JPWO2014065210A1 - 豚の浮腫病を予防するワクチン - Google Patents
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Abstract
豚の浮腫病が予想される農場に対して豚の浮腫病を予防することができるワクチンを提供することを課題とする。当該課題を解決したワクチンは、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとStx2eBとを結合させた融合タンパク質又はその多量体であり、これを豚に免疫することで高い中和抗体を誘導することや、豚浮腫病に対する発症防御を行うことが可能となる。
Description
本発明は豚の浮腫病を予防するワクチンに関する。より具体的には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと豚の浮腫病の原因毒素であるStx2eのBサブユニット（Stx2eB）を融合させた組換えタンパク質及び／又はその多量体を有効成分とするワクチンである。この融合タンパク質及び／又はその多量体を豚に接種することで高い毒素中和抗体が誘導され、浮腫病の発症を予防することが可能なワクチンである。
豚浮腫病は４〜12週齢の子豚に多発し、眼瞼浮腫や神経症状等を呈し、その多くは発症後24時間以内に死亡する（非特許文献１、Proc. Jpn. Pig Vet. Soc. 2006,48,7-13）。死亡率は、50〜90％と高く、再発や発育不良などによる生産性の低下を招くため、経済的損失は大きい。本疾病は腸管に接着した志賀毒素産生性大腸菌（Shiga toxin producing E. coli、STEC）が産生する志賀毒素Stx2eが原因で発症する。Stx2eは、rRNA N-glycosidase活性を有するAサブユニット（Stx2eA）とレセプター（globotetraosyl ceramide (Gb4)）結合能を有するBサブユニット5量体（Stx2eB）から構成されるAB5型の毒素タンパク質である。腸管から取り込まれ、Bサブユニットによって血管内皮細胞等の細胞表層に到達したStx2eは、Aサブユニットを標的細胞質内へ送達させ、リボソームのタンパク質合成を阻害することで浮腫病の症状を誘発させることが知られている。国内では豚浮腫病予防用ワクチンは市販されておらず、抗生物質で対応しているものの、発症後の投与では手遅れになる場合が多い。また、薬剤耐性菌の出現も報告されており、有効な予防法や治療法の開発が望まれている。
このような背景にもとづき、豚浮腫病を効果的に予防する方法が研究されている。例えば、Stx2eトキソイド免疫による実施例では、実験感染に対して防御効果を示している（非特許文献２、Vet. Microbiol. 1991,29,309-318）。しかし、他の報告では、無毒化が困難なため、一部の豚でトキソイド免疫後に浮腫病の発症が観察されている（非特許文献３、Infect. Immun. 1992,60,485-90）。また、Stx2eAのアミノ酸配列の一部を改変して無毒化した組換えStx2eを豚に免疫し、中和抗体の誘導を確認した例が報告されている（非特許文献３、Infect. Immun. 1992,60,485-90）。しかし、組換え大腸菌による無毒化Stx2eの産生量は極めて低く、実用化には課題が残る。
Proc.Jpn. Pig Vet. Soc. 2006,48,7-13
Vet.Microbiol. 1991,29,309-318
Infect.Immun. 1992,60,485-90
Adv.Protein Chem. 2005,70,37-78
Infect.Immun. 2005,7,5654-65
Infect.Immun. 2011,79(10),4260-4275
本発明が解決しようとする課題は、豚の浮腫病の発生が予想される農場に対して、豚の浮腫病を有効に予防し得るワクチンを提供することである。
本発明の発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとStx2eBを融合させたタンパク質をワクチンとして豚に接種することで高い毒素中和抗体を誘導することを見出し、本発明を完成させるに到った。
すなわち本発明は、
［1］コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質。
［2］前記ポリペプチドとStx2eBとの間にリンカー配列及び／又はタグ配列を有する、［1］に記載の融合タンパク質。
［3］前記コイルドコイル形成ユニットが天然の多量体形成タンパク質に由来するものである、［1］又は［2］に記載の融合タンパク質。
［4］前記天然の多量体形成タンパク質が、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択されたものである、［3］に記載の融合タンパク質。
［5］前記天然の多量体形成タンパク質が、COMP又はCMPである、［4］に記載の融合タンパク質。
［6］前記天然の多量体形成タンパク質が、COMPである、［5］に記載の融合タンパク質。
［7］配列番号27若しくは配列番号28で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［6］に記載の融合タンパク質。
［8］前記天然の多量体形成タンパク質が、CMPである、［5］に記載の融合タンパク質。
［9］配列番号32または配列番号33で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［8］に記載の融合タンパク質。
［10］Stx2eBが、配列番号20、配列番号22若しくは配列番号24で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである［1］から［9］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［11］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。
［12］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。
［13］［12］に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
［14］［12］に記載の核酸断片が導入された形質転換体。
［15］［13］に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
［16］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質と結合することができる抗体。
［17］［11］に記載の融合タンパク質多量体と結合することができる抗体。
［18］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
［19］［11］に記載の融合タンパク質多量体を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
［20］［16］又は［17］に記載の抗体を有効成分として含有する豚浮腫病用治療剤。
［21］［12］に記載の核酸断片を有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
［22］［13］に記載の組換え発現ベクターを有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
［23］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
［24］［11］に記載の融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
［25］［16］又は［17］に記載の抗体を含む、被検試料中のStx2eBの含有量を測定するためのキット。
［26］コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質を宿主で発現させた後、リフォールディングする工程を含む、融合タンパク質多量体の製造方法。
［27］前記融合タンパク質が、前記ポリペプチドとStx2eBとの間にスペーサーを有するものである、［26］に記載の製造方法。
［28］前記ポリペプチドが、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択された天然の多量体形成タンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［26］又は［27］に記載の製造方法。
［29］前記ポリペプチドがCOMP又はCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［28］に記載の製造方法。
［30］前記ポリペプチドがCOMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［29］に記載の製造方法。
［31］前記ポリペプチドが、配列番号27若しくは配列番号28で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［30］に記載の製造方法。
［32］前記ポリペプチドがCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［29］に記載の製造方法。
［33］前記ポリペプチドが、配列番号32または配列番号33で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［32］に記載の製造方法。
［34］Stx2eBが、配列番号20、配列番号22若しくは配列番号24で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［26］から［33］のいずれか一項に記載の製造方法。
［35］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［36］［11］に記載の融合タンパク質多量体を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［37］［16］又は［17］に記載の抗体を豚に投与する豚浮腫病の治療方法。
［38］［12］に記載の核酸断片を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［39］［13］に記載の組換え発現ベクターを豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［1］コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質。
［2］前記ポリペプチドとStx2eBとの間にリンカー配列及び／又はタグ配列を有する、［1］に記載の融合タンパク質。
［3］前記コイルドコイル形成ユニットが天然の多量体形成タンパク質に由来するものである、［1］又は［2］に記載の融合タンパク質。
［4］前記天然の多量体形成タンパク質が、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択されたものである、［3］に記載の融合タンパク質。
［5］前記天然の多量体形成タンパク質が、COMP又はCMPである、［4］に記載の融合タンパク質。
［6］前記天然の多量体形成タンパク質が、COMPである、［5］に記載の融合タンパク質。
［7］配列番号27若しくは配列番号28で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［6］に記載の融合タンパク質。
［8］前記天然の多量体形成タンパク質が、CMPである、［5］に記載の融合タンパク質。
［9］配列番号32または配列番号33で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［8］に記載の融合タンパク質。
［10］Stx2eBが、配列番号20、配列番号22若しくは配列番号24で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである［1］から［9］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［11］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。
［12］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。
［13］［12］に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
［14］［12］に記載の核酸断片が導入された形質転換体。
［15］［13］に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
［16］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質と結合することができる抗体。
［17］［11］に記載の融合タンパク質多量体と結合することができる抗体。
［18］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
［19］［11］に記載の融合タンパク質多量体を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
［20］［16］又は［17］に記載の抗体を有効成分として含有する豚浮腫病用治療剤。
［21］［12］に記載の核酸断片を有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
［22］［13］に記載の組換え発現ベクターを有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
［23］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
［24］［11］に記載の融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
［25］［16］又は［17］に記載の抗体を含む、被検試料中のStx2eBの含有量を測定するためのキット。
［26］コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質を宿主で発現させた後、リフォールディングする工程を含む、融合タンパク質多量体の製造方法。
［27］前記融合タンパク質が、前記ポリペプチドとStx2eBとの間にスペーサーを有するものである、［26］に記載の製造方法。
［28］前記ポリペプチドが、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択された天然の多量体形成タンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［26］又は［27］に記載の製造方法。
［29］前記ポリペプチドがCOMP又はCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［28］に記載の製造方法。
［30］前記ポリペプチドがCOMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［29］に記載の製造方法。
［31］前記ポリペプチドが、配列番号27若しくは配列番号28で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［30］に記載の製造方法。
［32］前記ポリペプチドがCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、［29］に記載の製造方法。
［33］前記ポリペプチドが、配列番号32または配列番号33で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［32］に記載の製造方法。
［34］Stx2eBが、配列番号20、配列番号22若しくは配列番号24で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［26］から［33］のいずれか一項に記載の製造方法。
［35］［1］から［10］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［36］［11］に記載の融合タンパク質多量体を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［37］［16］又は［17］に記載の抗体を豚に投与する豚浮腫病の治療方法。
［38］［12］に記載の核酸断片を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
［39］［13］に記載の組換え発現ベクターを豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとStx2eBを結合させた融合タンパク質を有効成分とするワクチンを豚に接種すると高い毒素中和抗体が誘導され、豚の浮腫病の発症を予防することが可能である。
（１）融合タンパク質
本発明には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）が結合した融合タンパク質が含まれる。
本発明には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）が結合した融合タンパク質が含まれる。
本発明の融合タンパク質を構成するStx2eBとしては、分泌シグナルを含む前駆体のStx2eB（例えば配列番号1や配列番号20）、分泌シグナルを含まない成熟型のStx2eB（例えば配列番号21や配列番号22）、成熟型のStx2eBのうち大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化したStx2eB（例えば配列番号23や配列番号24）が例示される。
Stx2eBをコードするDNA配列（Stx2eBのDNA配列）としては、配列番号1、配列番号21、配列番号23のDNA配列の他、これらのDNA配列に適当な制限酵素切断部位が付加されたDNA配列やこれらのDNA配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列も包含される。さらに、これらのDNA配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるDNA配列も包含される。
またStx2eBには、配列番号20、配列番号22、配列番号24で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及びこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
一方、Stx2eBと結合して本発明の融合タンパク質を構成するコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドは、コイルドコイル構造を形成する能力を有するものであれば特に制限されないが、天然の多量体を形成するタンパク質（多量体形成タンパク質）に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが好適である。例えば、非特許文献４（Adv Protein Chem. 2005,70,37-78）に記載の多量体形成タンパク質が例示され、COMP（cartilage oligomeric matrix protein、5量体）、好熱菌（Staphylothermus marinus）由来のテトラブラキオン（TB、4量体）、GCN4（3量体）、鶏由来のcartilage matrix protein（CMP、3量体）などの多量体形成タンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが挙げられる。これらの中でも、Stx2eBとの融合タンパク質とした場合に凝集性が低く可溶性タンパク質として得られ、毒素中和抗体誘導効果に優れるため、COMPなど５量体及びCMPなど３量体を形成するタンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが好ましく、特にCOMPなど５量体を形成するタンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが好ましい。
COMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドをコードするDNA配列（コイルドコイル形成ユニットのDNA配列）としては、配列番号26のDNA配列の他、大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化した配列（例えば配列番号10）、これらのDNA配列に適当な制限酵素切断部位が付加されたDNA配列やこれらのDNA配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列も包含される。さらに、これらのDNA配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるDNA配列も包含される。
またCOMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドには、配列番号27や大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化した配列（例えば配列番号28）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及びこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドをコードするDNA配列（コイルドコイル構造のDNA配列）としては、配列番号30のDNA配列の他、大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化した配列（例えば配列番号31）、これらのDNA配列に適当な制限酵素切断部位が付加されたDNA配列やこれらのDNA配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列も包含される。さらに、これらのDNA配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるDNA配列も包含される。
またCMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドには、配列番号32や大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化した配列（例えば配列番号33）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及びこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
本発明の融合タンパク質は、コイルドコイル形成ユニットを有するペプチドとStx2eBが隣接して結合していてもよく、両者の分子間相互作用を低減させる等の目的で間にリンカー配列やタグ配列などのスペーサーが挿入されていても構わない。リンカー配列としては、特に限定されないが、例えばGPGPもしくはGGGGS(G4S)の組み合わせによる配列を用いることができる。また、(G4S)が1〜4回繰り返された配列((G4S)1〜(G4S)4)を用いてリンカー配列として使用することもでき、さらに、これに(GP)2を組み合わせてもよい。タグ配列としては、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、Hisx6（H6）が例示される。タグ配列とリンカー配列の組み合わせの好ましい例として、(GP)2GH6(G4S)3が例示できる。また、この配列中、(G4S)部分を繰り返し配列((G4S)1〜3)に変えることも可能である。さらに、GPGPH6GPGPやG4SH6G4Sの配列も利用可能である。
本発明の融合タンパク質としては、例えば、COMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと、大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化したStx2eBとを採用し、それらの間にタグ配列（H6）とリンカー配列（(G4S)3）が挿入された融合タンパク質（例えば配列番号17、配列番号16）が例示される。本発明の融合タンパク質には、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、このアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、これらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
また本発明の融合タンパク質として、CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと、大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化したStx2eBとを採用し、それらの間にタグ配列（H6）とリンカー配列（(G4S)3）が挿入された融合タンパク質（例えば配列番号34、配列番号35）も例示される。本発明の融合タンパク質には、配列番号35のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、このアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、これらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとStx2eBを結合させる際には、遺伝子工学的に両者を結合させて発現させてもよい。例えば、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とStx2eBのDNA配列が隣接するように発現ベクターを作製した後に適当な宿主に導入し、融合タンパク質を発現させる方法が例示される。コイルドコイル形成ユニットのDNA配列は、Stx2eBのDNA配列の5’側に配置してもよく、3’側に配置しても構わない。好ましくは、3’側に配置することである。前記の発現ベクターを作製する際に、リンカー配列及び／又はタグ配列のDNA配列が、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とStx2eBのDNA配列の間に挿入されていてもよく、上記のDNA配列の5’側や3’側に付加されていても構わない。例えば、5’側からStx2eBのDNA配列、タグ配列及び／又はリンカー配列のDNA配列、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列と配置して発現ベクターを作製する方法が例示される。
上記のDNA配列は化学合成によって入手し、それを鋳型として公知の遺伝子増幅方法によって増幅し、各種制限酵素を用いて発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製することが可能である。遺伝子増幅で使用するオリゴヌクレオチドは、鋳型のDNA配列の5’側もしくは3’側にハイブリダイズするように設計され、制限酵素による切断部位が付加されていることが好ましい。上記のオリゴヌクレオチド、鋳型DNA、DNAポリメラーゼ等を用いて、公知の遺伝子増幅方法により、鋳型DNAを増幅することが可能である。増幅したDNA配列と発現ベクターを制限酵素で処理した後、それらを適当なDNAリガーゼにより結合させることで、目的のDNA配列が挿入された組換え発現ベクターを構築することが可能である。本発明にはそうした組換え発現ベクターも含まれる。
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられるが、簡便な取り扱いとコストの観点からプラスミドベクターが好ましい。例えば、宿主が大腸菌の場合には、pFN6A (HQ) Flexi Vector（Promega）、pFN7A (HQ) Flexi Vector（Promega）、pFN2A (GST) Flexi Vector（Promega）、pET-22b（MERCK）、pET-21d（MERCK）、pColdベクター（タカラバイオ）等、哺乳動物の場合には、pF4A CMV Flexi Vector（Promega）、pF5A CMV-neo Flexi Vector（Promega）、pF9A CMV hRluc-neo Flexi Vector（Promega）、pCI-neo Mammalian Expression Vector（Promega）が挙げられる。発現ベクターには、複製起点、遺伝子発現に調節的役割を持つプロモーター配列、エンハンサー配列等の調節配列、選択マーカーの配列が含まれていてもよい。
プロモーター配列の一例としては、細菌プロモーターは、大腸菌lacI及びlacZプロモーター、T3及びT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーター、tacプロモーター、及びtrp、trcプロモーターである。そのうち、この点に関して適当な公知の真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルス（「CMV」）即時型プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（「RoSV」）のプロモーター、及びメタロチオネイン−Iプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
高等な真核細胞を宿主として融合タンパク質を発現させる際には、エンハンサー配列を発現ベクター中に挿入することにより転写活性を増加させてもよい。エンハンサー配列は、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する。エンハンサーの例は、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、βアクチンエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどを包含する。
選択マーカーの一例としては、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）のｔｒｐ１遺伝子、哺乳動物細胞のネオマイシン耐性遺伝子が例示される。
本発明には、上記本発明の融合タンパク質をコードする、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とStx2eBのDNA配列を含む核酸断片が含まれる。本発明の核酸断片は、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とStx2eBのDNA配列が連続して配置した核酸断片、あるいは、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とStx2eBのDNA配列の間にタグ配列及び／又はリンカー配列のDNA配列が挿入された核酸断片が含まれる。例えば、配列番号17、34の核酸断片が含まれる。
本発明の核酸断片は配列全体を化学合成によって入手することが可能である。また、一部の核酸断片と残りの部分の核酸断片を化学合成によって入手後、公知の遺伝子組換え技術によって、それらを連結させても構わない。例えば、Stx2eB又はコイルドコイル形成ユニットのDNA配列を化学合成した後に、それらを公知の遺伝子増幅方法を用いて増幅させた後、別々のクローニングベクターに挿入する。それぞれのクローニングベクターからStx2eBのDNA配列又はコイルドコイル形成ユニットのDNA配列を制限酵素によって切り出したのち、同じく制限酵素処理した発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを作製する。挿入する際には、それぞれの断片が連続的に配置されるように設計する。そして、組換え発現ベクターから制限酵素などを用いて核酸断片を切り出すことで、コイルドコイル形成ユニットとStx2eBのDNA配列が連結された核酸断片を入手することが可能である。上記の方法で核酸断片を作製する際に、タグ配列やリンカー配列のDNA配列をコイルドコイル形成ユニットとStx2eBのDNA配列の間に挿入させて発現ベクターを作成し、核酸断片を作製しても構わない。
上記のようにして作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、発現ベクターを含有する形質転換体を得ることができる。本発明にはそうした形質転換体も含まれる。宿主としては、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞株、昆虫細胞、植物等の公知のものが挙げられる。大腸菌としては、BL21株、DH5α等が例示できる。酵母としては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、哺乳動物細胞としては、CHO細胞、HEK293細胞、COS-1/-7細胞等が挙げられる。
宿主への発現ベクターの導入は、宿主に応じて公知の方法によって行うことができ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が例示できる。導入後、選択マーカーを含む培地で培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換体を選択することができる。
上記のようにして作製された形質転換体を好適な条件下で増殖させた後、選択されたプロモーターを特定の条件下（pH、温度、化合物の添加）で誘導させ、融合タンパク質を産生することができる。発現した融合タンパク質は、細胞内で蓄積あるいは細胞外へ分泌される。
大腸菌を宿主にして発現させる場合には、封入体画分に融合タンパク質を発現させても構わない。大腸菌から封入体を回収する方法としては、例えば、超音波破砕法、高圧ホモジナイザー法、BugBuster（メルク株式会社）を用いた方法が例示される。
大腸菌を宿主にして発現させる場合には、封入体画分に融合タンパク質を発現させても構わない。大腸菌から封入体を回収する方法としては、例えば、超音波破砕法、高圧ホモジナイザー法、BugBuster（メルク株式会社）を用いた方法が例示される。
このようにして得られる本発明の融合タンパク質は、単量体として利用することもできるが、高い毒素中和抗体を誘導できることから多量体を形成させることが好ましい。このような融合タンパク質多量体は、例えば、2量体、3量体、4量体、5量体、5量体以上であり、それらの多量体の混合物も含まれる。このような融合タンパク質多量体を形成するには、例えば、上記のようにして大腸菌から封入体を回収し、融合タンパク質を可溶化させた後、可溶化溶液にリフォールディング処理を行えばよい。封入体から融合タンパク質を可溶化させる方法としては、封入体にグアニジン塩酸塩や尿素溶液を加える方法、Inclusion Body Solubilization Reagent（Funakoshi）、Proteospin Inclusion Body Isolation Kit（Norgen）が例示される。リフォールディング処理としては、可溶化溶液にアルギニン、Tween80、酢酸ナトリウム、及びDL-シスチンを加える方法、TAPS-sulfonate（片山工業株式会社）、Refolding CA Kit（タカラバイオ）を利用する方法などが例示される。
なお本発明の融合タンパク質は、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとStx2eBが結合したものであるが、それらは化学的に結合させてもよい。その際には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと、Stx2eBを個別に発現させて、クロスリンカーを用いて結合する方法が例示される。
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドやStx2eBを個別に発現させる際には、それぞれのDNA配列を化学合成により入手し、それを鋳型として公知の遺伝子増幅方法で増幅させ、上記の方法でそれぞれの発現プラスミドを構築することが可能である。発現プラスミドは上記のように宿主に導入して、目的タンパク質をそれぞれ入手することが可能である。
クロスリンカーを用いて結合させる際には、タンパク質に存在するアミノ基やチオール基（SH基）、タンパク質に存在する糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。例えば、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドのSH基とStx2eBのアミノ基とを反応させる方法が例示でき、より具体的には、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤により還元処理したポリペプチドと、N−スクシニル−3−（2−ピリジルジチオ）プロプリオネート（SPDP)によりピリジルジスルフィド基を導入したStx2eBとをインキュベートすることによって結合させることができる。さらにビオチン、アビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合することもできる。
上記の方法で得られた融合タンパク質及びその多量体は、一般的な精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等各種精製法が挙げられる。
本発明には、前記した本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を有効成分とする豚浮腫病ワクチンが含まれる。本発明のワクチンには、融合タンパク質多量体が含まれることが好ましい。好ましくは2量体、3量体、4量体、5量体、5量体以上、又はそれらの多量体の混合物である。
豚浮腫病ワクチンには、1用量あたり0.1〜1000μgの前記融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を含むことが好ましい。さらに、このワクチンを感受性動物に免疫した場合、発症防御以上の毒素中和抗体を誘導することができる。
本発明のワクチンには、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる、また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合しても構わない。
アジュバントとしては、Emulsigen（MVP Laboratories）、酢酸トコフェロール、アラム、サポニン（QS21、ISCOM）、CpGオリゴ等が含まれる。
本発明のワクチンには、前記の融合タンパク質以外に豚の感染症を予防する抗原を混合しても構わない。そうした感染症としては、豚パルボウイルス感染症、豚丹毒、豚伝染性胃腸炎、豚マイコプラズマ性肺炎、豚萎縮性鼻炎、豚日本脳炎、豚サーコウイルス感染症、豚繁殖・呼吸器障害症候群、豚レンサ球菌症、豚インフルエンザウイルス感染症、豚胸膜肺炎、グレーサー病、豚赤痢、豚流行性下痢、豚大腸菌症、増殖性腸炎、豚壊死性腸炎、豚サルモネラ症、豚ロタウイルス病が例示される。
本発明のワクチンは、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与して構わない。
本発明のワクチンは、豚に接種することにより、高い毒素中和抗体を誘導し、豚浮腫病の発生を効果的に予防することができるものであるが、その理由は、Stx2eBとコイルドコイル構造を形成する能力を有するポリペプチドを融合化することによって、5量体形成を含むStx2eB本来の適切な立体構造をとることが容易になったためと推察される。
本発明には、前記の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキットが含まれる。本発明の融合タンパク質を含むキットは、融合タンパク質が固相化されたプレートであっても良い。被検試料を前記のプレートに適用して、プレート上の融合タンパク質と被検試料中に含まれる抗体を反応させる。酵素や蛍光物質で標識した二次抗体を適用して、一次抗体と反応させる。必要に応じて酵素の基質を加えて、酵素反応の生成物や蛍光量を検出することで、被検試料中に含まれる抗体量を測定しても良い。本発明のキットは、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を有効成分とするワクチンを豚へ免疫後に、ワクチンに由来する抗体産生の有無を検出することによって、ワクチンの有効性評価に使用しても良い。
本発明には、上述の核酸断片や組換え発現ベクターを有効成分とする豚浮腫病用DNAワクチンが含まれる。本発明のDNAワクチンにおいて、核酸断片や組換え発現ベクターは豚に免疫後に融合タンパク質を発現させるプロモーター配列を含むことが好ましい。
本発明のDNAワクチンを作製する方法は、上記のDNAワクチンを豚へ接種する前後にSTEC又はStx2eで豚へ攻撃試験を行う。その結果、豚浮腫病に伴う臨床症状を有意に軽減させた核酸断片や組換え発現ベクターを豚浮腫病治療剤の有効成分として選抜し、その際の投与量から有効成分量を規定しても構わない。
本発明のDNAワクチンには、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる、また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合しても構わない。
本発明のDNAワクチンは、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与して構わない。
本発明には前記の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体と結合する抗体が含まれる。本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を抗原に、通常の免疫方法（Current Protocols in Molecular Biology、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A.K. BORREBAECK）によってモノクローナル及びポリクローナル抗体等の作製あるいはこれらのヒト型抗体の作製が可能となる。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: APRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECK）により当該融合タンパク質及び／又はその多量体と結合する抗体の作出が可能である。本発明の抗体は後述する豚浮腫病治療剤、キット、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての用途が想定される。
本発明には上記の抗体を有効成分とする豚浮腫病用治療剤が含まれる。本発明の治療剤を作製する方法は、上記の方法で作製された抗体を豚へ接種する前後にSTEC又はStx2eで豚へ攻撃試験を行う。その結果、豚浮腫病に伴う臨床症状を有意に軽減させた抗体を豚浮腫病治療剤の有効成分として選抜し、その際の抗体投与量から有効成分量を規定しても構わない。
本発明の豚浮腫病治療剤は、前記の抗体を有効成分とし、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる、また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合しても構わない。
本発明の豚浮腫病用治療剤は、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与して構わない。
本発明には、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体に結合する抗体を含み、被検試料中のStx2eBの含有量を測定するためのキットが含まれる。そうしたキットとしては、融合タンパク質に結合する抗体をプレート等に固相化したキットが含まれる。本発明の抗体を含むキットは、Stx2eBの含有量を指標にして、豚浮腫感染の有無を評価する際に使用しても構わない。例えば、前記の抗体を固相化したプレートに被検試料を適用したのち、酵素や蛍光色素で標識した抗体を適用する。プレートをインキュベーション、洗浄した後、必要に応じて発色基質を加え、蛍光量を測定することで被検試料中のStx2eBの含有量を評価することが出来る。
プレートとしては、Nunc イムノプレート マキシソープ（Thermo scientific）、ELISA用プレート（住友ベークライト株式会社）、ELISPOT（MERCK）、イムノプレート（コスモバイオ株式会社）、エライサプレート（IWAKI）、ELISAプレート（ExtraGene）が例示され、当業者において通常実施される方法で抗体をプレートに結合させても構わない。
抗体を酵素や蛍光色素で標識する方法としては、EasyLink antibody conjugation kits（abcam）、Lightning-Link Rapid Conjugation System（Innova Biosciences Ltd）、Oyster Antibody Labeling Kit（Luminartis GmbH）、酵素標識キットEZ-Link（PIERCE Biotechnology）、PlatinumLink Protein Labeling Kit（Kreatech Biotechnology BV）、DyLight Antibody Labeling Kit（PIERCE Biotechnology）が例示される。
抗体を酵素や蛍光色素で標識する方法としては、EasyLink antibody conjugation kits（abcam）、Lightning-Link Rapid Conjugation System（Innova Biosciences Ltd）、Oyster Antibody Labeling Kit（Luminartis GmbH）、酵素標識キットEZ-Link（PIERCE Biotechnology）、PlatinumLink Protein Labeling Kit（Kreatech Biotechnology BV）、DyLight Antibody Labeling Kit（PIERCE Biotechnology）が例示される。
本発明には、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体に対する抗体を担体に結合させたアフィニティークロマトグラフィー用担体が含まれる。本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体は宿主の内外で発現され、宿主内に発現された場合には宿主を破壊して融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体が回収され、宿主外に発現された場合には培養環境から融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体が回収される。本発明の担体はそうした夾雑画分から融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を回収する等の用途が想定される。
担体としては、HiTrap NHS-activated HP（GEヘルスケア）、NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア）、CNBr-activated Sepharose 4B（GEヘルスケア）、CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア）、EAH Sepharose 4B（GEヘルスケア）、ECH Sepharose 4B（GEヘルスケア）、Profinity エポキシ樹脂（BIORAD）、アフィゲル Hz Hydrazide ゲル（BIORAD）が例示され、当業者において通常使用される方法で抗体を結合させても構わない。
以下、本発明についてさらに実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。
実施例１
Stx2eB-His-COMPタンパク質及びその多量体の調製
（１）発現ベクターの構築
Stx2eB-His発現ベクターの構築及びStx2eB-His発現大腸菌の作出
Stx2eBの前駆体（配列番号1）をコードするDNA配列を基に、大腸菌及び酵母で発現させるためのコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端への制限酵素NdeI認識配列並びに3'末端への制限酵素XhoI認識配列を付加したDNA配列（配列番号2）を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-22b(メルク株式会社)をNde I及びXho Iで処理し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター1」とした。
中間ベクター1を鋳型とし、制限酵素Nco I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号3）及び制限酵素XhoI認識配列を含むオリゴDNA（配列番号4）をプライマーとして、PCR反応を行い、分泌シグナル配列を含まない成熟型Stx2eBをコードするDNAを増幅した。
この増幅産物及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)をNco I及びXho Iで処理し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドをpSTXBとした。本プラスミドはStx2eB及びHis-tagの融合タンパク質（以下Stx2eB-His）（配列番号5）（図1）を発現する。また、Stx2eB-HisをコードするDNA塩基配列を配列番号6に示す。さらに、pSTXBを大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Stx2eB-His発現大腸菌STXB株を得た。
Stx2eB-His-COMPタンパク質及びその多量体の調製
（１）発現ベクターの構築
Stx2eB-His発現ベクターの構築及びStx2eB-His発現大腸菌の作出
Stx2eBの前駆体（配列番号1）をコードするDNA配列を基に、大腸菌及び酵母で発現させるためのコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端への制限酵素NdeI認識配列並びに3'末端への制限酵素XhoI認識配列を付加したDNA配列（配列番号2）を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-22b(メルク株式会社)をNde I及びXho Iで処理し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター1」とした。
中間ベクター1を鋳型とし、制限酵素Nco I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号3）及び制限酵素XhoI認識配列を含むオリゴDNA（配列番号4）をプライマーとして、PCR反応を行い、分泌シグナル配列を含まない成熟型Stx2eBをコードするDNAを増幅した。
この増幅産物及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)をNco I及びXho Iで処理し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドをpSTXBとした。本プラスミドはStx2eB及びHis-tagの融合タンパク質（以下Stx2eB-His）（配列番号5）（図1）を発現する。また、Stx2eB-HisをコードするDNA塩基配列を配列番号6に示す。さらに、pSTXBを大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Stx2eB-His発現大腸菌STXB株を得た。
（２）Stx2eB-His-COMP発現ベクターの構築及びStx2eB-His-COMP発現大腸菌の作出
Cholera toxin B subunit前駆体発現ベクターであるpB（非特許文献５、Infect Immun. 2005,7,5654-65）を鋳型として、制限酵素Mun I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号7）及び制限酵素Mun I認識配列と(GP)2GH6（EcoR I）H6リンカー（人工配列）コード配列を含むオリゴDNA（配列番号8）をプライマーとしてPCR反応を行い、CTB-(GP)2GH6(EcoRI)H6をコードするDNAを増幅した。
この増幅DNAをMun Iで処理し、またpPIC3.5Kベクター（Life Technologies)をEcoR Iで切断し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター２」とした。
(G4S)3リンカー（人工配列）をコードするDNA（配列番号9）と大腸菌及び酵母で発現させるためにコドンを至適化したCartilage oligomeric matrix protein の5量体形成ドメイン（以下、COMP）をコードするDNA（配列番号10）の融合タンパク質をコードするDNA（配列番号11）を設計し、人工合成した。上記の合成DNAを鋳型とし、制限酵素Mun I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号12）及び制限酵素EcoR I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号13）をプライマーとして、PCR反応を行い、(G4S)3リンカー-COMPをコードするDNAを増幅した。この増幅産物をMun I及びEcoR Iで処理したものと、中間ベクター２をEcoR Iで処理したものを結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター３」とした。
Cholera toxin B subunit前駆体発現ベクターであるpB（非特許文献５、Infect Immun. 2005,7,5654-65）を鋳型として、制限酵素Mun I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号7）及び制限酵素Mun I認識配列と(GP)2GH6（EcoR I）H6リンカー（人工配列）コード配列を含むオリゴDNA（配列番号8）をプライマーとしてPCR反応を行い、CTB-(GP)2GH6(EcoRI)H6をコードするDNAを増幅した。
この増幅DNAをMun Iで処理し、またpPIC3.5Kベクター（Life Technologies)をEcoR Iで切断し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター２」とした。
(G4S)3リンカー（人工配列）をコードするDNA（配列番号9）と大腸菌及び酵母で発現させるためにコドンを至適化したCartilage oligomeric matrix protein の5量体形成ドメイン（以下、COMP）をコードするDNA（配列番号10）の融合タンパク質をコードするDNA（配列番号11）を設計し、人工合成した。上記の合成DNAを鋳型とし、制限酵素Mun I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号12）及び制限酵素EcoR I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号13）をプライマーとして、PCR反応を行い、(G4S)3リンカー-COMPをコードするDNAを増幅した。この増幅産物をMun I及びEcoR Iで処理したものと、中間ベクター２をEcoR Iで処理したものを結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター３」とした。
中間ベクター３を鋳型とし、制限酵素Xho I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号14）及び制限酵素Xho I認識配列を含むオリゴDNA（配列番号15）をプライマーとして、PCR反応を行い、(GP)2GH6(G4S)3リンカーとCOMPの融合タンパク質をコードするDNAを増幅した。増幅DNA及びpSTXBをXho Iで処理し、両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5aへ導入し、得られたプラスミドをpSTXCとした。本プラスミドは、Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3リンカー、及びCOMPの融合タンパク質（以下Stx2eB-His-COMP）（配列番号16）（図2）を発現するためのベクターである。また、Stx2eB-His-COMPをコードするDNA塩基配列を配列番号17に示す。さらにpSTXCを大腸菌BL21(DE3)株に導入し、Stx2eB-His-COMP発現大腸菌STXC株を得た。
（３）Stx2eB-His-COMP-His-Z発現ベクターの構築及びStx2eB-His-COMP-His-Z発現大腸菌の作出
COMP-His-Z発現ベクター（非特許文献６、Infect. Immune. 2011,79(10),4260-4275）をNco I及びXho Iで切断し、COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2リンカー及びイムノグロブリン結合ドメインZ（以下ドメインZ）の融合タンパク質（以下COMP-His-Z）をコードするDNA断片を調製した。このDNA断片と、pET-21dベクター(MERCK)を制限酵素Nco I及びXho Iで処理したものを結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター４」とした。中間ベクター４をさらにNco I及びBsm Iで処理し、COMPの5’末端からBsm I認識部位までを除去した「中間ベクター５」を調製した。
次にpSTXCを鋳型として、配列番号3及び配列番号15のオリゴDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、Stx2eB-His-COMPをコードするDNAを増幅した。この増幅DNAを制限酵素Nco I及びBsm Iで処理した。このDNA断片はCOMPのカルボキシル末端の一部欠いている。このDNA断片と中間ベクター５を結合した。結合産物を大腸菌DH5αに導入し、得られたプラスミドをpSTXZとした。本プラスミドはStx2eB、(GP)2GH6(G4S)3リンカー、COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2リンカー及びドメインZの融合タンパク質（以下Stx2eB-His-COMP-His-Z）（配列番号18）（図４）を発現する。また、Stx2eB-His-COMP-His-ZをコードするDNA配列を配列番号19に示す。さらに、pSTXZを大腸菌BL21(DE3)（MERCK）に導入し、Stx2eB-His-COMP-His-Z発現大腸菌STXZ株を得た。
COMP-His-Z発現ベクター（非特許文献６、Infect. Immune. 2011,79(10),4260-4275）をNco I及びXho Iで切断し、COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2リンカー及びイムノグロブリン結合ドメインZ（以下ドメインZ）の融合タンパク質（以下COMP-His-Z）をコードするDNA断片を調製した。このDNA断片と、pET-21dベクター(MERCK)を制限酵素Nco I及びXho Iで処理したものを結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター４」とした。中間ベクター４をさらにNco I及びBsm Iで処理し、COMPの5’末端からBsm I認識部位までを除去した「中間ベクター５」を調製した。
次にpSTXCを鋳型として、配列番号3及び配列番号15のオリゴDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、Stx2eB-His-COMPをコードするDNAを増幅した。この増幅DNAを制限酵素Nco I及びBsm Iで処理した。このDNA断片はCOMPのカルボキシル末端の一部欠いている。このDNA断片と中間ベクター５を結合した。結合産物を大腸菌DH5αに導入し、得られたプラスミドをpSTXZとした。本プラスミドはStx2eB、(GP)2GH6(G4S)3リンカー、COMP、(GP)2G4SH6G4S(GP)2リンカー及びドメインZの融合タンパク質（以下Stx2eB-His-COMP-His-Z）（配列番号18）（図４）を発現する。また、Stx2eB-His-COMP-His-ZをコードするDNA配列を配列番号19に示す。さらに、pSTXZを大腸菌BL21(DE3)（MERCK）に導入し、Stx2eB-His-COMP-His-Z発現大腸菌STXZ株を得た。
実施例２
組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製
（１）STXB株の培養及びStx2eB-Hisの精製
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXB株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、25℃で20時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（メルク株式会社）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
調製した封入体画分を1%SDS溶液で可溶化し、透析（Spectrum laboratories, inc. Spectra/Por CE dialysis membrane. MWCO: 3.5-5 kD.）によりPBSへBuffer置換したものをStx2eB-His抗原とした。
組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製
（１）STXB株の培養及びStx2eB-Hisの精製
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXB株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、25℃で20時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（メルク株式会社）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
調製した封入体画分を1%SDS溶液で可溶化し、透析（Spectrum laboratories, inc. Spectra/Por CE dialysis membrane. MWCO: 3.5-5 kD.）によりPBSへBuffer置換したものをStx2eB-His抗原とした。
（２）STXC株の培養、Stx2e-His-COMPの精製
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXC株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、37℃で6時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（メルク株式会社）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXC株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、37℃で6時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（メルク株式会社）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
次に封入体に６Mグアニジン塩酸塩（pH8.2）溶液を加え、可溶化溶液を調製した。可溶化溶液を特許文献１（特開2008-50344）を参考にリフォールディング処理した。具体的には、可溶化溶液にTween80（終濃度0.05％）、酢酸ナトリウム（終濃度１M）、DL-シスチン（終濃度２ｍM）を加え、４℃で一夜静置した。リフォールディング処理後、His Trap HP（GEへルスケア・ジャパン株式会社）を用いてStx2eB-His-COMPを精製し、限外ろ過（Amicon Ultra-15 30kDa、ミリポア社）によってPBSへのbuffer置換を経たものをStx2eB-His-COMP抗原とした。非還元状態下で12.5%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、CBB染色及び抗His抗体によるウェスタンブロッティングにより多量体の形成を確認した（図３）。
（３）STXZ株の培養、Stx2e-His-COMP-His-Zの精製
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXZ株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようIPTGを添加し、37℃で6時間振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（MERCK）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
次に封入体に６Mグアニジン塩酸塩（pH8.2）溶液を加え、可溶化溶液を調製した。可溶化溶液を特許文献１（特開2008-50344）を参考にリフォールディング処理した。具体的には、可溶化溶液にTween80（終濃度0.05％）、酢酸ナトリウム（終濃度１M）、DL-シスチン（終濃度２ｍM）を加え、４℃で一夜静置した。リフォールディング処理後、His Trap HP（GEへルスケア）を用いてStx2eB-His-COMP-His-Zを精製し、限外ろ過（Amicon Ultra-15 30kDa、ミリポア社）によってPBSへのbuffer置換を経たものをStx2e-His-COMP-His-Z抗原とした。非還元状態下で5-20%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、CBB染色及び抗His抗体によるウェスタンブロッティングにより多量体の形成を確認した（図５）。
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STXZ株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようIPTGを添加し、37℃で6時間振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体から、BugBuster（MERCK）を用い、遠心により封入体画分を調製した。
次に封入体に６Mグアニジン塩酸塩（pH8.2）溶液を加え、可溶化溶液を調製した。可溶化溶液を特許文献１（特開2008-50344）を参考にリフォールディング処理した。具体的には、可溶化溶液にTween80（終濃度0.05％）、酢酸ナトリウム（終濃度１M）、DL-シスチン（終濃度２ｍM）を加え、４℃で一夜静置した。リフォールディング処理後、His Trap HP（GEへルスケア）を用いてStx2eB-His-COMP-His-Zを精製し、限外ろ過（Amicon Ultra-15 30kDa、ミリポア社）によってPBSへのbuffer置換を経たものをStx2e-His-COMP-His-Z抗原とした。非還元状態下で5-20%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、CBB染色及び抗His抗体によるウェスタンブロッティングにより多量体の形成を確認した（図５）。
実施例３
１．マウスでの中和抗体誘導確認
（１）ワクチン調製とマウスへの免疫
a. Stx2eB-His抗原及びStx2eB-His-COMP抗原の中和抗体誘導能比較
100μLあたり50μgのStx2eB-His-COMP抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）（Thermo Fisher Scientific Inc.）を混合したワクチンを調製した。50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-Hisは26.6μgであるため、100μLあたり26.6μgのStx2eB-His抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。また、100μLあたり50μgのStx2e-His-COMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を混合し、乳化したワクチンを調製した。
各群5匹のBALB/ｃ、♀、７週齢マウスにワクチンを100μLずつ、２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に採血を行い、下記のVero細胞を用いたStx2e中和試験によって抗体価を測定した。
b. Stx2eB-His-COMP抗原及びStx2eB-His-COMP-His-Z抗原の中和抗体誘導能比較
100μLあたり50μgのStx2eB-His-COMP抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-His-COMP-His-Zは75μgであるため、100μLあたり75μgのStx2eB-His-COMP-His-Z抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。
各群5匹のBALB/ｃ、♀、７週齢マウスにワクチンを100μLずつ、２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に採血を行い、下記のVero細胞を用いたStx2e中和試験によって抗体価を測定した。
１．マウスでの中和抗体誘導確認
（１）ワクチン調製とマウスへの免疫
a. Stx2eB-His抗原及びStx2eB-His-COMP抗原の中和抗体誘導能比較
100μLあたり50μgのStx2eB-His-COMP抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）（Thermo Fisher Scientific Inc.）を混合したワクチンを調製した。50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-Hisは26.6μgであるため、100μLあたり26.6μgのStx2eB-His抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。また、100μLあたり50μgのStx2e-His-COMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を混合し、乳化したワクチンを調製した。
各群5匹のBALB/ｃ、♀、７週齢マウスにワクチンを100μLずつ、２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に採血を行い、下記のVero細胞を用いたStx2e中和試験によって抗体価を測定した。
b. Stx2eB-His-COMP抗原及びStx2eB-His-COMP-His-Z抗原の中和抗体誘導能比較
100μLあたり50μgのStx2eB-His-COMP抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-His-COMP-His-Zは75μgであるため、100μLあたり75μgのStx2eB-His-COMP-His-Z抗原と50μLのImjectAlum（登録商標）を混合したワクチンを調製した。
各群5匹のBALB/ｃ、♀、７週齢マウスにワクチンを100μLずつ、２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に採血を行い、下記のVero細胞を用いたStx2e中和試験によって抗体価を測定した。
（２）毒素液の調製
豚から分離された浮腫病菌のグリセリンストックから１白金耳量をサークルグロー（MP Biomedicals）寒天培地に接種し、37℃で一晩培養した。単コロニーを50mLのサークルグロー培地が入った500mL三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩旋回培養した。50mLのサークルグロー培地が入った500mL三角フラスコ４本に上述の培養菌液を５mLずつ接種し、37℃、220rpmで８時間旋回培養した。菌液をプールし、吸光度（OD650）を測定した。10000ｇ、４℃、15分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を20mLの10ｍＭ Tris-HCl(7.0)に懸濁した。超音波処理（Branson、Duty Cycle 30%、Output 1）を行い、吸光度（OD650）が処理前の60％になった時点で終了した。10000ｇ、４℃、30分間遠心し、上清を回収した。0.22μmフィルターろ過処理による滅菌を行った。-80℃で凍結保存した。
豚から分離された浮腫病菌のグリセリンストックから１白金耳量をサークルグロー（MP Biomedicals）寒天培地に接種し、37℃で一晩培養した。単コロニーを50mLのサークルグロー培地が入った500mL三角フラスコに接種し、37℃、220rpmで一晩旋回培養した。50mLのサークルグロー培地が入った500mL三角フラスコ４本に上述の培養菌液を５mLずつ接種し、37℃、220rpmで８時間旋回培養した。菌液をプールし、吸光度（OD650）を測定した。10000ｇ、４℃、15分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を20mLの10ｍＭ Tris-HCl(7.0)に懸濁した。超音波処理（Branson、Duty Cycle 30%、Output 1）を行い、吸光度（OD650）が処理前の60％になった時点で終了した。10000ｇ、４℃、30分間遠心し、上清を回収した。0.22μmフィルターろ過処理による滅菌を行った。-80℃で凍結保存した。
（３）細胞障害活性測定
＜準備物＞
・細胞；Vero細胞
・培養用培地：5%FBS加イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
・希釈用培地：イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
＜細胞浮遊液の調整＞
Vero細胞を培養用培地で培養し、上清を除去した。中角（75cm2）あたり3mLのトリプシン−EDTAを添加し、37℃で5〜10分処理した。10mLの培養用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をほぐしながら遠心管に回収した。1500rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。5mLの培養用培地で再浮遊させ、細胞数をカウントした。培養用培地で4.0×105 cells/mLに調整した。
＜細胞障害活性の測定＞
細胞培養用96穴プレートに希釈用培地を125μl/wellずつ分注した。希釈用培地で２倍階段希釈した毒素液を25μl/wellずつ加えた。4.0×105 cells/mLに調整した細胞浮遊液を50μL/wellずつ加えた。プレートにシールをして37℃で5日間培養した。
＜判定＞
ネガティブコントロールの細胞シート形成率が95％以上であることを確認し、細胞シート形成率が50％以下を示した希釈倍数を50％細胞障害活性（cytotoxic dose、CD50）量とする。
＜準備物＞
・細胞；Vero細胞
・培養用培地：5%FBS加イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
・希釈用培地：イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
＜細胞浮遊液の調整＞
Vero細胞を培養用培地で培養し、上清を除去した。中角（75cm2）あたり3mLのトリプシン−EDTAを添加し、37℃で5〜10分処理した。10mLの培養用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をほぐしながら遠心管に回収した。1500rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。5mLの培養用培地で再浮遊させ、細胞数をカウントした。培養用培地で4.0×105 cells/mLに調整した。
＜細胞障害活性の測定＞
細胞培養用96穴プレートに希釈用培地を125μl/wellずつ分注した。希釈用培地で２倍階段希釈した毒素液を25μl/wellずつ加えた。4.0×105 cells/mLに調整した細胞浮遊液を50μL/wellずつ加えた。プレートにシールをして37℃で5日間培養した。
＜判定＞
ネガティブコントロールの細胞シート形成率が95％以上であることを確認し、細胞シート形成率が50％以下を示した希釈倍数を50％細胞障害活性（cytotoxic dose、CD50）量とする。
（４）Vero細胞を用いたStx2e中和試験
＜準備物＞
・細胞；Vero細胞
・培養用培地：5%FBS加イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
・希釈用培地：イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
＜細胞浮遊液の調整＞
Vero細胞を培養用培地で培養した後、細胞の上清を除去した。中角（75cm2）あたり3mLのトリプシン−EDTAを添加し、37℃で5〜10分処理した。10mLの培養用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をほぐしながら遠心管に回収した。1500rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。5mLの培養用培地で再浮遊させ、細胞数をカウントする。培養用培地で4.0×105 cells/mLに調整した。
＜中和反応＞
希釈用培地で10CD50に調整した毒素液60μLと希釈用培地で２倍階段希釈した被検血清60μLを混合し、37℃で1時間反応した。96ウェルプレートに希釈用培地を100μl/wellずつ分注した。37℃で反応させた中和反応液を50μLずつ加えた。4.0×105 cells/mLに調整した細胞浮遊液を50μL/wellずつ加えた。プレートにシールをして37℃で5日間培養した。
＜判定＞
ネガティブコントロールの細胞シート形成率が95％以上であることを確認し、細胞シート形成率が50％以上を示す被検血清の最高希釈倍率を中和抗体価とした。結果を表１及び表２に示した。
＜準備物＞
・細胞；Vero細胞
・培養用培地：5%FBS加イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
・希釈用培地：イーグル培地（10% TPB、1.5% 重曹、0.1% PS）
＜細胞浮遊液の調整＞
Vero細胞を培養用培地で培養した後、細胞の上清を除去した。中角（75cm2）あたり3mLのトリプシン−EDTAを添加し、37℃で5〜10分処理した。10mLの培養用培地を添加し、ピペッティングにより細胞をほぐしながら遠心管に回収した。1500rpmで5分間遠心し、細胞を回収した。5mLの培養用培地で再浮遊させ、細胞数をカウントする。培養用培地で4.0×105 cells/mLに調整した。
＜中和反応＞
希釈用培地で10CD50に調整した毒素液60μLと希釈用培地で２倍階段希釈した被検血清60μLを混合し、37℃で1時間反応した。96ウェルプレートに希釈用培地を100μl/wellずつ分注した。37℃で反応させた中和反応液を50μLずつ加えた。4.0×105 cells/mLに調整した細胞浮遊液を50μL/wellずつ加えた。プレートにシールをして37℃で5日間培養した。
＜判定＞
ネガティブコントロールの細胞シート形成率が95％以上であることを確認し、細胞シート形成率が50％以上を示す被検血清の最高希釈倍率を中和抗体価とした。結果を表１及び表２に示した。
この結果から、Stx2eB-His-COMP抗原はマウスにおいてStx2eに対する中和抗体を誘導することが確認された。一方でStx2eB-His注射群では中和抗体の上昇が見られなかった。この検討結果からStx2eBのみでは適切な多量体構造の形成が困難であり、COMPと融合することの優位性が示された。さらに、Stx2eB-His-COMP抗原は、Stx2eB-His-COMP-His-Z抗原よりも有意に高い毒素中和抗体を誘導できることが確認された。
２．マウスでのStx2e攻撃試験
100μLあたり50μgのStx2e-His-COMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン社）を混合して乳化したワクチンを調製した。マウスはBALB/ｃ、♀、７週齢を供試し、各群10頭としてワクチン100μLを２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に浮腫病菌から調製した毒素液（調整方法は前述）を0.4ｍL（32000 50%Vero細胞変性量）ずつ腹腔内に注射した。Stx2e投与後７日間観察して死亡頭数を確認した結果を表３に示した。
100μLあたり50μgのStx2e-His-COMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン社）を混合して乳化したワクチンを調製した。マウスはBALB/ｃ、♀、７週齢を供試し、各群10頭としてワクチン100μLを２週間隔で３回皮下注射した。３回目免疫２週後に浮腫病菌から調製した毒素液（調整方法は前述）を0.4ｍL（32000 50%Vero細胞変性量）ずつ腹腔内に注射した。Stx2e投与後７日間観察して死亡頭数を確認した結果を表３に示した。
表３より、プラセボ群と免疫群で有意差（p=0.0041）が見られ、Stx2eB-His-COMP抗原をマウスに免疫することで、Stx2e攻撃を防御することが確認された。
実施例４
豚での中和抗体誘導確認
2mL当たり100μgのStx2eB-His-COMP抗原と0.4mLのEmulsigen（MVP Laboratories）を含むワクチンを調製した。３〜４週齢の豚に、２週間隔で２回、ワクチンを頚部筋肉内注射した。初回免疫時、追加免疫時及び追加免疫２週後に採血し、Vero細胞を用いたStx2e中和試験により抗体価を測定した。結果を表４に示した。
豚での中和抗体誘導確認
2mL当たり100μgのStx2eB-His-COMP抗原と0.4mLのEmulsigen（MVP Laboratories）を含むワクチンを調製した。３〜４週齢の豚に、２週間隔で２回、ワクチンを頚部筋肉内注射した。初回免疫時、追加免疫時及び追加免疫２週後に採血し、Vero細胞を用いたStx2e中和試験により抗体価を測定した。結果を表４に示した。
この結果から、Stx2eB-His-COMP抗原は豚においてもStx2eに対する中和抗体を誘導することが確認された。
実施例５
豚でのStx2e攻撃試験
実施例４で使用した豚について、追加免疫２週後に浮腫病菌から調製した毒素液（調整方法は前述）を腹腔内に20ｍL（600000 50%Vero細胞変性量）注射した。また、混入しているLPSの影響を排除するため、Stx2e溶液を80℃、10分加熱してStx2eを熱不活化させたものをプラセボ群の１頭に投与した。Stx2e投与後3日間臨床症状を観察した。結果を表５に示した。
豚でのStx2e攻撃試験
実施例４で使用した豚について、追加免疫２週後に浮腫病菌から調製した毒素液（調整方法は前述）を腹腔内に20ｍL（600000 50%Vero細胞変性量）注射した。また、混入しているLPSの影響を排除するため、Stx2e溶液を80℃、10分加熱してStx2eを熱不活化させたものをプラセボ群の１頭に投与した。Stx2e投与後3日間臨床症状を観察した。結果を表５に示した。
表５の結果から、Stx2eB-His-COMP抗原を豚に免疫することで、Stx2eの攻撃を防御できることが確認された。
実施例６
Stx2eB-His-CMPタンパク質及びその多量体の調製
（１）Stx2eB-His-CMP発現ベクターの構築及びStx2eB-His-CMP発現大腸菌の作出
Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3リンカー、及びCMPの融合タンパク質（以下Stx2eB-His-CMP）（配列番号35）（図6）を大腸菌で発現させるためにコドンを最適化し（配列番号34）、発現ベクターにクローニングするための5'末端への制限酵素Nco I認識配列並びに3'末端への制限酵素XhoI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列（配列番号36）を設計し、人工合成した。この合成DNAを、プラスミドpUC57（ジェンスクリプト株式会社）のEcoRVサイトに挿入した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター６」とした。
中間ベクター６をNco I及びXho Iで処理し、Stx2eB-His-CMPをコードするDNA断片を得た。このDNA断片とNco I及びXho Iで処理したプラスミドpET-21d（メルク株式会社）を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpSTX-CMPとした。さらに、pSTX-CMPを大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Stx2eB-His-CMP発現大腸菌STX-CMP株を得た。
Stx2eB-His-CMPタンパク質及びその多量体の調製
（１）Stx2eB-His-CMP発現ベクターの構築及びStx2eB-His-CMP発現大腸菌の作出
Stx2eB、(GP)2GH6(G4S)3リンカー、及びCMPの融合タンパク質（以下Stx2eB-His-CMP）（配列番号35）（図6）を大腸菌で発現させるためにコドンを最適化し（配列番号34）、発現ベクターにクローニングするための5'末端への制限酵素Nco I認識配列並びに3'末端への制限酵素XhoI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列（配列番号36）を設計し、人工合成した。この合成DNAを、プラスミドpUC57（ジェンスクリプト株式会社）のEcoRVサイトに挿入した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを「中間ベクター６」とした。
中間ベクター６をNco I及びXho Iで処理し、Stx2eB-His-CMPをコードするDNA断片を得た。このDNA断片とNco I及びXho Iで処理したプラスミドpET-21d（メルク株式会社）を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpSTX-CMPとした。さらに、pSTX-CMPを大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Stx2eB-His-CMP発現大腸菌STX-CMP株を得た。
（２）STX-CMP株の培養、Stx2e-His-CMP抗原の調製
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STX-CMP株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、37℃で6時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。100mL培養分の菌体をリゾチーム（終濃度1mg/mL）を含むリシスバッファー（50mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl）に懸濁し、超音波発生機UD-201（トミー株式会社）を用いて菌体破砕を行った。菌体破砕液を10,000rpm・4℃で10分間遠心分離し、封入体を得た。この封入体を再びリシスバッファーに懸濁することで洗浄し、10,000rpm・4℃で10分間遠心分離して封入体を回収した。
12mLサイズの試験管に3mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、STX-CMP株を接種して、37℃で16時間程度振盪培養した（前培養）。2Lサイズの三角フラスコに200mLの2×YT培地とアンピシリン溶液（終濃度200μg/mL）を分注し、これに2mLの前培養菌液を植菌して、OD590が0.5を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.5を超えたところで、終濃度10μMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、37℃で6時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、10,000rpm・4℃・10分間の遠心分離によって菌体を回収した。100mL培養分の菌体をリゾチーム（終濃度1mg/mL）を含むリシスバッファー（50mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl）に懸濁し、超音波発生機UD-201（トミー株式会社）を用いて菌体破砕を行った。菌体破砕液を10,000rpm・4℃で10分間遠心分離し、封入体を得た。この封入体を再びリシスバッファーに懸濁することで洗浄し、10,000rpm・4℃で10分間遠心分離して封入体を回収した。
次に封入体に50mMトリス（pH8.2）、6Mグアニジン塩酸塩を含むバッファーを加え、可溶化溶液を調製した。可溶化溶液を段階透析によってリフォールディング処理した。具体的には、50mMトリス（pH8.2）、2Mグアニジン塩酸塩を含むバッファーで4時間透析し、次に50mMトリス（pH8.2）、1Mグアニジン塩酸塩、1Mアルギニン塩酸塩、5mM DL-シスチンを含むバッファーで4時間透析し、次に50mMトリス（pH8.2）、0.5Mグアニジン塩酸塩、1Mアルギニン塩酸塩、5mM DL-シスチンを含むバッファーで16時間透析し、最後に1Mアルギニン塩酸塩を含むPBSバッファーで4時間透析した。これによって得られた試料をStx2eB-His-CMP抗原とした。非還元状態下で12.5%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、CBB染色及び抗His抗体によるウェスタンブロッティングにより多量体の形成を確認した（図7）。
実施例７
マウスでのStx2e攻撃試験
（１）ワクチン調製
実施例３に記載の50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-His-CMPは46.5μgであるため、100μLあたり46.5μgのStx2eB-His-CMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を混合し、乳化したワクチンを調製した。
マウスでのStx2e攻撃試験
（１）ワクチン調製
実施例３に記載の50μgのStx2eB-His-COMPと等しいmol数になるStx2eB-His-CMPは46.5μgであるため、100μLあたり46.5μgのStx2eB-His-CMP抗原と50μLのIncomplete Freund’s Adjuvant（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を混合し、乳化したワクチンを調製した。
（２）マウスでのStx2e攻撃試験
各群10匹のBALB/ｃ、♀、9週齢マウスを供試した。免疫群にはワクチンを100μLずつ、２週間隔で２回皮下注射した。無投与群は何も投与しなかった。２回目免疫２週後に浮腫病菌から調製したStx2e毒素液（調製方法は前述）を0.4ｍL（64000 50%Vero細胞変性量）ずつ腹腔内に注射した。Stx2e投与後7日間観察して死亡頭数を確認した結果を表6に示した。
各群10匹のBALB/ｃ、♀、9週齢マウスを供試した。免疫群にはワクチンを100μLずつ、２週間隔で２回皮下注射した。無投与群は何も投与しなかった。２回目免疫２週後に浮腫病菌から調製したStx2e毒素液（調製方法は前述）を0.4ｍL（64000 50%Vero細胞変性量）ずつ腹腔内に注射した。Stx2e投与後7日間観察して死亡頭数を確認した結果を表6に示した。
表6より、無投与群と免疫群で有意差（p=0.047）が見られ、Stx2eB-His-CMP抗原をマウスに免疫することで、半数のマウスをStx2e攻撃から防御することが確認された。
豚の浮腫病の発生が予想される農場において豚浮腫病の発症予防を行うことが可能である。
Claims (39)
- コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドとStx2eBとの間にリンカー配列及び／又はタグ配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記コイルドコイル形成ユニットが、天然の多量体形成タンパク質に由来するものである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
- 前記天然の多量体形成タンパク質が、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択されたものである、請求項３に記載の融合タンパク質。
- 前記天然の多量体形成タンパク質が、COMP又はCMPである、請求項４に記載の融合タンパク質。
- 前記天然の多量体形成タンパク質が、COMPである、請求項５に記載の融合タンパク質。
- 配列番号２７若しくは配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項６に記載の融合タンパク質。
- 前記天然の多量体形成タンパク質が、CMPである、請求項５に記載の融合タンパク質。
- 配列番号３２または配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項８に記載の融合タンパク質。
- Stx2eBが、配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。
- 請求項１２に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
- 請求項１２に記載の核酸断片が導入された形質転換体。
- 請求項１３に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質と結合することができる抗体。
- 請求項１１に記載の融合タンパク質多量体と結合することができる抗体。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
- 請求項１１に記載の融合タンパク質多量体を有効成分として含有する豚浮腫病用ワクチン。
- 請求項１６又は１７に記載の抗体を有効成分として含有する豚浮腫病用治療剤。
- 請求項１２に記載の核酸断片を有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
- 請求項１３に記載の組換え発現ベクターを有効成分として含有する豚浮腫病用DNAワクチン。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
- 請求項１１に記載の融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のStx2eBに対する抗体量を測定するためのキット。
- 請求項１６又は１７に記載の抗体を含む、被検試料中のStx2eBの含有量を測定するためのキット。
- コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと志賀毒素Stx2eのBサブユニット（Stx2eB）を結合させた融合タンパク質を宿主で発現させた後、リフォールディングする工程を含む、融合タンパク質多量体の製造方法。
- 前記融合タンパク質が、前記ポリペプチドとStx2eBとの間にスペーサーを有するものである、請求項２６に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドが、cartilage oligomeric matrix protein (COMP)、cartilage matrix protein（CMP）、テトラブラキオン（TB）及びGCN4よりなる群から選択された天然の多量体形成タンパク質に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、請求項２６又は２７に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドがCOMP又はCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、請求項２８に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドがCOMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、請求項２９に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号２７若しくは配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３０に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドがCMPに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものである、請求項２９に記載の製造方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号３２または配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３２に記載の製造方法。
- Stx2eBが、配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項１から１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
- 請求項１１に記載の融合タンパク質多量体を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
- 請求項１６又は１７に記載の抗体を豚に投与する豚浮腫病の治療方法。
- 請求項１２に記載の核酸断片を豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
- 請求項１３に記載の組換え発現ベクターを豚に投与する豚浮腫病の予防方法。
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