGTCCATCTACTCCACCGTGGCTTCCTCCCTGGCTCTGGCTATCATGGTGGCTGGTCTGTCCCTGTGGATGTGCTCCAACGGTTCCCTGCAGTGCCGTATCTGCATCTAATAATGAGGCGCGCCAAGCTTGAGCTCA/Anh«i Seqüência de Proteína HA <seq ID si)

mekivlllai vslvksdqic igyhannste qvdtimeknv tvthaqdixiekthngklcdl dgvkplilrd csvagwllgn pmcdefinvp ewsyivekahpandlcypgn fndyeeiikhl lsrinhfeki qiipksswsd heassgvssacpyqgtpsff rnvvwltkkn ntyptikrsy hhtnqedlli lwgihhsndaaeqtklyqnp ttyisvgtst lnqrlvpkia trskvngqsg rmdffhtilkpndainfesn gnfiapeyay kivkkgdsai vkseveygnc ntkcqtpigainssmpfhni hpltigecpk yvksrklvla tglrnsplre rglrgaiagfieggwqgmvd gsygyhksile qgsgyradke stqkaldgvt nkvnsiidkmntqfeavgre fnnlerr1en lnkkmedgfl dvwtynaell vlmenertldfhdsnvknly dkvrlqlrdn akelgngcfe pyhkcdnecm esvrhgtydypqyseearlk reeisgvkle sigtyqilsi ystvasslal aimvaglslwmcsngslqcr ici

A/Bar goose superior/Qinghai/1 a/2005

a/qinghai otimizada HA (códons de partida e chegada são sublinhados) iseq id 52)

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a/qingbai Seqüência de Proteína HA<seq id 53)

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av1qinghai otimizada NA (códons de partida e chegada são sublinhados) <seq id 50accgtcccaccatcgggcgcgsatcc,ctcgaga^aaccccaaccagaagatcatcaccfttcggctccatctgcívtggtgatcgg ratcgtgtccctgatgctgcagatcggtaacatgatctccarctgggtgtcccactccatccagaccggt aac

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cccgacggtgccgagctgcccttcaccatcgacaagtaataatgaatcgatttgtcgagaagtactagaggatcataatSeqüência de Proteína:

A/oinghai Seqüência de Proteína NA (seq id 55)

MttPNQKIITI GSICMVIGXV SLMLQIGNMI SIBVSHSIQT GbJQRQAEPISNTKPiTEKAV ASVTIAGNSS LCPISGWAVY SKDNSIRIGS RGDVFVIREPFISCSfiLECR TFFLTQGALL NDKfiSNGTVK DRSPHRTLWS CPVGIAPSPYNSRFESVAWS ASACHOGTSW LTIGISGPDN GAVAVLKYNG I!!TDTIKSWRWtJILKTQBSE CACVNGSCFT VMTDGPSNGQ ASVKIFKMEK GKVVKSVELDAPNYHYEECS CYPDAGEITC VCRDNWHGSN RPWVSFNQNl EYQIGJfICSGVFGDlfPRPND GTGSCGPVSP NGAYGVKGFS FKVGNGVWIG RTKSTMSRSGm3I»DPBGW TGTDSSFSVK QDIVAITDWS GYSGSFVQKP ELTGLDCIRf1CFWVBLIRGR PKEST1WTS6 SSISFCGVNS DTVSWSWPDG AELPFTIDK

As seguintes referências são aqui incorporadas por referência:

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Outras Concretizações

Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazesde determinar usando-se não mais do que experimento de rotina, muitosequivalentes às concretizações específicas da invenção aqui descrita. Taisequivalentes são pretendidos para serem envolvidos pelas reivindicaçõesque se seguem:LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Novavax, Inc.

<120> PARTÍCULAS SIMILARES A VÍRUS DA GRIPE FUNCIONAIS (VLPS)

<130> NOW-OO2/O6WO

<150> US 60/727,513

<151> 2005-10-18

<150> US 60/780,847

<151> 2006-03-10

<150> US 60/800,006

<151> 2006-05-15

<150> US 60/831,196

<151> 2006-07-17

<150> US 60/832,116

<151> 2006-07-21

<150> US 60/845,495

<151> 2006-09-19

<160> 58

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 1

atgaatccaa atcaaaagat' aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata 60tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt 120accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata 180acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca 240gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag 300gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta 360tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac 420aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag 480ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc 540tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact 600gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc 660ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact 720gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt 780gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc 840cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg 900ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgçtc aggacttgtt 960ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac 1020gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg 1080ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt 1140tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac 1200tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcatcaa caggtgtttt 1260tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc 1320atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg 1380aatatcaatt tcatgtctat ataa 1404

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<210> 3

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 5

<211> 33

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<210> 6

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<210> 11<211> 1350<212> DNA<2i3> Vírus da gripe

<400> 11 atgaatccaa atcagaagat aataaccatt ggatcaatct gtatggtaat tggaatagtt 60agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcagaca 120gggaatcaac accaagctga atcaatcagc aatactaacc ctcttactga gaaagctgtg 180gcttcagtaa cattagcggg caattcatct ctttgcccca ttagaggatg ggctgtacac 240agtaaggaca acaatataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat tagagagccg 300ttcatctcat gctcccacct ggaatgcaga actttcttct tgactcaggg agccttgctg 360aatgacaagc actccaacgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt 420tgtcctgtgg gtgaggctcc ctctccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 480gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacaattg gaatttctgg cccagacaat 540gaggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 600aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact 660gtaatgactg atggaccaag tgatgggcag gcatcatata agatcttcaa aatggaaaaa 720ggaaaagtgg tcaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc 780tgttatcctg atgccggcga aatcacatgt gtttgcaggg ataattggca tggctcaaat 840aggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggccc gatgtcccct 960aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ttggatcggg 1020agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1080actggaacgg acagtagctt ttcagtgaaa caagatatag tagcaataac tgattggtca 1140ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag gattagattg cataagacct 1200tgtttctggg ttgagttaat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg 1260agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtga gttggtcttg gccagacggt 1320gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350

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<212> DNA

<213> vírus da gripe

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atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

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<210> 13

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 14

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<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213 > Vírus da gripe

<400> 15

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<210> 16

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<212> DNA

<213> vírus da gripe

<400> 16

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctatataggc atgagattga tgtccgc 57

<210> 17<211> 38

<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 17

aaagaattca tgagtcttct aaccgaggtc gaaacgta

38

<210> 18

<211> 38<212> DNA<213> vírus da gripe

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aaattcgaat tactccagct otatgctgac aaaatgac 38

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<212> DNA

<213> vírus da gripe

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

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<212> DNA

<213> vírus da gripe

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57

<213> vírus da gripe

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<400> 23

agaattcatg aaggcaataa ttgtactact catgg

<210> 24

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<212> DNA

<213> vírus da gripe

<400> 24

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<213> Vírus da gripe

<400> 25

agaattcatg ctaccttcaa ctatacaaac g

<210> 26

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 26

agcggccgct tacagagcca tatcaacacc tgtgacagtg

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<211> 568

<212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> Vac2-hac-opt

<400> 27

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1 5 10 15

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<212> PRT

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<220>

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<400> 28

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Val Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly370 375 3B0

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Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp435 440 445

Lys '

<210> 32

<211> 252

<212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> Vac2-mc-opt<400> 32

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<210> 33

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<212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> VN1203-ha-cs-opt

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<210> 34

<211> 572

<212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> VN1203-ha-spc-opt

<400> 34

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120

125

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Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala165 170 175

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Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn385 390 395 400

Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val405 410 415

Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys420 425 430

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<210> 35

<211> 570

<212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> VN1203-ha-sph9-opt<400> 35

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Ásn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly340 345 350

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Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala370 375 380

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Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg405 410 415

Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met420 425 430

Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val435 440 445

Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys450 455 460

Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu465 470 475 480Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys

Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu

Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser

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Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

<210> 36<211> 1707<212> DNA<213> vírus da gripe

<400> 36

atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60

attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180

gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag çtggatggct cctcggaaac 240

ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300

ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420

catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480

agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540

aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600

gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660

ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720

aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780

ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840

atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa 960tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380gtcaagaacc tttàcgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat 1500ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt 1560ggagtaaaat tggaatcaat aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg 1620agttccctag caetggcaat catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatgga 1680tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707

<210Ϊ> 37

<211> 1750

<212> DNA

<213> vírus da gripe

<400> 37 agtgtgatgg atatctgcag aattcgccct taggcgcgcc atggagaaaa tagtgcttct 60ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc attggttacc.atgcaaacaa 120ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt actgttacac atgcccaaga 180catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta gatggagtga agcctctaat 240tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac ccaatgtgtg acgaattcat 300caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat ccagtcaatg acctctgtta 360cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta ttgagcagaa taaaccattt 420tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt catgaagcct cattaggggt 480gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc agaaatgtgg tatggcttat 540caaaaagaac agtacatacc caàcaataaa gaggagctac aataatacca accaagaaga 600tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg gcagagcaga caaagctcta 660tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca ctaaaccaga gattggtacc 720aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga aggatggagt tcttctggac 780aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat ggaaatttca ttgctccaga 840atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt atgaaaagtg aattggaata 900tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg ataaactcta gcatgccatt 960ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa tatgtgaaat caaacagatt 1020agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag agaagaagaa aaaagagagg 1080attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg cagggaatgg tagatggttg 1140gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac gctgcagaca aagaatccac 1200tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg atcattgaca aaatgaacac 1260tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa aggagaatag agaatttaaa 1320caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat aatgctgaac ttctggttct 1380catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat gtcaagaacc tttacgacaa 1440ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt aacggttgtt tcgagttcta 1500tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat ggaacgtatg actacccgca 1560gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt ggagtaaaat tggaatcaat 1620aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg agttccctag cactggcaat 1680catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatggg tcgttacaat gcagaatttg 1740catttaagcg 1750

<210> 38<211> 1350<212> DNA<213> Vírus da gripe

<400> 38

atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatggtaac tggaatagtt 60

agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcacaca 120

gggaatcaac accaatctga accaatcagc aatactaatt ttcttactga gaaagctgtg 180

gcttcagtaa aattagcggg caattcatct ctttgcccca ttaacggatg ggctgtatac 240

agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat aagagagccg 300

ttcatctcat gctcocactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg 360

aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt 420

tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 4 80

gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacgattg gaatttctgg cccagacaat 540ggggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 600aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact 660gtaatgactg acggaccaag taatggtcag gcatcacata agatcttcaa aatggaaaaa 720gggaaagtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc 780tgttatccta atgccggaga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggctcaaat 840cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggtcc ggtgtcctct 960aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ctggatcggg 1020agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1080actgaaacgg acagtagctt ttcagtgaaa caagatatcg tagcaataac tgaítggtca 1140ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag gactagattg cataagacct 1200tgtttctggg ttgagttgat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg 1260agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1320gccgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350<210> 39 <211> 1400 <212> DNA <213> vírus da gripe <400> 39 ccgggatgaa tccaaatcag aagataataa ccatcggatc aatctgtatg gtaactggaa 60tagttagctt aatgttacaa attgggaaca tgatctcaat atgggtcagt cattcaattc 120acacagggaa tcaac.accaa tctgaaccaa tcagcaatac taattttctt actgagaaag 180ctgtggcttc agtaaaatta gcgggcaatt catctctttg ccccattaac ggatgggctg 240tatacagtaa ggacaacagt ataaggatcg gttccaaggg ggatgtgttt gttataagag 300agccgttcat ctcatgctcc cacttggaat gcagaacttt ctttttgact cagggagcct 360cgctgaatga caagcactcc aatgggactg tcaaagacag aagccctcac agaacattaa 420tgagttgtcc tgtgggtgag gctccctccc catataactc aaggtttgag tctgttgctt 480ggtcagcaag tgcttgccat gatggcacca gttggttgac gattggaatt tctggcccag 540acaatggggc tgtggctgta ttgaaataca atggcataat aacagacact atcaagagtt 600ggaggaacaa catactgaga actcaagagt ctgaatgtgc atgtgtaaat ggctcttgct 660ttactgtaat gactgacgga ccaagtaatg gtcaggcatc acataagatc ttcaaaatgg 720aaaaagggaa agtggttaaa tcagtcgaat tggatgctcc taattatcac tatgaggaat 780gctcctgtta tcctaatgcc ggagaaatca catgtgtgtg cagggataat tggcatggct 840caaatoggcc atgggtatct ttcaatcaaa atttggagta tcaaatagga tatatatgca 900

gtggagtttt cggagacaat ccacgcccca atgatggaac aggtagttgt ggtccggtgt 960

cctctaacgg ggcatatggg gtaaaagggt tttcatttaa atacggçaat ggtgtctgga 1020

tcgggagaac caaaagcact aattccagga gcggctttga aatgatttgg gatccaaatg 1080

ggtggactga aacggacagt agcttttcag tgaaacaaga tatcgtagca ataactgatt 1140

ggtcaggata tagcgggagt tttgtccagc atccagaact gacaggacta gattgcataa 1200

gaccttgttt ctgggttgag ttgatcagag ggcggcccaa agagagcaca atttggacta 1260

gtgggagcag catatctttt tgtggtgtaa atagtgacac tgtgggttgg tcttggccag 1320

acggtgctga gttgccattc accattgaca agtaggggcc ctcgagtaSg" ggcgaattcc 1380

agcacactgg cggccgttac 1400

<210> 40

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<212> DNA

<213> Vírus da gripe

<400> 40

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag X20

gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180

ggatttgtat toacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300

aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360

accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgactacg 420

gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480

tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaãtggtg 540

ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600

gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660

actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac "720

cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtga 759

<210> 41<211> 793<212> DNA<213> Vírus da gripe

<400> 41

atatctgcag aattcgccct tagaattcga cgtcatgagt cttctaaccg aggtcgaaac 60gtacgttctc tctatcatcc cgtcaggccc cctcaaagcc gagatcgcac agaaacttga 120agatgtcttt gcaggaaaga acaccgatct cgaggctctc atggagtggc taaagacaag 180accaatcctg tcacctctga ctaaágggat tttgggattt gtattcacgc tcaccgtgcc 240cagtgagcga ggactgcagc gtagacgctt tgtccagaat gccctaaatg gaaatggaga 300tccaaataat atggataggg cagttaagct atataagaag ctgaaaagag aaataacatt 360ccatggggct aaggaggtcg cactcagcta ctcaaccggt gcacttgcca gttgcatggg 420tctcatatac aacaggatgg gaacggtgac tacggaagtg gcttttggcc tagtgtgtgc 480cacttgtgag cagattgcag attcacagca tcggtctcac agacagatgg caactatcac 540caacccacta atcagacatg agaacagaat ggtgctggcc agcactacag ctaaggctat 600ggagcagatg gcgggatcaa gtgagcaggc agcggaagcc atggagatcg ctaatcaggc 660taggcagatg gtgcaggcaa tgaggacaat tgggactcat cctaactcta gtgctggtct 720gagagataat cttcttgaaa atttgcaggc ctaccagaaa cgaatgggag tgcagatgca 780gcgattcaag tga 793

<210> 42

<211> * 1-740

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gene HA de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula de inseto

<400> 42 .

ggtaccggat ccgccaccat ggagaagatc gtgctgctgc tggctatcgt gtccetggtg 60aagtccgacc agatctgcat cggttaccac gctaacaact ccaccgagca ggtggacacc 120atcatggaga agaacgtcac cgtgacccac gctcaggaca tcctcgaaaa gacccacaac 180ggcaagctgt gcgacctgga cggtgtcaag cccctgatcc tgcgtgactg ctccgtggct 240ggttggctgc tgggtaaccc catgtgcgac gagttcatca acgtgcccga gtggtcctac 300atcgtggaga aggctaaccc caccaacgac ctgtgctacc ccggttcctt caacgactac 360gaggagctga agcacctgct gtcccgtatc aaccacttcg agaagatcca gatcatcccc 420aagtcctctt ggtccgacca cgaggcttcc tccggtgtct cctccgcttg cccctacctg 480ggttccccct ccttcttccg taacgtggtg tggctgatca agaagaactc cacctacccc 540accatcaaga agtcctacaa caacaccaac caggaggacc tgctggtcct gtggggtatc 600caccacccca acgacgctgc cgagcagacc cgtctgtacc agaaccccac cacctacatc 660tccatcggca cctccaccct gaaccagcgt ctggtgccca agatcgctac ccgttccaag 720gtgaacggcc agtccggtcg tatggagttc ttctggacca tcctgaagcc taacgacgct 780atcaacttcg agtccaacgg caacttcatc gctcccgagt acgcttacaa gatcgtgaag 840aagggcgact ccgctatcat gaagtccgag ctggagtacg gtaactgcaa caccaagtgc . 900cagaccccca tgggtgctat caactcctcc atgcccttcc acaacatcca ccccctgacc 960atcggcgagt gccccaagta cgtgaagtcc aaccgtctgg tgctggctac cggtctgcgt 1020aactcccccc agcgcgagtc ccgtcgtaag aagcgtggtc tgttcggcgc tatcgctggt 1080ttcatcgagg gcggttggca gggcatggtg gacggatggt acggttacca ccactctaac 1140gagcagggtt ccggttacgc tgctgacaag gagtccaccc agaaggctat cgacggcgtc 1200accaacaagg tgaactccat catcgacaag atgaacaccc agttcgaggc tgtgggtcgt 1260gagttcaaca acctcgagcg tcgtatcgag aacctgaaca agaagatgga ggacggtttc 1320ctggacgtgt ggacctacaa cgccgagctg ctggtgctga tggagaacga gcgtaccctg 1380gacttccacg actccaacgt gaagaacctg tacgacaagg tccgcctgca gctgcgtgac 1440aacgctaagg agctgggtaa cggttgcttc gagttctacc acaagtgcga caacgagtgc 1500atggagtcca tccgtaacgg cacctacaac tacccccagt actccgagga ggctcgtctg 1560aagcgtgagg agatctccgg cgtgaagctc gagtccatcg gaacctacca gatcctgtcc 1620atctactcca ccgtggcttc ctccctggct ctggctatca tgatggctgg tctgtccctg 1680tggatgtgct ccaacggttc cctgcagtgc cgtatctgca tctaatgaaa gcttgagctc 1740

<210> 43

<211> 568

<212> PRT

<213> Vírus da gripe

<400> 43

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lye Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp65 70

Cys Ser Val Ala

Gly Trp Leu Leu Gly Asn75 80Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile165 170 175

Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn ser325 330 335

Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile340 345 350

Ala Gly Phe Xle Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu485 490 495

Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala530 535 540

Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly545 550 555 560Ser Leu Gln Cys Arg Xle Cys Xle565

<210> 44<211> 1716<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gene HA de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula de inseto<400> 44

ggatccgcca ccatggagaa gatcgtgctg ctgctggcta tcgtgtccct ggtgaagtcc 60gaccagatct gcatcggtta ccacgctaac aactccaccg agcaggtgga caccatcatg 120gagaagaacg tcaccgtgac ccacgctcag gacatcctcg aaaagaccca caacggcaag 180ctgtgcgacc tggacggtgt caagcccctg atcctgcgtg actgctccgt ggctggttgg 240ctgctgggta accccatgtg cgacgagttc atcaacgtgc ccgagtggtc ctacatcgtg 300gagaaggcta accccaccaa cgacctgtgc taccccggtt ccttcaacga ctacgaggag 360ctgaagcacc tgctgtcccg tatcaaccac ttcgagaaga tccagatcat ccccaagtcc 420tcttggtccg accacgaggc ttcctccggt gtctcctccg cttgccccta cctgggttcc 480ccctccttct tccgtaacgt ggtgtggctg atcaagaaga actccaccta ccccaccatc 540aagaagtcct acaacaacac caaccaggag gacctgctgg tcctgtgggg tatccãccac 600cccaacgacg ctgccgagca gacccgtctg taccagaacc ccaccaccta catctccatc 660ggcacctcca ccctgaacca gcgtctggtg cccaagatcg ctacccgttc caaggtgaac 720ggccagtccg gtcgtatgga gttcttctgg accatcctga agcctaacga cgctatcaac 780ttcgagtcca acggcaactt catcgctccc gagtacgctt acaagatcgt gaagaagggc 840gactccgcta tcatgaagtc cgagctggag tacggtaact gcaacaccaa gtgccagacc 900cccatgggtg ctatcaactc ctccatgccc ttccacaaca tccaccccct gaccatcggc 960gagtgcccca agtacgtgaa gtccaaccgt ctggtgctgg ctaccggtct gcgtaactcc 1020ccccagcgcg agtcccgtgg tctgttcggc gctatcgctg gtttcatcga gggcggttgg 1080cagggcatgg tggacggatg gtacggttac caccactcta acgagcaggg ttccggttac 1140gctgctgaca aggagtccac ccagaaggct atcgacggcg tcaccaacaa ggtgaactcc 1200atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gctgtgggtc gtgagttcaa caacctcgag 1260cgtcgtatcg agaacctgaa caagaagatg gaggacggtt tcctggacgt gtggacctac 1320aacgccgagc tgctggtgct gatggagaac gagcgtaccc tggacttcca cgactccaac 1380gtgaagaacc tgtacgacaa ggtccgcctg cagctgcgtg acaacgctaa ggagctgggt 1440155

aacggttgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggagtc catccgtaac 1500

ggcaoctaca actaccccca gtactccgag gaggctcgtc tgaagcgtga ggagatctcc 1560

ggcgtgaagc tcgagtccat cggaacctac cagatcctgt ccatctactc caccgtggct 1620

tcctccctgg ctctggctat catgatggct ggtctgtccc tgtggatgtg ctccaacggt 1680

tccctgcagt gccgtatctg catctaatga aagctt 1716

<210> 45

<211> 564

<212> PRT

<213> Virusdagripe

<400> 45

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 BO

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cye Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile165 170 175Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn GIn Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly215 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser290 295 300

-Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser325 330 335

Pro Gln Arg Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile340 345 350

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His355 360 365

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln370 375 380

Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys385 390 395 400

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu405 410 415Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp420 425 430

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg435 440 445

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val450 455 460

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glii Leu Gly Asn Gly Cys Phe465 470 475 480

Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn485 490 495

Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg500 505 510

Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile515 520 525

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Sef Leu Ala Leu Ala Ile Met530 535 540

Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys545 550 555 560

Arg Ile Cys Ile

<210> 46

<211> 1383

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Gene NA de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula ae inseto

<400> 46 ggtaccggat ccgccaccat gaaccccaac cagaagatca tcaccatcgg ctccatctgc 60atggtgatcg gtatcgtgtc cctgatgctg cagatcggta acatgatctc catctgggtg 120tcccactcca tccagaccgg taaccagcac caggctgagt ccatctccaa caccaacccc 180ctgaccgaga aggctgtggc ttccgtgacc ctggctggta actcctccct gtgccccatc 240cgtggttggg ctgtgcactc caaggacaac aacatccgca tcggttccaa gggtgacgtg 300ttcgtgatcc gtgagccctt catctcctgc tcccacctcg agtgccgtac cttcttcctg 360

acccaaggtg ctctgctgaa cgacaagcac tccaacggca ccgtgaagga ccgttccccc 420

caccgtaccc tgatgtcctg ccccgtgggc gaggctccct ccccctacaa ctcccgtttc 480

gagtccgtgg cttggtccgc ttccgcttgc cacgacggca cctcttggct gaccatcggt 540

atctccggtc ccgacaacga ggctgtcgct gtgctgaagt acaacggcat catcaccgac 600

accatcaagt cctggcgtaa caacatcctg cgtacccagg agtccgagtg cgcttgcgtg 660

aacggttcct gcttcaccgt gatgaccgac ggtccctccg acggccaggc ttcctacaag 720

atcttcaaga tggagaaggg caaggtggtg aagtccgtgg agctggacgc tcccaactac 780

cactacgagg agtgctcttg ctaccccgac gctggcgaga tcacctgcgt gtgccgtgac 840

aactggcacg gttccaaccg tccctgggtg tccttcaacc agaacctcga gtaccagatc 900

ggttacatct gctccggcgt gttcggtgac aacccccgtc ccaacgacgg aaccggttcc 960

tgcggtccca tgtcccccaa cggtgcttac ggtgtcaagg gcttctcott caagtacggt 1020

aacggtgtct ggatcggtcg taccaagtcc accaactccc gctccggttt cgagatgatc 1080

tgggacccca acggttggac cggcaccgac tcttccttct ccgtgaagca ggacatcgtg 1140

gctatcaccg actggtccgg ttactccggt tccttcgtgc agcaccccga gctgaccggt 1200

ctggactgca ttcgtccctg cttctgggtg gagctgatcc gtggtcgtcc caaggagtcc 1260

accatctgga cctccggctc ctccatctct ttctgcggtg tgaactccga caccgtgtcc 1320

tggtcctggc ccgacggtgc cgagctgccc ttcaccatcg acaagtaatg aaagcttgag 1380

CtC 1383

<210> 47<211> 449<212> PRT<213> Vfrusdagripe

<400> 47

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val

Ile Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile20 25 30

Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Asn Gln His Gln Ala Glu Ser35 40 45

Ile Ser Asn Thr Asn Pro Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val ThrLeu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly Trp Ala Val His65 70 75 80

Ser Lys Asp Asn Asn Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val85 90 95

Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe100 105 110

Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr115 120 125

Val Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly130 135 140

Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser145 150 155 160

Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser165 170 175

Gly Pro Asp Asn Glu Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile180 185 190

Thr Asp Thx Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu195 208 205

Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp210 215 220

Gly Pro Ser Asp Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys225 230 235 240

Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr245 250 255

Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys260 265 270

Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln275 280 285

Asn

Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp290 295 300Asn Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Met Ser Pro305 310 315 320

Asn Gly Ala Tyr Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly325 330 335

Val Tzp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu340 345 350

Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Ser Ser Phe Ser355 360 365

Val Lys Gln Asp lie Val Ala lie Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly370 375 380

Ser Phè Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro385 330 395 400

Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile405 410 415

Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr420 425 430

Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp435 440 445

Lys

<210> 48<211> 792<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gene M1 de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula de inseto<400> 48

ggtaccggat ccgccaccat gtccctgctg accgaggtgg agacotacgt gctgtccatc 60atcccctccg gtcctctgaa ggctgagatc gctcagaagc tcgaggacgt tttcgctggc 120aagaacaccg acctcgaggc tctgatggag tggctcaaga cccgtcccat cctgtccccc 180ctgaccaagg gtatcctggg tttcgtgttc accctgaccg tgccctccga gcgtggtctg 240cagcgtcgtc gtttcgtgca gaacgctctg aacggtaacg gtgaccccaa caacatggac 300cgtgctgtga agctgtacaa gaagctgaag cgcgagatca ccttccacgg tgctaaggag 360gtgtccctgt cctactccac cggtgctctg gctagctgca tgggcctgat ctacaaccgt 420atgggcaccg tgaccaccga ggtggccttc ggtctggtct gcgctacctg cgagcagatc 480gctgactccc agcaccgttc ccaccgtcag atggctacca tcaccaaccc cctgatccgt 540cacgagaacc gtatggtgct ggcttccacc accgctaagg ctatggagca gatggctggt 600tcctccgagc aggctgctga ggccatggag gtggccaacc aggctcgtca gatggtgcag 660gctatgcgta ccatcggcac ccaccccaac tcctccgctg gtctgcgtga caacctgctc 720gagaacctgc aggcttacca gaagcgtatg ggagtccaga tgcagcgctt caagtaatga 780aagcttgagc tc 792

<210> 49

<211> 252

<212> PRT

<213> V)-rus da grjpe

<400> 49

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln *Lys Leu Glu Asp Val Phe20 25 30

Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr35 40 45

Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly. Phe Val Phe50 55 60

Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val65 70 75 80

Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala85 90 95

Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala100 105 110

Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met115 120 125

Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe130 135 140Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg145 150 155 160

Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu165 170 175

Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met180 185 190

Ala Gly Ser Ser Glu Gln Rla Ala Glu AIa Met Glu Val Rla Rsn Gln195 200 205

Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn210 215 220

Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr225 230 235 240

Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys245 250

<210> 50

<211> 1736

<212> dna

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gene ha de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula de inseto

<400> 50 ggtaccggat ccctcgagat ggagaagatc gtgctgctgc tggctatcgt gtccctggtg 60aagtccgacc agatctgcat cggttaccac gctaacaact ccaccgagca ggtggacacc 120atcatggaga agaacgtcac cgtgacccac gctcaggaca tcctggaaaa gacccacaac 180ggcaagctgt gcgacctgga cggtgtcaag cccctgatcc tgcgtgaotg ctccgtggct 240ggttggctgc tgggtaaccc catgtgcgac gagttcatca acgtgcccga gtggtcctac 300atcgtggaga aggctaaccc cgctaacgac ctgtgctacc ccggtaactt caacgactac 360gaggagctga agcacctgct gtcccgtatc aaccacttcg agaagatcca gatcatcccc 420aagtcctctt ggtccgacca cgaggcttcç tceggtgtct cctccgcttg cccataccag 480ggcaccccat ctttcttccg taacgtggtg tggctgatca agaagaacaa cacctacccc 540accatcaagc gttcctacaa caacaccaac caggaggacc tgctgatcct gtggggtatc 600caccactcca acgacgctgc cgagcagacc aagctgtacc agaaccccac cacctacatc 660tccgtgggca cctccaccct gaaccagcgt ctggtgccca agatcgctac ccgttccaag 720gtgaacggcc agtccggtcg tatggacttc ttctggacca tcctgaagcc taacgacgct 780

atcaacttcg agtccaacgg caacttcatc gctcccgagt acgcttacaa gatcgtgaag 840

aagggcgact ccgctatcgt caagtccgag gtggagtacg gtaactgcaa caccaagtgc 900

cagaccccca tcggtgctat caactcctcc atgcccttcc acaacatcca ccccctgacc 960

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aactcccccc tgcgtgagcg tggtctgttc ggcgctatcg ctggtttcat cgagggcggt 1080

tggcagggca tggtggacgg ttggtacggt taccaccaca gcaacgagca gggttccggt 1140

tacgctgctg acaaggagtc cacccagaag gctatcgacg gcgtcaccaa caaggtgaac 1200

tccatcatcg acaagatgaa cacccagttc gaggctgtgg gtcgtgagtt caacaacctg 1260

gagcgtcgta tcgagaaoct gaacaagaag atggaggacg gtttcctgga cgtgtggacc 1320

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aacgtgaaga acctgtacga caaggtccgc ctgcagctgc gtgacaacgc taaggagctg 14 40

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aacggcacct acgactaccc ccagtactcc gaggaggctc gtctgaagcg tgaggagatc 1560

tccggcgtga agctggagtc catcggcacc taccagatcc tgtccatcta ctccaccgtg 1620

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<210> 51<211> 563<212> PRT<213> Virusdagripe

<400> 51

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Pro Leu Ile Leu Arg65

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Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser325 330 335

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<211> 1738

<212> DNA

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<223> Gene Hfi de gripe otimizado para expressão em sistema de expressão de célula de inseto

<400> 52 cgggcgcgga gcggccgcat ggagaagatc gtgctgctgc tggctatcgt gtctctggtc 60aagtccgacc agatctgcat cggttaccac gctaacaact ccaccgagca ggtggacacc 120atcatggaga agaacgtcac cgtgacccac gctcaggaca tcctcgaaaa gacccacaac 180ggcaagctgt gcgacctgga cggcgtgaag cccctgatcc tgcgtgactg ctccgtggct 240ggttggctgc tgggtaaccc catgtgcgac gagttcctca acgtgcccga gtggtcctac 300atcgtggaga agatcaaccc cgctaacgac ctgtgctacc ccggtaactt caacgactac 360gaggagctga agcacctgct gtcccgtatc aaccacttcg agaagatcca gatcatcccc 420aagtcctctt ggtccgacca cgaggcttcc tccggtgtct cctccgcttg cccataccag 480ggccgttctt ccttcttccg caacgtggtg tggctgatca agaagaacaa cgcctacccc 540accatcaagc gttcctacaa caacaccaac caggaggacc tgctggtcct gtggggtatc 600caccacccca acgacgctgc cgagcagacc cgtctgtacc agaaccccac cacctacatc 660tccgtgggca cctctaccct gaaccagcgt ctggtgccca agatcgctac ccgttccaag 720gtgaacggcc agtccggtcg tatggagttc ttctggacca tcctgaagcc taacgacgct 780atcaacttcg agtccaacgg caacttcatc gctcccgaga acgcttacaa gatcgtgaag 840aagggcgact ccaccatcat gaagtccgag ctggagtacg gcaactgcaa cactaagtgc 900cagaccccca tcggtgctat caactcctcc atgcccttcc acaacatcca ccccctgact 960atcggcgagt gccccaagta cgtgaagtcc aaccgtctgg tgctggctac cggtctgcgt 1020aactcccccc agatcgagac tcgtggtctg ttcggcgcta tcgctggttt catcgagggc 1080ggttggcagg gcatggtgga cggttggtac ggttaccacc actctaacga gcagggttcc 1140ggttacgctg ctgacaagga gtctacccag aaggctatcg acggcgtcac caacaaggtg 1200aactccatca tcgacaagat gaacacccag ttcgaggctg tgggtcgtga gttcaacaac 1260ctcgaacgtc gtatcgagaa cctgaacaag aagatggagg acggtttcct ggacgtgtgg 1320acctacaacg ccgagctgct ggtgctgatg gagaacgagc gtaccctgga cttccacgac 1380tccaacgtga agaacctgta cgacaaggtc cgcctgcagc tgcgtgacaa cgctaaggag 1440ctgggtaacg gttgcttcga gttctaccac cgttgcgaca acgagtgcat ggagtccgtg 1500

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<210> 53

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<212> PRT

<213> Virusdagripe

<400> 53

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<210> 54<211> 1422<212> DNA

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<210> 55

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<212> PRT

<213> Virusdagripe

<400> 55

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Lys

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<212> DNA

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<400> 56

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<400> 58

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Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu485 490 495

Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala530 535 540

Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile565

Claims (30)

1. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende VLP degripe, em que o dito VLP compreende M1 de gripe, as proteínas HA e NA,em que a dita vacina induz à uma imunidade substancial para infecção pelovírus da gripe em humanos suscetíveis à gripe.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são derivadas de um vírus da gripesazonal.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe sazonal é um tipo de vírus da gripe.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe sazonal é um tipo de vírus gripe B.

5. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são derivadas de um vírus da gripeaviária.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe aviária é o H5N1.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe aviária é o H9N2.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a dita proteína M1 é derivada de uma cepa diferente do vírus dagripe em comparação com as proteínas HA e NA.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a dita proteína M1 é derivada de um vírus da gripe aviária.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são derivadas de um vírus da gripesazonal.

11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe sazonal é um tipo de vírus da gripe.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe sazonal é um tipo de vírus da gripe B.

13. Vacina de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são derivadas de um vírus da gripeaviária.

14. Vacina de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe aviária é o H5N1.

15. Vacina de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelofato de que o dito vírus da gripe aviária é o H9N2.

16. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a dita HA e / ou NA exibe atividade de hemaglutinina e / ou ativi-dade da neuraminidase, respectivamente.

17. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a dita VLP de gripe é formulada com um adjuvante ou estimula-dor imune.

18. Vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelofato de que o dito adjuvante compreende Novasomes ®.

19. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende uma VLPde gripe, em que a dita VLP é constituída essencialmente por M1 de gripe,proteínas HA e NA, em que a dita vacina induz a imunidade substancial parauma infecção por vírus da gripe em humanos suscetíveis à gripe.

20. Vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são proteínas HA e NA do vírus dagripe sazonal.

21. Vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são proteínas HA e NA do vírus dagripe aviária.

22. Vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que a dita proteína M1 é derivada de uma cepa diferente do vírus dagripe em comparação com as proteínas HA e NA.

23. Vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelofato de que a dita proteína M1 é derivada de um vírus da gripe aviária.

24. Vacina de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são proteínas HA e NA do vírus dagripe sazonal.

25. Vacina de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelofato de que as ditas proteínas HA e NA são proteínas HA e NA do vírus dagripe aviária.

26. Método de induzir imunidade substancial para uma infecçãopelo vírus da gripe em humanos suscetíveis à gripe, caracterizado pelo fatode que compreende a administração de pelo menos uma dose eficaz de umavacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que o referido método compreende administrar a um ser humano, adita VLP de gripe por via oral, intradérmica, por via nasal, por via intramuscu-Iar, intraperítoneal, intravenosa ou subcutânea.

28. Uso de uma VLP de gripe, em que a dita VLP compreendeM1 de gripe, as proteínas HA e NA, caracterizado pelo fato de que é para apreparação de uma vacina que induz a uma imunidade substancial para umainfecção pelo vírus da gripe em humanos suscetíveis à gripe.

29. Uso de uma VLP de gripe, em que a dita VLP é constituídaessencialmente por M1 de gripe, as proteínas HA e NA, caracterizado pelofato de que é para a preparação de uma vacina que induz a uma imunidadesubstancial para uma infecção por vírus de gripe em humanos suscetíveis àgripe.

30. Uso de uma VLP de gripe, em que a dita VLP consiste de M1de gripe, proteínas HA e NA, caracterizado pelo fato de que é para a prepa-ração de uma vacina que induz a uma imunidade substancial para uma in-fecção por vírus de gripe em humanos suscetíveis à gripe.