ES2320392T3 - Epitopos protectores de la adenilato ciclasa-hemolisina (ac-hly), su aplicacion al tratamiento o a la prevencion de las infecciones por bordetella. - Google Patents
Epitopos protectores de la adenilato ciclasa-hemolisina (ac-hly), su aplicacion al tratamiento o a la prevencion de las infecciones por bordetella. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE AC-HLY DE B. PERTUSSIS, B. PARAPERTUSSIS Y/O B. BRONCHISEPTICA, QUE LLEVA EPITOPES CAPACES DE INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNITARIA PROTECTORA CONTRA LA INFECCION POR BORDETELLA. LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS, PARTICULARMENTE MONOCLONALES, DIRIGIDOS CONTRA ESTOS EPITOPES.
Description
Epítopos protectores de la adenilato
ciclasa-hemolisina (AC-Hly), su
aplicación al tratamiento o a la prevención de las infecciones por
Bordetella.
La presente invención se refiere a secuencias de
aminoácidos que comprenden los epítopos de la adenilato
ciclasa-hemolisina de Bordetella. La
adenilato ciclasa-hemolisina
(AC-Hly) es una de las toxinas que participan en los
síndromes infecciosos de Bordetella. La
AC-Hly es una proteína bifuncional, que posee una
actividad adenilato ciclasa y una actividad hemolítica. Es
secretada por la bacteria. Se ha clonado y secuenciado su gen
(Glaser P. et al, 1988, Molec. Microb. 2,
19-20). Se ha comprobado que esta proteína forma
parte de la familia de las toxinas llamadas "RTX" por
"repeats in toxins" (repeticiones en toxinas) y presenta
homologías con la hemolisina de Escherichia coli,
Actinobacillus pleuropneumoniae, las leucotoxinas de
Pasteurella haemolytica y Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Esta proteína, como la PTX (toxina de la
tos ferina), es capaz de penetrar en las células eucariotas tales
como los macrófagos, de ser activada por la calmodulina, de
sintetizar grandes cantidades de AMPc y de alterar las funciones
celulares (Coote J. 1992. FEMS Microbiol. Rev.
88:137-162).
Los inventores han identificado dentro de esta
secuencia diferentes dominios que tienen la capacidad de inducir la
formación de anticuerpos protectores contra una infección por
Bordetella, en particular, por B. pertussis, y/o
B. parapertussis y/o B. bronchiseptica.
Por consiguiente, la invención tiene por objeto
secuencias de aminoácidos que pueden entrar en la constitución de
composiciones inmunógenas o de vacunas protectoras contra
infecciones por Bordetella, así como anticuerpos dirigidos
contra estas secuencias de aminoácidos, utilizables por ejemplo en
inmunoterapia. La inmunoterapia o seroterapia es especialmente
aplicable en los niños, y si es necesario en alimentos infectados
por B. pertussis, B. parapertussis o B.
bronchiseptica. La invención propone aplicaciones en medicina
humana o en medicina veterinaria.
La presente invención tiene por objeto una
secuencia de aminoácidos derivados de la secuencia polipeptídica de
la adenilato ciclasa-hemolisina
(AC-Hly), caracterizada porque es capaz de inducir
la formación de anticuerpos protectores contra una infección por
B. pertussis y/o B. parapertussis y/o B.
bronchiseptica y en la que se elige entre las secuencias
siguientes:
- a)
- la secuencia de una proteína truncada que comprende la concatenación de los aminoácidos situados aproximadamente entre la posición 910, preferentemente 913, y el último aminoácido del extremo carboxilo de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, comprendiendo dicha secuencia una modificación por adición de un ácido graso entre los aminoácidos aproximadamente 980 y aproximadamente 985, preferentemente en el aminoácido 983;
- b)
- una secuencia que tiene una conformación tridimensional idéntica o análoga a la de la secuencia polipeptídica correspondiente de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, que comprende una concatenación de aminoácidos tal como la definida más arriba en a) y una concatenación de 16 a 500 aminoácidos que comprende una secuencia que consiste en la concatenación de los aminoácidos 385 a 400, 385 a 450 ó 385 a 500 de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, reuniéndose estas dos concatenaciones por medio de una secuencia antigénica derivada de una proteína diferente de la AC-Hly; y
- c)
- una secuencia que tiene una conformación tridimensional idéntica o análoga a la de la secuencia polipeptídica correspondiente de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, que comprende una concatenación de aminoácidos tal como la definida más arriba en a) y una concatenación de 16 a 500 aminoácidos que comprende una secuencia que consiste en la secuencia de los aminoácidos 385 a 400, 385 a 450 ó 385 a 500 de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, estando estas dos concatenaciones contiguas o bien unidas por medio de la secuencia de aminoácidos que aparece en la naturaleza entre las dos concatenaciones definidas más arriba dentro de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, y estando truncada la secuencia de aminoácidos obtenida con relación a la secuencia AC-Hly de Bordetella.
La solicitud describe también una secuencia que
comprende una concatenación de 16 a 500 aminoácidos que comprende
los aminoácidos 385 a 400 de la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia
que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B.
bronchiseptica, capaz de inducir la formación de anticuerpos
protectores contra una infección por B. pertussis y/o B.
parapertussis y/o B. bronchiseptica.
Con la expresión "secuencia de aminoácidos
derivada de la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly" se entiende, dentro del ámbito de la
invención, una secuencia cuyos aminoácidos son idénticos, por su
naturaleza o por su concatenación, a los de la secuencia
polipeptídica de la AC-Hly, o se han sustituido,
eliminado o añadido algunos de ellos, de tal forma que se conservan
las propiedades inmunitarias de la AC-Hly. En
particular, una secuencia tal, derivada de la secuencia
polipeptídica de la AC-Hly, es reconocida por
anticuerpos formados en un paciente infectado por
Bordetella, especialmente por B. pertussis, B.
parapertussis o B. bronchiseptica.
Se considerará, en el ámbito de la presente
invención, que la estructura o la conformación de la
AC-Hly está conservada, y que la secuencia de
aminoácidos de la invención tiene en tal caso una estructura
idéntica o análoga a la de la AC-Hly, cuando dicha
secuencia de aminoácidos es capaz, después de la inmunización de un
paciente o de un animal, de inducir una inmunidad protectora contra
las infecciones por Bordetella.
Una secuencia según la invención se puede
obtener mediante proteólisis de la AC-Hly purificada
de Bordetella. Preferentemente, esta secuencia se ha
obtenido mediante síntesis química o mediante las técnicas de
ingeniería genética.
Así, para producir mediante ingeniería genética
una secuencia de aminoácidos según la invención, se acudirá a
plásmidos que llevan los fragmentos del gen CyaA.
A modo de ejemplo, la síntesis química se puede
realizar automáticamente en aparatos de tipo Applied Biosystem.
También se puede llevar a cabo la técnica de Betsou F. et al,
1993, Infect. Immun., 61:3583-3589.
De este modo, se podrá preparar un péptido que
corresponde a la secuencia de los aminoácidos 385 a 400, o bien 385
a 500, de la AC-Hly de B. pertussis o en la
concatenación correspondiente de la AC-Hly de B.
parapertussis o de B. bronchiseptica. La secuencia de los
aminoácidos así como la secuencia nucleotídica de la
AC-Hly de B. pertussis se ha descrito en
Glaser et al., 1988, Molec. Microb.
2-19-30 y está representada en la
figura 5. La secuencia de aminoácidos y la secuencia nucleotídica de
la AC-Hly de B. bronchiseptica se representa
en la figura b.
La secuencia de aminoácidos de la
AC-Hly de B. parapertussis y la secuencia
nucleotídica que codifica la AC-Hly se pueden
obtener por las técnicas clásicas a partir del ADN de una cepa de
B. parapertussis, por ejemplo la cepa n.º 1 depositada en la
CNCM el 2 de diciembre de 1994 con el n.º
I-1498.
Cuando una secuencia de aminoácidos según la
invención se genera mediante ingeniería genética a partir del ADN
de los genes CyaA de B. pertussis, B.
parapertussis o B. bronchiseptica, y cuando comprende el
aminoácido en la posición 983 de la AC-Hly de B.
pertussis o un aminoácido correspondiente de la
AC-Hly de B. parapertussis o B.
bronchiseptica, se procurará que se genere esta secuencia en una
célula hospedadora que exprese igualmente el gen CyaC de las
cepas identificadas más arriba. La expresión del gen CyaC
permite la modificación por adición de un ácido graso para conservar
en la secuencia de aminoácidos que comprende el resto 983. La
adición de un ácido graso puede, a modo de ejemplo, ser una
palmitoilación.
Las cepas utilizables para tener acceso a los
genes CyaA y CyaC son, por ejemplo, B.
pertussis HAV depositada en la CNCM el 19 de octubre de 1994
con el n.º I-1485, B. parapertussis
I-1498 y B. bronchiseptica 9.73S depositadas
en la CNCM el 12 de mayo de 1989 con el n.º
I-858.
Por otro lado, las secuencias nucleotídicas que
codifican la AC-Hly de B. pertussis y de
B. bronchiseptica se presentan respectivamente en las
figuras 5 y 6.
La secuencia nucleotídica del gen CyaC,
activador del gen CyaA, se ha descrito en la publicación de
Barry E. M. et al (Journal of Bacteriology, enero de
1991, pág. 720-726).
Una secuencia interesante en el ámbito de la
presente invención es la secuencia que corresponde a las regiones
llamadas región de modificación y región repetida de la
AC-Hly (véase la figura 1).
Cuando se presenta una secuencia antigénica
heteróloga con relación a la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly, puede tratarse de una secuencia de un
antígeno de un microorganismo patógeno bacteriano, vírico,
parasitario especialmente, contra el cual se busca, por ejemplo, la
formación de anticuerpos protectores.
Con la expresión "anticuerpos protectores
contra una infección por B. pertussis y/o B.
parapertussis y/o B. bronchiseptica" se hace
referencia a los anticuerpos que protegen contra las infecciones
mortales y submortales inducidas por bacterias, es decir, que
protegen contra la enfermedad y la infección.
Ventajosamente, las secuencias de aminoácidos
según la invención, capaces de inducir la formación de anticuerpos
protectores contra las infecciones citadas más arriba, se asocian a
factores implicados en la virulencia de las Bordetella,
utilizadas, por ejemplo, en forma de preparaciones polipeptídicas o
de extractos bacterianos que tienen la capacidad de inducir una
protección contra la persistencia de bacterias en el hospedador.
Una secuencia de aminoácidos interesante en el
ámbito de la invención es una secuencia caracterizada porque se
encuentra en forma de un polipéptido que tiene una conformación
tridimensional idéntica o análoga a la de la secuencia
polipeptídica correspondiente de la AC-Hly de B.
pertussis o de B. parapertussis o de B.
bronchiseptica, en la que comprende la concatenación de
aminoácidos situados entre las posiciones 900 aproximadamente, en
particular 910, y el último aminoácido cercano al extremo carboxilo
de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B.
pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en
B. parapertussis o en B. bronchiseptica,
comprendiendo dicha secuencia además una modificación por adición de
un ácido graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 985
aproximadamente, en particular en el aminoácido 983.
Esta secuencia de aminoácidos comprende la
región de modificación y la región repetida de la
AC-Hly.
Otra secuencia de aminoácidos preferente según
la invención es una secuencia caracterizada porque está formada por
la concatenación de aminoácidos comprendidos entre el aminoácido en
la posición 385 aproximadamente y aproximadamente el último
aminoácido del extremo carboxilo de la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia
que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B.
bronchiseptica, comprendiendo dicha secuencia una modificación
por adición de un ácido graso entre los aminoácidos 980
aproximadamente y 985 aproximadamente, preferentemente en el
aminoácido 983.
La solicitud también describe una secuencia de
aminoácidos, formada por la concatenación de aminoácidos
comprendidos entre el aminoácido en la posición 385 aproximadamente
y el aminoácido en la posición 400 aproximadamente de la secuencia
polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o
de una secuencia que corresponde a la anterior en B.
parapertussis o en B. bronchiseptica.
Ventajosamente, esta secuencia de aminoácidos
comprende un epítopo capaz de inducir la formación de anticuerpos
protectores contra una infección por las Bordetella de tipo
B. pertussis, B. parapertussis y B.
bronchiseptica.
También se describe una secuencia de
aminoácidos, caracterizada porque está formada por la concatenación
de aminoácidos comprendidos entre el aminoácido en la posición 385
aproximadamente y el aminoácido en la posición 500 aproximadamente
de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B.
pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en
B. parapertussis o en B. bronchiseptica.
Ventajosamente, esta secuencia que comprende los
aminoácidos 385 a 400 ó 385 a 500 se presenta en una conformación
idéntica o análoga a la conformación que posee en la proteína
AC-Hly de Bordetella.
La invención tiene igualmente por objeto las
secuencias de aminoácidos obtenidos por la eliminación de fragmentos
polipeptídicos a partir de la secuencia de la
AC-Hly de Bordetella, bien si se trata de la
secuencia purificada a partir de la bacteria, y en particular a
partir de B. pertussis, B. parapertussis o B.
bronchiseptica, o bien si se trata de una secuencia obtenida a
partir de una proteína recombinante
r-AC-Hly.
Una secuencia de aminoácidos así obtenida es
ventajosamente la secuencia denominada \DeltaCla que corresponde
a la concatenación de la AC-Hly modificada por la
eliminación de un fragmento \DeltaCla representado en la figura
1, que corresponde a la concatenación de los aminoácidos 827 a 887
de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B.
pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en
B. parapertussis o en B. bronchiseptica,
comprendiendo la secuencia obtenida una modificación por la adición
de un ácido graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 985
aproximadamente, preferentemente en el aminoácido 983.
Se puede eliminar otro fragmento de la secuencia
de la AC-Hly para formar una secuencia de
aminoácidos según la invención; se trata del fragmento
polipeptídico \DeltaH que corresponde a la concatenación de los
aminoácidos 385 a 827 de la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que
corresponde a la precedente en B. parapertussis o en B.
bronchiseptica, comprendiendo la secuencia obtenida una
modificación por adición de un ácido graso entre los aminoácidos 980
aproximadamente y 985 aproximadamente, preferentemente en el
aminoácido 983.
La invención también tiene por objeto la
secuencia de aminoácidos que forma la "región repetida" de la
AC-Hly de Bordetella, comprendida entre los
restos de aminoácidos 1000 y 1600 aproximadamente. La región
repetida de B. bronchiseptica comprende una repetición de
menos con respecto a la AC-Hly de B.
pertussis. En este sentido, la invención se refiere, por
ejemplo, a la secuencia que comprende los aminoácidos 1552 a 1592
de AC-Hly B. pertussis.
La invención se refiere también a las secuencias
nucleotídicas que codifican las secuencias de aminoácidos de la
invención descritas más arriba.
Los genes CyaA, CyaB y
particularmente CyaD de B. bronchiseptica se han
clonado en el plásmido pFBD2 alojado por E. coli K12 XL1 y
depositado en la CNCM el 21 de junio de 1995 con el n.º
1-1601.
El plásmido pFBD2 se obtiene mediante la
inserción del fragmento de 8 kb de B. bronchiseptica que
contiene los genes CyaA, CyaB y parcialmente CyaD, en
el sitio BamHI.
Por otro lado, la invención tiene por objeto
composiciones polipeptídicas que comprenden secuencias según la
invención originarias de diferentes tipos de Bordetella. Por
ejemplo, una composición polipeptídica ventajosa comprende una
secuencia definida anteriormente de B. pertussis y otra
secuencia o varias de estas secuencias de B.
parapertussis.
Otra composición polipeptídica de la invención
comprende además una o varias secuencias de B.
bronchiseptica.
Según otro modo de realización de la invención,
una composición polipeptídica se caracteriza porque comprende una o
varias secuencias de la invención definidas anteriormente de B.
parapertussis y una o varias secuencias de B.
bronchiseptica.
La invención tiene igualmente por objeto las
composiciones inmunógenas caracterizadas porque comprenden una o
varias secuencias de la invención definidas en las páginas
anteriores.
De modo interesante para la protección contra la
infección por las Bordetella y en particular para la
protección contra la persistencia de bacterias en el hospedador, una
composición inmunógena que comprende las secuencias de aminoácidos
de la invención se puede caracterizar porque comprende además un
extracto bacteriano que contiene los productos de expresión de los
vrg de una cepa de Bordetella elegida entre B.
pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica o
de una parte de estos productos de expresión, suficiente para
inducir una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le
administrará el extracto.
Además de la presencia de diferentes adhesinas y
toxinas, las Bordetella se caracterizan por una regulación
de la expresión de los factores implicados en su virulencia. Es
decir, las Bordetella experimentan variaciones y
modulaciones de fase.
Las Bordetella, de acuerdo con su
entorno, pueden convertirse en "avirulentas", es decir,
incapaces de inducir la muerte, una reacción inflamatoria y lesiones
pulmonares en el modelo murino de infección respiratoria.
Experimentan o bien una modulación de fase, o bien una variación de
fase. La variación de fase se observa a una frecuencia que va de
10^{-3} a 10^{-6} y es casi irreversible. Se traduce en una
parada de la expresión de las toxinas y de las adhesinas descritas
anteriormente, y en la expresión de otros factores que todavía no
se han caracterizado bien (cambio de las bacterias "virulentas"
de fase I en bacterias "avirulentas" de fase IV). Las
bacterias de fase I y de fase IV han sido descritas por Lacey B,
1960, J. Hyg, 58:57-93. La modulación de
fase, fenotípicamente parecida a la variación de fase, es totalmente
reversible y se traduce en una parada de la síntesis de las
adhesinas y de las toxinas cuando se producen cambios
medioambientales (composición del medio de cultivo, temperatura,
etc.).
La variación de fase y la modulación de fase
observadas en Bordetella se encuentran bajo el control de
dos genes reguladores, bvgA y bvgS (Arico B. et
al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:
6671-6675).
El gen bvgS codifica una proteína
sensible a las condiciones externas. Esta proteína modula, mediante
fosforilación, la actividad de la proteína codificada por el gen
bvgA, que es por una parte un activador positivo de la
transcripción de los genes que codifican los factores de virulencia
(genes vag por "vir activated genes" (genes activados
por vir) citados anteriormente (Uhl M. A. y Miller J. 1994. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:1163-1167), por otra
parte un represor de la transcripción de algunos genes (Beattie D.
T. et al, J. of Bacteriology, enero 93, pág.
159-527). Los genes cuya expresión se reprime se
denominan genes vrg por "vir repressed genes" (genes
reprimidos por vir) y todavía están mal caracterizados. Sin
embargo, se ha demostrado que el gen vrg6 de B.
pertussis codifica una proteína que interviene en la
persistencia de la bacteria en el hospedador (Beatties D. et
al, 1992, Infect. Imm. 60:571-577). En
B. bronchiseptica, se han caracterizado dos proteínas
codificadas por los genes vrg: se trata de proteínas de tipo
flagelos (B. bronchiseptica en fase I es una bacteria inmóvil
que no sintetiza los flagelos, pero que sintetiza adhesinas y
toxinas, y B. bronchiseptica en fase IV es una bacteria móvil
que sintetiza flagelos).
La presencia en la composición inmunógena de un
extracto bacteriano que comprende los productos de expresión de los
genes vrg permitirá mejorar la respuesta inmunitaria humoral
y/o celular obtenida después de la infección en los sujetos
vacunados y contribuirá también a la protección contra la
persistencia de la bacteria.
El extracto bacteriano llamado "extracto
bacteriano vrg" que se menciona más arriba contiene todos los
constituyentes de la membrana externa de una bacteria de fase IV, es
decir, de una bacteria que no expresa los genes vag,
incluida la endotoxina LPS. Sin embargo, esta endotoxina se puede
eliminar o destoxificar.
Este extracto se puede presentar en forma de
suspensión.
Los extractos bacterianos "vrg" a los que
se hace alusión para realizar la invención son preferentemente
extractos llamados "extractos de urea".
Un "extracto de urea" se compone de una
mezcla de proteínas expresadas en la superficie de la bacteria y
que se preparan de la bacteria después de la incubación de ésta con
urea a 5 M. El extracto de urea "vrg" contiene varias
proteínas todavía sin caracterizar, los flagelos y el LPS.
La utilización de los extractos de urea permite
especialmente fabricar una vacuna de menor coste en relación con
una vacuna que se obtendrá a partir de las proteínas contenidas en
los extractos, en forma purificada.
Además, los inventores han constatado que los
extractos de urea utilizados pueden inducir una respuesta
inmunitaria celular del tipo T (linfoproliferación), que se
comportan así como la vacuna celular utilizada hasta la fecha.
Al contrario, las composiciones exclusivamente
acelulares no inducirán la respuesta T, reacción que se produce por
lo tanto en caso de infección.
Los extractos de urea vrg se preparan
respectivamente a partir de las bacterias de fase IV. Si es
necesario, las bacterias de fase IV se reemplazan por bacterias
cuyo gen bvgS está mutado de forma tal que las bacterias
sólo expresan las proteínas codificadas por los genes
vrg.
La preparación de estos extractos se describe en
detalle en la parte experimental.
Así, la invención se refiere preferentemente a
una composición inmunógena que comprende al mismo tiempo un
extracto de urea vag de B. pertussis y un extracto de urea
vrg de B. pertussis.
Una cepa de B. pertussis adecuada para la
preparación de estos extractos es la cepa HAV que entra en el
ámbito de la invención y que está depositada en la CNCM
(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes en
París), el 19 de octubre de 1994 con el n.º 1-1485.
Para preparar el extracto de urea vag, la cepa HAV se puede
utilizar directamente porque se trata de una cepa de fase I.
En cambio, el extracto de urea vrg se obtiene a
partir de una cepa de fase IV derivada de la cepa de fase I, por
ejemplo, por mutación del gen bvgS de la bacteria o mediante
el cultivo de dicha cepa de fase I en un medio que contiene
únicamente sulfato de magnesio, para obtener la expresión solo de
los genes vrg de B. pertussis.
Del mismo modo y si es necesario, para mejorar
la respuesta inmunitaria en el hospedador en el que se administrará
la composición inmunógena. Ésta comprende además una o varias
adhesinas o toxinas de B. pertussis, B. parapertussis
o de B. bronchiseptica, elegida(s) entre la FHA, las
AGG o la PRN y la PTX, o una parte de estas proteínas, suficiente
para inducir una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le
administrará el extracto.
De modo ventajoso, las secuencias de aminoácidos
derivados de la toxina AC-Hly, y si es necesario las
proteínas expresadas por los genes VRG, se obtienen a partir
de la cepa HAV registrada en la CNCM con el n.º
I-1485.
Igualmente, las secuencias de aminoácidos de
B. parapertussis utilizadas en el ámbito de la invención se
obtienen a partir de la cepa n.º 1 depositada en la CNCM con el n.º
I-1498.
Por otro lado, las secuencias de aminoácidos de
la cepa B. bronchiseptica utilizadas en el ámbito de la
invención pueden obtener a partir de la cepa n.º 9.73S depositada en
la CNCM con el n.º I-858.
Las referencias dadas más arriba de las
diferentes cepas de Bordetella se indican bien para dar
acceso a la secuencia de las proteínas y, si es necesario, para
reproducir esta secuencia mediante síntesis química, o bien para
obtener las secuencias de aminoácidos de la invención por
proteólisis de las proteínas de Bordetella, o bien para dar
acceso al ADN de las cepas y así permitir la producción de las
secuencias de aminoácidos de la invención mediante las técnicas de
ingeniería genética.
La invención tiene igualmente por objeto una
composición para vacuna que comprende a modo de principio activo
una composición inmunógena definida más arriba, en asociación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable y si es necesario con un
adyuvante.
La invención se refiere también a un
procedimiento para preparar anticuerpos monoclonales que reconocen
la AC-Hly de B. pertussis, y la
AC-Hly de B. parapertussis y la
AC-Hly de B. bronchiseptica que comprende
las etapas de:
- -
- inmunización de un animal, por ejemplo un ratón Balb/c, con un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención descrita más arriba, realizándose la inmunización, si llegara el caso, por medio de administraciones repetidas del péptido;
- -
- fusión de los esplenocitos del animal inmunizado con las células de mieloma para formar un hibridoma;
- -
- cultivo del hibridoma en las condiciones que permiten la producción de anticuerpos;
- -
- recuperación de los anticuerpos dirigidos contra la secuencia de los aminoácidos utilizada para la inmunización.
La solicitud describe también a un procedimiento
de preparación de anticuerpos monoclonales que reconocen la
AC-Hly de B. pertussis y la
AC-Hly de B. parapertussis y la
AC-Hly de B. bronchiseptica que comprende las
etapas de:
- -
- inmunización de un animal, por ejemplo un ratón Balb/c, con un péptido que comprende la secuencia de los aminoácidos 385 a 400 de la AC-Hly de B. pertussis, realizándose la inmunización, si llegara el caso, por medio de administraciones repetidas del péptido;
- -
- fusión de los esplenocitos del animal inmunizado con las células de mieloma para formar un hibridoma;
- -
- cultivo del hibridoma en las condiciones que permiten la producción de anticuerpos;
- -
- recuperación de los anticuerpos dirigidos contra la secuencia de los aminoácidos 385 a 400 de la AC-Hly de B. pertussis.
Ventajosamente, el procedimiento anteriormente
descrito permite utilizar para la inmunización un antígeno
específico de la AC-Hly de B. pertussis para
obtener anticuerpos monoclonales que reconocen al mismo tiempo la
AC-Hly de B. pertussis así como las de B.
parapertussis y B. bronchiseptica. Además, tales
anticuerpos monoclonales tienen de forma interesante la capacidad de
proteger de cara a la infección de un hospedador humano o un animal
por las Bordetella del tipo B. pertussis, B.
parapertussis y/o B. bronchiseptica. Así, los
anticuerpos monoclonales obtenidos al llevar a cabo el procedimiento
descrito anteriormente se pueden utilizar para el tratamiento de
los pacientes o de los animales infectados por una o varias cepas
de Bordetella elegidas entre B. pertussis, B.
parapertussis o B. bronchiseptica.
De forma general, la invención tiene por objeto
los anticuerpos monoclonales caracterizados porque reconocen la
secuencia de los aminoácidos 385 a 400 de la AC-Hly
de B. pertussis.
La invención se refiere como tales a los
anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo que comprende la
secuencia de los aminoácidos 385 a 400 de la AC-Hly
de B. pertussis, producidos por el hibridoma
B5-4 depositado en la CNCM el 19 de junio de 1996
con el n.º I-1734.
Se producen otros anticuerpos monoclonales
ventajosos contra la secuencia de los 217 últimos aminoácidos de la
AC-Hly de B. pertussis y se producen mediante
el hibridoma E17-21 depositado en la CNCM el 19 de
junio de 1996 con el n.º I-1733.
La invención tiene igualmente por objeto
anticuerpos monoclonales dirigidos contra una cualquiera de las
secuencias de los aminoácidos anteriormente descritas. Los
anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra la
secuencia del extremo carboxilo de la AC-Hly se
encuentran entre los anticuerpos interesantes de la invención. Unos
anticuerpos en particular, por ejemplo, se dirigen contra una
secuencia derivada de la concatenación correspondiente que
comprende los 217 últimos aminoácidos de la AC-Hly
B. pertussis, especialmente los aminoácidos 1488 a 1705 de
la AC-Hly de B. pertussis o los aminoácidos
1489 a 1706 de la AC-Hly de B.
bronchiseptica. Estos anticuerpos monoclonales se pueden
preparar mediante un procedimiento análogo al descrito más arriba
para los anticuerpos monoclonales obtenidos contra el epítopo
contenido en la secuencia de los aminoácidos 385 a 400
aproximadamente de la AC-Hly de B.
pertussis.
Los anticuerpos de la invención se pueden
humanizar, por ejemplo, al reemplazar la parte hipervariable de una
inmunoglobulina humana que no tiene una función de anticuerpo, por
una región hipervariable de una inmunoglobulina monoclonal obtenida
por medio de la técnica descrita más arriba.
Estas técnicas que permiten humanizar los
anticuerpos se han descrito, por ejemplo, en Waldmann T., junio
1991, Science, vol. 252, pág. 1657-1662;
Winter G. et al., 1993, Immunology Today, vol. 14, nº
6, pág. 243-246; Carter et al., mayo de
1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pág.
4285-4289; Singer G. et al., 1 de abril de
1993, Journal of Immunology, vol. 150, nº 7, pág.
2844-2857.
La solicitud también describe los sueros
policlonales como los obtenidos mediante la inmunización de un
animal con una secuencia de aminoácidos que responden a las
definiciones dadas anteriormente y la recuperación de los
anticuerpos formados capaces de reconocer las secuencias utilizadas
para la inmunización.
Si es necesario, la inmunización comprende la
administración, junto con las secuencias de aminoácidos, de un
adyuvante.
Según un modo de realización particular de la
invención, la inmunización se realiza con una o varias secuencias
de aminoácidos y con una composición inmunógena que comprende los
antígenos diferentes de la AC-Hly.
La invención se refiere también a una
composición farmacéutica que comprende a modo de principio activo
los anticuerpos monoclonales según la invención.
Estos anticuerpos, en particular los anticuerpos
dirigidos contra la secuencia que comprende los aminoácidos 385 a
400 y/o los anticuerpos dirigidos contra la parte del extremo
carboxilo de la proteína AC-Hly, se pueden utilizar
como un medicamento en inmunoterapia en un hospedador infectado por
B. pertussis y/o B. parapertussis y/o B.
bronchiseptica.
Por ejemplo, se recurrirá a los anticuerpos
monoclonales producidos por el hibridoma B5-4
depositado en la CNCM con el n.º I-1734 o por el
hibridoma E17-21 depositado en la CNCM con el nº
I-1733.
Los anticuerpos según la invención también se
pueden utilizar como medio para analizar las cepas de
Bordetella recogidas. Los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra la secuencia de los aminoácidos 385 a 400 o contra la
secuencia del extremo carboxilo de la proteína
AC-Hly también son adecuados para el análisis de las
cepas de B. pertussis.
También entra dentro del ámbito de la invención
un procedimiento de detección in vitro de una infección por
una Bordetella, en particular por B. pertussis, B.
parapertussis o B. bronchiseptica, caracterizada porque
una muestra de líquido biológico de un paciente o de un animal que
puede estar infectado por Bordetella se pone en contacto con
los anticuerpos monoclonales de la invención definidos más arriba, y
en el que se detecta una reacción inmunológica entre dichos
anticuerpos monoclonales y las bacterias del género
Bordetella cuando se presentan en la muestra.
La detección de la infección por una bacteria
del género Bordetella, especialmente por B. pertussis,
B. parapertussis, B. bronchiseptica también se puede
poner en práctica sobre una muestra de un líquido biológico de un
paciente o de un animal al poner en contacto la muestra comprobada
con una secuencia de aminoácidos de la invención, seguida de la
detección de una reacción inmunológica entre dichas secuencias de
aminoácidos y los anticuerpos presentes en la muestra
comprobada.
La invención se refiere también a una
composición farmacéutica que comprende a modo de principio activo
las secuencias nucleotídicas de la invención descritas
anteriormente.
La utilización de las secuencias nucleotídicas
en las composiciones farmacéuticas se puede realizar por referencia
a la técnica descrita por Donnelly et al. (Nature
Médecine, 1995, vol. 1, nº 6, pág. 583-587).
Figura 1: Representación esquemática de las
proteínas truncadas de la AC-Hly utilizada. La
construcción de los plásmidos y la producción de las proteínas
truncadas correspondientes se ha descrito en las publicaciones
anteriores de Sebo P. et al., 1991, Gene,
104:19-24 y Sebo P. et al., 1993, Mol.
Microb. 9:999-1009. Los números colocados en la
columna "Mr" indican las masas moleculares relativas a las
toxinas, calculadas a partir de su secuencia de aminoácidos
deducida. Los números que siguen al símbolo \Delta en el nombre
del plásmido son los números del primer y del último aminoácido de
las partes eliminadas del marco de lectura de cyaA. Los
números que siguen al símbolo \DeltaC representan los restos del
extremo carboxilo que faltan. Los alelos cyaA se coexpresan
con el gen cyaC bajo el control de señales de iniciación de
la transcripción y de la traducción de un gen lacZ idéntico
al presente en el plásmido pCACT3 (Betsou F. et al., 1993,
Infect. Immun. 61:3583-3589). \DeltaC1307
se ha generado a partir de pDIA 5240 (pACT\DeltaC1307) en
presencia del gen cyaC expresado en trans a partir de
un plásmido compatible pPS4C (Betsou F. et al., 1993,
Infect. Immun. 61:3583-3589 y Sebo P. et
al., 1991, Gene, 104:19-24).
Figura 2: Caracterización de B. pertussis
y de la proteína r-AC-Hly: 200 ng de
B. pertussis purificada y de
r-AC-Hly se han sometido a una
electroforesis sobre SDS-PAGE 8-25%
y se han coloreado las proteínas con azul de Coomassie (A), o se
han transformado sobre una membrana HYBOND C-Super y
se han incubado con sueros mezclados
anti-r-AC-Hly de 20
ratones 22 días después de la vacunación (B), o con anticuerpos
monoclonales específicos contra la AC-Hly de B.
pertussis (C), o una mezcla de sueros de niños infectados
(infecciones confirmadas por cultivo) (D), o un suero de ratones
infectados por B. pertussis 18323 recogido dos semanas
después de la infección (E), o un suero de ratones infectados por
B. pertussis recogido dos meses después de la infección (F).
Se ha realizado la inmunodetección con los anticuerpos antirratón de
conejo marcados con peroxidasa. Carril 1: B. pertussis
AC-Hly; Carril 2:
r-AC-Hly; Carril 3: \DeltaHR2;
Carril 4: \DeltaH; Carril 5: \DeltaCla; Carril 6: \DeltaC217;
Carril 7: \DeltaC1307; los números indican los marcadores de masa
molecular.
Figura 3: inhibición de las actividades
adenilato ciclasa (A), hemolítica (B) y citotóxica (C) de la
AC-Hly de B. pertussis mediante los
antisueros dirigidos contra los fragmentos de la
r-AC-Hly obtenidos en diferentes
ratones y por sueros de ratones y de niños infectados por B.
pertussis: la AC-Hly se ha incubado con
diferentes sueros tal y como está descrito en la parte de
materiales y métodos. Las barras indican la desviación estándar (n
= 4).
Figura 4: Actividades protectoras de la
r-AC-Hly y de sus proteínas
truncadas. Los ratones de 3 a 4 semanas de edad se han inmunizado 2
veces, a intervalos de dos semanas, con 15 \mug de
r-AC-Hly
(\Delta-\Delta), \DeltaCla
(\ding{115}-\ding{115}), \DeltaC1307
(\bullet-\bullet), o \DeltaHR2
(\Box-\Box), \DeltaC217
(\blacksquare-\blacksquare), \DeltaH
(\Box-\Box) o AC-Hly de B.
pertussis (\medcirc-\medcirc) adsorbidos
sobre hidróxido de aluminio, o con un tampón que contiene hidróxido
de aluminio solo como control (\Box-\Box). Se
han infectado por vía intranasal dos semanas más tarde con 10^{5}
UFC de B. pertussis 18323. Las curvas muestran la desviación
geométrica estándar (barras) para seis ratones por punto.
Figura 5: Secuencia nucleotídica del gen que
codifica la AC-Hly de B. pertussis y la
secuencia de aminoácidos correspondiente.
Figura 6: Secuencia nucleotídica del gen que
codifica la AC-Hly de B. bronchiseptica y la
secuencia de aminoácidos correspondiente.
La cepa virulenta B. pertussis 18323
(ATCC 9797) se ha cultivado sobre un medio de agar Bordet Gengou
completado con 15% de sangre de cordero desfibrinado (BG) a 36ºC
durante 72 horas y de nuevo durante 24 horas. Los subcultivos en un
medio líquido se han efectuado en un medio de
Stainer-Scholte (Stainer D. W. y Scholte M. J.,
1971, J. Gen. Microb., 63:211-220) durante 8
horas a 36ºC hasta obtener una densidad óptica a 650 nm de 1,0
(DO_{620} = 1,0).
Los plásmidos utilizados para la producción de
la proteína recombinante r-AC-Hly y
de sus derivados truncados en E. coli se han descrito en las
publicaciones siguientes: Betsou F., P. Sebo y N. Guiso, 1993,
"CyaC-mediated activation is important not only
for toxic but also for protective activities of Bordetella
pertussis adenylate cyclase-hemolysin",
Infect. Immun. 61:3583-3589; Iwaki M.,
Ullmann A. y P. Sebo, 1995, "Oligomerization of the adenylate
cyclase toxin of Bordetella pertussis: Evidence from in vitro
complementation of individually inactive mutants". enviado;y
Sebo P., P. Glaser, H. Sakamoto et A. Ullmann, 1991, "High Level
synthesis of adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis in a
reconstructed Escherichia coli system", Gene 104:
19-24.
Los plásmidos permiten la producción de
diferentes proteínas (figura 1) en presencia de la proteína
activadora CyaC. Las cepas E. coli XL-1 Blue
(Stratagène) que contienen los plásmidos respectivos se han
cultivado a 37ºC sobre un medio 2xYT que contiene 100 \mug/m de
ampicilina a una densidad óptica (DO_{600}) de 0,5 a 0,7, y se
han inducido con IPTG (1 mM) durante cuatro horas más para obtener
la producción de la AC-Hly (Betsou F., P. Sebo y N.
Guiso, 1993, Infect. Immun. 61:
3583-3589).
La actividad adenilato ciclasa se ha medido
según el protocolo descrito por Ladant D., C. Brezin, I. Crenon, J.
M. Alonso y N. Guiso, (1987, "Bordetella pertussis adenylate
cyclase: purification, characterization and radioimmunoassay",
J. Biol. Chem. 261:16264-16269). Una unidad
(U) de actividad adenilato ciclasa corresponde a 1 nmol de AMPc
formado por minuto a 30ºC a pH 8,0. Las actividades hemolítica y
citotóxica de la AC-Hly se han determinado a 37ºC,
utilizando los eritrocitos lavados de cordero (109/ml) según la
descripción de Bellalou J., H. Sakamoto, D. Ladant, C. Geoffroy et
A. Ullmann, (1990, "Deletions affecting hemolytic and toxin
activities of Bordetella pertussis adenylate cyclase
infect." Immun. 58: 3242-3247). La
concentración de proteína se ha determinado mediante el método de
Bradford ("A rapid and sensitive method for the quantification of
micrograms of protein, utilising the principle of
protein-dye binding." Anal. Biochem. 72:
248-257).
La AC-Hly purificada de B.
pertussis se ha incubado a 100 U/ml en Tris-HCl
a 50 mM a pH 7,6, con 0,2 mM de CaCl_{2} y 0,1
NP-40 con diferentes sueros diluidos 100 veces
durante 18 a 20 h a 4ºC; se ha medido la actividad adenilato
ciclasa tras la incubación (IA) de las muestras. La actividad AC
(adenilato ciclasa) después de la incubación con el suero de
ratones inmunizados con el hidróxido de aluminio únicamente (CA) se
ha tomado como referencia de la actividad 100% (es decir, 0% de
inhibición).
El porcentaje de inhibición de la actividad AC
se ha calculado de la siguiente forma:
% \ de \
inhibición = 100% - (100% \ x \
IA/CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mezclado una unidad U de toxina y 5 \mul
de los diferentes sueros en 1 ml de Tris-HCl a 10 mM
a pH 8, con 2 mM de CaCl_{2}, 150 mM de NaCl y 1 \muM de
calmodulina bovina de cerebro, y se han preincubado durante 20
minutos a 4ºC. Se han añadido eritrocitos de cordero lavados
(10^{9}) y se ha determinado la actividad hemolítica restante
después de incubar durante 3 horas a la temperatura ambiente. Se han
recuperado los eritrocitos sin lisar en forma de un precipitado
después de centrifugar a 2000 RPM y se ha medido la densidad óptica
a 541 nm de la hemoglobina liberada (RH) en los sobrenadantes. Se ha
tomado como referencia de la actividad 100% (0% de inhibición) la
actividad hemolítica de la toxina incubada con sueros de ratón
inmunizados únicamente con hidróxido de aluminio (CH). Se han
utilizado los eritrocitos de cordero incubados sin la toxina como
control de la lisis inespecífica. El porcentaje de inhibición de la
actividad hemolítica se ha calculado de la siguiente forma: % de
inhibición = 100% - (100% x RH/CH).
Se han preincubado una unidad U de toxina y 5
\mul de diferentes sueros a 4ºC durante 20 minutos en un volumen
total de 1 ml de Tris-HCl a 10 mM a pH 8, con 2 mM
de CaCl_{2}, 150 mM de NaCl, 5 mM de glucosa, 1 mg/ml de SAB y 1
\muM de calmodulina bovina de cerebro. A continuación se han
lavado 10^{9} eritrocitos de cordero y se ha proseguido con la
incubación a 37ºC durante 30 minutos. Para detener la actividad de
la toxina, se han inyectado 50 \mul de suspensión de eritrocitos
en 1 ml de acetato de sodio a 50 mM en ebullición a pH 5,2 y se han
calentado a 100ºC durante 5 minutos. La cantidad de AMPc formada en
los eritrocitos lisados (IT) se ha determinado por el método ELISA
estándar (Pradelles P., Grassi J., Chabardes D., Guiso N. 1989,
Analytical Chemistry, 61:447-450). Se ha
utilizado la toxina incubada a 4ºC como control negativo de la
citotoxicidad. La actividad de la toxina incubada con el suero de
ratones inmunizados con hidróxido de aluminio sólo (CT) se ha
considerado como la actividad 100% (0% de inhibición). El porcentaje
de inhibición de la actividad citotóxica se ha calculado de la
siguiente forma: % de inhibición = 100% - (100% x IT/CT).
Se ha realizado una electroforesis
SDS-PAGE con un gel de poliacrilamida del 8 al 25%
listo para utilizar por el sistema PhastSystem (Pharmacia), y las
proteínas separadas se han electrotransferido de los geles de
poliacrilamida a membranas Hybond C-Super
(Amersham). Después del bloqueo, las membranas se han incubado con
una dilución 10^{-3} de los sueros policlonales a 4ºC durante toda
la noche. Se ha realizado la detección inmunoquímica utilizando las
inmunoglobulinas de cordero antirratón marcadas con peroxidasa de
rábano y un sistema de quimioluminiscencia mejorado
(ECL-Amersham).
La AC-Hly de B.
pertussis, la r-AC-Hly
(AC-Hly recombinante) producida a partir de E.
coli y las diferentes proteínas truncadas recombinantes se han
extraído de las bacterias con urea y se han purificado en columnas
de afinidad con calmodulina según el método descrito por Guiso N.,
M. Szatanik y M. Rocandourt (1991, "Protective activity of
Bordetella adenylate cyclase against bacterial
colonization". Microb. Pathog.
11:423-431). Las preparaciones enzimáticas se han
conservado en urea 8 M con Tris-HCl a 50 mM a pH 8,
con 0,2 mM de CaCl_{2}, a -20ºC. Se han analizado todas las
preparaciones para determinar su grado de pureza mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
(SDS-PAGE).
Las preparaciones purificadas de
r-AC-Hly y las proteínas truncadas
se han adsorbido a 60 \mug/ml sobre hidróxido de aluminio (250
\mug/ml). Para realizar un inmunización activa, se han tratado
ratones Balb/c hembra de 3 a 4 semanas de edad (CERJ, St Berthevin,
Francia) con 15 \mug de antígenos proteicos dos veces, por
inyección subcutánea, a intervalos de dos semanas. Los controles han
recibido sólo el tampón con hidróxido de aluminio. A continuación,
se han sangrado los ratones una semana después de la última
inyección para acceder a los anticuerpos en circulación presentes.
Se ha realizado la infección respiratoria submortal dos semanas
después de la segunda inmunización.
Se ha cultivado la cepa de B. pertussis
sobre un medio Bordet Gengou BG durante 48 h según la descripción
anterior y se han resuspendido las bacterias en un 1% de
casaminoácidos. Se han administrado cantidades submortales mediante
inyecciones intranasales de 50 \mul de las suspensiones
bacterianas. Se han sacrificado los ratones infectados por luxación
cervical 1 hora después de la exposición (en el momento designado
como "Día 0") y en días diferentes después del día 0 (6
ratones para cada etapa). Los pulmones se han recogido en asepsia y
se han homogeneizado en sal con una trituradora de tejidos. Las
diluciones de las preparaciones homogéneas de pulmón se han
muestreado sobre un medio BG y se han contado las unidades
formadoras de colonias (UFC) después de 3 días de incubación a
36ºC. Se han realizado todos los experimentos al menos 2 veces y han
dado resultados coherentes.
Para obtener los sueros de los ratones
infectados, se han infectado 10 ratones Balb/c hembra (de 4 semanas)
infectadas por vía intranasal con 2 x 10^{5} bacterias virulentas
B. pertussis según la técnica descrita por Guiso N.
Rocancourt, M. Szatanik y J. M. Alonso, (1989, "Bordetella
adenylate cyclase is a virulence associated factor and a protective
antigen", Molec. Pathog. 7:373-380). Se
han sangrado los ratones 14 días después de la infección o en
diferentes días indicados después de estos 14 días.
Los sueros policlonales de ratón dirigidos
contra los derivados truncados de la AC-Hly se han
recogido una semana después de haber inyectado los ratones por
segunda vez con cada uno de los antígenos considerados.
Se ha preparado el suero de los pacientes
infectados mediante la mezcla de sueros inmunitarios policlonales
de 10 niños seleccionados sin vacunar e infectados con B.
pertussis. Estos niños tenían más de 8 meses para descartar que
tuvieran anticuerpos maternos, y menos de 2 años para estar seguros
de su historia clínica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ya se había demostrado anteriormente que la
modificación de la AC-Hly gracias a la
intermediación de la proteína CyaC de B. pertussis es
esencial para su actividad protectora (Betsou et al,
"CyaC-mediated activation is important not only
for toxic but also for protective activities of Bordetella
pertussis adenylate cyclase-hemolysin",
Infect. Immun, 61:3583-3589). Por lo tanto,
era importante determinar si esta modificación contribuía por sí
sola a la formación del epítopo protector en su forma lineal o si
esta modificación inducía una modificación conformacional en la
toxina, modificación que se requiere para la presentación de los
epítopos protectores. También se han examinado las propiedades
inmunitarias y protectoras de un determinado número de proteínas
truncadas; las proteínas truncadas en cuestión se representan
esquemáticamente en la figura 1.
Estas proteínas se han producido en E.
coli en presencia de la proteína CyaC mediante la utilización
los plásmidos pCACT o pDIA para permitir que CyaC añada los acilos
de las cadenas de ácidos grasos, conteniendo dichas construcciones
el sitio de modificación. Tal y como muestra la figura 2A, las
preparaciones purificadas de todas las proteínas contenían un
polipéptido principal que correspondía a la masa molecular esperada.
Estas proteínas se han controlado mediante un análisis de
inmunotransferencia para verificar su reconocimiento mediante
diferentes sueros. Como muestra la figura 2B, el suero producido
contra la proteína r-AC-Hly
reconocía a la proteína r-AC-Hly y
reconocía también a la proteína AC-Hly purificada a
partir de B. pertussis, así como a las formas truncadas
derivadas de la r-AC-Hly. Conforme a
la figura 2A, las preparaciones polipeptídicas purificadas que
comprenden la proteína completa, en otras palabras, las
preparaciones AC-Hly,
r-AC-Hly y los polipéptidos
truncados \DeltaCla y \DeltaC217, contenían también varios
fragmentos reconocidos por un suero policlonal obtenido contra la
proteína purificada r-AC-Hly (figura
2B). Los anticuerpos monoclonales (figura 2) preparados
específicamente contra el dominio adenilato-ciclasa
de AC-Hly reconocían también estos fragmentos de
AC-Hly, \DeltaCla y \DeltaC217, lo que demuestra
que estos fragmentos eran fragmentos proteolíticos truncados en la
parte del extremo carboxilo y que contenían el dominio AC que se
copurificaba con la AC-Hly sobre
calmodulina-agarosa. Sin embargo, el anticuerpo
monoclonal no reconocía las proteínas \DeltaH o \DeltaHR2 que
estaban desprovistas de los restos 385 a 828 y 1489 a 1706
respectivamente, pero este anticuerpo reconocía la \DeltaC1307.
Utilizando estas observaciones en particular, los inventores han
establecido que la región de la molécula localizada entre los
aminoácidos 385 y 400 participaba en la formación de un epítopo.
De forma completamente excepcional, y al
contrario de lo que podría ocurrir con el suero
anti-r-AC-Hly, los
sueros obtenidos en los niños infectados y utilizados en mezcla no
han reconocido el dominio AC de la AC-Hly
(\DeltaC1307; carril 7), y no han reconocido tampoco la proteína
desprovista de los 217 restos terminales de la
AC-Hly (\DeltaC217; carril 6), ni la proteína que
contienen los últimos 217 restos, pero desprovista de las regiones
hidrófobas, de modificación y de la principal parte de la región
repetida de la AC-Hly (\DeltaHR2, carril 3). Sin
embargo, estos sueros reconocían la AC-Hly B.
pertussis y la r-AC-Hly (figura
2D, carriles 1 y 2) y las dos proteínas truncadas que poseían las
regiones de modificación y repetida (últimos 900 restos) de la
AC-Hly (figura 2D, carriles 4 y 5). Se ha obtenido
un esquema de reconocimiento idéntico (figura 2E) con el suero de
ratón infectado con B. pertussis 18323 (cepa de referencia) y
recogido rápidamente después de la infección (14 días). Los sueros
recogidos mucho tiempo después de la infección (35 días) reconocían
la parte del extremo carboxilo de la AC-Hly presente
en la proteína \DeltaHR2 (figura 2F, carril 3), mientras que
continuaban sin reconocer el dominio AC (figura 2F, carril 7) y la
proteína \DeltaC217 desprovista únicamente de los últimos 217
restos (figura F, carril 6). Estos resultados sugieren fuertemente
que los anticuerpos anti-AC-Hly
sintetizados después de la infección por B. pertussis se
dirigen predominantemente contra la región del extremo carboxilo
que comprende la región de modificación y la región repetida de la
AC-Hly (últimos 900 restos). Además, ni la proteína
\DeltaC217 desprovista de los últimos 217 restos de la
AC-Hly ni la proteína \DeltaHR2 que contenía los
últimos 217 restos han sido reconocidas por los sueros inmunitarios
y murinos, lo que sugiere que estos sueros policlonales reconocían
una estructura particular de la región repetida de la
AC-Hly, estructura que se elimina con una cualquiera
de las dos deleciones que no se superponen.
Es importante recalcar que los sueros de los
pacientes o de ratones infectados reconocían sólo los polipéptidos
que se extienden a lo largo de toda la proteína
(AC-Hly, r-AC-Hly,
\DeltaCla y \DeltaH), pero no sus fragmentos proteolíticos. La
ausencia de reconocimiento por estos sueros de los productos de
proteólisis, que contienen el dominio AC y que se escinden en su
extremo carboxilo (véase más arriba la figura 2C) indica además que
la región de modificación y la región repetida de la
AC-Hly (900 últimos restos) deben permanecer
intactos para ser reconocidos por estos sueros.
Se ha investigado si los sueros de ratones
infectados por B. pertussis o los sueros de pacientes humanos
infectados por B. pertussis o aún los sueros policlonales
dirigidos contra las diferentes formas truncadas de la
r-AC-Hly, obtenidos mediante
inmunización con las proteínas truncadas purificadas, podían inhibir
específicamente una de las actividades de la toxina. Como era
necesario un control previo a estos experimentos, se han determinado
las valoraciones con ELISA de diferentes sueros utilizando la
r-AC-Hly completa como antígeno de
recubrimiento en estos ensayos. Estas valoraciones eran similares,
a excepción del título obtenido con el suero
anti-\DeltaC1307, que no reconocía la
AC-Hly en el ELISA aunque la había reconocido en un
análisis de inmunotransferencia, como los otros sueros. Tal y como
muestra la figura 3A, la actividad adenilato-ciclasa
resultó inhibida por todos los sueros obtenidos después de la
inmunización de los ratones con la
r-AC-Hly purificada y con las
proteínas derivadas truncadas. Sin embargo, ninguno de estos sueros
infectados ni los pacientes humanos infectados inhibieron la
actividad AC de la AC-Hly en condiciones idénticas.
Esto concuerda con el resultado obtenido con el análisis de
inmunotransferencia (véase más arriba) que muestra que estos sueros
contienen anticuerpos dirigidos de modo predominante contra la
parte del extremo carboxilo de la AC-Hly (los
últimos 900 restos) y no contra el dominio AC. De hecho, los sueros
de los niños infectados inhibían la actividad hemolítica de la
proteína AC-Hly, y los sueros de los ratones
infectados la inhibían con mucha menos fuerza. Sin embargo, se
observó una fuerte inhibición de la actividad hemolítica con los
antisueros obtenidos mediante inmunización con las proteínas
AC-Hly, r-AC-Hly,
\DeltaH, \DeltaCla y \DeltaHR2 de B. pertussis (figura
3B). Probablemente, esta inhibición se debía a la presencia de
anticuerpos específicos contra la parte del extremo carboxilo de la
AC-Hly. De hecho, el suero
anti-\DeltaC1307, dirigido contra el dominio AC de
la AC-Hly que estaba desprovisto de tales
anticuerpos, no inhibía la actividad hemolítica de la
AC-Hly. Resulta muy interesante que el suero
dirigido contra la proteína \DeltaC217 desprovista únicamente de
los 217 últimos restos no inhibiera tampoco la actividad hemolítica
de la AC-Hly a nivel medible. Esto indica que los
217 últimos restos o bien son la diana de los anticuerpos
neutralizantes, o bien están implicados en la formación de una
estructura que favorece la síntesis de anticuerpos neutralizantes
dirigidos contra otras partes de la AC-Hly. En
conjunto, estos resultados indican además que los anticuerpos
sintetizados después de la infección están principalmente dirigidos
contra la parte hemolisina del extremo carboxilo de
AC-Hly y son capaces de neutralizar la actividad
hemolítica de esta proteína, pero no la actividad enzimática de su
dominio adenilato-ciclasa en el extremo amino. Tal y
como muestra la figura 3C, se ha observado una inhibición
significativa de la actividad citotóxica de la
AC-Hly con los sueros obtenidos contra la
AC-Hly intacta y contra las proteínas \DeltaH,
\DeltaCla y \DeltaHR2 truncadas que contienen todas el dominio
AC y los últimos 217 restos. Los antisueros han neutralizado también
las actividades AC y hemolíticas. Al contrario, los 2 sueros que
inhibían o bien la actividad hemolítica sola (por ejemplo, los
sueros de ratones o de pacientes infectados) o bien la actividad AC
sola (los sueros anti-\DeltaC1306 y
anti-\DeltaC217), no han inhibido la actividad
citotóxica de la AC-Hly). Así, resulta que podría
ser necesaria la presencia de los anticuerpos contra el dominio AC
y contra los 217 últimos restos de la AC-Hly para
neutralizar su actividad citotóxica.
Para localizar los epítopos de la
AC-Hly requeridos para obtener una actividad
protectora se ha ensayado la actividad protectora de diferentes
proteínas truncadas purificadas en el modelo respiratorio murino. Se
han inmunizado varios grupos de ratones dos veces con el hidróxido
de aluminio solo (testigo), o con las proteínas truncadas
purificadas adsorbidas sobre el hidróxido de aluminio y, a
continuación, se han puesto en contacto estos ratones, por vía
intranasal, con dosis submortales de cepas de B. pertussis
18323 virulentas. Este modelo pone en evidencia la capacidad que
tienen las bacterias para adherirse, colonizar, sobrevivir y
multiplicarse en el aparato respiratorio de los ratones. Tal y como
se muestra en la figura 4, las bacterias se multiplican rápidamente
en los pulmones de los ratones de control durante 6 horas después de
la infección, y luego comienzan ser eliminadas de los pulmones. No
se ha observado que las bacterias se multipliquen en los pulmones de
los ratones inmunizados con las proteínas AC-Hly o
r-AC-Hly de B. pertussis y,
después de 3 días, ha comenzado a disminuir el número de bacterias
(figura 4). De acuerdo con las observaciones anteriores (Betsou F.,
Sebo y N. Guiso, 1993, "CyaC-mediated activation
is important not only for toxic but also for protective activities
of Bordetella pertussis adenylate
cyclase-hemolysin", Infect. Immun.
61:3583-3589), la eficacia protectora contra B.
pertussis que tiene la AC-Hly era más elevada
que la de la r-AC-Hly. Una
protección similar a la inducida por la
r-AC-Hly también se obtenía con la
proteína \DeltaCla, lo que sugiere que la parte eliminada en la
proteína \DeltaCla entre los restos 827 y 887 no era indispensable
para la inducción de la inmunidad protectora. La proteína
\DeltaH, que carece de los restos 385 a 828, presentaba una
actividad protectora más débil que la \DeltaCla. La proteína
\DeltaC1307 desprovista de toda la parte hemolisina de la
AC-Hly no indujo ninguna protección. Resulta aún más
interesante que la proteína \DeltaC217 desprovista de los últimos
217 restos y la proteína \DeltaHR2 que contiene los últimos 217
restos de la AC-Hly no permitieran inducir la
protección. Por lo tanto, la actividad protectora se correlaciona
con el esquema
de reconocimiento de las construcciones individuales mediante sueros de pacientes infectados o de ratones infectados.
de reconocimiento de las construcciones individuales mediante sueros de pacientes infectados o de ratones infectados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos dirigidos contra la
AC-Hly habitualmente están presentes en los sueros
de los niños infectados (Arciniaga J. L., E. L. Hewlett, F. D.
Jonhson, A. Deforest, S. G. F. Wassilak, I. M. Onorato, C. R.
Manclark y D. L. Burns, 1991, J. Infect. Dis.
163:135-142; y Guiso N., E. Grimprel, I. Anjak y P.
Bégué, 1993, Eur. J. Clin. Microbiol. and Infect. Dis. en
prensa) y en el pasado se demostró que la inmunización con la
AC-Hly protege a los ratones contra la colonización
bacteriana de Bordetella (Khelef, N., H. Sakamoto y N.
Guiso, 1992, Microb. Pathog. 12:227-235). La
obtención de un conjunto de formas truncadas de la
AC-Hly recombinante ha permitido realizar un
estudio de la importancia de los diferentes dominios de la proteína
en la inducción de la inmunidad protectora mediante la vacunación
con la AC-Hly. Los resultados presentados más
arriba demuestran que los anticuerpos
anti-AC-Hly, sintetizados después de
la infección con B. pertussis se dirigen predominantemente
contra el dominio modificado y el dominio repetido de la
AC-Hly (aproximadamente 800 restos). En efecto,
sólo las formas truncadas de la AC-Hly que poseían
estas regiones intactas eran reconocidas por los sueros de ratones
y de pacientes infectados en un análisis de inmunotransferencia, y
estas proteínas eran las únicas que presentaban la capacidad de
inducir protección en los ratones. Esto indica que, al menos en el
caso de los ratones, un conjunto relativamente pequeño de epítopos
idénticos o solapantes podría ser interesante para, al mismo
tiempo, inducir la síntesis de anticuerpos
anti-AC-Hly por los sujetos
infectados, y para la inducción de la síntesis de anticuerpos
protectores obtenidos después de la vacunación con la
AC-Hly. Los experimentos descritos anteriormente
han demostrado que la supresión de los últimos 217 restos de la
AC-Hly, que se encuentran en posición distal
respecto de los sitios de modificación de la proteína por el
producto de expresión del gen CYaC, a nivel del resto lisina 983,
abolía el reconocimiento de esta proteína (\DeltaC217) por los
sueros de ratones y de pacientes infectados, y que desaparecía
también su actividad protectora. Sin embargo, esto no era un
defecto de la modificación de la proteína \DeltaC217 porque esta
proteína estaba acilada a nivel de los cadenas de ácidos grasos
cuando se producía en presencia de la proteína CyaC. Además, los
217 restos por sí solos no eran reconocidos por los sueros y no
mostraban actividad protectora cuando estaban presentes en la
proteína \DeltaHR2, que estaba desprovista del sitio de
modificación (lisina 983) y de una gran parte de la región
repetida.
Se ha concluido que los últimos 217 restos y la
región de modificación eran al mismo tiempo importantes para la
actividad protectora de la AC-Hly. Así, sería
necesaria una interacción entre la región de modificación y los
últimos 217 restos de la AC-Hly para que se formen o
sean activos los epítopos protectores de la AC-Hly.
De forma sorprendente, ni la proteína \DeltaC217 carente de los
217 restos terminales de la AC-Hly ni la proteína
\DeltaHR2 desprovista de la región de modificación y de una gran
parte de las repeticiones, pero que contiene los últimos 217
restos, han sido reconocidas por los sueros policlonales de los
pacientes infectados ni tampoco por los de ratones (suero nuevo).
Los antisueros podrían tener una especificidad estricta contra un
único epítopo, o contra un pequeño grupo de epítopos localizados en
el punto de ruptura de las regiones repetidas presentes en las
proteínas \DeltaC217 y \DeltaHR2 (prolina 1489). No obstante,
parece poco probable esta posibilidad con los antisueros
policlonales mezclados. Además, los sueros de los ratones y de los
pacientes humanos infectados reconocían la mayor parte de los
polipéptidos completos de las diferentes proteínas, pero no
reconocían los fragmentos proteolíticos de los extremos carboxilo
escindidos presentes en estas preparaciones, fragmentos que eran
reconocidos por un anticuerpo monoclonal anti-AC.
Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la formación de
epítopos protectores sobre la AC-Hly y el
reconocimiento de la AC-Hly por los sueros de los
sujetos infectados necesitaban la presencia de una estructura
particular que se forma sólo cuando están presentes las regiones de
modificación y repetida de la AC-Hly. Se puede
concebir que la formación de esta estructura necesite la
modificación por acilación con cadenas de ácidos grasos después de
la traducción de la AC-Hly a nivel del resto lisina
983 y también se podría abolir por la supresión de la parte del
extremo carboxilo de la AC-Hly. En este sentido, es
importante que se pierdan al mismo tiempo las actividades hemolítica
y citotóxica de la AC-Hly cuando se suprimen los
últimos 75 restos de la AC-Hly que contienen la
señal de secreción sin modificar y que no están implicados
directamente en la actividad de formación de los poros (4 y 29).
Además, estas observaciones corroboraban la hipótesis de que la
parte final de la región del extremo carboxilo de la
AC-Hly desempeña una función esencial en la
estructura global de la AC-Hly.
Ya se ha sugerido que los epítopos protectores
principales de la AC-Hly estarían localizados en la
parte AC (Guiso, N., M. Rocancourt, M. Szatanik y J. M. Alonso,
1989, Molec. Pathog. 7:373-380 y Guiso, N. M.
Szatanik y M. Rocancourt, 1991, Microb. Pathog.
11:423-431). Los resultados presentados aquí
demuestran que la contaminación por fragmentos de la
AC-Hly se extienden sobre las regiones de
modificación y repetida de la AC-Hly entraría en la
obtención de una actividad protectora asociada a los fragmentos del
dominio AC presente en las preparaciones descritas en el estado
actual de la técnica. Sin embargo, se puede dudar de la capacidad
que tienen estos contaminantes en cantidades menores para producir
una actividad protectora. Otra interpretación sería que, en algunas
condiciones, la región entre los aminoácidos 385 y 450 ó 500 también
podría desempeñar una función importante en la actividad protectora
contra la AC-Hly. La estructura de esta región
podría modificarse en la AC-Hly en ausencia de los
217 últimos restos de aminoácidos o en ausencia de acilación. La
estructura de la parte extremo amino de 40 a 50 kDa y la
presentación al sistema inmunitario podría inducir la protección
cuando esta estructura se escinda del resto de la molécula de la
AC-Hly en los sobrenadantes del cultivo de B.
pertussis. Un argumento a favor de esta hipótesis sería que un
anticuerpo monoclonal dirigido contra la parte de la molécula
localizada entre los aminoácidos 385 y 400 es un anticuerpo
protector.
Igualmente, se ha examinado si existe una
correlación entre la actividad protectora de una proteína truncada
obtenida a partir de la r-AC-Hly
in vivo y su actividad para inducir la síntesis de
anticuerpos que podría neutralizar la actividad tóxica in
vitro. No se ha establecido tal correlación. Mientras que todas
las proteínas que tienen una actividad protectora inducían la
síntesis de anticuerpos neutralizantes, la proteína \DeltaHR2 que
no era del todo protectora inducía una respuesta humoral muy
neutralizante. Esto sugiere que la presencia de anticuerpos
neutralizantes contra la actividad tóxica de la
AC-Hly no es una medida fiable de la inducción de
la protección contra la infección por B. pertussis.
Por otro lado, resulta importante destacar que
la proteína \DeltaCla, desprovista de una parte del dominio
hidrófobo, presentaba una actividad protectora. Esta proteína
recombinante es un buen candidato para la inclusión en las vacunas
acelulares contra B. pertussis porque no tiene una actividad
citotóxica residual.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extractos de urea vrg se han preparado a
partir de las 3 mismas especies bacterianas en fase IV, es decir, a
partir de las bacterias que no expresan ningún gen vag pero
que expresan los genes vrg. Todavía no se han caracterizado
bien los productos de estos genes, a excepción de los flagelos B.
bronchiseptica. Los extractos de urea vrg se preparan como los
extractos de urea vag.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- Esterilícese en el autoclave durante 15
minutos a 120º
- Consérvese a 4ºC
\vskip1.000000\baselineskip
En el momento de la utilización:
El medio Bordet Gengou se enriquece con 15% a
20% de sangre de carnero o de caballo. Fúndanse los tubos y
manténganse fundidos a 54ºC. Agréguense 2,5 ml de sangre de carnero
en cada tubo, en esterilidad. Viértase el contenido del tubo en una
placa de Petri estéril.
Nota:
Para la investigación de Bordetella
pertussis a partir de una muestra nasofaríngea, utilícense
placas nuevas (máximo 7 días a 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar 2 litros de una disolución
concentrada 10 veces:
Disuélvanse los diferentes constituyentes en una
parte del volumen del agua final. Ajústese el pH a 7,4 con ayuda de
ácido clorhídrico. Complétese hasta el volumen final y consérvese a
-20ºC.
- En el momento de su utilización,
mézclense:
- -
- 100 ml de la disolución concentrada 10 veces
- -
- 900 ml de agua pirolizada
- -
- 1 g de (2,6-O-dimetil)-ciclodextrina, referencia Aldrich nº 51166-71-3
- -
- 15 g de agar Bacto, referencia de Difco nº0140-01
\vskip1.000000\baselineskip
Repártase por fracciones de 20 ml en tubo de
cristal
Esterilícese y añádase el complemento
estéril
- Disolución del complemento:
- Mézclese:
- -
- 1 ml de la disolución del complemento concentrada 10 veces
- -
- 100 mg de glutatión, referencia de Merck nº 4090
- -
- 9 ml de agua pirolizada
\vskip1.000000\baselineskip
Fíltrese esta disolución por un filtro Millex de
0,22 \mum
Añádanse 200 \mul de esta disolución a 1 tubo
de 20 ml del medio
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar 2 litros de una disolución
concentrada 10 veces:
Disuélvanse los diferentes constituyentes en una
parte del volumen final de agua. Ajústese el pH a 7,6 con ayuda de
ácido clorhídrico. Complétese hasta el volumen final y repártase
esta disolución concentrada, que se puede conservar a -20ºC varias
semanas.
En el momento de su utilización, dilúyase el
medio, esterilícese a 120ºC durante 15 minutos y luego añádase el
complemento esterilizado mediante filtración.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar 200 ml de una disolución
concentrada 10 veces:
Disuélvase. En esta preparación, viértase la
mezcla siguiente disuelta previamente:
Complétese hasta 200 ml con agua pirolizada,
repártase la disolución por fracciones de 1, 2, 3 ó 4 ml y congélese
a -20ºC.
En el momento de su utilización, dilúyase la
disolución 10 veces en agua pirolizada y añádase:
- \quad
- el glutatión (Ref. Merck n.º4090) 100 mg/10 ml de complemento diluido, esterilícese esta disolución mediante filtración (filtro Millex 0,22 \mum desechable) y añádase 1 ml de la disolución estéril a 100 ml del medio de base estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Centrifúguese la suspensión bacteriana 30 minutos a 5000 g a 4ºC.
- -
- Resuspéndase el precipitado bacteriano en 5 M de urea preparada en el tampón PBS (descrito más arriba) a razón de un volumen igual a 5 veces el peso húmedo del precipitado bacteriano.
- -
- Déjese en agitación durante 1 hora a 4ºC y luego centrifúguese 40 minutos a 40.000 g a 4ºC.
- -
- Consérvese el sobrenadante a -80ºC hasta su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Después de la eliminación de la urea, al pasar por una columna G25, se diluye el extracto de urea vrg en PBS para obtener una concentración proteica de 300 \mug/ml.
- -
- Añádase gota a gota un volumen de glutaraldehído al 2,5% para obtener una concentración final del 0,05%.
- -
- Déjese 2 horas a temperatura ambiente mezclando con regularidad.
- -
- Párese la reacción mediante la adición de lisina (concentración final: 0,02 M).
- -
- Después de 2 horas a temperatura ambiente, se adsorbe el extracto de urea sobre hidróxido de aluminio preparado en PBS (1 mg/ml), durante una noche a 4ºC, agitándolo suavemente. La vacuna está entonces lista para la inmunización del animal a razón de 10 a 20 \mug/inyección (descrito más arriba).
Claims (31)
1. Secuencia de aminoácidos derivada de la
secuencia polipeptídica de la adenilato
ciclasa-hemolisina (AC-Hly),
caracterizada porque es capaz de inducir la formación de
anticuerpos protectores contra una infección por B.
pertussis y/o B. parapertussis y/o B.
bronchiseptica y porque se elige entre las secuencias
siguientes:
- a)
- la secuencia de una proteína truncada que comprende la concatenación de los aminoácidos situados aproximadamente entre la posición 910, preferentemente 913, y el último aminoácido del extremo carboxilo de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, comprendiendo dicha secuencia una modificación por adición de un ácido graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 98 aproximadamente 5, preferentemente en el aminoácido 983;
- b)
- una secuencia que tiene una conformación tridimensional idéntica o análoga a la de la secuencia polipeptídica correspondiente de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, que comprende una concatenación de aminoácidos tal como la definida más arriba en a) y una concatenación de 16 a 500 aminoácidos que comprende una secuencia que consiste en la concatenación de los aminoácidos 385 a 400, 385 a 450 ó 385 a 500 de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, reuniéndose estas dos secuencias por medio de una secuencia antigénica obtenida de una proteína diferente a la AC-Hly;
- c)
- una secuencia que tiene una conformación tridimensional idéntica o análoga a la de la secuencia polipeptídica correspondiente de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, que comprende una concatenación de aminoácidos tal como la definida más arriba en a) y una concatenación de 16 a 500 aminoácidos que comprende una secuencia que consiste en la concatenación de los aminoácidos 385 a 400, 385 a 450 ó 385 a 500 de la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B. bronchiseptica, estando estas dos concatenaciones contiguas o bien unidas por medio de la concatenación de aminoácidos que aparece en la naturaleza entre las dos concatenaciones definidas más arriba dentro de la AC-Hly de B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica, y estando la secuencia de aminoácidos obtenida truncada con relación a la secuencia la AC-Hly de Bordetella.
2. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1, caracterizada porque se encuentra en forma
de un polipéptido que tiene una conformación tridimensional
idéntica o análoga a la de la secuencia polipeptídica
correspondiente de la AC-Hly de B. pertussis
o de B. parapertussis o de B. bronchiseptica, en la
que comprende la concatenación de aminoácidos situada entre la
posición 900 aproximadamente, en particular 910, y el último
aminoácido aproximadamente del extremo carboxilo de la secuencia
polipeptídica de la AC-Hly de B. pertussis o
de una secuencia que corresponde a la anterior en B.
parapertussis o en B. bronchiseptica, comprendiendo
dicha secuencia además una modificación por adición de un ácido
graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 985
aproximadamente, en particular en el aminoácido 983.
3. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1, caracterizada porque está formada por la
concatenación de los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido
en la posición 385 aproximadamente y aproximadamente el último
aminoácido del extremo carboxilo de la secuencia polipeptídica de la
AC-Hly de B. pertussis o de una secuencia
que corresponde a la anterior en B. parapertussis o en B.
bronchiseptica, comprendiendo dicha secuencia una modificación
por adición de un ácido graso entre los aminoácidos 980
aproximadamente y 985 aproximadamente, preferentemente en el
aminoácido 983.
4. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1, caracterizada porque se trata de la
secuencia polipeptídica de la AC-Hly modificada por
la eliminación de un fragmento polipeptídico denominado \DeltaCla
que corresponde a la concatenación de los aminoácidos 827 a 887 de
la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B.
pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en
B. parapertussis o en B. bronchiseptica, comprendiendo
la secuencia obtenida una modificación por la adición de un ácido
graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 985
aproximadamente, preferentemente en el aminoácido 983.
5. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1, caracterizada porque se trata de la
secuencia polipeptídica de la AC-Hly modificada por
la eliminación de un fragmento polipeptídico denominado \DeltaCla
que corresponde a la concatenación de los aminoácidos 385 a 827 de
la secuencia polipeptídica de la AC-Hly de B.
pertussis o de una secuencia que corresponde a la anterior en
B. parapertussis o en B. bronchiseptica, comprendiendo
la secuencia obtenida una modificación por la adición de un ácido
graso entre los aminoácidos 980 aproximadamente y 985
aproximadamente, preferentemente en el aminoácido 983.
6. Secuencia de aminoácidos según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la
modificación por adición de un ácido graso es una
palmitoilación.
7. Composición polipeptídica,
caracterizada porque comprende una secuencia según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 de B. pertussis y
una secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 de
B. parapertussis.
8. Composición polipeptídica según la
reivindicación 7, caracterizada porque comprende además una
secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 de
B. bronchiseptica.
9. Composición polipeptídica,
caracterizada porque comprende una secuencia según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 de B. parapertussis
y una secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6
de B. bronchiseptica.
10. Secuencia nucleotídica que codifica una
secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
11. Composición inmunógena, caracterizada
porque comprende una o varias secuencias según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6.
12. Composición inmunógena según la
reivindicación 11, caracterizada porque comprende además un
extracto bacteriano que contiene los productos de expresión de los
genes vrg de una cepa de Bordetella elegida entre
B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica o
una parte de estos productos de expresión, suficiente para inducir
una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le
administraría el extracto.
13. Composición inmunógena según la
reivindicación 11, caracterizada porque comprende además una
o varias adhesinas o toxinas de B. pertussis, B.
parapertussis o B. bronchiseptica, elegida(s)
entre la FHA, las AGG o la PRN y la PTX o una parte de estas
proteínas, suficiente para inducir una respuesta inmunitaria en un
hospedador al que se le administraría el extracto.
14. Composición inmunógena según una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque la
cepa de B. pertussis a partir de la cual se obtienen las
secuencias de aminoácidos derivadas de la toxina
AC-Hly y, si es necesario, las proteínas expresadas
por los genes vrg, es la cepa HAV depositada en la CNCM con
el nº. I-1485.
15. Composición inmunógena según una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque la
cepa de B. parapertussis a partir de la cual se obtienen las
secuencias de aminoácidos derivadas de la toxina
AC-Hly y las proteínas expresadas por los genes
vrg, es la cepa n.º 1 depositada en la CNCM con el nº.
I-1498.
16. Composición inmunógena según una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque la
cepa de B. bronchiseptica a partir de la cual se obtienen las
secuencias de aminoácidos derivadas de la toxina
AC-Hly y las proteínas expresadas por los genes
vrg, es la cepa 9.73 S depositada en la CNCM con el nº.
I-858.
17. Composición de vacuna, caracterizada
porque comprende a modo de principio activo una composición
inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en
asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, si es
necesario, un adyuvante.
18. Procedimiento de preparación de un suero
policlonal, que comprende las etapas de:
- -
- inmunización de un animal no humano con una o varias secuencias de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 asociadas o no a un adyuvante,
- -
- recuperación de los anticuerpos formados, capaces de reconocer las secuencias de aminoácidos utilizados para la inmunización.
19. Procedimiento de preparación según la
reivindicación 18, caracterizada porque la inmunización del
animal se realiza con una o varias secuencias de aminoácidos según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y una composición
inmunógena que comprende los antígenos diferentes de la
AC-Hly.
20. Procedimiento de preparación de anticuerpos
monoclonales que reconocen la AC-Hly de B.
pertussis y/o de B. parapertussis y/o de B.
bronchiseptica, que comprende las etapas de:
- -
- inmunización de un animal no humano, por ejemplo, un ratón Balb/c, con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
- -
- fusión de los esplenocitos del animal inmunizado con células de mieloma para formar un hibridoma;
- -
- cultivo del hibridoma en las condiciones que permiten la producción de anticuerpos;
- -
- recuperación de los anticuerpos dirigidos contra la secuencia de aminoácidos utilizada para la inmunización.
21. Anticuerpos monoclonales,
caracterizados porque se dirigen contra la secuencia de los
aminoácidos 385 a 400 de la AC-Hly de B.
pertussis.
\newpage
22. Anticuerpos monoclonales,
caracterizados porque se dirigen específicamente contra la
secuencia de los 217 últimos aminoácidos de la
AC-Hly de B. pertussis, especialmente la
secuencia de los aminoácidos 1488 a 1705 de la
AC-Hly de B. pertussis o la secuencia de los
aminoácidos 1489 a 1706 de la AC-Hly de B.
bronchiseptica.
23. Anticuerpos monoclonales según la
reivindicación 21 ó 22, tales como los obtenidos al llevar a cabo el
procedimiento según la reivindicación 20, caracterizados
porque estos anticuerpos tienen una capacidad protectora frente a
la infección de un hospedador humano o animal por las
Bordetella del tipo B. pertussis, B.
parapertussis y/o B. bronchiseptica.
24. Anticuerpos monoclonales producidos por el
hibridoma B5-4 depositado en la CNCM con el n.º
I-1734 o por el hibridoma E17-21
depositado en la CNCM con el nº I-1733.
25. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra
una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5.
26. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende a modo de principio activo los
anticuerpos monoclonales según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 25.
27. Anticuerpos monoclonales según una
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, para la utilización como
medicamento en inmunoterapia en un hospedador infectado por
B. pertussis y/o B. parapertussis y/o
B. bronchiseptica.
28. Hibridoma, caracterizado porque se
trata del hibridoma B5-4 depositado en la CNCM con
el n.º I-1734 o del hibridoma
E17-21 depositado en la CNCM con el nº
I-1733.
29. Procedimiento de detección in vitro
de una infección por una Bordetella, en particular por B.
pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica,
caracterizado porque una muestra de líquido biológico de un
paciente o de un animal que puede estar infectado por
Bordetella se pone en contacto con los anticuerpos
monoclonales según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25,
y porque se detecta una reacción inmunológica entre dichos
anticuerpos monoclonales y las bacterias del género
Bordetella cuando están presentes en la muestra.
30. Procedimiento de detección in vitro
de una infección por una Bordetella, en particular por B.
pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica,
caracterizada porque una muestra de líquido biológico de un
paciente o de un animal que puede estar infectado por
Bordetella se pone en contacto con una secuencia de
aminoácidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y
porque se detecta una reacción inmunológica entre dichas secuencias
de aminoácidos y de anticuerpos presentes en la muestra
analizada.
31. Composición farmacéutica,
caracterizada porque comprende a modo de principio activo las
secuencias nucleotídicas según la reivindicación 10.
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