JP3370672B2 - ウェルシュ菌ワクチン - Google Patents
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- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウェルシュ菌(Clostridium perfringen
s)に対して防御性を示すヒト又は動物の免疫応答を誘
発し(illiciting)得る新規ペプチド、特にこの微生物
のα毒素に対する防御応答を誘発し得る新規ペプチド、
並びにこのペプチドに対して産生される抗体及び抗血清
に関する。好ましい物質によって、ウェルシュ菌を原因
とするヒト及び他の動物の疾病状態の予防及び治療が可
能となる。
s)に対して防御性を示すヒト又は動物の免疫応答を誘
発し(illiciting)得る新規ペプチド、特にこの微生物
のα毒素に対する防御応答を誘発し得る新規ペプチド、
並びにこのペプチドに対して産生される抗体及び抗血清
に関する。好ましい物質によって、ウェルシュ菌を原因
とするヒト及び他の動物の疾病状態の予防及び治療が可
能となる。
ウェルシュ菌(C.perfringens)は環境の至る所に存
在し、土壌の腐敗する有機物質中や、ヒト及び動物の腸
内細菌叢の一部分として検出されている。様々なウェル
シュ菌株は、毒素産生性によって5つの生物型(A−
E)のひとつに限定することができる(McDonel(198
6)Pharmacology of Bacterial Toxins;F Dorner及
びJ Drews(編者)Pergamon Press,Oxford)。A型
株はヒトのガス壊疽の病原菌として特に重要である。こ
の疾病は、年配者及び糖尿病集団、特に組織への血液供
給が悪化して、細菌増殖に適した無酸素状態となり得る
下肢手術患者で重大性が増している。損傷した組織に消
化管内容物が混入して汚染されたため胃腸管手術を受け
た患者でもこの疾病にかかり得る。ガス壊疽発生のより
一時期的な増加は軍事紛争中に見られ、第1次世界大戦
中には、重度の組織創傷部に土の混入した負傷者をすぐ
に治療することができなかったため、数十万人の兵士が
死亡した。
在し、土壌の腐敗する有機物質中や、ヒト及び動物の腸
内細菌叢の一部分として検出されている。様々なウェル
シュ菌株は、毒素産生性によって5つの生物型(A−
E)のひとつに限定することができる(McDonel(198
6)Pharmacology of Bacterial Toxins;F Dorner及
びJ Drews(編者)Pergamon Press,Oxford)。A型
株はヒトのガス壊疽の病原菌として特に重要である。こ
の疾病は、年配者及び糖尿病集団、特に組織への血液供
給が悪化して、細菌増殖に適した無酸素状態となり得る
下肢手術患者で重大性が増している。損傷した組織に消
化管内容物が混入して汚染されたため胃腸管手術を受け
た患者でもこの疾病にかかり得る。ガス壊疽発生のより
一時期的な増加は軍事紛争中に見られ、第1次世界大戦
中には、重度の組織創傷部に土の混入した負傷者をすぐ
に治療することができなかったため、数十万人の兵士が
死亡した。
ガス壊疽発生の原因は主として、細菌による潜在的外
毒素の産生であると考えられ得る。このうち、α毒素が
この疾病の主要原因であるとして注目を集めた。この毒
素は、組織への血液供給を低下させ、感染拡大に必要な
状態を促進することによって、初期の感染病巣の周辺に
作用し得る。
毒素の産生であると考えられ得る。このうち、α毒素が
この疾病の主要原因であるとして注目を集めた。この毒
素は、組織への血液供給を低下させ、感染拡大に必要な
状態を促進することによって、初期の感染病巣の周辺に
作用し得る。
疾病の後期段階では、毒素は全身に作用して死に至ら
しめる。1937年とかなり以前に、未精製のウェルシュ菌
トキソイドワクチンが実験的に誘発されたガス壊疽を防
御することが実証され(Penfold及びTolhurst(1937)M
edical Journal of Australia,pp604)、その後行わ
れた研究は、このワクチンの有効成分がα毒素に由来す
るものであることを示唆していた(Robertson及びKeppi
e(1943),Lancet 2 p311;Boyd等(1972)J.Med.Mic
robil 5,p467;Kameyama(1975)Japanese Journal
of Medicine,Science and Biology 25,p200)。こ
のような進展が見られたにもかかわらず、ヒトに用いら
れるワクチンは開発されず、ガス壊疽に対する現在の治
療は通常、冒された四肢又は組織を除去することからな
る。
しめる。1937年とかなり以前に、未精製のウェルシュ菌
トキソイドワクチンが実験的に誘発されたガス壊疽を防
御することが実証され(Penfold及びTolhurst(1937)M
edical Journal of Australia,pp604)、その後行わ
れた研究は、このワクチンの有効成分がα毒素に由来す
るものであることを示唆していた(Robertson及びKeppi
e(1943),Lancet 2 p311;Boyd等(1972)J.Med.Mic
robil 5,p467;Kameyama(1975)Japanese Journal
of Medicine,Science and Biology 25,p200)。こ
のような進展が見られたにもかかわらず、ヒトに用いら
れるワクチンは開発されず、ガス壊疽に対する現在の治
療は通常、冒された四肢又は組織を除去することからな
る。
ウェルシュ菌は更に、他の疾病、例えばウマ、ウサ
ギ、ウシ、ヒツジ及び家禽の仙痛や腸性毒血症の病原菌
であると同定又は考えられていた。このような動物で使
用されるワクチンは、多数の先行特許出願、例えばUS
42654588、US4292307、GB2030451、SU152943、GB96819
9、GB958575、GB958574及びGB958564に開示されてお
り、全て形式的な(formal)トキソイド又は同等材料に
関するものである。
ギ、ウシ、ヒツジ及び家禽の仙痛や腸性毒血症の病原菌
であると同定又は考えられていた。このような動物で使
用されるワクチンは、多数の先行特許出願、例えばUS
42654588、US4292307、GB2030451、SU152943、GB96819
9、GB958575、GB958574及びGB958564に開示されてお
り、全て形式的な(formal)トキソイド又は同等材料に
関するものである。
本発明者等は以前に、α毒素をコードする遺伝子を単
離したことがあり(Titball等(1989)Infection and
Immunity,Vol 57,p357−376)、またタンパク質の構
造と機能との関係を研究した(Titball及びRubidge 19
90;Titball等(1991)Infection and Immunity,Vol
59,p1872−1874)。これらの研究の一部分として、ある
種の抗体エピトープの位置が確定された(Logan等(199
2)Infection and Immunity,Vol 59,p4338−438
2)。
離したことがあり(Titball等(1989)Infection and
Immunity,Vol 57,p357−376)、またタンパク質の構
造と機能との関係を研究した(Titball及びRubidge 19
90;Titball等(1991)Infection and Immunity,Vol
59,p1872−1874)。これらの研究の一部分として、ある
種の抗体エピトープの位置が確定された(Logan等(199
2)Infection and Immunity,Vol 59,p4338−438
2)。
動物又はヒトに投与してウェルシュ菌α毒素(CPa)
に対する防御的抗体の産生を誘発することにより、ウェ
ルシュ菌への感染、この感染によって生じる病状及び/
又はα毒素自体を予防することを可能とする新規ワクチ
ンを提供することが本発明の目的である。本発明は特
に、比較的安全で、製造の簡単なワクチンを提供するこ
とを目的とする。更に、このようにして産生される抗体
及び抗血清を提供する。これらは、α毒素が微生物の作
用、即ち生存能力のために不可欠となっている病状の全
てではないが、少なくとも幾つかを治療するために使用
することができる。
に対する防御的抗体の産生を誘発することにより、ウェ
ルシュ菌への感染、この感染によって生じる病状及び/
又はα毒素自体を予防することを可能とする新規ワクチ
ンを提供することが本発明の目的である。本発明は特
に、比較的安全で、製造の簡単なワクチンを提供するこ
とを目的とする。更に、このようにして産生される抗体
及び抗血清を提供する。これらは、α毒素が微生物の作
用、即ち生存能力のために不可欠となっている病状の全
てではないが、少なくとも幾つかを治療するために使用
することができる。
本発明の他の目的はCPaに対する抗体の産生を誘発し
得るワクチンペプチド単離物及び複合体を提供すること
であり、これらを、ガス壊疽の病理発生におけるα毒素
の役割を研究するためのツールとして使用してもよい。
このようなワクチンペプチドは他の毒化(toxoided)ウ
ェルシュ菌活性をもたない。これらの目的を達成するた
め、本発明者等は、このようなワクチンで使用され得る
新規ペプチドを能動免疫剤として提供する。
得るワクチンペプチド単離物及び複合体を提供すること
であり、これらを、ガス壊疽の病理発生におけるα毒素
の役割を研究するためのツールとして使用してもよい。
このようなワクチンペプチドは他の毒化(toxoided)ウ
ェルシュ菌活性をもたない。これらの目的を達成するた
め、本発明者等は、このようなワクチンで使用され得る
新規ペプチドを能動免疫剤として提供する。
従って最も広義の実施態様として、本発明は、アミノ
酸261−300由来のウェルシュ菌α毒素のエピトープのア
ミノ酸配列を含んでいるが、ホスホリパーゼC及び/又
はスフィンゴミエリン加水分解活性に必要でα毒素のア
ミノ酸1−240間に見出されるエピトープ/アミノ酸配
列を欠失しているペプチド又はペプチド複合体を提供す
る。前記ペプチドはヒト又は動物に投与すると、α毒素
に対して防御的な免疫応答を誘発し得る。Titball等(1
991)は望ましくない領域を詳細に記述している。
酸261−300由来のウェルシュ菌α毒素のエピトープのア
ミノ酸配列を含んでいるが、ホスホリパーゼC及び/又
はスフィンゴミエリン加水分解活性に必要でα毒素のア
ミノ酸1−240間に見出されるエピトープ/アミノ酸配
列を欠失しているペプチド又はペプチド複合体を提供す
る。前記ペプチドはヒト又は動物に投与すると、α毒素
に対して防御的な免疫応答を誘発し得る。Titball等(1
991)は望ましくない領域を詳細に記述している。
本発明のペプチドは、好ましくはアミノ酸261−アミ
ノ酸370、最も好ましくはアミノ酸247−370由来のウェ
ルシュ菌α毒素のアミノ酸配列を含んでいる。特にウェ
ルシュ菌A型α毒素DNAに由来するペプチドを提供す
る。
ノ酸370、最も好ましくはアミノ酸247−370由来のウェ
ルシュ菌α毒素のアミノ酸配列を含んでいる。特にウェ
ルシュ菌A型α毒素DNAに由来するペプチドを提供す
る。
本発明の最も好ましい形態のペプチドは、ウェルシュ
菌α毒素のアミノ酸配列のアミノ酸247−アミノ酸370だ
けからなるか、又はこのアミノ酸配列をα毒素のアミノ
酸1−アミノ酸246のアミノ酸配列ではない他のアミノ
酸配列と融合したペプチド形態若しくは他の望ましい作
用を有する物質と複合した形態のものからなる。“他の
アミノ酸配列”という用語が使用者のニーズに適するよ
うに完全タンパク質及び比較的短い配列を包含している
ことは当業者には自明であろう。例えば他の免疫又は標
識を行うために前記配列と融合した非ウェルシュ菌抗原
性タンパク質も含まれ得る。
菌α毒素のアミノ酸配列のアミノ酸247−アミノ酸370だ
けからなるか、又はこのアミノ酸配列をα毒素のアミノ
酸1−アミノ酸246のアミノ酸配列ではない他のアミノ
酸配列と融合したペプチド形態若しくは他の望ましい作
用を有する物質と複合した形態のものからなる。“他の
アミノ酸配列”という用語が使用者のニーズに適するよ
うに完全タンパク質及び比較的短い配列を包含している
ことは当業者には自明であろう。例えば他の免疫又は標
識を行うために前記配列と融合した非ウェルシュ菌抗原
性タンパク質も含まれ得る。
他の実施態様として、本発明は、本発明のペプチド又
は結合体を適量含んでいるワクチン組成物を提供する。
これらには必要に応じて、防御を最適化するための他の
物質(例えばアジュバント及び担体)が任意に補充され
る。このような適切な物質の幾つかは、先に引用した特
許に開示されているものである。フロインド不完全又は
完全アジュバントを代表的なアジュバントとして使用し
てもよいが、WO9203164に記載されている他の適切な物
質が当業者には自明であろう。担体機能は単に生理食塩
水溶液によって満たされ得る。
は結合体を適量含んでいるワクチン組成物を提供する。
これらには必要に応じて、防御を最適化するための他の
物質(例えばアジュバント及び担体)が任意に補充され
る。このような適切な物質の幾つかは、先に引用した特
許に開示されているものである。フロインド不完全又は
完全アジュバントを代表的なアジュバントとして使用し
てもよいが、WO9203164に記載されている他の適切な物
質が当業者には自明であろう。担体機能は単に生理食塩
水溶液によって満たされ得る。
本発明者等は、N末端(アミノ酸1−249=Cpa249)
ドメインもC末端(アミノ酸250−370)ドメインも単独
では致死作用を有し得ないことを確定した。ホスホリパ
ーゼ活性がN末端ドメインに完全に存在することが判明
した一方で、C末端ドメインの配列に公知のスフィンゴ
ミエリナーゼ関連エピトープが欠落していることが判明
しており、これらの知見に照らしてみれば、上記のこと
は驚くべきことである。本発明者らが更に実験を行った
結果、これらのN末端ドメインエピトープに対する抗体
が毒素作用を中和させ得るという事実にもかかわらず、
N末端ドメインが単独では防御応答を誘発し得ないこと
が判明した。従って、比較的不活性なC末端ドメインが
防御応答を誘発し得るが、比較的活性なN末端はそうで
はないという発見が全く驚くべき結果であることは容易
に見てとれよう。
ドメインもC末端(アミノ酸250−370)ドメインも単独
では致死作用を有し得ないことを確定した。ホスホリパ
ーゼ活性がN末端ドメインに完全に存在することが判明
した一方で、C末端ドメインの配列に公知のスフィンゴ
ミエリナーゼ関連エピトープが欠落していることが判明
しており、これらの知見に照らしてみれば、上記のこと
は驚くべきことである。本発明者らが更に実験を行った
結果、これらのN末端ドメインエピトープに対する抗体
が毒素作用を中和させ得るという事実にもかかわらず、
N末端ドメインが単独では防御応答を誘発し得ないこと
が判明した。従って、比較的不活性なC末端ドメインが
防御応答を誘発し得るが、比較的活性なN末端はそうで
はないという発見が全く驚くべき結果であることは容易
に見てとれよう。
本発明者等によって以前にマッピングされたC末端エ
ピトープの位置は、α毒素アミノ酸配列中ほぼ273−275
及び295−297の位置に相当することが判明した。これら
のエピトープの位置又は種類は、機能的活性を保持して
いるならば単離物から僅かに変化してもよく、従ってこ
のような変化は本発明の範囲に包含され、防御応答は保
持されると考えるべきである。
ピトープの位置は、α毒素アミノ酸配列中ほぼ273−275
及び295−297の位置に相当することが判明した。これら
のエピトープの位置又は種類は、機能的活性を保持して
いるならば単離物から僅かに変化してもよく、従ってこ
のような変化は本発明の範囲に包含され、防御応答は保
持されると考えるべきである。
C末端ドメイン内のある配列が必要な免疫原活性の提
供にあたって他のものよりも遥かに効果的であることは
前述した内容から当業者には自明であろう。これは、防
御作用が通常、当該エピトープの配向におけるペプチド
の三次構造に幾分左右されるからである。これは、N末
端ドメインを保持する活性エピトープがそれだけでは致
命的ではないことからも明白であり、このことは、これ
らのエピトープを正しく配向するのにC末端も必要であ
ることを示している。本明細書に記載した情報から考え
て、当業者が必要な活性について本発明の様々な配列を
スクリーニングすることができ、また標準的な遺伝子工
学技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応及び遺伝子クロー
ニング)を用いて望ましくないホスホリパーゼやスフィ
ンゴミエリン分解活性の欠落した様々な配列が容易に提
供され得ることも明白である。これらの“望ましくな
い”領域は、本発明者等が論文に詳細に記述している
(Shuttleworth等(1988)“Epitope mapping of Cl
ostridium perfringens alphatoxin"F J Fehrenba
ch等(編者)bacterial Protein Toxins,Gustav Fis
cher Verlag,Stuttgart,p65−66;Titball等(1989)In
fection and Immunity,Vol 57,p357−376;Titball等
(1991)Infection and Immunity,Vol 59,5,p1872
−1874;Logan等(1991)Infection and Immunity,Vol
59,12,p4338−4382)。
供にあたって他のものよりも遥かに効果的であることは
前述した内容から当業者には自明であろう。これは、防
御作用が通常、当該エピトープの配向におけるペプチド
の三次構造に幾分左右されるからである。これは、N末
端ドメインを保持する活性エピトープがそれだけでは致
命的ではないことからも明白であり、このことは、これ
らのエピトープを正しく配向するのにC末端も必要であ
ることを示している。本明細書に記載した情報から考え
て、当業者が必要な活性について本発明の様々な配列を
スクリーニングすることができ、また標準的な遺伝子工
学技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応及び遺伝子クロー
ニング)を用いて望ましくないホスホリパーゼやスフィ
ンゴミエリン分解活性の欠落した様々な配列が容易に提
供され得ることも明白である。これらの“望ましくな
い”領域は、本発明者等が論文に詳細に記述している
(Shuttleworth等(1988)“Epitope mapping of Cl
ostridium perfringens alphatoxin"F J Fehrenba
ch等(編者)bacterial Protein Toxins,Gustav Fis
cher Verlag,Stuttgart,p65−66;Titball等(1989)In
fection and Immunity,Vol 57,p357−376;Titball等
(1991)Infection and Immunity,Vol 59,5,p1872
−1874;Logan等(1991)Infection and Immunity,Vol
59,12,p4338−4382)。
本発明の他の態様として、ペプチドの発現が達成され
得るように本発明のペプチドをコードする組換えDNA、
このようなDNAを含むプラスミド、及びこれらのプラス
ミド又は組換えDNA自体を含んでいる細胞系を提供す
る。このような組換えDNAは、二本鎖配列の各一方の末
端にターゲットされるプライマーを用いて、所望の配列
(例えばCpa247-370又はCpa261-370)をコードするDNA
をPCR増幅することによって好都合に提供される。ある
いは、より多量の天然(native)α毒素をコードするDN
Aに対し適切な制限酵素を使用してもよい。誘導されたD
NAを適切なベクターに連結し、場合によっては続いて所
望の融合ペプチドの残りの部分を含む配列を連結して、
ベクターを適切な宿主細胞(例えば大腸菌)内に挿入す
る。望ましいペプチドを発現する細胞系は、公知の方法
(例えばペプチド、α毒素又はGSTのような複合ペプチ
ドに対する抗体を用いるウエスタンブロッティング)で
選択され得る。
得るように本発明のペプチドをコードする組換えDNA、
このようなDNAを含むプラスミド、及びこれらのプラス
ミド又は組換えDNA自体を含んでいる細胞系を提供す
る。このような組換えDNAは、二本鎖配列の各一方の末
端にターゲットされるプライマーを用いて、所望の配列
(例えばCpa247-370又はCpa261-370)をコードするDNA
をPCR増幅することによって好都合に提供される。ある
いは、より多量の天然(native)α毒素をコードするDN
Aに対し適切な制限酵素を使用してもよい。誘導されたD
NAを適切なベクターに連結し、場合によっては続いて所
望の融合ペプチドの残りの部分を含む配列を連結して、
ベクターを適切な宿主細胞(例えば大腸菌)内に挿入す
る。望ましいペプチドを発現する細胞系は、公知の方法
(例えばペプチド、α毒素又はGSTのような複合ペプチ
ドに対する抗体を用いるウエスタンブロッティング)で
選択され得る。
ある種の融合ペプチドを選択すると、開裂して1回精
製した後にα毒素関連ペプチドを産生し得る比較的大き
な画分が得られるため、ペプチドの単離が容易となり得
ることに注目すべきである。
製した後にα毒素関連ペプチドを産生し得る比較的大き
な画分が得られるため、ペプチドの単離が容易となり得
ることに注目すべきである。
本発明の他の態様として、本発明は、本発明のペプチ
ドに対して産生される抗血清及びこれに由来する抗体を
提供する。更には、本発明は、本発明のペプチドに対す
るモノクローナル抗体及びこれを産生するためのハイブ
リドーマ細胞を提供する。
ドに対して産生される抗血清及びこれに由来する抗体を
提供する。更には、本発明は、本発明のペプチドに対す
るモノクローナル抗体及びこれを産生するためのハイブ
リドーマ細胞を提供する。
本発明の抗血清は、宿主動物(例えばマウス、ブタ又
はウサギ)に本発明のペプチドを注射し、次いで抗体産
生に適した期間(例えば14日〜28日)が経過した後にこ
の動物から血清を単離することによって容易に調製され
る。適切な公知の方法を用いて、例えば本発明の固定化
ペプチド又はこのペプチドと複合したペプチド(例えば
GST)を抗体保持のために用いるアフィニティークロマ
トグラフィーで動物の血液又はその血清から抗体を単離
してもよい。同様に、本発明のペプチドに対する抗体を
発現するハイブリドーマ細胞系を産生する公知の手順を
用いると、モノクローナル抗体が容易に産生され得る。
例えば本発明のペプチドに対する抗体に由来するマウス
モノクローナル抗体軽鎖をヒト抗体重鎖と共に組み込む
他の公知の手順を用いて前述のモノクローナル抗体をヒ
トに適応させてもよい。
はウサギ)に本発明のペプチドを注射し、次いで抗体産
生に適した期間(例えば14日〜28日)が経過した後にこ
の動物から血清を単離することによって容易に調製され
る。適切な公知の方法を用いて、例えば本発明の固定化
ペプチド又はこのペプチドと複合したペプチド(例えば
GST)を抗体保持のために用いるアフィニティークロマ
トグラフィーで動物の血液又はその血清から抗体を単離
してもよい。同様に、本発明のペプチドに対する抗体を
発現するハイブリドーマ細胞系を産生する公知の手順を
用いると、モノクローナル抗体が容易に産生され得る。
例えば本発明のペプチドに対する抗体に由来するマウス
モノクローナル抗体軽鎖をヒト抗体重鎖と共に組み込む
他の公知の手順を用いて前述のモノクローナル抗体をヒ
トに適応させてもよい。
前述の内容を説明するため、本発明のペプチド及びペ
プチドワクチンの図面及び実施例を提供する。これら
は、塩基性C末端ドメインペプチドの効果に関するデー
タを提供するための非制限的な実施例であり、これによ
り当業者は、本発明の範囲内で可能な変形に関して自身
の結論を導き出すことができよう。
プチドワクチンの図面及び実施例を提供する。これら
は、塩基性C末端ドメインペプチドの効果に関するデー
タを提供するための非制限的な実施例であり、これによ
り当業者は、本発明の範囲内で可能な変形に関して自身
の結論を導き出すことができよう。
図面の説明
図1:完全α毒素配列(Cpa1-370)=A;本発明のC末端
ドメインペプチド(Cpa247-370)=B及び本発明の融合
ペプチド(GST−Cpa247-370)=C上にマッピングされ
た主要エピトープの相対位置を示す。番号はエピトープ
の大体の位置を示す。
ドメインペプチド(Cpa247-370)=B及び本発明の融合
ペプチド(GST−Cpa247-370)=C上にマッピングされ
た主要エピトープの相対位置を示す。番号はエピトープ
の大体の位置を示す。
図2:検査ワクチンを最初に(腹腔内に)注射してから
v日後のlog10抗体力価を示す。ブースター注射はプロ
ット地点の印で示す。力価は防御とは無関係である。○
=α毒素;□=GST;△=Cpa247-370;▲=Cpa247-370GS
T。
v日後のlog10抗体力価を示す。ブースター注射はプロ
ット地点の印で示す。力価は防御とは無関係である。○
=α毒素;□=GST;△=Cpa247-370;▲=Cpa247-370GS
T。
配列表:
配列番号1は、ウェルシュ菌α毒素をコードする完全DN
A配列である。これは二本鎖配列の一方の鎖である。
A配列である。これは二本鎖配列の一方の鎖である。
配列番号2は、配列番号1によってコードされるα毒素
のアミノ酸配列である。
のアミノ酸配列である。
配列番号3は、Cpa247-370(本明細書で同定した本発明
の好ましいペプチド)をコードするDNA配列である。
の好ましいペプチド)をコードするDNA配列である。
配列番号4は、Cpa247-370のアミノ酸配列である。
実施例
実施例1:ウェルシュ菌α毒素のC末端(Cpa247-370)ペ
プチド及びその結合体の産生 全ての化学物質は、特に明記しない限りBDH Chemica
l Company又はSigma Chemical Companyから入手し
た。α毒素のC末端ドメイン(アミノ酸247−370=Cpa
247-370)をコードするα毒素遺伝子の断片を大腸菌で
発現させることによりウェルシュ菌α毒素に対するワク
チンペプチドを産生した。
プチド及びその結合体の産生 全ての化学物質は、特に明記しない限りBDH Chemica
l Company又はSigma Chemical Companyから入手し
た。α毒素のC末端ドメイン(アミノ酸247−370=Cpa
247-370)をコードするα毒素遺伝子の断片を大腸菌で
発現させることによりウェルシュ菌α毒素に対するワク
チンペプチドを産生した。
α毒素遺伝子の断片は、Titball等が以前に発表した
α毒素遺伝子配列のヌクレオチド823−1194間の領域を
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増殖させることにより
産生した。ウェルシュ菌NCTC 8237のα毒素遺伝子(Cp
a)のヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド(30マ
ー)を設計し(Titball等(1989)Infect.Immun,57,367
−376参照)、これをBiosystems 392 DNA合成機上に
て、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む5'末端の6個の
付加ヌクレオチド、並びにヌクレオチドテール(GGG A
TG)を取り込んで、遺伝子断片のクローニング及び発現
を容易にするヌクレオチド823で開始する領域と相同のP
CRプライマーと共に合成した。NCTC 8237Cpaをプラス
ミド内でクローン化し(Titball;上掲)、線状化し、PC
Rで鋳型DNA(40ng)として使用した。Cpa247-370をコー
ドするDNA断片を20回の増幅サイクル(LEP Premサーマ
ルサイクラー)後に産物として産生し、アガロースゲル
電気泳動で精製し、Sma I及びHind III消化した。精製
した断片を、Sma I−Hind III消化したpBluescript SK
+(Stratagene)と連結し、大腸菌JM109細胞内で形質
転換した(Hanahan、(1985)DNA cloning;a practic
al approach Vol 1(Glover Ed)pp109−135,IRL
Press,Oxfordの方法参照)。クローン化した断片のヌ
クレオチド配列の真偽を慣用の手法を用いて検証した
(Maniatis等,1989.Molecular cloning:a laboratory
manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s.)。配列分析及びクローニング作業のために組換えプ
ラスミドを産生した(pCTH1)。
α毒素遺伝子配列のヌクレオチド823−1194間の領域を
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増殖させることにより
産生した。ウェルシュ菌NCTC 8237のα毒素遺伝子(Cp
a)のヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド(30マ
ー)を設計し(Titball等(1989)Infect.Immun,57,367
−376参照)、これをBiosystems 392 DNA合成機上に
て、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む5'末端の6個の
付加ヌクレオチド、並びにヌクレオチドテール(GGG A
TG)を取り込んで、遺伝子断片のクローニング及び発現
を容易にするヌクレオチド823で開始する領域と相同のP
CRプライマーと共に合成した。NCTC 8237Cpaをプラス
ミド内でクローン化し(Titball;上掲)、線状化し、PC
Rで鋳型DNA(40ng)として使用した。Cpa247-370をコー
ドするDNA断片を20回の増幅サイクル(LEP Premサーマ
ルサイクラー)後に産物として産生し、アガロースゲル
電気泳動で精製し、Sma I及びHind III消化した。精製
した断片を、Sma I−Hind III消化したpBluescript SK
+(Stratagene)と連結し、大腸菌JM109細胞内で形質
転換した(Hanahan、(1985)DNA cloning;a practic
al approach Vol 1(Glover Ed)pp109−135,IRL
Press,Oxfordの方法参照)。クローン化した断片のヌ
クレオチド配列の真偽を慣用の手法を用いて検証した
(Maniatis等,1989.Molecular cloning:a laboratory
manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s.)。配列分析及びクローニング作業のために組換えプ
ラスミドを産生した(pCTH1)。
Sma I及びHind IIIを用いてCpa247-370をコードする
断片(Sma I−Hind III断片)をpBluescriptクローンか
ら単離し、この断片を精製し、Klenow断片を用いてHind
III部位をブラント末端化し(Sambrook等:Molecular
Cloning、上掲)、この断片を、Sma I消化したpGEX−3X
発現ベクターDNA(LKB−Pharmacia Biotechnology)と
連結することにより発現させた。産生した組換えプラス
ミドは、大腸菌JM109内で形質転換すると、Cpa247-370
を、ベクターコードされたグルタチオン−S−トランス
フェラーゼとの融合タンパク質(=GST−Cpa247-370)
として発現した。PCRを用いて形質転換細胞をスクリー
ニングし、(pB3X13とも呼ばれる)プラスミドpGEX3−1
3を含むコロニーを単離した。次いで、プラスミドの製
造業者がGSTの精製について示している手順に従って、
発現したタンパク質を精製した。
断片(Sma I−Hind III断片)をpBluescriptクローンか
ら単離し、この断片を精製し、Klenow断片を用いてHind
III部位をブラント末端化し(Sambrook等:Molecular
Cloning、上掲)、この断片を、Sma I消化したpGEX−3X
発現ベクターDNA(LKB−Pharmacia Biotechnology)と
連結することにより発現させた。産生した組換えプラス
ミドは、大腸菌JM109内で形質転換すると、Cpa247-370
を、ベクターコードされたグルタチオン−S−トランス
フェラーゼとの融合タンパク質(=GST−Cpa247-370)
として発現した。PCRを用いて形質転換細胞をスクリー
ニングし、(pB3X13とも呼ばれる)プラスミドpGEX3−1
3を含むコロニーを単離した。次いで、プラスミドの製
造業者がGSTの精製について示している手順に従って、
発現したタンパク質を精製した。
細胞をヘルパーバクテリオファージM13K07に同時感染
させてpCTH1を含む細胞から一本鎖DNAを産生し、一本鎖
DNAを精製し、α35S−dCTPを用いるジデオキシ鎖終止法
の配列決定反応に使用し、反応産物を電気泳動で分離
し、オートラジオグラフィーで可視化することによって
ヌクレオチド配列を決定した(前述のSambrook Molecu
lar cloning参照)。GST−Cpa247-370及びCpa247-370
の発現及び精製: 手順1:250mlのErlenmeyerフラスコ内の容量10×100mlの
BHIブロスにプラスミドpGEX3X−13を含む大腸菌を導入
し、150rpmで振盪しながら37℃で培養した。OD600が0.6
に達した培養菌にIPTG(最終濃度1mM)を添加して、tac
プロモーターによる融合タンパク質の発現を誘起した。
更に5時間増殖させた後に細胞を遠心分離によって採取
し、3mlのリン酸緩衝食塩水(PBS.Oxoid)に再度懸濁さ
せ、懸濁液にリゾチーム溶液(80μl、10mg/ml)を添
加し、インキュベート(10分、22℃)した後、30μlの
トリトンX−100を加えた。細胞懸濁液を(−20℃に)
凍結し、解凍し、氷上にて12×30秒間超音波処理した
(Braun超音波処理器、最大出力25mmプローブ)。(10,
000×g、4℃で)遠心分離した後に、上清を、予めPBS
+0.1%トリトンX−100で3度洗浄した2mlのグルタチ
オン−セファロースゲル(Pharmacia)と混合した。混
合物を4℃で18時間撹拌し、クロマトグラフィーのカラ
ムに充填し、カラムを20mlのPBS+0.1%トリトンX−10
0で、次いで5mM還元グルタチオンを含む10mlのトリス緩
衝液(10mM、pHはHClを加えて8.0)で洗浄した。収集し
た画分(2ml)をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(Pharmacia Phast System、10〜15%勾配ゲル)にか
け、クーマシーブルーR250で染色して、融合タンパク質
の存在を分析した。Cpa247-370を産生するため、製造業
者のデータシートに従って、GST−Cpa247-370融合タン
パク質(2mg)を因子X(BCL;30μg)で18時間(22
℃)開裂した。混合物を1mlのグルタチオンセファロー
スミニカラムに加え、カラムを3mlのPBSで溶離した。画
分(1ml)をCpa247-370について前述したように分析し
た。SDS−ポリアクリルアミドゲル分析によって、純粋C
pa247-370が得られたことが判明した。
させてpCTH1を含む細胞から一本鎖DNAを産生し、一本鎖
DNAを精製し、α35S−dCTPを用いるジデオキシ鎖終止法
の配列決定反応に使用し、反応産物を電気泳動で分離
し、オートラジオグラフィーで可視化することによって
ヌクレオチド配列を決定した(前述のSambrook Molecu
lar cloning参照)。GST−Cpa247-370及びCpa247-370
の発現及び精製: 手順1:250mlのErlenmeyerフラスコ内の容量10×100mlの
BHIブロスにプラスミドpGEX3X−13を含む大腸菌を導入
し、150rpmで振盪しながら37℃で培養した。OD600が0.6
に達した培養菌にIPTG(最終濃度1mM)を添加して、tac
プロモーターによる融合タンパク質の発現を誘起した。
更に5時間増殖させた後に細胞を遠心分離によって採取
し、3mlのリン酸緩衝食塩水(PBS.Oxoid)に再度懸濁さ
せ、懸濁液にリゾチーム溶液(80μl、10mg/ml)を添
加し、インキュベート(10分、22℃)した後、30μlの
トリトンX−100を加えた。細胞懸濁液を(−20℃に)
凍結し、解凍し、氷上にて12×30秒間超音波処理した
(Braun超音波処理器、最大出力25mmプローブ)。(10,
000×g、4℃で)遠心分離した後に、上清を、予めPBS
+0.1%トリトンX−100で3度洗浄した2mlのグルタチ
オン−セファロースゲル(Pharmacia)と混合した。混
合物を4℃で18時間撹拌し、クロマトグラフィーのカラ
ムに充填し、カラムを20mlのPBS+0.1%トリトンX−10
0で、次いで5mM還元グルタチオンを含む10mlのトリス緩
衝液(10mM、pHはHClを加えて8.0)で洗浄した。収集し
た画分(2ml)をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(Pharmacia Phast System、10〜15%勾配ゲル)にか
け、クーマシーブルーR250で染色して、融合タンパク質
の存在を分析した。Cpa247-370を産生するため、製造業
者のデータシートに従って、GST−Cpa247-370融合タン
パク質(2mg)を因子X(BCL;30μg)で18時間(22
℃)開裂した。混合物を1mlのグルタチオンセファロー
スミニカラムに加え、カラムを3mlのPBSで溶離した。画
分(1ml)をCpa247-370について前述したように分析し
た。SDS−ポリアクリルアミドゲル分析によって、純粋C
pa247-370が得られたことが判明した。
手順2:各培養菌の光学密度(600nm)が約0.3になるま
で、pGEX3X−13を含む大腸菌を1LのL−ブロス+アンピ
シリン中にて37℃、150rpmで培養した。IPTGを加えて最
終濃度を1mMとし、培養菌を更に4時間増殖させた。細
胞を30mlのPBS+トリトンX100(1%)中に再度懸濁さ
せ、Braun Labsonic超音波処理器を用いて氷上で5×3
0秒間超音波処理することにより全細胞溶解物を調製し
た。遠心分離後に得られた上清をグルタチオン−セファ
ロース(LKB−Pharmacia)のカラムから選択的に溶離さ
せて精製した。Cpa247-370断片だけを単離するため、GS
T−Cpa247-370ペプチド(800μl中に約10mg)を室温に
て一晩因子X(15U)で消化し、グルタチオン−セファ
ロースカラムに通してCpa247-370断片をGSTと分離し
た。
で、pGEX3X−13を含む大腸菌を1LのL−ブロス+アンピ
シリン中にて37℃、150rpmで培養した。IPTGを加えて最
終濃度を1mMとし、培養菌を更に4時間増殖させた。細
胞を30mlのPBS+トリトンX100(1%)中に再度懸濁さ
せ、Braun Labsonic超音波処理器を用いて氷上で5×3
0秒間超音波処理することにより全細胞溶解物を調製し
た。遠心分離後に得られた上清をグルタチオン−セファ
ロース(LKB−Pharmacia)のカラムから選択的に溶離さ
せて精製した。Cpa247-370断片だけを単離するため、GS
T−Cpa247-370ペプチド(800μl中に約10mg)を室温に
て一晩因子X(15U)で消化し、グルタチオン−セファ
ロースカラムに通してCpa247-370断片をGSTと分離し
た。
Cpa247-370の免疫学的特性:
単離精製したCpa247-370のC末端ドメインが、完全α
毒素のこの領域と免疫学的に同様であるかどうかを確定
するために、これを以下で示すように免疫原としてマウ
スで使用し、産生した抗血清を、毒素のC末端ドメイン
の一次アミノ酸配列に由来する重複ペプチドと反応させ
た。結果は、反応性パターンが、全毒素に対する抗血清
をこれらのペプチドと反応させたときに得られるパター
ンとは異ならないことを示しており(Logan等、(199
1)Infect.Immun.59.4338−4342の手法参照)、このこ
とは、新規の有意な逐次的(sequential)抗体結合部位
が産生されなかったこと、また完全毒素のc末端と同一
の正しい折り畳み(folding)及び構造が存在すること
を示唆していた。
毒素のこの領域と免疫学的に同様であるかどうかを確定
するために、これを以下で示すように免疫原としてマウ
スで使用し、産生した抗血清を、毒素のC末端ドメイン
の一次アミノ酸配列に由来する重複ペプチドと反応させ
た。結果は、反応性パターンが、全毒素に対する抗血清
をこれらのペプチドと反応させたときに得られるパター
ンとは異ならないことを示しており(Logan等、(199
1)Infect.Immun.59.4338−4342の手法参照)、このこ
とは、新規の有意な逐次的(sequential)抗体結合部位
が産生されなかったこと、また完全毒素のc末端と同一
の正しい折り畳み(folding)及び構造が存在すること
を示唆していた。
Cpa247-370の生化学的特性:精製Cpa247-370を幾つかの
酵素アッセイで検査して、Cpa247-370が完全毒素とは異
なりこのスフィンゴミエリナーゼ活性を欠失し、またマ
ウス赤血球の溶血を引き起こさないことを確定した。折
り畳みが同一であることが判明したので、この活性のコ
ーディングは存在しないと考えられる。
酵素アッセイで検査して、Cpa247-370が完全毒素とは異
なりこのスフィンゴミエリナーゼ活性を欠失し、またマ
ウス赤血球の溶血を引き起こさないことを確定した。折
り畳みが同一であることが判明したので、この活性のコ
ーディングは存在しないと考えられる。
細胞作用:1.25μg/mlのα毒素はマウスリンパ球に対し
毒性を示し、組織培養容量1ml当たり2.5μgで最大の用
量応答を示したが、Cpa1−249もCpa247-370もこれらの
濃度では無毒であった。Cpa247-370は10μgを何度かマ
ウスに注射しても無毒であったが、α毒素は1μgで24
時間以内に死に至らしめる。しかしながら、Cpa1-249及
びCpa247-370を一緒に使用すると、リンパ球の溶血が生
じ、順次使用すると溶血は生じなかった。B.cereus PC
−PCL1-249及びCpa247-370にはこのような作用はないの
で、2つのCpa切形体(trancates)が相互作用して、酵
素作用を示すと考えられる。
毒性を示し、組織培養容量1ml当たり2.5μgで最大の用
量応答を示したが、Cpa1−249もCpa247-370もこれらの
濃度では無毒であった。Cpa247-370は10μgを何度かマ
ウスに注射しても無毒であったが、α毒素は1μgで24
時間以内に死に至らしめる。しかしながら、Cpa1-249及
びCpa247-370を一緒に使用すると、リンパ球の溶血が生
じ、順次使用すると溶血は生じなかった。B.cereus PC
−PCL1-249及びCpa247-370にはこのような作用はないの
で、2つのCpa切形体(trancates)が相互作用して、酵
素作用を示すと考えられる。
Cpa=α毒素;Cpa247-370=本発明の好ましいペプチド;a
=p−ニトロフェノールホスホリルコリン(pNPPC)加
水分解活性1Uが1nmolの基質の加水分解を触媒した。
=p−ニトロフェノールホスホリルコリン(pNPPC)加
水分解活性1Uが1nmolの基質の加水分解を触媒した。
b=N−ω−トリニトロフェニルラウリルスフィンゴシ
ルホスホリルコリン(TNPAL)加水分解活性1Uが1nmolの
基質の加水分解を触媒した。
ルホスホリルコリン(TNPAL)加水分解活性1Uが1nmolの
基質の加水分解を触媒した。
c=TLCで評価したウシ脳、ウシ赤血球又はニワトリ卵
黄のスフィンゴミエリンの加水分解。
黄のスフィンゴミエリンの加水分解。
d=溶血活性。1溶血単位(Hu)は100μlの5%v/vマ
ウス赤血球懸濁液の50%溶解(lysis)を引き起こす活
性。
ウス赤血球懸濁液の50%溶解(lysis)を引き起こす活
性。
候補ワクチンの毒性:
バリヤー内飼育した6週齢のメスBalb/cマウスで、マ
ウス病原体を保有していないものをCharles River La
boratories,Margate,Kent UKから入手して、これらの
研究で使用した。
ウス病原体を保有していないものをCharles River La
boratories,Margate,Kent UKから入手して、これらの
研究で使用した。
6匹のマウスグループに用量10μgを腹腔内接種して
ワクチン融合ペプチドの毒性を測定した。ワクチンはこ
のような用量では致死を示さず、マウスは接種後2週間
の間に急性毒性の兆候も慢性毒性の兆候も示さなかっ
た。
ワクチン融合ペプチドの毒性を測定した。ワクチンはこ
のような用量では致死を示さず、マウスは接種後2週間
の間に急性毒性の兆候も慢性毒性の兆候も示さなかっ
た。
ワクチンに対する抗体応答:
6匹のマウスグループに候補ワクチンをアジュバント
(不完全フロインドアジュバント−IFA)と共に腹腔内
投与した。α毒素に対する抗体の出現をELISAで監視し
た。Cpa247-370又はGST−Cpa247-370はα毒素に対する
強い抗体応答を誘起し、この応答はブースター接種後増
大した(図2)。Cpa247-370に対するα毒素抗体応答
は、このポリペプチドとグルタチオン−S−トランスフ
ェラーゼとの融合の作用を受けなかった。Cpa249(N末
端ドメイン)、Cpa247-370又はGST−Cpa247-370に対す
る抗体応答の大きさは、未精製ホルムアルデヒドαトキ
ソイド投与時に観察されたのと同様であった。
(不完全フロインドアジュバント−IFA)と共に腹腔内
投与した。α毒素に対する抗体の出現をELISAで監視し
た。Cpa247-370又はGST−Cpa247-370はα毒素に対する
強い抗体応答を誘起し、この応答はブースター接種後増
大した(図2)。Cpa247-370に対するα毒素抗体応答
は、このポリペプチドとグルタチオン−S−トランスフ
ェラーゼとの融合の作用を受けなかった。Cpa249(N末
端ドメイン)、Cpa247-370又はGST−Cpa247-370に対す
る抗体応答の大きさは、未精製ホルムアルデヒドαトキ
ソイド投与時に観察されたのと同様であった。
ワクチンに対して産生された抗体の特性:
Cpa249、Cpa247-370又はGST−Cpa247-370で免疫した
動物に由来する血清がα毒素関連の生物学的活性をin
vitroで中和する能力を調べた。全ての血清が、毒素の
ホスホリパーゼC活性を効果的に阻害した。しかしなが
ら、Cpa247-370又はGST−Cpa247-370に対する抗血清の
みが、毒素の溶血活性を阻害した。
動物に由来する血清がα毒素関連の生物学的活性をin
vitroで中和する能力を調べた。全ての血清が、毒素の
ホスホリパーゼC活性を効果的に阻害した。しかしなが
ら、Cpa247-370又はGST−Cpa247-370に対する抗血清の
みが、毒素の溶血活性を阻害した。
毒素攻撃に対する防御:
ホルモールトキソイド、Cpa249、Cpa247-370、GST−C
pa247-370又はGSTだけで免疫した動物に5μgの精製α
毒素(ほぼ50LD50用量)を腹腔内投与しチャレンジし
た。対照マウス及びGSTで免疫したマウスは24時間以内
に死亡し、Cpa249で免疫した6匹のマウス中4匹が24時
間以内に死亡した。ホルモールトキソイド、Cpa247-370
又はGST−Cpa247-370で免疫したマウスは生存し、中毒
の兆候は示さなかった。
pa247-370又はGSTだけで免疫した動物に5μgの精製α
毒素(ほぼ50LD50用量)を腹腔内投与しチャレンジし
た。対照マウス及びGSTで免疫したマウスは24時間以内
に死亡し、Cpa249で免疫した6匹のマウス中4匹が24時
間以内に死亡した。ホルモールトキソイド、Cpa247-370
又はGST−Cpa247-370で免疫したマウスは生存し、中毒
の兆候は示さなかった。
微生物攻撃に対する防御:
ホルモールトキソイド、Cpa247-370又はGST−Cpa
247-370が実験的なガス壊疽に対しても防御を生起し得
るかどうかを調べるため、これらの候補ワクチンで免疫
した6匹のマウスグループに1010個のウェルシュ菌NCTC
8237生存細胞を筋肉内投与しチャレンジした。免疫し
た動物は全てこの攻撃後生存したが、免疫しなかった対
照動物は6匹中3匹が48時間で死亡した。
247-370が実験的なガス壊疽に対しても防御を生起し得
るかどうかを調べるため、これらの候補ワクチンで免疫
した6匹のマウスグループに1010個のウェルシュ菌NCTC
8237生存細胞を筋肉内投与しチャレンジした。免疫し
た動物は全てこの攻撃後生存したが、免疫しなかった対
照動物は6匹中3匹が48時間で死亡した。
表2:候補ワクチンでの免疫化によって確立したα毒素攻
撃に対する防御。6匹のBalb/Cマウスグループにフロイ
ンド不完全アジュバントと混合した抗原6×10μgを80
日の期間にわたり腹腔内投与した。マウスに10μgの精
製α毒素を腹腔内投与してチャレンジし、24時間以内の
死亡を記録した。
撃に対する防御。6匹のBalb/Cマウスグループにフロイ
ンド不完全アジュバントと混合した抗原6×10μgを80
日の期間にわたり腹腔内投与した。マウスに10μgの精
製α毒素を腹腔内投与してチャレンジし、24時間以内の
死亡を記録した。
結論:この研究によって作製された遺伝子工学的に最も
簡単なワクチンであるCpa247-370は、α毒素のC末端ド
メインに相当する。このタンパク質は、10μgまでの用
量ではマウスに対して無毒であるように思われる。マウ
スにこのタンパク質を繰り返し接種すると、強い抗体応
答が生じて、動物をα毒素及びウェルシュ菌の攻撃から
守る。このワクチンにはホルモールトキソイドに比べて
幾つかの潜在的な利点がある。Cpa247-370は製造が遥か
に簡単である。またホルムアルデヒド、他の毒化ウェル
シュ菌毒素及び一部が毒化した材料を含まないため、元
来ワクチンへの適用に際し安全であり、反応原性(reac
togenic)も低い。
簡単なワクチンであるCpa247-370は、α毒素のC末端ド
メインに相当する。このタンパク質は、10μgまでの用
量ではマウスに対して無毒であるように思われる。マウ
スにこのタンパク質を繰り返し接種すると、強い抗体応
答が生じて、動物をα毒素及びウェルシュ菌の攻撃から
守る。このワクチンにはホルモールトキソイドに比べて
幾つかの潜在的な利点がある。Cpa247-370は製造が遥か
に簡単である。またホルムアルデヒド、他の毒化ウェル
シュ菌毒素及び一部が毒化した材料を含まないため、元
来ワクチンへの適用に際し安全であり、反応原性(reac
togenic)も低い。
比較例:完全螺旋を包含するモデルを用いて、ホスホリ
パーゼ−C中和抗体によって認識されるα毒素の領域
(この領域はCpa193-198)を、この領域を正確に示すの
に必要となり得る追加の領域と共に含む他のワクチン候
補を幾つか調製した。6つの予測螺旋を含むタンパク質
の20.5kDalton(kDa)断片をコードするCpa由来のBamH
I−Hind III断片をcro−β−ガラクトシダーゼ(cro−
β−gal−Cpa99-249)として発現した。3つの予測螺旋
を含む9kDa断片をコードするプラスミド(cro−β−gal
−Cpa179-249)も構築した。全てを精製し、これをSDS
−PAGEで検査した。全てのタンパク質は産生した抗体と
反応して、ホスホリパーゼ−C活性を中和したが、cro
−β−ガラクトシダーゼだけでは中和しなかった。
パーゼ−C中和抗体によって認識されるα毒素の領域
(この領域はCpa193-198)を、この領域を正確に示すの
に必要となり得る追加の領域と共に含む他のワクチン候
補を幾つか調製した。6つの予測螺旋を含むタンパク質
の20.5kDalton(kDa)断片をコードするCpa由来のBamH
I−Hind III断片をcro−β−ガラクトシダーゼ(cro−
β−gal−Cpa99-249)として発現した。3つの予測螺旋
を含む9kDa断片をコードするプラスミド(cro−β−gal
−Cpa179-249)も構築した。全てを精製し、これをSDS
−PAGEで検査した。全てのタンパク質は産生した抗体と
反応して、ホスホリパーゼ−C活性を中和したが、cro
−β−ガラクトシダーゼだけでは中和しなかった。
Cpa99-249もCpa179-249も測定可能な抗毒素力価を生
じなかった。Cpa249はホルモールトキソイドと同様の力
価を示したが、in vitro検査では溶血活性を妨げるこ
とができず、in vivo検査ではα毒素攻撃した動物は全
て死亡した。ホルモールトキソイド及びCpa247-370ペプ
チド族で免疫した動物だけが生存した。109個のウェル
シュ菌生存細胞を100μlの生理食塩水に加えたものを
筋肉内注射したときに非複合ペプチドがGST−複合体よ
りも優れた防御を示したことに注目すべきである。
じなかった。Cpa249はホルモールトキソイドと同様の力
価を示したが、in vitro検査では溶血活性を妨げるこ
とができず、in vivo検査ではα毒素攻撃した動物は全
て死亡した。ホルモールトキソイド及びCpa247-370ペプ
チド族で免疫した動物だけが生存した。109個のウェル
シュ菌生存細胞を100μlの生理食塩水に加えたものを
筋肉内注射したときに非複合ペプチドがGST−複合体よ
りも優れた防御を示したことに注目すべきである。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)氏名:THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE
IN HER BRITANNIC MAJESTY, (B)通り:WHITEHALL (C)市:LONDON (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SWIA 2HB (A)氏名:RICHARD WILLIAM TITBALL (B)通り:CBDE PORTON DOWN (C)市:SALISBURY (D)州:WILTSHIRE (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SP4 OJQ (A)氏名:ETHEL DIANE WILLIAMSON (B)通り:CBDE PORTON DOWN (C)市:SALISBURY (D)州:WILTSHIRE (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SP4 OJQ (ii)発明の名称:ウェルシュ菌ワクチン (iii)配列の数:4 (iv)コンピューターの読取り可能形態: (A)媒体の型:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PCコンパチブル (C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO) (vi)先願データ: (A)出願番号:GB 9210717.6 (B)出願日:1992年5月20日 (vi)先願データ: (A)出願番号:GB 9215655.3 (B)出願日:1992年7月23日 (2)配列番号1の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:1113塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:なし (iv)アンチセンス:なし (v)フラグメント型:C末端 (vi)起源: (A)生物名:ウェルシュ菌 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:1..1110 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:736..1110 (2)配列番号2の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:370アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:タンパク質 (xi)配列番号2の配列: (2)配列番号3の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:375塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:なし (iv)アンチセンス:なし (v)フラグメント型:C末端 (vi)起源: (A)生物名:ウェルシュ菌 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:1..375 (xi)配列番号3の配列: (2)配列番号4の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:124アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:タンパク質 (xi)配列番号4の配列:
IN HER BRITANNIC MAJESTY, (B)通り:WHITEHALL (C)市:LONDON (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SWIA 2HB (A)氏名:RICHARD WILLIAM TITBALL (B)通り:CBDE PORTON DOWN (C)市:SALISBURY (D)州:WILTSHIRE (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SP4 OJQ (A)氏名:ETHEL DIANE WILLIAMSON (B)通り:CBDE PORTON DOWN (C)市:SALISBURY (D)州:WILTSHIRE (E)国:UNITED KINGDOM (F)郵便番号(ZIP):SP4 OJQ (ii)発明の名称:ウェルシュ菌ワクチン (iii)配列の数:4 (iv)コンピューターの読取り可能形態: (A)媒体の型:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PCコンパチブル (C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO) (vi)先願データ: (A)出願番号:GB 9210717.6 (B)出願日:1992年5月20日 (vi)先願データ: (A)出願番号:GB 9215655.3 (B)出願日:1992年7月23日 (2)配列番号1の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:1113塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:なし (iv)アンチセンス:なし (v)フラグメント型:C末端 (vi)起源: (A)生物名:ウェルシュ菌 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:1..1110 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:736..1110 (2)配列番号2の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:370アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:タンパク質 (xi)配列番号2の配列: (2)配列番号3の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:375塩基対 (B)型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(ゲノム) (iii)ハイポセティカル:なし (iv)アンチセンス:なし (v)フラグメント型:C末端 (vi)起源: (A)生物名:ウェルシュ菌 (ix)配列の特徴: (A)名/記号:CDS (B)存在位置:1..375 (xi)配列番号3の配列: (2)配列番号4の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:124アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:タンパク質 (xi)配列番号4の配列:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12P 21/08 C12R 1:145
(C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA
C12R 1:145)
(72)発明者 チトボール,リチヤード・ウイリアム
イギリス国、エス・ピー・4・0・ジエ
イ・キユー、ウイルトシヤイアー、サリ
スベリー、ポートン・ダウン、シー・ビ
イ・デイ・イー(番地なし)
(72)発明者 ウイリアムソン,エーテル・ダイアン
イギリス国、エス・ピー・4・0・ジエ
イ・キユー、ウイルトシヤイアー、サリ
スベリー、ポートン・ダウン、シー・ビ
イ・デイ・イー(番地なし)
(56)参考文献 FEMS Microbiology
Letters,Vol.59(1989)
p.173−176
Infection and Imm
unity,Vol.59,No.12
(1991)p.4338−4342
Infection and Imm
unity,Vol.57 No.2
(1989)p.367−376
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/00
C12P 21/08
BIOSIS(DIALOG)
MEDLINE(STN)
WPI(DIALOG)
SwissProt/PIR/GeneS
eq
Claims (20)
- 【請求項1】配列番号No.2で表されるアミノ酸261−300
のウェルシュ菌(Clostridium perfringens)α毒素の
エピトープのアミノ酸配列を含むが、ホスホリパーゼC
及びスフィンゴミエリン加水分解活性を有するアミノ酸
1−240間に見出される配列を欠いているペプチド又は
複合ペプチドであって、前記ペプチドをヒト又は動物に
投与すると、α毒素に対して感染防御免疫応答を誘発し
得ることを特徴とする前記ペプチド又は複合ペプチド。 - 【請求項2】アミノ酸261−370のウェルシュ菌α毒素の
アミノ酸配列を含む請求項1に記載のペプチド又は複合
ペプチド。 - 【請求項3】アミノ酸247−アミノ酸370のウェルシュ菌
α毒素のアミノ酸配列を含む請求項2に記載のペプチド
又は複合ペプチド。 - 【請求項4】配列番号No.2で表されるウェルシュ菌α毒
素のアミノ酸配列のアミノ酸247−370からなるか、又は
他のアミノ酸配列との融合ペプチド若しくは他の所望の
効果を有する物質と複合したアミノ酸配列からなるペプ
チドであり、但し、他のペプチドとの複合体である場合
は配列番号No.2で表されるα毒素のアミノ酸1−246の
配列との複合体ではない、前記ペプチド。 - 【請求項5】ペプチドが、グルタチオン−S−トランス
フェラーゼのアミノ酸配列を更に含む融合ペプチドであ
る請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチド又は
複合ペプチド。 - 【請求項6】配列番号No.2で表されるアミノ酸261−300
のウェルシュ菌α毒素のアミノ酸配列を含んでいるが、
ホスホリパーゼC及びスフィンゴミエリン加水分解活性
に必要でアミノ酸配列のアミノ酸1−240間に見出され
るエピトープ又は他の配列を欠失しているペプチド又は
複合ペプチドと、医薬的に許容できる担体とを含んでな
るウェルシュ菌α毒素に対するワクチン組成物。 - 【請求項7】請求項2から5のいずれか一項に記載のペ
プチド又は複合ペプチドを含む請求項6に記載のワクチ
ン組成物。 - 【請求項8】更にアジュバントを含む請求項6又は7に
記載のワクチン組成物。 - 【請求項9】アジュバントがフロインド不完全アジュバ
ントである請求項8に記載のワクチン組成物。 - 【請求項10】請求項1から5のいずれか一項に記載の
ペプチドをコードする組換えDNA。 - 【請求項11】請求項1から5のいずれか一項に記載の
ペプチドをコードする単離DNA。 - 【請求項12】請求項1から5のいずれか一項に記載の
ペプチドをコードする組換えDNAを含むプラスミド。 - 【請求項13】プラスミドDNAに連結した請求項11に記
載の単離DNAを含むプラスミド。 - 【請求項14】請求項10から13のいずれか一項に記載の
組換え若しくは単離DNA又はプラスミドを含む細胞系。 - 【請求項15】請求項14に記載の細胞系によって発現さ
れる請求項1から5のいずれか一項に記載のペプチド。 - 【請求項16】医薬的に許容できる担体中に含まれる請
求項1から9のいずれか一項に記載の抗血清又は抗体を
投与することからなる、ウェルシュ菌を媒介とする非ヒ
ト動物の疾病の治療方法。 - 【請求項17】医薬的に許容できる担体中に含まれる請
求項1から5のいずれか一項に記載のペプチド又は複合
ペプチドを投与することからなる、非ヒト動物のウェル
シュ菌感染に対するワクチンを接種する方法。 - 【請求項18】医薬品として使用するための請求項1か
ら5のいずれか一項に記載のペプチド又は複合ペプチ
ド。 - 【請求項19】医薬品として使用するための請求項6か
ら9のいずれか一項に記載のワクチン組成物。 - 【請求項20】ヒトに医薬品として使用するための請求
項18に記載のペプチド又は複合ペプチド。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9210717.6 | 1992-05-20 | ||
GB929210717A GB9210717D0 (en) | 1992-05-20 | 1992-05-20 | Clostrdium perfringens vaccines |
GB929215655A GB9215655D0 (en) | 1992-05-20 | 1992-07-23 | Clostridium perfringens vaccines |
GB9215655.3 | 1992-07-23 | ||
PCT/GB1993/001039 WO1993023543A1 (en) | 1992-05-20 | 1993-05-20 | Clostridium perfringens vaccines |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07506725A JPH07506725A (ja) | 1995-07-27 |
JP3370672B2 true JP3370672B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=26300904
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52002593A Expired - Fee Related JP3370672B2 (ja) | 1992-05-20 | 1993-05-20 | ウェルシュ菌ワクチン |
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EP (1) | EP0642581B1 (ja) |
JP (1) | JP3370672B2 (ja) |
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AU (1) | AU671838B2 (ja) |
CA (1) | CA2136230C (ja) |
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DK (1) | DK0642581T3 (ja) |
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GB (1) | GB2283020B (ja) |
IL (1) | IL105763A (ja) |
MX (1) | MX9302964A (ja) |
NZ (1) | NZ253189A (ja) |
PT (1) | PT642581E (ja) |
WO (1) | WO1993023543A1 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP1765394B1 (en) | 2004-06-04 | 2009-08-05 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES | Methods for preparing immunogenic conjugates |
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WO2009025888A2 (en) | 2007-05-10 | 2009-02-26 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Regulated synthesis of antigen and/or regulated attentuation to enhance vaccine immunogenics and/or safety |
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WO2010045620A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae |
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