ES2202361T3 - Vacuna para moraxella catarrhalis. - Google Patents
Vacuna para moraxella catarrhalis.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN COMPOSICIONES QUE INCLUYEN LA MEMBRANA EXTERIOR DE LA PROTEINA "E", Y PEPTIDOS Y POLIPEPTIDOS DE LA ANTERIOR, DE LA MORAXELLA CATARRHALIS. ADICIONALMENTE, SE MUESTRAN SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LA PROTEINA, EL PEPTIDO O EL POLIPETIDO, ASI COMO VECTORES RECOMBINANTES QUE CONTIENEN ESAS SECUENCIAS. LA PROTEINA, EL PEPTIDO O OLIGOPEPTIDO PUEDEN PRODUCIRSE A PARTIR DE LOS SISTEMAS CELULARES DEL RECEPTOR QUE CONTIENEN ESOS VECTORES RECOMBINANTES. LOS PEPTIDOS Y OLIGOPEPTIDOS PUEDEN TAMBIEN SINTETIZARSE QUIMICAMENTE. SE MUESTRAN LOS USOS DE LA PROTEINA, PEPTIDOS Y OLIGOPEPTIDOS, COMO ANTIGENOS PARA FORMULAS DE VACUNAS, Y COMO ANTIGENOS EN ENSAYOS INMUNOLOGICOS DE DIAGNOSTICO. LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS SON UTILES EN VECTORES DE CONSTRUCCION PARA USAR COMO VACUNAS, PARA INSERTARSE EN EL INTERIOR DE BACTERIAS ATENUADAS EN LA CONSTRUCCION DE UNA VACUNA BACTERIANA RECOMBINANTE Y PARA LA INSERCION DENTRO DE UN VECTOR VIRAL EN LA CONSTRUCCION DE UNA VACUNA VIRAL RECOMBINANTE. TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO DE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS RELACIONADAS CON EL GEN QUE CODIFICA E COMO IMPRIMADORES Y/O MUESTRAS EN LOS ENSAYOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA LA DETECCION DE M. CATARRHALIS.
Description
Vacuna para Moraxella Catarrhalis.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden una proteína, y péptidos y oligopéptidos de las
mismas, asociados con la membrana externa de Moraxella
catarrhalis (denominada previamente como Branhamella
catarrhalis). Más particularmente, la invención está dirigida a
composiciones de una proteína, péptidos, y oligopéptidos de la
misma, relacionados con una proteína de membrana externa, "E",
la cual es una proteína que se modifica al calor de M.
catarrhalis, que tiene una masa molecular aparente de
aproximadamente 35.000 daltons a 25ºC y alrededor de 50.000 daltons
cuando se calienta a 100ºC. También se describen métodos para
preparar E, péptidos de E, y oligopéptidos de E utilizando ADN
recombinante y/o técnicas bioquímicas. Relacionado con lo mismo, se
describe la secuencia de ADN que codifica E, y vectores útiles para
dirigir la expresión de E, péptidos de E, y oligopéptidos de E, y
las células hospedantes transformadas con dichos vectores.
Las proteínas, péptidos, y oligopéptidos, se
pueden utilizar como inmunógenos en formulaciones de vacunas para
inmunización activa; y se pueden utilizar para generar antisueros
específicos para proteínas y específicos para péptidos, útiles para
la inmunización pasiva, y como reactivos para análisis
diagnósticos. Las secuencias de nucleótidos descritas, proveen la
síntesis de oligonucleótidos correspondientes que se pueden
utilizar como reactivos en análisis de diagnósticos dirigidos a la
detección de material genético de M. catarrhalis.
Moraxella catarrhalis (también conocida
como una Branhamella catarrhalis) es un patógeno importante
del tracto respiratorio en humanos. M. catarrhalis es la
tercera causa más común de otitis media en infantes y niños, después
del Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae
no determinable, como es documentado en los estudios en los cuales
se ha utilizado timpanocentesis, para establecer el agente
etiológico (Murphy, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J.
8:S75-S77). M. catarrhalis es una causa
común de sinusitis y conjuntivitis tanto en niños como en adultos
(Véase por ejemplo, Bluestone, 1986, Drugs
31:A132-S141; Brorson y otros, 1976, Scand. J.
Infect. Dis. 8:151-155; y Romberger y otros,
1987, South. Med. J. 80:926-928); y es una
causa importante de infecciones del tracto respiratorio inferior en
adultos con bronquitis crónica y enfermedad pulmonar obstructiva
(Murphy y otros, 1992, Am. Rev. Respir. Dis.
146:1067-1083; Catlin, 1990, Clin. Microbiol.
Rev. 3:293-320). Adicionalmente M.
catarrhalis, puede causar neumonía, endocarditis, septicemia y
meningitis en huéspedes inmunocomprometidos (Cocchi y otros, 1968,
Acta Paediatr. Scand. 57:451-3; Douer y
otros, 1977, Ann. Intern. Med. 86:116-119;
McNeely y otros, 1976, Am. Rev. Respir. Dis.
114:399-402).
Dado que la otitis media recurrente está asociada
con la morbidez substancial, existe un interés para identificar las
estrategias para evitar estas infecciones. Uno de dichos enfoques es
el desarrollo de vacunas. Una vacuna efectiva para evitar la otitis
media bacteriana, podría necesitar incluir antígenos que podrían
generar protección contra la infección por S. pneumoniae,
H. influenzae no determinable y M. catarrhalis.
Además, el desarrollo de la vacuna para el neumococo y H.
influenzae no determinable, son progresivos de tal manera que
los antígenos potencialmente protectores han sido identificados y
actualmente están siendo sometidos a pruebas (Véase por ejemplo,
Murphy y otros, Patente de EE.UU. No. 5.173.294; y Vella y otros,
1992 Infect. Immun. 60:4977-4983). Dado que
estas vacunas se están desarrollando y utilizando más ampliamente,
la importancia relativa de M. catarrhalis como una causa de
otitis media, se incrementara en la siguiente década. Además de
infantes y niños que se bene-fician de una vacuna
para evitar la otitis media ocasionada por M. catarrhalis,
los adultos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y los niños
y adultos inmunocomprometidos podrían beneficiarse con una vacuna
para prevenir infecciones ocasionadas por M.
catarrhalis.
Los componentes bacterianos que han sido
investigados como antígenos de vacunas potenciales incluyen
polisacáridos, lipopolisacáridos o modificaciones de los mismos, y
las proteínas de membranas externas. En general, como se
ejemplifica por el polisacárido capsular de tipo b de H.
influenzae, se ha mostrado que los antígenos polisacáridos son
un inmunógeno pobre en niños menores a 18 meses de edad. La
inmunización activa con lipopolisacárido (LPS) no es aceptable
debido a su toxicidad inherente. Los efectos patofisiológicos de
LPS, pueden incluir fiebre, leucopenia, leucocitosis, la reacción de
Shwarzman, coagulación intravascular diseminada, y en grandes dosis,
choque y muerte. En general, las proteínas son inmunogénicas en
infantes de alrededor de tres meses de edad. Por lo tanto, las
membranas de proteínas externas están siendo investigadas como
antígenos de vacunas posibles.
Mientras que los estudios recientes han empezado
a enfocarse en las proteínas de membranas externas de M.
catarrhalis, se sabe poco acerca de la estructura antigénica y
molecular de estas proteínas. Los estudios de membranas externas
purificadas por electroforesis de gel de poliacrilamida de
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) han revelado un
patrón homogéneo entre las cepas de bacterias (Bartos y Murphy,
1988, J. Infect. Dis. 158:761-765). Se han
identificado ocho proteínas principales de membrana externa,
designadas por las letras A-H, (Murphy y otros,
1989, Microbial Pathogen. 6:159-174; Bartos y
otros, 1988, J. Infect. Dis. 158:761-765).
Los experimentos en los cuales fueron absorbidas 20 cepas de M.
catarrhalis con antisueros desarrollados contra la cepa 25240 de
M. catarrhalis, indican que la proteína E de la membrana
externa contiene determinantes conservados antigénicamente que son
expresados sobre la superficie bacteriana (Murphy y otros, 1989,
Infect. Immun. 57:2938-2941).
Por lo tanto, con el reconocimiento creciente de
M. catarrhalis, como un patógeno bacteriano importante,
existe la necesidad de una vacuna que sea inmunogénica en niños y
adultos. Dicha vacuna tendría que ser dirigida hacia un componente
bacteriano que tiene un epítopo expuesto a la superficie en
bacterias intactas, en donde el epítopo se conserva entre las cepas
de M. catarrhalis.
La presente invención se dirige a una proteína,
péptidos y oligopéptidos relacionados con una proteína de membrana
externa que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente
35.000 daltons a aproximadamente 50.000 daltons de M.
catarrhalis, en donde la proteína perece ser una proteína
modificable al calor, dando como resultado diferencias en la
migración en geles de SDS, dependiendo de la temperatura de
procesamiento de la muestra. La proteína E, y péptidos de la misma
(también denominados aquí "péptidos de E" u "oligopéptidos de
E"), de la presente invención, se pueden utilizar como
inmunógenos en formulaciones de vacunas profilácticas y/o
terapéuticas; o como un antígeno en inmunoanálisis diagnósticos
dirigidos a la detección de infección por M. catarrhalis,
midiendo un incremento en la titulación de suero de anticuerpo
específico para M. catarrhalis. También, la proteína E,
péptidos de E y oligopéptidos de E de la presente invención, se
pueden utilizar para generar anticuerpos específicos para E que
pueden ser útiles para la inmunización pasiva y como reactivos para
análisis de diagnóstico dirigidos a la detección de la presencia de
M. catarrhalis en muestras clínicas. Los péptidos de E u
oligopéptidos de E, se pueden obtener mediante síntesis química;
purificación de M. catarrhalis; o se pueden producir de
sistemas de expresión de vector recombinante utilizando las
secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente
memoria.
Una realización de la presente invención, se
dirige a la construcción de secuencias de ADN y vectores novedosos
incluyendo ADN de plásmidos, y ADN viral tales como virus de seres
humanos, virus de animales, virus de insectos, o bacteriófagos que
se pueden utilizar para dirigir la expresión de la proteína E,
péptidos de E, u oligopéptidos de E en células hospedantes
apropiadas, a partir de las cuales se pueden purificar las proteínas
o péptidos expresados.
Otra realización de la presente invención, provee
métodos para clonación molecular del gen que codifica E, y provee
composiciones que comprenden oligonucleótidos dentro de la secuencia
de genes que codifican E. Las secuencias de ácidos nucleicos de la
presente invención, se pueden utilizar en análisis de diagnóstico
moleculares para material genético de M. catarrhalis a través
de hibridación de ácidos nucleicos, e incluyendo la síntesis de
oligonucleótidos específicos para la secuencia de E, para utilizarse
como iniciadores y/o sondas en la amplificación, y la detección de
ácidos nucleicos amplificados.
Adicionalmente, la proteína E, péptidos de E y
oligopéptidos de E, se pueden utilizar como inmunógenos en
formulaciones de vacunas profilácticas y/o terapéuticas contra
cepas patogénicas de M. catarrhalis, ya sea que el inmunógeno
sea sintetizado químicamente, purificado de M. catarrhalis, o
purificado de un sistema de vector de expresión recombinante.
Alternativamente, el gen que codifica E o uno o más fragmentos de
genes que codifican péptidos de E u oligopéptidos de E, se pueden
incorporar en una vacuna bacteriana o viral que comprende bacterias
o virus recombinantes que son diseñados para producir uno o más
epítopos inmunogénicos de E por sí mismos, o en combinación con los
epítopos inmunogénicos de otros microorganismos patogénicos.
Además, el gen que codifica E o uno o más
fragmentos de genes que codifican péptidos de E u oligopéptidos de
E, unidos operativamente a uno o más elementos reguladores, se
pueden introducir directamente en seres humanos para expresar la
proteína E, péptido de E, u oligopéptidos de E para producir una
respuesta inmunoprotectora.
La Figura 1, es un perfil de hidrofobicidad de
Kay-Doolittle de la proteína E de membrana externa
de M. catarrhalis como se determinó utilizando la secuencia
de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del gen que
codifica E. Los valores positivos representan regiones hidrofobias y
los valores negativos representan regiones hidrofílicas.
La Figura 2, representa geles de poliacrilamida
teñidos con bromuro de etidio y que contienen producto amplificado
de los genomas de diferentes cepas de M. catarrhalis después
de la digestión con varias enzimas de restricción. La línea 1
representa tamaños normales de ADN, y las líneas
2-20 son productos amplificados de las cepas
enumeradas en la Tabla 1, respectivamente.
La Figura 2A, es un gel que muestra los productos
amplificados restringidos con Sau96 l.
La Figura 2B, es un gel que muestra los productos
amplificados restringidos con Bs1 l.
La presente invención está dirigida a
composiciones de una proteína de membrana bacteriana externa, y los
péptidos de la misma, de M. catarrhalis en donde la proteína
ha sido designada "E". El patrón de la migración de
SDS-PAGE de la proteína E es característica de una
proteína que se modifica al calor. Es decir, el patrón de migración
depende de la temperatura de procesamiento de la muestra anterior.
Por lo tanto, si la muestra que contiene la proteína E se calienta a
25ºC antes de SDS-PAGE, la masa molecular aparente
es de aproximadamente 35.000 daltons y si la muestra se calienta a
100ºC, la masa molecular aparente es de aproximadamente 50.000
daltons. Como se indica por la secuencia de nucleótidos de la
presente invención (SEQ ID NO:11), el gen que codifica E revela que
la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína E madura, tiene
una masa molecular calculada de aproximadamente 47.030 daltons. La
proteína E, péptidos de E y oligopéptidos de E de la presente
invención, se puede producir utilizando métodos de ADN recombinante
como se ilustra en la presente, o se puede sintetizar químicamente a
partir de la secuencia de aminoácidos descritos en la presente
invención. Adicionalmente, los péptidos se pueden producir de la
división enzimática o química de la proteína madura. La proteína E,
péptidos de E y oligopéptidos de E con epítopo(s)
inmunogénico(s), se pueden utilizar como inmunógenos en
varias formulaciones de vacunas para la prevención de otitis media,
sinusitis, conjuntivitis, e infecciones del tracto respiratorio
inferior ocasionadas por M. catarrhalis. Adicionalmente, de
acuerdo con la presente invención, la proteína E, péptidos de E y
oligopéptidos de E producidos, se pueden utilizar para generar
antisuero específico contra M. catarrhalis, útiles para
inmunización pasiva contra infecciones ocasionadas por M.
catarrhalis.
La presente invención proporciona además la
secuencia de nucleótidos del gen que codifica E, así como la
secuencia de aminoácidos deducida del gen aislado. De acuerdo con
una realización de la presente invención, el uso de técnicas de ADN
recombinante, el gen que codifica E, o fragmentos de genes que
codifican uno o más péptidos de E que tienen epítopo(s)
inmunogénico(s), se incorpora en un vector de expresión, y el
vector recombinante se introduce en una célula hospedante apropiada
por lo que dirige la expresión de estas secuencias en la célula
hospedante particular. El sistema de expresión, que comprende el
vector recombinante introducido en la célula hospedante, se puede
utilizar (a) para producir proteína E, péptidos de E, u
oligopéptidos de E, que se pueden purificar para utilizarse como un
inmunógeno en formulaciones de vacunas; b) para producir proteína E,
péptidos de E, u oligopéptidos de E para ser utilizados como un
antígeno para inmunoanálisis de diagnóstico o para generar
antisueros específicos para M. catarrhalis de valor
terapéutico y/o diagnóstico; c) o si el vector de expresión
recombinante es un virus vivo tal como el virus de vaccinia, el
vector por sí mismo, se puede utilizar como una preparación de
vacuna viva o inactivada para ser introducido en las células
hospedantes para la expresión de E o péptidos de E u oligopéptidos
de inmunogénicos; d) o si el vector de expresión recombinante se
introduce en células de bacterias vivas atenuadas que se utilizan
para expresar la proteína E, péptidos de E u oligopéptidos de E
para vacunar individuos; e) o ser introducidas directamente en un
individuo para inmunizarse contra la proteína E codificada y
expresada, péptido de E u oligopéptido de E.
Para los fines de la descripción, los métodos y
compuestos de la presente invención serán ilustrados en las
siguientes realizaciones:
Realización A - Clonación y secuenciación
molecular del gen que codifica E, y vectores que expresa epítopos
específicos para E;
Realización B - Conservación del gen que codifica
E entre cepas de M. catarrhalis;
Realización C - Métodos para utilizar secuencias
de nucleótidos específicos para E en análisis de diagnóstico
molecular para la detección de M. catarrhalis;
Realización D - Métodos para preparar y utilizar
E, péptidos de E, y oligopéptidos de E, en inmunoanálisis de
diagnóstico;
Realización E - Métodos y compuestos para
formulaciones de vacunas relacionadas con E, péptidos de E, y
oligopéptidos de E.
Realización
A
La clonación y secuenciación molecular del gen
que codifica E, y vectores que expresan apítopos específicos para
E.
La estrategia utilizada fue aislar ADN genómico
de M. catarrhalis, dividir el ADN aislado en fragmentos,
construir un banco genómico que comprende insertar los fragmentos en
un vector de expresión, introducir los vectores recombinantes en la
célula hospedante apropiada, y escrutar clones de células hospedante
que contienen el gen que codifica E mediante hibridación por filtro
con una familia de oligonucleótidos marcados, degenerados, que
corresponden a la secuencia del amino terminal de la proteína E. Los
oligonucleótidos sintetizados fueron escrutados previamente por
mancha de Southern en cuanto a ADN de M. catarrhalis, y E.
coli como un control, para determinar qué oligonucleótidos
degenerados se hibridaban fuertemente al ADN de M.
catarrhalis.
La cepa 25240 de Moraxella catarrhalis,
obtenida de la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") se
utilizó como la fuente de ADN genómico bacteriano. M.
catarrhalis se desarrolló en placas de agar de chocolate a 37ºC
en CO2 al 5% o el caldo de infusión de cerebro y corazón. La
Escherichia coli (E. coli) LE392, fue utilizada como
la cepa hospedante para el banco genómico lambda de bacteriófagos
(EMBL-3). Dependiendo de las circunstancias, E.
coli fue desarrollada en caldo de triptona suplementado con la
maltosa al 0,2% y 10 mN MgSO_{4}; o para escrutar, en placas de
agar de NZCYM conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina.
Un banco genómico de EMBL3, se construyó con ADN
genómico de M. catarrhalis 25240 utilizando métodos descritos
previamente (Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in
Molecular Biology, publicado por John Wiley and Sons). El ADN
genómico de la cepa 25240 de M. catarrhalis, se purificó
utilizando extracción con detergente, y tratamiento con proteinasa.
El ADN genómico purificado, se digirió después parcialmente con la
enzima de restricción Sau 3A para generar fragmentos que varían en
tamaño. Los fragmentos de ADN fueron separados por centrifugación de
gradientes de sacarosa sobre un gradiente de sacarosa del 10% al
40%. Las fracciones que contienen fragmentos de aproximadamente 9 a
23 kilobases (kb) en tamaño, fueron recopiladas, desfosforiladas
utilizando fosfatasa intestinal de ternera, y subsecuentemente
ligada a brazos de fagos y después empaquetadas en fagos. Una
porción del banco EMBL-3 resultante, se sembró en
placas de NZCYM con E. coli LE392 como la cepa
hospedante.
Las placas fueron transferidas a discos de filtro
de nitrocelulosa y escrutadas por hibridación con una familia de
oligonucleótidos radiomarcados degenerados (ejemplos representativos
descritos en SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:8) que corresponden a la
secuencia de amino terminal de la proteína E de la membrana externa.
Se escrutaron un total de aproximadamente 8100 placas y se
identificaron seis clones positivos. Se recogieron las placas
positivas iniciales, se eluyeron en solución reguladora de pH, y
después se purificaron para sembrar en placas a baja densidad y se
volvieron a escrutar con los mismos oligonucléotidos hasta que
fueron positivas todas las placas de un
re-escrutinio. Los lisados líquidos de los clones
positivos, se utilizaron para aislar el ADN lambda que contiene el
inserto. El ADN lambda aislado se digirió después con Sa1 I y se
sometieron a electroforesis los productos de la digestión en geles
de agarosa para confirmar la presencia de insertos. Los tamaños de
insertos de los clones positivos, estuvieron entre 12 kilobases (kb)
y 17 kb. El clon que contiene el inserto de 12 kb se utilizó para
localizar el gen que codifica E contenido dentro del inserto. El ADN
del clon, se cortó con Sa1 I y el inserto de 12 kb se electroeluyó a
partir de porciones de gel y se restringió con una o más de varias
enzimas diferentes (Nde I, Nco I, Hind III,
Sac I, Eco RI, y Nde I y Nco I). Los
productos de la digestión se sometieron a electroforesis en geles de
agarosa, y los fragmentos se analizaron por mancha de Southern con
las sondas de oligonucleótidos.
Un fragmento de Nde I - Sal I de 4,4 kb y
un fragmento de Eco I - Sal I de 1,9, se seleccionaron
y manipularon para subclonarlos en cualesquiera de los plásmidos
PET22b+ o pGEM5zf^{-} para facilitar la secuenciación subsecuente.
Después de intentos repetidos sin éxito para transformar E.
coli con los plásmidos recombinantes, y a pesar del éxito con
ADN de control y controles de transformación, se concluyó que los
fragmentos que contienen el gen que codifica E, o que contiene
porciones del mismo, fueron tóxicos para la E. coli. Por lo
tanto, se tomó un enfoque alternativo para determinar la secuencia
de nucleótidos. Las secuencias de los extremos del fragmento de 1,9
kb, fueron determinadas mediante el método de
Maxam-Gilbert. El fragmento de 1,9 kb se digirió con
Hind III y se purificaron dos fragmentos, un fragmento de 1,1
kb y un fragmento de 0,8 kb. Estos fragmentos fueron marcados y
después secuenciados utilizando el método de
Maxam-Gilbert (1977, Proc. Natl. Acad. Sci.
US 74:560-564). A partir de este análisis de
secuencias, se sintetizaron dos oligonucleótidos adicionales (SEQ ID
NO:9 y SEQ ID NO:10).
Dos iniciadores (SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:10) se
seleccionaron para amplificar un fragmento del inserto de ADN, del
clon que tiene el inserto de 12 kb, utilizando la reacción en cadena
de la polimerasa. Las reacciones fueron llevadas a cabo en un
volumen de 50 \mul con 0,25 \mug de iniciadores y 1,5 mM dNTP.
Se realizó la predesnaturalización a 95ºC durante 3 minutos. La
desnaturalización se realizó a 96ºC durante 15 segundos,
recalentando a 62ºC durante 1 minuto y polimerizando a 74ºC durante
1 minuto, durante 15 ciclos en presencia de MgSO_{4} 3 mM. El
resultado de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando estos
dos iniciadores, fue un producto amplificado de 0,8 kb. El producto
amplificado de 0,8 kb se purificó por electroforesis de gel de
agarosa y electroelución, y después se subclonó en el sitio de Eco
RI de M13mp8. Se preparó ADN M13 de una sola cadena, a partir del
recombinante para determinar la secuencia de nucleótidos del
producto de 0,8 kb mediante el método de terminación de cadena con
didesoxi. La porción restante del gen que codifica E, se secuenció
directamente a partir del inserto de 12 kb del clon lambda
utilizando oligonucleótidos adicionales sintetizados para
corresponder a la región del gen que codifica E.
De la secuencia completa de nucleótidos (SEQ ID
NO:11), el gen que codifica E se define como un marco de lectura
abierto de 1377 pares de base (codificando 459 aminoácidos)
iniciando con el codón en la posición 154 y finalizando con TAA en
la posición 1531. Un ribosoma potencial que se une al sitio GGAGA,
se localizó cinco bases corriente arriba del codón de iniciación de
traducción de ATG. Treinta bases corriente abajo del codón de parada
de TAA, estaba la secuencia ATAAAAAATAGCTTGAATTTCAAGCTATTTTTTAT, un
palindrome que podía formar una estructura del bucle de soporte que
sirve potencialmente como un terminador de transcripción. El
contenido global de guanina y citosina (G+C) del gen que codifica E,
es 43,4% el cual es similar al contenido de G+C reportado de 41%
para el genoma de M. catarrhalis (Catlin, 1990, Clin.
Microbiol. Rev. 3:293-320).
La secuencia de aminoácidos, deducida del marco
de lectura abierto, definió E como una proteína de una masa
molecular calculada de 49.334 daltons. La secuencia de aminoácidos
deducida para E, sugirió la presencia de un péptido de señalamiento
con un sitio probable de escisión entre los aminoácidos 25 (Ala) y
26 (Ala). Los primeros 24 aminoácidos del sitio de escisión
putativo, de la secuencia de aminoácidos deducida del marco de
lectura abierto, corresponde precisamente a la secuencia de proteína
N-terminal determinada de la proteína E de membrana
externa purificada. Estas observaciones confirman además que el gen
codifica E, y que E se sintetiza como un precursor que tiene un
péptido de señalamiento compuesto de 25 residuos de aminoácidos. Un
perfil de hidrofobicidad de la secuencia de aminoácido deducida
(Fig. 1), mostró una porción hidrofóbica fuerte que corresponde al
péptido de señalamiento. Los determinantes antigénicos predichos
corresponden a las regiones hidrofílicas indicadas en la Figura 1.
Esos determinantes antigénicos incluyen los aminoácidos 369 a 374;
29 a 34; y 294 a 299. La masa molecular predicha de la proteína
madura es de 47.030 daltons, que se correlaciona bien con la
migración de la proteína E de membrana externa en
SDS-PAGE de muestras que contienen M.
catarrhalis. El análisis de la composición de aminoácidos de E,
indicó que la alanina, glicina, leucina y valina, son más abundantes
(escala 13%-18%) y que no están presentes residuos de cisteína.
Para determinar el sitio de iniciación
transcripcional del gen que codifica E, se llevó a cabo el análisis
de extensión del iniciador utilizando dos iniciadores diferentes
específicos para E (SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13) hibridando a la
región 5' del ARN mensajero correspondiente. El ARN total se extrajo
mediante el método de tiocianato de guanidina de la cepa 25240 de
M. catarrhalis. Los iniciadores específicos para E, fueron
extremos de 5' marcados con [^{32}P]ATP. Para la extensión
del iniciador, se recalentaron 50 \mug del ARN total con 100
fmoles de los iniciadores marcados y se incubaron a 55ºC durante 45
minutos. Esto fue seguido por la extensión con transcriptasa inversa
en presencia de trifosfatos de desoxirribonucleósido durante una
hora a 42ºC. El producto de extensión del iniciador, se analizó en
un gel de secuenciación de acrilamida de urea al 8%. Las reacciones
de secuenciación de nucleótidos de didesoxi que generan una escalera
de secuencias y se inician con los mismos iniciadores, también se
sometieron a electroforesis en pistas adyacentes para evaluar la
base exacta para la iniciación de la transcripción correspondiente a
E. Los resultados indican que la transcripción empieza con un
residuo de guanina en la posición 75, la cual está 78 bases
corriente arriba del codón de ATG. El TAAGAT de potencial -10 a la
caja de "Pribnow" (posición de nucleótido
63-68) se localizó seis bases corriente arriba del
sitio de iniciación +1 de la transcripción. El TTGTT -35 (posición
40-45) se localizó diecisiete bases corriente arriba
de la secuencia -10. Dos regiones de simetría de pares unidos con
guiones, 5'-TTAATTTCATTTAA-3' y
5'-TACAAATGTGTAAGACTTTTGTA-3', se
identificaron corriente abajo de la región -35 que puede jugar un
papel en la regulación de expresión del gen que codifica E.
Basado en la secuencia de nucleótidos del gen que
codifica E, se sintetizaron tres series de iniciadores de
oligonucleótidos, y se utilizaron para amplificar porciones del gen,
mediante reacción en cadena de polimerasa, para subclonar y analizar
la expresión. Dos iniciadores (SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15) se
utilizaron para amplificar 1.573 kb del gen, conteniendo el
fragmento amplificado el gen completo y la región del promotor. Otro
grupo de iniciadores (SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17) fueron utilizados
para amplificar 1.391 kb del gen que contenía la secuencia que
codifica el péptido líder junto con el resto del gen. Un tercer
grupo de iniciadores (SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18) se utilizaron
para amplificar 1.313 kb del gen que codifica a partir del primer
aminoácido de la proteína madura al final del caboxi terminal. Los
tres productos amplificados, de 1.573 kb, 1.391 kb y 1.313 kb
fueron subclonados por separado en un vector, fagémido
pCR-Script SK^{+}, y se transformaron en E.
coli utilizando protocolos normales. No tuvieron éxito los
intentos de transformación con el plásmido recombinante que contenía
el fragmento 1.573 kb, sugiriendo, de nuevo, que la expresión de la
proteína E de M. catarrhalis en E. coli es tóxica para
la bacteria transformada. Se identificó que los transformantes
contenían plásmidos recombinantes con el inserto de 1.391 kb (todo
el marco de lectura abierto sin el promotor) y el inserto de 1.313
kb (secuencia que codifica la proteína madura). La confirmación de
los insertos, secuenciando los extremos de los insertos, indicó que
todos los clones identificados contenían las secuencias de genes en
la orientación equivocada para la expresión de la proteína mediante
el promotor de plásmido; además existe la evidencia de que la
expresión de la proteína E es tóxica para E. coli.
Por lo tanto, esta realización ilustra que las
secuencias de nucleótidos que codifican E o porciones de la misma
se pueden insertar en varios vectores incluyendo vectores de fagos y
plásmidos. La expresión exitosa de la proteína y los péptidos de la
proteína E, requiere que cualquiera de los insertos que comprenden
el gen o fragmento del gen que codifica epítopos de proteína E, o el
vector mismo, contenga los elementos necesarios para la
transcripción y traducción, los cuales son compatibles con, y
reconocidos por, el sistema de hospedante particular utilizado para
la expresión. El ADN que codifica la proteína E, péptidos de E, u
oligopéptidos de E, se pueden sintetizar o aislar y secuenciar
utilizando los métodos y secuencias de iniciadores como se ilustra
de acuerdo con las realizaciones A, B y E en la presente memoria.
Una variedad de sistemas de hospedantes, se puede utilizar para
expresar la proteína E, los péptidos de E, u oligopéptidos de E, los
cuales incluyen, pero no están limitados a, las bacterias
transformadas con un vector de bacteriófagos, vector de plásmidos, o
ADN de cósmido; levaduras que contienen vectores de levaduras;
hongos que contienen vectores fúngicos; líneas celulares de insectos
infectadas con virus (v.gr., baculovirus); y líneas celulares de
mamíferos transfectadas con plásmidos o vectores de expresión
viral, o infectadas con virus recombinantes (v.gr., virus vaccinia,
adenovirus, adenovirus asociado, retrovirus, etc.).
Utilizando métodos conocidos en la técnica de
biología molecular, incluyendo métodos descritos antes, se pueden
incorporar varios promotores e incrementadores en el vector o la
secuencia de ADN que codifica secuencias de aminoácidos de E, es
decir, proteína E de membrana externa recombinante, péptido de E u
oligopéptidos de E, para incrementar la expresión de secuencia de
aminoácidos de E a condición de que la expresión incrementada de las
secuencias de aminoácidos E sea compatible con (por ejemplo, no
tóxica hacia) el sistema celular hospedante particular utilizado.
Por lo tanto, y de manera importante, la secuencia de ADN puede
consistir del gen que codifica la proteína E, o cualquier segmento
del gen que codifica un epítopo funcional de la proteína E. Además,
el ADN puede ser fusionado a ADN que codifica otros antígenos, tales
como otras proteínas bacterianas de membrana externa, u otros
antígenos bacterianos, fúngicos, parasíticos, o virales, para crear
un antígeno multivalente fusionado genéticamente (que comparte una
cadena principal común de péptidos) para utilizarse como una
composición de vacuna mejorada.
La selección del promotor dependerá del sistema
de expresión utilizado. Los promotores varían en resistencia, es
decir, capacidad de facilitar la transcripción. Generalmente, para
el propósito de expresar un gen clonado, es conveniente utilizar un
promotor fuerte con el fin de obtener un alto nivel de transcripción
del gen y expresión en el producto del gen. Por ejemplo, los
promotores bacterianos, de fagos, o plásmidos conocidos en la
técnica a partir de los cuales se ha observado un alto nivel de
transcripción en un sistema de células hospedantes que comprenden
E. coli, incluyen el promotor de lac, promotor de trp,
promotor de recA, promotor de ARN ribosomal, los promotores de
P_{R} y P_{L}, lacUV5, cmpF, bla, Ipo, y similares. se pueden
utilizar para proveer la transcripción de la secuencia de ADN
insertado que codifica las secuencias de aminoácidos de E.
Adicionalmente, si la proteína E, péptidos de E,
u oligopéptidos de E pueden ser letales o dañinos para las células
hospedantes, la línea/cepa de células hospedantes y vectores de
expresión pueden ser elegidos de tal forma que la acción del
promotor sea inhibida hasta que sea inducida específicamente. Por
ejemplo, en ciertos operones, la adición de inductores específicos
es necesaria para la transcripción eficiente del ADN insertado
(v.gr., el operón de lac es inducido por la adición de la lactosa o
isopropiltio-beta-D-galactósido).
Una variedad de operones tales como el operón de trp están bajo
diferentes mecanismos de control. El operón de trp es inducido
cuando el triptófano está ausente en el medio de crecimiento. El
promotor de P_{L} se puede inducir mediante un incremento en la
temperatura de las células hospedantes que contienen un represor
lambda sensible a la temperatura. En esta forma, se puede inhibir la
transcripción dirigida por el promotor en más del 95% en las células
no inducidas. Por lo tanto, la expresión de E recombinante, péptidos
de E, u oligopéptidos de E, se puede controlar mediante el cultivo
de células transformadas o transfectadas bajo condiciones tales que
no se induce el promotor que controla la expresión del ADN
insertado que codifica aminoácidos de E, y cuando las células
alcanzan una densidad adecuada en el medio de crecimiento, el
promotor se puede inducir para la expresión del ADN insertado.
Otros elementos de control para la transcripción
eficiente del gen o la traducción de mensaje, incluyen
incrementadores y señales reguladoras. Las secuencias
incrementadoras son elementos de ADN que parecen incrementar la
eficiencia transcripcional en una forma relativamente independiente
de su posición y orientación con respecto a un gen cercano. Por lo
tanto, dependiendo del sistema del vector de expresión de las
células hospedantes utilizado, se puede colocar un incrementador ya
sea corriente arriba o corriente abajo de las secuencias de ADN
insertadas que codifican aminoácidos de E para incrementar la
eficiencia transcripcional. Como se ilustró previamente en esta
realización, se han identificado otras secuencias reguladoras
específicas las cuales pueden afectar la expresión del gen que
codifica E. Estos u otros sitios reguladores, tales como señales de
iniciación de transcripción o traducción, se pueden utilizar para
regular la expresión del gen que codifica E, o fragmento del gen de
los mismos. Dichos elementos reguladores se pueden insertar en
secuencias de ADN que codifican aminoácidos de E o secuencias de ADN
de vectores cercanos utilizando métodos de ADN recombinante
descritos en la presente memoria para la inserción de secuencias de
ADN.
Consecuentemente, las secuencias de nucleótidos
de M. catarrhalis que contienen regiones que codifican para
E, péptidos de E, u oligopéptidos de E, se pueden ligar en un vector
de expresión en un sitio específico en relación con el promotor,
control, y elementos reguladores de vectores de tal forma que cuando
se introduce en la célula hospedante, las secuencias de ADN
específicos para E de M. catarrhalis, se pueden expresar en
la célula hospedante. Por ejemplo, las secuencias de ADN específico
para E que contienen sus propios elementos reguladores, se pueden
ligar en un vector de expresión en una relación u orientación para
el promotor del vector y elementos de control los cuales permitirán
la expresión de las secuencias de aminoácidos de E. El vector
recombinante se introduce después en las células hospedantes
apropiadas, y las células hospedantes son seleccionadas, y
escrutinizadas en cuanto a las células que contienen el vector
recombinante. La selección y escrutinio pueden ser logrados mediante
métodos conocidos en la técnica que incluyen la detección de la
expresión de un gen marcador (v.gr., marcador de resistencia al
fármaco) presentes en el plásmido, el inmunoescrutinio para la
producción de los epítopos específicos para E que utilizan
antisueros generados para los epítopos específicos para E, y sondear
el ADN de las células hospedantes para las secuencias de nucleótidos
específicos para E utilizando uno o más oligonucleótidos y métodos
descritos de acuerdo con la realización C de la presente
memoria.
Las técnicas de ingeniería genética, también se
pueden utilizar para caracterizar, modificar y/o adaptar los
péptidos de E o proteínas de E codificados. Por ejemplo, la
mutagénesis dirigida al sitio para modificar un fragmento de
proteína de membrana externa en regiones fuera de los dominios
protectores, puede ser deseable para incrementar la solubilidad del
subfragmento para permitir una purificación más fácil. Además, las
técnicas de ingeniería genética se pueden utilizar para generar
secuencias de ADN que codifican una porción de la secuencia de
aminoácidos de E. Por ejemplo, a partir de la secuencia descrita
como SEQ ID NO:11, se puede determinar cuál enzima de restricción o
combinación de enzimas de restricción se pueden utilizar para
generar secuencias que codifican péptidos de E u oligopéptidos de E.
La selección de enzimas de restricción se puede hacer de tal manera
que no destruya la inmunopotencia del péptido u oligopéptido
resultantes. Los sitios antigénicos de una proteína, pueden variar
en tamaño pero pueden consistir de aproximadamente 7 a
aproximadamente 14 aminoácidos. Por lo tanto, una proteína del
tamaño de E, puede contener muchos sitios antigénicos discretos; por
lo tanto, varias secuencias de genes parciales, podrían codificar
epítopos antigénicos de E. Consecuentemente, utilizando la Figura 1
y la SEQ ID NO:11 como guías, se pueden utilizar combinaciones de
enzimas de restricción para generar secuencias de AD, las cuales,
cuando se inserta en el vector apropiado, son capaces de dirigir la
producción de secuencias de aminoácidos específicos para E (péptidos
u oligopéptidos) que comprenden diferentes epítopos antigénicos.
Realización
B
Los estudios previos, utilizando experimentos de
adsorción de anticuerpos, demostraron que uno o más de los
determinantes expuestos a la superficie de M. catarrhalis,
fueron conservados antigénicamente entre la mayoría de las cepas
(Murphy y otros, 1989, supra). Sin embargo, estos estudios no
se dirigen a la conservación del gen que codifica E entre las
cepas. Para que las secuencias de nucleótidos de la presente
invención, sean útiles en análisis de diagnósticos, el gen que
codifica E, debe ser conservado altamente entre las cepas de M.
catarrhalis. Además, un gen altamente conservado, indica que la
secuencia de proteínas también es altamente conservada. Para que una
proteína o péptido bacterianos sea útil como un antígeno en
formulaciones de vacunas contra la infección ocasionada por M.
catarrhalis, la proteína o péptido deben contener epítopos que
son tanto inmunogénicos como conservados entre las cepas de M.
catarrhalis. Para determinar el grado de conservación del gen
que codifica E entre las cepas de M. catarrhalis, el ADN
genómico se purificó y analizó a partir de 19 aislados recuperados
de diversas fuentes clínicas y geográficas. Primero, las secuencias
de genes específicos para E del ADN purificado de los aislados,
fueron amplificadas utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa e iniciadores (SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17). El análisis
de los productos amplificados, por electroforesis de gel de agarosa
mostraron que el gen que codifica E fue del mismo tamaño
(aproximadamente 1,4 kb) en todas las cepas probadas.
Adicionalmente, se analizaron los polimorfismos de longitud del
fragmento de restricción, restringiendo los productos amplificados
en fragmentos utilizando ya sea Hind III, Sau96 I,
Bs1 I o Bsg I, y visualizando los fragmentos mediante
electroforesis sobre un gel de acrilamida al 6% teñido con bromuro
de etidio. El patrón de bandas de los productos amplificados, no
mostraron variación entre las cepas probadas con respecto a la
presencia de los sitios de restricción y diferencias mínimas en el
tamaño observado de los fragmentos (como se ilustra en la Figura 2A
para Sau96 I, y la Figura 2B para Bs1 I). De las
cuatro enzimas diferentes, utilizadas en la restricción de los
productos amplificados, tres de las enzimas se cortan en tres sitios
diferentes dentro de los productos amplificados, y uno se corta en
dos sitios diferentes. Por lo tanto, los resultados similares en
todas las cepas, indican que las secuencias reconocidas en los once
sitios, son idénticas entre las cepas probadas. Las cepas enumeradas
en la Tabla 1, son las cepas probadas para los polimorfismos de la
longitud de fragmentos de restricción, en el mismo orden en el que
aparecen sobre los geles (mostrados en la Figura 2A y Figura 2B,
empezando con la pista 2). Pueden existir diferencias en los
patrones de restricción entre las cepas diferentes, pero no se
vieron diferencias con estas enzimas de restricción particulares
probadas.
| Designación de la cepa | Fuentes clínicas |
| Tal 2 | seno |
| 58 | esputo |
| 3584 | fluido del oído medio |
| 9483 | fluido del oído medio |
| 45 | esputo |
| 690 | esputo |
| 621 | esputo |
| 56 | esputo |
| 1 | aspiración transtraqueal |
| 42 | esputo |
| 931 | esputo |
| 701 | esputo |
| 14 | esputo |
| 135 | fluido del oído medio |
| 7221 | fluido del oído medio |
| 585 | sangre |
| 555 | fluido del oído medio |
| 25240 | aislado de ATCC |
| 5191 | fluido del oído medio |
\newpage
Estos hallazgos indican que el gen que codifica
E, se conserva altamente entre las cepas de M. catarrhalis, y
por lo tanto las secuencias de nucleótidos descritas en la presente
memoria, tienen aplicaciones para uso de diagnóstico y vacunas.
Realización
C
Debido a la conservación del gen que codifica E,
como se describió en la Realización B, las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención se pueden utilizar en análisis
de diagnósticos moleculares para detectar material genético de
M. catarrhalis. En particular, y como se ilustra por la SEQ
ID NO:1 - SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:12 - SEQ ID NO:18, los
oligonucleótidos específicos para la secuencia de E, pueden ser
sintetizados para usarse como iniciadores y/o sondas para amplificar
y detectar ácidos nucleicos amplificados de M. catarrhalis.
Los avances recientes en biología molecular, han provisto varios
medios para amplificar enzimáticamente secuencias de ácidos
nucleicos. Actualmente, el método más comúnmente utilizado, PCR™
(reacción en cadena de la polimerasa, Cetus Corporation) implica el
uso de una Polimerasa de ADN termoestable, secuencias conocidas como
iniciadores y ciclos de calentamiento que separan las cadenas de
ácido desoxirribonucleico (ADN) de replicación, y amplifican
exponencialmente un gen de interés. Otros métodos de amplificación
actualmente bajo desarrollo, incluyen LCR™ (reacción en cadena de la
ligasa, BioTechnica International) la cual utiliza ligasa de ADN, y
una sonda que consiste de dos mitades de un segmento de ADN que es
complementaria a la secuencia del ADN que va a ser amplificada;
replicasa de la enzima QB (Gene-Trak Systems) y un
molde de secuencias de ácido ribonucleico (ARN) unido a una sonda de
ARN complementario; y NASBA™ (amplificación basada en secuencias
de ácidos nucleicos, Cangene Corporation) que puede ser realizada en
ARN o ADN como la secuencia de ácido nucleico que va a ser
amplificada.
Las sondas de ácido nucleico que son capaces de
hibridación con secuencias de genes específicos, han sido
utilizadas con éxito para detectar patógenos específicos en muestras
biológicas a niveles de sensibilidad alcanzando
10^{3}-10^{4} organismos por muestra (1990,
Gene Probes for Bacteria, eds. Macario y de Macario, Academic
Press). Acoplado con un método que permita la amplificación de
secuencias de ADN diana específicas, las sondas de ácidos nucleicos
específicos para especies pueden incrementar en gran parte el nivel
de sensibilidad para detectar organismos en una muestra clínica. El
uso de estas sondas puede permitir la detección directa sin apoyarse
en cultivos previos y/o técnicas bioquímicas de identificación,
convencionales. Esta realización de la presente invención se dirige
a iniciadores que amplifican secuencias específicas para especies
del gen que codifica E de M. catarrhalis, y a sondas que se
hibridan específicamente con estos fragmentos de ADN amplificados.
Utilizando las secuencias de ácidos nucleicos de la presente
invención y de acuerdo con los métodos de la presente invención, se
pueden detectar tan poco como un organismo de M. catarrhalis,
en presencia de 10 \mug/ml de ADN extraño.
Esta realización está dirigida a oligonucleótidos
específicos para especies que se pueden utilizar para amplificar
secuencias de ADN de M. catarrhalis, si está presente, de ADN
extraído de muestras clínicas incluyendo fluido del oído medio,
esputo, sangre, y fluidos de nasofaringe, ojos y adenoides; y para
determinar subsecuentemente si ha ocurrido amplificación. En una
realización de la presente invención, se utilizan un par de
oligonucleótidos de ADN específicos para M. catarrhalis, para
hibridar al ADN genómico de M. catarrhalis, que puede estar
presente en ADN extraído de una muestra clínica, y para amplificar
el segmento específico del ADN genómico entre los dos iniciadores
del flanqueo utilizando síntesis enzimática y ciclos de
temperatura. Cada par de iniciadores está diseñado para hibridarse
solamente con las secuencias de nucleótidos de M. catarrhalis que
comprenden el gen que codifica E (es decir, dentro de la región del
genoma que contiene SEQ ID NO:11) para el cual se han sintetizado
para complementarse; uno con cada cadena del ADN de doble cadena.
Por lo tanto, la reacción es específica aún en presencia de
cantidades en microgramos de ADN heterólogo. Para los fines de esta
descripción, el iniciador derivado de la secuencia de la cadena
(gen) positiva de ADN será denominado como el "iniciador
positivo", y el iniciador derivado de la secuencia de la cadena
negativa (complementaria) será denominado como el "iniciador
negativo".
La amplificación del ADN se puede lograr mediante
cualquiera de los métodos comercialmente disponibles. Por ejemplo,
la reacción en cadena de la polimerasa, se puede utilizar para
amplificar el ADN. Una vez que los iniciadores se han hibridado con
cadenas opuestas del ADN diana, la temperatura se eleva para
permitir la replicación del segmento específico de ADN a través de
la región entre los dos iniciadores mediante una polimerasa de ADN
termoestable. Después de la reacción se termocicla de tal manera que
en cada ciclo, se duplica la cantidad de ADN que representa las
secuencias entre los dos iniciadores, y se produce la amplificación
específica de las secuencias de ADN de M. catarrhalis, si está
presente. La identificación adicional del fragmento de ADN
amplificado, que es derivado del ADN de M. catarrhalis, puede
lograrse mediante hibridación de líquidos. Esta prueba utiliza uno o
más oligonucleótidos marcados como sondas para hibridarse
específicamente con el segmento amplificado de ADN de M.
catarrhalis. La detección de la presencia del ADN amplificado
específico para la secuencia, se puede lograr utilizando cualquiera
de varios métodos conocidos en la técnica, tal como un análisis de
retardo en gel con autorradiografía. Por lo tanto, las secuencias de
nucleótidos de la presente invención proveen bases para la síntesis
de oligonucleótidos que tienen aplicaciones comerciales en kits de
diagnóstico para la detección de M. catarrhalis. En una
realización relacionada, los oligonucleótidos utilizados como
iniciadores se pueden marcar directamente, o sintetizar para
incorporar una marca. Dependiendo de la marca utilizada, los
productos de amplificación se pueden detectar entonces, después de
la unión en una matriz de afinidad, utilizando detección isotópica o
colorimétrica.
El ADN se puede extraer de muestras clínicas que
pueden contener M. catarrhalis que utiliza métodos conocidos
en la técnica. Por ejemplo, las células contenidas en la muestra
pueden ser lavadas en disolución reguladora de pH en TE y
peletizadas mediante centrifugación. Las células se pueden
resuspender después en 100 \mul de solución reguladora de pH de
reacción de amplificación, que contiene detergentes y proteinasa K.
Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, la muestra
resultante puede estar compuesta de las células en 10 mM de Tris, pH
de 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,01% de gelatina, 0,45%
de NP40{TM}, 0,045% de Tween 20^{TM}, y 60 \mug/ml de
proteinasa K. La muestra se incuba en un baño de agua a 55ºC,
durante 1 hora. Después de la incubación, la muestra se incuba a
95ºC durante 10 minutos para inactivar por calor la proteinasa K. La
muestra después se puede amplificar de acuerdo con el protocolo para
la reacción en cadena de la polimerasa como se establece más
adelante.
El ADN de M. catarrhalis, se puede
amplificar utilizando cualquiera de varios protocolos para
amplificar ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de
polimerasa. En un modo de esta realización, el gen que codifica E,
se amplificó a partir de 19 aislados clínicos de B.
catarrhalis, utilizando las siguientes condiciones: El ADN que
será amplificado (aproximadamente 1 \mug de ADN genómico) se
distribuyó en tubos de microfuga de 0,5 ml y el volumen se ajustó a
50 \mul añadiendo una mezcla de reacción que comprende 0,2 mM
dNTPS (sATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,25 \mug de cada iniciador de
oligonucleótidos positivo y negativo, 1 unidad de polimerasa de ADN
termoestable, polimerasa 10x de solución reguladora de pH (5
\mul), 3 mM de MgSO_{4} (concentración final), y agua destilada
estéril para lograr el volumen total. La polimerasa de ADN se añade
a la mezcla de reacción justo antes de usarse y se mezcla
suavemente, no se agita. Una capa de aceite mineral, aproximadamente
2 gotas, se añade a cada tubo y después los tubos se colocan en el
aparato de ciclos térmicos. De treinta a treinta y cinco ciclos,
generalmente son suficientes para la amplificación de ADN
bacteriano. Un ciclo consiste en 15 segundos a 96ºC, 1 minuto a
62ºC, y 1 minuto a 74ºC. El primer ciclo incluye una incubación de 3
minutos a 95ºC para asegurar la desnaturalización completa.
Los oligonucleótidos útiles como iniciadores o
sondas que se hibridan específicamente con el gen que codifica E de
M. catarrhalis y se utilizan en la amplificación y/o
detección de ADN, pueden ser sintetizados bioquímicamente,
utilizando métodos conocidos en la técnica, de las secuencias de
nucleótidos descritas en la presente invención. La especificidad de
los oligonucleótidos para M. catarrhalis, puede ser
comprobada mediante una investigación de base de datos de banco de
genes (Genbank) para cada secuencia individual. En general, los
oligonucleotidos se deben seleccionar de bajo contenido en
G-C. Los pares de iniciadores que se han utilizado
para esta realización con el fin de amplificar el gen entero que
codifica E, incluyen SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:15. Los pares de
iniciadores utilizados para amplificar porciones del gen, incluyen
SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17; y SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18.
Para fines de detección, los oligonucleótidos de
la presente invención pueden ser marcados en el extremo con un
radioisótopo. Las secuencias de sondas, internas para los dos
iniciadores utilizados para amplificación de la secuencia de genes,
pueden ser marcadas en un extremo utilizando quinasa de
polinucleótido T_{4} y ^{32}P ATP gama. Veinte pmoles del ADN de
la sonda en la solución reguladora de pH de quinasa (50 mM de Tris,
pH 7,6, 10 mM de MgCl_{2}, 5 mM de ditiotreitol, 0,1 mM de
espermidina-HCl, 0,1 mM de EDTA, pH 8,0) se mezcla
con 120 \muCi de ^{32}P ATP gama y se incuba a 37ºC durante 1
hora. La sonda marcada se separa del marcador no incorporado en un
ensayo sobre gel de acrilamida al 8% tratado durante 1 hora a 200
voltios en solución reguladora de pH de Tris Borato EDTA (TBE) a
temperatura ambiente. La sonda marcada se localiza primero
exponiendo el gel de acrilamida a la película de rayos X durante
tres minutos. El autorradiograma resultante se coloca después bajo
el gel, y la banda que contiene la sonda marcada se saca del gel. La
porción de gel se pulveriza en un mililitro de agua destilada
estéril, y la sonda se eluye mediante incubación con agitación
durante la noche a 37ºC. La sonda eluida se separa de los fragmentos
de gel mediante centrifugación utilizando una columna de
cromatografía preparativa. La radioactividad de la sonda se
determina contando un microlitro de la sonda marcada sobre un filtro
de fibra de vidrio, mediante centelleo de líquidos. Dichas
secuencias de sondas se pueden elegir de cualquiera de las
secuencias identificadas como SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:10, y SEQ ID
NO:12 a SEQ ID NO:18 siempre y cuando la secuencia de la sonda sea
interna a los dos iniciadores utilizados para amplificación de la
secuencia de nucleótidos deseada descrita en la presente
invención.
Se pueden utilizar métodos alternativos conocidos
en la técnica para mejorar la detección de secuencias diana
amplificadas de acuerdo con las composiciones y métodos de la
presente invención. La sensibilidad de detección de las secuencias
de ADN amplificado, se puede mejorar sometiendo las secuencias a
hibridación líquida. Los métodos alternativos de detección conocidos
en la técnica, además de la electroforesis en gel y electroforesis
en gel con hibridación de Southern y autorradiografía, que se pueden
utilizar con las composiciones y métodos de la presente invención,
incluyen: digestión de enzima de restricción con electroforesis en
gel; hibridación de transferencia en ranura con una sonda de
oligonucleótidos marcada; amplificación con un iniciador
radiomarcado con electroforesis en gel, hibridación de Southern y
autorradiografía; amplificación con un iniciador radiomarcado con
transferencia de mancha y autorradiografía; amplificación con
oligonucleótidos que contienen etiquetas de afinidad (ej. biotina, o
un iniciador que incorpora biotina y el otro iniciador con una
secuencia específica para una proteína de unión de ADN) seguido por
la detección en un análisis basado en afinidad (ej. ELISA); y
amplificación con oligonucleótidos que contienen fluoróforos seguido
por detección de fluorescencia.
Una realización de detección no isotópica,
implica la incorporación de biotina en los iniciadores de
oligonucleótidos de la presente invención. El grupo
5'-amino de los iniciadores se puede biotinilar con
sulfo-NHS-biotina, o la biotina se
puede incorporar directamente en el iniciador sintetizando el
iniciador en presencia de dNTPs marcados con biotina. Los
iniciadores no isotópicos marcados, se utilizan después amplificando
ADN de una muestra clínica. La detección para la presencia o
ausencia de secuencias diana amplificadas, se puede lograr
capturando las secuencias diana amplificadas utilizando una matriz
de afinidad que tiene unido a la misma avidina, seguido por la
incubación con un conjugado de avidina que contiene una enzima, la
cual se puede utilizar para visualizar el complejo con el desarrollo
subsecuente del substrato. Alternativamente, las secuencias diana
amplificadas, se pueden inmovilizar mediante hibridación con la
sondas correspondientes de la secuencia diana en donde las sondas se
han fijado en una matriz. La detección se puede lograr utilizando un
conjugado de avidina que contiene una enzima que se puede utilizar
para visualizar el complejo con el desarrollo subsecuente del
substrato.
Realización
D
La proteína E, péptidos de E, y oligopéptidos de
E, se pueden purificar para utilizarse como un inmunógeno en
formulaciones de vacuna; y como un antígeno para análisis de
diagnóstico o para generar antisueros específicos de M.
catarrhalis de valor terapéutico y/o diagnóstico. La proteína E
de M. catarrhalis o péptidos de la misma, o proteína E
recombinante, péptidos de E recombinantes u oligopéptidos de E
recombinantes producidos a partir de un sistema de vector de
expresión, se puede purificar con los métodos conocidos en la
técnica incluyendo extracción de detergentes, cromatografía (v.gr.,
intercambio iónico, afinidad, inmunoafinidad, o columnas de
dimensionamiento), centrifugación diferencial, solubilidad
diferencial, u otras técnicas estándar para la purificación de
proteínas. Por ejemplo, una preparación parcialmente purificada que
contiene principalmente proteínas de membrana externa de bacterias,
se pueden preparar como sigue. Las bacterias que expresan E de 30
placas de agar de chocolate, se inocularon en 25 ml de PBS de pH
7,2, y se cultivaron por centrifugación a 12.000 x g durante 20
minutos a 4ºC. El pelet bacteriano se resuspendió en 10 ml de
acetato de sodio
1M-\beta-mercaptoetanol 0,001 M
(pH 4,9). Se añadió un volumen de 90 ml de una solución que contiene
agente de Zwitter Z 3,14 (Calbiochem-Behring) al 5%
y CaCl_{2} 0,5% M y la suspensión se mezcló durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los ácidos nucleicos se precipitaron por la
adición de 25 ml de etanol frío y centrifugación subsecuente a
17.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las proteínas restantes se
precipitaron por la adición de 375 ml de etanol frío y se recogieron
por centrifugación a 17.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los pelets
se dejaron secar y se suspendieron después en 10 ml de solución
reguladora de pH de detergente conteniendo agente de Zwitter al
0,05%, Tris 0,05 M, EDTA 0,01 M, pH 8,0, y se mezclaron durante 1
hora a temperatura ambiente. Las proteínas de membrana exterior
bacteriana están presentes en la fracción soluble de la solución
reguladora de pH detergente después de la centrifugación a 12.000 x
g durante 10 minutos a 4ºC.
La inmunopurificación de la proteína E a partir
de una preparación de proteína de membrana externa se puede lograr
utilizando métodos conocidos en la técnica para cromatografía de
inmunoafinidad. Los anticuerpos monoclonales específicos de E se
pueden unir a una matriz cromatográfica para formar una matriz de
afinidad. La preparación de proteína de membrana exterior se incuba
entonces con la matriz de afinidad permitiendo que los anticuerpos
se unan a E. La matriz de afinidad se lava después para separar
componentes no unidos y después se eluye E de la matriz de afinidad
dando como resultado una preparación purificada de la proteína E. La
E purificada se puede utilizar como un antígeno para análisis de
diagnóstico, o se puede dividir química o enzimáticamente en
péptidos utilizando métodos conocidos por los expertos en la
materia. Alternativamente, los péptidos u oligopéptidos de E, se
pueden sintetizar químicamente utilizando la secuencia de
aminoácidos deducida del gen que codifica E como referencia. La
proteína E recombinante se puede purificar utilizando métodos
similares.
Los oligopéptidos de E son definidos en la
presente memoria como una serie de péptidos que corresponden a una
porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína E como se
describe en la SEQ ID NO:11 que se sintetizan como uno o son unidos
químicamente. Dichos péptidos u oligopéptidos, se pueden sintetizar
utilizando uno de varios métodos de la síntesis de péptidos
conocidos en la materia, incluyendo la síntesis de péptidos sólidos
estándar, utilizando aminoácidos de butoxicarbonilo terciario
(Mitchell y otros, 1978, J. Org. Chem.
43:2845-2852), utilizando aminoácidos de
9-fluorenilmetiloxicarbonilo sobre un soporte de
poliamida (Dryland y otros, 1986, J. Chem. So. Perkin Trans.
I, 125-137); mediante la síntesis de búsqueda de
péptidos (Geysen y otros, 1987, J. Immunol. Methods 03:259;
1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998); o mediante
síntesis normal de péptidos en fase líquida. La modificación de los
péptidos u oligopéptidos, tal como por supresión o substitución de
aminoácidos (incluyendo extensiones y adiciones a los aminoácidos) y
en otras formas, se puede hacer de tal manera que no se aparte
substancialmente de las propiedades inmunológicas del péptido u
oligopéptido. En particular, la secuencia de aminoácidos de la
proteína E se puede alterar reemplazando uno o más aminoácidos con
aminoácidos fundamentalmente equivalentes, dando como resultado una
alteración que es silente en términos de una diferencia observada en
el comportamiento fisicoquímico de la proteína, péptido u
oligopéptido.
La proteína E, péptidos de E, y oligopéptidos de
E purificados, se pueden utilizar como antígenos en inmunoanálisis
para la detección de antisuero específico para Moraxella
catarrhalis, presente en el fluido corporal de un individuo que
se sospecha que tiene una infección ocasionada por M.
catarrhalis. Los fluidos corporales incluyen, pero no están
limitados a, fluido del oído medio, esputo, sangre, y fluidos de la
nasofaringe, ojos, y adenoides. La detección de E, péptidos de E, u
oligopéptidos de E, como un antígeno en inmunoanálisis, incluye
cualquier inmunoanálisis conocido en la técnica, incluyendo pero no
limitado a, radioinmunoanálisis, análisis inmunoabsorbente unido a
enzima (ELISA), análisis de "sándwich", reacción de
precipitina, análisis de aglutinación, inmunoanálisis fluorescente,
e inmunoanálisis basado en quimioluminiscencia.
\newpage
Realización
E
Esta realización de la presente invención, provee
proteína E y péptidos de la misma, para ser utilizados como
inmunógenos en una vacuna profiláctica y/o terapéutica para
inmunización activa para proteger contra o tratar infecciones
ocasionadas por M. catarrhalis. Para el desarrollo de la
vacuna, las secuencias de aminoácidos específicos para E, que
comprenden el inmunógeno, se pueden purificar a partir de M.
catarrhalis, o se pueden purificar a partir de un hospedante que
contiene un vector recombinante el cual expresa E, péptido de E, u
oligopéptidos de E. Dichos hospedantes incluyen, pero no están
limitados a, transformantes bacterianos, transformantes de levadura,
transformantes fúngicos filamentosos, y células cultivadas que han
sido o bien infectadas o transfectadas con un vector que codifica
secuencias de aminoácidos de E. Los péptidos u oligopéptidos que
corresponden a porciones de proteínas E se pueden producir a partir
de división química o enzimática de proteína E, o se pueden
sintetizar químicamente utilizando métodos conocidos en la técnica y
con la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de
nucleótidos del gen que codifica E como una referencia.
Alternativamente, los péptidos de E u oligopéptidos de E, se pueden
producir a partir de un vector recombinante. En cualquier caso, el
inmunógeno de proteína E, péptido de E, u oligopéptido de E, está
incluido como el material inmunogénico relevante en la formulación
de la vacuna, y en cantidades terapéuticamente efectivas, para
inducir una respuesta inmune. Se conocen muchos métodos para la
introducción de una formulación de vacuna en el ser humano o animal
que será vacunado. Estos incluyen, pero no están limitados a
administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal, oral. Además, la vacuna
puede comprender un vehículo fisiológico tal como una solución, un
polímero o liposomas; y un adyuvante, o una combinación de los
mismos.
Se utilizan varios adyuvantes junto con las
formulaciones de vacunas. Los adyuvantes ayudan a obtener un nivel
más duradero y superior de inmunidad utilizando cantidades menores
de antígeno de vacunas o dosis más pequeñas que si el antígeno de
vacunas fuera administrado solo. El mecanismo de acción adyuvante,
es complejo y no está completamente entendido. Sin embargo, puede
implicar la inmunomodulación a través de la estimulación de
producción de citoquina, fagocitosis y otras actividades del
sistema reticuloendotelial, así como la liberación retardada y la
degradación/procesamiento del antígeno para incrementar el
reconocimiento inmune. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el
adyuvante de Freund incompleto, el Adyuvante 65 (que contiene
aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de
aluminio), emulsiones de aceite, adyuvante de Ribi, los polioles
plurónicos, poliaminas, Avidina, Quil A saponina, MPL,
QS-21, y genes minerales tales como hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, etc.
Otra realización de este modo de la invención
implica la producción de secuencias de aminoácidos específicos para
E como un hapteno, es decir, una molécula que no puede producir una
respuesta inmune. En dicho caso, el hapteno puede estar unido
covalentemente a un vehículo u otra molécula inmunogénica que
conferirá inmunogenicidad al hapteno acoplado cuando se expone al
sistema inmune. Por lo tanto, dicho hapteno específico para E, unido
a una molécula de vehículo, puede ser el inmunógeno en una
formulación de vacuna.
Otra forma de esta realización, provee ya sea una
vacuna viral recombinante viva, una vacuna bacteriana recombinante,
una vacuna bacteriana atenuada recombinante, o una vacuna viral
recombinante inactivada, que se utiliza para proteger contra
infecciones causadas por M. catarrhalis. El virus de vaccinia
es el mejor ejemplo conocido en la técnica de un virus infeccioso
que es diseñado para expresar antígenos de vacunas derivados de
otros organismos. El virus de vaccinia vivo recombinante, que está
atenuado o tratado de otra manera de tal forma que no ocasione
enfermedad por sí mismo, se utiliza para inmunizar al hospedante. La
replicación subsecuente del virus recombinante dentro del
hospedante, provee una estimulación continua del sistema inmune con
los antígenos de vacunas tales como E, o péptidos de E,
proporcionando así inmunidad duradera. Otros vectores de vacunas
vivos incluyen; adenovirus, citomegalovirus, y preferiblemente los
poxvirus tales como vaccinia (Paoletti y Panicali, Patente de US Nº.
4.603.112) y cepas de Salmonella atenuada (Stocker y otros,
Patentes de US N^{os} 5.210.035; 4.837.151; y 4.735.801; y Curtiss
y otros, 1988, Vaccine, 6:155-160). Las vacunas
vivas son particularmente ventajosas dado que estimulan
continuamente el sistema inmune que puede conferir substancialmente
inmunidad duradera. Cuando la respuesta inmune protege contra una
infección de M. catarrhalis subsecuente, la vacuna viva por
sí misma, se puede utilizar en una vacuna preventiva contra M.
catarrhalis.
Para ilustrar este modo de la realización,
utilizando técnicas biológicas moleculares tales como aquellas
ilustradas en la Realización A, el gen que codifica E, o un
fragmento de gen que codifica uno o más péptidos de E, se pueden
insertar en el ADN genómico del virus de vaccinia en un sitio que
permite la expresión de epítopos de E pero no afecta negativamente
el crecimiento o replicación del vector del virus de vaccinia. El
virus recombinante resultante se puede utilizar como el inmunógeno
en una formulación de vacuna. Los mismos métodos se pueden utilizar
para construir una formulación de vacuna viral recombinante
inactivada, excepto en que el virus recombinante es inactivado, tal
como por medios químicos conocidos en la técnica, antes de
utilizarse como un inmunógeno y sin afectar substancialmente la
inmunogenicidad del inmunógeno expresado. Una mezcla de los virus
inactivados que expresan diferentes epítopos se pueden utilizar en
la formulación de una vacuna inactivada multivalente. En cualquier
caso, la vacuna recombinante inactivada o mezcla de virus
inactivados, se pueden formular con un adyuvante adecuado con el fin
de aumentar la respuesta inmunológica para los antígenos de
vacuna.
En otra variación de esta realización, el
material genético se utiliza directamente como la formulación de
vacuna. El ácido nucleico (AND o ARN) que contiene secuencias que
codifican E, péptido de E u oligopéptido de E, unidos operativamente
a uno o más elementos reguladores, se pueden introducir directamente
para vacunar al individuo ("transferencia directa del gen")
contra cepas patogénicas de M. catarrhalis. La transferencia
directa del gel en un individuo vacunado, dando como resultado la
expresión del material genético por las células del individuo
vacunado tal como células endoteliales vasculares así como el tejido
de los órganos principales, se ha demostrado mediante las técnicas
en la materia tales como inyección intravenosa de un complejo de
plásmido de expresión: liposoma catiónico (Zhu y otros, 1993,
Science 261:209-211). Otros métodos efectivos para
administrar al ADN del vector en una célula diana son conocidos en
la materia. En un ejemplo, el ADN de plásmido recombinante
purificado que contiene genes virales se ha utilizado para inocular
vacunas (ya sea parenteralmente, mucosalmente, o vía inmunización de
gen-gun) para inducir una respuesta inmunoprotectora
(Fynan y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. US 90:
11478-11482). En otro ejemplo, las células retiradas
de un individuo se pueden transfectar o someter a electroforesis
mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, dando como
resultado la introducción del ADN del vector recombinante en la
célula diana. Las células que contienen el ADN del vector
recombinante se pueden seleccionar entonces para utilizar métodos
conocidos en la técnica tales como vía una selección de marcador
expresado en el vector, y las células seleccionadas se pueden
reintroducir después en el individuo para expresar la proteína E,
péptido de E, u oligopéptido de E.
Un método preferido de vacunación con material
genético, comprende el paso de administrar al individuo la molécula
de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica una o más de las proteínas E, péptidos de E, u
oligopéptidos de E, en donde la molécula de ácido nucleico está
unida operativamente a una o más secuencias reguladoras necesarias
para la expresión. La molécula de ácido nucleico se puede
administrar directamente, o introducir primero en un vector viral y
administrarse vía el vector. La molécula de ácido nucleico se puede
administrar en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable,
y puede contener compuestos que pueden incrementar la efectividad de
la vacuna. Estos compuestos adicionales incluyen, pero no están
limitados a, adyuvantes, que modulan e incrementan la respuesta
inmune, u otros compuestos que incrementan la absorción de ácido
nucleico mediante las células. La inmunización con la molécula de
ácido nucleico, puede ser a través de cualquier ruta parenteral
(intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, o
intramuscular) o vía contacto con superficies mucosas de la
nasofaringe, tráquea, o tracto gastrointestinal.
Como una alternativa para la inmunización activa,
tal como en donde un individuo inmunocomprometido, sufre de una
infección que amenaza potencialmente la vida, ocasionada por M.
catarrhalis, la inmunización puede ser pasiva, es decir, la
inmunización que comprende la administración de inmunoglobulina
purificada de seres humanos, que contiene anticuerpo contra
epítopos de E.
Se debe entender que mientras la invención se ha
descrito en detalle en la presente memoria, los ejemplos únicamente
fueron para propósitos de ilustración. Otras modificaciones de las
realizaciones de la presente invención, que son obvias para los
expertos en la técnica de biología molecular, diagnósticos médicos,
y disciplinas relacionadas, se pretende que estén dentro del alcance
de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Murphy, Timothy F.
\hskip3.5cmBhushan, Reva
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna para Moraxella catarrhalis
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Hodgson, Russ, Andrews, Woods & Goodyear
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1800 One M&T Plaza
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Buffalo
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New York
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 14203-2391
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, almacenamiento de 1.44 kb
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Microsoft Windows 3.1
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Wordperfect
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: U.S. con Nº de Serie 08/245.758
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 17/05/94
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Nelson, M. Bud
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35,300
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 11520.0063
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (716) 856-4000
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (716) 849-0349
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CELULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGTA CATATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGTA CGTATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAGATGGTA CTTATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGTA CCTATGCGAA
\hfill20
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGCA CATATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGCA CGTATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGCA CTATGCGAA
\hfill20
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCAAGATGGCA CCTATGCGAA
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGCTTGGGC ACTTTGTCAT CACCCTCC
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTTGAATTCA CACCAGTTTG AAAATCCAAG
\hfill30
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1650 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: doble cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- Hipotética: si
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LOCALIZACIÓN: región del gen E, 154-1531
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCCAAACTC AGCGCTTTCT ATCC
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 nucleótidos
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTCAGTCCTT CCAATATGTA AAAC
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGATAAAAA TTGTTAAGAAA ATATATATAT TTTAC
\hfill35
\vskip0.666000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTATTTTTT ATATTTAGAC ATTTTTGTAT CATTTAGC
\hfill38
\vskip0.666000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTGATGAGCT TAAAATTTGG ATACAAAGCG CTGAG
\hfill35
\vskip0.666000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCATGAGATT ATTTGGCGTG ATAAGCAAGC
\hfill30
\vskip0.666000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 nucleótidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- No. CADENAS: una cadena
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- FUENTE INMEDIATA: sintetizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Moraxella catarrhalis
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: 25240
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCAGGCCTGG ATCGCTCAGG GCAAGATGTG ACTG
\hfill34
Claims (21)
1. Una formulación de vacuna que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de un péptido, oligopéptido, o
proteína sustancialmente puros, que tiene uno o más epítopos de E,
en donde E es una proteína de la membrana exterior de Moraxella
catarrhalis de una masa molecular aparente desde alrededor de
35.000 a alrededor de 50.000 daltons mediante
SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se muestra en la SEQ ID NO:11 desde el residuo
de aminoácido 26 al 459.
2. La formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el péptido, oligopéptido, o proteína se
ha producido recombinantemente a partir de células cultivadas de un
sistema de célula hospedante diseñado genéticamente para incluir un
vector que contiene una secuencia de nucleótidos que regula la
expresión de secuencias de ADN que codifican epítopos de E, siendo
dicho sistema de célula hospedante seleccionado del grupo que
consiste en bacterias, levaduras, hongos filamentosos, líneas
celulares de insectos, y líneas celulares de mamíferos.
3. La formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el péptido u oligopéptido es producido
por escisión química o enzimática de la proteína E.
4. La formulación de vacuna según la
reivindicación 1, en la que el péptido u oligopéptido es producido
por síntesis química.
5. La formulación de vacuna según la
reivindicación 1, que comprende además un vehículo farmacéutico.
6. Un péptido, oligopéptido, o proteína
sustancialmente puros que tiene uno o más epítopos de E, en donde E
es una proteína de la membrana exterior Moraxella catarrhalis
de una masa molecular aparente desde alrededor de 35.000 a alrededor
de 50.000 daltons mediante SDS-PAGE y que tiene una
secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la SEQ
ID NO:11 desde el residuo de aminoácido 26 al 459.
7. El péptido, oligopéptido, o proteína según la
reivindicación 6, en los que el péptido, oligopéptido o proteína se
han producido recombinantemente a partir de células cultivadas de un
sistema de célula hospedante diseñado genéticamente para incluir un
vector que contiene una secuencia de nucleótidos que regula la
expresión de secuencias de ADN que codifican epítopos de E, siendo
dicho sistema de célula hospedante seleccionado del grupo que
consiste en bacterias, levaduras, hongos filamentosos, líneas
celulares de insectos, y líneas celulares de mamíferos.
8. Un vector recombinante que comprende una
secuencia de ADN que codifica uno o más determinantes antigénicos o
epítopos de E, en donde E es una proteína de la membrana exterior de
Moraxella catarrhalis de una masa molecular aparente desde
alrededor de 35.000 a alrededor de 50.000 daltons mediante
SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se muestra en la SEQ ID NO: 11 desde el residuo
de aminoácido 26 al 459.
9. El vector recombinante de la reivindicación 8,
en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un
vector plásmido, un vector fagémido, un vector cósmido y un vector
vírico.
10. Una composición para usar en la inmunización
pasiva de individuos que padecen una infección causada por M.
catarrhalis, comprendiendo dicha composición un antisuero
purificado que reconoce uno o más epítopos de E, en donde E es una
proteína de la membrana exterior de M. catarrhalis de una
masa molecular aparente desde alrededor de 35.000 a alrededor de
50.000 daltons mediante SDS-PAGE y que tiene una
secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la SEQ
ID NO: 11 desde el residuo de aminoácido 26 al 459.
11. Oligonucleótidos purificados para usar en la
detección de M. catarrhalis, consistiendo dichos nucleótidos
esencialmente en secuencias de ácidos nucleicos seleccionados del
grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID
NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO:
18.
12. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Moraxella catarrhalis en una muestra clínica, en
el que el método comprende las etapas de:
- (a)
- lisar células de Moraxella catarrhalis en la muestra para liberar material genético bacteriano;
- (b)
- poner en contacto el material genético con dos oligonucleótidos bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de los oligonucleótidos con el material genético, en donde un primer oligonucleótido se hibrida con una región dentro de un gen que comprende el marco de lectura abierto de 1377 pares de bases de SEQ ID NO:11, y un segundo oligonucleótido se híbrida con una región en la cadena complementaria correspondiente;
- (c)
- amplificar enzimáticamente una región específica de la secuencia del material genético que comprende el gen y su correspondiente cadena usando los oligonucleótidos de la etapa (b) como iniciadores; y
- (d)
- detectar la presencia de secuencias amplificadas del gen y su correspondiente cadena, en donde la presencia de estas secuencias amplificadas se correlacionan con la presencia de M. catarrhalis en la muestra.
13. El método de la reivindicación 12, en el que
la detección se facilita además por hibridación de secuencias
amplificadas con una sonda de oligonucleótido marcada que consiste
en una secuencia de nucleótidos que corresponde a una región en la
secuencia amplificada, si está presente, dicho marcador es un
marcador que se sabe que está incorporado en oligonucleótidos
seleccionados particularmente de entre marcadores radiactivos, tales
como ^{32}P, y marcadores enzimáticos, tales como biotina.
14. Un método para la detección de Moraxella
catarrhalis en una muestra clínica, en el que el método
comprende las etapas de:
- (a)
- lisar células de Moraxella catarrhalis en una muestra clínica obtenida para liberar material genético bacteriano;
- (b)
- poner en contacto el material genético con una sonda de oligonucleótidos sintetizada para corresponderse con una región de un gen que comprende el marco de lectura abierto de 1377 pares de bases de SEQ ID NO:11, o su correspondiente cadena complementaria, bajo condiciones adecuadas que permiten la hibridación del oligonucleótido con el material genético; y
- (c)
- detectar la interacción entre la muestra y la sonda, siendo dicha interacción entre el material genético de M. catarrhalis y la sonda.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 14, en el que la muestra es un fluido corporal
seleccionado del grupo que consiste en fluido del oído medio,
esputo, sangre y fluidos de la nasofaringe, o el ojo, o
adenoide.
16. Un método para la detección de un antisuero
específico M. catarrhalis en un fluido corporal de un
individuo, que comprende usar péptidos o proteínas que tienen uno o
más epítopos de E como un antígeno en un inmunoensayo para
interactuar con, y detectar, antisuero específico de M.
catarrhalis en el fluido corporal, en donde E es una proteína
de la membrana exterior de Moraxella catarrhalis de una masa
molecular aparente desde alrededor de 35.000 a alrededor de 50.000
daltons mediante SDS-PAGE y que tiene una secuencia
de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la SEQ ID NO: 11
desde el residuo de aminoácido 26 al 459.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el inmunoensayo en un ensayo seleccionado del grupo que consiste en
un radioinmunoensayo, ensayo inmunoabsorbente unido a enzima, ensayo
"sándwich", reacción de precipitina, ensayo de aglutinación,
inmunoensayo basado en fluorescencia, e inmunoensayo basado en
quimioluminiscencia.
18. Un gen aislado o fragmentos del mismo que
codifican epítopos de una proteína E de la membrana exterior de
Moraxella catarrhalis que tiene una masa molecular aparente
desde alrededor de 35.000 a alrededor de 50.000 daltons mediante
SDS-PAGE, en el que dicho gen comprende el marco de
lectura abierto de 1377 pares de bases de la SEQ ID NO:11, en el que
dichos fragmentos del gen aislado codifican 7-14
aminoácidos.
19. Una formulación de vacuna que comprende una
molécula de ácido nucleico que codifica la proteína E, o uno o más
fragmentos de gen que codifican uno o más péptidos de E u
oligopéptidos de E, en donde E es una proteína de la membrana
exterior de Moraxella catarrhalis de una masa molecular
aparente desde alrededor de 35.000 a alrededor de 50.000 daltons
mediante SDS-PAGE y que tiene una secuencia de
aminoácidos sustancialmente como se muestra en SEQ ID NO: 11 desde
el residuo de aminoácido 26 al 459, y dicha molécula de ácido
nucleico está operativamente unida con secuencias reguladoras; y un
vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en el que dichos
fragmentos de gen codifican 7-14 aminoácidos.
20. Un microorganismo recombinante infeccioso que
contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia
de aminoácidos E seleccionada del grupo que consiste en proteína E,
péptidos de E, y oligopéptidos de E de M. catarrhalis, en
donde E es una proteína de la membrana exterior de Moraxella
catarrhalis de una masa molecular aparente desde alrededor de
35.000 a alrededor de 50.000 daltons mediante
SDS-PAGE y que tiene una secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se muestra en la SEQ ID NO: 11 desde el residuo
de aminoácido 26 al 459, y en donde el microorganismo recombinante
expresa la secuencia de aminoácidos de E bajo condiciones de
crecimiento adecuadas.
21. Un microorganismo según la reivindicación 20,
que es un virus de vaccinia, adenovirus, citomegalovirus, o una
bacteria del género Salmonella.
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