JP2004501647A - 野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ）のアセンブリー - Google Patents

Abstract

構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２を含んで成るインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）が記述される。Ｍ１ならびにＨＡ、ＮａおよびＭ２のいずれか１種もしくは２種を含むＶＬＰがそうであるように、Ｍ１単独を含有するＶＬＰもまた生成される。ＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部が、キメラＶＬＰを含んで成るようにインフルエンザウイルスにより産生されない異種部分により置き換えられるＶＬＰがそうであるように、１種のインフルエンザサブタイプからのＨＡおよび異なるインフルエンザサブタイプからのＮＡを含むＶＬＰもまた記述される。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、マトリックスタンパク質単独から構成されるインフルエンザウイルス様粒子に関し、また、インフルエンザの構造タンパク質のいずれかをさらに包含してよい。
【０００２】
（発明の背景）
インフルエンザウイルスはＡ、ＢおよびＣと呼称されるサブタイプよりなる。インフルエンザウイルスは該ウイルスの生活環に必要とされる１０種のポリペプチドをコードする、セグメント化された一本の負鎖ＲＮＡゲノムを所有する。完全なゲノムの８個のＲＮＡセグメントのそれぞれは、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）の複数のサブユニットでキャプシドで包まれ（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）、かつ、数分子の三量体のポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡサブユニット）と会合されて、それによりリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する（参考文献一覧表見出し１）。マトリックスタンパク質（Ｍ１）の層がこれらの構造を取り巻いており、これはコアとウイルスエンベロープとの間の結合体としてはたらくようである。この宿主細胞由来のエンベロープは、２種の主要なウイルスにコードされる表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにずっとより少量のグリコシル化されない小型のタンパク質Ｍ２で鋲をつけられる（ｓｔｕｄｄｅｄ）（１，２）。ＨＡ糖タンパク質はプロテアーゼにより切断されてＨＡ１およびＨＡ２を形成する。
【０００３】
インフルエンザウイルスの感染は、シアル酸を含有する細胞レセプターへの表面のヘマグルチニンの付着により開始する。この最初のウイルスと細胞の相互作用は、レセプターに媒介されるエンドサイトーシスによる細胞中へのウイルス粒子の組込みを誘導する。エンドソームの低いｐＨ条件下で、ＨＡは、ＨＡ２の疎水性のＮＨ_２末端ドメインおよびエンドソーム膜の相互作用を助長するコンホメーション変化を受け、膜融合、ならびにコアＲＮＰおよびマトリックスタンパク質（Ｍ１）のサイトゾル中へのその後の放出をもたらす。完全なゲノムの転写および複製が起こる核にＲＮＰが移る前に、ＲＮＰおよびマトリックスタンパク質の解離がサイトゾル中で起こる（３，４）。
【０００４】
一次転写後に、新たに合成されたタンパク質がウイルスゲノムの複製を開始し、それは順に転写およびタンパク質合成を増大させる。ウイルスの生活環のこの時点で、表面糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは原形質膜の別個の領域に蓄積することを開始し、ここから新たにアセンブリーされたウイルスが放出されることができる。ウイルスのアセンブリーは、膜に固定されたタンパク質の細胞質および／もしくは膜貫通ドメインと、下にあるマトリックスタンパク質（Ｍ１）との間の何らかの種類の相互作用を介して開始すると想定され、それは順にＲＮＰとの緊密な会合を維持する（５，６）。集合的に、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２は４種のウイルスにコードされる構造タンパク質を構成する。マトリックスタンパク質Ｍ１とＲＮＰ複合体との間の接触、ならびに８種のＲＮＰの完全な組が成熟ビリオン粒子中に組込まれるようになる機構は、十分に明らかにされていない。構造成分間の特定の分子接触が、形態形成の過程がどのように開始しかつ成熟粒子のアセンブリーおよび宿主細胞の表面からの出芽の点まで進行するかを命令すると想定される。
【０００５】
該過程の複雑さは：１）アセンブリーおよび出芽にどのウイルスタンパク質が必要とされるかの同定。２）アセンブリーおよび出芽過程を駆動する、表面と下にある成分との間のタンパク質−タンパク質および脂質−タンパク質相互作用の型。３）ＲＮＰがアセンブリー部位にもたらされ、粒子中に組込まれそして類似のセグメントから区別される機構。４）アセンブリーおよび出芽の相互作用および調節の性質および化学量論、のような論点を生じさせている。これらの事象の全部は複雑な細胞環境中で起こり、そこでは、若干の宿主分子がアセンブリーおよび出芽過程の進行を促進もしくは妨害するかもしれないかもしくはしないかもしれない。これは、順に、細胞のタンパク質が実際にウイルスのアセンブリーに関与しているかどうか、および、出芽された粒子の表面から非ウイルスタンパク質が一般にどのように排除されるかという論点につながる。
【０００６】
多様な科のエンベロープをもつ（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ＲＮＡウイルスを用いて、これらの論点のいくつかを扱うために多数の研究が実施されているが（５）；しかしながら、これらの論点の大部分はインフルエンザウイルスに関して解明されないままである。インフルエンザにいくぶん形態学的にかつ進化上関係する（ラブドウイルス科およびパラミクソウイルス科のような）セグメント化されないＲＮＡウイルス科を用いた研究は、ラブドウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のマトリックスタンパク質（Ｍ）が独力で膜粒子として細胞表面から分離する（出芽する）ことが可能であることを示した（７，８）。加えて、出芽におけるＭタンパク質の重要性は、Ｇ表面タンパク質をコードする遺伝子の欠失を伴う狂犬病ウイルス（別のラブドウイルス）のコピーがなお形成されかつ感染した細胞から放出される（９）という事実においてもまた反映される。ＰＩＶ−３（パラミクソウイルス）を用いたより最近の研究もまた、マトリックスタンパク質がヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）と一緒になってウイルス様構造に会合しそして細胞表面から出芽することが可能である（１０）ことを示した。しかしながら、インフルエンザウイルスに関しては、セムリキ森林ウイルスのレプリコンを使用したこれら２種のタンパク質の発現は、これらのタンパク質間の会合もしくは膜小胞の出芽のいずれも示さなかった（１１）。
【０００７】
インフルエンザウイルスの逆遺伝（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を実施することは、構造成分間のタンパク質−タンパク質相互作用を検討するための有用な一アプローチであった。インフルエンザのアセンブリーにおける糖タンパク質の細胞質ドメインの重要性が最近研究され（１２，１３，１４）、そして、ＨＡの末端の欠失が粒子中へのその組込みならびに出芽の効率を低下させたが、しかしビリオンの形態に影響を及ぼさなかったことが示された。他方、欠失されたＮＡ末端を伴うウイルスは糸状の形態を示し、そしてエンベロープ中へのＮＡの組込みが損なわれた。加えて、二重の欠失は、出芽の効率、ならびに感染性を低下させると思われ、そしてビリオンの形態学を変化させた（末端の欠失を伴うものおよび野性型ウイルスと識別可能であった）。二重の末端の欠失は出芽の効率およびウイルス粒子の形態に影響を及ぼすようであったとは言え、それらはビリオン粒子のアセンブリーおよび放出（ｅｘｉｔ）を完全には排除しなかった。これは、Ｍ１タンパク質がウイルスのアセンブリーおよび出芽を導くことが可能であることを示唆した（１３）。
【０００８】
同様に、マトリックスタンパク質と原形質膜との間で確立される相互作用は、ウイルスのアセンブリーおよび放出に決定的に重要であると思われる。しかしながら、この会合の物理的性質、すなわちマトリックスタンパク質が原形質膜中に完全に埋め込まれているのかもしくは静電的相互作用により単に付着されているのかどうかは解明されない論点である。この疑問を取り扱う最近の研究は、マトリックスおよび膜が静電的相互作用により会合されたことを強く示唆したが、しかし、ある量のＭ１が膜中に埋め込まれているかもしれないことを排除できなかった（１５）。成熟ビリオンの構造中のＭ１およびＭ２タンパク質の重要な役割は、アミノ酸置換がこれらの分子のいずれか中に存在する場合に、粒子の球状もしくは糸状の形態に反映される（１６）。
【０００９】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫原性組成物中への包含のための潜在的な候補として、近年非常に興味深い主題であった。これは、ＶＬＰが、それらが所望の免疫応答を導き出すことができるようにそれらの天然のコンホメーションに十分類似したコンホメーションで表される１種もしくはそれ以上の表面タンパク質を含有するためである。同時に、ＶＬＰは、宿主中でウイルス子孫を生じさせるのに必要とされる遺伝物質の補足物を欠く。従って、野性型ウイルスと異なり、ＶＬＰは疾患の症状もしくは病状を伴う感染を引き起こすことができない。例えば、ロタウイルス（二本鎖ＲＮＡウイルス）の２もしくは３種のタンパク質がＶＬＰ中にアセンブリーされ、これは免疫応答を導き出した（１７）。
【００１０】
バキュロウイルス発現系は、二十面体構造に自己アセンブリーするエンベロープのないウイルスのＶＬＰの形態形成およびアセンブリーを検討するために広範に使用されている（１８，１９，２０，２１）。同様に、レトロウイルス科の多様なメンバーのタンパク質ｇａｇおよび／もしくはｅｎｖの昆虫細胞中での発現もまた、エンベロープをもつウイルスのコア構造のアセンブリーおよび出芽を研究するのに使用されている（２２，２３，２４，２５）。
【００１１】
インフルエンザのＶＬＰを産生するバキュロウイルス発現系の能力を評価する必要性が存在する。とりわけ、ＶＬＰにアセンブリーすることができるインフルエンザウイルスタンパク質の最小数を同定しかつそれらのＶＬＰの形態学および免疫原性を評価する必要性が存在する。
【００１２】
（発明の要約）
従って、ＶＬＰにアセンブリーすることができるインフルエンザウイルスタンパク質の最小数を同定することが、本発明の一目的である。１種以上のサブタイプのインフルエンザウイルスからのタンパク質を含有するＶＬＰを生成させることが、本発明のさらなる一目的である。異種の非インフルエンザ供給源からのタンパク質を含有するキメラＶＬＰを生成させることが、本発明のなおさらなる一目的である。前述のＶＬＰの１種もしくはそれ以上を含有する免疫原性および製薬学的組成物を処方することが、本発明のなお別の目的である。
【００１３】
これらおよび下に論考されるところの本発明の他の目的は、最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質を含んで成るインフルエンザＶＬＰのアセンブリーにより達成され、ここで前記ＶＬＰは常にＭ１を包含する。本発明の一態様において、ＶＬＰはＭ１（ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）を組込んでもよい）のみを含有する。こうしたＶＬＰは、Ｍ１をコードする組換えＤＮＡ分子を構築すること、前記組換えＤＮＡ分子で適する宿主細胞をトランスフェクト、感染もしくは別の方法で形質転換すること、Ｍ１の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養し、その結果ＶＬＰがＭ１の発現後に細胞内でアセンブリーされること、および培養上清からＶＬＰを精製することにより製造される。
【００１４】
本発明の別の態様において、ＶＬＰは、ＨＡ、ＮＡおよびＭ２よりなる群から選択されるインフルエンザの構造タンパク質の最低１種をさらに含んで成る。こうしたＶＬＰは、Ｍ１ならびにＨＡ、ＮＡおよびＭ２の最低１種をコードする１種もしくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子を構築すること、前記１種もしくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子で適する宿主細胞をトランスフェクト、感染もしくは別の方法で形質転換すること、前記インフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養し、その結果ＶＬＰが構造タンパク質の発現後に細胞内でアセンブリーされること、ならびに培養上清からＶＬＰを精製することにより製造される。Ｍ１のみ、もしくはＭ１ならびにＨＡ、ＮＡおよびＭ２の最低１種を含有するＶＬＰは、インフルエンザウイルスにより引き起こされる感染に対し脊椎動物を免疫化するための免疫原性組成物として、希釈剤もしくは担体とともに処方される。
【００１５】
本発明のなお別の態様において、異なるサブタイプのインフルエンザウイルスからの表面糖タンパク質を含有するＶＬＰを製造することが望ましいかもしれない。１種のサブタイプからのＨＡおよび異なるサブタイプからのＮＡを含有するこうしたＶＬＰは、それら２種のサブタイプのインフルエンザウイルスにより引き起こされる感染に対し脊椎動物を免疫化するための二価免疫原性組成物として、希釈剤もしくは担体とともに処方される。
【００１６】
本発明のなお別の態様において、ＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部が、キメラＶＬＰを含んで成るようにインフルエンザウイルスにより産生されない異種部分により置き換えられるＶＬＰを製造することが望ましいかもしれない。こうした部分は、限定されるのもでないがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を挙げることができる。ＨＡもしくはＮＡの一部分のみが置き換えられるべきである場合、ＨＡもしくはＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列の一部分が、非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる。ＨＡもしくはＮＡ全体が置き換えられるべきである場合、ＨＡもしくはＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列全体が、非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる。
【００１７】
一局面において、こうした非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質は病原性微生物からである。これらのキメラＶＬＰは、その病原性微生物により引き起こされる感染に対し脊椎動物を免疫化するための免疫原性組成物として、希釈剤もしくは担体とともに処方される。
【００１８】
別の局面において、こうした非インフルエンザ部分は製薬学的に活性の部分である。これらのキメラＶＬＰは、製薬学的組成物として希釈剤もしくは担体とともに処方され、そして前記こうした非インフルエンザ部分で脊椎動物を治療するために有効な量で投与される。
【００１９】
なお別の局面において、ＶＬＰはＲＮＰをアセンブリーかつパッケージングし、そして異種ヌクレオチド配列をさらに組込みかつ発現してよい。
【００２０】
前述の免疫原性および製薬学的組成物のいずれも、アジュバントをさらに含んでよい。
【００２１】
（発明の詳細な記述）
ウイルスに感染した細胞の表面からのエンベロープをもつウイルス粒子のアセンブリーおよび放出は、複雑かつ段階的な過程である。それは、ビリオン粒子のアセンブリーを開始するための、ウイルスにコードされるグリコシル化されたおよびグリコシル化されないタンパク質の原形質膜の別個の領域との協調した相互作用を必要とする。これらの成分に加え、ウイルスの遺伝物質を表すタンパク質でキャプシドで包まれた核酸もまた、形態形成過程（細胞表面からの成熟ビリオン粒子の分離もしくは出芽により完了する）を完了させるために構造中に組込まれる。完全なビリオン粒子のアセンブリーおよび最終的な放出における多様な構造成分の正確な分子相互作用および寄与は、十分に特徴づけられていない。
【００２２】
本発明は、インフルエンザウイルスの構造タンパク質を発現した組換えベクターで感染させた細胞の表面からのインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）のアセンブリーおよび放出を記述する。多様な発現系がＶＬＰの生成に適する。本発明は、インフルエンザウイルスの構造タンパク質を発現したバキュロウイルス組換え体で感染させた昆虫細胞を用いて例示される。
【００２３】
インフルエンザウイルスのアセンブリーおよび出芽に必要とされる分子を定義するために、一連の単一の遺伝子および４部分からなる（４区画ｒｕｐｌｅ）遺伝子のバキュロウイルス組換え体を構築した。該組換え体は、スポドプテラ フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）９（Ｓｆ９）細胞中で４種のインフルエンザ構造タンパク質（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２）を発現した。Ｓｆ９細胞は、ＳＦ２１細胞系の派生物である昆虫細胞系である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １７１１）。全４種の構造タンパク質をコードする導入ベクターが記述されるとは言え、これら４種のタンパク質を集合的にコードする２ないし４種の導入ベクターの使用もまた本発明の範囲内にある。
【００２４】
４部分からなる組換え体を得るために、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の４種の構造タンパク質をコードする単一のバキュロウイルス導入ベクターを、シャトルベクターのアプローチを使用して構築し、これは使用可能なプラスミドの大きさを減少させかつ制限部位の数を増大させることによりクローニングを助長した。最終的な導入ベクター中で、インフルエンザ遺伝子は、反対の方向の遺伝子の転写を駆動するよう配置されたバキュロウイルスプロモーターｐ１０（ＮＡおよびＭ２）ならびにポリへドリン（ＨＡおよびＭ１）から下流に位置した（図１）。
【００２５】
４部分からなる（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２）バキュロウイルス組換え体は、直鎖状にされたウイルスＤＮＡおよび導入ベクターＤＮＡでのＳｆ９細胞の同時トランスフェクションにより得た。数個の組換えウイルスプラークを選択し、そして付加的な２回のプラークごとの単離によりさらに精製した。イムノブロットにより評価されるタンパク質発現のレベルに基づき、ＨＡ／Ｑ２８と呼称されるこの４部分からなる組換え導入ベクターを、後の実験での使用のため選択した。
【００２６】
この構築物の１つの重要な特徴は、Ｍ１遺伝子上のドナーおよびアクセプターのスプライス部位がＭ１ ｍＲＮＡのスプライシングを予防するよう突然変異されたことであった。さもなければ、Ｍ１ ｍＲＮＡはＭ２ ｍＲＮＡにスプライスされてＭ１タンパク質の低下されたレベルの発現をもたらしていたであろう。Ｍ２ ＤＮＡを独立遺伝子として該導入ベクターに導入した。
【００２７】
これら４種のインフルエンザ構造タンパク質の発現が、４部分からなるバキュロウイルス組換え体ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９昆虫細胞の表面からのインフルエンザのＶＬＰのアセンブリーおよび出芽を駆動するのに十分であったかどうかを検討するために、培養上清をウェスタンブロットにより分析してＭ１およびＨＡタンパク質の存在を確かめた。培地を感染７２時間後に収穫し、４０００×ｇで３０分間澄明にし、そしてその後、残存する懸濁された物質を２０００００×ｇで２時間の遠心分離により濃縮した。
【００２８】
抗ＨＡ、Ｍ１およびＭ２モノクローナル抗体の組合せでプロービングされた、感染した細胞からの濃縮された上清のウェスタンブロット分析は、インフルエンザのＨＡ、Ｍ１およびＭ２タンパク質の有意の発現を立証した（図３Ａ）。ＨＡタンパク質は、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）に感染したマジン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞からのＨＡと異なるパターンで移動するようであり、これはこのタンパク質の多様なグリコシル化形態の反映かもしれない。他方、Ｍ１およびＭ２タンパク質の移動パターンは、ＭＤＣＫのインフルエンザに感染した細胞中で発現されたものに類似であった（図３Ａ、レーン１〜３）。ＮＡタンパク質の発現は、ＨＡ、Ｍ１およびＭ２もまた認識したマウスポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにより検出された（データは示されない）。
【００２９】
下に論考される結果は、４種のインフルエンザ構造タンパク質の発現が、ＶＬＰのアセンブリーおよびＳｆ９昆虫細胞の表面からの出芽に十分であることを立証する。これら４種のタンパク質に加えて、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）の発現は、ＮＰタンパク質を粒子中に組込んだＶＬＰの形成につながった。さらに、Ｍ１タンパク質単独の発現は、Ｍ１と共発現される場合にヌクレオキャプシドＮＰもまた組込む可能性があるＶＬＰの放出を誘導した。加えて、４部分からなる組換え体中で水疱性口内炎ウイルスの完全長のＧタンパク質もしくはハイブリッドＨＡ／ＧのいずれかによりＨＡ遺伝子を置き換えることは、キメラＶＬＰのアセンブリーおよび放出を誘導した。これらのＶＬＰの全部が、培地中へのＶＬＰの分泌後に慣習的な精製手段により得られる。
【００３０】
異種の非インフルエンザ糖タンパク質がインフルエンザのＶＬＰの表面に組込まれる可能性があるかどうかを評価するために、２種の異なるキメラの４部分からなるバキュロウイルス組換え体を構築した。ＶＳＶ−Ｇ／Ｑと呼称される第一のものは、インフルエンザＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ配列を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の完全長の糖タンパク質ＧをコードするＤＮＡ配列で置き換えた。ＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ−Ｑと呼称される第二のものは、ＶＳＶ Ｇタンパク質の細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）ならびにインフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質末端をコードするハイブリッドＤＮＡ配列を運搬した（図２を参照されたい）。双方の組換え体は、３種の構造的なインフルエンザウイルスタンパク質、Ｍ１、ＮＡおよびＭ２の遺伝子を含有した。
【００３１】
これらの構築物を、野性型インフルエンザのＶＬＰと同一の特徴づけ研究にかけ、そして、結果は、いずれかの構築物へのＳｆ９昆虫細胞の感染は、それらの表面上にＶＳＶ Ｇタンパク質を担持するインフルエンザ様粒子のアセンブリーおよび放出を指図したことを示した。これらの組換えウイルスの双方が、また培地中に分泌された４種のタンパク質（Ｍ１、Ｍ２、ＮＡおよびＶＳＶ−Ｇ）の発現を駆動することが可能であった。
【００３２】
ＶＳＶ−Ｇ／Ｑに感染させたＳｆ９細胞のウェスタンブロット分析は、ＶＳＶ Ｇタンパク質、ならびにインフルエンザタンパク質Ｍ１およびＭ２が感染７２時間後に発現されたことを示した（図３Ｂ）。さらに、感染した細胞の濃縮された上清は、ＶＳＶ ＧならびにインフルエンザのＭ１およびＭ２に対する抗体でプロービングされた場合に陽性のウェスタンブロットを示した（図３Ｂ、レーン３）。
【００３３】
ＶＳＶ Ｇタンパク質についてたった今記述された方法は、生物学的目的の他の非インフルエンザ糖タンパク質のＶＬＰの表面への組込み、ならびにインフルエンザウイルスにより産生されない部分の組込みに容易に応用可能である。こうした部分は、限定されるものでないがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を挙げることができる。下に論考されるとおり、こうしたＶＬＰは、免疫原性組成物として、レセプター−リガンド相互作用の研究において、および／もしくは製薬学的組成物の一部としての非インフルエンザ部分の送達のための系として使用される。
【００３４】
Ｓｆ９細胞中でのインフルエンザタンパク質の発現および細胞での局在化をさらに評価するために、プラーク精製されたバキュロウイルス組換え体ＨＡ／Ｑ２８に感染させた細胞の免疫蛍光分析を実施した。これらの実験は、間接的免疫蛍光により示されるとおり、４種のインフルエンザの構造タンパク質が発現されたことを示した（図４〜６）。抗ＨＡおよび抗ＮＡ抗体を用いる二重染色実験は、これらの表面糖タンパク質がある程度の重なり合いを伴い感染した細胞の外周に局在したことを立証した（図５Ｃ）。これらの結果は、これらの主要な糖タンパク質が、感染した昆虫細胞の表面上の別個の領域に共局在したことを示唆し、これは哺乳動物細胞の天然のインフルエンザ感染で予想されるものに似ている。
【００３５】
同様に、ＨＡおよびＭ１のいずれかに対するモノクローナル抗体の混合物でのＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞の二重免疫蛍光染色は、表面タンパク質およびマトリックスＭ１が細胞膜の別個の領域に共局在するようであることを示した（図４Ｃ）。
【００３６】
他方、Ｍ１−バキュロウイルス組換え体に感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光は、Ｍ１タンパク質が主として感染した細胞の核に蓄積し、そして少量のみが細胞表面で可視化されたことを示した（データは示されない）。感染した細胞中のＭ１タンパク質の分布パターンは、Ｍ１が単一遺伝子として発現されようがＨＡ、ＮＡおよびＭ２と一緒に４部分からなる組換え体として発現されようが変わらないようである（図４）。加えて、Ｍ１およびＮＰの単一組換え体でのＳｆ９細胞の同時感染は、Ｍ１もしくはＮＰいずれかの組換え体に個別に感染させたＳｆ９細胞と比較して、細胞中でのこれらのタンパク質の再分配（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示さなかった（データは示されない）。
【００３７】
従って、感染した細胞のウェスタンブロットおよび免疫蛍光分析は、これら４種のタンパク質が細胞および細胞上清中に存在したのみならず、しかしまた原形質膜上の別個の領域にも共局在したことをはっきりと示した。これは、これらの構造タンパク質間の会合の可能性を示唆した。
【００３８】
ＶＳＶ−Ｇ／Ｑ組換え体で感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光研究は、ＶＳＶ Ｇタンパク質が発現されるのみならず、しかしまた感染した細胞の表面にも蓄積するようであることを示した。
【００３９】
免疫蛍光研究が、これらのタンパク質が細胞表面で共局在したことを示したため、これは、これら４種のウイルスタンパク質がＶＬＰの形成および感染した細胞の表面からの放出を駆動するのに十分であったかどうかの評価に至った。具体的には、これらのタンパク質が細胞の損傷および死の結果として細胞から放出されたかどうかを検討するために、もしくは、それらが細胞表面から出芽したＶＬＰとしてアセンブリーしたため、ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞からの濃縮された上清を、イオディキサノール（２６）速度勾配遠心分離（２０００００×ｇ、３．５時間）にかけた。個別に明記されるとおり、目的のタンパク質を含有する画分を２０〜６０％ショ糖勾配上での付加的な精製にかけた。
【００４０】
収集された画分のウェスタンブロット分析は、ＨＡおよびＭ１が勾配を通って共に移動して画分２でピーク濃度に達したことを示した（図８Ａ、レーン２）。これらのタンパク質はまた、隣接する画分３および４、ならびに画分７および８中でも見出された（図８Ａ）。これらのより下の画分（勾配の底部に向かって）中でのＨＡおよびＭ１の検出は、バキュロウイルスとのこれらのタンパク質の会合（これらの条件下で画分７および８中でバンドを形成する）によることがありそうであった（データは示されない）。
【００４１】
ＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ−Ｑ（キメラ）およびＶＳＶ−Ｇ／Ｑ（完全長）構築物を用いて類似の実験を実施した。ＨＡ／Ｑ２８で観察されたとおり、イオディキサノール勾配の画分２は、ウェスタンブロット分析により示されたとおり、ＶＳＶ ＧならびにインフルエンザのＭ１およびＭ２タンパク質を含有した（図８Ｂ、レーン２）。Ｓｆ９細胞を、ＨＡの代わりに完全長のＶＳＶ−Ｇを運搬する４区画組換え体で感染させた場合、全部のプロービングされた（ｐｒｏｂｅｄ）タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ、Ｍ１およびＭ２）が、濃縮された上清ならびにイオディキサノール勾配の画分２および３の双方にもまた存在した（図３Ｂ、レーン３および図８Ｂ）。これらの結果は、４区画のＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ−Ｑ（キメラ）もしくはＶＳＶ−Ｇ／Ｑ（完全長）のいずれかでのＳｆ９細胞の感染が、それらの表面上にＶＳＶ Ｇタンパク質を担持するインフルエンザのＶＬＰのアセンブリーおよび放出を導くことを示唆した。
【００４２】
電子顕微鏡検査下で検査されたＨＡ／Ｑ２８粒子のいくつかが検出可能な表面スパイクを示さなかった（下を参照されたい）という事実に鑑み、インフルエンザのマトリックスタンパク質は独力で小胞粒子のアセンブリーおよび放出を駆動するのに十分であるかどうかという疑問が現れた。この疑問を取り扱うため、Ｓｆ９昆虫細胞をＭ１バキュロウイルス組換え体に７２時間感染させ、そして濃縮された培養上清を上述されたと同一の分析にかけた。イオディキサノール勾配の上清画分のイムノブロット分析は、マトリックスタンパク質が画分２および３中に濃縮された（ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞から放出されたＶＬＰの移動パターンに類似する）ことを立証した（図９Ａ）。
【００４３】
マトリックスタンパク質（Ｍ１）が、核から細胞表面（ここでウイルスアセンブリーが起こる）へのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の輸送で重要な役割を演じているという強い証拠が存在する（３）。マトリックスとＲＮＰとの間の会合は、ＮＰ、ビリオンＲＮＡもしくは双方との接触により媒介される可能性がある。従って、Ｓｆ９細胞を４部分からなる組換え体ＨＡ／Ｑ２８およびＮＰ単一のバキュロウイルス組換え体で重感染させた場合にヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）がＶＬＰ中に組込まれたかどうかを評価することが興味深かった。勾配画分２のウェスタンブロット分析は、ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰが実際に、生じるＶＬＰ中に組込まれたことを立証した（図９Ｂ）。この結果は、粒子中へのＮＰの組込みを可能にするためにどのタンパク質がＮＰとの接触を確立するかに関する疑問を提起した。
【００４４】
この疑問を取り扱うために、Ｍ１およびＮＰ単一のバキュロウイルス組換え体を使用した。Ｓｆ９細胞中でのＭ１およびＮＰの同時発現は、双方のタンパク質から構成される膜粒子を生じさせた。これは、正確な末端をもつ定義されたインフルエンザＲＮＡの非存在下でのこれら２種のタンパク質間の潜在的な相互作用の評価を可能にした。Ｍ１およびＮＰ組換え体に二重に感染させたＳｆ９細胞由来の勾配精製された粒子のウェスタンブロット分析は、Ｍ１およびＮＰが同一画分中に共局在したことを示した（図８Ｃ）。他方、ＮＰ組換え体単独への感染は粒子の放出を誘導せず、また、画分のいずれにおいても反応性のＮＰの存在を立証しなかった（データは示されない）。これらの結果はＭ１とＮＰの間の相互作用を示唆し、それは、ＲＮＡの非存在下でさえＭ１を含有する粒子中にＮＰをもたらすのに十分強かった。
【００４５】
インフルエンザウイルス中でのＮＰタンパク質の局在、およびタンパク質の粒子アセンブリーの他の研究（１０）に基づけば、ＮＰタンパク質がマトリックスタンパク質Ｍ１との接触を確立し、そしてこの相互作用の結果としてＶＬＰ中に組込まれたようになると推論することは理にかなっている。インフルエンザに感染した細胞において、核から原形質膜のウイルスアセンブリーの部位へのＲＮＰの輸送が、十分に特徴づけられていない機構により、マトリックスタンパク質との会合後に起こる。
【００４６】
ＮＰタンパク質はインフルエンザＲＮＡに結合するのみならず、しかしまたより低い親和性で非特異的ＲＮＡにも結合するかもしれないことが示されている（２７）。従って、この結果は、ＲＮＡがＭ１とＮＰとの間に生じる相互作用に必要とされる可能性を排除しない。
【００４７】
従って、マトリックスタンパク質は、粒子のアセンブリーおよび放出につながる分子相互作用を開始するのみならず、しかしまたヌクレオキャプシドＮＰを結合しかつ粒子中に組込むことも可能であると結論づけられる。インフルエンザに感染した細胞において、Ｍ１タンパク質は輸送およびウイルスアセンブリー中にＲＮＰと会合する。単一のＭ１組換え体の場合には、これらの他のインフルエンザ構造が存在しないが、それでもなお出芽がなお起こる。ＮＰは単量体もしくはオリゴマーとして、または細胞ＲＮＡを結合した後にＭ１と会合するかもしれない。会合の性質が何であれ、昆虫細胞中で発現されたＭ１およびＮＰが十分な親和性を伴い結合して、細胞から出ることが可能である小胞中にアセンブリーすることが明らかである。
【００４８】
画分２および３中に共に移動したインフルエンザタンパク質間の会合の性質をさらに特徴づけるために、これらの画分中に存在する物質の電子顕微鏡検査の評価を実施した。
【００４９】
画分２の電子顕微鏡検査は、インフルエンザウイルスおよび不完全なウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子に大きく似た表面突起で鋲をつけられた高濃度の小胞および非小胞双方の粒子の存在を示した（図１０）。ＶＬＰの形状および構造的特徴は勾配中のそれらの位置に依存して変動した。いくつかの小胞の表面から突出するスパイクは、それらがインフルエンザウイルスの表面からするようにそれらが該粒子の表面から外側に突き出るため、インフルエンザのＨＡおよびＮＡに類似に見えた。
【００５０】
画分２からのいくつかのＶＬＰ中の突起は、インフルエンザウイルスに存在するＨＡスパイクに有意に類似であった（図１０）。ＮＡの形態は、こうした広範なスパイクをつけられた（ｓｐｉｋｅ−ｓｔｕｄｄｅｄ）実体を含有するサンプル中でより少なく特徴的である。画分３は類似の範囲の粒子を高濃度で含有したが、しかしながら、それは画分２より高濃度の凝集された膜を含有するようであった（データは示されない）。
【００５１】
電子顕微鏡下で最大数のインフルエンザのＶＬＰを示した画分は、ウェスタンブロット分析により立証されるとおり、最高濃度のＭ１およびＨＡタンパク質もまた含有した。表面突起で覆われかつ長さが約７５ｎｍから１５０ｎｍまでの範囲にわたったＶＬＰは、大きさおよび形態がインフルエンザウイルスに明らかに似ていた。
【００５２】
Ｍ１粒子の構造をさらに特徴づけするため、該勾配のこれら２画分を電子顕微鏡検査により検査した。陰性染色された電子顕微鏡検査は変動する形状の多数の小胞を示し、それらはそれらの表面上にスパイクを担持しなかった（データは示されない）。
【００５３】
バキュロウイルスに感染した細胞が自発的に小胞を放出したかどうか、もしくは、細胞表面でのＭ１タンパク質の会合が粒子の放出を駆動するのに十分であったかどうかを決定するため、野性型もしくはＮＰ組換え体のいずれかのバキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞の濃縮された上清の類似の勾配画分を、電子顕微鏡検査により検査した。対応する単一組換え体に感染させたＳｆ９細胞の上清を分析で使用した場合に、他のタンパク質（ＮＰ、ＨＡ）のいずれもこれらの画分中で検出されなかった。これらの結果は、マトリックスタンパク質が独力で、ＶＬＰのアセンブリーおよび昆虫細胞の表面からの放出を駆動するのに十分であったことを示した。
【００５４】
ＨＡおよびＮＡに対する特異的モノクローナル抗体（免疫蛍光実験で使用されたものと同一であった）でプロービングされたイムノゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）標識された表面抗原の電子顕微鏡検査により、ＶＬＰの表面から突出するスパイクのタンパク質組成を検討した。この検査は、主要なインフルエンザの表面抗原ＨＡが、金ビーズの存在により示されたとおり、ＶＬＰの表面上に実際に存在したことを示した（図１１Ａ）。これは、陰性染色および電子顕微鏡検査により可視化されたスパイクの構造の評価から想定されることを確認した（図１０）。同様に、抗ＮＡ抗体でのイムノゴールド標識および電子顕微鏡検査はまた、ＨＡほど多量ではないとは言えＶＬＰの表面上のＮＡ糖タンパク質の存在も示した（図１１Ｂ）。
【００５５】
Ｍ２タンパク質のアミノ末端の１８アミノ酸を包含するペプチドに対し生じられたウサギポリクローナル抗体を使用するイムノゴールド標識により、ＶＬＰの表面上でのＭ２タンパク質の存在を検出するための試みがなされた。Ｍ２タンパク質は、それがイムノゴールド標識−電子顕微鏡検査（ＩＥＭ）にかけられた勾配画分中に存在したのに、粒子の表面上で検出されなかった。しかしながら、ＩＥＭは少量のタンパク質を検出するのに十分感受性の系でなく、また、天然のインフルエンザウイルスででさえ、非常にわずかなＭ２が産生されかつそれを検出することが困難であるため、これは驚くべきことではなかった。
【００５６】
キメラのインフルエンザ−ＶＳＶ ＶＬＰを精製しかつ電子顕微鏡検査により検査した場合、それらはインフルエンザのＶＬＰに類似の形態を有することが見出された。加えて、イムノゴールド標識分析は、それらが抗Ｇ抗体と反応性であった表面糖タンパク質を担持したことを示した（データは示されない）。
【００５７】
いずれの構築物を用いて生成された粒子も、形態においていかなる有意の差異も示すようではなかった。双方の粒子の表面上のＧタンパク質の含量は見かけ上同様であった。これは、Ｇ／ＨＡキメラのＨＡ部分と膜の下にあるＭ１との間の潜在的に好都合な相互作用が、粒子中へのＧの組込みのレベルを有意に高めなかったことを示唆した。
【００５８】
野性型のインフルエンザのＶＬＰおよびキメラＶＬＰ（ＶＳＶ Ｇを含有する）の免疫原性を評価するため、２群のＢａｌｂ／ｃマウスを、ＨＡ／Ｑ２８もしくはＶＳＶ−Ｇ／Ｑのいずれかを用いて筋肉内経路を介して免疫化し、ここで各組のＶＬＰはリン酸アルミニウムとともに処方した。各群中の全部のマウスが、２週間隔で一次免疫および２回の追加免疫注入を受けた。最後の免疫感作２週間後に血液サンプルを得、そして、ウェスタンブロット（双方の型のＶＬＰについて）、赤血球凝集反応の阻害（ＨＡ／Ｑ２８について）および血清中和試験（ＶＳＶ−Ｇ／Ｑについて）により、対応する抗原に対する抗体の存在を評価した。
【００５９】
イムノブロット分析は、インフルエンザＨＡ／Ｑ ２８で免疫化されたマウスからの血清が、試験免疫原として使用されたインフルエンザウイルス（主にＨＡおよびＭ１；図１２ＡおよびＢ、レーン２）を認識したことを立証した。同様に、キメラＶＬＰ ＶＳＶ−Ｇ／Ｑで免疫化されたマウスからの血清はＶＳＶのＧタンパク質を認識した（図１３ＡおよびＢ、レーン２）。
【００６０】
インフルエンザウイルスの赤血球凝集反応の阻害試験（ＩＨＡ）の能力は、ＨＡ／Ｑ２８で免疫化されたマウスからの血清が９６ＩＨＡＵのＩＨＡ力価（対照の、投与を受けたことのないマウスから得られたもの（３２ＩＨＡＵ）より２倍以上より高かった）を有したことを示した。この応答は、陽性対照としてはたらいた、生きているインフルエンザＡ／香港型（Ｈ３Ｎ２）（ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｍｂａｗｕｉｋｅ博士の好意による）での２回の鼻内免疫感作（２週間隔）により導き出された１２８ＩＨＡＵのＩＨＡ力価にほぼ等しかった。
【００６１】
ＶＳＶ−Ｇ／Ｑで免疫化されたマウスからの血清によるＶＳＶの中和は、１／６４と同じくらいの希釈が標準力価のＶＳＶを完全に中和して、それにより細胞単層中でのいかなるプラークの形成も予防したことを示した。
【００６２】
これらの結果は、インフルエンザのＶＬＰが、ウェスタンブロットで野性型インフルエンザウイルスを認識したのみならずしかしまたインフルエンザウイルスの赤血球凝集反応も阻害した抗体応答を導き出したことを立証した。さらに、ＶＳＶ Ｇタンパク質を運搬するキメラＶＬＰでのマウスの免疫感作は、ウェスタンブロットで野性型ウイルスのＶＳＶ Ｇタンパク質を認識しかつまた血清中和試験でＶＳＶ感染を予防した、体液性抗体応答を誘導した。
【００６３】
昆虫細胞を除いた他の型の宿主細胞もまた、ＶＬＰを産生させるために、インフルエンザウイルスの構造タンパク質（および所望の場合は非インフルエンザタンパク質）をコードする１種もしくはそれ以上の組換えベクターとともに使用してもよい。ＶＳＶのＭタンパク質を用いた研究は、この特性が昆虫（８）および哺乳動物（７）双方の細胞型において示されたことを立証した。加えて、パラインフルエンザウイルス（別のセグメント化されない負鎖ＲＮＡウイルス）のマトリックスＭおよびＮＰタンパク質の哺乳動物細胞中での発現が、ウイルス様粒子の形成および放出につながった（１０）。
【００６４】
宿主細胞としての使用に適する他の細胞型は、哺乳動物（チャイニーズハムスター卵巣、ニワトリ胚線維芽細胞、ＢＨＫ細胞、ヒトＳＷ１３細胞のような）および酵母（ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のような）の宿主細胞を包含する。哺乳動物もしくは酵母細胞の使用は、昆虫細胞で得ることができるより野性型タンパク質のものにより類似したグリコシル化を伴うタンパク質の発現をもたらすかもしれない。
【００６５】
バキュロウイルスに加えて遺伝子の送達に適する組換えベクターは、限定されるものでないが、ワクシニアおよび他のポックスウイルス、シンドビス、アデノウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスならびに他のアルファウイルスのようなウイルス、ならびにプラスミドＤＮＡを挙げることができる。
【００６６】
組換えベクターは、プロモーター、ならびに対応する宿主細胞型中でインフルエンザ（およびいずれかの非インフルエンザ）タンパク質の発現を導いてＶＬＰを産生させるのに有効な他の調節要素（ポリアデニル酸化シグナルのような）を包含すべきである。宿主細胞は、当該技術分野で既知の慣習的技術によりトランスフェクト、感染もしくは別の方法で形質転換される。こうした技術は、限定されるものでないが形質導入、電気穿孔法およびリポフェクションもまた挙げることができる。
【００６７】
本明細書に記述されるとおり、インフルエンザの４種の構造タンパク質（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２）の４部分からなるバキュロウイルス組換え体を介する発現は、ＶＬＰのアセンブリーおよびＳｆ９昆虫細胞の表面からの放出を駆動するのに十分であった。これは、４種の構造タンパク質のみで産生されたインフルエンザのＶＬＰの形成の最初の報告である。実際に、ＶＬＰは１個の構造タンパク質Ｍ１と同じくらいの数を含むことができる。従って、本発明は、Ｍ１単独、Ｍ１ならびにＨＡ、ＮＡおよびＭ２の１種もしくは２種、ならびにこれらの構造タンパク質の全４種より構成されるＶＬＰを包含する。
【００６８】
アセンブリーされたＶＬＰは、それらの大きさ、粒子の形態および表面のスパイクの微細な構造が野性型インフルエンザウイルスに緊密に似ている。さらに、インフルエンザのＲＮＰの非存在下でのＶＬＰの形成は、ＲＮＰが粒子のアセンブリーおよび放出に必要でないことを示す。
【００６９】
インフルエンザのＶＬＰをアセンブリーするためのこの新規アプローチは、新たなインフルエンザ変異体に対する免疫原性組成物の設計に非常に重要である。この系の１つの重要な特徴は、表面糖タンパク質を異なるサブタイプのＨＡおよび／もしくはＮＡで置き換える能力であり；これはこれらのタンパク質の新たな抗原性変異体を用いる処方の更新を可能にすることができる。これらの糖タンパク質の抗原性変異体が同定される際に、ＶＬＰはこれらの新たな変異体を包含するよう更新されることができる。従って、Ｈ１Ｎ１（１９１８スペイン型インフルエンザから）もしくは汎流行性の潜在能力をもつＨＡ、ＮＡの組合せのような極めて危険な表面糖タンパク質でさえ、数十年間ヒト中で広まらなかった遺伝子の放出を巻き込むことについての懸念なしに、ＶＬＰ中に組込むことが可能である。これは、ＶＬＰが感染性でなく、複製せずかつ疾患を引き起こす可能性がないためである。
【００７０】
さらに、ＶＬＰの表面上に異種糖タンパク質を組込むことの実行可能性は、このアプローチを送達系として魅力的にするのみならず、しかしまたそれらの表面上に組込まれた表面糖タンパク質に基づき特定の細胞型に標的を定めること（親和性）も見込むかもしれない。一態様において、ＶＬＰはＨＡの細胞質末端および膜貫通ドメイン、ならびに、多価免疫感作に有用なキメラ粒子の生成を助長する非インフルエンザの糖タンパク質の外的ドメインを含有する。
【００７１】
要約すれば、野性型およびキメラのインフルエンザウイルス様粒子は、マトリックスタンパク質Ｍ１が常に発現される限りは、ただ１種ないし４種のウイルス構造タンパク質の発現後にアセンブリーされかつＳｆ９細胞の表面から放出されることができることが示された。Ｍ１は、２者が一緒に存在する場合にＮＰを含有する小胞粒子の放出を駆動することが可能であることもまた立証された。
【００７２】
本発明のさらなる一態様において、ＶＬＰ中へのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）（３種のポリメラーゼサブユニットＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２、ならびに核タンパク質ＮＰを含有する）の形成およびその後のキャプシドでの被包化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）が達成された。Ｓｆ９昆虫細胞中で３種のポリメラーゼサブユニットおよびＮＰを同時に発現した、第二の４部分からなるバキュロウイルス組換え体が生成された（図１４）。
【００７３】
ＲＮＰの形成およびキャプシドでの被包化を評価するために、インフルエンザウイルスのＮＰ末端の３’および５’の保存されたおよび非コーディング領域により隣接された、アンチセンスの向きでルシフェラーゼをコードするインビトロの負のセンスＲＮＡ鋳型を合成した。インビトロで生成されたＲＮＡでのＳｆ９昆虫細胞のトランスフェクション、ならびにＱ２８および第二の４部分からなる組換え体でのその後の重感染は、レポーター遺伝子ならびにポリメラーゼおよびＮＰを運搬したＶＬＰのアセンブリーおよび放出につながった。トランスフェクト／感染されたＳｆ９細胞の濃縮された上清をベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）単層に移し、インキュベートし、そして細胞をルシフェラーゼアッセイ溶解緩衝液で破壊した。感染した細胞のライセートは、感染していない対照細胞のものの７０〜７００倍のルシフェラーゼ活性を示した（図１５）。
【００７４】
同様に、ＲＮＰの形成およびキャプシドでの被包化を評価するため、インフルエンザウイルスのＮＰ末端の３’および５’の保存されたおよび非コーディング領域により隣接された、アンチセンスの向きで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするインビトロの負のセンスＲＮＡ鋳型を合成した。インビトロで生成されたＲＮＡでのＳｆ９昆虫細胞のトランスフェクション、ならびにＱ２８および第二の４部分からなる組換え体でのその後の重感染は、レポーター遺伝子ならびにポリメラーゼおよびＮＰを運搬したＶＬＰのアセンブリーおよび放出につながった。トランスフェクト／感染されたＳｆ９細胞の濃縮された上清をＭＤＣＫ細胞単層に移した場合に、ＧＦＰの発現が検出された（図１６）。
【００７５】
これらの結果は、バキュロウイルス由来の粒子が、ルシフェラーゼおよびＧＦＰの発現により立証されたとおり、一次転写で機能的であったＲＮＰをキャプシドで包むことが可能であったことを示す。従って、ＶＬＰはＲＮＰをアセンブリーかつパッケージングすること、ならびに異種ヌクレオチド配列をさらに組込みかつ発現することが可能である。こうした発現される異種配列は、限定されるものでないが、下述されるところの非インフルエンザの病原性微生物からのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を包含する、インフルエンザウイルスにより産生されない異種部分を挙げることができる。こうした発現される異種配列は、免疫応答を増大および／もしくは移動させる免疫調節物質をさらに包含する。こうした免疫調節物質は、限定されるものでないがＩＬ−１２（ジェネティックス インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびＧＭ−ＣＳＦ（イムネックス コーポレーション（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）、ワシントン州シアトル）を挙げることができる。なおさらなる発現される異種配列は、標的を定めるおよび／もしくは治療部分としてはたらくモノクローナル抗体を包含する。
【００７６】
本発明のＶＬＰは、免疫原性もしくは製薬学的組成物を処方するのに使用される。そうするために、ＶＬＰを適切な濃度に調節し、そしていずれかの適するアジュバント、希釈剤もしくは担体とともに処方する。生理学的に許容できる媒体を担体および／もしくは希釈剤として使用してよい。これらは、限定されるものでないが：水、適切な等張の媒体、グリセロール、エタノールおよび他の慣習的溶媒、リン酸緩衝生理的食塩水などを挙げることができる。適するアジュバントは、限定されるものでないが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ イムノケム リサーチ インク（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミルトン、現在コリキサ（Ｃｏｒｘｉａ））、５２９（コリキサ（Ｃｏｒｉｘａ））のような合成リピドＡ類似物、スティムロン［Ｓｔｉｍｕｌｏｎ］（商標）ＱＳ−２１（アキラ バイオファーマシューティカルズ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、マサチューセッツ州フラミンガム）、ＩＬ−１２（ジェネティックス インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号明細書（２８））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定性トキシン、およびコレラトキシン（野性型、もしくは例えば国際特許出願公開第ＷＯ ００／１８４３４号明細書（２９）に従ってアミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置き換えられる突然変異体のいずれかの形態の）を挙げることができる。
【００７７】
本発明の一態様において、ＶＬＰを包含する製剤は免疫原性組成物としての使用を意図している。ウイルスは、タンパク質（例えばアルブミン、ゼラチン）、糖（例えばショ糖、乳糖、ソルビトール）、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）、生理的食塩水、もしくは他の保護剤のような細胞保護性添加物もしくは安定剤と混合してよい。この混合物を液体状態に維持するか、またはその後輸送および貯蔵のため乾燥もしくは凍結乾燥し、そして投与直前に水と混合する。
【００７８】
インフルエンザウイルスの構造タンパク質のみを含有するＶＬＰを含んで成る製剤は、ヒトもしくは他の脊椎動物被験体を免疫化してインフルエンザウイルスによる感染に対する保護を誘導するのに有用である。従って、本発明はさらに、上述されたとおり生成される、インフルエンザウイルスの構造タンパク質のみを含有するＶＬＰを組込む免疫原性組成物の製剤の有効免疫化量を被験体に投与することによりインフルエンザウイルスによる感染に対する保護を誘導するための被験体の免疫化方法を提供する。
【００７９】
１種のサブタイプからのＨＡおよび異なるサブタイプからのＮＡのような、異なるサブタイプのインフルエンザウイルスからの表面糖タンパク質を含有するＶＬＰを含んで成る製剤は、それら２種のサブタイプのインフルエンザウイルスにより引き起こされる感染に対して脊椎動物を免疫化するための二価免疫原性組成物として、希釈剤もしくは担体とともに処方される。上で論考されたとおり、ＨＡおよびＮＡのそれぞれは、抗原の変異体が同定される際に置き換えることができる。従って、更新されたキメラＶＬＰは、本明細書に記述される方法に従って容易に構築される。
【００８０】
あるいは、多価免疫原性組成物が、目的の各インフルエンザ株から一組のＶＬＰを生成させること、ＶＬＰの該組を適切な比で混合すること、および生じる免疫原性組成物を投与することにより製造される。
【００８１】
本発明の製剤はまた、ＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部が、キメラＶＬＰを含んで成るようにインフルエンザウイルスにより産生されない異種部分により置き換えられるＶＬＰも含んで成る。こうした部分は限定されるものでないがペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を挙げることができる。ＨＡもしくはＮＡの一部分のみが置き換えられるべきである場合は、ＨＡもしくはＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列の一部分が、非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる。ＨＡもしくはＮＡ全体が置き換えられるべきである場合には、ＨＡもしくはＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列全体が、非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる。
【００８２】
あるいは、インフルエンザウイルス（もしくはＮＰをコードするもののようなインフルエンザウイルスのセグメント）により産生されない、上述されたところの異種部分が、ＶＬＰ内に組込まれる。これは：（ａ）それぞれ最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質をコードする１種もしくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子［ここで、Ｍ１をコードする組換えＤＮＡ分子は常に構築される］、および（ｂ）異種部分（もしくはインフルエンザウイルスセグメント）をコードする組換えＤＮＡ分子、で、適する宿主細胞を重感染、コトランスフェクトもしくは別の方法で共形質転換すること、前記最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養して、その結果ＶＬＰが該最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現後に細胞内にアセンブリーされること、ならびにＶＬＰを培養上清から精製することにより達成される。異種部分（もしくはインフルエンザタンパク質）がＶＬＰ内に組込まれる。
【００８３】
こうした非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質が病原性微生物からである場合、生じるキメラＬＰは、その病原性微生物（ならびにインフルエンザウイルス）により引き起こされる感染に対して脊椎動物を免疫化するための免疫原性組成物として、希釈剤もしくは担体とともに処方される。最も典型的には、キメラＶＬＰは非インフルエンザの病原性微生物からの表面抗原を包含する。
【００８４】
こうした非インフルエンザの病原体微生物は、限定されるものでないが、ヒトおよび非ヒト脊椎動物を感染させるウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫の微生物からのものを挙げることができる。他の型の非インフルエンザ部分は、限定されるものでないが癌細胞もしくは腫瘍細胞からのもの、モノクローナル抗体（例えば標的を定めるおよび／もしくは治療部分として使用される）、アレルゲン、アミロイドペプチドタンパク質、または他の巨大分子成分を挙げることができる。
【００８５】
こうしたウイルスの例は、限定されるものでないが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルスタイプ１−３、単純疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ感染性ファブリキウス嚢疾患ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタ呼吸繁殖障害症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを挙げることができる。
【００８６】
こうした細菌の例は、限定されるものでないが、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（型分類可能および型分類不可能の双方）、ヘモフィルス ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、モラクセラ カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコックス アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ コレラシス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラスマ ガリセプチクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）を挙げることができる。
【００８７】
こうした真菌の例は、限定されるものでないがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）を挙げることができる。
【００８８】
こうした寄生虫の例は、限定されるものでないが、森林型熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスティス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）を挙げることができる。
【００８９】
こうした癌細胞もしくは腫瘍細胞の例は、限定されるものでないが、前立腺特異的抗原、癌胎児抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を挙げることができる。
【００９０】
こうしたアレルゲンの例は、限定されるものでないが、米国特許第５，８３０，８７７号明細書（３０）および国際特許出願公開第ＷＯ ９９／５１２５９号明細書（３１）（これにより引用することにより組込まれる）を挙げることができ、また、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、真菌の胞子および薬物（ペニシリンのような）を包含する。こうした成分は、ＩｇＥ抗体（アレルギー反応の既知の一原因）の産生を妨害する。
【００９１】
アミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病、アミロイドーシスもしくはアミロイド発生性疾患と多様に称される疾患に関与している。β−アミロイドペプチド（Ａβペプチドともまた称される）はＡＰＰの４２アミノ酸のフラグメントであり、βおよびγ分泌酵素によるＡＰＰのプロセシングにより生成され、そして以下の配列：
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ（配列番号２）
を有する。
【００９２】
若干の患者において、アミロイド沈着物は凝集されたＡβペプチドの形態をとる。驚くべきことに、単離されたＡβペプチドの投与が、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着物のＡβペプチド成分に対する免疫応答を誘導することが今や見出された（３２）。こうしたＡβペプチドはまた無関係の部分にも結合されている。従って、本発明のＶＬＰは、インフルエンザウイルスのＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部の代わりのこのＡβペプチド、ならびにＡβペプチドのフラグメント、およびＡβペプチドもしくはそのフラグメントに対する抗体の発現を包含する。Ａβペプチドの１種のこうしたフラグメントは、以下の配列（３３）：
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ（配列番号３）
を有する２８アミノ酸のペプチドである。
【００９３】
適切な投与数の十分な量の上述された免疫原性組成物を、免疫応答を導き出すために被験体に投与する。当業者はこうした量および投薬量を容易に決定することが可能であろう。投与は、鼻内に、非経口で、経口でのようないずれかの慣習的な有効な形態によってよいか、またはエアゾルスプレーによるように鼻内、口腔、眼、肺、膣もしくは直腸表面のようないずれかの粘膜表面に局所的に適用される。好ましい投与手段は鼻内投与による。
【００９４】
こうした非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質はまた製薬学的に活性の部分であることもできる。こうした部分は、限定されるものでないが、治療薬タンパク質、成長因子、免疫調節物質、モノクローナル抗体、ならびに免疫原性組成物に関して上に列挙された部分を挙げることができる。これらのキメラＶＬＰは、製薬学的組成物として上で論考されたところの希釈剤もしくは担体とともに処方され、そして前記こうした非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質で脊椎動物を治療するのに有効な量で投与される。有効量は当業者により容易に決定される。
【００９５】
前述の製薬学的組成物は、上に論考されたところのアジュバントをさらに含んでよい。
【００９６】
こうした非インフルエンザのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質はまた、レセプター−リガンド研究で有用なレセプターもしくはリガンドであることもできる。例えば、非インフルエンザの糖タンパク質が、特定のレセプターに標的を定められるＶＬＰ中に包含される。
【００９７】
これらの免疫原性もしくは製薬学的組成物の全部において、ＶＬＰは脊椎動物宿主に投与される場合に免疫応答を誘導することが可能であるが、しかし、疾患の症状を引き起こすことは可能でない。ＶＬＰは遺伝物質を含有せず、そして脊椎動物被験体中で複製することができないためである。
【００９８】
本明細書で引用される全部の特許および刊行物は、これにより引用することにより組込まれる。
【００９９】
本発明がより良好に理解されることができるために、以下の実施例を示す。実施例は具体的説明のみの目的上であり、そして本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
【０１００】
実施例
実施例１
バキュロウイルス導入ベクターｐＡｃＡＢ４へのインフルエンザＭ２遺伝子のクローニング
Ｍ１ ｍＲＮＡのスプライスされた産物であるインフルエンザＭ２遺伝子を、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株に感染していたＭＤＣＫ細胞から抽出されたポリアデニル酸化ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより単離した。Ｍ２遺伝子をＤＮＡ挿入物としてｐＧｅｍＴベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化し、そして、特異的プライマーを用い、色素ターミネーション配列決定反応および自動化ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシークェンサー（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して配列決定した。
【０１０１】
Ｍ２遺伝子をＥａｇＩ制限酵素での消化によりｐＧｅｍＴ−Ｍ２プラスミドから遊離させ、そしてｐＡｃＡＢ４（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））バキュロウイルス導入ベクターへのクローニングのため準備した。Ｍ２−ＤＮＡフラグメントをＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）で埋め、そしてＢｇｌＩＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼでのライゲーションにより末端に組込んだ。全部の酵素およびリンカーはニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）から得た。その後、導入ベクターｐＡｃＡＢ４をＢｇｌＩＩで消化し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。その後、Ｍ２挿入物をゲル精製し（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、そして３：１の比で導入ベクターに連結した。陽性クローンを制限分析により選択し、そして、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）プラスミド精製キットを使用して１００ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。この構築物を今やｐＡｃＡＢ４／Ｍ２と称することができる。
【０１０２】
実施例２
中間（「シャトル」）ベクターの構築
インフルエンザの遺伝子を導入ベクターｐＡｃＡＢ４にクローン化するための便宜的制限部位の数の制限により、ＰＣＲにより付加された新たな制限部位により隣接された３個のバキュロウイルスプロモーター（２個のポリへドリンおよび１個のｐ１０）を運搬するシャトルクローニングベクターを生成させた。このシャトルベクターは以下のとおり構築した。すなわち、ｐＡｃＡＢ４Ｍ２（実施例１から）をＳｍａＩで消化しかつ２サンプルに分割した。一方のｐＡｃＡＢ４／Ｍ２−ＳｍａＩサンプルはＸｂａＩで消化し、それは４００ヌクレオチド長のＤＮＡフラグメントを遊離した。このＤＮＡをゲル精製し、そして２種のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。プライマーの一方は最終生成物の一端にＰｍｅＩ（斜体）およびＮｏｔＩ（下線を付けられた）部位を組込んだ：
５’ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡ３’（配列番号４）
５’ＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＡＡＴ３’（配列番号５）
他方のｐＡｃＡＢ４／Ｍ２−ＳｍａＩサンプルはＢａｍＨＩで消化し、そして遊離されたＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ　ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてまた２種のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。プライマーの一方は最終のＰＣＲ産物にＳａｃＩ（斜体）およびＮｈｅＩ（下線を付けられた）部位を組込んだ：
５’ＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＧＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡ３’（配列番号６）
５’ＡＣＡＡＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＧＡ（配列番号７）
改変されない末端で重なり合うこれら２種のＰＣＲ産物を、新たに組込まれた制限酵素部位に特異的な２種の外的プライマー：
５’ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ３’（配列番号８）
５’ＡＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＧＣＧＴＡ３’（配列番号９）
を用いる別のＰＣＲ反応で使用した。
【０１０３】
その後、このＰＣＲ　ＤＮＡをＳａｃＩ／ＰｍｅＩで消化した。ｐＮＥＢ１９３プラスミド（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））もまたＳａｃＩ／ＰｍｅＩで消化し、そしてＴ４リガーゼを用いて、消化されたＰＣＲ　ＤＮＡと連結した。最終的に、この結果として生じるｐＮＥＢ１９３シャトルベクターは、インフルエンザ遺伝子ＨＡ、ＮＡおよびＭ１のその後のクローニングで使用される新たな制限部位により隣接された２個のポリへドリンプロモーターおよび１個のｐ１０プロモーターを含有するＤＮＡフラグメントを運搬する。
【０１０４】
実施例３
シャトルベクターへのインフルエンザＨＡ、ＮＡおよびＭ１遺伝子のクローニング
インフルエンザ遺伝子ＨＡ、ＮＡおよびマトリックス（Ｍ１）を、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）の精製されたゲノムＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより回収した。全３種の遺伝子をＤＮＡ挿入物としてｐＧｅｍＴもしくはｐＧｅｍＴｅａｓｙベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化し、そして、特異的プライマーを用い、色素ターミネーション配列決定反応および自動化ＡＢＩ　３７７　ＤＮＡシークェンサーを使用して配列決定した。Ｍ１遺伝子の５’端の２個のドナースプライス部位を、宿主細胞中でのＭ１　ｍＲＮＡの潜在的スプライシングを予防するように、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）キットを使用して突然変異させた（ｐＧＴ−Ｍ１スプライス）。
【０１０５】
これら３種の遺伝子を３段階でシャトルベクターにクローン化した。すなわち１）Ｍ１遺伝子のクローニング：
ｐＧｅｍＴ／Ｍ１（スプライス）プラスミド（Ｍ１遺伝子を運搬するｐＧｅｍＴ）を、増幅されたＤＮＡ中にそれぞれＮｈｅＩおよびＳａｃＩ部位を導入した５’および３’プライマーを用いるＰＣＲ反応で鋳型として使用した。その後、このＰＣＲ　ＤＮＡをＮｈｅＩ／ＳａｃＩで消化しかつゲル精製した。同様に、ｐＮＥＢ１９３シャトルベクターをＮｈｅＩ／ＳａｃＩで消化しかつ精製した。シャトルベクターおよび挿入物（Ｍ１　ＰＣＲ）を連結し、そしてトランスフェクション後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させた。ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）（パーキン　エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））を使用してＭ１遺伝子を配列決定した。Ｍ１遺伝子はポリへドリンプロモーターから下流に配置された。生じるプラスミドをｐＮＥＢ１９３Ｍ１と呼んだ。
２）ＨＡ遺伝子のクローニング：
ｐＧｅｍＴ／ＨＡプラスミド（ＨＡ遺伝子を運搬するｐＧｅｍＴ）をＳａｃＩＩで消化しかつ末端を埋めた。消化されたＤＮＡにＮｏｔＩリンカーを連結した。その後、ＨＡ挿入物が遊離されかつ各端にＮｏｔＩ部位を有することができるように、該ＤＮＡをＮｏｔＩで消化した。プラスミドｐＮＥＢ１９３Ｍ１をＮｏｔＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、そしてＨＡ挿入物をＴ４　ＤＮＡリガーゼでそれに連結した（方向性をもたない）。ＰＣＲを使用して、ポリへドリンプロモーターの転写制御下にあるＨＡ遺伝子の向きを決定した。生じるプラスミドをｐＮＥＢ１９３Ｍ１／ＨＡと呼んだ。
３）ＮＡ遺伝子のクローニング：
プラスミドｐＧｅｍＴ／ＮＡ３Ｂ（ＮＡ遺伝子を運搬するｐＧｅｍＴ）を最初にＳａｃＩＩで消化し、そしてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで末端を埋めた。その後、ＮＡ遺伝子をＳｐｅＩでの消化により遊離しかつクレノウで埋め、そしてＮＡ挿入物を平滑末端連結した。次に、ｐＮＥＢ１９３Ｍ１／ＨＡをＳｍａＩで消化し、そしてＮＡ挿入物を平滑末端連結した。ＰＣＲを使用して、正しい向きにＮＡ遺伝子を運搬したクローンを同定した。ＮＡ遺伝子はｐ１０プロモーターから下流に配置された。生じるプラスミドをｐＮＥＢ１９３Ｍ１／ＨＡ／ＮＡと呼んだ。
【０１０６】
実施例４
インフルエンザ遺伝子Ｍ２、Ｍ１、ＨＡおよびＮＡを含有する導入ベクターの構築
実施例３に記述される過程の完了後、ｐＮＥＢ１９３Ｍ１／ＨＡ／ＮＡシャトルベクターは、バキュロウイルスプロモーターの転写調節制御下に配置されたＭ１、ＨＡおよびＮＡ遺伝子を含有した。これら３種の遺伝子を単一のＤＮＡ片として遊離させるために、該シャトルベクターをＰｍｅＩ／ＳａｃＩで消化した。このＤＮＡフラグメントを実施例１からのｐＡｃＡＢ４Ｍ２（Ｍ２遺伝子を既に含有した）に連結した。これは以下のとおり改変されていた。すなわち、シャトルベクターからのこれら３種の遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントのクローニングを助長するために、新たな制限部位をｐＡｃＡＢ４／Ｍ２に導入した。その後このｐＡｃＡＢ４／Ｍ２プラスミドをＸｂａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント）で末端を埋め、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてＰｍｅＩリンカーを付加した。その後、このＤＮＡをＰｍｅＩで消化しかつ再連結してＰｍｅＩ部位を再生した。同様に、再連結されたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）で埋め、そしてＴ４リガーゼを用いてＳａｃＩリンカーを結合した。ＳａｃＩでのその後の消化およびライゲーションはＳａｃＩ部位を復帰させた。生じるｐＡｃＡＢ４／Ｍ２ベクターは２個の新たな部位、すなわちＰｍｅＩおよびＳａｃＩを有する。該ベクターを、ＰｍｅＩ／ＳａｃＩでの消化およびゲル精製により、付加的なインフルエンザ遺伝子の挿入のため準備した。全部の結合部を配列決定して、いかなる突然変異もｐＮＥＢ１９３のクローニングの間に導入されなかったことを確実にした。生じる構築物をＨＡ／Ｑと呼称し（図１を参照されたい）、これは４種のインフルエンザ遺伝子を運搬する導入ベクター（ｐＡｃＡＢ４／Ｍ２／Ｍ１／ＨＡ／ＮＡ）である。
【０１０７】
実施例５
キメラ導入ベクターの生成
Ｇ遺伝子の３’および５’端に特異的なプライマー（５’ＡＡＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＴＧＴ３’（配列番号１０）および５’ＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＧＧ３’（配列番号１１））を用いるウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、ＶＳＶ　Ｇタンパク質のコーディング配列をＶＳＶから回収し、そしてｐＧｅｍＴプラスミド（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化した。生じるｐＧｅｍＴ−ＶＳＶクローンをＳａｃＩＩで消化し、そしてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。その後それをＳｐｅＩで消化しかつクレノウで末端を埋めた。ＮｏｔＩリンカーをＴ４リガーゼで付加し、そしてその後ＮｏｔＩで再消化した。その後、ＶＳＶ　Ｇのコーディング配列を、ＨＡ遺伝子を除去するようにＮｏｔＩで消化されていたＱ２８ベクターに連結した。遺伝子の向きをＰＣＲおよび配列決定により確認した。この構築物を導入ベクターＶＳＶ−Ｇと呼称した。
【０１０８】
代替の一態様において、ＶＳＶ　Ｇ遺伝子の一部分のみを挿入した。ＨＡの膜貫通（２９アミノ酸）および細胞質（１４アミノ酸）ドメインと同じ読み枠で融合されたＧタンパク質の細胞外ドメインを含有するキメラ遺伝子（図２を参照されたい）を、以下のとおりＰＣＲにより生成させた。すなわち、インフルエンザのＨＡ遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞質末端を、ｐＧｅｍＴ−ＨＡクローンからＰＣＲにより増幅しかつゲル精製した。ＶＳＶ　Ｇ遺伝子の細胞外ドメインもまたＰＣＲにより増幅しかつゲル精製した。これらのＤＮＡフラグメントの双方を、ＶＳＶ　Ｇ遺伝子の５’端およびＨＡ遺伝子の３’端に対応するプライマーを使用する、ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）を用いるＰＣＲ反応において鋳型として使用した。１６２０ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＮｏｔＩリンカーをＴ４リガーゼで付加し、次いでＮｏｔＩで消化した。この挿入物を、ＨＡ遺伝子を除去するようにＮｏｔＩで消化されていたＨＡ／Ｑベクターに連結した。結果として生じる構築物が導入ベクターＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ（キメラ）を生成させた。
【０１０９】
実施例６
昆虫細胞における４部分からなるバキュロウイルス組換え体のトランスフェクション
Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）を、皿あたり２×１０^６個の細胞の密度で６０ｍｍ皿上に接種した。およそ２μｇのＨＡ／Ｑ導入ベクターを０．５μｇの直鎖状にされたバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）ＤＮＡ（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））と混合し、そしてバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）トランスフェクションキット（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用してＳｆ９細胞を該ＤＮＡでトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを選択し、そして３回のプラーク精製により精製した。１個のこうしたプラーク精製された組換え体をＨＡ／Ｑ２８と呼称し、そしてさらなる研究のため選択した。
【０１１０】
加えて、完全長のＶＳＶ−ＧもしくはＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ（キメラ）を運搬する、４部分からなる導入ベクターＤＮＡを、上述されたとおり、直鎖状にされたバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）ＤＮＡとともにＳｆ９細胞にトランスフェクトして、組換え体ＶＳＶ−Ｇ／ＱおよびＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ／Ｑを生成させた。組換えウイルスをＨＡ／Ｑ２８について上述されたとおり選択した。全部の組換え体を７×１０^７ｐｆｕ／ｍｌの力価までＳｆ９細胞中で増幅した。
【０１１１】
実施例７
Ｓｆ９昆虫細胞の成長およびバキュロウイルス組換え体への感染
全部のＳｆ９細胞培養物は血清を含まない培地中で懸濁物中で成長させた。バキュロウイルス組換え体への感染は５の感染多重度（ＭＯＩ）で実施した。組換えウイルスを小容量で細胞単層に接種し、室温で３０分間吸着させ、そしてその後、血清を含まない新鮮培地を添加した後に２８℃でインキュベートした。細胞および培地は、別の方法で明記されない限り感染７２時間後に収集し、そしてタンパク質の発現およびＶＬＰの形成のその後の分析に使用した。
【０１１２】
実施例８
導入ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５への単一のインフルエンザ遺伝子のクローニング、および単一のバキュロウイルス組換え体の生成
インフルエンザＡ／ＵｄｏｒｎのＭ１遺伝子は以前にｐＧｅｍＴにクローン化した（ｐＧＴ−Ｍ１スプライス、上の実施例１を参照されたい）。Ｍ１遺伝子をサブクローニングするために、ｐＧＴ−Ｍ１をＳａｃＩＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そしてＳａｃＩリンカーをＴ４リガーゼで末端に付加した。その後、該プラスミドをＳａｃＩ／ＳａｌＩで消化し、そして遊離されたＭ１をゲル精製した。ＳａｃＩ／ＳａｌＩで消化されていたｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入物を連結し、そしてライゲーション混合物でＤＨ５α細胞を形質転換した。
【０１１３】
ＨＡ遺伝子をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５にサブクローニングするために、ｐＧｅｍＴ／ＨＡ（上の実施例３を参照されたい）をＳａｃＩＩで消化し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。その後、該ＤＮＡをＳａｌＩで再消化して挿入物を取り出しかつゲル精製した。ＮｈｅＩ（平滑）／ＳａｌＩ消化されたｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５にＨＡ挿入物を連結し、そしてライゲーション混合物を用いてＳＴＢＬ２コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。
【０１１４】
ｐＧｅｍＴ−ＮＡ（上の実施例３を参照されたい）をＳａｃＩＩで消化しかつＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。その後、このＤＮＡをＳｐｅＩで消化しかつゲル精製した。ＮｈｅＩ／ＳｍａＩで消化されていたｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ベクターに挿入物を連結し、そしてＳＴＢＬ２コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換した。
【０１１５】
導入ベクターＤＮＡが正しいことが配列決定により見出された場合に、５μｇの各ｐＢｌｕｅＢａｃクローンおよび１０μｇのＢａｃ ＆ Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でＳｆ９細胞をトランスフェクトした。リポソームに媒介されるトランスフェクションにより、Ｓｆ９細胞をこれらのＤＮＡでコトランスフェクトした。細胞を５日間インキュベートしそして上清をプラーク精製した。単一の青色プラークを成長させかつＳｆ９細胞中で増幅し、そしてタンパク質発現をウェスタンブロットにより評価した。この研究で使用されたＮＰバキュロウイルス組換え体（インフルエンザのＮＰ遺伝子を含有する）は、Ｇａｌａｒｚａら（２７）により記述されたとおり構築した。
【０１１６】
実施例９
イムノブロッティング分析
ウェスタンブロット分析を使用して、感染したＳｆ９細胞、濃縮された上清および勾配画分中でタンパク質を同定した。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し（別の方法で明記されない限り）、そしてニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットを、５％脱脂粉乳および０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するＴＢＳ（トリス緩衝生理的食塩水）の溶液中でブロッキングし、そしてその後、インフルエンザのＨＡ、Ｍ１（マトリックス）およびＭ２タンパク質に対するモノクローナル抗体の混合物でプロービングした。マウスモノクローナル抗ＨＡ（クローン１２ＣＡ５）はロシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インジアナ州インジアナポリス）から得た。マウスモノクローナル抗Ｍ１（クローンＧＡ２Ｂ）はセロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）（ノースカロライナ州ローリー）からであった。マウスモノクローナル抗Ｍ２はマウント サイナイ ハイブリドーマ センター（Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｎｔｅｒ）（ニューヨーク州ニューヨーク）からであった。アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて、ウェスタンブロット上で抗原を可視化した。単一遺伝子のバキュロウイルス組換え体の一、二もしくは三重の組合せに感染させたＳｆ９細胞中でのＶＬＰ形成の分析を類似の様式で実施した。ＶＳＶ Ｇタンパク質を含有するサンプルの分析を、インフルエンザのＭ１およびＭ２タンパク質に対する抗体と組合せのマウスモノクローナル抗Ｇ抗体（クローンＰ５Ｄ４；ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））でプロービングした。結果を図３に示す。
【０１１７】
実施例１０
感染したＳｆ９細胞の免疫蛍光
Ｓｆ９細胞を八区画チャンバー（ｅｉｇｈｔ ｓｑｕａｒｅ−ｃｈａｍｂｅｒ）中で成長させ（ボックス培養物）、そして１のＭＯＩで４部分からなるもしくは単一の遺伝子のバキュロウイルス組換え体に感染させた。感染後７２時間に、Ｓｆ９細胞の個々のボックスをメタノール／アセトン（２：１）もしくは３％パラホルムアルデヒドのいずれかで固定した。ブロッキング段階として、固定された細胞を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中室温で３０分間インキュベートした。その後、各スライドガラスを続けて一次および二次抗体の溶液とともにインキュベートした。ラット抗ＨＡ（ロシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））／マウス抗Ｍ１モノクローナル（実施例９を参照されたい）抗体の組合せ（一次として、１００倍希釈）、および、ヤギ抗ラットローダミン結合（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））／ヒツジ抗マウスＦＩＴＣ結合（シグマ（Ｓｉｇｍａ））抗体の組合せ（二次として）を使用して、ＨＡおよびＭ１の発現を検査した。ラットモノクローナル抗ＨＡ／ウサギ抗ＮＡペプチド（リサーチ ジェネティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）により注文により作られた）の組合せ（一次として、１００倍希釈）およびヤギ抗ラットローダミン結合（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））／ヒツジ抗ウサギＦＩＴＣ結合（シグマ（Ｓｉｇｍａ））抗体（二次として）を使用して、ＮＡおよびＨＡの発現を検査した。ローダミンに対する一代替として、Ｃｙ３結合ヤギ抗ラット（シグマ（Ｓｉｇｍａ））抗体を使用してもよい。各抗体反応を室温で３０分間インキュベートし、そして、段階の間にはスライドガラスをＰＢＳで３回すすいだ。ＦＩＴＣおよびローダミン分子は、４９５ｎｍおよび５５２ｎｍの波長で励起された場合にそれぞれ緑色および赤色の光を発射し、それらを適切なフィルターで識別した。免疫蛍光分析の結果を図４〜７に示す。
【０１１８】
実施例１１
インフルエンザのＶＬＰの精製
Ｓｆ９細胞を、１５０ｃｍ^２組織培養フラスコあたり７．５×１０^７個の細胞の密度で接種しかつ室温で３０分間静置させた。細胞を、５のＭＯＩでバキュロウイルス組換え体（ＨＡ／Ｑ２８、ＶＳＶ−Ｇ／Ｑ、ＶＳＶ−Ｇ／ＨＡ／Ｑキメラもしくは単一の組換え体）に感染させ、そして感染を２８℃で７２時間進行させた。完了の場合に、培地を収穫しかつ低速遠心分離（４℃かつ２０００×ｇで３０分）にかけた。その後、上清を、２０００００×ｇで９０分間回転させることによりペレットにした。当初感染させた細胞の数に依存して、生じるペレットを５０μｌもしくは５００μｌの１×ＰＢＳに再懸濁し、短い超音波処理によりホモジェナイズし、そしてその後イオディキサノール（オプティプレップ（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）、ニコメド（Ｎｙｃｏｍｅｄ）／シグマ（Ｓｉｇｍａ））勾配（１．０８ｇ／ｍｌないし１．３２ｇ／ｍｌの密度）の上部に負荷した。該勾配を２０００００×ｇで３．５時間回転し、そして、Ｕ字形マイクロキャピラリーチューブを使用してチューブの底部から重力により画分を収集した。これらの画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロットを図８および９に示す。粒子をさらに精製するために、ＶＬＰを含有する画分を第二のショ糖勾配遠心分離にかけた。ショ糖平衡勾配遠心分離のため、以前に選択された画分はＰＢＳを用いて透析し、そして２０〜６０％（ｗｔ／ｗｔ）ショ糖（ＮＴＥ中）勾配上に層状に重ね、そして４℃かつ１５００００×ｇで２２時間遠心分離した。遠心分離後、０．５ｍｌの画分を上述されたとおりチューブの底部から収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にウェスタンブロットにより分析した。
【０１１９】
その後、ＶＬＰを含有する画分を、電子顕微鏡検査およびイムノゴールド標識により検査した（実施例１２を参照されたい）。
【０１２０】
実施例１２
電子顕微鏡検査：陰性染色およびイムノゴールド標識
陰性染色およびイムノゴールド標識のため、ＶＬＰを培養上清から濃縮し、そして２回の連続する密度勾配遠心分離により精製した（実施例１１を参照されたい）。サンプルのアリコートを、新鮮なグロー放電されたプラスチック／炭素被覆された格子上に置き、数滴の蒸留水で穏やかに洗浄し、２％リンタングステン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で陰性染色し、そして電子顕微鏡で見た。陰性に染色されたインフルエンザのＶＬＰの電子顕微鏡写真を図１０に描く。
【０１２１】
ＶＬＰを装飾する表面抗原のイムノゴールド標識のためのサンプルを、０．５％グルタルアルデヒド中で５分間前固定し、上述されたような格子上に置き、そして数滴の蒸留水で洗浄した。その後、それらを、１００μｌ容量の以下の溶液、すなわちＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈された一次抗体、３０分間；ＰＢＳ−１％ＢＳＡで３回、各５分間；ＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈された（１：１０）マウスＩｇＧに対する抗体で被覆された金球体の懸濁液、３０分間；ＰＢＳ−１％ＢＳＡで３回、各５分間、の上面で伏せて続けてインキュベートした。最後に、それらを数滴の蒸留水で洗浄し、２％酢酸ウラシルで染色し、風乾しそして電子顕微鏡で検査した。抗ＨＡもしくは抗ＮＡモノクローナル抗体でプロービングされかつ抗マウスＩｇＧに結合された金球体で対染色された、イムノゴールド標識されたインフルエンザのＶＬＰの電子顕微鏡写真を、図１１に描く。
【０１２２】
実施例１３
ＶＬＰ中へのインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）の組込み
Ｓｆ９細胞を、ＨＡ／Ｑ２８およびＮＰもしくはＮＰおよびＭ１の単一のバキュロウイルス組換え体のいずれかに重感染させた。重感染した細胞の濃縮された上清を実施例１１に従って精製した。これらの重感染した細胞により発現されたところのＨＡおよびＮＰ双方を含有する画分のウェスタンブロットを図９Ｂに描く。これらの重感染した細胞により発現されたところのＮＰおよびＭ１を含有する画分のウェスタンブロットを図８Ｃに描く。
【０１２３】
実施例１４
マウスにおけるＶＬＰの免疫原性
２群のＢａｌｂ／ｃマウス（４〜５週齢）を、ＨＡ／Ｑ２８ ＶＬＰ（およそ１μｇのＨＡ）もしくはＶＳＶ−Ｇ／Ｑ ＶＬＰ（およそ１μｇのＧ）のいずれかで筋肉内経路を介して免疫化し、ここで各組のＶＬＰはリン酸アルミニウム（２００μ／用量）とともに処方した。各群の全部のマウスは２週間間隔で初期抗原（ｐｒｉｍｅｒ）および２回の追加抗原注入を受領した。最後の免疫感作の２週間後に血液サンプルを得、そして、ウェスタンブロット（双方の型のＶＬＰについて）、赤血球凝集反応の阻害アッセイ（ＩＨＡ）（ＨＡ／Ｑ２８について）および血清中和試験（ＶＳＶ−Ｇ／Ｑについて）により、対応する抗原に対する抗体の存在を評価した。ウェスタンブロットを図１２（ＨＡ／Ｑ２８について）および図１３（ＶＳＶ−Ｇ／Ｑについて）に描く。ＩＨＡ力価はＩＨＡ単位（ＩＨＡＵ）で測定し、そして以下のとおりであった。すなわち、
投与を受けたことのないマウス： ３２ ＩＨＡＵ＊
陽性対照： １２８ ＩＨＡＵ
［インフルエンザＡ／香港型］
ＨＡ／Ｑ２８のプールされた血清： ９６ ＩＨＡＵ
＊投与を受けたことのないマウスは阻害力価を示し、これは非特異的アグルチニンによるかもしれない。全サンプルは、非特異的阻害物質および／もしくは非特異的アグルチニンを不活性化するための努力において、カオリンで処理しかつ５６℃で３０分間加熱した。
【０１２４】
血清中和試験のためには、ＶＳＶ−Ｇ／Ｑで免疫化されたマウスの血清の増大する希釈物を、ＶＳＶを含有する細胞単層の頂上に置き、インキュベートし、そして、細胞単層中のいずれかのプラークの形成の予防によりみられるところのウイルスを阻害する能力について分析した。血清の６４倍と同じくらいの希釈物がＶＳＶの標準的力価（１×１０^６ＰＦＵ／ｍｌ）を完全に中和したことが見出された。
【０１２５】
実施例１５
インフルエンザのＶＬＰ中へのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のパッケージングおよびレポーター遺伝子の発現
ポリメラーゼ（サブユニットＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）ならびにＮＰのバキュロウイルス構築物（４部分からなる導入ベクター組換え体）
インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のポリメラーゼのサブユニット（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡタンパク質）ならびに核タンパク質ＮＰをコードする３種の遺伝子を、単一のバキュロウイルス導入ベクターＰＡｃＡＢ４にサブクローニングした。ＰＢ１およびＰＡ遺伝子は、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターの転写制御下に反対の向きで配置した一方、また反対の向きのＰＢ２およびＮＰ遺伝子はバキュロウイルスｐ１０プロモーターの転写制御下にあった。ポリメラーゼ遺伝子およびＮＰを運搬する精製された導入ベクターＤＮＡ、ならびに直鎖状にされたゲノムのバキュロウイルスＤＮＡでのＳｆ９昆虫細胞のコトランスフェクションは、相同的組換えを見込んだ。これは、バキュロウイルスＤＮＡ中へのポリメラーゼおよびＮＰの遺伝子の導入をもたらした。この細胞内組換え事象は、培地中に放出された４部分からなるバキュロウイルス組換え体（図１４）を生成させた。３つの連続するプラーク精製／増幅段階を実施して、４部分からなるバキュロウイルス導入ベクター組換え体を選択した。遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲを実施して、精製された４部分からなる組換え体中での４種の遺伝子の存在を確認した。抗ＰＢ１、抗ＰＢ２、抗ＰＡおよび抗ＮＰ特異的ポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットアッセイを実施して、３種のポリメラーゼサブユニットおよびＮＰの発現を評価した（データは示されない）。
レポーター遺伝子構築物
インフルエンザウイルスの保存された３’および５’末端により隣接されるルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有したＤＮＡプラスミドを生成させた。これらの配列は、野性型ウイルスの感染において、インフルエンザゲノムの転写／複製およびパッケージングに必要とされる。保存された配列に加えて、正確な３’および５’末端が機能的ゲノムに不可欠である。これらの正確な末端を得るために、変えられたＴ７プロモーターをインフルエンザ配列の５’末端に付加し；その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでの転写が、ＲＮＡ転写物中で正確なインフルエンザの５’末端を生成させた。加えて、ＢｓａＩ制限部位をインフルエンザ配列の３’端に設計した。この制限酵素での該プラスミドの消化は５’オーバーハングをもつＤＮＡ鋳型を生じさせ、これは、ラン−オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写反応において、正確なインフルエンザの３’末端をもつＲＮＡ分子を生成させた。その後、ポリメラーゼ活性、ＲＮＡのキャプシドでの被包化、およびインフルエンザウイルス様粒子中へのＲＮＡのパッケージングを研究するのに、これらのモデルインフルエンザレポーター遺伝子を使用した。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＶＬＰパッケージング
Ｓｆ９昆虫細胞を、Ｑ２８（ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２）および４部分からなる導入（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ）ベクターのバキュロウイルス組換え体に同時に感染させた（ＭＯＩ：５）。感染を４８時間進行させ、そして、その時点で、インフルエンザゲノムの３’および５’末端により隣接された逆向きのルシフェラーゼ遺伝子を含有する３０μｇのインビトロ合成されたＲＮＡを、ＬＴ１トランスフェクション試薬（パンヴェラ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ウィスコンシン州マディソン）を使用してＳｆ９細胞にトランスフェクトした。感染／トランスフェクトされた細胞を追加の２４時間インキュベートした。その後、培養上清を収穫し、低速遠心分離により澄明にし、そしてＶＬＰを２０００×ｇで２時間の遠心分離により濃縮した。ＶＬＰを培地に再懸濁し、そしてベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）の新たな単層上に適用した。４８時間のインキュベーション後に、ＢＨＫ細胞をルシフェラーゼアッセイ溶解緩衝液で破壊し、そしてルシフェラーゼ活性を細胞抽出物中で測定した。バックグラウンドのルシフェラーゼ活性は、感染していないＢＨＫ細胞（対照）にて照度計を使用して測定し、そして示度は５０から５００相対光単位（ＲＬＵ）までの範囲にわたった。ＶＬＰに感染したＢＨＫ細胞のライセートは、３６，０００ＲＬＵのルシフェラーゼ活性の示度を示した（図１５）。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子のＶＬＰパッケージング
ＶＬＰ中へのＲＮＰの類似のパッケージング実験を、レポーターとして緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を使用して実施した。上述されたパラメータに従ってＳｆ９昆虫細胞を感染／トランスフェクトした。インフルエンザウイルスＲＮＡの３’および５’末端により隣接されるアンチセンスの向きのＧＦＰのコーディング配列を含有した、トランスフェクトされたＲＮＡ分子を構築した。ＢＨＫ細胞およびＭＤＣＫ細胞をＶＬＰで２４時間感染させ、そしてその後、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターを使用してＧＦＰの発現をモニターした。少数の緑色細胞が存在し、ＶＬＰがＧＦＰ遺伝子を導入してそれにより緑色蛍光タンパク質の発現をもたらすことが可能であったことを示唆した（図１６）。
【０１２６】
【表１】

【０１２７】
【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の４種の遺伝子を運搬する４部分からなるバキュロウイルス導入ベクター（構造的４区画（ｓｔｒｕｃｔｕａｌ　ｑｕａｄ））を描く。インフルエンザ遺伝子ＨＡおよびＭ１の転写はポリへドリンプロモーター（「ｐＨ」として略記される）により駆動される一方、Ｍ２およびＮＡはｐ１０プロモーターにより駆動される。このベクターを、直鎖状にされたバキュロウイルスＤＮＡと一緒にＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクトして、４部分からなる組換え体（ＨＡ／Ｑ）を生成させた。
【図２】
発明にかかる、ＶＳＶ−Ｇ／ＨＡキメラの構造を描く。インフルエンザＨＡの細胞質末端の１４アミノ酸および膜貫通ドメインの２９アミノ酸を、ＶＳＶ−Ｇ表面糖タンパク質の細胞外ドメインと同じ読み枠で融合した（配列番号１）。
【図３】
発明にかかる、４部分からなるバキュロウイルス組換え体（ＨＡ／Ｑ２８もしくはＶＳＶ−Ｇ／Ｑ）により感染されたＳｆ９細胞中で発現されたインフルエンザおよびＶＳＶ　Ｇタンパク質のウェスタンブロット分析を描く。図３Ａにおいて、インフルエンザタンパク質ＨＡ、Ｍ１およびＭ２が、抗ＨＡ、抗Ｍ１およびＭ２モノクローナル抗体の混合物を使用して、４部分からなる組換え体ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞の上清中で検出され（感染後７２時間）（レーン１）；ＨＡおよびＭ１はまた細胞ペレット中でも検出された（レーン２）。インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）に感染したＭＤＣＫ細胞を対照として使用した（レーン３）。
【図３Ｂ】
発明にかかる、ＶＳＶ−Ｇ／Ｑ（完全長のＧ）に感染させたＳｆ９細胞中でのＶＳＶ　ＧならびにインフルエンザのＭ１およびＭ２タンパク質の発現を描く。発現は、抗Ｇ、抗Ｍ１およびＭ２モノクローナル抗体の混合物でプロービングされた場合に、細胞ペレット（レーン２）および培養上清（レーン３）中で検出された。感染していないＳｆ９細胞（レーン１）、ＶＳＶに感染したＢＨＫ細胞（レーン４）およびインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）に感染したＭＤＣＫ細胞（レーン５）を、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。
【図４】
発明にかかる、４部分からなるバキュロウイルス組換え体（ＨＡ／Ｑ２８）に感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光分析を描く。Ｓｆ９細胞のボックス（ｂｏｘ ｃｕｌｔｕｒｅ）培養物を１のＭＯＩでＨＡ／Ｑ２８に感染させかつ７２時間インキュベートした。その時点で個々のボックスをメタノール−アセトンで固定し、そして続けて一次および二次抗体とともにインキュベートした。ＨＡ（図４Ａ）、Ｍ１（図４Ｂ）もしくはＨＡ／Ｍ１（図４Ｃ）の発現を、適切なフィルターを使用して検出した。
【図５】
発明にかかる、ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光分析を描く。ボックス培養物を１のＭＯＩでＨＡ／Ｑ２８に感染させかつ７２時間インキュベートした。その時点で個々のボックスをパラホルムアルデヒドで固定し、そして続けて一次および二次抗体とともにインキュベートした。ＨＡ（図５Ａ）、ＮＡ（図５Ｂ）もしくはＨＡ／ＮＡ（図５Ｃ）の発現を、適切なフィルターを使用して検出した。
【図６】
発明にかかる、ＨＡ／Ｑ２８に感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光分析を描く。Ｓｆ９細胞のボックス培養物を１のＭＯＩでＨＡ／Ｑ２８に感染させかつ７２時間インキュベートした。その時点で個々のボックスをパラホルムアルデヒドで固定し、そして続けて一次および二次抗体とともにインキュベートした。Ｍ２の発現を、適切なフィルターを使用して検出した。
【図７】
発明にかかる、ＶＳＶ−Ｇ／Ｑ（完全長のＶＳＶ Ｇ遺伝子により置き換えられたＨＡ／Ｑ２８中の完全長のインフルエンザＨＡ遺伝子）に感染させたＳｆ９細胞の免疫蛍光分析を描く。ボックス培養物を１のＭＯＩでＶＳＶ−Ｇ／Ｑに感染させかつ７２時間インキュベートした。その時点で個々のボックスをメタノール−アセトンで固定し、そして続けて一次および二次抗体とともにインキュベートした。ＶＳＶ Ｇの発現を、適切なフィルターを使用して検出した。
【図８】
発明にかかる、イオディキサノール勾配遠心分離によるＶＬＰ形成の分析を描く。図８Ａは、ＨＡ／Ｑ２８からの画分を抗ＨＡおよびＭ１モノクローナル抗体の混合物を用いるウェスタンブロットによりプロービングした場合の結果を描く。レーン１〜８はチューブの上部から底部まで収集された画分を表し；レーン９はＭＤＣＫのインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）に感染した対照である。図８Ｂは、ＶＳＶ−Ｇ／Ｑからの画分を抗ＶＳＶ−Ｇ、抗Ｍ１および抗Ｍ２モノクローナル抗体の混合物を用いるウェスタンブロットによりプロービングした場合の結果を描く。レーン１〜８はチューブの上部から底部まで収集された画分を表し；レーン９は対照として組合せられたＶＳＶに感染したＢＨＫおよびインフルエンザに感染したＭＤＣＫ細胞の混合物である。図８Ｃは、二重に感染した（Ｍ１およびＮＰの単一組換え体）Ｓｆ９細胞の濃縮された上清を精製しかつ抗Ｍ１および抗ＮＰ抗体の混合物でプロービングした場合の結果を描く。レーン１〜８はチューブの上部から底部まで収集された勾配画分を表し；レーン９は対照としてのインフルエンザに感染したＭＤＣＫ細胞である。
【図９】
発明にかかる、Ｍ１単独もしくはＨＡ／Ｑ２８およびＮＰ単一のバキュロウイルス組換え体に感染させたＳｆ９細胞の培養上清のウェスタンブロット分析を描く。図９Ａは、抗Ｍ１抗体でプロービングした単一のＭ１感染の上清由来の画分の分析を描く。レーン１〜８はチューブの上部から先端まで収集された画分を表し；レーン９は対照としてのインフルエンザに感染したＭＤＣＫ細胞である。図９Ｂは、二重に感染したＳｆ９細胞（ＨＡ／Ｑ２８およびＮＰ単一のバキュロウイルス組換え体）の上清を精製しかつ抗ＨＡ、抗Ｍ１および抗ＮＰ抗体の混合物でプロービングした場合の結果を描く。レーン１〜８はチューブの上部から底部まで収集された画分を表し；レーン９は図９Ａ中と同一の対照である。
【図１０】
発明にかかる、４部分からなる組換え体ＨＡ／Ｑ２８に感染させたｓｆ９細胞の培地から精製された陰性染色されたインフルエンザのＶＬＰの電子顕微鏡写真を描く。
【図１１】
発明にかかる、イムノゴールド標識されたインフルエンザのＶＬＰの電子顕微鏡写真を描く。図１１Ａ（３視野）では、ＶＬＰを抗ＨＡモノクローナル抗体でプロービングし、そして抗マウスＩｇＧに結合された金球体で対染色した。図１１Ｂでは、ＶＬＰを抗ＮＡモノクローナル抗体でプロービングし、そして図１１Ａでのとおり対染色した。
【図１２】
発明にかかる、ＨＡ／Ｑ２８ ＶＬＰで免疫化されたマウスからの血清のプールでプロービングされた、インフルエンザウイルスに感染させた細胞のウェスタンブロットを描く。図１２Ａでは、２匹のマウスの最初の対からのプールされた血清からの結果を描く。図１２Ｂでは、２匹のマウスの第二の対からのプールされた血清からの結果を描く。図１２ＡおよびＢのそれぞれにおいて、レーン１：対照としての感染していないＭＤＣＫ細胞；レーン２：インフルエンザＡウイルスに感染させたＭＤＣＫ細胞。感染していないＭＤＣＫ細胞のプロービングは、Ｍ１のもののわずかに上の非特異的バンドを示し、これはインフルエンザに感染した細胞中にもまた存在した。
【図１３】
発明にかかる、ＶＳＶ−Ｇ／ＱキメラＶＬＰで免疫化されたマウスからの血清のプールでプロービングされた、ＶＳＶに感染させた細胞のブロットを描く。図１３Ａでは、２匹のマウスの最初の対からのプールされた血清からの結果を描く。図１３Ｂでは、２匹のマウスの第二の対からのプールされた血清からの結果を描く。図１３ＡおよびＢのそれぞれにおいて：レーン１：対照としての感染していないＢＨＫ細胞；レーン２：ＶＳＶに感染させたＢＨＫ細胞；レーン３：対照としての感染していないＭＤＣＫ細胞；レーン４：インフルエンザに感染させたＭＤＣＫ細胞。
【図１４】
発明にかかる、ポリメラーゼサブユニットおよび核タンパク質をコードする３種の遺伝子を包含する、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の４種の遺伝子を運搬する４部分からなるバキュロウイルス導入ベクターを描く。反対の向きに配置されるインフルエンザ遺伝子ＰＢ１およびＰＡの転写はポリへドリンプロモーター（「ｐＨプロモーター」として略記される）により駆動される一方、また反対の向きのＰＢ２およびＮＰ遺伝子の転写はｐ１０プロモーターにより駆動される。４種の遺伝子をバキュロウイルス導入ベクターＰＡｃＡＢ４にサブクローニングし、その後、直鎖状にされたバキュロウイルスＤＮＡとともにＳｆ９昆虫細胞にコトランスフェクトして、４部分からなる組換え体を生成させた。
【図１５】
発明にかかる、感染していない（対照）およびＶＬＰに感染させたベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）中の相対光単位（ＲＬＵ）でのルシフェラーゼ活性の測定を描く。
【図１６】
発明にかかる、ＧＦＰ遺伝子を運搬するＶＬＰへの感染後のＢＨＫ細胞中での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を描く。矢印はＧＦＰを発現するＢＨＫ細胞を示す。

Claims (46)

1. （ｉ）それぞれ最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質をコードする１種もしくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子を構築すること［ここで、マトリックスタンパク質（Ｍ１）をコードする組換えＤＮＡ分子が常に構築される］；
   （ｉｉ）前記１種もしくはそれ以上の組換えＤＮＡ分子で適する宿主細胞をトランスフェクト、感染もしくは別の方法で形質転換すること、前記最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養すること、その結果該最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現後にインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）が該細胞内でアセンブリーされること；および
   （ｉｉｉ）ＶＬＰを培養上清から精製すること
   の段階を含んで成る、ＶＬＰの製造方法。
2. ＶＬＰが、Ｍ１、ならびにヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびＭ２よりなる群から選択されるインフルエンザの構造タンパク質の最低１種を含んで成る、請求項１記載の方法。
3. ＨＡおよびＮＡが異なるサブタイプのインフルエンザウイルスからのものである、請求項２記載の方法。
4. ＨＡもしくはＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列の一部分もしくは全部が、キメラＶＬＰを産生するように、インフルエンザウイルスにより産生されない部分をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる、請求項２記載の方法。
5. ＨＡをコードする組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質をコードするＤＮＡ配列により置き換えられる、請求項４記載の方法。
6. １種の組換えＤＮＡ分子中のＤＮＡ配列がＨＡの膜貫通および細胞質ドメインをコードするが、しかし、ＨＡの残存するコーディング領域が、ＶＳＶのＧタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列により置き換えられる、請求項４記載の方法。
7. インフルエンザタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で宿主細胞をコトランスフェクト、重感染もしくは共形質転換し、その結果インフルエンザタンパク質がＶＬＰ内に組込まれることをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
8. 組換えＤＮＡ分子がインフルエンザのヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）をコードする請求項７記載の方法。
9. インフルエンザウイルスにより産生されない部分をコードする組換えＤＮＡ分子で宿主細胞をコトランスフェクト、重感染もしくは共形質転換し、その結果非インフルエンザ部分がＶＬＰ内に組込まれることをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
10. 前記ＶＬＰが常にＭ１を包含する、最低１種のインフルエンザウイルスの構造タンパク質を含んで成るインフルエンザＶＬＰ。
11. ＶＬＰが、ＨＡ、ＮＡおよびＭ２よりなる群から選択されるインフルエンザの構造タンパク質の最低１種をさらに含んで成る、請求項１０記載のインフルエンザＶＬＰ。
12. ＨＡおよびＮＡが異なるサブタイプのインフルエンザウイルスからのものである、請求項１１記載のインフルエンザＶＬＰ。
13. ＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部が、キメラＶＬＰを含んで成るように、インフルエンザウイルスにより産生されない部分により置き換えられる、請求項１０記載のインフルエンザＶＬＰ。
14. ＨＡもしくはＮＡの一部分もしくは全部が、病原性微生物により産生されるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質により置き換えられる、請求項１３記載のキメラＶＬＰ。
15. ＨＡがＶＳＶのＧタンパク質により置き換えられる、請求項１４記載のキメラＶＬＰ。
16. ＨＡの膜貫通および細胞質ドメインが存在するが、しかし、ＨＡの残存する領域がＶＳＶのＧタンパク質の細胞外ドメインにより置き換えられる、請求項１４記載のキメラＶＬＰ。
17. インフルエンザタンパク質がＶＬＰ内に組込まれる、請求項１０記載のインフルエンザＶＬＰ。
18. ＶＬＰ内に組込まれるインフルエンザタンパク質がＮＰである、請求項１７記載のインフルエンザタンパク質。
19. インフルエンザウイルスにより産生されない部分がＶＬＰ内に組込まれる、請求項１０記載のインフルエンザＶＬＰ。
20. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１０記載のＶＬＰを含んで成る免疫原性組成物。
21. アジュバントをさらに含んで成る、請求項２０記載の免疫原性組成物。
22. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１１記載のＶＬＰを含んで成る免疫原性組成物。
23. アジュバントをさらに含んで成る、請求項２２記載の免疫原性組成物。
24. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１３記載のＶＬＰを含んで成る製薬学的組成物。
25. アジュバントをさらに含んで成る、請求項２４記載の製薬学的組成物。
26. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１４記載のＶＬＰを含んで成る免疫原性組成物。
27. アジュバントをさらに含んで成る、請求項２６記載の免疫原性組成物。
28. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１７記載のＶＬＰを含んで成る免疫原性組成物。
29. アジュバントをさらに含んで成る、請求項２８記載の免疫原性組成物。
30. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１９記載のＶＬＰを含んで成る免疫原性組成物。
31. アジュバントをさらに含んで成る、請求項３０記載の免疫原性組成物。
32. 希釈剤もしくは担体と一緒になって請求項１９記載のＶＬＰを含んで成る製薬学的組成物。
33. アジュバントをさらに含んで成る、請求項３２記載の製薬学的組成物。
34. 脊椎動物に請求項２０記載の免疫原性組成物を投与することを含んで成る、インフルエンザウイルスにより引き起こされる感染に対する免疫化方法。
35. 脊椎動物に請求項２２記載の免疫原性組成物を投与することを含んで成る、インフルエンザウイルスにより引き起こされる感染に対する免疫化方法。
36. 脊椎動物に請求項２６記載の免疫原性組成物を投与することを含んで成る、インフルエンザウイルス以外の病原性微生物により引き起こされる感染に対する免疫化方法。
37. 脊椎動物に請求項３０記載の免疫原性組成物を投与することを含んで成る、インフルエンザウイルス以外の病原性微生物により引き起こされる感染に対する免疫化方法。
38. 脊椎動物に有効量の請求項２４記載の製薬学的組成物を投与することを含んで成る治療方法。
39. 脊椎動物に有効量の請求項３２記載の製薬学的組成物を投与することを含んで成る治療方法。
40. インフルエンザウイルスのＭ１、Ｍ２、ＨＡおよびＮＡタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクト、感染もしくは形質転換された宿主細胞。
41. インフルエンザウイルスのポリメラーゼのサブユニットＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２、ならびにインフルエンザウイルスの核タンパク質ＮＰをコードする第二の組換えＤＮＡ分子でさらにトランスフェクト、感染もしくは形質転換された、請求項４０記載の宿主細胞。
42. 異種ヌクレオチド配列でさらにトランスフェクト、感染もしくは形質転換された、請求項４１記載の宿主細胞。
43. 発現している異種ヌクレオチド配列がインフルエンザウイルスにより産生されない部分である、請求項４２記載の宿主細胞。
44. リボ核タンパク質複合体をアセンブリーかつパッケージングするインフルエンザＶＬＰ。
45. 異種ヌクレオチド配列をさらに発現する、請求項４４記載のインフルエンザＶＬＰ。
46. 発現している異種ヌクレオチド配列がインフルエンザウイルスにより産生されない部分である、請求項４５記載のインフルエンザＶＬＰ。

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