JP2001321183A

JP2001321183A - ペプチドリピート免疫原

Info

Publication number: JP2001321183A
Application number: JP2000148085A
Authority: JP
Inventors: Howan Jauran; ジャウラン・ホワン; Shu Chia-Tsue; チア−ツェ・シュ; Tein Chun-Jen; チュン−ジェン・ティン
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2001-11-20

Abstract

(57)【要約】【課題】抗原性が高く、毒性が低い、抗原特異性抗体
の産生。【解決手段】（１）シュウドモナス（Pseudomonos）エ
キソトキシンＡのレセプター結合ドメインと、（２）ペ
プチド配列の少なくとも２コピーを含むことを特長とす
る、ポリペプチドを抗原として使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、ペプチド抗原に対
する免疫応答を発生せしめる新規な手段に関する。

【０００２】（背景技術）タンパク質に基づくワクチン
の開発を成功させるには、しばしば特定抗原の免疫原性
の向上とそのような向上によって誘導された潜在的毒性
の間の微妙なバランスが必要である。例えば、動物の研
究に用いられる有効なアジュバント（例えば、完全フロ
イント）は、ヒト用に製造されたワクチンで使用するた
めには、毒性が過剰である。

【０００３】（発明の開示）本発明は、抗原としてのペ
プチドに対する免疫応答を生じさせる新規な手段の発見
に基づくものであって、当該手段は上記ペプチドの鎖状
体形成（concatemerizing)を行い、形成されたペプチド
鎖状体をシュウドモナスエキソトキシンのレセプター結
合ドメインに融合させることから成る。このような融合
タンパク質は、種々の哺乳類において抗原特異的抗体を
誘導するが、毒性は殆ど又は全く認められない。

【０００４】従って、本発明は、(１)ペプチド配列の少
なくとも２コピー(例えば、少なくとも１２または１６
コピー)と、（２)シュウドモナスエキソトキシンＡのレ
セプター結合ドメインを含むポリペプチドを提供するも
のである。

【０００５】上記ペプチド配列は、その長さが少なくと
も２つのアミノ酸(例えば、少なくとも３、５、７、９
または１０のアミノ酸）から成るものでなけれらならな
い。好ましい実施態様では、ペプチド配列は、１０００
のアミノ酸(例えば、５００、１００、５０または２０
以下のアミノ酸)を越えない長さである。ペプチド配列
には、それに対する免疫応答が有益である抗原の配列を
含み得る。そのような抗原の例には、ゴナドトロピン
（性腺刺激ホルモン）放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およ
び、ワクシニアウィルスコートタンパク質およびそれら
の断片を含む。ペプチド配列の具体例には、ＧｎＲＨの
配列であるＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ(配列番号1)、ワクシ
ニアウィルスコートタンパク質の断片の配列であるＬＩ
ＧＩＣＶＡＶＴＶＡＩ(配列番号2)などが含まれる。

【０００６】レセプター結合ドメインは、ＬＤＬ／ａｌ
ｐｈａ₂-ミクログロブリン細胞レセプターに特異的に結
合するポリペプチド内のアミノ酸配列である。レセプタ
ー結合ドメインの一例として、シュドモナス・エルギノ
ーサのエキソトキシンＡ(ＰＥ)のアミノ酸１〜２５２
（ドメイン１ａ）が挙げられる：

【化１】

【０００７】レセプター結合ドメインがＬＤＬ／ａｌｐ
ｈａ₂-ミクログロブリン細胞レセプターと特異的に結合
する限り、上記配列の変異体（variants)、すなわち上
記配列において置換、欠失又は付加したものであっても
よい。置換、欠失又は付加し得るアミノ酸数は、１また
はそれ以上であり、通常、数個以内である。

【０００８】本発明のポリペプチドは、哺乳類において
免疫応答を誘発し得る限り、その中で種々のエレメント
の位置が変化してもよい。例えば、ペプチド配列のすべ
てのコピーが連続していてもよく、その場合には、任意
の２つのコピーの間にアミノ酸が介在することなく、す
べてのコピーがペプチドの繰り返しの単一ブロックとし
て存在することを意味する。また、レセプター結合ドメ
インは、抗原としてのポリペプチドの所期の機能が失わ
れない限り、ポリペプチド内の任意の位置(例えば、ペ
プチド配列のＮ末端、Ｃ末端、内部又は２つのコピーの
間)に存在することが出来る。

【０００９】本発明はまた、本発明のポリペプチドをコ
ードする核酸(例えば、発現ベクター（ウイルスベクタ
ーを含む)）を提供するものである。そのような核酸
は、裸のＤＮＡを基にするワクチンに使用し得るか、ま
たは本発明のポリペプチドの多量生産に使用し得る。

【００１０】更に、本発明は、(１)本発明の核酸を用意
し、(２)この核酸を細胞(例えば、細菌または真核細胞
（細胞系および原発性細胞を含む)）に導入し、(３)当
該細胞内でポリペプチドを発現させることを特長とす
る、ポリペプチドの生産方法を提供するものである。

【００１１】本発明のポリペプチドおよび核酸は、特定
ペプチド配列に対し免疫応答を誘導する新しい抗原およ
びワクチンを提供するために使用することが出来る。当
該抗原は、哺乳類およびヒトに対する安全かつ効果的な
ワクチンとして調製することが出来、少なくともヒトお
よび／または動物モデル（霊長類動物モデルを含む）に
おいて、その効力を試験することが出来る。

【００１２】本発明の他の特徴または利点は、以下の図
および詳細な説明より、そしてまた、特許請求の範囲の
記載から明らかとなるであろう。

【００１３】添付図面において、図１は、本発明のポリ
ペプチドの中で使用されるGnRHペプチド配列(配列番号
1)及びそれ又はその部分をコードするプライマー配列
(オリゴＡ：配列番号4;オリゴＢ：配列番号5)を示す。

【００１４】図２は、図１のプライマーを連続的に伸
長、変性およびアニーリング（すなわちＰＣＲ）して、
ペプチド配列の鎖状体をコードする核酸を製造する方法
を示す。

【００１５】図３は、図２の鎖状体核酸の最終的ＰＣＲ
増幅による、鎖状体の末端における停止コドンとクロー
ニングのための適当な制限部位の導入を示す。アダプタ
ープライマーＡを配列番号6、アダプターＢを配列番号
7、EcoRI部位を含む５’オーバーハング配列を配列番号
8、SacII部位を含む５’オーバーハング配列を配列番号
９で示す。

【００１６】（詳細な説明）本発明は、シュウドモナス
エキソトキシンのレセプター結合ドメインに融合した多
コピーのペプチド抗原を有する新規ポリペプチドに関す
る。多コピーのペプチド抗原は、そのメカニズムは不明
であるが、各単量体ペプチド配列中に存在するエピトー
プの免疫提示（immunologic presentation）を増加す
る。また、エキソトキシン断片は、ポリペプチドと抗原
提示細胞との間の結合を増加し、それによりペプチド配
列の取り込みと提示を容易にするものである。

【００１７】Ｉ．抗体の作成本発明のポリペプチドは、単量体ペプチド配列に特異的
に結合する抗体を発生させるために使用することが出来
る。そのような抗体は、ペプチド配列によって与えられ
るエピトープを含む任意の分子の増強、阻止又は検出を
必要とする、診断的又は治療的方法において使用され得
る。

【００１８】特に、種々の宿主動物は、本発明のポリペ
プチドを含む組成物の注射によって免疫することが出来
る。宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット、ラッ
トなどが含まれる。種々のアジュバントを宿主種に応じ
て免疫応答を増強させるために使用することが出来、そ
の例として、フロイント（完全又は不完全）、水酸化ア
ルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのよう
な表面活性物質、プルロニックポリオール類、ポリアニ
オン類、ペプチド類、油エマルジョン、キーホール・リ
ンペット・ホモシアニン、ジニトロフェノール及びＢＣ
Ｇ（無菌化ウシ型結核菌）やコリネバクテリウム・パル
ブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントなどが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。

【００１９】抗体には、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断
片、F(ab')₂断片、Fab発現ライブラリーを使用して生産
された分子などが含まれる。

【００２０】特定の抗原に対する抗体の均一な集合であ
るモノクローナル抗体は、上記したポリペプチドを使用
し、標準のハイブリドーマ技術（コーラーら: Nature,
256:495, 1975; コーラーら: Eur. J. Immunol., 6:51
1, 1976; コーラーら:Eur. J.Immunol., 6:292, 1976;
ハマーリングら: In: Monoclonal Antibodies and TCel
l Hybridomas, Elsevier, NY, 1981; アメリカ特許4,37
6,110; コスボアら：Immunology Today, 4:72, 1983;
コールら: Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:2026,1983; コ
ールら: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss,Inc., pp. 77-96, 1983）を採用すること
によって、調製することが出来る。このような抗体は、
IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及びそれらのサブクラスを含
む、任意のイムノグロブリンのクラスから選択すること
が出来る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マは、イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれで培養さ
れてもよい。イン・ビボで高い力価のモノクローナル抗
体を産生する能力は、本発明が優れた産生方法と認識さ
れる所以である。

【００２１】抗体は、例えば診断的検定の部分として生
物学的試料中の抗原の存在を検出するために使用するこ
とが出来る、また、他の治療的方法による医療的処置効
果の評価のために使用することも出来る。

【００２２】また、適当な抗原特異性のマウス抗体分子
からの遺伝子と適当な生物学的活性のヒト抗体分子から
の遺伝子とを一緒にスプライシングすることによる、キ
メラ抗体の産生のために開発された技術（モリソンら:
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851,1984); ノイバーガー
ら: Nature, 312: 604,1984; タケダら: Nature,314:45
2,1984)も使用することが出来る。キメラ抗体は、その
異なった部分が異なった動物種から誘導された分子であ
り、例えばきっ歯類モノクローナル抗体から誘導された
変動領域とヒトイムノグロブリン定常領域を有する分子
がそれである。

【００２３】また、単鎖抗体の調製用技術（アメリカ特
許4,946,778, 4,946,778 および 4,704,692）を適用し
て、特定のペプチド抗原に対する単鎖抗体を産生するこ
とが出来る。単鎖抗体は、Fv領域の重鎖断片と軽鎖断片
を、アミノ酸橋を介して結合させ、単鎖ポリペプチドを
形成せしめることにより、得ることが出来る。

【００２４】特異的エピトープを認識し、結合する抗体
断片は、常套の方法によって生成せしめることが出来
る。そのような断片には、例えば、抗体分子のペプシン
消化によって産生することが出来るF(ab')₂断片や、F(a
b')₂断片のジスルフィド橋を還元することによって産生
することが出来るFab断片などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。

【００２５】II.ワクチン組成物の製造と使用本発明は、本発明のポリペプチドの少なくとも１つと、
要すれば希釈剤としてのリン酸塩緩衝食塩水や重炭酸塩
（例えば0.24M NaHCO₃)のような医薬的に許容され得る
担体を含むワクチン組成物（例えば、非経口的な注射に
よって投与し得るワクチン）を包含するものである。当
該組成物に使用される担体は、投与の形式や経路及び標
準の調剤上の実務に基づいて選択すればよい。適当な医
薬的担体及び希釈剤並びにそれらの使用上の必要性につ
いては、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記載
されている。必要なら、当該組成物にアジュバント、例
えばコレラトキシン、大腸菌熱不安定エンテロトキシン
（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激性複合物(ISCOM)など
から選択したものを配合してもよい。

【００２６】投与されるワクチンの量は、例えばポリペ
プチド中の特定ペプチド抗原、アジュバントが抗原と共
に投与されるか否か、共投与されるアジュバントの種
類、投与の形式や頻度、所望の効果（例えば、防御か処
置か）などを考慮して、当業者により決定される。

【００２７】一般に、本発明の新規ワクチン抗原は、ヒ
ト成人用量として、ポリペプチド１μg〜100mgの範囲で
投与される。アジュバントがワクチンと共に投与される
場合には、ヒト成人当たり１ng〜１mgの量が普通に使用
される。当業者により決定され得ることであるが、投与
は繰り返し行なわれる必要があろう。例えば、初期抗原
投与に続いて、各週の間隔で３回のブースター投与を行
うことが出来る。最初の免疫後、８〜１２週にブースタ
ーショットを行い、更に同じ製剤を用いて、１６〜２０
週に第２のブースターを行うことが出来る。

【００２８】ニューロトキシンに対するワクチンによっ
て誘導された免疫応答を試験するため、個体から血清ま
たはＴ−細胞を採取する。特異的抗原に対する抗体又は
細胞毒性Ｔ細胞の検定方法は、当該技術分野でよく知ら
れているところである。必要なら、追加のブースターを
行ってもよい。ポリペプチドの量、ポリペプチド中のペ
プチド抗原のコピー数、投与の回数などを変化させるこ
とにより、免疫プロトコールを最高の免疫応答が誘導さ
れるように調整することが出来る。

【００２９】上記した組成物をヒトに投与する前に、毒
性や効力を動物で試験することが望ましい。効力試験の
例として、マウス（例えば、スイス−ウェブスターマウ
ス）に、本発明のポリペプチドを含む組成物を経口的ま
たは非経口的経路によりワクチン接種する。ワクチンに
よる最初の接種後又は任意のブースター接種後、当該マ
ウス（及び偽接種(mock vaccination)を行った対照マウ
ス）に対して、感染剤のLD₉₅量を対抗投与した。致死以
外の終点を使用することも出来る。効力は、ワクチンを
接種されたマウスが偽接種マウスよりも低い割合で致死
したならば、有効と認められる。上記試験において、マ
ウスの代わりにウサギを使用してもよい。

【００３０】また、本発明の新規ワクチン組成物は、免
疫刺激性複合物(ISCOM)として使用することも出来る。
抗原輸送担体としてISCOMを使用することにより、トキ
ソプラスマ症やエプシュタイン−バールウイルス起因腫
瘍を含む種々の感染症の実験モデルにおいて、保護的免
疫性が認められている（Mowatら：Immunology Today,1
2: 383-385, 1991）。ISCOM中にカプセル化された１μ
ｇ程度の少量の抗原の投与により、クラスＩ投薬細胞毒
性Ｔ細胞応答を産生することが認められた（タカハシ
ら：Nature, 344: 873-875,1990)。

【００３１】当業者は、上記の開示と以下の記載に基づ
いて、更に格別の努力を払うことなく、本発明を充分に
実施することが出来るものと確信する。以下の実施例
は、単に当業者が発明をどのように実施することが出来
るかを説明するためのものであり、本明細書の残余の部
分をいかなる意味においても制限するものと理解されて
はならない。本明細書に引用された刊行物は、参考又は
参照のために記載されたものである。

【００３２】（実施例）実施例１：ゴナドトロピン放出ホルモンに対する多量体
ワクチンゴナドトロピン放出ホルモン(ＧｎＲＨ)は、視床下部の
アーチ形核により産生されるデカペプチドであり、黄体
形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンの発現を調節し、
次いで、ヒトの性腺発達を調節する。加えて、ＧｎＲＨ
およびそのレセプターの発現増強は、乳癌、卵巣癌、子
宮癌及び前立腺癌を含む種々の腫瘍に関係する。例え
ば、イマイら：Cancer, 74:2555-2561,1994; アイドン
ら：J.Clin.Endocrinol.Metab., 64:425-432,1987; イ
ルマーら：Cancer Res., 55:817-822,1995等参照。従っ
て、ＧｎＲＨに対する抗体は、再生ホルモン活性および
／または癌発生および進行を調節する手段を提供するこ
とが出来る。

【００３３】レセプター結合ドメインに融合したＧｎＲ
Ｈの鎖状体を含む抗原を作成するために、図１-３に概
略した方法を使用した。この方法を、鋳型繰り返しPCR
(TRPCR)と称する。

【００３４】２つのオリゴヌクレオチドをＴＲＰＣＲ用
に設計した(図１)。オリゴＡは標的抗原ＧｎＲＨをコー
ドし、オリゴＢはオリゴＡに相補的であった。オリゴＡ
は、等しい長さの５'側半分のＡ１と３'側半分のＡ２に
分けられ、オリゴＢは、同様に等しい長さの５'側半分
のＢ１と３'側半分のＢ２に分けられる。Ａ１はＢ１に
相補的であり、Ａ２はＢ２に相補的であった。

【００３５】サーマルサイクラー（thermal cycler)を
次の通りプログラムした:変性、９４℃３０秒；アニー
リング、３７℃３０秒；伸長、７２℃３０秒。オリゴＡ
とオリゴＢを用いて、ＰＣＲを３０サイクル行い、その
後、最終伸長を７２℃１０分間行った。このＰＣＲによ
り、図２に示したような、ＧｎＲＨをコードする繰り返
し配列を含むＤＮＡ種が作成された。

【００３６】繰り返しオープンリーディングフレーム
(ＯＲＦ)の端に適当な停止コドンを付加し、ＯＲＦに隣
接して２つの適当な制限酵素部位が位置するように、２
つのアダプタープライマー(アダプターＡとアダプター
Ｂ)を設計した(図３)。この段階(アダプターＰＣＲと呼
称する）に対し、ＰＣＲの鋳型は、上記のとおり産生さ
れたTRPCRの１００倍希釈物であった。サーマルサイク
ラーは、上記と同様にプログラムされたが、変性時間を
３０秒の代わりに１分間とした。産生されたＰＣＲ産物
には、５’末端にＳａｃＩＩ部位、３’末端にＥｃｏＲ
Ｉ部位、ＯＲＦの端に停止コドンが存在した。

【００３７】次いで、ＴＲＰＣＲとアダプターＰＣＲの
産物を、ポリアクリルアミドゲルで調べた。ＴＲＰＣＲ
産物の大多数は、５００〜７００ｂｐの長さであった。
アダプターＰＣＲ後、産物はラダー状態に分布した。最
も小さいバンドにはダイマーのＧｎＲＨＤＮＡリピー
ト（繰り返し）が含まれ、最も移動度の遅いバンドには
より高いオーダーのマルチマーが含まれていた。繰り返
し数は３から少なくとも１２の範囲であった。繰り返し
数１２のＧｎＲＨをコードする配列を含むクローンを、
更なる研究用に選択した。

【００３８】繰り返し数１２のＧｎＲＨをコードするＤ
ＮＡ断片を、プラスミドｐＰＥＤＩにサブクローニング
した。当該プラスミドｐＰＥＤＩは、プラスミドｐＪＨ
１４(ワングら：J.Biol.Chem., 264:2379-2384, 1989)
中のＰＥのドメインＩａをコードする配列をｐＥＴ(Nov
agen)にサブクローニングすることにより作成した。当
該プラスミドｐＰＥＤＩは、トキシンのトキシンレセプ
ター結合ドメインを有するＰＥのドメインＩａを含むポ
リペプチドを発現し、そのＮ末端にはＨｉｓ₆タグを有
する。ＧｎＲＨリピートをＰＥ構造遺伝子の３'末端に
挿入し、ｐＰＥＤＩＧ１２を作成した。この発現プラス
ミドにより産生されたタンパク質をＰＥＩａ-ＧｎＲＨ
１２と名付けた。

【００３９】ｐＰＥＤＩＧ１２をＢＬ２１(ＤＥ３)ｌｙ
ｓＳに形質転換した。形質転換体を３７℃でアンピシリ
ン(５０μｇ／ｍｌ)、クロラムフェニコール(２５μｇ
／ｍｌ)およびテトラサイクリン(１０μｇ／ｍｌ)を含
むＬＢ培地中で培養した。培地のＡ₆₀₀が０．２に到達
したとき、ＩＰＴＧを培養培地に添加し、最終濃度０．
１ｍＭとした。細胞を更に９０分間培養した後、回収し
た。ＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２は封入体の形で過剰発現す
るので、回収した細胞を６Ｍ尿素で抽出した。

【００４０】次いで、その抽出物をNovagen ｐＥＴＨ
ｉｓ-Ｔａｇシステムを用いて精製した。ＰＥＩａ-Ｇｎ
ＲＨ１２を含む画分を集め、５０ｍＭの酢酸アンモニウ
ム(ｐＨ４．０)で透析した。ＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２
は、４℃で保存すると、少なくとも６ヶ月間安定であっ
た。ニッケル-アガロースアフィニティーカラムクロマ
トグラフィーの後、ＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２を単離し、
ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定すると、９５％の純度であっ
た。

【００４１】この新規免疫原の試験のために、生後６週
間のメスのニュージランドウサギをＰＥＩａ-ＧｎＲＨ
１２で免疫した。ＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２１００μｇお
よびリン酸アルミニウム(ｐＨ７．０)１２５μｇを含む
ボラス０．５ｍｌを、最初の時点(生後６週間)でウサギ
に注射した。最初の免疫から１週間後、同じボラス０．
５ｍｌを２回目の免疫として、ウサギに注射し、その
後、最初の注射から２週間後に同じ注射を行った。３回
目の免疫後、ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティング用に
血清を採取した。マルチマー抗原に対する抗体が、モノ
マーエピトープに指向しているのか、モノマー間の結合
部を橋渡しするエピトープに指向しているのかを試験す
るため、ＧｎＲＨの種々のマルチマーを含む幾つかのＧ
ＳＴ融合タンパク質をＥＬＩＳＡの標的として調製し
た。

【００４２】免疫したウサギ内に産生された抗体は、Ｇ
ＳＴ単独を認識しなかったが、５，０００倍の希釈血清
は、ＧＳＴ融合タンパク質がどのような数のＧｎＲＨリ
ピートを含んでいるかにかかわらず、すべてのＧＳＴ-
ＧｎＲＨ融合タンパク質を同程度で認識した。この結果
は、免疫原に応答して生産された抗体のほとんどが、鎖
状体形成により作られたハイブリッドエピトープより
も、モノマーＧｎＲＨエピトープを認識したことを示唆
するものである。

【００４３】ＧＳＴ-ＧｎＲＨ１およびＧＳＴ-ＧｎＲＨ
５はＥＬＩＳＡ標的として特異的に使用された。３回免
疫したウサギの血清を１０，０００倍に希釈したもの
は、ＧＳＴ-ＧｎＲＨ１およびＧＳＴ-ＧｎＲＨ５を同程
度に認識したので、免疫原に対する免疫応答は、ＧｎＲ
Ｈモノマー特異的エピトープに指向されていることが確
認された。

【００４４】新規抗原により誘導された抗体が生理学的
に活性であることを確認するため、免疫したウサギの卵
巣の発達をモニターした。対照として、ウサギをＰＥＩ
ａ-ＴｏｐＮ８(１０アミノ酸のトポイソメラーゼＮ末端
ペプチドの８リピートに融合したＰＥのドメインＩａを
含むペプチド)でも免疫した。ＰＥＩａ-ＴｏｐＮ８で免
疫したウサギは、正常な卵巣発達を示したが、ＰＥＩａ
-ＧｎＲＨ１２で免疫したウサギの卵巣の大きさは、有
意に減少した。従って、産生されたＧｎＲＨ免疫原は、
ＧｎＲＨ関連疾患の処置に有用な自己抗体を誘導する抗
原として有用である。

【００４５】更に新規ＧｎＲＨ免疫原の有用性を確認す
るため、マウスおよびブタをＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２で
免疫した。マウスの免疫化手順は、上記のウサギの免疫
化手順と同じであったが、マウスの場合、各々に対して
注射毎にＰＥＩａ-ＧｎＲＨ１２１０μｇおよびリン酸
アルミニウム(ｐＨ７．０)２５μｇを含むボラス１００
μｌを投与した。また、生後２４日のブタには、ＰＥＩ
ａ-ＧｎＲＨ１２１０ｍｇおよびリン酸アルミニウム
(ｐＨ７．０)２５０μｇを含むボラス１ｍｌを１度に注
射した。ＧｎＲＨ-特異的抗体は、ウサギ同様、マウス
およびブタでも容易に誘導され、抗原は種々の動物にお
いて免疫応答を誘発することが示された。なお、１度の
免疫化が免疫応答の誘発に充分であった。

【００４６】実施例２：ワクシニアウイルスに対するマ
ルチマーワクチンＧｎＲＨペプチド配列の代わりに、ワクシニアウイルス
コートタンパク質ペプチドＬＩＧＩＣＶＡＶＴＶＡＩ
(配列番号2)のリピートを含むＤＮＡ配列を、上記実施
例１に記載のとおりにＰＣＲを用いて構成した。１６リ
ピートのウイルスコートタンパク質ペプチドを含むＰＥ
融合タンパク質を、実施例１の方法に従って産生し、精
製した。

【００４７】生後６週間のウサギに、ウイルス性ペプチ
ドリピート抗原１００μｇと完全フロイントアジュバン
ト１００μｇを含むボラス１ｍｌを注射した。４週間
後、抗原１００μｇと不完全フロイントアジュバント１
００μｇを含む、２回目の注射１ｍｌを適用した。最初
の免疫から８週間後、ウサギに抗原１００μｇを含むボ
ラス１ｍｌ(アジュバント含まず)を注射した。ウイルス
性コートタンパク質免疫原により３回免疫したウサギ
は、ワクシニアウイルス特異的抗体を産生した。

【００４８】従って、ＰＥレセプター結合ドメインにペ
プチドリピートを結合させる一般的な方法は、第２のペ
プチドに対しても適用可能であることが証明された。

【００４９】他の実施態様以上、本発明は詳細な説明と共に記載されたが、この記
載は以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の
範囲を説明するためのものであって、限定するものと理
解されてはならない。他の態様、利点および修飾は、す
べて本発明の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のポリペプチドで使用されるGnRHペプチ
ド配列(配列番号1)及びそれ又はその部分をコードする
プライマー配列(オリゴＡ：配列番号4;オリゴＢ：配列
番号5)を示す。

【図２】図１のプライマーを連続的に伸長、変性および
アニーリング（すなわちＰＣＲ）して、ペプチド配列の
鎖状体をコードする核酸を製造する方法を示す。

【図３】図２の鎖状体核酸の最終的ＰＣＲ増幅による、
鎖状体の末端における停止コドンとクローニングのため
の適当な制限部位の導入を示す。アダプタープライマー
Ａを配列番号6、アダプターＢ配列番号7、EcoRI部位を
含む５’オーバーハング配列を配列番号8、SacII部位を
含む５’オーバーハング配列を配列番号９で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/21 Ａ６１Ｐ 35/00 14/59 Ｃ０７Ｋ 14/07 19/00 14/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 14/59 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 37/43 (72)発明者チア−ツェ・シュ台湾タイナン、シ−カン、ク−ゼ−トウ、ナンバー67、セカンド・フロアー (72)発明者チュン−ジェン・ティン台湾シンチゥ、ドンダ・ロード、セクション２、レイン172、ナンバー29、サード・フロアーＦターム(参考） 4B024 AA01 BA01 BA31 BA32 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 AG15 AG32 CA02 CA19 CC24 CE06 CE08 CE12 DA01 4C084 AA02 AA07 BA17 BA18 CA53 NA14 ZB262 4C085 AA03 AA13 BB08 DD62 FF01 FF20 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 CA01 CA11 DA45 DA83 DA86 EA31 FA74 GA01 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (１)ペプチド配列の少なくとも２コピー
と、(２)レセプター結合ドメインを含むことを特長とす
る、免疫原性を増加する抗原として有用なポリペプチ
ド。
【請求項２】ペプチド配列が有用な免疫応答を与える
抗原を構成するアミノ酸配列であり、レセプター結合ド
メインがＬＤＬ／ａｌｐｈａ₂-ミクログロブリン細胞レ
セプターに特異的に結合するポリペプチド内のアミノ酸
配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】ペプチド配列がゴナドトロピン放出ホル
モンまたはその断片の配列である、請求項２に記載のポ
リペプチド。
【請求項４】ペプチド配列が配列番号1である、請求
項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】ペプチド配列がワクシニアウイルスコー
トタンパク質またはその断片の配列である、請求項２に
記載のポリペプチド。
【請求項６】ペプチド配列が配列番号２である、請求
項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】レセプター結合ドメインがシュウドモナ
ス（Pseudomonos）エキソトキシンのものである請求項
１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】ポリペプチドがペプチド配列の１０〜２
０コピーを含むものである、請求項１〜７のいずれかに
記載のポリペプチド。
【請求項９】ペプチド配列のすべてのコピーが連続し
ている、請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチ
ド。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載のポリ
ペプチドをコードする、核酸。
【請求項１１】請求項１０に記載の核酸を細胞内に導
入し、細胞中でポリペプチドを発現させることを特長と
する、ポリペプチドの製造法。