ES2316450T3

ES2316450T3 - Proteina gapc quimerica de streptococcus y su uso en vacunacion y diagnostico.

Info

Publication number: ES2316450T3
Application number: ES01944803T
Authority: ES
Inventors: Andrew A. Potter; Jose Perez-Casal; Michael Fontaine
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 2000-06-12
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2021-06-11
Also published as: US6660270B2; US20080009022A1; WO2001096379A3; PT1294771E; EP1294771B1; CY1108724T1; CA2411919A1; EP1294771A2; WO2001096379A2; US6875853B2; AR028713A1; US20020044928A1; DK1294771T3; US7258992B2; CA2411919C; UY26763A1; DE60136356D1; US20040062774A1; US20050142615A1; ATE412673T1

Abstract

Polipéptido de fusión de epítope múltiple que comprende una secuencia de aminoácido o una secuencia con al menos 80% de identidad de secuencia del mismo, la secuencia de aminoácido que comprende la secuencia mostrada como Figura 6 (SEQ ID NO: 22) pero que carece de secuencia de señal E. coli LipoF descrita como residuos 1 a 27 de la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

Description

Proteína GapC quimérica de Streptococcus y su uso en vacunación y diagnóstico.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere generalmente a antígenos bacterianos y genes que codifican los mismos. Más en particular, la presente invención pertenece a la construcción de una plasmina quimérica que une una proteína de un gen.

Antecedentes

La mastitis, una infección de la glándula mamaria usualmente causada por una bacteria o un hongo, resulta anualmente en grandes pérdidas económicas a la industria lechera. Entre las especies bacterianas más comúnmente asociadas con la mastitis se encuentran varias especies del género Streptococcus, que incluyen S. aureus, S. uberis, (ilegible), S. agalactiae (Lancefield grupo B), S. dysgalactiae (Lancefleld grupo C), S. zooepidemicus, y los grupos Lancefield D, G., L y N streptococci. Algunas de estas especies son contagiosas (por ejemplo S. agalactiae), mientras que otras son consideradas ambiental patógenos (por ejemplo S. dysgalactiae y S. uberis. El patógeno ambiental S. uberis es responsable de aproximadamente un 20% de todos los casos clínicos de mastitis (Bramley, A.J. and Dodd, F.H. (1984) J. Dairy Res. 51:481-512; Bramley, A.J. (1987) Animal Health Nutrition 42:12-16; Watts, J.L. (1988) J. Dairy Sci.71:1616-1624); es el organismo predominante aislado a partir de glándulas mamarias durante el período de no-lactancia (Bramley, A.J. (1984) Br. Vet. J. 140:328-335; Brainley and Dodd (1984) J. Dairy Res. 51:481-512; Oliver, S.P. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1789-1793).

La mastitis que resulta de la infección con S. uberis es comúnmente subclínica, caracterizada por leche aparentemente normal con un incremento en los recuentos de las células somáticas debido al influjo de los leucocitos. La química composición de la leche se cambia debido a la supresión de la secreción con la transferencia de cloruro y bicarbonato de sodio desde la sangre a la leche, causando un cambio del pH a un nivel más alcalino. La mastitis S. uberis puede también tomar la forma de una condición clínica aguda, con signos obvios de enfermedad tales como coágulos o descoloración de la leche e hinchazón o rigidez de la glándula mamaria. Algunos casos de la enfermedad clínica pueden ser severos y puede presentarse pirexia. Para una revisión de las manifestaciones clínicas de mastitis S. ubenis, ver, Bramley (1991) Mastitis: physiology or pathology. p. 3-9. In C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom, y A. W. Hill (ed.), New insights into the pathogenoesis of mastitis. Rijksuniversiteit Gent, Belgium; y Schalm et al. (1971) The mastitis complex-A brief summary. p. 1-3. In Bovine Mastitis. Lea & Febiger, Philadelphia.

Los procedimientos convencionales antibacterianos de control tales como la inmersión del pezón y la terapia con antibióticos son efectivos en el control de muchos tipos de mastitis contagiosa, pero los organismos ambientales típicamente encontrados en todos los establos lecheros son con frecuencia resistente a dichas medidas. La vacunación es por lo tanto una estrategia atractiva para prevenir infecciones de las glándulas mamarias, y se ha mostrado beneficioso en el caso de algunos patógenos contagiosos de la mastitis.

La literatura es limitada con referencia a los estudios de vacunación con S. dysgalactiae y S. uberis, y se han observado resultados variables. En algunos casos, la inmunización ha resultado en sensibilidad incrementada al organismo específico y en otros casos se ha obtenido protección específica a una cepa.

Por ejemplo, estudios previos han mostrado que la infección primaria con S. uberis pueden reducir considerablemente la tasa de infección siguiendo un segundo desafío con la misma cepa (Hill, A.W. (1988) Res. Vet. Sci. 44:386-387). La vacunación local con S. uberis muertos protege la glándula mamaria bovina contra el desafío intramamario con la cepa homologa (Finch et al. (1994) Infect. Immun. 62:3599-3603). De forma similar, la vacunación subcutánea con S. uberis vivos ha mostrado que provoca una modificación dramática de la patogénesis de mastitis con la misma cepa (Hill et al. (1994) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8:109-118). Los animales vacunados de esta forma vierten menos bacterias en su leche y muchos cuartos permanecen libres de infección.

No obstante, la vacunación con bacterias vivas o atenuadas pueden presentar riesgos al receptor. Por otra parte, está claro que las vacunas convencionales muertas son en general en gran parte no efectivas contra S. uberis y S. agalactiae, ya sea debido a la falta de antígenos protectores sobre células cultivadas in vitro o enmascarando estos antígenos mediante mimetismo molecular.

La actual carencia de vacunas existentes para mastitis contra S. agalactiae o las cepas contagiosas de estreptococos se debe al menos en parte a una carencia de conocimientos referentes a los determinantes de virulencia y a los antígenos protectores producidos por aquellos organismos que están implicados en la invasión y protección de la glándula mamaria (Collins et al. (1988) J. Dairy Res. 55:25-32; Leigh et al. (1990) Res. Vet. Sci. 49: 85-87; Marshall et al. (1986) J. Dairy Res. 53: 507-514).

S. dysgalactiae es conocido por unir diversas proteínas extracelulares y derivadas del plasma tales como fibronectina, fibrinógeno, colágeno, alfa-II-macroglobulina, IgG, albumina y otros compuestos. El organismo también produce hialuronidasa y fibrinolisina y es capaz de adherirse e invadir células epiteliales mamarias bovinas. Sin embargo, los roles exactos de los componentes bacterianos responsables de estos fenotipos en la patogénesis no son conocidos.

De una manera similar, la patogénesis de la infección por S. uberis es poco entendida. Por otra parte, la influencia de los factores de virulencia de S. uberis sobre los mecanismos de defensa del huésped y fisiología de la glándula mamaria no está bien definida. Los factores de virulencia conocidos asociados con S. uberis incluyen una cápsula de ácido hialurónico (Hill, A.W. (1988) Res. Vet. Sci. 45:400-404), hialuronidasa (Schaufuss et al. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 271:46-53), proteína similar a R (Groschup, M.H. and Timoney, J.F. (1993) Res. Vet. Sci. 54:124-126), y una cohemolisina, el factor CAMP, también conocido como factor UBERIS (Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249:190-194),), proteína similar a R, activador plasminogen y factor CAMP. Sin embargo, se conoce muy poco de sus papeles en la patogenicidad.

Se ha propuesto el uso de determinantes de virulencia a partir de Streptococcus como agentes inmunogénicos. Por ejemplo, el factor CAMP de S. uberis ha se ha mostrado como protector de sujetos vertebrados de la infección mediante dicho organismo (Jiang, Patente U.S. No. 5.863.543).

El antígeno \gamma del grupo B Streptococci cepa A909 (ATCC No. 27591) es un componente del complejo marcador fr la proteína c, el cual adicionalmente comprende una subunidad \alpha y \beta (Boyle, Patente U.S. No. 5.721.339). Subconjuntos del serotipo Ia, II, y virtualmente todas las células del serotipo Ib del grupo B estreptococo, han sido informados por expresar componentes de la proteína c. Se ha propuesto el uso de la subunidad \gamma como un agente inmunogénico contra infecciones por el Grupo de infección Lancefield B Streptococcus. Sin embargo, su uso para evitar o tratar las infecciones bacterianas en animales, que incluyen mastitis en el ganado, no se han estudiado todavía.

Una plasmina GapC que une proteína a partir de una cepa del Grupo A Streptococcus ha sido previamente identificada y caracterizada, y se ha descrito su uso en terapias trombolíticas (Boyle, et al., Patente U.S. No. 5.237.050; Boyle, et al., Patente U.S. No. 5.328.996). Sin embargo, el uso del GapC como un agente inmunogénico para tratar o prevenir la mastitis no fue ni descrito ni sugerido.

La proteína del grupo A estreptocócica M es considerada uno de los factores de mayor virulencia de este organismo en virtud de su habilidad para impedir el ataque por parte de fagocitos humanos (Lancefield, R.C. (1962) J. Immunol. 89:307-313). Las bacterias persisten en el tejido infectado hasta que se producen anticuerpos contra la molécula M. Los anticuerpos de tipo especifico para la proteína M son capaces de revertir el efecto antifagocítico de la molécula y permite la limpieza eficiente del organismo invasor.

Las proteínas M son uno de los factores claves de la virulencia de Streptococcus pyogenes, debido a su implicación en la mediación de la resistencia a la fagocitosis (Kehoe, M.A. (1991) Vaccine 9:797-806) y su habilidad para inducir las respuestas inmunes potencialmente dañinas al huésped a través de su superantigenicidad y a su capacidad de inducir respuestas reacción cruzada huésped-anticuerpo (Bisno, A.L. (1991) New Engl. J. Med. 325:783-793; Froude et al. (1989) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145:5-26; Stollerman, G.H. (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 61:131-142).

Sin embargo, existen obstáculos para utilizar proteínas M intactas como vacunas. Los epítopes de proteínas opsónicas son extremadamente tipo-específicos, resultando en una estrecha, tipo-protección específica. Por otra parte, algunas M proteínas parece que contienen epítopes que reaccionan de forma cruzada con tejidos del sujeto inmunizado, causando una respuesta autoinmune dañina (Ver por ejemplo, Dale, J.L. and Beached, G.H. (1982) J. Exp. Med 156:1165-1176; Dale, J.L. and Beached, G.H. (1985) J. Exp. Med. 161:113-122; Baird, R.W., Bronze, M.S., Drabs, W., Hill, H.R., Veasey, L.G. and Dale, J.L. (1991) J. Immun. 146:3132-3137; Bronze, M.S. and Dale, J.L. (1993) J. Immun 151:2820-2828; Cunningham, M.W. and Russell, S.M. (1983) Infect. Immun. 42:531-538).

Una vacuna octavalente de M Proteína se ha construido y se evaluó para inmunogenicidad protectora contra múltiples serotipos de la infección del estreptococo grupo A en conejos. Sin embargo, la respuesta inmune obtenida era serotipo-especifica, confiriendo protección sólo contra aquellas cepas bacterianas exhibiendo los epitopes Proteína M presentes en la proteína quimérica (Dale, J.B., Simmons, M., Chiang, E.C., and Chiang, E.Y. (1996) Vaccine 14:944-948).

Las proteínas quiméricas que contienen tres dominios de unión fibronectina diferentes (FNBDs) derivados de las proteínas de unión fibronectina S. dysgalactiae y Staphylococcus aureus se han expresado sobre la superficie de células de Staph. carnosus. En el caso de una de estas proteínas, las inmunizaciones intranasales con células Staph. carnosus vivas recombinantes que expresen la proteína clinérica sobre sus superficies resultan en una respuesta mejorada de anticuerpos a un inmunogen modele presente dentro de la superficie de la proteína quimérica.

Es conocida una molécula quimérica de Proteína G (un tipo III Fc que une la proteína específica para la Fc región de todas las subclases de moléculas de anticuerpo IgG), pero su uso como un agente inmunogénico todavía no ha sido descrito o sugerido (Bjorck, et al. (1992) Patente U.S. No. 5.108.894).

Hasta ahora, la capacidad protectora de las proteínas de fusión GapC epítope múltiple no se ha estudiado todavía.

El documento WO 98/18930 describe péptidos antigénicos de Steptococcus pneumoniae, que incluyen un péptido que puede corresponder a la proteína GapC de S. pneumoniae.

Descripción de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona múltiples epítopes de proteínas de fusión GapC y polinucleótidos que codifican la misma. Según la presente invención, proporcionamos un polipéptido de fusión epitope múltiple que comprende una secuencia de aminoácido o una secuencia con al menos 80% de identidad de secuencia del mismo, la secuencia de aminoácido que comprende la secuencia mostrada como la Figura 6 (SEQ ID NO: 22) pero que carece de una secuencia de señal E. coli LipoF descrita como residuos 1 a 27 de la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

El polipéptido de fusión de epítope múltiple puede comprender una secuencia de aminoácidos como se indicó con anterioridad junto con una secuencia de señal. La secuencia de señal puede comprender la secuencia de aminoácidos descrita en las posiciones 1-27 de la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión de epítope múltiple comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

Nosotros describimos un polipéptido de fusión de epítope múltiple que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

Además en otras realizaciones, la invención está dirigida una secuencias de polinucleótidos que codifican la secuencia del polipéptido de fusión de epítope múltiple descrita con anterioridad o complementos de la misma, así como vectores recombinantes que comprenden el polinucleótido, células huésped que comprende los vectores recombinantes y procedimientos de producir de forma recombinante los polipéptidos.

En otra realización, la invención está dirigida a la composición de la vacuna que comprende un farmacéuticamente aceptable vehículo y un polipéptido de fusión de epítope múltiple como se describió con anterioridad. En ciertas realizaciones, las composiciones de la vacuna comprenden un adyuvante.

Aún en otra realización adicional, la invención está dirigida a un procedimiento de producción de una composición de vacuna que comprende las etapas de:

(1) proporcionar el polipéptido de fusión de epítope múltiple; y

(2) combinar el polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La vacuna puede ser utilizada en un procedimiento de tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto vertebrado, el procedimiento que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la vacuna como se describió con anterioridad.

La infección bacteriana puede ser una infección estreptocócica. Por otra parte, la infección bacteriana puede causar mastitis.

El polinucleótido puede ser utilizado en un procedimiento de tratamiento o prevención de una infección bacteriana en un sujeto vertebrado, el procedimiento que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polinucleótido como se describe aquí.

Según otro aspecto de la invención, proporcionamos el uso de un polipéptido de fusión de epítope múltiple según el primer aspecto de la invención para la fabricación de una composición de la vacuna útil para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado.

En algunas realizaciones, la infección bacteriana es una infección estreptocócica. La infección bacteriana puede causar mastitis.

En realizaciones adicionales, la invención está dirigida a anticuerpos dirigidos contra los anteriores epítope múltiple fusión polipéptidos. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

En otra realización, la invención está dirigida a un procedimiento de detección de anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica, que comprende:

(a) reaccionar dicha muestra biológica con un polipéptido de fusión de epítope múltiple bajo condiciones que permiten que dichos anticuerpos de Streptococcus, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan a dicha secuencia para formar un complejo anticuerpo/antígeno; y

(b) detectar la presencia o ausencia de dicho complejo, y detectando así la presencia o ausencia de anticuerpos de Streptococcus en dicha muestra.

Aún en otra realización adicional, la invención está dirigida a un equipo de prueba inmunodiagnostica para detectar la infección de Streptococcus. El equipo de prueba comprende un polipéptido de fusión de epítope múltiple como se ha descrito con anterioridad e instrucciones para llevar a cabo la prueba inmunodiagnóstica.

Estas y otras realizaciones del objeto de la invención serán fácilmente evidentes a aquellos entendidos en la técnica en vista de lo aquí descrito.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1B describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia deducida del aminoácido del gen gapC para S. dysgalactiae (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12). En la figura, el asterisco representa un codón de terminación, y las regiones subrayadas representan secuencias de nucleótidos complementarias a los iniciadores utilizados para aislar los genes de los cromosomas bacterianos.

Las figuras 2A-2B describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia deducida del aminoácido del gen gapC para S. agalactiae (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14). En la figura, el asterisco representa un codón de terminación, y las regiones subrayadas representan secuencias de nucleótidos complementarias a los iniciadores utilizados para aislar los genes de los cromosomas bacterianos.

Las figuras 3A-3B describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia deducida del aminoácido del gen gapC para S. uberis (SEQ ID NO: 15) y SEQ ID NO: 16). En la figura, el asterisco representa un codón de terminación, y las regiones subrayadas representan secuencias de nucleótidos complementarias a los iniciadores utilizados para aislar los genes de los cromosomas bacterianos.

Las figuras 4A-4B describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia deducida del aminoácido del gen gapC para S. parauberis (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18). En la figura, el asterisco representa un codón de terminación, y las regiones subrayadas representan secuencias de nucleótidos complementarias a los iniciadores utilizados para aislar los genes de los cromosomas bacterianos.

Las figuras 5A-5B describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia deducida del aminoácido del gen gapC para S. iniae (SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20). En la figura, el asterisco representa un codón de terminación, y las regiones subrayadas representan secuencias de nucleótidos complementarias a los iniciadores utilizados para aislar los genes de los cromosomas bacterianos.

La figura 6 describe la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 21) y la secuencia deducida del aminoácido (SEQ ID NO: 22) de la proteína de fusión GapC de epitope múltiple.

Las figuras 7A-7E muestran una carta de alineación de ADN creada por PileUp y mostrado por Pretty software (un componente del GCG Wisconsin Package, versión 10, provisto por el paquete de análisis de secuencia SeqWeb, versión 1.1, de Canadian Bioinformatics Resource). La figura describe la secuencia aislada de los nucleótidos de los genes gapC para S. dysgalactiae (DysGapC, Check 9344) (SEQ ID NO: 11); S. agalactiae (AgalGapC. Check 2895) (SEQ ID NO: 13); S. uberis (UberGapC, Check 5966) (SEQ ID NO: 15); S. parauberis (PUberGapC, Check 9672) (SEQ ID NO: 17); y S. iniae (IniaeGapC, Check 990) (SEQ ID NO: 19). Las secuencias previamente conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check 5841), S. pyogenes (SpyGapC, Check 4037), y una proteína bovina GAPDH (BovGapC, check 5059) son también incluidas. Los parámetros longitud y peso fueron los mismos para todas las secuencias (1018 y 1.00, respectivamente). Los parámetros utilizados en la sed comparación de la secuencia de ADN fueron los siguientes: Pluralidad-2,00; Límite-1; Peso Promedio-1,00; Coincidencia promedio-1,00; Asimetría promedio-0,00; Tabla de comparación de símbolos-pileupdna.cmp; Comprobar-6876; Diferencia Peso-5; Longitud Diferencia Peso-1; PileUp MSF- -1018; Tipo- -N; Comprobación-3804. En la figura, los guiones representan nucleótidos idénticos; los puntos representan intervalos introducidos mediante el software utilizado para generar la carta de alineación, y las tildes representan regiones no incluidas en la alineación general debido a diferencias en la longitud de las secuencias del gen.

Las figuras 8A-8C muestran una carta de alineación de la secuencia de aminoácidos creada por PileUp y mostrada por Pretty (como anteriormente) que describe la alineación de PolyGap4 (SEQ ID NO: 22) con la secuencia deducida de aminoácidos de las proteínas nativas GapC aisladas a partir de S. dysgalactiae DysGapC, Check 6731) (SEQ ID NO: 12), S. agalactiae (AgalGapC, Check 1229) (SEQ ID NO: 14), S. uberis (UberGapC, Check 8229) (SEQ ID NO: 16), S. parauberis (PUberGapC, Check 8889) (SEQ ID NO: 18), y S. iniae (IniaeGapC, check 8785) (SEQ ID NO: 20). Las secuencias previamente conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check 8252), S. pyogenes (SpyGapC, Check 6626) y una proteína bovina GAPDH (BovGapC, Check 8479) también son incluidas. En la figura, los guiones representan nucleótidos idénticos; los puntos representan intervalos introducidos mediante el software PileUp, y las tildes representan regiones no incluidas en la alineación general debido a diferencias en la longitud de las secuencias del gen.

La Figura 9 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada a partir de S. dysgal.

La Figura 10 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada a partir de S. agal.

La Figura 11 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada a partir S. uberis.

La Figura 12 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada a partir S. parauberis.

La Figura 13 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada a partir S. iniae.

La Figura 14 muestra un bloque de hidropatía Kyte-Doolittle, promediada sobre una ventana de 7, un bloque de probabilidad de superficie Emini, un bloque de flexibilidad de cadena Karplus-Schulz, un bloque de índice antigénico Jameson-WoIf, y tanto un bloque de estructura secundaria Chou-Fasman como un Garnier-Osguthorpe-Robson para LipoFGAP4 (SEQ ID NO: 22), la proteína quimérica GapC.

La Figura 15 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para la proteína aislada GapC a partir de S. dysgal.

La Figura 16 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para la proteína aislada GapC a partir de S. agal.

La Figura 17 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para la proteína aislada GapC a partir de S. uberis.

La Figura 18 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para la proteína aislada GapC a partir de S. parauberis.

La Figura 19 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para la proteína aislada GapC a partir de S. iniae.

La Figura 20 es una representación esquemática del bloque de estructura secundaria Chou-Fasman para LipoFGAP4 (SEQ ID NO: 22), la proteína quimérica GapC.

La Figura 21 es un diagrama del plásmido pPolyGap.1.

La Figura 22 es un diagrama del plásmido pPolyGap.2.

La Figura 23 es un diagrama del plásmido pPolyGap.3.

La Figura 24 es un diagrama del plásmido pPolyGap.4.

La Figura 25 es un diagrama del plásmido polygap4.

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Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular, tecnología de microbiología de ADN recombinante, e inmunología, las cuales se encuentran dentro de las habilidad de la técnica. Dichas técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

Las siguientes abreviaturas se utilizan a lo largo del texto:

Alanina: Ala (A): Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N): Ácido Aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C): Glutamina: Gln (Q)

Ácido Glutámico: Glu (E): Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H): Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L): Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M): Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P): Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T): Triptofano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y): Valina: Val (V)

A. Definiciones

En este documento, se emplearán los siguientes términos, y se propone definirlas como se indica a continuación.

Debe destacarse que, como se emplea en este documento, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido claramente dicte otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una proteína Streptococcus GapC" incluye una mezcla de dos o más de dichas proteínas, y similares.

Los términos "proteína GapC" y "proteína GapC de unión plasmina" (aquí empleados de forma intercambiable) o una secuencia de nucleótidos que codifican las mismas, propone una proteína o una secuencia de nucleótidos, respectivamente, que es derivado a partir de un gen GapC encontrado en una variedad de especies de Streptococcus, que incluyen, sin limitación, ciertas cepas del estreptococo grupo A (Lottenbery, R., et al., (1987) Infect. Immun. 55:1914-1918). La secuencia de nucleótidos de genes representativos Streptococcus gapC, y la correspondiente secuencia de aminoácidos de las proteínas GapC codificada por estos genes, son descritas en las figuras. En particular, las figuras 1 a la 5 describen la secuencia aislada del nucleótido y la secuencia aislada de aminoácidos de S. dysgalactiae (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente), S. agalactiae (SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente), S. uberis (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente), S. parauberis (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, respectivamente), y S. iniae (SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, respectivamente). Sin embargo, una proteína GapC como se define aquí no está limitada a las secuencias descritas como subtipos de cada una de estas especies Streptococcus son conocidas y se producirán variaciones en las proteínas GapC entre ellas.

Genes representativos gapC, derivados a partir de S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, y S. parauberis, se encuentran en los plásmidos pET15bgapC, pMF521c, pMF521a, pMF521d, y pMF521e, respectivamente.

Por otra parte, la proteína derivada o secuencia de nucleótidos necesita no ser físicamente derivado a partir del gen descrito con anterioridad, pero puede ser generado en cualquier forma, que incluyen por ejemplo, síntesis química, aislamiento (por ejemplo, a partir de S. dysgalactiae) o mediante producción recombinante, basado en la información aquí provista. Adicionalmente, el término propone proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa (como se define a continuación) unas secuencias contiguas de aminoácidos codificada por los genes, que muestran actividad inmunológica y/o que unen plasmina.

Por lo tanto, los términos propuestos longitud completa, así como inmunogénico, secuencias truncadas y parciales, y análogos y formas precursoras activas de las proteínas. También están incluidos en el término los fragmentos de nucleótido del gen que incluye al menos aproximadamente 8 pares de bases contiguas, más preferentemente al menos aproximadamente 10-20 pares de bases contiguas, y más preferentemente al menos aproximadamente de 25 a 50, o más, pares de bases contiguas del gen, o cualquier entero entre estos valores. Dichos fragmentos son útiles como sondas y en procedimientos diagnósticos, discutidos con mayor detalle a continuación.

Los términos también incluyen aquellas formas que poseen, así como también que carecen, de una secuencia de señal, si la misma está presente, así como las secuencias de ácido nucleico que por tanto las codifican. Adicionalmente, el término propone formas de las proteínas GapC que carece de una región de anclaje de membrana, y secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas con dichas anomalías. Dichas anomalías pueden ser deseables en sistemas que no prevén la secreción de la proteína. Por otra parte, los dominios de unión de plasmina de las proteínas, pueden o no estar presente. Por lo tanto, por ejemplo, si la proteína GapC de unión de plasmina se usará para purificar la plasmina, el dominio de unión de plasmina será generalmente retenido. Si la proteína debe utilizarse en la composición de las vacunas, estarán presentes epítopes inmunogénicos que pueden o no incluir el dominio de unión plasmina.

Los términos también incluyen proteínas en forma neutral o en la forma de sales de adición básica o ácida dependiendo del modo de preparación. Dichas sales de adición ácida pueden implicar grupos amino libres y pueden formarse sales básicas con carboxilos libres. Las sales de adición básicas y ácidas farmacéuticamente aceptables son discutidas por otra parte a continuación. Además, las proteínas pueden ser modificadas mediante combinación con otros materiales biológicos tales como lípidos (tanto aquellos que se producen naturalmente con la molécula u otros lípidos que no destruyen la actividad inmunológica) y sacáridos, o mediante modificación de cadena lateral, tales como la acetilación de grupos amino, fosforilación de cadenas laterales hidroxilo, oxidación de grupos sulfidril, glicosilación de residuos aminoácidos, así como otras modificaciones de la secuencia primaria codificada.

El término por lo tanto propone anomalías, adiciones y sustituciones a la secuencia, en tanto que las funciones del polipéptido para producir una respuesta inmunológica como la que se define aquí. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente conservadoras en la naturaleza, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos están generalmente divididos en cuatro familias: (1) ácida - - aspartato y glutamato; (2) básica - - lisina, arginina, histidina; (3) no-polar - - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargado - - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. Algunas veces fenilalanina, triptofano, y tirosina son clasificados como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato con un glutamato o viceversa; una treonina con una serina o viceversa; o un reemplazo similar conservador de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un mayor efecto sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones menores de aminoácidos que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad y/o afinidad de unión de plasmina de la proteína, y por lo tanto dentro de la definición del polipéptido de referencia.

Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácido, o hasta aproximadamente 15-25 o 20-50 sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácido, o cualquier entero entre estos valores, en tanto que la función deseada de la molécula permanezca intacta.

A este respecto, las proteínas GapC aisladas a partir de estreptococos exhiben diversas regiones variables en su secuencia de aminoácidos, localizadas en las posiciones aminoácido 62 a 81; 102 a 112; 165 a 172; 248 a 271; y 286 a 305. Estas regiones, que en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae exhiben desde 1 a 9 sustituciones de aminoácidos, es probable que sean favorables a la variación sin afectar sustancialmente la función inmunogénica o enzimática.

De forma similar, las sustituciones que se producen en el dominio de unión de la transmembrana, si están presentes, y la secuencia de señal, si está presente, normalmente no afectarán la inmunogenicidad. Un entendido en la técnica puede determinar fácilmente otras regiones de la molécula de interés que pueden tolerar cambios por referencia a los bloques de estructura de proteína mostrados aquí en las figuras 9 a 20.

El término "proteína GapC estreptocócica" indica una proteína GapC de unión plasmina, como se definió con anterioridad, derivada a partir de especies estreptocócicas que producen la misma, que incluyen, pero no están limitadas a S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis, y S. iniae. Por ejemplo, una "proteína GapC S. dysgalactiae" es una proteína GapC de unión plasmina como se definió con anterioridad, derivada a partir de S. dysgalactiae. De forma similar, una "proteína GapC S. agalactiae" indica una proteína gapC de unión derivada a partir de S. agalactiae. Las proteínas o polipéptidos de "tipo salvaje" o "nativo" se refieren a proteínas o polipéptidos aislados a partir de la fuente en la cual las proteínas se producen naturalmente. Los polipéptidos "recombinantes" se refieren a polipéptidos producidos mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas mediante una construcción de ADN exógeno que codifican el polipéptido deseado. Los polipéptidos "sintéticos" son aquellos preparados mediante síntesis química.

Una proteína o polipéptido "aislado" es molécula una proteína o polipéptido separado y discreto de la totalidad del organismo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza; o una proteína o polipéptido desprovisto, en su totalidad o en parte, de secuencias normalmente asociadas con él en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas (como se define a continuación) en asociación con la misma.

El término "funcionalmente equivalente" indica que la secuencia de aminoácido de una proteína GapC de unión plasmina es una que producirá una respuesta inmunológica sustancialmente equivalente o mejorada, como se definió con anterioridad, en comparación con la respuesta producida por una proteína GapC de unión plasmina que tiene identidad con la proteína GapC de unión plasmina de referencia, o una porción inmunogénica de la misma.

El término "epítope" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden B células y/o T células especificas. El término también se utiliza de forma intercambiable con un "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope pueden ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la habilidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Los epítopes pueden incluir de 3 a 5 aminoácidos, más preferentemente de 5 a 10 aminoácidos, hasta la longitud completa de la molécula de referencia.

El término proteína o polipéptido "epítope múltiple" especifica una secuencia de aminoácidos que comprende un epítope como se ha definido aquí, el cual contiene al menos un epítope repetido dos o más veces dentro de una molécula lineal. La secuencia repetitiva no necesita estar directamente conectada a sí misma, no se repite en la naturaleza de la misma forma y, por otra parte, puede estar presente dentro de una secuencia mayor la cual incluye otros aminoácidos que no están repetidos. Para los propósitos de este documento, la secuencia epítope puede ser tanto una copia exacta de una secuencia epítope de tipo salvaje, o una secuencia que es "funcionalmente equivalente" como se ha definido aquí se refiere a una proteína o polipéptido epítope múltiple como se ha definido aquí que se produce mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Una proteína o polipéptido "fusión" o "quimérico" es uno en el cual se unen las secuencias de aminoácidos de más de una fuente. Dichas moléculas puede ser producida de forma sintética o recombinante, como por otra parte se describe aquí (ver la sección titulada "Producción de Proteínas GapC de unión plasmina" infra). Por lo tanto, el término "proteína o polipéptido de fusión epítope múltiple" se refiere a una proteína o polipéptido epítope múltiple como se ha definido aquí que se realiza tanto a través de medios sintéticos o recombinantes.

A este respecto, puede ser producida una proteína de fusión epítope múltiple que comprende las regiones variables en la secuencia de aminoácidos de las proteínas GapC referidas con anterioridad. La secuencia de aminoácido para una proteína de fusión GapC epítope múltiple representativa, y una correspondiente secuencia codificadora del polinucleótido, es descrita aquí en las figuras 6A-6C. Procedimientos para producir la proteína de forma recombinante, que incluyen un procedimiento para construir el plásmido polyGap4 que contiene la secuencia quimérica codificadora (diagramada en la figura 25) y un procedimiento para expresar la proteína a partir del plásmido polyGap4, son descritos en los Ejemplos 4 y 5 infra.

Los términos proteína o polipéptido "inmunogénico" se refiere a una secuencia de aminoácido que produce una respuesta inmunológica como aquí se describe. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se emplea aquí, incluye la secuencia de longitud completa de la plasmina proteína de unión GapC en cuestión, con o sin la secuencia de señal, dominio de anclaje de membrana y/o dominio de unión plasmina, análogos del mismo, o fragmentos inmunogénicos del mismo. Mediante "fragmento inmunogénico" se indica un fragmento de una proteína GapC de unión plasmina que incluye uno o más epítopes y por lo tanto produce la respuesta inmunológica descrito con anterioridad. Dichos fragmentos pueden ser identificados usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopes, bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, epitopes lineales pueden ser determinados mediante la síntesis concurrente de grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula proteína, y reaccionando los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos aún están unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Patente U.S. No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De forma similar, epitopes conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación espacial de la conformación de los aminoácidos tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia nuclear magnética 2-dimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de proteínas también pueden ser identificadas usando bloques de antigenicidad estándar e hidropatía, tales como aquellos calculados usando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible en el Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el procedimiento Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para bloques de hidropatía. Aquí, las figuras 9 a 20 describen perfiles Kyte-Doolittle para proteínas representativas.

Los fragmentos Inmunogénicos usualmente incluirán al menos aproximadamente 3 aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más preferentemente al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, y más preferentemente 25 o más aminoácidos, de la molécula de proteína parental GapC de unión plasmina. No existe limite critico superior para la longitud del fragmento, el cual puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de proteína, o aún una proteína de fusión que comprende dos o más epitopes de GapC.

Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende una molécula antigénica donde la administración de la composición a un sujeto resulta en el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a la molécula antigénica de interés.

Mediante "subunidad de composición de la vacuna" se indica una composición que contiene al menos un polipéptido inmunogénico, pero no todos los antígenos, derivados a partir de u homólogos a un antígeno a partir de un patógeno de interés. Dicha composición está sustancialmente libre de células o partículas del patógeno intacto, o el lisado de dichas células o partículas. De esta manera, una "subunidad composición de la vacuna" se prepara a partir de polipéptidos inmunogénicos al menos parcialmente purificados (preferentemente sustancialmente purificados) del patógeno, o análogos recombinantes del mismo. Una subunidad de composición de la vacuna puede comprender la subunidad antígeno o antígenos de interés sustancialmente libre de otros o polipéptidos del patógeno.

Mediante "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se indica un material el cual no es indeseable biológica o de otra forma, es decir, el material puede ser administrado a un individuo en una formulación o composición sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar en una forma deletérea con cualquiera de los componentes de la composición en la cual está contenido.

Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por un anticuerpo a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una "inmunológica respuesta" incluye pero no está limitado a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células auxiliares T, células supresoras T, y/o células citotóxicas T y/o células \gamma\delta T, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de forma tal que será mejorada la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección y/o reducida la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección será demostrada ya sea mediante una reducción o una carencia de los síntomas normalmente mostrados por un huésped infectado y/o un tiempo de recuperación más rápido.

Mediante "inmunización del ácido nucleico" se indica la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos seleccionados dentro de una célula huésped, para la expresión in vivo de un antígeno, antígenos, un epítope, o epítopes. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente dentro de un sujeto receptor, tales como mediante inyección, inhalación, administración oral, intranasal y mucosal, o similares, o puede ser introducida ex vivo, dentro de células que han sido extraídas del huésped. En este último caso, las células transformadas son reintroducidas dentro del sujeto donde puede montarse una respuesta inmune contra el antígeno codificado mediante la molécula de ácido nucleico.

El término "tratamiento" como se emplea aquí se refiere tanto a (1) la prevención de infección o reinfección (profilaxis), o a (2) la reducción o eliminación de síntomas de la enfermedad de interés (terapia).

Mediante "mastitis" se indica una inflamación de la glándula mamaria en mamíferos, que incluyen vacas, ovejas, cabras, cerdas, yeguas, y similares, causada por la presencia de microorganismos patogénicos, tales como S. uberis. La infección se manifiesta mediante la infiltración de células fagocíticas en la glándula. Generalmente, se reconocen 4 tipos clínicos de mastitis: (1) peraguda, asociada con hinchazón, temperatura, dolor, y secreción anormal en la glándula y acompañada por fiebre y otros signos de disturbio sistémico, tales como depresión marcada, pulso débil y rápido, ojos hundidos, debilidad y anorexia completa; (2) aguda, con cambios en la glándula similares a aquellos citados con anterioridad pero donde la fiebre, la anorexia y la depresión son de leves a moderadas; (3) sub-aguda, donde no se muestran cambios sistémicos y los cambios en la glándula y su secreción son menos marcados; y (4) subclínica, donde la reacción inflamatoria es detectable sólo mediante pruebas estándar parar mastitis.

Las pruebas estándar para la detección de mastitis incluyen pero no están limitadas a, Prueba de Mastitis de California, Prueba de Mastitis de Wisconsin, prueba Nagase, la cuenta electrónica de células y las cuentas de células somáticas utilizados para detectar un alto contenido persistente de células blancas sanguíneas en la leche. En general, una cuenta de células somáticas de aproximadamente 300.000 hasta aproximadamente 500.000 células por ml o mayores, en leche indicará la presencia de infección. De esta manera, una vacuna es considerada efectiva en el tratamiento y/o prevención de la mastitis cuando, por ejemplo, la cuenta de células somáticas en la leche es retenida por debajo de aproximadamente 500.000 células por ml. Para una discusión sobre la mastitis y el diagnóstico de la misma, ver, por ejemplo, The Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Terapia, and Disease Prevención and Control for the Veterinarian, Merck and Co., Rahway, New Jersey, 1991.

Mediante los términos "vertebrado", "sujeto", y "sujeto vertebrado" se indica cualquier miembro del subphylum Chordata, que incluyen, sin limitación, mamíferos tales como bovinos, ovinos, cerdos, cabras, caballos, y humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y aves, que incluyen aves domesticas, salvajes y de caza tales como gallos y gallinas que incluyen pollos, pavos y otras aves gallináceas; y peces. El término no indica una edad particular. De esta manera, tanto adultos y animales recién nacidos, así como fetos, pretenden estar cubiertos.

Una molécula de "ácido nucleico" puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, mARN eucariótico, cADN a partir de eucariótico mARN, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo, mamíferos), e incluso secuencias sintéticas de ADN. El término también abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos base conocidos de ADN y RNA.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico separada y discreta de la totalidad del organismo con el cual la molécula se encuentra en la naturaleza; o una molécula de ácido nucleico desprovisto, en su totalidad o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero teniendo secuencia heterólogas (como se define a continuación) en asociación con la misma. El término "aislado" en el contexto de un polinucleótido indica que el polinucleótido está aislado del cromosoma con el cual está normalmente asociado, y está aislado de la secuencia genómica completa en la cual normalmente se produce. El "polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o fragmento del mismo que es esencialmente libres, por ejemplo, contiene menos de aproximadamente 50%, preferentemente menos de aproximadamente 70%, y más preferentemente menos de aproximadamente 90%, de la proteína con la cual el polinucleótido está naturalmente asociado. Las técnicas para purificar los polinucleótidos de interés son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, desorganización de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y separación del polinucleótido(s) y proteínas mediante cromatografía de intercambio de iones, cromatografía por afinidad y sedimentación según la densidad.

Una "secuencia de codificación" o una "secuencia de nucleótidos que codifican" una proteína particular, es una secuencia de nucleótidos que se transcribe y traducen en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se colocan bajo el control de elementos reguladores apropiados. Las fronteras de la secuencia de codificación son determinadas mediante un codón de iniciación en el término 5' (amino) y un codón de terminación de traducción en el término 3' (carboxi). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, cADN a partir de mARN eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de terminación de transcripción usualmente se localizará 3' a la secuencia de codificación. Una secuencia "complementaria" es una en la cual la base nitrogenada en una posición nucleótido dada es el complemento de la base nitrogenada que aparece en la misma posición en la secuencia de referencia. Para ilustrar, el complemento de la adenosina es tirosina, y vice versa; de forma similar, la citocina es complementaria a la guanina, y vice versa; por lo tanto, el complemento de la secuencia de referencia 5'-ATGCTGA-3' sería 5'-TACGACT-3'.

Una secuencia "de tipo salvaje" o "nativa", como se emplea aquí, se refiere a un polipéptido que codifica secuencias que son esencialmente como las mismas se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, la proteína GapC S. dysgalactiae que codifica secuencias descrita en las figuras 1A-1B (SEQ ID NO: 12).

"Recombinante" como se emplea aquí para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, cADN, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociada con toda o con una porción del polinucleótido con el cual el mismo está asociado en la naturaleza; y/o (2) está unido a un polinucleótido distinto de aquel con el cual el mismo está unido en la naturaleza. El término "recombinante" como se utiliza aquí respecto a una proteína o polipéptido indica un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. "Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros términos como éstos denotan microorganismos procarióticos o líneas celulares eucarióticas cultivadas como entidades unicelulares, se emplean de forma intercambiable, y se refieren a células que pueden ser, o han sido, utilizadas como recipientes para vectores recombinantes u otros ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que han sido transfectadas. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en ADN genómico o total complemento para el progenitor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que son suficientemente similares al progenitor a ser caracterizado por la propiedad relevante, tales como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido deseado, se incluyen en la progenie indicada mediante esta definición, y son cubiertos por términos anteriores.

La "homología" se refiere al porcentaje de identidad entre los dos polinucleótidos o las dos mitades de polipéptido. Dos ADN, o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homólogos" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 80%-85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%-98% secuencia de identidad durante una longitud definida de las moléculas. Como se emplea aquí, sustancialmente homólogos también se refiere a secuencias que muestran identidad completa al ADN específico o secuencia de polipéptido.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido-a-nucleótido o aminoácido-a-aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptido, respectivamente. El porcentaje de identidad puede ser determinado mediante una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas mediante la alineación de las secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado mediante 100. Pueden emplearse programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo local de homología de Smith and Waterman (1981) Advances en Appl. Math. 2:482-489 para el análisis de péptidos. Programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Secuencia Analysis Package, Version 8 (disponible en Genetics Computer Grupo, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith and Waterman. Estos programas son fácilmente utilizados con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Secuencia Analysis Package referido con anterioridad. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia particular de nucleótidos a una secuencia de referencia puede ser determinada usando el algoritmo de homología de Smith and Waterman con una tabla de puntuación por defecto y un intervalo de penalización de seis posiciones nucleótido.

Otro procedimiento de establecer el porcentaje de identidad es utilizar el MPSRCH package de programas registrados por la University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De esta serie de paquetes puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman donde los parámetros por defecto se utilizan para la tabla de puntación (por ejemplo, penalización de separación abierta de 12, penalización de extensión de separación de uno, y una separación de seis). A partir de los datos generados los valores "Coincide" reflejan de "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizados con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden utilizarse siguiendo los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; hilo = ambos; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado por = ALTA PUNTUACIÓN; Bases de datos = no redundantes, GenBank \pm EMBL + DDBJ + PDB + traducciones GenBank CDS + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden ser consultados en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, la homología puede ser determinada mediante la hibridación de los polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homologas, seguidas por la digestión con nucleasa(s) específicas de un único hilo, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, como se definió para ese sistema particular. La definición de las condiciones apropiadas de hibridación se encuentra dentro de las habilidades de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; ADN Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Mediante el término "variante degenerada" se indica un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia del ácido nucleico del mismo, que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido que el polipéptido codificado por el polinucleótido a partir del cual se deriva la variante degenerada.

Las técnicas para determinar la "similitud" de la secuencia de aminoácidos son bien conocidas en la técnica. En general, "similitud" significa la comparación exacta aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, donde los aminoácidos son idénticos o poseen similares propiedades químicas y/o físicas tales como carga o hidrofobicidad. Así un llamado "porcentaje similitud" puede ser determinado entonces entre las secuencias de polipéptido comparadas. Las técnicas para determinar la identidad del ácido nucleico y la secuencia de aminoácido también son bien conocidas en la técnica e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del mARN para ese gen (usualmente a través de un intermediario cADN) y determinar la secuencia de aminoácido codificada por el mismo, y comparar esto con una segunda secuencia de aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, respectivamente.

Una región "heteróloga" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro o unido a otra molécula de ADN que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. De esta manera, cuando la región heteróloga codifica un gen bacteriano, el gen estará usualmente flanqueado por ADN que no flanquea el gen bacteriano en el genoma de la bacteria fuente. Otro ejemplo de la secuencia heteróloga de codificación es una construcción donde la secuencia de codificación en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienes codones diferentes del gen nativo gene). La variación de alelos o eventos de mutación naturalmente producidos no dan lugar a una región heteróloga de ADN, como se emplea aquí.

Un "vector" es un replicón, tales como un plásmido, fago, o cósmido, al cual otro segmento de ADN puede ser unido de forma tal de causar la replicación del segmento unido. Un vector es capaz de transferir secuencias de genes a células objetivo (por ejemplo, vectores plásmido bacterianos, vectores virales, vectores no virales, transportadores particulados, y liposomas).

Típicamente, los términos "vector de construcción", "vector de expresión", "vector de expresión del gen", "vector de entrega del gen", "vector de transferencia del gen", y "cassette de expresión" todo esto se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. De esta manera, los términos incluyen vehículos de clonado y de expresión, así como vectores virales.

Estos conjuntos incluyen un promotor que está operativamente unido a una secuencia o gen(es) de interés. Otros elementos de control pueden asimismo estar presentes. Los cassettes de expresión aquí descritos pueden estar contenidos dentro de una construcción de plásmido. Además de los componentes del cassette de expresión, la construcción de plásmido puede también incluir un origen bacteriano de replicacion, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite que la construcción de plásmido exista como un ADN de cadena única (por ejemplo, un M13 origen de replicacion), un sitio de clonado múltiple, y un origen "mamífero" de replicacion (por ejemplo, un SV40 o adenovirus origen de replicacion).

Los "elementos de control" de ADN se refieren colectivamente a promotores de transcripción, elementos mejoradores de la transcripción, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de poliadenilación (ubicadas 3' del codón de terminación de la traducción), secuencias para la optimización de la iniciación de la traducción (ubicadas 5' de la secuencia de codificación), secuencias de terminación de la traducción, dominios reguladores anteriores, sitios de unión de ribosomas y similares, los cuales colectivamente prevén la transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula huésped. Ver por ejemplo, McCaughan et al. (1995) PNAS USA 92:5431-5435; Kochetov et al (1998) FEBS Letts. 440:351-355. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes en un vector recombinante en tanto que el gen deseado es capaz de ser transcrito y traducido. "Operativamente unido" se refiere a una disposición de elementos en la cual los componentes así descritos están configurados de forma tal de realizar su función habitual. De esta manera, los elementos de control operativamente unidos a una secuencia de codificación son capaces de realizar la expresión de la secuencia de codificación. Los elementos de control no necesitan estar contiguos a la secuencia de codificación, en tanto que funcionan para dirigir la expresión del mismo. De esta manera, por ejemplo, secuencias intervinientes no traducidas aunque si transcritas pueden estar presentes entre un promotor y la secuencia de codificación y el promotor puede todavía considerarse "operativamente unido" a la secuencia de codificación. De forma similar, "elementos de control compatibles con la expresión en un sujeto" son aquellos que son capaces de realizar la expresión de la secuencia de codificación en ese sujeto.

Un elemento de control, tal como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia de codificación en una célula cuando la ARN polimerasa se unirá al promotor y transcribirá la secuencia de codificación en mARN, el cual es luego traducido en el polipéptido codificado por la secuencia de codificación.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o que es capaz de transformación, mediante una molécula exógena de ácido nucléico.

Una célula ha sido "transformada" mediante ADN exógeno cuando dicho ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana de la célula. El ADN exógeno puede o no estar integrado (unido de forma covalente) dentro del ADN cromosómico formando parte del genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno puede ser mantenido sobre un elemento episomal, tales como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula establemente transformada es una en la cual el ADN exógeno se ha integrado dentro del cromosoma de forma tal de que es heredado por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la habilidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares o clones comprendidos por una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

Como se emplea aquí, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un sujeto, que incluyen pero no están limitadas a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de la piel, secreciones externas de la piel, y de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras constituyentes de cultivos celulares in vitro que incluyen pero no están limitadas a medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes, y componentes de la célula.

Como se emplea aquí, los términos "etiqueta" y "etiqueta detectable" se refieren a una molécula capaz de detección, que incluyen, pero no están limitadas a, isótopos radioactivos, fluorescentes, quimiluminiscentes, enzimas, substratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y similares. El término "fluorescente" se refiere a una substancia o a una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en el rango detectable. Ejemplos particulares de etiquetas que pueden ser utilizadas incluyen fluoresceina, rodamina, dansil, umbelliferona, rojo Texas, luminol, NADPH y \alpha-\beta-galactosidasa.

2. Formas de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no está limitada a formulaciones particulares o parámetros de procesos ya que los mismos, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología aquí empleada es sólo con el propósito de describir realizaciones particulares de la invención, y que no indica que sea limitante.

A pesar de que un número de procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden ser utilizados en la práctica de la presente invención, los materiales y procedimientos preferidos son descritos aquí.

Descripción General

Hemos descubierto que la Proteína GapC es capaz de producir una respuesta inmune en un sujeto vertebrado. Los experimentos realizados al respecto han demostrado que la inmunización de ganado lechero con la Proteína GapC de S. dysgalactiae confiere protección contra la infección experimental con este organismo, y por otra parte, confiere protección cruzada contra la infección por S. uberis.

GapC es producida por un número de diferentes especies de estreptococos. Con la excepción de varias regiones variables localizadas, la secuencia de aminoácidos de las Proteínas GapC producidas por aquellas cepas está altamente conservada. Por lo tanto, es deseable la construcción de Proteínas GapC de fusión de epítope múltiple que comprende determinantes antigénicos tomados de ambas regiones altamente conservadas de GapC, y las únicas regiones de Proteínas GapC de varias especies estreptocócicas. Los experimentos realizados al respecto han demostrado que dicha proteína es capaz de producir una inmunidad amplia contra una variedad de infecciones estreptocócicas a la vez que proveen la ventaja económica adicional de minimizar el número de antígenos presentes en la formulación final, y de forma concomitante reducir el coste de producción de dicha formulación.

Describimos proteínas GapC de fusión de epítope múltiple las cuales tienen una formula estructural general
(A)_{x}- -(B)_{y}- -(C)_{z} representando una secuencia linear de aminoácidos. B es una secuencia de aminoácidos de al menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos de un determinante antigénico a partir de una Proteína GapC, y y es un entero de 2 o más. A y C son cada uno diferente de B, siendo también diferentes uno del otro, y son independientemente una secuencia de aminoácido de un determinante antigénico que contiene al menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos no inmediatamente adyacentes a B en la naturaleza. x y z son cada uno independientemente un entero de 0 o más, en donde al menos un de x y z es 1 o más.

Típicamente, A, B, y C son determinantes antigénicos de las Proteínas GapC de una o más especies bacterianas. En una realización preferida, A, B, y C son secuencias de aminoácidos que comprenden uno o más determinantes antigénicos de la Proteína GapC de una o más de las siguientes especies de estreptococos: S. dysgalaetiae; S. agalactiae; S. uberis; S. parauberis, y S. iniae.

A este respecto, las figuras 9 a la 13 muestran bloques de lo siguiente para las proteínas GapC estreptocócicas empleadas: hidropatía Kyte-Doolittle, promediadas sobre una ventana de 7; probabilidad de superficie según Emini; flexibilidad de cadena según Karplus-Schulz; índice de antigenicidad según Jameson-Wolf; estructura secundaria según Gamier-Osguthorpe-Robson; estructura secundaria según Chou-Fasman; y sitios predichos de glicosilación. Las figuras 15 a 19 muestran bloques de estructura secundaria según Chou-Fasman para las proteínas antes mencionadas. Un entendido en la técnica puede usar fácilmente la información presentada en las figuras 9 a 13 y 15 a 19 en vista de las enseñanzas de la presente especificación para identificar regiones antigénicas que pueden ser empleadas en la construcción de una proteína quimérica.

Más preferentemente, A, B, y/o C incluyen una o más regiones variables de las proteínas GapC de más de una especies de estreptococos. A este respecto, las figuras 8A-8C muestran una alineación de secuencia de aminoácidos la cual ilustra regiones de homología y variabilidad que existen entre las proteínas GapC de S dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis, y S. iniae. La secuencia de aminoácidos para las proteínas GapC de S. pyogenes y S. equisimilis, S. pyogenes también son incluidas. En particular, varias regiones variables están ubicadas en las posiciones aminoácido 62 a 81; 102 a 112; 165 a 172; 248 a 271; y 286 a 305.

La proteína de fusión de epítope múltiple puede también incluir secuencias espaciadoras interpuestas entre A, B, y/o C. Las secuencias espaciadoras son típicamente secuencias de aminoácidos de 1 a 1.000 aminoácidos, pueden ser la misma o diferente de A, B, o C, y pueden ser la misma o diferente entre sí.

La proteína puede también incluir una secuencia de señal y/o una secuencia transmembrana. Ejemplos de secuencia de señales adecuadas incluyen la secuencia de señal E. coli LipoF, y la secuencia de señal OmpF. Ejemplos de secuencias transmembrana adecuadas incluyen aquellas asociadas con LipoF y OmpF.

Describimos en detalle la proteína de fusión Gap4 de epítope múltiple. La secuencia de aminoácidos de Gap4 (SEQ ID NO: 22), una proteína GapC de fusión de epítope múltiple, se muestra en Las figuras 6A-6C, tal como la polisecuencia de nucleótidos que la codifica (SEQ ID NO: 21). La Gap4 es una proteína quimérica 47.905 kDa de 448 aminoácidos. Los residuos 1 a 27 son idénticos a los residuos aminoácidos 1 a 27 de la secuencia de señal E. coli LipoF. Los residuos 28 a 123 son idénticos a los residuos 1 a 96 de la Proteína GapC de S. dysgalactiae. Los residuos 124 (leucina) y 125 (ácido glutámico) son aminoácidos espaciadores. Los mismos están seguidos por residuos 126 a 165, los cuales son idénticos a los residuos 56 a 95 de S. parauberis así como a los mismos residuos de S. uberts. El residuo 166 (isoleucina) es un aminoácido espaciador. Los residuos 167 a 208 son idénticos a los residuos 55 a 96 de la proteína GapC de S. agalactiae. Los residuos 209 (treonina) y 210 (serina) son aminoácidos espaciadores. Los residuos 211 a 448 son idénticos a los 99 a 336 de la proteína GapC de S. dysgalactiae.

Como se ha expresado, la Gap4 tiene un residuo cisteína presente en el extremo amino terminal de la proteína madura. La secuencia de señal LipoF y el residuo cisteína están presentes para asegurar que la molécula quimérica es eficientemente secretada desde la célula bacteriana huésped y que se une a la célula huésped membrana a través de la mitad lipídica. La proteína puede entonces ser extraída a partir de la superficie de la célula a través de solubilización diferencial con un detergente tales como Sarkosyl o TritonX-100® (ver Ejemplo 5 infra).

Las proteínas GapC quiméricas o fragmentos antigénicos de la misma puede proporcionarse en composición de subunidad de las vacunas. Además del uso en la composición de las vacunas, las proteínas o anticuerpos pueden además ser utilizados como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia de la infección en un sujeto vertebrado. De forma similar, los genes que codifican las proteínas pueden ser clonados y utilizados para diseñar sondas para detectar y aislar genes homólogos en otras cadenas bacterianas. Por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos, más preferentemente al menos aproximadamente 20-50 nucleótidos, y más preferentemente aproximadamente 60-100 nucleótidos, o cualquier entero entre estos valores, encontrará un uso en estas realizaciones.

La composición de las vacunas puede ser usada para tratar o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas en sujetos vertebrados. Por ejemplo, la composición de las vacunas que incluyen proteínas de fusión GapC de epítope múltiple que comprende determinantes antigénicas de S. dysgalactiae. S. uberis, S. parauberis, S. iniae, y/o estreptococo grupo B (GBS) tales como S. agalactiae, pueden ser usadas para tratar infecciones estreptocócicas en sujetos vertebrados que son causadas por estas u otras especies. En particular, S. uberis y S. agalactiae son patógenos bacterianos comunes asociados con la mastitis en especies bovinas, equinas, ovinas y caprinas. Adicionalmente, el estreptococo grupo B, tales como S. agalactiae, son conocidos por causar otras numerosas infecciones en vertebrados, que incluyen septicemia, meningitis, bacteremia, impétigo, artritis, infecciones de tracto urinario, abscesos, abortos espontáneos, etc. Por lo tanto, la composición de la vacuna que contiene Proteínas quimérica GapC encontrará uso en el tratamiento y/o la prevención de una amplia variedad de infecciones estreptocócicas.

De forma similar, las proteínas de fusión GapC epítope múltiple que comprenden determinantes antigénico derivados a partir de otros géneros bacterianos tales como Staphylococcus, Mycobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Pasteurella, Clostridium y Mycoplasma encontrarán uso para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por especies pertenecientes a aquellos géneros. De esta manera, es fácilmente evidente que las Proteínas GapC quiméricas pueden ser usadas para tratar y/o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas en numerosas especies.

Las proteínas de fusión GapC de epítope múltiple pueden ser usadas en la composición de la vacunas ya sea solas o en combinación con otros antígenos bacterianos, fúngicos, virales o protozoarios. Estos otros antígenos pueden ser provistos separadamente o también como proteínas de fusión que comprenden la proteína GapC quimérica fusionada a uno o más de estos antígenos. Por ejemplo, otras proteínas inmunogénicas de S. uberis, tales como el factor CAMP, cápsula de ácido hialurónico, hialuronidasa, proteína a modo de R y activador plasminogen, pueden ser administrados con la Proteína quimérica GapC. Adicionalmente, las proteínas inmunogénicas de otros organismos implicadas en la mastitis, tales como del género Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Nocardia, Clostridium, Mycobacteriurn, Mycoplasma, Pasteurella, Prototheca, otros estreptococos, bacterias coliformes, así como levaduras, pueden ser administradas junto con las proteínas GapC de fusión aquí descritas para proporcionar un amplio espectro de protección. De esta manera, por ejemplo, las proteínas inmunogénicas a partir de Staphylococcus aureus, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. zooepidemicus, Corynebacterium pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes y Klebsiella spp. Pueden proporcionarse junto con las proteínas GapC de unión plasmina.

Producción de Proteínas de fusión GapC de Epitope múltiple

Las proteínas quiméricas descritas con anterioridad y los fragmentos activos y análogos derivados de las mismas, pueden ser producidas mediante procedimientos recombinantes como aquí se describe. Estos productos recombinantes pueden tomar la forma de secuencias parciales de proteína, secuencias de longitud completa, formas precursoras que incluyen secuencias de señales, o formas maduras sin señales.

Las secuencias de ADN de proteína GapC de unión plasmina usadas para la construcción de las proteínas quiméricas pueden ser aisladas mediante una variedad de procedimientos conocidos por aquellos entendidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Procedimientos para aislar, clonar y secuenciar las secuencias de genes que codifican Proteínas GapC de S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis, y S. iniae son detalladas en los Ejemplos 1, 2 y 3, infra.

Después de aislar y clonar las secuencias de proteína GapC, las secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas son construidas usando técnicas recombinantes estándar que incluyen amplificación PCR, restriccion de endonucleasa digestión y ligación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra. Procedimientos para construir Gap4 son detallados en el Ejemplo 4, infra.

Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican las proteínas de interés pueden ser preparadas de forma sintética en vez de ser clonadas. Las secuencias de ADN pueden ser designadas con los codones apropiados para la secuencia particular de aminoácido. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el indicado huésped si la secuencia se utilizará para expresión. La secuencia completa se monta a partir de oligonucleótidos que se solapan preparados mediante procedimientos estándar y se montan dentro de una secuencia completa de codificación. Ver, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Una vez que la secuencia de codificaciones para las proteínas deseadas ha sido preparada, estas pueden ser clonadas dentro de cualquier vector o replicón adecuado. Numerosos vectores clonares son conocidos para aquellos entendidos en la técnica, y la selección de un vector clonar apropiado es un problema de elección. Ejemplos de vectores de ADN recombinante para clonar y células huéspedes a las cuales pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E. coil), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coil), pKT230 (bacteria gram-negativa), pGV1106 (bacteria gram-negativa), pLAFR1 (bacteria gram-negativa), pME290 (no-(E. coli bacteria gram-negativa), pHV14 ((E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamíferos). Ver, Sambrook et al, supra; ADN Clonar, supra; B. Perbal, supra.

El gen puede ser ubicado bajo el control de un promotor, sitio de unión de ribosomas (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (colectivamente referido aquí como elementos de "control"), de forma tal que la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada se transcribe dentro del ARN en la célula huésped transformada mediante un vector que contiene esta expresión de construcción. La secuencia de codificación puede o no contener un péptido señal o secuencia líder. Si se incluye una secuencia de señal, la misma puede ser la secuencia nativa, homologa, o una secuencia heteróloga. Por ejemplo, la secuencia de señal LipoF se añade a la región amino-terminal de la proteína Gap4 quimérica para permitir secreción de la proteína después de la expresión. Ver Ejemplos 4E y 5, infra. Las secuencias líderes pueden ser extraídas por el huésped en un procedimiento post-traducción. Ver, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

Otras secuencias regulatorias que permiten la regulación de expresión de las secuencias de proteína en relación con el crecimiento de la célula huésped también pueden ser deseables. Las secuencias reguladoras son conocidas para aquellos entendidos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellos que provocan que la expresión de un gen sea encendida o apagada en respuesta a estímulos químicos o físicos, que incluyen la presencia de un compuesto regulador. Otros tipos de elementos reguladores también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias mejoradoras.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ser ligada a la secuencia de codificación antes de la inserción dentro de un vector, tales como los vectores clonales descritos con anterioridad. Alternativamente, la secuencia de codificación puede ser clonada directamente dentro de un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de codificación de forma tal que la misma puede ser unida a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura adecuado. También puede ser deseable producir mutantes o análogos de la proteína GapC de unión plasmina. Los mutantes o análogos pueden ser preparados mediante la detección de una porción de la secuencia que codifica la proteína, mediante la inserción de una secuencia, y/o mediante substitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar secuencia de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio, son descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra; ADN clonar, supra; Ácido nucléico Hybridization, supra.

El vector de expresión se utiliza entonces para transformar una célula huésped apropiada. Un numero de las líneas celulares de mamífero son conocidas en la técnica e incluyen líneas de célula inmortalizadas disponibles a partir del American Type Culture Collection (ATCC), tales como, pero no están limitadas a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células Madin-Darby de riñón bovino ("MDBK"), así como otras. De forma similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., encontrarán uso con las construcciones de la presente expresión. Las levaduras huéspedes útiles incluyen inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polyrnorpha, Kluyveromyces friagilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para utilizar vectores de expresión con baculovirus incluyen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionados, las proteínas pueden ser producidas mediante el cultivo de la célula huésped transformada mediante un vector de expresión descrito con anterioridad bajo condiciones en donde la proteína de interés se expresa. La proteína se aísla entonces a partir de la célula huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína dentro del medio de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente a partir del medio. Si la proteína no es secretada, ésta es aislada a partir de lisados de células. La selección de las condiciones apropiadas de crecimiento y los procedimientos de recuperación se encuentran dentro de las habilidades de la técnica.

La proteína también puede ser producida mediante síntesis química tales como síntesis de péptido de fase sólida, utilizando secuencias de aminoácidos conocidas o secuencias de aminoácidos derivadas a partir de la secuencia de ADN de los genes de interés. Dichos procedimientos son conocidos por aquellos entendidos en la técnica. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254, para técnicas de síntesis de péptido de fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntesis clasica de solución. La síntesis química de péptidos puede ser preferible si un pequeño fragmento del antígeno en cuestión es capaz de producir una respuesta inmunológica en el sujeto de interés.

Las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina, o sus fragmentos, pueden ser usados para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) se inmuniza con un antígeno, o su fragmento, o con un antígeno mutado. Se recoge suero del animal inmunizado y se trata según procedimientos conocidos. Ver, por ejemplo, Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 348:363-370. Si se emplea el suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden ser purificados mediante cromatografía por inmunoafinidad, utilizando procedimientos conocidos.

Los anticuerpos monoclonales de las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina y los fragmentos de la misma, también puede ser fácilmente producida por un entendido en la técnica. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales mediante el empleo de tecnología de hibridoma es bien conocida. Las líneas de células inmortales productoras de anticuerpos pueden ser creadas mediante fusión de células, y también mediante otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B mediante ADN oncogénico, o transfección con virus Epstein-Barr. Ver, por ejemplo, M. Schreier et al., Hybridoma Técnicas (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); ver también Patentes U.S. Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500. 4.491.632; y 4.493.890. Paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina, o fragmentos de las mismas, puede ser revisados por varias propiedades; es decir, por isotipo, epitope, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son útiles en la purificación, utilizando técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales contra los cuales están dirigidos. Tanto los anticuerpos monoclonales como los policlonales también pueden ser utilizados para la inmunización pasiva o pueden ser combinados con preparaciones de subunidad vacuna para mejorar la respuesta inmune. Los anticuerpos policlonales y monoclonales también son útiles para propósitos de diagnóstico.

Formulaciones y Administración de Vacunas

Las proteínas de fusión de GapC epítope múltiple pueden ser formuladas en la composición de las vacunas, ya sea solas o en combinación con otros antígenos, para su uso en la inmunización de sujetos como se describe a continuación. Los procedimientos de preparación de tales formulaciones se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990. Típicamente, las vacunas son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos previamente a la inyección también pueden ser preparadas. La preparación también puede ser emulsificada o el ingrediente activo encapsulado en vehículos lisosoma. El ingrediente inmunogénico activo generalmente se mezcla con un vehículo farmacéutico compatible, tal como, por ejemplo, agua, salino, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. En adición, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes y agentes tamponadores del pH.

Los adyuvantes que mejoran la efectividad de la vacuna también pueden añadirse a la formulación. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos muramil, avridina, hidróxido de aluminio, dimetildioctadecil bromuro de amonio (DDA), aceites, emulsiones aceite-en-agua, saponinas, citoquinas, y otras substancias conocidas en la técnica.

La proteína quimérica GapC de unión plasmina puede ser vinculada a un transportador para incrementar la inmunogenicidad de la misma. Los transportadores adecuados incluyen macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, que incluyen albúminas de suero, hemocianina de lapa de cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, y otras proteínas bien conocidas para aquellos entendidos en la técnica; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, cuentas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares; copolímeros aminoácidos; y partículas inactivas de virus.

Las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina pueden ser utilizadas en su forma nativa o el contenido de su grupo funcional puede ser modificado mediante, por ejemplo, succinilación de los residuos lisina o reacción con cis-tiolactona. Un grupo sulfidril también puede ser incorporado dentro del transportador (o antígeno) mediante, por ejemplo, reacción de funciones amino con 2-iminotiolano o el éster N-hidroxisuccinimida de 3-(4-ditiopiridil propionato. Los transportadores adecuados también pueden ser modificados para incorporar brazos espaciadores (tales como hexametileno diamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para la unión de péptidos.

Otros transportadores adecuados para las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina incluyen polipéptidos VP6 de rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, como se describe en la Patente U.S. No. 5.071.651. También es útil un producto de fusión de una proteína viral y las proteínas quiméricas del sujeto realizado mediante procedimientos descritos en la Patente U.S. No. 4.722.840. Más aún otros transportadores adecuados incluyen células, tales como linfocitos, debido a que la presentación en esta forma imita el modo natural de presentación en el sujeto, lo que da lugar al estado inmunizado. Alternativamente, las proteínas pueden ser acopladas a eritrocitos, preferentemente los propios eritrocitos del sujeto. Los procedimientos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células son conocidos para aquellos con conocimientos en la técnica.

Por otra parte, las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina (o complejos de las mismas) pueden ser formuladas dentro de una composición de la vacuna tanto en forma neutral como de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y los cuales están formados con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos hidroclórico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también ser derivadas a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.

Las formulaciones de vacuna contendrán una "cantidad terapéuticamente efectiva" del ingrediente activo, es decir, una cantidad capaz de producir una respuesta inmune en un sujeto al cual se administra la composición. En el tratamiento y la prevención de la mastitis, por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" sería preferentemente una cantidad que mejore la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección y/o reduzca la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección será demostrada tanto mediante una reducción o carencia de los síntomas normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una cuenta disminuida de células somáticas en la leche de un cuarto infectado. Por ejemplo, la habilidad de la composición para retener o llevar la cuenta de células somáticas (SCC) en la leche por debajo de aproximadamente 500.000 células por ml, el valor umbral indicado por la International Dairy Federation, por sobre el cual, se considera que los animales tienen mastitis clínica, será indicativa de un efecto terapéutico.

La cantidad exacta es fácilmente determinada por un entendido en la técnica utilizando pruebas estándar. La concentración de proteína quimérica GapC de unión plasmina típicamente oscilará desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95% (w/w) de la composición, o aún más alto o más bajo si fuera apropiado. Con las presentes formulaciones de la vacuna, 5 a 500 \mug de activo ingrediente por ml de solución inyectada deberían ser adecuados para dar lugar a una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de 1 a 3 ml por animal.

Para inmunizar un sujeto, la vacuna es generalmente administrada de forma parenteral, usualmente mediante inyección intramuscular. Otros modos de administración, sin embargo, tales como inyecciones subcutáneas, intraperitoneales e intravenosas, también son aceptables. La cantidad a administrar depende del animal a tratar, de la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección deseado. Las dosis efectivas pueden ser fácilmente establecidas mediante una persona de conocimiento ordinario en la técnica a través de ensayos de rutina que establezcan curvas de respuesta a las dosis. El sujeto se inmuniza mediante la administración de la vacuna en al menos una dosis, y preferentemente en dos dosis. Por otra parte, al animal pueden ser administradas tantas dosis como se requiera para mantener el estado de inmunidad a la infección.

Formulaciones adicionales de vacuna que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, aerosol, intranasal, formulaciones orales, y formulaciones de liberación sostenida. Para los supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes y transportadores tradicionales, tales como, glicoles polialcalinos, o triglicéridos. Dichos supositorios puede ser formados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el rango de aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 10% (w/w), preferentemente aproximadamente 1% hasta aproximadamente 2%. Los vehículos orales incluyen aquellos excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, sodio sacarina celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Esta composición oral de las vacunas puede ser tomada en la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 95% del ingrediente activo, preferentemente aproximadamente 25% hasta aproximadamente 70%.

Las formulaciones intranasales usualmente incluirán vehículos que ni causen irritación a la mucosa nasal ni disturben significativamente la función ciliar. Diluentes tales como agua, salino acuoso u otras substancias conocidas pueden ser empleadas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero no están limitadas a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Un surfactante puede estar presente para mejorar la absorción de las proteínas a través de la mucosa nasal del sujeto.

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida se realizan mediante la incorporación de la proteína dentro de transportadores o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no reabsorbibles tales como copolímeros etilenevinil acetato y copolímeros Hytrel®, polímeros hinchables tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tales como colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres tales como aquellos para realizar suturas reabsorbibles. Las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina también se suministran utilizando mini-bombas implantadas, bien conocidas en la técnica.

Las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina también pueden ser administradas a través de un virus transportador que expresa el mismo. El virus transportador que encontrará uso incluye, pero no está limitado, a la vaccinia y otros virus de la viruela, adenovirus, y el virus del herpes. A modo de ejemplo, los virus de vaccinia recombinantes que expresan las proteínas noveles pueden ser construidos como sigue. El ADN que codifica la proteína particular primero se inserta dentro de un vector apropiado de forma tal que sea adyacente a un promotor vaccinia y al costado de la secuencia de ADN de la vaccinia, tales como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector se usa entonces para transfectar células las cuales son simultáneamente infectadas con vaccinia. La recombinación de homólogos sirve para insertar el promotor vaccinia además del gen que codifica la proteína instantánea dentro del genoma viral. El TK recombinante resultante puede ser seleccionado mediante el cultivo de las células en la presencia de 5-bromodeoxiuridina y seleccionando placas virales resistentes al mismo.

Una ruta alternativa de administración implica la terapia de genes o la inmunización del ácido nucleico. De esta manera, la secuencia de nucleótidos (y los elementos reguladores acompañantes) que codifican las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina del sujeto pueden ser administradas directamente a un sujeto para la traducción in vivo de las mismas. Alternativamente, la transferencia del gen puede ser lograda mediante la transfección de las células o tejidos ex vivo del sujeto y se reintroducen el material transformado dentro del huésped. El ADN puede ser directamente introducido dentro del organismo del huésped, es decir, mediante inyección (ver International Publication No. WO/90/11092; y Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468). La transferencia de genes mediada por liposomas también puede lograrse utilizando procedimientos conocidos. Ver, por ejemplo, Hazinski. et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209, Brigham et al. (1989) Am. J. Med Sci. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219A; y Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288. Los agentes de reconocimiento, tales como anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie expresados sobre tipos especifico de célula, puede ser covalentemente conjugados a la superficie del liposoma de forma tal que el ácido nucleico puede ser suministrado a tejidos y células específicos susceptibles a la infección.

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Ensayos Diagnósticos

Como se explicó con anterioridad, las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina también pueden ser utilizadas como diagnósticas para detectar la presencia de anticuerpos reactivos de estreptococos, por ejemplo S. dysgalactiae, en una muestra biológica para determinar la presencia de estreptococos infección. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos reactivos con proteínas quiméricas GapC de unión plasmina pueden ser detectados utilizando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnosis estándar, que incluyen inmunoensayos tales como competición, reacción directa, o ensayos de tipo sandwich. Tales ensayos incluyen, pero no están limitados a, Western blots; pruebas de aglutinación; inmunoensayos marcados por enzimas e inmunoensayos mediados, tales como ELISAs; ensayos de tipo biotina/avidina; radio inmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen etiquetas reveladoras tales como etiquetas fluorescentes, quimioluminescente, radioactiva, enzimática o moléculas de tinción, u otros procedimientos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o anticuerpos que reaccionaron con el mismo.

Los ensayos antes mencionados generalmente implican la separación de anticuerpos no unidos en una fase liquida de un soporte de fase sólida a los cuales están unidos los complejos antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que pueden ser usados incluyen substratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pozo microtítulo); polivinilclorida (por ejemplo, hojas o pozos microtítulo); látex poliestireno (por ejemplo, cuentas o placas microtítulo); polivinilidina fluoruro; papel diazotizado; membranas de nylon; cuentas activadas, cuentas que responden magnéticamente, y similares.

Típicamente, un soporte sólido se reacciona primero con un componente de fase sólida (por ejemplo, una o más proteínas quiméricas GapC de unión plasmina) bajo condiciones adecuadas uniéndose de forma tal que dicho componente es suficientemente inmovilizado al soporte. Algunas veces, la inmovilización del antígeno al soporte puede ser mejorado mediante primero el acoplamiento del antígeno a una proteína con mejores propiedades de unión. Las proteínas adecuadas de acoplamiento incluye, pero no están limitadas a, macromoléculas tales como suero albúminas que incluyen suero albúmina bovina (BSA), hemocianina de lapa de cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, y otras proteínas bien conocidas para aquellos entendidos en la técnica. Otras moléculas que pueden ser usadas para unir los antígenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicolico, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y similares. Dichas moléculas y procedimientos de acoplamiento de estas moléculas a los antígenos, son bien conocidas para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Ver, por ejemplo, Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63 y Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30:117-124.

Después de reaccionar el soporte sólido con el componente de fase sólida, cualquier componente no inmovilizado en fase sólida son extraídos del soporte mediante lavado, y el componente de unión al soporte es contactado luego con una muestra biológica sospechosa de contener mitades de ligando (por ejemplo, anticuerpos hacia los antígenos inmovilizados) bajo condiciones adecuadas de unión. Después del lavado para extraer cualquier ligando no unido, se añade una mitad secundaria bajo condiciones adecuadas de unión, en donde el aglutinante secundario es capaz de asociarse selectivamente con el ligando de unión. La presencia del aglutinante secundario puede ser detectada entonces usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Más en particular, puede ser usado un procedimiento ELISA, en el cual los pocillos de una placa de microtítulo son revestidos con una proteína quimérica GapC de unión plasmina. Una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene moléculas de inmunoglobulina anti-quimérica de proteína GapC de unión plasmina se añade entonces a los pocillos revestidos. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la unión del anticuerpo al antígeno inmovilizado, la placa(s) puede ser lavada para extraer las mitades no unidas y se añade una molécula secundaria de unión marcada detectable. La molécula secundaria de unión se deja reaccionar con cualquier muestra de anticuerpos capturada, la placa se lava y se detecta la presencia de la molécula secundaria de unión se detecta usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

De esta manera, en una realización particular, la presencia de antígeno ligando anti-quimérica GapC de unión plasmina unido a partir de una muestra biológica puede ser fácilmente detectada utilizando un aglutinante secundario que comprende un anticuerpo dirigido contra los ligandos del anticuerpo. Un numero de moléculas anti-bovino inmunoglobulina (Ig) son conocidas en la técnica las cuales pueden ser fácilmente conjugadas a una etiqueta enzima detectable, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o ureasa, utilizando procedimientos conocidos para aquellos entendidos en la técnica. Un substrato apropiado de enzima se emplea entonces para generar una señal detectable. En otras realizaciones relacionadas, puede ser practicadas técnicas de tipo competitivo ELISA utilizando procedimientos conocidos por aquellos entendidos en la técnica.

También pueden llevarse a cabo ensayos en solución, de forma tal que las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina y los anticuerpos específicos para aquellas proteínas forman complejos bajo condiciones de precipitación. En una realización particular, proteínas quiméricas GapC de unión plasmina puede ser unidas a partículas de fase sólida (por ejemplo, una cuenta de agarosa o similares) utilizando técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, tales como mediante acoplamiento químico directo o indirecto. La partícula revestida de antígeno se contacta entonces bajo condiciones adecuadas de unión con una muestra biológica que se sospecha que contiene anticuerpos para las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina. La reticulación entre anticuerpos unidos causa la formación de agregados de complejos partícula-antígeno-anticuerpo que pueden ser precipitados y separados a partir de la muestra utilizando lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción puede ser analizada para determinar la presencia o la ausencia de complejos anticuerpo-antígeno utilizando cualquiera de un número de procedimientos estándar, tales como aquellos procedimientos de inmunodiagnosis descrito con anterioridad.

En otra realización más, puede proporcionarse una matriz de inmunoafinidad, en la cual una población policlonal de anticuerpos a partir de una muestra biológica sospechosa de contener moléculas anti-quiméricas GapC de unión plasmina se inmoviliza en un substrato. En este aspecto, una purificación inicial de afinidad de la muestra puede ser llevada a cabo utilizando antígenos inmovilizados. La preparación de muestra resultante de esta manera no sólo contendrá mitades anti-estreptococos, evitando propiedades potenciales de unión no específicas en el soporte de afinidad. Un número de procedimientos de inmunoglobulinas inmovilizadas (ya sea intactos o en fragmentos específicos) de alto rendimiento y retención de actividad de unión antígeno son conocidos en la técnica. No estando limitado por ningún procedimiento particular, la inmovilización de la proteína A o proteína G puede ser usado para inmovilizar inmunoglobulinas.

Por consiguiente, una vez que las moléculas de inmunoglobulina han sido inmovilizadas para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, proteínas quiméricas GapC de unión plasmina marcadas son contactadas con los anticuerpos unidos bajo condiciones adecuadas de unión. Después de que cualquier antígeno no específicamente unido se ha lavado del soporte de inmunoafinidad, la presencia de antígeno unido puede ser determinado mediante el ensayo para la etiqueta utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

Adicionalmente, anticuerpos aumentados a las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina, más que las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina en sí, pueden ser usados en los ensayos descritos con anterioridad para detectar la presencia de anticuerpos a las proteínas en una muestra dada. Estos ensayos se realizan esencialmente como se describió con anterioridad y son bien conocidos para aquellos entendidos en la técnica.

Los ensayos reactivos descritos con anterioridad, que incluyen las proteínas quiméricas GapC de unión plasmina, o anticuerpos de las mismas, puede ser provistos en equipos, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, para realizar inmunoensayos como se describió con anterioridad. El equipo también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular utilizado, etiquetas adecuadas y otros reactivos y materiales embalados y (es decir tampones de lavado y similares). Los inmunoensayos estándar, tales como aquellos descritos con anterioridad, puede ser realizados utilizando estos equipos.

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Depósitos de Cepas

Un depósito de cultivos puros biológicamente puros de las siguientes cepas se realizó con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, bajo las previsiones del Budapest Treaty. El número de adhesión indicado se asignó después de una evaluación de viabilidad exitosa, y se pagaron las tarifas de requisito. Los depósitos designados serán mantenidos durante un período de treinta (30) años a partir de la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de la última petición para el depósito, el que sea más largo. Si un cultivo se torna no viable o es destruido de forma inadvertida, o, en el caso del plásmido que contiene cepas, pierde su plásmido, será reemplazado con un cultivo(s) viable de la misma descripción taxonómica.

Si existiera una discrepancia entre la secuencia presentada en la presente solicitud y la secuencia del gen de interés en el plásmido depositado debido a errores rutinarios de secuenciado, controla la secuencia en el plásmido depositado.

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A continuación hay ejemplos de realizaciones especificas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, and no pretenden limitar el ámbito de la presente invención en ninguna forma.

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C. Experimental

Ejemplo 1

Preparación de ADN Cromosómico

Un S. dysgalactiae clínico aislado a partir de un caso de mastitis bovina (ATCC Accession No. ATCC43078) fue obtenida de la American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209), y se utilizó como una fuente de ADN. El organismo fue cultivado rutinariamente sobre placas de sangre de oveja TSA (PML Microbiologicals, Mississauga, Ontario) a 37ºC durante 18 horas, o en caldo Todd-Hewitt (Oxoid Ltd., Hampshire, England) suplementado con 0,3% extracto de levadura (THB-YE) a 37ºC, 5% CO_{2}.

Se preparó ADN cromosómico a partir de S. dysgalactiae cultivado en 100 ml de THB-YE suplementado con 20 mM de glicina durante aproximadamente 6 horas, hasta que se alcanzó un A_{600} de 0,8 a 1,0. Las células fueron recogidas y re-suspendidas en 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 0,5% Tween-20® (Sigma, St. Louis, MO) y suplementado con RNase A (200 mg/ml), proteinasa K (20 mg/ml), lisozima (100 mg/ml) y mutanolisina (100 mg/ml). (todas las enzimas adquiridas en SIGMA, St. Louis, MO). A continuación de la lisis bacteriana durante 30 minutos a 37ºC con agitado vigoroso, se mezclaron guanidina hidrocloruro y Twee-2®, pH 5,5, con el lisado para dar una concentración final de 0,8 M y 5%, respectivamente. Esta mezcla fue incubada a 50ºC durante 30 minutos. El ADN cromosómico se purificó entonces utilizando un Qiagen genómico-tip 100g (Qiagen, Santa Clarita, California) y se precipitó utilizando 0,7 volúmenes de isopropanol. El gránulo resultante se lavó en etanol 70% y se re-suspendió en 0,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,8.

El ADN cromosómico de S. agalactiae, S. uberis y, S. parauberis fue aislado esencialmente como se describió con anterioridad, a partir de cepas designadas ATCC 27541, 9927, y 13386, respectivamente. El ADN cromosómico de S. iniae también fue aislado como anteriormente a partir de una cepa designada 9117 obtenida del Mount Sinai Hospital, University of Toronto, Canadá.

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Ejemplo 2

Amplificación y Clonación de genes gapC a partir de S. dysgalactiae, S. uberis, S. parauberis, S. agalactiae y S. iniae

Las secuencias de polinucleótidos que codifican GapC de S. dysgalactiae, S. uberis, S. parauberis, S. agalactiae y S. iniae fueron inicialmente aisladas del ADN cromosómico mediante amplificación PCR. Los iniciadores usados para amplificar PCR los genes gapC de todas las especies fueron gapC1 (SEQ ID NO: 1) y gapC1r (SEQ ID NO: 2), mostrados en la Tabla 1. En la tabla, el subrayado indica nucleótidos añadidos a las secuencias originales (es decir, nucleótidos añadidos al extremo 5' de la secuencia original en el sentido del hilo y al extremo 3' de la secuencia original en el sentido contrario del hilo, respectivamente, de la región de codificación gapC que se amplifica), y las negritas indican la localización de sitios de restricción de reconocimiento de endonucleasa.

PCR se llevó a cabo utilizando Vent ADN polimerasa (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canada). Una mezcla de reacción que contiene 0,2 \mug de ADN genómico, 1pM de cada uno de los iniciadores precedentes, 100 pM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 10 mM Tris HCL, pH 9; 1,5 mM MgCl_{2}, 50 mM HCL, 1,5 unidades Taq ADN polimerasa (Pharmacia, Quebec, Canada) se incubó durante 40 ciclos de amplificación de 40 segundos a 94ºC, 40 segundos a 55ºC, y 1 minuto, 20 segundos a 72ºC, y luego durante un único ciclo de 10 minutos a
72ºC.

Los productos de reacción resultantes PCR se digirieron entonces en NdeI y BamHI. En el caso de producto S. dysgalactiae gapC, el fragmento fue clonado directamente dentro de los mismos sitios pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin) después que el plásmido fue digerido con las mismas enzimas. La construcción resultante fue denominada pET15bgapC. En el caso de secuencias S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae, cada una fue primero clonada en pPCR-Script utilizando el protocolo clonar descrito en el Equipo Clonar PCR-Script Amp (Stratagene, La Jolla, California), posteriormente recortado utilizando NdeI y BamHI, y finalmente re-clonado en los correspondientes sitios de pET15b utilizando protocolos conventionales de clonado (ver por ejemplo, Sambrook et al.,
supra).

Los plásmidos que contiene las secuencias S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae fueron designados pMF521c-inv, pMF521a-inv, pMF521d-inv, y pMF521e-inv, respectivamente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Números de Identificación de Secuencia y Correspondientes Nucleótidos y Secuencia de aminoácidos

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Ejemplo 3

Secuenciado de los genes gapC

Los genes aislados y clonados en los ejemplos precedentes fueron secuenciados utilizando terminadores tag de fluorescencia en un secuenciador automático ABI 373 ADN (Applied Biosystems, Emeryville, California) en el Plant Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá).

La secuencia de nucleótidos así determinada, y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida a partir de la misma, se muestran en las figuras 1 a la 5.

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Ejemplo 4

Construcción de un Gen Quimérico gapC

Un gen quimérico gapC compuesto de secuencias de S. dysgalactiae, S. parauberis, y S. agalactiae se construyó en un proceso de tres etapas utilizando pAA556, un plásmido estándar de expresión tac-inducible derivado del plásmido pGH432 que contiene la secuencia de señal del gen E. Coli ompF.

Las secuencias parciales del gen gapC utilizado para la construcción del gen quimérico fueron preparados mediante amplificación PCR de secuencias seleccionadas de polinucleótidos de los genes gapC genómicos aislados con anterioridad, utilizando los iniciadores de Gap-1 a Gap-8. Las secuencias del iniciador son descritas en la Tabla 1.

Después del montaje, el gen quimérico, sans la ompF secuencia de señal, fue entonces recortado de pAA556 e insertado en el plásmido pAA555, un derivado pGH432 que es un plásmido de expresión estándar tac-inducible que contiene la secuencia de señal del gen de E. coli ompF.

A. Construcción de pPolyGap.1

En la primera etapa, las primeras 288 bases del gen S. dysgalactiae gapC fueron amplificadas PCR utilizando los iniciadores Gap-1 y Gap-2.

La PCR amplificación se llevó a cabo como sigue: 1,6 \mug de ADN patrón se combinó en una mezcla de reacción que contiene 20 pM de cada iniciador Gap-1 (SEQ ID NO: 1) y Gap-2 (SEQ ID NO: 2), 200 \mum de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 2,5 mM MgSO_{4}, PCR Tampón (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), y 1 unidad Taq ADN polimerasa (Pharmacia, Quebec, Canadá). La mezcla se amplificó durante 1 ciclo de 1 minuto a 95ºC, luego durante 29 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC, y 30 segundos a 72ºC, y finalmente durante 1 ciclo de 10 minutos a 4ºC.

El producto de amplificación fue entonces digerido con BamHI y NcoI e insertado en los mismos sitios de un vector pAA556. La construcción resultante de plásmido, designada pPolyGap.1, se ilustra en la figura 21.

B. Construcción de pPolyGap.2

Un producto PCR que representa las bases 170-285 del gen S. parauberis gapC se obtuvo entonces utilizando los iniciadores Gap-3 (SEQ ID NO: 5) y Gap-4 (SEQ ID NO: 6). Este producto codifica una secuencia de aminoácido idéntica a la correspondiente secuencia de aminoácido hallada en el gen S. uberis gapC. La amplificación PCR se llevó a cabo esencialmente con anteriormente, excepto que utilizando 2 \mug de patrón ADN.

El producto PCR S. parauberis y el plásmido pPolyGap1 fueron ambos digeridos con Xho1 y Nco1, y el producto PCR fue ligado en los correspondientes sitios en el vector. Esta construcción, llamada pPolyGap.2, es ilustrada en la figura 22.

C. Construcción de pPolyGap.3

Los nucleótidos 166-288 del gen S. agalactiae gapC fueron amplificados utilizando iniciadores PCR Gap-5 (SEQ ID NO: 7) y Gap-6 (SEQ ID NO: 8) como en el Ejemplo 4B anterior.

El producto PCR obtenido fue digerido con ClaI y NcoI, luego insertado en los mismos sitios de pPolyGap2 inmediatamente a continuación de la secuencia de S. parauberis. pPolyGap3 es diagramado en la figura 23.

D. Construcción de pPolyGap.4

La etapa final en la construcción del gen quimérico implicado en la inserción de la secuencia restante de S. dysgalactiae gapC (nucleótidos 295-1011) en marco e inmediatamente a continuación de la secuencia de S. agalactiae.

La secuencia de S. dysgalactiae fue primero amplificada PCR utilizando los iniciadores Gap-7 (SEQ ID NO: 9) y Gap-8 (SEQ ID NO: 10) como en el Ejemplo 4A anterior. El producto de amplificación fue entonces digerido con la enzima GamHi/NcoI, como el vector pPolyGap.3, y el fragmento fue entonces ligado en los correspondientes sitios del vector.

Esta etapa final resulta en el plásmido pPolyGap.4 que contiene la construcción completa del gen gapC quimérico que comprende una espina dorsal de S. dysgalactiae gapC con secuencias únicas de S. parauberis así como de S. agalactiae. Ver la Figura 24.

E. Clonación del Gen Quimérico gapC en pAA55: Construcción de PolyGap.4

El gen quimérico gapc construido en las etapas precedentes fue recortado de pAA556 mediante digestión con BamHI y NcoI e insertado en el plásmido pAA555 digerido con las mismas enzimas. pAA555 es idéntico a pAA556 excepto en que el plásmido anterior contiene la secuencia de señal LipoF, y proporciona la adición de una cisteína en el extremo amino terminal de la Proteína GapC madura. La cisteína N-terminal se añadió para asegurar la eficiente secreción de la proteína quimérica de la célula y unión a la membrana a través de la mitad lipídica. La secuencia de codificación de la construcción del plásmido PolyGap4 se muestra en la figura 25.

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Ejemplo 5

Expresión y Aislación de la Proteína Quimérica GapC

PolyGap4 se utiliza para transformar E. coli J5 en la presencia de polietilen glicol (Kurien and Scofield (1995) BioTeclaniques 18:1023-1026).

Las células transformadas que llevan pPolyGap4 se cultivan a una fase logarítmica en medio LB a 37ºC con agitado. Se induce entonces la expresión de la Proteína quimérica GapC mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM e incubando las células a 37ºC durante 4 horas adicionales.

La Proteína quimérica GapC es extraída entonces de la superficie celular mediante solubilización diferencial. Las células son recogidas mediante centrifugación y re-suspendidas en un volumen de tampón de resuspensión (solución 0,85% NaCl que contiene 0,6% sarkosyl) igual a 1/10th del volumen original de cultivo. La suspensión es incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos con suave agitado. Las células son recogidas mediante centrifugación y el sobrenadante que contiene la Proteína quimérica GapC se pasa a través de un filtro de membrana de 0,2 \mum. Alícuotas del sobrenadante estéril son analizadas mediante SDS-PAGE y Western blots utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-GapC.

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Ejemplo 6

Inmunización de Animales con la Proteína Quimérica GapC

Se formularon vacunas en una forma tal que las mismas contenían 100 \mug/ml de Proteína quimérica GapC purificada en el adyuvante de base aceite VSA3 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá). VSA3 es una combinación de Emulsigen Plus^{TM} (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) y dimetildioctadecil amonio bromuro (Kodak, Rochester, New York).

Son obtenidas vacas Holstein no lactantes con una historia de no infección por S. dysgalactiae. Dos semanas antes de la vacunación, todos los animales son tratados con 300 mg de Cephapirin por cuarto (Cepha-dry^{TM}, Ayerst Laboratories, Montreal, Canadá), para resolver cualquier infección de la ubre pre-existente antes de la etapa de vacunación.

Grupos de animales experimentales son inmunizados de forma subcutánea con dos dosis de vacuna que contiene la Proteína quimérica GapC o un placebo con un intervalo de tres semanas entre inmunizaciones. Diez días a dos semanas a continuación de la segunda inmunización, los animales son expuestos a 500-1.000 unidades formadoras de colonias de S. dysgalactiae suministradas en tres cuartos con una cánula de infusión de la ubre. El cuarto cuarto de cada animal sirve como un control no infectivo.

Todos los animales son examinados diariamente por signos clínicos de la enfermedad y en cada día se recogen muestras de todos los cuartos de la ubre. Las muestras son observadas por su consistencia y título de anticuerpos, cuentas de células somáticas, y se determina el número de bacterias.

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Ejemplo 7

Determinación de Anticuerpos Específicos para la Proteína Quimérica GapC

Los anticuerpos GapC-específicos en suero bovino son medidos utilizando un ensayo enzima-vinculado inmunoabsorbente (ELISA). Brevemente, placas microtítulo (NUNC, Naperville, Illinois) son revestidas mediante la adición de 0,1 microgramo por pocillo de proteína quimérica purificada en 50 mM de tampón carbonato de sodio, pH 9,6, incubado toda la noche a 4ºC. El liquido se extrae y los pocillos se bloquean con 3% albumina de suero bovino durante 1 hr a 37ºC. Se añaden diluciones seriales de suero bovino (desde 1:4 a 1:64.000) a los pocillos y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos son aspirados, lavados e incubados con 100 \mul de alcalina fosftasa-conjugada cabra anti-bovino IgG (Kirkgaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, Maryland) durante 1 hr a temperatura ambiente. Los pocillos son lavados de nuevo, y 100 \mul de p-nitrofenol fosfato (Sigma, St. Louis, Missouri) se añade como un substrato para detectar actividad de alcalina fosfatasa. La absorbancia a 405 nanómetros se registra a continuación de 1 hr de incubación con el substrato a temperatura ambiente.

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Ejemplo 8

Colonización Bacteriana

Las bacterias son enumeradas mediante la propagación de diluciones seriales (10^{0} a 10^{-6}) directamente sobre placas de agar y sangre de oveja TSA seguida por una incubación durante toda la noche a 37ºC, 5% CO_{2}. La colonización se define como >500 cfu/ml del organismo desafío recuperado.

Para confirmar que la bacteria recuperada de las secreciones de leche son S. dysgalactiae, se prueban colonias seleccionadas recuperadas de cada animal utilizando una prueba API strep-20 (bioMerieux SA, Hazelwood, Missouri) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta prueba identifica especies de Streptococcus según un perfil analítico compilado sobre las bases de la actividad enzimática y la fermentación de azúcar, utilizando tanto un índice de perfil analítico o software de identificación.

La relación entre el título anti-GapC y la colonización bacteriana también es determinada.

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Ejemplo 9

Determinación de respuesta inflamatoria

La respuesta inflamatoria se mide como una función de la cuenta de células somáticas de la glándula mamaria es decir, linfocitos, neutrófilos, y monocitos). Las cuentas de células somáticas son medidas utilizando técnicas estándar recomendadas por Agriculture and AgriFood Canadá (IDF50B (1985): Milk and Milk Products- -Methods of Sampling en a Coulter counter). Las muestras son leídas dentro de las 48 horas de recolección y fijación, en los días 1 hasta 7 después del desafío.

Los números de células somáticas presentes en la glándula son determinados en cada día post desafío.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5863543 A, Jiang [0011]: \bullet US 5721339 A, Boyle [0012]

\bullet US 5237050 A, Boyle [0013]: \bullet US 5328996 A, Boyle [0013]

\bullet US 5108894 A, Bjorck [0019]: \bullet WO 9818930 A [0021]

\bullet US 4708871 A [0061]: \bullet US 4431739 A [0114]

\bullet US 4425437 A [0114]: \bullet US 4338397 A [0114]

\bullet US 4341761 A [0122]: \bullet US 4399121 A [0122]

\bullet US 4427783 A [0122]: \bullet US 4444887 A [0122]

\bullet US 4452570 A [0122]: \bullet US 4466917 A [0122]

\bullet US 4472500 A [0122]: \bullet US 4491632 A [0122]

\bullet US 4493890 A [0122]: \bullet US 5071651 A [0127]

\bullet US 4722840 A [0127]: \bullet WO 9011092 A [0136]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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<110> University of Saskatchewan

\hskip1cm

Potter, Andrew A.

\hskip1cm

Perez-Casal, José

\hskip1cm

Fontaine, Michael

\vskip0.400000\baselineskip

<120> INMUNIZACIÓN OF DAIRY CATTLE WITH QUIMÉRICA PROTEÍNA GAPC AGAINST STREPTOCOCCUS INFECCIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<130> O8-891816WO

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente In Ver. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador gapC1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador gapC1r

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador gap-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap-8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus dysgalactiae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1011)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus dysgalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1011)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus agalactiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus uberis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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25

26

27

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<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus uberis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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28

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 1011

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<212> ADN

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<213> Streptococcus parauberis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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30

31

32

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<210> 18

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus parauberis

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<400> 18

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33

34

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<210> 19

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<211> 1011

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<212> ADN

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<213> Streptococcus iniae

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

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<400> 19

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35

36

37

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<210> 20

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus iniae

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<400> 20

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38

39

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<210> 21

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<211> 1347

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador Gap4 Proteína GapC quimérica

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(1347)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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40

41

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

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<211> 448

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

45

Claims

1. Polipéptido de fusión de epítope múltiple que comprende una secuencia de aminoácido o una secuencia con al menos 80% de identidad de secuencia del mismo, la secuencia de aminoácido que comprende la secuencia mostrada como Figura 6 (SEQ ID NO: 22) pero que carece de secuencia de señal E. coli LipoF descrita como residuos 1 a 27 de la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

2. Polipéptido de fusión de epítope múltiple que comprende una secuencia de aminoácido según la reivindicación 1 junto con una secuencia de señal.

3. Polipéptido de fusión de epítope múltiple según la reivindicación 2, en el cual la secuencia de señal comprende la secuencia de aminoácido descrita en las posiciones 1-27 de la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

4. Polipéptido de fusión de epítope múltiple según la reivindicación 2 o 3, en el cual el polipéptido de fusión de epítope múltiple comprende la secuencia de aminoácido descrita en la figura 6 (SEQ ID NO: 22).

5. Secuencia de polinucleótidos que codifican la secuencia del polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un complemento de las mismas.

6. Vector recombinante que comprende: (a) un polinucleótido según la reivindicación 5; y (b) al menos un elemento de control operativamente unido al polinucleótido, en donde la secuencia de codificación puede ser transcrita y traducida en una célula huésped.

7. Célula huésped que comprende un vector recombinante según la reivindicación 6.

8. Procedimiento para producir Polipéptido de fusión de epítope múltiple, el procedimiento que comprende cultivar una célula según la reivindicación 7 bajo condiciones para producir el polipéptido.

9. Composición de la vacuna que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Composición de la vacuna según la reivindicación 9, que comprende además un adyuvante.

11. Procedimiento de producción de la composición de la vacuna que comprende las etapas de: (a) proporcionar polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y (b) combinar el polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Anticuerpo dirigido contra el polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

14. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el cual el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

15. Equipo de prueba inmunodiagnóstica para detectar infección por Streptococcus, comprendiendo el equipo de prueba polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, e instrucciones para realizar la prueba inmunodiagnóstica.

16. Uso del polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de la composición de la vacuna útil para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto vertebrado.

17. Uso según la reivindicación 16, en el cual la infección bacteriana es una infección estreptocócica.

18. Uso según la reivindicación 17, en el cual la infección bacteriana causes mastitis.

19. Procedimiento de detección de anticuerpos de Streptococcus en una muestra biológica que comprende: (a) reaccionar la muestra biológica con el polipéptido de fusión de epítope múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de Streptococcus, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse a la secuencia para formar un complejo anticuerpo/antígeno; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo, y por lo tanto detectar la presencia o ausencia de los anticuerpos de Streptococcus en la muestra.