JPH09187284A - アデニルシクラーゼ − ヘモリジン(AC−Hly)の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用 - Google Patents

アデニルシクラーゼ − ヘモリジン(AC−Hly)の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用

Info

Publication number
JPH09187284A
JPH09187284A JP8204038A JP20403896A JPH09187284A JP H09187284 A JPH09187284 A JP H09187284A JP 8204038 A JP8204038 A JP 8204038A JP 20403896 A JP20403896 A JP 20403896A JP H09187284 A JPH09187284 A JP H09187284A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
sequence
hly
pertussis
derived
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP8204038A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4302784B2 (ja
Inventor
Fotini Betsou
フォティニ・ベトスー
Peter Sebo
ペーター・セボ
Nicole Guiso
ニコル・ギーソ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur de Lille filed Critical Institut Pasteur de Lille
Publication of JPH09187284A publication Critical patent/JPH09187284A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4302784B2 publication Critical patent/JP4302784B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/235Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82Proteins from microorganisms
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】ボルデテラ属菌による感染に対する防御免疫応
答を誘発することが可能なエピトープを担持する、百日
咳菌、パラ百日咳菌及び/または気管支敗血症菌に由来
するAC−Hlyのアミノ酸配列、これらのエピトープ
に対する抗体、特にモノクローナル抗体及びそのボルデ
テラ菌感染の治療もしくは予防への応用方法の提供。 【解決手段】アデニールサイクラーゼ−溶血素(AC−
Hly)のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸配
列であって、百日咳菌及び/又はパラ百日咳菌及び/又
は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成を
誘発することが可能であり、複数の鎖より選択されるこ
とを特徴とするアミノ酸配列、これを含む免疫組成物及
び医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】この出願は、ボルデテラ属菌由来のアデニ
ールサイクラーゼ−溶血素のエピトープを含むアミノ酸
配列に関する。アデニールサイクラーゼ−溶血素(AC
−Hly)は、ボルデテラ感染症候群に関与する毒素の
1つである。AC−Hlyは、アデニールサイクラーゼ
活性及び溶血素活性を有する二機能性蛋白質である。こ
れは細菌によって分泌される。その構造遺伝子はクロー
ン化され、かつ配列決定されている(Glaser P. et a
l., 1988, Molec. Microb. 2, 19-20 )。この蛋白質
は、“毒素中の繰返し”に対応する“RTX”と名付け
られた毒素群の一員であり、大腸菌(Escherichia col
i)及びActinobacillus pleuropneumoniae に由来する
溶血素並びにPasteurella haemolytica 及びActinobaci
llus actinomycetemcomitansに由来するロイコトキシン
(leucotoxins )との相同性を示すという事実がある。
この蛋白質は、PTX(百日咳毒素)と同様に、マクロ
ファージのような真核細胞内に浸透し、カルモジュリン
で活性化し、大量のcAMPを合成し、かつ細胞の機能
を破壊することが可能である(Coote J. 1992, FEMS Mi
crobiol. Rev. 88: 137-162 )。
【0002】本発明者らは、この配列内において、ボル
デテラ属菌、特には百日咳菌(B. pertussis)及び/又
はパラ百日咳菌(B. parapertussis)及び/又は気管支
敗血症菌(B. bronchiseptica )による感染に対する防
御抗体の形成を誘発する能力を有する様々なドメインを
同定している。
【0003】したがって、本発明が目的とするものに
は、例えば免疫療法に利用可能な免疫組成物又は防御ワ
クチンの組成に組み入れることが可能なアミノ酸配列
が、これらのアミノ酸配列を指向する抗体の他にある。
免疫療法及び血清療法は、特に、百日咳菌、パラ百日咳
菌又は気管支敗血症菌に感染した幼児に適しているとい
う点で小児に利用可能である。本発明は、ヒトの医療又
は獣医学における用途を提示する。
【0004】本発明が目的とするものは、アデニールサ
イクラーゼ−溶血素(AC−Hly)のポリペプチド配
列から誘導されるアミノ酸配列であって、百日咳菌及び
/又はパラ百日咳菌及び/又は気管支敗血症菌による感
染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能であ
り、かつ下記鎖より選択されることを特徴とするアミノ
酸配列である: a)百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配
列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前
記配列に対応する配列の910位、好ましくは913位
と最終C−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸
鎖を含む配列であって、大凡980位から大凡985位
のアミノ酸の間に、好ましくは983位アミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列; b)6ないし500個のアミノ酸を有する鎖を含む配列
であって、百日咳菌由来のAC−Hlyのポリペプチド
配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における
前記配列に対応する配列の385ないし400位のアミ
ノ酸を含む配列; c)前記a)及びb)に定義されるアミノ酸鎖を含む配
列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳
菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するAC−
Hly内で上記a)及びb)に定義される鎖の間に天然
に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるい
はAC−Hlyとは異なる蛋白質から誘導される抗原性
配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百
日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対
応AC−Hlyポリペプチド配列と同等の、もしくは類
似する3次元構造を有する配列。
【0005】“AC−Hlyのポリペプチド配列に由来
するアミノ酸配列”という表現は、本発明の枠内におい
て、それらのアミノ酸が、それらの性質もしくはそれら
の結合の状態の観点からAC−Hlyのポリペプチド配
列に等しいか、あるいはAC−Hlyの免疫学的特性が
保全されるような方式でそれらの幾つかが置換され、欠
失し、もしくは付加されている配列を意味するものと理
解される。特に、AC−Hlyのポリペプチド配列から
誘導される配列は、ボルデテラ属、特には百日咳菌、パ
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に感染した患者において
形成される抗体によって認識される。
【0006】本発明のアミノ酸配列が、患者もしくは動
物の免疫の後に、ボルデテラ感染に対する防御免疫を誘
発することが可能である場合には、AC−Hlyの構造
又は配座が保全され、本発明のアミノ酸配列がAC−H
lyと等価もしくは類似する構造を有することが、本発
明の枠内において考慮される。
【0007】本発明による配列は、ボルデテラ属菌から
精製されるAC−Hlyの蛋白分解により得ることがで
きる。好ましくは、この配列は化学合成又は遺伝子工学
手法により得られる。
【0008】例えば、遺伝子工学により本発明によるア
ミノ酸配列を製造するには、CyaA遺伝子断片を担持
するプラスミドが用いられる。
【0009】例としてではあるが、化学合成はアプライ
ド・バイオシステム(Applied Biosystem )型の自動機
器において行うことができる。また、Betsou F et al.,
1993, Infect. Immun., 61: 3583-3589の技術を用いる
ことも可能である。
【0010】このようにして、百日咳菌に由来するAC
−Hlyの385ないし400位のアミノ酸鎖、もしく
は385ないし500位のアミノ酸鎖にさえ相当するペ
プチド、又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由
来するAC−Hlyの対応鎖に相当するペプチドを調製
することが可能である。百日咳菌に由来するAC−Hl
yのアミノ酸配列は、そのヌクレオチド配列と共に、Gl
aser et al., 1988, Molec. Microb. 2-19-30 に記載さ
れており、図7〜9に示されている。気管支敗血症菌に
由来するAC−Hlyのアミノ酸配列及びヌクレオチド
配列は図10〜13に示されている。
【0011】パラ百日咳菌に由来するAC−Hlyのア
ミノ酸配列及びAC−Hlyをコードするヌクレオチド
配列は、パラ百日咳菌株、例えば、I−1498として
1994年12月2日にCNCMに寄託された第1号
株、からのDNAより通常の技術によって得ることがで
きる。
【0012】本発明によるアミノ酸配列を百日咳菌、パ
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するCyaA遺伝
子のDNAから遺伝子工学により作製し、かつそれが百
日咳菌に由来するAC−Hlyの983位のアミノ酸又
はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来するAC
−Hlyの対応アミノ酸を有する場合には、この配列
を、確実に、前述の株に由来するCyaC遺伝子をも発
現する細胞性ホストにおいて産生させるように注意を払
う。CyaC遺伝子の発現は、残基983を含むアミノ
酸配列の保全に必要な脂肪酸の付加による変性を可能に
する。脂肪酸の付加は、例えば、パルミトイル化であ
る。
【0013】CyaA及びCyaC遺伝子を利用するた
めに用いられる株は、例えば、I−1485として19
94年10月19日にCNCMに寄託された百日咳菌H
AV、パラ百日咳菌I−1498及びI−858として
1989年5月12日にCNCMに寄託された気管支敗
血症菌973Sである。
【0014】さらに、百日咳菌及び気管支敗血症菌に由
来するAC−Hlyをコードするヌクレオチド配列が、
それぞれ、図7〜9及び図10〜13に示されている。
【0015】CyaA遺伝子を活性化するCyaC遺伝
子のヌクレオチド配列は、Barry E.M. らの刊行物(Jou
rnal of Bacteriology, Jan. 1991, p. 720-726)に記
述されている。
【0016】本発明の枠内において有利な配列は、AC
−Hlyの変性領域及び繰返し領域と名付けられた領域
に相当する配列である(図1を参照)。
【0017】AC−Hlyのポリペプチド配列に関して
非相同の抗原性配列が存在する場合には、その配列は細
菌性、ウイルス性もしくは寄生生物性の病原生物に由来
する配列、特に、その配列に対する、例えば防御抗体の
形成が求められる配列であればよい。
【0018】“百日咳菌及び/又は気管支敗血症菌によ
る感染に対する防御抗体”という表現は、これらの細菌
によって誘発される致死及び亜致死感染を防御する抗
体、すなわち、この疾患及び感染を防御する抗体を意味
するものと理解される。
【0019】前述の感染に対する防御抗体の形成を誘発
することが可能な本発明によるアミノ酸配列は、ボルデ
テラ属菌の病原性に関与する因子と関連があり、ホスト
における細菌の存続に対する防御を誘発する能力を有す
るポリペプチド製剤又は細菌抽出物の形態で用いられる
ことが有利である。
【0020】本発明の枠内での有利なアミノ酸配列は、
百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来す
るAC−Hlyの対応ポリペプチド配列と等価の、もし
くは類似する3次元構造を有するポリペプチドの形態に
あり、百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド
配列の大凡900位、特には910位、と大凡最終C−
末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、又はこのア
ミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌
の配列鎖を含むことを特徴とする配列であって、加え
て、この配列が大凡980位のアミノ酸と大凡985位
のアミノ酸との間に、特には983位のアミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列であ
る。
【0021】このアミノ酸配列は、AC−Hlyの変性
領域及び繰返し領域を含む。
【0022】本発明による別の好ましいアミノ酸配列
は、百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配
列の大凡385位のアミノ酸と大凡最終C−末端アミノ
酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパ
ラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形
成されることを特徴とする配列であって、この配列が大
凡980位のアミノ酸と大凡985位のアミノ酸との間
に、特には983位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付
加による変性を受けている配列である。
【0023】また、本発明が目的とするものは、百日咳
菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配列の大凡3
85位のアミノ酸と大凡400位のアミノ酸との間のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成される、前
述の定義の範囲内のアミノ酸でもある。
【0024】このアミノ酸配列は、好都合なことに、百
日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌の型のボルデ
テラ属菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発し得
るエピトープを有している。
【0025】本発明の別の態様によると、アミノ酸配列
は、百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配
列の大凡385位のアミノ酸と大凡500位のアミノ酸
との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ
百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成
されることを特徴とする。
【0026】385位ないし400位又は385位ない
し500位のアミノ酸を有するこの配列は、それがボル
デテラ属菌に由来するAC−Hlyにおいてとる構造と
等価もしくは類似の構造で存在することが有利である。
【0027】また、本発明が目的とするものには、それ
が細菌、特には百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血
症菌から精製された配列であろうと、あるいは組換え蛋
白質r−AC−Hlyから得られた配列であろうと、ボ
ルデテラ属菌に由来するAC−Hlyの配列からポリペ
プチド断片を欠失させることにより得られるアミノ酸配
列でもある。
【0028】このようにして得られるアミノ酸配列は、
図1に示されるΔCla断片の欠失により変性されたA
C−Hly鎖に相当する、ΔClaと呼ばれる配列であ
って、前記ΔCla断片が百日咳菌に由来するAC−H
lyのポリペプチド配列の827位ないし887位のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖に相当する配列であり、
得られる配列が大凡980位のアミノ酸と大凡985位
のアミノ酸の間に、好ましくは983位のアミノ酸のレ
ベルで脂肪酸の付加による変性を受けているものである
ことが有利である。
【0029】本発明によるアミノ酸配列を形成するため
に、別の断片を欠失させることもできる;これは、百日
咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配列の38
5位ないし827位のアミノ酸鎖又はこのアミノ酸に対
応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
相当するポリペプチド断片ΔHであり、得られた配列は
大凡980位のアミノ酸と大凡985位のアミノ酸との
間に、好ましくは983位アミノ酸のレベルで脂肪酸の
付加による変性を受けている。
【0030】また、本発明が目的とするものは、大凡1
000位から1600位のアミノ酸残基の間に、ボルデ
テラ属菌に由来するAC−Hlyの“繰返し領域”を形
成するアミノ酸配列でもある。気管支敗血症菌に由来す
る繰返し領域は、百日咳菌に由来するAC−Hlyと比
較して繰返しが1つ少ない。これに関連して、本発明
は、例えば、百日咳菌に由来するAC−Hlyの155
2位ないし1592位のアミノ酸を含む配列に関する。
【0031】また、本発明は、前述のアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列にも関する。
【0032】気管支敗血症菌に由来するCyaA、Cy
aB及び、部分的に、CyaDを、大腸菌K12XL1
に組込まれたプラスミドpFBD2にクローン化し、I
−1601として1995年6月21日にCNCMに寄
託した。
【0033】このプラスミドpFBD2は、CyaA、
CyaB及び、部分的に、CyaD遺伝子を担持する気
管支敗血症菌由来の8kb断片をBamHI部位に挿入
することにより得られる。
【0034】さらに、本発明が目的とするものは、本発
明による様々な型のボルデテラ属菌に由来する配列を含
むポリペプチド組成物でもある。例えば、有利なポリペ
プチド組成物は、前に定義される百日咳菌由来の配列、
又は他の配列、又はパラ百日咳菌に由来するこれらの配
列の幾つかを含む。
【0035】本発明の別のポリペプチド組成物は、これ
らに加えて、気管支敗血症菌に由来する1以上の配列を
含む。
【0036】本発明の別の態様によると、ポリペプチド
配列は、前に定義されるパラ百日咳菌に由来する1以上
の配列及び気管支敗血症菌に由来する1以上の配列を含
むことを特徴とする。
【0037】また、本発明が目的とするものは、先行頁
に定義される1以上の配列を含むことを特徴とする免疫
組成物でもある。
【0038】ボルデテラ属菌による感染に対する防御、
特にホストにおける細菌の残存に対する防御に有利であ
るために、本発明のアミノ酸配列を含む免疫組成物は、
それに加えて、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支
敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来するv
rg遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の一
部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホスト
に免疫応答を誘発するに十分なだけ含有することを特徴
としてもよい。
【0039】様々なアドヘシン(adhesins)及び毒素に
加えて、ボルデテラ属菌はそれらの毒性に関与する因子
の発現の調節によって特徴付けられる。換言すると、ボ
ルデテラ属菌は相変異及び調節を受ける。
【0040】ボルデテラ属菌は、それらの環境に応じ
て、“無毒性”、すなわち、呼吸器感染のネズミモデル
において致死性、炎症反応及び肺の病変を引き起こすこ
とができなくなり得る。これらは、相調節又は相変異の
いずれかを受ける。相変異は10-3ないし10-6の範囲
の頻度で観察され、実際には可逆的である。これは、前
述の毒素及びアドヘシンの発現の停止と、未だによく特
徴付けられていない他の因子の発現を生じる結果となる
(第I相“毒性”細菌の第IV相“無毒性”細菌への変
化)。第I相及び第IV相細菌は、Lacey B. 1960, J. Hy
g, 58: 57-93に記述されている。表現型の上では相変異
に類似する相調節は完全に可逆的であり、環境変化(培
養培地の組成、温度等)の間のアドヘシン及び毒素の合
成停止を生じる。
【0041】ボルデテラ属において観察される相変異及
び相調節は、2つの調節遺伝子、bvgA及びbvgS
の制御の下にある(Arico B et al., 1989, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 86: 6671-6675 )。
【0042】bvgS遺伝子は外部環境に対して感受性
の蛋白質をコードする。この蛋白質は、リン酸化によ
り、bvgA遺伝子によってコードされる蛋白質の活性
を制御する。このbvgA遺伝子によってコードされる
蛋白質は、一方では、前述の毒性因子をコードする遺伝
子(“vir活性化遺伝子”に対応してvag)の転写
の正活性化因子であり(Uhl M. A. and Miller J, 199
4, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1163-1167)、他
方では、特定遺伝子の転写の抑制因子である(Beattie
D. T. et al., J. of Bacteriology, Jan. 93, p. 159-
527 )。発現が抑制される遺伝子は“vir抑制遺伝
子”に対応してvrgと呼ばれ、未だにほとんど特徴付
けられていない。しかしながら、百日咳菌に由来するv
rg6遺伝子が、ホストにおける細菌の残存に関して役
割があるタンパク質をコードすることが示されている
(Beatties D. et al., 1992, Infect. Imm. 60: 571-5
77)。気管支敗血症菌では、vrg遺伝子によってコー
ドされる2つの蛋白質が特徴付けられている:これら
は、鞭毛型の蛋白質である(第I相気管支敗血症菌は、
鞭毛は合成しないがアドヘシン及び毒素は合成する非運
動性細菌であり、第IV相気管支敗血症菌は鞭毛を合成す
る運動性細菌である)。
【0043】免疫組成物のおける、vrg遺伝子の発現
産生物を含む細菌抽出物の存在は、ワクチン投与した被
検体において感染後に得られる体液性及び/又は細胞性
免疫応答を増強することを可能とし、かつ細菌の残存に
対する防御にも寄与する。
【0044】上で問題にされた、“vrg細菌抽出物”
と名付けられる細菌抽出物は、第IV相細菌、すなわちv
ag遺伝子を発現しない細菌、の外膜の成分をLPS内
毒素を含めて全て含んでいる。しかしながら、この内毒
素は、除去もしくは解毒することが可能である。
【0045】この抽出物は、懸濁液の形で存在してもよ
い。
【0046】本発明の実施に用いられる“vrg”細菌
抽出物は、好ましくは、“尿素抽出物”と呼ばれる抽出
物である。
【0047】“尿素抽出物”は、細菌の表面に発現し、
5M尿素と共にインキュベーションした後に細菌から分
離される蛋白質の混合物を含んでなる。“vrg”尿素
抽出物は、未だ特徴付けられていない幾つかの蛋白質、
鞭毛及びLPSを含有している。
【0048】尿素抽出物を用いることにより、抽出物中
に含まれる蛋白質から得られる純粋な形のワクチンと比
較して安価なワクチンを製造することが可能となる。
【0049】加えて、本発明者らは、用いられた尿素抽
出物がT型細胞免疫応答(リンパ球増殖)を誘発し、し
たがって現在まで用いられている細胞性ワクチンと同様
に振る舞うことを観察している。
【0050】対照的に、排他的な無細胞組成物は、感染
に際してその反応が起こるにもかかわらず、T応答を誘
発することはないと考えられている。
【0051】vrg尿素抽出物は、第IV相細菌から別々
に調製される。適当である場合には、この第IV相細菌
を、細菌がvrg遺伝子によってコードされる蛋白質の
みを発現するようにbvgS遺伝子が変異を受けている
細菌に置き換える。
【0052】これらの抽出物の調製は、実験の部に詳細
に記述されている。
【0053】このように、本発明は、好ましくは、百日
咳菌に由来するvag尿素抽出物及び百日咳菌に由来す
るvrg尿素抽出物の両者を含有する免疫組成物に関す
る。これらの抽出物の調製に適する百日咳菌株は、本発
明の枠内にあり、かつI−1485として1994年1
0月19日にCNCM(パリのCollection Nationale d
e Cultures de Microorganismes )に寄託されているH
AV株である。HAV株は第I相株であるため、vag
尿素抽出物の調製に直接用いることが可能である。
【0054】他方、vrg尿素抽出物は第IV相株から得
られる。この第IV相株は、第I相株から、百日咳菌vr
g遺伝子のみの発現が得られるように、例えば、細菌に
由来するbvgS遺伝子を変異させることにより、ある
いは、硫酸マグネシウムのみを含有する培地中で第I相
株を培養することにより、誘導される。
【0055】同様にして、免疫組成物が投与されるホス
トにおける免疫応答を改善することが適当である場合に
は、後者は、それらに加えて、FHA、AGG類もしく
はPRN及びPTX又はこれらの蛋白質の一部から選択
される、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に
由来する1以上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出
物が投与されるホストにおける免疫応答を誘発するに十
分なだけ含有する。
【0056】AC−Hly毒素から誘導されるアミノ酸
配列及び、適当であるならば、vrg遺伝子によって発
現する蛋白質は、I−1485としてCNCMに寄託さ
れているHAV株から得ることが有利である。
【0057】同様に、本発明の枠内において用いられる
パラ百日咳菌に由来するアミノ酸配列は、I−1498
としてCNCMに寄託されている第1号株から得られ
る。
【0058】さらに、本発明の枠内において用いられる
気管支敗血症菌株に由来するアミノ酸配列は、I−85
8としてCNCMに寄託されている9735株から得る
ことができる。
【0059】様々なボルデテラ属菌株に対して上に与え
られる参照符号は、これらの蛋白質の配列を利用する機
会を与え、適当である場合には、化学合成によりこの配
列を再現し、あるいは、ボルデテラ属菌に由来する蛋白
質の蛋白分解により本発明のアミノ酸配列を得、あるい
は、これらの株のDNAの利用機会を与え、それにより
遺伝子工学手法によって本発明のアミノ酸配列の生成を
可能とするために示されている。
【0060】また、本発明が目的とするものは、活性成
分として上に定義される免疫組成物を、薬学的に許容し
得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に
含有するワクチン組成物でもある。
【0061】また、本発明は、百日咳菌に由来するAC
−Hly、パラ百日咳菌に由来するAC−Hly及び気
管支敗血症菌に由来するAC−Hlyを認識するモノク
ローナル抗体の調製方法であって、 − 動物、例えば、Balb/cマウスを、百日咳菌に
由来するAC−Hlyの385位ないし400位のアミ
ノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合に
は、この免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工
程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを形成する工程、 − このハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で
培養する工程、 − 百日咳菌のAC−Hlyの385位ないし400位
のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、を包含す
る方法に関する。
【0062】上記方法は、免疫に百日咳菌に由来するA
C−Hlyに特異的な抗原を用いることにより、百日咳
菌に由来するAC−Hly並びにパラ百日咳菌及び気管
支敗血症菌に由来するAC−Hlyの両者を認識するモ
ノクローナル抗体を得ることを有利に可能とする。加え
て、このようなモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ
百日咳菌及び/又は気管支敗血症菌型のボルデテラ属菌
によるヒトもしくは動物ホストの感染に関する防御能力
を有利に有している。したがって、上記方法を用いて得
られるモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ百日咳菌
又は気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属菌の1
以上の株に感染した患者又は動物の治療に用いることが
できる。
【0063】一般に、本発明が目的とするものは、百日
咳菌に由来するAC−Hlyの385位ないし400位
のアミノ酸配列を認識することを特徴とするモノクロー
ナル抗体である。
【0064】これに関連して、本発明は、百日咳菌に由
来するAC−Hlyの385−400位アミノ酸配列を
含むエピトープを認識するモノクローナル抗体であっ
て、I−1734として1996年6月19日にCNC
Mに寄託されたハイブリドーマB5−4によって産生さ
れるモノクローナル抗体に関する。
【0065】別の有利なモノクローナル抗体が、百日咳
菌に由来するAC−Hlyの最後の217個のアミノ酸
の配列に対して、I−1733として1996年6月1
9日にCNCMに寄託されたハイブリドーマE17−2
1によって産生される。
【0066】また、本発明が目的とするものは、上述の
あらゆるアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体でも
ある。AC−HlyのC−末端配列に特異的なモノクロ
ーナル抗体は、本発明の有利な抗体のうちの1つであ
る。特別な抗体は、例えば、百日咳菌に由来するAC−
Hlyの最後の217個のアミノ酸、特には百日咳菌に
由来するAC−Hlyの1488位ないし1705位の
アミノ酸又は気管支敗血症菌に由来するAC−Hlyの
1489位ないし1706位のアミノ酸を含む対応鎖か
ら誘導される配列に対するものである。これらのモノク
ローナル抗体は、百日咳菌に由来するAC−Hlyの大
凡385位ないし400位のアミノ酸配列に含まれるエ
ピトープに対して得られるモノクローナル抗体について
上述したものと類似の方法により調製することができ
る。
【0067】本発明の抗体は、例えば、抗体機能のない
ヒト免疫グロブリンの超可変部分を、上述の手法により
得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変領域と
置換することにより、ヒト化することが可能である。
【0068】抗体のヒト化を可能にする手法は、例え
ば、Waldmann T.,June 1991, Science, vol. 252, p.16
57-1662 ;Winter G. et al., 1993, Immunology Toda
y, vol.14, No. 6, p. 243-246;Carter et al., May 1
992, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, vol. 89, p. 4285-4
289;Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immun
ology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2875 に記述されて
いる。
【0069】また、本発明が目的とするものは、動物を
上述の定義に相当するアミノ酸配列で免疫し、免疫に用
いた配列を認識し得る形成抗体を回収することにより得
られるポリクローナル血清でもある。
【0070】適当であるならば、この免疫には、アミノ
酸配列と共に、アジュバントの投与が含まれる。
【0071】本発明の特定の態様によると、免疫は、1
以上のアミノ酸配列及びAC−Hlyの様々な抗原を含
む免疫組成物で行われる。
【0072】また、本発明は、本発明によるモノクロー
ナル抗体を活性成分として含有する医薬組成物にも関す
る。
【0073】これらの抗体、特に、385位ないし40
0位のアミノ酸を含む配列に対する抗体及び/又はAC
−Hly蛋白質のC−末端部分に対する抗体は、百日咳
菌及び/又はパラ百日咳菌及び/又は気管支敗血症菌に
感染したホストに対する免疫療法における医薬品として
用いることができる。
【0074】例えば、I−1734としてCNCMに寄
託されたハイブリドーマB5−4又はI−1733とし
てCNCMに寄託されたハイブリドーマE17−21に
よって産生されるモノクローナル抗体が用いられる。
【0075】本発明による抗体は、採取されたボルデテ
ラ属菌株の分析手段として用いることもできる。したが
って、AC−Hly蛋白質の358位ないし400位の
アミノ酸配列又はC−末端配列に対するモノクローナル
抗体は、百日咳菌株の分析に適している。
【0076】ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ百日
咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方
法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物
からの生物学的流体サンプルを上に定義されるモノクロ
ーナル抗体又は上に定義されるポリクローナル血清と接
触させ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合
には、前記モノクローナルもしくはポリクローナル抗体
とボルデテラ属の細菌との免疫学的反応を検出すること
を特徴とする方法も、本発明の枠内にある。
【0077】ボルデテラ属の細菌、特に百日咳菌、パラ
百日咳菌及び気管支敗血症菌による感染の検出は、被検
サンプルを上述の定義に相当するアミノ酸配列と接触さ
せ、次いで前記アミノ酸配列と被検サンプル中に存在す
る抗体との免疫学的反応を検出することにより、患者も
しくは動物からの生物学的流体サンプルについて行うこ
ともできる。
【0078】また、本発明は、上述のヌクレオチド配列
を活性成分として含有する医薬組成物にも関する。
【0079】医薬組成物におけるヌクレオチド配列の利
用は、Donnellyらによって記述される手法(Nature M馘
ecine, 1995, vol. 1, No. 6, p. 583-587)を参照して
行うことができる。
【0080】
【実施例】
材料及び方法 細菌株、プラスミド及び増殖条件:毒性株百日咳菌18
323(ATCC9797)を、15%脱繊維素ヒツジ
血液を補足したボルデット・ジェンゴウ(Bordet Gengo
u )寒天培地(BG)で、36℃で72時間培養し、再
度24時間培養した。液体培地中での副次培養を、St
ainer−Scholte培地(Stainer D. W. and
Scholte M. J., 1971, J. Gen. Microb., 63: 211-220
)において36℃で20時間、650nmでの光学密
度が1.0(OD620 =1.0)になるまで行った。
【0081】大腸菌内での組換え蛋白質r−AC−Hl
y及びその切詰められた派生物の産生に用いられるプラ
スミドは下記刊行物に記載されている:Betsou F., P.
Seboand N. Guiso, 1993, CyaC−介在活性化は百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけで
はなく防御活性にも重要である(CyaC-mediated activa
tion is important not only for toxic but also for
protective activities of Bordetella pertussis aden
ylate cyclase-haemolysin), Infect. Immun.61: 3583
-3589;Iwaki M., Ullmann A. and P.Sebo, 1995,
“百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素のオリゴマ
ー化:個々に不活性化した変異体の生体外補足からの証
拠”("Oligomerization of the adenylate cyclase to
xin of Bordetella pertussis: Evidence from in vitr
o complementation of individually inactive mutant
s" ). 投稿済み;及びSebo P., P. Glaser, H. Sakamo
to and A. Ullmann, 1991, 再構築大腸菌システムにお
ける百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素の高レベ
ル合成(High level synthesis of adenylate cyclaset
oxin of Bordetella pertussis in a reconstructed Es
cherichia coli system), Gene 104: 19-24 。
【0082】これらのプラスミドは、活性化蛋白質Cy
aCの存在下での様々な蛋白質(図1)の生成を可能と
する。それぞれのプラスミドを有する大腸菌XL−1ブ
ルー株(Stratagene)を、37℃で、100μg/lの
アンピシリンを含有する2×YT培地において、0.5
ないし0.7の光学密度OD600 で培養し、AC−Hl
yを産生させるためにIPTG(1mM)でさらに4時
間誘発した(Betsou F., P. Sebo, and N. Guiso, 199
3, Infect. Immun. 61: 3583-3589)。
【0083】アデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞
毒性活性の試験 アデニレートサイクラーゼ活性は、Ladant D., C. Brez
in, I. Crenon, J. M.Alonso,及びN. Guiso(1987, 百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ:精製、特徴付け及び
ラジオイムノアッセイ(Bordetella pertussis adenyla
te cyclase: purification, characteriation and radi
oimmunoassay), J. Biol. Chem. 261:16264-16269 )
によって記述された手順に従って測定した。1ユニット
(U)のアデニレートサイクラーゼ活性は、30℃、p
H8.0で1分当たりに1ナノモルのcAMPが形成さ
れることに相当する。AC−Hlyの溶血及び細胞毒性
活性は、Bellalou J., H. Sakamoto, D. Ladant, C. Ge
offroy 及び A. Ullmannの記述(1990, 百日咳菌の溶
血及び毒性活性に影響を及ぼす欠失(Deletions affect
ing haemolytic and toxin activities of Bordetella
pertussis adenylate cyclase ), Infect. Immun. 58:
3242-3247)に従い、洗浄したヒツジ赤血球(109
ml)を用いて37℃で決定した。蛋白質濃度は、Brad
fordの方法(蛋白質−染料結合の原理を利用する、マイ
クログラムの蛋白質の迅速かつ高感度の定量方法(A ra
pid and sensitive method for the quantification of
micrograms of protein, utilizing the principle of
protein-dye binding). Anal. Biochem. 72: 248-25
7)によって決定した。
【0084】アデニレートサイクラーゼ阻害の試験 100U/mlの百日咳菌に由来する精製AC−Hly
を、pH7.6の50mMトリス−HClにおいて、
0.2mM CaCl2 及び0.1 NP−40、並び
に100倍に希釈した様々な血清と共に、4℃で18な
いし20時間インキュベートした;インキュベーション
後のサンプルのアデニレートサイクラーゼ活性(IA)
を測定した。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
からの血清と共にインキュベートした後のAC(アデニ
レートサイクラーゼ)活性(CA)を、活性100%
(換言すると阻害0%)の基準として採用した。AC活
性の阻害パーセンテージを以下のように算出した: 阻害%=100%−(100%×IA/CA)
【0085】溶血活性阻害の試験 1ユニット(U)の毒素及び5μlの様々な血清を、1
mlの10mMトリス−HCl、pH8中において、2
mM CaCl2 、150mM NaCl及び1μMウ
シ脳カルモジュリンと混合し、4℃で20分間予備イン
キュベートした。洗浄したヒツジ赤血球(109 )を添
加し、室温で3時間インキュベートした後に残存する溶
血活性を決定した。未溶解の赤血球を2000rpmで
遠心した後にペレットの形で回収し、上清中に放出され
たヘモグロビン(RH)の光学密度を541nmで測定
した。水酸化アルミニウムのみで免疫されたマウスの血
清と共にインキュベートした毒素の溶血活性(CH)
を、活性100%(阻害0%)の基準として採用した。
毒素なしでインキュベートしたヒツジ赤血球を非特異的
溶解についての対照として用いた。溶血活性の阻害パー
センテージを以下のように算出した: 阻害%=100%−(100%×RH/CH)
【0086】細胞毒性活性阻害の試験 1ユニット(U)の毒素及び5μlの様々な血清を、総
容量1mlの10mMトリス−HCl、pH8におい
て、2mM CaCl2 、150mM NaCl、5m
Mグルコース、1mg/ml BSA及び1μMウシ脳
カルモジュリンと共に、4℃で20分間予備インキュベ
ートした。次いで、109 個の洗浄したヒツジ赤血球を
添加し、37℃で30分間インキュベーションを継続し
た。毒素の活性を停止させるため、赤血球懸濁液をpH
5.2の50mM沸騰酢酸ナトリウム1mlに注入し、
100℃で5分間加熱した。溶血した赤血球中に形成さ
れたcAMPの量(IT)を、標準ELISA法(Prad
elles P. Grassi J. Chabardes D., Guiso N. 1989, An
alytical Chemistry, 61: 447-450 )により決定した。
4℃でインキュベートした毒素を細胞毒性の陰性対照と
して用いた。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
の血清と共にインキュベートした毒素の活性(CT)を
活性100%(阻害0%)と想定した。細胞毒性活性の
阻害パーセンテージを以下のように算出した: 阻害%=100%−(100%×IT/CT)
【0087】電気泳動及び免疫ブロッティング法 ファストシステム(PhastSystem )(Pharmacia )用の
8−25%調製済み(ready-for-use )ポリアクリルア
ミドゲルを用いてSDS−PAGE電気泳動を行い、分
離した蛋白質をポリアクリルアミドゲルからハイボンド
・C−スーパー・メンブラン(Amersham)に電気移動
(electrotransferred)させた。ブロックした後、この
膜を、10-3の希釈率で、ポリクローナル血清と共に、
4℃で一晩インキュベートした。セイヨウワサビ・ペル
オキシダーゼ標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン及び
増強化学発光システム(ECL-Amersham)を用いて免疫化
学検出を行った。
【0088】AC−Hlyの生成及び精製 Guiso N., M. Szatanik 及びM. Rocandourt によって記
述される方法(1991,細菌コロニー形成に対するボルデ
テラ属菌アデニレートサイクラーゼの防御活性(Protec
tive activity of Bordetella adenylate cyclase agai
nst bacterialcolonaization ). Microb. Pathog. 11:
423-431 )に従って、百日咳菌由来のAC−Hly、
大腸菌から産生されるr−AC−Hly(組換えAC−
Hly)及び様々な組換え切詰め蛋白質を尿素を用いて
細菌から抽出し、カルモジュリン・アフィニティカラム
で精製した。これらの酵素調製品を、8M尿素中に、5
0mMトリス−HCl、pH8、及び0.2mM Ca
Cl2 と共に−20℃で保存した。全ての調製品を、そ
れらの純度を決定するため、SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分析した。
【0089】能動免疫化 r−AC−Hly及び切詰められた蛋白質の精製調製品
を水酸化アルミニウム(250μg/ml)に60μg
/ml吸着させた。能動免疫化を行うため、3ないし4
週齢のBalb/cマウス(CERJ, St Berthevin, Fran
ce)を、15μgの蛋白質抗原を2週間の間隔をおいて
2回皮下注射することにより処置した。対照には、水酸
化アルミニウムを含むバッファのみを投与した。次い
で、最後の注射の1週間後に、存在する循環抗体を入手
することが可能となるように、これらのマウスから血液
を抜いた。第2の免疫化の2週間後に亜致死呼吸器感染
が達成された。
【0090】マウスの鼻腔内感染 前掲の記載に従って百日咳菌をボルデット・ジェンゴウ
BG培地で48時間培養し、細菌を1%カザミノ酸に再
懸濁した。この細菌懸濁液50μlを鼻腔内注入するこ
とにより亜致死量を投与した。暴露の1時間後(“第0
日”で示される時点)及び第0日後の異なる日(各ステ
ージの間に6匹のマウス)に、頚部脱臼により感染マウ
スを殺した。切除により肺を採取し、組織破砕器を用い
て塩中にホモジナイズした。均質肺調製品の希釈物をB
G培地にサンプリングし、36℃で3日間インキュベー
トした後にコロニー形成単位(cfu)の計数を行っ
た。全ての実験は少なくとも2回行い、一貫性のある結
果を得た。
【0091】免疫血清の調製 感染マウスから血清を得るため、Guiso N. Rocancourt,
M. Szatanik及びJ. M. Alonsoによって記述された手法
(1989, ボルデテラ属菌アデニレートサイクラーゼは毒
性関連因子及び防御抗原である(Bordetella adenylate
cyclase is avirulence associated factor and a pro
tective antigen), Molec. Pathog. 7: 373-380 )に
従い、10匹の雌Balb/cマウス(4週齢)を2×
105 毒性百日咳菌を鼻腔内投与することにより感染さ
せた。感染の14日後又はこれらの14日に続く異なる
指定日に、これらのマウスの血液を抜いた。
【0092】AC−Hlyの切詰められた派生物に対す
るマウスポリクローナル血清を、考慮される抗原の各々
でのマウスへの第2の注入の1週間後に採取した。
【0093】感染患者の血清を、百日咳菌に感染した1
0名の選ばれた非ワクチン投与の小児からのポリクロー
ナル免疫血清を混合することにより調製した。これらの
小児は、彼らの体内に母親の抗体が存在するのを排除す
るために8月齢を越えたものであり、かつ彼らの病歴を
確実なものとするために2歳未満であった。
【0094】結果 r−AC−Hly蛋白質及びその切詰められた変種の免
疫学的特性 百日咳菌からCyaC蛋白質を介して生じるAC−Hl
yの変性はその防御活性に必須のものであることが過去
に示されている(Betsou et al., CyaC−介在活性
化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性
だけではなく防御活性にも重要である, Infect. Immun.
61: 3583-3589) 。したがって、この変性自体がその直
鎖状形態における防御エピトープの形成に寄与するのか
どうか、あるいは、この変性が防御エピトープの表出に
必要な変性である毒素における構造的な変性を誘発する
のかどうかを決定することが重要である。このため、多
数の切詰められた蛋白質の免疫学的特性及び防御特性を
調べた;問題となる切詰められた蛋白質を図1に模式的
に示す。
【0095】これらの蛋白質は、変性部位を有する構築
物のCyaCによる脂肪酸鎖でのアシル化が可能となる
ように、CyaC蛋白質の存在下において、プラスミド
pCACT又はpDIAを用いて、大腸菌内で生成し
た。図2(A)に示されるように、全ての蛋白質から精
製された調製品は、期待される分子量に相当する主要ポ
リペプチドを含んでいた。これらの蛋白質を、様々な血
清によるそれらの認識を確かめるため、ウェスタン・ブ
ロット試験でチェックした。図2(B)に示されるよう
に、r−AC−Hlyに対して生成された血清はr−A
C−Hlyを認識し、r−AC−Hlyから派生した全
ての切詰められた形態の他に、百日咳菌から精製された
AC−Hly蛋白質をも認識した。図2(A)による
と、蛋白質の全長を含む精製ポリペプチド調製品、換言
すると、AC−Hly、r−AC−Hly並びに切詰め
られたポリペプチドΔCla及びΔC217の調製品も
また、精製蛋白質r−AC−Hlyに対して得られたポ
リクローナル血清によって認識される幾つかの断片を有
していた(図2(B))。AC−Hlyのアデニレート
サイクラーゼ・ドメインに対して特異的に調製されたモ
ノクローナル抗体(図2)もまた、AC−Hly、ΔC
la及びΔC217のこれらの断片を認識した。これ
は、これらの断片が、C−末端部分が切詰められ、カル
モジュリン−寒天でAC−Hlyと共に精製されるAC
ドメインを有する蛋白分解断片であることを示してい
る。しかしながら、このモノクローナル抗体は、残基3
85ないし828及び1489ないし1706をそれぞ
れ欠いている蛋白質ΔH又はΔHR2は認識しなかった
が、蛋白質ΔC1307は認識した。特にこれらの観察
を用いて、本発明者らは、385位ないし400位のア
ミノ酸の間に位置する分子領域がエピトープの形成に関
与していることを確証した。
【0096】極めて顕著に、しかも抗−r−AC−Hl
y血清で起こり得ることとは対照的に、感染した小児か
ら得られ、混合物の形態で用いられる血清は、AC−H
lyのACドメインを認識せず(ΔC1307;ライン
7)、AC−Hlyの217末端残基を欠く蛋白質(Δ
C217;ライン6)も、最後の217残基は有するも
のの疎水性領域は欠いている(これは、変性を受けてお
り、AC−Hlyの繰返し領域の主要部分である)蛋白
質(ΔHR2;ライン3)も認識しなかった。しかしな
がら、これらのヒト血清は、百日咳菌に由来するAC−
Hly及びr−AC−Hly(図2(D)、ライン1及
び2)及び変性を受け、AC−Hlyの繰返し領域(最
後の900残基)を有する2つの切詰められた蛋白質
(図2(D)、ライン4及び5)を認識した。百日咳菌
18323(参照株)で感染させ、感染後迅速に(第1
4日)に採取したマウス血清でも同様の認識パターン
(図2(F))が得られた。感染から長期間経過した後
(第35日)に採取された血清は、依然としてACドメ
イン(図2(F)、ライン7)及び最後の217残基の
みを欠く蛋白質ΔC217(図2(F)、ライン6)を
認識しなかったものの、蛋白質ΔHR2(図2(F)、
ライン3)に存在するAC−HlyのC−末端部分を認
識した。これらの結果は、百日咳菌での感染後に合成さ
れる抗−AC−Hly抗体は、AC−Hlyの変性領域
及び繰返し領域を含むC−末端領域(最後の900残
基)に優先的に向けられたものであることを強く示唆し
ている。さらに、AC−Hlyの最後の217残基を欠
く蛋白質ΔC217も、最後の217残基を有するタン
パク質ΔHR2も、免疫及びネズミ血清では認識されな
かった。これは、これらのポリクローナル血清が、AC
−Hlyの繰返し領域の特定の構造であって、2つの非
重複欠失のいずれによっても破棄される構造を認識する
ことを示唆している。
【0097】感染患者又はマウスからの血清が、蛋白質
の全長に亘って伸びるポリペプチド(AC−Hly、r
−AC−Hly、ΔCla及びΔH)のみを認識し、そ
れらの蛋白分解断片を認識しなかったことに注目するこ
とが重要である。これに加えて、これらの血清が、AC
ドメインを含み、それらのC−末端部分で開裂している
蛋白分解生成物を認識しない(上記図2(C)を参照)
ことは、これらの血清によって認識されるためにはAC
−Hlyの変性領域及び繰返し領域(最後の900残
基)が無傷でなければならないことを示している。
【0098】AC−Hlyの切詰められた派生体に対す
る血清によるアデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞
毒性活性の阻害 百日咳菌に感染したマウスからの血清、又は百日咳菌に
感染したヒト患者からの血清、あるいは精製された切詰
め蛋白質で免疫することにより得られる、r−AC−H
lyの様々な切詰め形態に対するポリクローナル抗体
が、毒素の活性の1つを特異的に阻害し得るかどうかを
調べた。これらの実験に先立って対照が必要であったた
め、完全なr−AC−Hlyをこれらの試験の被覆抗原
として用いて、様々な血清のELISA力価を決定し
た。これらの力価は、抗−ΔC1307血清を用いて得
られる力価を除いて類似していた。この抗−ΔC130
7血清は、他の血清と同様にウェスタン・ブロットにお
いてはAC−Hlyを認識したが、ELISAにおいて
はAC−Hlyを認識しなかった。図3に示されるよう
に、アデニレートサイクラーゼ活性は、マウスを精製r
−AC−Hly及び切詰められた派生蛋白質で免疫した
後に得られる血清の全てで阻害された。しかしながら、
感染マウス又は感染ヒト患者からの血清で、同様の条件
下において、AC−HlyのAC活性を阻害したものは
なかった。これは、これらの血清が、AC−HlyのC
−末端部分(最後の900残基)を優先的に指向する
が、ACドメインは指向しない抗体を含むことを示すウ
ェスタン・ブロット分析によって得られた結果(上記参
照)と一致する。実際、蛋白質AC−Hlyの溶血活性
が、感染小児からの血清と、より弱くではあるが、感染
マウスからの血清とによって阻害された。しかしなが
ら、百日咳菌に由来する蛋白質AC−Hly、r−AC
−Hly、ΔH、ΔCla及びΔHR2で免疫すること
により得られる抗血清を用いて、溶血活性の強い阻害が
観察された(図4)。この阻害は、恐らく、AC−Hl
yのC−末端部分に対する特異的抗体の存在によるもの
である。実際、そのような抗体を欠く、AC−Hlyの
ACドメインに対する抗−ΔC1307血清は、AC−
Hlyの溶血活性を阻害しなかった。あらゆる点で有利
な様式において、最後の217残基のみを欠く蛋白質Δ
C217に対する血清は、測定し得るレベルではAC−
Hlyの溶血活性を阻害しなかった。これは、最後の2
17残基が、中和抗体の標的であるか、もしくはAC−
Hlyの別の部分に対する中和抗体の合成に都合の良い
構造の形成に関与しているかのいずれかであることを示
している。総合すると、これらの結果は、さらに加え
て、感染後に合成される抗体は主としてAC−Hlyの
C−末端ヘモリシン部分を指向するものであって、この
蛋白質の溶血活性を中和することは可能であるが、その
N−末端アデニレートサイクラーゼ・ドメインの酵素活
性を中和するものではないことを示している。図5に示
されるように、無傷のAC−Hly及び切詰められた蛋
白質ΔH、ΔCla及びΔHR2に対して得られる血清
で、AC−Hlyの細胞毒性の有意の阻害が観察されて
いる。これらの蛋白質は全て、ACドメイン及び最後の
217残基の両者を有している。また、これらの抗血清
は、AC及び溶血活性をも中和した。反対に、溶血活性
のみ(例えば、感染マウスまたは患者からの血清)又は
AC活性のみ(抗−ΔC1306及び抗−ΔC217血
清)のいずれかを阻害する2種の血清は、AC−Hly
の細胞毒性活性を阻害しなかった。したがって、その細
胞毒性活性を中和するためには、AC−HlyのACド
メイン及び最後の217残基に対する抗体の存在を必要
とする可能性があるように思われる。
【0099】様々な組換えAC−Hly構築物の防御活
性 防御活性を得るために必要なAC−Hlyのエピトープ
を突き止めるために、ネズミ呼吸器モデルを用いて、様
々な精製された切詰め蛋白質の防御活性を試験した。複
数群のマウスを、水酸化アルミニウム単独(対照)、ま
たは水酸化アルミニウムに吸着させた精製切詰め蛋白質
で2回免疫した後、これらのマウスを、鼻腔内経路を介
して、亜致死用量の毒性百日咳菌18323株と接触さ
せた。このモデルは、マウスの呼吸器系における細菌の
吸着、コロニー形成、生存及び増殖の能力を反映する。
図6に示されるように、細菌は感染の6日後に対照マウ
スの肺内で急速に増殖した後、肺から除去され始める。
百日咳菌に由来する蛋白質AC−Hlyまたはr−AC
−Hlyで免疫したマウスの肺においては細菌の増殖は
観察されず、3日後に細菌の数が増加し始めた(図
6)。以前の観察(Betsou F., Sebo and N. Guiso, 19
93, CyaC−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイ
クラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要
である, Infect.Immun. 61: 3583-3589)と一致して、
百日咳菌AC−Hlyの防御効力はr−AC−Hlyよ
りも高かった。r−AC−Hlyによって誘発される防
御に類似する防御が蛋白質ΔClaでも得られた。これ
は、残基827ないし887の蛋白質ΔClaにおける
欠失部分が、防御免疫の誘発に必須ではないことを示唆
している。残基385ないし828が失われている蛋白
質ΔHは、ΔClaよりは弱い防御活性を示す。AC−
Hlyのヘモリシン部分全体を欠く蛋白質ΔC1307
では防御は誘発されなかった。より有利な様式におい
て、AC−Hlyの最後の217残基を欠く蛋白質ΔC
217及び最後の217残基を有するタンパク質ΔHR
2は、防御の誘発を可能にすることができなかった。し
たがって、防御活性は、感染患者もしくは感染マウスか
らの血清による個々の構築物の認識パターンと相関す
る。
【0100】検討 AC−Hlyに対する抗体は、通常、感染小児の血清中
に存在し(ArciniagaJ. L., E. L. Hewlett, F. D. Joh
nson, A. Deforest, S. G. F. Wassilak, I.M. Onorat
o, C. R. Manclark and D. L. Burns, 1991, J. Infec
t. Dis. 163: 135-142;及びGuiso N., E. Grimprel,
I. Anjak and P. B馮u 1993, Eur. J. Clin. Microbio
l. and Infect. Dis. In Press)、AC−Hlyでの免
疫化がボルデテラ属菌によるコロニー形成からマウスを
防御することが過去に示されている(Khelef, N., H. S
akamoto and N. Guiso, 1992, Microb. Pathog. 12: 22
7-235 )。一組の切詰められた形態の組換えAC−Hl
yを生成させることにより、AC−Hlyのワクチン投
与による防御免疫の誘導におけるこの蛋白質の様々なド
メインの重要性の研究を行うことが可能となっている。
上に提示される結果は、百日咳菌に感染した後に合成さ
れる抗−AC−Hly抗体が、主に、AC−Hlyの変
性ドメイン及び繰返しドメイン(約800残基)を指向
することを示している。実際、損なわれていないこれら
の領域を有する切詰められた形態のAC−Hlyのみが
ウェスタン・ブロットにおいて感染マウス及び患者の血
清によって認識され、これらの蛋白質のみがマウスにお
ける防御を誘発する能力を示すものであった。これは、
少なくともマウスの場合において、同一もしくは重複す
るエピトープの比較的限定された組が、感染被験者によ
る抗−AC−Hly抗体の合成の誘発及びAC−Hly
のワクチン投与の後に得られる防御抗体の合成の誘発の
両者に有利であることを示している。従来報告されてい
る実験は、983位リシン残基のレベルでのCyaC遺
伝子発現の産生物による蛋白質の変性部位に対して、末
梢位置にあるAC−Hlyの最後の217残基を除去す
ることで、感染マウス及び患者の血清によるこの蛋白質
(ΔC217)の認識が無効となり、その防御活性もが
無効となったことを示している。しかしながら、これ
は、この蛋白質ΔC217が蛋白質CyaCの存在下に
おいて産生された場合には脂肪酸鎖のレベルでアシル化
されているので、蛋白質ΔC217の変性の欠如による
ものではなかった。さらに、この217残基それ自体
は、それらが変性部位(リシン983)及び繰返し領域
の大部分を欠く蛋白質ΔHR2中に存在する場合には、
血清によって認識されず、いかなる防御活性をも示さな
かった。
【0101】これは、最後の217残基及び変性領域の
両者がAC−Hlyの防御活性に重要であるという結論
に繋がった。このように、AC−Hlyの変性領域と最
後の217残基との相互作用がAC−Hlyの防御エピ
トープの形成または活性に必要である。驚いたことに、
AC−Hlyの最後の217残基を欠く蛋白質ΔC21
7も、変性領域及び繰返しの大部分を欠くが最後の21
7残基は有する蛋白質ΔHR2も、感染患者及び/又は
マウスのポリクローナル血清(新鮮な血清)によっては
認識されなかった。この抗血清は、蛋白質ΔC217及
びΔHR2に存在する繰返し領域の区切りの点(breakp
oint)に位置する単一のエピトープ又はエピトープの小
群に対する狭い特異性を有する可能性がある(1489
位プロリン)。しかしながら、この可能性は、混合ポリ
クローナル抗血清ではそれほど確かであるようには見え
ない。加えて、感染したヒト患者及びマウスの血清は、
様々な蛋白質の完全長ポリペプチドのほとんどを感染し
たが、これらの調製品中に存在する、抗−ACモノクロ
ーナル抗体によっては認識される開裂C−末端蛋白分解
断片は認識しなかった。これらをまとめると、これらの
結果は、AC−Hly上での防御エピトープの形成及び
感染被験者の血清によるAC−Hlyの認識に、AC−
Hlyの変性及び繰返し領域が存在する場合にのみ形成
される特定の構造の存在が必要とされることを示唆して
いる。この構造の形成にAC−Hlyの翻訳後のアシル
化による983位リシン残基での脂肪酸鎖の変性が必要
であり、それがAC−HlyのC−末端部分の除去によ
って無効となる可能性が考えられる。これに関して、A
C−Hlyの溶血及び細胞毒性活性の両者が、非変性分
泌シグナルを含むAC−Hlyの最後の75残基が除去
された場合に失われ、孔(pores )(4及び29)の形
成活性に直接関与しないことは重要である。これらの観
察は、これらに加えて、AC−HlyのC−末端領域の
最後の部分がAC−Hly全体の構造において必要不可
欠な役割を果たしているという仮定を支持する。
【0102】AC−Hlyの主要防御エピトープがAC
部分に位置する可能性があることは既に示唆されている
(Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik and J. M.
Alonso, 1989, Molec. Pathog. 7: 373-380 及びGuiso,
N. M. Szatanik and M. Rocancourt, 1991, Microb. P
athog. 11: 423-431)。ここに提示される結果は、AC
−Hlyの変性及び繰返し領域に亘るAC−Hly断片
の混入が、当該技術分野の従来の状況において記述され
る調製品中に存在するACドメイン断片に関連する防御
活性の生成の要因である可能性を示している。それでも
やはり、少量のこれらの混入の防御活性を生じる能力に
は疑わしいものがある。別の解釈は、特定に条件下にお
いて、385位ないし450位又は500位アミノ酸の
領域もAC−Hlyの防御活性において役割を果たし得
るというものである。AC−Hlyのこの領域の構造
は、最後の217アミノ酸残基の非存在下、又はアシル
化の非存在下において、変性させることが可能である。
40−50kDaのN−末端部分の構造及び免疫系への
呈示は、この構造が開裂している場合、百日咳菌培養上
清におけるAC−Hly分子の残りの部分に関する防御
を誘発することが可能である。この仮定に対する説明の
1つは、385位から400位アミノ酸の間に位置する
分子の一部に対するモノクローナル抗体が防御抗体であ
るというものである。
【0103】また、r−AC−Hlyから得られる切詰
められた蛋白質の生体内における防御活性と、毒性活性
を中和し得る抗体の合成を誘発する生体外におけるその
活性との間に相関が存在するかどうかも調べた。そのよ
うな相関は確立されなかった。防御活性を有する蛋白質
の全てが中和抗体の合成を誘発したが、全く防御しない
蛋白質ΔHR2が強力な中和抗体応答を誘発した。これ
は、AC−Hlyの毒性活性に関する中和抗体の存在
が、百日咳菌の感染に対する防御の誘発の信頼できる基
準ではないことを示唆している。
【0104】疎水性ドメインの一部を欠く蛋白質ΔCl
aが防御活性を示すことに留意することがより重要であ
る。この組換え蛋白質は、残留する細胞毒性活性を示さ
ないため、百日咳に対する無細胞ワクチンに含める含有
物の良い候補である。
【0105】vrg尿素抽出物の調製 同じ3つの第IV相細菌種、すなわち、もはやいかなるv
ag遺伝子をも発現しないがvrg遺伝子は発現する細
菌からvrg尿素抽出物を調製する。これらの遺伝子の
産生物は、気管支敗血症菌の鞭毛を除いて、未だによく
特徴付けられていない。vrg尿素抽出物はvag尿素
抽出物と同様に調製する。
【0106】 培養培地の説明 脱水ボルデット・ジェンゴウ培地 組成: 1リットル 5リットル ボルデット・ジェンゴウ培地 30g 150g グリセロール 10ml 50ml 熱分解水 1リットル 5リットル pHを7.4に調整 −加熱 −120℃で15分間オートクレーブ処理 −4℃で保存 使用時:ボルデット・ジェンゴウを15%ないし20%
ヒツジもしくはウマ血液で富化させる。管を溶融し、5
4℃で溶融状態を維持する。各管に、無菌的な方式で、
2.5mlのヒツジ血液を添加する。管の内容物を無菌
ペトリ皿に注ぐ。 注:鼻咽頭サンプルからの百日咳菌の同定については、
新たな皿を用いる(最大4℃で7日間)。
【0107】CSM寒天培地 10倍濃縮溶液2リットルを調製するため: グルタミン酸水素ナトリウム (参照プロラボ(Prolabo )番号27872.298)...107g L−プロリン (参照メルク(Merck )番号7434)..........2.4g NaCl (参照プロラボ番号27810.295).........25g H2 PO4 (参照プロラボ番号26926.298)..........5g KCl (参照プロラボ番号26759.291)..........2g MgCl2 (参照プロラボ番号25108.295)..........1g トリス−塩基 (参照メルク番号8382.2500).........15.2g カザミノ酸 (参照ディフコ(Difco )番号0288−01−2)......5g CaCl2 の1%熱分解水溶液 (参照プロラボ番号22317.297).........20ml 熱分解水 全量......1リットル これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。
塩酸でpHを7.4に調整する。最終容量まで満たし、
−20℃で保存する。
【0108】−使用時に: −10倍濃縮溶液100ml −熱分解水900ml −(2,6−O−ジメチル)シクロデキストリン、参照
アルドリッチ(Aldrich )番号51166−71−3、
1g −20mlの小分画に分けてガラス管に分配される、バ
クト寒天(Bacto agar)、参照ディフコ番号0140−
01、15g を混合する。
【0109】無菌化し、無菌の補足物を添加する。
【0110】−補足物溶液: −10倍に濃縮された補足物溶液1ml −グルタチオン、参照メルク番号4090、100mg −熱分解水9ml を混合する。
【0111】この溶液を0.22μmミレックス(Mill
ex)フィルターで濾過する。この溶液200μlを培地
20mlを収容する1管に添加する。 ステイナー(Stainer )培養培地 A.基礎培地 10倍濃縮溶液2リットルを調製するため: グルタミン酸水素ナトリウム (参照プロラボ番号27872.298).......204.0g L−プロリン (参照メルク番号7434)...............4.8g NaCl (参照プロラボ番号27810.295)........50.0g H2 PO4 (参照プロラボ番号26926.298)........10.0g KCl (参照プロラボ番号26759.291).........4.0g MgCl2 (参照プロラボ番号25108.295).........2.0g トリス−塩基 (参照メルク番号8382.2500).........30.5g CaCl2 の1%熱分解水溶液 (参照プロラボ番号22317.297).........40ml 熱分解水 全量......2リットル これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。
塩酸を用いてpHを7.6に調整する。最終容量まで満
たし、この濃縮溶液を分配する。これは、−20℃で、
数週間保存することが可能である。
【0112】使用時に、この培地を希釈し、120℃で
15分間無菌化した後、濾過により無菌化した補足物を
添加する。 B.補足物溶液 10倍濃縮溶液200mlを調製するため: − L−システイン (参照プロラボ番号23260.184)..........8g − 濃HCl.......................20ml を溶解する。この調製品に予め溶解した下記混合物を注
ぐ。
【0113】 FeSO4 ・7H2 O (参照プロラボ番号24244.232)...........2g L(+)アスコルビン酸 (参照プロラボ番号20155.237)...........4g ニコチン酸 (参照メルク番号6817)...............0.8g 熱分解水........................120ml 熱分解水で200mlとし、この溶液を1、2、3もし
くは4mlの小分画に分配して−20℃で凍結させる。
【0114】使用時に、この溶液を熱分解水で10倍に
希釈して、希釈補足物: グルタチオン(参照メルク番号4090)....100mg/10ml を添加し、この溶液を濾過(単一使用0.22μmミレ
ックスフィルター)により無菌化して、無菌溶液1ml
を無菌基礎培地100mlに添加する。2.1.2.v
rg尿素抽出物の調製 − 細菌懸濁液を、5000gで30分間、4℃で遠心
する。
【0115】− 細菌ペレットを、この細菌ペレットの
湿潤重量の5倍に等しい容量でPBSバッファ中に調製
された5M尿素(先に記述されている)に再懸濁する。
【0116】− 4℃で1時間攪拌したままにした後、
40,000gで40分間、4℃で遠心する。
【0117】− 使用時まで、上清を−80℃で保存す
る。 2.1.3.vrg尿素抽出物の不活性化 − G25カラムを通過させることによって尿素を除去
した後、300μg/mlの蛋白質濃縮物が得られるよ
うにvrg尿素抽出物をPBSで希釈する。
【0118】− 0.05%の最終濃度が得られるよう
な容量の2.5%グルタルアルデヒドを滴下により添加
する。
【0119】− 規則的に攪拌しながら室温で2時間放
置する。
【0120】− ライシンを添加することにより反応を
停止させる(最終濃度0.02M)。
【0121】− 室温で2時間後、PBS中に調製した
水酸化アルミニウム(1mg/ml)に、4℃で一晩、
攪拌しながら、尿素抽出物を吸着させる。これにより、
10ないし20μg/注射の量での動物の免疫化のため
のワクチンの準備が整う(先に記述されている)。
【図面の簡単な説明】
【図1】使用される、AC−Hlyの切詰められた蛋白
質の模式図。プラスミドの構造及び対応する切詰められ
た蛋白質の生成は、以前の刊行物であるSebo P. et a
l., 1991, Gene, 104: 19-24及びSebo P. et al., 199
3, Mol. Microb. 9: 999-1009に記述されている。“M
r”欄の数字は、それらの推定アミノ酸配列から算出さ
れる毒素の相対分子量を示す。プラスミドの名称におい
て記号Δに続く数字は、cyaAの読取り枠から欠失し
た部分の最初と最後のアミノ酸の番号である。記号ΔC
に続く数字は失われたC−末端残基を表す。cyaA対
立遺伝子は、プラスミドpCACT3に存在するものと
同様に、lacZ遺伝子の転写及び翻訳の開始シグナル
の制御の下にcyaC遺伝子と同時発現する(Betsou
F. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589)。
ΔC1307は、適合プラスミドpPS4Cを介して発
現するcyaC遺伝子の存在下において、pDIA52
40(pACTΔC1307)から生成した(Betsou
F. et al., 1993, Infect.Immun. 61: 3583-3589及びSe
bo P. et al., 1991, Gene, 104: 19-24)。
【図2】百日咳菌及びr−AC−Hly蛋白質の特徴付
け。200ngの精製百日咳菌及びr−AC−Hlyを
8−25%SDS−PAGEゲルで電気泳動し、蛋白質
をクーマシー・ブルーで染色し(A)、あるいは、ハイ
ボンド・C−スーパー・メンブラン(HYBOND C-Super m
embrane )に移して、ワクチン接種22日後の20匹の
マウスからの混合抗−r−AC−Hly血清(B)、又
は百日咳菌に由来するAC−Hlyに特異的なモノクロ
ーナル抗体(C)、又は感染した小児(培養によって確
認された感染)からの血清混合物(D)、又は百日咳菌
18323に感染したマウスから感染の2週間後に採取
した血清(E)、又は百日咳菌に感染したマウスから感
染の2ヶ月後に採取した血清(F)と共にインキュベー
トした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を
用いて免疫検出を行った。ライン1:百日咳菌AC−H
ly;ライン2:r−AC−Hly;ライン3:ΔHR
2;ライン4:ΔH;ライン5:ΔCla;ライン6:
ΔC217;ライン7:ΔC1307;数字は分子量マ
ーカーを示す。
【図3】様々なマウスにおいて得られるr−AC−Hl
y断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、アデニレートサイクラーゼ活
性の阻害を示す。:AC−Hlyを材料及び方法の部に
記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線
は標準偏差(n=4)を示す。
【図4】様々なマウスにおいて得られるr−AC−Hl
y断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、百日咳菌に由来するAC−H
lyの溶血活性の阻害を示す。:AC−Hlyを材料及
び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベー
トした。横線は標準偏差(n=4)を示す。
【図5】様々なマウスにおいて得られるr−AC−Hl
y断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、細胞毒性活性の阻害を示
す。:AC−Hlyを材料及び方法の部に記載される様
々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差
(n=4)を示す。
【図6】r−AC−Hly及びその切詰められた蛋白質
の防御活性。3ないし4週齢のマウスを、水酸化アルミ
ニウムに吸着させた15μgのr−AC−Hly(△−
△)、ΔCla(黒三角−黒三角)、ΔC1307(黒
丸−黒丸)、もしくはΔHR2([]−[])、ΔC2
17(黒四角−黒四角)、ΔH(□−□)又は百日咳菌
AC−Hly(○−○)で、あるいは対照としての水酸
化アルミニウムのみを含有するバッファ(□−[])
で、2週間の間隔で2回免疫した。これらを、2週間後
に、鼻腔内経路により105 CFUの百日咳菌1832
3に感染させる。曲線は、ポイント毎の6匹のマウスに
ついての標準幾何偏差(横線)を示す。
【図7】百日咳菌に由来するAC−Hlyをコードする
遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
【図8】図7に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列の続き。
【図9】図7に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列の続き。
【図10】気管支敗血症菌に由来するAC−Hlyをコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ
酸配列。
【図11】図10に示すアミノ酸配列の続き。
【図12】図10に示すアミノ酸配列の続き。
【図13】図10に示すアミノ酸配列の続き。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成8年11月27日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図2
【補正方法】変更
【補正内容】
【図2】百日咳菌及びr−AC−Hly蛋白質の電気泳
動を表す写真。200ngの精製百日咳菌及びr−AC
−Hlyを8−25%SDS−PAGEゲルで電気泳動
し、蛋白質をクーマシー・ブルーで染色し(A)、ある
いは、ハイボンド・C−スーパー・メンブラン(HYB
OND C−Super membrane)に移し
て、ワクチン接種22日後の20匹のマウスからの混合
抗−r−AC−Hly血清(B)、又は百日咳菌に由来
するAC−Hlyに特異的なモノクローナル抗体
(C)、又は感染した小児(培養によって確認された感
染)からの血清混合物(D)、又は百日咳菌18323
に感染したマウスから感染の2週間後に採取した血清
(E)、又は百日咳菌に感染したマウスから感染の2ヶ
月後に採取した血清(F)と共にインキュベートした。
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を用いて免
疫検出を行った。ライン1:百日咳菌AC−Hly;ラ
イン2:r−AC−Hly;ライン3:ΔHR2;ライ
ン4:ΔH;ライン5:ΔCla;ライン6:ΔC21
7;ライン7:ΔC1307;数字は分子量マーカーを
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07H 21/04 C07H 21/04 B C07K 14/235 C07K 14/235 16/12 16/12 C12N 5/10 C12P 21/02 C 15/02 21/08 C12P 21/02 G01N 33/569 B 21/08 33/577 B G01N 33/569 C12N 5/00 B 33/577 9282−4B 15/00 C //(C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 ニコル・ギーソ フランス国、75013 パリ、ブールバー ル・サンマルセル 13

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 アデニールサイクラーゼ−溶血素(AC
    −Hly)のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸
    配列であって、百日咳菌及び/又はパラ百日咳菌及び/
    又は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成
    を誘発することが可能であり、かつ下記鎖より選択され
    ることを特徴とするアミノ酸配列: a)百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリペプチド配
    列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前
    記配列に対応する配列の910位、好ましくは913位
    と最終C−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸
    鎖を含む配列であって、大凡980位から大凡985位
    のアミノ酸の間に、好ましくは983位アミノ酸のレベ
    ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列; b)6ないし500個のアミノ酸を有する鎖を含む配列
    であって、百日咳菌由来のAC−Hlyのポリペプチド
    配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における
    前記配列に対応する配列の385ないし400位のアミ
    ノ酸を含む配列; c)前記a)及びb)に定義されるアミノ酸鎖を含む配
    列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳
    菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するAC−
    Hly内で上記a)及びb)に定義される鎖の間に天然
    に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるい
    はAC−Hlyとは異なる蛋白質から誘導される抗原性
    配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百
    日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対
    応AC−Hlyポリペプチド配列と同等の、もしくは類
    似する3次元構造を有する配列。
  2. 【請求項2】 百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗
    血症菌に由来するAC−Hlyの対応ポリペプチド配列
    と等価の、もしくは類似する3次元構造を有するポリペ
    プチドの形態にあり、百日咳菌に由来するAC−Hly
    のポリペプチド配列の大凡900位、特には910位、
    と最終C−末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、
    又は該アミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支
    敗血症菌の配列鎖を含むことを特徴とする請求項1記載
    のアミノ酸配列であって、加えて、該配列が大凡980
    位のアミノ酸と大凡985位のアミノ酸との間に、特に
    は983位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による
    変性を受けているアミノ酸配列。
  3. 【請求項3】 百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリ
    ペプチド配列の大凡385位のアミノ酸と大凡最終C−
    末端アミノ酸との間のアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対
    応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
    よって形成されることを特徴とする請求項1記載のアミ
    ノ酸配列であって、該配列が大凡980位のアミノ酸と
    大凡985位のアミノ酸との間に、特には983位のア
    ミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による変性を受けてい
    るアミノ酸配列。
  4. 【請求項4】 百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリ
    ペプチド配列の大凡385位のアミノ酸と大凡400位
    のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対応
    するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によ
    って形成されることを特徴とする請求項1記載のアミノ
    酸配列。
  5. 【請求項5】 百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリ
    ペプチド配列の大凡385位のアミノ酸と大凡500位
    のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対
    応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
    よって形成されることを特徴とする請求項1記載のアミ
    ノ酸配列。
  6. 【請求項6】 百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリ
    ペプチド配列の827位ないし887位のアミノ酸鎖、
    又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管
    支敗血症菌の配列鎖に相当する、ΔClaと呼ばれるポ
    リペプチド断片の欠失により変性されたAC−Hlyの
    ポリペプチド配列であることを特徴とする請求項1記載
    のアミノ酸配列であって、得られる配列が大凡980位
    のアミノ酸と大凡985位のアミノ酸の間に、好ましく
    は983位のアミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変
    性を受けているアミノ酸配列。
  7. 【請求項7】 百日咳菌に由来するAC−Hlyのポリ
    ペプチド配列の385位ないし827位のアミノ酸鎖又
    はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支
    敗血症菌の配列鎖に相当する、ΔHと呼ばれるポリペプ
    チド断片の欠失により変性されたAC−Hlyのポリペ
    プチド配列であることを特徴とする請求項1記載のアミ
    ノ酸配列であって、得られた配列が大凡980位のアミ
    ノ酸と大凡985位のアミノ酸との間に、好ましくは9
    83位アミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変性を受
    けているアミノ酸配列。
  8. 【請求項8】 脂肪酸の付加による変性がパルミトイル
    化であることを特長とする請求項1ないし7のいずれか
    1項に記載のアミノ酸配列。
  9. 【請求項9】 百日咳菌に由来する請求項1ないし8の
    いずれか1項に記載の配列、及びパラ百日咳菌に由来す
    る請求項1ないし8のいずれか1項に記載の配列を含有
    することを特徴とするポリペプチド組成物。
  10. 【請求項10】 気管支敗血症菌に由来する請求項1な
    いし8のいずれか1項に記載の配列をさらに含有するこ
    とを特徴とする請求項3記載のポリペプチド組成物。
  11. 【請求項11】 パラ百日咳菌に由来する請求項1ない
    し8のいずれか1項に記載の配列及び気管支敗血症菌に
    由来する請求項1ないし8のいずれか1項に記載の配列
    を含有することを特徴とするポリペプチド組成物。
  12. 【請求項12】 請求項1ないし7のいずれか1項に記
    載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
  13. 【請求項13】 請求項1ないし11のいずれか1項に
    記載の配列の1以上を含有することを特徴とする免疫組
    成物。
  14. 【請求項14】 百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管
    支敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来する
    vrg遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の
    一部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホス
    トに免疫応答を誘発するに十分なだけさらに含有するこ
    とを特徴とする請求項13記載の免疫組成物。
  15. 【請求項15】 FHA、AGG類もしくはPRN及び
    PTX又はこれらの蛋白質の一部から選択される、百日
    咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する1以
    上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出物が投与され
    るホストにおける免疫応答を誘発するに十分なだけさら
    に含有することを特徴とする請求項14記載の免疫組成
    物。
  16. 【請求項16】 AC−Hly毒素から誘導されるアミ
    ノ酸配列及び、適当であるならば、vrg遺伝子によっ
    て発現する蛋白質が得られる百日咳菌の株が、I−14
    85としてCNCMに寄託されているHAV株であるこ
    とを特徴とする請求項13ないし15のいずれか1項に
    記載の免疫組成物。
  17. 【請求項17】 AC−Hly毒素から誘導されるアミ
    ノ酸配列及びvrg遺伝子によって発現する蛋白質が得
    られるパラ百日咳菌の株が、I−1498としてCNC
    Mに寄託されている第1号株であることを特徴とする請
    求項13ないし15のいずれか1項に記載の免疫組成物
  18. 【請求項18】 AC−Hly毒素から誘導されるアミ
    ノ酸配列及びvrg遺伝子によって発現する蛋白質が得
    られる気管支敗血症菌の株が、I−858としてCNC
    Mに寄託されている9735株であることを特徴とする
    請求項13ないし15のいずれか1項に記載の免疫組成
  19. 【請求項19】 活性成分として請求項13ないし18
    のいずれか1項に記載の免疫組成物を、薬学的に許容し
    得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に
    含有することを特長とするワクチン組成物。
  20. 【請求項20】 − アジュバントと組合せて、あるい
    は他の方法でアジュバントを用いて、請求項1ないし7
    のいずれか1項に記載のアミノ酸配列の1以上で動物を
    免疫する工程、 − 免疫に用いられたアミノ酸配列を認識することが可
    能な、形成された抗体を回収する工程、によって得られ
    るポリクローナル血清。
  21. 【請求項21】 動物の免疫が、請求項1ないし7のい
    ずれか1項に記載のアミノ酸配列の1以上及びAC−H
    lyから定義される抗原を含有する免疫組成物を用いて
    行なわれることを特長とする請求項20記載のポリクロ
    ーナル血清。
  22. 【請求項22】 百日咳菌に由来するAC−Hly、パ
    ラ百日咳菌に由来するAC−Hly及び気管支敗血症菌
    に由来するAC−Hlyを認識するモノクローナル抗体
    の製造方法であって、 − 動物、例えば、Balb/cマウスを、百日咳菌に
    由来するAC−Hlyの385位ないし400位のアミ
    ノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合に
    は、該免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工
    程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
    ハイブリドーマを形成する工程、 − 該ハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培
    養する工程、 − 百日咳菌に由来するAC−Hlyの385位ないし
    400位のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、
    を包含する方法。
  23. 【請求項23】 請求項22に記載の方法を用いて得ら
    れるモノクローナル抗体。
  24. 【請求項24】 百日咳菌に由来するAC−Hlyの3
    85位ないし400位のアミノ酸配列を認識することを
    特徴とするモノクローナル抗体。
  25. 【請求項25】 百日咳菌に由来するAC−Hlyの最
    後の217個のアミノ酸の配列、特には百日咳菌に由来
    するAC−Hlyの1488位ないし1705位のアミ
    ノ酸配列又は気管支敗血症菌に由来するAC−Hlyの
    1489位ないし1706位のアミノ酸配列に対するモ
    ノクローナル抗体。
  26. 【請求項26】 I−1734としてCNCMに寄託さ
    れているハイブリドーマB5−4又はI−1733とし
    てCNCMに寄託されているハイブリドーマE17−2
    1によって産生される、請求項24又は25に記載のモ
    ノクローナル抗体。
  27. 【請求項27】 請求項1ないし7のいずれか1項に記
    載のアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体。
  28. 【請求項28】 百日咳菌及び/又はパラ百日咳菌及び
    /又は気管支敗血症菌に由来するAC−Hlyを認識す
    るモノクローナル抗体の製造方法であって、 − 動物、例えば、Balb/cマウスを、請求項1な
    いし9のいずれか1項に記載のアミノ酸配列で免疫する
    工程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
    ハイブリドーマを形成する工程、 − 該ハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培
    養する工程、 − 免疫に用いられたアミノ酸配列に対する抗体を回収
    する工程、を包含する方法。
  29. 【請求項29】 活性成分として、請求項22ないし2
    7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含有す
    ることを特徴とする医薬組成物。
  30. 【請求項30】 百日咳菌及び/又はパラ百日咳菌及び
    /又は気管支敗血症菌に感染したホストの免疫療法にお
    いて医薬生成物として用いられる、請求項22ないし2
    7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
  31. 【請求項31】 百日咳菌及び/又はパラ百日咳菌及び
    /又は気管支敗血症菌に感染したホストの免疫療法にお
    いて医薬生成物として用いられる、請求項20又は21
    に記載のポリクローナル血清。
  32. 【請求項32】 I−1734としてCNCMに寄託さ
    れるハイブリドーマB5−4又はI−1733としてC
    NCMに寄託されるハイブリドーマE17−21である
    ことを特徴とするハイブリドーマ。
  33. 【請求項33】 ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ
    百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出す
    る方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は
    動物からの生物学的流体サンプルを請求項23ないし2
    7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は請求
    項20又は21に記載のポリクローナル血清と接触さ
    せ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合に、
    該モノクローナルもしくはポリクローナル抗体とボルデ
    テラ属の細菌との免疫学的反応を検出することを特徴と
    する方法。
  34. 【請求項34】 ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ
    百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出す
    る方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は
    動物からの生物学的流体サンプルを請求項1ないし7の
    いずれか1項に記載のアミノ酸配列と接触させ、該アミ
    ノ酸配列と被検サンプル中に存在する抗体との免疫学的
    反応を検出することを特徴とする方法。
  35. 【請求項35】 活性成分として、請求項12に記載の
    ヌクレオチド配列を含有することを特徴とする医薬組成
    物。
JP20403896A 1995-06-30 1996-07-01 アデニルシクラーゼ − ヘモリジン(AC−Hly)の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用 Expired - Fee Related JP4302784B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9507945A FR2736064B1 (fr) 1995-06-30 1995-06-30 Epitopes protecteurs de l'adenyl cyclase-hemolysine(ac-hty). leur application au traitement ou a la prevention des infections par bordetella
FR9507945 1995-06-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH09187284A true JPH09187284A (ja) 1997-07-22
JP4302784B2 JP4302784B2 (ja) 2009-07-29

Family

ID=9480602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP20403896A Expired - Fee Related JP4302784B2 (ja) 1995-06-30 1996-07-01 アデニルシクラーゼ − ヘモリジン(AC−Hly)の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用

Country Status (11)

Country Link
US (3) US6309648B1 (ja)
EP (1) EP0787796B9 (ja)
JP (1) JP4302784B2 (ja)
AT (1) ATE420951T1 (ja)
AU (1) AU5625796A (ja)
CA (1) CA2180280A1 (ja)
DE (1) DE69637812D1 (ja)
DK (1) DK0787796T3 (ja)
ES (1) ES2320392T3 (ja)
FR (1) FR2736064B1 (ja)
PT (1) PT787796E (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646776B1 (fr) * 1989-05-12 1994-06-03 Pasteur Institut Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella
FR2728170A1 (fr) * 1994-12-15 1996-06-21 Pasteur Institut Vaccin de type acellulaire anti-bordetella
US7462472B2 (en) * 2001-11-02 2008-12-09 The University Of Chicago Methods and compositions relating to anthrax pathogenesis
EP1489092A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-22 Institut Pasteur Modified Bordetella adenylate cyclase comprising or lacking CD11b/CD18 interaction domain and uses thereof
US9017681B2 (en) * 2007-01-12 2015-04-28 Cornell Research Foundation, Inc. Adenylyl cyclases as novel targets for antibactrial interventions
WO2008088771A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 Cornell Research Foundation, Inc. Adenylyl cyclases as novel targets for the treatment of infection by eukaryotic pathogens
US20100112009A1 (en) * 2008-11-03 2010-05-06 Institut Pasteur Acellular antibordetella vaccine
US20190071706A1 (en) * 2016-04-04 2019-03-07 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for preventing and treating disease

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8412207D0 (en) * 1984-05-12 1984-06-20 Wellcome Found Antigenic preparations
FR2590483B1 (fr) 1985-11-22 1988-12-09 Pasteur Institut Antigenes purifies ayant des proprietes vaccinantes contre b. pertussis, moyens notamment adns recombinants pour les produire et compositions de vaccins les contenant
FR2606789B1 (fr) 1986-11-17 1991-05-31 Pasteur Institut Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques
ATE80179T1 (de) 1986-12-23 1992-09-15 Univ Leland Stanford Junior Modifiziertes pertussistoxin.
DE3855442T2 (de) 1988-04-19 1997-03-06 Inst Nat Sante Rech Med Verfahren zur Gewinnung von Schutzantigenen gegen Bordetella-Infektionen und toxische Prozesse
EP0338170A1 (en) 1988-04-19 1989-10-25 Institut Pasteur Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bacteria
FR2638169B1 (fr) * 1988-10-25 1991-01-11 Pasteur Institut Derives d'adenyl cyclase et leurs utilisations biologiques
FR2646776B1 (fr) 1989-05-12 1994-06-03 Pasteur Institut Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella
FR2728170A1 (fr) * 1994-12-15 1996-06-21 Pasteur Institut Vaccin de type acellulaire anti-bordetella

Also Published As

Publication number Publication date
AU5625796A (en) 1997-01-23
EP0787796B9 (fr) 2009-08-05
CA2180280A1 (fr) 1996-12-31
US6309648B1 (en) 2001-10-30
PT787796E (pt) 2009-04-03
DE69637812D1 (de) 2009-03-05
ATE420951T1 (de) 2009-01-15
US6994854B1 (en) 2006-02-07
EP0787796B1 (fr) 2009-01-14
DK0787796T3 (da) 2009-04-20
FR2736064B1 (fr) 1997-09-05
FR2736064A1 (fr) 1997-01-03
JP4302784B2 (ja) 2009-07-29
US7902349B2 (en) 2011-03-08
EP0787796A1 (fr) 1997-08-06
ES2320392T3 (es) 2009-05-21
US20060292161A1 (en) 2006-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vodkin et al. A heat shock operon in Coxiella burnetti produces a major antigen homologous to a protein in both mycobacteria and Escherichia coli
JP3242106B2 (ja) 組換えdna由来コレラトキシンサブユニット類似体
US4888170A (en) Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes
JP2655583B2 (ja) 新規な百日咳毒素変異体、このような変異体を生産し得るボルデテラ菌株及び抗百日咳菌ワクチンの開発に於けるそれらの使用
JP5566684B2 (ja) Clostridiumdifficileに対する、組換え毒素A/毒素Bワクチン
CA1338705C (en) Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes
Burnette et al. Direct expression of Bordetelia pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia coli
CA2167677A1 (en) Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group b porin proteins from neisseria meningitidis
US7902349B2 (en) Nucleic acids encoding protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly)
JP2006187286A (ja) シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質f
HUT77048A (hu) Neisseria-eredetű hemoglobin-receptorok
JPH04504656A (ja) ボルデテラワクチン
EP0815236B1 (en) Haemophilus adhesion proteins
JPH10510984A (ja) 無細胞性抗ボルデテラワクチン
JPH09502095A (ja) マイコバクテリウム・チューベルクローシスの細胞性取込みをコードしているdna分子
AU761394B2 (en) Superoxide dismutase as a vaccine antigen
HUT52701A (en) Process for producing vaccine of bordetella pertussis
US6399764B1 (en) DNA molecule encoding for cellular uptake of mycobacterium tuberculosis and uses thereof
CA2212870A1 (en) Dna molecule encoding for cellular uptake of mycobacterium tuberculosis and uses thereof
JP2003503059A (ja) 破傷風毒素ポリペプチド
EP3381931A1 (en) Adenylate cyclase toxoid with reduced cytolytic activity
JP2021534761A (ja) 免疫原性タンパク質および組成物
KR101713635B1 (ko) 비브리오 패혈증균의 시스테인 단백질 분해효소 도메인 유래 재조합 단백질 및 이의 용도
EP0358692A1 (en) Cholera vaccines
WO2004050119A1 (en) Vaccine against enteropathogenic and enterohaemorragic escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060322

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20060622

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060627

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060922

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080603

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080903

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080908

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081202

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20090324

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090423

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120501

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees