CN114181316A - 自组装蛋白质纳米颗粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

自组装蛋白质纳米颗粒(SAPN)是极好的抗原，因为它能够同时向B细胞呈递多个表位，并产生比单个表位更强的B细胞受体信号传导。大部分SAPN来源于病毒或细菌噬菌体的衣壳蛋白，其颗粒稳定性低，存在针对衣壳蛋白的抗体以及对肽插入的结构不相容性。在本发明中，发明人使用热稳定且耐受靶肽掺入的非病毒蛋白创建了SAPN。该SAPN的组装亚基是两个组成部分之间的融合蛋白：第一组成部分，由修饰A型流感病毒M2蛋白得到的两亲螺旋肽组成的聚合模块，第二组成部分，由超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)组成的靶肽呈递模块，其中在sfGFP的特定环上具有肽插入位点。该颗粒能够通过基因重组掺入靶肽，并将靶蛋白呈递在纳米颗粒表面，刺激产生针对靶肽的高亲和力抗体，而无需使用佐剂。

Description

自组装蛋白质纳米颗粒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于免疫、诊断和疾病治疗的新型自组装蛋白质纳米颗粒。
背景技术
文献报道的自组装蛋白质纳米颗粒(SAPN)大多来源于病毒或细菌噬菌体的衣壳蛋白。这些SAPN亚基蛋白包括HBV表面抗原(HBs)、人乳头瘤病毒L1主要衣壳蛋白(HPV L1)、不动杆菌噬菌体的衣壳蛋白(AP205)和HBV的核心抗原(HBcAg)。SAPN的两个结构特征，分子特异性和多价性，使其成为合适的疫苗佐剂和载体。SAPN上的高抗原密度和结构有序的抗原排列类似于病原体的识别模式，因此促进了抗原与BCR的交联。这种多价相互作用是激发有效免疫反应的关键步骤，也是亚单位疫苗免疫原性较弱的解决方案。事实上，除了CD8+T细胞介导的保护之外，SAPN还引发(elicit)高滴度的高亲和力中和IgG。它们不仅触发补体激活，还有助于创造促进疫苗与APC相互作用的微环境。因此，SAPN已用于预防性和免疫治疗性疫苗。在自组装蛋白上纳入(incorporation)抗原并随后产生嵌合SAPN是通过直接自组装过程或使抗原与纳米颗粒产生共价化学键合来完成的。
特征最好的病毒SAPN之一是基于乙型肝炎病毒的核心抗原(HBcAg)。HBcAg单体包含一个组装结构域(1–149aa)和一个用于结合核酸的C端结构域(CTD)。组装结构域由5个α螺旋和位于螺旋3和螺旋4之间的主要免疫显性区(MIR)组成，主要免疫显性区(MIR)用作外源肽的插入位点。HBcAg单体结合成二聚体并在微生物蛋白质表达过程中通过二聚体间接触(interdimer contact)自发组装。HBcAg在人类疫苗中的应用面临两个挑战。首先，这种SAPN基于人类病原体，因此由于现有抗体，它对全球4.5亿慢性HBV携带者无效，并且对那些已经接触过病毒的人可能效果较差。其次，插入核心基因的许多外源肽破坏了HBcAg颗粒的自组装特性。这两个问题使得开发解决这两个问题的SAPN更显重要。
荧光蛋白是具有相似3D结构和功能的蛋白质家族。已经在珊瑚、海葵、节肢动物和桡足类的各种物种中鉴定出荧光蛋白同源物。来自不同物种的荧光蛋白具有相似的3D结构，但初级蛋白质序列的相似性较低。荧光蛋白共享一个β桶结构，其由11个β折叠和一个包含贯穿桶的发色团的α螺旋组成。每个β折叠通过一个环连接到下一个，特定环对肽插入的耐受性更强，而不会影响结构完整性及其产生荧光的功能。荧光蛋白具有高度热稳定性和快速折叠性，可以轻松与另一种蛋白质融合，而不会破坏两种蛋白质的结构。荧光蛋白已应用于多个领域，例如在细胞生物学研究中，当与靶蛋白融合时，可作为报告蛋白(reporter)在荧光显微镜下监测靶蛋白定位；在生物化学研究中，通过两个相容的荧光蛋白对之间的能量转移来标记两种蛋白质之间的密切相互作用，每个荧光蛋白对与一个靶蛋白融合。通过DNA改组(DNA shuffling)和筛选在结构破坏者存在的情况下仍正确折叠的克隆，利用结合了荧光蛋白编码区的随机诱变的直接进化过程来提高荧光蛋白的稳定性及其对肽插入的耐受性。破坏者可以是插入在β折叠8和9之间的肽序列。通过这个过程，所有物种的荧光蛋白都可以被修改为超折叠形式。顺天堂大学的Kobayashi博士已经证明，可以将充当纯化用串联亲和标签的功能性肽插入sfGFP的β折叠8和9之间的环中，而不会破坏结构完整性。亲和标签中包含的肽之一包括链霉亲和素结合肽(序列：MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHH PQGQREP)，这是一种含有38个氨基酸的肽，可与链霉亲和素以高特异性和亲和力相互作用。芝加哥大学的Pavoor博士描述了通过选择插入到GFP的两个近端环中的随机序列来生成基于荧光蛋白的抗体。当该抗体库用于筛选模型蛋白时，可以鉴定出具有纳摩尔亲和力的荧光蛋白抗体。
蛋白质聚集是一种生物学现象，其中本质上无序的蛋白质或错误折叠的蛋白质通过疏水相互作用而相互作用。合成后，蛋白质通常折叠成在热力学最有利的特定三维构象：它们的天然状态。这种折叠过程是由疏水作用驱动的：蛋白质的疏水部分通过埋入蛋白质内部来保护自己免受细胞亲水环境的影响。因此，蛋白质的外部通常是亲水的，而内部通常是疏水的。蛋白质表面存在疏水性补丁(hydrophobic patch)会增加通过与另一种蛋白质的疏水性补丁相互作用形成蛋白质聚集的机会。持续的蛋白质聚集导致蛋白质沉淀和失活。
两亲性螺旋肽是介导蛋白质与脂质膜相互作用的结构基序。这些相互作用可以分为几类：首先，介导外周膜蛋白的膜定位；第二，通过一些细菌毒素直接嵌入膜，破坏膜的完整性；第三，为病毒出芽创造膜弯曲。已知来自A型流感病毒M2蛋白的两亲性螺旋肽(M2AH)介导病毒出芽和M2质子通道的膜锚定。A型流感病毒的M2AH位于M2蛋白的第44至62位氨基酸，不同A型流感病毒株之间存在一定差异。当M2AH整合到含有胆固醇的磷脂膜中时，M2AH介导的病毒出芽的机制已被证明涉及膜弯曲。
为了表达满足药物需求或生物医学研究需求的重组蛋白，已经开发了各种重组蛋白表达系统。从最简单但高产的细菌表达系统到最复杂但最精细的哺乳动物细胞表达系统，不同的表达系统就翻译后修饰而言提供了独特的生态位。无细胞蛋白质表达系统，如小麦胚芽提取物、兔网织红细胞裂解物或大肠杆菌(E.coli)提取物系统，为生物医学研究人员提供了一种有用的工具，可实现高通量功能基因组和蛋白质组学。
发明内容
本发明描述了可用于产生具有多种功能的自组装蛋白质纳米颗粒的新型试剂的产生，所述多种功能包括当特定靶肽通过基因重组插入该纳米颗粒时，可刺激针对该靶肽的长持续时间抗体反应。该试剂由两个组成部分组成，第一组成部分是聚合模块，其含有来源于A型流感病毒M2蛋白的两亲性螺旋肽；第二组成部分是靶肽呈递模块，其包含一个超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)，其中靶肽插入位点位于sfGFP的β折叠8和9之间。8×His标签可位于该插入位点的N端以促进蛋白质纯化。该试剂在各个领域的应用始于合成包含靶肽编码序列的小基因。然后将该基因通过基因重组插入到靶肽插入位点，构建蛋白表达质粒。将该质粒转化到表达蛋白质的大肠杆菌菌株中并培养用于蛋白质诱导。表达的重组蛋白将在翻译后自发组装成SAPN，并可使用Ni-NTA树脂或其他方法进行纯化。纯化后的蛋白质可用于不同的应用，例如：免疫动物以产生高亲和力抗体或直接作为传染病疫苗。
附图说明
受益于以下实施方案的详细描述和参考附图，本发明的优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中：
图1.描绘了本发明融合蛋白的开放阅读框。该融合蛋白包含两部分，聚合模块和靶肽呈递模块。聚合模块包含一个两亲性螺旋肽(LYRRLE)，其肽序列为MDRLFFKCLYRRLEYGLKRG。靶肽呈递模块包含一个sfGFP，其中靶肽插入位点位于β折叠8和9之间。用于重组蛋白纯化的8×His标签可位于靶肽插入位点之前或其他位点。
图2.描绘了AH3-GFP介导的SAPN的表征。A)当GFP与AH3肽融合时，形成更高级的蛋白质结构。该GFP源自pEGFP-C1载体，具有增强型GFP(EGFP)的一级序列。His-GFP或AH3-GFP的蛋白质制剂在截留分子量(MWCO)为100kDa、300kDa和1000kDa的尺寸排阻膜上离心。通过SDS-PAGE分析通过膜的蛋白质以与输入蛋白质进行比较。B)显示了AH3-GFP的透射电子显微镜图像。比例尺为100nm。AH3-GFP蛋白复合物的TEM图像是用磷钨酸负染色后获得的。图像是使用Tecnai G2 Spirit Twin拍摄的。C)在没有脱氧胆酸盐(DOC，deoxycholate)情况下用His-GFP和AH3-GFP蛋白对小鼠进行一次免疫后，追踪6个月。用与脱氧胆酸盐(deoxycholate)混合的蛋白质免疫小鼠后，只观察第一个月。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析收集的血清以鉴定抗GFP IgG几何平均滴度(GMT)。D)根据TEM图像构建AH3-GFP聚合物结构模型。
图3.描绘了生成的AH3变体以及能够形成不含疏水性补丁的SAPN的AH3变体的鉴定。A)通过由蛋白质结构模型指导的诱变生成的AH3变体的列表。在AH3-sfGFP-2xhM2e中相较于AH3改变的氨基酸标有下划线。B)评估使用阶梯蔗糖梯度(step sucrose gradient)来鉴定由AH3变体形成的不含疏水性补丁的SAPN的适用性。在13ml聚丙烯管(Beckman cat#14287)中，首先在底部铺有1ml 85％(w/v)蔗糖溶液，顶部铺有2ml45％(w/v)蔗糖溶液，然后是7ml 15％(w/v)蔗糖溶液。苏丹III储备溶液在异丙醇中制备为0.5％。管1是铺有蔗糖阶梯梯度层但不添加细菌裂解物的对照离心管(control centrifuge tube)。管2是铺有细菌裂解物和苏丹III溶液的离心管。细菌裂解物通过将超声处理的细菌细胞在Sorvall 6C的SS34转子中以10K rpm离心10分钟来制备。将细菌裂解物和苏丹III加在蔗糖阶梯梯度(sucrose step gradient)上后，将管在SW41Ti转子中以35K rpm离心2小时。离心后，管1苏丹III染料迁移并位于45％和85％蔗糖溶液之间的交界处，但在管2中，苏丹III染料停在15％和45％蔗糖溶液之间的交界处。该数据支持当添加细菌裂解物时细菌膜和结合的苏丹III染料(associated Sudan III dye)在15％至45％的蔗糖交界处累积。C)使用相同的蔗糖阶梯梯度，将含有不同AH3变体重组蛋白的1毫升细菌裂解液加在蔗糖阶梯梯度的顶部，并在SW41Ti转子中以35K rpm的速度离心2小时，然后通过将离心管暴露于发射450nm波长光的LED灯泡进行成像以获得荧光SAPN的分布。对AH3变体的排列：管1，AH3(序列3)；管2，LY(序列4)；管3，LYRLLK(序列5)；管4，LYRLLE(序列6)；管5，LYRRLE(序列7)；管6，RRLE(序列8)；管7，RRLD(序列9)。结果显示由LYRRLE、RRLE和RRLD变体形成的SAPN仍然形成SAPN并可沉降到45％和85％蔗糖级分之间的交界处。与细菌膜共沉淀的蛋白质较少。但大部分由AH3、LY、LYRLLK或LYRLLE变体形成的SAPN与细菌膜共沉淀，没有一个达到45％-85％的交界处。D)显示了AH3-sfGFP-2xhM2e的LYRRLE变体的TEM图像。比例尺为50nm。这些结果表明LYRRLE、RRLE和RRLD变体能够形成不含疏水性补丁且不与细菌膜相互作用的SAPN。
图4.描绘了LYRRLE-sfGFP-2xhM2e SAPN的热稳定性。A)LYRRLE-sfGFP-2xhM2e和AH3-sfGFP-2xhM2e被脱盐(desalted)到1/2×GF缓冲液中，并在室温度下保存20天。通过将蛋白质溶液以14.5K rpm离心5分钟来获得留在溶液中的蛋白质。蛋白质完整性利用SDS-PAGE电泳进行评估，并通过考马斯蓝染色进行可视化。B)LYRRLE-sfGFP-2xhM2e SAPN首先脱盐(desalted)到1/2×GF缓冲液中，并在4℃或37℃下保存4个月。小鼠用三种制剂的20μgLYRRLE-sfGFP-2xhM2e免疫一次，所述三种制剂包括：新鲜制备的蛋白质(1w)，在4℃下保存4个月(4-4m)或在37℃下保存4个月(37-4m)。在第14天收集血清(sera)，然后分析抗hM2eIgG几何平均滴度(GMT)。结果显示4℃和37℃存储之间没有区别。这些结果支持了基于LYRRLE-sfGFP的SAPN在高温储存中的稳定性和活性。(N＝5)
图5.描绘了不含疏水性补丁的SAPN产生的长期免疫反应。将纯化的AH3-sfGFP-2xhM2e和LYRRLE-sfGFP-2xhM2e重组蛋白脱盐(desalted)到1/2×GF缓冲液(10mM NaPO4、150mM NaCl、pH 7.4)中，然后以每只20μg的单剂量免疫小鼠。对照小鼠用1/2×GF缓冲液(PBS)免疫。在第14、50、90和200天通过面部静脉穿刺收集血液，并在100倍稀释后测试血清的抗hM2e IgG滴度。ELISA结果显示在A)PBS、B)AH3-sfGFP-2xhM2e或C)LYRRLE-sfGFP-2xhM2e组中的所有5只小鼠的OD 450读数。结果表明，用LYRRLE变体SAPN免疫的小鼠中，五只小鼠中四只具有持久的抗体反应，而用基于原始AH3的SAPN免疫的五只小鼠中只有一只具有持久的抗体反应。
图6.描述了使用基于LYRRLE-sfGFP的SAPN生成高亲和力抗体。使表达并用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白LYRRLE-sfGFP-2xhM2e，脱盐(desalted)至1/2×GF缓冲液。使用肌肉注射以每次20μg剂量对小鼠进行两次免疫，间隔为14天。在免疫后第90天收集血清(serum)(#830)，用于通过蛋白质印迹(WB)检测免疫重组蛋白。A)在WB中用三种不同的蛋白质作底物，1)His-sfGFP，其带有插入位点和N端His标签，但不含AH3肽，2)LYRRLE-sfGFP-2xhM2e，3)LYRRLE-sfGFP-2xM2e，其具有和样品2不同的M2e序列。对照抗体是从Sigma(Sigma，cat#70796-m)购买的抗His单克隆抗体(mAb)。VP-10是从用AH3-sfGFP-M2e蛋白免疫两次的小鼠收集的血清。B)测试抗体(#830)对不同量的免疫抗原(LYRRLE-sfGFP-2xhM2e)的亲和力：10ng、5ng、2ng、1ng和0.2ng。对照抗体是来自Sigma的抗His mAb。结果表明，LYRRLE-sfGFP-2xhM2e免疫激活了具有高亲和力和高特异性的抗体。
图7.描绘了使用基于LYRRLE-sfGFP的SAPN生成CMTR2肽抗体。选择来自小鼠CMTR2ORF的肽序列进行基因合成，并通过基因重组插入LYRRLE-sfGFP SAPN以生成LYRRLE-sfGFP-CMTR2。表达和纯化重组蛋白，并在没有佐剂的情况下用于小鼠免疫。在4次免疫后，从小鼠身上收集血清(sera)并以1:1000稀释用于蛋白质印迹实验，以检测1ng水平的重组蛋白。A)使用SDS-PAGE来检测基于相同的LYRRLE-sfGFP平台所制备的各种蛋白质(individual protein)。His-sfGFP(泳道1)、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e(泳道2)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2(泳道3)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-6(泳道4)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-B(泳道5)、LYRRLE-sfGFP-Notch3-1(泳道6)、LYRRLE-sfGFP-Notch3-3(泳道7)。B)使用从用LYRRLE-sfGFP-CMTR2免疫的小鼠收集的血清混合A组中列出的蛋白质并调整至各1ng，用于WB分析。H代表来自Sigma的抗His mAb。结果显示所有五只小鼠(66-70)的血清都能够以高强度检测到1ng水平的含CMTR2肽的重组蛋白。
图8.描述了以亲和树脂去除(depletion)抗sfGFP抗体的测试。将从用LYRRLE-sfGFP-2xhM2e免疫两次的小鼠身上收集的血清样品用于抗体去除效率测试。10微升血清首先以ELISA封闭缓冲液(ELISA blocking buffer)(10mM NaPO4、150mM NaCl、0.05％Tween20、1％BSApH 7.4)稀释20倍，然后通过50微升或100微升亲和树脂。亲和树脂上的His-sfGFP抗原密度为2mg/ml。然后通过ELISA分析流出物以检测A)抗His-sfGFP IgG和B)抗hM2e IgG。结果表明sfGFP亲和树脂能够通过50μl树脂去除高达90％的抗sfGFP IgG或通过100μl树脂去除高达98％的抗sfGFP IgG。但该亲和树脂对抗hM2e IgG滴度影响不大。
虽然本发明可以有各种修改和替代形式，但其特定实施方案在附图中以示例的方式示出并且将在本文中详细描述。附图可能不是按比例绘制的。然而，应当理解的是，附图及其详细描述并非旨在将本发明限制于所公开的特定形式，而是相反，其目的在于涵盖落入如所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
具体实施方式
应当理解，本发明不限于特定的设备或方法，其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括所指对象之单数和复数，除非内容另有明确规定。此外，在整个申请中，“可以”一词是在允许的意义上使用(即，有可能，能够)，而不是在强制性意义上(即，必须)使用。术语“包括”及其派生词的意思是“包括但不限于”。术语“偶联的(coupled)”是指直接或间接连接。术语“靶肽(targetpeptide)”是指用作抗原、诊断探针或蛋白质结合肽的肽序列。本发明包括一种重组蛋白，其自组装成蛋白质纳米颗粒(SAPN)，该纳米颗粒可以通过基因重组将靶肽掺入到表面。在一个优选的实施方案中，融合蛋白由两部分组成：包含修饰A型流感病毒M2蛋白得到的两亲螺旋肽的聚合模块；包含超级折叠GFP和短DNA片段的靶肽呈递模块，所述短DNA片段框内插入到β折叠8和9之间的环内。这个短DNA片段可以编码一个8×His标签和一个靶肽插入位点(图1，序列1)。
在另一个实施方案中，靶肽呈递模块中的sfGFP可以被sfmCherry或热绿蛋白(TGP)替代用于靶肽掺入(target peptide incorporation)。
在另一个实施方案中，靶肽呈递模块的sfGFP可以被另一种具有β桶结构的荧光蛋白替代，该荧光蛋白由11个β折叠和1个α螺旋组成，当被光子激发时发出荧光。
在另一个实施方案中，聚合模块可以融合到靶肽呈递模块的C端。
在另一个实施方案中，聚合模块可以包含A型流感病毒M2蛋白的氨基酸44至氨基酸62的肽序列。
在一个实施方案中，聚合模块中的LYRRLE肽(序列号7)可以被具有DRLFFKCLYRRLDYGLKRG序列的肽替代。
在另一个实施方案中，聚合模块中的LYRRLE肽(序列号7)可以被含有序列号8的肽替换。
在另一个实施方案中，聚合模块中的LYRRLE肽(序列号7)可以被含有序列号9的肽替换。
在另一个实施方案中，聚合模块可以包含具有LFFKCLYRRLEYGL序列(序列12)的肽。
在一个实施方案中，靶肽可以是调节肿瘤生长的肿瘤抗原。与肿瘤抗原结合的SAPN可通过免疫患肿瘤的人而用作针对肿瘤的治疗性疫苗。
在一个实施方案中，靶肽可以是传染性病原体的介导感染过程的蛋白质。
在一个实施方案中，靶肽可以是人类细胞上的病毒受体。
在一个实施方案中，靶肽可以是一种肿瘤结合肽，当SAPN被注射到宿主中时，它能够将荧光SAPN集中到肿瘤部位。
在一个实施方案中，靶肽可以是链霉亲和素结合肽，其使基于LYRRLE-sfGFP的SAPN能够与大的生物素化蛋白质交联。
在一个实施方案中，可以在无细胞蛋白质表达系统中翻译编码基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的DNA片段以产生大量的SAPN克隆，每个克隆都包含(incorporate)不同的靶肽。
在一个实施方案中，可以通过在重组蛋白的N端添加6His标签来增强基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的稳定性；可以通过在重组蛋白的C端添加6His标签来增强基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的稳定性。
在一个实施方案中，可以通过添加二糖如海藻糖或蔗糖来增强基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的稳定性。
在另一个实施方案中，可以将信号肽连接到基于LYRRLE-sfGFP的重组蛋白的N端，以促进SAPN运送到大肠杆菌的周质空间。这些肽包括来自麦芽糖结合蛋白(MBP)、β-内酰胺酶、Cry1Ia毒素、PelB、HlyA、GeneIII的信号肽。
在优选的实施方案中，高亲和力抗体的产生是通过使用化学合成或PCR来合成编码靶肽的基因开始的。然后可以通过DNA重组技术将该基因克隆到靶肽插入位点。然后可以将所得的蛋白质表达质粒转化到蛋白质表达大肠杆菌菌株中，如ClearColi BL21(DE3)，然后在低温(20℃)培养箱中使用IPTG进行蛋白质诱导，以增强蛋白质折叠和生产力。在超声装置(Misonix sonicator 3000)中通过超声处理将细菌均质化后，使用Ni-NTA树脂纯化表达的蛋白质。然后将含有重组蛋白的细菌裂解物在SS34转子中在Sorvall RC6离心机中以10000rpm离心10分钟以去除细胞碎片。然后通过与Ni-NTA树脂结合来纯化重组蛋白，并用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱。按照上述程序表达和纯化的重组蛋白无需进一步处理即可自发形成SAPN，并可在洗脱缓冲液(20mM NaPO4、300mM NaCl、500mM咪唑，pH 8.0)中于4℃保存数月。在免疫之前，使用脱盐柱(GE illustra NAP-5)将蛋白质脱盐(desalted)到1/2×GF缓冲液中。将蛋白质不加佐剂直接注射到小鼠后肢进行免疫，免疫后2周或更晚采血进行ELISA测定。该SAPN还可用于免疫小鼠以外的动物，例如鱼、兔、鸡、犬、猫、猪、牛、马和人。并且对于本领域技术人员显而易见的是，该蛋白质也可以在用于重组蛋白质生产的其他非细菌表达系统中生产，例如酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞中生产。
在一个实施方案中，基于LYRRLE-sfGFP的SAPN可以在免疫前与佐剂混合以增强靶肽的抗原性。
在另一个实施方案中，聚合模块可以直接与另一种蛋白质融合，并形成具有新功能的全新SAPN。例如，LYRRLE肽可以与单链可变片段(scFv)融合并驱动基于scFv的SAPN的形成，该SAPN能够同时结合多个scFv靶标以获得更高的亲和力。
在另一个实施方案中，聚合模块可以直接与GFP抗体融合以形成覆盖有用作诊断工具的结合靶蛋白的GFP抗体的SAPN。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成了其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1
AH3与GFP的融合使纳米颗粒形成和长期免疫反应成为可能。
AH3是源自A型流感病毒M2蛋白的两亲性螺旋肽。GFP从编码增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1载体克隆而来。与His-GFP相比，AH3-GFP形成分子量大于1000kDa的更高级的蛋白质结构，如在不同MWCO的尺寸排阻膜中离心AH3-GFP蛋白质溶液所示(图2A)。在透射电子显微镜下检查时，AH3-GFP形成棒状结构(图2B)。该数据支持了大于1000kDa的AH3-GFP聚合物的形成。当AH3-GFP重组蛋白用于小鼠免疫时，它诱导了持续6个月的抗GFP抗体(图2C)。AH3-GFP聚合物的结构是通过使用为α-螺旋结构的AH3肽的蛋白质建模来预测的。蛋白质建模的预测结构显示AH3肽作为聚合中心，将十字形的AH3-GFP四聚体堆叠在另一个四聚体顶部，并形成棒状结构(图2D)。每个预测的四聚体都包含一个驱动聚合过程的疏水性补丁。如图3所示，AH3-sfGFP-2xhM2e蛋白与细菌膜相互作用并与细菌膜共沉淀。在由蛋白质模型指导的诱变后，将AH3肽序列的变体引入AH3-sfGFP-2xhM2e融合蛋白中，并通过在蔗糖阶梯梯度测定中分析含有具有AH3变体的SAPN的细菌裂解物来确认通过诱变去除了疏水性补丁。结果表明，AH3变体LYRRLE(序列号7)、RRLD(序列号9)和RRLE(序列号8)具有减少的膜共沉淀(membrane co-sedimentation)，这表明这些变体去除了疏水性补丁。图3中的数据表明用谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代13位的赖氨酸对于去除疏水性补丁是重要的，并且可能有助于颗粒稳定性。发现一种AH3变体LYRRLE在TEM下保持棒状结构(图3C和图3D)。
实施例2
评估基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的热稳定性。
众所周知，荧光蛋白可以承受高达75℃的高温，对于超级折叠GFP甚至高达85℃的高温，也不会失去荧光。在高温储存期间保持活性的能力将使开发出的疫苗能够到达冷链以外的偏远地区。在生理缓冲液中评估从SAPN去除疏水性补丁后LYRRLE变体的稳定性。将AH3-sfGFP-2xhM2e和LYRRLE-sfGFP-2xhM2e脱盐到生理缓冲液(10mM NaPO4、150mM NaCl，pH 7.4)中并调整至1mg/ml，然后在室温(25℃)下储存20天。在第10天，AH3-sfGFP-2xhM2e变得浑浊，但LYRRLE-sfGFP-2xhM2e没有。在第20天，通过在微量离心机中以14.5krpm离心5分钟去除聚集的蛋白质(aggregated protein)。上清液用于进行蛋白质完整性的SDS-PAGE分析。结果显示I8L和K13E的突变稳定了基于AH3-sfGFP的SAPN(图4A)。为了测试基于LYRRLE-sfGFP的SAPN在储存过程中是否能够承受高温，将LYRRLE-sfGFP-2xhM2e在4℃或37℃下储存在生理缓冲液中4个月。然后将蛋白质用于小鼠免疫以测试该蛋白质的热稳定性。将小鼠分为三组，每组用20μg不同储存条件的蛋白质(在4℃或37℃下储存4个月或新鲜制备的蛋白质)免疫一次。免疫后14天收集血清(sera)并用于ELISA测定检测抗-hM2e肽IgG滴度。结果显示，与新鲜制备的蛋白质相比，LYRRLE-sfGFP-2xhM2e蛋白在4℃或37℃下储存4个月均使刺激抗hM2e IgG产生的活性降低了4倍(图4B)。所以高温储存对基于LYRRLE-sfGFP的SAPN活性没有影响。
实施例3
呈递广谱流感疫苗表位hM2e的基于LYRRLE-sfGFP的SAPN的构建、表达和免疫。
合成编码通过接头隔开的2个拷贝的来自A型流感病毒株PR8的M2异位结构域(ectopic domain)(hM2e)的基因，并使用基因重组将其框内插入至编码LYRRLE-sfGFP重组蛋白的质粒上的插入位点。插入位点位于8His标签后面的β折叠8和9之间的环中。将包含正确插入的质粒(LYRRLE-sfGFP-2xhM2e)转化到ClearColi BL21(DE3)感受态细胞中，并接种在含有50μg/ml卡那霉素的琼脂平板上。将平板在37℃培养箱中培养2天。在第三天早上，从平板上刮下菌落并重新悬浮在含有50μg/ml卡那霉素的LB肉汤中。然后将肉汤在37℃的培养箱中摇晃直到O.D.600达到0.5-0.7，然后将培养瓶从培养箱中取出，将其放在冰上冷却。加入0.2mM IPTG后，将培养物置于20℃的培养箱中进行蛋白质诱导16小时。通过RC6离心机在SLA1500转子中以5000rpm离心10分钟来收获细菌。然后将细菌沉淀物(pellet)重新悬浮在裂解缓冲液(20mM NaPO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)中，并使用超声波破碎器(Misonix sonicator 3000)以开启10秒/关闭20秒循环在冰浴中进行超声处理5分钟。使用Sorval SS34转子在4℃下以10000rpm离心10分钟去除不溶性碎片。然后按照用户手册中的说明，将含有靶蛋白质的可溶性部分(fraction)用于通过Ni-NTA树脂进行纯化。使用洗脱缓冲液(20mM NaPO4、300mM NaCl、500mM咪唑，pH8.0)洗脱结合的蛋白质。洗脱的蛋白质可在4℃下保存较长时间。在小鼠免疫之前，使用sephadex 25柱(GE illustra NAP5)将蛋白质脱盐到1/2×GF缓冲液(10mM NaPO4、150mM NaCl、pH7.4)中。通过将20μg重组蛋白AH3-sfGFP-2xhM2e或LYRRLE-sfGFP-2xhM2e注射到小鼠后肢肌肉中一次进行免疫。在第15天、第50天、第90天和第202天通过面部静脉采血后收集血清(sera)用于ELISA分析以确定抗hM2eIgG滴度(图5)。结果显示5只小鼠中有4只使用LYRRLE-sfGFP-2xhM2e蛋白免疫小鼠刺激了延长的抗hM2e IgG滴度持续时间，但是当使用AH3-sfGFP-2xM2e蛋白免疫小鼠时，5只小鼠中只有1只具有长效持久的抗hM2e IgG滴度。
实施例4
使用来自通过LYRRLE-sfGFP-2xM2e和LYRRLE-sfGFP-2xhM2e蛋白免疫的小鼠的血清检测和区分两种M2e肽变体。
三种蛋白质，His-sfGFP(泳道1)、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e(泳道2)和LYRRLE-sfGFP-2xM2e(泳道3)分别加载到SDS-PAGE凝胶中，并在电泳后印迹到PVDF膜上。然后用血清VP-10(用含有M2e的SAPN免疫)或#830(用含有hM2e的SAPN免疫)探测(probed)膜并通过ECL试剂检测。结果显示血清VP-10或#830仅检测到具有相同抗原肽序列的蛋白质，在hM2e(SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD，23个氨基酸)和M2e(SLLTEVETPTRSEWESRSSDSSD，23个氨基酸)之间有五个氨基酸的差异(图6A)。#830还可以在1:5000稀释后检测10ng蛋白质。注：#830对泳道1和泳道3的检测较弱，可能是抗His抗体的诱导所致。血清#830还对hM2e肽具有高亲和力，它可以检测WB中低至1ng的重组蛋白(图6B)。
实施例5
LYRRLE-sfGFP-CMTR2 SAPN的构建、纯化和免疫。
合成编码2个串联拷贝的CMTR2(Cap甲基转移酶2)肽(氨基酸233-253)的基因(序列10)并通过基因重组构建到LYRRLE-sfGFP表达质粒的插入位点中。将构建的质粒LYRRLE-sfGFP-CMTR2转化到ClearColi BL21(DE3)感受态细胞中并接种于卡那霉素平板上。在细菌培养物的光密度达到O.D.600在0.5-0.7之间后，蛋白表达由0.2mM IPTG在20℃下诱导16小时。细菌裂解物通过离心澄清后，使用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。与Ni-NTA树脂结合的重组蛋白在含有500mM咪唑的洗脱缓冲液中洗脱。LYRRLE-sfGFP-CMTR2脱盐到生理缓冲液中用于免疫。在以14天的间隔进行40μg的4次连续免疫后，由从小鼠面部静脉收集的血液制备血清，用于蛋白质印迹分析。A)混合物中存在的抗原蛋白包括His-sfGFP(泳道1)、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e(泳道2)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2(泳道3)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-6(泳道4)、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-B(泳道5)、LYRRLE-sfGFP-Notch3-1(泳道6)、LYRRLE-sfGFP-Notch3-3(泳道7)。B)蛋白质混合物包含1ng的图A(panel A)中所示的每种蛋白质，通过SDS-PAGE分离并印迹到PVDF膜上，并用使用LYRRLE-sfGFP-CMTR2产生的5份血清进行探测。结果显示来自被LYRRLE-sfGFP-CMTR2免疫的小鼠的血清仅检测到具有相应插入肽的蛋白质，但未检测共享相同的LYRRLE-sfGFP序列的其他蛋白质(图7)。
实施例6
使用亲和树脂从免疫血清中去除抗sfGFP IgG。
表达并使用Ni-NTA树脂纯化没有聚合模块或靶肽的重组蛋白sfGFP-8His。首先将洗脱的蛋白质调节至4mg/ml，然后将2ml sfGFP-8His蛋白质首先脱盐到偶联缓冲液(0.6M柠檬酸盐，0.1M MOPS pH 7.5)中，然后与0.5克活化珠(Pierce Ultralink Biosupport)混合用于交联。偶联反应混合物上下颠倒旋转连续1小时，然后去除游离蛋白质。未反应的交联剂通过旋转3小时用5ml 1M乙醇胺淬灭。然后将His-sfGFP蛋白包被的珠子加载到空色谱柱中，珠子用10个柱床体积(bed volume)的1M NaCl和10个柱床体积的无菌Milli-Q水洗涤，以去除非共价连接的His-sfGFP蛋白。按照此方案(protocol)制备的亲和树脂储存在4℃的20％乙醇中。为了测试His-sfGFP树脂去除背景抗sfGFP IgG和抗His IgG的能力，首先将10μl来自用LYRRLE-sfGFP-2xhM2e抗原免疫两次的小鼠的血清在ELISA封闭缓冲液(1％BSA、10mM NaPO4、150mM NaCl、0.05％Tween-20pH7.5)中稀释20倍，然后通过含有50μl或100μl亲和树脂的小柱3次。流通液(flow through)用于针对微孔板上包被的hM2e肽或sfGFP-8His蛋白的ELISA。结果显示使用最终稀释400倍的血清的OD450结果。它表明sfGFP亲和树脂可以有效去除抗sfGFP IgG但不能去除抗hM2e IgG(图8)。
鉴于此描述，本发明的各个方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，该描述仅被解释为说明性的并且是为了教导本领域技术人员实施本发明的一般方式。应当理解，本文所示和描述的本发明的形式将被视为实施方案的示例。在本文中示出和描述的那些要素(element)和材料可以被替代，部分(part)和过程(process)可以颠倒，并且本发明的某些特征可以独立使用，所有这些对于本领域技术人员在受益于对本发明的描述之后将是显而易见的。在不脱离如所附权利要求中描述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述的要素进行改变。
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Gly Thr Thr Ser Asp Val Met Ser Lys Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
35 40 45
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
65 70 75 80
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys
85 90 95
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser
100 105 110
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp
115 120 125
Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
130 135 140
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
145 150 155 160
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val
165 170 175
Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys
180 185 190
Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser His His His His His His His
195 200 205
His Lys Leu Ser Glu Leu Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
210 215 220
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
225 230 235 240
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
245 250 255
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His
260 265 270
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
275
<210> 2
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 含有 hM2e 肽的重组蛋白
<400> 2
Met Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Gly Thr Thr Ser Asp Val Met Ser Lys Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
35 40 45
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
50 55 60
Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
65 70 75 80
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys
85 90 95
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser
100 105 110
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp
115 120 125
Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
130 135 140
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
145 150 155 160
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val
165 170 175
Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys
180 185 190
Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser His His His His His His His
195 200 205
His Lys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu
210 215 220
Trp Gly Ser Arg Ser Asn Gly Ser Ser Asp Ser Ser Gly Gly Ser Leu
225 230 235 240
Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser
245 250 255
Asn Gly Ser Ser Asp Glu Leu Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr
260 265 270
Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn
275 280 285
His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys
290 295 300
Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
305 310 315 320
His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
325
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<300>
<308> Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149
<309> 2020-09-18
<313> (1)..(19)
<400> 3
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的 I8L 突变体
<300>
<308> Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149
<309> 2020-09-18
<313> (1)..(19)
<400> 4
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的I8L/R11L突变体
<300>
<308> Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149
<309> 2020-09-18
<313> (1)..(19)
<400> 5
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的I8L/R11L/K13E 突变体
<300>
<308> Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149
<309> 2020-09-18
<313> (1)..(19)
<400> 6
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的I8L/K13E突变体
<300>
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<313> (1)..(19)
<400> 7
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的K13E 突变体
<300>
<308> Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149
<309> 2020-09-18
<313> (1)..(19)
<400> 8
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的 K13D 突变体
<400> 9
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Asp Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 10
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CMTR2 基因
<400> 10
aagcttggcg gcagcagcac cgcggatggc agctttgata gccagggcaa cccgggcgaa 60
caggaagcgc tggtgagcag cctgcatggc ggcagcagca agcgcaagag cagcggcggc 120
accgcggatg gcagctttga tagccagggc aacccgggcg aacaggaagc gctggtgagc 180
agcctgcatg gcggcagcag cgagctc 207
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AH3的I8L/K13D 突变体
<400> 11
Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Asp Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Lys Arg Gly
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 最小肽(Minimal peptide)
<400> 12
Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu
1 5 10

Claims (15)

1.一种重组自组装蛋白，其包括聚合模块和靶肽呈递模块；聚合模块通过基因重组与靶肽呈递模块框内融合；在宿主中表达时自组装成蛋白质纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的重组自组装蛋白，其聚合模块包含具有在来自A型流感病毒的M2蛋白的氨基酸44至氨基酸62之间的序列的肽。
3.如权利要求1所述的重组自组装蛋白，其聚合模块包括具有DRLFFKCLYRRLXYGLKRG序列的肽，其中X是包含谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的基团。
4.如权利要求1所述的重组自组装蛋白，其聚合模块包括具有DRLFFKCIYRRLXYGLKRG序列的肽，其中X是包含谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的基团。
5.如权利要求1所述的重组自组装蛋白，其靶肽呈递模块包含在β折叠8和9之间含有肽插入位点的荧光蛋白。
6.如权利要求5所述的重组自组装蛋白，其荧光蛋白包含由11个β折叠和1个α螺旋组成的桶形蛋白质，所述桶形蛋白质在被光子激发时发出荧光。
7.如权利要求5所述的重组自组装蛋白，其荧光蛋白包括超级折叠绿色荧光蛋白。
8.如权利要求5所述的重组自组装蛋白，其肽插入位点包括8×His标签和靶肽。
9.如权利要求8所述的重组自组装蛋白，其靶肽包括抗原肽。
10.如权利要求1所述的重组自组装蛋白，其产生之蛋白质纳米颗粒可作为疫苗成分。
11.一种制备高亲和力抗体的方法，其包括以下步骤：(a)设计编码靶抗原的基因；(b)通过基因重组将其插入权利要求1所述的自组装蛋白的靶肽插入位点，以制作蛋白质表达载体；(c)将蛋白表达载体转化到蛋白质表达宿主；(d)表达和纯化包含靶抗原的自组装蛋白质纳米颗粒；(e)在无佐剂的情况下使用该自组装蛋白质纳米颗粒对动物进行免疫；(f)通过动物放血收集抗体或产生针对靶抗原的单克隆抗体。
12.如权利要求11所述的制备高亲和力抗体的方法，其蛋白质表达宿主包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物、哺乳动物细胞培养物。
13.如权利要求11所述的制备高亲和力抗体的方法，其蛋白质表达宿主包括无细胞蛋白质表达系统。
14.一种自组装肽，其蛋白质序列为DRLFFKCLYRRLXYGLKRG，其中X为包含谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的基团。
15.一种自组装肽，其蛋白质序列为DRLFFKCIYRRLXYGLKRG，其中X为包含谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)的基团。
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