TWI434933B

TWI434933B - 抗多型禽流感病毒之ｄｎａ疫苗及其組合物

Info

Publication number: TWI434933B
Application number: TW101113644A
Authority: TW
Inventors: Suh Chin Wu; Shih Chang Lin
Original assignee: Nat Univ Tsing Hua
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2014-04-21
Also published as: CN103372207B; TW201343913A; CN103372207A

Description

抗多型禽流感病毒之DNA疫苗及其組合物

本發明關於一種DNA疫苗。更特定而言，本發明係關於一種包含過度醣化之抗原的DNA疫苗。本發明亦關於一種DNA疫苗組合物及一種以其在一個體內引發抗多種禽流感病毒亞型之免疫反應的方法。

高病原性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)H5N1病毒及其從鳥類傳染給人類的能力引起世界各國的關注，並擔心可能引發人與人之間的流行。隨著H5N1流感病毒持續傳播，新的病毒株隨之出現，且未來尚會持續改變與進化。世界衛生組織將最近分離出來的H5N1病毒，依據其血球凝集素(hemagglutinin，HA)序列的演化樹分析結果，分類成10個分化支(clades，或稱sublineages)。因為從鳥類宿主持續有新的流感威脅出現，因此發展具有廣效型保護效力的疫苗變得格外重要。至目前為止，廣效型保護效力的H5N1疫苗主要是藉由新穎的佐劑配方達成。

然而，發展具有廣效型保護效力的疫苗時，免疫原(immunogen)的設計卻未將流感病毒抗原改變的固有特性納入考量。已知再聚焦(Refocusing)抗體反應的原理為設計免疫原，保留該免疫原大致的摺疊結構，但選擇性地將高度變異(介由突變躲開保護性免疫反應)、具有免疫抑制性(降低對感染的免疫反應)及會引起交叉反應(引發作用於和免疫原相似之蛋白質的免疫反應)等「不受歡迎」的抗原位置進行突變。以再聚焦抗體反應設計免疫原的方法已落實於HIV-1疫苗，該疫苗利用過度醣化的HIV-1 gp120蛋白質做為免疫原，並在該免疫原中選擇性地合併N鏈接聚醣以遮蔽不受歡迎的抗原決定位。上述聚醣遮蔽策略最近也被利用於設計流感病毒疫苗，這些疫苗可以強化抗各型H3N1病毒的廣效性抗體反應。然而，尚未有人將聚醣遮蔽免疫原設計的概念應用於H5N1疫苗。

DNA疫苗已被認定為劃時代的疫苗學，其具有提供抗原基因設計、製造時間較短、穩定性佳且不需冷鏈供應，以及免疫原性主要為經由內源性抗原處理過程引起T細胞反應等優點。DNA疫苗在大型動物(包括人類)中的免疫原性明顯較低的特性，已利用基因槍或電穿孔等新穎的投遞系統克服。此外，DNA疫苗引發的免疫反應可進一步利用異源性初始/加強接種策略(prime-boost immunization regimen)放大，加強劑為一種包含相同或相似抗原的不同疫苗型式。已被報導的DNA疫苗初始/加強接種策略實例有去活性流感病毒、減毒流感病毒、重組腺病毒、類病毒顆粒(VLPs)及佐劑中的重組次單原蛋白。更進一步而言，初始接種H5 DNA疫苗接著以去活性H5N1疫苗加強的人類疫苗，已證實會增強抗體反應的保護性(HAI)，而且在某些案例中甚至會引發紅血球凝集素主幹特異性(haemagglutinin-stem-specific)的中和抗體。

流感類病毒顆粒(Influenza virus-like particles，VLPs)不具感染性且大小及外型與自然病毒粒子結構相似，但他們不帶病毒複製用的基因組RNAs。流感VLPs的組裝倚賴M1蛋白質及/或其他病毒表面蛋白(例如： HA、NA及M2)與細胞脂質膜的交互作用。M1蛋白質與HA及NA棘狀突起結構之細胞質端的交互作用，可增加流感病毒組裝時M1蛋白質與脂質膜的結合。HA及NA對M1蛋白質的交互作用亦可減少細胞內細長狀不成熟粒子的形成，以及增進球狀成熟VLPs的分泌。此外，M2蛋白質的細胞質端藉由與M1蛋白質交互作用，可進一步促進流感病毒粒子的出芽(budding)與釋放。近來發現M2蛋白質是流感病毒粒子出芽與釋出的細胞膜引導訊號。最近的LC/MS/MS分析顯示，宿主細胞蛋白可被包覆到VLPs中。因此，流感VLPs的生物合成可說是牽涉病毒與細胞成份間複雜交互作用的自我組裝過程。

本文中用語「野生型」代表自然生成的有機體。該術語亦關於從自然過程形成的自然生成群體的自然生成有機體中所發現的核酸及蛋白質，例如從自然突變形成並由基因漂移、自然選擇等等所保留的多型性，且不包括藉由如重組方法所得到的核酸或蛋白質。

「免疫原」或「抗原」在本文中可交互使用，代表一引發抗體(體液性)及/或T細胞源(細胞性)特定免疫反應的分子(例如：包含一種結合至該分子的抗體或一可辨認表現該分子之病毒感染細胞的CD4⁺ 或CD8⁺ T細胞)。該分子可包含一或多個一特定抗體或T細胞結合的位置。如技術領域中所習知，該些位置被稱為抗原決定基(epitopes)或決定因素(determinants)。抗原可為多肽、聚核苷酸、多醣類、脂質等及其組合，例如：醣蛋白或脂蛋白。免疫性化合物或產物，或是抗原性化合物或產物，可引發特定免疫反應，該免疫反應可為體液性免疫反應、細胞性免疫反應或兩者皆是。

本文中「個體」或「主體」或「動物」代表負鏈RNA病毒可感染的脊椎動物，包括但不限於鳥類(例如：水禽與雞)及哺乳類的成員，例如：犬、貓、狼、貂、囓齒類(拉辛(racine)及鼠類等等)、馬、牛、綿羊、山羊、豬以及靈長類，後者包括人類。

本文中的用語「複數個」係用於描述本發明中的元件及成分。本描述除非明確地另有所指，否則應理解為一個以上。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。

本文中的用語「或」係用以描述「及/或」。

因此，本發明提供一種包含過度醣化之突變HA基因的DNA疫苗，該過度醣化之突變HA基因係衍生自禽流感病毒，其中該突變HA基因編碼一種具有一或多個突變胺基酸殘基的蛋白質，該胺基酸殘基係選自由第83、86、94、127、138、161、182、252個胺基酸殘基及其組合所組成之群組。

在一具體實施例中，該過度醣化之突變HA基因編碼一種蛋白質，其包含選自由SEO ID NOs：4、6、8、10、12、14、16、18及20所組成之群組的胺基酸序列。在另一具體實施例中，該突變HA基因編碼一種包含SEQ ID NOs：4、6或10的胺基酸序列之蛋白質。

在一具體實施例中，將該DNA疫苗投遞到一個體，在該個體中引發一種抗複數禽流感病毒亞型之免疫反應。在另一具體實施例中，該投遞係經由例如但不限於皮下注射、肌肉注射、口腔投予、噴灑或基因腔注射的方式所達成。

本發明亦提供一種DNA疫苗組合物，包含(a)一種上述之DNA疫苗；及(b)一種加強劑。

在一具體實施例中，該加強劑係一種流感類病毒顆粒(influenza virus-like particles，VLPs)。在另一具體實施例中，該流感類病毒顆粒係衍生自受包含一或多個含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的質體之重組桿狀病毒感染的細胞，該FliC-M2基因編碼FliC-M2融合蛋白。

在一具體實施例中，該DNA疫苗組合物進一步包含一種佐劑。在另一具體實施例中，該佐劑係一種含鋁佐劑。

在一具體實施例中，該DNA疫苗及該加強劑的質量比介於1：2至17：6之間。在另一具體實施例中，該DNA疫苗及該加強劑的質量比介於5：6至5：2之間。在又一具體實施例中，該DNA疫苗及該加強劑的質量比為5比3。

以下實例提供一些本發明之解釋性具體實施例。

本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。

實施例一 材料與方法 DNA-HA疫苗載體的建構

流感病毒A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1(分化支1)HA基因的cDNA序列(SEQ ID NO：1)係由泰國Siriraj醫院的Prasert Auewarakul教授提供。將HA序列的全長利用Kpn I/Not I切位插入pcDNA^TM 3.1(+)載體(Invitrogen)中。將建構完成的含H5HA質體利用Turbofect試劑(Fermentas)轉染到293A細胞中。轉染後48小時，以5000 rpm轉速離心10分鐘以收集細胞溶解物，並利用西方墨點法以抗H5HA抗體(ab21297；Abcam)分析HA的表現。

HA醣化型態和胰蛋白酶處理

為了描繪HA醣化型態的特徵，在轉染DNA-HA載體48小時之後收集293A細胞。在37℃以Endo H或PNGase F處理細胞溶解物2小時，並利用西方墨點法測定H5HA醣化型態。進行胰蛋白酶處理時，將細胞溶解物與胰蛋白酶一起在冰上培養30分鐘，以西方墨點法觀察HA0被切割成為HA1及HA2的情形。

VLPs的製備

VLPs的製備如先前文獻所述(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011)：7163-7172)。簡而言之，將HA(SEQ ID NO：1)及M1(SEQ ID NO：21)選殖到一pFastBac^TM Dual載體(Invitrogen)中，而將NA(SEQ ID NO：27)及表現FliC-M2融合蛋白的FliC-M2(SEQ ID NO： 25)選殖到另一載體中以製作重組桿狀病毒。在感染後的72小時收集共感染重組桿狀病毒的Sf9細胞，並以500 kDa濾膜將含FliC-VLPs的上清液過濾濃縮。將濃縮液加至0-60%蔗糖梯度上並以33,000 rpm轉速離心4小時。藉由西方墨點法利用抗H5HA抗體(ab21297；Abcam)、抗NA抗體(ab70759；Abcam)、抗M1抗體(ab25918；Abcam)及抗M2抗體(NB100-2073；Novus)觀察想要的微粒。如先前文獻(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011)：7163-7172)所述，亦使用穿透式電子顯微鏡(TEM)確認該微粒。

過度醣化之H5HA的製備

使用編碼野生型H5HA基因(SEQ ID NO：1)的質體作為模版，並利用定點突變(site-directed mutagenesis)在HA基因中導入突變位。50微升PCR反應溶液中含有100奈克模版、2毫莫耳引子對、200毫莫耳dNTPs 及2U的DNA聚合酶。純化PCR產物並進一步以Dpn I在37℃處理2小時。將Dpn I處理後的產物轉形到TOP10勝任細胞中，然後分離該突變質體。

血球吸附試驗(Hemadsorption assay)

以野生型或突變的H5HA DNA載體轉染293A細胞，並在轉染後72小時收集細胞。以磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌之後，加入足夠的0.5%火雞紅血球(RBCs)覆蓋單層細胞並培養30分鐘。以PBS潤洗兩次後觀察吸附於經轉染細胞上的RBCs。

小鼠免疫注射

利用異源初始-加強免疫法(heterologous prime-boost strategy)，以混合於PBS中的50微克DNA、30微克純化VLPs及鋁佐劑接種6至8週齡的母BALB/c品系小鼠。免疫注射係在第0及第3週藉由肌肉注射進行。在免疫注射後第14天收集血液，並分離血清。將血清樣本在56℃去活性30分鐘並儲存在-20℃。所有實驗皆依照國立清華大學實驗動物中心的指導原則進行。動物實驗流程經國立清華大學實驗動物中心審核通過(核准號為09733)。

酵素結合免疫吸附分析法(ELISA assay)

以如先前文獻所述的方式執行ELISA分析法(Lin SC et al.,PLoS One 6(2011)：e20052)。簡言之，將2微克/毫升的純化蛋白質塗覆到96孔槽培養盤上，然後以BSA進行阻斷。將系列稀釋度的各血清樣本在培養盤中培養1小時，並以3次洗滌移除。將與HRP共軛連結的山羊抗小鼠IgG(Bethyl Laboratories,Inc.)在培養盤中培養1小時，接著洗滌3次。在與TMB受質的反應停止後，測量培養盤在450奈米的吸光值。終端效價(End-point titer)為最終稀釋度的倒數，最終稀釋度的吸光值為陰性控制組的兩倍。

血球凝集抑制試驗(Hemagglutinin inhibition assays，HI assays)及中和試驗(Neutralization assays，NT assays)

以如先前文獻所述的方式執行HI及NT試驗(Huang MH et al.,PLoS One 5(2010)：e12279)。HI試驗中將血清樣本(以1：10為初始稀釋度開始兩倍稀釋)與四倍HA單元的流感病毒株一起培養。然後加入火雞紅血球並對血球凝集反應的抑制程度進行評分。血清滴定濃度為最高稀釋度的倒數，該最高稀釋度可完全抑制HA。NT試驗中，在各培養孔槽中加入200 TCID₅₀ 的病毒與兩倍連續稀釋的小鼠血清一起培養，起始稀釋度為1：40。將混合的病毒及血清轉移到單層MDCK細胞並培養4天。中和效價為最高血清稀釋度的倒數，在最高血清稀釋度時，有一半培養孔槽中的H5N1病毒感染力被中和。感染力係藉由第4天細胞病(cytopathy)的存在而判斷，而利用Reed-Muench方法計算效價。

統計分析

所有結果皆利用雙尾Student’st 試驗進行分析，P 值小於0.05即代表具有統計上的顯著性。

結果 DNA-HA疫苗載體以及用於初始-加強免疫法的FliC-VLPs的建構與特性分析

編碼A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1(分化支1)HA基因之全長cDNA(SEQ ID NO：1)的DNA疫苗載體係建構自pcDNA^TM 3.1(+)載體。以西方墨點法分析DNA-HA載體轉染的293A細胞，證實全長HA蛋白質的表現且其分子量約為75 kDa(圖一A)。293A細胞中所表現的HA對PNGase F處理敏感但對Endo H切割有抵抗性，暗示其為含有複雜N鏈接聚醣型態的醣蛋白(圖一A)。經DNA-HA轉染之293A細胞中所表現的HA亦對胰蛋白酶處理敏感，可從HA0被切割為HA1及HA2次單元，HA1顯示之分子量約為46kDa(圖一A)。

含有FliC的VLPs(FliC-VLPs)係得自經兩種重組桿狀病毒感染的Sf9細胞，該兩種重組桿狀病毒編碼四種流感病毒基因：HA、NA及M1，以及M2與沙門氏桿菌fliC基因的融合(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011)：7163-7172)。FliC-VLPs係取自經桿狀病毒感染之Sf9細胞的培養上清液，並利用超高速離心及蔗糖梯度沉積法純化。結果顯示蔗糖密度梯度的第6至第10個部分含有所有四種病毒蛋白或融合蛋白質(圖一B)。電子顯微鏡觀察顯示FliC-VLPs的球狀外型且粒子大小約為100奈米(圖一C)。

為了研究以初始-加強免疫法合併使用DNA-HA疫苗載體及FliC-VLP，以三個禮拜為間距分為兩劑利用肌肉注射初始-加強免疫BALB/c小鼠：(i)PBS+PBS；(i)FliC-VLP+FliC-VLP(iii)DNA-HA+DNA-HA(iv)DNA-HA+FliC-VLP。第二劑注射後兩個禮拜，收集免疫小鼠的血清。結果顯示，以DNA-HA疫苗載體進行初始，接著以FliC-VLP加強所得的HA專一性總體IgG效價，顯著高於利用DNA-HA載體及FliC-VLPs進行兩劑免疫注射所得的HA專一性總體IgG效價(圖二)。藉由測量抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的HI及NT效價揭露中和活性，結果顯示DNA-HA載體初始及FliC-VLP加強注射在小鼠體內引發最高強度的中和性抗體(圖三A-B)。

以從人類分離之H5N1的胺基酸序列為基準設計過度醣化之HA

為了設計過度醣化之HADNA疫苗，首先以163株從人類分離的高病原性禽流感病毒H5N1進行序列比對分析(序列檢索自NCBI資料庫)。將該些HA1蛋白質序列中的胺基酸差異以下列分數為基準進行分析：4(不同胺基酸)、2(弱相似胺基酸)、1(強相似胺基酸)、0(相同胺基酸)，如Vector NTI相似表所描繪。依據圖四所顯示的比對圖，HA1蛋白質中有十一個胺基酸被認為具有相對較高的分數，包括：第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252個殘基。為了設計抗體再聚焦免疫原(antibody-refocused immunogens)，以能夠增加N-X-S/T結構(N鏈接醣基化位置)的突變在這五個區域內分別進行定點突變，但避開受體結合位置(Yang ZY et al.,Science 317(2007)：825-828；and Yang H et al.,PLoS Pathog 6(2010)：e1001081)。因而將九個N-X-S/T結構導入HA1中，包括83NNT(SEQ ID NO：4)、86NNT(SEQ ID NO：6)、94NFT(SEQ ID NO：8)、127NSS(SEQ ID NO：10)、138NRT(SEQ ID NO：12)、140NSS(SEQ ID NO：14)、161NRS(SEQ ID NO：16)、182NDT(SEQ ID NO：18)及252 NAT(SEQ ID NO：20)(圖五)。將各種含有指定N連接醣基化位置的再聚焦性(refocusing)過度醣基化之HA基因選殖到DNA-HA疫苗載體中。然而，在轉染到293A細胞中以後，九種免疫聚焦性HA中只有六種保留了火雞紅血球細胞的血球凝集作用特性(圖六)。同時也研究這六種HA突變基因(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS)以探討HA抗原中N鏈接聚醣的導入，其可由分子量的上升並在PNGase F處理後回復到原分子量而描繪出來(圖七)。

以過度醣化之HA DNA疫苗進行初始注射接著以FliC-VLP進行加強

為了研究這六種過度醣化之HA突變體所引發的抗體反應(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS)，以三個禮拜為間隔將小鼠以各種DNA-HA載體接種兩次，接著以FliC-VLPs給予第三次的加強注射。結果顯示，當與野生型控制組做比較時，所有以過度醣化之HA DNA疫苗進行接種的組別，其HA專一性總體IgG效價皆無顯著差別(圖八)。83NNT及86NNT HA變異體引發較高的HI效價(圖九A)，但是只有83NNT HA變異體對屬於相同H5N1分化支1的NIBRG-14病毒具有較高的NT效價(圖九9B)。同時也測量該些血清抗Mongolia/2/2006 H5N1病毒(分化支2.2)的HI及NT效價。以跨分化支功能性抗體(cross-clade functional antibodies)呈現的實驗數據顯示，83NNT、86NNT、127NSS HA突變體引發較高的HI效價(圖10A)而83NNT、86NNT、127NSS、161NRS HA突變體具有較高的NT效價(圖10B)。綜合上述，83NNT突變體可引發較有效的抗NIBRG-14(分化支1)及抗Mongolia/2/2006(分化支2.2)高病原性H5N1病毒的HI及NT效價。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之DNA疫苗及其製造程序與使用方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。

在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

圖一顯示DNA-HA及FliC-VLP的表現與定性。(A)將轉染DNA-HA或空載體的293A細胞溶解物以Endo H、PNGase F及胰蛋白酶處理，並藉由西方墨點法分析。全長HA蛋白質的分子量大約為75 kDa，HA1蛋白質的分子量則約為46 kDa。(B)藉由蔗糖梯度沉積法純化FliC-VLPs，結果顯示蔗糖梯度沉積法的第6至10部份(fractions)包含所有4種蛋白質。(C)電子顯微鏡顯像呈現FliC-VLPs的圓球狀型態，其粒子大小約為100奈米。

圖二顯示DNA-HA及FliC-VLP所誘發的總體抗HA IgG抗體效價。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。

圖三以抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算，未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。

圖四顯示163個禽流感病毒株的HA變異胺基酸分析結果。HA1次單元中的11個胺基酸，包括第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252個殘基具有相對較高的評分。

圖五顯示9個N鏈接醣基化位置：83NNT(SEQ ID NO：4)、86NNT(SEQ ID NO：6)、94NFT(SEQ ID NO：8)、127NSS(SEQ ID NO：10)、138NRT(SEQ ID NO：12)、140NSS(SEQ ID NO：14)、161NRS(SEQ ID NO：16)、182NDT(SEQ D NO：18)及252NAT(SEQ ID NO：20)。箭頭自野生型序列畫底線的3個胺基酸，指向造成N鏈接醣基化序列的胺基酸變化。

圖六顯示血球吸附試驗(hemadsorption assay)的結果。(A)陽性控制組；(B)陰性控制組；(C)83NNT；(D)86NNT；(E)94NFT；(F)127NSS；(G)138NRT；(H)161NRS；(I)182NDT；及(J)252NAT。

圖七顯示過度醣化之HA蛋白質的定性結果。由分子量的增加及於PNGase F處理後降低至原分子量，說明了6種突變蛋白質(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT、161NRS)附加有N鏈接聚醣。

圖八顯示過度醣化之HA所誘發的抗HA IgG總體效價。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。

圖九以抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算，未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。

圖十以抗Mongolia/2/2006(分化支2.2)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算，未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。

<110> 國立清華大學

<120> 抗多型禽流感病毒之DNA疫苗及其組合物

<130> 1589-NTHU-TW

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<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1695)

<400> 15

<210> 16

<211> 564

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 16

<210> 17

<211> 1695

<212> DNA

<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1695)

<400> 17

<210> 18

<211> 564

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 18

<210> 19

<211> 1695

<212> DNA

<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1695)

<400> 19

<210> 20

<211> 564

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 20

<210> 21

<211> 759

<212> DNA

<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(759)

<400> 21

<210> 22

<211> 252

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 22

<210> 23

<211> 294

<212> DNA

<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(294)

<400> 23

<210> 24

<211> 97

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 24

Glu

<210> 25

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FliC(沙門氏桿菌)及M2(流感病毒)融合蛋白的cDNA

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1860)

<400> 25

<210> 26

<211> 619

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構築體

<400> 26

<210> 27

<211> 1350

<212> DNA

<213> 流感病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1350)

<400> 27

<210> 28

<211> 449

<212> PRT

<213> 流感病毒

<400> 28

Claims

一種DNA疫苗，包含過度醣化之突變HA基因，其係衍生自禽流感病毒，其中該過度醣化之突變HA基因編碼一種蛋白質，其包含SEQ ID NOs：4、6或10之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項之DNA疫苗，其在一個體中引發一種抗複數禽流感病毒亞型之免疫反應。
一種DNA疫苗組合物，包含：a.一種如申請專利範圍第1項之DNA疫苗；及b.一種加強劑。
如申請專利範圍第3項之DNA疫苗組合物，其中該加強劑係一種流感類病毒顆粒(VLP)。
如申請專利範圍第4項之DNA疫苗組合物，其中該流感類病毒顆粒係衍生自被包含一或多個含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的質體之重組桿狀病毒感染的細胞，該FliC-M2基因編碼FliC-M2融合蛋白。
如申請專利範圍第3項之DNA疫苗組合物，其進一步包含一種佐劑。
如申請專利範圍第6項之DNA疫苗組合物，其中該佐劑係含鋁佐劑。
如申請專利範圍第3項之DNA疫苗組合物，其中該DNA疫苗及加強劑的質量比為5比3。
如申請專利範圍第3項之DNA疫苗組合物，其在一個體中引發一種抗複數禽流感病毒亞型之免疫反應。