JP2017189178A - 機能的インフルエンザウイルス様粒子(vlp) - Google Patents
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Abstract
【課題】インフルエンザウイルスM1タンパク質とインフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれているウイルス様粒子(VLP)が提供されるウイルス様粒子(VLP)を提供すること。【解決手段】本発明では、季節的なインフルエンザウイルスのタンパク質、トリインフルエンザウイルスタンパク質、および/または世界的に流行する可能性があるウイルスに由来するインフルエンザウイルスタンパク質を発現する、ならびに/あるいはそれらが含まれているウイルス様粒子(VLP)が開示され、そして請求される。本発明には、上記タンパク質が含まれているベクター構築物、上記構築物が含まれている細胞、本発明のVLPが含まれている処方物およびワクチンが含まれる。【選択図】なし
Description
本願は、2005年10月18日に出願された仮特許出願第60/727,513号、2006年3月10日に出願された仮特許出願第60/780,847号、2006年5月15日に出願された仮特許出願第60/800,006号、2006年7月17日に出願された米国仮特許出願第60/831,196号、2006年7月21日に出願された仮とっきょ出願大60/832,166号、および2006年9月19日に出願された仮特許出願第60/845,495号に対する優先権を主張する。これらの全てが、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
(発明の背景)
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のファミリーのメンバーである(概要については、Murphy and Webster,1996を参照のこと)。これには、A、B、およびCと指定されたインフルエンザウイルスの3つのサブタイプが存在している。インフルエンザのビリオンには、断片化されているマイナスセンスのRNAゲノムが含まれている。インフルエンザのビリオンには以下のタンパク質が含まれる:ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックス(M1)、プロトンイオン−チャンネルタンパク質(M2)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)タンパク質。HA、NA、M1、およびM2は膜結合型であり、一方、NP、PB1、PB2、PA、およびNS2はヌクレオカプシド結合タンパク質である。NS1は、ビリオン粒子に結合していない唯一の非構造タンパク質であるが、これは、インフルエンザに感染した細胞に特異的である。M1タンパク質は、インフルエンザ粒子の中に最も豊富に存在しているタンパク質である。HAタンパク質とNAタンパク質は、ウイルスの付着、および細胞へのウイルス粒子の浸潤に関与しているエンベロープ糖タンパク質であり、そしてウイルスの中和および防御免疫のための主要な免疫優性エピトープの供給源である。HAタンパク質およびNAタンパク質はいずれも、予防的なインフルエンザワクチンの最も重要な成分と考えられている。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のファミリーのメンバーである(概要については、Murphy and Webster,1996を参照のこと)。これには、A、B、およびCと指定されたインフルエンザウイルスの3つのサブタイプが存在している。インフルエンザのビリオンには、断片化されているマイナスセンスのRNAゲノムが含まれている。インフルエンザのビリオンには以下のタンパク質が含まれる:ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックス(M1)、プロトンイオン−チャンネルタンパク質(M2)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)タンパク質。HA、NA、M1、およびM2は膜結合型であり、一方、NP、PB1、PB2、PA、およびNS2はヌクレオカプシド結合タンパク質である。NS1は、ビリオン粒子に結合していない唯一の非構造タンパク質であるが、これは、インフルエンザに感染した細胞に特異的である。M1タンパク質は、インフルエンザ粒子の中に最も豊富に存在しているタンパク質である。HAタンパク質とNAタンパク質は、ウイルスの付着、および細胞へのウイルス粒子の浸潤に関与しているエンベロープ糖タンパク質であり、そしてウイルスの中和および防御免疫のための主要な免疫優性エピトープの供給源である。HAタンパク質およびNAタンパク質はいずれも、予防的なインフルエンザワクチンの最も重要な成分と考えられている。
インフルエンザウイルス感染は、シアル酸が含まれている細胞性受容体(糖タンパク質および糖脂質)に対するビリオン表面のHAタンパク質の結合によって開始される。NAタンパク質は、シアル酸受容体のプロセシングを媒介し、そして細胞へのウイルスの浸潤は、HA依存性受容体によって媒介されるエンドサイトーシスに依存する。インフルエンザのビリオンが含まれているインターナライズされたエンドソームの酸性の範囲(confine)においては、HAタンパク質は立体構造の変化を受け、それにより、ウイルスと宿主の細胞膜との融合、続いて、ウイルスの脱殻およびヌクレオカプシド結合リボ核タンパク質(RNP)に由来するM1タンパク質のM2によって媒介される放出が導かれる。これは、ウイルスRNAの合成のために細胞核の中に移動する。HA分子に対する抗体は、ウイルスの感染性を中和することによってウイルス感染を予防することができる。一方、NAタンパク質に対する抗体は、ウイルスの複製の初期段階に対するそれらの作用を媒介する。
不活化させられたA型およびB型インフルエンザウイルスワクチンは、現在、非経口投与用の3価のワクチンとして認可されている。これらの3価のワクチンは、胚含有鶏卵の尿膜腔の中で1価の塊として生産され、rate zonal遠心分離またはカラムクロマトグラフィーによって精製され、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンで不活化させられ、そして定められた年に人の集団の間で流行するA型インフルエンザウイルス株とB型インフルエンザウイルス株の2つの株の混合物として処方される。利用することができる市販されているインフルエンザワクチンは、全ウイルス(whole virus)(WV)ワクチンまたはサブビリオン(SV;分割されたまたは精製された表面抗原)ウイルスワクチンである。WVワクチンには、完全な、不活化させられたビリオンが含まれる。トリ−n−ブチルホスフェート(Flu−Shield,Wyeth−Lederle)のような溶媒で処理されたSVワクチンには、ほとんど全てのウイルスの構造タンパク質と、ウイルスエンベロープのいくつかが含まれる。Triton X−100で可溶化させられたSVワクチン(Fluzone,Sanofi−Aventis;Fluvirin,Novartis)には、主にHAモノマー、NA、およびNPの凝集物が含まれるが、残りの量の他のウイルスの構造タンパク質も存在する。生存している弱毒化させられた低温適応性のウイルスワクチン(FluMist,MedImmune)は、5〜17歳の健常な小児および若者、ならびに18〜49歳の健常な成人において、能動免疫法、ならびにA型およびB型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患の予防に適応される鼻腔内に投与されるワクチンとして商業的な使用がFDAによって最近承認された、承認された製品(granted marketing)である。
いくつかの組み換え産物が、組み換え体であるインフルエンザワクチンの候補として開発されている。これらのアプローチは、A型インフルエンザウイルスのHAタンパク質およびNAタンパク質の発現、生産、および精製に焦点があてられており、これには、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞(Crawfordら、1999;Johansson,1999;Treanorら、1996)、ウイルスベクター(Pushkoら、1997;Berglundら、1999)およびDNAワクチン構築物(Olsenら、1997)を使用するこれらのタンパク質の発現が含まれる。
Crawfordら、(1999)では、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現させられたインフルエンザHAが、トリH5インフルエンザサブタイプおよびH7インフルエンザサブタイプによって引き起こされる致死性のインフルエンザ疾患を予防することができることが明らかにされている。同時に、別のグループによっては、バキュロウイルスによって発現させられたインフルエンザのHAタンパク質およびNAタンパク質によって、従来のワクチンによって誘導される免疫応答よりも優れた免疫応答が動物において誘導されることが明らかにされている(Johanssonら、1999)。バキュロウイルスによって発現させられたウマインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの免疫原性と効力が、相同DNAワクチンの候補に対して比較された(Olsenら、1997)。まとめると、データは、インフルエンザウイルスでのチャレンジに対する高い程度の防御を組み換え体であるHAタンパク質またはNAタンパク質を用いて、様々な実験的アプローチを使用して様々な動物モデルにおいて誘導することができたことを示している。
Lakeyら(1996)は、バキュロウイルスから誘導されたインフルエンザHAワクチンが、第I相用量増加安全性試験においてヒトボランティアにおいて十分な耐用性があり、免疫原性であることを示した。しかし、HAタンパク質および/またはNAタンパク質からなるインフルエンザワクチンの数回の用量がワクチン接種されたヒトボランティアにおいていくつかの臨床機関で行われた第II相試験による結果は、組み換え体であるサブユニットタンパク質ワクチンは防御免疫を誘発しなかったことを示した[G.Smith,Protein Sciences;M.Perdue,USDA,Personal Communications]。これらの結果は、感染性のビリオンのHAおよびNAペプロマー(peplomer)の表面上に提示される立体構造エピトープが、中和抗体および防御免疫の誘発に重要であることを示していた。
組み換え体インフルエンザワクチンの候補の中に他のインフルエンザタンパク質を含めることに関して、多数の実験が行われており、これには、インフルエンザ核タンパク質、NPが、単独で、またはM1タンパク質との組み合わせにおいて関与している実験が含まれる(Ulmerら、1993;Ulmerら、1998;Zhouら、1995;Tsuiら、1998)。これらのワクチン候補(これは、擬似不変内部ビリオンタンパク質からなる)は、主に細胞性(CD4+およびCD8+メモリーT細胞の両方)である、広範な免疫力を誘発した。これらの実験には、DNAベクターまたはウイルスゲノムベクターの使用が含まれていた。比較的多量のDNAの注射が必要であった。なぜなら、低い用量のDNAを用いた実験の結果はほとんど防御を示さなかったか、または全く防御を示さなかったからである(Chenら、1998)。したがって、さらに別の前臨床試験および臨床試験が、インフルエンザNPおよびM1が関与しているそのようなDNAをベースとするアプローチが安全であり、有効であり、そして持続性であるかどうかを評価するために必要であり得る。
最近、インフルエンザについてのより有効なワクチンを開発する試みにおいて、粒子状タンパク質が、インフルエンザM2タンパク質エピトープのキャリアとして使用された。M2をベースとするワクチンの開発についての理論的根拠は、動物実験においては、インフルエンザに対する防御免疫がM2タンパク質によって誘発されたことである(Slepushkinら、1995)。Neirynckら、(1999)は、HBcAgキャプシド様粒子の表面上のM2エピトープ(単数または複数)に曝すためのB型肝炎ウイルスコア抗原(HBcAg)とのアミノ末端融合パートナーとして、23アミノ酸長のM2膜貫通ドメインを使用した。しかし、全長のM2タンパク質とM2−HBcAg VLPのいずれもがマウスにおいて検出可能な抗体および防御を誘導したという事実にもかかわらず、将来のインフルエンザワクチンがもっぱらM2タンパク質をベースとするとはなりそうにはない。なぜなら、M2タンパク質はビリオンあたり低コピー数で存在し、抗原性が弱く、遊離のインフルエンザビリオンに結合した抗体を誘発することができず、そして細胞受容体に対するウイルスの結合をブロックすること(すなわち、ウイルスの中和)ができないからである。
これまでの研究によって表面インフルエンザ糖タンパク質HAおよびNAがインフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発についての主な標的であり、そしてM1はインフルエンザに対する細胞性免疫についての保存されている標的を提供することが示されたので、新しいワクチン候補には、タンパク質の巨大分子粒子(例えば、ウイルス様粒子(VLP))としてのこれらのウイルス抗原が含まれ得る。さらに、これらのインフルエンザ抗原を有している粒子は立体構造エピトープを提示することができ、これは、インフルエンザウイルスの複数の株に対して中和抗体を誘発する。
いくつかの実験によって、組み換え体インフルエンザタンパク質が、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用する細胞培養物中でVLPになるように自己アセンブリすることができることが明らかにされている(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3)。非特許文献1によっては、インフルエンザVLPの効率的な形成がウイルスタンパク質の発現レベルに依存していることが明らかにされた。非特許文献2によっては、クローニングされたcDNAに完全に由来する感染性のインフルエンザウイルス様粒子を作成するための、哺乳動物発現プラスミドをベースとするシステムが確立された。非特許文献3によっては、HA、NA、M1、およびM2遺伝子を同時発現する組み換え体であるバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞中でのインフルエンザVLPの形成が報告された。これらの実験により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核生物細胞の中での同時発現されると自己アセンブリし得ることが明らかとなった。
いくつかの実験によって、組み換え体インフルエンザタンパク質が、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用する細胞培養物中でVLPになるように自己アセンブリすることができることが明らかにされている(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3)。非特許文献1によっては、インフルエンザVLPの効率的な形成がウイルスタンパク質の発現レベルに依存していることが明らかにされた。非特許文献2によっては、クローニングされたcDNAに完全に由来する感染性のインフルエンザウイルス様粒子を作成するための、哺乳動物発現プラスミドをベースとするシステムが確立された。非特許文献3によっては、HA、NA、M1、およびM2遺伝子を同時発現する組み換え体であるバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞中でのインフルエンザVLPの形成が報告された。これらの実験により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核生物細胞の中での同時発現されると自己アセンブリし得ることが明らかとなった。
Gomez−Puertasら、(1999)J.Gen.Virol.80,1635−1645
Neumann,Gら、(2000)J.Virol.74,547−551
Latham,T.,およびGalarza,J.M.(2001)J.Virol.75,6154−6165
発明の要旨
本発明により、インフルエンザウイルスM1タンパク質とインフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれているウイルス様粒子(VLP)が提供される。1つの実施形態においては、M1タンパク質は、H5およびN1タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記H5またはN1は、H5N1クレード1のインフルエンザウイルスに由来する。
本発明により、インフルエンザウイルスM1タンパク質とインフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれているウイルス様粒子(VLP)が提供される。1つの実施形態においては、M1タンパク質は、H5およびN1タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記H5またはN1は、H5N1クレード1のインフルエンザウイルスに由来する。
本発明によってはまた、VLPの形成を可能にする条件下で、インフルエンザH5タンパク質およびN1タンパク質とインフルエンザM1タンパク質をコードする1つ以上の核酸が含まれている真核生物細胞から発現させられたVLPも提供される。1つの実施形態においては、上記真核生物細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞から選択される。他の実施形態においては、上記真核生物細胞は昆虫細胞である。
本発明によってはまた、ヒトまたは動物に投与されると、インフルエンザ感染に対して防御性である中和抗体を上記ヒトまたは動物の中で誘発するVLPも提供される。
本発明によってはまた、有効用量の本発明のVLPが含まれている免疫原性組成物も提供される。1つの実施形態においては、上記組成物にはアジュバントが含まれる。
本発明によってはまた、有効用量の本発明のVLPが含まれているワクチンも提供される。1つの実施形態においては、上記ワクチンには、少なくとも第2のVLPが含まれる。これには、異なるインフルエンザ株に由来するHAとNAが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンにはアジュバントが含まれる。
本発明によってはまた、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法も提供される。この方法には、少なくとも1有効用量の、本発明のVLPが含まれているワクチンを投与する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記ワクチンは、動物に対して経口で、皮内で、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。
本発明によってはまた、動物用のワクチンの調製のための本発明のVLPの使用も提供される。ここでは、ワクチンによって、上記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
本発明によってはまた、本発明のVLPを作成する方法も提供される。この方法には、真核生物細胞の中でM1、HA、およびNAを発現させる工程が含まれる。
本発明によっては、インフルエンザVLPが含まれているワクチンが提供される。ここでは、上記VLPには、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれる。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。1つの実施形態においては、上記ワクチンにはインフルエンザVLPが含まれる。ここでは、VLPは、原則としてインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質から構成される。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。別の実施形態においては、上記ワクチンには、インフルエンザVLPが含まれる。ここでは、上記VLPには、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれる。ここでは、上記ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
本発明によってはまた、インフルエンザVLPの使用も提供される。ここでは、上記VLPには、ワクチンの調製のためのインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれる。ここでは、ワクチンによって、ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力が誘導される。
したがって、本発明により、(a)第1のインフルエンザウイルスM1タンパク質と(b)さらなる構造タンパク質(これには、第2またはそれ以上のインフルエンザウイルスM1タンパク質;第1、第2、またはそれ以上のインフルエンザウイルスHAタンパク質;第1、第2、またはそれ以上のインフルエンザウイルスNAタンパク質;および第1、第2、またはそれ以上のインフルエンザウイルスM2タンパク質が含まれ得る)が含まれている、巨大分子タンパク質構造が提供される。さらに別の構造タンパク質が第2またはそれ以上のインフルエンザウイルスM1タンパク質に由来しない場合には、グループの両方のメンバーまたは全てのメンバー(例えば、第1および第2のインフルエンザM2ウイルスタンパク質)が含まれる。このように、サブウイルス粒子、VLP、もしくはカプソメア構造が含まれている機能性のインフルエンザタンパク質構造、またはその一部、ワクチン、多価ワクチン、および本発明の方法によって生産されたインフルエンザウイルス構造タンパク質から原則として構成されているそれらの混合物が提供される。特に好ましい実施形態においては、インフルエンザ巨大分子タンパク質構造には、野生型ウイルスに由来する合成断片としてクローニングされたインフルエンザウイルス遺伝子の遺伝子産物である、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1タンパク質が含まれる。
巨大分子タンパク質構造にはまた、さらに別の構造タンパク質、例えば、核タンパク質(NP)、非インフルエンザ(noninfluenza)ウイルス以外の種に由来する膜タンパク質、およびインフルエンザではない供給源に由来する膜タンパク質(これは、トリまたは哺乳動物起源、およびインフルエンザウイルスの様々なサブタイプ(インフルエンザウイルスサブタイプAおよびサブタイプBが含まれる)に由来する)も含まれ得る。本発明には、キメラである巨大分子タンパク質構造が含まれ得る。これには、インフルエンザウイルスによっては生産されない部分を有している少なくとも1つのタンパク質の一部が含まれる。
インフルエンザの予防は、組み換え体である構築物から宿主細胞の中で自己アセンブリし得る巨大分子タンパク質構造を提供することによって得られ得る。本発明の巨大分子タンパク質構造は、HAおよびNAタンパク質上に立体構造エピトープを提示する同型または異型のウイルス様粒子(VLP)になるように自己アセンブリする能力を有しており、これは、防御性である中和抗体を誘発する。組成物はワクチン組成物であり得、これにはまた、担体もしくは希釈剤および/またはアジュバントも含まれる。機能性のインフルエンザVLPは、機能性のインフルエンザVLPに1つ以上のウイルス株またはタイプに由来するHAタンパク質および/またはNAタンパク質が含まれているかどうかに応じて、インフルエンザウイルスの1つ以上の株またはタイプに対する中和抗体を誘発する。ワクチンには、野生型インフルエンザウイルスタンパク質であるインフルエンザウイルスタンパク質が含まれ得る。好ましくは、インフルエンザVLPが含まれている構造タンパク質、またはその一部は、野生型インフルエンザウイルスの様々な株に由来し得る。インフルエンザワクチンは1つ以上のインフルエンザウイルス株またはタイプに対する防御免疫を誘発するために、ヒトまたは動物に投与され得る。
本発明の巨大分子タンパク質構造は、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
本発明により、M1、HA、およびインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの構造タンパク質が含まれている、インフルエンザ構造遺伝子をコードする組み換え体構築物を構築することによって、インフルエンザに由来するVLPを生産するための方法が提供される。組み換え体である構築物は、組み換え体であるバキュロウイルスで適切な宿主細胞をトランスフェクトする、感染させる、または形質転換するために使用される。宿主細胞は、M1、HA、およびインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、そしてVLPは宿主細胞中で形成させられる。機能性のインフルエンザVLPが含まれている感染させられた細胞は細胞媒体が回収され、そしてVLPが精製される。本発明はまた、第2のインフルエンザタンパク質をコードする第2の組み換え体構築物を用いて、宿主細胞を同時トランスフェクトする、同時感染させる、または同時形質転換し、それによって、VLPの中に第2のインフルエンザタンパク質を取り込ませるさらなる工程を特徴とする。そのような構造タンパク質は、インフルエンザウイルスに由来し得(NA、M2、およびNPが含まれる)、そして少なくとも1つの構造タンパク質はトリまたは哺乳動物起源に由来する。構造タンパク質は、インフルエンザウイルスサブタイプAおよびサブタイプBであり得る。本発明にしたがうと、宿主細胞は真核生物細胞であり得る。加えて、VLPはキメラVLPであり得る。
本発明はまた、宿主細胞の中にインフルエンザウイルス遺伝子をコードする組み換え体構築物を導入すること、および組み換え体であるインフルエンザウイルスタンパク質の機能性の同型または異型VLPへの細胞の中での自己アセンブリを可能にすることによって、インフルエンザVLPが含まれている製剤原料を処方する方法を特徴とする。インフルエンザVLPが単離され、精製され、そしてインフルエンザVLPが含まれている薬物原料が処方される。薬物原料にはさらに、アジュバントが含まれ得る。加えて、本発明により、そのようなインフルエンザVLPが含まれている薬物材料を脂質小胞(すなわち、非イオン性の脂質小胞)と混合することによる、薬物材料を処方するための方法が提供される。したがって、機能性の同型または異型VLPが、感染させられた細胞から包まれた(enveloped)粒子として芽を出し得る。発芽したインフルエンザVLPは、限外濾過またはカラムクロマトグラフィーによって、薬物材料として単離されそして精製され得、そして単独で処方され得るか、またはワクチンのような薬物産物としてのNovavax,Incの製品であるNovasomes(登録商標)のように、単独でまたはアジュバントとともに処方される。Novasomes(登録商標)(これにより、高い免疫学的効果が提供される)はさらに、引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第4,911,928に記載されている。
本発明により、脊椎動物においてインフルエンザウイルス感染に対する体液性免疫を検出するための方法が提供される。この方法は、インフルエンザウイルスの巨大分子構造の少なくとも1つの立体構造エピトープを有している有効な抗体検出量のインフルエンザウイルスタンパク質が含まれている試験試薬を提供することによる。試験試薬は、インフルエンザウイルス感染について試験される脊椎動物に由来する体液試料と接触させられる。試料中に含まれるインフルエンザウイルス特異的抗体は、抗原−抗体複合体を形成するように、インフルエンザウイルスの巨大分子構造の立体構造エピトープに結合させることができる。複合体は、結合していない複合体から分離され、そして検出できるように標識された免疫グロブリン結合試薬と接触させられる。複合体に結合させられた検出できるように標識された免疫グロブリン結合試薬の量が決定される。
インフルエンザウイルスは、検出可能なシグナルを生産する標識を有しているか、または検出できるように標識された試薬に結合させられた、インフルエンザウイルスの粒子の少なくとも1つの立体構造エピトープに対して特異性を有している抗体を提供することによって、ウイルスに感染していると予想される動物またはヒト由来の検体の中で検出することができる。検体は抗体と接触させられ、そして抗体がインフルエンザウイルスに結合させられる。検体中のインフルエンザウイルスの存在は、検出可能な標識によって決定される。
本発明により、有効量の本発明の組成物を脊椎動物に投与することにより、処置、予防のための、および防御免疫応答を生じさせるための方法が提供される。
あるいは、インフルエンザVLP薬物材料は、インフルエンザウイルスの構造試験および臨床的な診断アッセイに使用される研究室用の試薬として処方され得る。本発明によってはまた、有効量の本発明の組成物を投与することによりインフルエンザウイルスを処置するためのキット、および使用のための説明書も提供される。
本発明によってはまた、脊椎動物において病的状態または死を引き起こす可能性がある、トリインフルエンザウイルスに由来するHA、NA、およびM1タンパク質が含まれているVLPも提供される。1つの実施形態においては、上記HA、NA、およびM1タンパク質は、A型トリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、HAは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16からなる群より選択され、そしてNAは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、およびN9からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、上記HAタンパク質とNAタンパク質は、それぞれ、H5およびN1である。別の実施形態においては、上記HAタンパク質およびNAタンパク質は、それぞれ、H9およびN2である。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。1つの実施形態においては、VLPは、原則として、HA、NA、およびM1タンパク質から構成される。すなわち、これらのインフルエンザタンパク質しか、VLP中には実質的には存在しない。
本発明によってはまた、VLPを生産する方法も提供される。この方法には、トリインフルエンザウイルスタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトする工程、および上記トリインフルエンザウイルスタンパク質を、VLPを形成させるための条件下で発現させる工程が含まれる。1つの実施形態においては、この方法には、HA、NA、およびM1インフルエンザタンパク質だけをコードする組み換え体DNA分子で宿主細胞をトランスフェクトする工程が含まれる。
本発明にはまた、脊椎動物において病的状態または死を引き起こす可能性がある、トリインフルエンザウイルスに由来するHA、NA、およびM1タンパク質が含まれているVLPが含まれている抗原性処方物も含まれる。別の実施形態においては、HAは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16からなる群より選択され、そしてNAは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、およびN9からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、上記HAタンパク質とNAタンパク質は、それぞれ、H5およびN1である。別の実施形態においては、上記HAタンパク質およびNAタンパク質は、それぞれ、H9およびN2である。さらなる実施形態においては、上記抗原性処方物は、被験体に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。
本発明によってはさらに、トリインフルエンザウイルスに対して脊椎動物を予防接種する方法が提供される。この方法には、上記脊椎動物に、トリインフルエンザウイルスに由来するHA、NA、およびM1タンパク質が含まれているVLPの防御誘導量を投与する工程が含まれる。
本発明にはまた、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法も含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記VLPは、原則として、HA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記VLPには、インフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。
本発明にはまた、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のトリインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPは、原則として、トリHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザLVPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はトリHA、NA、およびM1からなる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量の季節的なインフルエンザのVLPを投与する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPは、原則として、季節的なHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は季節的なHA、NA、およびM1からなる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量の少なくとも1つの季節的なインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPには、季節的なインフルエンザのHA、NA、およびM1が含まれる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPは、原則的には、季節的なインフルエンザのHA、NA、およびM1からなる。
本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な防御性の免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。
本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的に防御性の細胞性免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。
本発明にはさらに、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導するワクチンを処方する方法が含まれる。この方法には、上記処方物に対して、有効用量のインフルエンザVLPを添加する工程が含まれる。1つの実施形態においては、上記インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力は、1用量で誘導される。別の実施形態においては、上記インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力は、複数回の用量で誘導される。
本発明にはさらに、インフルエンザVLPが含まれているワクチンが含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPは、トリインフルエンザVLPである。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPは季節的なインフルエンザのVLPである。
本発明にはさらに、インフルエンザVLPが含まれている抗原性処方物が含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPはトリインフルエンザVLPである。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPは季節的なインフルエンザのVLPである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
インフルエンザウイルスM1タンパク質と、インフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれている、ウイルス様粒子(VLP)。
(項目2)
前記M1タンパク質が、H5およびN1タンパク質タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルス株に由来する、項目1に記載のVLP。
(項目3)
前記H5またはN1が、H5N1 clade 1インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目4)
前記H5およびN1が、H5N1 clade 2インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目5)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号43および46、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目3に記載のVLP。
(項目6)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号50および54、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目4に記載のVLP。
(項目7)
前記H5およびN1が、感染した動物から単離されたインフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目8)
前記感染した動物がヒトである、項目7に記載のVLP。
(項目9)
前記VLPが、VLPの形成が可能な条件下で、インフルエンザH5およびN1タンパク質をコードする核酸と、インフルエンザM1タンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上を含む真核生物細胞から発現される、項目1に記載のVLP。
(項目10)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目9に記載のVLP。
(項目11)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目10に記載のVLP。
(項目12)
前記昆虫細胞がSf9である、項目11に記載のVLP。
(項目13)
前記VLPが、ヒトまたは動物に投与されるとインフルエンザ感染に対して防御的である中和抗体を前記ヒトまたは動物において誘発する、項目1に記載のVLP。
(項目14)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれている免疫原性組成物。
(項目15)
前記組成物にアジュバントが含まれている、項目14に記載の組成物。
(項目16)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれているワクチン。
(項目17)
前記ワクチンに、様々なインフルエンザ株に由来するHAおよびNAを含む第2のVLPが少なくとも含まれている、項目16に記載のワクチン。
(項目18)
前記ワクチンにアジュバントが含まれている、項目16または17に記載のワクチン。
(項目19)
前記アジュバントにNovasomes(登録商標)が含まれている、項目15もしくは18に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
(項目20)
項目16〜18のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法。
(項目21)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記動物がヒトである、項目20または21に記載の方法。
(項目23)
動物用のワクチンの調製のための、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの使用であって、前記ワクチンが前記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目24)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目23に記載の方法。
(項目25)
真核生物細胞の中で前記M1、HA、およびNAタンパク質を発現させる工程が含まれる、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPを作成する方法。
(項目26)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記昆虫細胞がSf9である、項目27に記載の方法。
(項目29)
インフルエンザH5またはN1タンパク質の少なくとも1つをコードする、昆虫細胞発現ベクター。
(項目30)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目31)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPは、原則として、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目32)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPには、M1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目33)
ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法であって、項目30〜32のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、方法。
(項目34)
前記ワクチンが、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目33に記載の方法。
(項目35)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPにインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目36)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPがインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目37)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目38)
前記ワクチンがヒトに対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目35〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記ワクチンがバキュロウイルスを不活化させるために処理される、項目16〜19および30〜32のいずれか1項に記載のワクチン。
(項目40)
前記不活化処理に、およそ0.2%のβ−プロピルラクトン(BPL)中にVLPを含む試料を、約25℃で約3時間インキュベートする工程が含まれる、項目40に記載のワクチン。
本発明にはさらに、インフルエンザVLPが含まれている抗原性処方物が含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPはトリインフルエンザVLPである。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPは季節的なインフルエンザのVLPである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
インフルエンザウイルスM1タンパク質と、インフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれている、ウイルス様粒子(VLP)。
(項目2)
前記M1タンパク質が、H5およびN1タンパク質タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルス株に由来する、項目1に記載のVLP。
(項目3)
前記H5またはN1が、H5N1 clade 1インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目4)
前記H5およびN1が、H5N1 clade 2インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目5)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号43および46、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目3に記載のVLP。
(項目6)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号50および54、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目4に記載のVLP。
(項目7)
前記H5およびN1が、感染した動物から単離されたインフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目8)
前記感染した動物がヒトである、項目7に記載のVLP。
(項目9)
前記VLPが、VLPの形成が可能な条件下で、インフルエンザH5およびN1タンパク質をコードする核酸と、インフルエンザM1タンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上を含む真核生物細胞から発現される、項目1に記載のVLP。
(項目10)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目9に記載のVLP。
(項目11)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目10に記載のVLP。
(項目12)
前記昆虫細胞がSf9である、項目11に記載のVLP。
(項目13)
前記VLPが、ヒトまたは動物に投与されるとインフルエンザ感染に対して防御的である中和抗体を前記ヒトまたは動物において誘発する、項目1に記載のVLP。
(項目14)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれている免疫原性組成物。
(項目15)
前記組成物にアジュバントが含まれている、項目14に記載の組成物。
(項目16)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれているワクチン。
(項目17)
前記ワクチンに、様々なインフルエンザ株に由来するHAおよびNAを含む第2のVLPが少なくとも含まれている、項目16に記載のワクチン。
(項目18)
前記ワクチンにアジュバントが含まれている、項目16または17に記載のワクチン。
(項目19)
前記アジュバントにNovasomes(登録商標)が含まれている、項目15もしくは18に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
(項目20)
項目16〜18のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法。
(項目21)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記動物がヒトである、項目20または21に記載の方法。
(項目23)
動物用のワクチンの調製のための、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの使用であって、前記ワクチンが前記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目24)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目23に記載の方法。
(項目25)
真核生物細胞の中で前記M1、HA、およびNAタンパク質を発現させる工程が含まれる、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPを作成する方法。
(項目26)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記昆虫細胞がSf9である、項目27に記載の方法。
(項目29)
インフルエンザH5またはN1タンパク質の少なくとも1つをコードする、昆虫細胞発現ベクター。
(項目30)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目31)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPは、原則として、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目32)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPには、M1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目33)
ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法であって、項目30〜32のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、方法。
(項目34)
前記ワクチンが、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目33に記載の方法。
(項目35)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPにインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目36)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPがインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目37)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目38)
前記ワクチンがヒトに対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目35〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記ワクチンがバキュロウイルスを不活化させるために処理される、項目16〜19および30〜32のいずれか1項に記載のワクチン。
(項目40)
前記不活化処理に、およそ0.2%のβ−プロピルラクトン(BPL)中にVLPを含む試料を、約25℃で約3時間インキュベートする工程が含まれる、項目40に記載のワクチン。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合は、用語「バキュロウイルス」はバキュロウイルス科としても知られており、節足動物のエンベロープを有しているDNAウイルスのファミリーを意味する。そのうちの複数メンバーは、昆虫細胞培養物中で組み換え体タンパク質を生産させるための発現ベクターとして使用することができる。ビリオンには、環状のスーパーコイル状の二本鎖のDNA分子が含まれている1つ以上の桿状のヌクレオカプシドが含まれる(Mr 54×106〜154×106)。ベクターとして使用されるウイルスは、通常は、Autographa californica核多角体病ウイルス(NVP)である。導入された遺伝子の発現は、その中ではウイルスが感染させられた細胞の中に埋め込まれている大きな核内封入体の多面体タンパク質成分の発現を通常制御する強いプロモーターの制御下にある。
本明細書中で使用される場合は、用語「バキュロウイルス」はバキュロウイルス科としても知られており、節足動物のエンベロープを有しているDNAウイルスのファミリーを意味する。そのうちの複数メンバーは、昆虫細胞培養物中で組み換え体タンパク質を生産させるための発現ベクターとして使用することができる。ビリオンには、環状のスーパーコイル状の二本鎖のDNA分子が含まれている1つ以上の桿状のヌクレオカプシドが含まれる(Mr 54×106〜154×106)。ベクターとして使用されるウイルスは、通常は、Autographa californica核多角体病ウイルス(NVP)である。導入された遺伝子の発現は、その中ではウイルスが感染させられた細胞の中に埋め込まれている大きな核内封入体の多面体タンパク質成分の発現を通常制御する強いプロモーターの制御下にある。
本明細書中で使用される場合には、用語「〜に由来する」は起源または供給源を意味し、そしてこれには、自然界に存在している分子、組み換え体である分子、精製されていない分子、または精製された分子が含まれ得る。本発明のタンパク質および分子は、インフルエンザ分子またはインフルエンザ以外の分子に由来し得る。
本明細書中で使用される場合には、用語「第1の」インフルエンザウイルスタンパク質、すなわち、第1のインフルエンザウイルスM1タンパク質は、M1、HA、NA、およびM2のようなタンパク質を意味し、これは、インフルエンザウイルスの特定の株に由来する。第1のインフルエンザウイルスの株またはタイプは、第2のインフルエンザウイルスタンパク質の株またはタイプとは異なる。したがって、「第2の」インフルエンザウイルスタンパク質、すなわち、第2のインフルエンザウイルスM1タンパク質は、第1のインフルエンザウイルスタンパク質とは異なる株またはタイプである第2のインフルエンザウイルス株に由来する、M1、HA、NA、およびM2のようなタンパク質を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ヘマグルチニン活性」は、HA含有タンパク質、VLP、またはその一部の、赤血球細胞(赤血球)に結合し、そしてそれらを凝集させる能力を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ノイラミニダーゼ活性」は、NA含有タンパク質、VLP、またはその一部の、フェチュイン(fetuin)のようなタンパク質が含まれている基質からシアル酸残基を切断する酵素活性を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「異型(heterotypic)」は、ウイルスの1つ以上の異なるタイプまたは株を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「同型(homotypic)」は、ウイルスの1つのタイプまたは株を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「巨大分子タンパク質構造」は、1つ以上のタンパク質の構造または配置を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「多価」ワクチンは、インフルエンザウイルスの複数のタイプまたは株に対するワクチンを意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「インフルエンザ以外の」は、インフルエンザウイルス由来ではないタンパク質または分子を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「ワクチン」は、病原体に対する抗体の形成または免疫力を誘導するために使用される、死滅させられたかもしくは弱められた病原体の調製、または誘導された抗原性決定基の調製を意味する。ワクチンは、疾患(例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザ)に対する免疫力を提供するために投与される。本発明により、免疫原性であるワクチン組成物が提供され、そして防御が提供される。加えて、用語「ワクチン」はまた、脊椎動物が防御免疫(すなわち、感染に付随する疾患の重篤度を低くする免疫力)を生じるように投与される、免疫原(例えば、VLP)の懸濁液または溶液を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的な免疫力」は、本発明のVLPが脊椎動物に投与された場合に、上記脊椎動物においてインフルエンザ感染の予防、インフルエンザ感染の改善、または上記脊椎動物におけるインフルエンザウイルス感染に関する少なくとも1つの症状の軽減を生じる、上記脊椎動物の免疫システムの誘導が存在する免疫応答を意味する。実質的な免疫力はまた、哺乳動物における≧40のヘマグルチニン阻害(HI)力価をも意味し得、ここでは、本発明のVLPが投与され、そして免疫応答が誘導される。
本明細書中で使用される場合は、用語「アジュバント」は、処方物中で特異的な免疫原(例えば、VLP)と組み合わせて使用された場合に、得られる免疫応答を増進するか、または別の方法で変更するもしくは変化させる化合物を意味する。免疫応答の変更には、抗体および細胞性の免疫応答のいずれかまたは両方の特異性の強化または拡大が含まれる。免疫応答の変更はまた、特定の抗原特異的免疫応答の減少または抑制をも意味し得る。
本明細書中で使用される場合は、用語「免疫促進剤」は、体自身の化学的伝達物質(サイトカイン)を介して免疫応答を増進する化合物を意味する。これらの分子には、免疫賦活活性、免疫増強活性、およびプロ炎症活性を有している様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン(例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);成長因子(例えば、顆粒球−マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF));ならびに、他の免疫賦活分子(例えば、)マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2など)が含まれる。免疫促進剤分子は、インフルエンザVLPと同じ処方物の中で投与することができ、また、別々に投与することもできる。タンパク質、またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫賦活効果を生じるように投与することができる。
本明細書中で使用される場合は、「有効用量」は、一般的には、免疫力を誘導するため、インフルエンザウイルス感染を防ぐおよび/もしくは改善するため、またはインフルエンザ感染の少なくとも1つの症状を軽減するため、ならびに/あるいは、VLPのさらなる用量の効力を高めるために十分な本発明のVLPの量を意味する。有効用量は、インフルエンザ感染の発症を遅らせるかまたは最少にするために十分なVLPの量を意味し得る。有効用量はまた、インフルエンザ感染の処置または管理において治療上の利点を提供するVLPの量をも意味し得る。さらに、有効用量は、本発明のVLPに関する、単独での、または他の治療薬との組み合わせにおける量であり、これによって、インフルエンザウイルス感染の処置または管理において治療上の利点が提供される。有効用量はまた、その後のインフルエンザウイルスへの暴露に対して、被験体(例えば、ヒト)自身の免疫応答を増進するために十分な量でもあり得る。免疫力のレベルは、例えば、中和分泌抗体および/または血清抗体の量を測定することによって、例えば、プラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、または中和試験(microneutralization)によってモニターすることができる。ワクチンの場合には、「有効用量」は、疾患を防ぐか、または症状の重篤度を低くする用量である。
本明細書中で使用される場合は、用語「トリインフルエンザウイルス」は、主に鳥類において見られるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを意味する。いくつかの例においては、トリインフルエンザウイルスは、一人のヒトから別のヒトに感染または拡散し得る。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザの世界的流行、すなわち、ヒトにおいて疾患状態および/または死を引き起こす可能性がある。世界的流行は、新しいインフルエンザウイルス株(ヒトが生まれつきの免疫力を有していないウイルス)が出現し、個々の地域を越えて拡散し、おそらくは地球全体に拡散し、そして瞬時に多くのヒトに感染すると起こる。
本明細書中で使用される場合は、用語「季節的なインフルエンザウイルス」は、National Influenza Centers worldwideによって行われた疫学的調査に基づいて所定のインフルエンザの季節についてヒトの集団の中で流行する(pass)と決定されたインフルエンザウイルス株を意味する。これらの疫学的試験およびいくつかの単離されたインフルエンザウイルスは、詳細な試験のために4つのWorld Health Organization(WHO)参照試験所(そのうちの1つは、AtlantaのCanters for Disease Control and Prevention(CDC)にある)のうちの1つに送られる。これらの試験所では、現在のワクチンに対して作成された抗体が流行しているウイルスおよび新規のfluウイルスに対してどの程度十分に反応するかが試験される。この情報は、flu活性についての情報とともにまとめられ、そして米国食品医薬品局(U.S.Food and
Drug Administration)(FDA)の諮問委員会と、WHO会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのfluワクチンに入れられる3種類のウイルス(A型インフルエンザウイルスの2つのサブタイプとB型インフルエンザウイルスの1つのサブタイプ)の選択が行われる。選択は、北半球では2月に、南半球では9月に行われる。通常、ワクチンの中の3種類の株のうちの1つまたは2つは毎年変えられる。
Drug Administration)(FDA)の諮問委員会と、WHO会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのfluワクチンに入れられる3種類のウイルス(A型インフルエンザウイルスの2つのサブタイプとB型インフルエンザウイルスの1つのサブタイプ)の選択が行われる。選択は、北半球では2月に、南半球では9月に行われる。通常、ワクチンの中の3種類の株のうちの1つまたは2つは毎年変えられる。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に防御性の抗体応答」は、脊椎動物(例えば、ヒト)によって示される、インフルエンザ感染を防ぐかもしくは改善する、またはその少なくとも1つの症状を軽減する、インフルエンザウイルスに対する抗体によって媒介される免疫応答を意味する。本発明のVLPは、抗体(例えば、インフルエンザウイルスの細胞への侵入をブロックする、上記インフルエンザの複製をウイルスに結合することによってブロックする、ならびに/または宿主細胞を感染および崩壊から防御する中和抗体)の生産を刺激することができる。
本明細書中で使用される場合は、用語「実質的に防御性の細胞応答」は、脊椎動物(例えば、ヒト)によって示される、インフルエンザ感染を防ぐかもしくは改善する、またはその少なくとも1つの症状を軽減する、T−リンパ球および/または他の白血球によって媒介されるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を意味する。細胞性の免疫の1つの重要な態様には、細胞溶解性T細胞(「CTL」)による抗原特異的応答が含まれる。CTLは、主要組織適合性複合体(MHC)によってコードされ、そして細胞の表面上で発現されるタンパク質と会合した状態で提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の崩壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を助け、誘導し、そして促進する。細胞性免疫の別の態様には、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答が含まれる。ヘルパーT細胞は、それらの表面上のMHC分子と会合した状態でペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激を助け、そしてその活性の焦点をあてるように作用する。「細胞性の免疫応答」はまた、活性化T細胞、および/または他の白血球細胞によって生産されるサイトカイン、ケモカイン、および他のそのような分子(CD4+およびCD8+細胞に由来する分子が含まれる)の生産をも意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「広い集団における(in a population−wide basis)実質的な免疫力」は、集団の中の複数の個体に対して投与された本発明のVLPの結果としての免疫力を意味する。上記集団の中の上記個体の免疫力は、上記個体においてインフルエンザ感染の予防、改善、または上記個体のインフルエンザウイルス感染に関連する少なくとも1つの症状の軽減、ならびに上記集団の他のものに対する上記インフルエンザウイルスの拡散の予防を生じる。用語集団は、個体のグループ(例えば、学童、高齢者、健常な個体など)として定義され、そしてこれには、幾何学的領域(例えば、特定の市、学校、近隣、職場、国、州など)が含まれ得る。
本明細書中で使用される場合は、用語「抗原性処方物」または「抗原性組成物」は、脊椎動物(特に、鳥類または哺乳動物)に投与されると免疫応答を誘導するであろう調製物を意味する。
本明細書中で使用される場合は、用語「脊椎動物」または「被験体」または「患者」は、cordata亜門(ヒトおよび他の霊長類(ヒト以外の霊長類(例えば、チンパンジー、および他の類人猿およびサル種)が含まれるが、これらに限定はされない))の任意のメンバーを意味する。家畜(farm animal)(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ);家畜(domestic)である哺乳動物(例えば、イヌおよび猫);実験用動物(齧歯類(例えば、マウス、ラット、およびモルモット)が含まれる);鳥類(家畜である鳥類、野生の鳥類、および競技用の鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽である鳥類、アヒル、ガチョウなど)が含まれる)もまた、限定ではない例である。用語「哺乳動物」および「動物」はこの定義に含まれる。生体である個体および生まれたばかりの個体が含まれるように意図される。
インフルエンザは、最適条件下でも60〜80%の有効性しかない特異的な不活化されたウイルスワクチンの有用性にもかかわらず、伝染する公衆衛生の懸念がある。これらのワクチンが有効であれば、疾病は通常はウイルス感染を防ぐことによって回避される。度重なる抗原性の差(抗原性のシフトおよび抗原性のドリフト)の結果として、ワクチンがうまくいかないことが起こり得る。例えば、トリA型インフルエンザウイルスH9N2は、ブタにおいてはヒトA型インフルエンザウイルスSydney/97(H2N2)と一緒に流行して、世界的に流行する可能性のある新しいヒトインフルエンザウイルス株の遺伝的混ぜ合わせおよび出現を導く(Peirisら、2001)。そのような抗原性のシフトの事象においては、現在のワクチンは適切な防御は提供できないであろう。
インフルエンザワクチンプログラムが十分ではないことについての別の理由は、現在のワクチンによって引き起こされる免疫力の持続期間が比較的短いことである。インフルエンザの感染対策のさらなる不適切さは、幼い小児、高齢者および市販の認可されている不活化ウイルスインフルエンザワクチンの製造に使用される卵の成分に対してアレルギーを有しているヒトにおけるワクチンの反応生成性(reactogenicity)と副作用の理由から、現在のワクチンの使用の制限に反映される。
加えて、不活化インフルエンザウイルスワクチンには、多くの場合には、HAおよびNAの立体構造エピトープは含まれないか、または、中和抗体を誘発し、そして疾患に対する防御において主要な役割を果たす変化させられたHAおよびNAの立体構造エピトープが含まれる。したがって、不活化ウイルスワクチン、ならびにいくつかの組み換え体であるモノマーインフルエンザサブユニットタンパク質ワクチンは不適切な応答を誘導する。一方、巨大分子タンパク質構造(例えば、カプソメア、サブウイルス粒子、および/またはVLP)には、立体構造エピトープを示す自然界に存在しているタンパク質の複数のコピーが含まれる。これらは、最適なワクチン免疫原性に有利である。
本発明には、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子の1つのバキュロウイルス発現ベクターへの、単独で、またはタンデムでのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である同型の巨大分子タンパク質構造(これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザVLPが含まれる)へと自己アセンブリする組み換え体であるインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
本発明には、ヒトインフルエンザA/Sydney/5/97およびA/Fujian/411/2002(H3N2)ウイルスのHA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子のバキュロウイルス発現ベクターへのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である同型の巨大分子タンパク質構造(これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザVLPが含まれる)へと自己アセンブリするインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
加えて、本発明には、ヒトインフルエンザA/Sydney/5/97およびA/Fujian/411/2002(H3N2)ウイルスのHAと、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子の1つのバキュロウイルスへのタンデムでのクローニング、ならびに、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞の中で機能性でありそして免疫原性である異型の巨大分子タンパク質構造(これには、サブウイルスインフルエンザ粒子とインフルエンザVLPが含まれる)へと自己アセンブリするインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチン候補または試薬の生産が記載される。
本発明のVLP
本発明のインフルエンザVLPは、インフルエンザウイルスに対するワクチンの調製に有用である。このシステムの1つの重要な特徴は、HAおよび/もしくはNAまたは他のウイルスタンパク質のさまざまなサブタイプを有している表面糖タンパク質を置き換え、したがってそれによって毎年の新しいインフルエンザの抗原性変異体のアップデートと、インフルエンザの世界的流行に備えた準備を可能にする能力である。これらの糖タンパク質の抗原性変異体が同定されているので、VLPは、これらの新しい変異体(例えば、季節的なインフルエンザワクチンについての新しい変異体)を含むようにアップデートすることができる。加えて、世界的流行の可能性があるウイルス(例えば、H5N1)に由来する表面糖タンパク質、または世界的流行の可能性がある他のHA、NAの組み合わせを、数十年間ヒトにおいては流行しなかった遺伝子の放出を懸念することなく、VLPの中に取り込ませることができる。その理由は、VLPが感染性ではないこと、複製しないこと、および疾患を引き起こし得ないことである。したがって、このシステムにより、毎年新しい候補のインフルエンザワクチンを作成することが可能となり、そして/または、必要である場合にはいつでもインフルエンザの世界的流行に対するワクチンを作成することが可能となる。
本発明のインフルエンザVLPは、インフルエンザウイルスに対するワクチンの調製に有用である。このシステムの1つの重要な特徴は、HAおよび/もしくはNAまたは他のウイルスタンパク質のさまざまなサブタイプを有している表面糖タンパク質を置き換え、したがってそれによって毎年の新しいインフルエンザの抗原性変異体のアップデートと、インフルエンザの世界的流行に備えた準備を可能にする能力である。これらの糖タンパク質の抗原性変異体が同定されているので、VLPは、これらの新しい変異体(例えば、季節的なインフルエンザワクチンについての新しい変異体)を含むようにアップデートすることができる。加えて、世界的流行の可能性があるウイルス(例えば、H5N1)に由来する表面糖タンパク質、または世界的流行の可能性がある他のHA、NAの組み合わせを、数十年間ヒトにおいては流行しなかった遺伝子の放出を懸念することなく、VLPの中に取り込ませることができる。その理由は、VLPが感染性ではないこと、複製しないこと、および疾患を引き起こし得ないことである。したがって、このシステムにより、毎年新しい候補のインフルエンザワクチンを作成することが可能となり、そして/または、必要である場合にはいつでもインフルエンザの世界的流行に対するワクチンを作成することが可能となる。
16種類のヘマグルチニン(HA)と9種類のノイラミニダーゼ(NA)が存在しており、これらは全て、鳥類の間で広く見られる。野性の鳥類は、主に、全てのA型インフルエンザウイルスの自然界でのレザーバーであり、そして他の全ての脊椎動物のあらゆるタイプのA型インフルエンザウイルスの供給源であると考えられる。これらのサブタイプは、それらの表面上のヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)の変化が原因で異なる。HAタンパク質とNAタンパク質の多くの様々な組み合わせが可能である。個々の組み合わせは、様々なタイプのA型インフルエンザウイルスを示す。加えて、個々のタイプはさらに、その8個の遺伝子のそれぞれにおいて見られるさまざまな変異に基づいて複数の株に分類することができる。
全ての公知のタイプのA型インフルエンザウイルスは鳥類で見ることができる。通常、トリインフルエンザウイルスはヒトには感染しない。しかし、いくつかのトリインフルエンザウイルスは、種のバリアを超える能力を伴っている遺伝子のバリエーションを生じる。そのようなウイルスは、世界的流行を引き起こすことができる。なぜなら、ヒトは、このウイルスに対しては生まれつきの免疫力を有しておらず、ヒトからヒトへと容易に拡散し得るからである。1997年には、香港での家禽類におけるトリfluの大発生の間に、トリインフルエンザはトリからヒトにまで突然飛び越えた。このウイルスは、インフルエンザウイルスH5N1と同定された。このウイルスは、18人において重篤な呼吸器疾患を引き起こし、そのうちの6人が死亡した。その時から、既知のH5N1感染のさらに多くの症例がヒトの間で世界的に流行した。これらのヒトのうちのおよそ半分が死亡した。
したがって、本発明には、トリインフルエンザウイルス、世界的流行の可能性のあるインフルエンザウイルス、および/または季節的なインフルエンザウイルスに由来するHA、NA、およびM1ヌクレオチドの、発現ベクターへのクローニングが含まれる。本発明にはまた、機能的なVLPへと自己アセンブリするインフルエンザタンパク質からなるインフルエンザワクチンの候補または試薬の生産も記載される。ウイルスタンパク質の全ての組み合わせは、M1ヌクレオチドと同時発現されなければならない。
本発明のVLPは、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなるか、または本発明のVLPにはそれらが含まれる。1つの実施形態においては、上記VLPには、トリ、世界的流行する、および/もしくは季節的なインフルエンザウイルスに由来するHAと、トリ、世界的に流行する、および/もしくは季節的なインフルエンザウイルスに由来するNAが含まれる。ここでは、上記HAは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16からなる群より選択され、そして上記NAは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、およびN9からなる群より選択される。別の実施形態においては、本発明にはVLPが含まれ、これは原則として、HA、NA、およびM1からなる。上記HAおよびNAは、HAおよびNAについての上記のリストによるものであり得る。これらのVLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、HAおよび/またはNAは、VLPの表面上に発現された場合には、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性をそれぞれ示し得る。
別の実施形態においては、上記VLPには、H5N1ウイルスのHAとNA、およびM1タンパク質(M1タンパク質は同じウイルス株に由来する場合も、またはそうではない場合もある)が含まれる。別の実施形態においては、上記VLPは、原則として、M1タンパク質と、H5N1ウイルスのHA、NAからなる。これらのVLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。さらなる実施形態においては、上記VLPは、M1タンパク質と、H5N1ウイルスのHA、NAからなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、H5、N1、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、H5、N9、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、H4、および/またはN1の断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、H5および/またはN1は、VLPの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
別の実施形態においては、上記VLPには、M1タンパク質、ならびに、H9N2ウイルスのHAとNAが含まれる。別の実施形態においては、上記VLPは、原則として、H9N2ウイルスのHAとNA、ならびにM1タンパク質からなる。これらのVLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記VLPは、M1タンパク質、ならびに、H9N2ウイルスのHAとNAからなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、H9、N2、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、H9、N2、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、H9、および/またはN2の断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、H9および/またはN2は、VLPの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
別の実施形態においては、上記VLPには、M1タンパク質、ならびに、B型インフルエンザウイルスに由来するHAおよびNAが含まれる。B型インフルエンザウイルスは、通常、ヒトだけに見られる。A型インフルエンザウイルスとは異なり、これらのウイルスはサブタイプには分類されない。B型インフルエンザウイルスは、ヒトにおいて疾患状態および死を引き起こす可能性があるが、一般的には、A型インフルエンザウイルスほど深刻には流行しない。別の実施形態においては、上記VLPは、原則として、M1タンパク質、ならびに、B型インフルエンザウイルスのHAおよびNAからなる。これらのVLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、上記VLPは、M1タンパク質、ならびに、B型インフルエンザウイルスのHAおよびNAからなる。別の実施形態においては、HAおよび/またはNAは、VLPの表面上に発現された場合には、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示し得る。
本発明にはまた、本発明のVLP上で、またはVLPの中で発現させられた上記インフルエンザタンパク質の変異体も含まれる。変異体には、構成要素であるタンパク質のアミノ酸配列の中に変化が含まれ得る。用語「変異体」は、ポリペプチドに関して用いられる場合には、参照配列と比較して1つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を意味する。変異体は、「保存的」変化を有し得、ここでは、置換されたアミノ酸は、類似する構造的または化学的特性を有する(例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換)。あるいは、変異体は、「非保存的」変化(例えば、グリシンのトリプトファンでの置換)を有し得る。同様の主要ではないバリエーションにはまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはそれらの両方が含まれ得る。どのアミノ酸残基を、生物学的または免疫学的活性を失うことなく置換する、挿入する、または欠失させることができるかを決定する指針は、当業者に周知のコンピュータープログラム(例えば、DNASTARソフトウェア)を使用して見出すことができる。
自然界に存在している変異体は、抗原性のドリフトが原因で起こり得る。抗原性のドリフトは、時間と共に頻繁に起こり得るウイルスタンパク質の中での小さな変化である。したがって、特定のfluウイルス株に感染したヒトは、そのウイルスに対する抗体を生じ、新しいウイルス株が出現すると、もはや古い株に対する抗体は新しいウイルスを認識することができず、再感染が起こり得る。これは、季節ごとにインフルエンザに対する新しいワクチンが存在する理由である。加えて、インフルエンザウイルスにおけるいくつかの変化は、種を飛び越えるインフルエンザを生じる可能性がある。例えば、いくつかのトリインフルエンザウイルスは、種のバリアを飛び越える能力を有している遺伝的バリエーションを生じた。そのようなウイルスは、世界的流行を引き起こす可能性がある。なぜなら、ヒトはそのウイルスに対しては生まれつきの免疫力を有しておらず、ウイルスはヒトからヒトへ容易に拡散することができるからである。インフルエンザタンパク質のこれらの自然界に存在しているバリエーションは、本発明の1つの実施形態である。
本発明に適用することができる分子生物学的技術(クローニング、突然変異、細胞培養など)が記載されている一般的なテキストとしては、Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrookら、Molecular Cloning−−A Laboratory Manual(第3版)、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,2000(「Sambrook」)およびCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubelら編、Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.とJohn Wiley & Sons,Inc.,(「Ausubel」)の合弁会社が挙げられる。これらのテキストには、突然変異誘発、例えば、HAおよび/またはNA分子のクローニングおよび突然変異に関係するベクター、プロモーター、および他の多くの関連トピックスの使用が記載されている。したがって、本発明には、本発明のVLP上で、またはVLPの中で発現させられたインフルエンザタンパク質の特性を改良するまたは変化させるための、タンパク質の操作、および組み換えDNA技術の公知の方法を使用することも含まれる。様々なタイプの突然変異誘発を、変異体HA、NA、および/またはM1分子を生産しそして/または単離するために、ならびに/あるいは、本発明のポリペプチドを改良する/変異させるために使用することができる。これらには、部位特異的、ランダムな点変異、相同組み換え(DNAシャッフリング)、ウラシルが含まれている鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップが入れられた二本鎖のDNAを使用する突然変異誘発などが含まれるが、これらに限定はされない。さらに別の適切な方法としては、点不適合の修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異、遺伝子合成全体による突然変異誘発、二本鎖の断裂の修復などが挙げられる。突然変異誘発(例えば、キメラ構築物が含まれる)もまた、本発明に含まれる。1つの実施形態においては、突然変異誘発は、自然界に存在している分子、または変化させられたかもしくは突然変異させられた自然界に存在している分子の公知の情報(例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造など)によって導かれ得る。
本発明にはさらに、実質的な生物学的活性を示す(例えば、VLP上でまたはVLPの中で発現された場合に有効な抗体応答を誘発することができる)インフルエンザタンパク質変異体が含まれる。そのような変異体には、活性に対してはほとんど影響を及ぼさないように、当該分野で公知の一般的な規則にしたがって選択された欠失、挿入、反転、反復、および置換が含まれる。
上記インフルエンザタンパク質のクローニング方法は当該分野で公知である。例えば、特異的なインフルエンザタンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子は、インフルエンザウイルスに感染させられた細胞から抽出されたポリアデニル化mRNAからのRT−PCRによって単離することができる。得られる産物である遺伝子は、ベクターの中にDNA挿入断片としてクローニングすることができる。用語「ベクター」は、それによって核酸を生物、細胞、または細胞性の成分の間で増幅させることができ、そして/また導入することができる手段を意味する。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられ、これらは自律複製するか、または宿主細胞の染色体の中に組み入ることができる。ベクターはまた、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖の中にDNAとRNAの両方が含まれているポリヌクレオチド、ポリリジン結合DNAまたはRNA、ペプチド結合DNAまたはRNA、リポソーム結合DNAなどでもあり得、これらは自律複製しない。多くの(しかし全てではない)一般的な実施形態においては、本発明のベクターはプラスミドまたはバックミド(bacmid)である。
したがって、本発明にはVLPの形成を誘導する細胞の中で発現させることができる発現ベクターにクローニングされた、HA、NA、および/またはM1インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。「発現ベクター」は、さらには、その中に取り込まれている核酸の発現、さらには複製を促進させることができるプラスミドのようなベクターである。通常、発現させられる核酸は、プロモーターおよび/またはエンハンサーに「動作可能であるように連結」されており、そして、プロモーターおよび/またはエンハンサーによる転写の調節が制御される。1つの実施形態においては、トリインフルエンザウイルス、世界的に流行するインフルエンザウイルス、および/または季節的なインフルエンザウイルスに由来するHAをコードする上記ヌクレオチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16からなる群より選択される。別の実施形態においては、トリインフルエンザウイルス、世界的に流行するインフルエンザウイルス、および/または季節的なインフルエンザウイルスに由来するNAをコードする上記ヌクレオチドは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、およびN9からなる群より選択される。別の実施形態においては、上記ベクターには、HA、NA、およびM1インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターは、HA、NA、およびM1インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドからなる。好ましい発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。上記インフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドがクローニングされた後、上記ヌクレオチドをさらに操作することができる。例えば、当業者は、変異体が生じるようにコード領域の中の特異的な塩基を変異させることができる。変異体には、コード領域の中に、非コード領域の中に、またはそれらの両方の中に変化が含まれる。そのような変異体は、インフルエンザタンパク質の免疫原性を高める場合があり、また、タンパク質もしくはRNAからスプライシング部位を除去する場合もある。例えば、1つの実施形態においては、インフルエンザMタンパク質(全長)上にあるスプライシングドナー部位およびスプライシングアクセプター部位は、M1およびM2転写物の中でのM mRNAのスプライシングを防ぐように変異させられる。別の実施形態においては、HAは切断部位を除去するかまたは変異させるように操作される。例えば、野生型H5 HAは、複数の塩基性アミノ酸(RRRKR)が含まれている切断部位を有する。この野生型配列は、HAを、宿主の中に存在し得る複数の偏在するプロテアーゼに対して、またはシステムの発現をこれらのHAに対してより敏感にする。1つの実施形態においては、これらのアミノ酸を除去することによって、様々なプロテアーゼに対するHAの感度を下げることができる。別の実施形態においては、切断部位は、切断部位を除去するように変異させる(例えば、RESRに変異させる)ことができる。
本発明ではまた、NA、HA、およびM1をコードする核酸およびポリペプチドも利用される。1つの実施形態においては、インフルエンザNA核酸またはタンパク質は、配列番号1、11、31、32、39、38、46、47、54、または55に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。別の実施形態においては、インフルエンザHA核酸またはタンパク質は、配列番号2、10、56、57、58、27、28、29、30、37、36、33、34、35、42、43、44、45、50、51、52、または53に対して、少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。別の実施形態においては、インフルエンザM1核酸またはタンパク質は、配列番号12、40、41、48、または49に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。
いくつかの実施形態においては、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるタンパク質の特性または活性を変化させることのない変化が含まれている変異、ならびにタンパク質を作成する方法が開示される。様々な理由からヌクレオチド変異体が生産され得る(例えば、特定の宿主についてコドンの発現を最適化させるため(ヒトmRNAのコドンがSf9細胞のような昆虫細胞に好ましいコドンに変化させられる))。米国特許公開番号2005/0118191(全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる)を参照のこと。本発明の最適化されたコドン配列の例は以下に開示される(例えば、配列番号42、44、46、48、51、および54を参照のこと)。
加えて、ヌクレオチドは、正確なコード領域がクローニングされ、そしていずれの望ましくない変異も含まれないことを確実にするために、配列決定され得る。ヌクレオチドは、任意の細胞の中での発現のために発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)にサブクローニングされ得る。上記は、インフルエンザウイルスタンパク質をクローニングすることができる方法の一例にすぎない。当業者は、さらに別の方法を利用することができ、それらが可能であることを理解している。
本発明によってはまた、NA、M1、および/またはHAを含むインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードする、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なヌクレオチドが含まれている構築物ならびに/あるいはベクターも提供される。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。NA、M1、および/またはHAを含む、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードする構築物ならびに/あるいはベクターは、適切なプロモーター(例えば、AcMNPVポリヘドリンプロモーター(または他のバキュロウイルス)、ファージλPLプロモーター、E.coli lac、phoA、およびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびに、レトロウイルスLTRのプロモーターが限定ではない例である)に動作可能であるように連結されなければならない。他の適切なプロモーターは、所望される宿主細胞および/または所望される発現速度に応じて、当業者に公知であろう。発現構築物にはさらに、転写開始、終結のための複数の部位、ならびに、転写される領域の中に、翻訳のためのリボソーム結合部位が含まれるであろう。構築物によって発現させられた転写物のコード部分には、好ましくは、開始部位の翻訳開始コドンと、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終結コドンが含まれるであろう。
発現ベクターには、好ましくは、少なくとも1つの選択マーカーが含まれるであろう。そのようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核生物細胞の培養のためのG418もしくはネオマイシン耐性、ならびに、E.coliおよび他の細菌の中での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。中でも好ましいベクターは、ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ニワトリポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど)、アデノウイルス(例えば、イヌアデノウイルス)、ヘルペスウイルス、ならびにレトロウイルス)である。本発明とともに使用することができる他のベクターには、細菌の中で使用されるベクターが含まれる。これには、pQE70、pQE60、およびpQE−9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5が含まれる。中でも好ましい真核生物ベクターは、pFastBac1 pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLである。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかであろう。1つの実施形態においては、HA、M1、および/またはNAを含む、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードするヌクレオチドが含まれている上記ベクターは、pFastBacである。別の実施形態においては、HA、M1、および/またはNAを含む、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なインフルエンザウイルス構造遺伝子をコードするヌクレオチドからなる挿入断片が含まれている上記ベクターは、pFastBacである。
次に、組み換え体ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトされる、感染させられる、または形質転換され得る。したがって、本発明により、HA、M1、および/またはNAをコードし、VLPを形成させることができる条件下で上記宿主細胞中でHA、M1、および/またはNAを発現することができる核酸が含まれているベクター(単数または複数)が含まれている宿主細胞が提供される。
1つの実施形態においては、上記組み換え体構築物は、真核生物および/または原核生物細胞をトランスフェクトする、感染させる、もしくは形質転換するために使用することができ、そしてそれらの中でHA、NA、およびM1インフルエンザタンパク質を発現することができる。中でも、真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫、トリ、植物、C.elegans(すなわち、線虫)、および哺乳動物の宿主細胞である。昆虫細胞の限定ではない例は、Spodoptera frugiperda(Sf)細胞(例えば、Sf9、Sf21)、Trichoplusia ni細胞(例えば、High Five細胞)、ならびにDrosophila S2細胞である。真菌(酵母が含まれる)宿主細胞の例は、S.cerevisiae、Kluyveromyces lactis(K.lactis)、Candidaの種(C.albicansおよびC.glabrataが含まれる)、Aspergillus nidulans、Shizosaccharomyces pombe(S.pombe)、Pichia pastoris、ならびにYarrowia lipolyticaである。哺乳動物細胞の例は、COS細胞、べビーハムスター腎臓細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、およびアフリカミドリザル細胞、CV1細胞、HeLa細胞、MDCK細胞、Vero細胞、およびHep−2細胞である。アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵巣細胞または両生類起源の他の細胞もまた、使用され得る。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、E.coli、B.subtilis、およびマイコバクテリウムが挙げられる。
ベクター(例えば、HA、NA、および/またはM1ポリヌクレオチドが含まれているベクター)は、当該分野で周知の方法にしたがって宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、真核生物細胞の中への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションによって行うことができる。1つの実施形態においては、上記ベクターは、組み換え体バキュロウイルスである。別の実施形態においては、上記組み換え体バキュロウイルスは、真核生物細胞の中にトランスフェクトされる。好ましい実施形態においては、上記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態においては、上記昆虫細胞はSf9細胞である。
別の実施形態においては、上記ベクターおよび/または宿主細胞には、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16からなる群より選択される、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なインフルエンザウイルスHAタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび/または宿主細胞には、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、およびN9からなる群より選択されるNAタンパク質をコードするヌクレオチドが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび/または宿主細胞には、インフルエンザHA、M1、および/またはNAが含まれる。別の実施形態においては、上記ベクターおよび/または宿主細胞は、原則として、HA、M1、および/またはNAから構成される。さらなる実施形態においては、上記ベクターおよび/または宿主細胞は、HA、M1、およびNAを含むインフルエンザタンパク質からなる。これらのベクターおよび/または宿主細胞には、HA、NA、およびM1が含まれ、そしてこれには、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、上記ヌクレオチドは、VLPの表面上に発現された場合には、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性をそれぞれ示す、HAおよび/またはNAをコードする。
本発明によってはまた、VLPの生産効率を高めるであろう構築物および方法も提供される。例えば、タンパク質の発現を増大させるためのタンパク質からの切断部位の除去である(上記を参照のこと)。他の方法には、より効率的な輸送のための、HA、NA、および/またはM1タンパク質に対するリーダー配列の付加が含まれる。例えば、異種シグナル配列を、HA、NA,および/またはM1インフルエンザタンパク質に融合させることができる。1つの実施形態においては、シグナル配列は昆虫細胞の遺伝子から導くことができ、そして(昆虫細胞の中での発現のために)インフルエンザHAタンパク質に融合させることができる。別の実施形態においては、シグナルペプチドはキチナーゼシグナル配列であり、これは、バキュロウイルス発現システムにおいて効率よく役割を果たす。他の実施態様においては、複数のインフルエンザタンパク質の間の交換(interchanging)リーダー配列によって、より良好なタンパク質の輸送が提供され得る。例えば、H5ヘマグルチニンが、粒子の表面への輸送については効率が悪いことが示されている。しかし、H9ヘマグルチニンは表面を標的化し、より効率よく表面に組み込まれる。したがって、1つの実施形態においては、H9リーダー配列がH5タンパク質に融合させられる。
VLPの生産効率を高めるための別の方法は、特異的な細胞のタイプのHA、NA、および/またはM1タンパク質をコードするヌクレオチドをコドン最適化することである。例えば、Sf9細胞中での発現のための核酸のコドン最適化である(米国特許公開番号2005/0118191(全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる)を参照のこと)。Sf9細胞について最適化させられたコドン配列の例が以下に開示される(例えば、配列番号42、44、46、48、50、52、および54)。1つの実施形態においては、コドンが最適化されたインフルエンザタンパク質の核酸配列は、配列番号42、44、46、48、50、52、および54のいずれか1つに対して、少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%である。
本発明によってはまた、VLPを生産する方法も提供される。上記方法には、VLPの形成を可能にする条件下での、トリ、世界的に流行する、および/または季節的なインフルエンザタンパク質を発現させる工程が含まれる。選択された発現システムおよび宿主細胞に応じて、VLPは、組み換えタンパク質が発現させられ、そしてVLPが形成される条件下で、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を増殖させることによって生産される。適切な増殖条件の選択は、当業者の能力の範囲内である。
本発明のVLPを生産するように操作された細胞を増殖させるための方法としては、バッチ、フェドバッチ(batch−fed)、連続、および潅流細胞培養技術が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞培養は、バイオリアクター(醗酵チャンバー)の中での細胞の増殖および拡大を意味し、ここで、細胞が増殖し、精製および単離されるタンパク質(例えば、組み換え体タンパク質)が発現させられる。通常、細胞培養は、バイオリアクターの中で、滅菌状態、管理された温度および空気圧条件下で行われる。バイオリアクターは、その中の環境条件(例えば、温度、空気圧、攪拌、および/またはpH)をモニターすることができる、細胞を培養するために使用されるチャンバーである。1つの実施形態においては、上記バイオリアクターは滅菌の鋼鉄製のチャンバーである。別の実施形態においては、上記バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ(例えば、Cellbag(登録商標)、Wave Biotech,Bridgewater,NJ)である。他の実施形態においては、上記予め滅菌されたプラスチックバッグは、約50Lから1000Lのバッグである。
その後、VLPは、その完全性を保つ方法(例えば、勾配遠心分離(例えば、塩化セシウム、スクロース、およびイオジキサノール)ならびに標準的な精製技術(例えば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれる)を使用して単離される。
以下は、本発明のVLPを作成し、単離し、そして精製することができる方法の一例である。通常、VLPは、上記細胞が細胞培養物の中で増殖させられる(上記を参照のこと)と、VLPを作成するように操作された組み換え体細胞株から生産される。VLPの生産は、図26に示される反応図式によって行われ得る。当業者は、本発明のVLPを作成し、そして精製するために利用することができるさらに別の方法が存在することを理解するであろう。したがって、本発明は記載される方法に限定されない。
本発明のVLPの生産は、Sf9細胞(感染させられていない)を震盪フラスコの中に播種することによって開始することができる。これによって、細胞は拡大させられ、そして細胞増殖および複製するにつれてスケールアップ(例えば、125mlのフラスコから50LのWaveバッグへと)することができる。細胞を増殖させるために使用される培地は、適切な細胞株用に策定される(好ましくは、無血清培地、例えば、昆虫培地ExCell−420、JRH)。次に、上記細胞が、組み換え体バキュロウイルスで最も効率のよい感染多重度で感染させられる(例えば、1つの細胞あたり約1から約3プラーク形成単位)。一旦感染が起こると、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質がウイルスゲノムから発現され、VLPへと自己アセンブリし、そして感染後およそ24から72時間で細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が対数増殖中期にある(4〜8×106細胞/ml)ときに最も効率が高く、そして少なくとも約90%が生存可能である。
本発明のVLPは、感染後およそ48から96時間で回収することができる。この時点では、細胞培養培地中でのVLPのレベルはほぼ最大であるが、多数の細胞が溶解する前である。回収時のSf9細胞の密度および生存性は、色素排除試験によって示されるように、約0.5×106細胞/mlから約1.5×106細胞/mlで、少なくとも20%の生存性であり得る。次に、培地が取り出され、明澄化させられる。NaClを約0.4から約1.0Mの濃度で、好ましくは、約0.5Mの濃度で培地に添加して、VLPの凝集を避けることができる。本発明のVLPが含まれている細胞培養培地からの細胞および細胞破片の除去は、使い捨ての予め滅菌された中空繊維0.5または1.00μmのフィルターカートリッジまたは同様のデバイスを用いる接線流濾過(TFF)によって行うことができる。
次に、明澄化させられた培養培地中のVLPは、使い捨ての予め滅菌された500,000分子量カットオフ中空繊維フィルターカートリッジを使用して、限外濾過によって濃縮することができる。濃縮されたVLPは、10倍量の、0.5MのNaClが含まれているpH7.0から8.0のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析して、残留している培地成分を除去することができる。
濃縮され、透析されたVLPは、さらに、0.5MのNaClを含むpH7.2のPBS緩衝液中の20%から60%の不連続なスクロース勾配上で、約4℃から10℃で18時間、6,500×gでの遠心分離によって精製することができる。通常、VLPは、約30%から約40%のスクロースの間、または勾配から回収しそして保存することができる界面(20%および60%の段階の勾配において)に、際立った見ることができるバンドを形成するであろう。この生成物は、精製プロセスの次の工程のための準備において、200mMのNaClを含むように希釈することができる。この生成物にVLPが含まれており、これには、完全なバキュロウイする粒子が含まれ得る。
VLPのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、または44%の等密度スクロースクッション遠心分離によって行うことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、スクロース勾配による試料(上記を参照のこと)が、陰イオンを含む媒体が含まれているカラム(例えば、Matrix Fractogel EMD TMAE)にロードされ、そして塩勾配(約0.2Mから約1.0MのNaCl)によって溶出させられる。これによりVLPを他の混入物質(例えば、バキュロウイルスおよびDNA/RNA)から分離することができる。スクロースクション法においては、VLPが含まれている試料が44%のスクロースクッションに添加され、30,000gで約18時間遠心分離される。VLPは44%スクロースの最上部にバンドを形成し、一方、バキュロウイルスは底に沈殿し、他の混入しているタンパク質は上部の0%スクロースの層に残る。VLPのピークまたはバンドが回収される。
完全なバキュロウイルスは、所望される場合には不活化させることができる。不活化は、化学的方法(例えば、ホルマリンまたはβ−プロピルラクトン(BPL))によって行うことができる。完全なバキュロウイルスの除去および/または不活化はまた、主に、上記で説明されたような当該分野で公知の選択的沈殿およびクロマトグラフィー方法を使用して行うこともできる。不活化方法には、VLPが含まれている試料を0.2%のBPLの中で、約25℃から約27℃で3時間インキュベートする工程が含まれる。バキュロウイルスは、VLPが含まれている試料を0.05%のBPLとともに4℃で3日間インキュベートし、その後、37℃で1時間インキュベートすることによっても不活化させることができる。
不活化/除去工程の後、VLPが含まれている生成物については、不活化工程による任意の試薬および/または全ての残留しているスクロースを除去し、そして所望される緩衝液(例えば、PBS)の中にVLPを入れるための、さらなる透析工程を行うことができる。VLPが含まれている溶液は当該分野で公知の方法(例えば、滅菌濾過)によって滅菌することができ、そして、冷蔵庫または冷凍庫で保存することができる。
上記技術は、様々な規模で行うことができる。例えば、Tフラスコ、震盪フラスコ、スピナーボトル(spinner bottle)、産業的規模のバイオリアクターまでである。バイオリアクターには、鋼鉄製のタンクまたは予め滅菌されたプラスチックバッグ(例えば、Wave Biotech,Bridgewater,NJによって販売されているシステム)のいずれかを含めることができる。当業者は、彼らの目的に最も望ましいものを知っているであろう。
バキュロウイルス発現ベクターの増幅および生産、ならびに、組み換え体インフルエンザVLPを生産させるための組み換え体バキュロウイルスでの細胞の感染は、先に記載されたように、昆虫細胞(例えば、Sf9昆虫細胞)の中で行うことができる。好ましい実施形態においては、細胞は、インフルエンザVLPを生産するように操作された組み換え体バキュロウイルスに感染させられたSF9である。
薬学的処方物またはワクチン処方物、および投与
本明細書中で有用な薬学的組成物には、薬学的に許容される担体(任意の適切な希釈剤または賦形剤が含まれる)(これには、それ自体は組成物を投与される脊椎動物に対して有害な免疫応答の生産を誘導することはなく、そして、投与されても過度の毒性は伴わない任意の薬学的物質が含まれる)と本発明のVLPが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは、米国薬局方、欧州薬局方、または脊椎動物(およびより具体的には、ヒト)での使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御性の免疫応答を誘導するためのワクチンおよび/または抗原性組成物として有用であり得る。
本明細書中で有用な薬学的組成物には、薬学的に許容される担体(任意の適切な希釈剤または賦形剤が含まれる)(これには、それ自体は組成物を投与される脊椎動物に対して有害な免疫応答の生産を誘導することはなく、そして、投与されても過度の毒性は伴わない任意の薬学的物質が含まれる)と本発明のVLPが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは、米国薬局方、欧州薬局方、または脊椎動物(およびより具体的には、ヒト)での使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御性の免疫応答を誘導するためのワクチンおよび/または抗原性組成物として有用であり得る。
上記本発明の薬学的処方物には、インフルエンザM1、HA、および/またはNAタンパク質を含むVLPと、薬学的に許容される担体または賦形剤が含まれる。薬学的に許容される担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌の等張性の水性緩衝液、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。薬学的に許容される担体、希釈剤、および他の賦形剤についての十分な議論は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.,現行版)に示されている。処方物は、投与の態様に適していなければならない。好ましい実施形態においては、処方物はヒトへの投与に適しており、好ましくは、滅菌であり、微粒子状ではなく、そして/また非発熱性である。
所望される場合には、組成物にはまた、主要ではない量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含まれ得る。組成物は、固体の形態(例えば、再構成に適している凍結乾燥させられた粉末)、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放処方物、または散剤であり得る。経口処方物には、標準的な担体(例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム)が含まれ得る。
本発明によってはまた、本発明のワクチン処方物の成分のうちの1つ以上が充填された1つ以上の容器が含まれている、薬学的パックまたはキットも提供される。好ましい実施形態においては、キットには2つの容器が含まれ、一方にはVLPが含まれており、そして他方にアジュバントが含まれる。そのような容器(単数または複数)には、製造を規制する政府機関によって記載された形式で、薬学的製品または生物学的製品の使用または販売についての注意書きが伴う場合がある。この注意書きには、製造機関による承認、ヒトへの投与についての使用または販売が反映される。
本発明によってはまた、組成物の量が示されているアンプルまたは小袋のような、密封された容器の中にパッケージされたVLP処方物も提供される。1つの実施形態においては、VLP組成物は液体として、別の実施形態においては、密封された容器の中に乾燥している滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として提供され、そして、例えば、被験体への投与に適している濃縮物になるように、例えば、水または生理食塩水で再構成することができる。好ましくは、VLP組成物は、密封された容器の中の乾燥した滅菌の凍結乾燥粉末として、好ましい単位投与量で、約1μg、約5μg、約10μg、約20μg、約25μg、約30μg、約50μg、約100μg、約125μg、約150μg、または約200μgで提供される。あるいは、VLP組成物の単位投与量は、約1μg未満、例えば、約0.08μg、約0.04μg;約0.2μg、約0.4μg、約0.8μg、約0.5μgまたはそれ未満、約0.25μgまたはそれ未満、あるいは約0.1μgまたはそれ未満であるか、あるいは、約125μgより多い、例えば、約150μgまたはそれより多い、約250μgまたはそれより多い、または約500μgまたはそれより多い。これらの用量は、VLP全体として測定される場合も、また、HAのμgとして測定される場合もある。VLP組成物は、凍結乾燥させられた粉末から再構成された後、約12時間以内に、好ましくは約6時間以内に、約5時間以内に、約3時間以内に、または約1時間以内に投与されるべきである。
別の実施形態においては、VLP組成物は、VLP組成物の量および濃度が示されている密封された容器の中に液体形態で提供される。好ましくは、VLP組成物の液体形態は、少なくとも約50μg/ml、より好ましくは、少なくとも約100μg/ml、少なくとも約200μg/ml、少なくとも500μg/ml、または少なくとも1mg/mlで、密封された容器の中に提供される。
一般的には、本発明のインフルエンザVLPは、1つ以上のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を刺激するために効果的な量または十分な量(上記で定義された)で投与される。好ましくは、本発明のVLPの投与によって、少なくとも1つのインフルエンザウイルスに対する実質的な免疫力が誘発される。通常、用量は、年齢、健康状態、体重、性別、食事療法、投与のタイミング、および他の臨床的な要因に基づいてこの範囲内で調節することができる。予防用のワクチン処方物は、全身的に、例えば、注射針と注射器、または針のない注射用デバイスを使用して、皮下または筋肉内注射によって投与される。あるいは、ワクチン処方物は、鼻腔内に、点鼻薬、大きな粒子のエアゾール(約10ミクロンよりも大きい)、または上部呼吸管への噴霧のいずれかによって投与される。上記投与経路のいずれによっても免疫応答が生じるが、鼻腔内投与によっては、インフルエンザウイルスの侵入部位での粘膜免疫を誘発する付加的な利点が提供される。
したがって、本発明には、被験体に対してインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導するワクチンまたは抗原性組成物を処方する方法も含まれる。この方法には、上記処方物に有効用量のインフルエンザVLPを加える工程が含まれる。
1用量での実質的な免疫力の刺激が好ましいが、所望される効果を得るためにさらなる投与量を同じ経路または別の経路によって投与することができる。新生物および乳児においては、例えば、複数内の投与が十分なレベルの免疫力を誘発するために必要であり得る。投与は、インフルエンザ感染に対する十分なレベルの防御を維持するため必要に応じて、小児期の間に間隔をあけて継続して行われ得る。同様に、繰り返しのインフルエンザ感染または重篤なインフルエンザ感染に特にかかりやすい成人(例えば、医療従事者、デイケア従事者、低年齢の小児の家族のメンバー、高齢者、および心肺機能が低下している個体)には、防御免疫応答を確立し、そして/または維持するためには複数回の免疫化が必要であり得る。誘導される免疫力のレベルは、例えば、中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニターされ得、そして、所望される防御レベルを誘発し、そして維持するため必要に応じて、投与量が調節されるかまたはワクチン接種が繰り返され得る。
したがって、1つの実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPには、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1タンパク質が含まれる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、原則として、インフルエンザHA、NA、およびM1からなる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、インフルエンザHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザHA、NA、およびM1は、季節的なインフルエンザおよび/またはトリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施態様においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量の、インフルエンザタンパク質が含まれているインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパクからなる。これらのVLPにはHA、NA、およびM1が含まれ、そして、これには、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。別の実施形態においては、上記方法には、1用量の上記処方物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する工程が含まれる。別の実施形態においては、この方法には、複数回の用量で上記処方物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する工程が含まれる。
VLPが含まれている組成物(ワクチンおよび/または抗原性処方物)を投与する方法としては、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下)、硬膜外、および粘膜(例えば、鼻腔内および経口、または肺経路、または坐剤による)が挙げられるが、これらに限定はされない。特異的な実施形態においては、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物は、例えば、任意の通常の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜の内層(例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、子宮、膀胱、および腸粘膜など)を介する吸収によって投与することができ、そして、他の生物学的活性のある物質と一緒に投与することができる。いくつかの実施形態においては、本発明のVLPが含まれている組成物の鼻腔内または他の粘膜による投与経路によって、他の投与経路よりも実質的に高い抗体応答または他の免疫応答が誘導され得る。別の実施形態においては、本発明のVLPが含まれている組成物の鼻腔内または他の粘膜による投与経路によって、他のインフルエンザウイルス株に対する交差防御(cross protection)を誘導するであろう抗体応答または他の免疫応答が誘導され得る。投与は全身的であっても、また局所的であってもよい。
なお別の実施形態においては、ワクチンおよび/または抗原性処方物は、免疫化の部位で免疫応答を誘発するために粘膜組織を標的化する様式で投与される。例えば、粘膜組織(例えば、消化管関連リンパ系組織(GALT))は、特定の粘膜標的化特性を有しているアジュバントを含む組成物の経口投与を使用することによって、免疫化のために標的化され得る。さらに別の粘膜組織(例えば、鼻咽頭リンパ系組織(NALT)および気管支関連リンパ系組織(BALT))もまた標的化され得る。
本発明のワクチンおよび/または抗原性処方物はまた、投与スケジュールで、例えば、最初のワクチン組成物の投与と、それに続くブースター投与で投与される場合もある。特定の実施形態においては、組成物の第2の用量は、最初の投与後、2週間から1年、好ましくは、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約4ヶ月、約5ヶ月から約6ヶ月のいずれかの時点で投与される。加えて、3回目の用量が、2回目の投与後に、そして最初の投与後約3ヶ月から約2年、またはさらに長い間、好ましくは、約4ヶ月、約5ヶ月、または約6ヶ月、または約7ヶ月から約1年後に投与され得る。3回目の用量は、状況に応じて、2回目の用量の後、被験体の血清および/もしくは尿、または粘膜分泌物の中で特異的な免疫グロブリンがもはや検出されないか、低いレベルでしか検出されなくなった時点で投与される場合もある。好ましい実施形態においては、2回目の用量は1回目の投与の約1ヵ月後に投与され、そして3回目の用量は1回目の投与の約6ヵ月後に投与される。別の実施形態においては、2回目の用量は1回目の投与の約6ヵ月後に投与される。
別の実施形態においては、本発明の上記VLPは、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明のVLPは、他の免疫原性組成物および/または抗ウイルス剤(例えば、アマンタジン(Amantadine)、リマンタジン(Rimantadine)、ザナミビル(Zanamivir)およびオステルタミビル(Osteltamivir))と一緒に処方することができる。
薬学的処方物の投与量は、例えば、予防的な免疫応答または治療的な免疫応答を誘発するために有効な用量を(例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することによって、または血清試料、もしくは尿試料、もしくは粘膜分泌液中での抗体の阻害率を測定することによって)最初に同定することにより、当業者によって容易に決定することができる。上記投与量は、動物実験から決定することができる。インフルエンザウイルスを研究するために使用される動物の限定ではないリストには、モルモット、ゴールデンハムスター(Syrian hamster)、チンチラ、ハリネズミ、ニワトリ、ラット、マウス、およびフェレットが含まれる。ほとんどの動物は、自然界ではインフルエンザウイルスの宿主ではないが、それでも疾患の様々な態様の研究に役立ち得る。例えば、上記動物のうちの任意のものに、ワクチンの候補(例えば、本発明のVLP)を、誘導される免疫応答を部分的に特性決定するために、および/またはどの中和抗体が生産されるかを決定するために、投与することができる。例えば、多くの研究がマウスモデルにおいて行われている。なぜなら、マウスは大きさが小さく、そのコストが低いことによって研究者は大規模な実験を行うことができるからである。そうは言うものの、マウスの小さい大きさは疾患のあらゆる臨床的兆候の容易な観察の難しさをもまた増大させ、そしてマウスは、ヒトの疾患についての予測モデルではない。
ヒトインフルエンザウイルス感染およびその作用の経過の様々な態様を研究するためにはフェレットが広く使用されている。インフルエンザウイルスに対する免疫力についての現在の概念の多くの開発は、フェレットの使用なしには不可能である(Maherら、2004)。フェレットは、いくつかの理由からインフルエンザを研究するための優れたモデルであることが証明されている:フェレットでのインフルエンザ感染は、臨床的兆候、病因、および免疫力に関して、ヒトでの感染とよく似ている;ヒトのA型およびB型インフルエンザは、自然界でフェレットに感染し、したがって、その中で感染、疾病の伝染と、インフルエンザウイルスの糖タンパク質の中でのアミノ酸の配列バリエーションの間での相互作用が観察される、完全に制御された集団を実験するための機会が提供される;そして、フェレットは、それを疾患の発現を解析するための理想的なモデルとする他の身体特性を有している。例えば、フェレットとヒトは、宿主の年齢、ウイルスの株、環境条件、2回目の細菌感染の程度、および多くの他の変数に応じて見られる、インフルエンザ感染の極めて類似する臨床的兆候を示す。したがって、当業者は、上記に記載されたマウスまたは任意の他の動物モデルと比較して、フェレットモデルによるインフルエンザワクチンの効力および投与レジュメを、ヒトに対してより容易に相関させることができる。
加えて、ヒトについての好ましい有効用量を決定するためのヒトでの臨床試験を、当業者は行うことができる。そのような臨床試験は日常的に行われ、そして当該分野で周知である。使用される正確な用量は投与経路に応じて様々であろう。有効用量は、インビトロまたは動物試験システムから導かれる用量応答曲線から推定され得る。
これもまた当該分野で周知であるように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって高めることができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫力の全体的な増大を促進するように、経験的に使用されている(例えば、米国特許第4,877,611号)。免疫化プロトコールでは、長年にわたり応答を刺激するためにアジュバントが使用されており、そしてそのようなアジュバントは当業者には周知である。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンによって沈殿させられると高まる。抗原の乳化によっては、抗原の提示期間も長くなる。全ての目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み入れられるVogelら、「A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第2版)」に記載されている任意のアジュバントを含めることは、本発明の範囲において想定される。
例示的なアジュバントには、完全なフロイトのアジュバント(死滅させられたヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)が含まれている免疫応答の非特異的刺激因子)、不完全なフロイトのアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。他のアジュバントにはGMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物(例えば、thur−MDP、およびnor−MDP)、CGP(MTP−PE)、リピッドA(lipid A)、ならびに、モノホスホリルリピッドA(MPL)が含まれる。RIBI(これには、細菌から抽出された3つの成分:MPL、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)が2%のスクワレン/Tween 80エマルジョンの中に含まれている)もまた想定される。MF−59、Novasomes(登録商標)、MHC抗原もまた使用され得る。
本発明の1つの実施形態においては、アジュバントは、脂質二重層を含まない大きな不定形の中心孔の回りを取り囲む水層によって分けられた実質的に球形の殻の形態に配置された、約2から10個の二重層を有している寡層薄膜非リン脂質小胞体(paucilamellar lipid vesicle)である。寡層薄膜非リン脂質小胞体は、いくつかの方法で、非特異的刺激因子として、抗原についての担体として、さらに別のアジュバントの担体として、およびそれらの組み合わせで、免疫応答を刺激するように作用し得る。寡層薄膜非リン脂質小胞体は、例えば、抗原を予め形成させられた小胞と混合することによってワクチンが調製される場合には非特異的免疫刺激因子として作用し、その結果、抗原は、小胞に対して細胞外にとどまる。抗原を小胞の中心孔にカプセル化することによって、小胞は、免疫刺激因子としても、そして抗原のための担体としても作用する。別の実施形態においては、小胞は、主にリン脂質ではない小胞からなる。他の実施形態においては、小胞は、Novasomesである。Novasomes(登録商標)は、約100nmから約500nmの範囲の寡層薄膜非リン脂質小胞体である。これらには、Brij 72、コレステロール、オレイン酸、およびスクワレンが含まれる。Novasomesは、インフルエンザ抗原についての有効なアジュバントであることが示されている(全ての目的のためのそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる、米国特許第5,629,021号、同第6,387,373号、および同第4,911,928号を参照のこと)。
1つの態様においては、アジュバント効果は、リン酸緩衝化生理食塩水中で約0.05から約0.1%溶液として使用される、ミョウバンのような物質の使用によって得られる。あるいは、VLPは、約0.25%の溶液として使用される糖の合成ポリマー(Carbopol(登録商標))との混合物として作成することができる。いくつかのアジュバント(例えば、細菌から得られる特定の有機分子)は、抗原ではなくむしろ宿主に対して作用する。一例は、ムラミルジペプチド(N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン[MDP])、細菌のペプチドグリカンである。他の実施形態においては、ヘモシアニンおよびヘモエリスリンもまた、本発明のVLPとともに使用され得る。キーホールリンペット由来のヘモシアニン(KLH)の使用が、特定の実施形態においては好ましいが、他の軟体動物ならびに節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリスリンが使用される場合もある。
様々な多糖アジュバントもまた使用され得る。例えば、マウスの抗体応答に対する様々な肺炎球菌多糖アジュバントの使用が記載されている(Yinら、1989)。最適な応答を生じるか、またはそうでなければ抑制を生じない用量は、示されているように使用されるべきである(Yinら、1989)。多糖類のポリアミン変化が特に好ましく、例えば、キチンおよびキトサン(脱アセチル化キチンが含まれる)である。別の実施形態においては、ムラミルジペプチドの親水性二糖−三糖誘導体が、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成させられた人工のリポソームの中での使用について記載されている。
両親媒性の界面活性物質(例えば、サポニン、およびQS21(Cambridge Biotech)のような誘導体)は、本発明のVLPと共に使用されるアジュバントのなお別のグループを形成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤(Rabinovichら、1994)もまた使用され得る。オリゴヌクレオチドは、アジュバントの別の有用なグループである(Yamamotoら、1988)。Quil Aおよびレンチネン(lentinen)は、本発明の特定の実施形態において使用され得る他のアジュバントである。
アジュバントの別のグループは、解毒された内毒素であり、例えば、米国特許第4,866,034号の精製された解毒された内毒素である。これらの精製された解毒された内毒素は、脊椎動物においてアジュバント応答を生じさせることにおいて有効である。もちろん、解毒された内毒素は、マルチアジュバント処方物を調製するために他のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、解毒された内毒素のトレハロースジミコレートとの組み合わせが、米国特許第4,435,386号に記載されているように具体的に想定される。米国特許第4,436,727号、同第4,436,728号、および同第4,505,900号に記載されているように、解毒された内毒素の、細胞壁骨格(CWS)、またはCWSとトレハロースとの組み合わせにおいてそうであるように、解毒された内毒素のトレハロースジミコレートおよび内毒素の糖脂質との組み合わせもまた想定される(米国特許第4,505,899号)。解毒された内毒素が含まれていない、CWSとトレハロースジミコレートだけの組み合わせもまた、米国特許第4,520,019号に記載されているように、有用であると想定される。
当業者は、本発明にしたがってワクチンに組み合わせることができる様々な種類のアジュバントを知っているであろう。そしてこれらには、アルキルリソホスフィリピッド(alkyl lysophosphilipid)(ALP);BCG、およびビオチン(ビオチニル化された誘導体が含まれる)などが含まれる。使用が具体的に想定される特定のアジュバントは、グラム細胞(Gram−cell)に由来するテイコ酸である。これらには、リポテイコ酸(LTA)、リビトールテイコ酸(RTA)、およびグリセロールテイコ酸(GTA)が含まれる。それらの合成の対応物の活性な形態もまた、本発明と組み合わせて使用され得る(Takadaら、1995)。
様々なアジュバント(さらには、ヒトにおいては一般的には使用されないものも)もなお、例えば、抗体を惹起させること、または続いて活性化T細胞を得ることが所望される場合には、他の脊椎動物において使用される場合がある。アジュバントまたは細胞のいずれかによって生じ得る(例えば、照射されていない腫瘍細胞を使用することによって起こり得る)、毒性または他の有害な作用は、そのような状況においては不適切である。
免疫応答を誘導する別の方法は、「免疫促進剤」と共に本発明のVLPを処方することによって行うことができる。これらは、免疫系の応答を増大させるための体自身の化学的伝達物質(サイトカイン)である。免疫促進剤としては、免疫賦活活性、免疫増強活性、およびプロ炎症活性を有している様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン(例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−12、IL−13);成長因子(例えば、顆粒球−マクロファージ(GM)コロニー刺激因子(CSF));ならびに、他の免疫賦活分子(例えば、マクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2など)が挙げられるが、これらに限定はされない。免疫促進剤分子は、インフルエンザVLPと同じ処方物の中で投与することができ、また、別々に投与することもできる。タンパク質、またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを、免疫賦活効果を生じるように投与することができる。
インフルエンザに対する免疫応答を刺激する方法
本発明のVLPは、インフルエンザウイルスに対する免疫力または実質的な免疫力を付与する免疫応答を刺激する組成物を調製するために有用である。粘膜免疫および細胞性の免疫のいずれもが、インフルエンザ感染および疾患に対する免疫力に寄与し得る。上部呼吸管に局所的に分泌される抗体は、自然な感染に対する抵抗力の主要な要因である。分泌型の免疫グロブリンA(sIgA)は、上部呼吸管の防御に、そして血清IgGは下部呼吸管の防御に関与している。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルスへの再感染、または抗原的に類似しているウイルス株への再感染を防御する。インフルエンザウイルスは、頻繁に、そして予想できない変化を受ける;したがって、自然な感染後には、宿主の免疫力によって提供された防御の有効期間は、社会に流行する新しいウイルス株に対してはわずかに数年間しかない。
本発明のVLPは、インフルエンザウイルスに対する免疫力または実質的な免疫力を付与する免疫応答を刺激する組成物を調製するために有用である。粘膜免疫および細胞性の免疫のいずれもが、インフルエンザ感染および疾患に対する免疫力に寄与し得る。上部呼吸管に局所的に分泌される抗体は、自然な感染に対する抵抗力の主要な要因である。分泌型の免疫グロブリンA(sIgA)は、上部呼吸管の防御に、そして血清IgGは下部呼吸管の防御に関与している。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルスへの再感染、または抗原的に類似しているウイルス株への再感染を防御する。インフルエンザウイルスは、頻繁に、そして予想できない変化を受ける;したがって、自然な感染後には、宿主の免疫力によって提供された防御の有効期間は、社会に流行する新しいウイルス株に対してはわずかに数年間しかない。
本発明のVLPは、脊椎動物(例えば、ヒト)に投与された場合には、上記脊椎動物において実質的な免疫力を誘導することができる。実質的な免疫力は、本発明のインフルエンザVLPに対する免疫応答によって生じ、これは、上記脊椎動物におけるインフルエンザ感染を防御もしくは緩和する、またはインフルエンザウイルス感染の症状を少なくとも症状を軽減する。いくつかの例においては、上記脊椎動物が感染しても、上記感染は無症候性である。応答は、完全には防御性の応答ではない場合がある。この場合、上記脊椎動物がインフルエンザウイルスに感染すると、脊椎動物は、免疫化されていない脊椎動物と比較すると、軽い症状または短い症状の期間を経験するであろう。
1つの実施形態においては、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、上記実質的な免疫力の誘導によってインフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPには、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1タンパク質が含まれる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、原則として、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1からなる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
最近、世界的流行を起こす可能性があるトリインフルエンザウイルスに対するワクチンをつくる努力が行われている。この理由は、多数のトリインフルエンザが種のバリアを飛び越えて、ヒトに直接感染して疾病を生じ、いくつかの症例では死亡しているからである。これらのウイルスは、H5N1、H9N2、およびH9N1である(Coxら、2004)。最近の実験では、ワクチンとして不活化させられたH5N1インフルエンザウイルスを使用する可能性が試験された。ワクチンの処方は、現在販売が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様であった。不活化H5N1ウイルスを使用して行われた実験では、ヒトにおいては免疫応答が誘導されたが、投与された用量が非常に多かった(認可されているワクチンの15μgと比較して、90μgのトリインフルエンザ)(Treanorら、2006)。トリインフルエンザ抗原についてのこの量の多さは、全世界でのワクチン接種キャンペーンのためには非現実的である。以下に説明されるように、本発明のVLPは、脊椎動物に投与されると、上記脊椎動物において免疫応答を誘導する。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のトリインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、上記実質的な免疫力の誘導によってインフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、上記免疫力の誘導は、本発明のVLPの中で少なくとも0.2μgのトリHAを投与することによる。別の実施形態においては、上記免疫力の誘導は、本発明のVLPの中で約0.2μgのトリHAから約15μgのHAを投与することによる。投与は、1回以上の用量で行われ得るが、1用量で行われることが有利であり得る。別の実施形態においては、上記VLPのトリHAは、トリインフルエンザH5N1に由来する。
別の実施形態においては、本発明には、被験体においてトリインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のトリインフルエンザVLPを投与する工程が含まれ、ここでは、上記VLPには、トリインフルエンザHA、NA、およびM1が含まれる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザVLPにはトリインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記トリインフルエンザタンパク質はHA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてトリインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する上記方法には、少なくとも1有効用量のトリインフルエンザVLPを投与する工程が含まれ、ここでは、上記VLPは、原則として、トリインフルエンザHA、NA、およびM1からなる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、インフルエンザHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザHAおよびNAは、それぞれ、H5N1である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザHAおよびNAは、それぞれ、H9N2である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザHAおよびNAは、それぞれ、H7N7である。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザHAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
別の実施形態においては、上記トリインフルエンザVLPによっては、脊椎動物において免疫応答が誘導されるであろう。これは、現在販売が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様に処方された類似するトリインフルエンザ抗原よりも、約2倍、約4倍、約8倍、約16倍、約32倍、約64倍、約128倍大きく強力(またはより高く強力)である。現在の処方物には、完全な不活化ウイルスワクチン(例えば、ホルムアルデヒド処理されたもの)、ウイルス成分ワクチン(化学的に破壊させられたもの)、およびサブユニットワクチン(精製された糖タンパク質)が含まれる。ワクチンの効力を決定するための方法は当該分野で公知であり、日常的に行われている。例えば、中和試験(microneutralization assay)およびヘマグルチニン阻害試験を、現在製造が認可されている承認されている不活化ワクチンと同様に処方されたトリインフルエンザ抗原と比較して、トリVLPワクチンの効力を決定するために行うことができる。1つの実施形態においては、効力における上記増大は、約0.2μg、約0.4μg、約0.6μg、約0.8μg、約1μg、約2μg、約3μg、約4μg、約5μg、約6μg、約7μg、約9μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約35μg、40μg、約45μg、約50μg、またはそれ以上のVLPと、現在販売が認可されている不活化ワクチンと同様に処方された抗原が脊椎動物に投与された場合(すなわち、認可されている不活化ワクチンおよび/または任意の他の抗原と同様に処方された等量のHAおよび/またはNAが含まれている、VLP中の等量のHAおよび/またはNA)に、実現される。量は、HA含有量にしたがって測定することができる。例えば、1μgの本発明のVLPは、HAが含まれているVLPの溶液中の約1μgのHAであるか、またはVLPの重量から測定され得る。
季節的なインフルエンザワクチンは、各年のインフルエンザの症例の罹患率を低下させるために、毎年ヒトに投与される。現在は、米国で流行しているものは、A型インフルエンザとB型インフルエンザの2つのサブタイプがある。したがって、現在のワクチンは、現在流行している株に対する防御を提供するための、3価のものである。毎年、インフルエンザウイルスのさまざまな株またはバリエーションが変化する。したがって、ほとんどの年について、新しいワクチン組成物が製造され、投与される。不活化ワクチンは、孵化鶏卵の中でのウイルスの増殖によって生産される。尿膜腔液が回収され、そしてウイルスが濃縮され、精製され、そして不活化される。したがって、現在認可されているインフルエンザウイルスワクチンには、残留している卵タンパク質が微量含まれる可能性があり、したがって、卵に対するアナフィラキシー性の過敏症を有しているヒトには投与されるべきではない。加えて、卵の供給業者が組織化されていなければならず、ワクチンの生産のための株は、次のインフルエンザの季節より数ヶ月前に選択されなければならず、それにより、このアプローチの柔軟性が制限され、多くの場合には、生産と流通に遅れおよび不足が生じる。加えて、いくつかのインフルエンザ株は、孵化鶏卵の中では十分には複製せず、これにより、増殖させ、ワクチンに処方することができるインフルエンザ株が制限され得る。
上記のように、本発明のVLPには、生産のためには卵は必要ない。これらのVLPは細胞培養システムによって作成される。したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量の季節的なインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。上記で議論されたように、季節的なインフルエンザウイルスは、世界中のNational Influenza Centerによる疫学的調査に基づいて所定のインフルエンザの季節についてヒトの集団の中で流行する(pass)と決定されたインフルエンザウイルス株を意味する。上記研究、およびいくつかの単離されたインフルエンザウイルスは、詳細な試験のために4つのWorld Health Organization(WHO)参照試験所(そのうちの1つは、AtlantaのCanters for Disease Control and Prevention(CDC)にある)のうちの1つに送られる。これらの試験所では、現在のワクチンに対して作成された抗体が流行しているウイルスおよび新規のfluウイルスに対してどの程度十分に反応するかが試験される。この情報は、flu活性についての情報とともにまとめられ、そして米国食品医薬品局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)の諮問委員会と、WHO会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのfluワクチンに入れられる3種類のウイルス(A型インフルエンザウイルスの2つのサブタイプとB型インフルエンザウイルスの1つのサブタイプ)の選択が行われる。選択は、北半球では2月に、南半球では9月に行われる。通常、ワクチンの中の3種類の株のうちの1つまたは2つは毎年変えられる。別の実施形態においては、実質的な免疫力の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。
別の実施形態においては、本発明には、被験体において季節的なインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量の季節的なインフルエンザのVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPには、季節的なインフルエンザのHA、NA、およびM1が含まれる。別の実施形態においては、上記季節的なインフルエンザVLPには季節的なインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質はHA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、被験体において季節的なインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する上記方法には、少なくとも1有効用量の季節的なインフルエンザVLPを投与する工程が含まれ、ここでは、上記VLPは、原則として、季節的なインフルエンザのHA、NA、およびM1からなる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、季節的なインフルエンザHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記トリインフルエンザHAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
一般的には、本発明の季節的なインフルエンザVLPは、1種類以上の季節的なインフルエンザウイルス株に対する実質的な免疫力を刺激するために十分な量で投与される。1つの実施形態においては、VLPは、異なるインフルエンザサブタイプのタンパク質(上記に列挙される)が含まれている他のVLPと一緒に混合される。別の実施形態においては、処方物は、少なくとも2種類のA型インフルエンザサブタイプおよび/または少なくとも1種類のB型インフルエンザサブタイプに由来する、季節的なインフルエンザHAおよび/またはNAタンパク質とのVLPの混合物が含まれている3価の処方物である。別の実施形態においては、上記B型のサブタイプは、上記と同じ方法で生産される。別の実施形態においては、多価の処方物には、上記のように、本発明の1種類以上のVLPが含まれる。
別の実施形態においては、本発明のVLP(トリVLPまたは季節的なVLP)は、1種類以上のインフルエンザウイルス株に対する防御を提供するであろう免疫応答を誘発し得る。特定のサブグループの特定の株から構築されたインフルエンザVLPでの脊椎動物のこの交差防御は、様々な株および/またはサブグループのインフルエンザウイルスに対する交差防御を誘導するであろう。以下の例は、本発明のVLPが様々な株および/またはサブグループとの交差反応を誘導できることを示している。
体液性の免疫系によっては、様々なインフルエンザ抗原に対する抗体が生産される。そのうち、HA特異的抗体は、ウイルスの中和、ひいては疾病の予防に最も重要である。NA特異的抗体は、感染の予防においては効果が低いが、これらは、感染した細胞からのウイルスの放出を少なくする。粘膜組織は、インフルエンザを含む多くの病原体の主要な侵入口であり、そして、粘膜の免疫系によっては、先天性免疫とは異なる、感染に対する第1線の防御が提供される。SIgAは、そしてIgMはある程度は、病原体の侵入を防ぐ粘膜の病原体に対する主要な中和抗体であり、ウイルスの複製を阻害するように細胞内で機能することができる。鼻汁には、特に、インフルエンザHAおよびNAに対する中和抗体が含まれる。これらは主にIgAイソ型であり、局所的に生産される。最初の感染の際には、HAに特異的な全部で3種類の主要なIgクラス(IgG、IgA、およびIgM)が、酵素結合免疫吸着アッセイによって、鼻洗浄液の中で検出され得るが、IgAおよびIgMが、IgGよりも頻繁に検出される。IgA、およびいくらかであるがIgMも、局所的に活発に分泌され、一方、IgGは血清分泌物に由来する。局所的なIgA応答を有している被験体においては、血清IgA応答もまた観察される。自然な感染によって刺激された局所的なIgA応答は、少なくとも3〜5ヶ月間持続し、そしてインフルエンザ特異的であるIgA前駆メモリー細胞(IgA−committed memory cell)は局所的に検出され得る。IgAもまた、二次感染後の局所分泌液において優性なIgイソ型であり、IgA応答がその後の感染の際に血清中で検出される。生存しているウイルスワクチンによって誘導された局所的に生産された中和抗体の存在は、野生型ウイルスでのチャレンジ後の感染および疾病に対する抵抗力と相関する。
インフルエンザ感染または疾病に対する抵抗力は、HAおよびNAに対する局所および/または血清抗体のレベルと相関する。血清抗HA抗体は、インフルエンザに対する防御についての最も一般的に測定される相関関係があるものである(Coxら、1999)。防御性の血清抗体(ヘマグルチニン阻害(HI)力価≧40)応答は、自然なインフルエンザ感染後に、被験体のうちのおよそ80%において検出することができる。3種類の主要なIgクラスを全て生産するB細胞は、正常な被験体においては末梢血の中に存在し(Coxら、1994)、そしてインフルエンザに感染した個体においても末梢血の中に存在する。ヒトにおいては、血清抗体は、インフルエンザ感染に対する抵抗力、およびインフルエンザ感染からの回復のいずれにおいても役割を担っている。ヒトにおけるHAおよびNAに対する血清抗体のレベルは、実験による感染後、および自然な感染後の疾病に対する抵抗力と相関関係にあり得る。最初の感染の際には、3種類の主要なIgクラスが10〜14日以内に検出され得る。IgAおよびIgMレベルは2週間後にピークとなり、その後、低下し始める。一方、IgGのレベルは4〜6週間でピークとなる。IgGおよびIgMは、初回応答において優性であり、IgGとIgAは二次免疫応答において優性である。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、実質的な防御抗体応答の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPには、インフルエンザウイルスHA、NA、およびM1タンパク質が含まれる。
別の実施形態においては、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な防御抗体応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、原則として、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、原則として、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、これには、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、インフルエンザHA、NA、およびM1からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザHA、NA、およびM1は、季節的なインフルエンザおよび/またはトリインフルエンザに由来する。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
本明細書中で使用される場合は、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に、あるいは部分的にコードされる1つ以上のポリペプチドが含まれているタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位には四量体が含まれる。個々の四量体は、2つの同じポリペプチド鎖の対からなり、それぞれの対は、1つの「軽」鎖(約25kD)と1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有している。それぞれの鎖のN末端は、抗原認識を主に担っている、約100から110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または、様々なペプチダーゼでの消化によって生じる十分に特性決定された多数の断片として存在する。
細胞媒介性免疫もまた、インフルエンザ感染からの回復において役割を担っており、そしてインフルエンザが関係している合併症を防ぎ得る。インフルエンザ特異的細胞性リンパ球は、感染した被験体の血液中および下部呼吸管分泌液中で検出されている。インフルエンザに感染した細胞の細胞溶解は、インフルエンザ特異的抗体および補体と協力してCTLによって媒介される。最初の細胞傷害性応答は、感染した個体、またはワクチン接種された個体において、6〜14日後に血液中で検出することができ、21日までに消滅する(Ennisら、1981)。インフルエンザ特異的CTLは、インビトロ培養物中で交差反応特異性を示す;したがって、これらは、同じタイプのインフルエンザに感染した細胞を溶解させるが、他のタイプのインフルエンザに感染した細胞は溶解させない(例えば、A型インフルエンザウイルスに感染した細胞を溶解させるが、B型インフルエンザウイルスに感染した細胞は溶解させない)。内部非グリコシル化タンパク質M、NP、およびPB2を認識するCTLが単離されている(Fleischerら、1985)。CTL応答は、A型インフルエンザ株の間では交差反応性であり(Gerhardら、2001)、そして、抗体との併用においては、ウイルスの拡散を最少にすることにおいて重要である(Nguyenら、2001)。
細胞媒介性免疫もまた、インフルエンザ感染からの回復において役割を担っており、そして、インフルエンザが関係している合併症を防ぎ得る。インフルエンザ特異的細胞性リンパ球は、感染した被験体の血液、および下部呼吸管において検出されている。インフルエンザに感染した細胞の細胞溶解は、インフルエンザ特異的抗体および補体と協力してCTLによって媒介される。最初の細胞傷害性応答は、感染した個体、またはワクチン接種された個体において、6〜14日後に検出することができ、21日までに消滅する(Ennisら、1981)。インフルエンザ特異的CTLは、インビトロ培養物中で交差反応特異性を示す;したがって、これらは、同じタイプのインフルエンザに感染した細胞を溶解させるが、他のタイプのインフルエンザに感染した細胞は溶解させない(例えば、A型インフルエンザウイルスに感染した細胞を溶解させるが、B型インフルエンザウイルスに感染した細胞は溶解させない)。内部非グリコシル化タンパク質M、NP、およびPB2を認識するCTLが単離されている(Fleischerら(1985))。CTL応答は、A型インフルエンザ株の間では交差反応性であり(Gerhardら、2001)、そして、抗体との併用においてウイルスの拡散を最少にすることにおいて重要である(Nguyenら、2001)。
したがって、本発明には、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な防御性の細胞性免疫応答を誘導する方法が含まれる。この方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザのVLPを投与する工程が含まれる。別の実施形態においては、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する方法には、少なくとも1有効用量のインフルエンザVLPを投与する工程が含まれる。ここでは、上記VLPは、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなる。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPにはインフルエンザタンパク質が含まれ、ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、そして、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、上記インフルエンザHA、NA、およびM1は、季節的なインフルエンザおよび/またはトリインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。
上記に記載されたように、本発明のVLP(トリインフルエンザVLPおよび/または季節的なインフルエンザVLP)は、被験体のインフルエンザ感染の少なくとも1つの症状を予防するかまたは軽減する。インフルエンザの症状は当業者に周知である。これには、発熱、筋肉痛、頭痛、ひどい倦怠感、乾性咳嗽、のどの痛み、体重の減少、および鼻炎が含まれる。したがって、本発明の方法には、インフルエンザウイルス感染に伴う少なくとも1つの症状の予防または軽減が含まれる。症状の軽減は、主観的に、または客観的に、例えば、被験体による自己評価によって、医師の評価によって、あるいは、適切なアッセイまたは測定(例えば、体温)(例えば、生活の質の評価、インフルエンザ感染もしくはさらに別の症状の進行の遅延、インフルエンザの症状の重篤度の低下が含まれる)、あるいは適切なアッセイ(例えば、抗体力価および/またはT細胞活性化アッセイ)を行うことによって決定され得る。客観的評価には、動物の評価とヒトの評価の両方が含まれる。
インフルエンザの管理についてのAdvisory Committee on Immunization Practices(ACIP)によって主張される主要なストラテジーは、インフルエンザによる重篤な合併症のリスクがあるヒト(具体的には、≧65歳のヒト)へのワクチン接種である。しかし、毎年のインフルエンザの流行は衰えることなく継続し、我々の社会に対して有意な健康上の負担および金銭的な負担となる(Glaserら、1996)。最近20年(1976〜1999年)には、インフルエンザが原因である全ての過剰死亡の有意な増加が起こった。1990年から1999年には、毎年のインフルエンザが原因である全ての死亡が50,000件を超えた(Thompsonら、2003)。最近10年間で≧65歳のヒトのワクチン接種率は65%にまで増えたにもかかわらず、インフルエンザが原因である全ての過剰死亡においては、対応する減少は観察されていない。
したがって、インフルエンザの予防および管理のための別のストラテジーは、健常な小児および個体の全てに対するワクチン接種である。子供は感染率が高く、インフルエンザによる疾病および入院が医学的に付随する(Neuzilら、2000)。小児は、学校、家族、および社会におけるインフルエンザの伝染において重要な役割を担っている。社会において学齢期の児童のおよそ80%に現在のインフルエンザワクチンをワクチン接種することによって、成人の呼吸器疾患、および高齢者の過剰死亡が減少した(Reichertら、2001)。この概念は「コミュニティー免疫(community immunity)または「間接予防(herd immunity)」として知られており、疾患に対して社会を防御する重要な部分を果たすと考えられている。ワクチン接種されたヒトはインフルエンザウイルスを中和する抗体を有するので、彼らはインフルエンザウイルスを他のヒトに伝染させる可能性はかなり低い。したがって、ワクチン接種されていないヒト(およびワクチンが弱くなったヒト、またはワクチンが完全には有効ではなかったヒト)でも、多くの場合には、彼らの周りのワクチン接種された人が病気にならないので、間接予防によって防御することができる。間接予防は、ワクチン接種されたヒトの割合が多ければ多いほど有効である。間接予防を得るためには、社会のうちのおよそ95%がワクチンによって防御されなければならないと考えられている。免疫化されていないヒトは、彼らおよび他の人が疾患にかかる可能性を高める。
したがって、本発明には、社会の集団に対して本発明のVLPを投与することによる、免疫力がない個体またはワクチン接種されていない個体の間でのインフルエンザウイルス感染の罹患率を低下させるために、集団または社会に対してインフルエンザウイルス感染に対する実質的な防御免疫力を誘導する方法が含まれる。1つの実施形態においては、ほとんどの学齢期の児童が、本発明のVLPを投与することによってインフルエンザウイルスに対して免疫化される。別の実施形態においては、社会のほとんどの健常な個体が、本発明のVLPを投与することによってインフルエンザウイルスに対して免疫化される。別の実施形態においては、本発明のVLPは、「ダイナミックワクチン(dynamic vaccination)」ストラテジーの一部である。ダイナミックワクチンは、新しい世界的に流行する株に関係している低効力のワクチンの安定した生産であるが、抗原性のドリフトが原因で、哺乳動物においては完全な防御を提供できない可能性がある(Germannら、2006を参照のこと)。世界的に流行する株の将来の実態についての不確実さの理由から、十分に適合した世界的に流行する株を備蓄することはほとんど不可能である。しかし、あまり適合していないが、有効である可能性があるワクチンでのワクチン接種によっては、世界的に流行するウイルスの拡散を遅らせることができる可能性があり、そして/また、世界的に流行するインフルエンザウイルス株の症状の重篤度を下げる可能性がある。
本発明にはまた、インフルエンザVLPが含まれているワクチンが含まれる。ここでは、被験体に投与された場合には、上記ワクチンによって、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力が誘導される。別の実施形態においては、実質的な免疫力の上記誘導により、インフルエンザの症状の期間が短くなる。別の実施形態においては、上記ワクチンにより、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質を含むVLPが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンにより、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、原則としてインフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなるVLPが含まれる。上記VLPには、さらに別のインフルエンザタンパク質および/またはタンパク質混入物質が無視できる濃度で含まれ得る。別の実施形態においては、上記ワクチンによって、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなるVLPが含まれる。別の実施形態においては、上記ワクチンによって、被験体においてインフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力が誘導され、上記ワクチンには、インフルエンザタンパク質を含むVLPが含まれる。ここでは、上記インフルエンザタンパク質は、HA、NA、およびM1タンパク質からなる。これらのVLPには、HA、NA、およびM1が含まれ、これには、さらに別の細胞性の構成成分(例えば、細胞性タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物など)が含まれ得るが、さらに別のインフルエンザタンパク質(M1、HA、および/またはNAの断片以外)は含まれない。別の実施形態においては、上記インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質は、トリインフルエンザウイルス、および/または季節的なインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記HAおよび/またはNAは、それぞれ、ヘマグルチニン活性および/またはノイラミニダーゼ活性を示す。別の実施形態においては、上記被験体は哺乳動物である。別の実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。さらなる実施形態においては、上記VLPは、アジュバントまたは免疫促進剤とともに処方される。別の実施形態においては、上記ワクチンは哺乳動物に投与される。さらなる実施形態においては、上記哺乳動物はヒトである。
本発明は以下の実施例によってさらに説明される。以下の実施例は限定と解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、および公開されている特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、引用により本明細書中に組み入れられる。
実施例1
材料および方法
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルスバックミド発現システムを使用してヨウトガ(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf−9S細胞株;ATCC PTA−4047)の中で発現させた。HA、NA、およびM1遺伝子を逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスから単離したRNAを使用して合成した(図1、2、および3)。逆転写およびPCRのために、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した(表1)。これらの遺伝子のcDNAコピーを、最初に、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPOにクローニングした。得られた3種類のpCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルストランスファーベクターpFastBac1(InVitrogen)の中のAcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、3種類のpFastBac−1をベースとするプラスミド:それぞれ、これらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するpHA、pNA、およびpM1を得た。その後、HA遺伝子とM1遺伝子の両方(それぞれ、別のポリヘドリンプロモーターの下流にある)をコードする1つのpFastBac1をベースとするプラスミドpHAMを構築した(図4)。pNAプラスミドの中に隣接する5’領域と3’領域を有しているNA遺伝子のヌクレオチド配列を決定した(配列番号1)(図1)。同時に、隣接する領域を有しているHA遺伝子とM1遺伝子のヌクレオチド配列もまた、pHAMプラスミドを使用して決定した(配列番号2および3)(図2および3)。
材料および方法
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルスバックミド発現システムを使用してヨウトガ(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf−9S細胞株;ATCC PTA−4047)の中で発現させた。HA、NA、およびM1遺伝子を逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスから単離したRNAを使用して合成した(図1、2、および3)。逆転写およびPCRのために、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した(表1)。これらの遺伝子のcDNAコピーを、最初に、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPOにクローニングした。得られた3種類のpCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルストランスファーベクターpFastBac1(InVitrogen)の中のAcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、3種類のpFastBac−1をベースとするプラスミド:それぞれ、これらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するpHA、pNA、およびpM1を得た。その後、HA遺伝子とM1遺伝子の両方(それぞれ、別のポリヘドリンプロモーターの下流にある)をコードする1つのpFastBac1をベースとするプラスミドpHAMを構築した(図4)。pNAプラスミドの中に隣接する5’領域と3’領域を有しているNA遺伝子のヌクレオチド配列を決定した(配列番号1)(図1)。同時に、隣接する領域を有しているHA遺伝子とM1遺伝子のヌクレオチド配列もまた、pHAMプラスミドを使用して決定した(配列番号2および3)(図2および3)。
最後に、HA発現カセットとM1発現カセットの両方をコードする、pHAMプラスミドに由来する制限DNA断片を、pNAプラスミドにクローニングした。これによって、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子をコードするプラスミドpNAHAMを得た(図4)。
プラスミドpNAHAMを使用して、ゲノムの中に組み込まれたインフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子を含む(それぞれ、別のバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流にある)組み換え体バキュロウイルスを構築した。得られた組換え体バキュロウイルスでの、感染許容状態のSf−9S昆虫細胞の感染によって、そのような組み換え体バキュロウイルスに感染した個々のSf−9S細胞の中でのこれらの3種類のインフルエンザ遺伝子の同時発現が生じた。
感染させたSf−9S細胞の中の発現産物を、感染の72時間後に特性決定した(例えば、SDS−PAGE分析、クマシーブルータンパク質染色、ならびに、HA特異的抗体およびM1特異的抗体を使用するウェスタン免疫ブロット分析による)(図5)。ウェスタン免疫ブロット分析を、インフルエンザウイルスA/HongKong/1073/99(H9N2)に対して惹起させられたウサギ抗体(CDC,Atlanta、Ga.,USA)、またはインフルエンザM1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体(Serotec,UK)を使用して行った。予想される分子量(それぞれ、64kd、60kd、および31kd)のHA、NA、およびM1タンパク質を、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。このアッセイにおいて検出したHAタンパク質の量と比較すると、NAタンパク質は、インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスに対するウサギ血清との低い反応性を示した。検出することができるNAタンパク質の量の説明には、HAタンパク質と比較した、組み換え体バキュロウイルスに感染させたSf−9S細胞からのNAタンパク質の低い発現レベル、ウェスタン免疫ブロットアッセイの変性条件下でのこの血清とのNAの低い反応性(膜結合の電気泳動の間の重要なNAエピトープの排除が原因である)、HA抗体と比較した低いNA抗体親和性、または血清中のNA抗体の少ない量が含まれた。
A/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1タンパク質を発現する組み換え体バキュロウイルスに感染させたSf−9S細胞からの培養培地もまた、インフルエンザタンパク質についてプローブした。明澄化させた培養上清を、インフルエンザウイルスの高分子タンパク質複合体(例えば、サブウイルス粒子、VLP、VLPの複合体、ならびに、おそらくは、インフルエンザHA、NA、およびM1タンパク質からなる他の自己アセンブリした粒子)を濃縮するために、27,000rpmで超遠心分離した。ペレット状となったタンパク質産物をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.2)の中に再懸濁し、不連続な20〜60%のスクロース段階勾配上での超遠心分離によってさらに精製した。スクロース勾配からの画分を回収し、SDS−PAGE分析、ウェスタン免疫ブロット分析、および電子顕微鏡によって分析した。
予想された分子量のインフルエンザHAおよびM1タンパク質を、クマシーブルー染色およびウェスタン免疫ブロット分析によって、複数のスクロース密度勾配画分の中で検出した(図6、表1)。これは、感染したSf−9S細胞からのインフルエンザウイルスタンパク質が、高分子量の複合体(例えば、カプソメア、サブウイルス粒子、VLP、および/またはVLP複合体)に凝集することが示唆している。NAタンパク質は、クマシーブルー染色とウェスタン免疫ブロット分析によっては一貫性なく検出された(その原因はおそらく、ウェスタン免疫ブロットアッセイにおいては、ウサギの抗インフルエンザ血清は変性したNAタンパク質を認識することができないことである)が、ノイラミニダーゼ酵素活性のアッセイにおいては、一貫して検出された(図10)。
スクロース勾配画分の中のインフルエンザVLPおよびタンパク質の形態を電子顕微鏡検査によって解析した。ネガティブ染色電子顕微鏡検査のために、2つのスクロース密度勾配画分からのインフルエンザタンパク質を、PBS(pH7.2)中の2%のグルタルアルデヒドで固定した。ネガティブ染色した試料の電子顕微鏡検査により、両方の画分の中の巨大分子タンパク質複合体またはVLPの存在が明らかになった。これらのVLPは、およそ60および80nmの直径を含む様々な大きさ、ならびに形態(球形)を示した。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された(図8)。全ての観察された巨大分子構造はそれらの表面上に鋭くとがった部分(spike)(ペプロマー(peplomer))を有しており、これはインフルエンザウイルスの特徴である。80nmの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子と類似しているので、これらの構造はおそらくVLPを呈し、これは、野生型インフルエンザビリオンに対して異なる類似性(類似する粒子の幾何学、構造、三角形の数(triangulation number)、対称性、および他の特徴)を有する。およそ60nmの小さい粒子は、形態学的にも、構造的にも、VLPとは異なるサブウイルス粒子を示し得る。様々な大きさおよび形態の組み換え体巨大分子タンパク質の類似する表現形もまた、他のウイルスについて報告された。例えば、B型肝炎ウイルスの組み換え体コア抗原(HBcAg)は、様々な大きさの粒子を形成し、これらは様々な構造および三角形の数T=4およびT=3を、それぞれ有する(Crowtherら、1994)。
精製されたインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)VLPの機能的特性を特性決定するために、試料をヘマグルチニンアッセイ(図9)およびノイラミニダーゼ酵素アッセイ(図10)において試験した。ヘマグルチニンアッセイについては、精製したインフルエンザVLPの2倍希釈物を0.6%のモルモットの赤血球と混合し、4℃で1時間または16時間インキュベートした。ヘマグルチニン化の程度を目視検査し、赤血球を凝集させることができる組換え体インフルエンザタンパク質の最大希釈を決定し、記録した(図9)。再び、スクロース密度勾配による多くの画分がヘマグルチニン活性を示し、これは、インフルエンザタンパク質の複数の巨大分子形態および単量体形態が存在することを示唆している。検出された最も高い力価は1:4000であった。対照実験においては、野生型インフルエンザA/Shangdongウイルスは、1:2000の力価を示した。ヘマグルチニンアッセイによっては、インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1タンパク質からなる組み換え体VLPが機能的に活性であることが明らかになった。これはVLPの中でのHAサブユニットタンパク質のアセンブリ、立体構造、および折り畳みが、野生型インフルエンザウイルスのものと類似しているか、または同じであることを示唆していた。
加えて、ノイラミニダーゼ酵素アッセイを、精製したH9N2 VLPの試料について行った。スクロース密度勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量を、基質としてフェチュインを使用して決定した。ノイラミニダーゼアッセイにおいては、ノイラミニダーゼによって、基質分子からシアル酸が切断されて、測定されるシアル酸が放出された。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸の量に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色(発色団)の量を、549nmの波長で分光光学的に測定した。この方法を使用して、ノイラミニダーゼ活性を、インフルエンザVLPが含まれているスクロース勾配画分の中で明らかにした(図10)。予想したように、活性はいくつかの画分の中で観察され、2つのピーク画分があった。ポジティブ対照としては、野生型インフルエンザウイルスを使用した。野生型インフルエンザウイルスは、精製されたインフルエンザVLPのものに匹敵するノイラミニダーゼ酵素活性を示した。これらの知見は、タンパク質の立体構造に関するHAの結果を裏づけ、インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスの精製したVLPが野生型インフルエンザウイルスと機能的に類似していることを示唆していた。
上記の分析およびアッセイによる結果は、インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1タンパク質の発現が、バキュロウイルスに感染した細胞からの機能的なVLPの自己アセンブリおよび輸送に十分であることを示していた。これらのインフルエンザVLPは、自己アセンブリしたインフルエンザ構造タンパク質を呈し、そして野生型インフルエンザウイルスの特性と類似する機能的および生化学的特性を示すので、これらのインフルエンザVLPは、有効なインフルエンザワクチンに不可欠な表面エピトープを含む重要な立体構造を保存していた。
実施例2
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
組み換え体インフルエンザウイルスタンパク質の生産を指示することができる合成の核酸配列を提供することが、本発明の1つの目的である。そのような合成の核酸配列は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法によって、ウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然のゲノムRNAを使用して得た。この用途の目的については、核酸配列は、RNA、DNA、cDNA、またはタンパク質をコードするそれらの任意の合成の変異体を意味する。
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
組み換え体インフルエンザウイルスタンパク質の生産を指示することができる合成の核酸配列を提供することが、本発明の1つの目的である。そのような合成の核酸配列は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法によって、ウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然のゲノムRNAを使用して得た。この用途の目的については、核酸配列は、RNA、DNA、cDNA、またはタンパク質をコードするそれらの任意の合成の変異体を意味する。
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスは、K.Subbarao博士(Centers for Disease Control,Atlanta,Ga.,USA)によって提供された。ウイルスのゲノムRNAを酸フェノールRNA抽出法によって、CDCのBiosafety Level 3(BSL3)汚染条件下で、Trizol LS試薬(Invitrogen,Carlsbad,Calif.USA)を使用して単離した。ウイルスRNAのcDNA分子は、MuLV逆転写酵素(InVitrogen)を使用する逆転写、ならびに、HA、NA、およびM1タンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとTaq I DNAポリメラーゼ(InVitrogen)を使用するPCRによって得た(表1)。PCR断片を、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPO(InVitrogen)に、EcoRI部位の間にクローニングし、これによりHA、HA、およびM1 cDNAクローンを含む3種類の組み換え体プラスミドを得た。
実施例3
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/94(H3N2)ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
インフルエンザA/Sydney/5/97(H3N2)ウイルスは、M.Massare博士(Novavax,Inc.,Rockville,Md.)から得た。ウイルスのゲノムRNAを酸フェノールRNA抽出法によって、Novavax,Inc.のBSL2汚染条件下で、Trizol LS試薬(Invitrogen)を使用して単離した。ウイルスRNAのcDNA分子は、HA、NA、M1、M2、およびNPタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写とPCRによって得た(表1)。PCR断片を、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPO(InVitrogen)に、EcoRI部位の間にクローニングして、HA、HA、M1、M2、およびNP cDNAクローンを含む5種類の組み換え体プラスミドを得た。
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/94(H3N2)ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
インフルエンザA/Sydney/5/97(H3N2)ウイルスは、M.Massare博士(Novavax,Inc.,Rockville,Md.)から得た。ウイルスのゲノムRNAを酸フェノールRNA抽出法によって、Novavax,Inc.のBSL2汚染条件下で、Trizol LS試薬(Invitrogen)を使用して単離した。ウイルスRNAのcDNA分子は、HA、NA、M1、M2、およびNPタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写とPCRによって得た(表1)。PCR断片を、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPO(InVitrogen)に、EcoRI部位の間にクローニングして、HA、HA、M1、M2、およびNP cDNAクローンを含む5種類の組み換え体プラスミドを得た。
実施例4
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス cDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクター(InVitrogen)の中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−HAに由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−NAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−M1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌(InVitrogen)をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−HA、pFastBac1−NA、およびpFastBac1−M1を、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した(図4A)。クローニングした遺伝子の図1〜3に示したようなヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子についてのヌクレオチド配列と同じであることを示していた(インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のNA、HA、およびM1遺伝子(それぞれ、GenBank登録番号AJ404629、AJ404626、およびAJ278646))。
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス cDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクター(InVitrogen)の中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−HAに由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−NAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−M1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌(InVitrogen)をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−HA、pFastBac1−NA、およびpFastBac1−M1を、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した(図4A)。クローニングした遺伝子の図1〜3に示したようなヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子についてのヌクレオチド配列と同じであることを示していた(インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のNA、HA、およびM1遺伝子(それぞれ、GenBank登録番号AJ404629、AJ404626、およびAJ278646))。
実施例5
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/97ウイルスcDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクターの中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hHA3に由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M2遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM2に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NP遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNPに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−hHA3、pFastBac1−hNA2、pFastBac1−hM1、pFASTBAC1−hM2、およびpFASTBAC1−hNPを、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した。クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同じであることを示していた。
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/97ウイルスcDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクターの中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hHA3に由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M2遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM2に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NP遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNPに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−hHA3、pFastBac1−hNA2、pFastBac1−hM1、pFASTBAC1−hM2、およびpFASTBAC1−hNPを、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した。クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同じであることを示していた。
実施例6
複数のトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスの遺伝子をコードする多重遺伝子バキュロウイルストランスファーベクターの構築
複数のインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスの遺伝子を発現するpFastBac1をベースとするバックミドトランスファーベクターを構築するために、最初に、M1遺伝子が含まれているpFastBac1−M1プラスミドに由来するSnaBI−HpaI DNA断片を、pFastBac1−HAのHpaI部位にクローニングした。これにより、別々の発現カセットの中に、そして別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられるHA遺伝子とM1遺伝子の両方をコードするpFastBac1−HAMプラスミドを得た。
複数のトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスの遺伝子をコードする多重遺伝子バキュロウイルストランスファーベクターの構築
複数のインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスの遺伝子を発現するpFastBac1をベースとするバックミドトランスファーベクターを構築するために、最初に、M1遺伝子が含まれているpFastBac1−M1プラスミドに由来するSnaBI−HpaI DNA断片を、pFastBac1−HAのHpaI部位にクローニングした。これにより、別々の発現カセットの中に、そして別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられるHA遺伝子とM1遺伝子の両方をコードするpFastBac1−HAMプラスミドを得た。
最後に、HA発現カセットとM1発現カセットが含まれているpFastBac1−HAMに由来するSnaBI−AvrII DNA断片を、HpaI−AvrIIで消化したpFastBac1−NAプラスミドDNAに導入した。これにより、インフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子の発現のための3つの異なる発現カセットをコードし、別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられる、プラスミドpFastBac1−NAHAMを得た(図4B)。
別の実施例においては、pFASTBAC1−hHA3(実施例5を参照のこと)に由来するH3遺伝子を、異種インフルエンザVLPの発現および生産のための第4のインフルエンザウイルス遺伝子として、pFASTBAC1−NAHAMにクローニングした。
実施例7
昆虫細胞の中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスのNA、HA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスの作成
得られた多重遺伝子バックミドトランスファーベクターpFastBac1−NAHAMを使用して、昆虫細胞の中での発現のためのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスを作成した。組み換え体バックミドDNAを、コンピテントE.coli DH10BAC細胞(InVitrogen)の中に有しているpFastBac1−NAHAM DNAとAcMNPCバキュロウイルスゲノムとの間でのポリヘドリンとTn7 att DNA配列での部位特異的組み換えによって得た(図4B)。組み換え体バックミドDNAを、ミニプレップDNA法によって単離し、陽イオン性脂質CELLFECTIN(InVitrogen)を使用してSf−9s細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、組み換え体バキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてSf−9S昆虫細胞の中で増幅させた。ウイルスのストックをSf−9S昆虫細胞の中で調製し、そしてトリインフルエンザウイルスHA、NA、およびM1遺伝子産物の発現について特性決定した。得られた組み換え体バキュロウイルスをbNAHAM−H9N2と命名した。
昆虫細胞の中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスのNA、HA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスの作成
得られた多重遺伝子バックミドトランスファーベクターpFastBac1−NAHAMを使用して、昆虫細胞の中での発現のためのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスを作成した。組み換え体バックミドDNAを、コンピテントE.coli DH10BAC細胞(InVitrogen)の中に有しているpFastBac1−NAHAM DNAとAcMNPCバキュロウイルスゲノムとの間でのポリヘドリンとTn7 att DNA配列での部位特異的組み換えによって得た(図4B)。組み換え体バックミドDNAを、ミニプレップDNA法によって単離し、陽イオン性脂質CELLFECTIN(InVitrogen)を使用してSf−9s細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、組み換え体バキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてSf−9S昆虫細胞の中で増幅させた。ウイルスのストックをSf−9S昆虫細胞の中で調製し、そしてトリインフルエンザウイルスHA、NA、およびM1遺伝子産物の発現について特性決定した。得られた組み換え体バキュロウイルスをbNAHAM−H9N2と命名した。
実施例8
昆虫細胞の中での組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99タンパク質の発現
無血清培地(HyQ SFM,HyClone,Ogden,Utah)の中で28℃の震盪フラスコの中で懸濁培養物として維持したSf−9S昆虫細胞を、3pfu/細胞の感染多重度(MOI)で、組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に2×106細胞/mlの細胞密度で感染させた。ウイルス感染を72時間進行させて、インフルエンザタンパク質を発現させた。感染した昆虫細胞中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHAおよびM1タンパク質の発現を、SDS−PAGEおよびウェスタン免疫ブロット分析によって確認した。SDS−PAGE分析は、4〜12%の直線勾配のNuPAGEゲル(Invitrogen)上で、還元条件と変性条件下で行った。ウェスタン免疫ブロット分析の中の一次抗体は、CDCから入手したトリインフルエンザウイルスA/HongKong/1073/99(H9N2)に対して惹起させられたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザM1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗血清(Serotec,UK)であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための二次抗体は、ウサギまたはマウスIgG(H+L)に対して惹起させられた、アルカリホスファターゼ結合ヤギIgG抗血清(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,Md.,USA)であった。これらの分析の結果(図5)は、HAタンパク質とM1タンパク質が、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現されることを示していた。
昆虫細胞の中での組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99タンパク質の発現
無血清培地(HyQ SFM,HyClone,Ogden,Utah)の中で28℃の震盪フラスコの中で懸濁培養物として維持したSf−9S昆虫細胞を、3pfu/細胞の感染多重度(MOI)で、組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に2×106細胞/mlの細胞密度で感染させた。ウイルス感染を72時間進行させて、インフルエンザタンパク質を発現させた。感染した昆虫細胞中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHAおよびM1タンパク質の発現を、SDS−PAGEおよびウェスタン免疫ブロット分析によって確認した。SDS−PAGE分析は、4〜12%の直線勾配のNuPAGEゲル(Invitrogen)上で、還元条件と変性条件下で行った。ウェスタン免疫ブロット分析の中の一次抗体は、CDCから入手したトリインフルエンザウイルスA/HongKong/1073/99(H9N2)に対して惹起させられたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザM1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗血清(Serotec,UK)であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための二次抗体は、ウサギまたはマウスIgG(H+L)に対して惹起させられた、アルカリホスファターゼ結合ヤギIgG抗血清(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,Md.,USA)であった。これらの分析の結果(図5)は、HAタンパク質とM1タンパク質が、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現されることを示していた。
実施例9
組み換え体トリインフルエンザH9N2ウイルス様粒子および巨大分子タンパク質複合体の精製
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子産物を発現する組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に感染させたSf−9S昆虫細胞に由来する培養上清(200ml)を、低速遠心分離によって回収した。培養上清を、Sorval RC−5B高速遠心分離機でGS−3ローターを使用して、4℃で10,000×gで1時間の遠心分離によって明澄化させた。ウイルスとVLPを、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで3時間、4℃での、Sorval TH−641スイングバケットローターを使用した遠心分離によって、明澄化させた培養上清から単離した。ウイルスのペレットを、1mlのPBS(pH7.2)に再懸濁し、20〜60%の不連続なスクロース段階勾配上にロードし、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで16時間、4℃での、Sorval TH−641ローターを使用した遠心分離によって分解させた。画分(0.5ml)を、スクロース勾配の最上部から回収した。
組み換え体トリインフルエンザH9N2ウイルス様粒子および巨大分子タンパク質複合体の精製
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子産物を発現する組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に感染させたSf−9S昆虫細胞に由来する培養上清(200ml)を、低速遠心分離によって回収した。培養上清を、Sorval RC−5B高速遠心分離機でGS−3ローターを使用して、4℃で10,000×gで1時間の遠心分離によって明澄化させた。ウイルスとVLPを、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで3時間、4℃での、Sorval TH−641スイングバケットローターを使用した遠心分離によって、明澄化させた培養上清から単離した。ウイルスのペレットを、1mlのPBS(pH7.2)に再懸濁し、20〜60%の不連続なスクロース段階勾配上にロードし、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで16時間、4℃での、Sorval TH−641ローターを使用した遠心分離によって分解させた。画分(0.5ml)を、スクロース勾配の最上部から回収した。
複数のスクロース勾配画分中のインフルエンザタンパク質を、実施例6において上記に記載したように、SDS−PAGEおよびウェスタン免疫ブロット分析によって分析した。HAタンパク質およびM1タンパク質は、ウェスタンブロット分析によって示されたものと同じスクロース勾配画分の中に見られ(図6)、そしてこのことは、HAタンパク質とM1タンパク質が巨大分子タンパク質複合体として会合していることを示唆していた。HAタンパク質とM1タンパク質はいずれも、スクロース勾配全体にわたって複数の画分の中で見られた。このことは、これらの組み換え体ウイルスタンパク質が様々な密度および組成の巨大分子タンパク質複合体と会合していることを示唆している。
実施例10
ゲル濾過クロマトグラフィーによる組み換え体トリインフルエンザH9N2のVLPおよびタンパク質の分析
VLPのようなタンパク質巨大分子および単量体タンパク質は、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー上では、それらの質量の大きさおよび形状に基づいて異なって移動する。スクロース抗体画分に由来する組み換え体インフルエンザタンパク質が単量体タンパク質であるかまたはVLPのような巨大分子タンパク質複合体であるかを決定するために、14mlのSepharose CL−4B(Amersham)の樹脂ベッド容量を有しているクロマトグラフィーカラム(7mm×140mm)を準備した。サイズ排除カラムをPBSで平衡化し、それぞれ、2,000,000;20,000;および1,357ダルトンの見かけの分子量を有しているデキストランブルー(Dextran Blue)2000、デキストランイエロー(Dextran Yellow)、およびビタミンB12(Amersham Pharmacia)で較正して、カラムの空隙容量を決定した。空隙容量(6mlの画分)の中のカラムからは、デキストランブルー2000もまた溶出した。予想したように、組み換え体インフルエンザタンパク質複合体が、空隙容量(6mlの画分)のカラムから溶出した。この結果は、VLPのような高分子量の巨大分子タンパク質複合体の特徴である。カラム画分中のウイルスタンパク質を、上記実施例6に記載したように、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。M1タンパク質は空隙容量の画分の中で検出された(図7)。予想したように、バキュロウイルスタンパク質もまた、空隙容量の中に含まれていた。
ゲル濾過クロマトグラフィーによる組み換え体トリインフルエンザH9N2のVLPおよびタンパク質の分析
VLPのようなタンパク質巨大分子および単量体タンパク質は、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー上では、それらの質量の大きさおよび形状に基づいて異なって移動する。スクロース抗体画分に由来する組み換え体インフルエンザタンパク質が単量体タンパク質であるかまたはVLPのような巨大分子タンパク質複合体であるかを決定するために、14mlのSepharose CL−4B(Amersham)の樹脂ベッド容量を有しているクロマトグラフィーカラム(7mm×140mm)を準備した。サイズ排除カラムをPBSで平衡化し、それぞれ、2,000,000;20,000;および1,357ダルトンの見かけの分子量を有しているデキストランブルー(Dextran Blue)2000、デキストランイエロー(Dextran Yellow)、およびビタミンB12(Amersham Pharmacia)で較正して、カラムの空隙容量を決定した。空隙容量(6mlの画分)の中のカラムからは、デキストランブルー2000もまた溶出した。予想したように、組み換え体インフルエンザタンパク質複合体が、空隙容量(6mlの画分)のカラムから溶出した。この結果は、VLPのような高分子量の巨大分子タンパク質複合体の特徴である。カラム画分中のウイルスタンパク質を、上記実施例6に記載したように、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。M1タンパク質は空隙容量の画分の中で検出された(図7)。予想したように、バキュロウイルスタンパク質もまた、空隙容量の中に含まれていた。
実施例11
組み換え体インフルエンザVLPの電子顕微鏡検査
スクロース勾配上で単離した、組み換え体トリインフルエンザタンパク質が含まれている巨大分子タンパク質複合体がインフルエンザビリオンと同様の形態を有しているかどうかを決定するために、ネガティブ染色された試料の電子顕微鏡試験を行った。組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)タンパク質複合体を、実施例7に記載したように、不連続なスクロース勾配上での超遠心分離によって培養上清から濃縮し、精製した。スクロース勾配画分のアリコートを、PBS(pH7.2)中の2%のグルタルアルデヒドで処理し、新しく放電させたプラスチック/炭素コーティングした格子上に吸着させ、そして蒸留水で洗浄した。試料を2%のタングストリン酸ナトリウム(pH6.5)で染色し、透過型電子顕微鏡(Philips)を使用して観察した。2つのスクロース勾配画分に由来するネガティブ染色した組み換え体トリインフルエンザH9N2タンパク質複合体の試料の電子顕微鏡写真は、2つのスクロース勾配画分から球状および棒状の粒子を示した(図8)。粒子は、様々な大きさ(60および80nm)および形態を有していた。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された(図8)。全ての観察されたタンパク質複合体構造は、インフルエンザウイルスHAおよびNAペプロマーに似ている鋭くとがった部分(spike)を有している表面上の突起を示した。80nmの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子のものと類似しているので、これらの構造はおそらくエンベロープを持ったインフルエンザVLPを呈する。およそ60nmの小さい粒子は、おそらく、形態学的にも、構造的にも、上記VLPとは異なるサブウイルス粒子を呈する。
組み換え体インフルエンザVLPの電子顕微鏡検査
スクロース勾配上で単離した、組み換え体トリインフルエンザタンパク質が含まれている巨大分子タンパク質複合体がインフルエンザビリオンと同様の形態を有しているかどうかを決定するために、ネガティブ染色された試料の電子顕微鏡試験を行った。組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)タンパク質複合体を、実施例7に記載したように、不連続なスクロース勾配上での超遠心分離によって培養上清から濃縮し、精製した。スクロース勾配画分のアリコートを、PBS(pH7.2)中の2%のグルタルアルデヒドで処理し、新しく放電させたプラスチック/炭素コーティングした格子上に吸着させ、そして蒸留水で洗浄した。試料を2%のタングストリン酸ナトリウム(pH6.5)で染色し、透過型電子顕微鏡(Philips)を使用して観察した。2つのスクロース勾配画分に由来するネガティブ染色した組み換え体トリインフルエンザH9N2タンパク質複合体の試料の電子顕微鏡写真は、2つのスクロース勾配画分から球状および棒状の粒子を示した(図8)。粒子は、様々な大きさ(60および80nm)および形態を有していた。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された(図8)。全ての観察されたタンパク質複合体構造は、インフルエンザウイルスHAおよびNAペプロマーに似ている鋭くとがった部分(spike)を有している表面上の突起を示した。80nmの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子のものと類似しているので、これらの構造はおそらくエンベロープを持ったインフルエンザVLPを呈する。およそ60nmの小さい粒子は、おそらく、形態学的にも、構造的にも、上記VLPとは異なるサブウイルス粒子を呈する。
実施例12
ヘマグルチニンアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特徴の分析
精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質がインフルエンザウイルスの特徴である機能的活性(例えば、ヘマグルチニン活性およびノイラミニダーゼ活性)を有しているかどうかを決定するために、精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質を、ヘマグルチニンアッセイおよびノイラミニダーゼアッセイにおいて試験した。
ヘマグルチニンアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特徴の分析
精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質がインフルエンザウイルスの特徴である機能的活性(例えば、ヘマグルチニン活性およびノイラミニダーゼ活性)を有しているかどうかを決定するために、精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質を、ヘマグルチニンアッセイおよびノイラミニダーゼアッセイにおいて試験した。
ヘマグルチニンアッセイについては、インフルエンザVLPまたはポジティブ対照である野生型のA型インフルエンザウイルスが含まれているスクロース勾配画分の2倍希釈物のシリーズを準備した。その後、これらを、PBS(pH7.2)中の0.6%のモルモット赤血球と混合し、4℃で1時間〜16時間インキュベートした。ネガティブ対照としては、PBSを使用した。ヘマグルチニン化の程度を目視検査し、モルモットの赤血球を凝集させることができる画分の最大希釈を決定した(図9)。精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質について観察された最も高いヘマグルチニン化の力価は1:4000であった。これは、1:2000であった野生型インフルエンザによって示された力価よりも高かった。
実施例13
ノイラミニダーゼアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特性の分析
インフルエンザVLPが含まれているスクロース勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量をノイラミニダーゼアッセイによって決定した。このアッセイでは、NA(酵素)が基質(フェチュイン)に対して作用して、シアル酸が放出させられる。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色(発色団)の量を、594nmの波長で分光光度計で測定した。図8に示したデータは、有意な量のシアル酸がVLPが含まれているスクロース勾配の画分によって生産されたこと、およびこれらの画分がヘマグルチニン活性を示すそれらの画分と対応していたことを示していた。
ノイラミニダーゼアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特性の分析
インフルエンザVLPが含まれているスクロース勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量をノイラミニダーゼアッセイによって決定した。このアッセイでは、NA(酵素)が基質(フェチュイン)に対して作用して、シアル酸が放出させられる。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色(発色団)の量を、594nmの波長で分光光度計で測定した。図8に示したデータは、有意な量のシアル酸がVLPが含まれているスクロース勾配の画分によって生産されたこと、およびこれらの画分がヘマグルチニン活性を示すそれらの画分と対応していたことを示していた。
実施例14
機能的な同型の組み換え体インフルエンザH9N2 VLPでのBALB/cマウスの免疫化
組み換え体インフルエンザVLPの免疫原性を、マウスの免疫化、それに続く免疫血清のウェスタンブロット分析によって確認した。A型トリインフルエンザ/HonkKong/1073/99に由来するウイルスHA、NA、およびM1タンパク質から構成されており、そして、スクロース勾配上で精製した組み換え体VLP(1μg/注射)を、0日目および28日目に、10匹の雌のBALB/cマウスの三角筋部に皮下に接種した(図11)。PBS(pH7.2)を、ネガティブ対照として5匹のマウスに同様に投与した。マウスを、−1日目(事前採血)、27日目(1回目の採血)、および54日目(2回目の採血)に、眼窩上の孔(supraorbital cavity)から採血した。血清を、一晩の凝固および遠心分離後に血液試料から回収した。
機能的な同型の組み換え体インフルエンザH9N2 VLPでのBALB/cマウスの免疫化
組み換え体インフルエンザVLPの免疫原性を、マウスの免疫化、それに続く免疫血清のウェスタンブロット分析によって確認した。A型トリインフルエンザ/HonkKong/1073/99に由来するウイルスHA、NA、およびM1タンパク質から構成されており、そして、スクロース勾配上で精製した組み換え体VLP(1μg/注射)を、0日目および28日目に、10匹の雌のBALB/cマウスの三角筋部に皮下に接種した(図11)。PBS(pH7.2)を、ネガティブ対照として5匹のマウスに同様に投与した。マウスを、−1日目(事前採血)、27日目(1回目の採血)、および54日目(2回目の採血)に、眼窩上の孔(supraorbital cavity)から採血した。血清を、一晩の凝固および遠心分離後に血液試料から回収した。
ウェスタンブロット分析のために、200ngの不活化A型トリインフルエンザウイルスH9N2または低温適応性のA型トリインフルエンザウイルスH9N2、ならびに、See Blue Plus 2で予め染色したタンパク質標準物(InVitrogen)を変性させ(95℃、5分間)、そして、MBS緩衝液中の4〜12%のポリアクリルアミド勾配NuPAGEゲル(InVitrogen)上の還元条件(10mMのβ−メルカプトエタノール)で、172ボルトで、ブロモフェノールブルー追跡用色素が消滅するまで電気泳動した。タンパク質ゲルについては、電気泳動タンパク質をコロイド状のクマシーブルー試薬(InVitrogen)での染色によって視覚化した。タンパク質を、標準的なウェスタンブロット手順によってゲルからメタノール中のニトロセルロース膜に移動させた。VLPで免疫化したマウス、および不活化トリインフルエンザウイルスH9N2(ポジティブ対照血清)で免疫化したウサギに由来する血清を、それぞれ、PBS溶液(pH7.2)中で1:25および1:100に希釈し、一次抗体として使用した。5%のカゼインでブロックしたタンパク質を結合させた膜を、一次抗血清と、室温で60分間、一定速度で震盪させながら反応させた。Tween 20が含まれているリン酸緩衝化生理食塩溶液での一次抗体膜の洗浄後、二次抗血清(ヤギ抗マウスIgG−−アルカリホスファターゼ結合体(1:10,000)またはヤギ抗ウサギIgG−−アルカリホスファターゼ結合体(1:10,000))を膜と60分間反応させた。Tween 20が含まれているリン酸緩衝化生理食塩水での二次抗体膜の洗浄後、膜上の抗体が結合したタンパク質を、NBT/BCIP(InVitrogen)のような発色性の基質での現像によって視覚化させた。
ウェスタンブロット分析の結果(図12)は、ウイルスのHAタンパク質およびM1タンパク質(それぞれ、75および30kd)に類似する分子量を有しているタンパク質がポジティブ対照血清に結合し(図12B)、そして、組み換え体インフルエンザH9N2 VLPで免疫化したマウスに由来する血清にも結合した(図12A)ことを示している。これらの結果は、組み換え体インフルエンザH9N2は、単独で、この投与経路によってマウスにおいて免疫原性であることを示していた。
実施例15
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性とBALB/cマウスでのチャレンジ実験
BALB/cマウスを、100μgのNovasomeアジュバントを含むか、またはNovasomeアジュバントを含まないH9N2 VLP(1μgのHAまたは10μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、0日目、27日目、および57日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図13から図16に示す。
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性とBALB/cマウスでのチャレンジ実験
BALB/cマウスを、100μgのNovasomeアジュバントを含むか、またはNovasomeアジュバントを含まないH9N2 VLP(1μgのHAまたは10μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、0日目、27日目、および57日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図13から図16に示す。
高力価のH9N2抗体が、Novasomeを含むか、またはNovasomeを含まないH9N2 VLPワクチンと、1μgのHAを含む10μgのVLPの用量を含む1回の免疫化(初回)後に誘導された(図13)。特異的抗体力価は、追加免疫後に約2分の1から1対数増大した。
H9N2 VLPの形態の1μgのHAでの免疫化および追加免疫後、血清HIレベルは全ての動物において一般的に防御性と考えられるレベル(log2=5)であったか、またはそれを越えるものであった(図14、下左のパネル)。Novasomeアジュバントを用いて処方したH9N2 VLPは、初回免疫化後には約2倍にHI応答を増大させ、追加免疫後には約4倍に増大させた(図14、下右のパネル)。精製したサブユニットH9N2ヘマグルチニンもまた、追加免疫化後に防御レベルのHI抗体を誘導し、Novasomeは、再び、HI抗体応答を初回免疫化後には約2倍、そして追加免疫後には4倍増大させた(図14、上のパネル)。サブユニットワクチンとして投与された10μgのHAによって誘導されたHI抗体のレベルは、VLPの形態で提示された1μgのHAと同じであった。
加えて、体重の減少は、ワクチン接種しなかった対照動物と比較して、H9N2 VLPで免疫化したマウス、またはVLPとアジュバントで免疫化したマウスにおいて有意に少なかった(図15)。H9N2 VLPで免疫化したグループ、およびH9N2 VLPとNovasomeアジュバントで免疫化したグループにおいては、体重の減少に統計的な差はなかった。
同様に、H9N2ウイルスでのチャレンジの3日後および5日後の肺でのウイルス力価は、H9N2 VLPで免疫化したマウスにおいては有意に低かった(図16)。肺組織の中でインフルエンザウイルス力価がピークとなる3日目には、H9N2 VLPとNovasomes(登録商標)で免疫化したマウスは、VLPだけで免疫化したマウス、およびワクチン接種しなかった対照のマウスと比較して、ウイルス力価の有意な低下を有していた。
実施例16
A/Fujian/411/2002(H3N2)VLPの免疫原性といくつかのインフルエンザ株の間での交差反応性
BALB/cマウスをA/Fujian/411/2002 VLP(3.0、0.6、0.12、および0.24μgのHA/用量)で、IMおよびINで2回免疫化した。マウスを0日目および35日目に採血した。その後、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。この実験の結果を、図17A、17B、および17Cに示す。これらの結果は、免疫応答が、HAおよびNAに対するIMおよびINの両方を増大させたことを示している。
A/Fujian/411/2002(H3N2)VLPの免疫原性といくつかのインフルエンザ株の間での交差反応性
BALB/cマウスをA/Fujian/411/2002 VLP(3.0、0.6、0.12、および0.24μgのHA/用量)で、IMおよびINで2回免疫化した。マウスを0日目および35日目に採血した。その後、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。この実験の結果を、図17A、17B、および17Cに示す。これらの結果は、免疫応答が、HAおよびNAに対するIMおよびINの両方を増大させたことを示している。
実施例17
H3N2 VLPの接種後のマウスの中でのIgGイソ型の決定
マウスにVLPを筋肉内および鼻腔内に接種した。5週間で血清を回収し、そしてIgGイソ型を識別するためにアッセイした。
H3N2 VLPの接種後のマウスの中でのIgGイソ型の決定
マウスにVLPを筋肉内および鼻腔内に接種した。5週間で血清を回収し、そしてIgGイソ型を識別するためにアッセイした。
血清を、ELISAアッセイを使用して精製したHA(Protein Sciences)A/Wyoming/3/2003でコーティングしたプレート上で試験した。血清の段階的な5倍希釈物をウェルに添加し、そしてプレートをインキュベートした。次に、ビオチニル化ヤギ抗マウスIg、または抗マウスIgG1、抗マウスIgG2a、抗マウスIgG2b、および抗マウスIgG3。その後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをウェルに添加した。結合した結合体を検出した。結果を図18AおよびBに示す。これらの結果は、IgG2aが、マウスでのVLPに対する免疫応答において最も豊富なイソ型であることを示している。
実施例18
SDラットにおけるA/Hong Kong/1073/99(H9N2)用量範囲試験
SDラット(1用量につき6匹)を、中性pHのPBSで0.12、0.6、3.0、および15.0μgのHAになるようにPBSで希釈した精製したA/HongKong/1073/99(H9N2)VLPで、あるいは、PBSだけで、0日目および21日目に免疫化した。血液試料を、0日目、21日目、35日目、および49日目に動物から採取し、ヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)のために血清をアッセイして、HAの結合機能を阻害することができる機能性の抗体を検出した。投与量は、SDS−PAGEを使用して、そして精製したH9N2 VLPのデンシトメトリーをスキャンして測定したHA含有量に基づいた。ヘマグルチニン阻害アッセイの力価の結果を図19に示す。1回の0.6μgHA用量のH9N2 VLP、または2用量の0.12μgのHAによって、ラットにおいてHI抗体の防御的レベルが生じた。これらのデータは、HAがVLPの一部である場合には、少量のHAによって、防御応答を誘導できることを示している。
SDラットにおけるA/Hong Kong/1073/99(H9N2)用量範囲試験
SDラット(1用量につき6匹)を、中性pHのPBSで0.12、0.6、3.0、および15.0μgのHAになるようにPBSで希釈した精製したA/HongKong/1073/99(H9N2)VLPで、あるいは、PBSだけで、0日目および21日目に免疫化した。血液試料を、0日目、21日目、35日目、および49日目に動物から採取し、ヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)のために血清をアッセイして、HAの結合機能を阻害することができる機能性の抗体を検出した。投与量は、SDS−PAGEを使用して、そして精製したH9N2 VLPのデンシトメトリーをスキャンして測定したHA含有量に基づいた。ヘマグルチニン阻害アッセイの力価の結果を図19に示す。1回の0.6μgHA用量のH9N2 VLP、または2用量の0.12μgのHAによって、ラットにおいてHI抗体の防御的レベルが生じた。これらのデータは、HAがVLPの一部である場合には、少量のHAによって、防御応答を誘導できることを示している。
実施例19
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性
BALB/Cマウスを、100μgのNovasomeおよびAlumアジュバントを含むか、またはNovasomeおよびAlumアジュバントを含まないH9N2 VLP(0.12、0.6μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、3.0および15.0μgのHA/用量(アジュバントを含まない)でも免疫化した。マウスを0日目、21日目、35日目、および49日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図20AおよびBに示す。
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性
BALB/Cマウスを、100μgのNovasomeおよびAlumアジュバントを含むか、またはNovasomeおよびAlumアジュバントを含まないH9N2 VLP(0.12、0.6μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、3.0および15.0μgのHA/用量(アジュバントを含まない)でも免疫化した。マウスを0日目、21日目、35日目、および49日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図20AおよびBに示す。
結果は、より強い全体的な免疫応答が、VLPをアジュバントと共に投与した場合には観察されたことを示している。しかし、防御性の応答が、Alumを含むVLP処方物およびアジュバントを含まないVLPと比較した場合に、3週間目に、0.12μgのHA/用量によって誘発された。7週目にもまた、Novasomesを含むVLPは、Alumを含むVLPと比較して、HI力価の約2logの増大を有していた。応答の強さは、アジュバントを含まない、3.0および15.0μgのHA/用量で投与したVLPと同様であった。これらの結果は、NovasomesがAlumと比較してより強い応答を誘発することを示している。加えて、VLPをNovasomesを含む処方物の中で投与した場合には、防御免疫応答を25分の1の少ないVLPを用いて得ることができた。
また、0.6μgのHA/用量のデータにおいては、Novasome処方物は、Alumと比較すると、約1.5log大きな応答を有していた。免疫応答は、アジュバントを含まない、3.0および15.0μgのHA/用量で投与したVLPと同様の大きさであった。これらの結果は、アジュバントを含む場合には、防御応答を得るために、およそ5分の1の少ないVLPしか投与される必要がないことを示している。
また、図20Bは、Novasomesの様々な処方物を使用したH9N2 VLPのHI力価を示す。以下は、実験に使用した式である:
グループ1:H9N2 VLP(0.1μg)(n=5)
グループ2:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW neat)(n=5)
グループ3:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:3)(n=5)
グループ4:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:9)(n=5)
グループ5:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:27)(n=5)
グループ6:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX1)(n=5)
グループ7:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX2)(n=5)
グループ8:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX3)(n=5)
グループ9:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX4)(n=5)
グループ10:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX5)(n=5)
グループ11:H9N2 VLP(0.1μg)w/Alum−OH)(n=5)
グループ12:H9N2 VLP(0.1μg)w/CpG)(n=5)
グループ13:PBS(0.6μg)(n=5)
グループ14:H3 VLPs(0.6μg)(n=5)
グループ15:H5 VLPs(0.6μg)(n=8)
−H9:(ロット#11005)
−DCW:Novasomes(ロット#121505−2、ポリオキシエチレン−2−セチルエーテル、コレステロール、細かい大豆油、および塩化セチルピリジニウム)
−NVAX1:B35P83、MF−59レプリカ(スクワレン、ポリソルベート、およびSpan)
−NVAX2:B35P87(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68)
−NVAX3:B35P88(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68、およびポリエチレンイミン)
−NVAX4:B31P60(スクワレン、Brij、コレステロール、オレイン酸)
−NVAX5:B31P63(大豆油、モノステアリン酸グリセリル、コレステロール、ポリソルベート)
−CpG:(ロット#1026004)
−H5:(ロット#22406)
図21は、H9N2 VLPの用量応答曲線を示す。このデータは、0.6μgのHA/用量のVLPの用量が、3週間後にマウスにおいて防御免疫応答を誘発するための最少量であることを示している。
グループ1:H9N2 VLP(0.1μg)(n=5)
グループ2:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW neat)(n=5)
グループ3:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:3)(n=5)
グループ4:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:9)(n=5)
グループ5:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:27)(n=5)
グループ6:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX1)(n=5)
グループ7:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX2)(n=5)
グループ8:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX3)(n=5)
グループ9:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX4)(n=5)
グループ10:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX5)(n=5)
グループ11:H9N2 VLP(0.1μg)w/Alum−OH)(n=5)
グループ12:H9N2 VLP(0.1μg)w/CpG)(n=5)
グループ13:PBS(0.6μg)(n=5)
グループ14:H3 VLPs(0.6μg)(n=5)
グループ15:H5 VLPs(0.6μg)(n=8)
−H9:(ロット#11005)
−DCW:Novasomes(ロット#121505−2、ポリオキシエチレン−2−セチルエーテル、コレステロール、細かい大豆油、および塩化セチルピリジニウム)
−NVAX1:B35P83、MF−59レプリカ(スクワレン、ポリソルベート、およびSpan)
−NVAX2:B35P87(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68)
−NVAX3:B35P88(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68、およびポリエチレンイミン)
−NVAX4:B31P60(スクワレン、Brij、コレステロール、オレイン酸)
−NVAX5:B31P63(大豆油、モノステアリン酸グリセリル、コレステロール、ポリソルベート)
−CpG:(ロット#1026004)
−H5:(ロット#22406)
図21は、H9N2 VLPの用量応答曲線を示す。このデータは、0.6μgのHA/用量のVLPの用量が、3週間後にマウスにおいて防御免疫応答を誘発するための最少量であることを示している。
実施例20
フェレットの実験のための材料および方法
フェレットを、Triple F Farms(FFF、Sayre,PA)から購入した。購入した全てのフェレットは、10ヘマグルチニン単位未満であるHAI力価を有していた。ワクチン接種のおよそ2日前に、動物に温度自動応答装置(temperature transponder)(BioMedic Data Systems, Inc.)を埋め込んだ。動物(6匹の動物/グループ)に、(1)PBS(ネガティブ対照、グループ1)、(2)H3N2インフルエンザVLP@15μgのH3(グループ2)、(3)H3N2インフルエンザVLP@3μgのH3(グループ2)、(4)H3N2インフルエンザVLP@0.6μgのH3(グループ3)、(5)H3N2インフルエンザVLP@0.12μgのH3(グループ5)、または(6)rH3N2@15μg(グループ6)のいずれかを、0日目にワクチン接種した。21日目に動物にワクチンを追加免疫した。動物を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目に採血した。動物を、有害なワクチン効果の臨床的兆候について、実験期間を通じて1週間に1回評価した。同様の実験を他のインフルエンザVLPを用いて行った。
フェレットの実験のための材料および方法
フェレットを、Triple F Farms(FFF、Sayre,PA)から購入した。購入した全てのフェレットは、10ヘマグルチニン単位未満であるHAI力価を有していた。ワクチン接種のおよそ2日前に、動物に温度自動応答装置(temperature transponder)(BioMedic Data Systems, Inc.)を埋め込んだ。動物(6匹の動物/グループ)に、(1)PBS(ネガティブ対照、グループ1)、(2)H3N2インフルエンザVLP@15μgのH3(グループ2)、(3)H3N2インフルエンザVLP@3μgのH3(グループ2)、(4)H3N2インフルエンザVLP@0.6μgのH3(グループ3)、(5)H3N2インフルエンザVLP@0.12μgのH3(グループ5)、または(6)rH3N2@15μg(グループ6)のいずれかを、0日目にワクチン接種した。21日目に動物にワクチンを追加免疫した。動物を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目に採血した。動物を、有害なワクチン効果の臨床的兆候について、実験期間を通じて1週間に1回評価した。同様の実験を他のインフルエンザVLPを用いて行った。
フェレットの血清中のHAIレベル
フェレットの血清をFFFから入手し、Recepter Destroying Enzyme(RDE)で処理し、そして標準的な手順(Kendalら、(1982))によってヘマグルチニン阻害(HAI)アッセイにおいて試験した。試験した実験のために選択した全てのフェレットは、現在流行しているヒトインフルエンザウイルス(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A Panama/2007/99(H3N2)、A/Wellington/01/04(H2N3)、およびB/Sichuan/379/99、およびH5N1)に対する既存の抗体についてはネガティブ(HAI=10)であった。
フェレットの血清をFFFから入手し、Recepter Destroying Enzyme(RDE)で処理し、そして標準的な手順(Kendalら、(1982))によってヘマグルチニン阻害(HAI)アッセイにおいて試験した。試験した実験のために選択した全てのフェレットは、現在流行しているヒトインフルエンザウイルス(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A Panama/2007/99(H3N2)、A/Wellington/01/04(H2N3)、およびB/Sichuan/379/99、およびH5N1)に対する既存の抗体についてはネガティブ(HAI=10)であった。
フェレット
およそ8ヶ月齢の、インフルエンザに感染したことのない、去勢したもの、および去勢していない雄のFitchフェレット(Mustela putorius furo)をFFFから購入した。動物を、Sani−chips Laboratory Animal Bedding(P.J.Murphy Forest Products,NJ)を含むステンレス鋼製のウサギ用のケージ(Shor−line,KS)の中で飼育した。フェレットには、Teklad Global Ferret Diet(Harlan Teklad,WI)と新鮮な水を不断給餌で与えた。皿は1週間に3回交換し、ケージは1週間に2回(byweekly)清掃した。
およそ8ヶ月齢の、インフルエンザに感染したことのない、去勢したもの、および去勢していない雄のFitchフェレット(Mustela putorius furo)をFFFから購入した。動物を、Sani−chips Laboratory Animal Bedding(P.J.Murphy Forest Products,NJ)を含むステンレス鋼製のウサギ用のケージ(Shor−line,KS)の中で飼育した。フェレットには、Teklad Global Ferret Diet(Harlan Teklad,WI)と新鮮な水を不断給餌で与えた。皿は1週間に3回交換し、ケージは1週間に2回(byweekly)清掃した。
フェレットのワクチン接種と採血
ワクチンであるH3N2インフルエンザVLPまたはH9N2インフルエンザVLPと、対照(例えば、rH3NA(A/Wyoming/3/2003)およびPBS(ネガティブ対照))は使用するまで4℃で保存しておいた。ほとんどの実験については、フェレットの6つのグループ(N−6/グループ)に、0.5mlの容量中のいずれかの濃度のワクチンまたは対照を筋肉内にワクチン接種した。
ワクチンであるH3N2インフルエンザVLPまたはH9N2インフルエンザVLPと、対照(例えば、rH3NA(A/Wyoming/3/2003)およびPBS(ネガティブ対照))は使用するまで4℃で保存しておいた。ほとんどの実験については、フェレットの6つのグループ(N−6/グループ)に、0.5mlの容量中のいずれかの濃度のワクチンまたは対照を筋肉内にワクチン接種した。
採血およびワクチン接種の前に、動物を、カタミン(Katamine)(25mg/kg)、アトロピン(Atropine)(0.05mg/kg)とキシラジン(Xylazine)(2.0mg/kg)の溶液「KAX」で太ももの内側への筋肉内注射によって麻酔した。麻酔がかかった時点で、フェレットを背を下にして寝させ、1ccのツベルクリン注射器に取り付けた23ゲージの1’’針を使用して、前脚の静脈から血液を採血した(0.5から1.0mlの間の容量)。血液を、血清分離装置と血餅活性化因子(clot activaor)が含まれているチューブに移して、室温で凝血させた。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、そして−80℃で凍結させた。血液は、ワクチン接種前(0日目)、追加ワクチン接種の前(21日目)、および42日目に採血し、HAIアッセイによって試験した。
フェレットのモニタリング
温度を、実験期間の間中、ほぼ同じ時間に1週間に1回測定した。ワクチン接種前の値を平均して、個々のフェレットについてのベースライン温度を得た。温度(カ氏温度)の変化を、個々の動物についてそれぞれの時点で計算した。フェレットを、有害なワクチン効果の臨床的兆候(温度、体重の減少、活動の減少、鼻汁、くしゃみ、および下痢を含む)について毎週試験した。Reumanら(1989)に記載されているシステムに基づくスコアリングシステムを使用して、活性のレベルを評価した。ここでは、0=機敏であり、よくじゃれる;1=機敏であるが、刺激を与えた時にしかじゃれない;2=機敏であるが、刺激を与えてもじゃれない;3=機敏ではなく、刺激を与えてもじゃれない。グループの中の個々の動物についてのスコアに基づいて、相対的な非活動指数を、Σ(0日目−42日目)[活動スコア+1]/Σ(0日目−42日目)として計算した。式中、nは観察の総数に等しい。1の値を個々のベーススコアに加え、「0」のスコアを分母で割り算できるようにして、1.0の指標値を得た。
温度を、実験期間の間中、ほぼ同じ時間に1週間に1回測定した。ワクチン接種前の値を平均して、個々のフェレットについてのベースライン温度を得た。温度(カ氏温度)の変化を、個々の動物についてそれぞれの時点で計算した。フェレットを、有害なワクチン効果の臨床的兆候(温度、体重の減少、活動の減少、鼻汁、くしゃみ、および下痢を含む)について毎週試験した。Reumanら(1989)に記載されているシステムに基づくスコアリングシステムを使用して、活性のレベルを評価した。ここでは、0=機敏であり、よくじゃれる;1=機敏であるが、刺激を与えた時にしかじゃれない;2=機敏であるが、刺激を与えてもじゃれない;3=機敏ではなく、刺激を与えてもじゃれない。グループの中の個々の動物についてのスコアに基づいて、相対的な非活動指数を、Σ(0日目−42日目)[活動スコア+1]/Σ(0日目−42日目)として計算した。式中、nは観察の総数に等しい。1の値を個々のベーススコアに加え、「0」のスコアを分母で割り算できるようにして、1.0の指標値を得た。
血清の調製
血清は、一般的には、ヘマグルチニンに対する非特異的阻害因子について低いレベルを有していた。これらの非特異的阻害因子を不活化させるために、血清を、試験する前に(RDE)で処理した。簡単に説明すると、3部のRDEを1部の血清に添加して、37℃で一晩インキュベートした。RDEを、56℃で30分間のインキュベーションによって不活化させた。RDEの不活化の後、PBSを、1:10(RDE−Tx)の最終的な血清希釈のために試料に添加した。希釈したRDE−Tx血清を、試験するまで(7日間)4℃で保存したか、または−20℃で保存した。
血清は、一般的には、ヘマグルチニンに対する非特異的阻害因子について低いレベルを有していた。これらの非特異的阻害因子を不活化させるために、血清を、試験する前に(RDE)で処理した。簡単に説明すると、3部のRDEを1部の血清に添加して、37℃で一晩インキュベートした。RDEを、56℃で30分間のインキュベーションによって不活化させた。RDEの不活化の後、PBSを、1:10(RDE−Tx)の最終的な血清希釈のために試料に添加した。希釈したRDE−Tx血清を、試験するまで(7日間)4℃で保存したか、または−20℃で保存した。
シチメンチョウの赤血球の調製:
ヒトインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,6−ガラクトース結合を含むシアル酸受容体に結合する。トリインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,3ガラクトース(α2,3結合)を含むシアル酸受容体に結合し、α2,3およびα2,6結合の両方を発現する。シチメンチョウの赤血球(TRBC)をHAIアッセイに使用した。なぜなら、A/Fujianはヒトインフルエンザウイルスであるからである。TRBCは、PBSで0.5%vol/vol懸濁液となるように調節した。細胞を4℃で維持し、調製から72時間以内に使用した。
ヒトインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,6−ガラクトース結合を含むシアル酸受容体に結合する。トリインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,3ガラクトース(α2,3結合)を含むシアル酸受容体に結合し、α2,3およびα2,6結合の両方を発現する。シチメンチョウの赤血球(TRBC)をHAIアッセイに使用した。なぜなら、A/Fujianはヒトインフルエンザウイルスであるからである。TRBCは、PBSで0.5%vol/vol懸濁液となるように調節した。細胞を4℃で維持し、調製から72時間以内に使用した。
HAIアッセイ
HAIアッセイを、CDCの研究室をベースとするインフルエンザの管理マニュアル(全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるKendalら、(1982)Concepts and procerudes for laboratory based influenza surveillance,U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,Centers for Disease Control,Atlanta,Georgia)から採用した。RDE−Tx血清を、v底マイクロタイタープレートの中で段階的に2倍希釈した。ウイルスを等容量になるように調節し、それぞれのウェルにおよそ8HAU/50μlに調節したものを添加した。プレートにカバーをかけ、室温で15分間インキュベートし、その後、0.5%のTRBCを添加した。プレートを攪拌によって混合し、カバーをかけ、そしてTRBCを室温で30分間沈殿させた。HAI力価を、凝集しなかったTRBCが含まれていた最後の列の希釈率の逆数によって決定した。ポジティブ血清対照とネガティブ血清対照をそれぞれのプレートに含めた。
HAIアッセイを、CDCの研究室をベースとするインフルエンザの管理マニュアル(全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるKendalら、(1982)Concepts and procerudes for laboratory based influenza surveillance,U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,Centers for Disease Control,Atlanta,Georgia)から採用した。RDE−Tx血清を、v底マイクロタイタープレートの中で段階的に2倍希釈した。ウイルスを等容量になるように調節し、それぞれのウェルにおよそ8HAU/50μlに調節したものを添加した。プレートにカバーをかけ、室温で15分間インキュベートし、その後、0.5%のTRBCを添加した。プレートを攪拌によって混合し、カバーをかけ、そしてTRBCを室温で30分間沈殿させた。HAI力価を、凝集しなかったTRBCが含まれていた最後の列の希釈率の逆数によって決定した。ポジティブ血清対照とネガティブ血清対照をそれぞれのプレートに含めた。
実施例21
フェレットでのA/HongKong/1073/99(H9N2)VLP用量範囲の実験
インフルエンザウイルスについてヘマグルチニン阻害によって血清学的にネガティブであったフェレットを使用して、H9N2 VLPの接種後の抗体およびHI力価を評価した。フェレットを、0日目および21日目に採血し、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。結果を図22に示す。これらの結果は、HI力価が1.5および15μgのVLP用量での防御抗体レベルに対応することを示している。
フェレットでのA/HongKong/1073/99(H9N2)VLP用量範囲の実験
インフルエンザウイルスについてヘマグルチニン阻害によって血清学的にネガティブであったフェレットを使用して、H9N2 VLPの接種後の抗体およびHI力価を評価した。フェレットを、0日目および21日目に採血し、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。結果を図22に示す。これらの結果は、HI力価が1.5および15μgのVLP用量での防御抗体レベルに対応することを示している。
実施例21
フェレットでのH3N2 VLPのワクチン接種
フェレットを、0日目にワクチン接種し、そして21日目には、様々な投与量の様々なH3N2株のVLPで追加免疫を投与した(0.12、0.6、3.0、15.0μgのHA投与量)。ポジティブ対照は、15μgのrH3HAであり、PBSだけをネガティブ対照とした。上記のように、血清を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目にフェレットから採血した。HIアッセイを血清試料について行って、VLPに対する免疫応答があるかどうかを決定した。これらのデータを図23に示す。これらのデータは、H3N2 VLPが、フェレットに導入した場合には、免疫応答を誘導することを示している。したがって、H3N2 VLPはフェレットにおいては免疫原性である。
フェレットでのH3N2 VLPのワクチン接種
フェレットを、0日目にワクチン接種し、そして21日目には、様々な投与量の様々なH3N2株のVLPで追加免疫を投与した(0.12、0.6、3.0、15.0μgのHA投与量)。ポジティブ対照は、15μgのrH3HAであり、PBSだけをネガティブ対照とした。上記のように、血清を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目にフェレットから採血した。HIアッセイを血清試料について行って、VLPに対する免疫応答があるかどうかを決定した。これらのデータを図23に示す。これらのデータは、H3N2 VLPが、フェレットに導入した場合には、免疫応答を誘導することを示している。したがって、H3N2 VLPはフェレットにおいては免疫原性である。
実施例22
インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子のRT−PCRならびにクローニング
Clade 2インフルエンザウイルスであるA/Indonesia/5/05株(H5N1)ウイルスのRNAを、BSL−3封じ込め条件下で、Trizol LS(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して抽出した。逆転写(RT)およびPCRを、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたOne−Step RT−PCRシステム(InVitrogen)を使用して、抽出したウイルスRNAについて行った。以下のプライマーを、それぞれ、H5N1ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、およびマトリックス(M1)遺伝子の合成のために使用した:
インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子のRT−PCRならびにクローニング
Clade 2インフルエンザウイルスであるA/Indonesia/5/05株(H5N1)ウイルスのRNAを、BSL−3封じ込め条件下で、Trizol LS(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して抽出した。逆転写(RT)およびPCRを、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたOne−Step RT−PCRシステム(InVitrogen)を使用して、抽出したウイルスRNAについて行った。以下のプライマーを、それぞれ、H5N1ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、およびマトリックス(M1)遺伝子の合成のために使用した:
RT−PCRの後、それぞれ、1.7、1.4、および0.7kBの分子量を有しているインフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子が含まれているcDNA断片を、pCR2.1−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。HA、NA,およびM1遺伝子のヌクレオチド配列を、DNA配列決定によって決定した。同様のストラテジーを、Vietnam/1203/2003からのclade 1 H5N1インフルエンザウイルスのクローニングのために行った。
実施例23
H5N1を含む組み換え体バキュロウイルスの作成
HA遺伝子を、RsrIIとHindIIIで消化したpFastBac1バックミドトランスファーベクター(Invitorgen)の中に、AcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流にRsrII−HindIII DNA断片(1.7kb)としてクローニングした。同様に、NAおよびM1遺伝子を、EcoRI−HindIIIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に、EcoRI−HindIII DNA断片(それぞれ、1.4kbおよび0.8kb)としてクローニングした。インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子をそれぞれ含む、3種類の得られたバキュロウイルストランスファープラスミドpHA、pNA、およびpM1を使用して、組み換え体バックミドを作成した。
H5N1を含む組み換え体バキュロウイルスの作成
HA遺伝子を、RsrIIとHindIIIで消化したpFastBac1バックミドトランスファーベクター(Invitorgen)の中に、AcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流にRsrII−HindIII DNA断片(1.7kb)としてクローニングした。同様に、NAおよびM1遺伝子を、EcoRI−HindIIIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に、EcoRI−HindIII DNA断片(それぞれ、1.4kbおよび0.8kb)としてクローニングした。インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子をそれぞれ含む、3種類の得られたバキュロウイルストランスファープラスミドpHA、pNA、およびpM1を使用して、組み換え体バックミドを作成した。
バックミドは、AcMNPVバキュロウイルスゲノムを含むE.coli DH10Bacコンピテント細胞(Invitrogen)の中にインフルエンザ遺伝子を含むバックミドトランスファープラスミドの形質転換後の、部位特異的相同組み換えによって得た。組み換え体バックミドDNAを、Sf9昆虫細胞にトランスフェクトした。
Indonesia/5/05のHA、NA、およびM1遺伝子のヌクレオチド配列
HA(配列番号10)
HA(配列番号10)
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたインフルエンザA/Indonesia/5/05のHA、NA、およびM1遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、Indonesia/5/05のHA遺伝子に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する(実施例31を参照のこと)。コドンが最適化させられたヌクレオチドは、米国特許公開番号2005/0118191(全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる)に開示されている方法にしたがって設計し、生産した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。ヌクレオチド配列については実施例31を参照のこと。
Vac2−hac−opt(修飾されていないアミノ酸配列)(配列番号27)
(修飾された、キチナーゼに由来するシグナルペプチド、下線)(配列番号28)
Vac2−naj−opt(ノイラミニダーゼ)(配列番号31)
実施例24
RT−PCRによるClade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)インフルエンザウイルスのクローニング
HA、NA、およびM1遺伝子を、上記の方法にしたがってRT−PCRによってクローニングした。以下の配列は、クローニングした遺伝子と比較した公開されている遺伝子の比較である。
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のHA遺伝子
上のレーン:Acc#AY818135 HA遺伝子(配列番号36)
下のレーン:NovavaxのA/Vietnam/1203/2004(H5N1)HA遺伝子(配列番号37)
RT−PCRによるClade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)インフルエンザウイルスのクローニング
HA、NA、およびM1遺伝子を、上記の方法にしたがってRT−PCRによってクローニングした。以下の配列は、クローニングした遺伝子と比較した公開されている遺伝子の比較である。
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のHA遺伝子
上のレーン:Acc#AY818135 HA遺伝子(配列番号36)
下のレーン:NovavaxのA/Vietnam/1203/2004(H5N1)HA遺伝子(配列番号37)
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のNA遺伝子(配列番号39)
H5N1naLANL ISDN 38704×NA_Viet1203_Lark(NVAX)(配列番号38)
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のM1遺伝子(配列番号40)
H5N1m1Lanl ISDN 39958×M1_Viet1203_Lark(NVAX)(配列番号41)
実施例25
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 1 H5N1インフルエンザA/VietNam/1203/04のHA、NA、およびM1遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、A/VietNam/1203/04に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する。ヌクレオチドは、上記に開示したように(実施例24を参照のこと)設計し、そして合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。
VN1203−ha−cs−opt(修飾された切断部位、下線)(配列番号33)
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 1 H5N1インフルエンザA/VietNam/1203/04のHA、NA、およびM1遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、A/VietNam/1203/04に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する。ヌクレオチドは、上記に開示したように(実施例24を参照のこと)設計し、そして合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。
VN1203−ha−cs−opt(修飾された切断部位、下線)(配列番号33)
H5N1 Vietnam/1203/2003 VLPの免疫原性(極端な投与量の節約)
BALB/cマウスを、極めて低用量のVLP(0.2、0.04、0.008、0.0016μgのHA/用量)で、H5N1 VLPで筋肉内および鼻腔内に免疫化した。マウスを、0日目、21日目、および35日目に採血した。マウスを21日目に追加免疫した。血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAを使用してインフルエンザウイルスについてアッセイした。この実験の結果を図24および25に示す。
結果は、VLPを極めて低用量で筋肉内に投与した場合には、強い全体的な免疫応答が観察されたことを示している。応答の強さは、3.0および0.6μgのHA/用量では対照と同程度であった。これらのデータは、0.2μgのVLPに対する真の用量応答と抗体応答が、3.0μgのrHAタンパク質よりも大きいことが見られることを示している。応答は、鼻腔内投与ほど強くはないが、0.2μgのHA/用量でのVLPの用量によっては、強い応答が誘導された。この実験において0.2μgの用量を用いた場合のELISA力価は、以前の実験(上記を参照のこと)での0.12μgのH3N2 VLPワクチンの用量と同程度である。
実施例27
チャレンジ実験
BALB/cマウスに、3μg、0.6μg、0.12μg、および0.02μgの濃度のH3N2 VLPでVLPを筋肉内および鼻腔内(合計のHA用量)に接種した後、マウスを、インフルエンザウイルスA/Aichi/268×31でチャレンジした。この実験の結果を図27および28に示す。これらのデータは、全てのワクチン接種した動物において体重が減少したが、3.0μgおよび0.12μgのVLPをワクチン接種した動物は、筋肉内でのワクチン接種および鼻腔内でのワクチン接種のいずれにおいても、他の動物よりも早く回復したことを示している。鼻腔内での投与によっては、高い防御が提供された。
チャレンジ実験
BALB/cマウスに、3μg、0.6μg、0.12μg、および0.02μgの濃度のH3N2 VLPでVLPを筋肉内および鼻腔内(合計のHA用量)に接種した後、マウスを、インフルエンザウイルスA/Aichi/268×31でチャレンジした。この実験の結果を図27および28に示す。これらのデータは、全てのワクチン接種した動物において体重が減少したが、3.0μgおよび0.12μgのVLPをワクチン接種した動物は、筋肉内でのワクチン接種および鼻腔内でのワクチン接種のいずれにおいても、他の動物よりも早く回復したことを示している。鼻腔内での投与によっては、高い防御が提供された。
実施例29
チャレンジ実験(フェレット)
この実験では、フェレットにH9N2 VLPをワクチン接種した。全部で18匹のフェレットをチャレンジ実験に含めた:6匹には模擬ワクチンを、6匹には、中用量(1.5μg)を、そして6匹には高用量(15.0μg)を筋肉内にワクチン接種した。次に、フェレットに、A/HK/1073/99の106 EID50を鼻腔内にチャレンジした。鼻腔洗浄液を、1日目、3日目、5日目、および7日目に回収した。鼻腔洗浄液の中のウイルスを、全ての動物について3日目、5日目、および7日目に滴定した。これらのデータを表2および図29に示す。これらのデータは、7日目までに、ワクチン接種した全ての動物について、鼻腔洗浄液の中に検出できるウイルスはなく、一方、模擬グループは検出できるウイルス力価を有していたことを示している。
表2 ウイルスでのチャレンジ後のフェレットにおける野生型ウイルス力価(log10/ml)
グループ:プラセボによる模擬対照(n=6)
チャレンジ実験(フェレット)
この実験では、フェレットにH9N2 VLPをワクチン接種した。全部で18匹のフェレットをチャレンジ実験に含めた:6匹には模擬ワクチンを、6匹には、中用量(1.5μg)を、そして6匹には高用量(15.0μg)を筋肉内にワクチン接種した。次に、フェレットに、A/HK/1073/99の106 EID50を鼻腔内にチャレンジした。鼻腔洗浄液を、1日目、3日目、5日目、および7日目に回収した。鼻腔洗浄液の中のウイルスを、全ての動物について3日目、5日目、および7日目に滴定した。これらのデータを表2および図29に示す。これらのデータは、7日目までに、ワクチン接種した全ての動物について、鼻腔洗浄液の中に検出できるウイルスはなく、一方、模擬グループは検出できるウイルス力価を有していたことを示している。
表2 ウイルスでのチャレンジ後のフェレットにおける野生型ウイルス力価(log10/ml)
グループ:プラセボによる模擬対照(n=6)
マウスでの筋肉内および鼻腔内接種実験
マウスに、0日目に、3μg、0.6μg、0.12μg、または0.024μg(合計のHA用量)の濃度のA/Fujian/411/2002(H3N2)VLPを、筋肉内または鼻腔内に接種し、3週間後に追加免疫した。対照マウスには、ホルマリンで不活化させたA/Wyoming(Fujian−Like、ワクチン株)またはPBSを接種した。血清を接種したマウスから、0週目、3週目、5週目、および8週目に回収した。回収した血清を、ヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。アッセイは、H3N2のA/Fujian/411/2002、A/Panama/2007/99、A/Wyoming/3/03、およびA/NewYork/55/2004インフルエンザウイルス株を使用して行った。この実験の結果を図30A〜Hに示す。これらのデータは、H3N2 VLPによって、元のインフルエンザウイルスA/Fujian/411/2002株に対する抗体と、他のH3N2株に対する抗体が誘導されたことを示している。これらのデータはまた、筋肉内に接種したマウスよりも、鼻腔内に摂取したマウスにおいては力価が遅れて上昇することを示している。しかし、鼻腔内投与による力価は、約8週間後には筋肉内投与による力価よりも高い。加えて、不活化ウイルス抗原に対する力価は、筋肉内接種後の等用量のVLPに匹敵することが明らかである。しかし、不活化抗原は、鼻腔内接種後には免疫原性ではないようであり、鼻腔内接種後にも広く防御的ではないようである。
実施例31
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 2 H5N1インフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子の作成
Clade 2 H5N1ウイルス、A A/Indonesia/5/05、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、およびA/Anhui/1/2005のHA、NA、およびM1に対応する、以下の最適化させられたヌクレオチドおよびポリペプチドを、上記に開示したように設計し、合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。最適化されたヌクレオチドおよびポリペプチドを以下に列挙する。VLPを作成するために、A/Anhui HAは、A/Indonesia NAおよびM1を用いて発現させることができる。A/Quinghai HAおよびNAが含まれているVLPについては、A/Indonesia M1遺伝子をA/Quinghai HAおよびNAと同時に発現させることができる。
A/INDONESIA/5/05
A/INDONESIAの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号42)
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 2 H5N1インフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子の作成
Clade 2 H5N1ウイルス、A A/Indonesia/5/05、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、およびA/Anhui/1/2005のHA、NA、およびM1に対応する、以下の最適化させられたヌクレオチドおよびポリペプチドを、上記に開示したように設計し、合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。最適化されたヌクレオチドおよびポリペプチドを以下に列挙する。VLPを作成するために、A/Anhui HAは、A/Indonesia NAおよびM1を用いて発現させることができる。A/Quinghai HAおよびNAが含まれているVLPについては、A/Indonesia M1遺伝子をA/Quinghai HAおよびNAと同時に発現させることができる。
A/INDONESIA/5/05
A/INDONESIAの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号42)
(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号44)
A/Anhuiの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号50)
A/Qinghaiの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号52)
A/QinghaiのNAタンパク質配列(配列番号55)
当業者は、日常的に行われる実験以上のものを用いることなく、本明細書中に記載される本発明の特異的な実施形態と同等の多くのものを理解するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求項に包含することが意図される。
(配列表)
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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US6387373B1 (en) | 1993-01-15 | 2002-05-14 | Novavax, Inc. | Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants |
US5629021A (en) | 1995-01-31 | 1997-05-13 | Novavax, Inc. | Micellar nanoparticles |
WO2002000885A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | American Cyanamid Company | Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps) |
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US8592197B2 (en) * | 2003-07-11 | 2013-11-26 | Novavax, Inc. | Functional influenza virus-like particles (VLPs) |
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