CN103372207A - 抗多型禽流感病毒的dna疫苗及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含高糖基化突变HA基因的DNA疫苗，该高糖基化突变HA基因系衍生自禽流感病毒。本发明亦涉及一种DNA疫苗组合物，其包含：（a）该DNA疫苗；及（b）一种加强剂。本发明更进一步涉及一种在个体中引发抗多型禽流感病毒的免疫反应的方法，其包含将该DNA疫苗或该DNA疫苗组合物施用至该个体的组织中。本发明利用突变技术产生具有免疫聚焦性的HA基因，接种本发明所提供的DNA疫苗或DNA疫苗组合物可于个体中引发抗多型禽流感病毒的免疫反应，预防多种亚型的禽流感病毒的感染。
Description
技术领域
本发明关于一种DNA疫苗。更特定而言，本发明是关于一种包含高糖基化抗原的DNA疫苗。本发明亦关于一种DNA疫苗组合物及一种以其在个体内引发抗多种禽流感病毒亚型的免疫反应的方法。
背景技术
高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）H5N1病毒及其从鸟类传染给人类的能力引起世界各国的关注，并担心可能引发人与人之间的流行。随着H5N1流感病毒持续传播，新的病毒株随之出现，且未来尚会持续改变与进化。世界卫生组织将最近分离出来的H5N1病毒，依据其血凝素（hemagglutinin，HA）序列的演化树分析结果，分类成10个分化支（clade，或称sublineage）。因为从鸟类宿主持续有新的流感威胁出现，因此开发具有广效型保护效力的疫苗变得格外重要。至目前为止，广效型保护效力的H5N1疫苗主要是藉由新颖的佐剂配方达成。
然而，开发具有广效型保护效力的疫苗时，免疫原（immunogen）的设计却未将流感病毒抗原改变的固有特性纳入考虑。已知再聚焦（Refocusing）抗体反应的原理为设计免疫原，保留该免疫原大致的折叠结构，但选择性地将高度变异（通过突变躲开保护性免疫反应）、具有免疫抑制性（降低对感染的免疫反应）及会引起交叉反应（引发作用于和免疫原相似的蛋白质的免疫反应）等“不受欢迎”的抗原位置进行突变。以再聚焦抗体反应设计免疫原的方法已落实于HIV-1疫苗，该疫苗利用高糖基化HIV-1gp120蛋白质做为免疫原，并在该免疫原中选择性地合并N连接聚糖以遮蔽不受欢迎的表位。上述聚糖遮蔽策略最近也被利用于设计流感病毒疫苗，这些疫苗可以强化抗各型H3N1病毒的广效性抗体反应。然而，尚未有人将聚糖遮蔽免疫原设计的概念应用于H5N1疫苗。
DNA疫苗已被认定为划时代的疫苗学，其具有提供抗原基因设计、制造时间较短、稳定性佳且不需冷链供应，以及免疫原性主要为经由内源性抗原处理过程引起T细胞反应等优点。DNA疫苗在大型动物（包括人类）中的免疫原性明显较低的特性，已利用基因枪或电穿孔等新颖的送递系统克服。此外，DNA疫苗引发的免疫反应可进一步利用异源性初始/加强接种策略（prime-boostimmunization regimen）放大，加强剂为一种包含相同或相似抗原的不同疫苗型式。已被报导的DNA疫苗初始/加强接种策略实例有灭活流感病毒、减毒流感病毒、重组腺病毒、病毒样颗粒（VLP）及佐剂中的重组次单原蛋白。更进一步而言，初始接种H5DNA疫苗接着以灭活H5N1疫苗加强的人类疫苗，已证实会增强抗体反应的保护性（HAI），而且在某些案例中甚至会引发血凝素主干特异性（haemagglutinin-stem-specific）的中和抗体。
流感病毒样颗粒（Influenza virus-like particle，VLP）不具感染性且大小及外型与自然病毒粒子结构相似，但他们不带病毒复制用的基因组RNA。流感VLP的组装倚赖M1蛋白质及/或其他病毒表面蛋白（例如：HA、NA及M2）与细胞脂质膜的相互作用。M1蛋白质与HA及NA棘状突起结构的细胞质端的相互作用，可增加流感病毒组装时M1蛋白质与脂质膜的结合。HA及NA对M1蛋白质的相互作用亦可减少细胞内细长状不成熟粒子的形成，以及增进球状成熟VLP的分泌。此外，M2蛋白质的细胞质端藉由与M1蛋白质相互作用，可进一步促进流感病毒粒子的出芽（budding）与释放。近来发现M2蛋白质是流感病毒粒子出芽与释出的细胞膜引导信号。最近的LC/MS/MS分析显示，宿主细胞蛋白可被包覆到VLP中。因此，流感VLP的生物合成可说是牵涉病毒与细胞成份间复杂相互作用的自我组装过程。
发明内容
本文中用语“野生型”代表自然生成的生物体。该术语亦关于从自然过程形成的自然生成群体的自然生成生物体中所发现的核酸及蛋白质，例如从自然突变形成并由基因漂移、自然选择等等所保留的多态性，且不包括藉由如重组方法所得到的核酸或蛋白质。
“免疫原”或“抗原”在本文中可交互使用，代表一引发抗体（体液性）及/或T细胞源（细胞性）特定免疫反应的分子（例如：包含一种结合该分子的抗体或可辨认表达该分子的病毒感染细胞的CD4+或CD8+T细胞）。该分子可包含一或多个一特定抗体或T细胞结合的位置。如技术领域中所习知，该些位置被称为抗原表位（epitope）或决定簇（determinant）。抗原可为多肽、多核苷酸、多糖类、脂质等及其组合，例如：糖蛋白或脂蛋白。免疫性化合物或产物，或是抗原性化合物或产物，可引发特定免疫反应，该免疫反应可为体液性免疫反应、细胞性免疫反应或两者皆是。
本文中“个体”或“主体”或“动物”代表负链RNA病毒可感染的脊椎动物，包括但不限于鸟类（例如：水禽与鸡）及哺乳类的成员，例如：犬、猫、狼、貂、啮齿类（拉辛（racine）及鼠类等等）、马、牛、绵羊、山羊、猪以及灵长类，后者包括人类。
本文中的用语“多种”用于描述本发明中的组件及成分。本描述除非明确地另有所指，否则应理解为一个以上。
本文中的用语“一”或“一种”用以叙述本发明的组件及成分。此术语仅为了叙述方便及给予本发明的基本观念。此叙述应被理解为包括一种或至少一种，且除非明显地另有所指，表示单数时亦包括复数。
本文中的用语“或”用以描述“和/或”。
因此，本发明提供一种包含高糖基化突变HA基因的DNA疫苗，该高糖基化突变HA基因衍生自禽流感病毒，其中该突变HA基因编码一种具有一或多个突变氨基酸残基的蛋白质，该氨基酸残基选自由第83、86、94、127、138、161、182、252位氨基酸残基及其组合所组成的群组。
在一具体实施方案中，该高糖基化突变HA基因编码一种蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18及20所组成的群组的氨基酸序列。在另一具体实施例中，该突变HA基因编码一种包含SEQ ID NO:4、6或10的氨基酸序列的蛋白质。
在一具体实施方案中，将该DNA疫苗送递到个体，在该个体中引发一种抗复数禽流感病毒亚型的免疫反应。在另一具体实施方案中，该送递系经由例如但不限于皮下注射、肌肉注射、口腔施用、喷洒或基因枪注射的方式所达成。
本发明亦提供一种DNA疫苗组合物，包含（a）一种上述的DNA疫苗；及（b）一种加强剂。
在一具体实施方案中，该加强剂是一种流感病毒样颗粒（influenza virus-likeparticle，VLP）。在另一具体实施方案中，该流感病毒样颗粒衍生自受包含一或多个含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的质粒的重组杆状病毒(baculovirus)感染的细胞，该FliC-M2基因编码FliC-M2融合蛋白。
在一具体实施方案中，该DNA疫苗组合物进一步包含一种佐剂。在另一具体实施方案中，该佐剂是一种含铝佐剂。
在一具体实施方案中，该DNA疫苗及该加强剂的质量比介于1∶2至17∶6之间。在另一具体实施方案中，该DNA疫苗及该加强剂的质量比介于5∶6至5∶2之间。在又一具体实施方案中，该DNA疫苗及该加强剂的质量比为5比3。
在一具体实施方案中，将该DNA疫苗送递到个体，在该个体中引发一种抗多种禽流感病毒亚型的免疫反应。在另一具体实施方案中，该送递是经由例如但不限于皮下注射、肌肉注射、口腔施用、喷洒或基因枪注射的方式所达成。
以下实例提供一些本发明的解释性具体实施例。
附图说明
图1显示DNA-HA及FliC-VLP的表达与定性。（A）将转染DNA-HA或空载体的293A细胞溶解物以EndoH、PNGase F及胰蛋白酶处理，并藉由蛋白印迹法分析。全长HA蛋白质的分子量大约为75kDa，HA1蛋白质的分子量则约为46kDa。（B）藉由蔗糖梯度沉积法纯化FliC-VLP，结果显示蔗糖梯度沉积法的第6至10级分（fraction）包含所有4种蛋白质。（C）电子显微镜显像呈现FliC-VLP的圆球状型态，其粒子大小约为100纳米。
图2显示DNA-HA及FliC-VLP所诱发的总体抗HA IgG抗体效价。星号表示具有统计上的显著差异性（p<0.05）。
图3以抗NIBRG-14（分化支1）H5N1流感病毒的（A）HI及（B）NT效价呈现经接种小鼠血清的中和活性。为了方便计算，未能测出的效价量皆定为1。分别计算各样本的效价（点）及各组平均值（线）。
图4显示163个禽流感病毒株的HA变异氨基酸分析结果。HA1亚基中的11个氨基酸，包括第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252位残基具有相对较高的评分。
图5显示9个N连接糖基化位置：83NNT（SEQ ID NO:4）、86NNT（SEQ IDNO:6）、94NFT（SEQ ID NO:8）、127NSS（SEQ ID NO:10）、138NRT（SEQ IDNO:12）、140NSS（SEQ ID NO:14）、161NRS（SEQ ID NO:16）、182NDT（SEQID NO:18）及252NAT（SEQ ID NO:20）。箭头自野生型序列画底线的3个氨基酸，指向造成N连接糖基化序列的氨基酸变化。
图6显示血球吸附试验（hemadsorption assay）的结果。（A）阳性对照组；（B）阴性对照组；（C）83NNT；（D）86NNT；（E）94NFT；（F）127NSS；（G）138NRT；（H）161NRS；（I）182NDT；及（J）252NAT。
图7显示高糖基化HA蛋白质的定性结果。由分子量的增加及于PNGase F处理后降低至原分子量，说明了6种突变蛋白质（83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT、161NRS）附加有N连接聚糖。
图8显示高糖基化HA所诱发的抗HAIgG总体效价。分别计算各样本的效价（点）及各组平均值（线）。
图9以抗NIBRG-14（分化支1）H5N1流感病毒的（A）HI及（B）NT效价呈现经接种小鼠血清的中和活性。为了方便计算，未能测出的效价量皆定为1。分别计算各样本的效价（点）及各组平均值（线）。星号表示具有统计上的显著差异性（p<0.05）。
图10以抗Mongolia/2/2006（分化支2.2）H5N1流感病毒的（A）HI及（B）NT效价呈现经接种小鼠血清的中和活性。为了方便计算，未能测出的效价量皆定为1。分别计算各样本的效价（点）及各组平均值（线）。星号表示具有统计上的显著差异性（p<0.05）。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例一
材料与方法
DNA-HA疫苗载体的构建
流感病毒A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1（分化支1）HA基因的cDNA序列（SEQ ID NO:1）由泰国Siriraj医院的Prasert Auewarakul教授提供。将HA序列的全长利用KpnI/NotI切割位点插入pcDNATM3.1(+)载体（Invitrogen）中。将构建完成的含H5HA质粒利用Turbofect试剂（Fermentas）转染到293A细胞中。转染后48小时，以5000rpm转速离心10分钟以收集细胞溶解物，并利用蛋白印迹法以抗H5HA抗体（ab21297；Abcam）分析HA的表达。
HA糖基化模式和胰蛋白酶处理
为了描绘HA糖基化模式的特征，在转染DNA-HA载体48小时之后收集293A细胞。在37°C以EndoH或PNGase F处理细胞溶解物2小时，并利用蛋白印迹法测定H5HA糖基化模式。进行胰蛋白酶处理时，将细胞溶解物与胰蛋白酶一起在冰上培养30分钟，以蛋白印迹法观察HA0被切割成为HA1及HA2的情形。
VLP的制备
VLP的制备如先前文献所述（Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172）。简而言之，将HA（SEQ ID NO:1）及M1（SEQ ID NO:21）克隆到一pFastBacTMDual载体（Invitrogen）中，而将NA（SEQ ID NO:27）及表达FliC-M2融合蛋白的FliC-M2（SEQ ID NO:25）克隆到另一载体中以制作重组杆状病毒。在感染后的72小时收集共感染重组杆状病毒的Sf9细胞，并以500kDa滤膜将含FliC-VLPs的上清液过滤浓缩。将浓缩液加至0-60%蔗糖梯度上并以33,000rpm转速离心4小时。藉由蛋白印迹法利用抗H5HA抗体（ab21297；Abcam）、抗NA抗体（ab70759；Abcam）、抗M1抗体（ab25918；Abcam）及抗M2抗体（NB 100-2073；Novus）观察想要的微粒。如先前文献（Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172）所述，亦使用透射电子显微镜（TEM）确认该微粒。
高糖基化H5HA的制备
使用编码野生型H5HA基因（SEQ ID NO:1）的质粒作为模版，并利用定点突变（site-directed mutagenesis）在HA基因中导入突变位。50微升PCR反应溶液中含有100纳克模版、2毫摩尔引物对、200毫摩尔dNTPs及2U的DNA聚合酶。纯化PCR产物并进一步以DpnI在37°C处理2小时。将DpnI处理后的产物转化到TOP10感受态细胞中，然后分离该突变质粒。
血球吸附试验（Hemadsorption assay）
以野生型或突变的H5HA DNA载体转染293A细胞，并在转染后72小时收集细胞。以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤之后，加入足够的0.5%火鸡红细胞（RBC）覆盖单层细胞并培养30分钟。以PBS润洗两次后观察吸附于经转染细胞上的RBC。
小鼠免疫注射
利用异源初始-加强免疫法（heterologous prime-boost strategy），以混合于PBS中的50微克DNA、30微克纯化VLP及铝佐剂接种6至8周龄的母BALB/c品系小鼠。免疫注射是在第0及第3周藉由肌肉注射进行。在免疫注射后第14天收集血液，并分离血清。将血清样本在56°C灭活30分钟并储存在–20°C。所有实验皆依照国立清华大学实验动物中心的指导原则进行。动物实验流程经国立清华大学实验动物中心审核通过（核准号为09733）。
酶联免疫吸附分析法（ELISA assay）
以如先前文献所述的方式执行ELISA分析法（Lin SC et al.,PLoS One 6(2011):e20052）。简言之，将2微克/毫升的纯化蛋白质涂覆到96孔培养皿上，然后以BSA进行封闭。将系列稀释度的各血清样本在培养皿中培养1小时，并以3次洗涤移除。将与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG（Bethyl Laboratories,Inc.）在培养皿中培养1小时，接着洗涤3次。在与TMB底物的反应停止后，测量培养皿在450纳米的吸光值。终点效价（End-point titer）为最终稀释度的倒数，最终稀释度的吸光值为阴性对照组的两倍。
血凝抑制试验（Hemagglutinin inhibition assay，HI assay）及中和试验（Neutralization assay，NT assay）
以如先前文献所述的方式执行HI及NT试验（Huang MH et al.,PLoS One 5(2010):e12279）。HI试验中将血清样本（以1:10为初始稀释度开始两倍稀释）与四倍HA单元的流感病毒株一起培养。然后加入火鸡红细胞并对血球凝集反应的抑制程度进行评分。血清滴定浓度为最高稀释度的倒数，该最高稀释度可完全抑制HA。NT试验中，在各培养孔中加入200TCID50的病毒与两倍连续稀释的小鼠血清一起培养，起始稀释度为1∶40。将混合的病毒及血清转移到单层MDCK细胞并培养4天。中和效价为最高血清稀释度的倒数，在最高血清稀释度时，有一半培养孔中的H5N1病毒感染力被中和。感染力藉由第4天细胞病（cytopathy）的存在而判断，而利用Reed-Muench方法计算效价。
统计分析
所有结果皆利用双尾Student’st检验进行分析，P值小于0.05即代表具有统计上的显著性。
结果
DNA-HA疫苗载体以及用于初始-加强免疫法的FliC-VLP的构建与特性分析
编码A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1（分化支1）HA基因的全长cDNA（SEQ ID NO:1）的DNA疫苗载体构建自pcDNATM3.1(+)载体。以蛋白印迹法分析DNA-HA载体转染的293A细胞，证实全长HA蛋白质的表达且其分子量约为75kDa（图1A）。293A细胞中所表达的HA对PNGase F处理敏感但对EndoH切割有抗性，暗示其为含有复杂N连接聚糖谱的糖蛋白（图1A）。经DNA-HA转染的293A细胞中所表达的HA亦对胰蛋白酶处理敏感，可从HA0被切割为HA1及HA2亚基，HA1显示的分子量约为46kDa（图1A）。
含有FliC的VLP（FliC-VLP）得自经两种重组杆状病毒感染的Sf9细胞，该两种重组杆状病毒编码四种流感病毒基因：HA、NA及M1，以及M2与沙门氏杆菌fliC基因的融合物（Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172）。FliC-VLP系取自经杆状病毒感染的Sf9细胞的培养上清液，并利用超高速离心及蔗糖梯度沉积法纯化。结果显示蔗糖密度梯度的第6至第10个级分含有所有四种病毒蛋白或融合蛋白（图1B）。电子显微镜观察显示FliC-VLP的球状外型且粒子大小约为100纳米（图1C）。
为了研究以初始-加强免疫法合并使用DNA-HA疫苗载体及FliC-VLP，以三个星期为间距分为两剂利用肌肉注射初始-加强免疫BALB/c小鼠：（i）PBS+PBS；（ii）FliC-VLP+FliC-VLP（iii）DNA-HA+DNA-HA（iv）DNA-HA+FliC-VLP。第二剂注射后两个星期，收集免疫小鼠的血清。结果显示，以DNA-HA疫苗载体进行初始，接着以FliC-VLP加强所得的HA特异性总体IgG效价，显著高于利用DNA-HA载体及FliC-VLPs进行两剂免疫注射所得的HA特异性总体IgG效价（图2）。藉由测量抗NIBRG-14（分化支1）H5N1流感病毒的HI及NT效价揭示中和活性，结果显示DNA-HA载体初始及FliC-VLP加强注射在小鼠体内引发最高强度的中和性抗体（图3A-B）。
以从人类分离的H5N1的氨基酸序列为基准设计高糖基化HA
为了设计高糖基化HA DNA疫苗，首先以163株从人类分离的高致病性禽流感病毒H5N1进行序列比对分析（序列检索自NCBI数据库）。将这些HA1蛋白质序列中的氨基酸差异以下列分数为基准进行分析：4（不同氨基酸）、2（弱相似氨基酸）、1（强相似氨基酸）、0（相同氨基酸），如Vector NTI相似表所描绘。依据图4所显示的比对图，HA1蛋白质中有十一个氨基酸残基被认为具有相对较高的分数，包括：第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252位残基。为了设计抗体再聚焦免疫原（antibody-refocused immunogen），以能够增加N-X-S/T结构（N连接糖基化位置）的突变在这五个区域内分别进行定点突变，但避开受体结合位置（Yang ZY et al.,Science 317(2007):825-828;and Yang Het al.,PLoS Pathog 6(2010):e1001081）。因而将九个N-X-S/T结构导入HA1中，包括83NNT（SEQ ID NO:4）、86NNT（SEQ ID NO:6）、94NFT（SEQ ID NO:8）、127NSS（SEQ ID NO:10）、138NRT（SEQ ID NO:12）、140NSS（SEQ ID NO:14）、161NRS（SEQ ID NO:16）、182NDT（SEQ ID NO:18及252NAT（SEQ ID NO:20）（图5）。将各种含有指定N连接糖基化位置的再聚焦性（refocusing）高糖基化HA基因克隆到DNA-HA疫苗载体中。然而，在转染到293A细胞中以后，九种免疫聚焦性HA中只有六种保留了火鸡红细胞的血球凝集作用特性（图6）。同时也研究这六种HA突变基因（83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS）以探讨HA抗原中N连接聚糖的导入，其可由分子量的上升并在PNGaseF处理后回复到原分子量而描绘出来（图7）。
以高糖基化HA DNA疫苗进行初始注射接着以FliC-VLP进行加强
为了研究这六种高糖基化HA突变体所引发的抗体反应（83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS），以三个星期为间隔将小鼠以各种DNA-HA载体接种两次，接着以FliC-VLP给予第三次的加强注射。结果显示，当与野生型对照组做比较时，所有以高糖基化HA DNA疫苗进行接种的组别，其HA特异性总体IgG效价皆无显著差别（图8）。83NNT及86NNT HA变体引发较高的HI效价（图9A），但是只有83NNT HA变体对属于相同H5N1分化支1的NIBRG-14病毒具有较高的NT效价（图9B）。同时也测量这些血清抗Mongolia/2/2006H5N1病毒（分化支2.2）的HI及NT效价。以跨分化支功能性抗体（cross-clade functional antibodies）呈现的实验数据显示，83NNT、86NNT、127NSS HA突变体引发较高的HI效价（图10A）而83NNT、86NNT、127NSS、161NRS HA突变体具有较高的NT效价（图10B）。综合上述，83NNT突变体可引发较有效的抗NIBRG-14（分化支1）及抗Mongolia/2/2006（分化支2.2）高致病性H5N1病毒的HI及NT效价。
本领域技术人员能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的DNA疫苗及其制造程序与使用方法乃优选实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。本领域技术人员将会想到其中可修改之处及其他用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求中界定。
本发明的内容叙述与实施例均详细公开，得使任何本领域技术人员能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。
说明书中提及的所有专利及出版品，都以和发明有关领域的一般技艺为准。所有专利和出版品都在此以相同程度援引加入，就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出援引加入。
在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所公开的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据优选实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是本领域技术人员仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的范围内。
Claims (11)
1.一种DNA疫苗，包含高糖基化突变HA基因，其衍生自禽流感病毒，
其中所述高糖基化突变HA基因编码一种具有一或多个突变氨基酸残基的蛋白质，所述氨基酸残基选自由第83、86、94、127、138、161、182、252位氨基酸及其组合所组成的群组。
2.权利要求1的DNA疫苗，其中所述高糖基化突变HA基因编码一种蛋白质，其包含选自由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18及20所组成的群组的氨基酸序列。
3.权利要求1的DNA疫苗，其中所述高糖基化突变HA基因编码一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:4、6或10的氨基酸序列。
4.权利要求1的DNA疫苗，其在个体中引发一种抗多种禽流感病毒亚型的免疫反应。
5.一种DNA疫苗组合物，包含：
a.一种权利要求1的DNA疫苗；及
b.一种加强剂。
6.权利要求5的DNA疫苗组合物，其中所述加强剂是一种流感病毒样颗粒（VLP）。
7.权利要求6的DNA疫苗组合物，其中所述流感病毒样颗粒衍生自被包含一或多个含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的质粒的重组杆状病毒感染的细胞，所述FliC-M2基因编码FliC-M2融合蛋白。
8.权利要求5的DNA疫苗组合物，其进一步包含一种佐剂。
9.权利要求8的DNA疫苗组合物，其中所述佐剂是含铝佐剂。
10.权利要求5的DNA疫苗组合物，其中所述DNA疫苗与加强剂的质量比为5比3。
11.权利要求5的DNA疫苗组合物，其在个体中引发一种抗多种禽流感病毒亚型的免疫反应。
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