ES2255488T3 - Clonacion y expresion de proteinas de union a transferrina de haemophilus somnus. - Google Patents

Abstract

Composición de vacuna que consiste esencialmente en un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptables, y una proteína de unión a transferrina de H. somnus aislada inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4.

Description

Clonación y expresión de proteínas de unión a transferrina de Haemophilus somnus.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a antígenos bacterianos y a los genes que codifican para los mismos. Más particularmente, la presente invención está relacionada con la clonación, expresión y caracterización de proteínas de unión a transferrina de Haemophilus somnus (H. somnus) y con el uso de las mismas en composiciones de vacuna.

Antecedentes

Haemophilus somnus es una bacteria gram negativa que produce varios síndromes de enfermedad en el ganado, denominados colectivamente hemofilosis bovina. La bacteria se asocia comúnmente con la meningoencefalitis tromboembólica (METE), miocarditis, septicemia, artritis y neumonía (Corbeil, L.B. (1990) Can. J. Vet. Res. 54: S57-S62; Harris y Janzen (1990) Can. Vet. J. 30: 816-822; Humphrey y Stephens (1983) Vet. Bull. 53: 987-1004). Estas enfermedades producen importantes pérdidas económicas anualmente para la industria ganadera.

Las vacunas convencionales frente a la infección por H. somnus se basan o bien en células completas inactivadas o bien en una fracción de proteína enriquecida en proteínas de membrana externa (PME). Sin embargo, las bacterinas de célula completa y los extractos de proteínas de superficie a menudo contienen componentes inmunosupresores que pueden hacer que los animales sean más sensibles a la infección. Se han descrito vacunas recombinantes que contienen las lipoproteínas de H. somnus, LppA, LppB y LppC. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional número WO 93/21323, publicada el 28 de octubre de 1993. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de vacunas de subunidad eficaces frente a la infección por H. somnus.

El hierro es un elemento esencial para el crecimiento de la mayoría de los microbios. Weinberg, E.D. (1978) Microbiol. Rev. 42: 45-66. Aun cuando el hierro es abundante dentro del tejido de mamífero, prácticamente todo el hierro dentro del organismo del mamífero está contenido intracelularmente como ferritina o como compuestos hemo, reservas que generalmente son inaccesibles para los microorganismos invasores. Adicionalmente, la pequeña cantidad de hierro presente en los espacios extracelulares se que la eficazmente mediante las glucoproteínas huéspedes de unión a hierro de alta afinidad, tales como la transferrina, presente en el suero y la linfa, y la lactoferrina, presente en los fluidos de secreción y en la leche. Otto et al. (1992) Crit. Rev. Microbiol. 18:217-233.

Por tanto, los patógenos bacterianos han desarrollado mecanismos específicos de captación de hierro. En muchas especies bacterianas, estos mecanismos incluyen la síntesis y la secreción de pequeños compuestos denominados sideróforos que muestran alta afinidad por el hierro férrico (FeIII). Los sideróforos pueden extraer el hierro unido a transferrina para formar complejos ferrisideróforos que, a su vez, son reconocidos por receptores de membrana específicos que pueden reprimirse por hierro y lo internalizan en la bacteria, en la que se libera el hierro. Crosa, J.H. (1989) Microbiol. Rev. 53: 517-530. Algunas bacterias gram negativas no secretan sideróforos detectables cuando crecen en un entorno deficiente en hierro, sino que producen proteínas de membrana externa que se unen directa y específicamente a la transferrina, permitiendo así el transporte de hierro hacia la célula bacteriana.

Las proteínas de unión a transferrina tienden a ser sumamente específicas para la transferrina de su huésped natural. Se ha demostrado la capacidad de los microorganismos para unirse y utilizar la transferrina como una fuente única de hierro, así como la correlación entre la virulencia y la capacidad para eliminar el hierro del huésped (Archibald y DeVoe (1979) FEMS Microbiol. Lett. 6: 159-162; Archibald y DeVoe (1980) Infect. Immun. 27: 322-334; Herrington y Sparling (1985) Infect. Immun. 48: 248-251; Weinberg, E.D. (1978) Microbiol. Rev. 42:45-66).

Se han identificado dos proteínas de unión a transferrina, denominadas proteína 1 y 2 de unión a transferrina (Tbp1 y Tbp2), respectivamente, en membranas externas bacterianas. Por ejemplo, González et al. (1990) Mol. Microbiol. 4: 1173-1179, describe proteínas de 105 y 56 kDa de Actinobacillus pleuropneumoniae, denominadas proteína 1 de unión a transferrina porcina (pTfBP1) y proteína 2 de unión a transferrina porcina (pTfBP2), respectivamente. Las patentes de los EE.UU. números. 5.417.971, 5.521.072 y 5.801.018 describen la clonación y la expresión de dos proteínas de unión a transferrina de A. pleuropneumoniae, así como el uso de las proteínas en composiciones de vacuna. Schryvers, A.B. (1989) J. Med. Microbiol. 29: 121-130, describe dos supuestas proteínas de unión a transferrina aisladas de Haemophilus influenzae. La patente de los EE.UU. número 5.708.149 y la Publicación Internacional número WO 95/13370, publicada el 18 de mayo de 1995, describen la producción recombinante de Tbp1 y Tbp2 de H. influenzae. Las patentes de los EE.UU. números. 5.141.743 y 5.292.869 y la Publicación Internacional número WO 90/12591 describen el aislamiento de proteínas receptoras de transferrina de Neisseria meningitidis y el uso de las proteínas aisladas en composiciones de vacuna. La Publicación Internacional número WO 95/33049, publicada el 7 de diciembre de 1995, y la Publicación Europea número EP 586.266, describen el ADN que codifica para las proteínas de unión a transferrina de N. meningitidis. Finalmente, Ogunnariwo et al. (1990) Microbiol. Path. 9: 397-406, describen el aislamiento de dos proteínas de unión a transferrina de H. somnus.

Sin embargo, hasta la fecha, las proteínas de unión a transferrina de H. somnus no se han producido de manera recombinante.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de los genes que codifican para las proteínas de unión a transferrina de H. somnus y en la caracterización de los mismos. Las proteínas codificadas por los genes se han producido de manera recombinante y pueden utilizarse estas proteínas, fragmentos inmunogénicos y análogos de los mismos, y/o las proteínas quiméricas que incluyen los mismos, o bien solos o bien en combinación con otros antígenos de H. somnus; en vacunas de subunidad novedosas para proporcionar protección frente a la infección bacteriana en sujetos mamíferos.

La invención objeto se refiere a:

1.

Composición de vacuna que consiste esencialmente en un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptables, y una proteína de unión a transferrina de H. somnus aislada inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4.

2.

Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3.

3.

Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3.

4.

Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4.

5.

Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4.

6.

Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus y una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus.

7.

Método para producir una composición de vacuna que comprende:

(a)

proporcionar una proteína de unión a transferrina de H. somnus aislada inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4; y

(b)

combinar dicha proteína de unión a transferrina con un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptables.

8.

Uso de una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica para la obtención de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para tratar o evitar La infección por H. somnus en un sujeto mamífero.

9.

Kit de prueba de inmunodiagnóstico para detectar la infección por Haemophilus somnus, comprendiendo dicho kit de prueba:

una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4; e instrucciones para realizar la prueba de inmunodiagnóstico.

10.

Uso de una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4, para la obtención de un reactivo de diagnóstico para detectar anticuerpos de Haemophilus somnus en una muestra biológica.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1B muestran las secuencias de nucleótidos de los genes tbp1 y tbp2 de H. somnus (SEQ ID NO: 1). El gen tbp1 se encuentra en las posiciones 2891-5803 y el gen tbp2 se encuentra en las posiciones 708-2693.

La figura 2 es un mapa genético de la región de tbp de H. somnus. Se muestran los sitios de restricción.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos completa de Tbp1 de H. somnus (SEQ ID NO: 2).

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos completa deTbp2 de H. somnus (SEQ ID NO: 3).

La figura 5 muestra la respuesta serológica específica para Tbp1, medida como títulos de anticuerpos, a vacunas que contienen proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante. La extracción de sangre 1 se realizó antes de la inmunización; la extracción de sangre 2 se obtuvo en el momento de la inmunización de recuerdo; y la extracción de sangre 3 se realizó antes de la exposición.

La figura 6 muestra la respuesta serológica específica para Tbp2, medida como títulos de anticuerpos, a vacunas que contienen proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante. La extracción de sangre 1 se realizó antes de la inmunización; la extracción de sangre 2 se obtuvo en el momento de la inmunización de recuerdo; y la extracción de sangre 3 se realizó antes de la exposición.

La figura 7 muestra la mortalidad en grupos de animales a los que se han administrado vacunas que contenían las proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante.

La figura 8 representa la temperatura media obtenida de animales a los que se han administrado vacunas que contenían proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante y de animales a los que se han administrado placebos, tal como se describe en los ejemplos. Se muestran los resultados tras la exposición a H. somnus.

La figura 9 muestra las puntuaciones de depresión de animales a los que se han administrado vacunas que contenían proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante y de animales a los que se han administrado placebos, tal como se describe en los ejemplos. Se muestran las puntuaciones de los días 5 - 8, tras la exposición a H. somnus.

La figura 10 muestra las puntuaciones medias de enfermedad de animales a los que se han administrado vacunas que contenían proteínas de unión a transferrina de H. somnus producidas de manera recombinante y de animales a los que se han administrado placebos, tal como se describe en los ejemplos. Se muestran las puntuaciones de los días 5 - 8 tras la exposición a H. somnus.

Las figuras 11A-11C representan un fragmento cromosómico (SEQ ID NO: 4) que incluye el gen lppB de H. somnus, que se encuentra en las posiciones 872-1906 de la figura, y muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente de LppB (SEQ ID NO: 5).

La figura 12 representa el perfil de antigenicidad de Hoop/Woods de Tbp1 madura de H. somnus.

La figura 13 representa el diagrama de la hidropatía de Kyte-Doolittle (parte inferior de la figura) y las hélices transmembrana de Argos (parte superior de la figura) de Tbp1 madura de H. somnus.

La figura 14 representa el perfil de antigenicidad de Hoop/Woods de Tbp2 de H. somnus.

La figura 15 representa el diagrama de la hidropatía de Kyte-Doolittle deTbp2 de H. somnus.

Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la biología molecular, la microbiología, la tecnología de ADN recombinante y la inmunología, que están dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II y III, Segunda Edición (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

A lo largo de todo el texto se utilizan las siguientes abreviaturas de aminoácidos:

Alanina: Ala (A)	Arginina: Arg (R)
Asparagina: Asn (N)	Ácido aspártico: Asp (D)
Cisteína: Cys (C)	Glutamina: Gln (Q)
Ácido glutámico: Glu (E)	Glicina: Gly (G)
Histidina: His (H)	Isoleucina: Ile (I)
Leucina: Leu (L)	Lisina: Lys (K)
Metionina: Met (M)	Fenilalanina: Phe (F)
Prolina: Pro (P)	Serina: Ser (S)
Treonina: Thr (T)	Triptófano: Trp (W)
Tirosina: Tyr (Y)	Valina: Val (V)

A. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende definirlos tal como se indica a continuación.

Debe observarse que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una proteína de unión a transferrina de H. somnus" incluye una mezcla de dos o más de tales proteínas, y similares.

Los términos "proteína de unión a transferrina", "proteína de unión a TF" y "Tbp" (utilizados de manera intercambiable en el presente documento) o una secuencia de nucleótidos que codifica para la misma, se refieren a una proteína o una secuencia de nucleótidos, respectivamente, que se deriva de un gen tbp de H. somnus. La secuencia de nucleótidos de dos genes tbp representativos de H. somnus, denominados "tbp1" y "tbp2" en el presente documento, y la secuencia de aminoácidos correspondiente de las proteínas Tbp codificadas por esos genes, se representan en las figuras. En particular, las figuras 1A-1B (SEQ ID NO: 1) muestran la secuencia de nucleótidos de tbp1 de longitud completa (que aparece en las posiciones de nucleótidos 2891-5803, inclusive) y tbp2 (que aparece en las posiciones de nucleótidos 708-2693, inclusive) y las figuras 3 (SEQ ID NO: 2) y 4 (SEQ ID NO: 3), muestran las secuencias de aminoácidos de longitud completa de Tbp1 y Tbp2, respectivamente. Sin embargo, una proteína de unión a transferrina de H. somnus, tal como se define en el presente documento, no se limita a las secuencias representadas, ya que se conocen varios subtipos de H. somnus y se producirán variaciones en las proteínas de unión a transferrina entre las cepas de H. somnus.

Además, no es necesario que la proteína o secuencias de nucleótidos derivadas se deriven físicamente del gen descrito anteriormente, sino que pueden generarse de cualquier manera, incluyendo por ejemplo, síntesis química, aislamiento (por ejemplo, de H. somnus) o mediante producción recombinante, basada en la información proporcionada en el presente documento. Adicionalmente, el término se refiere a proteínas que tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente homólogas (tal como se define más adelante) a secuencias de aminoácidos continuas codificadas por los genes, que muestran actividad inmunológica y/o de unión a transferrina.

Por tanto, los términos se refieren secuencias de longitud completa, así como inmunogénicas, truncadas y parciales, y a formas análogas y precursoras activas de las proteínas. También se incluyen en el término fragmentos de nucleótidos del gen que incluyen al menos aproximadamente 8 pares de bases contiguas, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-20 pares de bases contiguas, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente de 25 a 50, o más, pares de bases contiguas del gen. Tales fragmentos son útiles como sondas y en métodos de diagnóstico, tratados de manera más completa más adelante.

Los términos también incluyen aquellas formas que poseen, así como que carecen de, la secuencia señal, así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para ellas. Adicionalmente, el término se refiere a las formas de las proteínas de unión a transferrina que carecen de la región de anclaje a la membrana y a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para proteínas con tales deleciones. Tales deleciones pueden ser deseables en sistemas que no proporcionen la secreción de la proteína. Además, los dominios de unión a transferrina de las proteínas, pueden estar o no presentes. Así, por ejemplo, si la proteína de unión a transferrina se va a utilizar para purificar transferrina, el dominio de unión a transferrina se conservará generalmente. Si la proteína va a utilizarse en composiciones de vacuna, estarán presentes epítopos inmunogénicos que pueden incluir o no el dominio de unión a transferrina.

Los términos también incluyen proteínas en forma neutra o en forma de sales de adición de ácidos o bases, dependiendo del modo de preparación. Tales sales de adición de ácidos pueden incluir grupos amino libres y las sales de bases pueden formarse con carboxilos libres. Más adelante se tratan las sales de adición de ácidos o bases farmacéuticamente aceptables. Además, las proteínas pueden modificarse mediante su combinación con otros materiales biológicos, tales como lípidos (tanto los que se producen naturalmente con la molécula como otros lípidos que no destruyen la actividad inmunológica) y sacáridos, o mediante modificación de la cadena lateral, tal como la acetilación de grupos amino, la fosforilación de cadenas laterales de hidroxilo, la oxidación de grupos sulfhidrilo, la glucosilación de residuos de aminoácidos, así como otras modificaciones de la secuencia primaria codificada.

Las proteínas de la presente invención se encuentran normalmente en asociación con restos lipídicos. Es probable que el resto de ácido graso presente sea un derivado del ácido palmítico. Los antígenos de la presente invención, aun cuando llevan epítopos derivados de lipoproteínas, no requieren la presencia del resto lipídico. Además, si el lípido está presente, no es necesario que sea un lípido comúnmente asociado con la lipoproteína, siempre que provoque la respuesta inmunológica apropiada. En cualquier caso, ácidos grasos adecuados tales como, pero sin limitarse a ellos, el ácido palmítico o análogos del ácido palmítico, pueden añadirse convenientemente a la secuencia de aminoácidos deseada durante la síntesis, usando técnicas habituales. Por ejemplo, el palmitoílo unido a S-gliceril-L-Cys (Pam_{3}-Cys) está comercialmente disponible (por ejemplo a través de Boehringer Mannheim, Dorval, Quebec) y puede incorporarse fácilmente en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis. Véase, por ejemplo Deres et al. (1989) Nature 342: 561. Éste es un método particularmente conveniente para la producción cuando se utilizan secuencias de aminoácidos relativamente cortas. De manera similar, pueden utilizarse sistemas recombinantes que procesarán las proteínas expresadas mediante la adición de ácidos grasos adecuados. Los sistemas representativos para la producción recombinante se tratan más adelante.

Por tanto, el término se refiere a deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán de naturaleza generalmente conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, puede predecirse de manera razonable que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato por un glutamato o viceversa; una treonina por una serina o viceversa; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto principal sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones menores de aminoácidos que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína, están por tanto dentro de la definición del polipéptido de referencia.

Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5 - 10 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o incluso hasta aproximadamente 15 - 25 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta. A este respecto, las sustituciones que se producen en el dominio de unión transmembrana y en la secuencia señal normalmente no afectarán a la inmunogenicidad. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente otras regiones de la molécula de interés que pueden tolerar el cambio mediante la referencia a los diagramas de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle mostrados en las figuras 12 - 15 en el presente documento.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico separada y diferenciada del organismo completo con la que la molécula se encuentra en la naturaleza; o una molécula de ácido nucleico que carece, en su totalidad o en parte, de secuencias asociadas normalmente con ella en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas (tal como se define más adelante) en asociación con la misma.

Por "composición de vacuna de subunidad" se quiere decir una composición que contiene al menos un polipéptido inmunogénico, pero no todos antígenos, derivados de u homólogos a un antígeno de un patógeno de interés. Tal composición está sustancialmente libre de células o partículas patógenas intactas, o el lisado de tales células o partículas. Por tanto, una "composición de vacuna de subunidad" se prepara a partir de polipéptidos inmunogénicos al menos purificados parcialmente (preferiblemente, sustancialmente purificados) del patógeno, o análogos recombinantes del mismo. Una composición de vacuna de subunidad puede comprender el antígeno o antígenos de la subunidad de interés sustancialmente libre de otros antígenos o polipéptidos del patógeno.

El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que responden células B y/o células T específicas. El término también se utiliza de manera intercambiable con "determinante antigénico" o "sitio de determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo.

Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria mediada por células y/o anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos, células B, células T cooperadoras, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de manera que aumentará la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Tal protección se demostrará mediante una reducción o falta de los síntomas que normalmente se presentan en un huésped infectado y/o un tiempo de recuperación más rápido.

Los términos proteína o polipéptido "inmunogénico" se refieren a una secuencia de aminoácidos que provoca una respuesta inmunológica, tal como se describió anteriormente. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína de unión a transferrina en cuestión, con o sin la secuencia señal, el dominio de anclaje a la membrana y/o el dominio de unión a transferrina, análogos de los mismos, o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Por "fragmento inmunogénico" se quiere decir un fragmento de una proteína de unión a transferrina que incluye uno o más epítopos y que, por tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden identificarse utilizando cualquiera de varias técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, grandes números de péptidos que se sintetizan simultáneamente sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a partes de la molécula de la proteína y reaccionando los péptidos con anticuerpos, mientras que los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. De manera similar, los epítopos conformacionales se pueden identificar fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente. Las regiones antigénicas de las proteínas también pueden identificarse utilizando diagramas habituales de antigenicidad e hidropatía, tales como los calculados que utilizan, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad Sci USA (1981) 78: 3824-3828 para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte- Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para los diagramas de la hidropatía. Las figuras 12 - 14 en el presente documento representan los perfiles de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle para las proteínas representativas englobadas por la invención.

Los fragmentos inmunogénicos, para los fines de la presente invención, incluirán normalmente al menos aproximadamente 3 aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 - 15 aminoácidos, y lo más preferiblemente 25 o más aminoácidos, de la molécula original de proteína de unión a transferrina. No hay un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epítopos de Tbp1 y/o Tbp2.

Proteínas o polipéptidos "nativos" se refiere a proteínas o polipéptidos aislados de la fuente en la que se producen naturalmente las proteínas. Polipéptidos "recombinantes" se refiere a polipéptidos producidos mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas mediante un constructo de ADN exógeno que codifica para el polipéptido deseado. Polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados mediante síntesis química.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN de manera que se provoque la replicación del segmento unido.

Una "secuencia codificante" de ADN o una "secuencia de nucleótidos que codifica para" una proteína particular, es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se sitúa bajo el control de elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc procedente de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico procedente de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de la transcripción se situará normalmente en sentido 3' con respecto a la secuencia codificante.

Los "elementos de control" del ADN se refieren colectivamente a promotores, sitios de unión a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en el sentido de 5', potenciadores (enhancers), y similares, que colectivamente proporcionan la transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una célula huésped. No es necesario que todas estas secuencias de control estén presentes siempre en un vector recombinante, siempre que el gen deseado pueda transcribirse y traducirse.

"Operativamente unido" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados de manera que realicen su función habitual. Por tanto, los elementos de control operativamente unidos a una secuencia codificante pueden llevar a cabo la expresión de la secuencia codificante. No es necesario que los elementos de control sean contiguos a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias que intervienen no traducidas pero transcritas entre un promotor y la secuencia codificante y el promotor todavía puede considerarse "operativamente unido" a la secuencia codificante.

Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN polimerasa se une al promotor y transcriben la secuencia codificante en ARNm, que entonces se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

Una "célula huésped" es una célula que se ha transformado o que puede transformarse mediante una molécula exógena de ácido nucleico.

Una célula se ha "transformado" mediante ADN exógeno cuando tal ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. El ADN exógeno puede integrarse (unirse covalentemente) o no en el ADN cromosómico constituyendo el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN exógeno ha llegado a integrarse en el cromosoma, de manera que se hereda por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones compuestos de una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos restos de polinucleótidos o dos restos de polipéptidos. Dos secuencias de ADN o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias muestran al menos aproximadamente el 80% - 85%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% - 98% de identidad de secuencia durante una longitud definida de las moléculas. Tal como se usa en el presente documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia de ADN o de polipéptido especificada.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido - nucleótido o aminoácido - aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante una comparación directa de la información de la secuencia entre las dos moléculas mediante la alineación de las secuencias, el recuento del número exacto de los apareamientos entre las dos secuencias alineadas, la división por la longitud de la secuencia más corta, y la multiplicación del resultado por 100. Pueden utilizarse programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2: 482-489 para el análisis de péptidos. Programas para determinar la identidad de la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package nombrado anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos particular con respecto a una secuencia de referencia pude determinarse utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y penalización de huecos de seis posiciones de nucleótidos.

Otro método de establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete de programas MPSRCH cuyos derechos registró la Universidad de Edimburgo, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuidos por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este juego de paquetes, puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman en el que se utilizan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de hueco abierto de 12, penalización de aumento del hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de "Match" (apareamiento) refleja la "identidad de secuencia." Se conocen generalmente en la técnica otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizado con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden usarse utilizando los siguientes parámetros por defecto: código genético = habitual; filtro = ninguno; cadena = ambas; punto de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = ALTA PUNTUACIÓN; Bases de datos = non redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de CDS de GenBank + de proteínas suiza + Spupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, la homología puede determinarse mediante la hibridación de los polinucleótidos en condiciones en las que formen híbridos de dos cadenas estables entre regiones homólogas, seguido por digestión con
nucleasa(s) específica(s) de cadena simple, y una determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, tal como se definen para este sistema particular. Definir las condiciones apropiadas de hibridación está dentro de los conocimientos del experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; DNA Cloning, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente.

El término "variante degenerada" se refiere a un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácido nucleico del mismo, que codifica para un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido a partir del cual se deriva la variante degenerada.

El término "funcionalmente equivalente" se refiere a que la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a transferrina es una que provocará una respuesta inmunológica sustancialmente equivalente o aumentada, tal como se definió anteriormente, en comparación con la respuesta provocada por una a proteína de unión a transferrina que tiene identidad con la proteína de unión a transferrina de referencia, o una parte inmunogénica de la misma.

Una región "heteróloga" de un constructo de ADN es un segmento identificable de ADN dentro o unido a otra molécula de ADN que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica para un gen bacteriano, el gen estará flanqueado normalmente por ADN que no flanquea al gen bacteriano en el genoma de la bacteria de origen. Otro ejemplo de secuencia codificante heteróloga es un constructo en el que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes de los del gen natural). Los acontecimientos de variaciones alélicas o de mutación que se producen de manera natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN, tal como se usa en el presente documento.

El término "tratamiento", tal como se usa en el presente documento se refiere a, o bien (i) la prevención de la infección o la nueva infección (profilaxis); o bien (ii) la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad de interés (terapia).

Tal como se usa en el presente documento, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un sujeto incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, muestras de piel, secreciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro incluyendo, pero sin limitarse a, medios condicionados que resultan del crecimiento de las células y tejidos en el medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes y componentes celulares.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molécula capaz de detección, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y similares. El término "compuesto fluorescente" se refiere a una sustancia o a una parte de la misma que puede mostrar fluorescencia en el intervalo detectable. Ejemplos particulares de marcadores que pueden utilizarse en la invención incluyen fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, Texas red, luminol, NADPH y \alpha-\beta-galactosidasa.

B. Métodos generales

Fundamental para la presente invención es el descubrimiento de genes que codifican para dos proteínas de unión a transferrina de H. somnus, denominadas "Tbp1" y "Tbp2", respectivamente en el presente documento. En particular, se han aislado, secuenciado y caracterizado los genes para la proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus ("tbp1") y la proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus ("tbp2"), y se han deducido a partir de los mismos las secuencias de las proteínas para Tbp1 y Tbp2. Las secuencias de ADN completas se muestran en las figuras 1A-1B y las secuencias de las proteínas para Tbp1 y Tbp2 se muestran en las figuras 3 (SEQ ID NO: 2) y 4 (SEQ ID NO: 3), respectivamente.

Tal como se describe en los ejemplos, tbp1 de longitud completa, representado en las posiciones de nucleótidos 2891-5803, inclusive, de las figuras 1A-1B, codifica para una proteína Tbp1 de longitud completa de aproximadamente 971 aminoácidos, mostrada como los aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3 (SEQ ID NO: 2). La proteína tiene un peso molecular previsto de aproximadamente 109.725 kDa. La secuencia de longitud completa incluye un péptido señal de 28 aminoácidos, que aparece en las posiciones 1 a 28 de la figura 3. Por tanto, la secuencia de Tbp1 madura está representada mediante los aminoácidos 29 a 971, inclusive, de la figura 3 y está codificada por la secuencia de nucleótidos representada en las posiciones 2975 a 5803, inclusive, de las figuras 1A-1B. La figura 12 muestra el perfil de antigenicidad de Hoop/Woods de Tbp1 madura de H. somnus. La figura 13 representa el diagrama de la hidropatía de Kyte-Doolittle (parte inferior de la figura) y las hélices transmembrana de Argos (parte superior de la figura) de Tbp1 madura de H. somnus.

El tbp2 de longitud completa, representada en las posiciones de nucleótidos 708-2693, inclusive, de las figuras 1A-1C (SEQ ID NO: 1), codifica para una proteína Tbp2 de longitud completa de aproximadamente 662 aminoácidos, mostrada como los aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4 (SEQ ID NO: 3). La proteína tiene un peso molecular previsto de aproximadamente 71.311 kDa. La secuencia de longitud completa incluye un péptido señal de 19 aminoácidos, que aparece en las posiciones 1 a 19 de la figura 4. Por tanto, la secuencia de Tbp2 madura está representada mediante los aminoácidos 20 a 662, inclusive, de la figura 4 y está codificada por la secuencia de nucleótidos representada en las posiciones 765 a 2683, de las figuras 1A-1B. La figura 14 representa el perfil de antigenicidad de Hoop/Woods de Tbp2 de H. somnus y la figura 15 representa el diagrama de la hidropatía de Kyte-Doolittle de Tbp2 de H. somnus. A diferencia de Tbp1, no hay dominios de unión transmembrana presentes en la molécula de Tbp2.

Las proteínas de unión a transferrina de H. somnus, los fragmentos inmunogénicos de las mismas o las proteínas quiméricas que incluyen uno o más epítopos de Tbp1 y Tbp2, pueden proporcionarse, solos o en combinación, en composiciones de vacuna de subunidad para tratar o evitar las infecciones bacterianas producidas por H. somnus, incluyendo, pero sin limitarse a, hemofilosis, meningoencefalitis tromboembólica (ITEME), septicemia, artritis y neumonía (Corbeill, L.B., Can. J. Vet. Res. (1990) 54: S57-S62; Harris, F.W., y Janzen, E.D., Can. Vet. J. (1990) 30: 816-822; Humphrey, J.D., y Stephens, L.R., Vet. Bull. (1983) 53: 987-1004), así como miocarditis, pericarditis, aborto espontáneo, esterilidad y mastitis.

Además del uso en composiciones de vacuna, las proteínas y los fragmentos de las mismas, los anticuerpos para las mismas y los genes que codifican para las mismas, pueden utilizarse como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia de infección en un sujeto mamífero. De manera similar, los genes que codifican para las proteínas pueden clonarse y utilizarse para diseñar sondas para detectar y aislar genes homólogos en otras cepas bacterianas. Por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 nucleótidos, y lo más preferiblemente aproximadamente 60-100 o más nucleótidos, encontrarán uso en estas realizaciones. Las proteínas de unión a transferrina de H. somnus también encuentran uso en la purificación de transferrinas de las especies de Haemophilus y de las células huéspedes recombinantes que expresan las mismas.

Las proteínas de unión a transferrina de H. somnus pueden usarse en composiciones de vacuna, bien solas o en combinación, con otros antígenos bacterianos, fúngicos, víricos o protozoarios. Estos antígenos pueden proporcionarse separadamente o incluso como proteínas de fusión que comprenden uno o más epítopos de las proteínas de unión a transferrina unidos entre sí y/o a uno o más de los antígenos anteriores. Por ejemplo, pueden utilizarse otras proteínas inmunogénicas de H. somnus en las vacunas objeto, incluyendo, pero sin limitarse a, los polipéptidos LppA, LppB y/o LppC de H. somnus, la proteína de unión a hemina de H. somnus y la hemolisina de H. somnus. Todas estas proteínas de H. somnus se describen en la Publicación Internacional número WO 93/21323, publicada el 28 de octubre de 1993. Por ejemplo, las figuras 11A-11C representan la proteína LppB de H. somnus (SEQ ID NO: 5) y el gen que codifica para la misma (posiciones 872-1906 de la SEQ ID NO: 4). La preproteína LppB de H. somnus está codificada por las posiciones de nucleótidos 872 a 1906 (residuos de aminoácidos 1 a 345) y la proteína madura está codificada por las posiciones de nucleótidos 920 a 1906 (residuos de aminoácidos 17 a 345). La proteína LppB completa, o fragmentos que comprenden polipéptidos inmunogénicos de la proteína, pueden utilizarse en composiciones de vacuna en combinación con cualquiera o ambas de las proteínas de unión a transferrina de H. somnus.

Producción de proteínas de unión a transferrina

Las proteínas de unión a transferrina descritas anteriormente y los fragmentos, análogos y proteínas quiméricas activas derivadas de las mismas, pueden producirse mediante una diversidad de métodos. Específicamente, las proteínas de unión a transferrina pueden aislarse directamente de las bacterias que expresan la misma. Las proteínas pueden aislarse directamente de H. somnus a partir de preparaciones de membrana externa, utilizando técnicas de purificación habituales. Véase, por ejemplo Theisen y Potter (1992) Infect. Immun. 60: 826-831. Las proteínas deseadas pueden purificarse entonces adicionalmente, es decir, mediante cromatografía en columna, HPLC, técnicas de inmunoadsorción u otros métodos convencionales bien conocidos en la técnica.

Alternativamente, las proteínas pueden producirse de manera recombinante tal como se describe en el presente documento. Tal como se explicó anteriormente, estos productos recombinantes pueden tomar la forma de secuencias de proteína parciales, secuencias de longitud completa, formas precursoras que incluyen secuencias señal, formas maduras sin señales, o incluso proteínas de fusión (por ejemplo, con una secuencia líder apropiada para el huésped recombinante, o con otra secuencia antigénica de subunidad para H. somnus u otro patógeno).

Los genes tbp de la presente invención pueden aislarse basándose en la capacidad de los productos de la proteína para unirse a transferrina, utilizando los ensayos de unión a transferrina, tal como se describe más adelante. Por tanto, pueden construirse bibliotecas génicas y pueden usarse los clones resultantes para transformar una célula huésped apropiada. Las colonias pueden reunirse y seleccionarse para obtener clones que tienen actividad de unión a transferrina. Las colonias también pueden seleccionarse utilizando suero policlonal o anticuerpos monoclonales frente a la proteína de unión a transferrina.

Alternativamente, una vez determinadas las secuencias de aminoácidos, pueden prepararse sondas de oligonucleótidos que contienen los codones para una parte de las secuencias de aminoácidos determinadas y utilizarse para seleccionar bibliotecas genómicas o de ADNc para los genes que codifican para las proteínas objeto. Las estrategias básicas para preparar sondas de oligonucleótidos y bibliotecas de ADN, así como su selección mediante hibridación de ácidos nucleicos, son bien conocidas por los expertos habituales en la técnica. Véanse, por ejemplo, DNA Cloning: Vol. I, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente; Oligonucleotide Synthesis, citado anteriormente; Sambrook et al., citado anteriormente. Una vez identificado un clon de la biblioteca seleccionada mediante hibridación positiva, puede confirmarse mediante un análisis con enzimas de restricción y secuenciación del ADN que el inserto de biblioteca particular contiene un gen de la proteína de unión a transferrina o un homólogo del mismo. Los genes pueden aislarse entonces adicionalmente utilizando técnicas habituales y, si se desea, enfoques de PCR o enzimas de restricción empleadas para delecionar partes de la secuencia de longitud completa.

De manera similar, los genes pueden aislarse directamente de las bacterias usando técnicas conocidas, tales como extracción con fenol y manipularse adicionalmente la secuencia para producir cualquier alteración deseada. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente,para una descripción de las técnicas utilizadas para obtener y aislar ADN.

Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de interés pueden prepararse de manera sintética en lugar de clonarse. Las secuencias de ADN pueden diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el huésped deseado si la secuencia va a utilizarse para expresión. La secuencia completa se une a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos habituales y unidos en una secuencia codificante completa. Véanse, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.

Una vez preparadas o aisladas las secuencias codificantes para las proteínas deseadas, pueden clonarse en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado en una cuestión de elección. Ejemplos de vectores de ADN recombinante para la clonación y de las células huésped que pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram negativas), pGV1106 (bacterias gram negativas), pLAFR1 (bacterias gram negativas), pME290 (bacterias gram negativas distintas de E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamífero). Véanse, Sambrook et al., citado anteriormente; DNA Cloning, citado anteriormente; B. Perbal, citado anteriormente.

El gen puede situarse bajo el control de un promotor, un sitio de unión a ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (denominado colectivamente en el presente documento como elementos de "control"), de manera que la secuencia de ADN que codifica para la proteína deseada se transcribe en ARN en la célula huésped transformada mediante un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder. Si se incluye una secuencia señal, puede ser o bien la secuencia homóloga, natural o bien una secuencia heteróloga. Por ejemplo, la secuencia señal para la proteína de unión a transferrina de H. somnus particular, puede utilizarse para la secreción de la misma, al igual que varias de otras secuencias señal, bien conocidas en la técnica. Las secuencias líder pueden eliminarse por el huésped en el procesamiento tras la traducción. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de proteína en relación con el crecimiento de la célula huésped. Los expertos en la técnica conocen secuencias reguladoras, y ejemplos incluyen aquellas que producen la expresión de un gen que va a activarse o desactivarse en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes en el vector otros tipos de elementos reguladores, por ejemplo, secuencias potenciadoras.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia codificante de manera que pueda unirse a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura apropiado. También puede ser deseable producir mutantes o análogos de la proteína de unión a transferrina. Pueden prepararse mutantes y análogos mediante la deleción de una parte de la secuencia que codifica para la proteína, mediante la inserción de una secuencia, y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio, se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente; DNA Cloning, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente.

El vector de expresión se utiliza entonces para transformar una célula huésped apropiada. Se conocen en la técnica varias líneas celulares de mamífero e incluyen líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) (Colección Americana de Cultivos Tipo), tales como, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovinas de Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. De manera similar, huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., encontrarán uso con los presentes constructos de expresión. Huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Células de insecto para su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen mediante el cultivo de células huésped transformadas mediante un vector de expresión descrito anteriormente en las condiciones en las que se expresa la proteína de interés. La proteína se aísla entonces de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en los medios de crecimiento, la proteína puede purificarse directamente de los medios. Si la proteína no se secreta, se aísla de los lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento y los métodos de recuperación apropiados está dentro de los conocimientos del experto en la técnica.

Las proteínas de la presente invención también pueden producirse mediante síntesis química, tal como síntesis de péptidos en fase sólida, utilizando secuencias de aminoácidos conocidas o secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN de los genes de interés. Los expertos en la técnica conocen tales métodos. Véase, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), págs. 3-254, para las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, citado anteriormente, Vol. 1, para la síntesis en disolución clásica. La síntesis química de péptidos puede ser preferible si un pequeño fragmento del antígeno en cuestión puede producir una respuesta inmunológica en el sujeto de interés.

Las proteínas de unión a transferrina de la presente invención, o sus fragmentos, pueden utilizarse para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con un antígeno de la presente invención, o su fragmento, o un antígeno mutado. Se recoge el suero del animal inmunizado y se trata según procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348: 363-370. Si se utiliza suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad, utilizando procedimientos conocidos.

Los expertos en la técnica también pueden producir fácilmente anticuerpos monoclonales para las proteínas de unión a transferrina y los fragmentos de las mismas. La metodología general para obtener anticuerpos monoclonales mediante el uso de tecnología de hibridoma es bien conocida. Pueden crearse líneas celulares inmortales que producen anticuerpos mediante fusión celular y también mediante otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Véanse, por ejemplo, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); véanse también las patentes de los EE.UU. números. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; y 4.493.890. Pueden seleccionarse paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente a las proteínas de unión a transferrina, o a los fragmentos de las mismas, que tengan diversas propiedades; es decir, isotipo, epítopo, con afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles en la purificación, utilizando técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales frente a los que se dirigen. Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales también pueden utilizarse para la inmunización pasiva o pueden combinarse con preparaciones de vacuna de subunidad para aumentar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos policlonales y monoclonales también son útiles para fines de diagnóstico.

Formulaciones y administración de vacunas

Las proteínas de unión a transferrina de la presente invención pueden formularse en composiciones de vacuna, ya sea solas, en combinación y/o con otros antígenos, para su uso para inmunizar a sujetos, tal como se describe más adelante. Los métodos de preparación de tales formulaciones se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edición, 1990. Normalmente, las vacunas de la presente invención se preparan como inyectables, ya sea como suspensiones o disoluciones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la disolución o la suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o el principio activo puede encapsularse en vehículos de liposomas. Generalmente, el principio activo inmunogénico se mezcla con un vehículo farmacéutico compatible, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes y agentes tamponantes del pH.

También pueden añadirse a la formulación adyuvantes que mejoren la eficacia de la vacuna. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, muramil dipéptidos, avridina, hidróxido de aluminio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA), aceites, emulsiones de aceite en agua, saponinas, citocinas y otras sustancias conocidas en la técnica.

Las proteínas de unión a transferrina pueden unirse a un vehículo con el fin de aumentar la inmunogenicidad de las mismas. Vehículos adecuados incluyen macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente, tales como las proteínas, incluyendo albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica; los polisacáridos, tales como Sepharose, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares; los aminoácidos poliméricos tales como poli(ácido glutámico), polilisina, y similares; los copolímeros de aminoácidos; y las partículas inactivas de virus.

Las proteínas de unión a transferrina pueden utilizarse en su forma natural o su contenido en grupo funcional puede modificarse, por ejemplo, mediante la succinilación de los residuos de lisina o la reacción con Cys-tiolactona. También puede incorporarse un grupo sulfhidrilo en el vehículo (o antígeno), mediante por ejemplo, la reacción de las funciones amino con 2-iminotiolano o el éster N-hidroxisuccinimídico de 3-(4-ditiopiridilpropionato). Los vehículos adecuados también pueden modificarse para incorporar ramas de separación (tales como hexametilendiamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para unirse a péptidos.

Otros vehículos adecuados para las proteínas de unión a transferrina de la presente invención incluyen los polipéptidos VP6 de rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.071.651. También es útil un producto de fusión de una proteína vírica y los inmunógenos objeto obtenidos mediante los métodos descritos en la patente de los EE.UU. número 4.722.840. Todavía otros vehículos adecuados incluyen células, tales como linfocitos, ya que la presentación en esta forma imita el modo natural de presentación en un sujeto, que da lugar al estado inmunizado. Alternativamente, las proteínas de la presente invención pueden acoplarse a eritrocitos, preferiblemente a los propios eritrocitos del sujeto. Los expertos en la técnica conocen los métodos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células.

Además, las proteínas de unión a transferrina (o complejos de las mismas) pueden formularse en composiciones de vacuna en sus formas neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

Las formulaciones de vacuna contendrán una "cantidad terapéuticamente eficaz" del principio activo, es decir, una cantidad que pueda provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se administre la composición. En el tratamiento y la prevención de la infección por H. somnus, por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" sería preferiblemente una cantidad que mejore la resistencia del mamífero en cuestión a una nueva infección y/o reduzca la gravedad clínica de la enfermedad. Tal protección se demostrará mediante una reducción o la falta de los síntomas que normalmente se presentan en un huésped infectado y/o un tiempo de recuperación más rápido.

Un experto en la técnica determina fácilmente la cantidad exacta utilizando pruebas habituales. La concentración de la proteína de unión a transferrina oscilará normalmente desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 95% (p/p) de la composición, o incluso mayor o menor si resulta apropiado. Con las presentes formulaciones de vacuna, de 5 a 500 \mug de principio activo por ml de disolución inyectada, preferiblemente de 10 a 100 \mug de principio activo por ml, deben ser adecuados para provocar una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de 1 a 3 ml por animal.

Para inmunizar a un sujeto, la vacuna se administra generalmente por vía parenteral, normalmente mediante inyección intramuscular. Sin embargo, también son aceptables otros modos de administración, tales como inyección subcutánea, intraperitoneal e intravenosa. La cantidad que debe administrarse depende del animal que va a tratarse, de la capacidad del sistema inmunitario del animal para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseada. Un experto habitual en la técnica puede establecer fácilmente las dosis eficaces mediante ensayos habituales que establezcan las curvas dosis - respuesta. El sujeto se inmuniza mediante la administración de la vacuna en al menos una dosis, y preferiblemente dos dosis. Además, al animal se le pueden administrar tantas dosis como se requiera para mantener un estado de inmunidad a la infección.

Las formulaciones de vacuna adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasales, orales y formulaciones de liberación sostenida. Para los supositorios, la composición vehículo incluirá los agentes de unión y vehículos habituales, tales como glicoles polialcalinos o triglicéridos. Tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10% (p/p), preferiblemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2%. Los vehículos orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, celulosa, sacarina sódica, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones de vacuna orales pueden tomarse en forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 95% del principio activo, preferiblemente de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 70%.

Las formulaciones intranasales incluirán normalmente vehículos que ni producen irritación a la mucosa nasal ni alteran significativamente la función ciliar. Diluyentes tales como el agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas pueden emplearse con la invención objeto. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero sin limitarse a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas objeto por la mucosa nasal.

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida se obtienen mediante la incorporación de la proteína en excipientes o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles tales como copolímeros de acetato de etilenvinilo y copolímeros de Hytrel®, polímeros hinchables tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tales como el colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres, tales como los utilizados para realizar suturas reabsorbibles. Las proteínas de unión a transferrina también pueden administrarse utilizando minibombas implantadas, bien conocidas en la técnica.

Las proteínas de unión a transferrina de la presente invención también pueden administrarse mediante un virus vehículo que exprese las mismas. Los virus vehículo que encontrarán uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el virus vaccinia y otros poxvirus, adenovirus y herpesvirus. A modo de ejemplo, pueden construirse recombinantes del virus vaccinia que expresen las proteínas novedosas de la siguiente forma. El ADN que codifica para la proteína particular se inserta en primer lugar en un vector apropiado, de manera que quede adyacente a un promotor del virus vaccinia y flanqueante a las secuencias de ADN del virus vaccinia , tal como la secuencia que codifica para timidina cinasa (TK). Este vector se usa entonces para transfectar células que se infectan simultáneamente con el virus vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor del virus vaccinia más el gen que codifica para la presente proteína en el genoma viral. El recombinante de TK resultante puede seleccionarse cultivando las células en presencia de 5 bromodesoxiuridina y recogiendo las placas virales que resistan a la misma.

Una vía de administración alternativa incluye terapia génica o inmunización con ácidos nucleicos. Por tanto, pueden administrarse secuencias de nucleótidos (y elementos reguladores adjuntos) que codifican para las proteínas de unión a transferrina objeto directamente a un sujeto para la traducción in vivo de las mismas. Alternativamente, puede llevarse a cabo transferencia génica mediante la transfección de las células o tejidos del sujeto ex vivo y volviendo a introducir el material transformado en el huésped. El ADN puede introducirse directamente en el organismo huésped, es decir, mediante inyección (véanse las patentes de los EE.UU. números 5.580.859 y 5.589.466; la Publicación Internacional número WO/90/11092; y Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468). También puede llevarse a cabo la transferencia génica mediada por liposomas utilizando métodos conocidos. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.703.055; Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4: 206-209; Brigham et al. (1989) Am. J Med. Sci. 298: 278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39: 219A; y Nabel et al. (1990) Science 249: 1285-1288. Agentes de selección de objetivo, tales como anticuerpos dirigidos frente a antígenos de superficie expresados en tipos de células específicos, pueden conjugarse covalentemente a la superficie del liposoma, de manera que el ácido nucleico pueda administrarse a células y tejidos específicos propensos a la infección.

Ensayos de diagnóstico

Tal como se explicó anteriormente, las proteínas de unión a transferrina de la presente invención también pueden utilizarse como diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos reactivos de H. somnus en una muestra biológica con el fin de determinar la presencia de infección producida por H. somnus. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos que reaccionan con las proteínas de unión a transferrina puede detectarse utilizando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico habituales, incluyendo inmunoensayos, tales como ensayos de tipo de competencia, reacción directa o de tipo intercalado. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a, Western blots; pruebas de aglutinación; inmunoensayos mediados y marcados por enzimas, tales como ELISA; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcadores relevantes tales como marcadores fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivos, marcadores enzimáticos o moléculas colorantes, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o anticuerpos que han reaccionado con el mismo.

Los ensayos mencionados anteriormente incluyen generalmente la separación de anticuerpos no unidos en una fase líquida de un soporte en fase sólida al que se unen los complejos antígeno - anticuerpo. Los soportes sólidos que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillos de microtítulo); poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, láminas o pocillos de microtítulo); látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microtítulo); fluoruro de polivinilidina; papel diazotizado; membranas de nylon; perlas activadas, perlas magnéticamente sensibles, y similares.

Normalmente, un soporte sólido se hace reaccionar en primer lugar con un componente en fase sólida (por ejemplo, una o más proteínas de unión a transferrina) en condiciones de unión adecuadas, de manera que el componente esté suficientemente inmovilizado al soporte. En ocasiones, la inmovilización del antígeno al soporte puede mejorarse acoplando en primer lugar el antígeno a una proteína con mejores propiedades de unión. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas tales como albúminas séricas que incluyen albúmina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Otras moléculas que pueden utilizarse para unir antígenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y similares. Tales moléculas y métodos para acoplar estas moléculas a los antígenos, son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica. Véanse, por ejemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3: 2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 2: 56-63; y Anjaneyulu y Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30: 117-124.

Tras hacer reaccionar el soporte sólido con el componente en fase sólida, se elimina cualquier componente en fase sólida no inmovilizado del soporte mediante lavado, y entonces el componente unido al soporte se pone en contacto con una muestra biológica que se sospecha que contiene restos del ligando (por ejemplo, anticuerpos frente a los antígenos inmovilizados) en condiciones de unión adecuadas. Tras el lavado para eliminar cualquier ligando no unido, se añade un resto de unión secundario en condiciones de unión adecuadas, en las que el agente de unión secundario puede asociarse selectivamente con el ligando unido. La presencia del agente de unión secundario puede detectarse entonces utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Más particularmente, puede utilizarse un método de ELISA, en el que los pocillos de una placa de microtítulo se recubren con una proteína de unión a transferrina. Entonces se añade a los pocillos recubiertos una muestra biológica que contiene o que se sospecha que contiene moléculas de inmunoglobulina anti-proteína de unión a transferrina. Tras un periodo de incubación suficiente para permitir la unión del anticuerpo al antígeno inmovilizado, la(s)
placa(s) puede(n) lavarse para eliminar los restos no unidos y se añade una molécula de unión secundaria marcada de manera detectable. Se permite que la molécula de unión secundaria reaccione con cualquier anticuerpo de la muestra capturado, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Por tanto, en una realización particular, puede detectarse fácilmente la presencia de ligandos anti-antígeno de unión a transferrina unidos a partir de una muestra biológica utilizando un agente de unión secundario que comprende un anticuerpo dirigido frente a los ligandos de anticuerpo. Se conocen en la técnica varias moléculas de inmunoglobulina (Ig) anti-bovinas que pueden conjugarse fácilmente con un marcador enzimático detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o ureasa, utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se utiliza entonces un sustrato de enzima apropiado para generar una señal detectable. En otras realizaciones relacionadas, pueden ponerse en práctica técnicas competitivas de tipo ELISA utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden realizarse ensayos en disolución, de manera que las proteínas de unión a transferrina y los anticuerpos específicos para esas proteínas formen complejos en condiciones de precipitación. En una realización particular, las proteínas de unión a transferrina pueden unirse a una partícula en fase sólida (por ejemplo, una perla de agarosa o similar) utilizando técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, tales como mediante acoplamiento químico directo o indirecto. La partícula recubierta por antígeno se pone entonces en contacto, en condiciones de unión adecuadas, con una muestra biológica que se sospecha que contiene anticuerpos para las proteínas de unión a transferrina. La formación de enlaces transversales entre los anticuerpos unidos produce la formación de agregados de complejo partícula – antígeno - anticuerpo, que pueden precipitarse y separarse de la muestra utilizando lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción puede analizarse para determinar la presencia o ausencia de complejos anticuerpo - antígeno utilizando cualquiera de varios métodos habituales, tales como los métodos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente.

Todavía en una realización adicional, puede proporcionarse una matriz de inmunoafinidad, en la que una población policlonal de anticuerpos a partir de una muestra biológica que se sospecha que contiene anti-moléculas de unión a transferrina se inmoviliza a un sustrato. A este respecto, puede llevarse a cabo una purificación por afinidad inicial de la muestra utilizando antígenos inmovilizados. La preparación de muestra resultante sólo contendrá, por tanto, restos anti-H. somnus, evitando las posibles propiedades de unión no específicas en el soporte de afinidad. Se conocen en la técnica varios métodos de inmovilización de inmunoglobulinas (intactas o en fragmentos específicos) con alto rendimiento y buena conservación de la actividad de unión al antígeno. Sin limitarse a ningún método particular, puede usarse la proteína A o proteína G inmovilizada para inmovilizar inmunoglobulinas.

En consecuencia, una vez que las moléculas de inmunoglobulina se han inmovilizado para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, las proteínas de unión a transferrina marcadas se ponen en contacto con los anticuerpos unidos en condiciones de unión adecuadas. Tras lavar del soporte de inmunoafinidad cualquier antígeno no unido específicamente, puede determinarse la presencia de antígeno unido sometiendo a ensayo para determinar marcadores utilizando métodos conocidos en la técnica.

Adicionalmente, los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas de unión a transferrina, en lugar de las propias proteínas de unión a transferrina, pueden utilizarse en los ensayos descritos anteriormente con el fin de detectar la presencia de anticuerpos frente a las proteínas en una muestra dada. Estos ensayos se realizan esencialmente tal como se describió anteriormente y son muy conocidos por los expertos en la técnica.

Los reactivos de los ensayos descritos anteriormente, incluyendo las proteínas de unión a transferrina, o los anticuerpos frente a las mismas, pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar inmunoensayos, tal como se describió anteriormente. El kit también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular utilizado, marcadores adecuados y otros materiales y reactivos envasados (es decir tampones de lavado y similares). Los inmunoensayos habituales, tales como los descritos anteriormente, pueden realizarse utilizando estos kits.

A continuación, se muestran ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno.

C. Experimentos Ejemplo 1 Aislamiento y clonación de tbp1 y tbp2 de H. somnus Materiales y métodos Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento

E. coli DH5\alphaF'IQ[\phi80 lacZ\DeltaM15 endA1 recA1 hsdR17 (r_{K}^{-}m_{K}^{+}) supE44 thi-1 \lambda^{-} gyrA96 relA1 \Delta(lacZYA-argF) U169/F' lacI^{q} proAB^{+} lacZ\DeltaM15 zzf::Tn5 (Km^{r})] (disponible comercialmente de, por ejemplo, Stratagene), y JM105 (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II y III, Segunda Edición (1989)) procedían de la colección del laboratorio. Las cepas de E. coli se hicieron crecer en condiciones aerobias a 37ºC en medio Luria-Bertani (LB) o en medio definido M63 que contenía el 0,5% (v/v) de glicerol complementado con un 2% (p/v) de casaminoácidos. Se utilizó ampicilina a 50 \mug/ml. Se obtuvo la cepa de H. somnus HS25 del pulmón de un ternero que había muerto de neumonía y que se ha demostrado que induce hemofilosis experimental en los terneros. Las condiciones para el almacenamiento y el crecimiento de H. somnus se han descrito anteriormente. Theisen y Potter (1992) J. Bacteriol. 174: 17-23. Se obtuvieron cultivos líquidos en caldo de infusión de cerebro y corazón (Difco laboratories, Detroit, MI) complementado con el 0,1% (p/v) de base Tris y el 0,001% (p/v) de monofosfato de tiamina (BHI-TT). Se obtuvo el crecimiento en condiciones de hierro disminuido añadiendo el quelante de hierro 2,2'-dipiridilo a una concentración final de 300 \muM al medio BHI-TT.

La biblioteca de expresión consistió en los fragmentos de restricción de Sau3A1 parciales de 2 a 7 kb de ADN genómico de H. somnus ligado en el sitio de restricción BamHI de pGH432 (véase, Theisen y Potter (1992) J. Bacteriol. 174: 17-23), lo que permitió fusiones dentro del marco con un péptido líder artificial, cuya expresión puede inducirse a partir de un promotor tac controlado por lacO (Advanced Vectors, Hopkins, MN).

Preparación de receptores de transferrina natural de H. somnus y antisueros específicos

Las proteínas de unión a transferrina (Tbp) de la cepa de H. somnus HS25 se aislaron mediante cromatografía de afinidad utilizando transferrina bovina tal como describieron Ogunnariwo et al. (1990) Microbiol. Path. 9: 397-406. Brevemente, se mezclaron membranas totales de H. somnus con transferrina bovina biotinilada antes de su solubilización con EDTA-Sarkosyl y la adición a estreptavidina-agarosa. El material unido por afinidad se eliminó lavando con diversos tampones. Se obtuvo un antisuero específico frente a las proteínas de unión a transferrina en un conejo mediante métodos convencionales.

PAGE e inmunotransferencia

Se realizó la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) de las proteínas utilizando el método descrito por Laemmli (Laemmli, R.U. (1970) Nature 227: 680-685). Se llevó a cabo inmunotransferencia utilizando las técnicas habituales descritas por el fabricante del aparato de electrotransferencia (BioRad Laboratories). El antisuero primario fue suero de conejo obtenido frente a Tbp de H. somnus purificada mediante cromatografía de afinidad o suero hiperinmune bovino obtenido frente a la cepa viva de H. somnus HS25 (Theisen y Potter (1992) J. Bacteriol. 174: 17-23). Se detectaron las proteínas serorreactivas con inmunoglobulina G de cabra anti-conejo acoplada a fosfatasa alcalina (PhoA) o con inmunoglobulina G de cabra anti-bovina acoplada a PhoA (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.). Se visualizó la actividad de PhoA utilizando el sistema nitroazul de tetrazolio - BCIP (Promega, Madison, WI).

Inmunotransferencia de colonias de una biblioteca genómica de H. somnus

Células JM105 que portaban la biblioteca de expresión de plásmidos de H. somnus HS25 se colocaron en línea sobre placas de agar y se probaron para determinar la producción de Tbp por el método de hibridación en colonia (French et al. (1986) Anal. Biochem. 156: 417-423) utilizando suero de conejo obtenido frente a Tbp de H. somnus purificada por afinidad.

Técnicas de ADN

Se utilizaron métodos habituales para las manipulaciones del ADN (Sambrook, citado anteriormente). Se realizaron digestos con enzimas de restricción de ADN en el tampón de ADN polimerasa de T4 (Sambrook, citado anteriormente) con ditiotreitol 1 mM y complementado con espermidina 3 mM. Todos los oligonucleótidos sintéticos se produjeron con un sintetizador de ADN Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia). Se realizó la secuenciación del ADN mediante el método de terminación de cadena o didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467; el kit de secuenciación de T7 (Pharmacia)) o ADN de cadena simple derivado de deleciones anidadas preparadas mediante el tratamiento con exonucleasa III (Henikoff, S. (1977) Gene 28: 351-359; el kit de deleción anidado de doble cadena (Pharmacia)) o ADN de doble cadena como molde. Se analizaron las secuencias con el paquete de software PCGENE (IntelliGenetics, Mountain View, Calif.).

Se utilizó PCR inversa, basada en el método de Ochman et al. (Ochman et al. (1990) "Amplification of flanking sequences by inverse PCR" enPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press) para clonar tbp2 de HS25 de H. somnus.

Enriquecimiento de Tbp1 y Tbp2 de E. coli producidas de manera recombinante

Para Tbp1, se hicieron las bacterias crecer hasta la fase semilogarítmica en un litro de caldo L complementado con 50 \mug/ml de ampicilina. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,6, se añadió isopropil-\beta,D-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM y se incubaron los cultivos con agitación vigorosa durante 2 h a 37ºC. Se recogieron las bacterias mediante centrifugación, se resuspendieron en 40 ml de sacarosa al 25%/tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8) y se congelaron a -70ºC. Se descongelaron las células congeladas a temperatura ambiente y se añadieron 10 ml de lisozima (10 mg/ml en Tris-HCl 250 mM, pH 8). Tras 15 minutos en hielo se añadieron 300 ml de mezcla de detergente (5 partes de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4/cloruro sódico 300 mM/ácido desoxicólico al 2%/Nonidet-P40 al 2% y 4 partes de Tris-HCl 100 mM, pH 8/EDTA 50 mM/Triton X-100 al 2%). Se redujo la viscosidad mediante sonicación y se recogieron los agregados de proteínas mediante centrifugación a 27.000 X g durante 15 minutos. Se disolvieron los gránulos en un volumen mínimo de clorhidrato de guanidina 4 M. Se analizaron las proteínas mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio - poliacrilamida y se calculó la concentración de la proteína comparando la intensidad de las bandas teñidas con azul de Coomassie con un patrón de albúmina sérica
bovina.

Se purificó Tbp2 a partir de las membranas externas totales con Sarkosyl. Brevemente, se hicieron crecer las bacterias hasta la fase semilogarítmica en un litro de caldo L complementado con ampicilina. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó aproximadamente 0,6, se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM y se incubaron los cultivos con agitación vigorosa durante 2 - 4 h a 37ºC. Se recogieron las bacterias mediante centrifugación, se resuspendieron en tampón Tris-HCl, pH 8 y se trataron con lisozima, tal como se describió anteriormente. Se rompieron las células por sonicación y se eliminaron los desechos de células insolubles por centrifugación. Entonces se dividió el sobrenadante en fases en un gradiente de sacarosa y se retiró la banda de proteína de membrana externa con una jeringa tras centrifugación durante la noche. Tras la diálisis, se solubilizaron las lipoproteínas incluyendo Tbp2 selectivamente mezclando los fragmentos de membrana con Sarkosyl. En presencia de este detergente, las proteínas modificadas por lípidos siguen siendo solubles, mientras que se precipitan los fragmentos de membrana externa y pueden eliminarse por ultracentrifugación.

Marcaje de las proteínas con tratamiento de [^{3}H]palmitato y globomicina

Se incubaron células en crecimiento exponencial (4 x 10^{8} células por ml) de la cepa HS25 de H. somnus en BHI-TT y de E. coli DH5\alphaF'IQ que portaban los plásmidos especificados en medio definido M63, durante 2 h a 37ºC con [^{3}H]palmitato a una concentración final de 50 \muCi/ml, en ausencia o presencia de globomicina (100 \mug/ml), un inhibidor específico de la peptidasa señal II de prolipoproteínas (Dev et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 5891-5894) tal como se describió anteriormente (Theisen et al. (1992) Infect. Immun. 62: 826-831). Se terminó el marcaje mediante la precipitación con ácido tricloroacético (10%, p/v) durante 30 min en hielo. Se sedimentaron las proteínas por centrifugación a 15.000 x g durante 20 min y se lavaron dos veces con metanol para eliminar los lípidos. Se analizaron las proteínas, resuspendidas en tampón de muestra, mediante SDS-PAGE y se detectaron las bandas de proteínas radiomarcadas en el gel seco por fluorografía.

Fraccionamiento de células de H. somnus y preparación de las membranas externas

Se lisaron células de H. somnus HS25 en crecimiento exponencial mediante dos pases a través de una celda de prensa francesa. Se realizó la separación de las diversas fracciones celulares, incluyendo membranas externas insolubles en Sarkosyl (Filip et al. (1973) J. Bacteriol. 115: 717-722) mediante centrifugación diferencial, tal como se describió anteriormente (Rioux et al. (1992) Gene 116: 13-20). Se precipitaron las proteínas procedentes de los lisados celulares y diversas fracciones en ácido tricloroacético al 10% (p/v) durante 40 min en hielo, se sedimentaron mediante centrifugación a 15.000 x g durante 20 min, y se lavaron dos veces con metanol para eliminar los lípidos antes del análisis mediante SDS-PAGE.

Resultados

Con el fin de identificar los clones que expresan epítopos de Tbp, se seleccionó una biblioteca de expresión genómica de la cepa HS25 de H. somnus en E. coli con antisuero policlonal obtenido frente a Tbp1 y Tbp2 de H. somnus purificadas por afinidad. Este antisuero anti-Tbp reaccionó con proteínas con pesos moleculares relativos de 80.000 y 115.000, respectivamente (denominadas Tbp2 y Tbp1, respectivamente, en el presente documento).

Se obtuvo un clon que llevaba un inserto de ADN de 4,1 kilopares de bases. El análisis de la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN mostró la presencia de un marco de lectura abierto truncado que codificaba para un polipéptido previsto similar a la región carboxilo de los polipéptidos previstos Tbp1 de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Se produjo un polipéptido con un Mr de aproximadamente 110.000 mediante el clon; este polipéptido se reconoció mediante suero hiperinmune bovino frente a H. somnus HS25 viva.

Se obtuvo la región de ADN que codifica para el extremo amino terminal de Tbp1 de H. somnus utilizando el método de la reacción en cadena de la polimerasa inversa. El ORF de tbp1 completo codifica para un polipéptido de 971 aminoácidos con un peso molecular previsto de 109.725. Se confirmaron el marco de lectura y un posible sitio de escisión de la peptidasa señal I mediante la secuencia de aminoácidos parcial obtenida a partir de la microsecuenciación del extremo N-terminal de la forma madura de Tbp1 natural de H. somnus. La molécula incluye un péptido señal de 28 aminoácidos.

Se subclonó la región del gen tbp1 que codifica para Tbp1 madura en un vector de expresión pGH432 de E. coli, que contenía un promotor tac para dar el plásmido pCRR41 (número de registro de ATCC 98810) que expresaba la proteína Tbp1 de H. somnus como cuerpos de inclusión insolubles tras la inducción con IPTG, y se purificó parcialmente Tbp1 mediante la preparación de agregados.

Se aisló el gen que codifica para Tbp2 mediante PCR inversa y se expresó la secuencia que codifica para el péptido Tbp2 entero, incluyendo la secuencia señal, en el mismo vector tal como se describió anteriormente. Este plásmido se denominó pCRR90 (número de registro de ATCC 98811). Tras la inducción con IPTG, se extrajo la proteína Tbp2 de las membranas externas totales de E. coli con Sarkosyl, tal como se describió anteriormente. A diferencia de otras proteínas de membrana, Tbp2 permaneció soluble en este detergente debido a su modificación
lipídica.

Los genes que codifican para Tbp1 y Tbp2, más el ADN flanqueante se muestran en las figuras 1A-1B. Se encontraron dos marcos de lectura abiertos, uno que comienza en el nucleótido 708 y termina en la posición 2693 (Tbp2) y el segundo que comienza en el nucleótido 2891 y termina en la posición 5803 (Tbp1) (véase la figura 2). Las secuencias de aminoácidos previstas de estas dos proteínas se muestran en la figura 3 (Tbp1) y en la figura 4 (Tbp2). La secuencia de Tbp1 de longitud completa incluye un péptido señal de 28 aminoácidos, que aparece en las posiciones 1 a 28 de la figura 3. Por tanto, la secuencia de Tbp1 madura está representada por los aminoácidos 29 a 971, inclusive, de la figura 3 y está codificada por la secuencia de nucleótidos representada en las posiciones 2975 a 5803, inclusive de las figuras 1A-1B.

La secuencia de Tbp2 de longitud completa incluye un péptido señal de 19 aminoácidos, que aparece en las posiciones 1 a 19 de la figura 4. Por tanto, la secuencia de Tbp2 madura está representada por los aminoácidos 20 a 662, inclusive, de la figura 4 y está codificada por la secuencia de nucleótidos representados en las posiciones 765 a 2683, de la figuras 1A-1B.

Ejemplo 2 Eficacia protectora de las proteínas de unión a transferrina recombinantes

Las proteínas Tbp1 y Tbp2 se produjeron de manera recombinante en E. coli como cuerpos de inclusión y como proteínas unidas a la membrana, respectivamente. Tal como se explicó anteriormente, se prepararon los cuerpos de inclusión de Tbp1 utilizando procedimientos habituales, mientras que se preparó Tbp2 soluble a partir de las membranas externas de E. coli. Estas membranas se sometieron entonces a una extracción con Sarkosyl con el fin de solubilizar preferentemente Tbp2.

Se formularon vacunas utilizando el adyuvante VSA3 (una combinación de DDA (Kodak) y Emulsigen-Plus (MVP Laboratories, Omaha, NE)) de manera que el volumen de cada dosis fuera de 2 cc conteniendo 50 \mug de cada antígeno. También se preparó una vacuna placebo que contenía diluyente estéril en lugar de antígeno. Se incluyeron tres grupos en el ensayo, uno que recibió placebo, un segundo que recibió dos inmunizaciones con Tbp2 y un tercero que recibió dos inmunizaciones con Tbp1 + Tbp2. Cada grupo tenía ocho animales y el intervalo entre la inmunización primaria y la secundaria fue de tres semanas. Todas las vacunas se llevaron a cabo en una granja en el sur de Saskatchewan y las vacunas se administraron por vía subcutánea.

Dos semanas tras la segunda inmunización, se expusieron los animales a herpesvirus 1 bovino seguido cuatro días después por exposición con aerosol a la cepa HS25 de H. somnus. Se examinaron los animales diariamente por un veterinario y un técnico de la salud animal y se registraron los siguientes datos: peso, temperatura, puntuaciones nasales, depresión, fuerza, disnea y enfermedad. Se puntuó cada uno de estos criterios, con la excepción del peso y la temperatura, en una escala de 0-4.

Se midió la respuesta serológica a la vacunación utilizando un ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA). Se recogieron muestras séricas en el momento de las inmunizaciones primera y segunda más en el día de la exposición a BHV-1. Se presentan los títulos como recíprocos a la dilución sérica, lo que da como resultado una densidad óptica equivalente al valor de fondo más dos desviaciones estándar.

Ninguno de los animales mostró ninguna respuesta adversa a la inmunización con ninguna de las formulaciones utilizadas. Se determinó la respuesta serológica a la vacunación utilizando un procedimiento de ELISA que midió los niveles séricos de anticuerpos frente a Tbp1 y Tbp2. También se utilizó un extracto de membrana externa de H. somnus como un antígeno pero no se observó ningún aumento significativo en el título. Esto no resulta inesperado, ya que el nivel de proteínas de la membrana externa reguladas por hierro en esta preparación de antígeno es extremadamente bajo.

Los títulos de anticuerpos frente a Tbp1 y Tbp2 se muestran en las figuras 5 y 6, respectivamente. Puede observarse que los animales que recibieron vacunas de Tbp2 recombinante respondieron bien a este antígeno, sin diferencia significativa entre los grupos 2 y 3. La respuesta frente a Tbp1 fue mínima, tal como se esperaba basándose en la experiencia con este antígeno en otros organismos. El grupo que recibió sólo Tbp2 también tenía niveles séricos de anticuerpos frente a Tbp1, pero esto se debió probablemente a proteínas de E. coli contaminantes presentes en la preparación de antígeno utilizada para el ELISA.

La mortalidad en el grupo placebo fue del 62,5%, próxima a una tasa esperada de aproximadamente el 70%. La mortalidad por grupo se muestra en la figura 7 y se enumera por día en la tabla 1. Como puede observarse, la inmunización con vacunas que contienen Tbp2 recombinante redujo la mortalidad hasta el 25%, mientras que la inmunización con vacunas que incluían una combinación de Tbp1 y Tbp2, tuvo poco efecto en comparación con el placebo. Se realizaron autopsias de todos los animales que murieron durante el ensayo, y en todos los casos se obtuvo un cultivo de H. somnus de los pulmones y se observó que la patología concordaba con la neumonía producida por H. somnus.

Dado que los títulos de ELISA frente a Tbp2 fueron similares en ambos grupos de vacuna experimentales, es sorprendente que no se observaran niveles equivalentes de protección. Sin embargo, esto puede reflejar simplemente una captación más eficaz de H. somnus por las células fagocíticas en el grupo de Tbp1 + Tbp2, lo que permite la multiplicación aumentada de las bacterias en un entorno intracelular.

Los resultados clínicos se resumen en la tabla 1 y los resultados de las puntuaciones de temperatura, depresión y enfermedad se ilustran en las figuras 8, 9 y 10, respectivamente. Estos resultados son similares a los obtenidos para la mortalidad, mostrando el grupo inmunizado con Tbp2 constantemente puntuaciones más bajas en prácticamente todas las categorías. Los resultados mostrados en las figuras 8, 9 y 10 sólo incluyen del día 5 al 8 del ensayo, puesto que los animales se expusieron a H. somnus en el día 4. Las puntuaciones clínicas son prácticamente idénticas entre los tres grupos en los días 1 al 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Depósitos de cepas útiles en la puesta en práctica de la invención

Se elaboró un depósito de cultivos biológicamente puros de las cepas siguientes con la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas. El número de registro indicado se asignó tras las pruebas de viabilidad satisfactorias y se pagaron las tasas requeridas. Se elaboraron los depósitos según lo estipulado por el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y los Reglamentos conformes al mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos de viables durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha del depósito. Los microorganismos estarán disponibles en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, lo que garantiza la disponibilidad permanente e ilimitada de la progenie de uno determinado por el Commissioner of Patents and Trademarks (Comisionado de Patentes y Marcas) de los EE.UU. que da derecho al mismo según el artículo 35 del U.S.C. (United Status Code) párrafo 122 y las normas del Comisionado de conformidad al mismo (incluyendo el artículo 37 del C.F.R. (Code of Federal Regulations) párrafo 1.12 con referencia particular a 886OG638). En la concesión de una patente, se eliminarán irrevocablemente todas las restricciones sobre la disponibilidad para el público de los cultivos depositados.

Estos depósitos se facilitan simplemente como conveniencia para los expertos en la técnica, y no constituyen el reconocimiento de que se requiere un depósito según el artículo 35 del U.S.C., párrafo 112. Las secuencias de ácidos nucleicos de estos genes, así como las secuencias de aminoácidos de las moléculas codificadas por los mismos, se incorporan en el presente documento como referencia y se controlan en el caso de cualquier conflicto con la descripción en el presente documento.

Cepa	Fecha de depósito	Nº de ATCC
pCRR41 en E. coli DH5\alphaF'IQ	14 de julio de 1998	98810
pCRR90 en E. coli DH5\alphaF'IQ	14 de julio de 1998	98811

Así, se describe la clonación, expresión y caracterización de las proteínas de unión a transferrina de H. somnus, así como los métodos de uso de las mismas. Aunque se han descrito las realizaciones preferidas de la invención objeto en cierto detalle, se entiende que puede realizarse variaciones obvias sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Composición de vacuna que consiste esencialmente en un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptables, y una proteína de unión a transferrina de H. somnus aislada inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3.

4. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4.

5. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de unión a transferrina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4.

6. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus y una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus.

7. Método para producir una composición de vacuna que comprende:

(a) proporcionar una proteína de unión a transferrina de H. somnus aislada inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4; y

(b) combinar dicha proteína de unión a transferrina con un adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptables.

8. Uso de una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica para la obtención de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para tratar o evitar la infección por H. somnus en un sujeto mamífero.

9. Kit de prueba de inmunodiagnóstico para detectar la infección por Haemophilus somnus, comprendiendo dicho kit de prueba:

una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4; e

instrucciones para realizar la prueba de inmunodiagnóstico.

10. Uso de una proteína de unión a transferrina de H. somnus inmunogénica seleccionada del grupo que consiste en (a) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-971, inclusive, de la figura 3, (b) una proteína 1 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 29-971, inclusive, de la figura 3, (c) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 1-662, inclusive, de la figura 4, y (d) una proteína 2 de unión a transferrina de H. somnus que tiene al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia con la secuencia contigua de aminoácidos mostrada en las posiciones de aminoácidos 20-662, inclusive, de la figura 4, para la obtención de un reactivo de diagnóstico para detectar anticuerpos de Haemophilus somnus en una muestra biológica.