CN106362144B - 呼吸道合胞病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，包括一个重组融合蛋白抗原。在一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原，包括一个磷蛋白(P)部分，所述P部分是一个多肽，与SEQ ID NO 2或4代表的多肽有至少90％的同一性；和一个鞭毛素部分，所述鞭毛素部分是一个多肽，与SEQ ID NO 8代表的多肽有至少90％的同一性；其中所述P部分和鞭毛素部分共价耦合，从而形成一个线性多肽。

Description

呼吸道合胞病毒疫苗

技术领域

本发明一般涉及针对呼吸道合胞病毒(RSV)的预防和治疗试剂，并且更具体地涉及RSV疫苗，包括含有磷蛋白(P)蛋白的重组融合蛋白抗原。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)是在全球婴、幼儿，免疫低下和老年人群中引起支气管炎和严重呼吸道疾病的主要原因。幼儿自然感染RSV不会引起持久的免疫力，整个生命中仍然容易反复感染RSV。福尔马林灭活RSV(FI－RSV)疫苗，半个世纪前在婴儿中测试过，在随后暴露于自然感染RSV后导致发病率增加和两例死亡。婴儿和儿童在FI－RSV免疫后，在自然感染时，表现出低水平的中和抗体(Yang and Varga，2014)。

尽管很多努力和资源被投入到研发安全有效的RSV疫苗，但是迄今为止没有许可的RSV疫苗可用。迄今为止的研究表明，研制安全有效的RSV疫苗是一个艰巨的挑战。

因此，迫切需要开发新方法来研发抗RSV的安全有效的疫苗。

发明内容

本发明提供了呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，包括一个重组融合蛋白抗原。在一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原，包括一个磷蛋白(P)部分，所述P部分是一个多肽，与SEQID NO 2或4代表的多肽有至少90％的同一性；和一个鞭毛素部分，所述鞭毛素部分是一个多肽，与SEQ ID NO 8代表的多肽有至少90％的同一性；其中所述P部分和鞭毛素部分共价耦合，从而形成一个线性多肽。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述P部分是一个多肽，与SEQ ID NO 2或4代表的多肽有至少98％的同一性；所述鞭毛素部分是一个多肽，与SEQ ID NO 8代表的多肽有至少98％的同一性。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述P部分是一个多肽，与SEQ ID NO 2或4代表的多肽有至少99％的同一性；所述鞭毛素部分是一个多肽，与SEQ ID NO 8代表的多肽有至少99％的同一性。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述P部分是一个由SEQ ID NO 2或4代表的多肽；所述鞭毛素部分是一个由SEQ ID NO 8代表的多肽。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原进一步包括一个第一连接子，耦合所述P部分和鞭毛素部分；其中所述第一连接子是一个氨基酸或含有2－15氨基酸的多肽。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原进一步包括一个纯化标记，为方便重组融合蛋白抗原的纯化，其中所述纯化标记被置于重组融合蛋白抗原的N－端或C－端。在进一步的实施例中，所述纯化标记由6个组氨酸残基组成。在另一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原进一步包括一个第二连接子，耦合所述纯化标记和所述P部分或鞭毛素部分。在另一个进一步的实施例中，所述第二连接子是一个可裂解连接子，由一个氨基酸或氨基酸序列组成，在其C－端可被化学地或酶反应地裂解。

在所述RSV疫苗的另一个实施例中，所述重组融合蛋白抗原是一个由SEQ ID NO10代表的多肽。

通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。

附图说明

本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。

图1、显示如下序列：

(a)SEQ ID NO1，RSV A2株P蛋白的核苷酸序列；

(b)SEQ ID NO 2，RSV A2株P蛋白的氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO 3，RSV突变株CPT 248P蛋白的核苷酸序列；

(d)SEQ ID NO 4，RSV突变株CPT 248P蛋白的氨基酸序列；

(e)SEQ ID NO 5，重组P蛋白的核苷酸序列，His标记用下划线标注；

(f)SEQ ID NO 6，带有His标记的重组P蛋白的氨基酸序列，其中SEQ ID NO 4显示的RSV突变株CPT 248P蛋白的氨基酸序列用下划线标注，His标记用粗体标注；

(g)SEQ ID NO 7，重组鞭毛素KFD1的核苷酸序列；

(h)SEQ ID NO 8，重组鞭毛素KFD1的氨基酸序列；

(i)SEQ ID NO 9，重组P－KFD1的核苷酸序列，其中SEQ ID NO 3显示的RSV突变株CPT 248P蛋白用下划线标注，SEQ ID NO 7显示的核苷酸序列用双下划线标注，His标记用粗体标注；

(j)SEQ ID NO 10，重组P－KFD1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO 4显示的RSV突变株CPT 248P蛋白用下划线标注，SEQ ID NO 8显示的氨基酸序列用双下划线标注，His标记用粗体标注。

图2(a)显示了按照本发明一个实施例的一个重组P－KFD1蛋白的功能模块示意图；图2(b)显示，纯化的P－KFD1蛋白的Western blot。

图3显示了免疫和攻毒的时间程序图。

图4提供了图表，显示P－特异IgG和IgA抗体滴度，血清和阴道标本来自P+CTB或P－KFD1免疫组。

图5提供了图表，显示在攻毒后，在鼻腔或肺的病毒载量。

图6提供了图表，显示P－特异的T细胞反应。

图7提供了一组肺组织照片：(a)正常、未感染；(b)用生理盐水免疫的对照组，RSV感染；(c)FI－RSV免疫组，RSV感染；(d)P+CTB免疫组，RSV感染；和(e)P－KFD1免疫组，RSV感染。

图8提供了图表，显示攻毒后体重变化。

图9提供了图表：不同组在攻毒后，(a)显示吸气阻力(RI)与不同浓度的乙酰甲胆碱(MCH)的相关性；和(b)显示呼气阻力(RE)与不同浓度的乙酰甲胆碱(MCH)的相关性。

图10提供了图表，显示攻毒后第八天淋巴细胞浸润到肺组织：(a)免疫细胞数量；(b)中性粒细胞频率；(c)嗜酸性粒细胞频率；和(d)巨噬细胞频率。

具体实施方式

可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。

在本申请中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。

除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；分子生物学当代程序(FM Ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)。

RSV具有线性单链RNA基因组，拥有10个基因，编码11种蛋白质，包括非结构蛋白(NS1和NS2)、大聚合酶(L)、磷蛋白(P)、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)、表面黏附糖蛋白(G)、表面融合蛋白(F)、小疏水蛋白(SH)、转录因子(M2－1)和一个辅助蛋白(M2－2)。F和G蛋白被认为是两个主要保护性抗原，诱导机体产生中和抗体。G蛋白是高度糖基化的，参与病毒附着到宿主细胞，F蛋白介导细胞融合，使病毒进入细胞的细胞质中，形成合胞体(Yang andVarga，2014)。

由于RSV F蛋白是一个非常重要的中和抗原，可以诱导黏膜免疫，一直是RSV疫苗研发的焦点。基于最近的研究在融合前F中发现的非常强大的中和抗原位点，下一代RSV疫苗的备选应该包括以融合前形式表达的F蛋白(Yang and Varga，2014)。

因为RSV感染局限于呼吸道，为了最有效预防RSV感染，RSV疫苗应在上和下呼吸道引起黏膜免疫(Yang and Varga，2014)。黏膜免疫反应的高效诱导需要适当的给药途径和特异的佐剂和/或递送系统。相比其他黏膜给药途径，鼻腔给药是在多个黏膜部位诱导有效和广泛的黏膜免疫反应的最有效的途径(Yang and Varga，2014)。

RSV疫苗主要有四类，包括灭活、减毒活疫苗、基因载体、和亚单位。减毒活RSV疫苗鼻内给药，和一个亚单位RSV融合后F蛋白疫苗加上铝佐剂和肌内注射，已在近年来一些临床试验中广泛评估。然而，减毒活RSV疫苗诱导的反应，由于在减毒过程中免疫原性的丢失，因而在应答幅度上比自然感染弱，(Yang and Varga，2014)。

通过系统免疫时，基于F蛋白的RSV疫苗在年龄较大的儿童和成人是安全的，但是它们的免疫原性不高，不能诱导有效的黏膜免疫(Groothuis JR，et al.1998)。

抗原选择

VLP表达F或G蛋白在RSV攻毒时可以保护小鼠，但单独使用时VLP G疫苗加重病情；一个有趣的结果是，混合VLP F+VLP G没有疫苗诱导的免疫病理，但是没有提供合理的解释(Lee S.，et al.2014)。

编码RSV F、N和M2－1蛋白质的黑猩猩腺病毒和修饰牛痘病毒进行了I期临床试验(Green C.A.，2015)。

含有融合前形式F蛋白的VLP在棉鼠中测试了其对RSV的保护(Cullen L.M.，etal.2015)。

一个对应于HRSV B病毒表面疏水性小肽(SH)的胞外结构域的肽段(CGGGS－NKLSEHKTFSNKTLEQCQMYQINT)与乙型肝炎核心蛋白的病毒样颗粒(HBc SHeB)化学耦合，攻毒的小鼠和棉鼠显示了降低病毒复制(Schepens，B et al.2014)。

佐剂选择

含有铝佐剂的FI－RSV疫苗引起严重的疫苗－增强的RSV疾病，包括体重下降，嗜酸性粒细胞增多症，和肺组织病理学，尽管与无佐剂FI－RSV相比，增强对RSV的保护(KimKH，et al.2015)。

含有LPS，Poly(I：C)或PolyU佐剂的灭活病毒诱导保护性免疫，抵抗RSV的攻毒(Delgado MF，et al.2009)；然而，所有佐剂的选择是因为RSV的组分，即F蛋白如同LPS一样可以激活TLR4通路；Poly(I：C)和PolyU作用相当于病毒基因组。

牛RSV

牛呼吸道合胞病毒(BRSV)是牛呼吸道疾病综合征的关键成员，这是在工业化肉牛生产中最重要的经济和突出的福利问题之一。BRSV基因组与RSV基因组类似(Hagglund S.，et al.2014)。

当BRSV－免疫刺激复合物(ISCOM)用于免疫犊牛，F，G，N，和SH的特异性IgG抗体是高滴度的；值得注意的是，未检出显著的抗M和P的抗体反应(Hagglund S.，et al.2014)。

本发明发现了一种安全有效的RSV疫苗，包括重组融合蛋白抗原。所述重组融合蛋白抗原包括磷蛋白(P)部分和鞭毛素部分，其中所述P部分和鞭毛素部分共价结合以形成一个线性多肽。一个“融合蛋白”是一种嵌合分子，其中的构成部分是所有的多肽，并连接(融合)，这样的嵌合分子形成一个连续的单链。各种构成成分可以直接相互连接或可通过一个或多个肽连接子耦合。当用于指示一个嵌合分子时，“链接器”是指任何分子，连接或汇合嵌合分子的构成部分。当嵌合分子是一种融合蛋白，连接子可以是一个肽，结合包括融合蛋白的蛋白质。

现参照图1，P蛋白的示例序列包括RSV A2株(SEQ ID NO 1为其核苷酸序列与SEQID NO2为其氨基酸序列)和RSV突变株cpt－248(SEQ ID NO 3为其核苷酸序列与SEQ ID NO4为其氨基酸序列)。值得注意的是，RSV突变株cpt－248的P蛋白与其他RSV A株具有98－99％的同一性，以及与RSV B株有超过90％的同一性。

现参照图2(a)，根据本发明的一个实施例，提供了重组融合蛋白抗原的功能块的示意图。重组蛋白抗原1包括一个磷蛋白(P)部分10和一个鞭毛素部分20，其中P部分10和鞭毛素部分20是线性共价耦合。在一些实施例中，鞭毛素部分20利用其N端与P部分10的C端耦合(如图2(a)所示)。在一些实施例中，鞭毛素部分20利用其C端与P部分10的N端耦合(相对于图2(a)交换位置)。

在一些实施例中，P部分10是一个多肽，如SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示。在一些实施例中，P部分10是一个多肽，与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4所示的多肽具有至少90％，优选地98％，更优选地99％的同一性。

在一些实施例中，鞭毛素部分20是一个多肽，如SEQ ID NO 8所示。在一些实施例中，鞭毛素部分20是一个多肽，与SEQ ID NO 8所示的多肽具有至少90％，优选地98％，更优选地99％的同一性。

在一些实施例中，该重组融合蛋白抗原1进一步包括一个第一连接子30，耦合P部分10和鞭毛素部分20，其中第一连接子30是一个氨基酸或含有两个或两个以上氨基酸的肽段；第一连接子30中的氨基酸应灵活，无大侧基团，为了避免免疫反应。另外，第一连接子30对酶消化具有抵抗，从而在使用这种疫苗的时候稳定重组融合蛋白抗原。

在一些实施例中，重组融合蛋白抗原1还包括纯化标记40，用于促进重组融合蛋白抗原1的纯化。纯化标记40可以设置在重组融合蛋白抗原1的N－末端或C－末端。例如，六个组氨酸残基融合地位于其N－或C－末端，允许用Ni²⁺柱纯化。纯化后，六个组氨酸残基可以通过化学或酶切去除。事实上，任何已知的纯化标记是适合这里的，包括Myc标记，HA标记，Flag肽，KT3表位，α－微管蛋白表位，T7基因10蛋白肽标记，谷胱甘肽－S－转移酶(GST)标记，Strep标记，牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)，与麦芽糖结合蛋白(MBP)。

在一些实施例中，该重组融合蛋白抗原1还包括一个第二连接子50，线性耦合纯化标记40与P部分10或鞭毛素部分20。在一些实施例中，第二连接子50是一个可裂解的连接子，是一个氨基酸或氨基酸序列组成，在其C－末端可被化学或酶裂解。在表达载体上，可裂解的连接子包括DNA序列，编码一个氨基酸或氨基酸序列，在其C－末端可被化学或酶裂解。

裂解蛋白的化学剂例子有溴化氰，2(2－nitrophenylsulfenyl)－3－bromo－3”methylindolinium(BNPS－甲基吲哚)、羟胺等。溴化氰在蛋氨酸残基的羧基端裂解蛋白。BNPS－甲基吲哚裂解色氨酸残基的羧基端。羟胺裂解－Asn－Z－部分的C－末端，其中Z是甘氨酸、亮氨酸或丙氨酸。

用于裂解的酶试剂例子有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、肠激酶，等。每一个作用于其识别的一个特定的氨基酸序列。肠激酶，例如，识别的氨基酸序列－(Asp)_n－Lys－，其中n是一个从2到4的整数。

正如上面所讨论的，表达载体的克隆，构建和扩增的技术是众所周知的。因此，通过常规方法可以构建重组融合蛋白抗原的表达载体；为不掩盖本发明的原理，没有提供进一步的细节信息。

本发明的RSV疫苗还包括其药学上可接受的溶液，包括如盐水，PBS。在一些实施例中，RSV疫苗可能包括其它成分，如RSV的其它蛋白。

实施例

提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围

实施例1

病毒制备

在Hep－2细胞中扩增RSV A2毒株，超声破碎后，离心1000g，4℃，10min；取上清；超速离心纯化病毒，80000g，4℃，2h。纯化的病毒用噬斑法测定其滴度，保存用于攻毒。

实施例2

制备FI－RSV

往纯化的RSV A2病毒悬浮液加入中性福尔马林，比例1：4，000；37℃孵育3天，辅以旋转；然后30，000rpm离心，30分钟；重悬沉淀，体积为原体积的1/25；然后将FI－RSV与铝佐剂(4mg/ml)混合，室温孵育24小时。

实施例3

制备重组蛋白

现参照图1，提供了带有His标记的重组P蛋白的序列(SEQ ID NO 5为核苷酸序列，SEQ ID NO 6为氨基酸序列)，重组鞭毛蛋白KFD1序列(SEQ ID NO 7为核苷酸序列，SEQ IDNO 8为氨基酸序列)，和重组P－KFD1序列(SEQ ID NO 9为核苷酸序列，SEQ ID NO 10为氨基酸序列)。DNA片段被克隆到pET28a载体，使用引物(SEQ ID NOS 11－16)，以及由此产生的pET28a－P，pET28a－KFD1，和pET28a－P－KFD1质粒，按照常规程序被转化到细菌。所有表达的重组蛋白用它们的His标记进行纯化。使用前去除内毒素。

实施例4

免疫

现参照图3，BALB/c小鼠在第0，25，50天分别免疫3次：(a)10μl生理盐水滴鼻(i.n)；(c)10μl P蛋白(40ug)与2ul CTB佐剂(2ug，Sigma)混合液，滴鼻(i.n)；(d)12uL P－KFD1蛋白(24ug)，滴鼻(i.n)。对(b)组来说，第42天初免，2星期后加强，100μl FI－RSV疫苗，含2μg FI－RSV和400μg铝佐剂，肌肉注射(i.m)。在第21，39，64天采血，测定血清中抗体滴度。

实施例5

攻毒

现参照图3，在末次免疫后的第25天进行攻毒。所有小鼠用Avertin(三溴乙醇溶于叔戊醇)麻醉后，滴鼻攻毒1x10⁷PFU RSV A2，体积为50μl。表1总结了免疫和攻毒的抗原及条件。

表1、免疫和攻毒的抗原及条件的总结

实施例6

免疫噬斑法测定鼻和肺组织的病毒滴度

攻毒后第4天，杀鼠，取鼻及肺组织，用组织均浆器研磨。在24孔板中接种Vero细胞，待其生长至100％融合度时，将稀释的研磨液样品加入，37℃孵育1h，洗3次，加入1mLDMEM+2％FBS+1％P+S+0.75％甲基纤维素培养基在细胞培养箱中孵育4－5天。随后，轻轻弃孔中培养基，用多聚甲醛和Trion X－100固定穿孔20min，加入P蛋白特异性单克隆抗体孵育2h后，加入Goat Anti－Mouse IgG－HRP孵育1h，最后用AEC底物显色，并计算噬斑数量。

实施例7

血清中和抗体滴度测定

血清灭活后，按照2倍倍比系列稀释；稀释血清样品(100μl)与200PFU RSV A2(100μl)在37℃孵育1小时，随后加入Vero细胞单层上，吸附1小时后，甲基纤维素培养基在细胞培养箱中孵育4－5天，免疫噬斑法测定病毒滴度。血清中和抗体滴度用半数噬斑减少的血清稀释倍数来表示，即50％噬斑减少中和滴度(plaque reduction neutralizationtiter，PRNT)。

实施例8

小鼠气道反应性测定

攻毒后第4天，用戊巴比妥钠将小鼠麻醉，用手术剪剪开小鼠颈部皮肤，剥离气管，对小鼠进行气管插管，将插管另一端连接呼吸机，设置呼吸比为1.5：1，呼吸机被动呼吸频率设置为90次/分钟。

之后迅速将小鼠转移至体积扫描箱内，将气管插管与体积扫描箱气路连接。打开AniRes2005操作软件，观察气道压力变化曲线，调节出气量至小鼠自主呼吸不能对抗影响呼吸机的被动呼吸。待压力变化曲线平稳、规律后，分离小鼠颈部一侧的皮肤和肌肉，进行静脉穿刺并固定针头，建立颈外静脉给药通路。依次静脉注射乙酰甲胆碱(MCH)激发，浓度为0.025、0.05、0.1、0.2mgMCH/kg，分析软件将同步记录小鼠气道的吸气阻力(Ri)，呼气阻力(Re)和肺的顺应性(Cdyn)变化曲线。

实施例9

肺组织消化

小鼠用戊巴比妥钠麻醉后解剖，用5mL PBS从右心房灌注心脏，分离肺组织，剪碎至1－2mm²，用2mL消化液消化肺组织，37℃，40min。消化液配方：HBSS培养基含CollagenaseⅠ(125U/mL)及DNaseⅠ(30U/mL)。消化后的肺组织轻轻研磨后过300目筛网，获得单细胞悬液，之后用percoll分离液分离，从而得到淋巴细胞和单个核细胞。

实施例10

流式检测

检测肺中各类细胞浸润：用以下特异性单抗进行表面染色：FITC Anti－MouseF4/80，PE－Cy7Anti－Mouse Gr－1，APC－EF780Anti－Mouse CD11b，APC Anti－MouseCD45，PE Anti－Mouse Siglec F，4℃染色30min后固定。

实施例11

ELISPOT分析T细胞应答

攻毒后第4天，取肺和脾脏，用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。预包被的IFN－γELISPOT板活化后，分别接种肺淋巴细胞和脾脏淋巴细胞，用P蛋白刺激，并设置阳性对照孔及阴性对照孔，在培养箱中培养48小时，随后孵育二抗，用AEC底物显色，用多功能细胞分析及酶联斑点分析系统计算斑点。

实施例12

组织学

肺组织用福尔马林固定。固定后，用标准程序准备组织切片。一些切片用hematoxylin eosin(H&E)染色确定细胞浸润。

实施例13

结果

现参照图4，图表显示P－特异IgG和IgA抗体滴度，血清和阴道标本来自P+CTB或P－KFD1免疫组。很明显，P+CTB免疫组滴度比P－KFD1组高。

现参照图5，图表显示在攻毒后，在鼻腔或肺的病毒载量。

现参照图6，图表显示P－特异的T细胞反应。P+CTB免疫组显示显著T细胞应答；相反地，P－KFD1免疫组显示非显著T细胞应答。

现参照图7，一组肺组织照片：(a)正常、未感染；(b)用生理盐水免疫的对照组，RSV感染；(c)FI－RSV免疫组，RSV感染；(d)P+CTB免疫组，RSV感染；和(e)P－KFD1免疫组，RSV感染。所有免疫组的切片来自感染后第七天的小鼠。生理盐水和FI－RSV组显示大量间质性肺炎和支气管炎；P+CTB组有大量淋巴细胞浸润。意外的是，P－KFD1组没有明显的病理变化。

现参照图8，图表显示攻毒后体重变化。P－KFD1组显示明显比其他组少的体重降低。

现参照图9的图表：不同组在攻毒后，(a)显示吸气阻力(RI)与不同浓度的乙酰甲胆碱(MCH)的相关性；和(b)显示呼气阻力(RE)与不同浓度的乙酰甲胆碱(MCH)的相关性。P－KFD1组显示比FI－RSV和P+CTB组的更好的RI和RE值。

现参照图10，图表显示攻毒后第八天淋巴细胞浸润到肺组织：(a)免疫细胞数量；(b)中性粒细胞频率；(c)嗜酸性粒细胞频率；和(d)巨噬细胞频率。P－KFD1组有比P+CTB组少的淋巴细胞浸润。P－KFD1组无显著的趋化来的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的浸润。

尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。

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<130> 1002.P007

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus A2 P protein

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tggaaaagtt cgcgcctgaa ttccatggag aagatgcaaa caacagggct 120

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ctcaggaatg aggaaagtga aaagatggca aaagacacat cagatgaagt gtctctcaat 720

ccaacatcag agaaattgaa caacctattg gaagggaatg atagtgacaa tgatctatca 780

cttgaagatt ttaagcttgc gggcgcactc gag 813

<210> 2

<211> 271

<212> PRT

<213> respiratory syncytial virus A2 P protein

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His

20 25 30

Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys

35 40 45

Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile

50 55 60

Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr

65 70 75 80

Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Thr Ala

85 90 95

Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gln Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu

100 105 110

Asp Pro Thr Pro Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr

115 120 125

Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Ile Asn Asp Gln Thr Asn Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg

145 150 155 160

Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val

165 170 175

Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala

180 185 190

Met Val Gly Leu Arg Glu Glu Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala

195 200 205

Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu

210 215 220

Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn

225 230 235 240

Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp

245 250 255

Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp Phe Lys Leu Ala Gly Ala Leu Glu

260 265 270

<210> 3

<211> 723

<212> DNA

<213> respiratory syncytial virus mutant cpt-248 P protein

<400> 3

atggaaaagt tcgcgcctga attccatgga gaagatgcaa acaacagggc tactaaattc 60

ctagaatcaa taaagggcaa attcacatca cccaaagatc ccaagaaaaa agatagtatc 120

atatctgtca actcaataga tatagaagta accaaagaaa gccctataac atcaaattca 180

actattatca acccaacaaa tgagacagat gatactgcag ggaacaagcc caattatcaa 240

agaaaacctc tagtaagttt caaagaagac cctacaccaa gtgataatcc cttttctaaa 300

ctatacaaag aaaccataga aacatttgat aacaatgaag aagaatccag ctattcatac 360

gaagaaataa atgatcagac aaacgataat ataacagcaa gattagatag gattgatgaa 420

aaattaagtg aaatactagg aatgcttcac acattagtag tggcaagtgc aggacctaca 480

tctgctcggg atggtataag agatgccatg gttggtttaa gagaagaaat gatagaaaaa 540

atcagaactg aagcattaat gaccaatgac agattagaag ctatggcaag actcaggaat 600

gaggaaagtg aaaagatggc aaaagacaca tcagatgaag tgtctctcaa tccaacatca 660

gagaaattga acaacctatt ggaagggaat gatagtgaca atgatctatc acttgaagat 720

ttt 723

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> respiratory syncytial virus mutant cpt-248 P protein

<400> 4

Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg

1 5 10 15

Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys

20 25 30

Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile

35 40 45

Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn

50 55 60

Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Thr Ala Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gln

65 70 75 80

Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu Asp Pro Thr Pro Ser Asp Asn

85 90 95

Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn

100 105 110

Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu Glu Ile Asn Asp Gln Thr Asn

115 120 125

Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu

130 135 140

Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr

145 150 155 160

Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala Met Val Gly Leu Arg Glu Glu

165 170 175

Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu

180 185 190

Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys

195 200 205

Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn

210 215 220

Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp

225 230 235 240

Phe

<210> 5

<211> 834

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant P protein with His tag

<400> 5

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tggaaaagtt cgcgcctgaa ttccatggag aagatgcaaa caacagggct 120

actaaattcc tagaatcaat aaagggcaaa ttcacatcac ccaaagatcc caagaaaaaa 180

gatagtatca tatctgtcaa ctcaatagat atagaagtaa ccaaagaaag ccctataaca 240

tcaaattcaa ctattatcaa cccaacaaat gagacagatg atactgcagg gaacaagccc 300

aattatcaaa gaaaacctct agtaagtttc aaagaagacc ctacaccaag tgataatccc 360

ttttctaaac tatacaaaga aaccatagaa acatttgata acaatgaaga agaatccagc 420

tattcatacg aagaaataaa tgatcagaca aacgataata taacagcaag attagatagg 480

attgatgaaa aattaagtga aatactagga atgcttcaca cattagtagt ggcaagtgca 540

ggacctacat ctgctcggga tggtataaga gatgccatgg ttggtttaag agaagaaatg 600

atagaaaaaa tcagaactga agcattaatg accaatgaca gattagaagc tatggcaaga 660

ctcaggaatg aggaaagtga aaagatggca aaagacacat cagatgaagt gtctctcaat 720

ccaacatcag agaaattgaa caacctattg gaagggaatg atagtgacaa tgatctatca 780

cttgaagatt ttaagcttgc gggcgcactc gagcaccacc accaccacca ctga 834

<210> 6

<211> 277

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant RSV P protein with His tag

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His

20 25 30

Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys

35 40 45

Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile

50 55 60

Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr

65 70 75 80

Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Thr Ala

85 90 95

Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gln Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu

100 105 110

Asp Pro Thr Pro Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr

115 120 125

Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Ile Asn Asp Gln Thr Asn Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg

145 150 155 160

Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val

165 170 175

Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala

180 185 190

Met Val Gly Leu Arg Glu Glu Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala

195 200 205

Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu

210 215 220

Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn

225 230 235 240

Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp

245 250 255

Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp Phe Lys Leu Ala Gly Ala Leu Glu His

260 265 270

His His His His His

275

<210> 7

<211> 801

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant flagellin KFD1

<400> 7

atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60

aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120

gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180

ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240

gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300

accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360

gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420

aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480

aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatgctagcg ctacgacgac ggatccgctg 540

aaagcgctgg acgatgctat cgcatctgta gacaaattcc gttcttccct cggtgcggtg 600

caaaaccgtc tggattccgc ggttaccaac ctgaacaaca ccactaccaa cctgtctgaa 660

gcgcagtccc gtattcagga cgccgactat gcgaccgaag tgtccaatat gtcgaaagcg 720

cagatcatcc agcaggccgg taactccgtg ttggcaaaag ctaaccaggt accgcagcag 780

gttctgtctc tgctgcaggg t 801

<210> 8

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant flagellin KFD1

<400> 8

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr

85 90 95

Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Ala Thr Thr

165 170 175

Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys

180 185 190

Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val

195 200 205

Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg

210 215 220

Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala

225 230 235 240

Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln

245 250 255

Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly

260 265

<210> 9

<211> 1629

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant P-KFD1

<400> 9

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tggaaaagtt cgcgcctgaa ttccatggag aagatgcaaa caacagggct 120

actaaattcc tagaatcaat aaagggcaaa ttcacatcac ccaaagatcc caagaaaaaa 180

gatagtatca tatctgtcaa ctcaatagat atagaagtaa ccaaagaaag ccctataaca 240

tcaaattcaa ctattatcaa cccaacaaat gagacagatg atactgcagg gaacaagccc 300

aattatcaaa gaaaacctct agtaagtttc aaagaagacc ctacaccaag tgataatccc 360

ttttctaaac tatacaaaga aaccatagaa acatttgata acaatgaaga agaatccagc 420

tattcatacg aagaaataaa tgatcagaca aacgataata taacagcaag attagatagg 480

attgatgaaa aattaagtga aatactagga atgcttcaca cattagtagt ggcaagtgca 540

ggacctacat ctgctcggga tggtataaga gatgccatgg ttggtttaag agaagaaatg 600

atagaaaaaa tcagaactga agcattaatg accaatgaca gattagaagc tatggcaaga 660

ctcaggaatg aggaaagtga aaagatggca aaagacacat cagatgaagt gtctctcaat 720

ccaacatcag agaaattgaa caacctattg gaagggaatg atagtgacaa tgatctatca 780

cttgaagatt tcgggcgcgc catggcacaa gtcattaata ccaacagcct ctcgctgatc 840

actcaaaata atatcaacaa gaaccagtct gcgctgtcga gttctatcga gcgtctgtct 900

tctggcttgc gtattaacag cgcgaaggat gacgcagcgg gtcaggcgat tgctaaccgt 960

ttcacctcta acattaaagg cctgactcag gcggcccgta acgccaacga cggtatctcc 1020

gttgcgcaga ccaccgaagg cgcgctgtcc gaaatcaaca acaacttaca gcgtgtgcgt 1080

gaactgacgg tacaggccac taccggtact aactctgagt ctgatctgtc ttctatccag 1140

gacgaaatta aatcccgtct ggatgaaatt gaccgcgtat ctggtcagac ccagttcaac 1200

ggcgtgaacg tgctggcaaa aaatggctcc atgaaaatcc aggttggcgc aaatgataac 1260

cagactatca ctatcgatct gaagcagatt gatgctaaaa ctcttggcct tgatgctagc 1320

gctacgacga cggatccgct gaaagcgctg gacgatgcta tcgcatctgt agacaaattc 1380

cgttcttccc tcggtgcggt gcaaaaccgt ctggattccg cggttaccaa cctgaacaac 1440

accactacca acctgtctga agcgcagtcc cgtattcagg acgccgacta tgcgaccgaa 1500

gtgtccaata tgtcgaaagc gcagatcatc cagcaggccg gtaactccgt gttggcaaaa 1560

gctaaccagg taccgcagca ggttctgtct ctgctgcagg gtctcgagca ccaccaccac 1620

caccactga 1629

<210> 10

<211> 542

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Recombinant P-KFD1

<400> 10

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His

20 25 30

Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys

35 40 45

Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile

50 55 60

Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr

65 70 75 80

Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Thr Ala

85 90 95

Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gln Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu

100 105 110

Asp Pro Thr Pro Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr

115 120 125

Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Ile Asn Asp Gln Thr Asn Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg

145 150 155 160

Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val

165 170 175

Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala

180 185 190

Met Val Gly Leu Arg Glu Glu Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala

195 200 205

Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu

210 215 220

Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn

225 230 235 240

Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp

245 250 255

Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp Phe Gly Arg Ala Met Ala Gln Val Ile

260 265 270

Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn Asn Ile Asn Lys Asn

275 280 285

Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg

290 295 300

Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg

305 310 315 320

Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ala Arg Asn Ala Asn

325 330 335

Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Ser Glu Ile

340 345 350

Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr Val Gln Ala Thr Thr

355 360 365

Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile Gln Asp Glu Ile Lys

370 375 380

Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn

385 390 395 400

Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met Lys Ile Gln Val Gly

405 410 415

Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asp Ala

420 425 430

Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Ala Thr Thr Thr Asp Pro Leu Lys

435 440 445

Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu

450 455 460

Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn

465 470 475 480

Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp

485 490 495

Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln

500 505 510

Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val

515 520 525

Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His

530 535 540

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer P up with NheI

<400> 11

tatagctagc atggaaaagt tcgcgcctga a 31

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer P downstream with Hind III site

<400> 12

attaaagctt aaaatcttca agtgata 27

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer for pET28a P upstream with NheI site

<400> 13

tatagctagc atggaaaagt tcgcgcctga a 31

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer for pET28a P downstream with AscI site

<400> 14

atttggcgcg cccgaaatct tcaagtgata gat 33

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer for pET28a KFD1 upstream with AscI site

<400> 15

atttggcgcg ccatggcaca agtcattaat ac 32

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer for pET28a KFD1 downstream with XhoI site

<400> 16

atatctcgag accctgcagc agagacag 28

Claims (1)

1.呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的有效成分为一个重组融合蛋白抗原，其中所述重组融合蛋白抗原是一个由SEQ ID NO 10代表的多肽。

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