ES2213144T3 - Lipoproteina a de la membrana exterior del actinobacillus pleuropneumoniae y sus usos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVAS VACUNAS PARA USAR CONTRA ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE. LAS VACUNAS CONTIENEN AL MENOS UNA LIPOPROTEINA A DE MEMBRANA EXTERNA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, O UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DE LA MISMA. TAMBIEN SE DESCRIBEN SECUENCIAS DNA QUE CODIFICAN ESTAS PROTEINAS, VECTORES QUE INCLUYEN ESTAS SECUENCIAS Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS CON ESTOS VECTORES. LAS VACUNAS SE PUEDEN EMPLEAR PARA TRATAR O PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS PORCINAS.

Description

Lipoproteína A de la membrana exterior del Actinobacillus pleuropneumoniae y sus usos.

Sector técnico

La presente invención trata en líneas generales de la prevención de enfermedades en cerdos. Más especialmente, la presente invención trata de vacunas de subunidades frente al Actinobacillus pleuropneumoniae.

Antecedentes

El Actinobacillus (antiguamente llamado Haemophilus) pleuropneumoniae es un patógeno del tracto respiratorio porcino altamente infeccioso causante de la pleuroneumonía porcina. Los animales infectados desarrollan una neumonía fibrinosa aguda que lleva a la muerte u origina lesiones crónicas en el pulmón y disminuye la tasa de crecimiento. La infección se transmite por contacto o por aerosoles y la morbilidad en los grupos susceptibles puede acercarse al 100%. La persistencia del patógeno en cerdos que no presentan clínica también representa una amenaza constante de transmisión de la enfermedad a piaras que no han sido infectadas previamente.

El comienzo rápido y la gravedad de la enfermedad causan con frecuencia pérdidas antes de que el tratamiento antibiótico pueda ser eficaz. Las vacunas que se encuentran actualmente disponibles se componen, en líneas generales, de bacterias químicamente inactivadas combinadas con adyuvantes oleosos. Sin embargo, las bacterinas y los extractos de proteínas de superficie totales contienen con frecuencia componentes inmunosupresores que hacen que los cerdos sean más susceptibles a la infección. Además, estas vacunas pueden reducir la mortalidad pero no disminuyen el número de portadores crónicos en una piara.

Existen al menos 12 serotipos reconocidos de A. pleuropneumoniae siendo los serotipos 1, 5 y 7 los más frecuentes en Norte América. Las diferencias entre los serotipos coinciden generalmente con variaciones en la movilidad electroforética de las proteínas de la membrana exterior y las enzimas, indicando de este modo un origen clonal de las fracciones aisladas a partir del mismo serotipo. Esta diversidad antigénica ha dificultado el desarrollo de una estrategia de vacunación exitosa. La protección tras la inmunización parenteral con bacterinas muertas o un extracto libre de células es generalmente específica del serotipo y no previene la infección crónica o latente. Higgins, R., y col., Can. Vet. J. (1985) 26:86-89; Mac Innes, J.I. y Rosendal, S., Infect. Immun. (1987) 55:1626-1634. Por eso, sería útil desarrollar vacunas que protejan tanto de la muerte como de la cronicidad y no tengan propiedades inmunosupresoras. Un procedimiento por el cual esto se puede llevar a cabo es mediante el desarrollo de vacunas de subunidades antigénicas compuestas de proteínas específicas en forma pura o semi-pura.

Un número creciente de antígenos bacterianos ya han sido identificados como lipoproteínas (Anderson, B.E., y col., J. Bacteriol. (1988) 170:4493-4500; Bricker, T.M., y col., Infect. Immunol. (1988) 56:295-301; Hanson, M.S., y Hansen, E.J., Mol. Microbiol. (1991) 5:267-278; Hubbard, C.L., y col., Infect. Immunol. (1991) 59:1521-1528; Nelson, M.B., y col., Infect. Immunol. (1988) 56:128-134; Thirkell, D., y col., Infect. Immunol. (1991) 59:781-784). Una de estas lipoproteínas, proveniente de Haemophilus somnus, ha sido identificada positivamente. Se ha determinado la secuencia de nucleótidos que codifica esta lipoproteína, llamada "LppA", (Theisen, M., y col., Infect. Immunol. (1992) 60:826-831). Estas proteínas se localizan generalmente en la envoltura de la célula y se encuentran por lo tanto expuestas al sistema inmune del huésped. Se ha demostrado que la lipoproteína murina de la membrana externa de Escherichia coli actúa como un potente activador de los linfocitos murinos, induciendo tanto su proliferación como la secreción de inmunoglobulinas (Bessler, W., y col., Z. Immun. (1977) 153:11-22; Melchers. F., y col., J. Exp. Med. (1975) 142:473-482). Se ha demostrado que el fragmento lipoproteico activo de la proteína reside en la región N-terminal de la proteína que contiene ácidos grasos. Estudios recientes que emplean lipopéptidos sintéticos basados en esta proteína demuestran que incluso péptidos cortos, que contienen de dos a cinco aminoácidos unidos covalentemente a palmitato, son capaces de activar los linfocitos murinos (Bessler, W.G., y col., J. Immunol. (1985) 135:1900-1905).

Se ha descubierto que el A. pleuropneumoniae posee varias proteínas en la membrana externa que se expresan solamente en condiciones de crecimiento restrictivas de hierro (Denneer, H.G., y Potter, A.A., Infect. Immunol. (1989) 57:798-804). Sin embargo, las lipoproteínas de la membrana externa del A. pleuropneumoniae no han sido, hasta ahora, identificadas o caracterizadas en cuanto a su capacidad inmunogénica o protectora.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de una nueva subunidad antigénica de A. pleuropneumoniae que muestra una capacidad protectora en cerdos.

Por lo tanto, en una forma de realización, la invención está dirigida a una proteína de la membrana externa del A. pleuropneumoniae purificada e inmunogénica, en la que la proteína se selecciona del grupo formado por (a) una lipoproteína A inmunogénica de la membrana externa del Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en el 90% a la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1, o un fragmento inmunogénico de la misma y (b) una lipoproteína A inmunogénica de la membrana externa del Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en el 90% a la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2, o un fragmento inmunogénico de

\hbox{la misma.}

En otra forma de realización, la presente invención trata de una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un lipoproteína A inmunogénica de la membrana externa del A. pleuropneumoniae de la presente invención, o un fragmento inmunogénico de la misma.

En otra forma de realización más, la invención que nos ocupa trata de una construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos aislada descrita más arriba y secuencias control que se encuentran funcionalmente ligadas a la secuencia de nucleótidos y mediante las cuales la secuencia codificante puede ser transcrita y traducida en una célula huésped, y al menos una de las secuencias control es heteróloga a la secuencia codificante.

En otras formas más de realización, la presente invención trata de células huésped transformadas con estas construcciones y procedimientos para generar las proteínas recombinantes de A. pleuropneumoniae que nos ocupan.

En otra forma de realización, la invención que nos ocupa trata de una composición de una vacuna que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una lipoproteína A de la membrana externa del A. pleuropneumoniae de la presente invención o un fragmento inmunogénico de la misma.

En otra forma de realización más, la invención trata de un procedimiento para el tratamiento o la prevención de una infección por A. pleuropneumoniae en un sujeto vertebrado que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de una vacuna como la que se ha descrito más arriba.

Esta y otras formas de realización de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la materia a la vista de la descripción de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID No:1) del gen que codifica la lipoproteína A de la membrana externa del A. pleuropneumoniae serotipo 1 así como la secuencia de nucleótidos de las regiones flanqueantes del clon HB101/pOM37/E16. También se muestra la secuencia de aminoácidos esperada.

La Figura 2 representa la secuencia de nucleótidos (SEC ID No:2) del gen que codifica la lipoproteína A de la membrana externa del A. pleuropneumoniae serotipo 5 así como la secuencia de nucleótidos de las regiones flanqueantes del clon HB101/pSR213/E25. También se muestra la secuencia de aminoácidos esperada.

Descripción detallada

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, técnicas de ADN recombinante, e inmunología, las cuales se encuentran dentro de la destreza en la materia. Estas técnicas están descritas con todo detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D.N. Glover, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney, ed., 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

A. Definiciones

En la descripción de la presente invención se emplearán los siguientes términos, y se pretende que su definición sea la que se indica a continuación.

Los términos "lipoproteína A de la membrana externa" y "OmlA" son equivalentes e intercambiables y definen una proteína de la familia de las proteínas representada por la OmlA del A. pleuropneumoniae serotipo 1 (representada en la Figura 1) y la OmlA del A. pleuropneumoniae serotipo 5 (representada en la Figura 2). El término "OmlA" también incluye proteínas sustancialmente homólogas y funcionalmente equivalentes a las OmlAs nativas. De este modo, el término abarca modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones de las secuencias nativas (que generalmente conservan su naturaleza), siempre que no se destruya la actividad inmunológica (tal como se define a continuación). Tales modificaciones de la secuencia primaria de aminoácidos pueden dar como resultado antígenos con una mayor actividad comparado con la secuencia nativa. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como por mutagénesis dirigida, o pueden ser accidentales, como por mutaciones en los huéspedes que producen la lipoproteína. Todas estas modificaciones están incluidas, siempre que se conserve la actividad inmunogénica. Por lo tanto, OmlA del A. pleuropneumoniae serotipo 1 y OmlA del A. pleuropneumoniae serotipo 5 se refieren no solamente a las secuencias de aminoácidos representadas en las Figuras 1 y 2, respectivamente, sino también a las secuencias de aminoácidos homólogas a las mismas, que conservan la actividad inmunológica definida.

Además, el término "OmlA" (o fragmentos de la misma) significa una proteína que se encuentra en su forma neutra o en forma de sales de adición básicas o ácidas, dependiendo de la forma de preparación. Estas sales ácidas pueden implicar grupos amino libres y las sales básicas se pueden formar con carboxilos libres. Las sales de adición básicas y ácidas farmacéuticamente aceptables se tratan más adelante. Además, la proteína se puede modificar combinándola con otros materiales biológicos como lípidos (tanto los que se asocian normalmente con la lipoproteína como otros lípidos que no destruyan su actividad) y sacáridos, o por modificación de las cadenas laterales, como la acetilación de los grupos amino, la fosforilación de las cadenas laterales hidroxilo, o la oxidación de los grupos sulfidrilo, así como otras por modificaciones de la secuencia primaria codificada. De este modo, dentro de la definición de "OmlA" de la presente invención se incluyen la formas glicosiladas y no glicosiladas, las secuencias de aminoácidos con o sin lípidos asociados, y las secuencias de aminoácidos sustancialmente homólogas a la secuencia nativa que conservan la capacidad de provocar una respuesta inmune.

Dos secuencias de ADN o de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos el 90% aproximadamente, y preferiblemente al menos el 95% aproximadamente de los nucleótidos o de los aminoácidos coinciden, a lo largo de un fragmento definido de la molécula. Tal como se emplea en la presente invención, sustancialmente homólogas también hace referencia a secuencias que son idénticas a la secuencia de ADN o de polipéptidos que se especifica. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar mediante una técnica de hibridación tipo Southern en condiciones, por ejemplo, restrictivas, tal y como se definen para este sistema concreto. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra dentro de la destreza en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra; DNA Cloning, vols I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

El término "funcionalmente equivalente" significa que la secuencia de aminoácidos de la proteína que nos ocupa es una proteína que provocará una respuesta inmunológica, tal como se define a continuación, equivalente o mejor que la respuesta inmunológica provocada por una OmlA de A. pleuropneumoniae nativa.

Un "antígeno" hace referencia a una molécula que contiene uno o más epítopos que estimularán el sistema inmune del huésped para dar lugar a una respuesta humoral y/o celular antígeno específica. El término también se emplea de forma intercambiable con "inmunógeno".

Por "subunidad antigénica" se entiende una entidad antigénica extraída y separada de la totalidad de una bacteria (viva o muerta). De este modo, un antígeno contenido en un extracto libre de células constituiría una "subunidad antigénica" así como lo haría un antígeno sustancialmente purificado.

Un "hapteno" es una molécula que contiene uno o más epítopos y que no estimula el sistema inmune del huésped para dar lugar a una respuesta humoral o celular a menos que esté unido a un vehículo.

El término "epítopo" hace referencia al sitio en un antígeno o un hapteno al que se une una molécula de anticuerpo específica. El término se emplea también de forma intercambiable con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico".

Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o vacuna es el desarrollo, en el huésped, de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos frente a la composición o vacuna de interés. Normalmente, esta respuesta incluye, pero no se encuentra limitada a, uno o más de los siguientes efectos: producción de anticuerpos, células B, células T colaboradoras, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta, dirigidas específicamente frente a una antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés.

Los términos "polipéptido inmunogénico" y "secuencia de aminoácidos inmunogénica" hacen referencia a un polipéptido o una secuencia de aminoácidos, respectivamente, que dan lugar a la producción de anticuerpos que neutralizan la infectividad bacteriana y/o median en la citotoxicidad complemento-dependiente o en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Un "polipéptido inmunogénico" tal y como se emplea en la presente invención, incluye la secuencia completa (o casi completa) de una OmlA de A. pleuropneumoniae o un fragmento inmunogénico de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se hace referencia a un fragmento de una OmlA de A. pleuropneumoniae que incluye uno o más epítopos y de este modo da lugar a anticuerpos que neutralizan la infectividad bacteriana y/o median en la citotoxicidad complemento-dependiente o en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Estos fragmentos tendrán normalmente al menos 5 aminoácidos de largo, y preferiblemente al menos entre 10 y 15 aminoácidos de largo aproximadamente. No existe un límite alto crítico en cuanto a la longitud del fragmento, el cual podría comprender la secuencia proteica casi al completo, o incluso una proteína de fusión que comprenda fragmentos de dos o más de las subunidades antigénicas de A. pleuropneumoniae.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se emplean de forma intercambiable y hacen referencia a cualquier polímero de aminoácidos (dipéptido o mayor) unidos a través de enlaces peptídicos. De este modo, los términos "polipéptido" y "proteína" incluyen oligopéptidos, fragmentos de proteínas, análogos, mutantes, proteínas de fusión y similares.

Proteínas y polipéptidos "nativos" hacen referencia a proteínas y polipéptidos obtenidos a partir de una fuente que se encuentra en la naturaleza. De este modo, el término "lipoproteína A de la membrana externa nativa" incluiría las OmlA que se encuentran en la naturaleza y los fragmentos de estas proteínas.

"Proteína purificada" significa una proteína extraída y separada de un organismo completo (vivo o muerto), con el cual la proteína se encuentra normalmente asociada en la naturaleza. De este modo, una proteína contenida en un extracto libre de células constituiría una "proteína purificada", así como lo haría una proteína sintética o recombinante.

Los polipéptidos "recombinantes" hacen referencia a polipéptidos sintetizados mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, se sintetizan a partir de células transformadas con una construcción de ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Los polipéptidos "sintéticos" son aquellos que se preparan por síntesis química.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, como un plásmido, un fago, o un cósmido, al cual puede estar ligado otro segmento de ADN para dar lugar a la replicación del segmento ligado.

Una "molécula de ADN bicatenario" hace referencia a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (bases adenina, guanina, timina, o citosina) en una hélice de doble cadena, tanto en estado relajado como superenrrollado. Este término solamente hace referencia a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. De este modo, este término incluye el ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al hablar de la estructura de moléculas concretas de ADN bicatenario, las secuencias se describen en la presente invención de acuerdo con el convenio de dar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene la secuencia homóloga a la del ARNm).

Una "secuencia codificante" de ADN o una "secuencia de nucleótidos que codifica" una proteína concreta, es una secuencia de ADN que se transcribe y traduce a un polipéptido in vivo o in vitro cuando se pone bajo el control de las secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi) terminal. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se encuentra limitada a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamíferos), e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción se encontrará generalmente 3' de la secuencia
codificante.

Una "secuencia promotor" es una región de ADN reguladora capaz de unir una ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3'. Con objeto de definir la presente invención, la secuencia promotor está ligada en el extremo 3' a un codón de inicio de la traducción (ATG) de la secuencia codificante y se extiende en dirección 5' para incluir un número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotor se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido de forma conveniente por mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contienen a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procariotas contienen secuencias Shine-Dalgamo además de las secuencias consenso -10 y -35.

Las "secuencias control" de ADN hacen referencia de forma colectiva a secuencias promotor, sitios de unión de ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios de regulación en dirección 5', potenciadores, y similares, los cuales hacen posible, de forma colectiva, la transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una célula huésped.

"Funcionalmente ligado" hace referencia a una organización de elementos en la que los componentes así descritos están configurados de forma que realizan su función habitual. De este modo, las secuencias control funcionalmente ligadas a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Las secuencias control no han de ser contiguas a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir la expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, secuencias intermedias transcritas pero aún sin traducir pueden estar presentes entre una secuencia promotor y la secuencia codificante y la secuencia promotor se puede considerar aún "funcionalmente ligada" a la secuencia codificante.

Una secuencia control "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotor y transcribe la secuencia codificante a ARNm, el cual se traduce al polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o que es capaz de ser transformada, con una secuencia de ADN exógeno.

Una célula se ha "transformado" con ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana de la célula. El ADN exógeno puede estar integrado o no (mediante un enlace covalente) en el ADN cromosómico formando parte del genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en forma de elemento episomal, como un plásmido. En cuanto a las células eucariotas, una célula transformada de forma estable es aquella en la que el ADN exógeno se ha integrado en el cromosoma de forma que las células hijas lo heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad la demuestra la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones que se compongan de una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

Un "clon" es una población de células que deriva de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de forma estable in vitro durante muchas generaciones.

Una región "heteróloga" de una construcción de ADN es un segmento de ADN identificable dentro o unido a otra molécula de ADN que no se encuentra asociado a la otra molécula en la naturaleza. De este modo, cuando la región heteróloga codifica un gen bacteriano, el gen se encontrará normalmente flanqueado por ADN que no flanquea el gen bacteriano en el genoma de la bacteria fuente. Otro ejemplo de secuencia codificante heteróloga es una construcción en la que la secuencia codificante en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas con codones diferentes de los del gen nativo). La variación alélica o los fenómenos mutacionales que ocurren de forma natural no dan lugar a regiones heterólogas de ADN, tal como se emplean en la presente invención.

Una composición que contiene A está "sustancialmente libre de" B cuando al menos el 85% en peso, aproximadamente, del total de A + B en la composición es A. Preferiblemente, A comprende al menos el 90% en peso, aproximadamente, del total de A + B en la composición, más preferiblemente al menos el 95% aproximadamente, o incluso el 99% en peso.

El término "tratamiento" tal como se emplea en la presente invención hace referencia tanto a (i) la prevención de la infección o la reinfección (profilaxis), como a (ii) la disminución o la eliminación de los síntomas de la enfermedad de interés (terapia).

B. Procedimientos generales

El elemento central de la presente invención es el descubrimiento de una familia de lipoproteínas de la membrana externa de A. pleuropneumoniae, llamadas OmlAs en la presente invención, que son capaces de provocar una respuesta inmune en un animal al que se administran. Parece que los 12 serotipos de A. pleuropneumoniae contienen una gen que codifica una OmlA. Esta proteína, los análogos de la misma y/o los fragmentos inmunogénicos derivados de la proteína, se proporcionan en composiciones de vacunas de subunidades y de este modo se evitan los problemas inherentes a las anteriores composiciones de vacunas, tales como efectos secundarios localizados o sistémicos, así como la incapacidad para proteger frente a la enfermedad crónica. Las composiciones de vacunas pueden ser usadas para tratar o prevenir las enfermedades respiratorias inducidas por A. pleuropneumoniae en cerdos como la pleuroneumonía porcina. Los antígenos o los anticuerpos frente a ellos también se pueden emplear como medios diagnósticos para detectar la presencia de una infección por A. pleuropneumoniae en un sujeto. De forma similar, los genes de varios serotipos que codifican las proteínas OmlA se pueden clonar y emplear para diseñar sondas para detectar A. pleuropneumoniae en muestras de tejido así como para detectar genes homólogos en otras cepas bacterianas. Las subunidades antigénicas se pueden producir de forma conveniente mediante técnicas recombinantes, tal como se describe en la presente invención. Las proteínas de interés se producen en grandes cantidades en transformantes, no requieren una extensa purificación o procesamiento y no causan lesiones en el lugar de la inyección u otro tipo de enfermedades.

Se han aislado los genes que codifican la OmlA del A. pleuropneumoniae serotipo 1 y la OmlA del serotipo 5 y las secuencias se representan en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del gen omlA del serotipo 1, incluyendo el gen estructural y las regiones flanqueantes, se compone de aproximadamente 1340 pares de bases. El marco de lectura abierto codifica una proteína de aproximadamente 365 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del gen omlA del serotipo 5, incluyendo el gen estructural y las regiones flanqueantes, se compone de aproximadamente 2398 pares de bases. El gen estructural codifica una proteína de aproximadamente 367 aminoácidos. Las proteínas OmlA del serotipo 1 y del serotipo 5 son homólogas aproximadamente en un 65%.

El gen omlA del A. pleuropneumoniae serotipo 1 hibrida con el ADN genómico procedente del todos los demás serotipos conocidos de A. pleuropneumoniae. La invención abarca, por lo tanto, genes que codifican las OmlA procedentes de todos los serotipos de A. pleuropneumoniae.

Las lipoproteínas completas del serotipo 1 y del serotipo 5 tienen, ambas, un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kDa, tal como se ha determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico, con un sistema de tampón discontinuo (SDS-PAGE) de acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Laemmli, M.K., Nature (1970) 227:680-685). Los pesos moleculares esperados, basándose en la secuencia de aminoácidos, son 39,780 y 40,213, respectivamente. Las proteínas recombinantes son capaces de proteger a los cerdos de una posterior infección por A. pleuropneumoniae. Otras proteínas OmlA, procedentes de otros serotipos de A. pleuropneumoniae, también se pueden identificar, purificar y secuenciar, empleando cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las proteínas que nos ocupan se pueden determinar a partir de las proteínas purificadas, sometiéndolas a ciclos repetidos de degradación de Edman, seguido del análisis de los aminoácidos por HPLC. También se conocen en la materia otros procedimientos para la secuenciación de aminoácidos. Se pueden ensayar fragmentos de las proteínas purificadas para su actividad biológica y los fragmentos activos, tal como se ha descrito más arriba, se pueden emplear en composiciones en lugar de la proteína completa.

Con objeto de identificar los genes que codifican las proteínas que nos ocupan, se pueden emplear técnicas recombinantes. Por ejemplo, se puede preparar una librería de ADN lo cual consiste en ADN genómico de un serotipo de A. pleuropneumoniae. Los clones resultantes se pueden emplear para transformar un huésped adecuado, como E. coli. Se puede entonces hacer un cribado entre colonias individuales en un ensayo de inmunotransferencia, empleando suero policlonal o anticuerpos monoclonales frente al antígeno deseado.

Más específicamente, tras la preparación de la librería de ADN, los fragmentos de ADN de longitud deseada se aíslan, por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Estos fragmentos se ligan entonces en cualquier vector de expresión o replicón adecuado y a continuación se transforma la célula huésped correspondiente con el vector o replicón construido. Las células transformadas se plaquean en un medio adecuado. Se debe preparar también un duplicado de la placa porque los procedimientos posteriores matan las colonias. Las colonias se lisan entonces de una de las distintas formas que existen de hacerlo, por ejemplo, por exposición a vapores de cloroformo. Esto libera el antígeno de las colonias positivas. Las colonias lisadas se incuban con el anticuerpo adecuado sin marcar y se revela empleando un conjugado anti-inmunoglobulina y un sustrato adecuados. Las colonias que han reaccionado positivamente detectadas de este modo se pueden recuperar a partir del duplicado de la placa y subcultivar. Para caracterizar el gen codificante se puede emplear el mapeo físico, la construcción de derivados delecionados y la secuenciación de nucleótidos.

Un procedimiento alternativo para identificar genes que codifican las proteínas de la presente invención, una vez que se ha construido la librería de ADN genómico tal como se ha descrito más arriba, es la preparación de oligonucleótidos para sondar la librería y emplear estas sondas para aislar el gen que codifica la proteína deseada. Las estrategias básicas para la preparación de sondas de oligonucleótidos, así como el rastreo de librerías mediante la hibridación de ácidos nucleicos, son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, DNA Cloning: Vol. I, supra; Nucleic Acid-Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook y col., supra. Las secuencias concretas de nucleótidos se seleccionan para que se correspondan con los codones que codifican una secuencia conocida de aminoácidos de la proteína deseada. Puesto que el código genético es degenerado, a menudo será necesario sintetizar varios oligonucleótidos para cubrir todas las secuencias posibles de nucleótidos, o un número razonable de ellas, que codifican una región concreta de la proteína. De este modo, se prefiere generalmente al seleccionar una región sobre la que basar las sondas, que la región no contenga aminoácidos cuyos codones sean altamente degenerados. En determinadas circunstancias, a un experto en la materia le puede parecer conveniente preparar sondas bastante largas, y/o abarcar regiones de la secuencia de aminoácidos que tienen un alto grado de redundancia en sus secuencias correspondientes de ácidos nucleicos, especialmente si esta región larga y/o redundante es altamente característica de la proteína de interés. También puede ser conveniente emplear dos sondas (o un conjunto de sondas), cada una para diferentes regiones del gen, en un único experimento de hibridación. La síntesis automatizada de oligonucleótidos ha hecho relativamente sencilla la preparación de grandes familias de sondas. Mientras que la longitud exacta de la sonda empleada no es crítica, se admite generalmente en la materia que sondas de aproximadamente 14 hasta aproximadamente 20 pares de bases son generalmente eficaces. También se emplean sondas más largas de aproximadamente 25 hasta aproximadamente 60 pares de bases.

Las sondas de oligonucleótidos seleccionadas se marcan con un marcador, como un radionucleótido o biotina empleando procedimientos estándar. El conjunto de sondas marcadas se emplea entonces en la etapa de rastreo, que consiste en permitir que la sonda de cadena simple hibride con ssADN de la librería, de acuerdo con procedimientos estándar. Pueden ser apropiadas condiciones de hibridación tanto restrictivas como permisivas, dependiendo de varios factores, tales como la longitud de la sonda y si la sonda deriva de la misma especie que la librería, o de una especie cercana o lejana en la evolución. La selección de las condiciones apropiadas se encuentra dentro de la destreza en la materia. Véase, en líneas generales, Nucleic Acid Hybridization, supra. El requerimiento básico es que las condiciones de hibridación han de ser suficientemente restrictivas para que se produzca una hibridación selectiva; es decir, que la hibridación se deba a un grado suficiente de homología en los ácidos nucleicos (por ejemplo, al menos el 75% aproximadamente), por oposición a la unión inespecífica. Una vez que se ha identificado un clon de la librería rastreada mediante hibridación positiva, se puede confirmar por digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN que el inserto concreto de la librería contiene un gen para la proteína deseada.

De forma alternativa, las secuencias de ADN que codifican las proteínas de interés se pueden preparar sintéticamente en lugar de clonarlas. Se puede diseñar la secuencia de ADN con los codones apropiados para la secuencia concreta de aminoácidos. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el huésped previsto si la secuencia se va a emplear para su expresión. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante procedimientos estándar y ensamblados hasta formar la secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y col., (1984) Science 223:1299; Jay y col., (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Una vez que se han preparado o aislado las secuencias codificantes de las proteínas deseadas, se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la materia conocen numerosos vectores de clonación, y la elección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de gustos. Ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación y de células huésped que pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram negativas), pGV1106 (bacterias gram negativas), pLAFR1 (bacterias gram negativas), pME290 (bacterias gram negativas no E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Yip5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y el virus papiloma bovino (células de mamífero). Véase, en líneas generales, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook y col., supra; B. Perbal, supra.

El gen se puede poner bajo el control de un promotor, un sitio de unión ribosómico (para la expresión bacteriana) y, de forma opcional, un operador (denominados de forma colectiva en la presente invención elementos "control"), de forma que la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada se transcribe a ARN en la célula huésped transformada con un vector que contiene esta construcción. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder. El huésped puede eliminar las secuencias líder en un procesamiento post-transcripcional. Véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

Además de las secuencias control, puede ser conveniente añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias de la proteína en relación con el crecimiento de la célula huésped. Las secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la materia, y los ejemplos incluyen aquellas que provocan la expresión o no de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes en el vector otros tipos de elementos reguladores, por ejemplo, secuencias potenciadoras.

Un vector de expresión está construido de forma que la secuencia codificante concreta está localizada en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, la posición y la orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias control siendo de forma que la secuencia codificante se transcribe bajo el "control" de las secuencias control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias control transcribe la secuencia codificante). Puede ser conveniente modificar las secuencias que codifican el antígeno concreto de interés para alcanzar este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de forma que pueda estar unida a las secuencias control con la orientación adecuada; es decir, que conserve el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden estar ligadas a la secuencia codificante antes de su inserción en el vector, como los vectores de clonación descritos más arriba. De forma alternativa, la secuencia codificante se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias control y una diana de restricción apropiada.

En algunos casos, puede ser conveniente añadir secuencias que provoquen la secreción del polipéptido del organismo huésped, con la posterior escisión de la señal de secreción. También puede ser conveniente generar mutantes o análogos de los antígenos de interés. Los mutantes o análogos se pueden preparar mediante la deleción de una porción de la secuencia que codifica la proteína, mediante la inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, como la mutagénesis dirigida, son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid-Hybridization, supra.

Se conocen varios vectores de expresión en procariotas en la materia. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; véanse también las Solicitudes de Patentes U.K. GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; y la Solicitud de Patente Europea 103,395. Se conocen también vectores de expresión en levaduras en la materia. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; véanse también las Solicitudes de Patentes Europeas 103,409; 100,561; 96,491.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped elegido, las proteínas de la presente invención son producidas por células huésped en crecimiento transformadas con un vector de expresión descrito más arriba en condiciones en las cuales se expresa la proteína de interés. La proteína se aísla entonces de la célula huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína al medio de crecimiento, la proteína se puede purificar directamente a partir del medio. Si la proteína no se secreta, se aísla a partir de lisados celulares. La elección de las condiciones de crecimiento apropiadas y los procedimientos de recuperación forman parte de la destreza en la materia.

Los antígenos Omla también se pueden aislar directamente a partir de cualquierade los serotipos de A. pleuropneumoniae. En líneas generales, ésto se lleva a cabo preparando primero un extracto bruto que carece de componentes celulares y de varias proteínas irrelevantes. Los antígenos deseados se pueden entonces purificar más, es decir, por cromatografía en columna, HPLC, técnicas de inmunoadsorción u otros procedimientos convencionales bien conocidos en la materia.

Las proteínas de la presente invención también se pueden generar por síntesis química como la síntesis de péptidos en fase sólida, empleando secuencias conocidas de aminoácidos o secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN de los genes de interés. Dichos procedimientos son conocidos por los expertos en la materia. Se puede preferir la síntesis química de péptidos si un pequeño fragmento del antígeno en cuestión es capaz de despertar una respuesta inmunológica en el sujeto de interés.

Las proteínas de la presente invención o sus fragmentos se pueden emplear para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se quieren anticuerpos policlonales, un mamífero elegido (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, cerdo, etc) se inmuniza con un antígeno de la presente invención, o su fragmento, o un antígeno mutado. Se recoge suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo con los procedimientos conocidos. Si se emplea suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales se puede purificar por cromatografía de inmunoafinidad, empleando procedimientos conocidos.

Un experto en la materia también puede generar fácilmente anticuerpos monoclonales frente a las proteínas de la presente invención, y frente a fragmentos de las mismas. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales empleado la técnica del hibridoma es bien conocida. Se pueden crear líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos por fusión celular, y también por otras técnicas como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o la transfección con el virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier y col., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling y col., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennet y col., Monoclonal Antibodies (1980); véanse también las Patentes U.S. Nos 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890. Se pueden estudiar las diversas propiedades de los paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente al antígeno de interés, o fragmentos del mismo; es decir, isotipo, epítopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles en la purificación, empleando técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales frente a los que están dirigidos.

Los animales se pueden inmunizar con las composiciones de la presente invención mediante la administración de la proteína de interés, o un fragmento de la misma, o un análogo de la misma. Si se emplea el fragmento o el análogo de la proteína, incluirá la secuencia de aminoácidos de un epítopo que interaccione con el sistema inmune para inmunizar al animal frente a ese epítopo y otros estructuralmente similares.

Si se emplean proteínas sintéticas o recombinantes, la subunidad antigénica puede ser un solo polipéptido que codifica uno o varios epítopos de una o más OmlAs o dos o más polipéptidos separados que codifican distintos epítopos. La subunidad antigénica, incluso si lleva epítopos derivados de una lipoproteína, no requiere la presencia del radical lipídico. Sin embargo, si el lípido está presente, no es necesario que sea un lípido que esté normalmente asociado a la lipoproteína, siempre que se provoque la respuesta inmunológica apropiada.

Previo a la inmunización, puede ser conveniente incrementar la inmunogenicidad de una proteína concreta, o de un análogo de la proteína, o de fragmentos concretos de la proteína. Esto se puede llevar a cabo por cualquiera de las formas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el péptido antigénico se puede administrar unido a un vehículo. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes y lentamente metabolizadas tales como: proteínas; polisacáridos, como la sefarosa, la agarosa, la celulosa, las bolas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos tales como el ácido poliglutámico, la polilisina, y similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas de virus inactivados. Sustratos proteicos especialmente útiles son albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulinas, tiroglobulina, ovoalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la materia.

Los sustratos proteicos se pueden emplear en su forma nativa o bien su contenido en grupos funcionales se puede modificar mediante, por ejemplo, succinilación de residuos lisina o reacción con Cis-tiolactona. También se puede incorporar un grupo sulfidrilo al vehículo (o al antígeno) mediante, por ejemplo, reacción de las funciones amino con 2-iminotiolano o el éster N-hidroxi succinimida del 3-(4-ditiopiridil) propionato. Los vehículos adecuados también se pueden modificar para que incorporen brazos espaciadores (como hexametilendiamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para la unión de péptidos.

Otros vehículos adecuados para las proteínas de la presente invención incluyen los polipéptidos VP6 de los rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, tal y como se describe en la Patente U.S. No. 5,071,651. También es útil un producto de fusión de una proteína viral y el inmunógeno que nos ocupa realizado mediante los procedimientos descritos en la Patente U.S. No. 4,722,840. Otros vehículos adecuados más incluyen células, como los linfocitos, puesto que la presentación de esta forma mimetiza el modo natural de presentación en el sujeto, el cual da lugar al estado inmunizado. De forma alternativa, las proteínas de la presente invención se pueden acoplar a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos del propio sujeto. Los procedimientos para acoplar péptidos a proteínas o células son conocidos por los expertos en la materia.

Las nuevas proteínas de la presente invención también se pueden administrar por medio de un virus portador que expresa las mismas. Los virus portadores que encontrarán un uso en la presente invención incluyen, pero no se encuentran limitados a, vaccinia y otros pox virus, adenovirus y virus herpes. A modo de ejemplo, los virus vaccinia recombinantes que expresan las nuevas proteínas se pueden construir como sigue. El ADN que codifica la proteína concreta se inserta primero en un vector apropiado de forma que sea adyacente a un promotor de vaccinia y a secuencias flanqueantes de ADN de vaccinia, como la secuencia que codifica la timidin quinasa (TK). Este vector se emplea entonces para transfectar células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica la presente proteína en el genoma viral. El recombinante TK^{-} resultante se puede seleccionar cultivando las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y seleccionando las placas virales resistentes a la misma.

También es posible inmunizar un sujeto con la proteína de la presente invención, o un fragmento protector de la misma, administrada sola, o mezclada con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, las vacunas se preparan como inyectables, en forma de soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar en formas sólidas adecuadas para ponerlas en solución, o en suspensión, en un vehículo líquido, previo a la inyección. La preparación también se puede emulsionar o el principio activo se puede encapsular en vehículos liposómicos. El principio activo inmunogénico se mezcla a menudo con vehículos que contienen excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Vehículos adecuados son, por ejemplo, agua, salino, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y las combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares como agentes humidificantes o emulsionantes, agentes que tamponen el pH, o adyuvantes que potencien la eficacia de la vacuna. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, dipéptidos muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas y otras sustancias conocidas en la materia. Los procedimientos concretos para preparar tales formas de dosificación son conocidos, o se les ocurrirán, a los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15^{th} edition, 1975. La composición o formulación a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad adecuada de la proteína para alcanzar el estado de inmunización deseado en el individuo tratado.

Formulaciones adicionales de vacunas que son útiles para otras formas de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasales y orales, y formulaciones de liberación sostenida. Para los supositorios, la composición del vehículo incluirá aglomerantes y vehículos tradicionales, como glicoles polialcalinos, o triglicéridos. Estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen principio activo dentro del intervalo entre aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 10% (p/p), preferiblemente aproximadamente 1% hasta aproximadamente 2%. Los vehículos orales incluyen aquellos excipientes que se emplean normalmente como, por ejemplo, categorías farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, celulosa sacarina sódica, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones orales de vacuna se pueden tomar en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 95% de principio activo, preferiblemente desde aproximadamente 25% hasta aproximadamente 70%.

Las formulaciones intranasales incluirán normalmente vehículos que no causen irritación de la mucosa nasal ni alteren de forma significativa la función ciliar. Se pueden emplear diluyentes como agua, salino acuoso u otras sustancias conocidas en la invención que nos ocupa. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes como, pero no limitados a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un agente tensioactivo para potenciar la adsorción de las proteínas que nos ocupan a la mucosa nasal.

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida se hacen incorporando las proteínas a vehículos como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles como los copolímeros de acetato de etilenvinilo y los copolímeros Hytrel®, polímeros expansibles como los hidrogeles, o polímeros reabsorbibles como el colágeno y determinados poliácidos o poliésteres como aquellos que se emplean para hacer suturas reabsorbibles. Las proteínas también se pueden liberar empleando mini-bombas implantadas, bien conocidas en la materia.

Además, las proteínas (o complejos de las mismas) se pueden formular en forma de composiciones de vacunas en forma neutral o en forma de sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácidas (formadas con grupos amino libres de los polipéptidos activos) que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxido de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, o de hierro, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.

Para inmunizar a un sujeto, el polipéptido de interés, o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, se administra por vía parenteral, generalmente por inyección intramuscular en un vehículo apropiado. Sin embargo, otras vías de administración como la inyección subcutánea o intravenosa y la liberación intranasal, también son aceptables. Las formulaciones inyectables de la vacuna contendrán una cantidad eficaz de principio activo en un vehículo, siendo la cantidad exacta fácilmente determinada por un experto en la materia. El principio activo supone típicamente entre aproximadamente 1% y 95% (p/p) de la composición, o incluso más o menos si es apropiado. La cantidad a administrar depende del animal a tratar, de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección que se desea. Con las presentes formulaciones de vacunas, tan poco como 0,1 a 100 \mug o más, preferiblemente 0,5 a 50 \mug, más preferiblemente 1,0 a 25 \mug, de principio activo por ml de solución inyectada, debería ser adecuado para despertar una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de 1 a 2 ml por animal. Un experto en la materia puede establecer fácilmente otras dosis eficaces a través de ensayos de rutina que establecen curvas de dosis respuesta. El sujeto es inmunizado mediante la administración del antígeno concreto o un fragmento del mismo, o un análogo del mismo, en al menos una dosis, y preferiblemente dos dosis. Además, se pueden administrar al animal tantas dosis como sea necesario para mantener el estado de inmunidad a la neumonía.

Una vía de administración alternativa implica la terapia génica o la inmunización con ácidos nucleicos. De este modo, secuencias de nucleótidos (y elementos reguladores acompañantes) que codifican las proteínas que nos ocupan se pueden administrar directamente a un sujeto para su traducción in vivo. De forma alternativa, la transferencia de un gen se puede llevar a cabo transfectando las células o tejidos del sujeto ex vivo y reintroduciendo el material transformado en el huésped. El ADN se puede introducir directamente en el organismo huésped, es decir, por inyección (véanse International Publication No. WO/90/11092; y Wolff y col., Science (1990) 247:1465-1468). La transferencia de genes mediante liposomas también se puede llevar a cabo empleando procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Hazinski y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991) 4:206-209; Brigham y col., Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281; Canonico y col., Clin. Res. (1991) 39:219A; y Nabel y col., Science (1990) 249:1285-1288. Los agentes con una diana, como los anticuerpos dirigidos frente a antígenos de superficie expresados en tipos de células específicos, pueden estar unidos covalentemente a la superficie liposómica de forma que el ácido nucleico pueda ser liberado en tejidos o células específicos, susceptibles a A. pleuropneumoniae.

Más abajo hay ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen con propósitos solamente ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la invención en ningún sentido.

Depósitos de cepas útiles en la práctica de la invención

Se realizó un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, bajo las directrices del Tratado de Budapest. Se asignó el número de registro de adquisición indicado tras una prueba de viabilidad exitosa, y se pagaron las cuotas requeridas.

Estos depósitos se proporcionan simplemente por comodidad para los expertos en la materia, pero no son un reconocimiento de que se requiera un depósito. Las secuencias de ácido nucleicos de estos plásmidos, así como las secuencias de aminoácidos de los péptidos codificados por ellos, son determinantes en caso de cualquier conflicto con la descripción de la presente invención. Se pude requerir una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y por la presente no se concede dicha licencia.

Cepa	Fecha del depósito	Número de la ATCC
HB101/pOM37/E1 (en E.coli)	4/7/92	68954
HB101/pSR213/E25 (en E. coli)	18/8/92	69083

C. Experimental Materiales y procedimientos

Las enzimas se adquirieron de casas comerciales, y se emplearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los radionucleótidos y los filtros de nitrocelulosa también se adquirieron de casas comerciales.

En la clonación de fragmentos de ADN, excepto donde se especifica, todas las manipulaciones del ADN se hicieron de acuerdo con procedimientos estándar. Véase Sambrook y col., supra. Las enzimas de restricción, la T_{4} ADN ligasa, E. coli, la ADN polimerasa I, el fragmento Klenow, y otros reactivos biológicos se adquirieron de proveedores comerciales y se emplearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN bicatenario se separaron en geles de agarosa.

Cepas bacterianas, plásmidos y medios

La cepa AP37 de A. pleuropneumoniae serotipo 1 y la cepa AP213 de A. pleuropneumoniae serotipo 5 se aislaron de los pulmones de cerdos enfermos donados al Western College of Veterinary Medicine, Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá. La cepa AP205 de A. pleuropneumoniae serotipo 7 fue un aislado clínico de Nebraska obtenido de M.L. Chepok, Modern Veterinary Products, Omaha, Nebraska. Otras cepas de A. pleuropneumoniae fueron aislados de campo de piaras en Saskatchewan. La cepa HB101 de E. coli (hsdM, hsdR, recA) se empleó en todas las transformaciones en las que se empleó ADN de plásmido. Las cepas de E.coli NM538 (supF, hsdR) y NM539 (supF, hsdR, P2cox) sirvieron como huéspedes para la librería del bacteriófago \lambda. Los plásmidos pGH432 y pGH433 son vectores de expresión que contienen un promotor tac, un sitio de inicio de la traducción con dianas de restricción que permiten la ligación en los tres marcos de lectura seguidos de codones de parada en todos los marcos de lectura.

Las cepas de A. pleuropneumoniae se cultivaron en medio PPLO (Difco Laboratories, Detroit, MI) complementado con 10 mg/ml de dinucleótido de \beta-nicotinamida adenina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las placas de cultivos se incubaron en una atmósfera enriquecida con CO_{2} (5%) a 37ºC. Los cultivos líquidos se cultivaron en agitación continua a 37ºC sin enriquecimiento de CO_{2}.

La restricción de hierro se consiguió añadiendo 2,2'-dipiridilo a una concentración final de 100 \mumol. Los transformantes de E. coli se cultivaron en medio Luria (Sambrook y col., supra) complementado con ampicilina (100 mg/l). La transcripción a partir del promotor tac se indujo añadiendo isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mmol.

Preparación y análisis de sobrenadantes de cultivo, membranas externas y agregados de proteínas

Los sobrenadantes de cultivo, las membranas externas y los agregados de proteínas se prepararon tal como se describió anteriormente (Gerlach y col., Infect. Immunol. (1992) 60:892-898; Denner, H.G. and Potter, A.A., Infect. Immunol. (1989) 57:798-804). Los sobrenadantes de cultivo se mezclaron con dos volúmenes de etanol absoluto y se mantuvieron a -20ºC durante 1 h. Los precipitados se recuperaron por centrifugación y se resuspendieron en agua. Las membranas externas se prepararon por solubilización en sarkosyl tal como se ha descrito anteriormente (Deneer and Potter, supra). Para la preparación de agregados de proteínas, se indujeron los caldos de cultivos (50 ml) en la mitad de la fase logarítmica (OD_{660} de 0,6) añadiendo isopropiltiogalactósido 1 mmol (IPTG; concentración final). Tras 2 horas de enérgica agitación a 37ºC, las células se recogieron por centrifugación, y se resuspendieron en 2 ml de sacarosa al 25%, tampón Tris/HCl 50 mmol pH 8, y se congelaron a -70ºC. La lisis se llevó a cabo añadiendo 5 \mug de lisozima en tampón Tris/HCl 250 mmol pH 8 (5 min en hielo), añadiendo 10 ml de la mezcla de detergentes (5 partes de tampón Tris/HCl 20 mmol pH 8 (5 min en hielo)), añadiendo 10 ml de la mezcla de detergentes (5 partes de tampón Tris/HCl 20 mmol pH 7,4, NaCl 300 mmol, 2% de ácido desoxicólico, 2% de NP-40, y 4 partes de tampón Tris/HCl 100 mmol pH 8, ácido etilendiamina tetraacético 50 mmol, 2% de Tritón X-100), y sonicando. Los agregados de proteínas se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a 15.000g. Los agregados de proteínas se resuspendieron en H_{2}O hasta una concentración de 5-10 mg/ml y se solubilizaron añadiendo un volumen igual de clorhidrato de guanidina 7 molar. La concentración de proteína en las preparaciones de agregados se determinó separando diluciones seriadas de la proteína por SDS-PAGE. La intensidad de las bandas teñidas con azul de Coomassie se comparó con la de un patrón de albúmina sérica bovina. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Inmunotransferencia de tipo Western

Lisados totales de células de A. pleuropneumoniae cultivadas en un caldo de cultivo en condiciones de restricción de hierro se separaron por SDS-PAGE y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa esencialmente tal y como describieron Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1979) 76:4350- 4354). Las uniones inespecíficas se bloquearon por incubación con gelatina 0,5% en tampón de lavado (salino 150 mmol, Tris/HCl 30 mmol, Tritón X-100 0,05%), El anticuerpo y el conjugado con fosfatasa alcalina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) se añadieron en tampón de lavado, y se incubó cada uno durante una hora a temperatura ambiente. Las membranas se revelaron con un sustrato que contenía 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT) (ImmunoSelect, BRL, Gaithersburg, MD) en tampón Tris/HCl 100 mmol pH 9,5, NaCl 50 mmol, MgCl_{2} 5 mmol.

Preparación de antisueros

El suero frente a un sobrenadante de cultivo de A. pleuropneumoniae se obtuvo como sigue. El sobrenadante de cultivo de A. pleuropneumoniae serotipo 1 se precipitó con tricloroacético 10% (TCA; vol/vol), se emulsionó con adyuvante incompleto de Freund, y se empleó para inmunizar conejos dos veces con tres semanas de intervalo. Se obtuvieron sueros de cerdos convalecientes a partir de cerdos que habían sido infectados de forma experimental por vía intranasal con un aerosol con la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae serotipo 1.

Preparación de ADN e hibridación de tipo Southern

El ADN genómico se preparó mediante lisis por congelación-descongelación facilitada con SDS tal como se ha descrito previamente (Stauffer, G.V., y col., Gene, (1981) 14:63-72). El plásmido de ADN se preparó a partir de cultivos amplificados con 100 pg/ml de cloranfenicol por lisis alcalina y centrifugación en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio tal como se ha descrito previamente (Sambrook y col., supra).

Se hicieron digestiones con endonucleasas de restricción en tampón de T4 ADN polimerasa (Sambrook y col., supra) complementado con ditiotreitol 1 mmol y espermidina 3 mmol. El ADN digerido se separó en geles de agarosa al 0,7% y se transfirieron sobre nitrocelulosa por transferencia capilar. Se prepararon sondas marcadas con [P^{32}] por cebado aleatorio (Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), y los nucleótidos no incorporados se eliminaron pasando la preparación por una columna Sephadex G-50. Los filtros se prehibridaron en solución de Denhardt 5x-SSC 6x (SSC 1x es NaCl 0,15 mol, citrato de sodio 0,015 mol (pH 8))-SDS 0,5% a 65ºC. Los filtros se hibridaron en la misma solución a 55ºC y se lavaron a 55ºC con SSC 3x-0,5% (baja restricción), o a 65ºC en SSC 0,1x-SDS 0,5% (alta restricción).

Preparación y rastreo de la librería de expresión de A. pleuropneumoniae serotipo 1

El ADN genómico de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae se digirió parcialmente con la endonucleasa de restricción Sau3AI. Se aislaron fragmentos de 3000 pb a 8000 pb por centrifugación en gradiente de sacarosa (Sambrook y col., supra) y se ligaron en los sitios BamH1 y BglII de los vectores de expresión pGH432 y pGH433, permitiendo de este modo fusiones en los tres marcos de lectura. Se transformaron E. coli HB101 y se plaquearon a una densidad de aproximadamente 400 colonias por placa. Las colonias se plaquearon por duplicado sobre discos de nitrocelulosa, se indujeron durante 2 h con IPTG 1 mmol, y se lisaron con vapor de cloroformo. Las uniones inespecíficas se bloquearon con gelatina 0,5% en tampón de lavado y, tras retirar los debris celulares, la membrana se incubó con suero de conejo generado frente al sobrenadante de cultivo de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae y se reveló empleando un conjugado de cabra anti-conejo y un sustrato tal como se ha descrito más arriba.

Mutagénesis del transposón

El transposón TnphoA, portado por un fago lambda, así como la cepa CC118 de E. coli fosfatasa alcalina negativa, fueron proporcionadas por J. Beckwith, Harvard Medical School, Boston, MA. La mutagénesis se realizó tal como se ha descrito previamente (Manoil, C., y Beckwith, J. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133) y la secuencia de nucleótidos en el sitio de inserción se determinó empleando un oligonucleótido cebador complementario a los 20 primeros pares de bases del gen phoA en TnphoA (Chang y col. (1986) Gene 44:121-125; Manoil y Beckwith, supra).

Análisis de la secuencia de nucleótidos

Las secuenciación del ADN se realizó empleando vectores M13 y el procedimiento de terminación de cadena o didesoxi esencialmente tal como se ha descrito (Sanger, F., y col. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467). Las deleciones anidadas se realizaron mediante el tratamiento con exonucleasa III (Henikoff, S. (1987) Methods in Enzymology 155:156-165). Se sintetizaron cebadores específicos empleando el Pharmacia Gene Assembler (Pharmacia Canada Ltd., Baie D'Urfe, Quebec, Canada). Ambas cadenas se secuenciaron en su totalidad. El marco de lectura abierto (ORF) del gen omlA se confirmó por mutagénesis por inserción de TnphoA tal como se ha descrito más arriba. La secuencia se analizó empleando el programa IBI/Pustell y la base de datos GenBank.

Rastreo de la extensión del cebador

El ARN se preparó a partir de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae esencialmente tal como describieron Emory y Belasco (Emory, S.A. and Belasco, J.G. (1990) J. Bacteriol. 172:4472-4481). En resumen, 25 ml de cultivo bacteriano (OD_{660} = 0,4) se enfriaron en hielo picado y se centrifugaron. El sedimento bacteriano se resuspendió en 250 \mul de sacarosa 10%, acetato sódico 10 mM (pH 4,5), y se congeló a -70ºC. El sedimento se descongeló mezclándolo con un volumen igual de SDS 2%, acetato sódico 10 mM (pH 4,5) caliente (70ºC). Luego, se añadieron 375 \mul de fenol equilibrado con H_{2}O caliente (70ºC), los tubos se agitaron con vórtex, se congelaron a -70ºC, y se centrifugaron durante 10 minutos en una centrífuga de Eppendorf. El sobrenadante transparente se recogió, se le añadieron 2,5 volúmenes de etanol, y el ARN se almacenó a -70ºC hasta su uso. La extensión del cebador se realizó tal como se ha descrito anteriormente empleando un cebador complementario a una secuencia dentro del ORF. Con objeto de evitar compresiones se empleó 7-Deaza-dGTP y transcriptasa inversa AMV.

Radiomarcaje intrínseco con [H^{3}]-ácido palmítico, inmunoprecipitación y tratamiento con globomicina

El marcaje se realizó esencialmente tal como se ha descrito anteriormente (Ichiara, S. y col., (1981) J. Biol. Chem. 256:3125-3129). En resumen, se liofilizó ácido palmítico [9, 10-^{3}H] con una radioactividad específica de 55 Ci/mmol en tolueno (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) y se disolvió en isopropanol a una concentración de 5 mCi/ml. La cepa AP37 de A. pleuropneumoniae (en caldo de cultivo PPLO) y los transformantes de E. coli (en caldo de cultivo Luria con 1 \mumol de IPTG) se cultivaron con metanol, y se realizó un ensayo de inmunoprecipitación esencialmente tal como se ha descrito anteriormente (Huang, y col., (1989) J. Bacteriol. 171:3767-3774). El suero específico frente a OmlA se obtuvo de cerdos inmunizados, y se empleó proteína G-Sefarosa para recuperar los complejos de anticuerpos porcinos frente a OmlA. Las proteínas inmunoprecipitadas se resuspendieron en SDS-tampón de carga, se calentaron a 80ºC durante 5 min y se separaron por SDS-PAGE. Los geles se fijaron, se trataron con Amplify (Amersham Corp., Arlington Heights, IL), se secaron y se expusieron a una película de rayos X. La globomicina se disolvió en dimetilsulfóxido 50% a una concentración de 10 mg/ml. Esta solución se añadió a un cultivo de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae crecido hasta una OD_{660} de 0,6 a una concentración final de 100 \mug/ml y se prosiguió el crecimiento durante 1 hora. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en tampón de carga y se analizaron por SDS-PAGE y electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, tal como se ha descrito más arriba, empleado el suero específico frente a OmlA.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión del gen omlA de A. pleuropneumoniae serotipo 1

Se rastreó una librería de expresión de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae serotipo 1 en el vector pGH432 lacl con un antisuero policlonal de conejo generado frente a un sobrenadante de cultivo concentrado de A. pleuropneumoniae mediante un ensayo de inmunotransferencia de colonias tal como se ha descrito más arriba. Las colonias que reaccionaron frente al suero generado frente al sobrenadante de cultivo se subcultivaron, se indujeron con IPTG, y se examinaron por inmunotransferencia de tipo Western empleando suero de cerdo convaleciente. Entre los clones que reaccionaron en el ensayo de inmunotransferencia de colonias, un clon que también reaccionó con suero de convaleciente se seleccionó para su posterior estudio. El transformante de E. coli produjo una proteína que co-migró con una proteína inmunoreactiva proveniente de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae, y tuvo una movilidad electroforética de 50 kDa. Tras la inducción con IPTG, este transformante produjo la proteína inmunoreactiva en forma agregada. El plásmido que codifica este antígeno se denominó pOM37/E1 (ATCC Registro de Adquisición Número 68954), y la proteína se denominó OmlA.

El mapeo físico demostró que el plásmido contenía un inserto de 5.000 pb. Se construyeron varios derivados con deleciones, y se observó que los transformantes que contenían el derivado delecionado pOM37/E17 producían una proteína truncada, indicando de este modo que el gen codificante se superpone sobre la diana de la enzima de restricción KpnI.

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína OmlA de pOM37/E1 se muestra en la Figura 1. La secuencia se determinó por secuenciación didesoxi de las deleciones superpuestas generadas por digestión con exonucleasa III. La secuencia de nucleótidos posee un largo marco de lectura abierto (ORF) que se inicia en el nucleótido de posición 158 y que finaliza en la posición 1252. La secuencia de aminoácidos de este marco de lectura abierto también se muestra en la Figura 1. El polipéptido esperado tiene un peso molecular de 39,780 con una secuencia consenso para una modificación lipídica en el residuo aminoácido 20. Con objeto de confirmar esto, las células se marcaron con palmitato-[^{3}H] y se inmunoprecipitaron con antisuero de conejo generado frente a la proteína recombinante tal como se describió más arriba. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida y la autoradiografía, se observó una banda de aparente peso molecular de 50,000, indicando que se había producido la modificación lipídica del polipéptido. Además, cuando se añadió la globomicina, no se visualizó material marcado con palmitato-[^{3}H] en el autoradiograma. La globomicina es un inhibidor específico de la señal de la peptidasa II. De este modo, el producto del gen omlA es una lipoproteína. Esto puede explicar porqué migra en geles de poliacrilamida con un aparente peso molecular de 50,000 cuando el valor esperado es menor de 40,000.

El producto inmunoreactivo se expresó en transformantes incluso en ausencia de inducción con IPTG. Esto sugiere que existe un promotor que E. coli es capaz de reconocer en el ADN derivado de A. pleuropneumoniae en dirección 5' del ORF. La capacidad simultánea de ser inducido por IPTG, así como los polipéptidos truncados producidos por los transformantes de E. coli pOM37/E17, indicaron la localización del carboxi-terminal del gen omlA así como su dirección de transcripción.

Ejemplo 2 Análisis del plásmido pOM37/E16

Las colonias que reaccionaron con el suero generado frente al sobrenadante de cultivo se subcultivarion, se indujeron con IPTG, y se examinaron por inmunotransferencia de tipo Western tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. El plásmido más pequeño que expresaba la OmlA completa se denominó pOM37/E16. El análisis de la secuencia de nuleótidos de pOM37/E16 reveló un ORF de 1083 pb de largo que codifica una proteína con un peso molecular esperado de 39,780 Da. Se encontraba precedido por una secuencia consenso de Shine-Dalgamo AAGGAA de 8 bp en dirección 5' del codón de metionina. La proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de pOM37/E16 es idéntica a la que se muestra en la Figura 1.

Los 19 primeros aminoácidos del polipéptido poseen las características de un péptido señal de lipoproteína con un sitio de escisión esperado enfrente del residuo de cisteína en la posición 20. El ORF se confirmó mediante dos insertos independientes de TnphoA de 50 pb y 530 pb en dirección 3' del codón de metionina que, tras la transformación de la cepa de E. coli CC118 phoA negativa, dio lugar a transformantes fosfatasa alcalina positivos. Una búsqueda de homología en la base de datos GenBank empleando la secuencia esperada de aminoácidos de OmlA no reveló similitudes posibles (>35%) con los ORF y polipéptidos conocidos.

La extensión del cebador localizó el comienzo del ARNm en un residuo T 76 pben dirección 5' del codón de inicio de metionina. Las regiones -10 y -30 son las dos ricas en AT, y la estructura del promotor coincide con las características consenso de E. coli.

Se vio que una de los insertos TnphoA estaba localizado dentro del péptido señal. La expresión de una proteína PhoA funcional en esta fusión probablemente se deba a su localización detrás del núcleo hidrófobo del péptido señal. El sitio de inicio de la transcripción determinado por rastreo de la extensión del cebador está precedido por una región -10 y -30 similar a las que son frecuentes en los promotores de E. coli, Rosenberg, M. And Court, D., (1979) Annu. Rev. Genet. 13:319-353, y este descubrimiento concuerda con la expresión que se ha visto en transformantes de E. coli no inducidos. En dirección 3' al ORF, una secuencia palindrómica de 26 pb de largo está presente y podría actuar como secuencia de terminación. Adhya, S., y Gottesman, M., (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:967-996.

El sitio de escisión del péptido señal esperado que es en un residuo cisteína amino-terminal de la proteína madura se confirmó marcando los tranformantes de E. coli con [^{14}C]-palmitato y la posterior inmunoprecipitación empleando suero porcino anti-OmlA. Además, se demostró que el crecimiento de la cepa AO37 de A. pleuropneumoniae en presencia de globomicina inhibía el marcaje con palmitato de OmlA así como el procesamiento de la proteína precursora OmlA.

La expresión de la proteína OmlA fue independiente del nivel de hierro en el medio de cultivo. La proteína se encontró en las membranas totales, en las membranas externas preparadas por centrifugación en gradiente de sacarosa, y en vesículas de membrana; estaba ausente en las membranas externas tratadas con sarkosyl y en sobrenadantes obtenidos por centrifugación a alta velocidad.

Ejemplo 3 Clonación, expresión y secuenciación del gen omlA de A. pleuropneumoniae serotipo 5

El ADN genómico de la cepa AP213 de A. pleuropneumoniae serotipo 5 se digirió completamente con StyI y se ligó en el sitio NcoI del derivado pGH432 lacl, pAA505. Los HB101 recombinantes se cribaron con suero de convaleciente obtenido de un cerdo que había sido infectado con A. pleuropneumoniae serotipo 5. Un clon positivo, HB101/pSR213/E1, se seleccionó para su posterior análisis. Se demostró que HB101/pSR213/E1 contenía tres fragmentos StyI. Con objeto de aislar el ADN que codifica para la proteína inmunoreactiva, los fragmentos StyI de este plásmido se trataron con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I para rellenar las extensiones 5'. Estos fragmentos se ligaron en el sitio SmaI del vector, pGH432/lacl. Un clon seroreactivo, denominado HB101/pSR213/E4, se aisló y se demostró que producía una proteína seroreactiva con un aparente peso molecular de 50 kDa. Sin embargo, la proteína no se expresó en niveles elevados. Para incrementar el nivel de expresión, se digirió el plásmido pSR213/Er con BglII (que corta la secuencia del vector en dirección 5' del gen) y a continuación se digirió parcialmente con AseI (que corta al principio de la región codificante del gen). Las extensiones 5' se rellenaron con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, y el plásmido se recircularizó por ligación. El clon resultante, HB101/pSR213/E25 (ATCC Registro de Adquisición Número 69083) sobreexpresó la proteína seroreactiva.

Ambas cadenas del gen omlA de A. pleuropneumoniae serotipo 5 se secuenciaron empleando vectores M13 tal como se ha descrito más arriba. La secuencia de nucleótidos y la secuencia esperada de aminoácidos se muestran en la Figura 2. El marco de lectura abierto que se muestra en la figura codifica una proteína similar al producto de omlA de A. pleuropneumoniae serotipo 1, idéntica aproximadamente en un 65% a nivel de aminoácidos. De este modo, el marco de lectura abierto presente en pSR213/E25 codifica el omlA equivalente del serotipo 5.

Ejemplo 4 Distribución del gen omlA en los tipos de cepas de A. pleuropneumoniae

Se analizó el ADN genómico de los 12 tipos de cepas de A. pleuropneumoniae por hibridación de tipo Southern empleando el gen omlA derivado de la cepa AP37 de A. pleuropneumoniae como sonda. El ADN digerido con Styl de todos los tipos de cepas de A. pleuropneumoniae reaccionó con la sonda en condiciones poco restrictivas, y el ADN de los serotipos 1, 2, 8, 9, 11 y 12 permaneció hibridado a la sonda en condiciones de lavado muy restrictivas.

Los lisados celulares totales de todos los tipos de cepas de A. pleuropneumoniae, crecidas en condiciones restrictivas de hierro, se analizaron por inmunotransferencia de tipo Western empleando el suero de cerdos inmunizados con la proteína OmlA recombinante. Las mismas cepas que hibridaron la sonda de ADN en condiciones de lavado de elevada restricción unieron el suero anti-OmlA, y los lisados celulares totales de las cepas de A. pleuropneumoniae serotipos 1, 9 y 11 reaccionaron con más fuerza que los de los serotipos 2, 8 y 12.

Ejemplo 5 Capacidad protectora de la proteína recombinante OmlA del serotipo 1

La proteína OmlA se preparó a partir de E. coli HB101/pOM37/E1 por inducción con IPTG de un cultivo en fase logarítmica seguido de la recolección de las células y su disrupción, y separación de los cuerpos de inclusión por centrifugación. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron con clorhidrato de guanidina y se mezclaron con Emulsigen Plus (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) y salino de forma que la concentración final de proteína era de 0,5 \mug/ml, 2,5 \mug/ml o 12,5 \mug/ml. Se vacunaron grupos de 7 cerdos con 2 ml de vacuna o un placebo con Emulsigen Plus pero sin proteína. Cada grupo se vacunó de nuevo 21 días más tarde y se infectaron 7 días después de la intensificación con un aerosol con A. pleuropneumoniae (serotipo 1). Los signos clínicos de enfermedad se siguieron durante 3 días, y 7 días tras la infección todos los supervivientes se sacrificaron. La significación de las diferencias en las tasas de mortalidad entre los distintos grupos se determinó empleando la prueba de la razón de la verosimilitud G^{2} (Dixon, W.J., y col., BMDP Statistical Software Manual, University of California Press, 1988, pp.229-273). Los resultados se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1

1

A los 2 días de la infección, todos los cerdos que habían recibido el placebo estaban muertos mientras que solamente uno de los que habían sido vacunados con OmlA había muerto. Los signos clínicos de enfermedad eran significativamente más leves en los vacunados en el día 1 tras la infección, el único día en que se pudo hacer un a comparación debido a la elevada mortalidad en el grupo placebo. De este modo, el producto del gen omlA de A. pleuropneumoniae (serotipo 1) es un inmunógeno eficaz para la prevención de la pleuroneumonía porcina causada por A. pleuropneumoniae. La inmunización de cerdos con la proteína OmlA recombinante indujo una fuerte respuesta inmune y disminuyó significativamente la mortalidad. Estos resultados demuestran que la protección frente al A. pleuropneumoniae serotipo 1 se puede conseguir mediante la inmunización con un único antígeno proteico. Puesto que la proteína recombinante empleada para el ensayo de la vacunación se produjo en forma de agregado en E. coli, la modificación lipídica no parece ser necesaria para la inducción de una respuesta inmune protectora.

Ejemplo 6 Capacidad protectora de la proteína recombinante OmlA del serotipo 5

La proteína OmlA se preparó a partir de HB101/pSR213/E25 y se formuló con Emulsigen Plus tal como se ha descrito en el Ejemplo 5 de forma que 2 ml de dosis contenían 25 \mug de proteína. Los cerdos se vacunaron, recibieron una intens ificación del tratamiento y fueron infectados con la cepa AP213 de A. pleuropneumoniae serotipo 5 tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Los resultados mostrados en la Tabla 2 indican que la vacunación con OmlA proveniente del serotipo 5 redujo la morbilidad, la mortalidad y el daño pulmonar asociado a la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae. Se prevé que la vacunación con ambas proteínas OmlA, del serotipo 1 y del serotipo 5, pueda proteger a los cerdos frente a la infección por todos los serotipos de A. pleuropneumoniae, exceptuando posiblemente al serotipo 11.

TABLA 2

2

De este modo, están descritas las vacunas de subunidades para su uso frente a A. pleuropneumoniae, así como lo están los procedimientos para la preparación y el uso de las mismas.

Claims (12)

1. Una proteína de la membrana externa de Actinobacillus pleuropneumoniae purificada, inmunogénica, en la que la proteína se selecciona del grupo formado por (a) una lipoproteína A inmunogénica de la membrana externa de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1, o un fragmento inmunogénico de la misma y (b) una lipoproteína A inmunogénica de la membrana externa de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90% a la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2, o un fragmento inmunogénico de la misma.

2. La proteína de la reivindicación 1 en la que dicha proteína es una lipoproteína A de la membrana externa del serotipo 1 que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la Figura 1.

3. La proteína de la reivindicación 1 en la que dicha proteína es una lipoproteína A de la membrana externa del serotipo 5 que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la Figura 2.

4. Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende una secuencia que codifica una proteína de la membrana externa de Actinobacillus pleuropneumoniae de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Una construcción de ADN que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4; y

(b)

secuencias control que se encuentran funcionalmente ligadas a dicha secuencia de nucleótidos por las cuales dicha secuencia de nucleótidos puede ser transcrita y traducida en una célula huésped, y en la que al menos una de dichas secuencias control es heteróloga a dicha secuencia de nucleótidos.

6. Una célula huésped transformada con una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para generar una proteína inmunogénica de la membrana externa de Actinobacillus pleuropneumoniae, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

la aportación de una población de células huésped de acuerdo con la reivindicación 6; y

(b)

el crecimiento de dicha población de células en unas condiciones en la cuales la proteína codificada por dicha construcción de ADN se expresa.

8. Una composición de una vacuna que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos una proteína de la membrana exterior de Actinobacillus pleuropneumoniae de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

9. La composición de la vacuna de la reivindicación 8 que comprende además un adyuvante.

10. Una proteína de la membrana exterior de Actinobacillus pleuropneumoniae tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento o la prevención de la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae en un vertebrado.

11. Uso de una proteína de la membrana exterior de Actinobacillus pleuropneumoniae tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la fabricación de una vacuna.

12. Una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con la reivindicación 4 en la que la secuencia de nucleótidos aislada comprende la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 1 o la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 2.