ES2713962T3

ES2713962T3 - Vacuna para prevenir la enfermedad de edema porcino

Info

Publication number: ES2713962T3
Application number: ES13848760T
Authority: ES
Inventors: Kenji Yokogawa; Takashi Waki; Yoko Honda; Hirotaka Uefuji; Tomomitsu Sewaki; Takeshi Arakawa; Tetsuya Harakuni; Takeshi Miyata
Original assignee: JECTAS INNOVATORS Co Ltd; KM Biologics Co Ltd
Current assignee: JECTAS INNOVATORS Co Ltd; KM Biologics Co Ltd
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: WO2014065210A1; PL2910634T3; CA2888340A1; JPWO2014065210A1; CN104755619B; JP6172582B2; MX368398B; CN104755619A; MX2015005045A; EP2910634A1; US20150361142A1; CA2888340C; EP2910634A4; BR112015008972B1; DK2910634T3; KR102094569B1; PH12015500890A1; US9701724B2; EP2910634B1; KR20150074016A

Abstract

Una proteína de fusión en la que están unidos un polipéptido que consiste en una unidad formadora de superhélice de la proteína oligomérica de la matriz de cartílago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Shx2e (Stx2eB)

Description

DESCRIPCION

Vacuna para prevenir la enfermedad de edema porcino

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una vacuna para prevenir la enfermedad de edema porcino. Mas espedficamente, la vacuna contiene una protema recombinante en la que un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice y una subunidad B de Stx2e (Stx2eB), que es una toxina que causa la enfermedad de edema porcino se fusionan, y/o un multfmero de la misma como principio activo. Vacunando los cerdos con la protema de fusion y/o el multimero, se inducen potentes anticuerpos neutralizantes de la toxina, y la vacuna puede prevenir el inicio de la enfermedad de edema.

Antecedentes de la tecnica

La enfermedad de edema porcino a menudo se manifiesta en cerdos jovenes de 4 a 12 semanas de edad, causa edema palpebral, smtomas neurologicos y similares, y en su mayona produce la muerte dentro de las 24 horas posteriores al inicio (NPL 1, Proc. Jpn. Pig Vet. Soc. 2006, 48, 7-13). Su tasa de mortalidad es de hasta el 50 al 90 %, y la perdida economica es enorme porque la productividad disminuye debido a la recidiva, el desarrollo incompleto y similares. Esta enfermedad es causada por la toxina Shiga StX2e producida por Escherichia coli que produce toxina Shiga (E. coli que produce toxina Shiga, STEC) que se adhiere al tracto intestinal. La Stx2e es una protema de toxina de tipo AB5 que contiene una subunidad A (Stx2eA) que tiene actividad N-glucosidasa de ARNr y un pentamero de subunidad B (Stx2eB) que tiene la capacidad de unirse a un receptor (globotetraosil ceramida (Gb4)). Se sabe que Stx2e, que fue extrafda del tracto intestinal y fue llevada a la superficie de una celula tal como una celula endotelial vascular por la subunidad B, envfa la subunidad A al citoplasma de la celula diana e inhibe la smtesis de protemas por parte del ribosoma, induciendo de este modo los smtomas de la enfermedad de edema. En Japon, no esta disponible en el mercado una vacuna para prevenir la enfermedad de edema porcino y, aunque se usan antibioticos, la administracion despues del inicio generalmente es demasiado tarde. Ademas, se han notificado bacterias resistentes a los farmacos y se desea el desarrollo de un procedimiento preventivo y un procedimiento terapeutico eficaces.

En estas circunstancias, se han investigado procedimientos para prevenir eficazmente la enfermedad de edema porcino. Por ejemplo, un caso de inmunizacion con un toxoide de Stx2e ha demostrado un efecto de defensa contra la infeccion experimental (NPL 2, Vet. Microbiol. 1991, 29, 309-318). Sin embargo, en otro informe, se ha observado el inicio de enfermedad de edema en algunos cerdos despues de la inmunizacion con un toxoide porque la detoxificacion es diffcil (NPL 3, Infect. Immun. 1992, 60, 485-90). Ademas, en otro ejemplo, se notifica que la induccion de anticuerpos neutralizantes se confirmo cuando los cerdos se inmunizaron con Stx2e recombinante que se detoxifico modificando una parte de la secuencia de aminoacidos de Stx2eA (NPL 3, Infect. Immun. 1992, 60, 485-90). Sin embargo, la produccion de Stx2e detoxificada por E. coli recombinante es extremadamente baja, y aun existen problemas para el uso practico.

Lista de citas

Referencias de patente

PTL 1: JP-A-2008-50344

Referencias no de patente

NPL 1: Proc. Jpn. Pig Vet. Soc. 2006, 48, 7-13

NPL 2: Vet. Microbiol. 1991, 29, 309-318

NPL 3: Infect. Immun. 1992, 60, 485-90

NPL 4: Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78

NPL 5: Infect. Immun. 2005, 7, 5654-65

NPL 6: Infect. Immun. 2011, 79(10), 4260-4275

RAN XQ. Y COL., VET. MICROBIOL., vol. 127, no. 1-2, 2008, paginas 209-15 y MATSUI T. Y COL., TRANSGENIC RES., vol. 20, 2011, las paginas 735-48 desvelan el uso de una subunidad Stx2eB como un antígeno y una protema que contiene dicho antígeno como una vacuna contra la enfermedad de edema porcino.

El documento WO 2010/092963 desvela un farmaco que porta protemas multimericas de una estructura de helice y una molecula de ligando para el receptor de celulas inmunocompetentes.

TAKESHI MIYATA Y COL., INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, vol. 79, no.

10, 2011 desvela que los antígenos y adyuvantes de vacunas contra diversas enfermedades infecciosas pueden cargarse en un sistema inmunopotenciador de tres componentes. Se hace referencia espedfica a un antígeno de la malaria, pero no se usa ninguna protema formadora de helice en dicha estructura de tres componentes.

Sumario de la invencion

Problema tecnico

Un objetivo que la invencion es conseguir proporcionar granjas en las que se anticipa el inicio de la enfermedad de edema porcino con una vacuna que pueda prevenir eficazmente la enfermedad de edema porcino. Solucion al problema

Los inventores de la invencion han estudiado intensamente para lograr el objetivo y, como resultado, se descubrio que se inducen potentes anticuerpos neutralizantes de toxinas vacunando a los cerdos con una protema de fusion de un polipeptido que consiste en una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP ) y una subunidad B de la toxina Shiga Stx2eB como vacuna. Por tanto, los inventores han consumado la invencion.

Es decir, la invencion se refiere a lo siguiente:

[1] Una protema de fusion en la que estan unidos un polipeptido que consiste en una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Shx2e (Stx2eB).

[2] La protema de fusion descrita en el punto [1], que tiene una secuencia enlazadora y/o una secuencia de etiqueta entre el polipeptido y la Stx2eB.

[3] La protema de fusion descrita en los puntos [1] o [2], en la que la protema COMP es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:27 o la SEQ ID NO:28 o un polipeptido que tiene

una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

[4] La protema de fusion descrita en uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en la que la Stx2eB es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la ^sE^qiD NO:20, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:24 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

[5] Un multfmero de protema de fusion, en el que la protema de fusion descrita en uno cualquiera de los puntos [1] a [4] esta multimerizada.

[6] Un fragmento de acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la protema de fusion descrita en uno cualquiera de los puntos [1] a [4].

[7] Un vector de expresion recombinante que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en el punto [6].

[8] Una celula huesped que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en el punto [6] o el vector de expresion recombinante descrito en el punto [7].

[9] Una vacuna contra la enfermedad de edema porcino que comprende la protema de fusion descrita en uno cualquiera de los puntos [1] a [4] o el multimero de protema de fusion descrito en el punto [5] como principio activo.

[10] Una vacuna de ADN contra la enfermedad de edema porcino que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en el punto [6] o el vector de expresion recombinante descrito en el punto [7] como principio activo.

[11] Un kit para medir la cantidad de anticuerpos contra la Stx2eB en una muestra, que comprende la protema de fusion descrita en uno cualquiera de los puntos [1] a [4] o el multimero de protema de fusion descrito en el punto [5].

[12] Un procedimiento para producir un multimero de protema de fusion, que comprende un procedimiento de expresar una protema de fusion en la que un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartilago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Stx2e (Stx2eB) se unen en un huesped y a continuacion replegar la protema de fusion,

en el que la protema de fusion tiene preferentemente un espaciador entre el polipeptido y la Stx2eB.

[13] El procedimiento de produccion descrito en el punto [12], en la que la protema COMP es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:27 o la SEQ ID NO:28 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

[14] El procedimiento de produccion descrito en uno cualquiera de los puntos [12] o [13], en la que la Stx2eB es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:20, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:24 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

[15] Una protema de fusion como se describe en uno cualquiera de los puntos [1] a [4] o un multfmero de protema de fusion como se describe en el punto [5] o un fragmento de acido nucleico como se describe en el punto [6] o un vector de expresion recombinante como se describe en el punto [7] para su uso en un procedimiento para prevenir la enfermedad de edema porcino.

Efectos ventajosos de la invencion

Cuando se inocula a los cerdos con una vacuna que contiene como principio activo una protema de fusion en la que se unen un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice y Stx2eB como se definio anteriormente, es posible inducir potentes anticuerpos neutralizantes de toxinas y prevenir el inicio de la enfermedad de edema porcino.

Breve descripcion de los dibujos

[Figura 1] Un diagrama esquematico de Stx2eB-His.

[Figura 2] Un diagrama esquematico de Stx2eB-His-COMP.

[Figura 3] Una figura que muestra la formacion de multimeros de Stx2eB-His-COMP observada.

[Figura 4] Un diagrama esquematico de Stx2eB-His-COMP-Z.

[Figura 5] Una figura que muestra la formacion de multimeros de Stx2eB-His-COMP-Z observada.

[Figura 6] Un diagrama esquematico de Stx2eB-His-CMP.

[Figura 7] Una figura que muestra la formacion de multimeros de Stx2eB-His-CMP observada.

Descripcion de las realizaciones

(1) Protema de fusion

La invencion incluye una protema de fusion en la que estan unidos un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Shx2e (Stx2eB).

Los ejemplos de Stx2eB que constituyen la protema de fusion de la invencion son Stx2eB precursora que contiene una senal secretora (por ejemplo, s Eq ID NO:1 y SEQ ID NO:20), Stx2eB madura sin una senal secretora (por ejemplo, SEQ ID NO:21 y S^eQ ID NO:22) y Stx2eB obtenida optimizando los codones de Stx2eB madura para la expresion en E. coliy levaduras (por ejemplo, SEQ ID NO:23 y s Eq ID NO:24).

Como la secuencia de ADN que codifica Stx2eB (la secuencia de ADN de Stx2eB), ademas de las secuencias de ADN de la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 23, se incluyen estas secuencias de ADN a las que se anade un sitio de escision apropiado para una enzima de restriccion y estas secuencias de ADN con eliminacion, sustitucion o insercion de uno o varios nucleotidos. Ademas, tambien se incluyen secuencias de ADN que tienen una homologfa del 80 % o mas, preferentemente el 90 % o mas, mas preferentemente el 95% o mas, con estas secuencias de ADN.

Stx2eB incluye polipeptidos que comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por la SEQ ID NO:20, la SEQ ID NO:22 y la SEQ ID NO:24 y, polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos, cada una con una homologfa del 80 % o mas, preferentemente el 90 % o mas, mas preferentemente el 95% o mas, con estas secuencias de aminoacidos.

Por otro lado, el polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice que se une con Stx2eB para constituir la protema de fusion de la invencion proviene de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP). De acuerdo con la invencion, se usa un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice derivada de una protema que forma un pentamero tal como COMP, porque la protema de fusion de dicho polipeptido y Stx2eB es una protema soluble que es menos cohesiva y es excelente en el efecto de inducir anticuerpos neutralizantes de toxinas.

Como la secuencia de ADN que codifica el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice de COMP (la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice), ademas de la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:26, se incluyen secuencias con codones optimizados para la expresion en E. coli y levadura (por ejemplo, SEQ ID NO:10), estas secuencias de ADN a las que se anade un sitio de escision apropiado para una enzima de restriccion y estas secuencias de ADN con eliminacion, sustitucion o insercion de uno o varios nucleotidos. Ademas, tambien se incluyen secuencias de ADN que tienen una homologfa del 80 % o mas, preferentemente el 90 % o mas, mas preferentemente el 95% o mas, con estas secuencias de ADN.

Ademas, el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice de COMP incluye polipeptidos que comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por la SEQ ID NO:27 y secuencias con codones optimizados para la expresion en E. coli y levadura (por ejemplo, SEQ ID NO:28) y polipeptidos que comprenden estas secuencias de aminoacidos, cada una con una homologfa del 80 % o mas, preferentemente el 90 % o mas, mas preferentemente el 95% o mas, con estas secuencias de aminoacidos.

En la protema de fusion de la invencion, el peptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB puede estar adyacentes y unidos entre sf, o un espaciador tal como una secuencia enlazadora y una secuencia de etiqueta pueden insertarse entre el peptido y Stx2eB con el fin de reducir las interacciones intermoleculares o similares. La secuencia enlazadora no esta particularmente limitada, sino que por ejemplo, se puede usar una secuencia que tenga una combinacion de GPGP o GGGGS (G⁴S). Ademas, una secuencia que tiene de uno a cuatro (G⁴SX(G⁴S)ⁱa (G⁴S)⁴) tambien se puede usar como la secuencia enlazadora, y (GP)²se puede combinar adicionalmente. Ejemplos de la secuencia de etiqueta son la glutation-S-transferasa (GST), la protema de union a maltosa (MBP) y Hisx6 (H^a). Un ejemplo preferible de la combinacion de la secuencia de etiqueta y la secuencia enlazadora es (GP)²GH⁶(G⁴S)³. Ademas, es posible reemplazar la secuencia parcial (G⁴S) en la secuencia con una secuencia repetitiva ((G⁴S)^{i a 3}). Ademas, tambien se pueden usar las secuencias GPGPH^aGPGP y G⁴SH^aG⁴S.

Un ejemplo de la protema de fusion de la invencion es una protema de fusion del polipeptido que tiene la unidad de formacion de superhelice de COMP y Stx2eB con codones optimizados para la expresion en E. coli y levadura, en la que una secuencia de etiqueta (H^a) y una secuencia enlazadora ((G⁴S)³) se insertan entre el polipeptido y Stx2eB (por ejemplo, SEQ ID NO:l7 o SEQ ID NO:16). La protema de fusion de la invencion incluye no solo la protema que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n O:16, sino tambien un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos con eliminacion, sustitucion o insercion de uno o varios restos de aminoacidos. Ademas, tambien se incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos, cada una con una homologfa del 80 % o mas, preferentemente el 90 % o mas, mas preferentemente el 95 % o mas, con estas secuencias de aminoacidos.

Cuando el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB se unen, el polipeptido y el Stx2eB pueden unirse por ingeniena genetica y a continuacion expresarse. Por ejemplo, en un procedimiento, se prepara un vector de expresion de tal manera que la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice y la secuencia de ADN de Stx2eB sean adyacentes entre sf y a continuacion se introduce en un huesped apropiado, y se expresa la protema de fusion. La secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice puede estar en el extremo 5 'o en el extremo 3' de la secuencia de ADN de Stx2eB. Preferentemente, la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice esta en el extremo 3'. Cuando se prepara el vector de expresion, se puede insertar una secuencia de ^aDⁿde la secuencia enlazadora y/o secuencia de etiqueta entre la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice y la secuencia de ADN de Stx2eB o unirla al extremo 5' o al extremo 3' de la secuencia de ADN. Por ejemplo, en un procedimiento, se prepara un vector de expresion de tal manera que la secuencia de ADN de Stx2eB, la secuencia de ADN de la secuencia de etiqueta y/o la secuencia enlazadora y la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice se alinean en este orden desde el extremo 5'.

La secuencia de ADN anterior puede obtenerse por smtesis qmmica y usarse como modelo para un procedimiento conocido de amplificacion genica para amplificar el fragmento de ADN, y se puede preparar un vector de expresion recombinante insertando el fragmento de ADN en un vector de expresion usando una enzima de restriccion. Los oligonucleotidos usados para la amplificacion genica estan disenados para hibridar con el extremo 5' o el extremo 3' de la secuencia de ADN modelo y preferentemente contienen un sitio de escision para una enzima de restriccion. El ADN modelo puede amplificarse mediante un procedimiento conocido de amplificacion genica usando los oligonucleotidos, el ADN modelo, una ADN polimerasa y similares. Tratando la secuencia de ADN amplificada y un vector de expresion con una enzima de restriccion y uniendolos a continuacion con una ADN ligasa apropiada, se puede construir un vector de expresion recombinante que contenga la secuencia de ADN diana. Dicho vector de expresion recombinante tambien se incluye en la invencion.

El vector de expresion es un vector plasmfdico, un vector de fago, un vector vmico, un vector de cromosoma artificial o similar, y es preferible un vector plasmfdico debido a la facilidad de manejo y al coste. Por ejemplo, cuando el huesped es E. coli, el vector de expresion es pFN6A (HQ) Flexi Vector (Promega), pFN7A (HQ) Flexi Vector (Promega), pFN2A (GST) Flexi Vector (Promega), pET-22b (MERCK), pET-21d (MERCK), pCold vector (Takara Bio Inc.) o similar, mientras que cuando el huesped es un mairnfero, el vector de expresion es pF4A CMV Flexi Vector (Promega), pF5A CMV-neo Flexi Vector (Promega), pF9A CMV hRluc-neo Flexi Vector (Promega) o pCl-neo Mammalian Expression Vector (Promega). El vector de expresion puede contener un origen de replicacion, una secuencia reguladora que desempena un papel de regulacion de la expresion genica tal como una secuencia promotora y una secuencia potenciadora y la secuencia de un marcador de seleccion.

Como ejemplos de la secuencia promotora, los promotores bacterianos son promotores de E. coli lacl y lacZ, promotores T3 y T7, promotor gpt, promotor PR, PL de lambda, promotor tac y promotores trp y trc. Promotores eucariotas conocidos que son apropiados a este respecto son el promotor inmediato temprano de citomegalovirus ("CMV"), promotor de timidina cinasa de HSV, promotores temprano y tardfo de SV40, promotor LTR de retrovirus, promotor del virus del sarcoma de Rous ("RoSV"), por ejemplo, y promotores de metalotionema tales como el promotor de metalotionema-I.

Cuando la protema de fusion se expresa usando una celula eucariota superior como huesped, la actividad transcripcional puede potenciarse insertando una secuencia potenciadora en el vector de expresion. La secuencia potenciadora actua para potenciar la actividad transcripcional del promotor en una cierta celula huesped. Los ejemplos del potenciador incluyen el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma corriente abajo del origen de replicacion, el potenciador de p-actina y el potenciador de adenovirus.

Ejemplos del marcador de seleccion son un gen resistente a la ampicilina de E. coli, el gen trp1 de Saccharomyces cerevisiae y un gen resistente a la neomicina de una celula de mairnfero.

La invencion incluye un fragmento de acido nucleico que codifica la protema de fusion de la invencion y contiene la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice y la secuencia de ADN de Stx2eB. El fragmento de acido nucleico de la invencion incluye un fragmento de acido nucleico que contiene la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice y la secuencia de ADN de Stx2eB que estan alineadas adyacentes entre sf o un fragmento de acido nucleico que contiene la secuencia de ADN de la secuencia de etiqueta y/o secuencia enlazadora entre la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice y la secuencia de ADN de Stx2eB. Por ejemplo, se incluyen los fragmentos de acido nucleico de las SEQ ID NO:17 y 34.

La secuencia completa del fragmento de acido nucleico de la invencion se puede obtener por smtesis qmmica. Ademas, una parte del fragmento de acido nucleico y la parte restante del fragmento de acido nucleico pueden obtenerse primero mediante smtesis qmmica y a continuacion unirse mediante una tecnica conocida de recombinacion genica. Por ejemplo, despues de sintetizar qmmicamente las secuencias de ADN de Stx2eB y la unidad formadora de superhelice, los fragmentos de ADN se amplifican mediante un procedimiento conocido de amplificacion genica y se insertan en vectores de clonacion independientes. La secuencia de ADN de Stx2eB y la secuencia de ADN de la unidad formadora de superhelice se cortan de los respectivos vectores de clonacion usando un enzima de restriccion y a continuacion se insertan en un vector de expresion que tambien se ha tratado con una enzima de restriccion, preparando de este modo un vector de expresion recombinante. El procedimiento de insercion debe disenarse de modo que los fragmentos se alineen adyacentes entre sf. A continuacion, cortando el fragmento de acido nucleico del vector de expresion recombinante usando una enzima de restriccion o similar, se puede obtener el fragmento de acido nucleico en el que se unen las secuencias de ADN de la unidad formadora de superhelice y Stx2eB. Cuando el fragmento de acido nucleico se prepara mediante el procedimiento anterior, la secuencia de ADN de la secuencia de etiqueta o la secuencia enlazadora puede insertarse entre las secuencias de ADN de la unidad formadora de superhelice y Stx2eB para preparar el vector de expresion y preparar el fragmento de acido nucleico.

Transfectando un huesped con el vector de expresion preparado anteriormente, se puede obtener un transformante que contiene el vector de expresion. Dicho transformante tambien se incluye en la invencion. El huesped es un huesped conocido tal como E. coli, levadura, una lmea celular de mamffero, una celula de insecto y una planta. Ejemplos de E. coli son la cepa BL21 y DH5a. La levadura es Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae, y la celula de mai^ero es una celula CHO, una celula HEK293, una celula COS-1/-7 o similar.

El huesped puede ser transfectado con el vector de expresion mediante un procedimiento conocido de acuerdo con el huesped, y los ejemplos son un procedimiento que usa fosfato de calcio, electroporacion y lipofeccion. Tras la transfeccion, el transformante, que es la celula huesped que ha captado el vector de expresion, puede seleccionarse cultivando en un medio de cultivo que contiene un marcador de seleccion.

Proliferando el transformante preparado anteriormente en una condicion preferible y a continuacion induciendo el promotor seleccionado en una condicion espedfica (pH, temperatura o adicion de un compuesto), se puede producir la protema de fusion. La protema de fusion expresada se acumula en la celula o se secreta de la celula.

Cuando se expresa en E. coli como huesped, la protema de fusion puede expresarse en la fraccion de cuerpo de inclusion. Ejemplos del procedimiento para recuperar los cuerpos de inclusion de E. coli son fragmentacion ultrasonica, homogeneizacion a alta presion y un procedimiento que usa BugBuster (Merck KGaA).

La protema de fusion de la invencion obtenida de este modo se puede usar como un monomero, pero es preferible formar un multimero porque pueden inducirse potentes anticuerpos neutralizantes de toxinas. Por ejemplo, el multimero de protema de fusion es un dfmero, un tnmero, un tetramero, un pentamero o un multimero superior, y tambien se incluye una mezcla de los multfmeros. Con el fin de formar dicho multimero de protema de fusion, por ejemplo, los cuerpos de inclusion se recuperan de E. coli como se ha descrito anteriormente, la protema de fusion se solubiliza, y a continuacion la solucion solubilizada se somete a un tratamiento de replegamiento. Los ejemplos del procedimiento para solubilizar la protema de fusion proveniente de los cuerpos de inclusion son un procedimiento para anadir clorhidrato de guanidina o una solucion de urea a los cuerpos de inclusion, el reactivo de solubilizacion de cuerpos de inclusion (Funakoshi) y el kit de aislamiento de cuerpos de inclusion Proteospin (Norgen). Ejemplos del tratamiento de replegamiento son un procedimiento para anadir arginina, Tween 80, acetato de sodio y DL-cistina a la solucion solubilizada y un procedimiento que usa TAPS-sulfonato (Katayama Chemical., Ltd.) o un kit de replegamiento CA (Takara Bio Inc.)

A este respecto, el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB se unen para formar la protema de fusion de la invencion, y pueden unirse qmmicamente. En este caso, en un procedimiento, el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB se expresan individualmente y a continuacion se unen usando un reticulante.

Cuando el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB se expresan individualmente, las secuencias de ADN respectivas se pueden obtener mediante smtesis qmmica, los fragmentos de ADN se pueden amplificar mediante un procedimiento conocido de amplificacion genica usando las secuencias de ADN como moldes, y los respectivos plasmidos de expresion se pueden construir de acuerdo con el procedimiento anterior. Cada plasmido de expresion se puede introducir en el huesped como se ha descrito anteriormente y se puede obtener cada protema diana.

Cuando el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB se unen usando un reticulador, se pueden usar grupos amino y grupos tiol (grupos SH) en las protemas, se pueden usar grupos aldehffdo de cadenas de azucar en las protemas y similares, aunque los grupos funcionales a usar no estan limitados. Por ejemplo, en un procedimiento, se hacen reaccionar los grupos SH del polipeptido que tienen la unidad formadora de superhelice y los grupos amino de Stx2eB, y mas espedficamente, el polipeptido que se ha reducido usando un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) y la Stx2eB en la que se han introducido grupos disulfuro de piridilo mediante N-succinil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) puede incubarse y unirse de este modo. Ademas, el polipeptido que tiene la unidad formadora de superhelice y Stx2eB pueden unirse qmmicamente mediante usando enlaces mediante el uso de interacciones entre las biomoleculas tales como biotina y avidina.

La protema de fusion y su mulffmero obtenido mediante los procedimientos anteriores pueden aislarse y purificarse adicionalmente mediante un medio de purificacion general. En este contexto, como medio de purificacion, se mencionan procedimientos de purificacion tales como cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa de filtracion en gel.

La invencion incluye una vacuna contra la enfermedad de edema porcino que contiene la protema de fusion y/o el mulffmero de protema de fusion de la invencion como principio activo. Es preferible que la vacuna de la invencion contenga el mulffmero de la protema de fusion. Es preferible un dfmero, un tffmero, un tetramero, un pentamero o un mulffmero superior o una mezcla de los mulffmeros.

La vacuna contra la enfermedad de edema porcino contiene preferentemente de 0,1 a 1000 |jg de la protema de fusion y/o el mulffmero de la protema de fusion en una dosis. Ademas, cuando un animal susceptible se inmuniza con la vacuna, se pueden inducir anticuerpos neutralizantes de toxinas a un nivel para defenderse contra el inicio o superior.

La vacuna de la invencion puede contener un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos son solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, un tampon acuoso isotonico y una combinacion de los mismos. Ademas, se pueden anadir apropiadamente aditivos tales como un adyuvante, un agente emulsionante, un conservante, un agente de tonicidad y un agente de ajuste del pH.

Como adyuvante, Emulsigen (MVP Laboratories), acetato de tocoferol, alumbre, saponina (QS21, ISCOM), oligo CpG y similares estan incluidos.

Un anffgeno que previene una enfermedad infecciosa en cerdos se puede anadir a la vacuna de la invencion ademas de la protema de fusion. Entre las enfermedades infecciosas se encuentran infeccion por parvovirus porcino, erisipela porcina, gastroenteritis transmisible en cerdos, neumoma por micoplasma porcina, rinitis atrofica porcina, encefalitis japonesa en cerdos, infeccion por circovirus porcino, smdrome reproductivo y respiratorio porcino, infeccion estreptococica en cerdos, gripe porcina, pleuroneumoma porcina, enfermedad de Glasser, disenteffa porcina, diarrea epidemica porcina, infeccion por E. coli en cerdos, enteropaffa proliferativa, enterocolitis necrosante en cerdos, salmonelosis porcina e infeccion por rotavirus porcino.

La vacuna de la invencion puede administrarse a traves de cualquier via de administracion tal como administracion transdermica, administracion sublingual, administracion oftalmica, administracion intradermica, administracion intramuscular, administracion oral, administracion enteral, administracion nasal, administracion intravenosa, administracion subcutanea, administracion intraperitoneal y administracion por inhalacion desde la boca al pulmon. Al inocular cerdos con la vacuna de la invencion, la vacuna induce potentes anticuerpos neutralizantes de toxinas y puede prevenir la aparicion efectiva de la enfermedad de edema porcino. Se infiere que la razon para esto es que cuando se fusionan Stx2eB y el polipeptido capaz de formar una estructura de superhelice, la conformacion original apropiada de Stx2eB, incluyendo la formacion de pentameros, se consigue facilmente.

La invencion incluye un kit para medir la cantidad de anticuerpos para Stx2eB en una muestra, en el que el kit contiene la protema de fusion y/o el mulffmero de la protema de fusion. El kit que contiene la protema de fusion de la invencion puede ser una placa en la que se inmoviliza la protema de fusion. Se anade una muestra a la placa y se hacen reaccionar la protema de fusion en la placa y anticuerpos contenidos en la muestra. Los anticuerpos secundarios etiquetados con una enzima o una sustancia fluorescente se anaden y se hacen reaccionar con los anticuerpos primarios. La cantidad de anticuerpos contenidos en la muestra se puede medir anadiendo un sustrato de la enzima si es necesario y detectando el producto de la reaccion enzimatica o la intensidad de la fluorescencia. El kit de la invencion se puede usar para evaluar la eficacia de una vacuna inmunizando a un cerdo con la vacuna que contiene la protema de fusion y/o el mulffmero de protema de fusion como principio activo y detectando a continuacion la produccion de anticuerpos derivados de la vacuna.

La invencion incluye una vacuna de ADN contra la enfermedad de edema porcino que contiene el fragmento de acido nucleico o el vector de expresion recombinante como principio activo. En la vacuna de ADN de la invencion, el fragmento de acido nucleico o el vector de expresion recombinante contienen preferentemente una secuencia promotora para expresar la protema de fusion despues de inmunizar un cerdo.

Con respecto al procedimiento para producir la vacuna de ADN de la invencion, la prueba de provocacion se realiza en cerdos con STEC o Stx2e antes y despues de inocular a los cerdos con la vacuna de ADN. Como resultado, se selecciona un fragmento de acido nucleico o un vector de expresion recombinante que ha reducido significativamente un smtoma clmico de la enfermedad de edema porcino como principio activo de un agente para tratar la enfermedad de edema porcino, y la cantidad de principio activo se puede determinar a partir de la dosis en este punto.

La vacuna de ADN de la invencion puede contener un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos son solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, un tampon acuoso isotonico y una combinacion de los mismos. Ademas, se pueden anadir apropiadamente aditivos tales como un adyuvante, un agente emulsionante, un conservante, un agente de tonicidad y un agente de ajuste del pH.

La vacuna de ADN de la invencion puede administrarse a traves de cualquier via de administracion tal como administracion transdermica, administracion sublingual, administracion oftalmica, administracion intradermica, administracion intramuscular, administracion oral, administracion enteral, administracion nasal, administracion intravenosa, administracion subcutanea, administracion intraperitoneal y administracion por inhalacion desde la boca al pulmon.

La invencion describe un anticuerpo que se une a la protema de fusion y/o al multimero de la protema de fusion. Pueden producirse anticuerpos monoclonales y policlonales o similares, o puede producirse un anticuerpo humano de los mismos, usando la protema de fusion y/o el multimero de la protema de fusion de la invencion como antígeno, mediante un procedimiento de inmunizacion general (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH, Editado por J. McCAFFERTY y col., o ANTIBODY ENGINEERING segunda edicion, Editado por Carl A. K. BORREBAECK). Un anticuerpo que se une a la protema de fusion y/o su multfmero puede producirse mediante un procedimiento de produccion de anticuerpos mediante la tecnica de presentacion en fagos (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Edited by Brian K. Kay y col., Antibody Engineering: APRACTICAL APPROACH, Editado por J. McCAFFERTY y col., o ANTIBODY ENGINEERING segunda edicion, Editado por Carl A. K. BORREBAECK). Se supone que el anticuerpo de la invencion se usa como un agente para tratar la enfermedad de edema porcino, un kit y un portador para cromatograffa de afinidad, que se explican a continuacion.

La invencion describe un agente para tratar la enfermedad de edema porcino que contiene el anticuerpo como principio activo. Con respecto al procedimiento para producir el agente terapeutico de la invencion, la prueba de provocacion se realiza en cerdos con STEC o Stx2e antes y despues de inocular a los cerdos con el anticuerpo producido mediante el procedimiento anterior. Como resultado, un anticuerpo que ha reducido significativamente un smtoma clmico de la enfermedad de edema porcino se selecciona como principio activo del agente para tratar la enfermedad de edema porcino, y la cantidad de principio activo se puede determinar a partir de la dosis del anticuerpo en este momento.

El agente para tratar la enfermedad de edema porcino contiene el anticuerpo como principio activo y puede contener un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos son solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, un tampon acuoso isotonico y una combinacion de los mismos. Ademas, se pueden anadir apropiadamente aditivos tales como un adyuvante, un agente emulsionante, un conservante, un agente de tonicidad y un agente de ajuste del pH.

El agente para tratar la enfermedad de edema porcino puede administrarse a traves de cualquier via de administracion tal como administracion transdermica, administracion sublingual, administracion oftalmica, administracion intradermica, administracion intramuscular, administracion oral, administracion enteral, administracion nasal, administracion intravenosa, administracion subcutanea, administracion intraperitoneal y administracion por inhalacion desde la boca al pulmon.

La invencion describe un kit para medir el contenido de Stx2eB en una muestra, en el que el kit contiene el anticuerpo que se une a la protema de fusion y/o al multfmero de la protema de fusion. Como un kit de este tipo, se incluye un kit en el que el anticuerpo que se une a la protema de fusion se inmoviliza en una placa o similar. El kit que contiene el anticuerpo de la invencion se puede usar para evaluar si un sujeto esta infectado con edema porcino o no, usando el contenido de Stx2eB como mdice. Por ejemplo, se anade una muestra a la placa en la que se inmoviliza el anticuerpo, y a continuacion se anaden los anticuerpos etiquetados con una enzima o un colorante fluorescente. El contenido de Stx2eB en la muestra se puede medir incubando y lavando la placa, anadiendo un sustrato cromogeno si es necesario y midiendo la intensidad de la fluorescencia.

Ejemplos de la placa son Nunc Immuno plate MaxiSorp (Thermo scientific), una placa para ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), ELISPOT (MERCK), Immuno plate (Cosmo Bio Co., ltd.), Placa ELISA (IWAKI) y placa ELISA (ExtraGene), y el anticuerpo puede inmovilizarse en la placa mediante un procedimiento que generalmente es empleado por un experto en la materia.

Ejemplos del procedimiento para etiquetar el anticuerpo con una enzima o un colorante fluorescente son los kits de conjugacion de anticuerpos EasyLink (abcam), el sistema de conjugacion rapida Lightning-Link (Innova Biosciences Ltd), el kit de etiquetado de anticuerpos Oyster (Luminartis GmbH), el kit de etiquetado de enzimas EZ-Link (PIERCE Biotechnology), kit de etiquetado de protemas PlatinumLink (Kreatech Biotechnology BV) y el kit de etiquetado de anticuerpos DyLight (PIERCE Biotechnology).

La invencion describe un vehmulo para cromatograffa de afinidad en el que el anticuerpo para la protema de fusion y/o el multimero de la protema de fusion esta unido a un vehmulo. La protema de fusion y/o el multimero de la protema de fusion de la invencion se expresan dentro o fuera del huesped, y cuando se expresan en el huesped, la protema de fusion y/o el multimero de la protema de fusion se recuperan rompiendo el huesped, mientras que cuando se expresan fuera del huesped, la protema de fusion y/o el multfmero de protema de fusion se recuperan del entorno de cultivo. Se supone que el vehmulo de la invencion se usa para recuperar la protema de fusion y/o el multimero de protema de fusion de dicha fraccion contaminante o similar.

Ejemplos del vehmulo son HP activada por HiTrap NHS (GE Healthcare), Sepharose 4 Fast Flow activada por NHS (G^eHealthcare), Sepharose 4B activada por CNBr (GE Healthcare), Sepharose 4 Fast Flow activada por CNBr (GE Healthcare), EAH Sepharose 4B (GE Healthcare), ECH Sepharose 4^b(GE Healthcare), resina epoxi Profinity (BIORAD) y gel de hidrazida Affi-Gel Hz (BIORAD), y el anticuerpo puede unirse mediante un procedimiento que generalmente es usando por un experto en la materia.

Ejemplos

La invencion se explica mas detalladamente con los ejemplos a continuacion, pero la invencion no esta limitada por estos ejemplos.

Ejemplo 1

Preparacion de la protema Stx2eB-His-COMP y su multimero

(1) Construccion del vector de expresion

Construccion del vector que expresa Stx2eB-His y preparacion de E. coli que expresa Stx2eB-His

Se diseno una secuencia de ADN (SEQ ID NO:2) basada en una secuencia de ADN que codifica un precursor de Stx2eB (SEQ ID NO:1) optimizando los codones para la expresion en E. coli y levadura y anadiendo la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Nde I hasta el extremo 5' y la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Xho I hasta el extremo 3' para insercion en un vector de expresion, y el fragmento de ADN se sintetizo artificialmente. El ADN sintetico y el plasmido pET-22b (Merck KGaA) se trataron con Nde I y Xho I y se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino "vector intermedio 1". La reaccion de PCR se realizo usando el vector intermedio 1 como modelo y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Nco I (SEQ ID NO:3) y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Xho I (SEQ ID NO:4) como los cebadores, y se amplifico el ADN que codifica Stx2eB madura que no contiene una secuencia senal secretora.

El producto amplificado y el plasmido pET-21d (Merck KGaA) se trataron con Nco I y Xho I y se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino pSTXB. El plasmido expresa una protema de fusion de Stx2eB y etiqueta de His (en lo sucesivo denominada Stx2eB-His) (SEQ ID NO:5) (figura 1). Una secuencia de nucleotidos de ADN que codifica Stx2eB-His se muestra en la SEQ ID NO:6. Se transfecto E. coli BL21 (DE3) (Merck KGaA) con pSTXB, y se obtuvo una cepa de E. coli STXB que expresaba Stx2eB-His.

(2) Construccion del vector que expresa Stx2eB-His-COMP y preparacion de E. coli que expresa Stx2eB-His-COMP La reaccion de PCR se realizo usando pB (NPL 5, Infect Immun. 2005, 7, 5654-65), que es un vector de expresion de un precursor de la subunidad de la toxina B del colera, como modelo y oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Mun I (SEQ ID NO:7) y oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Mun I y una secuencia que codifica un enlazador (GP)2GH6(EcoR I)Ha (una secuencia artificial) (SEQ ID NO:8) como los cebadores, y se amplifico el ADN que codifica CTB-(GP)2GHa(EcoRI)Ha.

El ADN amplificado se trato con Mun I y un pPIC3.5K (Life Technologies) se corto con EcoR I, y el ADN y el vector pPIC3.5K se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino "vector intermedio 2".

ADN (SEQ ID NO:11) que codifica una protema de fusion de ADN que codifica un enlazador (G4S)3 (una secuencia artificial) (SEQ ID NO:9) y ADN que codifica el dominio formador de pentameros de la protema de la matriz oligomerica de cartflago (en lo sucesivo denominada COMP) con codones optimizados para la expresion en E. coli y levadura (SEQ ID NO:10) fue disenado y sintetizado artificialmente. La reaccion de PCR se realizo usando el ADN sintetico como modelo y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Mun I (SEQ ID NO:12) y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion EcoR I (SEQ ID NO:13) como los cebadores y el ADN que codifica enlazador (G⁴S)³-COMP se amplificaron. Se unieron el producto amplificado que se trato con Mun I y EcoR I y el vector intermedio 2 que se trato con EcoR I. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino "vector intermedio 3".

La reaccion de PCR se realizo usando el vector intermedio 3 como modelo y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Xho I (SEQ ID NO:14) y el oligo-ADN que contiene la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Xho I (SEQ ID NO:15) como los cebadores, y se amplifico el ADN que codifica una proterna de fusion de un enlazador (GP) ²GH⁶(G⁴S)³y COMP. El ADN amplificado y pSTXB se trataron con Xho I y se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino pSTXC. El plasmido es un vector para expresar una proterna de fusion de Stx2eB, el enlazador (GP)²GH⁶(G⁴S)³y COMP (en lo sucesivo denominado Stx2eB-His-COMP) (SEQ ID NO:16) (figura 2). Una secuencia de nucleotidos de ADN que codifica Stx2eB-His-COMP se muestra en la SEQ ID NO:17. Se transfecto la cepa de E. coli BL21 (DE3) (Merck KGaA) con pSTXC, y se obtuvo una cepa de E. coli STXC que expresaba Stx2eB-His-COMP.

(3) Construccion del vector que expresa Stx2eB-His-COMP-His-Z y preparacion de E. coli que expresa Stx2eB-His-COMP-His-Z

Se corto un vector que expresa COMP-His-Z (NPL 6, Infect. Immune. 2011, 79 (10), 4260-4275) con Nco I y Xho I, y se preparo un fragmento de ADN que codifica una proterna de fusion de COMP, un enlazador (GP)²G⁴SH⁶G⁴S(GP)²y el dominio Z de union a inmunoglobulina (en lo sucesivo denominado dominio Z) (la proterna de fusion se denomina COMP-His-Z a continuacion). Se unieron el fragmento de ADN y un vector pET-21d (MERCK) que se trato con enzimas de restriccion Nco I y Xho I. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino "vector intermedio 4". El vector intermedio 4 se trato adicionalmente con Nco I y Bsm I, y se preparo un "vector intermedio 5" en el que se preparo la secuencia desde el extremo 5' de COMP al sitio de reconocimiento para Bsm I.

A continuacion, se realizo la reaccion de PCR usando pSTXC como modelo y el oligo-ADN de la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:15 como los cebadores, y se amplifico el ADN que codificaba Stx2eB-His-COMP. El ADN amplificado se trato con las enzimas de restriccion Nco I y Bsm I. El fragmento de ADN carece de una parte del extremo carboxilo de COMP. El fragmento de ADN y el vector intermedio 5 se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino pSTXZ. El plasmido expresa una proterna de fusion de Stx2eB, el enlazador (GP)²GH⁶(G⁴S) ³, COMP, el enlazador (GP)2G4s H6G4S(GP)2 y el dominio Z (en lo sucesivo denominado Stx2eB-His-COMP-His-Z (SeQ ID NO:18) (figura 4). Una secuencia de Ad N que codifica Stx2eB-His-COMP-His-Z se muestra en la SEQ ID NO:19. Se transfecto E. coli BL21 (DE3) (MERCK) con pSTXZ y se obtuvo una cepa de E. coli STXZ que expresaba Stx2eB-His-COMP-His-Z.

Ejemplo 2

Cultivo de E. coli recombinante y purificacion de protemas expresadas

(1) Cultivo de la cepa STXB y purificacion de Stx2eB-His

A un tubo de ensayo de 12 ml, se le anadieron 3 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inoculo la cepa STXB, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 16 horas (precultivo). A un matraz conico de 2 l, se le anadieron 200 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inocularon 2 ml de la solucion de precultivo, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion hasta que la DO⁵⁹⁰supero 0,5. Cuando la DO⁵⁹⁰del cultivo supero 0,5, se anadio isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTg ) para dar una concentracion final de 10 pM, y la solucion se cultivo a 25 °C con agitacion durante 20 horas. La solucion de cultivo se transfirio a un tubo de centnfuga y las celulas bacterianas se recuperaron mediante centrifugacion a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. La fraccion de cuerpo de inclusion se preparo mediante centrifugacion usando BugBuster (Merck KGaA) a partir de las celulas bacterianas recuperadas.

La fraccion de cuerpo de inclusion preparada se solubilizo con una solucion de SDS al 1 % y el tampon se reemplazo con PBS mediante dialisis (Spectrum Laboratories, inc. Membrana de dialisis Spectra/Por CE. MWCO: 3,5-5 kD), obteniendo de este modo un antígeno Stx2eB-His.

(2) Cultivo de la cepa STXC y purificacion de Stx2e-His-COMP

A un tubo de ensayo de 12 ml, se le anadieron 3 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inoculo la cepa STXC, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 16 horas (precultivo). A un matraz conico de 2 l, se le anadieron 200 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inocularon 2 ml de la solucion de precultivo, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion hasta que la DO⁵⁹⁰supero 0,5. Cuando la DO⁵⁹⁰del cultivo supero 0,5, se anadio isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) para dar una concentracion final de 10 pM, y la solucion se cultivo a 37°C con agitacion durante seis horas. La solucion de cultivo se transfirio a un tubo de centnfuga y las celulas bacterianas se recuperaron mediante centrifugacion a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. La fraccion de cuerpo de inclusion se preparo mediante centrifugacion usando BugBuster (Merck KGaA) a partir de las celulas bacterianas recuperadas.

A continuacion, se anadio una solucion de clorhidrato de guanidina 6 M (pH 8,2) a los cuerpos de inclusion, y se preparo una solucion solubilizada. La solucion solubilizada se sometio a un tratamiento de replegamiento con referencia a PTL 1 (JP-A-2008-50344). Espedficamente, se anadieron Tween 80 (concentracion final del 0,05 %), acetato de sodio (concentracion final de 1 M) y DL-cistina (concentracion final de 2 mM) a la solucion solubilizada y la mezcla se dejo reposar a 4 °C durante una noche. Tras el tratamiento de replegamiento, Stx2eB-His-COMP se purifico usando His Trap HP (GE Healthcare Japan Corporation), y el tampon se reemplazo con PBS por ultrafiltracion (Amicon Ultra-15 30kDa, Millipore Corporation), obteniendo de este modo un antígeno Stx2eB-His-COMP. Se realizo SDS-PAGE en una condicion no reductora usando un gel de acrilamida al 12,5 %, y la formacion de multimeros se confirmo mediante tincion con CBB y transferencia de western usando un anticuerpo anti-His (figura 3).

(3) Cultivo de la cepa STXZ y purificacion de Stx2e-His-COMP-His-Z

A un tubo de ensayo de 12 ml, se le anadieron 3 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inoculo la cepa STXZ, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 16 horas (precultivo). A un matraz conico de 2 l, se le anadieron 200 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inocularon 2 ml de la solucion de precultivo, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion hasta que la DO⁵⁹⁰supero 0,5. Cuando la DO⁵⁹⁰del cultivo supero 0,5, se anadio IPTG para dar una concentracion final de 10 pM, y la solucion se cultivo a 37°C con agitacion durante seis horas. La solucion de cultivo se transfirio a un tubo de centnfuga y las celulas bacterianas se recuperaron mediante centrifugacion a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. La fraccion de cuerpo de inclusion se preparo mediante centrifugacion usando BugBuster (MERCK) a partir de las celulas bacterianas recuperadas.

A continuacion, se anadio una solucion de clorhidrato de guanidina 6 M (pH 8,2) a los cuerpos de inclusion, y se preparo una solucion solubilizada. La solucion solubilizada se sometio a un tratamiento de replegamiento con referencia a PTL 1 (JP-A-2008-50344). Espedficamente, se anadieron Tween 80 (concentracion final del 0,05 %), acetato de sodio (concentracion final de 1 M) y DL-cistina (concentracion final de 2 mM) a la solucion solubilizada y la mezcla se dejo reposar a 4 °C durante una noche. Tras el tratamiento de replegamiento, Stx2eB-His-COMP-His-Z se purifico usando His Trap HP (GE Healthcare), y el tampon se reemplazo con PBS por ultrafiltracion (Amicon Ultra-15 30kDa, Millipore Corporation), obteniendo de este modo un antígeno Stx2e-His-COMP-His-Z. Se realizo SDS-PAGE en una condicion no reductora usando un gel de acrilamida del 5 al 20%, y la formacion de multfmeros se confirmo mediante tincion con CBB y transferencia de western usando un anticuerpo anti-His (figura 5).

Ejemplo 3

1. Confirmacion de la induccion de anticuerpos neutralizantes en ratones

(1) Preparacion de vacunas e inmunizacion de ratones

a. Comparacion de las capacidades inductoras de anticuerpos neutralizantes entre el antígeno Stx2eB-His y el antígeno Stx2eB-His-COMP

Se preparo una vacuna en la que se mezclaron 50 pg de antígeno Stx2eB-His-COMP y 50 pl de Imject Alum (marca registrada) (Thermo Fisher Scientific Inc.) por 100 pl. Debido a que la cantidad de Stx2eB-His que es equivalente a 50 pg de Stx2eB-His-COMP en terminos de moles es 26,6 pg, se preparo una vacuna en la que se mezclaron 26,6 pg del antígeno Stx2eB-His y 50 pl de Imject Alum (marca registrada) por 100 pl.

Ademas, mezclando y emulsionando 50 pg del antígeno Stx2e-His-COMP y 50 pl de adyuvante incompleto de Freund (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) por 100 pl, se preparo una vacuna.

Las vacunas se inyectaron por via subcutanea en una cantidad de 100 pl a ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad (cinco ratones por grupo) tres veces a intervalos de dos semanas. La sangre se recogio dos semanas despues de la tercera inmunizacion, y los tttulos de anticuerpos se midieron mediante el ensayo de neutralizacion Stx2e usando las celulas Vero a continuacion.

b. Comparacion de las capacidades inductoras de anticuerpos neutralizantes entre el antígeno Stx2eB-His-COMP y el antígeno Stx2eB-His-COMP-His-Z

Se preparo una vacuna en la que se mezclaron 50 pg de antígeno Stx2eB-His-COMP y 50 pl de Imject Alum (marca registrada) por 100 pl. Debido a que la cantidad de Stx2eB-His-COMP-His-Z que es equivalente a 50 pg de Stx2eB-His-COMP en terminos de moles es 75 pg, se preparo una vacuna en la que se mezclaron 75 pg del antígeno Stx2eB-His-COMP-His-Z y 50 pl de Imject Alum (marca registrada) por 100 pl.

Las vacunas se inyectaron por via subcutanea en una cantidad de 100 |jl a ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad (cinco ratones por grupo) tres veces a intervalos de dos semanas. La sangre se recogio dos semanas despues de la tercera inmunizacion, y los tttulos de anticuerpos se midieron mediante el ensayo de neutralizacion Stx2e usando las celulas Vero a continuacion.

(2) Preparacion de la solucion de toxina

Se inoculo un asa de siembra de una reserva en glicerol de la bacteria del edema aislada de un cerdo en un medio de agar Circlegrow (MP Biomedicals) y se cultivo a 37 °C durante una noche. Se inoculo una unica colonia en un matraz conico de 500 ml que contema 50 ml de un medio de cultivo Circlegrow y se cultivo a 37 °C con rotacion a 220 rpm durante una noche. La solucion de cultivo (5 ml) se inoculo en cuatro matraces conicos de 500 ml que conteman 50 ml de un medio de cultivo Circlegrow y se cultivo a 37 °C con rotacion a 220 rpm durante ocho horas. Las soluciones de cultivo se agruparon y se midio la absorbancia (DO⁶⁵⁰). Despues de la centrifugacion a 10000 g a 4 °C durante 15 minutos, se recogieron los precipitados. Los precipitados se suspendieron en 20 ml de Tris-HCl 10 mM (7,0). El tratamiento ultrasonico (Branson, ciclo de trabajo 30 %, Salida 1) se realizo hasta que la absorbancia (DO⁶⁵⁰) disminuyo al 60 % del valor antes del tratamiento. Despues de la centrifugacion a 10000 g a 4 °C durante 30 minutos, se recogio el sobrenadante. El sobrenadante se esterilizo por filtracion a traves de un filtro de 0,22 jm . La muestra se congelo y se almaceno a -80 °C.

(3) Medicion de las actividades citotoxicas

• Celulas: celulas Vero

• Medio de cultivo para el cultivo: Medio de cultivo de Eagle (TPB al 10 %, bicarbonato de sodio al 1,5 %, PS al 0,1 %) con adicion de FBS al 5 %

• Medio de cultivo para la dilucion: Medio de cultivo de Eagle (TPB al 10 %, bicarbonato de sodio al 1,5 %, PS al 0,1 %)

Se cultivaron celulas Vero en el medio de cultivo para el cultivo y se retiro el sobrenadante. Por cuadrado de tamano medio (75 cm²), se anadieron 3 ml de tripsina-EDTA, y el tratamiento se realizo a 37 °C durante de 5 a 10 minutos. Despues de anadir 10 ml del medio de cultivo para el cultivo, las celulas se separaron mediante pipeteo y se recogieron en un tubo de centnfuga. Las celulas se recuperaron mediante centrifugacion a 1500 rpm durante cinco minutos. Las celulas se resuspendieron en 5 ml del medio de cultivo para el cultivo, y se conto el numero de celulas. La concentracion se ajusto a 4,0x10⁵celulas/ml usando el medio de cultivo para el cultivo.

El medio de cultivo para la dilucion se dispenso a una placa de 96 pocillos para el cultivo celular en una cantidad de 125 jl/pocillo. Se anadieron diluciones sucesivas de dos veces de la solucion de toxina, que se diluyeron con el medio de cultivo para la dilucion, en una cantidad de 25 jl/pocillo. La suspension celular ajustada a 4,0x10⁵celulas/ml se anadio en una cantidad de 50 jl/pocillo. La placa se sello y se cultivo a 37 °C durante cinco dfas. <Evaluacion>

Se confirmo que el porcentaje de formacion de la lamina celular del control negativo es del 95 % o mas, y se determino que la dilucion que muestra un porcentaje de formacion de la lamina celular del 50 % o menos es la cantidad de actividad citotoxica del 50 % (dosis citotoxica, DC⁵⁰).

(4) Ensayo de neutralizacion de Stx2e usando celulas Vero

• Celulas: celulas Vero

Despues de cultivar las celulas Vero en el medio de cultivo para el cultivo, se retiro el sobrenadante de las celulas. Por cuadrado de tamano medio (75 cm²), se anadieron 3 ml de tripsina-EDTA, y el tratamiento se realizo a 37 °C durante de 5 a 10 minutos. Despues de anadir 10 ml del medio de cultivo para el cultivo, las celulas se separaron mediante pipeteo y se recogieron en un tubo de centnfuga. Las celulas se recuperaron mediante centrifugacion a 1500 rpm durante cinco minutos. Las celulas se resuspenden en 5 ml del medio de cultivo para el cultivo, y se cuenta el numero de celulas. La concentracion se ajusto a 4,0x10⁵celulas/ml usando el medio de cultivo para el cultivo.

La solucion de toxina (60 |jl) que se ajusto a 10 DC50 con el medio de cultivo para la dilucion y 60 j l de diluciones sucesivas de dos veces de una muestra de suero diluida con el medio de cultivo para la dilucion se mezclaron y se hicieron reaccionar a 37 °C durante una hora. El medio de cultivo para la dilucion se dispenso a una placa de 96 pocillos en una cantidad de 100 jl/pocillo. Las soluciones de neutralizacion que se hicieron reaccionar a 37°C se anadieron, cada una, en una cantidad de 50 jl. La suspension celular ajustada a 4,0x105 celulas/ml se anadio en una cantidad de 50 jl/pocillo. La placa se sello y se cultivo a 37 °C durante cinco dfas.

Se confirmo que el porcentaje de formacion de la lamina celular del control negativo era del 95 % o mas, y se determino que la mayor dilucion de la muestra de suero que mostraba un porcentaje de formacion de la lamina celular del 50 % o mas era el titulo de anticuerpos neutralizantes. Los resultados se muestran en la tabla 1 y la tabla 2.

[Tabla 1]

Comparacion de las capacidades inductoras de anticuerpos neutralizantes entre el antigeno Stx2eB-His y el antigeno Stx2eB-His-COMP_______________________________________________________________________

[Tabla 2]

Comparacion de las capacidades inductoras de anticuerpos neutralizantes entre el antigeno Stx2eB-His-COMP y el antigeno Stx2eB-His-CpMP-His-Z__________________________________________________________________

A partir de estos resultados, se confirmo que el antigeno Stx2eB-His-COMP induce anticuerpos neutralizantes para Stx2e en ratones. Por otro lado, el aumento en los anticuerpos neutralizantes no se observo en el grupo de inyeccion de Stx2eB-His. Los resultados de este estudio muestran que es diticil que una estructura multimerica apropiada este formada solo por Stx2eB, y la fusion con COMP es ventajosa. Ademas, se confirmo que el antigeno Stx2eB-His-COMP puede inducir anticuerpos neutralizantes de la toxina significativamente potentes en comparacion con el antigeno Stx2eB-His-COMP-His-Z.

2. Prueba de provocacion con Stx2e en ratones

Se preparo una vacuna en la que se mezclaron 50 jg del antigeno Stx2e-His-COMP y 50 j l de adyuvante incompleto de Freund (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) por 100 j l y se emulsionaron. Se sometieron a la prueba ratones BALB/c hembra de siete semanas de edad, y se inyectaron 100 j l de la vacuna por via subcutanea tres veces a intervalos de dos semanas (10 ratones por grupo). Dos semanas despues de la tercera inmunizacion, se inyectaron por via intraperitoneal 0,4 ml (32000 50 % de la cantidad de degeneracion de celulas Vero) de una solucion de toxina preparada a partir de la bacteria del edema (el procedimiento de preparacion se ha descrito anteriormente). Los ratones se observaron durante siete dfas despues de la administracion de Stx2e, y se conto el numero de muertes. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

[Tabla 31

A partir de la tabla 3, se observo una diferencia significativa (p=0,0041) entre el grupo de placebo y el grupo inmunizado, y se confirmo que la inmunizacion de ratones con el antigeno Stx2eB-His-COMP defiende contra la provocacion con Stx2e.

Ejemplo 4

Confirmacion de la induccion de anticuerpos neutralizantes en cerdos

Se preparo una vacuna que contema 100 pg de antigeno Stx2eB-His-COMP y 0,4 ml de Emulsigen (MVP Laboratories) por 2 ml. La vacuna se inyecto por via intramuscular en cerdos de tres a cuatro semanas de edad en la region cervical dos veces en un intervalo de dos semanas. La sangre se recogio en el momento de la primera inmunizacion, en el momento de la inmunizacion adicional y dos semanas despues de la inmunizacion adicional, y los tttulos de anticuerpos se midieron mediante el ensayo de neutralizacion con Stx2e usando celulas Vero. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

[Tabla 41

A partir de estos resultados, se confirmo que el antígeno Stx2eB-His-COMP induce anticuerpos neutralizantes para Stx2e tambien en cerdos.

Ejemplo 5

Prueba de provocacion con Stx2e en cerdos

A los cerdos usados en el ejemplo 4 se les inyectaron por via intraperitoneal 20 ml (60000050 % de la cantidad de degeneracion de celulas Vero) de una solucion de toxina preparada a partir de la bacteria del edema (el procedimiento de preparacion se ha descrito anteriormente) dos semanas despues de la inmunizacion adicional. Ademas, Ademas, para excluir la influencia de LPS mixto, se administro una solucion de Stx2e que se calento a 80 °C durante 10 minutos para inactivar termicamente Stx2e a un cerdo en el grupo de placebo. Los smtomas clmicos se observaron durante tres dfas despues de la administracion de Stx2e. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

[Tabla 51

A partir de los resultados en la tabla 5, se confirmo que la inmunizacion de cerdos con el antígeno Stx2eB-His-COMP puede defender contra la provocacion con Stx2e.

Ejemplo 6

Preparacion de la protema Stx2eB-His-CMP y su multimero

(1) Construccion del vector que expresa Stx2eB-His-CMP y preparacion de E. coli que expresa Stx2eB-His-CMP Se diseno una secuencia de ADN (SEQ ID NO:36) optimizando los codones (SEQ ID NO:34) para expresar una protema de fusion de Stx2eB, un enlazador (GP)²GH⁶(G⁴S)³y CMP (en lo sucesivo denominado Stx2eB-His-CMP) (SEQ ID NO:35) (figuras 6) en E. coli, anadiendo la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Nco I al extremo 5' y la secuencia de reconocimiento para la enzima de restriccion Xhol al extremo 3' para la insercion en un vector de expresion y anadiendo ademas nucleotidos protectores al extremo 5' y al extremo 3', y la secuencia de ADN se sintetizo artificialmente. El ADN sintetico se inserto en el sitio de Eco RV del plasmido pUC57 (GenScript Corporation). El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino "vector intermedio 6".

El vector intermedio 6 se trato con Nco I y Xho I, y se obtuvo un fragmento de ADN que codifica Stx2eB-His-CMP. El fragmento de ADN y el plasmido pET-2ld (Merck KGaA) que se trato con Nco I y Xho I se unieron. El producto unido se introdujo en E. coli DH5a, y el plasmido obtenido se denomino pSTX-CMP. Ademas, se introdujo pSTX-CMP en E. coli BL2l (DE3) (Merck KGaA), y se obtuvo una cepa de E. coli STX-CMP que expresaba Stx2eB-His-CMP. (2) Cultivo de la cepa STX-CMP y preparacion de antigeno Stx2e-His-CMP

A un tubo de ensayo de 12 ml, se le anadieron 3 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inoculo la cepa STX-CMP, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion durante aproximadamente 16 horas (precultivo). A un matraz conico de 2 l, se le anadieron 200 ml de un medio de cultivo 2xYT y una solucion de ampicilina (concentracion final de 200 pg/ml) y se inocularon 2 ml de la solucion de precultivo, seguida de cultivo a 37 °C con agitacion hasta que la DO⁵⁹⁰supero 0,5. Cuando la DO⁵⁹⁰del cultivo supero 0,5, se anadio isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTg ) para dar una concentracion final de 10 pM, y la solucion se cultivo a 37°C con agitacion durante seis horas. La solucion de cultivo se transfirio a un tubo de centnfuga y las celulas bacterianas se recuperaron mediante centrifugacion a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. Las celulas bacterianas en 100 ml de la solucion de cultivo se suspendieron en un tampon de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM) que contema lisozima (concentracion final de 1 mg/ml) y las celulas bacterianas se desorganizaron mediante el homogeneizador ultrasonico UD-201 (Tomy Co., Ltd.). La solucion de celulas bacterianas desorganizadas se centrifugo a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos, y se obtuvieron cuerpos de inclusion. Los cuerpos de inclusion se resuspendieron en el tampon de lisis para lavar los cuerpos de inclusion, y los cuerpos de inclusion se recogieron mediante centrifugacion a 10.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos.

A continuacion, se anadio un tampon que contema tris 50 mM (pH 8,2) y clorhidrato de guanidina 6 M a los cuerpos de inclusion, y se preparo una solucion solubilizada. La solucion solubilizada se sometio a un tratamiento de replegamiento mediante dialisis por etapas. Espedficamente, la solucion solubilizada se dializo durante cuatro horas usando un tampon que contema tris 50 mM (pH 8,2) y clorhidrato de guanidina 2 M, a continuacion se dializo durante cuatro horas usando un tampon que contema tris 50 mM (pH 8,2), clorhidrato de guanidina 1 M, clorhidrato de arginina 1 M y DL-cistina 5 mM, a continuacion se dializo durante 16 horas usando un tampon que contema tris 50 mM (pH 8,2), clorhidrato de guanidina 0,5 M, clorhidrato de arginina 1 M y DL-cistina 5 mM y finalmente se dializo durante cuatro horas usando un tampon de PBS que contema clorhidrato de arginina 1 M. La muestra obtenida en este contexto se uso como un antígeno Stx2eB-His-CMP. Se realizo SDS-PAGE en una condicion no reductora usando un gel de acrilamida al 12,5 %, y la formacion de multimeros se confirmo mediante tincion con CBB y transferencia de western usando un anticuerpo anti-His (figura 7).

Ejemplo 7

Prueba de provocacion con Stx2e en ratones

(1) Preparacion de la vacuna

Debido a que la cantidad de Stx2eB-His-CMP que es equivalente a 50 pg de Stx2eB-His-COMP descrita en el ejemplo 3 en terminos de moles es 46,5 pg, se preparo una vacuna en la cual 46,5 pg del antígeno Stx2eB-His-CMP y 50 pl de adyuvante incompleto de Freund (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.) se mezclaron por 100 pl y se emulsionaron.

(2) Prueba de provocacion con Stx2e en ratones

Se sometieron a la prueba ratones BALB/c hembra de nueve semanas (10 ratones por grupo). La vacuna en una cantidad de 100 pl se inyecto por via subcutanea al grupo inmunizado dos veces en un intervalo de dos semanas. No se administro nada al grupo de no administracion. Dos semanas despues de la segunda inmunizacion, se inyectaron por via intraperitoneal 0,4 ml (64000 50 % de la cantidad de degeneracion de celulas Vero) de una solucion de toxina Stx2e preparada a partir de la bacteria del edema (el procedimiento de preparacion se ha descrito anteriormente). Los ratones se observaron durante siete dfas despues de la administracion de Stx2e, y se conto el

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una protema de fusion en la que estan unidos un polipeptido que consiste en una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Shx2e (Stx2eB).

2. La protema de fusion descrita en la reivindicacion 1, que tiene una secuencia enlazadora y/o una secuencia de etiqueta entre el polipeptido y la Stx2eB.

3. La protema de fusion descrita en la reivindicacion 1 o 2, en la que la protema COMP es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:27 o la SEQ ID NO:28 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

4. La protema de fusion descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la Stx2eB es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:20, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:24 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

5. Un multfmero de protema de fusion, en el que la protema de fusion descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 esta multimerizada.

6. Un fragmento de acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la protema de fusion descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un vector de expresion recombinante que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en la reivindicacion 6.

8. Una celula huesped que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en la reivindicacion 6 o el vector de expresion recombinante descrito en la reivindicacion 7.

9. Una vacuna contra la enfermedad de edema porcino que comprende la protema de fusion descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el multimero de protema de fusion descrito en la reivindicacion 5 como principio activo.

10. Una vacuna de ADN contra la enfermedad de edema porcino que comprende el fragmento de acido nucleico descrito en la reivindicacion 6 o el vector de expresion recombinante descrito en la reivindicacion 7 como principio activo.

11. Un kit para medir la cantidad de anticuerpos contra la Stx2eB en una muestra, que comprende la protema de fusion descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el multfmero de protema de fusion descrito en la reivindicacion 5.

12. Un procedimiento de produccion de un multimero de protema de fusion, que comprende un procedimiento de expresar una protema de fusion en la que un polipeptido que tiene una unidad formadora de superhelice de la protema oligomerica de la matriz de cartflago (COMP) y una subunidad B de la toxina Shiga Stx2e (Stx2eB) se unen en un huesped y a continuacion replegar la protema de fusion, en el que la protema de fusion tiene preferentemente un espaciador entre el polipeptido y la Stx2eB.

13. El procedimiento de produccion descrito en la reivindicacion 12, en la que la protema COMP es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID nO:27 o la SEQ ID NO:28 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

14. El procedimiento de produccion descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en la que la Stx2eB es un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEQ ID NO:20, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:24 o un polipeptido que tiene una homologfa de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % o mas preferentemente al menos el 95 % con dichas secuencias.

15. Una protema de fusion como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un multfmero de protema de fusion como se describe en la reivindicacion 5 o un fragmento de acido nucleico como se describe en la reivindicacion 6 o un vector de expresion recombinante como se describe en la reivindicacion 7 para su uso en un procedimiento para prevenir la enfermedad de edema porcino.