MXPA00011069A - Proteinas de moraxella catarrhalis - Google Patents

Abstract

Se proporcionan novedosos antigenos de B. Catarhalis, junto con su uso en vacunas asícomo métodos de diagnóstico y/o detección.

Description

PROTEÍNAS DE MORAXELLA CATARRHALIS La presente invención se refiere a novedosas proteínas de Branhamella catarrhalis, secuencias de DNA que codifican tales proteínas, así como su uso en diagnóstico y como la base para vacunas. La Branhamella catarrhalis (también conocida como Moraxella catarrhalis) es una bacteria aeróbica gram-negativa que provoca infecciones del tracto respiratorio en humanos. La B. catarrhalis puede existir como parte de la microflora del tracto respiratorio humano, particularmente en niños. La bacteria provoca infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos y otitis media en niños (Klein J.O., Clin. Infect. Dis., 19:823-833 (1994); Murphy T.F., Microbial. Rev., 60:267-279 (1996); Nicotra et al., Arch. Intern. Med., 146:890-893). Aproximadamente 30% de las exacerbaciones purulentas en adultos con enfermedad pulmonar de pulmón obstructiva crónica fueron por ß. catarrhalis en un estudio (Verghese et al, Antimicrob. Agents Chemother., 34:1041-1044 (1990)). Estudios usando cultivos de fluido del oído medio revelaron que 15 a 20% de los episodios de otitis media son provocados por B. catarrhalis (Klein (1994), supra). Las infecciones provocadas por B. catarrhalis inducen una respuesta inmune contra antígenos de membrana exterior de la bacteria (Chapman et al., J. Infect. Dis., 151:878-882 (1985); Faden et al., infect. Immun., 60:3824-3829 (1992); Sethi et al., Infecí. Immun., 63:1516-1520 (1995)). El anticuerpo para B. catarrhalis está presente en secreciones en el tracto respiratorio superior (Fadden (1992), supra, Stenfors, L.E y Raisanen, S., Acta Otolaryngol. , 1 1 3: 191 -1 95 (1993)). La respuesta inmune mucosal de cepa específica puede ser importante en la protección contra la otitis media provocada por ß. catarrhalis (Faden (1992), supra y Stenfors y Raisanen ( 1 993) , supra). Una variedad de publicaciones de patentes han descrito la proteína d aislada de B. catarrhalis y su uso potencial como antígeno. Ejemplos incluyen WO90/12591 , WO93/03761 , WO95/09025, WO95/3121 5, WO96/1 2733 y WO97/41731 . Sin embargo, existe una necesidad continua para proporcionar un rango de antígenos de B. catarrhalis, con el fin de proporcionar vacunas mejores y más efectivas por ejemplo. Ahora hemos aislado un rango de tales proteínas, las cuales pueden ser usadas para producir respuestas inmunes, así como encontrar uso como herramientas de diagnóstico. De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína, la cual es un antígeno de B. catarrhalis, y la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamene 14 hasta aproximadamente 71 kDa, como se determina por SDS-PAGE. En modalidades preferidas, la proteína es una de las siguientes, aisla bles de B. catarrhalis: (i) u na prote í na q ue tiene u n a masa molecu lar aparente de aproximadamente 14 kDa , como se determina por SDS -PAGE; (ii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14.5 kDa , como se determina por SDS-PAGE; (li i) una prote ína q ue tiene u na masa molecu lar aparente de aproximadamente 1 5 kDa, como se determina por SDS-PAG E; (iv) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 20 kDa, como se determina por SDS- PAGE, y que tiene la sig uiente secuencia N-terminal: AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT; (v) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: NVVTNTGATVVDGTRTI FSTLVKPAAVVAAV; (vi) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 35 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal : TPTVYGKAFLTI DAN NTDXTY; (vii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 44 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la sig uiente secuencia N-terminal : AGLDRSGQDVTASLQDGTYA; (viii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de 71 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene las siguientes secuencias de péptidos internos: residuos 350-361 GELSSNLQDRHK residuos 366-380 ADI HGNRFRGSAAIAS residuos 528-533 N FEYLK residuos 542-556 FGELSVGDSHSVFLQ residuos 665-682 DADVTGGFYGPNATEMGG .

Como se discute en la presente, las proteínas y polipéptidos de la invención son útiles como material antigénico. Tal material puede ser "antigénico" y/o "inmunogénico". De manera general, "antigénico" es tomado para significar que la proteína o polipéptido es capaz de ser usado para producir anticuerpos, o en realidad es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos en un sujeto. "Inmunogénico" es tomado para significar que la proteína o polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un sujeto. De esta manera, en el ú ltimo caso, la proteína o pol ipéptido puede ser capaz no solamente de generar una respuesta de anticuerpos, sino además respuestas inmunes no basadas en anticuerpos.

La persona experta apreciará que los homólogos o derivados de las proteínas o polipéptidos de la invención también encontrarán uso en el contexto de la presente invención , es decir, como material antigénico/inmunogénico. De esta manera, por ejem plo, proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, supresiones, substituciones o similares, están abarcados por la presente invención.

Además , puede ser posible reemplazar un aminoácido con otro. Uno puede usar un programa, tal como el programa CLU STAL para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de am inoácidos y encuentra la alineación óptima al insertar espacios en cualquier secuencia, según sea apropiado. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácidos) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor para el ajuste. De esta manera, es posible obtener una comparación donde se encuentran varias regiones de similitud, teniendo cada una un resultado diferente. Ambos tipos de análisis están contemplados en la presente invención. En el caso de homólogos y derivados, el grado e identidad con una proteína o polipéptido, como se describe en la presente, es menos importante que cual homólogo o derivado debería retener su antigenicidad o inmunogenicidad a streptococcus pneumoniae. Sin embargo, de manera adecuada, se proporcionan los homólogos o derivados teniendo al menos 60% de similitud (como se discutió antes) con las proteínas o polipéptidos descritos en la presente. De preferencia, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos 70% de similitud , más preferiblemente al menos 80% de similitud . Muy preferiblemente, se proporcionan homólogos o derivados teniendo al menos 90% o incluso 95% de similitud . En una aproximación alternativa, los homólogos o derivados podrían ser proteínas de fusión, incorporando porciones que hacen más fácil la purificación, por ejemplo, al marcar de manera efectiva la proteína o polipéptido deseado. Puede ser necesario remover la "etiqueta" o puede ser el caso de que la proteína de fusión retenga una antigenicidad suficiente para ser útil.

Las técnicas de clonación de genes pueden ser usadas para proporcionar una proteína de la invención en forma substancialmente pura. Estas técnicas son descritas, por ejemplo, en J. Sambrook et al. Molecular Cloning (Clonación molecular), 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). De esta manera, las secuencias N-terminales de las proteínas descritas en la presente, pueden ser usadas a su vez, como la base para sondas para aislar los genes que codifican las proteínas individuales. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste de una secuencia, la cual es: (i) una secuencia de DNA que codifica una proteína o polipéptido como se describe en la presente o sus equivalentes de RNA; (ii) una secuencia, la cual es complementaria a cualquiera de las secuencias de (i); (iii) una secuencia, la cual tiene identidad substa ncial con cualquiera de aq uéllas de (i) y (ií); (iv) una secuencia, la cual codifica un homólogo, derivado o frag mento de una proteína, como se define en la prese nte. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden incluir una pluralidad de tales secuencias y/o fragmentos . La persona experta apreciará que la presente invención puede incluir novedosas variantes de aquéllas moléculas de ácido nucleico, las cuales son ejemplificadas en la presente. Tales variantes son abarcadas por la presente invención . Estas pueden ocurrir en la naturaleza, por ejemplo, debido a variación de cepas. Por ejemplo, se incluyen adiciones, substituciones y/o supresiones.

Además y particularmente cuando se usan sistemas de expresión microbiana, uno puede desear diseñar la secuencia de ácido nucleico al hacer uso de uso de codones preferidos conocidos en el organismo particular siendo usado para la expresión. De esta manera, las variantes sintéticas o que no ocurren de manera natural, también están incluidas dentro del alcance de la invención. El término "equivalente de RNA", cuando se usa antes, indica que una molécula de RNA dada tiene una secuencia que es complementaria a aquélla de una molécula de DNA dada (permitiendo el hecho de que "U" de RNA reemplace "T" en el código genético). Cuando se comparan secuencias de ácidos nucleicos con ei fin de determinar el grado de homolog ía o identidad, uno puede usar programas, tales como, BESTFIT y GAP (ambos del paquete de programas de cómputo de Wisconsin Genetics Computer Group (GCG). Por ejemplo, BESTFIT, compara dos secuencias y produce un a alineación óptima de la mayoría de los segmentos similares. GAP permite que las secuencias sean alineadas a lo largo de su longitud completa y encuentra la alineación óptima al insertar espacios en cualquier secuencia, según sea apropiado. De manera adecuada, en el contexto de la presente invención , comparar cuando se discute la identidiad de secuencias de ácidos nucleicos, la comparación se hace mediante alineación de las secuencias a lo largo de su longitud completa. De preferencia, las secuencias que tienen identidad substancial tienen al menos 50% de identidad de secuencia , deseablemente al menos 75% de identidad de secuencia y más deseablemente al menos 90 o al menos 95% de identidad de secuencia con dichas secuencias. En algunos casos , la identidad de secuencia puede ser 99% o mayor. Deseablemente, el término "identidad substancial" indica que dicha secuencia tiene un mayor grado de identidad con cualquiera de las secuencias descritas en la presente que con las sec uencias de ácidos nucleicos de la técnica anterior. Sin embargo, se debería notar que donde una secuencia de ácido nucleico de la presente invención codifica al menos parte de un novedoso producto de gene, la presente invención incluye dentro de su alcance, toda las secuencias posibles que codifiquen el producto de gene o una parte novedosa del mismo. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada o recombinante. Puede estar incorporada en un vector y el vector puede estar incorporado en un huésped . Tales vectores y huéspedes adecuados forman todavía aspectos adicionales de la presente invención . En consecuencia, por ejemplo, al usar sondas diseñadas con base en las secuencias de aminoácidos N-terminales descritas en la presente, pueden identificarse genes en B. catarrhalis. Entonces pueden cortarse usando enzimas de restricción y clonarse en u n vector. El vector puede ser introducido en un huésped adecuado para expresión. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser obten idas a partir de B. catarrhalis mediante el uso de sondas apropiadas complementarias a parte de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico. Las enzimas de restricción o técnicas de sonicación , pueden ser usadas para obtener fragmentos dimensionados apropiadamente para sondeo. De manera alternativa, pueden usarse técnicas de PCR para amplificar una secuencia de ácido nucleico deseada. Así, los datos de secuencia proporcionados en la presente pueden ser usados para diseñar dos iniciadores para usarse en PCR, de manera que una secuencia deseada, incluyendo genes completos o fragmentos de los mismos, pueden ser enfocados y entonces amplificados a un alto grado. Un iniciador normalmente mostrará un alto grado de especificidad para una primera secuencia ubicada en un filamento de una molécu la de DNA, y el otro iniciador, normalmente mostrará un alto grado de especificidad para una segunda secuencia ubicada en el filamento complementario de la secuencia de DNA, y que está separada de la secuencia complementaria para la primera secuencia. Normalmente, los iniciadores serán al menos de 1 5-25 nucleótidos de largo. Como una alternativa adicional , puede usarse la síntesis química. Esta puede ser automatizada. Secuencias relativamente cortas pueden ser sintetizadas qu ímicamente y ligarse juntas para proporcionar una secuencia más larga. La persona experta reconocerá que la determin ación de SDS-PAGE de masa molecular produce resultados que son sometidos a una variación dei orden de ± 10%. Así, cualquier peso molecular aparente descrito en la presente, el cual ha sido determinado de esa manera , estará sometido a tal variación.

El experto apreciará que los fragmentos de las proteínas antigénicas de la invención podrían ser usados, con la condición , por supuesto, de que tales fragmentos retengan una antigenicidad suficiente para ser efectivos. Las técnicas para clasificar tales fragmentos son bien conocidas para aquéllos expertos en la técnica. Así, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona uno o más fragmentos antigénicos de una proteína como se describe en la presente. Como se mencionó antes, uno de los usos primarios de los antígenos (incluyendo fragmentos antigénicos) de la presente invención es provocar una respuesta inmune. De esta manera, en un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica, de preferencia, una composición de vacuna, la cual comprende uno o más de los antígenos de la invención (incluyendo fragmentos antigénicos). La composición puede ser formulada con portadores, excipientes, diluyentes farmacéuticos estándares y similares. Además, puede incluir uno o más auxilares, útiles para reforzar cualquier respuesta inmune. Las composiciones de vacuna de la invención pueden incluir uno o más auxiliares. Ejemplos de auxiliares bien conocidos en la técnica incluyen geles inorgánicos, tales como, hidróxido de aluminio o emulsiones agua en aceite, tales como auxiliar incompleto de Freund . Otros auxiliares útiles serán bien conocidos por el experto. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una o más proteínas, como se define en la presente, o uno o más frag mentos antigénicos de las mismas, en la preparación de una com posición inmunogénica. De preferencia, la composición inmunogénica es una vacuna. En las modalidades preferidas, la vacuna es para usarse en la profilaxis o tratamiento de la infección respiratoria o la profilaxis o tratamiento de otitis media. En particular, una o más de las siguientes proteínas, homólogos, derivados, o uno o más fragmentos antigénicos de los mismos, son usados en la preparación de la composición inmunogénica: (i) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14 kDa, como se determina por SDS-PAGE; (ii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14.5 kDa, como se determina por SDS-PAGE; (iii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 1 5 kDa, como se determina por SDS-PAGE; (iv) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 20 kDa , como se determina por SD65-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: AI SYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQI NN KNT; (v) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: NVVTNTGATVVDGTRTI FSTLVKPAAVVAAV; (vi) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 35 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: TPTVYGKAFLTI DAN NTDXTY; (vii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 44 kDa, como se determina por SDS -PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: AGLDRSGQDVTASLQDGTYA; (viii) una proteína que tiene una masa molecular aparente de 71 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene las siguientes secuencias de péptidos internos: residuos 350-361 GELSSNLQDRHK residuos 366-380 ADI HGN RFRGSAAIAS residuos 528-533 N FEYLK residuos 542-556 FGELSVGDSHSVFLQ residuos 665-682 DADVTGGFYGPNATEMGG.

Las proteínas antigénícas, derivados, homólogos o fragmentos de los mismos, descritos en la presente, pueden ser proporcionados solos, como una preparación purificada o aislada, o como parte de una mezcla con otras proteínas antigénicas de ß. catarrhalis. En consecuencia, en un quinto aspecto, la invención proporciona una composición de antígeno que comprende una o más de las proteínas de la invención , uno o más homólogos o derivados, o uno o más fragmentos antigénicos de los mismos, opcionalmente junto con al menos otro antígeno de B. catarrhalis, o uno o más fragmentos antigénicos del mismo. Adicionalmente, las proteínas de la presente invención, o fragmentos antigénicos de los mismos, pueden ser usadas para producir o seleccionar anticuerpos. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona anticuerpos producidos contra al menos una proteína de la invención , o contra uno o más fragmentos antigénicos de los mismos. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a proteínas de la presente invención y, por lo tanto, pueden ser usados para purificar tales proteínas (por ejemplo, pueden inmovilizarse y usarse para unirse a proteínas de la presente invención. Entonces, las proteínas pueden ser levigadas al lavarse con un levigante adecuado bajo condiciones apropiadas. ) Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser producidos al estimular su producción en un huésped animal adecuado (por ejemplo, un ratón , rata, conej il lo de Indias, conejo, borrego, cabra o mono) , cuando una proteína de la presente invención es inyectada en el animal. Si se desea , un auxiliar puede ser administrado junto con una prote ína de la presente invención Pueden usarse auxiliares bien conocidos, tales como aquéllos descritos antes. Los anticuerpos pueden ser purificados entonces en virtud de su unión a una proteína de la presente invención. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos a partir de hibridomas. Estos pueden formarse al fusionar células de mieloma y células de bazo, las cuales producen el anticuerpo deseado, con el fin de formar una l ínea celular inmortal . Así, puede usarse la técnica bien conocida de Kohler & Milstein {Nature 256 ( 1 97 5)) o variaciones subsecuentes sobre esta técnica. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen a una proteína particular están bien desarrolladas ahora en la técnica. Se discuten en libros de texto de inmunología estándares, por ejemplo, en Roitt et al. , Immunology (Inmunolog ía), segunda edición (1 989), Churchill Livigstone, Londres. Además de anticuerpos completos, la presente invención incluye derivados de los mismos, los cuales son capaces de unirse a proteínas de la presente invención. De esta manera , la presente invención incluye fragmentos de anticuerpos y constructos sintéticos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos y constructos sintéticos están dados por Dougall et al , en Tibtech 1 2 372-379 (septiembre de 1 994) . Los fragmentos de anticuerpos incluyen, por eje m plo, Fab, F(ab')2 y fragmentos FV, los cuales son discutidos en Roitt et al [supra]. Los fragmentos Fv pueden ser modificados para producir un constructo sintético conocido como una molécula Fv de cadena simple (scFv). Esta incluye un enlazador de péptido que une covalentemente regiones Vh y V,, lo cual contribuye a la estabilidad de la molécula. Otros constructos sintéticos que pueden ser usados incluyen péptidos CDR. Estos son péptidos sintéticos que comprenden determinantes de unión a antígeno. También pueden usarse imitadores de péptidos . Estas moléculas usualmente son anillos orgánicos conformacionalmente restringidos que imitan la estructura de un rizo de CDR y que incluyen cadenas laterales interactivas con antígeno. Los constructos sintéticos incluyen moléculas quiméricas. Así, por ejemplo, anticuerpos humanizados (o primatizados) o derivados de los mismos, están dentro del alcance de la presente invención. Un ejemplo de un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene regiones de marco de trabajo humano, pero regiones hipervariables de roedor. Las maneras de producir anticuerpos quiméricos se discuten , por ejemplo, por Morrison et al en PNAS, 81 , 6851 -6855 (1984) y por Takeda et al, en Nature 314, 452-454 (1 985) . Los constructos sintéticos también incluyen moléculas comprendiendo una porción adicional que proporciona la molécula con alguna propiedad deseable, además de la unión a antígeno. Por ejemplo, la porción puede ser una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta fluorescente o radioactiva). Los anticuerpos o derivados de los mismos de la presente invención, también encontrarán uso en la detección/diagnóstico de ß. catarrhalis. En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar y/o diagnosticar ß. catarrhalis, el cual comprende: (a) llevar a contacto uno o más anticuerpos de la invención, con una muestra a ser probada; y (b) detectar la presencia de una o más de las proteínas antigénicas de la invención , o uno o más fragmentos antigénicos de las mismas. De manera alternativa , las proteínas antigénicas de la presente invención pueden ser usadas para detectar anticuerpos contra B. catarrhalis, la cual puede estar presente en una muestra biológica obtenida de un sujeto. Así, todavía en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis, el cual comprende: 5 (a) llevar a contacto una o más proteínas antigénicas de la invención, o uno o más fragmentos antigénicos de las mismas, como se define en la presente, o en composición inmunogénica de la invención, con una muestra a ser probada; y (b) detectar la presencia de anticuerpos para B. catarrhalis. 10 En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una proteína antigénica, un fragmento antigénico de la misma o composición ¡nmunogénica de la presente invención, para detectar y/o diagnosticar ß. catarrhalis. De preferencia , la detección y/o diagnóstico se realiza in vítro. Las proteínas antigénicas, fragmentos antigénicos de las mismas o 15 composición antigénica de la invención, puede proporcionarse como parte de un conjunto para usarse en la detección y/o diag nóstico in vitro de ß. catarrhalis. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un conjunto para usarse en la detección y/o diagnóstico de B. catarrhalis, comprendiendo al menos una proteína antigénica, fragmento antigénico de 20 la misma, composición antigénica de la invención o al menos un anticuerpo de la invención. Como se discutió antes, las prote ínas antigénicas o fragmentos antigénicos de las mismas , pueden usarse para inducir una respuesta inmune contra ß. catarrhalis. As í, en un aspecto adicional, la presente >jtj-to-A-MBt-«Ma?» „ •- t t ~. - y. . -•'x •<. ^ .J«.. . , •. £ & - , t .y^ . . , . y -. » - . «...; y ¡ i j-ifaa»^» invención proporciona el uso del antigeno, un fragmento del mismo o una composición antigénica de la invención en medicina. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona: (a) el uso de la proteína antigénica, un fragmento antigénico de la misma o una composición inmunogénica, como se describe en la presente para inducir una respuesta inmune en un sujeto; (b) un método para el tratamiento de la pro filaxis de infección respiratoria en un sujeto, el cual comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína, al menos un fragmento antigénico de la misma o una composición inmunogénica de la invención, preferiblemente como una vacuna; y (c) un método para el tratamiento o profilaxis de otitis media en un sujeto, el cual comprende el paso de administrar al sujeto, una cantidad efectiva de al menos una proteína, al menos un frag mento antigénico de la misma, o una composición inmunogénica de la invención , preferiblemente como una vacuna. Un método conveniente para la producción de la proteína antigénica descrita en la presente (o en realidad fragmentos de la misma) , es mediante el uso de técnicas de DNA recombinantes. La presente invención será descrita ahora con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no deberían ser interpretados en ninguna manera como limitantes de la invención . Los ejemplos se refieren a las figuras, en las cuales: FIGURA 1 : muestra una representación de diagrama de flujo para el aislam iento de las proteínas de 30 kDa y 71 kDa descritas en la presente; FIGURA 2: muestra una representación de diagrama de flujo para el aislamiento de las proteínas de 1 4 kDa , 14.5 kDa y 1 5 kDa descritas en la presente; FIGU RA 3: muestra un gel de SDS-PAGE exhibiendo proteínas purificadas siguiendo manchado de plata; y FIGURA 4: muestra datos de proporción de clarificación para ratones infectados con B. catarrhalis con o sin inmunización con antígenos de la invención.

EJEMPLO 1 : Purificación de proteínas (i) 30 kDa y 71 kDa Se inocularon 20 ml de caldo de infusión de cerebro corazón con 4-5 colonias de ß. catarrhalis cepa K65 (un aislado clínico de esputo recuperado en el Sir Charles Gardiner Hospital, Perth, Australia; la cepa K65 produce una ß-lactamasa) y se incubaron durante la noche a 37°C en un incubador con agitador. Se adicionaron 2 ml del cultivo a cada uno de los matraces 4 x 500ml de caldo BHI y se incubaron durante la noche a 37°C en un incubador con agitador. Las bacterias fueron pelletizadas y se lavaron tres veces en PBS a 1 0,000 rpm durante 1 5 min a 4°C en una centrífuga Beckman JA-2 usando un rotor JA-14. Las proteínas fueron extra ídas usando un método de precipitación de etanol y extracción zwíttergente con la excepción de que no hubo ajuste de pH después de la adición de acetato de sodio/ß-mercaptoetanol. El producto final fue sometido a diálisis contra ag ua destilada , produciendo 40 ml a 1 5.35 mg/ml, un total de 614 mg de proteína. Las preparaciones se secaron por congelación. El extracto de proteína fue resuspendido a aproximadamente 60 mg/ml en Amortiguador A (25 mM tris-HCI, pH 8.1 ) antes de cargarse en una columna de intercambio de iones BioRad Q2. Se cargaron alícuotas de 1 ml en cada corrida. La columna se lavó con Amortiguador A durante 5 min a 1 ml/min. Las proteínas se levigaron usando una combinación de gradientes continuos y por pasos desde 1 00% de Amortiguador A hasta 100%o de Amortiguador B (25 m M Tris-HCl + 0.5 M NaCI , pH 8.1 ) sobre 5-10 min . El gradiente fue seguido por un lavado de 4 min con 100% de Amortiguador B, seguido por un lavado de 1 min con 1 00% de Amortiguador A. Las fracciones 2, 3 y 4 fueron depositadas, desaladas en una columna PD-10 para cambiar a amortiguador de Tris diluido, y entonces se secaron por congelación. El volumen fue ajustado a 600 µl con agua dest ilada, se mezclaron con 2.4 ml de amortiguador reductor (62.5 mM Tris, pH 6.8, 1 0% v/v de glicerol, 2% p/v de SDS, 5% v/v de ß-mercaptoetanol, 1 .2 x 10"3% p/v de azul bromofenol) y se incubaron a 37°C durante 30 min. La SDS-PAGE preparativa para purificar proteínas se realizó usando Prep Cell Modelo 491 de Bío-Rad, usando un gel de separación de 40 ml 9% T-1 .42% C acri lamida/BI S (N , N '-metilenbis acrilamida) con un gel de pila 1 0 ml 4% t-0.36%o C acrilamida/BIS polimerizado en una columna de 37 mm (diámetro interno [i.d.]). Las fracciones fueron levigadas de la columna con 0.025M Tris-HCl , se concentraron por liofilización y se analizaron por contenido de proteína mediante SDS-PAGE analítica . La proteína de 71 kDa estuvo en las fracciones 57-80. Estas se depositaron, secaron por congelación y reconstituyeron en 2.5 ml de agua destilada. La preparación fue desalada mediante intercambio de amortiguadores usando PBS diluido y se reconcentró, de manera que la concentración de PBS amortiguando la proteína fue isotónica. A partir de esta misma corrida celular prepa rativa, también se depositaron las fracciones 26-34, conteniendo las proteínas de 55-65 kDa y las fracciones 4-17 , conteniendo las proteínas de 20-35 kDa. Las fracciones 4-1 7 fueron purificadas de manera adicional usando un gel de separación 145 T-1 .42% C acrílamida/BIS con un gel de pila 4% T-0.36% C acrilamida/BIS (ver el diagrama de flujo de la figura 1 ). Las fracciones fueron valoradas por contenido de proteína como se describió antes, los rangos de fracciones apropiadas se depositaron y las proteínas purificadas se desalaron y concentraron. (i?) Purificación de otras proteínas Se inocularon 20 ml de caldo de infusión de cerebro corazón con 4-5 colonias de B. catarrhalis cepa K65 y se incubaron durante la noche a 37°C en un incubador con agitador. Se adicionaron 2 ml del cultivo a cada uno de los matraces 4 x 500 ml de caldo BHI y se i ncubaron durante la noche a 37°C en un incubador con agitador. Las bacterias fueron pel letizadas y se lavaron tres veces en PBS a 1 0, 000 rpm durante 1 5 min a 4°C en una centrífuga Beckman JA-2 usando un rotor JA-1 4. Las proteínas fueron extraídas usando un método de precipitación de etanol y extracción zwittergente con el pH de acetato de sodio/ß-mercaptoetanol ajustado a pH 4. El extracto de proteína fue resuspendido a aproximadamente 60 mg/ml en Amortiguador A antes de cargarse en una columna de intercambio de iones BioRad Q2, usando el protocolo descrito antes. Los picos de la columna se valoraron para contenido de proteína, las fracciones apropiadas se depositaron y se sometie ron a purificación adicional usando la electroforesis en gel preparativa (usando columnas como se indica en la figura 2 y protocolos como se describió antes), Todas las purificaciones de proteína que involucran electroforesis preparativas usando SDS tuvieron este detergente removido mediante precipitación con fosfato de potasio.

Resultados Se purificaron varias proteínas de otros extracto s de membranas de ß. catarrhalis en cantidades que varían desde 1 0 µg hasta 300 µg a partir de un procedimiento de extracción simple. La figura 3 muestra un análisis de SDS-PAGE analítica de proteínas que varían desde 23 hasta 71 kDa.

Identificación de secuencias de aminoácidos Secuenciación N-terminal Esta puede realizarse de acuerdo con protocolos suministrados por protocolos de Applied Biosystems. Sin em bargo , además, la persona experta también puede realizar tal secuenciación de acuerdo con los métodos descritos en Matusdaira, J. Biol. Chem. , 262: 10035-10038 (1997).

Secuenciación de péptidos internos La secuenciación se realizó usando el método de S-2-carboxamidotilación compatible con SDS-PAGE. La reacción de alquilación se realizó en la proteína en una solución de 10% de glicerol (vol/vol), 5% (p/v) de SDS, 0.025 M Tris HCl, 1 00mM 1 ,4-DTT, pH 8.3. La proteína fue reducida inicialmente al incubar esta mezcla a 90°C durante 15 minutos. Entonces la muestra se enfrió a 37°C, la acrilamida se adicionó a una concentración final de 2M y la mezcla se incubó bajo argón, excluyendo la luz durante 30 a 60 minutos. Se adicionó el amortiguador reductor de SDS, la muestra se sometió a SDS-PAGE, la proteína fue visualizada mediante manchado con coomassie y se cortó del gel. Este procedimiento se realizó en una proteína de 71 kDa, que fue incapaz de ser secuenciada de manera N-terminal.

EJEMPLO 2: Regímenes de inmunización La inmunización de parche I ntra-Peyer (I PP) fue una modificación de un método descrito para ratas (Kyd et al . , Infect. Immun. , 63:2931 -2940 (1 995)). El inoculo de inmunización se preparó al emulsificar la proteína con auxiliar incompleto de Freu nd (I FA) (Sigma, St. Louis, Ml ) en una proporción 1 : 1 para permitir dosificaciones variando desde 2.5 µg hasta 1 0 µg . Ratones BALB/c machos, libres de patógenos específicos (SPF) , de 6 a 8 semanas de edad, mantenidos bajo condiciones SPF, fueron anestesiados mediante una inyección subcutánea de 0.25 ml de cetam ina/xilazina en PBS (5 mg/ml de hidrocloruro de cetamina [Troy Laboratories, Smithfiled, NSW, Australia]; 2 mg/ml de hidrocloruro de xílazina [Bayer, Pymble, NSW, Australia]). El intestino delgado fue expuesto a través de 1 cm de incisión de línea media en la pared abdominal y se entregaron volúmenes de inoculo de aproximadamente 1 µl subserosalmente a cada parche de Peyer usando una aguja 26G. Los intestinos fueron enjuagados con PBS estéril y se suturó la cavidad abdominal. Los ratones inmunizados con falso fueron sometidos al mismo procedimiento quirúrgico con la inyección de una emulsión de I FA y PBS. Un refuerzo (IT) intra-traqueal se administró el el día 14 post-I PP. Los ratones fueron sedados mediante anestesia de saffan intravenosa (0.1 5 ml; 20 mg de alfadona en PBS/kg de peso corporal; Pitman-Moore, Nth Ryde, NSW, Australia) . Se entregó un volumen de 20 µl de proteína en PBS (la misma cantidad que se administró I PP) en los pulmones vía un catéter 22.5G (Terumo, Tokio, Japón) insertado oralmente en la traquea. El inoculo fue dispersado con dos volúmenes de 0.3 ml de aire.

Reto bacteriano Se hizo crecer ß. catarrhalis durante la noche sobre placas de agar de infusión de cerebro corazón (BHI ) complementado con 50 ml por litro de sangre de caballo desfibrinada (Amadeus I nternational , Brooklyn, Vic, Australia). Las placas se incubaron durante la noche a 37°C en 5% de CO2, l as bacterias se recolectaron y se lavaron tres veces en PBS . La concentración se estimó al medir la densidad óptic a a 405 mm y se £.4 * » » confirmó al contar unidades formadoras de colonia (CFU) del platinado durante la noche de diluciones seriales del inoculo. Los ratones fueron sedados con Saffan administrado de manera intravenosa. Se introdujo un inoculo de bolo de 20 µl de B. catarrhalis vivo en PBS en los pulmones 5 como se describió para los refuerzos IT. Los ratones fueron matados mediante inyección intrapeptoneal de pentobarbital de sodio, ya sea 4 horas después de la infección o como se indica. La sangre fue obtenida mediante punción al corazón y se permitió que coagulara para la recolección del suero. La traquea fue expuesta a través del cuello y se obtuvo un lavado bronqueoalveolar (BAL) al instilar y recuperar 0.5 ml de PBS en los pulmones vía una cánula. Después de obtener el BAL, se cortaron los pulmones intactos, se colocaron en un volumen de 2 ml de PBS , y se homogeneizaron en un homogeneízador de tejido (9500 rpm ; Heidolph DIAX 600, Electro GmbH & Co, Kelheim , Alemania). El BAL y el homogeneizado de pulmón fueron valorados para clarificación bacteriana mediante platinado de diluciones seriales para determinación de CFU . El suero fue seprado por centrifugación a 4°C y 450 x g durante 10 min (Juoan BR3. 1 1 , St Nazaire, Francia) y se almacenó a -80°C.

Resultados Los ratones fueron inmunizados I PP y se reforzaron IT con proteína purificada. Los datos mostrados en la figura 4 muestran el porcentaje de clarificación intensificada de bacterias, ya sea en el lavado bronqueoalveolar (BAL) o el tejido de pu lmón , comparado con la recuperación bacteriana no inmune Una proteína con una masa molecular aparente de 71 kDa fue muy efectiva para intensificar la clarificación del BAL, pero la respuesta inmune a esta proteína fue menos efectiva en la clarificación del tejido de pulmón.

La respuesta inmune siguiendo la inmunización con una proteína con una masa molecular aparente de 44 kDa fue efectiva para clarificar la bacteria tanto del BAL como del tejido de pulmón. La inmunización con proteínas de 1 5 y 30 kDa mostró más de 50% de clarificación intensificada tanto en BAL como pulmón , mientras que una proteína de 14.5 kDa que mostró esto para la clarificación de BAL, no logró la misma protección en el pulmón. Una proteína de 14 kDa no fue efectiva para clarificar la bacteria en el BAL, pero fue capaz de una clarificación ligeramente intensificada del pulmón .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Cortees (UK) Limited Cripps, Alian W Kyd, Jennelle <120> Proteínas <130> PWC/P20695WO <140> PCT/GB99/01473 <141> 1999-05-11 <150> GB 9810084.5 <151> 1998-05-11 <160> 9 <170> Patente en liberación Ver.2.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 1 Ala lie Ser Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ala Gln Pro Tyr Val Gly Ala 1 5 10 15 Lys lie Gly Gln Val Asp Ala Lys Gln lie Asn Asn Lys Asn Thr 20 25 30 <210> 2 ¿¿íiMxy- <211> 31 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 2 5 Asn Val Val Thr Asn Thr Gly Ala Thr Val Val Asp Gly Thr Arg Thr 1 5 10 15 Me Phe Ser Thr Leu Val Lys Pro Ala Ala Val Val Ala Ala Val 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <220> <221> SITE <222> (19) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400>3 20 Thr Pro Thr Val Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Thr lie Asp Ala Asn Asn 1 5 10 15 Thr Asp Xaa Thr Tyr 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 4 Ala Gly Leu Asp Arg Ser Gly Gln Asp Val Thr Ala Ser Leu Gln Asp 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Ala 20 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 5 Gly Glu Leu Ser Ser Asn Leu Gln Asp Arg His Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 6 Ala Asp lie His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Ala lie Ala Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis 5 <400> 7 Asn Phe Glu Tyr Leu Lys 1 5 <210> 8 10 <211> 15 <212> PRT <213> Branhamella catarrhahs <400> 8 Phe Gly Glu Leu Ser Val Gly Asp Ser His Ser Val Phe Leu Gln 15 1 5 10 15 <210> 9 <211> 18 <212> PRT 20 <213> Branhamella catarrhalis <400> 9 Asp Ala Asp Val Thr Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Met 1 5 10 15 Gly Gly i?á¡j&^j^^*«¿?jjlgg^

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES 1 . U na proteína, la cual es un antígeno de B. catarrhalis y el cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14 hasta aproximadamente 35 kDa, como se determina por SDS-PAGE.
2. 2. Una proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14 kDa, como se determina por SDS-PAGE.
3. 3. Una proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 14.5 kDa , como se determina por SDS-PAGE.
4. 4. Una proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 1 5 kDa, como se determina por SDS-PAGE.
5. 5. U na proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 20 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal : AI SYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQI N N KNT.
6. 6. Una proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: NVVTNTGATVVDGTRTI FSTLVKPAAVVAAV.
7. 7. Una proteína como se reclama en la reivindicación 1 , la cual tiene una masa molecular aparente de aproximad amente 35 kDa, como se determina por SDS-PAGE, y que tiene la siguiente secuencia N-terminal: . .~ .i* ¿t ...: ly ^ * , ? ¿ Li . J-fan-?n TPTVYGKAFLTI DANNTDXTY.
8. 8. Un homólogo o derivado de una proteína como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. Uno o más fragmentos antigénicos de una proteína, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. 1 0. Una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste de una secuencia, la cual es: (i) una secuencia de DNA que codifica una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o sus equivalentes de RNA; (ii) una secuencia, la cual es complementaria a cualquiera de las secuencias de (i); (iii) una secuencia , la cual tiene identidad substancial con cualquiera de aq uéllos de (i) y (ii) ; (iv) una secuencia, la cual codifica un homólogo, derivado o fragmento de una proteína como se define en cualquiera de las reivind icaciones 1 a 7.
11. 1 1 . Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico, como se define en la reivindicación 1 0.
12. 1 2. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector como se define en la reivindicación 1 1 .
13. 1 3. Una composición inmunogénica, que comprende una o más proteínas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 , uno o más homólogos o derivados como se define en la reivindicación 8, o uno o más fragmentos antigénicos como se define en la reivindicación 9.
14. 14. Una composición inmunogénica como se reclama en la reivindicación 13, la cual es una vacuna.
15. 1 5. El uso de una o más proteínas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, o uno o más fragmentos antigénicos, como se define en la reivindicación 9 en ia preparación de una composición inmunogénica.
16. 1 6. El uso como se reclama en la reivindicación 1 5, en donde la composición inmunogénica es una composición de vacuna para la profilaxis o tratamiento de infección respiratoria.
17. 17. El uso como se reclama en la reivindicación 1 5, en donde la composición inmunogénica es una vacuna para la profilaxis o tratamiento de otitis media.
18. 1 8. U na composición de antígeno que comprende una o más proteínas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 , y/o uno o más homólogos o derivados como se define en la reivindicación 8, y/o uno o más fragmentos antigénicos como se define en la reivindicación 9, opcionalmente junto con al menos otro antígeno de B. catarrhalis, o fragmento del mismo.
19. 1 9. Un anticuerpo producido contra una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 , un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, o un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 9.
20. 20. Un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis, el cual comprende' a) llevar a contacto uno o más anticuerpos corno se define en la reivindicación 1 9, con una muestra a ser probada; y b) detectar la presencia de uno o más antígenos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
21. 21 . Un método para detectar y/o diagnosticar B. catarrhalis, el cual comprende: a) llevar a contacto una o más proteínas antigénicas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, uno o más homólogos o derivados como se define en la reivindicación 8, uno o más fragmentos antigénicos como se define en la reivindicación 9, o una composición de antígeno como se define en la reivindicación 1 8 con una muestra a ser probada; y b) detectar la presencia de anticuerpos para ß. catarrhalis.
22. 22. El uso de una proteína como se define en cualquiera de las reivind icaciones 1 a 7, un homólogo o derivado corno se define en la reivindicación 8, un fragmento como se define en la reivindicación 9, o una composición de antígeno como se define en la reivindicación 1 8, para detectar/diagnosticar ß. catarrhalis.
23. 23. Un conjunto para uso en detectar/diagnosticar ß. catarrhalis, que comprende al menos una proteína antigénica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, al menos un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, al menos un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 9, una composición de antígeno como se define en la reivindicación 1 8 o un anticuerpo como se define en la reivindicación 1 9.
24. 24. El uso de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, un fragmento como se define en la reivindicación 9 o una composición inmunogénica como se define en la re ivindicación 1 3, en medicina.
25. 25. El uso de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 9, o una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 1 3, para inducir una respuesta inmune en un sujeto.
26. 26. Un método para el tratamiento o profilaxis de infección respiratoria en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 , al menos un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, al menos un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 9, o una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 1 3.
27. 27. Un método para el tratamiento o profilaxis de otitis media en un sujeto, el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, al menos un homólogo o derivado como se define en la reivindicación 8, al menos un fragmento antigénico como se define en la reividicación 9, o una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 1 3.