JPH09187284A - アデニルシクラーゼ − ヘモリジン（ＡＣ−Ｈｌｙ）の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用 - Google Patents
アデニルシクラーゼ − ヘモリジン（ＡＣ−Ｈｌｙ）の防護エピトープ、およびそのボルデテラ菌感染の治療もしくは予防への応用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ボルデテラ属菌による感染に対する防御免疫応
答を誘発することが可能なエピトープを担持する、百日
咳菌、パラ百日咳菌及び／または気管支敗血症菌に由来
するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列、これらのエピトープ
に対する抗体、特にモノクローナル抗体及びそのボルデ
テラ菌感染の治療もしくは予防への応用方法の提供。 【解決手段】アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ−
Ｈｌｙ）のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸配
列であって、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又
は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成を
誘発することが可能であり、複数の鎖より選択されるこ
とを特徴とするアミノ酸配列、これを含む免疫組成物及
び医薬組成物。
答を誘発することが可能なエピトープを担持する、百日
咳菌、パラ百日咳菌及び／または気管支敗血症菌に由来
するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列、これらのエピトープ
に対する抗体、特にモノクローナル抗体及びそのボルデ
テラ菌感染の治療もしくは予防への応用方法の提供。 【解決手段】アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ−
Ｈｌｙ）のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸配
列であって、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又
は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成を
誘発することが可能であり、複数の鎖より選択されるこ
とを特徴とするアミノ酸配列、これを含む免疫組成物及
び医薬組成物。
Description
【０００１】この出願は、ボルデテラ属菌由来のアデニ
ールサイクラーゼ−溶血素のエピトープを含むアミノ酸
配列に関する。アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ
−Ｈｌｙ）は、ボルデテラ感染症候群に関与する毒素の
１つである。ＡＣ−Ｈｌｙは、アデニールサイクラーゼ
活性及び溶血素活性を有する二機能性蛋白質である。こ
れは細菌によって分泌される。その構造遺伝子はクロー
ン化され、かつ配列決定されている（Glaser P. et a
l., 1988, Molec. Microb. 2, 19-20 ）。この蛋白質
は、“毒素中の繰返し”に対応する“ＲＴＸ”と名付け
られた毒素群の一員であり、大腸菌（Escherichia col
i）及びActinobacillus pleuropneumoniae に由来する
溶血素並びにPasteurella haemolytica 及びActinobaci
llus actinomycetemcomitansに由来するロイコトキシン
（leucotoxins ）との相同性を示すという事実がある。
この蛋白質は、ＰＴＸ（百日咳毒素）と同様に、マクロ
ファージのような真核細胞内に浸透し、カルモジュリン
で活性化し、大量のｃＡＭＰを合成し、かつ細胞の機能
を破壊することが可能である（Coote J. 1992, FEMS Mi
crobiol. Rev. 88: 137-162 ）。
ールサイクラーゼ−溶血素のエピトープを含むアミノ酸
配列に関する。アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ
−Ｈｌｙ）は、ボルデテラ感染症候群に関与する毒素の
１つである。ＡＣ−Ｈｌｙは、アデニールサイクラーゼ
活性及び溶血素活性を有する二機能性蛋白質である。こ
れは細菌によって分泌される。その構造遺伝子はクロー
ン化され、かつ配列決定されている（Glaser P. et a
l., 1988, Molec. Microb. 2, 19-20 ）。この蛋白質
は、“毒素中の繰返し”に対応する“ＲＴＸ”と名付け
られた毒素群の一員であり、大腸菌（Escherichia col
i）及びActinobacillus pleuropneumoniae に由来する
溶血素並びにPasteurella haemolytica 及びActinobaci
llus actinomycetemcomitansに由来するロイコトキシン
（leucotoxins ）との相同性を示すという事実がある。
この蛋白質は、ＰＴＸ（百日咳毒素）と同様に、マクロ
ファージのような真核細胞内に浸透し、カルモジュリン
で活性化し、大量のｃＡＭＰを合成し、かつ細胞の機能
を破壊することが可能である（Coote J. 1992, FEMS Mi
crobiol. Rev. 88: 137-162 ）。
【０００２】本発明者らは、この配列内において、ボル
デテラ属菌、特には百日咳菌（B. pertussis）及び／又
はパラ百日咳菌（B. parapertussis）及び／又は気管支
敗血症菌（B. bronchiseptica ）による感染に対する防
御抗体の形成を誘発する能力を有する様々なドメインを
同定している。
デテラ属菌、特には百日咳菌（B. pertussis）及び／又
はパラ百日咳菌（B. parapertussis）及び／又は気管支
敗血症菌（B. bronchiseptica ）による感染に対する防
御抗体の形成を誘発する能力を有する様々なドメインを
同定している。
【０００３】したがって、本発明が目的とするものに
は、例えば免疫療法に利用可能な免疫組成物又は防御ワ
クチンの組成に組み入れることが可能なアミノ酸配列
が、これらのアミノ酸配列を指向する抗体の他にある。
免疫療法及び血清療法は、特に、百日咳菌、パラ百日咳
菌又は気管支敗血症菌に感染した幼児に適しているとい
う点で小児に利用可能である。本発明は、ヒトの医療又
は獣医学における用途を提示する。
は、例えば免疫療法に利用可能な免疫組成物又は防御ワ
クチンの組成に組み入れることが可能なアミノ酸配列
が、これらのアミノ酸配列を指向する抗体の他にある。
免疫療法及び血清療法は、特に、百日咳菌、パラ百日咳
菌又は気管支敗血症菌に感染した幼児に適しているとい
う点で小児に利用可能である。本発明は、ヒトの医療又
は獣医学における用途を提示する。
【０００４】本発明が目的とするものは、アデニールサ
イクラーゼ−溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ）のポリペプチド配
列から誘導されるアミノ酸配列であって、百日咳菌及び
／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌による感
染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能であ
り、かつ下記鎖より選択されることを特徴とするアミノ
酸配列である： ａ）百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前
記配列に対応する配列の９１０位、好ましくは９１３位
と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸
鎖を含む配列であって、大凡９８０位から大凡９８５位
のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列； ｂ）６ないし５００個のアミノ酸を有する鎖を含む配列
であって、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド
配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における
前記配列に対応する配列の３８５ないし４００位のアミ
ノ酸を含む配列； ｃ）前記ａ）及びｂ）に定義されるアミノ酸鎖を含む配
列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳
菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙ内で上記ａ）及びｂ）に定義される鎖の間に天然
に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるい
はＡＣ−Ｈｌｙとは異なる蛋白質から誘導される抗原性
配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百
日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対
応ＡＣ−Ｈｌｙポリペプチド配列と同等の、もしくは類
似する３次元構造を有する配列。
イクラーゼ−溶血素（ＡＣ−Ｈｌｙ）のポリペプチド配
列から誘導されるアミノ酸配列であって、百日咳菌及び
／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌による感
染に対する防御抗体の形成を誘発することが可能であ
り、かつ下記鎖より選択されることを特徴とするアミノ
酸配列である： ａ）百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前
記配列に対応する配列の９１０位、好ましくは９１３位
と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸
鎖を含む配列であって、大凡９８０位から大凡９８５位
のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列； ｂ）６ないし５００個のアミノ酸を有する鎖を含む配列
であって、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド
配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における
前記配列に対応する配列の３８５ないし４００位のアミ
ノ酸を含む配列； ｃ）前記ａ）及びｂ）に定義されるアミノ酸鎖を含む配
列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳
菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙ内で上記ａ）及びｂ）に定義される鎖の間に天然
に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるい
はＡＣ−Ｈｌｙとは異なる蛋白質から誘導される抗原性
配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百
日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対
応ＡＣ−Ｈｌｙポリペプチド配列と同等の、もしくは類
似する３次元構造を有する配列。
【０００５】“ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列に由来
するアミノ酸配列”という表現は、本発明の枠内におい
て、それらのアミノ酸が、それらの性質もしくはそれら
の結合の状態の観点からＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列に等しいか、あるいはＡＣ−Ｈｌｙの免疫学的特性が
保全されるような方式でそれらの幾つかが置換され、欠
失し、もしくは付加されている配列を意味するものと理
解される。特に、ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列から
誘導される配列は、ボルデテラ属、特には百日咳菌、パ
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に感染した患者において
形成される抗体によって認識される。
するアミノ酸配列”という表現は、本発明の枠内におい
て、それらのアミノ酸が、それらの性質もしくはそれら
の結合の状態の観点からＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列に等しいか、あるいはＡＣ−Ｈｌｙの免疫学的特性が
保全されるような方式でそれらの幾つかが置換され、欠
失し、もしくは付加されている配列を意味するものと理
解される。特に、ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列から
誘導される配列は、ボルデテラ属、特には百日咳菌、パ
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に感染した患者において
形成される抗体によって認識される。
【０００６】本発明のアミノ酸配列が、患者もしくは動
物の免疫の後に、ボルデテラ感染に対する防御免疫を誘
発することが可能である場合には、ＡＣ−Ｈｌｙの構造
又は配座が保全され、本発明のアミノ酸配列がＡＣ−Ｈ
ｌｙと等価もしくは類似する構造を有することが、本発
明の枠内において考慮される。
物の免疫の後に、ボルデテラ感染に対する防御免疫を誘
発することが可能である場合には、ＡＣ−Ｈｌｙの構造
又は配座が保全され、本発明のアミノ酸配列がＡＣ−Ｈ
ｌｙと等価もしくは類似する構造を有することが、本発
明の枠内において考慮される。
【０００７】本発明による配列は、ボルデテラ属菌から
精製されるＡＣ−Ｈｌｙの蛋白分解により得ることがで
きる。好ましくは、この配列は化学合成又は遺伝子工学
手法により得られる。
精製されるＡＣ−Ｈｌｙの蛋白分解により得ることがで
きる。好ましくは、この配列は化学合成又は遺伝子工学
手法により得られる。
【０００８】例えば、遺伝子工学により本発明によるア
ミノ酸配列を製造するには、ＣｙａＡ遺伝子断片を担持
するプラスミドが用いられる。
ミノ酸配列を製造するには、ＣｙａＡ遺伝子断片を担持
するプラスミドが用いられる。
【０００９】例としてではあるが、化学合成はアプライ
ド・バイオシステム（Applied Biosystem ）型の自動機
器において行うことができる。また、Betsou F et al.,
1993, Infect. Immun., 61: 3583-3589の技術を用いる
ことも可能である。
ド・バイオシステム（Applied Biosystem ）型の自動機
器において行うことができる。また、Betsou F et al.,
1993, Infect. Immun., 61: 3583-3589の技術を用いる
ことも可能である。
【００１０】このようにして、百日咳菌に由来するＡＣ
−Ｈｌｙの３８５ないし４００位のアミノ酸鎖、もしく
は３８５ないし５００位のアミノ酸鎖にさえ相当するペ
プチド、又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由
来するＡＣ−Ｈｌｙの対応鎖に相当するペプチドを調製
することが可能である。百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌ
ｙのアミノ酸配列は、そのヌクレオチド配列と共に、Gl
aser et al., 1988, Molec. Microb. 2-19-30 に記載さ
れており、図７〜９に示されている。気管支敗血症菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列及びヌクレオチド
配列は図１０〜１３に示されている。
−Ｈｌｙの３８５ないし４００位のアミノ酸鎖、もしく
は３８５ないし５００位のアミノ酸鎖にさえ相当するペ
プチド、又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由
来するＡＣ−Ｈｌｙの対応鎖に相当するペプチドを調製
することが可能である。百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌ
ｙのアミノ酸配列は、そのヌクレオチド配列と共に、Gl
aser et al., 1988, Molec. Microb. 2-19-30 に記載さ
れており、図７〜９に示されている。気管支敗血症菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙのアミノ酸配列及びヌクレオチド
配列は図１０〜１３に示されている。
【００１１】パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのア
ミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド
配列は、パラ百日咳菌株、例えば、Ｉ−１４９８として
１９９４年１２月２日にＣＮＣＭに寄託された第１号
株、からのＤＮＡより通常の技術によって得ることがで
きる。
ミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド
配列は、パラ百日咳菌株、例えば、Ｉ−１４９８として
１９９４年１２月２日にＣＮＣＭに寄託された第１号
株、からのＤＮＡより通常の技術によって得ることがで
きる。
【００１２】本発明によるアミノ酸配列を百日咳菌、パ
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＣｙａＡ遺伝
子のＤＮＡから遺伝子工学により作製し、かつそれが百
日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの９８３位のアミノ酸又
はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来するＡＣ
−Ｈｌｙの対応アミノ酸を有する場合には、この配列
を、確実に、前述の株に由来するＣｙａＣ遺伝子をも発
現する細胞性ホストにおいて産生させるように注意を払
う。ＣｙａＣ遺伝子の発現は、残基９８３を含むアミノ
酸配列の保全に必要な脂肪酸の付加による変性を可能に
する。脂肪酸の付加は、例えば、パルミトイル化であ
る。
ラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＣｙａＡ遺伝
子のＤＮＡから遺伝子工学により作製し、かつそれが百
日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの９８３位のアミノ酸又
はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌に由来するＡＣ
−Ｈｌｙの対応アミノ酸を有する場合には、この配列
を、確実に、前述の株に由来するＣｙａＣ遺伝子をも発
現する細胞性ホストにおいて産生させるように注意を払
う。ＣｙａＣ遺伝子の発現は、残基９８３を含むアミノ
酸配列の保全に必要な脂肪酸の付加による変性を可能に
する。脂肪酸の付加は、例えば、パルミトイル化であ
る。
【００１３】ＣｙａＡ及びＣｙａＣ遺伝子を利用するた
めに用いられる株は、例えば、Ｉ−１４８５として１９
９４年１０月１９日にＣＮＣＭに寄託された百日咳菌Ｈ
ＡＶ、パラ百日咳菌Ｉ−１４９８及びＩ−８５８として
１９８９年５月１２日にＣＮＣＭに寄託された気管支敗
血症菌９７３Ｓである。
めに用いられる株は、例えば、Ｉ−１４８５として１９
９４年１０月１９日にＣＮＣＭに寄託された百日咳菌Ｈ
ＡＶ、パラ百日咳菌Ｉ−１４９８及びＩ−８５８として
１９８９年５月１２日にＣＮＣＭに寄託された気管支敗
血症菌９７３Ｓである。
【００１４】さらに、百日咳菌及び気管支敗血症菌に由
来するＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド配列が、
それぞれ、図７〜９及び図１０〜１３に示されている。
来するＡＣ−Ｈｌｙをコードするヌクレオチド配列が、
それぞれ、図７〜９及び図１０〜１３に示されている。
【００１５】ＣｙａＡ遺伝子を活性化するＣｙａＣ遺伝
子のヌクレオチド配列は、Barry E.M. らの刊行物（Jou
rnal of Bacteriology, Jan. 1991, p. 720-726）に記
述されている。
子のヌクレオチド配列は、Barry E.M. らの刊行物（Jou
rnal of Bacteriology, Jan. 1991, p. 720-726）に記
述されている。
【００１６】本発明の枠内において有利な配列は、ＡＣ
−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域と名付けられた領域
に相当する配列である（図１を参照）。
−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域と名付けられた領域
に相当する配列である（図１を参照）。
【００１７】ＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列に関して
非相同の抗原性配列が存在する場合には、その配列は細
菌性、ウイルス性もしくは寄生生物性の病原生物に由来
する配列、特に、その配列に対する、例えば防御抗体の
形成が求められる配列であればよい。
非相同の抗原性配列が存在する場合には、その配列は細
菌性、ウイルス性もしくは寄生生物性の病原生物に由来
する配列、特に、その配列に対する、例えば防御抗体の
形成が求められる配列であればよい。
【００１８】“百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌によ
る感染に対する防御抗体”という表現は、これらの細菌
によって誘発される致死及び亜致死感染を防御する抗
体、すなわち、この疾患及び感染を防御する抗体を意味
するものと理解される。
る感染に対する防御抗体”という表現は、これらの細菌
によって誘発される致死及び亜致死感染を防御する抗
体、すなわち、この疾患及び感染を防御する抗体を意味
するものと理解される。
【００１９】前述の感染に対する防御抗体の形成を誘発
することが可能な本発明によるアミノ酸配列は、ボルデ
テラ属菌の病原性に関与する因子と関連があり、ホスト
における細菌の存続に対する防御を誘発する能力を有す
るポリペプチド製剤又は細菌抽出物の形態で用いられる
ことが有利である。
することが可能な本発明によるアミノ酸配列は、ボルデ
テラ属菌の病原性に関与する因子と関連があり、ホスト
における細菌の存続に対する防御を誘発する能力を有す
るポリペプチド製剤又は細菌抽出物の形態で用いられる
ことが有利である。
【００２０】本発明の枠内での有利なアミノ酸配列は、
百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来す
るＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と等価の、もし
くは類似する３次元構造を有するポリペプチドの形態に
あり、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド
配列の大凡９００位、特には９１０位、と大凡最終Ｃ−
末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、又はこのア
ミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌
の配列鎖を含むことを特徴とする配列であって、加え
て、この配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位
のアミノ酸との間に、特には９８３位のアミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列であ
る。
百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来す
るＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列と等価の、もし
くは類似する３次元構造を有するポリペプチドの形態に
あり、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド
配列の大凡９００位、特には９１０位、と大凡最終Ｃ−
末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、又はこのア
ミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌
の配列鎖を含むことを特徴とする配列であって、加え
て、この配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位
のアミノ酸との間に、特には９８３位のアミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列であ
る。
【００２１】このアミノ酸配列は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性
領域及び繰返し領域を含む。
領域及び繰返し領域を含む。
【００２２】本発明による別の好ましいアミノ酸配列
は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡最終Ｃ−末端アミノ
酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパ
ラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形
成されることを特徴とする配列であって、この配列が大
凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間
に、特には９８３位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付
加による変性を受けている配列である。
は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡最終Ｃ−末端アミノ
酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパ
ラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形
成されることを特徴とする配列であって、この配列が大
凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間
に、特には９８３位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付
加による変性を受けている配列である。
【００２３】また、本発明が目的とするものは、百日咳
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡３
８５位のアミノ酸と大凡４００位のアミノ酸との間のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成される、前
述の定義の範囲内のアミノ酸でもある。
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の大凡３
８５位のアミノ酸と大凡４００位のアミノ酸との間のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成される、前
述の定義の範囲内のアミノ酸でもある。
【００２４】このアミノ酸配列は、好都合なことに、百
日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌の型のボルデ
テラ属菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発し得
るエピトープを有している。
日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌の型のボルデ
テラ属菌による感染に対する防御抗体の形成を誘発し得
るエピトープを有している。
【００２５】本発明の別の態様によると、アミノ酸配列
は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡５００位のアミノ酸
との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ
百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成
されることを特徴とする。
は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡５００位のアミノ酸
との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ
百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によって形成
されることを特徴とする。
【００２６】３８５位ないし４００位又は３８５位ない
し５００位のアミノ酸を有するこの配列は、それがボル
デテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙにおいてとる構造と
等価もしくは類似の構造で存在することが有利である。
し５００位のアミノ酸を有するこの配列は、それがボル
デテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙにおいてとる構造と
等価もしくは類似の構造で存在することが有利である。
【００２７】また、本発明が目的とするものには、それ
が細菌、特には百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血
症菌から精製された配列であろうと、あるいは組換え蛋
白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから得られた配列であろうと、ボ
ルデテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの配列からポリペ
プチド断片を欠失させることにより得られるアミノ酸配
列でもある。
が細菌、特には百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血
症菌から精製された配列であろうと、あるいは組換え蛋
白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから得られた配列であろうと、ボ
ルデテラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの配列からポリペ
プチド断片を欠失させることにより得られるアミノ酸配
列でもある。
【００２８】このようにして得られるアミノ酸配列は、
図１に示されるΔＣｌａ断片の欠失により変性されたＡ
Ｃ−Ｈｌｙ鎖に相当する、ΔＣｌａと呼ばれる配列であ
って、前記ΔＣｌａ断片が百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈ
ｌｙのポリペプチド配列の８２７位ないし８８７位のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖に相当する配列であり、
得られる配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位
のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位のアミノ酸のレ
ベルで脂肪酸の付加による変性を受けているものである
ことが有利である。
図１に示されるΔＣｌａ断片の欠失により変性されたＡ
Ｃ−Ｈｌｙ鎖に相当する、ΔＣｌａと呼ばれる配列であ
って、前記ΔＣｌａ断片が百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈ
ｌｙのポリペプチド配列の８２７位ないし８８７位のア
ミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌も
しくは気管支敗血症菌の配列鎖に相当する配列であり、
得られる配列が大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位
のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位のアミノ酸のレ
ベルで脂肪酸の付加による変性を受けているものである
ことが有利である。
【００２９】本発明によるアミノ酸配列を形成するため
に、別の断片を欠失させることもできる；これは、百日
咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の３８
５位ないし８２７位のアミノ酸鎖又はこのアミノ酸に対
応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
相当するポリペプチド断片ΔＨであり、得られた配列は
大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との
間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベルで脂肪酸の
付加による変性を受けている。
に、別の断片を欠失させることもできる；これは、百日
咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配列の３８
５位ないし８２７位のアミノ酸鎖又はこのアミノ酸に対
応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
相当するポリペプチド断片ΔＨであり、得られた配列は
大凡９８０位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との
間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベルで脂肪酸の
付加による変性を受けている。
【００３０】また、本発明が目的とするものは、大凡１
０００位から１６００位のアミノ酸残基の間に、ボルデ
テラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの“繰返し領域”を形
成するアミノ酸配列でもある。気管支敗血症菌に由来す
る繰返し領域は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙと比
較して繰返しが１つ少ない。これに関連して、本発明
は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１５５
２位ないし１５９２位のアミノ酸を含む配列に関する。
０００位から１６００位のアミノ酸残基の間に、ボルデ
テラ属菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの“繰返し領域”を形
成するアミノ酸配列でもある。気管支敗血症菌に由来す
る繰返し領域は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙと比
較して繰返しが１つ少ない。これに関連して、本発明
は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの１５５
２位ないし１５９２位のアミノ酸を含む配列に関する。
【００３１】また、本発明は、前述のアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列にも関する。
ードするヌクレオチド配列にも関する。
【００３２】気管支敗血症菌に由来するＣｙａＡ、Ｃｙ
ａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤを、大腸菌Ｋ１２ＸＬ１
に組込まれたプラスミドｐＦＢＤ２にクローン化し、Ｉ
−１６０１として１９９５年６月２１日にＣＮＣＭに寄
託した。
ａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤを、大腸菌Ｋ１２ＸＬ１
に組込まれたプラスミドｐＦＢＤ２にクローン化し、Ｉ
−１６０１として１９９５年６月２１日にＣＮＣＭに寄
託した。
【００３３】このプラスミドｐＦＢＤ２は、ＣｙａＡ、
ＣｙａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤ遺伝子を担持する気
管支敗血症菌由来の８ｋｂ断片をＢａｍＨＩ部位に挿入
することにより得られる。
ＣｙａＢ及び、部分的に、ＣｙａＤ遺伝子を担持する気
管支敗血症菌由来の８ｋｂ断片をＢａｍＨＩ部位に挿入
することにより得られる。
【００３４】さらに、本発明が目的とするものは、本発
明による様々な型のボルデテラ属菌に由来する配列を含
むポリペプチド組成物でもある。例えば、有利なポリペ
プチド組成物は、前に定義される百日咳菌由来の配列、
又は他の配列、又はパラ百日咳菌に由来するこれらの配
列の幾つかを含む。
明による様々な型のボルデテラ属菌に由来する配列を含
むポリペプチド組成物でもある。例えば、有利なポリペ
プチド組成物は、前に定義される百日咳菌由来の配列、
又は他の配列、又はパラ百日咳菌に由来するこれらの配
列の幾つかを含む。
【００３５】本発明の別のポリペプチド組成物は、これ
らに加えて、気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を
含む。
らに加えて、気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を
含む。
【００３６】本発明の別の態様によると、ポリペプチド
配列は、前に定義されるパラ百日咳菌に由来する１以上
の配列及び気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を含
むことを特徴とする。
配列は、前に定義されるパラ百日咳菌に由来する１以上
の配列及び気管支敗血症菌に由来する１以上の配列を含
むことを特徴とする。
【００３７】また、本発明が目的とするものは、先行頁
に定義される１以上の配列を含むことを特徴とする免疫
組成物でもある。
に定義される１以上の配列を含むことを特徴とする免疫
組成物でもある。
【００３８】ボルデテラ属菌による感染に対する防御、
特にホストにおける細菌の残存に対する防御に有利であ
るために、本発明のアミノ酸配列を含む免疫組成物は、
それに加えて、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支
敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来するｖ
ｒｇ遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の一
部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホスト
に免疫応答を誘発するに十分なだけ含有することを特徴
としてもよい。
特にホストにおける細菌の残存に対する防御に有利であ
るために、本発明のアミノ酸配列を含む免疫組成物は、
それに加えて、百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管支
敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来するｖ
ｒｇ遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の一
部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホスト
に免疫応答を誘発するに十分なだけ含有することを特徴
としてもよい。
【００３９】様々なアドヘシン（adhesins）及び毒素に
加えて、ボルデテラ属菌はそれらの毒性に関与する因子
の発現の調節によって特徴付けられる。換言すると、ボ
ルデテラ属菌は相変異及び調節を受ける。
加えて、ボルデテラ属菌はそれらの毒性に関与する因子
の発現の調節によって特徴付けられる。換言すると、ボ
ルデテラ属菌は相変異及び調節を受ける。
【００４０】ボルデテラ属菌は、それらの環境に応じ
て、“無毒性”、すなわち、呼吸器感染のネズミモデル
において致死性、炎症反応及び肺の病変を引き起こすこ
とができなくなり得る。これらは、相調節又は相変異の
いずれかを受ける。相変異は１０-3ないし１０-6の範囲
の頻度で観察され、実際には可逆的である。これは、前
述の毒素及びアドヘシンの発現の停止と、未だによく特
徴付けられていない他の因子の発現を生じる結果となる
（第Ｉ相“毒性”細菌の第IV相“無毒性”細菌への変
化）。第Ｉ相及び第IV相細菌は、Lacey B. 1960, J. Hy
g, 58: 57-93に記述されている。表現型の上では相変異
に類似する相調節は完全に可逆的であり、環境変化（培
養培地の組成、温度等）の間のアドヘシン及び毒素の合
成停止を生じる。
て、“無毒性”、すなわち、呼吸器感染のネズミモデル
において致死性、炎症反応及び肺の病変を引き起こすこ
とができなくなり得る。これらは、相調節又は相変異の
いずれかを受ける。相変異は１０-3ないし１０-6の範囲
の頻度で観察され、実際には可逆的である。これは、前
述の毒素及びアドヘシンの発現の停止と、未だによく特
徴付けられていない他の因子の発現を生じる結果となる
（第Ｉ相“毒性”細菌の第IV相“無毒性”細菌への変
化）。第Ｉ相及び第IV相細菌は、Lacey B. 1960, J. Hy
g, 58: 57-93に記述されている。表現型の上では相変異
に類似する相調節は完全に可逆的であり、環境変化（培
養培地の組成、温度等）の間のアドヘシン及び毒素の合
成停止を生じる。
【００４１】ボルデテラ属において観察される相変異及
び相調節は、２つの調節遺伝子、ｂｖｇＡ及びｂｖｇＳ
の制御の下にある（Arico B et al., 1989, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 86: 6671-6675 ）。
び相調節は、２つの調節遺伝子、ｂｖｇＡ及びｂｖｇＳ
の制御の下にある（Arico B et al., 1989, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 86: 6671-6675 ）。
【００４２】ｂｖｇＳ遺伝子は外部環境に対して感受性
の蛋白質をコードする。この蛋白質は、リン酸化によ
り、ｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる蛋白質の活性
を制御する。このｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる
蛋白質は、一方では、前述の毒性因子をコードする遺伝
子（“ｖｉｒ活性化遺伝子”に対応してｖａｇ）の転写
の正活性化因子であり（Uhl M. A. and Miller J, 199
4, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1163-1167）、他
方では、特定遺伝子の転写の抑制因子である（Beattie
D. T. et al., J. of Bacteriology, Jan. 93, p. 159-
527 ）。発現が抑制される遺伝子は“ｖｉｒ抑制遺伝
子”に対応してｖｒｇと呼ばれ、未だにほとんど特徴付
けられていない。しかしながら、百日咳菌に由来するｖ
ｒｇ６遺伝子が、ホストにおける細菌の残存に関して役
割があるタンパク質をコードすることが示されている
（Beatties D. et al., 1992, Infect. Imm. 60: 571-5
77）。気管支敗血症菌では、ｖｒｇ遺伝子によってコー
ドされる２つの蛋白質が特徴付けられている：これら
は、鞭毛型の蛋白質である（第Ｉ相気管支敗血症菌は、
鞭毛は合成しないがアドヘシン及び毒素は合成する非運
動性細菌であり、第IV相気管支敗血症菌は鞭毛を合成す
る運動性細菌である）。
の蛋白質をコードする。この蛋白質は、リン酸化によ
り、ｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる蛋白質の活性
を制御する。このｂｖｇＡ遺伝子によってコードされる
蛋白質は、一方では、前述の毒性因子をコードする遺伝
子（“ｖｉｒ活性化遺伝子”に対応してｖａｇ）の転写
の正活性化因子であり（Uhl M. A. and Miller J, 199
4, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1163-1167）、他
方では、特定遺伝子の転写の抑制因子である（Beattie
D. T. et al., J. of Bacteriology, Jan. 93, p. 159-
527 ）。発現が抑制される遺伝子は“ｖｉｒ抑制遺伝
子”に対応してｖｒｇと呼ばれ、未だにほとんど特徴付
けられていない。しかしながら、百日咳菌に由来するｖ
ｒｇ６遺伝子が、ホストにおける細菌の残存に関して役
割があるタンパク質をコードすることが示されている
（Beatties D. et al., 1992, Infect. Imm. 60: 571-5
77）。気管支敗血症菌では、ｖｒｇ遺伝子によってコー
ドされる２つの蛋白質が特徴付けられている：これら
は、鞭毛型の蛋白質である（第Ｉ相気管支敗血症菌は、
鞭毛は合成しないがアドヘシン及び毒素は合成する非運
動性細菌であり、第IV相気管支敗血症菌は鞭毛を合成す
る運動性細菌である）。
【００４３】免疫組成物のおける、ｖｒｇ遺伝子の発現
産生物を含む細菌抽出物の存在は、ワクチン投与した被
検体において感染後に得られる体液性及び／又は細胞性
免疫応答を増強することを可能とし、かつ細菌の残存に
対する防御にも寄与する。
産生物を含む細菌抽出物の存在は、ワクチン投与した被
検体において感染後に得られる体液性及び／又は細胞性
免疫応答を増強することを可能とし、かつ細菌の残存に
対する防御にも寄与する。
【００４４】上で問題にされた、“ｖｒｇ細菌抽出物”
と名付けられる細菌抽出物は、第IV相細菌、すなわちｖ
ａｇ遺伝子を発現しない細菌、の外膜の成分をＬＰＳ内
毒素を含めて全て含んでいる。しかしながら、この内毒
素は、除去もしくは解毒することが可能である。
と名付けられる細菌抽出物は、第IV相細菌、すなわちｖ
ａｇ遺伝子を発現しない細菌、の外膜の成分をＬＰＳ内
毒素を含めて全て含んでいる。しかしながら、この内毒
素は、除去もしくは解毒することが可能である。
【００４５】この抽出物は、懸濁液の形で存在してもよ
い。
い。
【００４６】本発明の実施に用いられる“ｖｒｇ”細菌
抽出物は、好ましくは、“尿素抽出物”と呼ばれる抽出
物である。
抽出物は、好ましくは、“尿素抽出物”と呼ばれる抽出
物である。
【００４７】“尿素抽出物”は、細菌の表面に発現し、
５Ｍ尿素と共にインキュベーションした後に細菌から分
離される蛋白質の混合物を含んでなる。“ｖｒｇ”尿素
抽出物は、未だ特徴付けられていない幾つかの蛋白質、
鞭毛及びＬＰＳを含有している。
５Ｍ尿素と共にインキュベーションした後に細菌から分
離される蛋白質の混合物を含んでなる。“ｖｒｇ”尿素
抽出物は、未だ特徴付けられていない幾つかの蛋白質、
鞭毛及びＬＰＳを含有している。
【００４８】尿素抽出物を用いることにより、抽出物中
に含まれる蛋白質から得られる純粋な形のワクチンと比
較して安価なワクチンを製造することが可能となる。
に含まれる蛋白質から得られる純粋な形のワクチンと比
較して安価なワクチンを製造することが可能となる。
【００４９】加えて、本発明者らは、用いられた尿素抽
出物がＴ型細胞免疫応答（リンパ球増殖）を誘発し、し
たがって現在まで用いられている細胞性ワクチンと同様
に振る舞うことを観察している。
出物がＴ型細胞免疫応答（リンパ球増殖）を誘発し、し
たがって現在まで用いられている細胞性ワクチンと同様
に振る舞うことを観察している。
【００５０】対照的に、排他的な無細胞組成物は、感染
に際してその反応が起こるにもかかわらず、Ｔ応答を誘
発することはないと考えられている。
に際してその反応が起こるにもかかわらず、Ｔ応答を誘
発することはないと考えられている。
【００５１】ｖｒｇ尿素抽出物は、第IV相細菌から別々
に調製される。適当である場合には、この第IV相細菌
を、細菌がｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白質の
みを発現するようにｂｖｇＳ遺伝子が変異を受けている
細菌に置き換える。
に調製される。適当である場合には、この第IV相細菌
を、細菌がｖｒｇ遺伝子によってコードされる蛋白質の
みを発現するようにｂｖｇＳ遺伝子が変異を受けている
細菌に置き換える。
【００５２】これらの抽出物の調製は、実験の部に詳細
に記述されている。
に記述されている。
【００５３】このように、本発明は、好ましくは、百日
咳菌に由来するｖａｇ尿素抽出物及び百日咳菌に由来す
るｖｒｇ尿素抽出物の両者を含有する免疫組成物に関す
る。これらの抽出物の調製に適する百日咳菌株は、本発
明の枠内にあり、かつＩ−１４８５として１９９４年１
０月１９日にＣＮＣＭ（パリのCollection Nationale d
e Cultures de Microorganismes ）に寄託されているＨ
ＡＶ株である。ＨＡＶ株は第Ｉ相株であるため、ｖａｇ
尿素抽出物の調製に直接用いることが可能である。
咳菌に由来するｖａｇ尿素抽出物及び百日咳菌に由来す
るｖｒｇ尿素抽出物の両者を含有する免疫組成物に関す
る。これらの抽出物の調製に適する百日咳菌株は、本発
明の枠内にあり、かつＩ−１４８５として１９９４年１
０月１９日にＣＮＣＭ（パリのCollection Nationale d
e Cultures de Microorganismes ）に寄託されているＨ
ＡＶ株である。ＨＡＶ株は第Ｉ相株であるため、ｖａｇ
尿素抽出物の調製に直接用いることが可能である。
【００５４】他方、ｖｒｇ尿素抽出物は第IV相株から得
られる。この第IV相株は、第Ｉ相株から、百日咳菌ｖｒ
ｇ遺伝子のみの発現が得られるように、例えば、細菌に
由来するｂｖｇＳ遺伝子を変異させることにより、ある
いは、硫酸マグネシウムのみを含有する培地中で第Ｉ相
株を培養することにより、誘導される。
られる。この第IV相株は、第Ｉ相株から、百日咳菌ｖｒ
ｇ遺伝子のみの発現が得られるように、例えば、細菌に
由来するｂｖｇＳ遺伝子を変異させることにより、ある
いは、硫酸マグネシウムのみを含有する培地中で第Ｉ相
株を培養することにより、誘導される。
【００５５】同様にして、免疫組成物が投与されるホス
トにおける免疫応答を改善することが適当である場合に
は、後者は、それらに加えて、ＦＨＡ、ＡＧＧ類もしく
はＰＲＮ及びＰＴＸ又はこれらの蛋白質の一部から選択
される、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に
由来する１以上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出
物が投与されるホストにおける免疫応答を誘発するに十
分なだけ含有する。
トにおける免疫応答を改善することが適当である場合に
は、後者は、それらに加えて、ＦＨＡ、ＡＧＧ類もしく
はＰＲＮ及びＰＴＸ又はこれらの蛋白質の一部から選択
される、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に
由来する１以上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出
物が投与されるホストにおける免疫応答を誘発するに十
分なだけ含有する。
【００５６】ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミノ酸
配列及び、適当であるならば、ｖｒｇ遺伝子によって発
現する蛋白質は、Ｉ−１４８５としてＣＮＣＭに寄託さ
れているＨＡＶ株から得ることが有利である。
配列及び、適当であるならば、ｖｒｇ遺伝子によって発
現する蛋白質は、Ｉ−１４８５としてＣＮＣＭに寄託さ
れているＨＡＶ株から得ることが有利である。
【００５７】同様に、本発明の枠内において用いられる
パラ百日咳菌に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−１４９８
としてＣＮＣＭに寄託されている第１号株から得られ
る。
パラ百日咳菌に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−１４９８
としてＣＮＣＭに寄託されている第１号株から得られ
る。
【００５８】さらに、本発明の枠内において用いられる
気管支敗血症菌株に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−８５
８としてＣＮＣＭに寄託されている９７３５株から得る
ことができる。
気管支敗血症菌株に由来するアミノ酸配列は、Ｉ−８５
８としてＣＮＣＭに寄託されている９７３５株から得る
ことができる。
【００５９】様々なボルデテラ属菌株に対して上に与え
られる参照符号は、これらの蛋白質の配列を利用する機
会を与え、適当である場合には、化学合成によりこの配
列を再現し、あるいは、ボルデテラ属菌に由来する蛋白
質の蛋白分解により本発明のアミノ酸配列を得、あるい
は、これらの株のＤＮＡの利用機会を与え、それにより
遺伝子工学手法によって本発明のアミノ酸配列の生成を
可能とするために示されている。
られる参照符号は、これらの蛋白質の配列を利用する機
会を与え、適当である場合には、化学合成によりこの配
列を再現し、あるいは、ボルデテラ属菌に由来する蛋白
質の蛋白分解により本発明のアミノ酸配列を得、あるい
は、これらの株のＤＮＡの利用機会を与え、それにより
遺伝子工学手法によって本発明のアミノ酸配列の生成を
可能とするために示されている。
【００６０】また、本発明が目的とするものは、活性成
分として上に定義される免疫組成物を、薬学的に許容し
得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に
含有するワクチン組成物でもある。
分として上に定義される免疫組成物を、薬学的に許容し
得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に
含有するワクチン組成物でもある。
【００６１】また、本発明は、百日咳菌に由来するＡＣ
−Ｈｌｙ、パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及び気
管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識するモノク
ローナル抗体の調製方法であって、 − 動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、百日咳菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミ
ノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合に
は、この免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工
程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを形成する工程、 − このハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で
培養する工程、 − 百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位
のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、を包含す
る方法に関する。
−Ｈｌｙ、パラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及び気
管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識するモノク
ローナル抗体の調製方法であって、 − 動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、百日咳菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミ
ノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合に
は、この免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工
程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを形成する工程、 − このハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で
培養する工程、 − 百日咳菌のＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位
のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、を包含す
る方法に関する。
【００６２】上記方法は、免疫に百日咳菌に由来するＡ
Ｃ−Ｈｌｙに特異的な抗原を用いることにより、百日咳
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ並びにパラ百日咳菌及び気管
支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの両者を認識するモ
ノクローナル抗体を得ることを有利に可能とする。加え
て、このようなモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ
百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌型のボルデテラ属菌
によるヒトもしくは動物ホストの感染に関する防御能力
を有利に有している。したがって、上記方法を用いて得
られるモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ百日咳菌
又は気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属菌の１
以上の株に感染した患者又は動物の治療に用いることが
できる。
Ｃ−Ｈｌｙに特異的な抗原を用いることにより、百日咳
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ並びにパラ百日咳菌及び気管
支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの両者を認識するモ
ノクローナル抗体を得ることを有利に可能とする。加え
て、このようなモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ
百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌型のボルデテラ属菌
によるヒトもしくは動物ホストの感染に関する防御能力
を有利に有している。したがって、上記方法を用いて得
られるモノクローナル抗体は、百日咳菌、パラ百日咳菌
又は気管支敗血症菌から選択されるボルデテラ属菌の１
以上の株に感染した患者又は動物の治療に用いることが
できる。
【００６３】一般に、本発明が目的とするものは、百日
咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位
のアミノ酸配列を認識することを特徴とするモノクロー
ナル抗体である。
咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位
のアミノ酸配列を認識することを特徴とするモノクロー
ナル抗体である。
【００６４】これに関連して、本発明は、百日咳菌に由
来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５−４００位アミノ酸配列を
含むエピトープを認識するモノクローナル抗体であっ
て、Ｉ−１７３４として１９９６年６月１９日にＣＮＣ
Ｍに寄託されたハイブリドーマＢ５−４によって産生さ
れるモノクローナル抗体に関する。
来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５−４００位アミノ酸配列を
含むエピトープを認識するモノクローナル抗体であっ
て、Ｉ−１７３４として１９９６年６月１９日にＣＮＣ
Ｍに寄託されたハイブリドーマＢ５−４によって産生さ
れるモノクローナル抗体に関する。
【００６５】別の有利なモノクローナル抗体が、百日咳
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸
の配列に対して、Ｉ−１７３３として１９９６年６月１
９日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２
１によって産生される。
菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸
の配列に対して、Ｉ−１７３３として１９９６年６月１
９日にＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２
１によって産生される。
【００６６】また、本発明が目的とするものは、上述の
あらゆるアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体でも
ある。ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端配列に特異的なモノクロ
ーナル抗体は、本発明の有利な抗体のうちの１つであ
る。特別な抗体は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸、特には百日咳菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８８位ないし１７０５位の
アミノ酸又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの
１４８９位ないし１７０６位のアミノ酸を含む対応鎖か
ら誘導される配列に対するものである。これらのモノク
ローナル抗体は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの大
凡３８５位ないし４００位のアミノ酸配列に含まれるエ
ピトープに対して得られるモノクローナル抗体について
上述したものと類似の方法により調製することができ
る。
あらゆるアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体でも
ある。ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端配列に特異的なモノクロ
ーナル抗体は、本発明の有利な抗体のうちの１つであ
る。特別な抗体は、例えば、百日咳菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙの最後の２１７個のアミノ酸、特には百日咳菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙの１４８８位ないし１７０５位の
アミノ酸又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの
１４８９位ないし１７０６位のアミノ酸を含む対応鎖か
ら誘導される配列に対するものである。これらのモノク
ローナル抗体は、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの大
凡３８５位ないし４００位のアミノ酸配列に含まれるエ
ピトープに対して得られるモノクローナル抗体について
上述したものと類似の方法により調製することができ
る。
【００６７】本発明の抗体は、例えば、抗体機能のない
ヒト免疫グロブリンの超可変部分を、上述の手法により
得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変領域と
置換することにより、ヒト化することが可能である。
ヒト免疫グロブリンの超可変部分を、上述の手法により
得られるモノクローナル免疫グロブリンの超可変領域と
置換することにより、ヒト化することが可能である。
【００６８】抗体のヒト化を可能にする手法は、例え
ば、Waldmann T.,June 1991, Science, vol. 252, p.16
57-1662 ；Winter G. et al., 1993, Immunology Toda
y, vol.14, No. 6, p. 243-246；Carter et al., May 1
992, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, vol. 89, p. 4285-4
289；Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immun
ology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2875 に記述されて
いる。
ば、Waldmann T.,June 1991, Science, vol. 252, p.16
57-1662 ；Winter G. et al., 1993, Immunology Toda
y, vol.14, No. 6, p. 243-246；Carter et al., May 1
992, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, vol. 89, p. 4285-4
289；Singer et al., 1 April 1993, Journal of Immun
ology, vol. 150, No. 7, p. 2844-2875 に記述されて
いる。
【００６９】また、本発明が目的とするものは、動物を
上述の定義に相当するアミノ酸配列で免疫し、免疫に用
いた配列を認識し得る形成抗体を回収することにより得
られるポリクローナル血清でもある。
上述の定義に相当するアミノ酸配列で免疫し、免疫に用
いた配列を認識し得る形成抗体を回収することにより得
られるポリクローナル血清でもある。
【００７０】適当であるならば、この免疫には、アミノ
酸配列と共に、アジュバントの投与が含まれる。
酸配列と共に、アジュバントの投与が含まれる。
【００７１】本発明の特定の態様によると、免疫は、１
以上のアミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙの様々な抗原を含
む免疫組成物で行われる。
以上のアミノ酸配列及びＡＣ−Ｈｌｙの様々な抗原を含
む免疫組成物で行われる。
【００７２】また、本発明は、本発明によるモノクロー
ナル抗体を活性成分として含有する医薬組成物にも関す
る。
ナル抗体を活性成分として含有する医薬組成物にも関す
る。
【００７３】これらの抗体、特に、３８５位ないし４０
０位のアミノ酸を含む配列に対する抗体及び／又はＡＣ
−Ｈｌｙ蛋白質のＣ−末端部分に対する抗体は、百日咳
菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌に
感染したホストに対する免疫療法における医薬品として
用いることができる。
０位のアミノ酸を含む配列に対する抗体及び／又はＡＣ
−Ｈｌｙ蛋白質のＣ−末端部分に対する抗体は、百日咳
菌及び／又はパラ百日咳菌及び／又は気管支敗血症菌に
感染したホストに対する免疫療法における医薬品として
用いることができる。
【００７４】例えば、Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄
託されたハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３とし
てＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２１に
よって産生されるモノクローナル抗体が用いられる。
託されたハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３とし
てＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマＥ１７−２１に
よって産生されるモノクローナル抗体が用いられる。
【００７５】本発明による抗体は、採取されたボルデテ
ラ属菌株の分析手段として用いることもできる。したが
って、ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の３５８位ないし４００位の
アミノ酸配列又はＣ−末端配列に対するモノクローナル
抗体は、百日咳菌株の分析に適している。
ラ属菌株の分析手段として用いることもできる。したが
って、ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の３５８位ないし４００位の
アミノ酸配列又はＣ−末端配列に対するモノクローナル
抗体は、百日咳菌株の分析に適している。
【００７６】ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ百日
咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方
法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物
からの生物学的流体サンプルを上に定義されるモノクロ
ーナル抗体又は上に定義されるポリクローナル血清と接
触させ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合
には、前記モノクローナルもしくはポリクローナル抗体
とボルデテラ属の細菌との免疫学的反応を検出すること
を特徴とする方法も、本発明の枠内にある。
咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出する方
法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は動物
からの生物学的流体サンプルを上に定義されるモノクロ
ーナル抗体又は上に定義されるポリクローナル血清と接
触させ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合
には、前記モノクローナルもしくはポリクローナル抗体
とボルデテラ属の細菌との免疫学的反応を検出すること
を特徴とする方法も、本発明の枠内にある。
【００７７】ボルデテラ属の細菌、特に百日咳菌、パラ
百日咳菌及び気管支敗血症菌による感染の検出は、被検
サンプルを上述の定義に相当するアミノ酸配列と接触さ
せ、次いで前記アミノ酸配列と被検サンプル中に存在す
る抗体との免疫学的反応を検出することにより、患者も
しくは動物からの生物学的流体サンプルについて行うこ
ともできる。
百日咳菌及び気管支敗血症菌による感染の検出は、被検
サンプルを上述の定義に相当するアミノ酸配列と接触さ
せ、次いで前記アミノ酸配列と被検サンプル中に存在す
る抗体との免疫学的反応を検出することにより、患者も
しくは動物からの生物学的流体サンプルについて行うこ
ともできる。
【００７８】また、本発明は、上述のヌクレオチド配列
を活性成分として含有する医薬組成物にも関する。
を活性成分として含有する医薬組成物にも関する。
【００７９】医薬組成物におけるヌクレオチド配列の利
用は、Donnellyらによって記述される手法（Nature M馘
ecine, 1995, vol. 1, No. 6, p. 583-587）を参照して
行うことができる。
用は、Donnellyらによって記述される手法（Nature M馘
ecine, 1995, vol. 1, No. 6, p. 583-587）を参照して
行うことができる。
【００８０】
材料及び方法 細菌株、プラスミド及び増殖条件：毒性株百日咳菌１８
３２３（ＡＴＣＣ９７９７）を、１５％脱繊維素ヒツジ
血液を補足したボルデット・ジェンゴウ（Bordet Gengo
u ）寒天培地（ＢＧ）で、３６℃で７２時間培養し、再
度２４時間培養した。液体培地中での副次培養を、Ｓｔ
ａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（Stainer D. W. and
Scholte M. J., 1971, J. Gen. Microb., 63: 211-220
）において３６℃で２０時間、６５０ｎｍでの光学密
度が１．０（ＯＤ620 ＝１．０）になるまで行った。
３２３（ＡＴＣＣ９７９７）を、１５％脱繊維素ヒツジ
血液を補足したボルデット・ジェンゴウ（Bordet Gengo
u ）寒天培地（ＢＧ）で、３６℃で７２時間培養し、再
度２４時間培養した。液体培地中での副次培養を、Ｓｔ
ａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（Stainer D. W. and
Scholte M. J., 1971, J. Gen. Microb., 63: 211-220
）において３６℃で２０時間、６５０ｎｍでの光学密
度が１．０（ＯＤ620 ＝１．０）になるまで行った。
【００８１】大腸菌内での組換え蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌ
ｙ及びその切詰められた派生物の産生に用いられるプラ
スミドは下記刊行物に記載されている：Betsou F., P.
Seboand N. Guiso, 1993, ＣｙａＣ−介在活性化は百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけで
はなく防御活性にも重要である（CyaC-mediated activa
tion is important not only for toxic but also for
protective activities of Bordetella pertussis aden
ylate cyclase-haemolysin）, Infect. Immun.61: 3583
-3589；Iwaki M., Ullmann A. and P.Sebo, 1995,
“百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素のオリゴマ
ー化：個々に不活性化した変異体の生体外補足からの証
拠”（"Oligomerization of the adenylate cyclase to
xin of Bordetella pertussis: Evidence from in vitr
o complementation of individually inactive mutant
s" ）. 投稿済み；及びSebo P., P. Glaser, H. Sakamo
to and A. Ullmann, 1991, 再構築大腸菌システムにお
ける百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素の高レベ
ル合成（High level synthesis of adenylate cyclaset
oxin of Bordetella pertussis in a reconstructed Es
cherichia coli system）, Gene 104: 19-24 。
ｙ及びその切詰められた派生物の産生に用いられるプラ
スミドは下記刊行物に記載されている：Betsou F., P.
Seboand N. Guiso, 1993, ＣｙａＣ−介在活性化は百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性だけで
はなく防御活性にも重要である（CyaC-mediated activa
tion is important not only for toxic but also for
protective activities of Bordetella pertussis aden
ylate cyclase-haemolysin）, Infect. Immun.61: 3583
-3589；Iwaki M., Ullmann A. and P.Sebo, 1995,
“百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素のオリゴマ
ー化：個々に不活性化した変異体の生体外補足からの証
拠”（"Oligomerization of the adenylate cyclase to
xin of Bordetella pertussis: Evidence from in vitr
o complementation of individually inactive mutant
s" ）. 投稿済み；及びSebo P., P. Glaser, H. Sakamo
to and A. Ullmann, 1991, 再構築大腸菌システムにお
ける百日咳菌のアデニレートサイクラーゼ毒素の高レベ
ル合成（High level synthesis of adenylate cyclaset
oxin of Bordetella pertussis in a reconstructed Es
cherichia coli system）, Gene 104: 19-24 。
【００８２】これらのプラスミドは、活性化蛋白質Ｃｙ
ａＣの存在下での様々な蛋白質（図１）の生成を可能と
する。それぞれのプラスミドを有する大腸菌ＸＬ−１ブ
ルー株（Stratagene）を、３７℃で、１００μｇ／ｌの
アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地において、０．５
ないし０．７の光学密度ＯＤ600 で培養し、ＡＣ−Ｈｌ
ｙを産生させるためにＩＰＴＧ（１ｍＭ）でさらに４時
間誘発した（Betsou F., P. Sebo, and N. Guiso, 199
3, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。
ａＣの存在下での様々な蛋白質（図１）の生成を可能と
する。それぞれのプラスミドを有する大腸菌ＸＬ−１ブ
ルー株（Stratagene）を、３７℃で、１００μｇ／ｌの
アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地において、０．５
ないし０．７の光学密度ＯＤ600 で培養し、ＡＣ−Ｈｌ
ｙを産生させるためにＩＰＴＧ（１ｍＭ）でさらに４時
間誘発した（Betsou F., P. Sebo, and N. Guiso, 199
3, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。
【００８３】アデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞
毒性活性の試験 アデニレートサイクラーゼ活性は、Ladant D., C. Brez
in, I. Crenon, J. M.Alonso,及びN. Guiso（1987, 百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ：精製、特徴付け及び
ラジオイムノアッセイ（Bordetella pertussis adenyla
te cyclase: purification, characteriation and radi
oimmunoassay）, J. Biol. Chem. 261:16264-16269 ）
によって記述された手順に従って測定した。１ユニット
（Ｕ）のアデニレートサイクラーゼ活性は、３０℃、ｐ
Ｈ８．０で１分当たりに１ナノモルのｃＡＭＰが形成さ
れることに相当する。ＡＣ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性
活性は、Bellalou J., H. Sakamoto, D. Ladant, C. Ge
offroy 及び A. Ullmannの記述（1990, 百日咳菌の溶
血及び毒性活性に影響を及ぼす欠失（Deletions affect
ing haemolytic and toxin activities of Bordetella
pertussis adenylate cyclase ）, Infect. Immun. 58:
3242-3247）に従い、洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ／
ｍｌ）を用いて３７℃で決定した。蛋白質濃度は、Brad
fordの方法（蛋白質−染料結合の原理を利用する、マイ
クログラムの蛋白質の迅速かつ高感度の定量方法（A ra
pid and sensitive method for the quantification of
micrograms of protein, utilizing the principle of
protein-dye binding）. Anal. Biochem. 72: 248-25
7）によって決定した。
毒性活性の試験 アデニレートサイクラーゼ活性は、Ladant D., C. Brez
in, I. Crenon, J. M.Alonso,及びN. Guiso（1987, 百
日咳菌アデニレートサイクラーゼ：精製、特徴付け及び
ラジオイムノアッセイ（Bordetella pertussis adenyla
te cyclase: purification, characteriation and radi
oimmunoassay）, J. Biol. Chem. 261:16264-16269 ）
によって記述された手順に従って測定した。１ユニット
（Ｕ）のアデニレートサイクラーゼ活性は、３０℃、ｐ
Ｈ８．０で１分当たりに１ナノモルのｃＡＭＰが形成さ
れることに相当する。ＡＣ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性
活性は、Bellalou J., H. Sakamoto, D. Ladant, C. Ge
offroy 及び A. Ullmannの記述（1990, 百日咳菌の溶
血及び毒性活性に影響を及ぼす欠失（Deletions affect
ing haemolytic and toxin activities of Bordetella
pertussis adenylate cyclase ）, Infect. Immun. 58:
3242-3247）に従い、洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ／
ｍｌ）を用いて３７℃で決定した。蛋白質濃度は、Brad
fordの方法（蛋白質−染料結合の原理を利用する、マイ
クログラムの蛋白質の迅速かつ高感度の定量方法（A ra
pid and sensitive method for the quantification of
micrograms of protein, utilizing the principle of
protein-dye binding）. Anal. Biochem. 72: 248-25
7）によって決定した。
【００８４】アデニレートサイクラーゼ阻害の試験 １００Ｕ／ｍｌの百日咳菌に由来する精製ＡＣ−Ｈｌｙ
を、ｐＨ７．６の５０ｍＭトリス−ＨＣｌにおいて、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 及び０．１ ＮＰ−４０、並び
に１００倍に希釈した様々な血清と共に、４℃で１８な
いし２０時間インキュベートした；インキュベーション
後のサンプルのアデニレートサイクラーゼ活性（ＩＡ）
を測定した。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
からの血清と共にインキュベートした後のＡＣ（アデニ
レートサイクラーゼ）活性（ＣＡ）を、活性１００％
（換言すると阻害０％）の基準として採用した。ＡＣ活
性の阻害パーセンテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＩＡ／ＣＡ）
を、ｐＨ７．６の５０ｍＭトリス−ＨＣｌにおいて、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 及び０．１ ＮＰ−４０、並び
に１００倍に希釈した様々な血清と共に、４℃で１８な
いし２０時間インキュベートした；インキュベーション
後のサンプルのアデニレートサイクラーゼ活性（ＩＡ）
を測定した。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
からの血清と共にインキュベートした後のＡＣ（アデニ
レートサイクラーゼ）活性（ＣＡ）を、活性１００％
（換言すると阻害０％）の基準として採用した。ＡＣ活
性の阻害パーセンテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＩＡ／ＣＡ）
【００８５】溶血活性阻害の試験 １ユニット（Ｕ）の毒素及び５μｌの様々な血清を、１
ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中において、２
ｍＭ ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１μＭウ
シ脳カルモジュリンと混合し、４℃で２０分間予備イン
キュベートした。洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ）を添
加し、室温で３時間インキュベートした後に残存する溶
血活性を決定した。未溶解の赤血球を２０００ｒｐｍで
遠心した後にペレットの形で回収し、上清中に放出され
たヘモグロビン（ＲＨ）の光学密度を５４１ｎｍで測定
した。水酸化アルミニウムのみで免疫されたマウスの血
清と共にインキュベートした毒素の溶血活性（ＣＨ）
を、活性１００％（阻害０％）の基準として採用した。
毒素なしでインキュベートしたヒツジ赤血球を非特異的
溶解についての対照として用いた。溶血活性の阻害パー
センテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＲＨ／ＣＨ）
ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中において、２
ｍＭ ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１μＭウ
シ脳カルモジュリンと混合し、４℃で２０分間予備イン
キュベートした。洗浄したヒツジ赤血球（１０9 ）を添
加し、室温で３時間インキュベートした後に残存する溶
血活性を決定した。未溶解の赤血球を２０００ｒｐｍで
遠心した後にペレットの形で回収し、上清中に放出され
たヘモグロビン（ＲＨ）の光学密度を５４１ｎｍで測定
した。水酸化アルミニウムのみで免疫されたマウスの血
清と共にインキュベートした毒素の溶血活性（ＣＨ）
を、活性１００％（阻害０％）の基準として採用した。
毒素なしでインキュベートしたヒツジ赤血球を非特異的
溶解についての対照として用いた。溶血活性の阻害パー
センテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＲＨ／ＣＨ）
【００８６】細胞毒性活性阻害の試験 １ユニット（Ｕ）の毒素及び５μｌの様々な血清を、総
容量１ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８におい
て、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍ
Ｍグルコース、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１μＭウシ脳
カルモジュリンと共に、４℃で２０分間予備インキュベ
ートした。次いで、１０9 個の洗浄したヒツジ赤血球を
添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続し
た。毒素の活性を停止させるため、赤血球懸濁液をｐＨ
５．２の５０ｍＭ沸騰酢酸ナトリウム１ｍｌに注入し、
１００℃で５分間加熱した。溶血した赤血球中に形成さ
れたｃＡＭＰの量（ＩＴ）を、標準ＥＬＩＳＡ法（Prad
elles P. Grassi J. Chabardes D., Guiso N. 1989, An
alytical Chemistry, 61: 447-450 ）により決定した。
４℃でインキュベートした毒素を細胞毒性の陰性対照と
して用いた。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
の血清と共にインキュベートした毒素の活性（ＣＴ）を
活性１００％（阻害０％）と想定した。細胞毒性活性の
阻害パーセンテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＩＴ／ＣＴ）
容量１ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８におい
て、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍ
Ｍグルコース、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１μＭウシ脳
カルモジュリンと共に、４℃で２０分間予備インキュベ
ートした。次いで、１０9 個の洗浄したヒツジ赤血球を
添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続し
た。毒素の活性を停止させるため、赤血球懸濁液をｐＨ
５．２の５０ｍＭ沸騰酢酸ナトリウム１ｍｌに注入し、
１００℃で５分間加熱した。溶血した赤血球中に形成さ
れたｃＡＭＰの量（ＩＴ）を、標準ＥＬＩＳＡ法（Prad
elles P. Grassi J. Chabardes D., Guiso N. 1989, An
alytical Chemistry, 61: 447-450 ）により決定した。
４℃でインキュベートした毒素を細胞毒性の陰性対照と
して用いた。水酸化アルミニウムのみで免疫したマウス
の血清と共にインキュベートした毒素の活性（ＣＴ）を
活性１００％（阻害０％）と想定した。細胞毒性活性の
阻害パーセンテージを以下のように算出した： 阻害％＝１００％−（１００％×ＩＴ／ＣＴ）
【００８７】電気泳動及び免疫ブロッティング法 ファストシステム（PhastSystem ）（Pharmacia ）用の
８−２５％調製済み（ready-for-use ）ポリアクリルア
ミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、分
離した蛋白質をポリアクリルアミドゲルからハイボンド
・Ｃ−スーパー・メンブラン（Amersham）に電気移動
（electrotransferred）させた。ブロックした後、この
膜を、１０-3の希釈率で、ポリクローナル血清と共に、
４℃で一晩インキュベートした。セイヨウワサビ・ペル
オキシダーゼ標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン及び
増強化学発光システム（ECL-Amersham）を用いて免疫化
学検出を行った。
８−２５％調製済み（ready-for-use ）ポリアクリルア
ミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、分
離した蛋白質をポリアクリルアミドゲルからハイボンド
・Ｃ−スーパー・メンブラン（Amersham）に電気移動
（electrotransferred）させた。ブロックした後、この
膜を、１０-3の希釈率で、ポリクローナル血清と共に、
４℃で一晩インキュベートした。セイヨウワサビ・ペル
オキシダーゼ標識ヒツジ抗−マウス免疫グロブリン及び
増強化学発光システム（ECL-Amersham）を用いて免疫化
学検出を行った。
【００８８】ＡＣ−Ｈｌｙの生成及び精製 Guiso N., M. Szatanik 及びM. Rocandourt によって記
述される方法（1991,細菌コロニー形成に対するボルデ
テラ属菌アデニレートサイクラーゼの防御活性（Protec
tive activity of Bordetella adenylate cyclase agai
nst bacterialcolonaization ）. Microb. Pathog. 11:
423-431 ）に従って、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙ、
大腸菌から産生されるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（組換えＡＣ−
Ｈｌｙ）及び様々な組換え切詰め蛋白質を尿素を用いて
細菌から抽出し、カルモジュリン・アフィニティカラム
で精製した。これらの酵素調製品を、８Ｍ尿素中に、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び０．２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 と共に−２０℃で保存した。全ての調製品を、そ
れらの純度を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。
述される方法（1991,細菌コロニー形成に対するボルデ
テラ属菌アデニレートサイクラーゼの防御活性（Protec
tive activity of Bordetella adenylate cyclase agai
nst bacterialcolonaization ）. Microb. Pathog. 11:
423-431 ）に従って、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙ、
大腸菌から産生されるｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（組換えＡＣ−
Ｈｌｙ）及び様々な組換え切詰め蛋白質を尿素を用いて
細菌から抽出し、カルモジュリン・アフィニティカラム
で精製した。これらの酵素調製品を、８Ｍ尿素中に、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び０．２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 と共に−２０℃で保存した。全ての調製品を、そ
れらの純度を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。
【００８９】能動免疫化 ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた蛋白質の精製調製品
を水酸化アルミニウム（２５０μｇ／ｍｌ）に６０μｇ
／ｍｌ吸着させた。能動免疫化を行うため、３ないし４
週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（CERJ, St Berthevin, Fran
ce）を、１５μｇの蛋白質抗原を２週間の間隔をおいて
２回皮下注射することにより処置した。対照には、水酸
化アルミニウムを含むバッファのみを投与した。次い
で、最後の注射の１週間後に、存在する循環抗体を入手
することが可能となるように、これらのマウスから血液
を抜いた。第２の免疫化の２週間後に亜致死呼吸器感染
が達成された。
を水酸化アルミニウム（２５０μｇ／ｍｌ）に６０μｇ
／ｍｌ吸着させた。能動免疫化を行うため、３ないし４
週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（CERJ, St Berthevin, Fran
ce）を、１５μｇの蛋白質抗原を２週間の間隔をおいて
２回皮下注射することにより処置した。対照には、水酸
化アルミニウムを含むバッファのみを投与した。次い
で、最後の注射の１週間後に、存在する循環抗体を入手
することが可能となるように、これらのマウスから血液
を抜いた。第２の免疫化の２週間後に亜致死呼吸器感染
が達成された。
【００９０】マウスの鼻腔内感染 前掲の記載に従って百日咳菌をボルデット・ジェンゴウ
ＢＧ培地で４８時間培養し、細菌を１％カザミノ酸に再
懸濁した。この細菌懸濁液５０μｌを鼻腔内注入するこ
とにより亜致死量を投与した。暴露の１時間後（“第０
日”で示される時点）及び第０日後の異なる日（各ステ
ージの間に６匹のマウス）に、頚部脱臼により感染マウ
スを殺した。切除により肺を採取し、組織破砕器を用い
て塩中にホモジナイズした。均質肺調製品の希釈物をＢ
Ｇ培地にサンプリングし、３６℃で３日間インキュベー
トした後にコロニー形成単位（ｃｆｕ）の計数を行っ
た。全ての実験は少なくとも２回行い、一貫性のある結
果を得た。
ＢＧ培地で４８時間培養し、細菌を１％カザミノ酸に再
懸濁した。この細菌懸濁液５０μｌを鼻腔内注入するこ
とにより亜致死量を投与した。暴露の１時間後（“第０
日”で示される時点）及び第０日後の異なる日（各ステ
ージの間に６匹のマウス）に、頚部脱臼により感染マウ
スを殺した。切除により肺を採取し、組織破砕器を用い
て塩中にホモジナイズした。均質肺調製品の希釈物をＢ
Ｇ培地にサンプリングし、３６℃で３日間インキュベー
トした後にコロニー形成単位（ｃｆｕ）の計数を行っ
た。全ての実験は少なくとも２回行い、一貫性のある結
果を得た。
【００９１】免疫血清の調製 感染マウスから血清を得るため、Guiso N. Rocancourt,
M. Szatanik及びJ. M. Alonsoによって記述された手法
（1989, ボルデテラ属菌アデニレートサイクラーゼは毒
性関連因子及び防御抗原である（Bordetella adenylate
cyclase is avirulence associated factor and a pro
tective antigen）, Molec. Pathog. 7: 373-380 ）に
従い、１０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週齢）を２×
１０5 毒性百日咳菌を鼻腔内投与することにより感染さ
せた。感染の１４日後又はこれらの１４日に続く異なる
指定日に、これらのマウスの血液を抜いた。
M. Szatanik及びJ. M. Alonsoによって記述された手法
（1989, ボルデテラ属菌アデニレートサイクラーゼは毒
性関連因子及び防御抗原である（Bordetella adenylate
cyclase is avirulence associated factor and a pro
tective antigen）, Molec. Pathog. 7: 373-380 ）に
従い、１０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週齢）を２×
１０5 毒性百日咳菌を鼻腔内投与することにより感染さ
せた。感染の１４日後又はこれらの１４日に続く異なる
指定日に、これらのマウスの血液を抜いた。
【００９２】ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた派生物に対す
るマウスポリクローナル血清を、考慮される抗原の各々
でのマウスへの第２の注入の１週間後に採取した。
るマウスポリクローナル血清を、考慮される抗原の各々
でのマウスへの第２の注入の１週間後に採取した。
【００９３】感染患者の血清を、百日咳菌に感染した１
０名の選ばれた非ワクチン投与の小児からのポリクロー
ナル免疫血清を混合することにより調製した。これらの
小児は、彼らの体内に母親の抗体が存在するのを排除す
るために８月齢を越えたものであり、かつ彼らの病歴を
確実なものとするために２歳未満であった。
０名の選ばれた非ワクチン投与の小児からのポリクロー
ナル免疫血清を混合することにより調製した。これらの
小児は、彼らの体内に母親の抗体が存在するのを排除す
るために８月齢を越えたものであり、かつ彼らの病歴を
確実なものとするために２歳未満であった。
【００９４】結果 ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質及びその切詰められた変種の免
疫学的特性 百日咳菌からＣｙａＣ蛋白質を介して生じるＡＣ−Ｈｌ
ｙの変性はその防御活性に必須のものであることが過去
に示されている（Betsou et al., ＣｙａＣ−介在活性
化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性
だけではなく防御活性にも重要である, Infect. Immun.
61: 3583-3589) 。したがって、この変性自体がその直
鎖状形態における防御エピトープの形成に寄与するのか
どうか、あるいは、この変性が防御エピトープの表出に
必要な変性である毒素における構造的な変性を誘発する
のかどうかを決定することが重要である。このため、多
数の切詰められた蛋白質の免疫学的特性及び防御特性を
調べた；問題となる切詰められた蛋白質を図１に模式的
に示す。
疫学的特性 百日咳菌からＣｙａＣ蛋白質を介して生じるＡＣ−Ｈｌ
ｙの変性はその防御活性に必須のものであることが過去
に示されている（Betsou et al., ＣｙａＣ−介在活性
化は百日咳菌アデニレートサイクラーゼ−溶血素の毒性
だけではなく防御活性にも重要である, Infect. Immun.
61: 3583-3589) 。したがって、この変性自体がその直
鎖状形態における防御エピトープの形成に寄与するのか
どうか、あるいは、この変性が防御エピトープの表出に
必要な変性である毒素における構造的な変性を誘発する
のかどうかを決定することが重要である。このため、多
数の切詰められた蛋白質の免疫学的特性及び防御特性を
調べた；問題となる切詰められた蛋白質を図１に模式的
に示す。
【００９５】これらの蛋白質は、変性部位を有する構築
物のＣｙａＣによる脂肪酸鎖でのアシル化が可能となる
ように、ＣｙａＣ蛋白質の存在下において、プラスミド
ｐＣＡＣＴ又はｐＤＩＡを用いて、大腸菌内で生成し
た。図２（Ａ）に示されるように、全ての蛋白質から精
製された調製品は、期待される分子量に相当する主要ポ
リペプチドを含んでいた。これらの蛋白質を、様々な血
清によるそれらの認識を確かめるため、ウェスタン・ブ
ロット試験でチェックした。図２（Ｂ）に示されるよう
に、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して生成された血清はｒ−Ａ
Ｃ−Ｈｌｙを認識し、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから派生した全
ての切詰められた形態の他に、百日咳菌から精製された
ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質をも認識した。図２（Ａ）による
と、蛋白質の全長を含む精製ポリペプチド調製品、換言
すると、ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ並びに切詰め
られたポリペプチドΔＣｌａ及びΔＣ２１７の調製品も
また、精製蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して得られたポ
リクローナル血清によって認識される幾つかの断片を有
していた（図２（Ｂ））。ＡＣ−Ｈｌｙのアデニレート
サイクラーゼ・ドメインに対して特異的に調製されたモ
ノクローナル抗体（図２）もまた、ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣ
ｌａ及びΔＣ２１７のこれらの断片を認識した。これ
は、これらの断片が、Ｃ−末端部分が切詰められ、カル
モジュリン−寒天でＡＣ−Ｈｌｙと共に精製されるＡＣ
ドメインを有する蛋白分解断片であることを示してい
る。しかしながら、このモノクローナル抗体は、残基３
８５ないし８２８及び１４８９ないし１７０６をそれぞ
れ欠いている蛋白質ΔＨ又はΔＨＲ２は認識しなかった
が、蛋白質ΔＣ１３０７は認識した。特にこれらの観察
を用いて、本発明者らは、３８５位ないし４００位のア
ミノ酸の間に位置する分子領域がエピトープの形成に関
与していることを確証した。
物のＣｙａＣによる脂肪酸鎖でのアシル化が可能となる
ように、ＣｙａＣ蛋白質の存在下において、プラスミド
ｐＣＡＣＴ又はｐＤＩＡを用いて、大腸菌内で生成し
た。図２（Ａ）に示されるように、全ての蛋白質から精
製された調製品は、期待される分子量に相当する主要ポ
リペプチドを含んでいた。これらの蛋白質を、様々な血
清によるそれらの認識を確かめるため、ウェスタン・ブ
ロット試験でチェックした。図２（Ｂ）に示されるよう
に、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して生成された血清はｒ−Ａ
Ｃ−Ｈｌｙを認識し、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから派生した全
ての切詰められた形態の他に、百日咳菌から精製された
ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質をも認識した。図２（Ａ）による
と、蛋白質の全長を含む精製ポリペプチド調製品、換言
すると、ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ並びに切詰め
られたポリペプチドΔＣｌａ及びΔＣ２１７の調製品も
また、精製蛋白質ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙに対して得られたポ
リクローナル血清によって認識される幾つかの断片を有
していた（図２（Ｂ））。ＡＣ−Ｈｌｙのアデニレート
サイクラーゼ・ドメインに対して特異的に調製されたモ
ノクローナル抗体（図２）もまた、ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣ
ｌａ及びΔＣ２１７のこれらの断片を認識した。これ
は、これらの断片が、Ｃ−末端部分が切詰められ、カル
モジュリン−寒天でＡＣ−Ｈｌｙと共に精製されるＡＣ
ドメインを有する蛋白分解断片であることを示してい
る。しかしながら、このモノクローナル抗体は、残基３
８５ないし８２８及び１４８９ないし１７０６をそれぞ
れ欠いている蛋白質ΔＨ又はΔＨＲ２は認識しなかった
が、蛋白質ΔＣ１３０７は認識した。特にこれらの観察
を用いて、本発明者らは、３８５位ないし４００位のア
ミノ酸の間に位置する分子領域がエピトープの形成に関
与していることを確証した。
【００９６】極めて顕著に、しかも抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌ
ｙ血清で起こり得ることとは対照的に、感染した小児か
ら得られ、混合物の形態で用いられる血清は、ＡＣ−Ｈ
ｌｙのＡＣドメインを認識せず（ΔＣ１３０７；ライン
７）、ＡＣ−Ｈｌｙの２１７末端残基を欠く蛋白質（Δ
Ｃ２１７；ライン６）も、最後の２１７残基は有するも
のの疎水性領域は欠いている（これは、変性を受けてお
り、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域の主要部分である）蛋白
質（ΔＨＲ２；ライン３）も認識しなかった。しかしな
がら、これらのヒト血清は、百日咳菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙ及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（図２（Ｄ）、ライン１及
び２）及び変性を受け、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域（最
後の９００残基）を有する２つの切詰められた蛋白質
（図２（Ｄ）、ライン４及び５）を認識した。百日咳菌
１８３２３（参照株）で感染させ、感染後迅速に（第１
４日）に採取したマウス血清でも同様の認識パターン
（図２（Ｆ））が得られた。感染から長期間経過した後
（第３５日）に採取された血清は、依然としてＡＣドメ
イン（図２（Ｆ）、ライン７）及び最後の２１７残基の
みを欠く蛋白質ΔＣ２１７（図２（Ｆ）、ライン６）を
認識しなかったものの、蛋白質ΔＨＲ２（図２（Ｆ）、
ライン３）に存在するＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分を認
識した。これらの結果は、百日咳菌での感染後に合成さ
れる抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域
及び繰返し領域を含むＣ−末端領域（最後の９００残
基）に優先的に向けられたものであることを強く示唆し
ている。さらに、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠
く蛋白質ΔＣ２１７も、最後の２１７残基を有するタン
パク質ΔＨＲ２も、免疫及びネズミ血清では認識されな
かった。これは、これらのポリクローナル血清が、ＡＣ
−Ｈｌｙの繰返し領域の特定の構造であって、２つの非
重複欠失のいずれによっても破棄される構造を認識する
ことを示唆している。
ｙ血清で起こり得ることとは対照的に、感染した小児か
ら得られ、混合物の形態で用いられる血清は、ＡＣ−Ｈ
ｌｙのＡＣドメインを認識せず（ΔＣ１３０７；ライン
７）、ＡＣ−Ｈｌｙの２１７末端残基を欠く蛋白質（Δ
Ｃ２１７；ライン６）も、最後の２１７残基は有するも
のの疎水性領域は欠いている（これは、変性を受けてお
り、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域の主要部分である）蛋白
質（ΔＨＲ２；ライン３）も認識しなかった。しかしな
がら、これらのヒト血清は、百日咳菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙ及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（図２（Ｄ）、ライン１及
び２）及び変性を受け、ＡＣ−Ｈｌｙの繰返し領域（最
後の９００残基）を有する２つの切詰められた蛋白質
（図２（Ｄ）、ライン４及び５）を認識した。百日咳菌
１８３２３（参照株）で感染させ、感染後迅速に（第１
４日）に採取したマウス血清でも同様の認識パターン
（図２（Ｆ））が得られた。感染から長期間経過した後
（第３５日）に採取された血清は、依然としてＡＣドメ
イン（図２（Ｆ）、ライン７）及び最後の２１７残基の
みを欠く蛋白質ΔＣ２１７（図２（Ｆ）、ライン６）を
認識しなかったものの、蛋白質ΔＨＲ２（図２（Ｆ）、
ライン３）に存在するＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分を認
識した。これらの結果は、百日咳菌での感染後に合成さ
れる抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体は、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域
及び繰返し領域を含むＣ−末端領域（最後の９００残
基）に優先的に向けられたものであることを強く示唆し
ている。さらに、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠
く蛋白質ΔＣ２１７も、最後の２１７残基を有するタン
パク質ΔＨＲ２も、免疫及びネズミ血清では認識されな
かった。これは、これらのポリクローナル血清が、ＡＣ
−Ｈｌｙの繰返し領域の特定の構造であって、２つの非
重複欠失のいずれによっても破棄される構造を認識する
ことを示唆している。
【００９７】感染患者又はマウスからの血清が、蛋白質
の全長に亘って伸びるポリペプチド（ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ
−ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣｌａ及びΔＨ）のみを認識し、そ
れらの蛋白分解断片を認識しなかったことに注目するこ
とが重要である。これに加えて、これらの血清が、ＡＣ
ドメインを含み、それらのＣ−末端部分で開裂している
蛋白分解生成物を認識しない（上記図２（Ｃ）を参照）
ことは、これらの血清によって認識されるためにはＡＣ
−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域（最後の９００残
基）が無傷でなければならないことを示している。
の全長に亘って伸びるポリペプチド（ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ
−ＡＣ−Ｈｌｙ、ΔＣｌａ及びΔＨ）のみを認識し、そ
れらの蛋白分解断片を認識しなかったことに注目するこ
とが重要である。これに加えて、これらの血清が、ＡＣ
ドメインを含み、それらのＣ−末端部分で開裂している
蛋白分解生成物を認識しない（上記図２（Ｃ）を参照）
ことは、これらの血清によって認識されるためにはＡＣ
−Ｈｌｙの変性領域及び繰返し領域（最後の９００残
基）が無傷でなければならないことを示している。
【００９８】ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた派生体に対す
る血清によるアデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞
毒性活性の阻害 百日咳菌に感染したマウスからの血清、又は百日咳菌に
感染したヒト患者からの血清、あるいは精製された切詰
め蛋白質で免疫することにより得られる、ｒ−ＡＣ−Ｈ
ｌｙの様々な切詰め形態に対するポリクローナル抗体
が、毒素の活性の１つを特異的に阻害し得るかどうかを
調べた。これらの実験に先立って対照が必要であったた
め、完全なｒ−ＡＣ−Ｈｌｙをこれらの試験の被覆抗原
として用いて、様々な血清のＥＬＩＳＡ力価を決定し
た。これらの力価は、抗−ΔＣ１３０７血清を用いて得
られる力価を除いて類似していた。この抗−ΔＣ１３０
７血清は、他の血清と同様にウェスタン・ブロットにお
いてはＡＣ−Ｈｌｙを認識したが、ＥＬＩＳＡにおいて
はＡＣ−Ｈｌｙを認識しなかった。図３に示されるよう
に、アデニレートサイクラーゼ活性は、マウスを精製ｒ
−ＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた派生蛋白質で免疫した
後に得られる血清の全てで阻害された。しかしながら、
感染マウス又は感染ヒト患者からの血清で、同様の条件
下において、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣ活性を阻害したものは
なかった。これは、これらの血清が、ＡＣ−ＨｌｙのＣ
−末端部分（最後の９００残基）を優先的に指向する
が、ＡＣドメインは指向しない抗体を含むことを示すウ
ェスタン・ブロット分析によって得られた結果（上記参
照）と一致する。実際、蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性
が、感染小児からの血清と、より弱くではあるが、感染
マウスからの血清とによって阻害された。しかしなが
ら、百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙ、ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２で免疫すること
により得られる抗血清を用いて、溶血活性の強い阻害が
観察された（図４）。この阻害は、恐らく、ＡＣ−Ｈｌ
ｙのＣ−末端部分に対する特異的抗体の存在によるもの
である。実際、そのような抗体を欠く、ＡＣ−Ｈｌｙの
ＡＣドメインに対する抗−ΔＣ１３０７血清は、ＡＣ−
Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。あらゆる点で有利
な様式において、最後の２１７残基のみを欠く蛋白質Δ
Ｃ２１７に対する血清は、測定し得るレベルではＡＣ−
Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。これは、最後の２
１７残基が、中和抗体の標的であるか、もしくはＡＣ−
Ｈｌｙの別の部分に対する中和抗体の合成に都合の良い
構造の形成に関与しているかのいずれかであることを示
している。総合すると、これらの結果は、さらに加え
て、感染後に合成される抗体は主としてＡＣ−Ｈｌｙの
Ｃ−末端ヘモリシン部分を指向するものであって、この
蛋白質の溶血活性を中和することは可能であるが、その
Ｎ−末端アデニレートサイクラーゼ・ドメインの酵素活
性を中和するものではないことを示している。図５に示
されるように、無傷のＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた蛋
白質ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２に対して得られる血清
で、ＡＣ−Ｈｌｙの細胞毒性の有意の阻害が観察されて
いる。これらの蛋白質は全て、ＡＣドメイン及び最後の
２１７残基の両者を有している。また、これらの抗血清
は、ＡＣ及び溶血活性をも中和した。反対に、溶血活性
のみ（例えば、感染マウスまたは患者からの血清）又は
ＡＣ活性のみ（抗−ΔＣ１３０６及び抗−ΔＣ２１７血
清）のいずれかを阻害する２種の血清は、ＡＣ−Ｈｌｙ
の細胞毒性活性を阻害しなかった。したがって、その細
胞毒性活性を中和するためには、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣド
メイン及び最後の２１７残基に対する抗体の存在を必要
とする可能性があるように思われる。
る血清によるアデニレートサイクラーゼ、溶血及び細胞
毒性活性の阻害 百日咳菌に感染したマウスからの血清、又は百日咳菌に
感染したヒト患者からの血清、あるいは精製された切詰
め蛋白質で免疫することにより得られる、ｒ−ＡＣ−Ｈ
ｌｙの様々な切詰め形態に対するポリクローナル抗体
が、毒素の活性の１つを特異的に阻害し得るかどうかを
調べた。これらの実験に先立って対照が必要であったた
め、完全なｒ−ＡＣ−Ｈｌｙをこれらの試験の被覆抗原
として用いて、様々な血清のＥＬＩＳＡ力価を決定し
た。これらの力価は、抗−ΔＣ１３０７血清を用いて得
られる力価を除いて類似していた。この抗−ΔＣ１３０
７血清は、他の血清と同様にウェスタン・ブロットにお
いてはＡＣ−Ｈｌｙを認識したが、ＥＬＩＳＡにおいて
はＡＣ−Ｈｌｙを認識しなかった。図３に示されるよう
に、アデニレートサイクラーゼ活性は、マウスを精製ｒ
−ＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた派生蛋白質で免疫した
後に得られる血清の全てで阻害された。しかしながら、
感染マウス又は感染ヒト患者からの血清で、同様の条件
下において、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣ活性を阻害したものは
なかった。これは、これらの血清が、ＡＣ−ＨｌｙのＣ
−末端部分（最後の９００残基）を優先的に指向する
が、ＡＣドメインは指向しない抗体を含むことを示すウ
ェスタン・ブロット分析によって得られた結果（上記参
照）と一致する。実際、蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙの溶血活性
が、感染小児からの血清と、より弱くではあるが、感染
マウスからの血清とによって阻害された。しかしなが
ら、百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙ、ｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙ、ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２で免疫すること
により得られる抗血清を用いて、溶血活性の強い阻害が
観察された（図４）。この阻害は、恐らく、ＡＣ−Ｈｌ
ｙのＣ−末端部分に対する特異的抗体の存在によるもの
である。実際、そのような抗体を欠く、ＡＣ−Ｈｌｙの
ＡＣドメインに対する抗−ΔＣ１３０７血清は、ＡＣ−
Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。あらゆる点で有利
な様式において、最後の２１７残基のみを欠く蛋白質Δ
Ｃ２１７に対する血清は、測定し得るレベルではＡＣ−
Ｈｌｙの溶血活性を阻害しなかった。これは、最後の２
１７残基が、中和抗体の標的であるか、もしくはＡＣ−
Ｈｌｙの別の部分に対する中和抗体の合成に都合の良い
構造の形成に関与しているかのいずれかであることを示
している。総合すると、これらの結果は、さらに加え
て、感染後に合成される抗体は主としてＡＣ−Ｈｌｙの
Ｃ−末端ヘモリシン部分を指向するものであって、この
蛋白質の溶血活性を中和することは可能であるが、その
Ｎ−末端アデニレートサイクラーゼ・ドメインの酵素活
性を中和するものではないことを示している。図５に示
されるように、無傷のＡＣ−Ｈｌｙ及び切詰められた蛋
白質ΔＨ、ΔＣｌａ及びΔＨＲ２に対して得られる血清
で、ＡＣ−Ｈｌｙの細胞毒性の有意の阻害が観察されて
いる。これらの蛋白質は全て、ＡＣドメイン及び最後の
２１７残基の両者を有している。また、これらの抗血清
は、ＡＣ及び溶血活性をも中和した。反対に、溶血活性
のみ（例えば、感染マウスまたは患者からの血清）又は
ＡＣ活性のみ（抗−ΔＣ１３０６及び抗−ΔＣ２１７血
清）のいずれかを阻害する２種の血清は、ＡＣ−Ｈｌｙ
の細胞毒性活性を阻害しなかった。したがって、その細
胞毒性活性を中和するためには、ＡＣ−ＨｌｙのＡＣド
メイン及び最後の２１７残基に対する抗体の存在を必要
とする可能性があるように思われる。
【００９９】様々な組換えＡＣ−Ｈｌｙ構築物の防御活
性 防御活性を得るために必要なＡＣ−Ｈｌｙのエピトープ
を突き止めるために、ネズミ呼吸器モデルを用いて、様
々な精製された切詰め蛋白質の防御活性を試験した。複
数群のマウスを、水酸化アルミニウム単独（対照）、ま
たは水酸化アルミニウムに吸着させた精製切詰め蛋白質
で２回免疫した後、これらのマウスを、鼻腔内経路を介
して、亜致死用量の毒性百日咳菌１８３２３株と接触さ
せた。このモデルは、マウスの呼吸器系における細菌の
吸着、コロニー形成、生存及び増殖の能力を反映する。
図６に示されるように、細菌は感染の６日後に対照マウ
スの肺内で急速に増殖した後、肺から除去され始める。
百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙまたはｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙで免疫したマウスの肺においては細菌の増殖は
観察されず、３日後に細菌の数が増加し始めた（図
６）。以前の観察（Betsou F., Sebo and N. Guiso, 19
93, ＣｙａＣ−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイ
クラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要
である, Infect.Immun. 61: 3583-3589）と一致して、
百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙの防御効力はｒ−ＡＣ−Ｈｌｙよ
りも高かった。ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙによって誘発される防
御に類似する防御が蛋白質ΔＣｌａでも得られた。これ
は、残基８２７ないし８８７の蛋白質ΔＣｌａにおける
欠失部分が、防御免疫の誘発に必須ではないことを示唆
している。残基３８５ないし８２８が失われている蛋白
質ΔＨは、ΔＣｌａよりは弱い防御活性を示す。ＡＣ−
Ｈｌｙのヘモリシン部分全体を欠く蛋白質ΔＣ１３０７
では防御は誘発されなかった。より有利な様式におい
て、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ
２１７及び最後の２１７残基を有するタンパク質ΔＨＲ
２は、防御の誘発を可能にすることができなかった。し
たがって、防御活性は、感染患者もしくは感染マウスか
らの血清による個々の構築物の認識パターンと相関す
る。
性 防御活性を得るために必要なＡＣ−Ｈｌｙのエピトープ
を突き止めるために、ネズミ呼吸器モデルを用いて、様
々な精製された切詰め蛋白質の防御活性を試験した。複
数群のマウスを、水酸化アルミニウム単独（対照）、ま
たは水酸化アルミニウムに吸着させた精製切詰め蛋白質
で２回免疫した後、これらのマウスを、鼻腔内経路を介
して、亜致死用量の毒性百日咳菌１８３２３株と接触さ
せた。このモデルは、マウスの呼吸器系における細菌の
吸着、コロニー形成、生存及び増殖の能力を反映する。
図６に示されるように、細菌は感染の６日後に対照マウ
スの肺内で急速に増殖した後、肺から除去され始める。
百日咳菌に由来する蛋白質ＡＣ−Ｈｌｙまたはｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙで免疫したマウスの肺においては細菌の増殖は
観察されず、３日後に細菌の数が増加し始めた（図
６）。以前の観察（Betsou F., Sebo and N. Guiso, 19
93, ＣｙａＣ−介在活性化は百日咳菌アデニレートサイ
クラーゼ−溶血素の毒性だけではなく防御活性にも重要
である, Infect.Immun. 61: 3583-3589）と一致して、
百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙの防御効力はｒ−ＡＣ−Ｈｌｙよ
りも高かった。ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙによって誘発される防
御に類似する防御が蛋白質ΔＣｌａでも得られた。これ
は、残基８２７ないし８８７の蛋白質ΔＣｌａにおける
欠失部分が、防御免疫の誘発に必須ではないことを示唆
している。残基３８５ないし８２８が失われている蛋白
質ΔＨは、ΔＣｌａよりは弱い防御活性を示す。ＡＣ−
Ｈｌｙのヘモリシン部分全体を欠く蛋白質ΔＣ１３０７
では防御は誘発されなかった。より有利な様式におい
て、ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ
２１７及び最後の２１７残基を有するタンパク質ΔＨＲ
２は、防御の誘発を可能にすることができなかった。し
たがって、防御活性は、感染患者もしくは感染マウスか
らの血清による個々の構築物の認識パターンと相関す
る。
【０１００】検討 ＡＣ−Ｈｌｙに対する抗体は、通常、感染小児の血清中
に存在し（ArciniagaJ. L., E. L. Hewlett, F. D. Joh
nson, A. Deforest, S. G. F. Wassilak, I.M. Onorat
o, C. R. Manclark and D. L. Burns, 1991, J. Infec
t. Dis. 163: 135-142；及びGuiso N., E. Grimprel,
I. Anjak and P. B馮u 1993, Eur. J. Clin. Microbio
l. and Infect. Dis. In Press）、ＡＣ−Ｈｌｙでの免
疫化がボルデテラ属菌によるコロニー形成からマウスを
防御することが過去に示されている（Khelef, N., H. S
akamoto and N. Guiso, 1992, Microb. Pathog. 12: 22
7-235 ）。一組の切詰められた形態の組換えＡＣ−Ｈｌ
ｙを生成させることにより、ＡＣ−Ｈｌｙのワクチン投
与による防御免疫の誘導におけるこの蛋白質の様々なド
メインの重要性の研究を行うことが可能となっている。
上に提示される結果は、百日咳菌に感染した後に合成さ
れる抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体が、主に、ＡＣ−Ｈｌｙの変
性ドメイン及び繰返しドメイン（約８００残基）を指向
することを示している。実際、損なわれていないこれら
の領域を有する切詰められた形態のＡＣ−Ｈｌｙのみが
ウェスタン・ブロットにおいて感染マウス及び患者の血
清によって認識され、これらの蛋白質のみがマウスにお
ける防御を誘発する能力を示すものであった。これは、
少なくともマウスの場合において、同一もしくは重複す
るエピトープの比較的限定された組が、感染被験者によ
る抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体の合成の誘発及びＡＣ−Ｈｌｙ
のワクチン投与の後に得られる防御抗体の合成の誘発の
両者に有利であることを示している。従来報告されてい
る実験は、９８３位リシン残基のレベルでのＣｙａＣ遺
伝子発現の産生物による蛋白質の変性部位に対して、末
梢位置にあるＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を除去す
ることで、感染マウス及び患者の血清によるこの蛋白質
（ΔＣ２１７）の認識が無効となり、その防御活性もが
無効となったことを示している。しかしながら、これ
は、この蛋白質ΔＣ２１７が蛋白質ＣｙａＣの存在下に
おいて産生された場合には脂肪酸鎖のレベルでアシル化
されているので、蛋白質ΔＣ２１７の変性の欠如による
ものではなかった。さらに、この２１７残基それ自体
は、それらが変性部位（リシン９８３）及び繰返し領域
の大部分を欠く蛋白質ΔＨＲ２中に存在する場合には、
血清によって認識されず、いかなる防御活性をも示さな
かった。
に存在し（ArciniagaJ. L., E. L. Hewlett, F. D. Joh
nson, A. Deforest, S. G. F. Wassilak, I.M. Onorat
o, C. R. Manclark and D. L. Burns, 1991, J. Infec
t. Dis. 163: 135-142；及びGuiso N., E. Grimprel,
I. Anjak and P. B馮u 1993, Eur. J. Clin. Microbio
l. and Infect. Dis. In Press）、ＡＣ−Ｈｌｙでの免
疫化がボルデテラ属菌によるコロニー形成からマウスを
防御することが過去に示されている（Khelef, N., H. S
akamoto and N. Guiso, 1992, Microb. Pathog. 12: 22
7-235 ）。一組の切詰められた形態の組換えＡＣ−Ｈｌ
ｙを生成させることにより、ＡＣ−Ｈｌｙのワクチン投
与による防御免疫の誘導におけるこの蛋白質の様々なド
メインの重要性の研究を行うことが可能となっている。
上に提示される結果は、百日咳菌に感染した後に合成さ
れる抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体が、主に、ＡＣ−Ｈｌｙの変
性ドメイン及び繰返しドメイン（約８００残基）を指向
することを示している。実際、損なわれていないこれら
の領域を有する切詰められた形態のＡＣ−Ｈｌｙのみが
ウェスタン・ブロットにおいて感染マウス及び患者の血
清によって認識され、これらの蛋白質のみがマウスにお
ける防御を誘発する能力を示すものであった。これは、
少なくともマウスの場合において、同一もしくは重複す
るエピトープの比較的限定された組が、感染被験者によ
る抗−ＡＣ−Ｈｌｙ抗体の合成の誘発及びＡＣ−Ｈｌｙ
のワクチン投与の後に得られる防御抗体の合成の誘発の
両者に有利であることを示している。従来報告されてい
る実験は、９８３位リシン残基のレベルでのＣｙａＣ遺
伝子発現の産生物による蛋白質の変性部位に対して、末
梢位置にあるＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を除去す
ることで、感染マウス及び患者の血清によるこの蛋白質
（ΔＣ２１７）の認識が無効となり、その防御活性もが
無効となったことを示している。しかしながら、これ
は、この蛋白質ΔＣ２１７が蛋白質ＣｙａＣの存在下に
おいて産生された場合には脂肪酸鎖のレベルでアシル化
されているので、蛋白質ΔＣ２１７の変性の欠如による
ものではなかった。さらに、この２１７残基それ自体
は、それらが変性部位（リシン９８３）及び繰返し領域
の大部分を欠く蛋白質ΔＨＲ２中に存在する場合には、
血清によって認識されず、いかなる防御活性をも示さな
かった。
【０１０１】これは、最後の２１７残基及び変性領域の
両者がＡＣ−Ｈｌｙの防御活性に重要であるという結論
に繋がった。このように、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域と最
後の２１７残基との相互作用がＡＣ−Ｈｌｙの防御エピ
トープの形成または活性に必要である。驚いたことに、
ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ２１
７も、変性領域及び繰返しの大部分を欠くが最後の２１
７残基は有する蛋白質ΔＨＲ２も、感染患者及び／又は
マウスのポリクローナル血清（新鮮な血清）によっては
認識されなかった。この抗血清は、蛋白質ΔＣ２１７及
びΔＨＲ２に存在する繰返し領域の区切りの点（breakp
oint）に位置する単一のエピトープ又はエピトープの小
群に対する狭い特異性を有する可能性がある（１４８９
位プロリン）。しかしながら、この可能性は、混合ポリ
クローナル抗血清ではそれほど確かであるようには見え
ない。加えて、感染したヒト患者及びマウスの血清は、
様々な蛋白質の完全長ポリペプチドのほとんどを感染し
たが、これらの調製品中に存在する、抗−ＡＣモノクロ
ーナル抗体によっては認識される開裂Ｃ−末端蛋白分解
断片は認識しなかった。これらをまとめると、これらの
結果は、ＡＣ−Ｈｌｙ上での防御エピトープの形成及び
感染被験者の血清によるＡＣ−Ｈｌｙの認識に、ＡＣ−
Ｈｌｙの変性及び繰返し領域が存在する場合にのみ形成
される特定の構造の存在が必要とされることを示唆して
いる。この構造の形成にＡＣ−Ｈｌｙの翻訳後のアシル
化による９８３位リシン残基での脂肪酸鎖の変性が必要
であり、それがＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分の除去によ
って無効となる可能性が考えられる。これに関して、Ａ
Ｃ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性活性の両者が、非変性分
泌シグナルを含むＡＣ−Ｈｌｙの最後の７５残基が除去
された場合に失われ、孔（pores ）（４及び２９）の形
成活性に直接関与しないことは重要である。これらの観
察は、これらに加えて、ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端領域の
最後の部分がＡＣ−Ｈｌｙ全体の構造において必要不可
欠な役割を果たしているという仮定を支持する。
両者がＡＣ−Ｈｌｙの防御活性に重要であるという結論
に繋がった。このように、ＡＣ−Ｈｌｙの変性領域と最
後の２１７残基との相互作用がＡＣ−Ｈｌｙの防御エピ
トープの形成または活性に必要である。驚いたことに、
ＡＣ−Ｈｌｙの最後の２１７残基を欠く蛋白質ΔＣ２１
７も、変性領域及び繰返しの大部分を欠くが最後の２１
７残基は有する蛋白質ΔＨＲ２も、感染患者及び／又は
マウスのポリクローナル血清（新鮮な血清）によっては
認識されなかった。この抗血清は、蛋白質ΔＣ２１７及
びΔＨＲ２に存在する繰返し領域の区切りの点（breakp
oint）に位置する単一のエピトープ又はエピトープの小
群に対する狭い特異性を有する可能性がある（１４８９
位プロリン）。しかしながら、この可能性は、混合ポリ
クローナル抗血清ではそれほど確かであるようには見え
ない。加えて、感染したヒト患者及びマウスの血清は、
様々な蛋白質の完全長ポリペプチドのほとんどを感染し
たが、これらの調製品中に存在する、抗−ＡＣモノクロ
ーナル抗体によっては認識される開裂Ｃ−末端蛋白分解
断片は認識しなかった。これらをまとめると、これらの
結果は、ＡＣ−Ｈｌｙ上での防御エピトープの形成及び
感染被験者の血清によるＡＣ−Ｈｌｙの認識に、ＡＣ−
Ｈｌｙの変性及び繰返し領域が存在する場合にのみ形成
される特定の構造の存在が必要とされることを示唆して
いる。この構造の形成にＡＣ−Ｈｌｙの翻訳後のアシル
化による９８３位リシン残基での脂肪酸鎖の変性が必要
であり、それがＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端部分の除去によ
って無効となる可能性が考えられる。これに関して、Ａ
Ｃ−Ｈｌｙの溶血及び細胞毒性活性の両者が、非変性分
泌シグナルを含むＡＣ−Ｈｌｙの最後の７５残基が除去
された場合に失われ、孔（pores ）（４及び２９）の形
成活性に直接関与しないことは重要である。これらの観
察は、これらに加えて、ＡＣ−ＨｌｙのＣ−末端領域の
最後の部分がＡＣ−Ｈｌｙ全体の構造において必要不可
欠な役割を果たしているという仮定を支持する。
【０１０２】ＡＣ−Ｈｌｙの主要防御エピトープがＡＣ
部分に位置する可能性があることは既に示唆されている
（Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik and J. M.
Alonso, 1989, Molec. Pathog. 7: 373-380 及びGuiso,
N. M. Szatanik and M. Rocancourt, 1991, Microb. P
athog. 11: 423-431）。ここに提示される結果は、ＡＣ
−Ｈｌｙの変性及び繰返し領域に亘るＡＣ−Ｈｌｙ断片
の混入が、当該技術分野の従来の状況において記述され
る調製品中に存在するＡＣドメイン断片に関連する防御
活性の生成の要因である可能性を示している。それでも
やはり、少量のこれらの混入の防御活性を生じる能力に
は疑わしいものがある。別の解釈は、特定に条件下にお
いて、３８５位ないし４５０位又は５００位アミノ酸の
領域もＡＣ−Ｈｌｙの防御活性において役割を果たし得
るというものである。ＡＣ−Ｈｌｙのこの領域の構造
は、最後の２１７アミノ酸残基の非存在下、又はアシル
化の非存在下において、変性させることが可能である。
４０−５０ｋＤａのＮ−末端部分の構造及び免疫系への
呈示は、この構造が開裂している場合、百日咳菌培養上
清におけるＡＣ−Ｈｌｙ分子の残りの部分に関する防御
を誘発することが可能である。この仮定に対する説明の
１つは、３８５位から４００位アミノ酸の間に位置する
分子の一部に対するモノクローナル抗体が防御抗体であ
るというものである。
部分に位置する可能性があることは既に示唆されている
（Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik and J. M.
Alonso, 1989, Molec. Pathog. 7: 373-380 及びGuiso,
N. M. Szatanik and M. Rocancourt, 1991, Microb. P
athog. 11: 423-431）。ここに提示される結果は、ＡＣ
−Ｈｌｙの変性及び繰返し領域に亘るＡＣ−Ｈｌｙ断片
の混入が、当該技術分野の従来の状況において記述され
る調製品中に存在するＡＣドメイン断片に関連する防御
活性の生成の要因である可能性を示している。それでも
やはり、少量のこれらの混入の防御活性を生じる能力に
は疑わしいものがある。別の解釈は、特定に条件下にお
いて、３８５位ないし４５０位又は５００位アミノ酸の
領域もＡＣ−Ｈｌｙの防御活性において役割を果たし得
るというものである。ＡＣ−Ｈｌｙのこの領域の構造
は、最後の２１７アミノ酸残基の非存在下、又はアシル
化の非存在下において、変性させることが可能である。
４０−５０ｋＤａのＮ−末端部分の構造及び免疫系への
呈示は、この構造が開裂している場合、百日咳菌培養上
清におけるＡＣ−Ｈｌｙ分子の残りの部分に関する防御
を誘発することが可能である。この仮定に対する説明の
１つは、３８５位から４００位アミノ酸の間に位置する
分子の一部に対するモノクローナル抗体が防御抗体であ
るというものである。
【０１０３】また、ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙから得られる切詰
められた蛋白質の生体内における防御活性と、毒性活性
を中和し得る抗体の合成を誘発する生体外におけるその
活性との間に相関が存在するかどうかも調べた。そのよ
うな相関は確立されなかった。防御活性を有する蛋白質
の全てが中和抗体の合成を誘発したが、全く防御しない
蛋白質ΔＨＲ２が強力な中和抗体応答を誘発した。これ
は、ＡＣ−Ｈｌｙの毒性活性に関する中和抗体の存在
が、百日咳菌の感染に対する防御の誘発の信頼できる基
準ではないことを示唆している。
められた蛋白質の生体内における防御活性と、毒性活性
を中和し得る抗体の合成を誘発する生体外におけるその
活性との間に相関が存在するかどうかも調べた。そのよ
うな相関は確立されなかった。防御活性を有する蛋白質
の全てが中和抗体の合成を誘発したが、全く防御しない
蛋白質ΔＨＲ２が強力な中和抗体応答を誘発した。これ
は、ＡＣ−Ｈｌｙの毒性活性に関する中和抗体の存在
が、百日咳菌の感染に対する防御の誘発の信頼できる基
準ではないことを示唆している。
【０１０４】疎水性ドメインの一部を欠く蛋白質ΔＣｌ
ａが防御活性を示すことに留意することがより重要であ
る。この組換え蛋白質は、残留する細胞毒性活性を示さ
ないため、百日咳に対する無細胞ワクチンに含める含有
物の良い候補である。
ａが防御活性を示すことに留意することがより重要であ
る。この組換え蛋白質は、残留する細胞毒性活性を示さ
ないため、百日咳に対する無細胞ワクチンに含める含有
物の良い候補である。
【０１０５】ｖｒｇ尿素抽出物の調製 同じ３つの第IV相細菌種、すなわち、もはやいかなるｖ
ａｇ遺伝子をも発現しないがｖｒｇ遺伝子は発現する細
菌からｖｒｇ尿素抽出物を調製する。これらの遺伝子の
産生物は、気管支敗血症菌の鞭毛を除いて、未だによく
特徴付けられていない。ｖｒｇ尿素抽出物はｖａｇ尿素
抽出物と同様に調製する。
ａｇ遺伝子をも発現しないがｖｒｇ遺伝子は発現する細
菌からｖｒｇ尿素抽出物を調製する。これらの遺伝子の
産生物は、気管支敗血症菌の鞭毛を除いて、未だによく
特徴付けられていない。ｖｒｇ尿素抽出物はｖａｇ尿素
抽出物と同様に調製する。
【０１０６】 培養培地の説明 脱水ボルデット・ジェンゴウ培地 組成： １リットル ５リットル ボルデット・ジェンゴウ培地 ３０ｇ １５０ｇ グリセロール １０ｍｌ ５０ｍｌ 熱分解水 １リットル ５リットル ｐＨを７．４に調整 −加熱 −１２０℃で１５分間オートクレーブ処理 −４℃で保存 使用時：ボルデット・ジェンゴウを１５％ないし２０％
ヒツジもしくはウマ血液で富化させる。管を溶融し、５
４℃で溶融状態を維持する。各管に、無菌的な方式で、
２．５ｍｌのヒツジ血液を添加する。管の内容物を無菌
ペトリ皿に注ぐ。 注：鼻咽頭サンプルからの百日咳菌の同定については、
新たな皿を用いる（最大４℃で７日間）。
ヒツジもしくはウマ血液で富化させる。管を溶融し、５
４℃で溶融状態を維持する。各管に、無菌的な方式で、
２．５ｍｌのヒツジ血液を添加する。管の内容物を無菌
ペトリ皿に注ぐ。 注：鼻咽頭サンプルからの百日咳菌の同定については、
新たな皿を用いる（最大４℃で７日間）。
【０１０７】ＣＳＭ寒天培地 １０倍濃縮溶液２リットルを調製するため： グルタミン酸水素ナトリウム （参照プロラボ（Prolabo ）番号２７８７２．２９８）．．．１０７ｇ Ｌ−プロリン （参照メルク（Merck ）番号７４３４）．．．．．．．．．．２．４ｇ ＮａＣｌ （参照プロラボ番号２７８１０．２９５）．．．．．．．．．２５ｇ Ｈ2 ＰＯ4 （参照プロラボ番号２６９２６．２９８）．．．．．．．．．．５ｇ ＫＣｌ （参照プロラボ番号２６７５９．２９１）．．．．．．．．．．２ｇ ＭｇＣｌ2 （参照プロラボ番号２５１０８．２９５）．．．．．．．．．．１ｇ トリス−塩基 （参照メルク番号８３８２．２５００）．．．．．．．．．１５．２ｇ カザミノ酸 （参照ディフコ（Difco ）番号０２８８−０１−２）．．．．．．５ｇ ＣａＣｌ2 の１％熱分解水溶液 （参照プロラボ番号２２３１７．２９７）．．．．．．．．．２０ｍｌ 熱分解水 全量．．．．．．１リットル これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。
塩酸でｐＨを７．４に調整する。最終容量まで満たし、
−２０℃で保存する。
塩酸でｐＨを７．４に調整する。最終容量まで満たし、
−２０℃で保存する。
【０１０８】−使用時に： −１０倍濃縮溶液１００ｍｌ −熱分解水９００ｍｌ −（２，６−Ｏ−ジメチル）シクロデキストリン、参照
アルドリッチ（Aldrich ）番号５１１６６−７１−３、
１ｇ −２０ｍｌの小分画に分けてガラス管に分配される、バ
クト寒天（Bacto agar）、参照ディフコ番号０１４０−
０１、１５ｇ を混合する。
アルドリッチ（Aldrich ）番号５１１６６−７１−３、
１ｇ −２０ｍｌの小分画に分けてガラス管に分配される、バ
クト寒天（Bacto agar）、参照ディフコ番号０１４０−
０１、１５ｇ を混合する。
【０１０９】無菌化し、無菌の補足物を添加する。
【０１１０】−補足物溶液： −１０倍に濃縮された補足物溶液１ｍｌ −グルタチオン、参照メルク番号４０９０、１００ｍｇ −熱分解水９ｍｌ を混合する。
【０１１１】この溶液を０．２２μｍミレックス（Mill
ex）フィルターで濾過する。この溶液２００μｌを培地
２０ｍｌを収容する１管に添加する。 ステイナー（Stainer ）培養培地 Ａ．基礎培地 １０倍濃縮溶液２リットルを調製するため： グルタミン酸水素ナトリウム （参照プロラボ番号２７８７２．２９８）．．．．．．．２０４．０ｇ Ｌ−プロリン （参照メルク番号７４３４）．．．．．．．．．．．．．．．４．８ｇ ＮａＣｌ （参照プロラボ番号２７８１０．２９５）．．．．．．．．５０．０ｇ Ｈ2 ＰＯ4 （参照プロラボ番号２６９２６．２９８）．．．．．．．．１０．０ｇ ＫＣｌ （参照プロラボ番号２６７５９．２９１）．．．．．．．．．４．０ｇ ＭｇＣｌ2 （参照プロラボ番号２５１０８．２９５）．．．．．．．．．２．０ｇ トリス−塩基 （参照メルク番号８３８２．２５００）．．．．．．．．．３０．５ｇ ＣａＣｌ2 の１％熱分解水溶液 （参照プロラボ番号２２３１７．２９７）．．．．．．．．．４０ｍｌ 熱分解水 全量．．．．．．２リットル これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。
塩酸を用いてｐＨを７．６に調整する。最終容量まで満
たし、この濃縮溶液を分配する。これは、−２０℃で、
数週間保存することが可能である。
ex）フィルターで濾過する。この溶液２００μｌを培地
２０ｍｌを収容する１管に添加する。 ステイナー（Stainer ）培養培地 Ａ．基礎培地 １０倍濃縮溶液２リットルを調製するため： グルタミン酸水素ナトリウム （参照プロラボ番号２７８７２．２９８）．．．．．．．２０４．０ｇ Ｌ−プロリン （参照メルク番号７４３４）．．．．．．．．．．．．．．．４．８ｇ ＮａＣｌ （参照プロラボ番号２７８１０．２９５）．．．．．．．．５０．０ｇ Ｈ2 ＰＯ4 （参照プロラボ番号２６９２６．２９８）．．．．．．．．１０．０ｇ ＫＣｌ （参照プロラボ番号２６７５９．２９１）．．．．．．．．．４．０ｇ ＭｇＣｌ2 （参照プロラボ番号２５１０８．２９５）．．．．．．．．．２．０ｇ トリス−塩基 （参照メルク番号８３８２．２５００）．．．．．．．．．３０．５ｇ ＣａＣｌ2 の１％熱分解水溶液 （参照プロラボ番号２２３１７．２９７）．．．．．．．．．４０ｍｌ 熱分解水 全量．．．．．．２リットル これらの様々な成分を最終容量の水の一部に溶解する。
塩酸を用いてｐＨを７．６に調整する。最終容量まで満
たし、この濃縮溶液を分配する。これは、−２０℃で、
数週間保存することが可能である。
【０１１２】使用時に、この培地を希釈し、１２０℃で
１５分間無菌化した後、濾過により無菌化した補足物を
添加する。 Ｂ．補足物溶液 １０倍濃縮溶液２００ｍｌを調製するため： − Ｌ−システイン （参照プロラボ番号２３２６０．１８４）．．．．．．．．．．８ｇ − 濃ＨＣｌ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｍｌ を溶解する。この調製品に予め溶解した下記混合物を注
ぐ。
１５分間無菌化した後、濾過により無菌化した補足物を
添加する。 Ｂ．補足物溶液 １０倍濃縮溶液２００ｍｌを調製するため： − Ｌ−システイン （参照プロラボ番号２３２６０．１８４）．．．．．．．．．．８ｇ − 濃ＨＣｌ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２０ｍｌ を溶解する。この調製品に予め溶解した下記混合物を注
ぐ。
【０１１３】 ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ （参照プロラボ番号２４２４４．２３２）．．．．．．．．．．．２ｇ Ｌ（＋）アスコルビン酸 （参照プロラボ番号２０１５５．２３７）．．．．．．．．．．．４ｇ ニコチン酸 （参照メルク番号６８１７）．．．．．．．．．．．．．．．０．８ｇ 熱分解水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１２０ｍｌ 熱分解水で２００ｍｌとし、この溶液を１、２、３もし
くは４ｍｌの小分画に分配して−２０℃で凍結させる。
くは４ｍｌの小分画に分配して−２０℃で凍結させる。
【０１１４】使用時に、この溶液を熱分解水で１０倍に
希釈して、希釈補足物： グルタチオン（参照メルク番号４０９０）．．．．１００ｍｇ／１０ｍｌ を添加し、この溶液を濾過（単一使用０．２２μｍミレ
ックスフィルター）により無菌化して、無菌溶液１ｍｌ
を無菌基礎培地１００ｍｌに添加する。２．１．２．ｖ
ｒｇ尿素抽出物の調製 − 細菌懸濁液を、５０００ｇで３０分間、４℃で遠心
する。
希釈して、希釈補足物： グルタチオン（参照メルク番号４０９０）．．．．１００ｍｇ／１０ｍｌ を添加し、この溶液を濾過（単一使用０．２２μｍミレ
ックスフィルター）により無菌化して、無菌溶液１ｍｌ
を無菌基礎培地１００ｍｌに添加する。２．１．２．ｖ
ｒｇ尿素抽出物の調製 − 細菌懸濁液を、５０００ｇで３０分間、４℃で遠心
する。
【０１１５】− 細菌ペレットを、この細菌ペレットの
湿潤重量の５倍に等しい容量でＰＢＳバッファ中に調製
された５Ｍ尿素（先に記述されている）に再懸濁する。
湿潤重量の５倍に等しい容量でＰＢＳバッファ中に調製
された５Ｍ尿素（先に記述されている）に再懸濁する。
【０１１６】− ４℃で１時間攪拌したままにした後、
４０，０００ｇで４０分間、４℃で遠心する。
４０，０００ｇで４０分間、４℃で遠心する。
【０１１７】− 使用時まで、上清を−８０℃で保存す
る。 ２．１．３．ｖｒｇ尿素抽出物の不活性化 − Ｇ２５カラムを通過させることによって尿素を除去
した後、３００μｇ／ｍｌの蛋白質濃縮物が得られるよ
うにｖｒｇ尿素抽出物をＰＢＳで希釈する。
る。 ２．１．３．ｖｒｇ尿素抽出物の不活性化 − Ｇ２５カラムを通過させることによって尿素を除去
した後、３００μｇ／ｍｌの蛋白質濃縮物が得られるよ
うにｖｒｇ尿素抽出物をＰＢＳで希釈する。
【０１１８】− ０．０５％の最終濃度が得られるよう
な容量の２．５％グルタルアルデヒドを滴下により添加
する。
な容量の２．５％グルタルアルデヒドを滴下により添加
する。
【０１１９】− 規則的に攪拌しながら室温で２時間放
置する。
置する。
【０１２０】− ライシンを添加することにより反応を
停止させる（最終濃度０．０２Ｍ）。
停止させる（最終濃度０．０２Ｍ）。
【０１２１】− 室温で２時間後、ＰＢＳ中に調製した
水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ）に、４℃で一晩、
攪拌しながら、尿素抽出物を吸着させる。これにより、
１０ないし２０μｇ／注射の量での動物の免疫化のため
のワクチンの準備が整う（先に記述されている）。
水酸化アルミニウム（１ｍｇ／ｍｌ）に、４℃で一晩、
攪拌しながら、尿素抽出物を吸着させる。これにより、
１０ないし２０μｇ／注射の量での動物の免疫化のため
のワクチンの準備が整う（先に記述されている）。
【図１】使用される、ＡＣ−Ｈｌｙの切詰められた蛋白
質の模式図。プラスミドの構造及び対応する切詰められ
た蛋白質の生成は、以前の刊行物であるSebo P. et a
l., 1991, Gene, 104: 19-24及びSebo P. et al., 199
3, Mol. Microb. 9: 999-1009に記述されている。“Ｍ
ｒ”欄の数字は、それらの推定アミノ酸配列から算出さ
れる毒素の相対分子量を示す。プラスミドの名称におい
て記号Δに続く数字は、ｃｙａＡの読取り枠から欠失し
た部分の最初と最後のアミノ酸の番号である。記号ΔＣ
に続く数字は失われたＣ−末端残基を表す。ｃｙａＡ対
立遺伝子は、プラスミドｐＣＡＣＴ３に存在するものと
同様に、ｌａｃＺ遺伝子の転写及び翻訳の開始シグナル
の制御の下にｃｙａＣ遺伝子と同時発現する（Betsou
F. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。
ΔＣ１３０７は、適合プラスミドｐＰＳ４Ｃを介して発
現するｃｙａＣ遺伝子の存在下において、ｐＤＩＡ５２
４０（ｐＡＣＴΔＣ１３０７）から生成した（Betsou
F. et al., 1993, Infect.Immun. 61: 3583-3589及びSe
bo P. et al., 1991, Gene, 104: 19-24）。
質の模式図。プラスミドの構造及び対応する切詰められ
た蛋白質の生成は、以前の刊行物であるSebo P. et a
l., 1991, Gene, 104: 19-24及びSebo P. et al., 199
3, Mol. Microb. 9: 999-1009に記述されている。“Ｍ
ｒ”欄の数字は、それらの推定アミノ酸配列から算出さ
れる毒素の相対分子量を示す。プラスミドの名称におい
て記号Δに続く数字は、ｃｙａＡの読取り枠から欠失し
た部分の最初と最後のアミノ酸の番号である。記号ΔＣ
に続く数字は失われたＣ−末端残基を表す。ｃｙａＡ対
立遺伝子は、プラスミドｐＣＡＣＴ３に存在するものと
同様に、ｌａｃＺ遺伝子の転写及び翻訳の開始シグナル
の制御の下にｃｙａＣ遺伝子と同時発現する（Betsou
F. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 3583-3589）。
ΔＣ１３０７は、適合プラスミドｐＰＳ４Ｃを介して発
現するｃｙａＣ遺伝子の存在下において、ｐＤＩＡ５２
４０（ｐＡＣＴΔＣ１３０７）から生成した（Betsou
F. et al., 1993, Infect.Immun. 61: 3583-3589及びSe
bo P. et al., 1991, Gene, 104: 19-24）。
【図２】百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の特徴付
け。２００ｎｇの精製百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙを
８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、蛋白質
をクーマシー・ブルーで染色し（Ａ）、あるいは、ハイ
ボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（HYBOND C-Super m
embrane ）に移して、ワクチン接種２２日後の２０匹の
マウスからの混合抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清（Ｂ）、又
は百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙに特異的なモノクロ
ーナル抗体（Ｃ）、又は感染した小児（培養によって確
認された感染）からの血清混合物（Ｄ）、又は百日咳菌
１８３２３に感染したマウスから感染の２週間後に採取
した血清（Ｅ）、又は百日咳菌に感染したマウスから感
染の２ヶ月後に採取した血清（Ｆ）と共にインキュベー
トした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を
用いて免疫検出を行った。ライン１：百日咳菌ＡＣ−Ｈ
ｌｙ；ライン２：ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン３：ΔＨＲ
２；ライン４：ΔＨ；ライン５：ΔＣｌａ；ライン６：
ΔＣ２１７；ライン７：ΔＣ１３０７；数字は分子量マ
ーカーを示す。
け。２００ｎｇの精製百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙを
８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、蛋白質
をクーマシー・ブルーで染色し（Ａ）、あるいは、ハイ
ボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（HYBOND C-Super m
embrane ）に移して、ワクチン接種２２日後の２０匹の
マウスからの混合抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清（Ｂ）、又
は百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙに特異的なモノクロ
ーナル抗体（Ｃ）、又は感染した小児（培養によって確
認された感染）からの血清混合物（Ｄ）、又は百日咳菌
１８３２３に感染したマウスから感染の２週間後に採取
した血清（Ｅ）、又は百日咳菌に感染したマウスから感
染の２ヶ月後に採取した血清（Ｆ）と共にインキュベー
トした。ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を
用いて免疫検出を行った。ライン１：百日咳菌ＡＣ−Ｈ
ｌｙ；ライン２：ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン３：ΔＨＲ
２；ライン４：ΔＨ；ライン５：ΔＣｌａ；ライン６：
ΔＣ２１７；ライン７：ΔＣ１３０７；数字は分子量マ
ーカーを示す。
【図３】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌ
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、アデニレートサイクラーゼ活
性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に
記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線
は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、アデニレートサイクラーゼ活
性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に
記載される様々な血清と共にインキュベートした。横線
は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図４】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌ
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈ
ｌｙの溶血活性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及
び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベー
トした。横線は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈ
ｌｙの溶血活性の阻害を示す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及
び方法の部に記載される様々な血清と共にインキュベー
トした。横線は標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図５】様々なマウスにおいて得られるｒ−ＡＣ−Ｈｌ
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、細胞毒性活性の阻害を示
す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に記載される様
々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差
（ｎ＝４）を示す。
ｙ断片に対する抗血清及び百日咳菌に感染したマウス及
び小児からの血清による、細胞毒性活性の阻害を示
す。：ＡＣ−Ｈｌｙを材料及び方法の部に記載される様
々な血清と共にインキュベートした。横線は標準偏差
（ｎ＝４）を示す。
【図６】ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ及びその切詰められた蛋白質
の防御活性。３ないし４週齢のマウスを、水酸化アルミ
ニウムに吸着させた１５μｇのｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（△−
△）、ΔＣｌａ（黒三角−黒三角）、ΔＣ１３０７（黒
丸−黒丸）、もしくはΔＨＲ２（［］−［］）、ΔＣ２
１７（黒四角−黒四角）、ΔＨ（□−□）又は百日咳菌
ＡＣ−Ｈｌｙ（○−○）で、あるいは対照としての水酸
化アルミニウムのみを含有するバッファ（□−［］）
で、２週間の間隔で２回免疫した。これらを、２週間後
に、鼻腔内経路により１０5 ＣＦＵの百日咳菌１８３２
３に感染させる。曲線は、ポイント毎の６匹のマウスに
ついての標準幾何偏差（横線）を示す。
の防御活性。３ないし４週齢のマウスを、水酸化アルミ
ニウムに吸着させた１５μｇのｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ（△−
△）、ΔＣｌａ（黒三角−黒三角）、ΔＣ１３０７（黒
丸−黒丸）、もしくはΔＨＲ２（［］−［］）、ΔＣ２
１７（黒四角−黒四角）、ΔＨ（□−□）又は百日咳菌
ＡＣ−Ｈｌｙ（○−○）で、あるいは対照としての水酸
化アルミニウムのみを含有するバッファ（□−［］）
で、２週間の間隔で２回免疫した。これらを、２週間後
に、鼻腔内経路により１０5 ＣＦＵの百日咳菌１８３２
３に感染させる。曲線は、ポイント毎の６匹のマウスに
ついての標準幾何偏差（横線）を示す。
【図７】百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙをコードする
遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
【図８】図７に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列の続き。
列の続き。
【図９】図７に示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列の続き。
列の続き。
【図１０】気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙをコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ
酸配列。
ードする遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ
酸配列。
【図１１】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
【図１２】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
【図１３】図１０に示すアミノ酸配列の続き。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年１１月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】百日咳菌及びｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ蛋白質の電気泳
動を表す写真。２００ｎｇの精製百日咳菌及びｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙを８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動
し、蛋白質をクーマシー・ブルーで染色し（Ａ）、ある
いは、ハイボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（ＨＹＢ
ＯＮＤ Ｃ−Ｓｕｐｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移し
て、ワクチン接種２２日後の２０匹のマウスからの混合
抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清（Ｂ）、又は百日咳菌に由来
するＡＣ−Ｈｌｙに特異的なモノクローナル抗体
（Ｃ）、又は感染した小児（培養によって確認された感
染）からの血清混合物（Ｄ）、又は百日咳菌１８３２３
に感染したマウスから感染の２週間後に採取した血清
（Ｅ）、又は百日咳菌に感染したマウスから感染の２ヶ
月後に採取した血清（Ｆ）と共にインキュベートした。
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を用いて免
疫検出を行った。ライン１：百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙ；ラ
イン２：ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン３：ΔＨＲ２；ライ
ン４：ΔＨ；ライン５：ΔＣｌａ；ライン６：ΔＣ２１
７；ライン７：ΔＣ１３０７；数字は分子量マーカーを
示す。
動を表す写真。２００ｎｇの精製百日咳菌及びｒ−ＡＣ
−Ｈｌｙを８−２５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動
し、蛋白質をクーマシー・ブルーで染色し（Ａ）、ある
いは、ハイボンド・Ｃ−スーパー・メンブラン（ＨＹＢ
ＯＮＤ Ｃ−Ｓｕｐｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移し
て、ワクチン接種２２日後の２０匹のマウスからの混合
抗−ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ血清（Ｂ）、又は百日咳菌に由来
するＡＣ−Ｈｌｙに特異的なモノクローナル抗体
（Ｃ）、又は感染した小児（培養によって確認された感
染）からの血清混合物（Ｄ）、又は百日咳菌１８３２３
に感染したマウスから感染の２週間後に採取した血清
（Ｅ）、又は百日咳菌に感染したマウスから感染の２ヶ
月後に採取した血清（Ｆ）と共にインキュベートした。
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗−マウス抗体を用いて免
疫検出を行った。ライン１：百日咳菌ＡＣ−Ｈｌｙ；ラ
イン２：ｒ−ＡＣ−Ｈｌｙ；ライン３：ΔＨＲ２；ライ
ン４：ΔＨ；ライン５：ΔＣｌａ；ライン６：ΔＣ２１
７；ライン７：ΔＣ１３０７；数字は分子量マーカーを
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/235 Ｃ０７Ｋ 14/235 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ニコル・ギーソ フランス国、75013 パリ、ブールバー ル・サンマルセル 13
Claims (35)
- 【請求項１】 アデニールサイクラーゼ−溶血素（ＡＣ
−Ｈｌｙ）のポリペプチド配列から誘導されるアミノ酸
配列であって、百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び／
又は気管支敗血症菌による感染に対する防御抗体の形成
を誘発することが可能であり、かつ下記鎖より選択され
ることを特徴とするアミノ酸配列： ａ）百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド配
列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における前
記配列に対応する配列の９１０位、好ましくは９１３位
と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に大凡位置するアミノ酸
鎖を含む配列であって、大凡９８０位から大凡９８５位
のアミノ酸の間に、好ましくは９８３位アミノ酸のレベ
ルで、脂肪酸の付加による変性を受けている配列； ｂ）６ないし５００個のアミノ酸を有する鎖を含む配列
であって、百日咳菌由来のＡＣ−Ｈｌｙのポリペプチド
配列又はパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌における
前記配列に対応する配列の３８５ないし４００位のアミ
ノ酸を含む配列； ｃ）前記ａ）及びｂ）に定義されるアミノ酸鎖を含む配
列であって、該鎖が隣接しているか、あるいは百日咳
菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−
Ｈｌｙ内で上記ａ）及びｂ）に定義される鎖の間に天然
に存在するアミノ酸鎖を介して結合しているか、あるい
はＡＣ−Ｈｌｙとは異なる蛋白質から誘導される抗原性
配列を介して結合しており、得られるアミノ酸配列が百
日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する対
応ＡＣ−Ｈｌｙポリペプチド配列と同等の、もしくは類
似する３次元構造を有する配列。 - 【請求項２】 百日咳菌又はパラ百日咳菌又は気管支敗
血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの対応ポリペプチド配列
と等価の、もしくは類似する３次元構造を有するポリペ
プチドの形態にあり、百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ
のポリペプチド配列の大凡９００位、特には９１０位、
と最終Ｃ−末端アミノ酸との間に位置するアミノ酸鎖、
又は該アミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支
敗血症菌の配列鎖を含むことを特徴とする請求項１記載
のアミノ酸配列であって、加えて、該配列が大凡９８０
位のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間に、特に
は９８３位のアミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による
変性を受けているアミノ酸配列。 - 【請求項３】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリ
ペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡最終Ｃ−
末端アミノ酸との間のアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対
応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
よって形成されることを特徴とする請求項１記載のアミ
ノ酸配列であって、該配列が大凡９８０位のアミノ酸と
大凡９８５位のアミノ酸との間に、特には９８３位のア
ミノ酸のレベルで、脂肪酸の付加による変性を受けてい
るアミノ酸配列。 - 【請求項４】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリ
ペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡４００位
のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又は該アミノ酸に対応
するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖によ
って形成されることを特徴とする請求項１記載のアミノ
酸配列。 - 【請求項５】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリ
ペプチド配列の大凡３８５位のアミノ酸と大凡５００位
のアミノ酸との間のアミノ酸鎖、又はこのアミノ酸に対
応するパラ百日咳菌もしくは気管支敗血症菌の配列鎖に
よって形成されることを特徴とする請求項１記載のアミ
ノ酸配列。 - 【請求項６】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリ
ペプチド配列の８２７位ないし８８７位のアミノ酸鎖、
又はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管
支敗血症菌の配列鎖に相当する、ΔＣｌａと呼ばれるポ
リペプチド断片の欠失により変性されたＡＣ−Ｈｌｙの
ポリペプチド配列であることを特徴とする請求項１記載
のアミノ酸配列であって、得られる配列が大凡９８０位
のアミノ酸と大凡９８５位のアミノ酸の間に、好ましく
は９８３位のアミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変
性を受けているアミノ酸配列。 - 【請求項７】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙのポリ
ペプチド配列の３８５位ないし８２７位のアミノ酸鎖又
はこのアミノ酸に対応するパラ百日咳菌もしくは気管支
敗血症菌の配列鎖に相当する、ΔＨと呼ばれるポリペプ
チド断片の欠失により変性されたＡＣ−Ｈｌｙのポリペ
プチド配列であることを特徴とする請求項１記載のアミ
ノ酸配列であって、得られた配列が大凡９８０位のアミ
ノ酸と大凡９８５位のアミノ酸との間に、好ましくは９
８３位アミノ酸のレベルで脂肪酸の付加による変性を受
けているアミノ酸配列。 - 【請求項８】 脂肪酸の付加による変性がパルミトイル
化であることを特長とする請求項１ないし７のいずれか
１項に記載のアミノ酸配列。 - 【請求項９】 百日咳菌に由来する請求項１ないし８の
いずれか１項に記載の配列、及びパラ百日咳菌に由来す
る請求項１ないし８のいずれか１項に記載の配列を含有
することを特徴とするポリペプチド組成物。 - 【請求項１０】 気管支敗血症菌に由来する請求項１な
いし８のいずれか１項に記載の配列をさらに含有するこ
とを特徴とする請求項３記載のポリペプチド組成物。 - 【請求項１１】 パラ百日咳菌に由来する請求項１ない
し８のいずれか１項に記載の配列及び気管支敗血症菌に
由来する請求項１ないし８のいずれか１項に記載の配列
を含有することを特徴とするポリペプチド組成物。 - 【請求項１２】 請求項１ないし７のいずれか１項に記
載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。 - 【請求項１３】 請求項１ないし１１のいずれか１項に
記載の配列の１以上を含有することを特徴とする免疫組
成物。 - 【請求項１４】 百日咳菌、パラ百日咳菌もしくは気管
支敗血症菌から選択されるボルデテラ属の株に由来する
ｖｒｇ遺伝子の発現産生物、又はこれらの発現産生物の
一部を含む細菌抽出物を、この抽出物が投与されるホス
トに免疫応答を誘発するに十分なだけさらに含有するこ
とを特徴とする請求項１３記載の免疫組成物。 - 【請求項１５】 ＦＨＡ、ＡＧＧ類もしくはＰＲＮ及び
ＰＴＸ又はこれらの蛋白質の一部から選択される、百日
咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌に由来する１以
上のアドヘシンもしくは毒素を、この抽出物が投与され
るホストにおける免疫応答を誘発するに十分なだけさら
に含有することを特徴とする請求項１４記載の免疫組成
物。 - 【請求項１６】 ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミ
ノ酸配列及び、適当であるならば、ｖｒｇ遺伝子によっ
て発現する蛋白質が得られる百日咳菌の株が、Ｉ−１４
８５としてＣＮＣＭに寄託されているＨＡＶ株であるこ
とを特徴とする請求項１３ないし１５のいずれか１項に
記載の免疫組成物。 - 【請求項１７】 ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミ
ノ酸配列及びｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質が得
られるパラ百日咳菌の株が、Ｉ−１４９８としてＣＮＣ
Ｍに寄託されている第１号株であることを特徴とする請
求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の免疫組成物 - 【請求項１８】 ＡＣ−Ｈｌｙ毒素から誘導されるアミ
ノ酸配列及びｖｒｇ遺伝子によって発現する蛋白質が得
られる気管支敗血症菌の株が、Ｉ−８５８としてＣＮＣ
Ｍに寄託されている９７３５株であることを特徴とする
請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の免疫組成
物 - 【請求項１９】 活性成分として請求項１３ないし１８
のいずれか１項に記載の免疫組成物を、薬学的に許容し
得る担体及び、適当であるならば、アジュバントと共に
含有することを特長とするワクチン組成物。 - 【請求項２０】 − アジュバントと組合せて、あるい
は他の方法でアジュバントを用いて、請求項１ないし７
のいずれか１項に記載のアミノ酸配列の１以上で動物を
免疫する工程、 − 免疫に用いられたアミノ酸配列を認識することが可
能な、形成された抗体を回収する工程、によって得られ
るポリクローナル血清。 - 【請求項２１】 動物の免疫が、請求項１ないし７のい
ずれか１項に記載のアミノ酸配列の１以上及びＡＣ−Ｈ
ｌｙから定義される抗原を含有する免疫組成物を用いて
行なわれることを特長とする請求項２０記載のポリクロ
ーナル血清。 - 【請求項２２】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ、パ
ラ百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙ及び気管支敗血症菌
に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識するモノクローナル抗体
の製造方法であって、 − 動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、百日咳菌に
由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし４００位のアミ
ノ酸配列を有するペプチドで免疫し、適当である場合に
は、該免疫がペプチドの繰返し投与により行われる工
程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを形成する工程、 − 該ハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培
養する工程、 − 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３８５位ないし
４００位のアミノ酸配列に対する抗体を回収する工程、
を包含する方法。 - 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法を用いて得ら
れるモノクローナル抗体。 - 【請求項２４】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの３
８５位ないし４００位のアミノ酸配列を認識することを
特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項２５】 百日咳菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの最
後の２１７個のアミノ酸の配列、特には百日咳菌に由来
するＡＣ−Ｈｌｙの１４８８位ないし１７０５位のアミ
ノ酸配列又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙの
１４８９位ないし１７０６位のアミノ酸配列に対するモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項２６】 Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄託さ
れているハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３とし
てＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマＥ１７−２
１によって産生される、請求項２４又は２５に記載のモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項２７】 請求項１ないし７のいずれか１項に記
載のアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体。 - 【請求項２８】 百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び
／又は気管支敗血症菌に由来するＡＣ−Ｈｌｙを認識す
るモノクローナル抗体の製造方法であって、 − 動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、請求項１な
いし９のいずれか１項に記載のアミノ酸配列で免疫する
工程、 − 免疫動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを形成する工程、 − 該ハイブリドーマを抗体の産生が可能な条件下で培
養する工程、 − 免疫に用いられたアミノ酸配列に対する抗体を回収
する工程、を包含する方法。 - 【請求項２９】 活性成分として、請求項２２ないし２
７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含有す
ることを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項３０】 百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び
／又は気管支敗血症菌に感染したホストの免疫療法にお
いて医薬生成物として用いられる、請求項２２ないし２
７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３１】 百日咳菌及び／又はパラ百日咳菌及び
／又は気管支敗血症菌に感染したホストの免疫療法にお
いて医薬生成物として用いられる、請求項２０又は２１
に記載のポリクローナル血清。 - 【請求項３２】 Ｉ−１７３４としてＣＮＣＭに寄託さ
れるハイブリドーマＢ５−４又はＩ−１７３３としてＣ
ＮＣＭに寄託されるハイブリドーマＥ１７−２１である
ことを特徴とするハイブリドーマ。 - 【請求項３３】 ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ
百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出す
る方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は
動物からの生物学的流体サンプルを請求項２３ないし２
７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は請求
項２０又は２１に記載のポリクローナル血清と接触さ
せ、サンプル中にボルデテラ属細菌が存在する場合に、
該モノクローナルもしくはポリクローナル抗体とボルデ
テラ属の細菌との免疫学的反応を検出することを特徴と
する方法。 - 【請求項３４】 ボルデテラ属菌、特に百日咳菌、パラ
百日咳菌又は気管支敗血症菌による感染を生体外検出す
る方法であって、ボルデテラ属菌に感染し得る患者又は
動物からの生物学的流体サンプルを請求項１ないし７の
いずれか１項に記載のアミノ酸配列と接触させ、該アミ
ノ酸配列と被検サンプル中に存在する抗体との免疫学的
反応を検出することを特徴とする方法。 - 【請求項３５】 活性成分として、請求項１２に記載の
ヌクレオチド配列を含有することを特徴とする医薬組成
物。
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