JP2016135142A - 機能的インフルエンザウイルス様粒子(vlp) - Google Patents
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Abstract
Description
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のファミリーのメンバーである(概要については、Murphy and Webster,1996を参照のこと)。これには、A、B、およびCと指定されたインフルエンザウイルスの3つのサブタイプが存在している。インフルエンザのビリオンには、断片化されているマイナスセンスのRNAゲノムが含まれている。インフルエンザのビリオンには以下のタンパク質が含まれる:ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックス(M1)、プロトンイオン−チャンネルタンパク質(M2)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)タンパク質。HA、NA、M1、およびM2は膜結合型であり、一方、NP、PB1、PB2、PA、およびNS2はヌクレオカプシド結合タンパク質である。NS1は、ビリオン粒子に結合していない唯一の非構造タンパク質であるが、これは、インフルエンザに感染した細胞に特異的である。M1タンパク質は、インフルエンザ粒子の中に最も豊富に存在しているタンパク質である。HAタンパク質とNAタンパク質は、ウイルスの付着、および細胞へのウイルス粒子の浸潤に関与しているエンベロープ糖タンパク質であり、そしてウイルスの中和および防御免疫のための主要な免疫優性エピトープの供給源である。HAタンパク質およびNAタンパク質はいずれも、予防的なインフルエンザワクチンの最も重要な成分と考えられている。
いくつかの実験によって、組み換え体インフルエンザタンパク質が、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用する細胞培養物中でVLPになるように自己アセンブリすることができることが明らかにされている(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3)。非特許文献1によっては、インフルエンザVLPの効率的な形成がウイルスタンパク質の発現レベルに依存していることが明らかにされた。非特許文献2によっては、クローニングされたcDNAに完全に由来する感染性のインフルエンザウイルス様粒子を作成するための、哺乳動物発現プラスミドをベースとするシステムが確立された。非特許文献3によっては、HA、NA、M1、およびM2遺伝子を同時発現する組み換え体であるバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞中でのインフルエンザVLPの形成が報告された。これらの実験により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核生物細胞の中での同時発現されると自己アセンブリし得ることが明らかとなった。
本発明により、インフルエンザウイルスM1タンパク質とインフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれているウイルス様粒子(VLP)が提供される。1つの実施形態においては、M1タンパク質は、H5およびN1タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態においては、上記H5またはN1は、H5N1クレード1のインフルエンザウイルスに由来する。
本発明にはさらに、インフルエンザVLPが含まれている抗原性処方物が含まれる。ここでは、上記ワクチンは、被験体に投与されると、インフルエンザウイルス感染またはその少なくとも1つの症状に対する実質的な免疫力を誘導する。1つの実施形態においては、上記インフルエンザVLPはトリインフルエンザVLPである。別の実施形態においては、上記インフルエンザVLPは季節的なインフルエンザのVLPである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
インフルエンザウイルスM1タンパク質と、インフルエンザウイルスH5およびN1ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質が含まれている、ウイルス様粒子(VLP)。
(項目2)
前記M1タンパク質が、H5およびN1タンパク質タンパク質と比較して、異なるインフルエンザウイルス株に由来する、項目1に記載のVLP。
(項目3)
前記H5またはN1が、H5N1 clade 1インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目4)
前記H5およびN1が、H5N1 clade 2インフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目5)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号43および46、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目3に記載のVLP。
(項目6)
前記H5およびN1タンパク質に、それぞれ、配列番号50および54、または、前記配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む配列が含まれている、項目4に記載のVLP。
(項目7)
前記H5およびN1が、感染した動物から単離されたインフルエンザウイルス由来である、項目1に記載のVLP。
(項目8)
前記感染した動物がヒトである、項目7に記載のVLP。
(項目9)
前記VLPが、VLPの形成が可能な条件下で、インフルエンザH5およびN1タンパク質をコードする核酸と、インフルエンザM1タンパク質をコードする核酸のうちの1つ以上を含む真核生物細胞から発現される、項目1に記載のVLP。
(項目10)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目9に記載のVLP。
(項目11)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目10に記載のVLP。
(項目12)
前記昆虫細胞がSf9である、項目11に記載のVLP。
(項目13)
前記VLPが、ヒトまたは動物に投与されるとインフルエンザ感染に対して防御的である中和抗体を前記ヒトまたは動物において誘発する、項目1に記載のVLP。
(項目14)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれている免疫原性組成物。(項目15)
前記組成物にアジュバントが含まれている、項目14に記載の組成物。
(項目16)
項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの有効用量が含まれているワクチン。
(項目17)
前記ワクチンに、様々なインフルエンザ株に由来するHAおよびNAを含む第2のVLPが少なくとも含まれている、項目16に記載のワクチン。
(項目18)
前記ワクチンにアジュバントが含まれている、項目16または17に記載のワクチン。
(項目19)
前記アジュバントにNovasomes(登録商標)が含まれている、項目15もしくは18に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
(項目20)
項目16〜18のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法。
(項目21)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記動物がヒトである、項目20または21に記載の方法。
(項目23)
動物用のワクチンの調製のための、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPの使用であって、前記ワクチンが前記動物においてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目24)
前記ワクチンが動物に対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目23に記載の方法。
(項目25)
真核生物細胞の中で前記M1、HA、およびNAタンパク質を発現させる工程が含まれる、項目1〜13のいずれか1項に記載のVLPを作成する方法。
(項目26)
前記真核生物細胞が、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物の細胞からなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記真核生物細胞が昆虫細胞である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記昆虫細胞がSf9である、項目27に記載の方法。
(項目29)
インフルエンザH5またはN1タンパク質の少なくとも1つをコードする、昆虫細胞発現ベクター。
(項目30)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目31)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPは、原則として、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目32)
インフルエンザVLPを含むワクチンであって、前記VLPには、M1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、ワクチン。
(項目33)
ヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する方法であって、項目30〜32のいずれか1項に記載のワクチンの少なくとも1有効用量を投与する工程が含まれる、方法。
(項目34)
前記ワクチンが、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目33に記載の方法。
(項目35)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPにインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目36)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPがインフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなり、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目37)
ワクチンの調製のためのインフルエンザVLPの使用であって、前記VLPに、インフルエンザM1、HA、およびNAタンパク質からなる群より選択されるインフルエンザタンパク質が含まれており、前記ワクチンがヒトにおいてインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫力を誘導する、使用。
(項目38)
前記ワクチンがヒトに対して、経口で、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される、項目35〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記ワクチンがバキュロウイルスを不活化させるために処理される、項目16〜19および30〜32のいずれか1項に記載のワクチン。
(項目40)
前記不活化処理に、およそ0.2%のβ−プロピルラクトン(BPL)中にVLPを含む試料を、約25℃で約3時間インキュベートする工程が含まれる、項目40に記載のワクチン。
本明細書中で使用される場合は、用語「バキュロウイルス」はバキュロウイルス科としても知られており、節足動物のエンベロープを有しているDNAウイルスのファミリーを意味する。そのうちの複数メンバーは、昆虫細胞培養物中で組み換え体タンパク質を生産させるための発現ベクターとして使用することができる。ビリオンには、環状のスーパーコイル状の二本鎖のDNA分子が含まれている1つ以上の桿状のヌクレオカプシドが含まれる(Mr 54×106〜154×106)。ベクターとして使用されるウイルスは、通常は、Autographa californica核多角体病ウイルス(NVP)である。導入された遺伝子の発現は、その中ではウイルスが感染させられた細胞の中に埋め込まれている大きな核内封入体の多面体タンパク質成分の発現を通常制御する強いプロモーターの制御下にある。
Drug Administration)(FDA)の諮問委員会と、WHO会議に提示される。これらの会議により、その後の秋および冬のためのfluワクチンに入れられる3種類のウイルス(A型インフルエンザウイルスの2つのサブタイプとB型インフルエンザウイルスの1つのサブタイプ)の選択が行われる。選択は、北半球では2月に、南半球では9月に行われる。通常、ワクチンの中の3種類の株のうちの1つまたは2つは毎年変えられる。
本発明のインフルエンザVLPは、インフルエンザウイルスに対するワクチンの調製に有用である。このシステムの1つの重要な特徴は、HAおよび/もしくはNAまたは他のウイルスタンパク質のさまざまなサブタイプを有している表面糖タンパク質を置き換え、したがってそれによって毎年の新しいインフルエンザの抗原性変異体のアップデートと、インフルエンザの世界的流行に備えた準備を可能にする能力である。これらの糖タンパク質の抗原性変異体が同定されているので、VLPは、これらの新しい変異体(例えば、季節的なインフルエンザワクチンについての新しい変異体)を含むようにアップデートすることができる。加えて、世界的流行の可能性があるウイルス(例えば、H5N1)に由来する表面糖タンパク質、または世界的流行の可能性がある他のHA、NAの組み合わせを、数十年間ヒトにおいては流行しなかった遺伝子の放出を懸念することなく、VLPの中に取り込ませることができる。その理由は、VLPが感染性ではないこと、複製しないこと、および疾患を引き起こし得ないことである。したがって、このシステムにより、毎年新しい候補のインフルエンザワクチンを作成することが可能となり、そして/または、必要である場合にはいつでもインフルエンザの世界的流行に対するワクチンを作成することが可能となる。
本明細書中で有用な薬学的組成物には、薬学的に許容される担体(任意の適切な希釈剤または賦形剤が含まれる)(これには、それ自体は組成物を投与される脊椎動物に対して有害な免疫応答の生産を誘導することはなく、そして、投与されても過度の毒性は伴わない任意の薬学的物質が含まれる)と本発明のVLPが含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは、米国薬局方、欧州薬局方、または脊椎動物(およびより具体的には、ヒト)での使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御性の免疫応答を誘導するためのワクチンおよび/または抗原性組成物として有用であり得る。
本発明のVLPは、インフルエンザウイルスに対する免疫力または実質的な免疫力を付与する免疫応答を刺激する組成物を調製するために有用である。粘膜免疫および細胞性の免疫のいずれもが、インフルエンザ感染および疾患に対する免疫力に寄与し得る。上部呼吸管に局所的に分泌される抗体は、自然な感染に対する抵抗力の主要な要因である。分泌型の免疫グロブリンA(sIgA)は、上部呼吸管の防御に、そして血清IgGは下部呼吸管の防御に関与している。感染によって誘導された免疫応答は、同じウイルスへの再感染、または抗原的に類似しているウイルス株への再感染を防御する。インフルエンザウイルスは、頻繁に、そして予想できない変化を受ける;したがって、自然な感染後には、宿主の免疫力によって提供された防御の有効期間は、社会に流行する新しいウイルス株に対してはわずかに数年間しかない。
材料および方法
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルスバックミド発現システムを使用してヨウトガ(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf−9S細胞株;ATCC PTA−4047)の中で発現させた。HA、NA、およびM1遺伝子を逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスから単離したRNAを使用して合成した(図1、2、および3)。逆転写およびPCRのために、トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した(表1)。これらの遺伝子のcDNAコピーを、最初に、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPOにクローニングした。得られた3種類のpCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルストランスファーベクターpFastBac1(InVitrogen)の中のAcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、3種類のpFastBac−1をベースとするプラスミド:それぞれ、これらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するpHA、pNA、およびpM1を得た。その後、HA遺伝子とM1遺伝子の両方(それぞれ、別のポリヘドリンプロモーターの下流にある)をコードする1つのpFastBac1をベースとするプラスミドpHAMを構築した(図4)。pNAプラスミドの中に隣接する5’領域と3’領域を有しているNA遺伝子のヌクレオチド配列を決定した(配列番号1)(図1)。同時に、隣接する領域を有しているHA遺伝子とM1遺伝子のヌクレオチド配列もまた、pHAMプラスミドを使用して決定した(配列番号2および3)(図2および3)。
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
組み換え体インフルエンザウイルスタンパク質の生産を指示することができる合成の核酸配列を提供することが、本発明の1つの目的である。そのような合成の核酸配列は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法によって、ウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然のゲノムRNAを使用して得た。この用途の目的については、核酸配列は、RNA、DNA、cDNA、またはタンパク質をコードするそれらの任意の合成の変異体を意味する。
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/94(H3N2)ウイルス遺伝子のRT−PCRクローニング
インフルエンザA/Sydney/5/97(H3N2)ウイルスは、M.Massare博士(Novavax,Inc.,Rockville,Md.)から得た。ウイルスのゲノムRNAを酸フェノールRNA抽出法によって、Novavax,Inc.のBSL2汚染条件下で、Trizol LS試薬(Invitrogen)を使用して単離した。ウイルスRNAのcDNA分子は、HA、NA、M1、M2、およびNPタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写とPCRによって得た(表1)。PCR断片を、細菌のサブクローニングベクターpCR2.1TOPO(InVitrogen)に、EcoRI部位の間にクローニングして、HA、HA、M1、M2、およびNP cDNAクローンを含む5種類の組み換え体プラスミドを得た。
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルス cDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、およびM1遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクター(InVitrogen)の中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−HAに由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−NAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−M1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌(InVitrogen)をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−HA、pFastBac1−NA、およびpFastBac1−M1を、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した(図4A)。クローニングした遺伝子の図1〜3に示したようなヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子についてのヌクレオチド配列と同じであることを示していた(インフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のNA、HA、およびM1遺伝子(それぞれ、GenBank登録番号AJ404629、AJ404626、およびAJ278646))。
ヒトインフルエンザA/Sydney/5/97ウイルスcDNAのバキュロウイルストランスファーベクターへのクローニング
pCR2.1TOPOをベースとするプラスミドから、HA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子を、pFastBac1バキュロウイルストランスファーベクターの中に、ポリへドロン遺伝子座とTn7 att部位の中に、そしてバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流であり、ポリアデニル化シグナル配列の上流にサブクローニングした。ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hHA3に由来するBamHI−Kpn I DNA断片をBamHI−KpnIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNAに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM1に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。M2遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM2に由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。NP遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNPに由来するEcoRI DNA断片をEcoRIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌をこれらのDNA連結反応物で形質転換し、形質転換されたコロニーを得、そして細菌クローンを単離した。得られたpFastBac1をベースとするプラスミドpFastBac1−hHA3、pFastBac1−hNA2、pFastBac1−hM1、pFASTBAC1−hM2、およびpFASTBAC1−hNPを、アガロースゲル上での制限酵素マッピングによって特性決定した。クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列を、自動DNA配列決定法によって決定した。DNA配列分析は、クローニングしたインフルエンザHA、NA、M1、M2、およびNP遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同じであることを示していた。
複数のトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスの遺伝子をコードする多重遺伝子バキュロウイルストランスファーベクターの構築
複数のインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)ウイルスの遺伝子を発現するpFastBac1をベースとするバックミドトランスファーベクターを構築するために、最初に、M1遺伝子が含まれているpFastBac1−M1プラスミドに由来するSnaBI−HpaI DNA断片を、pFastBac1−HAのHpaI部位にクローニングした。これにより、別々の発現カセットの中に、そして別々のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現させられるHA遺伝子とM1遺伝子の両方をコードするpFastBac1−HAMプラスミドを得た。
昆虫細胞の中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99ウイルスのNA、HA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスの作成
得られた多重遺伝子バックミドトランスファーベクターpFastBac1−NAHAMを使用して、昆虫細胞の中での発現のためのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子をコードする多重遺伝子組み換え体バキュロウイルスを作成した。組み換え体バックミドDNAを、コンピテントE.coli DH10BAC細胞(InVitrogen)の中に有しているpFastBac1−NAHAM DNAとAcMNPCバキュロウイルスゲノムとの間でのポリヘドリンとTn7 att DNA配列での部位特異的組み換えによって得た(図4B)。組み換え体バックミドDNAを、ミニプレップDNA法によって単離し、陽イオン性脂質CELLFECTIN(InVitrogen)を使用してSf−9s細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの後、組み換え体バキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてSf−9S昆虫細胞の中で増幅させた。ウイルスのストックをSf−9S昆虫細胞の中で調製し、そしてトリインフルエンザウイルスHA、NA、およびM1遺伝子産物の発現について特性決定した。得られた組み換え体バキュロウイルスをbNAHAM−H9N2と命名した。
昆虫細胞の中での組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99タンパク質の発現
無血清培地(HyQ SFM,HyClone,Ogden,Utah)の中で28℃の震盪フラスコの中で懸濁培養物として維持したSf−9S昆虫細胞を、3pfu/細胞の感染多重度(MOI)で、組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に2×106細胞/mlの細胞密度で感染させた。ウイルス感染を72時間進行させて、インフルエンザタンパク質を発現させた。感染した昆虫細胞中でのトリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHAおよびM1タンパク質の発現を、SDS−PAGEおよびウェスタン免疫ブロット分析によって確認した。SDS−PAGE分析は、4〜12%の直線勾配のNuPAGEゲル(Invitrogen)上で、還元条件と変性条件下で行った。ウェスタン免疫ブロット分析の中の一次抗体は、CDCから入手したトリインフルエンザウイルスA/HongKong/1073/99(H9N2)に対して惹起させられたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザM1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗血清(Serotec,UK)であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための二次抗体は、ウサギまたはマウスIgG(H+L)に対して惹起させられた、アルカリホスファターゼ結合ヤギIgG抗血清(Kirkegaard
and Perry Laboratories,Gaithersburg,Md.,USA)であった。これらの分析の結果(図5)は、HAタンパク質とM1タンパク質が、バキュロウイルスに感染させられた昆虫細胞の中で発現されることを示していた。
組み換え体トリインフルエンザH9N2ウイルス様粒子および巨大分子タンパク質複合体の精製
トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)のHA、NA、およびM1遺伝子産物を発現する組み換え体バキュロウイルスbNAHAM−H9N2に感染させたSf−9S昆虫細胞に由来する培養上清(200ml)を、低速遠心分離によって回収した。培養上清を、Sorval RC−5B高速遠心分離機でGS−3ローターを使用して、4℃で10,000×gで1時間の遠心分離によって明澄化させた。ウイルスとVLPを、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで3時間、4℃での、Sorval TH−641スイングバケットローターを使用した遠心分離によって、明澄化させた培養上清から単離した。ウイルスのペレットを、1mlのPBS(pH7.2)に再懸濁し、20〜60%の不連続なスクロース段階勾配上にロードし、Sorval OTD−65超遠心分離機の中での、27,000pmで16時間、4℃での、Sorval TH−641ローターを使用した遠心分離によって分解させた。画分(0.5ml)を、スクロース勾配の最上部から回収した。
ゲル濾過クロマトグラフィーによる組み換え体トリインフルエンザH9N2のVLPおよびタンパク質の分析
VLPのようなタンパク質巨大分子および単量体タンパク質は、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー上では、それらの質量の大きさおよび形状に基づいて異なって移動する。スクロース抗体画分に由来する組み換え体インフルエンザタンパク質が単量体タンパク質であるかまたはVLPのような巨大分子タンパク質複合体であるかを決定するために、14mlのSepharose CL−4B(Amersham)の樹脂ベッド容量を有しているクロマトグラフィーカラム(7mm×140mm)を準備した。サイズ排除カラムをPBSで平衡化し、それぞれ、2,000,000;20,000;および1,357ダルトンの見かけの分子量を有しているデキストランブルー(Dextran Blue)2000、デキストランイエロー(Dextran Yellow)、およびビタミンB12(Amersham Pharmacia)で較正して、カラムの空隙容量を決定した。空隙容量(6mlの画分)の中のカラムからは、デキストランブルー2000もまた溶出した。予想したように、組み換え体インフルエンザタンパク質複合体が、空隙容量(6mlの画分)のカラムから溶出した。この結果は、VLPのような高分子量の巨大分子タンパク質複合体の特徴である。カラム画分中のウイルスタンパク質を、上記実施例6に記載したように、ウェスタン免疫ブロット分析によって検出した。M1タンパク質は空隙容量の画分の中で検出された(図7)。予想したように、バキュロウイルスタンパク質もまた、空隙容量の中に含まれていた。
組み換え体インフルエンザVLPの電子顕微鏡検査
スクロース勾配上で単離した、組み換え体トリインフルエンザタンパク質が含まれている巨大分子タンパク質複合体がインフルエンザビリオンと同様の形態を有しているかどうかを決定するために、ネガティブ染色された試料の電子顕微鏡試験を行った。組み換え体トリインフルエンザA/HongKong/1073/99(H9N2)タンパク質複合体を、実施例7に記載したように、不連続なスクロース勾配上での超遠心分離によって培養上清から濃縮し、精製した。スクロース勾配画分のアリコートを、PBS(pH7.2)中の2%のグルタルアルデヒドで処理し、新しく放電させたプラスチック/炭素コーティングした格子上に吸着させ、そして蒸留水で洗浄した。試料を2%のタングストリン酸ナトリウム(pH6.5)で染色し、透過型電子顕微鏡(Philips)を使用して観察した。2つのスクロース勾配画分に由来するネガティブ染色した組み換え体トリインフルエンザH9N2タンパク質複合体の試料の電子顕微鏡写真は、2つのスクロース勾配画分から球状および棒状の粒子を示した(図8)。粒子は、様々な大きさ(60および80nm)および形態を有していた。両方のタイプの粒子の大きな複雑さもまた検出され、さらには、棒状の粒子も検出された(図8)。全ての観察されたタンパク質複合体構造は、インフルエンザウイルスHAおよびNAペプロマーに似ている鋭くとがった部分(spike)を有している表面上の突起を示した。80nmの粒子の大きさおよび外観は野生型インフルエンザウイルスの粒子のものと類似しているので、これらの構造はおそらくエンベロープを持ったインフルエンザVLPを呈する。およそ60nmの小さい粒子は、おそらく、形態学的にも、構造的にも、上記VLPとは異なるサブウイルス粒子を呈する。
ヘマグルチニンアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特徴の分析
精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質がインフルエンザウイルスの特徴である機能的活性(例えば、ヘマグルチニン活性およびノイラミニダーゼ活性)を有しているかどうかを決定するために、精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質を、ヘマグルチニンアッセイおよびノイラミニダーゼアッセイにおいて試験した。
ノイラミニダーゼアッセイによるインフルエンザタンパク質の機能的特性の分析
インフルエンザVLPが含まれているスクロース勾配画分中のノイラミニダーゼ活性の量をノイラミニダーゼアッセイによって決定した。このアッセイでは、NA(酵素)が基質(フェチュイン)に対して作用して、シアル酸が放出させられる。亜ヒ酸塩試薬を酵素活性を停止させるために添加した。遊離させられたシアル酸の量を、遊離のシアル酸に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸を用いて化学的に決定した。色(発色団)の量を、594nmの波長で分光光度計で測定した。図8に示したデータは、有意な量のシアル酸がVLPが含まれているスクロース勾配の画分によって生産されたこと、およびこれらの画分がヘマグルチニン活性を示すそれらの画分と対応していたことを示していた。
機能的な同型の組み換え体インフルエンザH9N2 VLPでのBALB/cマウスの免疫化
組み換え体インフルエンザVLPの免疫原性を、マウスの免疫化、それに続く免疫血清のウェスタンブロット分析によって確認した。A型トリインフルエンザ/HonkKong/1073/99に由来するウイルスHA、NA、およびM1タンパク質から構成されており、そして、スクロース勾配上で精製した組み換え体VLP(1μg/注射)を、0日目および28日目に、10匹の雌のBALB/cマウスの三角筋部に皮下に接種した(図11)。PBS(pH7.2)を、ネガティブ対照として5匹のマウスに同様に投与した。マウスを、−1日目(事前採血)、27日目(1回目の採血)、および54日目(2回目の採血)に、眼窩上の孔(supraorbital cavity)から採血した。血清を、一晩の凝固および遠心分離後に血液試料から回収した。
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性とBALB/cマウスでのチャレンジ実験
BALB/cマウスを、100μgのNovasomeアジュバントを含むか、またはNovasomeアジュバントを含まないH9N2 VLP(1μgのHAまたは10μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、0日目、27日目、および57日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図13から図16に示す。
A/Fujian/411/2002(H3N2)VLPの免疫原性といくつかのインフルエンザ株の間での交差反応性
BALB/cマウスをA/Fujian/411/2002 VLP(3.0、0.6、0.12、および0.24μgのHA/用量)で、IMおよびINで2回免疫化した。マウスを0日目および35日目に採血した。その後、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。この実験の結果を、図17A、17B、および17Cに示す。これらの結果は、免疫応答が、HAおよびNAに対するIMおよびINの両方を増大させたことを示している。
H3N2 VLPの接種後のマウスの中でのIgGイソ型の決定
マウスにVLPを筋肉内および鼻腔内に接種した。5週間で血清を回収し、そしてIgGイソ型を識別するためにアッセイした。
SDラットにおけるA/Hong Kong/1073/99(H9N2)用量範囲試験
SDラット(1用量につき6匹)を、中性pHのPBSで0.12、0.6、3.0、および15.0μgのHAになるようにPBSで希釈した精製したA/HongKong/1073/99(H9N2)VLPで、あるいは、PBSだけで、0日目および21日目に免疫化した。血液試料を、0日目、21日目、35日目、および49日目に動物から採取し、ヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)のために血清をアッセイして、HAの結合機能を阻害することができる機能性の抗体を検出した。投与量は、SDS−PAGEを使用して、そして精製したH9N2 VLPのデンシトメトリーをスキャンして測定したHA含有量に基づいた。ヘマグルチニン阻害アッセイの力価の結果を図19に示す。1回の0.6μgHA用量のH9N2 VLP、または2用量の0.12μgのHAによって、ラットにおいてHI抗体の防御的レベルが生じた。これらのデータは、HAがVLPの一部である場合には、少量のHAによって、防御応答を誘導できることを示している。
Kong/1073/99(H9N2)VLPの免疫原性
BALB/Cマウスを、100μgのNovasomeおよびAlumアジュバントを含むか、またはNovasomeおよびAlumアジュバントを含まないH9N2 VLP(0.12、0.6μgのHA/用量)で、0日目および21日目に免疫化し、そして57日目に同種の感染性ウイルスINでチャレンジした。マウスを、3.0および15.0μgのHA/用量(アジュバントを含まない)でも免疫化した。マウスを0日目、21日目、35日目、および49日目に採血し、そしてシチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによってインフルエンザについて血清をアッセイした。この実験の結果を、図20AおよびBに示す。
グループ1:H9N2 VLP(0.1μg)(n=5)
グループ2:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW neat)(n=5)
グループ3:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:3)(n=5)
グループ4:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:9)(n=5)
グループ5:H9N2 VLP(0.1μg)w/DCW 1:27)(n=5)
グループ6:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX1)(n=5)
グループ7:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX2)(n=5)
グループ8:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX3)(n=5)
グループ9:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX4)(n=5)
グループ10:H9N2 VLP(0.1μg)w/NVAX5)(n=5)
グループ11:H9N2 VLP(0.1μg)w/Alum−OH)(n=5)
グループ12:H9N2 VLP(0.1μg)w/CpG)(n=5)
グループ13:PBS(0.6μg)(n=5)
グループ14:H3 VLPs(0.6μg)(n=5)
グループ15:H5 VLPs(0.6μg)(n=8)
−H9:(ロット#11005)
−DCW:Novasomes(ロット#121505−2、ポリオキシエチレン−2−セチルエーテル、コレステロール、細かい大豆油、および塩化セチルピリジニウム)
−NVAX1:B35P83、MF−59レプリカ(スクワレン、ポリソルベート、およびSpan)
−NVAX2:B35P87(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68)
−NVAX3:B35P88(大豆油、Brij、コレステロール、Pluronic F−68、およびポリエチレンイミン)
−NVAX4:B31P60(スクワレン、Brij、コレステロール、オレイン酸)
−NVAX5:B31P63(大豆油、モノステアリン酸グリセリル、コレステロール、ポリソルベート)
−CpG:(ロット#1026004)
−H5:(ロット#22406)
図21は、H9N2 VLPの用量応答曲線を示す。このデータは、0.6μgのHA/用量のVLPの用量が、3週間後にマウスにおいて防御免疫応答を誘発するための最少量であることを示している。
フェレットの実験のための材料および方法
フェレットを、Triple F Farms(FFF、Sayre,PA)から購入した。購入した全てのフェレットは、10ヘマグルチニン単位未満であるHAI力価を有していた。ワクチン接種のおよそ2日前に、動物に温度自動応答装置(temperature transponder)(BioMedic Data Systems, Inc.)を埋め込んだ。動物(6匹の動物/グループ)に、(1)PBS(ネガティブ対照、グループ1)、(2)H3N2インフルエンザVLP@15μgのH3(グループ2)、(3)H3N2インフルエンザVLP@3μgのH3(グループ2)、(4)H3N2インフルエンザVLP@0.6μgのH3(グループ3)、(5)H3N2インフルエンザVLP@0.12μgのH3(グループ5)、または(6)rH3N2@15μg(グループ6)のいずれかを、0日目にワクチン接種した。21日目に動物にワクチンを追加免疫した。動物を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目に採血した。動物を、有害なワクチン効果の臨床的兆候について、実験期間を通じて1週間に1回評価した。同様の実験を他のインフルエンザVLPを用いて行った。
フェレットの血清をFFFから入手し、Recepter Destroying Enzyme(RDE)で処理し、そして標準的な手順(Kendalら、(1982))によってヘマグルチニン阻害(HAI)アッセイにおいて試験した。試験した実験のために選択した全てのフェレットは、現在流行しているヒトインフルエンザウイルス(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A Panama/2007/99(H3N2)、A/Wellington/01/04(H2N3)、およびB/Sichuan/379/99、およびH5N1)に対する既存の抗体についてはネガティブ(HAI=10)であった。
およそ8ヶ月齢の、インフルエンザに感染したことのない、去勢したもの、および去勢していない雄のFitchフェレット(Mustela putorius furo)をFFFから購入した。動物を、Sani−chips Laboratory Animal Bedding(P.J.Murphy Forest Products,NJ)を含むステンレス鋼製のウサギ用のケージ(Shor−line,KS)の中で飼育した。フェレットには、Teklad Global Ferret Diet(Harlan Teklad,WI)と新鮮な水を不断給餌で与えた。皿は1週間に3回交換し、ケージは1週間に2回(byweekly)清掃した。
ワクチンであるH3N2インフルエンザVLPまたはH9N2インフルエンザVLPと、対照(例えば、rH3NA(A/Wyoming/3/2003)およびPBS(ネガティブ対照))は使用するまで4℃で保存しておいた。ほとんどの実験については、フェレットの6つのグループ(N−6/グループ)に、0.5mlの容量中のいずれかの濃度のワクチンまたは対照を筋肉内にワクチン接種した。
温度を、実験期間の間中、ほぼ同じ時間に1週間に1回測定した。ワクチン接種前の値を平均して、個々のフェレットについてのベースライン温度を得た。温度(カ氏温度)の変化を、個々の動物についてそれぞれの時点で計算した。フェレットを、有害なワクチン効果の臨床的兆候(温度、体重の減少、活動の減少、鼻汁、くしゃみ、および下痢を含む)について毎週試験した。Reumanら(1989)に記載されているシステムに基づくスコアリングシステムを使用して、活性のレベルを評価した。ここでは、0=機敏であり、よくじゃれる;1=機敏であるが、刺激を与えた時にしかじゃれない;2=機敏であるが、刺激を与えてもじゃれない;3=機敏ではなく、刺激を与えてもじゃれない。グループの中の個々の動物についてのスコアに基づいて、相対的な非活動指数を、Σ(0日目−42日目)[活動スコア+1]/Σ(0日目−42日目)として計算した。式中、nは観察の総数に等しい。1の値を個々のベーススコアに加え、「0」のスコアを分母で割り算できるようにして、1.0の指標値を得た。
血清は、一般的には、ヘマグルチニンに対する非特異的阻害因子について低いレベルを有していた。これらの非特異的阻害因子を不活化させるために、血清を、試験する前に(RDE)で処理した。簡単に説明すると、3部のRDEを1部の血清に添加して、37℃で一晩インキュベートした。RDEを、56℃で30分間のインキュベーションによって不活化させた。RDEの不活化の後、PBSを、1:10(RDE−Tx)の最終的な血清希釈のために試料に添加した。希釈したRDE−Tx血清を、試験するまで(7日間)4℃で保存したか、または−20℃で保存した。
ヒトインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,6−ガラクトース結合を含むシアル酸受容体に結合する。トリインフルエンザウイルスは、N−アセチルノイラミン酸α2,3ガラクトース(α2,3結合)を含むシアル酸受容体に結合し、α2,3およびα2,6結合の両方を発現する。シチメンチョウの赤血球(TRBC)をHAIアッセイに使用した。なぜなら、A/Fujianはヒトインフルエンザウイルスであるからである。TRBCは、PBSで0.5%vol/vol懸濁液となるように調節した。細胞を4℃で維持し、調製から72時間以内に使用した。
HAIアッセイを、CDCの研究室をベースとするインフルエンザの管理マニュアル(全ての目的についてその全体が引用により本明細書中に組み入れられるKendalら、(1982)Concepts and procerudes for laboratory based influenza surveillance,U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,Centers for Disease Control,Atlanta,Georgia)から採用した。RDE−Tx血清を、v底マイクロタイタープレートの中で段階的に2倍希釈した。ウイルスを等容量になるように調節し、それぞれのウェルにおよそ8HAU/50μlに調節したものを添加した。プレートにカバーをかけ、室温で15分間インキュベートし、その後、0.5%のTRBCを添加した。プレートを攪拌によって混合し、カバーをかけ、そしてTRBCを室温で30分間沈殿させた。HAI力価を、凝集しなかったTRBCが含まれていた最後の列の希釈率の逆数によって決定した。ポジティブ血清対照とネガティブ血清対照をそれぞれのプレートに含めた。
フェレットでのA/HongKong/1073/99(H9N2)VLP用量範囲の実験
インフルエンザウイルスについてヘマグルチニン阻害によって血清学的にネガティブであったフェレットを使用して、H9N2 VLPの接種後の抗体およびHI力価を評価した。フェレットを、0日目および21日目に採血し、血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。結果を図22に示す。これらの結果は、HI力価が1.5および15μgのVLP用量での防御抗体レベルに対応することを示している。
フェレットでのH3N2 VLPのワクチン接種
フェレットを、0日目にワクチン接種し、そして21日目には、様々な投与量の様々なH3N2株のVLPで追加免疫を投与した(0.12、0.6、3.0、15.0μgのHA投与量)。ポジティブ対照は、15μgのrH3HAであり、PBSだけをネガティブ対照とした。上記のように、血清を、0日目(ワクチン接種前)、21日目(追加ワクチン接種の前)、および42日目にフェレットから採血した。HIアッセイを血清試料について行って、VLPに対する免疫応答があるかどうかを決定した。これらのデータを図23に示す。これらのデータは、H3N2 VLPが、フェレットに導入した場合には、免疫応答を誘導することを示している。したがって、H3N2 VLPはフェレットにおいては免疫原性である。
インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子のRT−PCRならびにクローニング
Clade 2インフルエンザウイルスであるA/Indonesia/5/05株(H5N1)ウイルスのRNAを、BSL−3封じ込め条件下で、Trizol LS(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して抽出した。逆転写(RT)およびPCRを、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたOne−Step RT−PCRシステム(InVitrogen)を使用して、抽出したウイルスRNAについて行った。以下のプライマーを、それぞれ、H5N1ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、およびマトリックス(M1)遺伝子の合成のために使用した:
H5N1を含む組み換え体バキュロウイルスの作成
HA遺伝子を、RsrIIとHindIIIで消化したpFastBac1バックミドトランスファーベクター(Invitorgen)の中に、AcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流にRsrII−HindIII DNA断片(1.7kb)としてクローニングした。同様に、NAおよびM1遺伝子を、EcoRI−HindIIIで消化したpFastBac1プラスミドDNAの中に、EcoRI−HindIII DNA断片(それぞれ、1.4kbおよび0.8kb)としてクローニングした。インフルエンザA/Indonesia/5/05(H5N1)ウイルスのHA、NA、およびM1遺伝子をそれぞれ含む、3種類の得られたバキュロウイルストランスファープラスミドpHA、pNA、およびpM1を使用して、組み換え体バックミドを作成した。
HA(配列番号10)
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたインフルエンザA/Indonesia/5/05のHA、NA、およびM1遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、Indonesia/5/05のHA遺伝子に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する(実施例31を参照のこと)。コドンが最適化させられたヌクレオチドは、米国特許公開番号2005/0118191(全ての目的のためのその全体が引用により本明細書中に組み入れられる)に開示されている方法にしたがって設計し、生産した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。ヌクレオチド配列については実施例31を参照のこと。
Vac2−hac−opt(修飾されていないアミノ酸配列)(配列番号27)
(修飾された、キチナーゼに由来するシグナルペプチド、下線)(配列番号28)
Vac2−naj−opt(ノイラミニダーゼ)(配列番号31)
RT−PCRによるClade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)インフルエンザウイルスのクローニング
HA、NA、およびM1遺伝子を、上記の方法にしたがってRT−PCRによってクローニングした。以下の配列は、クローニングした遺伝子と比較した公開されている遺伝子の比較である。
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のHA遺伝子
上のレーン:Acc#AY818135 HA遺伝子(配列番号36)
下のレーン:NovavaxのA/Vietnam/1203/2004(H5N1)HA遺伝子(配列番号37)
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のNA遺伝子(配列番号39)
H5N1naLANL ISDN 38704×NA_Viet1203_Lark(NVAX)(配列番号38)
Clade 1 A/VietNam/1203/04(H5N1)のM1遺伝子(配列番号40)
H5N1m1Lanl ISDN 39958×M1_Viet1203_Lark(NVAX)(配列番号41)
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 1 H5N1インフルエンザA/VietNam/1203/04のHA、NA、およびM1遺伝子の作成
以下のポリペプチドは、A/VietNam/1203/04に対応するコドンが最適化させられたヌクレオチドに由来する。ヌクレオチドは、上記に開示したように(実施例24を参照のこと)設計し、そして合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。
VN1203−ha−cs−opt(修飾された切断部位、下線)(配列番号33)
H5N1 Vietnam/1203/2003 VLPの免疫原性(極端な投与量の節約)
BALB/cマウスを、極めて低用量のVLP(0.2、0.04、0.008、0.0016μgのHA/用量)で、H5N1 VLPで筋肉内および鼻腔内に免疫化した。マウスを、0日目、21日目、および35日目に採血した。マウスを21日目に追加免疫した。血清を、シチメンチョウRBCを使用するヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAを使用してインフルエンザウイルスについてアッセイした。この実験の結果を図24および25に示す。
チャレンジ実験
BALB/cマウスに、3μg、0.6μg、0.12μg、および0.02μgの濃度のH3N2 VLPでVLPを筋肉内および鼻腔内(合計のHA用量)に接種した後、マウスを、インフルエンザウイルスA/Aichi/268×31でチャレンジした。この実験の結果を図27および28に示す。これらのデータは、全てのワクチン接種した動物において体重が減少したが、3.0μgおよび0.12μgのVLPをワクチン接種した動物は、筋肉内でのワクチン接種および鼻腔内でのワクチン接種のいずれにおいても、他の動物よりも早く回復したことを示している。鼻腔内での投与によっては、高い防御が提供された。
チャレンジ実験(フェレット)
この実験では、フェレットにH9N2 VLPをワクチン接種した。全部で18匹のフェレットをチャレンジ実験に含めた:6匹には模擬ワクチンを、6匹には、中用量(1.5μg)を、そして6匹には高用量(15.0μg)を筋肉内にワクチン接種した。次に、フェレットに、A/HK/1073/99の106 EID50を鼻腔内にチャレンジした。鼻腔洗浄液を、1日目、3日目、5日目、および7日目に回収した。鼻腔洗浄液の中のウイルスを、全ての動物について3日目、5日目、および7日目に滴定した。これらのデータを表2および図29に示す。これらのデータは、7日目までに、ワクチン接種した全ての動物について、鼻腔洗浄液の中に検出できるウイルスはなく、一方、模擬グループは検出できるウイルス力価を有していたことを示している。
表2 ウイルスでのチャレンジ後のフェレットにおける野生型ウイルス力価(log10/ml)
グループ:プラセボによる模擬対照(n=6)
マウスでの筋肉内および鼻腔内接種実験
マウスに、0日目に、3μg、0.6μg、0.12μg、または0.024μg(合計のHA用量)の濃度のA/Fujian/411/2002(H3N2)VLPを、筋肉内または鼻腔内に接種し、3週間後に追加免疫した。対照マウスには、ホルマリンで不活化させたA/Wyoming(Fujian−Like、ワクチン株)またはPBSを接種した。血清を接種したマウスから、0週目、3週目、5週目、および8週目に回収した。回収した血清を、ヘマグルチニン阻害アッセイ(HI)によって抗HA抗体について、そしてELISAによって抗インフルエンザ抗体についてアッセイした。アッセイは、H3N2のA/Fujian/411/2002、A/Panama/2007/99、A/Wyoming/3/03、およびA/NewYork/55/2004インフルエンザウイルス株を使用して行った。この実験の結果を図30A〜Hに示す。これらのデータは、H3N2 VLPによって、元のインフルエンザウイルスA/Fujian/411/2002株に対する抗体と、他のH3N2株に対する抗体が誘導されたことを示している。これらのデータはまた、筋肉内に接種したマウスよりも、鼻腔内に摂取したマウスにおいては力価が遅れて上昇することを示している。しかし、鼻腔内投与による力価は、約8週間後には筋肉内投与による力価よりも高い。加えて、不活化ウイルス抗原に対する力価は、筋肉内接種後の等用量のVLPに匹敵することが明らかである。しかし、不活化抗原は、鼻腔内接種後には免疫原性ではないようであり、鼻腔内接種後にも広く防御的ではないようである。
Sf9細胞の中での効率的な発現のために最適化させられたClade 2 H5N1インフルエンザHA、NA、およびM1遺伝子の作成
Clade 2 H5N1ウイルス、A A/Indonesia/5/05、A/Bar headed goose/Qinghai/1A/2005、およびA/Anhui/1/2005のHA、NA、およびM1に対応する、以下の最適化させられたヌクレオチドおよびポリペプチドを、上記に開示したように設計し、合成した(Geneart GMBH,Regensburg,FRG)。最適化されたヌクレオチドおよびポリペプチドを以下に列挙する。VLPを作成するために、A/Anhui HAは、A/Indonesia NAおよびM1を用いて発現させることができる。A/Quinghai HAおよびNAが含まれているVLPについては、A/Indonesia M1遺伝子をA/Quinghai HAおよびNAと同時に発現させることができる。
A/INDONESIA/5/05
A/INDONESIAの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号42)
(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号44)
A/Anhuiの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号50)
A/Qinghaiの最適化させられたHA(開始コドンと終結コドンには下線を付けた)(配列番号52)
A/QinghaiのNAタンパク質配列(配列番号55)
当業者は、日常的に行われる実験以上のものを用いることなく、本明細書中に記載される本発明の特異的な実施形態と同等の多くのものを理解するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求項に包含することが意図される。
(配列表)
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- 本明細書に記載の発明。
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