CN105960412B

CN105960412B - 作为疫苗平台的含鞭毛蛋白的蛋白纳米颗粒

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Publication number: CN105960412B
Application number: CN201580004255.8A
Authority: CN
Inventors: 彼得·布克哈德; 森蒂尔·库马尔·拉曼; 萨拉·玛丽亚·保利洛; 马泰奥·皮耶萨; 卡洛琳·库兰加拉; 克里斯汀·米特尔霍尔泽
Original assignee: ALPHA-O PEPTIDES AG
Current assignee: ALPHA-O PEPTIDES AG
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2035-01-09
Also published as: JP6652500B2; ES2705588T3; US10245318B2; CA2934472A1; AU2015205567B2; WO2015104352A1; EP3092245B1; AU2015205567A1; EP3092245A1; JP2017503857A; CN105960412A; US20160324958A1

Abstract

本发明涉及由适合的低聚化结构域构建的并且还包含TLR5结合蛋白鞭毛蛋白作为佐剂分子的自组装蛋白纳米颗粒。此外，本发明还涉及所述纳米颗粒用于疫苗接种的用途。

Description

作为疫苗平台的含鞭毛蛋白的蛋白纳米颗粒

技术领域

本发明涉及自组装蛋白纳米颗粒，包含TLR5结合蛋白质鞭毛蛋白的蛋白序列作为内置佐剂。并且，本发明还涉及所述纳米颗粒用于疫苗的用途。

背景技术

针对入侵病原体的第一道防线是通过宿主的先天免疫，并且Toll-样受体(TLR)作为膜结合受体在其中起重要作用(Yoon S.I.et al.,Science 2012,335:859-64)。TLR通过其富含亮氨酸的重复序列(LRR)的胞外域识别具有高度保守的分子结构的抗原。LRR具有马蹄形状。每种TLR具有可识别其特定分子抗原的独特的配体结合结构域，所述特定分子抗原可以是特殊形式的病毒或细菌核酸、细菌表面分子例如脂多糖(LPS)或其他具有特定模式的病原体相关分子。即使识别多种不相关的分子抗原，所有已知的激动剂激活的TLR结构(即已识别并结合其分子抗原的TLR)在抗原结合后形成相似的二聚体结构，这使其C-末端区域相互靠近，继而激活其细胞内Toll/白介素-1受体(TIR)结构域，以此起始细胞信号级联放大。

至于本发明的范围，有趣的是在许多不同的TLR受体中TLR5是仅有的脊椎动物(从鱼类到哺乳动物)中保守的蛋白结合TLR。TLR5可结合β-变形菌和γ-变形菌的未组装形式的鞭样鞭毛丝鞭毛蛋白，其负责鞭毛运动。近期的结晶学研究显示了鞭毛蛋白和TLR5之间的二聚复合体。鞭毛蛋白结合到TLR5后，MyD88-依赖的信号转导通路被诱导，继而激活树突状细胞、单核细胞和上皮细胞中的促炎转录因子NF-kB，最后引起针对鞭毛菌的先天免疫应答。

鞭毛蛋白的分子结构包含D0、D1、D2和D3四个结构域。蛋白链自D0结构域中的N-末端起始，通过其它结构域D1、D2和D3到分子末端并在那儿转弯形成大的环，然后通过D3、D2和D1结构域返回，使D0结构域中的C-末端非常靠近其N-末端。鞭毛蛋白以2种方式激活先天免疫系统。第一种方式是通过结合到TLR5受体，这主要通过其D1结构域高度保守的部分(Yoon et al.,loc.cit.)。第二种激活方式是通过与炎性体相互作用，这主要通过其D0结构域的高度保守的C-末端部分(Lightfield K.L.et al.,Nat Immunol.2008,9:1171-8)。

鞭毛蛋白已被用作常规佐剂，即可作为独立的部分与抗原一起注入，或者其可被改造以使其自身分子结构中含有抗原本身。第二种方式的优势在于佐剂效应与抗原效应共定位，因此佐剂的剂量可显著减少且结果是副作用也显著减小。

鞭毛蛋白可能的局限性之一是其可能会诱导炎性免疫应答。通过改造鞭毛蛋白结构使其缺失与炎性体互作的D0的C-末端可减低免疫刺激的炎性部分。

许多佐剂在使用中由于其严重的副作用而具有明显的局限性。例如弗氏完全佐剂，是非常强的免疫刺激成分，甚至已不能用于动物实验。目前，只有少数被许可的佐剂可用于人类，最重要的是明矾。限制全身性应用佐剂的副作用的一种可能的途径是将其配制为微粒系统，即，将佐剂掺入微粒中或者含油乳剂中，这可限制其副作用并且将佐剂集中靠近目标抗原。因此，抗原和佐剂可同时到达相同的淋巴结，因而在增加佐剂效应的同时减小佐剂的全身性副作用。

鞭毛蛋白是非常令人关注的可用于蛋白纳米颗粒的佐剂，如WO2004/071493中所述的那些，因为其本身是蛋白质，这不同于其他许多佐剂是小分子，例如咪喹莫德或者基于核酸的实体例如CpG。由于鞭毛蛋白是蛋白质，可通过分子生物学手段而不需要化学交联将其加工到纳米颗粒上。

发明内容

本发明涉及自组装的蛋白纳米颗粒，其由多个式(Ia)或(Ib)的结构单元的聚合体组成,

X–ND1–L1–ND2–FLA (Ia)或FLA–ND1–L1–ND2–X (Ib)

由包含蛋白低聚化结构域ND1、接头L1、蛋白低聚化结构域ND2、鞭毛蛋白衍生物FLA以及取代基X的连续链组成，其中

ND1是形成m个ND1亚基的低聚体(ND1)_m的蛋白质，

ND2是形成n个ND2亚基的低聚体(ND2)_n的蛋白质，

m和n各自的值介于2和10之间，条件是m不等于n，并且不是n的倍数，而且n不是m的倍数，

L1代表键或者是短的柔性接头，

FLA是鞭毛蛋白，或者缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列但至少包含TLR5结合结构域D1的鞭毛蛋白衍生物，并且其中，可任选地，缺失结构域被1到20个氨基酸的柔性接头片段取代以连接其余鞭毛蛋白序列的两个末端，或者被完全折叠的蛋白质抗原取代；

X可不存在或者是含有1到1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，

可任选地，与多个式(II)的结构单元共组装

Y–ND3–L2–ND4–Z (II)，

由包含蛋白低聚化结构域ND3、接头L2、蛋白低聚化结构域ND4以及其他取代基Y和Z的连续链组成，其中

ND3是形成y个ND3亚基的低聚体(ND3)_y的蛋白质，

ND4是形成z个ND4亚基的低聚体(ND4)_z的蛋白质，

y和z各自的值介于2和10之间，条件是y不等于z，并且不是z的倍数，而且z不是y的倍数，并且其中

ND3与ND1相同，或者ND4与ND2相同，或者ND3和ND4分别与ND1和ND2相同，

L2代表键或者是短的柔性接头，其可与L1不同或者相同，并且

Y和Z，独立于彼此地，可缺失或者是含有1到1000个氨基酸的肽或蛋白质序列。

附图说明

图1：在直立位置由含有表位的链以及含鞭毛蛋白或含鞭毛蛋白衍生物的链的共组装体组成的不同蛋白纳米颗粒的示意图。

左上角示出了融合到低聚化结构域ND2和ND1的含鞭毛蛋白的蛋白链单体；右侧示出了与ND3-L2-ND4-Z以1:59比率共组装的纳米颗粒，假定T＝1的二十面体对称。为了清晰，未示出最可能无序的His-标签(X和Y)。

“ND1”和“ND3”:五聚体结构域；“ND2”和“ND4”:三聚体结构域；“FLA”:鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生物；“Z”:表位。

A)鞭毛蛋白D0-D1-D2-D3及相应的表位呈递纳米颗粒的模式图；

B)鞭毛蛋白D0-D1-D2及相应的表位呈递纳米颗粒的模式图；

C)鞭毛蛋白D0-D1及相应的表位呈递纳米颗粒的模式图；

D)鞭毛蛋白D1-D2-D3及相应的表位呈递纳米颗粒的模式图；

E)融合到ND3-L2-ND4核心的低聚化结构域ND4的NANP B-细胞表位(Z)的模式图；

图2：鞭毛蛋白与TLR5相互作用的示意图。

理想地，鞭毛蛋白是二聚体并且在纳米颗粒上以翻转方向显示。所显示的蛋白链的部分起始于(例如五聚体的)低聚结构域ND1，其通过接头L连接到(例如二聚体的)低聚结构域ND2，继而连接到含D2的鞭毛蛋白衍生物FLA，然后连接到鞭毛蛋白的D1结构域直到顶部(T)。在顶部，D1序列联接并自身回折，并且进入D2结构域。为了清晰，未示出最可能无序的His-标签。

A)左图：单体的模式图；右图：其中鞭毛蛋白以右侧二聚体构象用于与TLR5互作的二聚体模式图。

B)上图：与TLR5二聚体互作的鞭毛蛋白二聚体的模式图。下图中左图：完全组装的“仅鞭毛蛋白”颗粒的裁剪模式图；右图：完全组装的“仅鞭毛蛋白”颗粒的全视图。

图3：pPEP-T载体图

“prom”:启动子；“term”:终止子；“ori”:起始位点；“bp”:碱基对；“amp”:氨苄西林抗性基因。

图4：蛋白纳米颗粒的透射电镜图。

重折叠并共组装重组表达蛋白后，将样本吸附到碳包被的网格上并用2％乙酸双氧铀负染色。

A)T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1:T81c-WRW-8RRVRA-T1BT*共组装比12:48，如“FLA-SAPN的设计”部分及实施例6中所述。标尺代表500nm。

B)T81c-8-D0-D1:T81c-8-Pf共组装比3:57，如实施例8中所述。标尺代表200nm。

C)PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori:PD52-2i88-PANDORA-Noro共组装比5:55，如实施例7中所述。标尺代表200nm。

D)DIM-D0-D1:DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept共组装比5:55，如实施例9中所述。标尺代表200nm。

图5：实施例1和5的构建体LONG-D2-D1-ori的SDS-PAGE。

该构建体的理论分子量为41.1kDa。

CL–澄清的裂解液；

FT–流通物；

1–pH8.0用10mM咪唑洗涤；

2–pH8.0用500mM NaH₂PO₄洗涤；

3–pH6.3洗涤；

4–pH 5.9洗涤；

5–pH 4.5洗涤；

Elu–250mM咪唑洗脱液，5μl和10μl样本用于凝胶。

图6：构建体LONG-D2-D1-ori的蛋白颗粒不同清晰度的透射电镜图

重折叠并共组装重组表达蛋白后，将纳米颗粒吸附到碳包被的网格上并用2％乙酸双氧铀负染色。

右上图、左上图、右下图和左下图的标尺分别代表1000nm、500nm、200nm和100nm。

图7：TLR5细胞途径的活化

A)Long-D2-D1-ori(实施例5)；

B)T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1:T81c-WRW-8RRVRA-T1BT*(12:48)(实施例6)；

C)PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori:PD52-2i88-PANDORA-Noro(5:55)(实施例7)；

上图:剂量-反应活性评估；

下图:EC50评估；

IMG-2205:鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(0.29ng/ml)，阳性对照。

X轴:纳米颗粒的浓度(ng/ml)；

Y轴:SEAP表达(ng/ml)或者％A＝％活性；

图8：C57Bl/6小鼠中免疫后，ELISA结合测定抗体滴度(实施例8[图A]和实施例9[图B]中所述)

A)

■单独的T81c-8-Pf，剂量为1μg；

◆单独的T81c-8-Pf，剂量为10μg；

X比率为3:57的T81c-8-D0-D1和T81c-8-Pf的共组装体，剂量为1μg；

▲比率为3:57的T81c-8-D0-D1和T81c-8-Pf的共组装体，剂量为10μg；

●比率为9:51的T81c-8-D0-D1和T81c-8-Pf的共组装体，剂量为1μg；

Ж比率为9:51的T81c-8-D0-D1和T81c-8-Pf的共组装体，剂量为10μg；

X轴:血清的稀释因子；

Y轴:OD＝光密度；

ELISA板使用用于免疫的完全免疫原包被；

B)

●比率为5:55的DIM-D0-D1和DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept的共组装体，剂量为10μg；

■耦合到载体KLH的尼古丁，剂量为10μg；

X轴:血清的稀释因子；

Y轴:OD＝光密度；

ELISA板仅用耦合到不相关载体的尼古丁包被。

图9：Nic-DEDDL构建体的蛋白纳米颗粒的透射电镜图。

标尺代表1000nm。

图10：抗体生成

三只C57Bl/6小鼠的组通过皮下注射10μg Nic-DEDDL(实施例10)进行免疫，或者皮下注射10μg Nic-KLH(耦合到载体KLH的尼古丁)作为阳性对照，每周独立注射3次。通过ELISA测定第0天(即第一次注射前)的抗体滴度以及每次注射后一周的抗体滴度。

d＝第一次免疫后的天数；A＝抗体滴度(log₂刻度)。

具体实施方式

本发明提供了不同形式的鞭毛蛋白，其包含以任一方向纳入纳米颗粒中的鞭毛蛋白的不同结构域。某些实施方案中，鞭毛蛋白连接到纳米颗粒，其N-末端和C-末端靠近纳米颗粒的表面(图1)；另一些实施方案中，鞭毛蛋白的远端部分靠近纳米颗粒表面，因此将鞭毛蛋白以相反方向呈递到纳米颗粒上(图2)。

由于炎性免疫应答是佐剂尤其是TLR结合佐剂的主要问题之一，因此减低其诱导炎性应答的潜能是有利的。已知鞭毛蛋白的C-末端部分作为D0结构域的部分，包含可与炎性体相互作用的肽序列，因此负责鞭毛蛋白的炎性反应。因此，设计了缺失可激活炎性体的D0结构域的C-末端部分的鞭毛蛋白构建体(图2)。

本发明涉及自组装蛋白纳米颗粒，其由多个式(Ia)或式(Ib)结构单元的聚集物组成。

X–ND1–L1–ND2–FLA (Ia)或者FLA–ND1–L1–ND2–X (Ib)，

由包含蛋白低聚化结构域ND1、接头L1、蛋白低聚化结构域ND2、鞭毛蛋白衍生物FLA以及其它取代基X的连续链组成，其中

ND1是形成m个ND1亚基的低聚体(ND1)_m的蛋白质，

ND2是形成n个ND2亚基的低聚体(ND2)_n的蛋白质，

L1代表键或者是短的柔性接头，

X可不存在或者是含有1到1000个氨基酸的肽或蛋白质序列，

可任选地与多个式(II)的结构单元共组装，

Y–ND3–L2–ND4–Z (II)，

ND3是形成y个ND3亚基的低聚体(ND3)_y的蛋白质，

ND4是形成z个ND4亚基的低聚体(ND4)_z的蛋白质，

L2代表键或者是短的柔性接头，其可与L1不同或者相同，并且

Y和Z，相互独立地，可不存在或者是包含1到1000个氨基酸的1到100个氨基酸的肽序列。

本发明的蛋白纳米颗粒以非常巧妙的方式将佐剂分子与目标免疫原共定位，因此鞭毛蛋白的佐剂属性可与所需免疫应答所针对的疫苗抗原共定位。通过将形成纳米颗粒的两种蛋白链，一种具有鞭毛蛋白或者式(Ia)或(Ib)分子中的鞭毛蛋白衍生物(FLA)，另一种是纳入目标抗原(Y或Z)的式(II)，共组装形成单个蛋白纳米颗粒，佐剂和抗原可完美地共定位。因此，这些实施方案中，佐剂效应与纳米颗粒重复的抗原展示的优点共定位。此外，佐剂效应的贡献可通过使用不同的、式(Ia)或(Ib)的含鞭毛蛋白蛋白链与式(II)的含抗原蛋白链共组装比来增加或减低。可调整佐剂效应以在最佳的抗原性和最低的副作用之间优化。

如上所述，FLA是鞭毛蛋白或者缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列但至少包含TLR5结合结构域D1的鞭毛蛋白衍生物。缺失结构域可以被1到20个氨基酸的柔性接头片段取代，以连接剩余鞭毛蛋白序列的两个末端，或者可被完全折叠的蛋白质抗原取代。柔性接头区域可包含适合的附着位点用于共价耦合抗原。

含鞭毛蛋白的纳米颗粒自身(即不与含抗原的、形成纳米颗粒的蛋白链共组装)可用作给定疫苗中的常规佐剂，简单地加入任意形式的抗原呈递中。

作为另外的选项，可将抗原作为取代基X加工到仅含鞭毛蛋白的、形成纳米颗粒的式(Ia)或(Ib)的蛋白链上，即，不再与含抗原的、形成纳米颗粒的式(II)蛋白链共组装，以最大化佐剂效应和重复抗原展示效应的益处，使用抗原X作为B-细胞表位，并且鞭毛蛋白衍生物FLA作为佐剂。

由于鞭毛蛋白结构体系中蛋白链在通过D0、D1、D2和D3所有结构域并且再返回形成环，一种或多种结构域可从所述序列中移除，通过再连接两个末端成连续的肽链，形成鞭毛蛋白衍生物FLA。因此，缺失鞭毛蛋白D2和D3结构域的鞭毛蛋白衍生物构建体可很容易加工获得，简单地通过在D1和D2结构域界面处连接蛋白链获得。类似地，顶部结构域(仅D3或者D2和D3一起)可被蛋白质抗原取代，只要该蛋白抗原的N-末端和C-末端可被连接到D1和D2之间界面的N-末端和C-末端。顶部结构域D2和D3还可被具有适合的残基的肽序列取代，以共价耦合抗原分子。这样的肽环的一个实例是序列KYKDGDKGDDK(SEQ ID NO：1)，其包含4个赖氨酸残基用于共价耦合到其第一个氨基。纳入赖氨酸残基的这样的亲水环提供耦合位点用于将配体分子共价附着到赖氨酸侧链的第一个氨基酸。用精氨酸取代鞭毛蛋白序列中的赖氨酸残基可移除所述分子其他部分中不需要的耦合位点。这两种修饰产生的鞭毛蛋白衍生物序列如下：

MAQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR (SEQ ID NO：28)

本发明的另一个目标是将鞭毛蛋白作为二聚体加工到纳米颗粒上。因此，与同样是二聚体的TLR5的相互作用是优选的。通过使用二聚体蛋白低聚化结构域作为ND1(m等于2)或者ND2(n等于2)可容易地实现，并且可将其用作鞭毛蛋白衍生物FLA的附着位点，分别如式(Ib)或(Ia)所示。这将使得鞭毛蛋白衍生物成为二聚体形式，其更容易与TLR5相互作用(图2)。优选地，该实施方案中，鞭毛蛋白所附着的式(Ia)或(Ib)结构单元中的二聚体低聚化结构域(式(Ia)中的ND2或式(Ib)中的ND1)与式(II)结构单元中相应的低聚化结构域(与式(Ia)的链共组装时的ND4或者与式(Ib)的链共组装时的ND3)不同。优选地，式(Ia)或(Ib)结构单元中的二聚体低聚化结构域比式(II)结构单元中相应的低聚化结构域(ND3或ND4)具有更强的相互作用，即二聚体形成潜能。这可保证在与式(Ia)或(Ib)和式(II)的结构单元共组装的纳米颗粒中，鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生物FLA总能够在相邻的式(Ia)或(Ib)结构单元上形成二聚体，并且作为单个单体分布在整个共组装的纳米颗粒中。

此外，通过将翻转方向的鞭毛蛋白加工(优选地作为二聚体)到纳米颗粒上，可优化与TLR5二聚体的相互作用(图2)。这样的纳米颗粒是优选的。例如，可通过在D0和D1结构域之间的界面处将所述蛋白链与肽序列例如KAKKKDGKDDKDS(SEQ ID NO：29，图2中的“T”)连接而创建D1-D2鞭毛蛋白构建体，以此缺失D0结构域并完全移除D3结构域而不需要重新连接蛋白链。因此，所产生的鞭毛蛋白分子将具有D2结构域中的N-末端和C-末端，以产生D2-D1序列，如

SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(SEQ ID NO：30)

可使用具有1到20个氨基酸的类似的柔性接头序列(图2中的“T”)，例如GS或GKDGKDGS(SEQ ID NO：31)或者GKDGKDGKDGKDGS(SEQ ID NO：32)。优选地，接头序列主要包含带电的或者极性氨基酸，其间散步有甘氨酸残基以产生接头柔性。为避免该D2-D1构建体上不希望的耦合位点，使用精氨酸残基取代赖氨酸残基。

然后，鞭毛蛋白衍生物FLA必须连接到鞭毛蛋白D2部分的二聚体低聚化结构域ND1或ND2。由这样的结构单元(单独的或者与相应的式(II)结构单元共组装的)制备纳米颗粒，可形成具有翻转方向鞭毛蛋白衍生物的优选的纳米颗粒。

单体结构单元

肽(或者多肽或蛋白质)是通过酰胺键共价连接的氨基酸链或氨基酸序列。肽可以是天然的、改性天然的、部分合成的或者完全合成的。改性天然的、部分合成的或者完全合成的可理解为意指自然条件下不会产生的。术语氨基酸包括选自20种必需的天然α–L-氨基酸的天然存在的氨基酸，合成氨基酸例如α–D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸等，以及天然存在的氨基酸经过了某些方式改性以改变某些属性例如带电性，例如磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸或者其他修饰例如正辛酰基丝氨酸等。在氨基酸衍生物中，形成酰胺键的氨基是烷基化的，或者侧链氨基、羟基或含硫官能团被烷基化或酰化，或者侧链羧基官能团被酰胺化或酯化。优选地，本发明的蛋白质包含选自20种必需的天然α–L-氨基酸的氨基酸。

粗略估计，可基于其大小将肽与蛋白质加以区别，即约50个氨基酸或更少的链称为肽，而更长的链称为蛋白质。二肽是最短的肽，由2个氨基酸通过单个肽键连接而成。同理，三肽由3个氨基酸组成，四肽由4个氨基酸组成等。多肽是长的、连续、不分支的肽链。文献中，可区分肽与蛋白质的尺寸边界不十分明确。有时，长的“肽”例如β淀粉样蛋白被看作是蛋白质，反之有时较小的蛋白质例如胰岛素被称作肽。

短的柔性接头链L1或L2选自任选取代的碳原子、任选取代的氮原子、氧原子、硫原子及其组合，优选地，链中含1到60个原子，尤其优选含1到20个原子。所述短的柔性接头链是例如聚亚乙基氧基链、柔性糖链或者优选柔性肽链，例如由1到20个氨基酸组成的肽链，特别是由1到6个氨基酸组成含有1个或数个氨基酸甘氨酸的肽链。最优选的接头具有高甘氨酸含量，由1到6个氨基酸组成。

本发明的低聚化结构域优选是卷曲螺旋。卷曲螺旋是具有连续模式的主要为疏水性的残基间隔开3和4个残基的蛋白质序列，其组装形成多聚螺旋束，下文将有更详细描述。

非卷曲螺旋的低聚化结构域是例如噬菌体T4蛋白fibritin的三聚结构域(折叠子)(Tao,Y.et al.,Structure 1997,5:789-798)。

低聚化结构域ND1、ND2、ND3和/或ND4以及接头L1和/或L2优选地可进一步被靶向实体或取代基取代，以增强纳米颗粒的佐剂性质，例如免疫刺激核酸，优选含脱氧肌苷的低聚脱氧核苷酸、含脱氧尿苷的低聚脱氧核苷酸、含CG基序、CpG的低聚脱氧核苷酸、咪喹莫德、瑞喹莫德、嘎德莫特、含肌苷和胞苷的核酸分子等。其他增强纳米颗粒佐剂性质的取代基是抗微生物肽，例如阳离子肽，其是一类免疫刺激剂，能够促进和/或提高适应性免疫应答的带正电荷分子。具有免疫增强性质的肽的一个实例是带正电荷的人工抗微生物肽KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:2)，其可在加强免疫接种后诱导有效的蛋白特异性2型驱动适应性免疫。可作为取代基的一个具体的靶向实体是ER-靶向信号，即，可将蛋白质或肽引导至内质网(ER)的信号肽。

可任选的取代基，例如上述可任选的取代基，优选连接到靠近低聚化结构域ND1、ND2、ND3和/或ND4末端并与结合L1或L2的末端相对的适合的氨基酸。蛋白纳米颗粒自组装后，所述取代基可呈递在纳米颗粒的表面。取代基可连接到连续蛋白链的末端，或者可连接到靠近ND1、ND2、ND3和/或ND4末端并与结合L1或L2的末端相对的氨基酸的侧链官能团。

一个最优选的实施方案中，取代基是肽或者蛋白质取代基，并且称作X、Y和/或Z，代表简单的蛋白链延伸，例如在ND1的N-末端的X–ND1–L1–ND2–FLA，或在其两个末端的Y–ND3–L2–ND4–Z，以产生组合的单个连续蛋白质序列，其可在重组蛋白表达系统中表达成单个分子。

其他实施方案中，肽或非肽取代基可连接到靠近ND1、ND2、ND3和/或ND4末端并与结合L1或L2的末端相对的氨基酸的侧链官能团，或者如果X、Y和/或Z是肽或蛋白质其优选地连接到X、Y和/或Z延伸中氨基酸的侧链官能团。

还可将取代基附着到接头L1或L2。此情况下，自组装的蛋白纳米颗粒重折叠后，取代基将定位于自组装蛋白纳米颗粒的内腔中。

形成低聚体的倾向意指所述蛋白质可依据条件形成低聚体，例如，在变性条件下它们是是单体，但在生理条件下，它们可形成例如二聚体、三聚体、四聚体或者五聚体。预定条件下，其采用单一低聚状态，这是纳米颗粒形成所需要的。但是，条件改变后其低聚状态可改变，例如盐浓度提高后可由二聚体变为三聚体(Burkhard P.et al.,Protein Science2000,9:2294-2301)或者pH降低后可由五聚体变为单体。

式(Ia)、(Ib)或(II)的结构单元构造与病毒衣壳蛋白明显不同。病毒衣壳由单一蛋白组成，其形成60的低聚体或其倍数，例如乙型肝炎病毒颗粒(EP 1 262 555、EP 0 201416)，或者由超过一种蛋白组成，其自组装形成病毒衣壳结构，依据病毒的类型其也可采取不同于二十面体的几何形状(Fender P.et al.,Nature Biotechnology 1997,15:52-56)。本发明的自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)也可显著不同于病毒类颗粒，由于(a)其结构不同于病毒衣壳蛋白，且(b)纳米颗粒中间的腔体太小而无法容纳完整病毒基因组的DNA/RNA。

蛋白低聚化结构域是公知的(Burkhard P.et al.,Trends Cell Biol 2001,11:82-88)。RCSB-PDB蛋白结构数据库(http://www.rcsb.org/)包含蛋白质的原子结构。该网站提供可从原子结构中鉴定蛋白质低聚体的工具。使用高级搜索模式(http://www.rsb.org/pdb/search/advSearch.do)，在“Protein Stoichiometry”中限定“A5”检索五聚体蛋白低聚化结构域。使用高级搜索模式在“SCOP classification Browser”中限定“Coiled coil proteins”检索卷曲螺旋蛋白低聚化结构域。结合这两种搜索，可在该数据库中检索所有的五聚体卷曲螺旋蛋白质结构。同样的，可分别使用“A2”、“A3”或者“A4”作为限定词，检索二聚体、三聚体或者四聚体卷曲螺旋结构。本发明中，低聚化结构域ND1、ND2、ND3和ND4是优选的卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋是具有连续模式的主要为疏水性的残基间隔开3和4个残基的蛋白质序列，通常为7个氨基酸的序列(7价重复)或11个氨基酸的序列(undecad重复)，其组装(折叠)形成多聚螺旋束。具有包含不规则分布的3和4个残基间隔的序列的卷曲螺旋也是可能的。疏水残基具体地是疏水性氨基酸Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。主要为疏水性意指至少50％的残基必须选自所述疏水性氨基酸。

例如，在式(Ia)、(Ib)或(II)的优选的单体结构单元中，ND1、ND2、ND3和ND4是具有任意下式的蛋白质

[aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)]_x (IIIa)，

[aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)]_x (IIIb)，

[aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)]_x (IIIc)，

[aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)]_x (IIId)，

[aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)]_x (IIIe)，

[aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)]_x (IIIf)，

[aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)]_x (IIIg)，

其中，aa代表氨基酸或其衍生物，aa(a)、aa(b)、aa(c)、aa(d)、aa(e)、aa(f)以及aa(g)是相同或者不同的氨基酸或其衍生物，优选地aa(a)和aa(d)是相同或者不同的疏水性氨基酸或其衍生物，并且x是2和20之间优选3和10之间的数值。

七价体是式aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)(IIIa)的七肽或式(IIIb)到(IIIg)的任意变换。

优选地是式(Ia)、(Ib)或(II)的单体结构单元，其中所有蛋白质低聚化结构域ND1、ND2、ND3和ND4是

(1)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中x等于3，并且aa(a)和aa(d)选自20种天然α-L-氨基酸，例如表1中该6种氨基酸的赋值总和至少是14，且所述蛋白质包含最多17种其他的七价体；或者

(2)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中x等于3，并且aa(a)和aa(d)选自20种天然α-L-氨基酸，例如表1中该6种氨基酸的赋值总和至少是12，条件是氨基酸aa(a)为带电荷氨基酸，能够与相邻七价体的氨基酸aa(d)或aa(g)形成螺旋间盐桥，氨基酸aa(d)为带电荷氨基酸，能够与相邻七价体的氨基酸aa(a)或aa(e)形成螺旋间盐桥，并且所述蛋白质包含最多2种其他的七价体。能够与相邻的七价体形成螺旋间盐桥的带电荷氨基酸是例如Asp或Glu，如果其他氨基酸是Lys、Arg或His，反之亦然。

表1：用于确定优选方案的氨基酸赋值

另外优选的是式(Ia)、(Ib)或(II)的单体结构单元，其中一种或多种蛋白质低聚化结构域ND1、ND2、ND3或ND4选自以下优选的蛋白质：

(11)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中

aa(a)选自Val、Ile、Leu和Met，及其衍生物，且

aa(d)选自Leu、Met、Val和Ile,及其衍生物。

(12)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中一个aa(a)是Asn且其他aa(a)选自Asn、Ile和Leu,并且aa(d)是Leu。这样的蛋白质通常是二聚化结构域。

(13)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中aa(a)和aa(d)都是Leu或者都是Ile。这样的蛋白质通常是三聚化结构域。

(14)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中aa(a)和aa(d)都是Trp。这样的蛋白质通常是五聚化结构域。

(15)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中aa(a)和aa(d)都是Phe。这样的蛋白质通常是四聚化结构域。

(16)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中aa(a)和aa(d)都是Trp或者Phe。这样的蛋白质通常是五聚化结构域。

(17)式(IIIa)到(IIIg)任意的蛋白质，其中aa(a)为Leu或Ile,且其中一个aa(d)是Gln，并且其他aa(d)选自Gln、Leu和Met。这样的蛋白质可能是五聚化结构域。

其他优选的蛋白质是上述蛋白质(1)、(2)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)和(17)，并且其中进一步地

(21)至少一个aa(g)选自Asp和Glu，并且后续七价体中的aa(e)是Lys、Arg或者His；和/或

(22)至少一个aa(g)选自Lys、Arg和His,并且后续七价体中的aa(e)是Asp或Glu,和/或

(23)至少一个aa(a到g)选自Lys、Arg和His,并且在序列中相隔3或4个氨基酸的aa(a到g)是Asp或Glu。aa(a到g)的氨基酸对是例如aa(b)和aa(e)或aa(f)。

卷曲螺旋预测程序例如PCOILS(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils；Gruber M.et al.,J.Struct.Biol.2006,155(2):140-5)或MULTICOIL(http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi)能够预测可形成卷曲螺旋的蛋白质序列。因此，式(Ia)、(Ib)或(II)的单体结构单元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含有两个七价体重复长度的至少一个序列的蛋白质，经卷曲螺旋预测程序PCOILS预测其以对于所有的氨基酸而言超过0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一个窗口大小。

式(Ia)、(Ib)或(II)一个更优选的的单体结构单元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含有三个七价体重复长度的至少一个序列的蛋白质，经卷曲螺旋预测程序PCOILS预测其以对于所有的氨基酸而言超过0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一个窗口大小。

式(Ia)、(Ib)或(II)另一个更优选的的单体结构单元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含有两个七价体重复长度的至少两个分离的序列的蛋白质，经卷曲螺旋预测程序PCOILS预测其以对于所有的氨基酸而言超过0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一个窗口大小。

已知卷曲螺旋序列可从数据库例如RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org)中检索。

最优选卷曲螺旋序列，并且单体结构单元在实施例中描述。

另一个优选的实施方案中，一个低聚化结构域ND1、ND2、ND3或ND4是噬菌体T4蛋白fibritin的三聚结构域(折叠子)(Tao,Y.et al.,Structure 1997,5:789-798)或其衍生物。所述三聚结构域序列为GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:3)。对该结构域进行小的修饰是可行的。

自组装蛋白纳米颗粒:LCM单元

自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)由式(Ia)、(Ib)的单体结构单元或者式(Ia)或(Ib)的单体结构单元与式(II)的单体结构单元的混合物形成。如果这些结构单元组装，它们将形成所谓的“LCM单元”。将组装成这样的LCM单元的单体结构单元的数量可通过最小公倍数(LCM)定义。因此，如果例如单体结构单元的低聚化结构域形成五聚体(ND1)₅(m＝5)和二聚体(ND2)₂(n＝2)，那么将由10个单体形成LCM单元。如果接头片段L具有适合的长度，那么该LCM单元可组装成球形蛋白纳米颗粒。

自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)可由仅一种或者超过一种LCM单元形成(表2)。这种SAPN代表拓扑封闭结构。

正多面体

有5种正多面体，四面体、立方体、八面体、十二面体和二十面体。他们具有不同的内部旋转对称元素。四面体具有一个2-折叠轴线和2个3-折叠轴线，立方体和八面体具有2-折叠、3-折叠和4-折叠旋转对称轴，十二面体和二十面体具有2-折叠、3-折叠和5-折叠旋转对称轴。立方体中，这些轴的空间定向与八面体完全一致，十二面体和二十面体中这些轴的空间定向也是相互之间完全一致。因此，为了本发明的SAPN的目的，十二面体和二十面体可以认为是一致的。十二面体/二十面体由60个一致的三维结构单元组成(表2)。这些结构单元是多面体的不对称单元(AU)。他们是椎体，并且椎体边缘对应于旋转对称轴，因此这些AU的边缘具有2-折叠、3-折叠和5-折叠对称元素。如果这些对称元素是由蛋白低聚化结构域产生的，则所述AU由上述单体结构单元构成。将两个低聚化结构域ND1和ND2或者ND3和ND4沿AU的两条对称轴排列是足够的。如果这两个低聚化结构域形成稳定的低聚体，则沿第三条对称轴的对称界面将自动产生，并且可通过优化沿该界面的相互作用例如疏水相互作用、亲水相互作用或离子相互作用或者共价键例如二硫键来使其稳定。

表2：正多面体形成中低聚化状态可能的组合

组装成为具有正多面体对称性的自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)

为形成具有规则几何形状(十二面体、二十面体、八面体、立方体)的自组装蛋白纳米颗粒(SAPN)，需要多于一个LCM单元。例如，为由含三聚体和五聚体低聚化结构域的单体形成二十面体，需要4个LCM单元，每种由15个单体结构单元组成，也就是具有规则几何形状的蛋白纳米颗粒将由60个单体结构单元组成。所需的两种低聚化结构域的低聚化状态的组合以及形成两种可能的多面体的LCM单元的数量见表2所列。

LCM单元是否将进一步组装形成由多于一个LCM单元组成的正多面体依赖于两种低聚化结构域ND1和ND2或者ND3和ND4相对于彼此的几何排列，尤其是依赖于两种低聚化结构域的旋转对称轴之间的角度。其控制主要通过i)纳米颗粒中相邻结构域之间的相互作用，ii)接头片段L的长度，iii)个体低聚化结构域的形状。与正多面体中的排列相比，LCM单元中的该角度较大。并且，与正多面体相反，单体结构单元中的角度并不一致。如果将正多面体的角度限定为较小值(通过两种低聚化结构域之间的有吸引力的疏水、亲水或离子相互作用或者共价二硫桥)并且接头L足够短，则每个包含确定数量的单体结构单元的给定数量的LCM单元将进一步退火形成正多面体(表2)，或者包装更多的单体结构单元以形成多面体的缺少精确内部对称性的纳米颗粒。

如果两种低聚化结构域之间的角度足够小(甚至小于具有二十面体对称的正多面体中的角度)，则大量(数百条)蛋白链可组装成蛋白纳米颗粒。该设计中，SAPN的分子量可相当于60条蛋白链的数倍，接近于准等价理论或病毒衣壳贴砖理论所描述的“全部五聚体”病毒结构。

优选地，可包含在含鞭毛蛋白纳米颗粒中的抗原可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位，并且选自：(a)适于诱导针对癌细胞的免疫应答的蛋白质或肽；(b)适于诱导针对感染性疾病的免疫应答的蛋白质、肽或碳水化合物；(c)适于诱导针对变应原的免疫应答的蛋白质或肽；(d)适于诱导可用于治疗人疾病的免疫应答的蛋白质或者肽激素；和(e)适于诱导可治疗成瘾或其他病症的免疫应答的半抗原分子。包含所述蛋白质、其肽段、肽、碳水化合物或者半抗原的蛋白纳米颗粒可适于诱导人或者农场动物及宠物体内的免疫应答。

另一方面，本发明涉及上述所定义的式(Ia)或(Ib)的单体结构单元。

另一方面，本发明涉及包含本文所述的蛋白纳米颗粒的组合物。所述组合物非常适合作为疫苗。优选的疫苗组合物包括水性缓冲溶液中的蛋白纳米颗粒，并且还可包括例如糖衍生的赋形剂(例如甘油、海藻糖、蔗糖等)或者氨基酸衍生的赋形剂(例如精氨酸、脯氨酸、谷氨酸等)或者阴离子、阳离子、非离子或两性离子去垢剂(例如胆酸盐、脱氧胆酸盐、吐温等)或任意类型的盐(例如NaCl、MgCl₂等)用于调节溶液的离子强度。

另一方面，本发明涉及预防接种人或者非人动物的方法，包括给予需要所述疫苗接种的受试者以有效量的本文所述蛋白纳米颗粒。

FLA-SAPN(含鞭毛蛋白的自组装蛋白纳米颗粒)的设计

本发明的FLA-SAPN的具体实例包括下述构建体“FLA-SAPN-1a”和“FLA-SAPN-2”

T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1(FLJB_SALTY)(FLA-SAPN-1a)，符合式(Ia)

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:4)

T81c-WRW-8RRVRA-T1BT*(FLA-SAPN-2),符合式(II)

MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(SEQ ID NO:5)

所述构建体由以下局部结构组成：

为方便纯化，FLA-SAPN-1a起始于式(Ia)或(Ib)中所定义的序列X：

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGS (SEQ ID NO:6)

其包含His-tag用于镍亲和纯化并且在DNA水平包含限制性位点用于进一步亚克隆(NcoI、NheI、BamHI)。

对于ND1，选择五聚结构域(m＝5)。具体的五聚化卷曲螺旋是色氨酸拉链五聚化结构域的新修饰(Liu J.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 2004；101(46):16156-61,pdb-entry 1T8Z)。

初始色氨酸拉链五聚化结构域序列如下：

SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT(SEQ ID NO:12)。

用于FLA-SAPN-1a的五聚化结构域的修饰的卷曲螺旋序列始于位点13、终于位点49，并且在其C-末端包含少量的序列变异(RALWM取代NQRWD)但保留色氨酸残基的七价重复模式，如起始序列(SEQ ID NO:12)中的。

13-WQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWM-49(SEQ ID NO:7)。

该序列然后通过2个甘氨酸残基的短接头L1(GG)延伸，然后连接到下述序列的三聚化结构域ND2，其为非常稳定的卷曲螺旋三聚体：

RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG(SEQ ID NO:8)

已发现，即使在SDS-PAGE的完全变性条件下也可形成三聚体(图5)。其还包含泛DR结合HTL表位串RFVAAWTLRVRA，其是具有优化的三聚体卷曲螺旋偏好的PADRE序列的衍生物。

FLA-SAPN-1a中，式1a的“FLA”部分由鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的D0和D1结构域(如专利US8,420,102所述)组成，具有如下序列：

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:9)。

然后，该设计得到如下序列，可用于蛋白表达、纯化和生物物理分析。

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:4)。

FLA-SAPN-1a单体的模型见图1C。

相应的构建体“FLA-SAPN-2”如下：

为方便纯化，FLA-SAPN-2起始于式(II)中所定义的序列Y：

MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGS(SEQ ID NO:10)

其包含His-tag可用于镍亲和纯化、来自疟原虫CS-蛋白的T-细胞表位序列T1BT*(Calvo-Calle J.M.,Infection and immunity 2006:6929–6939)

EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(SEQ ID NO:13)

其中一个半胱氨酸被丝氨酸取代，并且在DNA水平包含限制性位点用于进一步亚克隆(NcoI、NheI、BamHI)，因此与FLA-SAPN-1a的“X”有一些区别。

FLA-SAPN-2中的ND3与FLA-SAPN-1a中的ND1完全一致，以确保正确的共组装。

13-WQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWM-49(SEQ ID NO:7)。

该序列然后通过2个甘氨酸残基的短接头L2(GG)延伸，这也与FLA-SAPN-1a一致。

然后，FLA-SAPN-2中的接头与以下序列的三聚化结构域ND4连接：

RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG

(SEQ ID NO:8)

其与FLA-SAPN-1a中的序列完全一致，因此，纳米颗粒FLA-SAPN-1a和FLA-SAPN-2的核心ND1-L1-ND2和ND3-L2-ND4完全一致，并确保两种蛋白链重折叠后正确的共组装。

FLA-SAPN-2中，式(II)的“Z”部分由疟原虫环子孢子蛋白(CSP)的重复区组成，其包含3个重复的(NANP)以及在天然CS-蛋白序列中发生的它的某些修饰(DPNANPNVDPNANPNV,SEQ ID NO:14)，并且是可产生免疫应答的B-细胞表位。其通过序列SG连接到颗粒：

SGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(SEQ ID NO:11)

MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(SEQ ID NO:5)。

FLA-SAPN-2单体的模型见图1C。

由FLA-SAPN-1a和FLA-SAPN-2以1:59比率共组装的纳米颗粒的模型见图1C，假设T＝1二十面体对称。

FLA-SAPN-1a和FLA-SAPN-2蛋白以48:12比率共组装的EM图见图4。

实施例

实施例1—克隆

编码纳米颗粒构建体的DNA是通过标准分子生物学操作制备的。含有编码LONG-D2-D1-ori蛋白序列的DNA的质粒是通过将图3的基本SAPN表达构建体克隆进入NcoI/EcoRI限制性位点构建的。所述LONG-D2-D1-ori蛋白序列如下：

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGSSARLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAV(SEQID NO:15)

此构建不包括两种不同构建体的混合/共组装步骤。所述疫苗免疫原可通过将疫苗表位例如尼古丁共价附着到已经纳入鞭毛蛋白衍生物的载体产生，优选地附着到赖氨酸残基。

该构建体由五聚化卷曲螺旋色氨酸拉链(ND1)通过2个甘氨酸残基(GG)连接到三聚化从头设计的卷曲螺旋(ND2)构成，其包含泛DR结合CD4表位串ERFVAAWTLRVRAL(SEQ IDNO:16)。其N-末端包含His-tag及凝血酶切割位点(X)。该X–ND1–L1–ND2核心结构见上述。在C-末端，鞭毛蛋白构建体(FLA)由沙门菌鞭毛蛋白的D1和D2结构域组成，其来自有pdb-code3V47(RCSB蛋白质数据库)附着的结构。D1和D2结构域跨越部分的348到447残基通过单个甘氨酸残基以相反方向连接到D1和D2结构域再跨越部分的24到214残基。该设计将鞭毛蛋白D1和D2分子附着到纳米颗粒以将D1结构域展示在纳米颗粒的外表面，并且将TLR5结合位点暴露至纳米颗粒的表面(图2a)。与图2不同，从头设计的卷曲螺旋ND2是三聚化卷曲螺旋。

实施例2—表达

将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞，所述细胞在含氨苄西林的LB培养基中37℃培养。使用异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。诱导后4小时，从37℃取出细胞，并通过4,000×g离心15min收获细胞。将细胞沉淀物储存在-20℃。使细胞沉淀物在冰上解冻，并悬浮于由9M尿素、100mM NaH₂PO₄、10mM Tris pH 8、20mM咪唑和0.2mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)组成的裂解缓冲液中。

可选择地，其他细胞系也可用于表达，例如KRX细胞。KRX细胞中，通过KRX细胞的早期自诱导方法，使用含氨苄西林(100μg/mL)和葡萄糖(0.4％)的O/N预培养基在37℃培养可进行表达。将O/N预培养物以1:100稀释入含氨苄西林(100μg/mL)、葡萄糖(0.05％)和鼠李糖(0.1％)的表达培养基中在25℃培养24小时。通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达水平，见图5。所述构建体即使在SDS-PAGE变性条件下也可形成单体、三聚体和四聚体。

实施例3—纯化

通过超声裂解细胞，并通过30,500×g离心45min使裂解液澄清。将澄清的裂解液与Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen,Valencia,CA,USA)共孵育至少1小时。使用裂解缓冲液洗柱，然后使用含9M尿素、500mM NaH₂PO₄、10mM Tris pH 8、20mM咪唑和0.2mM TCEP的缓冲液洗柱。使用pH梯度：9M尿素、100mM NaH₂PO₄、20mM柠檬酸盐、20mM咪唑和0.2mM TCEP洗脱蛋白质。然后在pH 6.3、5.9和4.5条件下进行随后的洗涤。pH梯度后，使用增加咪唑强度的裂解缓冲液的梯度进一步洗脱蛋白质。通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达水平，见图5。

实施例4—重折叠

为重折叠，将蛋白质再缓冲到如下条件：9M尿素、20mM Tris pH 8.5、50mM NaCl、5％丙三醇、2mM EDTA。为第一次筛选的快速重折叠，将浓度为1.8mg/ml的4μl溶液加入到缓冲溶液中，如表3所示，至终浓度0.05mg/ml。然后，通过负染透射电子显微镜在不同解析度分析所得溶液。

表3:用于重折叠LONG-D2-D1(第一次筛选)的缓冲液

MES＝2-吗啉乙磺酸

HEPES＝2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸

TRIS＝2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇

如果需要进一步筛选进行优化，重折叠条件可在较小的pH和离子强度取样范围实施。此外，可加入赋形剂例如海藻糖、蔗糖、精氨酸、脯氨酸等，或者如果需要可加入去垢剂例如胆酸盐、脱氧胆酸盐、吐温-80等。LONG-D2-D1-ori不需要另外的优化重折叠，重折叠条件是pH 8.5、50mM NaCl、20mM Tris、5％甘油。重折叠后不同解析度下LONG-D2-D1-ori的EM图示出了精密的纳米颗粒结构(图6)。

实施例5—TLR5途径活化测定I

使用TLR5/SEA Porter HEK 293细胞(IMGENEX,目录号：IML-105)测定LONG-D2-D1-ori对Toll-样受体5(TLR5)的激动剂活性，并评价了活性LONG-D2-D1-ori的EC₅₀。将IML-105细胞系以5×10⁴个细胞/孔铺板至96-孔板中16小时。使用多种浓度(0.01和1000ng/ml之间)的每种测试样本、阳性对照(IMGENEX鞭毛蛋白,目录号：IMG-2205)或者介质对照(每种相应的缓冲液)一式两份地处理细胞24小时。然后将每孔中的细胞培养基按1:2稀释并转移到96-孔微孔滴定板(一式两份)，其中系列稀释的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)标准品也一式两份地加入。将板在65℃孵育30min以失活任意内源性碱性磷酸酶。然后向每孔中加入磷酸酶底物，并在室温孵育30min。将所述平板在405nm下读数测定，得到剂量-反应活性评估和EC₅₀评估(图7A)。

TLR5的激动剂活性有一定的提高，计算EC₅₀值为12.59ng/ml，而来自鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白阳性对照的计算EC₅₀值为0.29ng/ml。

实施例6—TLR5途径活化测定II

式(Ia)的化合物T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1(FLJB_SALTY):

式(II)的化合物T81c-WRW-8RRVRA-T1BT*(FLA-SAPN-2):

这两条共组装的链详述见上文。ND1–L1–ND2的核心结构与式(Ia)和(II)中的一致，即与ND3–L2–ND4一致，也与实施例1中的一致。链1(式Ia)中，FLA部分由鞭毛蛋白的D0和D1结构域组成，但是来自与实施例1中不同的链。链2中的取代基Y和Z是T1BT*T-细胞表位和来自疟原虫CS蛋白NANP重复区的28个残基长度的序列，作为B细胞表位。

所述两条链的克隆、表达、纯化和重折叠基本上按照实施例1、2、3和4中所述的方法。这些共组装纳米颗粒的重折叠条件是pH 7.5、50mM NaCl、20mM HEPES、5％甘油。共组装纳米颗粒的EM图见图4A所示。

TLR5激动剂的剂量-反应活性评估以及EC₅₀评估依据实施例5中所述方法实施。TLR5激动剂活性非常高，其计算EC₅₀值仅为0.0901ng/ml，而来自鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白阳性对照的计算EC₅₀值为0.29ng/ml(图7B)。因此，这些纳米颗粒可诱导非常强的TLR5激活，大约为天然鞭毛蛋白的3倍，虽然含鞭毛蛋白的链存在的摩尔比仅为12:48。剂量-反应曲线呈现为钟型曲线，因此鞭毛蛋白浓度较高时免疫应答下降。优选的浓度是大约50ng/ml。

实施例7—TLR5途径活化测定III

式(Ia)的化合物PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori:

MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSSARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(SEQ ID NO:17)

式(II)的化合物PD52-2i88-PANDORA-Noro:

MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTAS(SEQ ID NO:18)

这两条共组装链PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori和PD52-2i88-PANDORA-Noro的核心结构与式(Ia)和(II)中的一致，即ND1–L1–ND2与ND3–L2–ND4的核心结构一致。PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori(式Ia)中，FLA部分由鞭毛蛋白的D2和D1结构域组成。将低聚化结构域ND2(或ND4,分别地)设计形成二聚化卷曲螺旋。这是重要的，因为B-细胞表位(Z)以及鞭毛蛋白(FLA)形式都是二聚体蛋白质。共组装比率为5:55。

PD52-2i88-PANDORA-Noro(式II)中的取代基Y和Z分别是His-tag和通过GSGS接头连接到ND4的来自诺如病毒P-蛋白的298个残基长度的序列。该序列符合诺如病毒Hu/1968/US的P2-亚结构域(Jiang X.et al.,Virology 1993；195(1):51-61)，具有一致的pdb-入口码1IHM用于X-射线晶体结构。其包含223到520个残基，这是P结构域(缺失C-末端的10个残基521-530，因为这10个残基在X-射线晶体结构中是不规则的并且其带有很强的正电荷)加S结构域C-末端的3个氨基酸，依据Prasad B.V.V.et al.,Science 1999；286:287-290中所述命名法。223苏氨酸残基是通过计算机可视化程序仔细选择用作与noro-SAPN的附着位点，由于其是病毒衣壳的晶体结构中穿过2-折叠轴的链之间的最紧密接触点。

所述两条链的克隆、表达、纯化和重折叠基本上按照实施例1、2、3和4中所述的方法。这些共组装纳米颗粒的重折叠条件是pH 6.8、80mM NaCl、20mM MES、5％甘油。共组装(比率为5:55)纳米颗粒的EM图见图4C所示。

TLR5激动剂的剂量-反应活性评估以及EC₅₀评估依据实施例5中所述方法实施。TLR5激动剂活性有一定的提高，其计算的EC₅₀值为17.66ng/ml，而来自鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白阳性对照的计算EC₅₀值为0.29ng/ml(图7C)。

实施例8—免疫原性I

式(Ia)的化合物T81c-8-D0-D1(Eurogentec 0):

MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGNTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDGGENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSVRSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQN(SEQ ID NO:19)

式(II)的化合物T81c-8-Pf:

MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARLRALLMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGSGANANPNANPNANPNANP(SEQ ID NO:20)

这两条共组装链与实施例6中所述的链相似。Y中无T1BT*T-细胞表位并且Z中的来自疟原虫CS蛋白重复区的B细胞表位仅为16个残基长度。三聚化卷曲螺旋(ND2和ND4)包含泛DR结合表位PADRE。链1(式Ia)中，FLA部分由鞭毛蛋白的D0(6到171残基)和D1(229到312残基)结构域组成，但是其来自肠道沙门氏菌亚种肠鼠伤寒沙门氏菌的相位I的鞭毛蛋白中间结构域变体C150,这是与实施例1和6中不同的链。D0和D1通过两个甘氨酸残基相连。

所述两条链的克隆、表达、纯化和重折叠基本上按照实施例1、2、3和4中所述的方法。该类型共组装纳米颗粒的重折叠条件是pH 8.5、50mM NaCl、20mM Tris、5％甘油。比率为3:57的共组装纳米颗粒的EM图见图4B所示。

7只C57Bl/6小鼠的组通过腹腔注射10μg或者1μg进行免疫，共3次注射每次间隔2周。免疫原是单独的T81c-8-Pf(式II)或者T81c-8-D0-D1(式Ia)和T81c-8-Pf(式II)以3:57和9:51两种不同的共组装比率的共组装体。换言之，假设为T1-二十面体对称的纳米颗粒，则有3种不同的免疫原，每种纳米颗粒中包含0或3或9个D0-D1分子。第3次注射后的抗体滴度通过ELISA测定，见图8A所示。使用共组装比率为3:57的1μg(大致相当于总计20ng鞭毛蛋白)，似乎会出现免疫应答的饱和，与不含D0-D1结构域的纳米颗粒相比可增加抗体滴度的因数约等于9。与不含D0-D1结构域的纳米颗粒相比，共组装比率为9:51的10μg(大致相当于总计2μg鞭毛蛋白)的较高剂量实际上稍微减低了免疫应答。

实施例9—免疫原性II

式(Ia)的化合物DIM-D0-D1(Eurogentec 1):

MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:21)

式(II)的化合物DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept:

MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGSGSSARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(SEQID NO:22)

实施例5和实施例6中，D0-D1形式的鞭毛蛋白衍生物似乎比其D2-D1形式具有更高的免疫原性。因此，D0-D1形式可用作TLR5激动剂以增加携带D2-D1形式鞭毛蛋白的免疫原的免疫原性。因此，本实施例中序列D0-D1

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:23)

相当于式(Ia)中的“FLA”,但序列D2-D1-tip3

SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(SEQ ID NO:24)

相当于式(II)中的“Z”。D2-D1-tip3中的该序列“Z”是鞭毛蛋白的变体，其中鞭毛蛋白的D2结构域与D1结构域组合，如上所述。此外，D2-D1-tip3的蛋白骨架可作为载体用于展示尼古丁抗原。为将活化的尼古丁共价耦合到所述蛋白骨架，将非表面暴露的赖氨酸侧链突变为精氨酸，而将表面暴露的精氨酸突变为赖氨酸。活化的尼古丁共价附着到所述蛋白序列的第一位氨基后，尼古丁就展示在纳米颗粒的表面。此外，为将尼古丁分子展示在纳米颗粒的最外表面，D2-D1蛋白在包含高密度赖氨酸的分子的最暴露部分携带所谓的“tip3”序列KAKKKDGKDDKD(SEQ ID NO:25)(图2A)。因此将尼古丁共价耦合到赖氨酸侧链可在纳米颗粒分子表面提供尼古丁分子的高密度展示。

DIM-D0-D1和DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept的核心(即ND1-L1-ND2和ND3-L2-ND4)是一致的，尤其是低聚化结构域ND2和ND4分别设计形成二聚化卷曲螺旋。这可将鞭毛蛋白分子(任意形式)以二聚体形式展示，易于与二聚化TL5-受体相互作用(图2B)。

所述两条链的克隆、表达、纯化和重折叠基本上按照实施例1、2、3和4中所述的方法。该类型共组装纳米颗粒的重折叠条件是：pH 7.0、50mM NaCl、20mM HEPES、5％甘油。以5:55比率共组装的纳米颗粒的EM图见图4D所示。

7只C57Bl/6小鼠的组通过腹腔注射10μg进行免疫，共3次注射每次间隔2周。免疫原是以5:55比率共组装的DIM-D0-D1(式Ia)和DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept(式II)的共组装体，或者是附着了相同的活化的尼古丁分子的标准载体KLH(钥孔血蓝蛋白)。KLH是大的、多亚基、载氧金属蛋白，其发现于巨型钥孔帽贝的血淋巴中并且常作为抗原的载体用于免疫实验。第3次注射后的抗体滴度通过ELISA测定，见图8B所示。该类型含TLR5-激动剂纳米颗粒免疫原的抗体滴度与表面展示相同抗原(尼古丁)的标准载体KLH的滴度相比显著提高。

实施例10—免疫原性III

式(Ia)的化合物DEDDL:

MGDKHHHHHHKDGSDKGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(SEQ ID NO:26)

所述纳米颗粒蛋白链包含来自肠道沙门氏菌亚种肠鼠伤寒沙门氏菌的相位I的鞭毛蛋白中间结构域变体C150的修饰的D0-D1结构域作为“FLA”，如实施例8。该序列中所有的赖氨酸残基都被精氨酸取代。D0和D1结构域通过氨基酸序列KYKDGDKGDDK(SEQ ID NO:1)相连,其包含4个赖氨酸作为耦合位点用于分子的共价附着。

三聚化卷曲螺旋(ND2)包含泛DR结合序列ELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNA(SEQID NO:27)。取代基“X”包含6个氨基酸的his-tag以及3个赖氨酸残基，其大致均匀地分布在整个序列中用于分子的共价附着。并且，其N-末端适于共价附着，例如通过N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)化学。

蛋白链的克隆、表达和纯化基本上按照实施例1、2和3中所述的方法。

耦合反应的缓冲液交换之前，来自亲和纯化的汇集的洗脱流份与5mM EDTA共孵育至少1小时以螯合任意可能渗漏的镍离子。然后使用HiPrep 26/10脱盐柱进行缓冲液交换。使用5倍体积的下述耦合缓冲液平衡所述柱：6M盐酸胍、150mM NaCl、20mM HEPES pH 7.2，然后将样品结合到柱。使用2倍柱体积的耦合缓冲液进行洗脱步骤。

NHS-尼古丁(烟酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)的耦合以摩尔比1:50(DEDDL:NHS-尼古丁)进行，11.1mg蛋白质(2.5mL体积)相当于0.24μmol蛋白质。将NHS-尼古丁(5mg)溶入150μL 100％DMSO相当于12.8μmol。对于50-倍摩尔过量的NHS-尼古丁，141μL所述NHS-尼古丁溶液相当于将12μmol加入蛋白质中。在暗处(用铝箔覆盖)并且电磁搅拌器搅拌下孵育3小时进行耦合反应。

下一步的缓冲液交换步骤中，为除去未耦合的NHS-尼古丁并且将缓冲液交换至重折叠前的缓冲液，将PD minitrap G-25预填充柱用于重新缓冲至以下条件：8M尿素、20mMTris pH8.5、150mM NaCl和10％海藻糖。

重折叠蛋白链基本上依据实施例4所述的方案。特别地，将8mg耦合的Nic-DEDDL蛋白(DEDDL蛋白耦合到尼古丁,3.35mg/mL的蛋白溶液2.4mL)滴加到158.4mL重折叠缓冲液(20mM HEPES pH 7.0、150mM NaCl、10％海藻糖)中，同时搅拌。最终的蛋白质浓度达到0.05mg/mL。重折叠反应总计10分钟。重折叠的Nic-DEDDL纳米颗粒见图9所示。

3只C57Bl/6小鼠的组通过皮下注射用10μg Nic-DEDDL免疫或者用10μg Nic-KLH(尼古丁耦合到钥孔血蓝蛋白)作为阳性对照，进行3次注射，每次间隔一周。通过ELISA测定第0天(即第一次注射前)的抗体滴度以及每次注射后一周(第7、14和21天)的抗体滴度，图10所示。实验显示Nic-DEDDL具有高免疫原性，与Nic-KLH相比抗体诱导>30-倍。仅3次免疫后的滴度峰值接近163840。