ES2284254T3

ES2284254T3 - Proteinas moraxella catharralis.

Info

Publication number: ES2284254T3
Application number: ES99921008T
Authority: ES
Inventors: Allan William Cripps; Jennelle Kyd
Original assignee: Cortecs OM Pty Ltd
Current assignee: Cortecs OM Pty Ltd
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: ATE355301T1; WO1999058563A2; GB9810084D0; NO20005670L; EP1849800A3; NO20005670D0; CY1107636T1; DK1077999T3; AU3838399A; EP1077999B1; US20040005328A1; NZ537460A; ZA200006489B; US7557185B2; DE69935323T2; DE69935323D1; NZ508004A; EP1077999A2; WO1999058563A3; KR20010071236A

Abstract

Una proteína que es un antígeno de B. catarrhalis y que tiene una masa molecular aparente de alrededor de 30 kDa, determinada mediante SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV.

Description

Proteínas Moraxella catarrhalis.

La presente invención se refiere a una proteína nueva de Branhamella catarrhalis, las secuencias de ADN que codifican tal proteína, así como su uso en el diagnóstico y como base para vacunas.

Branhamella catarrhalis (también conocida como Moraxella catarrhalis) es una bacteria aerobia gram negativa que provoca infecciones de las vías respiratorias en humanos. B. catarrhalis puede existir como parte de la microflora de las vías respiratorias humanas, especialmente en niños. La bacteria provoca infecciones de las vías respiratorias inferiores en adultos y otitis media en niños (Klein J. O., Clin. Infect. Dis., 19:823-833 (1994); Murphy, T.F., Microbial. Rev., 60:267-279 (1996); Nicotra et al., Arch. Intern. Med., 146:890-893). Aproximadamente el 30% de las exacerbaciones purulentas en adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica fueron por B. catarrhalis en un estudio (Verghese et al., Antimicrob. Agents Chemother., 34:1041-1044 (1990)). Los estudios que usan cultivos de líquido del oído medio revelan que del 15 al 20% de los episodios de otitis media están provocados por B. catarrhalis (Klein (1994), anteriormente mencionado).

Las infecciones provocadas por B. catarrhalis inducen una respuesta inmunitaria contra antígenos de la membrana externa de la bacteria (Chapman et al., J. Infect. Dis., 151:878-882 (1985); Faden et al., Infect. Immun., 60:3824-3829 (1992); Sethi et al., Infect. Immun., 63:1516-1520 (1995)). El anticuerpo contra B. catarrhalis está presente en las secreciones de las vías respiratorias superiores (Fadden (1992), anteriormente mencionado; Stenfors, L.E. y Raisanen, S., Acta Otolaryngol., 113:191-195 (1993)). La respuesta inmunitaria mucosa específica de cepa puede ser importante en la protección contra la otitis media provocada por B. catarrhalis (Faden (1992), anteriormente mencionado y Stenfors y Raisanen (1993), anteriormente mencionados).

Varias publicaciones de patentes han descrito proteínas aisladas de B. catarrhalis, y su uso potencial como antígenos. Los ejemplos incluyen los documentos WO90/12591, WO93/03761, WO95/09025, WO95/31215, WO96/12733 y WO97/41731.

Existe, sin embargo, una necesidad continua de proporcionar una variedad de antígenos de B. catarrhalis para proporcionar vacunas mejores y más eficaces. Se ha aislado una variedad de tales proteínas que se pueden usar para provocar respuestas inmunitarias, así como para darles uso como herramientas diagnósticas.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína que es un antígeno de B. catarrhalis y que tiene una masa molecular aparente de alrededor de 30 kDa, determinada mediante SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal:

NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV;

Como se discute aquí, las proteínas y polipéptidos de la invención son útiles como material antigénico. Tal material puede ser "antigénico" y/o "inmunógeno". En general, se considera que "antigénico" significa que la proteína o polipéptido es capaz de ser usado para generar anticuerpos, o realmente es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos en un sujeto. Se considera que "inmunógeno" significa que la proteína o polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto. Así, en este último caso, la proteína o polipéptido puede ser capaz no solamente de generar una respuesta de anticuerpos, sino además respuestas inmunitarias que no se basan en anticuerpos.

El experto apreciará que los homólogos o derivados de las proteínas o polipéptidos de la invención también hallarán uso en el contexto de la presente invención, es decir, como material antigénico/inmunógeno. Así, por ejemplo, la presente invención abarca las proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares. Además, puede ser posible sustituir un aminoácido con otro de "tipo" similar. Por ejemplo, sustituir un aminoácido hidrófobo por otro. Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y halla la alineación óptima insertando espacios en cualquier secuencia según sea apropiado. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (la identidad más la conservación del tipo de aminoácidos) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Así, es posible obtener una comparación en la que se hallan diversas regiones de similitud, y cada una tiene un índice diferente. Ambos tipos de análisis están contemplados en la presente invención.

En el caso de los homólogos y derivados, el grado de identidad con una proteína o polipéptido descrito aquí es menos importante que que el homólogo o derivado mantenga su antigenicidad o inmunogenicidad hacia Streptococcus pneumoniae. Sin embargo, de forma adecuada, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos un 60% de similitud (como se discutió anteriormente) con las proteínas o polipéptidos descritos aquí. Preferiblemente, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos un 70% de similitud, más preferiblemente al menos un 80% de similitud. Lo más preferiblemente, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos un 90% o incluso un 95% de similitud.

En una aproximación alternativa, los homólogos o derivados podrían ser proteínas de fusión, que incorporan restos que hacen más fácil la purificación, por ejemplo marcando de forma eficaz la proteína o polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar la "marca", o puede ser que la propia proteína de fusión mantenga una antigenicidad suficiente para que sea útil.

Se pueden usar técnicas de clonado de genes para proporcionar una proteína de la invención en forma sustancialmente pura. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en J. Sambrook et al Molecular Cloning 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Así, las secuencias N-terminales de las proteínas descritas aquí se pueden usar a su vez como base para sondas para aislar los genes que codifican las proteínas individuales. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste en una secuencia que es:

(i): una secuencia de ADN que codifica una proteína o polipéptido como se describe aquí o sus equivalentes de ARN;

(ii): una secuencia que es complementaria a cualquiera de las secuencias de (i);

(iii): una secuencia que tiene una identidad sustancial con cualquiera de las de (i) y (ii);

(iv): una secuencia que codifica un homólogo, derivado o fragmento de una proteína como se define aquí.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden incluir una diversidad de tales secuencias, y/o fragmentos. El experto apreciará que la presente invención puede incluir variantes nuevas de esas moléculas nuevas particulares de ácido nucleico que se ejemplifican aquí. La presente invención abarca tales variantes. Estas se pueden dar en la naturaleza, por ejemplo debido a la variación de cepas. Por ejemplo, están incluidas las adiciones, sustituciones y/o deleciones. Además, y en particular cuando se utilizan sistemas de expresión microbianos, se puede desear modificar la secuencia del ácido nucleico haciendo uso de la utilización de códones preferidos conocidos en el organismo particular que se usa para la expresión. Así, las variantes sintéticas o que no se dan de forma natural también están incluidas dentro del alcance de la invención.

La expresión "equivalente de ARN", usada anteriormente, indica que una molécula de ARN dada tiene una secuencia que es complementaria a la de una molécula de ADN dada (teniendo en cuenta el hecho de que en el ARN "U" sustituye a "T" en el código genético).

Al comparar secuencias de ácido nucleico con el fin de determinar el grado de homología o identidad, se pueden usar programas tales como BESTFIT y GAP (ambos del paquete informático del Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)). BESTFIT, por ejemplo, compara dos secuencias y produce una alineación óptima de los segmentos más similares. GAP permite alinear las secuencias a lo largo de toda su longitud y halla la alineación óptima insertando espacios en cada secuencia según sea apropiado. De forma adecuada, en el contexto de la presente invención, al discutir la identidad de las secuencias de los ácidos nucleicos, la comparación se hace mediante la alineación de las secuencias a lo largo de toda su longitud.

Preferiblemente, las secuencias que tienen una identidad sustancial tienen al menos un 50% de identidad de secuencia, de forma deseable al menos un 75% de identidad de secuencia y de forma más deseable al menos un 90 o al menos un 95% de identidad de secuencia con dichas secuencias. En algunos casos, la identidad de secuencia puede ser del 99% o superior.

De forma deseable, la expresión "identidad sustancial" indica que dicha secuencia tiene un grado de identidad mayor con cualquiera de las secuencias descritas aquí que con las secuencias de ácidos nucleicos de la técnica anterior.

Sin embargo, se debería notar que cuando una secuencia de ácido nucleico de la presente invención codifica al menos parte de un producto génico nuevo, la presente invención incluye dentro de su alcance todas las secuencias posibles que codifican el producto génico o una parte nueva suya.

La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada o recombinante. Se puede incorporar en un vector, y el vector se puede incorporar en un hospedador. Tales vectores y hospedadores adecuados forman aspectos adicionales de la presente invención.

Por lo tanto, por ejemplo, mediante el uso de sondas diseñadas basándose en las secuencias de aminoácidos N-terminales descritas aquí, se pueden identificar genes en B. catarrhalis. Se pueden escindir después mediante el uso de enzimas de restricción y clonar en un vector. El vector se puede introducir en un hospedador adecuado para la expresión.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden obtener de B. catarrhalis mediante el uso de sondas apropiadas complementarias con partes de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico. Se pueden usar enzimas de restricción o técnicas de sonicación para obtener fragmentos de tamaños apropiados para el uso como sondas.

De forma alternativa, se pueden usar técnicas de PCR para amplificar una secuencia deseada de ácido nucleico. Así, se pueden usar los datos de secuencia proporcionados aquí para diseñar dos cebadores para el uso en PCR de forma que se puede seleccionar una secuencia deseada, que incluye genes completos o sus fragmentos, y después amplificarla en gran medida. Un cebador mostrará normalmente un elevado grado de especificidad por una primera secuencia localizada en una cadena de la molécula de ADN, y el otro cebador mostrará normalmente un elevado grado de especificidad por una segunda secuencia localizada en la cadena complementaria de la secuencia de ADN, y que está espaciada de la secuencia complementaria de la primera secuencia.

Típicamente, los cebadores tendrán al menos 15-25 nucleótidos de largo.

Como alternativa adicional se puede usar la síntesis química. Esta se puede automatizar. Se pueden sintetizar químicamente secuencias relativamente cortas y unirlas para proporcionar una secuencia más larga.

El experto reconocerá que la determinación mediante SDS-PAGE de la masa molecular proporciona resultados que están sometidos a una variación del orden de \pm 10%. Así, cualquier peso molecular aparente descrito aquí, que se ha determinado de esa forma, estará sometido a tal variación.

El experto apreciará que también se podrían usar fragmentos de las proteínas antigénicas de la invención, por supuesto con la condición de que tales fragmentos mantengan una antigenicidad suficiente para ser eficaces. Los expertos en la técnica conocen las técnicas para cribar tales fragmentos. Así, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona uno o más fragmentos antigénicos de una proteína como se describe aquí.

Como se mencionó anteriormente, uno de los usos principales de los antígenos (que incluyen los fragmentos antigénicos) de la presente invención es la provocación de una respuesta inmunitaria. Así, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunógena, preferiblemente una composición de vacuna, que comprende uno o más de los antígenos de la invención (que incluyen los fragmentos antigénicos). La composición se puede formular con vehículos, excipientes, diluyentes y similares farmacéuticos estándar. Además, puede incluir uno o más adyuvantes, útiles para potenciar cualquier respuesta inmunitaria. Las composiciones de vacuna de la invención pueden incluir uno o más adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes conocidos en la técnica incluyen geles inorgánicos tales como hidróxido de aluminio o emulsiones agua en aceite tales como adyuvante incompleto de Freund. El experto conocerá otros adyuvantes útiles.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una o más proteínas como se definen aquí, o uno o más fragmentos antigénicos suyos en la preparación de una composición inmunógena. Preferiblemente, la composición inmunógena es una vacuna. En las realizaciones preferidas, la vacuna es para el uso en la profilaxis o el tratamiento de una infección respiratoria o en la profilaxis o el tratamiento de otitis media.

En particular, se usa(n) la siguiente proteína, homólogos, derivados o uno o más fragmentos antigénicos suyos en la preparación de la composición inmunógena:

(v): una proteína que tiene una masa molecular aparente de alrededor de 30 kDa, determinada mediante SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal:

NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV;

Las proteínas antigénicas, derivados, homólogos o sus fragmentos, descritos aquí se pueden proporcionar solos, en forma de una preparación purificada o aislada, o como parte de una mezcla con otras proteínas antigénicas de B. catarrhalis.

En un quinto aspecto, por lo tanto, la invención proporciona una composición de antígeno que comprende una o más de las proteínas de la invención, uno o más homólogos o derivados o uno o más fragmentos antigénicos suyos, opcionalmente junto con al menos otro antígeno de B. catarrhalis, o uno o más fragmentos antigénicos suyos.

De forma adicional, las proteínas de la presente invención, o sus fragmentos antigénicos, se pueden usar para generar o seleccionar anticuerpos.

En un quinto aspecto, por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos generados contra al menos una proteína de la invención, o contra uno o más fragmentos antigénicos suyos. Los anticuerpos preferidos se unen de forma específica a las proteínas de la presente invención y se pueden usar, por lo tanto, para purificar tales proteínas (p.ej., se pueden inmovilizar y usar para unirse a las proteínas de la presente invención. Las proteínas se pueden eluir después mediante lavado con un eluyente adecuado en condiciones apropiadas).

Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales.

Los anticuerpos policlonales se pueden generar mediante la estimulación de su producción en un hospedador animal adecuado (p.ej. un ratón, rata, conejillo de Indias, conejo, oveja, cabra o mono) cuando se inyecta una proteína de la presente invención en el animal. Si se desea, se puede administrar un adyuvante junto con una proteína de la presente invención. Se pueden usar adyuvantes conocidos tales como los descritos anteriormente. Los anticuerpos se pueden purificar después por medio de su unión a una proteína de la presente invención.

Se pueden producir anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas. Estos se pueden formar fusionando células de mieloma y células de bazo que producen el anticuerpo deseado para formar una línea celular inmortal. Así, se puede usar la técnica conocida de Kohler & Milstein (Nature 256 (1975)) o las variaciones posteriores de esta técnica.

Actualmente, las técnicas para producir anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a una proteína particular están bien desarrolladas en la técnica. Se discuten en libros de texto de inmunología habituales, por ejemplo en Roitt et al, Immunology, segunda edición (1989), Churchill Livingstone, Londres.

Además de los anticuerpos completos, la presente invención incluye sus derivados que son capaces de unirse a las proteínas de la presente invención. Así, la presente invención incluye fragmentos de anticuerpos y construcciones sintéticas. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos y las construcciones sintéticas los proporciona Dougall et al en Tibtech 12 372-379 (septiembre de 1994).

Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv, que se discuten en Roitt et al (anteriormente mencionado). Los fragmentos Fv se pueden modificar para producir una construcción sintética conocida como una molécula Fv de cadena única (scFv). Esto incluye un espaciador peptídico que une de forma covalente las regiones V_{h} y V_{l} lo que contribuye a la estabilidad de la molécula. Otras construcciones sintéticas que se pueden usar incluyen péptidos CDR. Estos son péptidos sintéticos que comprenden los determinantes de unión al antígeno. También se pueden usar moléculas peptidomiméticas. Estas moléculas son normalmente anillos orgánicos restringidos conformacionalmente que imitan la estructura de un bucle CDR y que incluyen cadenas laterales que interaccionan con el antígeno.

Las construcciones sintéticas incluyen moléculas quiméricas. Así, por ejemplo, los anticuerpos humanizados (o primatizados) o sus derivados están dentro del alcance de la presente invención. Un ejemplo de un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene regiones estructurales humanas, pero regiones hipervariables de roedor. Las formas de producir anticuerpos quiméricos las discute, por ejemplo, Morrison et al en PNAS, 81, 6851-6855 (1984) y Takeda et al en Nature 314, 452-454 (1985).

Las construcciones sintéticas también incluyen moléculas que comprenden un resto adicional que proporciona a la molécula alguna propiedad deseable además de la unión al antígeno. Por ejemplo, el resto puede ser una molécula marcadora (p.ej., una molécula marcadora fluorescente o radiactiva).

Los anticuerpos o sus derivados de la presente invención también hallarán uso en la detección/diagnóstico de B. catarrhalis.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis que comprende:

(a): poner en contacto uno o más anticuerpos de la invención con una muestra a ensayar; y

(b): detectar la presencia de una o más proteínas antigénicas de la invención, o uno o más fragmentos antigénicos suyos.

De forma alternativa, las proteínas antigénicas de la presente invención se pueden usar para detectar anticuerpos contra B. catarrhalis, que pueden estar presentes en una muestra biológica obtenida de un sujeto. Así, en aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis que
comprende:

(a): poner en contacto una o más proteínas antigénicas de la invención, o uno o más fragmentos antigénicos suyos, como se definió aquí, o una composición inmunógena de la invención con una muestra a ensayar; y

(b): detectar la presencia de anticuerpos contra B. catarrhalis.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una proteína antigénica, un fragmento antigénico suyo o una composición inmunógena de la presente invención para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis. Preferiblemente, la detección y/o diagnóstico se lleva a cabo in vitro.

Las proteínas antigénicas, sus fragmentos antigénicos o la composición de antígeno de la invención se pueden proporcionar como parte de un equipo para el uso en la detección y/o diagnóstico in vitro de B. catarrhalis. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un equipo para el uso en la detección y/o diagnóstico de B. catarrhalis que comprende al menos una proteína antigénica, un fragmento antigénico suyo, una composición de antígeno de la invención o al menos un anticuerpo de la invención.

Como se discutió anteriormente, las proteínas antigénicas o sus fragmentos antigénicos se pueden usar para inducir una respuesta inmunitaria contra B. catarrhalis. Así, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso del antígeno, un fragmento suyo o una composición antigénica de la invención en medicina.

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En aspectos adicionales, la presente invención proporciona:

(a): el uso de una proteína antigénica, un fragmento antigénico suyo o una composición inmunógena como se describe aquí para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto;

(b): un método para el tratamiento o la profilaxis de una infección respiratoria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína, al menos un fragmento antigénico suyo o una composición inmunógena de la invención, preferiblemente como una vacuna; y

(c): un método para el tratamiento o la profilaxis de la otitis media en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína, al menos un fragmento antigénico suyo o una composición inmunógena de la invención, preferiblemente como una vacuna.

Un método conveniente para la producción de la proteína antigénica descrita aquí (o, realmente, sus fragmentos) es mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que no se deberían interpretar de ninguna manera como limitantes de la invención. Los ejemplos se refieren a las figuras, en las que:

Figura 1: muestra una representación en diagrama de flujo para el aislamiento de las proteínas de 30 kDa y 71 kDa descritas aquí;

Figura 2: muestra una representación en diagrama de flujo para el aislamiento de las proteínas de 14 kDa, 14,5 kDa y 15 kDa descritas aquí;

Figura 3: muestra un gel de SDS-PAGE que muestra las proteínas purificadas después de tinción de plata; y

Figura 4: muestra los datos de velocidad de eliminación para ratones infectados con B. catarrhalis con o sin inmunización con los antígenos de la invención.

Ejemplo 1 Purificación de proteínas (i) 30 kDa y 71 kDa

Se inocularon 20 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón con 4-5 colonias de la cepa K65 de B. catarrhalis (un aislamiento clínico de esputo aislado en el Sir Charles Gardiner Hospital, Perth, Australia; la cepa K65 produce una \beta-lactamasa) y se incubó durante la noche a 37ºC en un agitador-incubador. Se añadieron 2 ml del cultivo a 4 x matraces de 500 ml de caldo BHI y se incubaron durante la noche a 37ºC en un agitador-incubador. Las bacterias se centrifugaron y se lavaron tres veces en PBS a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC en una centrífuga Beckman JA-2 con un rotor JA-14. Las proteínas se extrajeron mediante el uso de una extracción con Zwittergent y un método de precipitación con etanol, con la excepción de que no hubo ajuste del pH tras la adición de acetato sódico/\beta-mercaptoetanol. El producto final se dializó con agua destilada, lo que produjo 40 ml de 15,35 mg/ml, un total de 614 mg de proteína. Las preparaciones se liofilizaron.

El extracto de proteínas se resuspendió en aprox. 60 mg/ml de Tampón A (tris-HCI 25 mM, pH 8,1) antes de cargarlo en una columna de intercambio jónico Q2 de BioRad. Se cargaron alícuotas de 1 ml en cada operación. La columna se lavó con Tampón A durante 5 min a 1 ml/min. Las proteínas se eluyeron mediante el uso de una combinación de gradientes continuos y por etapas desde un 100% de Tampón A a un 100% de Tampón B (Tris-HCI 25 mM + NaCl 0,5 M, pH 8,1) durante 5-10 min. El gradiente fue seguido por un lavado de 4 min con un 100% de Tampón B, seguido de un lavado de 1 min con un 100% de Tampón A. Las fracciones 2, 3 y 4 se mezclaron, se desalinizaron en una columna PD-10 para cambiar a tampón Tris diluido y se liofilizaron.

El volumen se ajustó a 600 \mul con agua destilada, se mezcló con 2,4 ml de tampón reductor (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 10% v/v de glicerol, 2% p/v de SDS, 5% v/v de \beta-mercaptoetanol, 1,2 x 10^{-3}% p/v de azul de bromofenol) y se incubó a 37ºC durante 30 min. Se realizó SDS-PAGE preparativa para purificar las proteínas mediante el uso del Model 491 Prep Cell de Bio-Rad mediante el uso de un gel de separación de 40 ml de acrilamida/BIS (N,N'-metilenbisacrilamida) 9% T-1,42% C con un gel concentrador de 10 ml de acrilamida/BIS 4% T-0,36% C polimerizado en una columna de 37 mm (diámetro interno [d.i.]). Las fracciones se eluyeron de la columna con Tris-HCI 0,025 M, se concentraron mediante liofilización y se analizó el contenido de proteínas mediante SDS-PAGE analítica. La proteína de 71 kDa estuvo en las fracciones 57-80. Estas se mezclaron, se liofilizaron y se reconstituyeron en 2,5 ml de agua destilada. La preparación se desalinizó mediante intercambio de tampón mediante el uso de PBS diluido, y se reconcentró de forma que la concentración del PBS que tamponaba a la proteína fue isotónica.

A partir de esta misma operación preparativa, se mezclaron también las fracciones 26-34, que contenían las proteínas de 55-65 kDa, y las fracciones 4-17, que contenían las proteínas de 20-35 kDa. Las fracciones 4-17 se purificaron adicionalmente mediante el uso de un gel de separación de acrilamida/BIS 145 T-1,42% C con un gel concentrador de acrilamida/BIS 4% T-0,36% C (véase el diagrama de flujo de la Figura 1). Se analizó el contenido de proteína en las fracciones como se describió anteriormente, se mezclaron los intervalos de fracciones apropiados y las proteínas purificadas se desalinizaron y se concentraron.

(ii): Purificación de otras proteínas

Se inocularon 20 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón con 4-5 colonias de la cepa K65 de B. catarrhalis y se incubaron durante la noche a 37ºC en un agitador-incubador. Se añadieron 2 ml del cultivo a 4 x matraces de 500 ml de caldo BHI y se incubaron durante la noche a 37ºC en un agitador-incubador. Las bacterias se centrifugaron y se lavaron tres veces en PBS a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC en una centrífuga Beckman JA-2 con un rotor JA-14. Las proteínas se extrajeron mediante el uso de una extracción con Zwittergent y un método de precipitación con etanol con el pH de acetato sódico/\beta-mercaptoetanol ajustado a pH 4.

El extracto de proteínas se resuspendió en aprox. 60 mg/ml de Tampón A antes de cargarlo en una columna de intercambio fónico Q2 de BioRad mediante el uso del protocolo descrito anteriormente. Se analizó el contenido de proteína en los picos de la columna, las fracciones apropiadas se mezclaron y se sometieron a purificación adicional mediante el uso de electroforesis preparativa en gel (mediante el uso de las columnas indicadas en la Figura 2 y en los protocolos descritos anteriormente). En todas las purificaciones de proteína que implicaron la electroforesis preparativa mediante el uso de SDS se eliminó este detergente mediante precipitación con fosfato potásico.

Resultados

Se purificaron varias proteínas a partir de otros extractos de membranas de B. catarrhalis en cantidades que oscilaron de 10 \mug a 300 \mug a partir de un único procedimiento de extracción. La Figura 3 muestra un análisis de SDS-PAGE analítica de proteínas que oscilan de 23 a 71 kDa.

Identificación de secuencias de aminoácidos Secuenciación N-terminal

Se puede llevar a cabo según los protocolos suministrados por Applied Biosystems. Sin embargo, además, el experto puede llevar a cabo tal secuenciación según los métodos descritos en Matsudaira, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 (1997).

Secuenciación interna de péptidos

Se llevó a cabo la secuenciación mediante el uso del método de S-2-carboxamidoetilación compatible con SDS-PAGE. La reacción de alquilación se realizó con la proteína en una disolución de un 10% de glicerol (vol/vol), un 5% (peso/vol) de SDS, Tris-HCI 0,025 M, 1,4-DTT 100 mM, pH 8,3. La proteína se redujo inicialmente incubando esta mezcla a 90ºC durante 15 minutos. La muestra se enfrió después a 37°C, se añadió acrilamida hasta una concentración final de 2 M y la mezcla se incubó sin luz en argón durante 30 a 60 minutos. Se añadió tampón reductor de SDS, la mezcla se sometió a SDS-PAGE, la proteína se visualizó mediante tinción de Coomassie y se cortó del gel. Este procedimiento se realizó con una proteína de 71 kDa que no se pudo secuenciar de forma N-terminal.

Ejemplo 2 Regímenes de inmunización

La inmunización intra-placas de Peyer (IPP) fue una modificación de un método descrito para ratas (Kyd et al, lnfect. lmmun., 63:2931-2940 (1995)). El inóculo de in- munización se preparó emulsionando la proteína con adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma, St Louis, MI) en una proporción 1:1 para permitir dosis que oscilan de 2,5 \mug a 10 \mug. Se anestesiaron ratones BALB/c macho exentos de patógenos específicos (SPF) de 6 a 8 semanas de edad mantenidos en condiciones SPF mediante una inyección subcutánea de 0,25 ml de ketamina/xilacina en PBS (5 mg/ml de hidrocloruro de ketamina [Troy Laboratories, Smithfield, NSW, Australia]; 2 mg/ml de hidrocloruro de xilacina [Bayer, Pymble, NSW, Australia]). El intestino delgado se expuso a través de una incisión de 1 cm en la línea media de la pared abdominal y se administraron volúmenes de aproximadamente 1 \mul de inóculo de forma subserosa a cada placa de Peyer mediante el uso de una aguja 26G. El intestino se lavó con PBS estéril y se suturó la cavidad abdominal. Los ratones inmunizados de referencia se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico con la inyección de una emulsión de IFA y PBS.

Se administró una dosis de refuerzo intratraqueal (IT) en el día 14 post-IPP. Los ratones se sedaron mediante anestesia con Saffan (0,15 ml; 20 mg de alfadolona en PBS/kg de peso corporal; Pitman-Moore, Nth Ryde, NSW, Australia). Se administró un volumen de 20 \mul de proteína en PBS (la misma cantidad que se administró IPP) en los pulmones por medio de un catéter 22,5G (Terumo, Tokio, Japón) insertado de forma oral en la tráquea. El inóculo se dispersó con dos volúmenes de 0,3 ml de aire.

Exposición bacteriana

Se cultivó B. catarrhalis durante la noche en placas de agar de infusión de cerebro y corazón (BHI) suplementado con 50 ml por litro de sangre de caballo desfibrinada (Amadeus International, Brooklyn, Vic, Australia). Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC en un 5% de CO_{2}, las bacterias se recogieron y se lavaron tres veces en PBS. La concentración se estimó midiendo la densidad óptica a 405 nm y se confirmó mediante recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) del cultivo en placas durante la noche de diluciones en serie del inóculo. Los ratones se sedaron con Saffan administrado de forma intravenosa. Se introdujo una inyección rápida de 20 \mul de inóculo de B. catarrhalis en PBS en los pulmones como se describió para las dosis de refuerzo IT. Los ratones se sacrificaron mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico 4 horas tras la infección o como se indica. Se obtuvo sangre mediante punción en el corazón y se dejó coagular para recoger el suero. Se expuso la tráquea a través del cuello y se obtuvo un lavado broncoalveolar (LBA) instilando y recuperando 0,5 ml de PBS en los pulmones por medio de una cánula. Después de obtener el LBA, se extrajeron los pulmones, se colocaron en un volumen de 2 ml de PBS y se homogeneizaron en un homogeneizador de tejidos (9500 rpm; Heidolph DIAX 600, Electro GmbH & Co, Kelheim, Alemania). Se determinó la eliminación bacteriana en el LBA y el homogeneizado de pulmón mediante el cultivo en placas de diluciones en serie para la determinación de UFC. Se separó el suero mediante centrifugación a 4ºC y 450 x g durante 10 min (Juoan BR3.11, St Nazaire, Francia) y se almacenó a -80ºC.

Resultados

Los ratones se inmunizaron IPP y se administró una dosis de refuerzo IT con proteína purificada. Los datos mostrados en la Figura 4 muestran el porcentaje de eliminación incrementada de bacterias en el lavado broncoalveolar (LBA) o en el tejido pulmonar, comparado con la recuperación bacteriana en ratones no inmunizados.

Una proteína con una masa molecular aparente de 71 kDa fue la más eficaz en el incremento de la eliminación del LBA, pero la respuesta inmunitaria a esta proteína fue menos eficaz en la eliminación del tejido pulmonar.

La respuesta inmunitaria tras la inmunización con una proteína con una masa molecular aparente de 44 kDa fue eficaz en la eliminación de bacterias tanto del LBA como del tejido pulmonar. La inmunización con las proteínas de 15 y 30 kDa mostraron una eliminación incrementada mayor del 50% tanto en el LBA como en el pulmón, mientras una proteína de 14,5 kDa que mostró este valor para la eliminación en el LBA no alcanzó la misma protección en el pulmón. Una proteína de 14 kDa no fue eficaz para eliminar las bacterias en el LBA, pero fue capaz de incrementar ligeramente la eliminación del pulmón.

<110> Cortecs (UK) Limited

\hskip1cm Cripps, Allan W

\hskip1cm Kyd, Jennelle

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<120> Proteínas

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<130> PWC/P20695WO

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<140> PCT/GB99/01473

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<141> 11-05-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 9810084.5

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<151> 11-05-1998

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<160> 9

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 31

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 1

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\sa{Ala Ile Ser Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ala Gln Pro Tyr Val Gly Ala}

\sac{Lys Ile Gly Gln Val Asp Ala Lys Gln Ile Asn Asn Lys Asn Thr}

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<210> 2

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<211> 31

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 2

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\sa{Asn Val Val Thr Asn Thr Gly Ala Thr Val Val Asp Gly Thr Arg Thr}

\sac{Ile Phe Ser Thr Leu Val Lys Pro Ala Ala Val Val Ala Ala Val}

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<210> 3

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<220>

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<221> SITIO

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<222> (19)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido

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<400> 3

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\sa{Thr Pro Thr Val Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Thr Ile Asp Ala Asn Asn}

\sac{Thr Asp Xaa Thr Tyr}

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<210> 4

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 4

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\sa{Ala Gly Leu Asp Arg Ser Gly Gln Asp Val Thr Ala Ser Leu Gln Asp}

\sac{Gly Thr Tyr Ala}

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<210> 5

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 5

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\sa{Gly Glu Leu Ser Ser Asn Leu Gln Asp Arg His Lys}

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<210> 6

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Ala Asp Ile His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser}

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<210> 7

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 7

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\sa{Asn Phe Glu Tyr Leu Lys}

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<210> 8

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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<400> 8

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\sa{Phe Gly Glu Leu Ser Val Gly Asp Ser His Ser Val Phe Leu Gln}

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<210> 9

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Branhamella catarrhalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Asp Ala Asp Val Thr Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Met}

\sac{Gly Gly}

Claims

1. Una proteína que es un antígeno de B. catarrhalis y que tiene una masa molecular aparente de alrededor de 30 kDa, determinada mediante SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal:

NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV.

2. Un fragmento antigénico de una proteína como se definió en la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que es:

(i): una secuencia de ADN que codifica una proteína como se definió en la reivindicación 1 o sus equivalentes de ARN;

(iii): una secuencia que tiene al menos un 75% o al menos un 90% de identidad con cualquiera de las de (i) y (ii);

(iv): una secuencia que codifica un fragmento antigénico definido en la reivindicación 2.

4. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se definió en la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector como se definió en la reivindicación 4.

6. Un método para la producción de una proteína antigénica que comprende la expresión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 por la célula hospedadora de la reivindicación 5.

7. Una composición inmunógena que comprende la proteína como se definió en la reivindicación 1 o uno o más fragmentos antigénicos como se definió en la reivindicación 2.

8. Una composición inmunógena según la reivindicación 7 que es una vacuna.

9. El uso de una proteína como se definió en la reivindicación 1 o uno o más fragmentos antigénicos como se definió en la reivindicación 2 en la preparación de una composición inmunógena.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que la composición inmunógena es una composición de vacuna para la profilaxis o el tratamiento de una infección respiratoria.

11. El uso según la reivindicación 9, en el que la composición inmunógena es una vacuna para la profilaxis o el tratamiento de otitis media.

12. Una composición de antígeno que comprende una proteína como se definió en la reivindicación 1 y/o uno o más fragmentos antigénicos como se definió en la reivindicación 2, opcionalmente junto con al menos otro antígeno de B. catarrhalis o su fragmento antigénico.

13. Un anticuerpo generado contra una proteína como se definió en la reivindicación 1 o un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2.

14. Un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis que comprende:

a): poner en contacto uno o más anticuerpos como se definió en la reivindicación 13 con una muestra a ensayar; y

b): detectar la presencia de uno o más antígenos como se definió en la reivindicación 1.

15. Un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis que comprende:

a): poner en contacto una o más proteínas antigénicas como se definió en la reivindicación 1, uno o más fragmentos antigénicos como se definió en la reivindicación 2, o una composición de antígeno como se definió en la reivindicación 12 con una muestra a ensayar; y

b): detectar la presencia de anticuerpos para B. catarrhalis.

16. El uso de una proteína como se definió en la reivindicación 1, un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2, o una composición de antígeno como se definió en la reivindicación 12 para detectar/diagnosticar B. catarrhalis in vitro.

17. Un equipo para el uso para detectar/diagnosticar B. catarrhalis, que comprende al menos una proteína antigénica como se definió en la reivindicación 1, al menos un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2, una composición de antígeno como se definió en la reivindicación 12 o un anticuerpo como se definió en la reivindicación 13.

18. Una proteína como se definió en la reivindicación 1, un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2 o una composición inmunógena como se definió en la reivindicación 7 para el uso en medicina.

19. El uso de una proteína como se definió en la reivindicación 1, un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2 o una composición inmunógena como se definió en la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para el uso para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra B. catarrhalis.

20. El uso de una proteína como se definió en la reivindicación 1, un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2 o una composición inmunógena como se definió en la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para el uso en la profilaxis de una infección respiratoria.

21. El uso de una proteína como se definió en la reivindicación 1, un fragmento antigénico como se definió en la reivindicación 2 o una composición inmunógena como se definió en la reivindicación 7, en la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento o la profilaxis de otitis media.