ES2705588T3 - Nanopartículas proteicas que contienen flagelina como plataforma de vacunas - Google Patents

Abstract

Una nanopartícula proteica de autoensamblaje que consiste en agregados de una multitud de unidades estructurales de fórmula (Ia) o (Ib) X - ND1 - L1 - ND2 - FLA (Ia) o FLA- ND1 - L1 - ND2 - X (Ib), que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND1, un enlazador L1, un dominio de oligomerización de proteínas ND2, un derivado de flagelina FLA y un sustituyente adicional X, en donde ND1 es una proteína que forma oligómeros (ND1)m de m subunidades ND1, ND2 es una proteína que forma oligómeros (ND2)n de n subunidades ND2, m y n son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que m no sea igual a n y no sea un múltiplo de n, y de que n no sea un múltiplo de m, L1 es un enlace o un enlazador flexible corto, FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde uno o varios dominios seleccionados de los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos; X está ausente o es una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos, en donde cada uno de ND1 y ND2 es un dominio de superhélice o el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas proteicas que contienen flagelina como plataforma de vacunas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nanopartículas proteicas de autoensamblaje que incorporan la secuencia de proteínas de la flagelina, proteína de unión a TLR5, como un adyuvante incorporado. Además, la invención se refiere al uso de dichas nanopartículas para vacunación.

Antecedentes de la invención

La primera línea de defensa contra los patógenos invasores es a través de la inmunidad innata del huésped, y los receptores tipo Toll (TLR), que son receptores unidos a la membrana, desempeñan un papel clave en ella (Yoon S.I. y otros., Science 2012, 335:859-64). Los TLR reconocen los antígenos con una estructura molecular altamente conservada usando sus ectodominios de repetición ricos en leucina (LRR). Este LRR tiene forma de herradura. Cada TLR tiene un dominio de unión al ligando distinto que reconoce su antígeno molecular particular, que puede ser una forma especial de ácidos nucleicos virales o bacterianos, moléculas de superficie bacteriana tales como lipopolisacáridos (LPS) u otras moléculas asociadas a patógenos con un patrón particular. Aunque reconocen diversos antígenos moleculares no relacionados, todas las estructuras de TLR activados por agonistas conocidos, es decir, los TLR que han reconocido y se han unido a su antígeno molecular, forman una organización dímera similar al unirse al antígeno, lo que hace que sus regiones C-terminales se acerquen entre sí, lo que a su vez activa sus dominios intracelulares Toll/receptor de interleucina-1 (TIR) y, por tanto, inicia las cascadas de señalización celular.

Con respecto al alcance de esta invención, es interesante observar que, de los muchos receptores TLR diferentes, TLR5 es el único TLR de unión a proteínas que se conserva en los vertebrados desde peces hasta mamíferos. TLR5 se une a una forma desensamblada de flagelina del filamento flagelar similar a un látigo de proteobacterias p y y, que es responsable de la flagelina de locomoción. Recientes estudios cristalográficos han mostrado un complejo dimérico entre la flagelina y TLR5. Tras la unión de la flagelina a TLR5, se induce la vía de señalización dependiente de MyD88, que a su vez activa el factor de transcripción proinflamatorio NF-kB en células dendríticas, monocitos y células epiteliales, lo que finalmente lleva a respuestas inmunitarias innatas contra bacterias flageladas.

La flagelina tiene una arquitectura molecular que se compone de cuatro dominios D0, D1, D2 y D3. La cadena proteica comienza con el extremo N en el dominio D0 y discurre en un gran bucle a través de los otros dominios D1, D2 y D3 hasta la punta de la molécula donde gira y discurre de nuevo a través de D3, D2 y D1 para llevar su extremo C-terminal en el dominio D0 muy cerca del extremo N-terminal. La flagelina tiene dos modos de activación del sistema inmunitario innato. El primer modo es uniéndose al receptor TLR5 principalmente a través de una parte altamente conservada de su dominio D1 (Yoon y otros., Loc. Cit.). El otro modo de activación es mediante la interacción con el inflamasoma principalmente a través de una parte C-terminal altamente conservada de su dominio D0 (Lightfield K.L. y otros., Nat Immunol. 2008, 9:1171-8).

La flagelina se ha usado como un adyuvante convencional, es decir, como una entidad independiente que se inyecta junto con el antígeno, o también se ha diseñado para contener el propio antígeno dentro de su propia arquitectura molecular. El segundo enfoque tiene la ventaja de que el efecto adyuvante se colocaliza con el efecto del antígeno, por lo tanto, la dosis del adyuvante se puede reducir significativamente y, como consecuencia, los efectos secundarios también se pueden reducir significativamente.

Una de las posibles limitaciones de la flagelina es su potencial para inducir respuestas inmunitarias inflamatorias. Podría ser posible reducir la parte inflamatoria de la estimulación inmunitaria mediante el diseño de construcciones de flagelina que carezcan de la parte C-terminal de D0 que interactúa con el inflamasoma.

Muchos adyuvantes tienen limitaciones significativas en su uso debido a sus efectos secundarios graves. Por ejemplo, el adyuvante completo de Freund, que es una formulación inmunoestimuladora muy potente, ya no se puede usar en experimentos con animales. Actualmente, solo hay muy pocos adyuvantes aprobados para uso humano, siendo el más importante la alúmina. Una posible forma de limitar los efectos secundarios de los adyuvantes aplicados sistémicamente es su formulación como un sistema de partículas, es decir, incorporando adyuvantes en forma de partículas o en una emulsión oleosa que puede limitar los efectos secundarios y concentrar el adyuvante cerca del antígeno de interés. Por lo tanto, el antígeno y el adyuvante pueden alcanzar el mismo ganglio linfático al mismo tiempo, lo que aumenta el efecto adyuvante al tiempo que reduce los efectos secundarios sistémicos del adyuvante.

La flagelina es un adyuvante particularmente interesante para uso en nanopartículas proteicas como las que se describen en el documento WO 2004/071493, ya que la propia flagelina es una proteína, a diferencia de muchos otros adyuvantes que son moléculas pequeñas, tales como el imiquimod o entidades basadas en ácido nucleico, tales como CpG. Dado que la flagelina es una proteína, se puede diseñar en la nanopartícula por medio de la biología molecular sin necesidad de reticulación química.

Compendio de la invención

La invención se refiere a una nanopartícula proteica de autoensamblaje que consiste en agregados de una multitud de unidades estructurales de fórmula (Ia) o (Ib)

X -ND1 - L1 -ND2 -F L A (la)

o

FLA-ND1 - L1 -ND2 - X (Ib),

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND1, un enlazador L1, un dominio de oligomerización de proteínas ND2, un derivado de flagelina FLA y un sustituyente adicional X, en donde

ND1 es una proteína que forma oligómeros (ND1)^m de m subunidades ND1,

ND2 es una proteína que forma oligómeros (ND2)ⁿ de n subunidades ND2,

m y n son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que m no sea igual a n y no sea un múltiplo de n, y de que n no sea un múltiplo de m,

L1 es un enlace o un enlazador flexible corto,

FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde uno o varios dominios seleccionados de los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos; X está ausente o es una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos, en donde cada uno de ND1 y ND2 es un dominio de superhélice o el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

opcionalmente coensamblada con una multitud de unidades estructurales de fórmula (II)

Y-ND3-L2-ND4-Z (II),

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND3, un enlazador L2, un dominio de oligomerización de proteínas ND4 y sustituyentes adicionales Y y Z, en donde

ND3 es una proteína que forma oligómeros (ND3)^y de y subunidades ND3,

ND4 es una proteína que forma oligómeros (ND4)^z de z subunidades ND4,

y y z son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que y no sea igual a z y no sea un múltiplo de z, y de que z no sea un múltiplo de y,

bien ND3 es idéntico a ND1, o ND4 es idéntico a ND2 o bien tanto ND3 como ND4 son idénticos a ND1 y ND2, respectivamente,

L2 es un enlace o un enlazador flexible corto que puede ser diferente de L1 o idéntico a L1, y

Y y Z están, independientemente entre sí, ausentes o son una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: presentación esquemática de diferentes nanopartículas proteicas compuestas por un coensamblaje de cadenas que contienen epítopos y cadenas que contienen flagelina o derivados de flagelina en posición vertical. En la esquina superior izquierda se muestra el monómero de la cadena proteica que contiene flagelina fusionado con los dominios de oligomerización ND2 y ND1; a la derecha, la nanopartícula coensamblada con ND3-L2-ND4-Z a una proporción de 1:59 asumiendo una simetría icosaédrica T=1. Para mayor claridad, no se muestran los marcadores de His más probablemente desordenados (X e Y).

"ND1" y "ND3": dominios de oligomerización pentaméricos; "ND2" y "ND4": dominios de oligomerización triméricos; "FLA": flagelina o derivado de flagelina; "Z": epítopo

A) Un modelo de flagelina D0-D1-D2-D3 y la correspondiente nanopartícula presentadora de epítopo.

B) Un modelo de flagelina D0-D1-D2 y la correspondiente nanopartícula presentadora de epítopo.

C) Un modelo de flagelina D0-D1 y la correspondiente nanopartícula presentadora de epítopo.

D) Un modelo de flagelina D1-D2-D3 y la correspondiente nanopartícula presentadora de epítopo.

E) Un modelo del epítopo de linfocitos B NANP (Z) fusionado con el dominio de oligomerización ND4 del núcleo ND3-L2-ND4.

Figura 2: Representación esquemática de la interacción de flagelina con TLR5.

Idealmente, la flagelina debe ser dimérica y mostrarse en una orientación volteada en las nanopartículas. La parte mostrada de las cadenas proteicas comienza con el dominio de oligomerización (p. ej., pentamérico) ND1 que está unido al dominio de oligomerización (p. ej., dimérico) ND2 mediante el enlazador L, conectado además al derivado de flagelina FLA que consiste en los dominios D2 y continuación de D1 de la flagelina hasta la punta (T). En la punta, la secuencia de D1 se une y se repliega sobre sí misma y dentro del dominio D2. Para mayor claridad, no se muestran los marcadores de His más probablemente desordenados.

A) Izquierda: un modelo del monómero. Derecha: un modelo del dímero en el que se mantiene la flagelina en la conformación dimérica derecha para la interacción con TLR5.

B) Panel superior: un modelo del dímero de flagelina que interactúa con un dímero de TLR5. Panel inferior, izquierda: un modelo de una partícula "solo de flagelina" totalmente ensamblada en una vista recortada. Derecha: un modelo de una partícula "solo de flagelina" totalmente ensamblada en una vista completa.

Figura 3: Mapa vectorial de pPEP-T.

"prom": promotor; "term": terminador; "ori": origen; "pb": pares de bases; "amp": gen de resistencia a ampicilina. Figura 4: Microfotografías electrónicas de transmisión de nanopartículas de proteínas.

Después del replegamiento y el coensamblaje de proteínas expresadas de forma recombinante, las muestras se adsorbieron en rejillas recubiertas con carbono y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo al 2%.

A) T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1: T81c-WRW-8RRVRA-T1BT*, proporción de coensamblaje 12:48 descrita en la sección "Diseño de un FLA-SAPN" y el ejemplo 6. La barra representa 500 nm.

B) T81c-8-D0-D1: T81c-8-Pf, proporción de coensamblaje 3:57 descrita en el ejemplo 8. La barra representa 200 nm. C) PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori: PD52-2i88-PANDORA-Noro, proporción de coensamblaje 5:55 descrita en el ejemplo 7. La barra representa 200 nm.

D) DIM-D0-D1: DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept, proporción de coensamblaje 5:55 descrita en el ejemplo 9. La barra representa 200 nm.

Figura 5: SDS-PAGE de la construcción LONG-D2-D1-ori de los ejemplos 1 y 5.

Esta construcción tiene un peso molecular teórico de 41,1 kDa.

CL - lisado aclarado

FT - Flujo pasante

1 - Lavado a pH 8,0 con imidazol 10 mM

2 - Lavado a pH 8,0 con NaH² PO⁴500 mM

3 - Lavado a pH 6,3

4 - Lavado a pH 5,9

5 - Lavado a pH 4,5

Elu - Elución de imidazol 250 mM con 5 y 10 pl de muestra aplicados al gel.

Figura 6: Microfotografías electrónicas de transmisión de nanopartículas proteicas de la construcción LONG-D2-D1-ori a diferentes resoluciones.

Después del replegamiento y el coensamblaje de una proteína expresada de forma recombinante, la nanopartícula se adsorbió en rejillas recubiertas con carbono y se tiñó negativamente con acetato de uranilo al 2%.

La barra representa 1000 nm, 500 nm, 200 nm y 100 nm para las imágenes superior derecha, superior izquierda, inferior derecha e inferior izquierda, respectivamente.

Figura 7: Activación de la ruta celular de TLR5.

A) Long-D2-D1-ori (ejemplo 5)

B) T81C-WRW-8RRVRA-D0-D1: T81c-WRW-8RRVRA-T1BT* (12:48) (ejemplo 6)

C) PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori: PD52-2i88-PANDORA-Noro (5:55) (ejemplo 7)

Paneles superiores: evaluación de la actividad de respuesta a la dosis

Paneles inferiores: evaluación de CE50

IMG-2205: flagelina de Salmonella typhimurium (0,29 ng/ml), control positivo.

Eje X: concentración (ng/ml) de la nanopartícula.

Eje Y: expresión de SEAP (ng/ml) o %A = % de actividad

Figura 8: Análisis de unión por ELISA de títulos de anticuerpos después de la inmunización en ratones C57BI/6 (descrito en los ejemplos 8 [panel A] y 9 [panel B]).

A)

■ T81c-8-Pf solo a una dosis de 1 |jg

• T81c-8-Pf solo a una dosis de 10 jg

X Coensamblaje de T81c-8-D0-D1 y T81c-8-Pf a una proporción de 3:57 y una dosis de 1 jg

▲ Coensamblaje de T81c-8-D0-D1 y T81c-8-Pf a una proporción de 3:57 y una dosis de 10 jg

• Coensamblaje de T81c-8-D0-D1 y T81c-8-Pf a una proporción de 9:51 y una dosis de 1 jg

)K

Coensamblaje de T81c-8-D0-D1 y T81c-8-Pf a una proporción de 9:51 y una dosis de 10 jg

Eje X: factor de dilución del suero

Eje Y: DO = densidad óptica

La placa ELISA está recubierta con el inmunógeno completo usado para la inmunización

B)

• Coensamblaje de DIM-D0-D1 y DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept a una proporción de 5:55 y una dosis de 10 jg

■ Nicotina acoplada al portador KLH a una dosis de 10 jg

Eje X: factor de dilución del suero

Eje Y: DO = densidad óptica

La placa de ELISA está recubierta solo con nicotina unida a un portador no relacionado

Figura 9: Microfotografías electrónicas de transmisión de nanopartículas proteicas de la construcción Nic-DEDDL. Después del replegamiento y el coensamblaje de una proteína expresada de forma recombinante, la nanopartícula se adsorbió en rejillas recubiertas con carbono y se tiñó negativamente con acetato de uranilo al 2%.

La barra representa 1000 nm

Figura 10: Formación de anticuerpos

Se inmunizaron s.c. grupos de tres ratones C57BI/6 con 10 jg de Nic-DEDDL (ejemplo 10) o 10 jg de Nic-KLH (nicotina acoplada al portador KLH) como control positivo en tres inyecciones cada una con una semana de diferencia. El título de anticuerpos en el día 0 (es decir, antes de la primera inyección) y luego una semana después de cada inyección se determinó mediante ELISA.

d = días después de la primera inmunización; A = título de anticuerpos (escala log2).

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se describen diferentes formas de flagelina que incorporan diferentes dominios de flagelina en cualquier orientación incorporada en las nanopartículas. Algunos de los diseños tienen flagelina unida a las nanopartículas con su extremo N y C terminal cerca de la superficie de la nanopartícula (figura 1), mientras que en otros diseños las partes distantes de la flagelina están cerca de la superficie de la nanopartícula, presentando de este modo la flagelina en la orientación opuesta en las nanopartículas (figura 2).

Dado que las respuestas inmunitarias inflamatorias son uno de los principales problemas de los adyuvantes, y en particular de los adyuvantes de unión a TLR, es beneficioso reducir su potencial para inducir respuestas inflamatorias. Se sabe que la parte C-terminal de la flagelina, que es parte del dominio D0, contiene una secuencia peptídica que interactúa con el inflamasoma y, por lo tanto, es responsable de las reacciones inflamatorias de la flagelina. Por lo tanto, se han diseñado construcciones de flagelina que carecen de la parte C-terminal del dominio D0 que activa el inflamasoma (figura 2).

La invención se refiere a una nanopartícula proteica de autoensamblaje que consiste en agregados de una multitud de unidades estructurales de fórmula (Ia) o (Ib)

X -ND1 - L1 -ND2 -F L A (la)

o

FLA-ND1 - L1 -ND2 - X (Ib),

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND1, un enlazador L1, un dominio de oligomerización de proteínas ND2, un derivado de flagelina FLA y un sustituyente adicional X, en donde

ND1 es una proteína que forma oligómeros (ND1)^m de m subunidades ND1,

ND2 es una proteína que forma oligómeros (ND2)ⁿ de n subunidades ND2,

m y n son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que m no sea igual a n y no sea un múltiplo de n, y de que n no sea un múltiplo de m,

L1 es un enlace o un enlazador flexible corto,

FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde uno o varios dominios seleccionados de los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos; X está ausente o es una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos, en donde cada uno de ND1 y ND2 es un dominio de superhélice o el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

opcionalmente coensamblada con una multitud de unidades estructurales de fórmula (II)

Y-ND3-L2-ND4-Z (II),

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND3, un enlazador L2, un dominio de oligomerización de proteínas ND4 y sustituyentes adicionales Y y Z, en donde

ND3 es una proteína que forma oligómeros (ND3)^y de y subunidades ND3,

ND4 es una proteína que forma oligómeros (ND4)^z de z subunidades ND4,

y y z son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que y no sea igual a z y no sea un múltiplo de z, y de que z no sea un múltiplo de y,

bien ND3 es idéntico a ND1, o ND4 es idéntico a ND2 o bien tanto ND3 como ND4 son idénticos a ND1 y ND2, respectivamente,

L2 es un enlace o un enlazador flexible corto que puede ser diferente de L1 o idéntico a L1, y

Y y Z están, independientemente uno de otro, ausentes o son una secuencia peptídica de 1 a 100 aminoácidos que comprende de 1 a 1000 aminoácidos.

Las nanopartículas de proteínas de esta invención ofrecen una forma muy elegante de colocalizar la molécula adyuvante con el inmunógeno de interés, por lo tanto, la propiedad adyuvante de la flagelina puede colocalizarse con el antígeno de vacuna contra el cual se desea una respuesta inmunitaria. Por coensamblaje de dos cadenas de proteínas formadoras de nanopartículas, una con flagelina o un derivado de flagelina (FLA) en una molécula de fórmula (la) o (Ib), la otra de fórmula (II) que incorpora el antígeno de interés (Y o Z), en una única nanopartícula proteica, el adyuvante y el antígeno están perfectamente colocalizados. Por lo tanto, en estos diseños, el efecto adyuvante se colocaliza con el beneficio de la presentación repetitiva de antígenos de las nanopartículas. Además, la contribución del efecto adyuvante puede aumentarse o disminuirse usando diferentes proporciones de ensamblaje de cadenas proteicas que contienen flagelina de fórmula (Ia) o (Ib) con cadenas proteicas que contienen antígeno de fórmula (II). El efecto adyuvante se adapta para optimizar entre la mejor antigenicidad y el efecto secundario más bajo.

Como se ha expuesto anteriormente, FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina pero que contiene al menos el dominio de unión a TLR5, D1. El o los dominios faltantes pueden ser sustituidos por un segmento enlazador flexible de 1 a 20 aminoácidos que une los dos extremos de la secuencia de flagelina restante, o pueden ser reemplazados por un antígeno proteico totalmente plegado. La región enlazadora flexible puede contener sitios de unión adecuados para el acoplamiento covalente de antígenos.

Las nanopartículas que contienen flagelina por sí mismas (es decir, sin coensamblaje con una cadena proteica formadora de nanopartículas que contienen antígeno) pueden usarse como un adyuvante convencional que simplemente se añade a cualquier forma de administración de antígeno en una vacuna dada.

Como una opción alternativa adicional, los antígenos pueden diseñarse como sustituyentes X en las cadenas proteicas formadoras de nanopartículas que contienen solo flagelina de fórmula (Ia) o (Ib), es decir, de nuevo sin coensamblaje con una cadena proteica formadora de nanopartículas que contiene antígeno de fórmula (II), para maximizar los beneficios del efecto adyuvante y el efecto de presentación de antígeno repetitivo, usando un antígeno X como epítopo de linfocitos B y el derivado de flagelina FLA como adyuvante.

Dado que en la arquitectura de la flagelina la cadena proteica se ejecuta como un bucle a través de todos los dominios D0, D1, D2 y D3 y viceversa, se pueden eliminar uno o varios dominios de la secuencia al unir los dos extremos en una cadena peptídica continua que da como resultado un derivado de flagelina FLA. Por lo tanto, una construcción de derivado de flagelina que carece de los dominios D2 y D3 de la flagelina se puede diseñar fácilmente, simplemente conectando la cadena proteica en la interfaz de los dominios D1 y D2. De manera simlar, los dominios de la punta (ya sea D3, o D2 y D3 juntos) pueden reemplazarse por un antígeno proteico, siempre que este antígeno proteico con sus extremos N y C se pueda conectar a los extremos N y C en la interfaz entre D1 y D2. Los dominios de la punta D2 y D3 también pueden reemplazarse por una secuencia peptídica con residuos adecuados para el acoplamiento covalente de moléculas de antígeno. Un ejemplo de dicho bucle peptídico es la secuencia KYKDGDKGDDK (SEQ ID NO:1), que contiene cuatro residuos de lisina para el acoplamiento covalente a su grupo amino primario. Dicho bucle hidrófilo que incorpora residuos de lisina proporciona sitios de acoplamiento para la unión covalente de moléculas de ligando al aminoácido primario de la cadena lateral de la lisina. Reemplazar los residuos de lisina dentro de la secuencia de flagelina por arginina elimina los sitios de acoplamiento no deseados en el resto de la molécula. Estas dos modificaciones dan un derivado de flagelina con la siguiente secuencia:

MAQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRGLTQASR

NANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQF

HGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDA

ALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVL

AQANQVPQNVLSLLR (SEQ ID NO: 28)

Un alcance adicional de esta invención es diseñar la flagelina como un dímero sobre la nanopartícula. Por lo tanto, la interacción con TLR5, que también es un dímero, se optimiza. Esto se consigue fácilmente usando un dominio de oligomerización de proteínas dimérico como ND1 (m es 2) o ND2 (n es 2) y se usa como sitio de unión para el derivado de flagelina FLA, es decir, como se muestra en la fórmula (Ib) o (Ia), respectivamente. Esto forzará al derivado de la flagelina a una forma dimérica, que interactúa más fácilmente con TLR5 (figura 2). Preferiblemente, en un diseño tal, el dominio de oligomerización dimérico en la unidad estructural de la fórmula (Ia) o (Ib) al que está unida la flagelina (ya sea ND2 en la fórmula (Ia) o ND1 en la fórmula (Ib)) es diferente del dominio de oligomerización correspondiente en la unidad estructural de fórmula (II) (ya sea ND4 cuando se coensambla con cadenas de fórmula (Ia), o ND3 cuando se coensambla con cadenas de fórmula (Ib)). Preferiblemente, el dominio de oligomerización diméico en la unidad estructural de fórmula (Ia) o (Ib) tiene una interacción, es decir, un potencial de formación de dímeros, más potente que el dominio de oligomerización correspondiente (ND3 o ND4) en la unidad estructural de fórmula (II). Esto garantizará que, en una nanopartícula coensamblada con unidades estructurales de fórmula (Ia) o (Ib) y fórmula (II), la flagelina o el derivado de flagelina FLA siempre forma un dímero en unidades estructurales adyacentes de fórmula (Ia) o (Ib) y no se distribuye como un monómero único por toda la nanopartícula coensamblada.

Además, diseñando la flagelina en la orientación volteada, preferentemente como un dímero, sobre la nanopartícula, la interacción con el dímero de TLR5 puede optimizarse (figura 2). Se prefiere dicha nanopartícula. Por ejemplo, una construcción de flagelina D1-D2 puede diseñarse uniendo las cadenas proteicas con una secuencia peptídica como KAKKKDGKDDKDS (SEQ ID n O: 29, "T" en la figura 2) en la interfaz entre el dominio D0 y D1, omitiendo de este modo el dominio D0 , y eliminando el dominio D3 completamente sin unir las cadenas proteicas. En consecuencia, la molécula de flagelina resultante tendrá sus extremos N y C en el dominio D2 para dar una secuencia D2-D1 como

SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRST

ANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKHANDGISIAQTTEGALNEIHN

NLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDG

ETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV

(SEQ ID NO:30)

Se podrían usar secuencias enlazadoras flexibles similares ("T" en la figura 2) con de 1 a 20 aminoácidos como, por ejemplo, GS o GKDGKDGS (SEQ ID NO:31) o GKDGKDGKDGKDGS (SEQ ID NO: 32). Preferiblemente, las secuencias enlazadoras contienen principalmente aminoácidos cargados o polares intercalados con residuos de glicina para hacer que el enlazador sea flexible. Para evitar los sitios de acoplamiento no deseados en esta construcción D2-D1, los residuos de lisina son reemplazados por residuos de arginina.

El derivado de la flagelina FLA tiene que estar conectado a un dominio de oligomerización dimérico ND1 o ND2 en la parte D2 de la flagelina. La preparación de una nanopartícula a partir de dicha unidad estructural, ya sea sola o conensamblada con una unidad estructural correspondiente de fórmula (II), formará una nanopartícula preferida con un derivado de flagelina en orientación volteada.

Unidades estructurales monoméricas

Un péptido (o polipéptido o proteína) es una cadena o secuencia de aminoácidos covalentemente unidos por enlaces amida. El péptido puede ser natural, modificado natural, parcialmente sintético o totalmente sintético. Se entiende que natural modificado, parcialmente sintético o totalmente sintético significa que no se aparece en la naturaleza. El término aminoácido abarca tanto aminoácidos de origen natural seleccionados de los 20 a-L-aminoácidos naturales esenciales, aminoácidos sintéticos, tales como a-D-aminoácidos, ácido 6-aminohexanoico, norleucina, homocisteína o similares, así como los aminoácidos naturales que se han modificado de alguna manera para alterar ciertas propiedades tales como la carga, tales como fosfoserina o fosfotirosina, u otras modificaciones tales como n-octanoilserina, o similares. En derivados de aminoácidos, el grupo amino que forma el enlace amida se alquila, o las funciones amino, hidroxi o tio de la cadena lateral se alquilan o acilan, o la función carboxi de la cadena lateral se amida o se esterifica. Preferiblemente, una proteína de la invención comprende aminoácidos seleccionados de los 20 a-L-aminoácidos naturales esenciales.

En una aproximación grosera, los péptidos pueden distinguirse de las proteínas tomando como base su tamaño, es decir, aproximadamente una cadena de 50 aminoácidos o menos puede considerarse un péptido, mientras quelas cadenas más largas pueden considerarse proteínas. Los dipéptidos son los péptidos más cortos y consisten en 2 aminoácidos unidos por un solo enlace peptídico. Del mismo modo, los tripéptidos consisten en tres aminoácidos, los tetrapéptidos consisten en cuatro aminoácidos, etc. Un polipéptido es una cadena peptídica larga, continua y no ramificada. En la bibliografía, los límites del tamaño que distinguen los péptidos de las proteínas son algo débiles. A veces, los "péptidos" largos, tales como el beta amiloide, se han considerado proteínas, y viceversa, las proteínas más pequeñas, tales como la insulina, se han denominado péptidos.

Una cadena enlazadora flexible corta L1 o L2 se selecciona de átomos de carbono opcionalmente sustituidos, átomos de nitrógeno opcionalmente sustituidos, átomos de oxígeno, átomos de azufre y combinaciones de los mismos, con preferiblemente de 1 a 60 átomos, en particular de 1 a 20 átomos en la cadena. Una cadena enlazadora flexible corta de este tipo es, p. ej., una cadena de polietilenoxi, una cadena de azúcar flexible o, preferiblemente, una cadena peptídica flexible, p. ej., una cadena peptídica que consta de 1 a 20 aminoácidos, en particular de 1 a 6 aminoácidos que comprenden uno o varios aminoácidos glicina. Los enlazadores más preferidos consisten en 1 a 6 aminoácidos con un alto contenido de glicina.

Los dominios de oligomerización según la invención son preferiblemente superhélices. Una superhélice es una secuencia proteica con un patrón contiguo de residuos principalmente hidrófobos separados por 3 y 4 residuos, que se ensambla para formar un haz multimérico de hélices, como se explicará con más detalle a continuación.

Los dominios de oligomerización, que no son superhélices, son, por ejemplo, el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4 (Tao, Y. y otros., Structure 1997, 5:789-798)

Los dominios de oligomerización ND1, ND2, ND3 y/o ND4, y los enlazadores L1 y/o L2 pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente por entidades de direccionamiento, o sustituyentes que refuerzan las propiedades adyuvantes de la nanopartícula, tales como un ácido nucleico inmunoestimulador, preferiblemente un oligodesoxinucleótido que contiene desoxinosina, un oligodesoxinucleótido que contiene desoxiuridina, un oligodesoxinucleótido que contiene un motivo CG, CpG, imiquimod, resiquimod, gardiquimod, una molécula de ácido nucleico que contiene inosina y citidina, o similares. Otros sustituyentes que refuerzan las propiedades adyuvantes de la nanopartícula son los péptidos antimicrobianos, tales como péptidos catiónicos, que son una clase de moléculas inmunoestimuladoras cargadas positivamente que son capaces de facilitar y/o mejorar las respuestas inmunitarias adaptativas. Un ejemplo de un péptido de este tipo con propiedades inmunopotenciadoras es el péptido antimicrobiano artificial cargado positivamente KLKLLLLLLKLK (SEQ ID NO:2) que induce una potente inmunidad adaptativa impulsada por el tipo 2 específico de proteínas después de inmunizaciones de sensibilización y de refuerzo. Una entidad de direccionamiento particular considerada como sustituyente es una señal de direccionamiento al RE, es decir, un péptido señal que induce el transporte de una proteína o péptido al retículo endoplasmático (RE).

Los sustituyentes opcionales, p. ej., aquellos sustituyentes opcionales descritos anteriormente en la presente memoria, están conectados preferiblemente a aminoácidos adecuados cerca del extremo y opuestos al extremo unido a L1 o L2 del dominio de oligomerización ND1, ND2, ND3 y/o ND4. En el autoensamblaje de la nanopartícula proteica, dichos sustituyentes se presentarán a continuación en la superficie de la nanopartícula. Dichos sustituyentes pueden estar conectados al extremo de la cadena proteica continua, o pueden estar conectados a un grupo funcional de cadena lateral de un aminoácido ubicado cerca del extremo de ND1, ND2, ND3 y/o ND4 opuesto al extremo unido a L1 o L2.

En la realización más preferida, el sustituyente es un sustituyente peptídico o proteico y se denomina X, Y y/o Z que representa una extensión simple de la cadena proteica, p. ej., como X - ND1 - L1 - ND2 - FLA en el extremo N-terminal de ND1, o en ambos extremos como Y - ND3 - L2 - ND4 - Z para generar una secuencia proteica continua única combinada, que puede expresarse en un sistema de expresión de proteínas recombinantes como una sola molécula.

En otras realizaciones, un sustituyente peptídico o no peptídico puede estar conectado a un grupo funcional de cadena lateral de un aminoácido ubicado cerca del extremo de ND1, ND2, ND3 y/o ND4 opuesto al extremo unido a L1 o L2, o preferiblemente a un grupo funcional de cadena lateral de un aminoácido dentro de las extensiones X, Y y/o Z si X, Y y/o Z son péptidos o proteínas.

También es posible unir un sustituyente al enlazador L1 o L2. En tal caso, después del replegamiento de la nanopartícula de proteína de autoensamblaje, el sustituyente se ubicará en la cavidad interna de la nanopartícula proteica de autoensamblaje.

Una tendencia a formar oligómeros significa que dichas proteínas pueden formar oligómeros dependiendo de las condiciones, p. ej., en condiciones de desnaturalización son monómeros, mientras que en condiciones fisiológicas pueden formar, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros o pentámeros. En condiciones predefinidas, adoptan un solo estado de oligomerización, que es necesario para la formación de nanopartículas. Sin embargo, su estado de oligomerización se puede cambiar tras cambiar las condiciones, p. ej. de dímeros a trímeros tras aumentar la concentración de sal (Burkhard P. y otros., Protein Science 2000, 9:2294-2301) o de pentámeros a monómeros tras disminuir el pH.

Una arquitectura de unidades estructurales según la fórmula (Ia), (Ib) o (II) es claramente distinta de las proteínas de la cápsida viral. Las cápsidas virales están compuestas por una sola proteína, que forma oligómeros de 60 o un múltiplo del mismo, como p. ej., las partículas del virus de la hepatitis B (Ep 1262 555, EP 0201 416), o de más de una proteína, que se conensamblan para formar la estructura de la cápsida viral, que puede adoptar también otras geometrías distintas de icosahédrica, dependiendo del tipo de virus (Fender P. y otros., Nature Biotechnology 1997, 15:52-56). Las nanopartículas proteicas de autoensamblaje (SAPN) de la presente invención también son claramente distintas de las partículas similares a virus, ya que (a) están construidas a partir de proteínas distintas de las de la cápsida viral y (b) que la cavidad en el medio de la nanopartícula es demasiado pequeña para acomodar el ADN/ARN de un genoma viral completo.

Los dominios de oligomerización de proteínas son bien conocidos (Burkhard P. y otros., Trends Cell Biol 2001, 11:82-88). La base de datos de estructura de proteínas RCSB-PDB (http://www.rcsb.org/) contiene estructuras atómicas de proteínas. Este sitio web ofrece herramientas para identificar oligómeros de proteínas entre esas estructuras atómicas. El uso del modo de búsqueda avanzada (http://www.rsb.org/pdb/search/advSearch.do) con el calificador "A5" en "Estequiometría de proteínas" recupera los dominios de oligomerización de proteínas pentaméricos. El uso del modo de búsqueda avanzada con el calificador "Proteínas de superhélice" en el "Navegador de clasificación SCOP" recupera los dominios de oligomerización de proteínas de superhélice. La combinación de las dos búsquedas recupera todas las estructuras de proteínas de superhélice pentaméricas en la base de datos. Del mismo modo, las estructuras de superhélice dímeras, triméricas o tetraméricas se pueden recuperar usando "A2", "A3" o "A4" como calificadores, respectivamente. En la presente invención, los dominios de oligomerización ND1, ND2, ND3 y ND4 son preferiblemente dominios de superhélice. Una superhélice es una secuencia proteica con un patrón contiguo de residuos principalmente hidrófobos separados por 3 y 4 residuos, generalmente en una secuencia de siete aminoácidos (repetición heptada) u once aminoácidos (repetición undecada), que se ensambla (se pliega) para formar un haz multimérico de hélices. También se contemplan superhélices con secuencias que incluyen alguna distribución irregular de la separación de 3 y 4 residuos. Los residuos hidrófobos son, en particular, los aminoácidos hidrófobos Val, Ile, Leu, Met, Tyr, Phe y Trp. Principalmente hidrófobo significa que al menos el 50% de los residuos deben seleccionarse de los aminoácidos hidrófobos mencionados.

Por ejemplo, en una unidad estructural monomérica preferida de fórmula (Ia), (Ib) o (II), ND1, ND2, ND3 y ND4 son proteínas de cualquiera de las fórmulas

[aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)]^x (IIIa),

[aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)]^x (IlIb),

[aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)]^x (IIIc),

[aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)]^x (IIId),

[aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)]^x (IIIe),

[aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)]^x (IIIf),

[aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)]^x (IIIg),

en las que aa significa un aminoácido o un derivado del mismo, aa(a), aa(b), aa(c), aa(d), aa(e), aa(f) y aa(g) son los mismos o diferentes aminoácidos o derivados de los mismos, preferiblemente aa(a) y aa(d) son los mismos o diferentes aminoácidos hidrófobos o derivados de los mismos; y x es una cifra entre 2 y 20, preferiblemente entre 3 y 10. Una heptada es un heptapéptido de fórmula aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g) (IIIa) o cualquiera de sus permutaciones de fórmulas (IIIb) a (IIIg).

Se prefieren las unidades estructurales monoméricas de fórmula (Ia), (Ib) o (II) en donde todos los dominios de oligomerización de proteínas ND1, ND2, ND3 y ND4 son

1. (1) una proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde x es 3, y aa(a) y aa(d) se seleccionan de los 20 a-L-aminoácidos naturales de manera que la suma de las puntuaciones de la tabla 1 para estos 6 aminoácidos sea al menos 14, y dichas proteínas comprendan hasta 17 heptadas más; o

2. (2) una proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde x es 3, y aa(a) y aa(d) se seleccionan de los 20 a-L-aminoácidos naturales de manera que la suma de las puntuaciones de la tabla 1 para estos 6 aminoácidos sea al menos 12, con la condición de que un aminoácido aa(a) sea un aminoácido cargado capaz de formar un puente salino inter-helicoidal a un aminoácido aa(d) o aa(g) de una heptada vecina, o que un aminoácido aa(d) sea un aminoácido cargado capaz de formar un puente salino inter-helicoidal a un aminoácido aa(a) o aa(e) de una heptada vecina, y proteínas de este tipo que comprenden hasta dos heptadas adicionales. Un aminoácido cargado capaz de formar un puente salino inter-helicoidal a un aminoácido de una heptada vecina es, por ejemplo, Asp o Glu si el otro aminoácido es Lys, Arg o His, o viceversa.

Tabla 1: Puntuaciones de aminoácidos para determinación de preferencia

También se prefieren unidades estructurales monoméricas de fórmula (la), (Ib) o (II) en donde uno o más dominios de oligomerización de proteínas ND1, ND2, ND3 o ND4 se seleccionan de las siguientes proteínas preferidas:

(11) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde

aa (a) se selecciona de Val, Ile, Leu y Met, y un derivado de los mismos, y

aa (d) se selecciona de Leu, Met, Val e Ile, y un derivado de los mismos.

(12) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde un aa(a) es Asn y el otro aa(a) se selecciona de Asn, Ile y Leu, y aa(d) es Leu. Dicha proteína es habitualmente un dominio de dimerización.

(13) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde aa(a) y aa(d) son ambos Leu o ambos Ile. Dicha proteína es habitualmente un dominio de trimerización.

(14) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde aa(a) y aa(d) son ambos Trp. Dicha proteína es habitualmente un dominio de pentamerización.

(15) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde aa(a) y aa(d) son ambos Phe. Dicha proteína es habitualmente un dominio de tetramerización.

(16) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde aa(a) y aa(d) son Trp o Phe. Dicha proteína es habitualmente un dominio de pentamerización.

(17) Proteína de cualquiera de las fórmulas (IIIa) a (IIIg) en donde aa(a) es Leu o Ile, y un aa(d) es Gln y el otro aa(d) se seleccionan de Gln, Leu y Met. Dicha proteína tiene el potencial de ser un dominio de pentamerización.

Otras proteínas preferidas son las proteínas (1), (2), (11), (12), (13), (14), (15), (16) y (17) como se definieron anteriormente en la presente memoria, y en donde además

(21) al menos un aa(g) se selecciona de Asp y Glu y aa(e) en una heptada siguiente es Lys, Arg o His; y/o

(22) al menos un aa(g) se selecciona de Lys, Arg y His, y aa(e) en una heptada siguiente es Asp o Glu, y/o

(23) al menos un aa(de a a g) se selecciona de Lys, Arg y His, y un aa(de a a g) con 3 o 4 aminoácidos separados en la secuencia es Asp o Glu. Dichos pares de aminoácidos aa(de a a g) son, por ejemplo, aa(b) y aa(e) o aa(f).

Programas de predicción de superhélices, tales como PCOILS (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils; Gruber M. y otros., J. Struct. Biol. 2006155 140-5) o MULTICOIL (http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi) pueden predecir secuencias de proteínas formadoras de superhélices. Por lo tanto, en una unidad estructural monomérica de fórmula (Ia), (Ib) o (II), ND1, ND2, ND3 y ND4 son proteínas que contienen al menos una secuencia de dos repeticiones de heptadas que es predicha por el programa de predicción de superhélices PCOILS para formar una superhélice con una probabilidad mayor que 0,9 para todos sus aminoácidos con al menos uno de los tamaños de ventana de 14, 21 o 28.

En una unidad estructural monomérica más preferida de fórmula (Ia), (Ib) o (II), ND1, ND2, ND3 y ND4 son proteínas que contienen al menos una secuencia de tres repeticiones de heptadas que es predicha por el programa de predicción de superhélices PCOILS para formar una superhélice con una probabilidad mayor que 0,9 para todos sus aminoácidos con al menos uno de los tamaños de ventana de 14, 21 o 28.

En otra unidad estructural monomérica más preferida de fórmula (Ia), (Ib) o (II), ND1, ND2, ND3 y ND4 son proteínas que contienen al menos dos secuencias independientes de dos repeticiones de heptadas que son predichas por el programa de predicción de superhélices PCOILS para formar una superhélice con una probabilidad mayor que 0,9 para todos sus aminoácidos con al menos uno de los tamaños de ventana de 14, 21 o 28.

Las secuencias de superhélice conocidas pueden recuperarse de bancos de datos tales como el banco de datos de proteínas RCSB (http://www.rcsb.org).

Las más preferidas son las secuencias de superhélice y las unidades estructurales monoméricas descritas en los ejemplos.

En aún otra realización preferida, un dominio de oligomerización ND1, ND2, ND3 o ND4 es el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4 (Tao, Y. y otros., Structure 1997, 5:789-798) o un derivado del mismo. Este dominio de trimerización tiene la secuencia GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSt Fl (SEQ ID NO:3). También se contemplan pequeñas modificaciones de este dominio.

Nanopartículas proteicas de autoensamblaje: unidades de MCM

Las nanopartículas proteicas de autoensamblaje (SAPN) se forman a partir de unidades estructurales monoméricas de fórmula (Ia), (Ib) o mezclas de unidades estructurales monoméricas de fórmula (Ia) o (Ib) con unidades estructurales monoméricas de fórmula (II). Si dichas unidades estructurales se ensamblan, formarán las llamadas "unidades de MCM". El número de unidades estructurales monoméricas, que se ensamblarán en una unidad de MCM de este tipo, se definirá por el mínimo común múltiplo (MCM). Por lo tanto, si, por ejemplo, los dominios de oligomerización de la unidad estructural monomérica forman un pentámero (ND1)5(m=5) y un dímero (ND2)2(n=2), 10 monómeros formarán una unidad de MCM. Si el segmento enlazador L tiene la longitud adecuada, esta unidad de MCM se puede ensamblar en forma de una nanopartícula proteica esférica.

Las nanopartículas proteicas de autoensamblaje (SAPN) pueden formarse por el ensamblaje de solo una o más de una unidades de m Cm (tabla 2). Dichas SAPN representan estructuras topológicamente cerradas.

Poliedros regulares

Existen cinco poliedros regulares, el tetraedro, el cubo, el octaedro, el dodecaedro y el icosaedro. Tienen diferentes elementos internos de simetría rotacional. El tetraedro tiene un eje de 2 veces y dos ejes de 3 veces, el cubo y el octaedro tienen un eje de simetría rotacional de 2 veces, uno de 3 veces, y uno de 4 veces y el dodecaedro y el icosaedro tienen un eje de simetría rotacional de 2 veces uno de 3 veces y uno de 5 veces. En el cubo, la orientación espacial de estos ejes es exactamente la misma que en el octaedro, y también en el dodecaedro y en el icosaedro, la orientación espacial de estos ejes unos con respecto otros es exactamente la misma. Por lo tanto, para el fin de SAPN de la invención, el dodecaedro y el icosaedro pueden considerarse idénticos. El dodecaedro/icosaedro se construye a partir de 60 unidades estructurales tridimensionales idénticas (tabla 2). Estas unidades estructurales son las unidades asimétricas (UA) del poliedro. Son pirámides y los bordes de la pirámide corresponden a uno de los ejes de simetría rotacional, por lo tanto, estas UA llevarán en sus bordes elementos de simetría de 2, 3 y 5 veces. Si estos elementos de simetría se generan a partir de dominios de oligomerización de proteínas, dichas UA se construyen a partir de unidades estructurales monoméricas como se describió anteriormente. Es suficiente alinear los dos dominios de oligomerización ND1 y ND2, o ND3 y ND4 a lo largo de dos de los ejes de simetría de la UA. Si estos dos dominios de oligomerización forman oligómeros estables, la interfaz de simetría a lo largo del tercer eje de simetría se generará automáticamente, y puede estabilizarse optimizando las interacciones a lo largo de esta interfaz, p. ej., interacciones hidrófobas, hidrófilas o iónicas, o enlaces covalentes, tales como puentes disulfuro.

Tabla 2: Posibles combinaciones de estados de oligomerización en la formación de poliedros regulares

Ensamblaje para nanopartículas proteicas de autoensamblaje (SAPN) con simetría poliédrica regular

Para generar nanopartículas proteicas de autoensamblaje (SAPN) con una geometría regular (dodecaedro, icosaedro, octaedro, cubo), se necesita más de una unidad de m Cm . P.ej., para formar un icosaedro a partir de un monómero que contiene dominios de oligomerización triméricos y pentaméricos, se necesitan 4 unidades de MCM, cada una compuesta por 15 unidades estructurales monoméricas, es decir, la nanopartícula proteica con geometría regular estará compuesta por 60 unidades estructurales monoméricas. Las combinaciones de los estados de oligomerización de los dos dominios de oligomerización necesarios y el número de unidades de MCM para formar los dos poliedros posibles se enumeran en la tabla 2.

Si las unidades de MCM se ensamblarán adicionalmente para formar poliedros regulares compuestos por más de una unidad de MCM, depende del alineamiento geométrico de los dos dominios de oligomerización ND1 y ND2, o ND3 y ND4 entre sí, especialmente en el ángulo entre los ejes de simetría rotacional de los dos dominios de oligomerización. Esto se rige principalmente por i) las interacciones entre dominios vecinos en una nanopartícula, ii) la longitud del segmento enlazador L, iii) la forma de los dominios de oligomerización individuales. Este ángulo es mayor en las unidades de MCM en comparación con la disposición en un poliedro regular. Además, este ángulo no es idéntico en las unidades estructurales monoméricas en comparación con el poliedro regular. Si este ángulo está restringido a los valores más pequeños del poliedro regular (por medio de interacciones hidrófobas, hidrófilas o iónicas atrayentes, o un puente de disulfuro covalente entre los dos dominios de oligomerización) y el segmento enlazador L es lo suficientemente corto, un número dado de unidades de MCM que contienen, cada una, un número definido de unidades estructurales monoméricas hibridarán aún más para formar un poliedro regular (tabla 2), o encerrarán más unidades estructurales monoméricas a partir de nanopartículas que carezcan de la estricta simetría interna de un poliedro.

Si el ángulo entre los dos dominios de oligomerización es suficientemente pequeño (incluso más pequeño que en un poliedro regular con simetría icosaédrica), entonces un gran número (varios cientos) de cadenas proteicas pueden ensamblarse en una nanopartícula proteica. En un diseño de este tipo, las SAPN pueden tener un peso molecular que corresponde a varias veces 60 cadenas proteicas similares a las arquitecturas descritas por la teoría de la cuasiequivalencia o la teoría del mosaico de las cápsidas virales para las arquitecturas de virus "totalmente pentaméricas".

Preferiblemente, los antígenos que estarán comprendidos en las nanopartículas que contienen flagelina pueden ser epítopos de linfocitos B y/o epítopos de linfocitos T y se seleccionan del grupo que consiste en

(a) proteínas o péptidos adecuados para inducir una respuesta inmunitaria contra células cancerosas;

(b) proteínas, péptidos o carbohidratos adecuados para inducir una respuesta inmunitaria contra enfermedades infecciosas; (c) proteínas o péptidos adecuados para inducir una respuesta inmunitaria contra alérgenos; (d) hormonas proteicas o peptídicas adecuadas para inducir una respuesta inmunitaria para el tratamiento de una enfermedad humana; y (e) moléculas de hapteno adecuadas para inducir una respuesta inmunitaria para tratar las adicciones u otros trastornos. Las nanopartículas proteicas que comprenden dichas proteínas, fragmentos peptídicos de las mismas, péptidos, carbohidratos o haptenos pueden ser adecuados para inducir una respuesta inmunitaria en seres humanos, o también en animales de granja y mascotas.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a unidades estructurales monoméricas de fórmula (Ia) o (Ib) como se definió anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende una nanopartícula proteica como se describe en la presente memoria. Dicha composición es particularmente adecuada como vacuna. Las composiciones de vacuna preferidas comprenden la nanopartícula proteica en una solución tampón acuosa y pueden comprender además, por ejemplo, excipientes derivados de azúcar (tales como glicerol, trehalosa, sacarosa o similares) o excipientes derivados de aminoácidos (tales como arginina, prolina, glutamato, o similares) o detergentes aniónicos, catiónicos, no iónicos o de zwitteriónicos (tales como colato, desoxicolato, tween o similares) o cualquier tipo de sal (tal como NaCl, MgCh o similares) para ajustar la fuerza iónica de la solución.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de vacunación de un ser humano o animal no humano, que comprende administrar una cantidad eficaz de una nanopartícula proteica como se describió anteriormente en la presente memoria a un sujeto que necesita dicha vacunación.

Diseño de una FLA-SAPN (nanopartícula proteica de autoensamblaje que contiene flagelina)

Un ejemplo particular de una FLA-SAPN según la invención son las siguientes construcciones "FLA-SAPN-1a" y "FLA-SAPN-2".

T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1 (FLJB_SALTY)(FLA-SAPN-1a) que corresponde a la fórmula (Ia)

Dichas construcciones están compuestas por las siguientes estructuras parciales:

Para facilitar la purificación, la FLA-SAPN-1a comienza con la secuencia X como se define en la fórmula (Ia) o (Ib):

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGS (SEQ ID NO:6)

que contiene un marcador His para purificación por afinidad a níquel y en los sitios de restricción a nivel de ADN para una subclonación adicional (Ncol, Nhel, BamHI).

Para ND1 se eligió un dominio de pentamerización (m=5). La superhélice pentamérica particular es una modificación novedosa del dominio de pentamerización de cremallera de triptófano (Liu J. y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(46):16156-61, entrada pdb 1T8Z).

El dominio de pentamerización de cremallera de triptófano original tiene la secuencia SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT (SEQ ID NO:12).

La secuencia de superhélice modificada del dominio de pentamerización usado para FLA-SAPN-1a comienza en la posición 13, termina en la posición 49 y contiene ligeras variaciones de secuencia en el extremo C-terminal (RALWM en lugar de NQRWD) pero manteniendo el patrón de repetición de heptada de los residuos de triptófano como en la secuencia original (SEQ ID NO:12).

13- WQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWM-49 (SEQ ID NO:7).

Esta secuencia se extiende a continuación mediante el enlazador corto L1 (GG) de dos residuos de glicina, a continuación se conecta con el dominio de trimerización ND2 de la siguiente secuencia, que es un trímero de superhélice extremadamente estable:

RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG (SEQ ID NO:8)

Se ha demostrado que un trímero se forma incluso en condiciones de desnaturalización total de una SDS-PAGE (figura 5). También contiene la cadena RFVAAWTLRVRA de epítopo HTL de unión a pan-DR, que es un derivado de la secuencia PADRE con propensión a superhélice trimérica optimizada.

En la FLA-SAPN-1a, la parte "FLA" de fórmula 1a se compone de los dominios D0 y D1 de la flagelina de Salmonella typhimurium (como en la patente US 8,420,102) con la siguiente secuencia

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTA

NIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSI

QAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTL

GLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN

TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:9)

Este diseño da como resultado la siguiente secuencia que se usó para la expresión, la purificación y el análisis biofísico de proteínas:

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRA

LWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEI

ARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANR

FTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDL

DSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINS

QTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITN

LGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:4)

En la figura 1C se muestra un modelo de monómero FLA-SAPN-1a.

La construcción correspondiente "FLA-SAPN-2" es la siguiente:

Para facilitar la purificación, la FLA-SAPN-2 comienza con la secuencia Y como se define en la fórmula (II) MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGS (SEQ ID NO:10)

que contiene un marcador His para la purificación por afinidad a níquel, la secuencia del epítopo de linfocitos T, T1BT* (Calvo-Calle J.M., Infection and immunity 2006:6929-6939) de la proteína CS de Plasmodium falciparum EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT (SEQ ID NO:13)

con una cisteína reemplazada por una serina y en los sitios de restricción a nivel de ADN para una subclonación adicional (Ncol, Nhel, BamHI) y, por lo tanto, es algo diferente de "X" de FLA-SAPN-1a.

ND3 en FLA-SAPN-2 es completamente idéntico a ND1 en FLA-SAPN-1a para garantizar el coensamblaje correcto.

13- WQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWM-49 (SEQ ID NO:7).

Esta secuencia se extiende a continuación mediante el enlace corto L2 (GG) de dos residuos de glicina, que también es idéntico a FLA-SAPN-la.

En FLA-SAPN-2, el enlazador se conecta a continuación con el dominio de trimerización ND4 de la siguiente secuencia

RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG (SEQ ID NO:8)

que es exactamente igual que en FLA-SAPN-1a, por lo tanto, los núcleos ND1-L1-ND2 y ND3-L2-ND4 y de las nanopartículas FLA-SAPN-1a y FLA-SAPN-2 son completamente idénticos y garantizan un coensamblaje adecuado de la cadena de dos proteínas al replegarse.

En el FLA-SAPN-2, la parte "Z" de fórmula (II) está compuesta por la región de repetición de la proteína circumsporozoito (CSP) de Plasmodium falciparum, que contiene tres repeticiones de (NANP) y algunas modificaciones de la misma (DPNANPNVDPNANPNV, SEQ ID NO:14) que se producen en la secuencia de la proteína CS nativa y es el epítopo de linfocitos B, al cual se debe generar una respuesta inmunitaria. Está enlazada a la partícula por la secuencia SG:

SGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ ID NO:11)

Este diseño da como resultado la siguiente secuencia que se usó para la expresión, la purificación y el análisis biofísico de proteínas:

MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQA

WRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRL

EELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ IDNO:5)

En la figura 1C se muestra un modelo de monómero FLA-SAPN-2.

En la figura 1C se muestra un modelo de una nanopartícula coensamblada a partir de FLA-SAPN-1a y FLA-SAPN-2 a una proporción de 1:59, asumiendo una simetría icosaédrica T=1.

En la figura 4 se muestra una imagen de ME de las proteínas FLA-SAPN-1a y FLA-SAPN-2 coensambladas a una proporción de 48:12.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 -3 Clonación

El ADN que codifica las construcciones de nanopartículas se preparó usando procedimientos estándar de biología molecular. Plásmidos que contienen el ADN que codifica la secuencia proteica LONG-D2-D1-ori

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRA

LWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEI

ARGSGSSARLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAGKTMFIDKTASG

VSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSRNANDG

ISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVS

NQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATV

GDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAV (SEQ ID NO:15)

se construyeron mediante clonación en los sitios de restricción NcoI/EcoRI de la construcción de expresión básica de SAPN de la figura 3.

Para esta construcción no hay una etapa de mezcla/coensamblaje de dos construcciones diferentes. El inmunógeno de la vacuna se generará uniendo covalentemente los epítopos de la vacuna, tales como la nicotina, al portador que ya incorpora el derivado de flagelina, preferentemente a los residuos de lisina.

Esta construcción está compuesta por una cremallera de triptófano de superhélice pentamérica (ND1) enlazada por dos residuos de glicina (GG) a una superhélice (ND2) diseñada de de novo trimérica que contiene una cadena de epítopo CD4 de unión a panDR ERFVAAWTLRv Ra L (SEQ ID NO:16). En el extremo N contiene un marcador de His y un sitio de escisión de trombina (X). Esta arquitectura del núcleo X - ND1 - L1 - ND2 se describió en detalle anteriormente. En el extremo C, una construcción de flagelina (FLA) compuesta por los dominios D1 y D2 de la flagelina de Salmonella de la estructura con código pdb 3V47 (banco de datos de proteínas RCSB) adjunta. Los residuos 348 a 447 que abarcan partes de los dominios D1 y D2 están enlazados a los residuos 24 a 214 que nuevamente abarcan partes de D1 y D2 en la dirección opuesta por medio de un único residuo de glicina. Este diseño une las moléculasde flagelina D1 y D2 a las nanopartículas de tal manera que el dominio D1 se muestra en la superficie exterior de la nanopartícula y el sitio de unión a TLR5 está expuesto a la superficie de la nanopartícula (figura 2a). En contraste con la figura 2, la superhélice ND2 diseñada de novo es una superhélice trimérica.

Ejemplo 2 - Expresión

Los plásmidos se transformaron en células de Escherichia coli BL21 (DE3), que se cultivaron en caldo Luria con ampicilina a 37°C. La expresión se indujo con isopropil p-D-tiogalactopiranósido. Cuatro horas después de la inducción, las células se retiraron de 37°C y se recogieron mediante centrifugación a 4.000 x g durante 15 min. El sedimento celular se almacenó a -20°C. El sedimento se descongeló en hielo y se suspendió en un tampón de lisis que consistía en urea 9 M, NaH² PO⁴ 100 mM, Tris 10 mM pH 8, imidazol 20 mM y Tris-2-carboxietilfosfina (TCEP) 0,2 mM.

Alternativamente, también se pueden usar otras líneas celulares para la expresión, tales como células KRX. La expresión de células KRX se puede realizar con el protocolo de autoinducción temprana de células KRX usando el precultivo O/N a 37 grados con Amp (100 pg/ml) y glucosa (0,4%). Diluyendo los precultivos de O/N a 1:100 en el cultivo de expresión que contiene Amp (100 pg/ml), glucosa (0,05%) y ramnosa (0,1%) a 25°C durante 24 horas. El nivel de expresión de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y se muestra en la figura 5. La construcción forma monómeros, trímeros y tetrámeros incluso en las condiciones de desnaturalización de la SDS-PAGE.

Ejemplo 3 - Purificación

Las células se lisaron por sonicación y el lisado se retiró mediante centrifugación a 30.500 x g durante 45 min. El lisado aclarado se incubó con perlas de agarosa Ni-NTA Agarose Beads (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.) durante al menos 1 hora. La columna se lavó con tampón de lisis y a continuación un tampón que contenía urea 9 M, NaH2PO4 500 mM, Tris 10 mM, pH 8, imidazol 20 mM y TCEP 0,2 mM. La proteína se eluyó con un gradiente de pH: urea 9 M, NaH² PO⁴ 100 mM, citrato 20 mM, imidazol 20 mM y TCEP 0,2 mM. Los lavados subsiguientes se realizaron a pH 6,3, 5,9 y 4,5. Tras el gradiente de pH, se usó un gradiente de tampón de lisis con aumento de la concentración de imidazol para eluir aún más la proteína. La pureza se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) como se muestra en la figura 5.

Ejemplo 4 - Replegamiento

Para el replegamiento, la proteína se tamponó de nuevo en las siguientes condiciones: urea 9 M, Tris 20 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM, glicerol al 5%, EDTA 2 mM. Para el replegamiento rápido de una primera criba, se añadieron 4 pl de una solución con una concentración de 1,8 mg/ml a una solución tampón como se indica en la tabla 3, hasta una concentración final de 0,05 mg/ml. La solución se analizó a continuación mediante microscopia electrónica de transmisión de tinción negativa a diferentes resoluciones.

Tabla 3: Tampones usados para el replegamiento de LONG-D2-D1 (primera criba)

Si es necesario, se pueden realizar cribas adicionales para optimizar las condiciones de replegamiento con tamaños de muestreo más pequeños del pH y la fuerza iónica. Adicionalmente, se pueden añadir excipientes tales como trehalosa, sacarosa, arginina, prolina u otros, o si es necesario, se pueden añadir detergentes tales como colato, desoxicolato, Tween-80 u otros. Para LONG-D2-D1-ori no fue necesaria una optimización adicional del replegamiento y las condiciones de replegamiento fueron de pH 8,5, NaCl 50 mM, Tris 20 mM, glicerol al 5%. Las imágenes en ME de LONG-D2-D1-ori a diferente resolución después del replegamiento muestran una buena formación de nanopartículas (figura 6).

Ejemplo 5 - Ensayo I de activación de la ruta de TLR5

La actividad agonista de LONG-D2-D1-ori sobre el receptor tipo Toll 5 (TLR5) se ensayó usando células TLR5/SEAPorter HEK 293 (IMGENEX, No. de Cat. IML-105) y se evaluó la CE⁵⁰ de LONG-D2-D1-ori activo. La línea celular IML-105 se colocó en placas de 96 pocillos a 5 x 10⁴ células por pocillo durante 16 h. Las células se trataron con diversas concentraciones (entre 0,01 y 1000 ng/ml) de cada muestra de ensayo, control positivo (IMGENEX flagellin, No. de Cat. IMG-2205) o control de vehículo (cada tampón correspondiente) por duplicado durante 24 horas. El medio de cultivo celular de cada pocillo se diluyó a continuación a 1:2 y se transfirió a placas de microtitulación de 96 pocillos por duplicado, en las que también se añadieron por duplicado los patrones de fosfatasa alcalina secretada en serie (SEAP). Las placas se incubaron a 65°C durante 30 minutos para inactivar cualquier fosfatasa alcalina endógena. El sustrato de fosfatasa se añadió a continuación a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se analizaron mediante lectura a 405 nm y se evaluó la actividad de respuesta a la dosis y se preparó una evaluación de CE⁵⁰ (figura 7A).

La actividad agonista de TLR5 fue moderadamente alta con un valor de CE⁵⁰ calculado de 12,59 ng/ml en comparación con 0,29 ng/ml de la flagelina de control positivo de Salmonella typhimurium.

Ejemplo 6 - Ensayo II de activación de la ruta de TLR5

Compuesto de fórmula (Ia) designado T81c-WRW-8RRVRA-D0-D1 (FLJB_SALTY):

MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRA

LWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEI

ARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANR

FTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDL

DSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINS

QTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITN

LGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:4)

Compuesto de fórmula (II) designado T81c-WRW-8RRVRA-T1BT* (FLA-SAPN-2):

MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQA

WRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRL

EELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ ID NO:5)

Estas dos cadenas coensambladas se describieron en detalle anteriormente. La arquitectura del núcleo ND1 - L1 -ND2, que es la misma tanto en la fórmula (Ia) como en (II), es decir, la misma que ND3 - L2 - ND4, también es la misma que en el ejemplo 1. En la cadena 1 (fórmula la) la parte FLA está compuesta por los dominios D0 y D1 de la flagelina pero de una cepa diferente a la del ejemplo 1. Los sustituyentes Y y Z en la cadena 2 son el epítopo de linfocitos T, T1BT* y una secuencia de 28 residuos de la región de repetición nA n P de la proteína CS de Plasmodium falciparum como epítopo de linfocitos B.

La clonación, la expresión, la purificación y el replegamiento de las dos cadenas se realizan esencialmente siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos 1, 2, 3 y 4. Las condiciones de replegamiento de estas nanopartículas coensambladas son pH 7,5, NaCl 50 mM, HEPES 20 mM, glicerol al 5%. En la figura 4A se muestra una imagen de ME de las nanopartículas coensambladas.

La evaluación de la actividad de respuesta a la dosis como un agonista de TLR5 y una evaluación de CE⁵⁰ se realizaron según el protocolo descrito en el ejemplo 5. La actividad agonista de TLR5 fue muy alta, con un valor de EC⁵⁰ calculado de solo 0.0901 ng/ml en comparación con 0,29 ng/ml de flagelina de control positivo de Salmonella typhimurium (figura 7B). Por lo tanto, estas nanopartículas inducen una activación muy fuerte de TLR5, que es aproximadamente tres veces más fuerte que la flagelina nativa, aunque la cadena que contiene flagelina solo está presente en una proporción molar de 12:48. La curva de respuesta a la dosis parece ser una curva en forma de campana, por lo tanto, a mayor concentración de flagelina, la respuesta inmunitaria es decreciente. La concentración óptima es de aproximadamente 50 ng/ml.

Ejemplo 7 - Ensayo III de activación de la ruta de TLR5

Compuesto de fórmula (la) designado PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori:

MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSK

LAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSSARLSDLEANN

AVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTA

NPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSKNANDGISIAQTTEGALNEINNN

LQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQM

KIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYA

AGADRYRVDINSGAV (SEQIDNO:17)

Compuesto de fórmula (II) designado PD52-2i88-PANDORA-Noro:

MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSK

LAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSTVEQKTRPFTL

PNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAK

IRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDV

DTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITE

ATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAA

LLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQL

KPVGTAS (SEQ ID NO:18)

Estas dos cadenas coensambladas PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori y PD52-2i88-PANDORA-Noro tienen la misma arquitectura central tanto en la fórmula (Ia) como en la fórmula (II), es decir, ND1 - L1 - ND2 es igual que ND3 - L2 -ND4. En PD52-2i88-PANDORA-D2-D1-ori (fórmula la), la parte f La está compuesta por los dominios D2 y D1 de la flagelina. El dominio de oligomerización ND2 (o ND4, respectivamente) está diseñado para formar una superhélice dimérica. Esto es importante porque tanto el epítopo de linfocitos B (Z) como la forma de flagelina (FLA) son proteínas diméricas. La proporción de coensamblaje es 5:55.

Los sustituyentes Y y Z en PD52-2i88-PANDORA-Noro (fórmula II) son un marcador de His y una secuencia larga de 298 residuos de la proteína P de norovirus enlazada a ND4 por el enlazador GSGS, respectivamente. Esta secuencia corresponde al subdominio P2 del norovirus Hu/1968/US (Jiang X. y otros, Virology 1993; 195(1):51-61) con el correspondiente código de entrada pdb 1IHM para la estructura cristalina a los rayos X. Contiene los residuos 223 a 520 que son el dominio P (que carecen de los 10 residuos C-terminales 521-530 porque estos 10 residuos están desordenados en la estructura cristalina a los rayos X y porque están muy cargados positivamente) más 3 aminoácidos del extremo C-terminal del dominio S según la nomenclatura presentada por Prasad B.V.V. y otros, Science 1999; 286:287-290. El residuo treonina 223 se eligió cuidadosamente mediante programas de visualización por ordenador para ser el punto de unión a noro-SAPN porque es el contacto más cercano entre las cadenas a través del eje de 2 veces en la estructura cristalina de la cápsida viral.

La clonación, la expresión, la purificación y el replegamiento de las dos cadenas se realizan esencialmente siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos 1, 2, 3 y 4. Las condiciones de replegamiento de estas nanopartículas coensambladas son pH 6,8, NaCl 80 mM, MES 20 mM, glicerol al 5%. En la figura 4C se muestra una imagen de ME de las nanopartículas coensambladas (proporción 5:55). Una evaluación de la actividad de respuesta a la dosis como un agonista de TLR5 y una evaluación de CE⁵⁰ se realizaron según el protocolo descrito en el ejemplo 5. La actividad agonista de TLR5 fue moderadamente alta con un valor de CE⁵⁰ calculado de 17,66 ng/ml en comparación con 0,29 ng/ml de la flagelina de control positivo de Salmonella typhimurium (figura 7C).

Ejemplo 8 - Inmunogenicidad I

Compuesto de fórmula (la) designado T81c-8-D0-D1 (Eurogentec 0):

MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRA

LWMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGNTNS

LSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQAS

RNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLN

EIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDGGENPL

QKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSVRSRIEDSDYATEVSN

MSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQN (SEQ ID NO:19)

Compuesto de fórmula (II) designado T81c-8-Pf:

MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARLRA

LLMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGSGA

NANPNANPNANPNANP (SEQ ID NO:20)

Estas dos cadenas coensambladas son similares a las descritas en el ejemplo 6. No hay un epítcpo de linfocitos T, T1BT * en Y, y el epítopo de linfocitos B de la región de repetición de la proteína CS de Plasmodium falciparum en Z tiene solo 16 residuos de longitud. La superhélice trimérica (ND2 y ND4) contiene el epítopo de unión a panDR, PADRE. En la cadena 1 (fórmula la), la parte FLA está compuesta por los dominios d 0 (residuos 6 a 171) y D1 (residuos 229 a 312) de lflagelina pero de la variante de dominio medio de la fase I C150 de Salmonella entérica subsp. entérica serovariedad Typhimurium, que es de nuevo una cepa diferente a la de los ejemplos 1 y 6. D0 y D1 están conectados por dos residuos de glicina.

La clonación, la expresión, la purificación y el replegamiento de las dos cadenas se realizan esencialmente siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos 1,2, 3 y 4. Las condiciones de replegamiento de este tipo de nanopartículas coensambladas son pH 8,5, NaCl 50 mM, Tris 2o mM, glicerol al 5%. En la figura 4B se muestra una imagen de ME de las nanopartículas coensambladas a una proporción de 3:57. Se inmunizaron i.p. grupos de siete ratones C57BI/6 con 10 |jg o 1 |jg en tres inyecciones con dos semanas de diferencia. Los inmunógenos fueron T81c-8-Pf (fórmula II) solo o el coensamblaje de T81c-8-D0-D1 (fórmula Ia) y T81c-8-Pf (fórmula II) en dos proporciones de coensamblaje diferentes de 3:57 y 9:51. En otras palabras - asumiendo la simetría T1-icosaédrica de las nanopartículas - hubo tres inmunógenos diferentes que contenían cero o tres o nueve moléculas D0-D1 por nanopartícula. El título de anticuerpos después de la tercera inyección se determinó mediante ELISA y se muestra en la figura 8A. Parece que hay una saturación de la respuesta inmunitaria, con 1 jg en una proporción de coensamblaje de 3:57 (que corresponde a un total de aproximadamente 20 ng de flagelina) aumentando el título de anticuerpos en un factor de aproximadamente nueve en comparación con la nanopartícula sin dominios D0-D1. De hecho, la dosis más alta de 10 jg en una proporción de coensamblaje de 9:51 (que corresponde a un total de aproximadamente 2 jg de flagelina) reduce la respuesta inmunitaria en comparación con la nanopartícula sin dominios D0-D1.

Ejemplo 9 - Inmunogenicidad II

Compuesto de fórmula (Ia) designado DIM-D0-D1 (Eurogentec 1):

MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSR

LERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGMAQVINT

NSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQ

ASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQR

LNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNV

HGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSE

ARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:21)

Compuesto de fórmula (II) designado DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept:

MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSR

LERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGSGSSARL

SDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAA

AARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDG

ISIAQTTEGALNEINNN LQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVS

NQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATV

GDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV (SEQ ID NO:22)

Según el ejemplo 5 y el ejemplo 6, el derivado de flagelina parece ser más inmunógeno en su forma D0-D1 que en su forma D2-D1. Por lo tanto, la forma D0-D1 se puede usar como agonista de TLR5 para aumentar la inmunogenicidad de un inmunógeno que porta la forma de flagelina D2-D1. Por tanto, en este ejemplo la secuencia D0-D1

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTA

NIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSI

QAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTL

GLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGN

TVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:23)

corresponde a "FLA" en la fórmula (Ia), mientras que la secuencia D2-D1-tip3

SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLIN

EDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKN

ANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEI

DRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPR

EATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(SEQIDNO:24)

corresponde a "Z" en la fórmula (II). Esta secuencia "Z" en D2-D1-tip3 es una modificación de la flagelina en la que el dominio D2 se combina con el dominio D1 de la flagelina como se describió anteriormente. Además, el armazón proteico de D2-D1-tip3 se usa como portador para la presentación del antígeno nicotina. Para permitir el acoplamiento covalente de la nicotina activada al armazón proteico, las cadenas laterales de lisina que no están expuestas en la superficie se mutan a argininas, mientras que las argininas que están expuestas en la superficie se mutan a lisinas. Tras la unión covalente de la nicotina activada a las aminas primarias de la secuencia proteica, la nicotina se presenta a continuación en la superficie de la nanopartícula. Además, para presentar las moléculas de nicotina en la superficie más externa de las nanopartículas, la proteína D2-D1 porta la denominada secuencia "tip3" KAKKKDGKDDKD (SEQ ID NO:25) en la parte más expuesta de la molécula (figura 2A) que contiene una alta densidad de lisinas, por tanto, el acoplamiento covalente de nicotina a las cadenas laterales de lisina proporcionará una presentación de alta densidad de moléculas de nicotina en la superficie de la nanopartícula.

Los núcleos de DIM-D0-D1 y DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept (es decir, ND1-L1-ND2 y ND3-L2-ND4) son idénticos y, en particular, los dominios de oligomerización ND2 y ND4, respectivamente, están diseñados para formar superhélices diméricas. Esto permite presentar la molécula de flagelina (en cualquiera de sus formas) como un dímero, lista para interactuar con el receptor TL5 dimérico (figura 2B).

La clonación, la expresión, la purificación y el replegamiento de las dos cadenas se realizan esencialmente siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos 1, 2, 3 y 4. Las condiciones de replegamiento de este tipode nanopartículas coensambladas son pH 7,0, NaCl 50 mM, HEPES 20 mM, glicerol al 5%. En la figura 4D se muestra una imagen de ME de las nanopartículas coensambladas a una proporción de 5:55.

Se inmunizaron i.p. grupos de siete ratones C57BI/6 con 10 |jg entres inyecciones con dos semanas de diferencia. Los inmunógenos fueron el coensamblaje de DIM-D0-D1 (fórmula la) y DIM-D2-D1-tip3_NIC-pept (fórmula II) en la proporción de coensamblaje de 5:55 o el portador estándar KLH (hemocianina de lapa californiana) a la que se unió la misma molécula de nicotina activada. KLH es una metaloproteína grande, multisubunidad, portadora de oxígeno, que se encuentra en la hemolinfa de la lapa californiana gigante y se usa con frecuencia como portador de antígenos en experimentos de inmunización. El título de anticuerpos después de la tercera inyección se determinó mediante ELISA y se muestra en la figura 8B. El título de anticuerpos de este tipo de inmunógeno de nanopartícula con el agonista TLR5 aumenta significativamente en comparación con el título del portador estándar KLH que presenta el mismo antígeno (nicotina) en su superficie.

Ejemplo 10 - Inmunogenicidad III

Compuesto de fórmula (Ia) designado DEDDL:

MGDKHHHHHHKDGSDKGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMG

GRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGM

AQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTAN

IRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQ

AEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLG

LDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLG

NTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR

(SEQ ID NO:26)

Esta cadena proteica de nanopartícula contiene como "FLA" un dominio D0-D1 modificado de la variante del dominio medio de flagelina de fase I C150 Salmonella entérica subsp. entérica serovariedad Typhimurium, como en el ejemplo 8. Todos los residuos de lisina dentro de esta secuencia se reemplazan por arginina. Los dominios D0 y D1 están conectados por la secuencia de aminoácidos KYKDGDKGDDK (SEQ ID n O:1), que contiene cuatro lisinas como sitios de acoplamiento para la unión covalente de moléculas.

La superhélice trimérica (ND2) contiene la secuencia de unión a panDR ELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNA (SEQ ID NO:27). El sustituyente "X" contiene un marcador de his de seis aminoácidos y tres residuos de lisina distribuidos de manera aproximadamente uniforme por toda la secuencia para la unión covalente de las moléculas. Además, el extremo N es adecuado para la unión covalente, por ejemplo, mediante la química del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS).

La clonación, la expresión y la purificación de la cadena proteica se realizan esencialmente siguiendo los protocolos descritos en los ejemplos 1, 2 y 3.

Antes del intercambio de tampón para la reacción de acoplamiento, las fracciones de elución combinadas provenientes de la purificación por afinidad se incubaron con EDTA 5 mM al menos durante una hora para quelar cualquier posible ion níquel lixiviado. A continuación, el tampón se intercambió usando una columna de desalinización HiPrep 26/10. La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna del siguiente tampón de acoplamiento: clorhidrato de guanidio 6 M, NaCl 150 mM, HEPES 20 mM pH 7.2, seguido de la unión de la muestra a la columna. La etapa de elución se realizó con 2 volúmenes de columna de tampón de acoplamiento.

El acoplamiento de NHS-nicotina (éster N-hidroxisuccinimídico del ácido nicotínico) se realizó en una proporción molar de 1:50 (DEDDL: NHS-nicotina) con 11,1 mg de proteína (volumen de 2,5 ml) correspondiente a 0,24 pmol de proteína. La NHS-nicotina (5 mg) se disolvió en 150 pl de DMSO al 100% correspondiente a 12,8 pmol. Para un exceso molar de 50 veces de NHS-nicotina, se añadieron a la proteína 141 pl de esta solución de NHS-nicotina correspondiente a 12 pmol. La reacción de acoplamiento se incubó durante 3 horas en la oscuridad (cubierta con papel de aluminio) y agitándose con un agitador magnético.

En una siguiente etapa de intercambio de tampón para deshacerse de la nicotina NHS no acoplada y para el intercambio de tampón con el tampón de pre-replegamiento, se usó una columna pre-rellenada G-25 de PD minitrap para retamponar en las siguientes condiciones: urea 8 M, Tris 20 mM pH 8,5, NaCl 150 mM y trehalosa al 10%.

El replegamiento de la cadena proteica fue esencialmente siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo 4. En particular, se añadieron gota a gota 8 mg de proteína Nic-DEDDL acoplada (proteína DEDDL acoplada a nicotina, 2,4 ml de solución proteica de 3,35 mg/ml) a 158,4 ml de tampón de replegamiento (HEPES 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, trehalosa al 10%) mientras se agitaba. La concentración final de proteína deseada fue de 0,05 mg/ml. La reacción de replegamiento se realizó durante un tiempo total de 10 minutos. Las nanopartículas de Nic-DEDDL replegadas se muestran en la figura 9.

Se inmunizaron s.c. grupos de tres ratones C57BI/6 con 10 pg de Nic-DEDDL o 10 pg de Nic-KLH (nicotina acoplada a hemocianina de lapa californiana) como control positivo en tres inyecciones cada unacon una semana de diferencia. El título de anticuerpos en el día 0 (es decir, antes de la primera inyección) y luego una semana después de cada inyección (día 7, 14 y 21) se determinó mediante ELISA y se muestra en la figura 10. Estos experimentos revelanque Nic-DEDDL es altamente inmunógeno con una inducción de anticuerpos >30 veces mejor en comparación con Nic

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula proteica de autoensamblaje que consiste en agregados de una multitud de unidades estructurales de fórmula (Ia) o (Ib)

X -ND1 - L1 -ND2 -F L A (Ia)

o

FLA- ND1 - L1 - ND2 - X (Ib)

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND1, un enlazador L1, un dominio de oligomerización de proteínas ND2, un derivado de flagelina FLA y un sustituyente adicional X, en donde

ND1 es una proteína que forma oligómeros (ND1)m de m subunidades ND1,

ND2 es una proteína que forma oligómeros (ND2)n de n subunidades ND2,

m y n son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que m no sea igual a n y no sea un múltiplo de n, y de que n no sea un múltiplo de m,

L1 es un enlace o un enlazador flexible corto,

FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde uno o varios dominios seleccionados de los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos;

X está ausente o es una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos,

en donde cada uno de ND1 y ND2 es un dominio de superhélice o el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

2. La nanopartícula proteica según la reivindicación 1, coensamblada con una multitud de unidades estructurales de fórmula (II)

Y-ND3-L2-ND4-Z (II)

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND3, un enlazador L2, un dominio de oligomerización de proteínas ND4 y sustituyentes adicionales Y y Z, en donde

ND3 es una proteína que forma oligómeros (ND3)y de y subunidades ND3,

ND4 es una proteína que forma oligómeros (ND4)z de z subunidades ND4,

y y z son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que y no sea igual a z y no sea un múltiplo de z, y de que z no sea un múltiplo de y,

bien ND3 es idéntico a ND1, o ND4 es idéntico a ND2 o bien tanto ND3 como ND4 son idénticos a ND1 y ND2, respectivamente,

L2 es un enlace o un enlazador flexible corto que puede ser diferente de L1 o idéntico a L1, y

Y y Z están, independientemente entre sí, ausentes o son una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos.

3. La nanopartícula proteica según la reivindicación 2, en la que al menos uno de ND3 y ND4 es una superhélice.

4. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos uno de X, Y y Z es un antígeno de interés.

5. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos.

6. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde FLA es un derivado de flagelina que carece de los dominios D2 y D3 de flagelina.

7. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde FLA es un derivado de flagelina que comprende un antígeno de interés.

8. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde n en una unidad estructural de fórmula (Ia) o m en una unidad estructural de fórmula (Ib) es 2.

9. La nanopartícula proteica según la reivindicación 8, en donde FLA está conectada en la parte D2 de la flagelina al dominio de oligomerización ND2 en la fórmula (Ia), en donde n es 2, o al dominio de oligomerización ND1 en la fórmula (Ib), en donde m es 2.

10. La nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde al menos uno de ND3 y ND4 es el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

11. Una composición que comprende una nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12 Una unidad estructural monomérica de fórmula (Ia) o (Ib)

X -ND1 - L1 -ND2 -F L A (Ia)

o

FLA-ND1 - L1 -ND2 - X (Ib),

que consiste en una cadena continua que comprende un dominio de oligomerización de proteínas ND1, un enlazador L1, un dominio de oligomerización de proteínas ND2, un derivado de flagelina FLA y un sustituyente adicional X, en donde

ND1 es una proteína que forma oligómeros (ND1)m de m subunidades ND1,

ND2 es una proteína que forma oligómeros (ND2)n de n subunidades ND2,

m y n son, cada uno, una cifra entre 2 y 10, con la condición de que m no sea igual a n y no sea un múltiplo de n, y de que n no sea un múltiplo de m,

L1 es un enlace o un enlazador flexible corto,

FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde uno o varios dominios seleccionados de los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos;

X está ausente o es una secuencia peptídica o proteica que comprende de 1 a 1000 aminoácidos, en donde cada uno de ND1 y ND2 es un dominio de superhélice o el dominio de trimerización (foldon) de la proteína fibritina del bacteriófago T4.

13. La unidad estructural monomérica según la reivindicación 12, en donde FLA es flagelina o un derivado de flagelina que carece de partes de la secuencia de aminoácidos de flagelina en donde los dominios D2 y D3 de la flagelina se eliminan de la secuencia de aminoácidos de flagelina uniendo los dos extremos en una cadena peptídica continua, y/o de 1 a 20 aminoácidos se sustituyen por otros aminoácidos, y/o que comprende además un antígeno directamente unido o unido a través de un enlazador que comprende entre 1 y 20 aminoácidos.

14. Una nanopartícula proteica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso en un método de vacunación de un ser humano o animal no humano, que comprende administrar una cantidad eficaz de la nanopartícula proteica a un sujeto que necesita dicha vacunación.