CN104755619A - 用于预防猪水肿病的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是对预计发生猪水肿病的农场提供可以预防猪水肿病的疫苗。满足该目的的疫苗是具有卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB结合而得的融合蛋白或所述融合蛋白的多聚体，通过用该疫苗对猪免疫，能够诱导高效中和抗体并抵御猪水肿病的发病。

Description

用于预防猪水肿病的疫苗
技术领域
本发明涉及用于预防猪水肿病的疫苗。更具体而言，所述疫苗包含使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与作为导致猪水肿病的毒素的Stx2e的B亚基(Stx2eB)融合而得的重组蛋白和/或所述重组蛋白的多聚体作为活性成分。通过对猪接种该融合蛋白和/或多聚体，能够诱导高效毒素中和抗体，该疫苗能预防水肿病的发病。
背景技术
猪水肿病多发于4至12周龄的幼猪，导致眼睑浮肿、神经症状等，大部分在发病后24小时以内死亡(非专利文献1，Proc.Jpn.Pig Vet.Soc.2006,48,7-13)。猪水肿病的死亡率高达50至90％，并且由于复发、发育不良等导致生产能力降低，因此经济损失巨大。本疾病由与肠道粘附的产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin producing E.coli，STEC)产生的志贺毒素Stx2e为原因而发病。Stx2e为AB5型毒素蛋白，由具有rRNAN-糖苷酶活性的A亚基(Stx2eA)和具有受体(globotetraosyl ceramide(Gb4))结合能力的B亚基5聚体(Stx2eB)构成。已知的是，从肠道被导入且通过B亚基而到达诸如血管内皮细胞的细胞的表面的Stx2e将A亚基向靶细胞的胞质内递送，阻碍核糖体的蛋白合成，从而诱发水肿病的症状。在日本，用于预防猪水肿病的疫苗尚未市售，虽然也使用抗生素，但是发病后的给药变得为时已晚的情况多。此外，也报告了耐药菌的出现，因此期望有效的预防方法和治疗方法的开发。
基于这样的背景，我们研究了能有效地预防猪水肿病的方法。例如，采用Stx2e类毒素免疫的实验例对实验感染显示防御效果(非专利文献2，Vet.Microbiol.1991,29,309-318)。然而，在其他报告中，由于去毒化困难，因此一些猪在类毒素免疫后仍观察到水肿病的发病(非专利文献3，Infect.Immun.1992,60,485-90)。此外，报告了将Stx2eA的氨基酸序列的一部分修饰而去毒化的重组Stx2e对猪免疫时，确认了中和抗体诱导产生的例子(非专利文献3，Infect.Immun.1992,60,485-90)。然而，由重组大肠杆菌产生去毒化Stx2e的产生量极低，实用性方面存在问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2008-50344
非专利文献
非专利文献1:Proc.Jpn.Pig Vet.Soc.2006,48,7-13
非专利文献2:Vet.Microbiol.1991,29,309-318
非专利文献3:Infect.Immun.1992,60,485-90
非专利文献4:Adv.Protein Chem.2005,70,37-78
非专利文献5:Infect.Immun.2005,7,5654-65
非专利文献6:Infect.Immun.2011,79(10),4260-4275
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是对预计发生猪水肿病的农场提供能够有效地预防猪水肿病的疫苗。
用于解决技术问题的手段
本发明的发明人为了解决上述技术问题而进行了深入研究，结果发现，通过将使具有卷曲螺旋形成单元的多肽和Stx2eB融合而得的蛋白作为疫苗对猪接种，能诱导高效毒素中和抗体，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下，
[1].融合蛋白，其是通过使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与志贺毒素Stx2e的B亚基(Stx2eB)结合而得的。
[2].根据[1]所述的融合蛋白，其在所述多肽与Stx2eB之间具有连接序列和/或标签序列。
[3].根据[1]或[2]所述的融合蛋白，其中所述卷曲螺旋形成单元来源于天然多聚体形成蛋白。
[4].根据[3]所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白选自软骨寡聚基质蛋白(COMP)、软骨基质蛋白(CMP)、tetrabrachion(TB)和GCN4。
[5].根据[4]所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为COMP或CMP。
[6].根据[5]所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为COMP。
[7].根据[6]所述的融合蛋白，其为包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽。
[8].根据[5]所述的融合蛋白，所述天然多聚体形成蛋白为CMP。
[9].根据[8]所述的融合蛋白，其为包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽。
[10].根据[1]至[9]中任一项所述的融合蛋白，其中Stx2eB为包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽。
[11].融合蛋白多聚体，其是通过将[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白多聚化而得的。
[12].核酸片段，其包含编码[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白的DNA序列。
[13].重组表达载体，其包含[12]所述的核酸片段。
[14].转化体，其导入了[12]所述的核酸片段。
[15].转化体，其导入了[13]所述的重组表达载体。
[16].抗体，其能够与[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白结合。
[17].抗体，其能够与[11]所述的融合蛋白多聚体结合。
[18].针对猪水肿病的疫苗，其含有作为活性成分的[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白。
[19].针对猪水肿病的疫苗，其含有作为活性成分的[11]所述的融合蛋白多聚体。
[20].针对猪水肿病的治疗剂，其含有作为活性成分的[16]或[17]所述的抗体。
[21].针对猪水肿病的DNA疫苗，其含有作为活性成分的[12]所述的核酸片段。
[22].针对猪水肿病的DNA疫苗，其含有作为活性成分的[13]所述的重组表达载体。
[23].用于测定被检样品中针对Stx2eB的抗体的量的试剂盒，其包含[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白。
[24].用于测定被检样品中针对Stx2eB的抗体的量的试剂盒，其包含[11]所述的融合蛋白多聚体。
[25].用于测定被检样品中的Stx2eB含量的试剂盒，其包含[16]或[17]所述的抗体。
[26].融合蛋白多聚体的制备方法，其包括下述过程：使由具有卷曲螺旋形成单元的多肽与志贺毒素Stx2e的B亚基(Stx2eB)结合而得的融合蛋白在宿主中表达，然后将所述融合蛋白进行重折叠。
[27].根据[26]所述的制备方法，其中所述融合蛋白在所述多肽与Stx2eB之间具有间隔子。
[28].根据[26]或[27]所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于选自软骨寡聚基质蛋白(COMP)、软骨基质蛋白(CMP)、tetrabrachion(TB)和GCN4的天然多聚体形成蛋白的卷曲螺旋形成单元。
[29].根据[28]所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于COMP或CMP的卷曲螺旋形成单元。
[30].根据[29]所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于COMP的卷曲螺旋形成单元。
[31].根据[30]所述的制备方法，其中所述多肽为包含SEQ IDNO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列的多肽。
[32].根据[29]所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于CMP的卷曲螺旋形成单元。
[33].根据[32]所述的制备方法，其中所述多肽为包含SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:33所示的氨基酸序列的多肽。
[34].根据[26]至[33]中任一项所述的制备方法，其中Stx2eB为包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽。
[35].猪水肿病的预防方法，包括对猪给予[1]至[10]中任一项所述的融合蛋白。
[36].猪水肿病的预防方法，包括对猪给予[11]所述的融合蛋白多聚体。
[37].猪水肿病的治疗方法，包括对猪给予[16]或[17]所述的抗体。
[38].猪水肿病的预防方法，包括对猪给予[12]所述的核酸片段。
[39].猪水肿病的预防方法，包括对猪给予[13]所述的重组表达载体。
发明的效果
如果将使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB结合而得的融合蛋白作为活性成分的疫苗对猪接种，则能够诱导高效毒素中和抗体，预防猪水肿病的发病。
附图说明
图1是Stx2eB-His的示意图。
图2是Stx2eB-His-COMP的示意图。
图3是显示了Stx2eB-His-COMP的多聚体形成的图。
图4是Stx2eB-His-COMP-Z的示意图。
图5是显示了Stx2eB-His-COMP-Z的多聚体形成的图。
图6是Stx2eB-His-CMP的示意图。
图7是显示了Stx2eB-His-CMP的多聚体形成的图。
具体实施方式
(1)融合蛋白
本发明中包含由具有卷曲螺旋形成单元的多肽与志贺毒素Stx2e的B亚基(Stx2eB)结合而得的融合蛋白。
构成本发明的融合蛋白的Stx2eB的实例包括包含分泌信号的前体Stx2eB(例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:20)、不含分泌信号的成熟Stx2eB(例如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22)、为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将成熟Stx2eB的密码子优化获得的Stx2eB(例如SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24)。
作为编码Stx2eB的DNA序列(Stx2eB的DNA序列)，除了SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23的DNA序列以外，还包括在这些DNA序列中增加了合适的限制性酶切割位点的DNA序列、在这些DNA序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基的DNA序列。此外，还包括与这些DNA序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的DNA序列。
此外，Stx2eB包括包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列的多肽以及包含具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入的这些氨基酸序列的多肽。此外，还包括包含与这些氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的氨基酸序列的多肽。
另一方面，与Stx2eB结合而构成本发明的融合蛋白的具有卷曲螺旋形成单元的多肽没有特别限制，只要其具有形成卷曲螺旋结构的能力，但具有来源于能形成多聚体的天然蛋白(多聚体形成蛋白)的卷曲螺旋形成单元的多肽是适合的。例如，非专利文献4(Adv Protein Chem.2005,70,37-78)所记载的多聚体形成蛋白是一个实例，还列出具有来源于COMP(软骨寡聚基质蛋白，5聚体)、Staphylothermus marinus来源的tetrabrachion(TB，4聚体)、GCN4(3聚体)、鸡来源的软骨基质蛋白(CMP，3聚体)等多聚体形成蛋白的卷曲螺旋形成单元的多肽。其中，优选为具有来源于形成COMP等5聚体和CMP等3聚体的蛋白的卷曲螺旋形成单元的多肽，特别优选为具有来源于形成COMP等5聚体的蛋白的卷曲螺旋形成单元的多肽，因为其与Stx2eB形成的融合蛋白为可溶性蛋白，凝集性低，诱导毒素中和抗体的效果优异。
作为编码具有COMP的卷曲螺旋形成单元的多肽的DNA序列(卷曲螺旋形成单元的DNA序列)，除了SEQ ID NO:26的DNA序列以外，还包括为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化的序列(例如SEQ ID NO:10)、在这些DNA序列中增加了适当的限制性酶切割位点的DNA序列、在这些DNA序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基的DNA序列。此外，还包括与这些DNA序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的DNA序列。
此外，在具有COMP的卷曲螺旋形成单元的多肽中，还包括包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列以及为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化的序列(例如SEQ ID NO:28)的多肽，以及包含在这些氨基酸序列中缺失、取代或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽。此外还包括包含与这些氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的氨基酸序列的多肽。
作为编码具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽的DNA序列(卷曲螺旋结构的DNA序列)，除了SEQ ID NO:30的DNA序列以外，还包括为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化的序列(例如SEQID NO:31)、在这些DNA序列中增加了适当的限制性酶切割位点的DNA序列、在这些DNA序列中缺失、取代或插入了一个或多个碱基的DNA序列。此外，还包括与这些DNA序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的DNA序列。
此外，在具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽中，还包括包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列、为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化的序列(例如SEQ ID NO:33)的多肽，以及包含在这些氨基酸序列中缺失、取代或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽。此外还包括包含与这些氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的氨基酸序列的多肽。
在本发明的融合蛋白中，具有卷曲螺旋形成单元的肽与Stx2eB可以相邻地结合，也可以出于使两者的分子间相互作用降低等目的而在肽与Stx2eB之间插入连接序列、标签序列等间隔子。连接序列没有特别限定，但例如，可以使用具有GPGP或GGGGS(G4S)的组合的序列。此外，也可以使用重复1～4次(G4S)的序列((G4S)1～(G4S)4)作为连接序列，此外，可以在其中组合(GP)2。作为标签序列，可例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Hisx6(H6)。标签序列与连接序列的组合的优选实例可以为(GP)2GH6(G4S)3。此外，在该序列中，也能够将(G4S)部分序列替换为重复序列((G4S)1～3)。此外，也能够使用GPGPH6GPGP、G4SH6G4S序列。
本发明的融合蛋白的实例可以为具有COMP的卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB的融合蛋白，为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化，其中在多肽与Stx2eB之间插入标签序列(H6)和连接序列((G4S)3)(例如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:16)。本发明的融合蛋白不仅包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的蛋白，而且包括包含在该氨基酸序列中缺失、取代或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽。此外，还包括包含与这些氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的氨基酸序列的多肽。
此外，本发明的融合蛋白的另一实例为具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB的融合蛋白，为了在大肠杆菌、酵母中进行表达而将密码子优化，其中在所述多肽与Stx2eB之间插入了标签序列(H6)和连接序列((G4S)3)(例如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35)。本发明的融合蛋白中，不仅包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列所示的蛋白，而且包括包含在该氨基酸序列中缺失、取代或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多肽。此外，还包括包含与这些氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上的氨基酸序列的多肽。
在使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB结合时，可以通过基因工程技术使两者结合，然后进行表达。例如，在一种方法中，可以使卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Stx2eB的DNA序列相邻的方式制备表达载体，然后导入到适当的宿主中，使融合蛋白表达。卷曲螺旋形成单元的DNA序列可以设置在Stx2eB的DNA序列的5’侧，也可以设置在3’侧。优选设置在3’侧。在制备上述表达载体时，连接序列和/或标签序列的DNA序列可以插入到卷曲螺旋形成单元的DNA序列与Stx2eB的DNA序列之间，也可以附加到上述DNA序列的5’侧、3’侧。例如，在一种方法中，按照从5’侧Stx2eB的DNA序列、标签序列和/或连接序列的DNA序列、卷曲螺旋形成单元的DNA序列的设置来制备表达载体。
上述的DNA序列能够通过化学合成而获得，以其作为模板通过公知的基因扩增方法进行扩增，使用各种限制性酶引入到表达载体，制备重组表达载体。基因扩增中使用的寡核苷酸被设计为能与模板DNA序列的5’侧或3’侧杂交，优选增加限制性酶的切割位点。能够使用上述的寡核苷酸、模板DNA、DNA聚合酶等，通过公知的基因扩增方法来扩增模板DNA。将扩增的DNA序列和表达载体用限制性酶处理后，使它们通过适当的DNA连接酶结合，从而能够构建插入了目标的DNA序列的重组表达载体。本发明中还包括这样的重组表达载体。
作为表达载体，可列举出质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等，但从简便的操作和成本的观点考虑，优选为质粒载体。例如，在宿主为大肠杆菌的情况下，可列举出pFN6A(HQ)FlexiVector(Promega)、pFN7A(HQ)Flexi Vector(Promega)、pFN2A(GST)Flexi Vector(Promega)、pET-22b(MERCK)、pET-21d(MERCK)、pCold载体(Takara Bio)等，在宿主为哺乳动物的情况下，可列举出pF4A CMVFlexi Vector(Promega)、pF5A CMV-neo Flexi Vector(Promega)、pF9ACMV hRluc-neo Flexi Vector(Promega)、pCI-neo Mammalian ExpressionVector(Promega)。表达载体中可以包含复制起点、对基因表达具有调控作用的启动子序列、增强子序列等调控序列、选择标记的序列。
作为启动子序列的实例，细菌启动子为大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR、PL启动子、tac启动子和trp、trc启动子。其中，关于这点适当的公知的真核细胞启动子，可列举出巨细胞病毒(“CMV”)即刻早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒LTR启动子，例如劳氏肉瘤病毒(“RoSV”)的启动子，以及金属硫蛋白-I启动子等金属硫蛋白启动子。
在以高等真核细胞作为宿主表达融合蛋白时，可以通过将增强子序列插入到表达载体来使转录活性增加。增强子序列在一定的宿主细胞型中以使启动子的转录活性增加的方式起作用。增强子的例子包括SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的下游的多瘤病毒增强子、β肌动蛋白增强子和腺病毒增强子等。
作为选择标记的实例，可以为大肠杆菌的氨苄西林抗性基因、酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)的trp1基因、哺乳动物细胞的新霉素抗性基因。
本发明包括编码上述本发明的融合蛋白的、包含卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Stx2eB的DNA序列的核酸片段。本发明的核酸片段包括卷曲螺旋形成单元的DNA序列与Stx2eB的DNA序列相邻地设置的核酸片段、或在卷曲螺旋形成单元的DNA序列与Stx2eB的DNA序列之间插入有标签序列和/或连接序列的DNA序列的核酸片段。例如，包括SEQ ID NO:17、34的核酸片段。
本发明的核酸片段能够通过将序列整体进行化学合成来获得。此外，可以通过化学合成来获得核酸片段的一部分和核酸片段的剩余部分后，通过公知的基因重组技术使它们连接。例如，在使Stx2eB或卷曲螺旋形成单元的DNA序列化学合成后，使用公知的基因扩增方法使它们扩增后，插入到分别的克隆载体中。通过限制性酶从分别的克隆载体切出Stx2eB的DNA序列或卷曲螺旋形成单元的DNA序列之后，插入到同样地进行了限制性酶处理的表达载体中，制备重组表达载体。在插入时，以各片段连续地设置的方式设计。而且，通过使用限制性酶等从重组表达载体切出核酸片段，能够获得卷曲螺旋形成单元与Stx2eB的DNA序列连接后的核酸片段。在通过上述方法制备核酸片段时，可以使标签序列、连接序列的DNA序列插入到卷曲螺旋形成单元与Stx2eB的DNA序列之间而形成表达载体，制备核酸片段。
通过用以上述方式制备出的表达载体转化宿主，可以获得含有表达载体的转化体。本发明中还包括这样的转化体。作为宿主，可列举出大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系、昆虫细胞、植物等公知的宿主。作为大肠杆菌，可以列举出BL21株、DH5α等。作为酵母，可列举出毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，作为哺乳动物细胞，可列举出CHO细胞、HEK293细胞、COS-1/-7细胞等。
表达载体向宿主的导入可以根据宿主而通过公知的方法来进行，实例可以为磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法等。在导入后，用包含选择标记的培养基进行培养，可以选择上述表达载体导入到宿主细胞中的转化体。
可以使以上述方式制备出的转化体在适合的条件下增殖后，使选择的启动子在特定的条件下(pH、温度、添加化合物)下诱导，产生融合蛋白。表达的融合蛋白在细胞内蓄积或向细胞外分泌。
在使用大肠杆菌作为宿主进行表达的情况下，可以使包涵体部分表达融合蛋白。作为从大肠杆菌回收包涵体的方法，可例如，超声波破碎法、高压均质法、使用BugBuster(Merck株式会社)的方法。
这样得到的本发明的融合蛋白也可以作为单体使用，但从诱导高效毒素中和抗体的角度考虑，优选形成多聚体。例如，这样的融合蛋白多聚体为2聚体、3聚体、4聚体、5聚体、5聚体以上，还包括这些多聚体的混合物。为了形成这样的融合蛋白多聚体，例如，只要以上述方式从大肠杆菌回收包涵体，使融合蛋白溶解后，对溶解溶液进行重折叠处理即可。作为使来自包涵体的融合蛋白溶解的方法，可例如在包涵体中加入胍盐酸盐、脲溶液的方法、Inclusion BodySolubilization Reagent(Funakoshi)、Proteospin Inclusion Body IsolationKit(Norgen)。作为重折叠处理，可例如在溶解溶液中加入精氨酸、Tween80、乙酸钠和DL-胱氨酸的方法，利用TAPS-sulfonate(片山工业株式会社)、Refolding CA Kit(Takara Bio)的方法等。
另外，本发明的融合蛋白是通过具有卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB结合而得的，它们可以化学结合。此时，在一种方法中，可以使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与Stx2eB单独表达，然后使用交联剂进行结合。
使具有卷曲螺旋形成单元的多肽、Stx2eB单独表达时，能够通过化学合成获得各自的DNA序列，以其作为模板通过公知的基因扩增方法进行扩增，通过上文所述的方法来构建各自的表达质粒。表达质粒能够以上述方式导入到宿主中，分别获得目标蛋白。
在使用交联剂进行结合时，可以利用存在于蛋白的氨基、硫醇基(SH基)、存在于蛋白的糖链的醛基等进行结合，但是所使用的官能团没有限制。例如，在一种方法中，可以使具有卷曲螺旋形成单元的多肽的SH基与Stx2eB的氨基反应，更具体而言，可以使通过二硫苏糖醇(DTT)等还原剂进行还原处理的多肽与通过N-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)导入了吡啶基二硫醚基的Stx2eB通过孵育来结合。此外也可以通过使用利用了生物素、抗生物素蛋白等生物分子彼此的相互作用的结合来化学结合。
通过上述方法获得的融合蛋白及其多聚体可以通过一般的纯化方法进一步进行分离和纯化。这里作为纯化方法，可列举出亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱等各种纯化法。
本发明包括以上述的本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体作为活性成分的针对猪水肿病的疫苗。在本发明的疫苗中，优选包含融合蛋白多聚体。优选为2聚体、3聚体、4聚体、5聚体、5聚体以上、或这些多聚体的混合物。
在针对猪水肿病的疫苗中，优选每一剂量包含0.1～1000μg的上述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。此外，在将该疫苗对易感动物免疫的情况下，可以诱导能防御发病水平或更高水平的毒素中和抗体。
本发明的疫苗中可以包含药学上可接受的载体。可列举出例如，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合。此外，也可以在其中适当配合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
作为佐剂，包括Emulsigen(MVP Laboratories)、生育酚乙酸酯、明矾、皂苷(QS21、ISCOM)、CpG oligo等。
本发明的疫苗中，除了上述融合蛋白以外，也可以增加预防猪感染性疾病的抗原。作为这样的感染性疾病的实例，可以为猪细小病毒病、猪丹毒、猪传染性胃肠炎、猪支原体肺炎、猪萎缩性鼻炎、猪日本脑炎、猪圆环病毒感染、猪繁殖和呼吸障碍综合征、猪链球菌病、猪流感、猪胸膜肺炎、格拉氏病、猪痢疾、猪流行性腹泻、猪大肠杆菌病、增生性肠病、猪坏死性肠炎、猪沙门氏菌病、猪轮状病毒感染。
本发明的疫苗可以通过经皮给药、舌下给药、点眼给药、皮内给药、肌肉内给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、从口至肺的吸入给药等任意给药途径来给药。
通过将本发明的疫苗对猪接种，可以诱导高效毒素中和抗体，有效地预防猪水肿病的发生。推测其理由是因为，通过将Stx2eB与具有形成卷曲螺旋结构的能力的多肽融合，能容易地实现包含5聚体形式的Stx2eB的原本的合适构象。
本发明中包括用于测定被检样品中针对Stx2eB的抗体的量的试剂盒，其包含上述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。包含本发明的融合蛋白的试剂盒可以为固定有融合蛋白的板。将被检样品施加于上述板，使板上的融合蛋白与被检样品中所包含的抗体反应。施以酶、荧光物质标记的二抗，使其与一抗反应。根据需要加入酶的底物，检测酶反应的产物或荧光量，从而可以测定被检样品中包含的抗体的量。在将以融合蛋白和/或融合蛋白多聚体作为活性成分的疫苗对猪免疫后，通过检测来源于疫苗的抗体产生，本发明的试剂盒可以用于评价疫苗的有效性。
本发明中包括包含以上述核酸片段、重组表达载体作为活性成分的针对猪水肿病的DNA疫苗。在本发明的DNA疫苗中，核酸片段、重组表达载体优选包含对猪免疫后能使融合蛋白表达的启动子序列。
关于制备本发明的DNA疫苗的方法，在将上述DNA疫苗对猪接种前后通过STEC或Stx2e对猪进行攻击试验。作为结果，可以筛选使猪水肿病的临床症状显著减轻的核酸片段、重组表达载体作为猪水肿病治疗剂的活性成分，由此时的给药量规定活性成分量。
本发明的DNA疫苗中也可以包含药学上可接受的载体。可列举出例如，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合，此外也可以在其中适当配合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
本发明的DNA疫苗可以通过经皮给药、舌下给药、点眼给药、皮内给药、肌肉内给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、从口至肺的吸入给药等任意给药途径来给药。
本发明中包括能与上述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体结合的抗体。以本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体作为抗原，通过常规免疫方法(现代分子生物学技术，抗体工程(Current Protocols in MolecularBiology，Antibody Engineering):A PRACTICAL APPROACH Edited byJ.McCAFFERTY et al.或ANTIBODY ENGINEERING second editionEdited by Carl A.K.BORREBAECK)，能够进行单克隆和多克隆抗体等的制备或它们的人抗体的制备。或者，通过利用噬菌体展示技术的抗体制备技术(Phage Display of Peptides and Proteins:A LaboratoryManual Edited by Brian K.Kay et al.，Antibody Engineering:APRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.或ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A.K.BORREBAECK)，能够进行与所述融合蛋白和/或其多聚体结合的抗体的制备。本发明的抗体设想到作为后述的猪水肿病治疗剂、试剂盒、亲和色谱用载体的用途。
本发明中包括以上述抗体作为活性成分的针对猪水肿病的治疗剂。关于制备本发明的治疗剂的方法，在将通过上述方法制备的抗体对猪接种前后用STEC或Stx2e对猪进行攻击试验。作为结果，可以筛选使猪水肿病的临床症状显著减轻的抗体作为猪水肿病治疗剂的活性成分，由此时的抗体给药量规定活性成分量。
以上述抗体作为活性成分的本发明的猪水肿病治疗剂也可以包含药学上可接受的载体。例如，可列举出盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、等渗水性缓冲液和它们的组合，此外也可以在其中适当配合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
本发明的针对猪水肿病的治疗剂也可以通过经皮给药、舌下给药、点眼给药、皮内给药、肌肉内给药、经口给药、经肠给药、经鼻给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔内给药、从口至肺的吸入给药等任意给药途径来给药。
本发明中包括用于测定被检样品中的Stx2eB含量的试剂盒，其包含与融合蛋白和/或融合蛋白多聚体结合的抗体。作为这样的试剂盒，包含将与融合蛋白结合的抗体固定于板等的试剂盒。以Stx2eB的含量作为指标，包含本发明的抗体的试剂盒可以在评价是否感染猪水肿病时使用。例如，在上述的固定有抗体的板上施加被检样品之后，施以酶、荧光染料标记的抗体。对板进行孵育、洗涤后，根据需要加入显色底物，测定荧光量，从而可以评价被检样品中的Stx2eB含量。
作为板，可例如Nunc Immuno plate MaxiSorp(Thermo scientific)、ELISA用板(住友Bakelite株式会社)、ELISPOT(MERCK)、Immunoplate(Cosmo Bio株式会社)、ELISA板(IWAKI)、ELISA板(ExtraGene)，对于本领域技术人员而言可以通过通常实施的方法使抗体与板结合。
作为将抗体用酶、荧光染料标记的方法，可例如EasyLink抗体偶联试剂盒(abcam)、Lightning-Link快速偶联系统(Innova BiosciencesLtd)、Oyster抗体标记试剂盒(Luminartis GmbH)、酶标记试剂盒EZ-Link(PIERCE Biotechnology)、PlatinumLink蛋白标记试剂盒(Kreatech Biotechnology BV)、DyLight抗体标记试剂盒(PIERCEBiotechnology)。
本发明中包括亲和色谱用载体，其中使针对融合蛋白和/或融合蛋白多聚体的抗体与载体结合。本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体在宿主内或宿主外被表达，在宿主内表达的情况下，破坏宿主而回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体，在宿主外表达的情况下，从培养环境回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。本发明的载体预想到用于从这样的杂质部分回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体等的用途。
作为载体，可例如HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)、NHS活化Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)、CNBr活化Sepharose4B(GE Healthcare)、CNBr活化Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)、EAH Sepharose 4B(GE Healthcare)、ECH Sepharose 4B(GE Healthcare)、Profinity环氧树脂(BIORAD)、Affi-Gel Hz Hydrazide凝胶(BIORAD)，对于本领域技术人员而言可以通过通常使用的方法使抗体结合。
实施例
以下进一步通过实施例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。
实施例1
Stx2eB-His-COMP蛋白及其多聚体的制备
(1)表达载体的构建
Stx2eB-His表达载体的构建和Stx2eB-His表达型大肠杆菌的制备
设计以编码Stx2eB的前体(SEQ ID NO:1)的DNA序列为基础，将用于在大肠杆菌和酵母中表达的密码子优化，用于表达载体插入在5'末端增加了限制性酶NdeI识别序列以及在3'末端增加了限制性酶XhoI识别序列的DNA序列(SEQ ID NO:2)，人工合成出该DNA序列。将该合成的DNA和质粒pET-22b(Merck株式会社)用NdeI和XhoI处理，将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5a，将所得的质粒设定为“中间载体1”。
以中间载体1作为模板，以包含限制性酶NcoI识别序列的寡DNA(SEQ ID NO:3)和包含限制性酶XhoI识别序列的寡DNA(SEQ IDNO:4)作为引物，进行PCR反应，将编码不含分泌信号序列的成熟Stx2eB的DNA进行扩增。
将该扩增产物和质粒pET-21d(Merck株式会社)用NcoI和XhoI进行处理，将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5a，将所得的质粒设定为pSTXB。该质粒表达Stx2eB和His标签的融合蛋白(以下称为Stx2eB-His)(SEQ ID NO:5)(图1)。此外，编码Stx2eB-His的DNA碱基序列示于SEQ ID NO:6。将pSTXB导入大肠杆菌BL21(DE3)(Merck株式会社)，获得表达Stx2eB-His的大肠杆菌STXB株。
(2)Stx2eB-His-COMP表达载体的构建和Stx2eB-His-COMP表达型大肠杆菌的制备
以作为霍乱毒素B亚基前体表达载体的pB(非专利文献5，InfectImmun.2005,7,5654-65)作为模板，以包含限制性酶MunI识别序列的寡DNA(SEQ ID NO:7)和包含限制性酶MunI识别序列和(GP)2GH6(EcoR I)H6连接序列(人工序列)编码序列的寡DNA(SEQ IDNO:8)作为引物进行PCR反应，将编码CTB-(GP)2GH6(EcoRI)H6的DNA进行扩增。
将扩增的DNA用MunI进行处理，此外将pPIC3.5K载体(LifeTechnologies)用EcoRI切割，将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，将所得的质粒设为“中间载体2”。
设计并人工合成编码融合蛋白的编码(G4S)3连接序列(人工序列)的DNA(SEQ ID NO:9)和编码软骨寡聚基质蛋白(以下称为COMP)的5聚体形成结构域并为了在大肠杆菌和酵母中表达而将密码子优化的的DNA(SEQ ID NO:10)的DNA(SEQ ID NO:11)。以上述合成DNA作为模板，以包含限制性酶MunI识别序列的寡DNA(SEQ ID NO:12)和包含限制性酶EcoR I识别序列的寡DNA(SEQ ID NO:13)作为引物，进行PCR反应，将编码(G4S)3连接序列-COMP的DNA进行扩增。将用MunI和EcoR I进行处理的扩增产物与将中间载体2用EcoR I进行处理而得的产物连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5a，将所得的质粒设为“中间载体3”。
以中间载体3作为模板，以包含限制性酶Xho I识别序列的寡DNA(SEQ ID NO:14)和包含限制性酶Xho I识别序列的寡DNA(SEQID NO:15)作为引物，进行PCR反应，将编码(GP)2GH6(G4S)3连接序列和COMP的融合蛋白的DNA进行扩增。将扩增的DNA和pSTXB用Xho I处理，将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5a，将所得的质粒设为pSTXC。本质粒为用于表达Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3连接序列和COMP的融合蛋白(以下称为Stx2eB-His-COMP)(SEQ IDNO:16)(图2)的载体。此外，将编码Stx2eB-His-COMP的DNA碱基序列示于SEQ ID NO:17。此外将pSTXC导入大肠杆菌BL21(DE3)株，获得了表达Stx2eB-His-COMP的大肠杆菌STXC株。
(3)Stx2eB-His-COMP-His-Z表达载体的构建和Stx2eB-His-COMP-His-Z表达型大肠杆菌的制备
将COMP-His-Z表达载体(非专利文献6，Infect.Immune.2011,79(10),4260-4275)用Nco I和Xho I切割，制备出编码COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2连接序列和免疫球蛋白结合结构域Z(以下称为结构域Z)的融合蛋白(以下称为COMP-His-Z)的DNA片段。将该DNA片段与将pET-21d载体(MERCK)用限制性酶Nco I和Xho I进行处理而得的产物连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，将所得的质粒设为“中间载体4”。将中间载体4进一步用Nco I和Bsm I处理，制备出除去COMP的5’末端到Bsm I识别位点的“中间载体5”。
接下来，以pSTXC作为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:15的寡DNA作为引物进行PCR反应，将编码Stx2eB-His-COMP的DNA进行扩增。将扩增的DNA用限制性酶Nco I和Bsm I进行处理。该DNA片段缺失COMP的羧基末端的一部分。将该DNA片段与中间载体5连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，将所得的质粒设为pSTXZ。本质粒表达Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3连接序列、COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2连接序列和结构域Z的融合蛋白(以下称为Stx2eB-His-COMP-His-Z)(SEQ ID NO:18)(图4)。此外，将编码Stx2eB-His-COMP-His-Z的DNA序列示于SEQ ID NO:19。此外，将pSTXZ导入大肠杆菌BL21(DE3)(MERCK)，获得表达Stx2eB-His-COMP-His-Z的大肠杆菌STXZ株。
实施例2
重组大肠杆菌的培养和表达蛋白的纯化
(1)STXB株的培养和Stx2eB-His的纯化
在12mL尺寸的试管中加入3mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，接种STXB株，在37℃振荡培养16小时左右(前培养)。在2L尺寸的锥形烧瓶中加入200mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，在其中接种2mL的前培养菌液，在37℃振荡培养直到OD590超过0.5为止。正式培养物的OD590超过了0.5后，以终浓度10μM添加异丙基‐β‐D‐吡喃半乳糖苷(IPTG)，在25℃振荡培养20小时。将正式培养液移至离心管，通过10,000rpm、4℃、10分钟的离心分离回收菌体。使用BugBuster(Merck株式会社)，从回收的菌体通过离心制备出包涵体部分。
将制备的包涵体部分用1％SDS溶液溶解，通过透析(Spectrumlaboratories,inc.Spectra/Por CE透析膜.MWCO:3.5-5kD.)将缓冲液替换为PBS而得的产物作为Stx2eB-His抗原。
(2)STXC株的培养，Stx2e-His-COMP的纯化
在12mL尺寸的试管中加入3mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，接种STXC株，在37℃振荡培养16小时左右(前培养)。在2L尺寸的锥形烧瓶中加入200mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，在其中接种2mL的前培养菌液，在37℃振荡培养直到OD590超过0.5为止。正式培养物的OD590超过了0.5后，以终浓度10μM添加异丙基‐β‐D‐吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养6小时。将正式培养液移至离心管，通过10,000rpm、4℃、10分钟的离心分离回收菌体。使用BugBuster(Merck株式会社)，从回收的菌体通过离心制备出包涵体部分。
接下来，在包涵体中加入6M胍盐酸盐(pH8.2)溶液，制备溶解溶液。以专利文献1(日本特开2008-50344)为参考对溶解溶液进行重折叠处理。具体而言，在溶解溶液中加入Tween80(终浓度0.05％)、乙酸钠(终浓度1M)、DL-胱氨酸(终浓度2mM)，在4℃静置过夜。在重折叠处理后，使用His Trap HP(GE Healthcare日本株式会社)对Stx2eB-His-COMP进行纯化，通过超滤(Amicon Ultra-15 30kDa，Millipore株式会社)将缓冲液替换为PBS，得到产物作为Stx2eB-His-COMP抗原。在非还原状态下使用12.5％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过采用CBB染色和抗His抗体的western印迹法来确认多聚体的形成(图3)。
(3)STXZ株的培养和Stx2e-His-COMP-His-Z的纯化
在12mL尺寸的试管中加入3mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，接种STXZ株，在37℃振荡培养16小时左右(前培养)。在2L尺寸的锥形烧瓶中加入200mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，在其中接种2mL的前培养菌液，在37℃振荡培养直到OD590超过0.5为止。正式培养物的OD590超过了0.5后，以终浓度10μM添加IPTG，在37℃振荡培养6小时。将正式培养液移至离心管，通过10,000rpm、4℃、10分钟的离心分离回收菌体。使用BugBuster(MERCK)，从回收的菌体通过离心制备包涵体部分。
接下来，在包涵体中加入6M胍盐酸盐(pH8.2)溶液，制备溶解溶液。以专利文献1(日本特开2008-50344)作为参考对溶解溶液进行重折叠处理。具体而言，在溶解溶液中加入Tween80(终浓度0.05％)、乙酸钠(终浓度1M)，DL-胱氨酸(终浓度2mM)，在4℃静置过夜。在重折叠处理后，使用His Trap HP(GE Healthcare)对Stx2eB-His-COMP-His-Z进行纯化，通过超滤(Amicon Ultra-15 30kDa，Millipore株式会社)将缓冲液替换为PBS，得到产物作为Stx2e-His-COMP-His-Z抗原。在非还原状态下使用5-20％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过采用CBB染色和抗His抗体的western印迹法确认了多聚体的形成(图5)。
实施例3
1.小鼠中的中和抗体诱导确认
(1)疫苗制备和对小鼠的免疫
a.Stx2eB-His抗原和Stx2eB-His-COMP抗原的中和抗体诱导能力比较
制备每100μL为50μg的Stx2eB-His-COMP抗原与50μL的ImjectAlum(注册商标)(Thermo Fisher Scientific Inc.)混合而得的疫苗。由于与50μg的Stx2eB-His-COMP同等的摩尔数的Stx2eB-His为26.6μg，因此，制备每100μL为26.6μg的Stx2eB-His抗原和50μL的ImjectAlum(注册商标)混合而得的疫苗。此外，将每100μL为50μg的Stx2e-His-COMP抗原和50μL的不完全弗氏佐剂(日本BectonDickinson株式会社)混合和乳化来制备疫苗。
对每组5只7周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射3次疫苗，每次100μL，间隔2周。在第3次免疫后2周进行采血，通过使用下述Vero细胞的Stx2e中和试验测定抗体效价。
b.Stx2eB-His-COMP抗原和Stx2eB-His-COMP-His-Z抗原之间中和抗体诱导能力比较
制备每100μL为50μg的Stx2eB-His-COMP抗原与50μL的ImjectAlum(注册商标)混合而得的疫苗。由于与50μg的Stx2eB-His-COMP同等摩尔数的Stx2eB-His-COMP-His-Z为75μg，因此制备每100μL为75μg的Stx2eB-His-COMP-His-Z抗原和50μL的Imject Alum(注册商标)混合而得的疫苗。
对每组5只7周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射3次疫苗，每次100μL，间隔2周。在第3次免疫后2周进行采血，通过使用了下述Vero细胞的Stx2e中和试验测定抗体效价。
(2)毒素液的制备
用由猪分离出的水肿病菌的甘油储备液对Circlegrow(MPBiomedicals)琼脂培养基接种1环的量，在37℃培养过夜。将单菌落接种到加有50mL的Circlegrow培养基的500mL锥形烧瓶，在37℃以220rpm旋转培养过夜。在加有50mL的Circlegrow培养基的4个500mL锥形烧瓶中每次5mL接种上述培养菌液，在37℃以220rpm旋转培养8小时。集中菌液，测定吸光度(OD650)。在10000g、4℃、15分钟的条件下离心，回收沉淀物。将沉淀物悬浮在20mL的10mM Tris-HCl(7.0)中。进行超声波处理(Branson，Duty Cycle 30％，Output 1)，在吸光度(OD650)降至处理前的60％时结束。在10000g、4℃、30分钟的条件下离心，回收上清液。通过0.22μm过滤器过滤处理进行灭菌。在-80℃冷冻保存。
(3)细胞毒性活性测定
＜材料＞
·细胞；Vero细胞
·培养用培养基：加有5％FBS的伊格尔培养基(10％ TPB，1.5％碳酸氢钠，0.1％ PS)
·稀释用培养基：伊格尔培养基(10％ TPB，1.5％碳酸氢钠，0.1％PS)
＜细胞悬浮液的制备＞
将Vero细胞在培养用培养基中培养，除去上清液。每中等尺寸方形(75cm2)添加3mL的胰蛋白酶-EDTA，在37℃处理5～10分钟。添加10mL的培养用培养基，通过抽吸将细胞分开并回收到离心管。以1500rpm离心5分钟，回收细胞。用5mL的培养用培养基再悬浮，计数细胞数。用培养用培养基调整至4.0×105个细胞/mL。
＜细胞毒性活性的测定＞
在细胞培养用96孔板中以125μl/孔的量加入稀释用培养基。以25μl/孔加入用稀释用培养基进行了2倍连续稀释的毒素液。以50μL/孔加入调整至4.0×105细胞/mL的细胞悬浮液。对板进行密封，在37℃培养5天。
＜评价＞
确认阴性对照的细胞片形成率为95％以上，将细胞片形成率显示50％以下的稀释倍数设为50％细胞毒活性量(细胞毒性剂量，CD50)。
(4)使用Vero细胞的Stx2e中和试验
＜材料＞
·细胞：Vero细胞
·培养用培养基：加有5％FBS的伊格尔培养基(10％ TPB，1.5％碳酸氢钠，0.1％ PS)
·稀释用培养基：伊格尔培养基(10％ TPB，1.5％碳酸氢钠，0.1％PS)
＜细胞悬浮液的制备＞
将Vero细胞在培养用培养基中培养后，除去细胞的上清液。每中等尺寸方形(75cm2)添加3mL的胰蛋白酶-EDTA，在37℃处理5～10分钟。添加10mL的培养用培养基，通过冲吸将细胞分开并回收到离心管。以1500rpm离心5分钟，回收细胞。用5mL的培养用培养基再悬浮，计数细胞数。用培养用培养基调整至4.0×105细胞/mL。
＜中和反应＞
将用稀释用培养基调整至10CD50的毒素液(60μL)和用稀释用培养基进行了2倍连续稀释的被检血清样品(60μL)混合，在37℃反应1小时。在96孔板中将稀释用培养基以100μl/孔加入。每孔50μL加入在37℃反应的中和反应液。以50μL/孔加入调整至4.0×105细胞/mL的细胞悬浮液。对板进行密封，在37℃培养5天。
＜评价＞
确认阴性对照的细胞片形成率为95％以上，将细胞片形成率显示50％以上的被检血清样品的最高稀释倍率设为中和抗体效价。结果示于表1和表2中。
[表1]
Stx2eB-His抗原和Stx2eB-His-COMP抗原的中和抗体诱导能力比较
[表2]
Stx2eB-His-COMP抗原和Stx2eB-His-COMP-His-Z抗原的中和抗体诱导能力比较
由以上结果确认，Stx2eB-His-COMP抗原在小鼠中诱导针对Stx2e的中和抗体。另一方面，在Stx2eB-His注射组中未见中和抗体的上升。由该研究结果可知，仅Stx2eB时难以形成合适的多聚体结构，显示出与COMP融合的优势性。此外确认了，Stx2eB-His-COMP抗原与Stx2eB-His-COMP-His-Z抗原相比可以诱导显著高效毒素中和抗体。
2.小鼠中的Stx2e攻击试验
制备每100μL为50μg的Stx2e-His-COMP抗原和50μL的不完全弗氏佐剂(日本Becton Dickinson社)混合并乳化的疫苗。测试小鼠为7周龄雌性BALB/c小鼠，每组为10只，将疫苗以100μL皮下注射3次，间隔2周。在第3次免疫后2周，腹腔内注射0.4mL(32000 50％ Vero细胞变性量)由水肿病菌制备的毒素液(制备方法如上所述)。在Stx2e给药后7天进行观察，确认了死亡只数的结果示于表3中。
[表3]
由表3确认了，在安慰剂组和免疫组中可见显著性差异(p＝0.0041)，通过将Stx2eB-His-COMP抗原对小鼠免疫能防御Stx2e攻击。
实施例4
猪的中和抗体诱导确认
制备包含每2mL为100μg的Stx2eB-His-COMP抗原和0.4mL的Emulsigen(MVP Laboratories)的疫苗。对3～4周龄的猪在颈部肌肉内注射2次疫苗，间隔2周。在初次免疫时、追加免疫时和追加免疫后2周采血，通过使用了Vero细胞的Stx2e中和试验测定抗体效价。将结果示于表4中。
[表4]
由该结果确认了，Stx2eB-His-COMP抗原在猪中也能诱导针对Stx2e的中和抗体。
实施例5
猪的Stx2e攻击试验
对于在实施例4中使用的猪，在追加免疫后2周，腹腔内注射20mL(600000 50％ Vero细胞变性量)由水肿病菌制备的毒素液(制备方法如上所述)。此外，为了排除混入的LPS的影响，将Stx2e溶液在80℃加热10分钟而使Stx2e热失活而得的溶液给予安慰剂组的1只猪。在Stx2e给药后3天观察临床症状。将结果示于表5中。
[表5]
由表5的结果确认了，通过将Stx2eB-His-COMP抗原对猪免疫可以防御Stx2e的攻击。
实施例6
Stx2eB-His-CMP蛋白及其多聚体的制备
(1)Stx2eB-His-CMP表达载体的构建和Stx2eB-His-CMP表达型大肠杆菌的制备
为了使Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3连接序列和CMP的融合蛋白(以下称为Stx2eB-His-CMP)(SEQ ID NO:35)(图6)在大肠杆菌中表达而将密码子优化(SEQ ID NO:34)，设计用于在表达载体中插入的对5'末端增加了限制性酶Nco I识别序列以及对3'末端增加了限制性酶XhoI识别序列，进一步对5'末端以及3'末端增加了保护碱基的DNA序列(SEQID NO:36)，进行人工合成。将该合成DNA插入到质粒pUC57(GenScript株式会社)的EcoRV位点。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，将所得的质粒设为“中间载体6”。
将中间载体6用Nco I和Xho I处理，获得了编码Stx2eB-His-CMP的DNA片段。将该DNA片段和用Nco I和Xho I进行了处理的质粒pET-21d(Merck株式会社)进行连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，将所得的质粒设为pSTX-CMP。此外，将pSTX-CMP导入到大肠杆菌BL21(DE3)(Merck株式会社)中，获得了表达的Stx2eB-His-CMP大肠杆菌STX-CMP株。
(2)STX-CMP株的培养以及Stx2e-His-CMP抗原的制备
在12mL尺寸的试管中加入3mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，接种STX-CMP株，在37℃振荡培养16小时左右(前培养)。在2L尺寸的锥形烧瓶中加入200mL的2×YT培养基和氨苄西林溶液(终浓度200μg/mL)，在其中接种2mL的前培养菌液，在37℃振荡培养直到OD590超过0.5为止。正式培养物的OD590超过0.5后，以终浓度10μM添加异丙基‐β‐D‐吡喃半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养6小时。将正式培养液移至离心管中，通过10,000rpm、4℃、10分钟的离心分离来回收菌体。将100mL培养量的菌体悬浮在包含溶菌酶(终浓度1mg/mL)的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，500mMNaCl)中，使用超声波粉碎机UD-201(Tomy株式会社)进行菌体破碎。将菌体破碎液以10,000rpm、4℃下离心分离10分钟，获得包涵体。通过将该包涵体再次悬浮在裂解缓冲液中来进行洗涤，以10,000rpm、4℃离心分离10分钟，回收包涵体。
接下来，在包涵体中加入包含50mM tris(pH8.2)、6M胍盐酸盐的缓冲液，制备溶解溶液。将溶解溶液通过阶段透析进行重折叠处理。具体而言，用包含50mM tris(pH8.2)、2M胍盐酸盐的缓冲液透析4小时，接下来用包含50mMtris(pH8.2)、1M胍盐酸盐、1M精氨酸盐酸盐、5mM DL-胱氨酸的缓冲液透析4小时，接下来用包含50mMtris(pH8.2)、0.5M胍盐酸盐、1M精氨酸盐酸盐、5mM DL-胱氨酸的缓冲液透析16小时，最后用包含1M精氨酸盐酸盐的PBS缓冲液透析4小时。将由此得到的样品作为Stx2eB-His-CMP抗原。在非还原状态下使用12.5％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过采用CBB染色和抗His抗体的western印迹法确认了多聚体的形成(图7)。
实施例7
小鼠中的Stx2e攻击试验
(1)疫苗制备
由于与实施例3所记载的50μg的Stx2eB-His-COMP同等摩尔数的Stx2eB-His-CMP为46.5μg，因此将每100μL为46.5μg的Stx2eB-His-CMP抗原和50μL的不完全弗氏佐剂(日本BectonDickinson株式会社)混合并乳化来制备疫苗。
(2)小鼠中的Stx2e攻击试验
测试小鼠为每组10只的9周龄雌性BALB/c小鼠。免疫组中，每次100μL皮下注射2次疫苗，间隔2周。对未给药组不进行任何给药。在第2次免疫后2周，将由水肿病菌制备的Stx2e毒素液(制备方法如上所述)以0.4mL(64000 50％ Vero细胞变性量)注射到腹腔内。在Stx2e给药后观察7天，确认了死亡只数的结果示于表6中。
[表6]
根据表6确认了，未给药组与免疫组中可见显著性差异(p＝0.047)，通过将Stx2eB-His-CMP抗原对小鼠免疫可以为半数的小鼠防御免受Stx2e攻击。
工业实用性
能够在预计发生猪水肿病的农场中进行猪水肿病的发病预防。

Claims (39)

1.融合蛋白，其是通过使具有卷曲螺旋形成单元的多肽与志贺毒素Stx2e的B亚基(Stx2eB)结合而得的。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其在所述多肽与Stx2eB之间具有连接序列和/或标签序列。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述卷曲螺旋形成单元来源于天然多聚体形成蛋白。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白选自软骨寡聚基质蛋白(COMP)、软骨基质蛋白(CMP)、tetrabrachion(TB)和GCN4。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为COMP或CMP。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为COMP。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其为包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽。
8.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为CMP。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其为包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中Stx2eB为包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽。
11.融合蛋白多聚体，其是通过将权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白多聚化而得的。
12.核酸片段，其包含编码权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白的DNA序列。
13.重组表达载体，其包含权利要求12所述的核酸片段。
14.转化体，其导入了权利要求12所述的核酸片段。
15.转化体，其导入了权利要求13所述的重组表达载体。
16.抗体，其能够与权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白结合。
17.抗体，其能够与权利要求11所述的融合蛋白多聚体结合。
18.针对猪水肿病的疫苗，其含有作为活性成分的权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白。
19.针对猪水肿病的疫苗，其含有作为活性成分的权利要求11所述的融合蛋白多聚体。
20.针对猪水肿病的治疗剂，其含有作为活性成分的权利要求16或17所述的抗体。
21.针对猪水肿病的DNA疫苗，其含有作为活性成分的权利要求12所述的核酸片段。
22.针对猪水肿病的DNA疫苗，其含有作为活性成分的权利要求13所述的重组表达载体。
23.用于测定被检样品中针对Stx2eB的抗体的量的试剂盒，其包含权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白。
24.用于测定被检样品中针对Stx2eB的抗体的量的试剂盒，其包含权利要求11所述的融合蛋白多聚体。
25.用于测定被检样品中的Stx2eB含量的试剂盒，其包含权利要求16或17所述的抗体。
26.融合蛋白多聚体的制备方法，其包括下述过程：使由具有卷曲螺旋形成单元的多肽与志贺毒素Stx2e的B亚基(Stx2eB)结合而得的融合蛋白在宿主中表达，然后将所述融合蛋白进行重折叠。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其中所述融合蛋白在所述多肽与Stx2eB之间具有间隔子。
28.根据权利要求26或27所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于天然多聚体形成蛋白的卷曲螺旋形成单元，所述天然多聚体形成蛋白选自软骨寡聚基质蛋白(COMP)、软骨基质蛋白(CMP)、tetrabrachion(TB)和GCN4。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于COMP或CMP的卷曲螺旋形成单元。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于COMP的卷曲螺旋形成单元。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其中所述多肽为包含SEQID NO:27或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:27或SEQID NO:28所示的氨基酸序列的多肽。
32.根据权利要求29所述的制备方法，其中所述多肽具有来源于CMP的卷曲螺旋形成单元。
33.根据权利要求32所述的制备方法，其中所述多肽为包含SEQID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:32或SEQID NO:33所示的氨基酸序列的多肽。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的制备方法，其中Stx2eB为包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽，或为包含具有一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入的SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的多肽。
35.猪水肿病的预防方法，包括对猪给予权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白。
36.猪水肿病的预防方法，包括对猪给予权利要求11所述的融合蛋白多聚体。
37.猪水肿病的治疗方法，包括对猪给予权利要求16或17所述的抗体。
38.猪水肿病的预防方法，包括对猪给予权利要求12所述的核酸片段。
39.猪水肿病的预防方法，包括对猪给予权利要求13所述的重组表达载体。
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