DE69531241T2

DE69531241T2 - Impfstoff gegen moraxella catarrhalis

Info

Publication number: DE69531241T2
Application number: DE69531241T
Authority: DE
Inventors: Timothy F. Murphy; Reva Bhushan
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2015-04-21
Also published as: EP0759777A4; EP0759777B1; MX9605615A; US5607846A; KR100396408B1; KR970703163A; EP0759777A1; DE69531241D1; ES2202361T3; AU2396995A; CA2189971A1; NZ284744A; CA2189971C; ATE244577T1; US5948412A; JPH10504444A; WO1995031215A1; JP4260879B2; AU709984B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die ein Protein und Peptide und Oligopeptide von diesem enthalten, das verbunden ist mit der äußeren Membran von Moraxella catarrhalis (bis vor kurzem bezeichnet als Branhamella catarrhalis). Genauer ist die Erfindung gerichtet auf Zusammensetzungen eines Proteins, und von Peptiden und Oligopeptiden davon, verbunden mit einem Außenmembranprotein, „E", das ein hitzemodifizierbares Protein von M. catarrhalis ist, mit einer anscheinenden Molmasse von ungefähr 35.000 Dalton bei 25°C und ungefähr 50.000 Dalton, wenn es auf 100°C erhitzt wird. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Zubereitung von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden unter Verwendung von rekombinanter DNS und/oder biochemischen Techniken. In Beziehung stehend dazu sind die DNS-Sequenz, die E kodiert, und Vektoren, die nützlich sind beim Lenken der Expression von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden, und Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind, offenbart.
Die Proteine, Peptide und Oligopeptide können verwendet werden als Immunogene in Impfformulierungen für die aktive Immunisierung; und sie können verwendet werden, um proteinspezifische und peptidspezifische Antisera zu erzeugen, die nützlich sind für die passive Immunisierung und als Reagenzien für diagnostische Ansätze. Die offenbarten Nukleotidsequenzen sind für die Synthese korrespondierender Oligonukleotide bereitgestellt, die als Reagenzien in diagnostischen Ansätzen verwendet werden können, die auf den Nachweis von genetischem Material von M. catarrhalis gerichtet sind.
Hintergrund der Erfindung
Moraxella catarrhalis (auch bekannt als Branhamella catarrhalis) ist ein wichtiges Pathogen der menschlichen Atemwege. M. catarrhalis ist die dritthäufigste allgemeine Ursache von Mittelohrentzündung bei Säuglingen und Kindern, nach Streptococcus pneumoniae und nicht typisierbarer Haemophilus influenzae, wie dokumentiert worden war in Studien, in denen Tympanozentese verwendet worden war, um das ätiologische Agens nachzuweisen (Murphy, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S75–S77). M. catarrhalis ist eine übliche Ursache von Sinusitis und Konjunktivitis sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen (siehe z. B., Bluestone, 1986, Drugs 31: S132–S141); Brorson et al., 1976, Scand. J. Infect. Dis. 8: 151–155; und Romberger et al., 1987, South. Med. J. 80: 926–928); es ist eine wichtige Ursache von Infektionen der unteren Atemwege bei Erwachsenen mit chronischer Bronchitis und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (Murphy et al., 1992, Am. Rev. Respir. Dis. 146: 1067–1083; Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3: 293–320). Weiterhin kann M. catarrhalis Lungenentzündung, Endokarditis, Blutvergiftung und Meningitis bei immungeschwächten Individuen hervorrufen (Cocchi et al., 1968, Acta Paediatr. Scand. 57: 451–3; Douer et al., 1977, Ann. Intern. Med. 86: 116–119; McNeely et al., 1976, Am Rev. Respir. Dis. 114: 399–402).
Da wiederkehrende Mittelohrentzündung mit beträchtlicher Morbidität verbunden ist, besteht ein Interesse an der Identifikation von Strategien zur Verhinderung dieser Infektionen. Ein solcher Ansatz ist die Entwicklung von Impfstoffen. Ein wirksamer Impfstoff zur Verhinderung von bakterieller Mittelohrentzündung würde Antigene einschließen müssen, die einen Schutz gegen Infektion durch S. pneumnniae, nicht typisierbare H. influenzae und M. catarrhalis erzeugen. In der Tat schreitet die Impfstoffentwicklung für den Pneumokokkus und nicht typisierbare H. influenzae voran, so dass mögliche schützende Antigene identifiziert worden sind, und kürzlich Testen unterzogen wurden (siehe z. B. Murphy et al., U.S. Patent Nr. 5,173,294; und Vella et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4977–4983). Indem diese Impfstoffe entwickelt werden und verbreiteter verwendet werden, wird die relative Wichtigkeit von M. catarrhalis als eine Ursache von Mittelohrentzündung im nächsten Jahrzehnt ansteigen. Neben Säuglingen und Kindern, denen ein Impfstoff zur Verhinderung von durch M. catarrhalis verursachter Mittelohrentzündung zugute käme, würden auch Erwachsene mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und immungeschwächte Kinder und Erwachsene von einem Impfstoff, zur Verhinderung von durch M. catarrhalis verursachten Infektionen profitieren.
Bakterielle Bestandteile, die untersucht worden waren als mögliche Impfstoffantigene, schließen Polysaccharide, Lipopolysaccharide oder Abwandlungen davon und Außenmembranproteine ein. Im Allgemeinen, wie veranschaulicht durch Typ b-Kapselpolysaccharide von H. influenzae, wurde von Polysaccharidantigenen gezeigt, dass sie ein schlechtes Immunogen bei Kindern unter einem Alter von 18 Monaten sind. Aktive Immunisierung mit Lipopolysaccharid (LPS) ist nicht annehmbar wegen seiner innewohnenden Toxizität. Die pathophysiologischen Wirkungen von LPS können Fieber, Leukopenie, Leukozytose, das Shwartzman-Sanarelli'sche Phänomen, disseminierte intravaskuläre Gerinnung, und in großen Dosen, Keislaufversagen und Tod sein. Im Allgemeinen sind Proteine in Säuglingen mit einem Alter von ungefähr drei Monaten immunogen. Folglich wurden Außenmembranproteine als mögliche Impfstoffantigene untersucht.
Während jüngste Studien begannen, sich auf Außenmembranproteine von M. catarrhalis zu konzentrieren, ist wenig bekannt über die antigene und molekulare Struktur dieser Proteine. Untersuchungen der gereinigten Außenmembranen mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) offenbarte ein ziemlich homogenes Muster innerhalb der Stämme des Bakteriums (Barlos und Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158: 761–765). Acht Hauptaußenmembranproteine, bezeichnet durch die Buchstaben A–H, wurden identifiziert (Murphy et al., 1989, Microbial Pathogen. 6: 159–174; Barlos et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: 761–765). Experimente, in denen 20 Stämme von M. catarrhalis absorbiert waren mit Antisera, die entwickelt worden waren gegen M. catarrhalis-Stamrn 25240, zeigen, dass Außenmembranprotein E antigen konservierte Determinanten enthält, die auf den bakteriellen Oberflächen exprimiert werden (Murphy et al., 1989, Infect. Immun. 57: 2938–2941).
Folglich besteht mit der steigenden Erkennung von M. catarrhalis als einem wichtigen bakteriellen Pathogen, ein Bedarf für einen Impfstoff, der in Kindern und Erwachsenen immunogen ist. Solch ein Impfstoff würde auf einen bakteriellen Bestandteil gerichtet sein müssen, der ein oberflächenausgesetztes Epitop auf intakten Bakterien hat, wobei das Epitop innerhalb der Stämme von M. catarrhalis konserviert ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird auf ein Protein, Peptide und Oligopeptide gerichtet, die verbunden sind mit einem Außenmembranprotein mit einer anscheinenden Molmasse von ungefähr 35.000 Dalton bis ungefähr 50.000 Dalton von M. catarrhalis, wobei das Protein ein hitzemodifizierbares Protein zu sein scheint, was in Unterschieden der Wanderung in SDS-Gelen in Abhängigkeit von der Probenbehandlungstemperatur resultiert. Das E-Protein der vorliegenden Erfindung und Peptide davon (hier auch bezeichnet als „E-Peptide" oder „E-Oligopeptide"), können als Immunogene in prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfformulierungen verwendet werden; oder als ein Antigen in diagnostischen Immunoassays, die gerichtet sind auf den Nachweis einer M. catarrhalis-Infektion durch Messen eines Anstiegs im Serumtiter von M. catarrhalis-spezifischem Antikörper. Auch können E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um E-spezifische Antikörper zu erzeugen, die nützlich sein könnten für die passive Immunisierung und als Reagenzien für diagnostische Ansätze, die gerichtet sind auf den Nachweis der Anwesenheit von M. catarrhalis in klinischen Proben. E-Peptide oder E-Oligopeptide können durch chemische Synthesen oder Aufreinigung von M. catarrhalis erhalten werden, oder können hergestellt werden aus rekombinanten Vektorexpressionssystemen unter Verwendung der hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist auf den Bau von neuen DNS-Sequenzen und Plasmid-DNS einschließenden Vektoren und virale DNS, wie z. B. menschlichen Viren, tierische Viren, Insektenviren oder Bakteriophagen, gerichtet, die verwendet werden können, um die Expression von E-Protein, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden in geeigneten Wirtszellen, aus denen das exprimierte Protein oder die Peptide aufgereinigt werden können, zu lenken.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zum molekularen Klonieren des Gens, das E-kodiert, bereit, und verschafft Zusammensetzungen, die Oligonukleotide innerhalb der E-kodierenden Gensequenz enthalten. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden in molekularen Diagnoseansätzen für genetisches Material von M. catarrhalis durch Nukleinsäurehybridisierung und schließt die Synthese von E-Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden zur Verwendung als Primer und/oder Sonden bei der Amplifizierung und beim Nachweis amplifizierter Nukleinsäuren ein.
Ferner können E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide verwendet werden als Immunogene in prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfformulierungen gegen pathogene Stämme von M. catarrhalis, sei es, dass das Immunogen chemisch synthetisiert wird, gereinigt wird aus M. catarrhalis oder aus einem rekombinanten Expressionsvektorsystem. Alternativ können das Gen, das E kodiert, oder eine oder mehrere Genfragmente, die E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren, in einen bakteriellen oder viralen Impfstoff eingebaut werden, der rekombinantes Bakterium oder Virus enthält, das angelegt wurde, um eine oder mehrere immunogene Epitope von E selber oder in Kombination mit immunogenen Epitopen anderer pathogener Mikroorganismen herzustellen.
Weiterhin kann das Gen, das E kodiert, oder eine oder mehrere Genfragmente, die E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren, die wirksam an eines oder mehrere regulatorische Elemente gekoppelt sind, direkt in Menschen eingeführt werden, um Protein E, E-Peptid oder E-Oligopeptide zu exprimieren, um eine schützende Immunantwort auszulösen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Kay-Doolittle-Hydrophobizitätsprofil des Außenmembranproteins E von M. catarrhalis, wie es bestimmt wurde unter Verwendung der Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz des Gens, das E-kodiert, abgeleitet worden ist. Positive Werte verkörpern hydrophobe Bereiche und negative Werte verkörpern hydrophile Bereiche.
2 stellt Polyacrylamidgele dar, die gefärbt wurden mit Ethidiumbromid und die das amplifizierte Produkt der Genome unterschiedlicher Stämme von M. catarrhalis nach der Verdauung mit zahlreichen Restriktionsenzymen enthält. Spur 1 repräsentiert DNS-Größenstandards und die Spuren 2–20 sind die amplifizierten Produkte der Stämme, die in Tabelle 1 jeweils aufgelistet sind.
2A ist ein Gel, das die amplifizierten Produkte zeigt, die mit Sau96 I eingeschränkt wurden.
2B ist ein Gel, das die amplifizierten Produke zeigt, die mit Bsl I einschränkt wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen eines bakteriellen Außenmembranproteins und Peptiden davon von M. catarrhalis gerichtet, worin das Protein mit „E" bezeichnet worden ist. Das Muster der Migration des E-Proteins auf SDS-PAGE ist charakteristisch für ein hitzemodifizierbares Protein. Dies bedeutet, dass das Migrationsmuster von der vorausgegangenen Probenbearbeitungstemperatur abhängt. Folglich beträgt die anscheinende Molmasse ungefähr 35.000 Dalton, wenn die E-Protein enthaltende Probe vor der SDS-PAGE auf 25°C erhitzt wurde; und falls die Probe auf 100°C erhitzt wurde, beträgt die anscheinende Molmasse ungefähr 50.000 Dalton. Wie durch die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung (SEQ ID Nr. 11) gezeigt wird, offenbart das Ekodierende Gen, dass die vorausgesagte Aminosäuresequenz des reifen E-Proteins eine berechnete Molmasse von ungefähr 47.030 Dalton hat. Das E-Protein, die E-Peptide und die E-Oligopeptide der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren, wie hier erläutert, oder sie können chemisch synthetisiert werden aus der Aminosäuresequenz, die in der vorliegenden Erfindung offenbart ist. Zusätzlich können Peptide durch enzymatische oder chemische Spaltung des reifen Proteins erzeugt werden. E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide mit einem immunogenen Epitop(en) können verwendet werden als Immunogene in zahlreichen Impfformulierungen zur Vorbeugung von Mittelohrentzündung, Sinusitis, Konjunktivitis und Infektionen der unteren Atemwege, die verursacht werden durch M. catarrhalis. Zusätzlich können gemäß der vorliegenden Erfindung die hergestellten E-Proteine, E-Peptide und E-Oligopeptide verwendet werden, um M. catarrhalis-spezifische Antisera zu erzeugen, die nützlich sind für die passive Immunisierung gegen Infektionen, die durch M. catarrhalis verursacht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Nukleotidsequenz des E-kodierenden Gens bereit, ebenso wie die Aminosäuresequenz, die von dem isolierten Gen abgeleitet. wird. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken, das E-kodierende Gen oder Genfragmente, die eines oder mehrere E-Peptide mit einem immunogenen Epitop(en) kodieren, in einen Expressionsvektor eingebaut, und der rekombinante Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, wodurch die Expression dieser Sequenzen in jener bestimmten Wirtszelle gelenkt wird. Das Expressionssystem, das den in die Wirtszelle eingeführten rekombinanten Vektor enthält, kann verwendet werden, (a) um E-Protein, E-Peptide oder E-Oligopeptide herzustellen, die aufgereinigt werden können zur Verwendung als ein Immunogen in Impfformulierungen; (b) um E-Protein, E-Peptide oder E-Oligopeptide herzustellen, die verwendet werden als ein Antigen für diagnostische Immunoassays oder zur Herstellung von M. catarrhalisspezifischen Antisera mit therapeutischem und/oder diagnostischem Wert; (c) oder, falls der rekombinante Expressionsvektor ein lebendes Virus, wie z. B. ein Vakziniavirus ist, kann der Vektor selber verwendet werden als eine lebende oder inaktivierte Impfstoffzubereitung, die eingeführt wird in die Zellen des Wirts zur Exprimierung von E oder immonogenen E-Peptiden oder E-Oligopeptiden; (d) oder, falls der rekombinante Expressionsvektor in lebende, abgeschwächte bakterielle Zellen eingeführt wird, die verwendet werden, um E-Protein, E-Peptide oder E-Oligopeptide zu exprimieren, um Individuen zu impfen; (e) oder können direkt in ein Individuum eingeführt werden, um gegen das kodierte oder exprimierte E-Protein, E-Peptid oder E-Oligopeptid zu immunisieren.
Für Zwecke der Beschreibung werden die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in den folgenden Ausführungsbeispielen erläutert:
Ausführungsbeispiel A- Molekulares Klonen und Sequenzieren des E-kodierenden Gens und der Vektoren, die E-spezifische Epitope exprimieren;
Ausführungsbeispiel B- Konservierung des E-kodierenden Gens unter M. catarrhalis-Stämmen;
Ausführungsbeispiel C- Verfahren zur Verwendung von E-spezifischen Nukleotidsequenzen in molekularen Diagnoseansätzen für den Nachweis von M. catarrhalis;
Ausführungsbeispiel D- Verfahren zur Herstellung und Verwendung von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden in diagnostischen Immunoassays;
Ausführungsbeispiel E- Verfahren und Zusammensetzungen für Impfformulierungen im Zusammenhang mit E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden.
Ausführungsbeispiel A
Molekulares Klonieren und Sequenzieren des E-kodierenden Gens und von Vektoren, die E-spezifische Epitope exprimieren.
Die verwendete Strategie war die, genomische DNS von M. catarrhalis zu isolieren, die isolierte DNS in Fragmente zu spalten, eine genomische Bibliothek, die die Insertion der Fragmente in einen Expressionsvektor umfasst, zu erzeugen, die rekombinanten Vektoren in die geeignete Wirtszelle einzuführen und auf Wirtszellklone, die das E-kodierende Gen enthalten, durch Filterhybridisierung mit einer Familie degenerierter, markierter Oligonukleotide, die mit der Aminoendsequenz des E-Proteins übereinstimmen, zu screenen. Die synthetisierten Oligonukleotide wurden vorgescreent durch Southern blot auf M. catarrhalis-DNS und E. coli als eine Kontrolle, um festzustellen, welche degenerierten Oligonukleotide stark an M. catarrhalis-DNS hybridisieren.
Moraxella catarrhalis-Stamm 25240, erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), wurde als die Quelle bakterieller, genomischer DNS verwendet. M. catarrhalis ließ man wachsen auf Schokoladenagarplatten bei 37°C in 5% CO₂ oder in Hirn-Herz-Infusionslösung. Escherichia coli (E. coli) LE392 wurde als der Wirtsstamm für die genomische Bibliothek des Bakteriophagen Lambda (EMBL-3) verwendet. In Abhängigkeit von den Verhältnissen ließ man E. coli in Trypton-Nährlösung, die mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO₄ ergänzt wurde, wachsen; oder für das Screening auf NZCYM-Agarplatten, die 50 μg/ml Ampicillin enthalten.
Es wurde eine EMBL3 genomische Bibliothek erzeugt mit genomischer DNS von M. catarrhalis 25240 unter Verwendung von kürzlich beschriebenen Verfahren (Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, veröffentlicht von John Wiley and Sons). Genomische DNS von M. catarrhalis-Stamm 25240 wurde unter Verwendung von Detergens-Extraktion und Proteinasebehandlung aufgereinigt. Die aufgereinigte genomische DNS wurde dann teilweise mit Restriktionsenzym Sau 3A verdaut, um in der Größe variierende Fragmente zu erzeugen. Die DNS-Fragmente wurden durch Sucrosegradientenzentrifugation auf einem 10% bis 40% Sucrosegradienten aufgetrennt. Die Fraktionen, die Fragmente von ungefähr 9 bis 23 Kilobasen (kb) in der Größe enthielten, wurden gesammelt, dephosphoryliert unter Verwendung von Kälberdarmphosphatase und anschließend in Phagenarme ligiert und dann in den Phagen verpackt. Ein Teil der resultierenden EMBL-3-Bibiliothek wurde auf NZCYM-Platten ausplattiert mit E. coli LE392 als dem Wirtsstamm.
Die Plaques wurden auf Nitrocellulosefilterscheiben übertragen und durch Hybridisierung mit einer Familie an degenerierten, radiomarkierten Oligonukleotiden (repräsentative Beispiele sind in den SEQ ID Nr.: 1 – SEQ ID Nr.: 8 offenbart) gescreent, die der aminoterminalen Sequenz des Außenmembranproteins E entsprechen. Insgesamt wurden ungefähr 8.100 Plaque gescreent und 6 positive Klone wurden identifiziert. Die anfänglich positiven Plaques wurden aufgenommen, in Puffer eluiert und dann durch Ausplattieren in niedriger Dichte aufgereinigt und erneut gescreent mit denselben Oligonukleotiden bis alle Plaques eines Rescreenings positiv waren. Flüssige Lysate der positiven Klone wurden verwendet, um die Lambda-DNS, die das Insert enthält, zu isolieren. Die isolierte Lambda-DNS wurde dann mit Sal I verdaut und das Verdaute wurde auf Agarosegelen der Elektrophorese unterzogen, um die Anwesenheit der Inserts zu bestätigen. Die Insertgrößen der positiven Klone lagen zwischen 12 Kilobasen (kb) und 17 kb. Der Klon, der das 12 kb-Insert enthielt, wurde verwendet, um das E-kodierende Gen, das in dem Insert enthalten war, zu lokalisieren. Die DNS des Klons wurde geschnitten mit Sal I und das 12 kb-Insert wurde von den Gelstücken elektroeluiert und mit einem oder mehreren etlicher unterschiedlicher Enzyme, (Nde I, Nco I, Hind III, Sac I, Eco RI, und Nde I und Nco I) eingeschränkt. Das Verdaute wurde der Elektrophorese auf Agarosegelen unterzogen und die Fragmente wurden durch Southern blot mit den Oligonukleotidsonden analysiert.
Ein 4,4 kb Nde I-Sal I-Fragment und ein 1,9 Nco I-Sal I-Fragment wurden ausgewählt und für das Subklonieren in jedes der Plasmide pET22b⁺ oder pGEM5zf manipuliert, um das anschließende Sequenzieren zu erleichtern. Nach wiederholten erfolglosen Versuchen, E. coli mit den rekombinanten Plasmiden zu transformieren, und trotz Erfolg mit Kontroll-DNS und Transformationskontrollen, wurde geschlossen, dass die Fragmente, die das E-kodierende Gen oder Teile davon enthalten, für die E. coli toxisch waren. Folglich wurde ein alternativer Ansatz unternommen, um die Nukleotidsequenz zu bestimmen. Die Sequenzen der Enden des 1,9 kb-Fragmentes wurden durch das Verfahren von Maxam-Gilbert bestimmt. Das 1,9 kb-Fragment wurde mit Hind III verdaut und zwei Fragmente wurden aufgereinigt, in 1,1 kb-Fragment und ein 0,8 kb-Fragment. Diese Fragmente wurden markiert und dann unter Verwendung des Verfahrens nach Maxam-Gilbert (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560– 564) sequenziert. Aus dieser Sequenzanalyse wurden zwei zusätzliche Oligonukleotide synthetisiert (SEQ ID Nr.: 9 und SEQ ID Nr.: 10).
Zwei Primer (SEQ ID Nr.: 7 und SEQ ID Nr.: 10) wurden ausgewählt, um ein Fragment der Insert-DNS des Klons mit dem 12 kb-Insert zu amplifizieren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion. Die Reaktionen wurden in einem 50 μl Volumen mit 0,25 μg Primern und 2,5 mM dNTP durchgeführt. Das Vordenaturieren wurde durchgeführt bei 95°C für 3 Minuten. Denaturieren wurde durchgeführt bei 96°C für 15 Sekunden, Annealing bei 62 °C für 1 Minute und Polymerisieren bei 74°C für 1 Minute, in 15 Zyklen in Anwesenheit von 3 mM MgSO₄. Das Ergebnis der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung dieser beiden Primer war ein amplifiziertes Produkt von 0,8 kb. Das 0,8 kb-amplifizierte Produkt wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und dann in die Eco RI-Stelle von M13mp18 subkloniert. Einzelsträngige M13-DNS wurde zubereitet aus der Rekombinante, um die Nukleotidsequenz des 0,8 kb-Produktes durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren zu bestimmen. Der verbleibende Anteil des E-kodierenden Gens wurde direkt von dem 12 kb-Insert des Lambda-Klons sequenziert unter Verwendung zusätzlicher Oligonukleotide, die synthetisiert waren, um der E-kodierenden Genregion zu entsprechen.
Aus der gesamten Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 11) wird das E-kodierende Gen definiert als ein offenes Leseraster aus 1.377 Basenpaaren (die 460 Aminosäuren kodieren), wobei es mit dem Codon bei Position 154 startet und mit TAA an der Position 1531 endet. Eine mögliche Ribosomenbindungsstelle GGAGA wurde 5 Basen stromaufwärts des ATG-Translationsstartcodons lokalisiert. Dreißig Basen stromabwärts des TAA-Stopcodons lag die Sequenz ATAAAAATGCTTGAATTTCAAGCTATTTTTTAT, ein Palindrom, das eine Stammschleifenstruktur bilden könnte, welche möglicherweise als eine transkriptorische Terminationssequenz dient. Der Guanin- und Cytosin- (G + C)- Gesamtgehalt des Ekodierenden Gens beträgt 43,4%, was ähnlich ist zu dem berichteten G + C-Gehalt von 41 für das M. catarrhalis-Genom (Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3: 293–320).
Die von dem offenen Leseraster abgeleitete Aminosäuresequenz definiert E als ein Protein mit einer berechneten Molmasse von 49.334 Dalton. Die für E abgeleitete Aminosäuresequenz legte die Anwesenheit eines Signalpeptids mit einer möglichen Spaltstelle zwischen den Aminosäuren 25 (Ala) und 26 (Ala) nahe. Die ersten 24 Aminosäuren der mutmaßlichen Spaltstelle der von dem offenen Leseraster abgeleiteten Aminosäuresequenz entsprechen exakt der N-terminalen Proteinsequenz, die von dem gereinigten Außenmembranprotein E bestimmt wurde. Diese Beobachtungen bestätigen weiter, dass das Gen E kodiert, und dass E als ein Vorläufer synthetisiert wird, der ein Signalpeptid, das aus 25 Aminosäureresten zusammengesetzt ist, aufweist. Ein Hydrophobizitätsprofil der abgeleiteten Aminosäuresequenz (1) zeigte einen starken hydrophoben Anteil, der dem Signalpeptid entspricht. Die vorhergesagten antigenen Determinanten entsprechen den in 1 gezeigten hydrophilen Regionen. Diese antigenen Determinanten schließen die Aminosäuren 369 bis 374; 29 bis 34; und 294 bis 299 ein. Die vorhergesagte Molmasse des reifen Proteins beträgt 47.030 Dalton, was gut mit der Wanderung des Außenmembranproteins E in SDS-PAGE von M. catarrhalis enthaltenden Proben korreliert. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung von E zeigte, dass Alanin, Glycin, Leucin und Valin, die Aminosäuren sind, die am reichlichsten vorhandenen sind (Bereich 13%–18%), und dass keine Cysteinreste vorhanden sind.
Um die transkriptorische Initiationsstelle des E-kodierenden Gens zu bestimmen, wurde die Primer-Extensions-Analyse unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Espezifischen Primern (SEQ ID Nr.: 12 und SEQ ID Nr.: 13) durchgeführt, wobei diese mit dem 5'-Bereich der korrespondierenden mRNS hybridisieren. Gesamt-RNS wurde durch das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren aus M. catarrhalis-Stamm 25240 extrahiert. Die Espezifischen Primer wurden am 5'-Ende mit [³²P]-ATP markiert. Für die Primerverlängerung wurden 50 μg der Gesamt-RNS mit 100 fmol der markierten Primer dem Annealing unterzogen und bei 55°C für 45 Minuten inkubiert. Auf dieses folgte die Verlängerung mit reverser Transkriptase in der Anwesenheit von Desoxyribonukleosidtriphosphaten für eine Stunde bei 42°C. Das Primerextensionsprodukt wurde auf einem Acrylamidsequenziergel mit 8% Harnstoff analysiert. Die Didesoxynukleotidsequenzierreaktionen, die eine Sequenzierleiter erzeugten und mit denselben Primern geprimt waren, wurden in benachbarten Spuren ebenfalls der Elektrophorese unterzogen, um die genaue Base für die Initiierung des E-entsprechenden Transkriptes abzuschätzen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit einem Guanin-Rest an Position 75 startet, die 78 Basen stromaufwärts des ATG-Codons liegt. Die mögliche –10 TAAGAT-Sequenz oder die Pribnow-Box (Nukleotidposition 63–68) wurde sechs Basen stromaufwärts der +1-Startstelle der Transkription lokalisiert. Die –35 (Position 40–45) TTGTT-Sequenz wurde 17 Basen stromaufwärts der –10-Sequenz lokalisiert. Zwei Bereiche mit getrennter Dyadensymmetrie, 5''-TTAATTTCATTTAA-3' und 5'TACAAATGTGTAAGACTTTTGTA-3'', wurden stromabwärts der -35-Region identifiziert, die eine Rolle bei der Regulation der Expression des E-kodierenden Gens spielen könnten.
Basierend auf der Nukleotidsequenz des E-kodierenden Gens wurden drei Sätze an Oligonukleotidprimern synthetisiert und verwendet, um Teile des Gens zu amplifizieren durch Polymerasekettenreaktion, für Subklonierung und Analyse der Expression. Zwei Primer (SEQ ID Nr.: 14 und SEQ ID Nr.: 15) wurden verwendet, um 1.573 kb des Gens zu amplifizieren, wobei das amplifizierte Fragment, das gesamte Gen und die Promoter-Region enthielt. Ein weiterer Primersatz (SEQ ID Nr.: 16 und SEQ ID Nr.: 17) wurde verwendet, um 1.391 kb des Gens zu amplifizieren, welches die Sequenz enthielt, die das Leitpeptid mit dem Rest des Gens kodiert. Ein dritter Primersatz (SEQ ID Nr.: 17 und SEQ ID Nr.: 18) wurde verwendet, um 1.313 kb des Gens zu amplifizieren, das von der ersten Aminosäure des reifen Proteins bis zum Ende des Carboxy-Endes kodiert. Die drei amplifizierten Produkte, 1.573 kb, 1.391 kb und 1.313 kb, wurden getrennt in einen Vektor, Phagemid pCR-Script SK⁺, subkloniert und in E. coli unter Verwendung von Standardprotokollen transformiert. Versuche der Transformation mit dem rekombinanten Plasmid, das das 1.573 kb Fragment enthielt, waren erfolglos, wodurch wiederum nahegelegt wurde, dass die Expression des M. catarrhalis-Proteins E in E. coli toxisch ist für die transformierten Bakterien. Es wurden die Transformanten identifiziert, die rekombinante Plasmide mit dem 1.391 kb Insert (das gesamte offene Leseraster, ohne den Promoter) und das 1.313 kb Insert (Sequenz, die das reife Protein kodiert) enthielten. Die Bestätigung der Inserts, durch Sequenzieren der Enden der Inserts, zeigte, dass alle identifizierten Klone die Gen-Sequenzen in der falschen Orientierung für die Expression des Proteins durch den Plasmidpromoter enthielten; ein weiterer Beleg, dass die Expression von Protein E für E. coli toxisch ist.
Folglich erläutert dieses Ausführungsbeispiel, dass Nukleotidsequenzen, die E oder Teile davon kodieren, in verschiedene Vektoren, einschließlich Phagenvektoren und Plasmiden, inseriert werden können. Erfolgreiche Expression des Proteins und der Peptide von Protein E benötigt, dass entweder das Insert, das das Gen oder Genfragment enthält, welches Epitope von Protein E kodiert, oder der Vektor selber die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation enthalten, die kompatibel sind mit und erkannt werden durch das bestimmte Wirtssystem, das für die Expession verwendet wird. DNS, die E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide kodiert, kann synthetisiert oder isoliert und sequenziert werden, unter Verwendung der Verfahren und Primersequenzen, wie dargestellt gemäß den hierin beschriebenen Ausführungsbeispielen A, B und E. Eine Reihe an Wirtssystemen kann verwendet werden, um E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide zu exprimieren, welche einschließen aber nicht beschränkt sind auf Bakterien, die mit einem Bakteriophagenvektor, Plasmid-Vektor oder mit Cosmid-DNS transformiert sind; Hefe, die Hefevektoren enthält; Pilze, die Pilzvektoren enthalten; Insektenzelllinien, die mit Viren (z. B. Baculovirus) infiziert sind; und Säugerzelllinien, die mit Plasmid oder viralen Expressionsvektoren transfiziert sind, oder die infiziert sind mit rekombinantem Virus (z. B. Vakziniavirus, Adenovirus, adenoassoziiertem Virus, Retrovirus, etc.).
Unter Verwendung von im Stand der Technik der Molekularbiologie bekannten Verfahren, einschließlich der oben beschriebenen Verfahren, können zahlreiche Promoter und Enhancer in den Vektor oder die DNS-Sequenz, die E-Aminosäuresequenzen kodieren, d. h. rekombinantes Außenmembranprotein E, E-Peptide oder E-Oligopeptide, eingebaut werden, um die Expression der E-Aminosäuresequenz zu erhöhen, vorausgesetzt, dass die gesteigerte Expression der E-Aminosäuresequenzen verträglich ist mit (z. B. nicht toxisch ist für) dem bestimmten, verwendeten Wirtszellsystem. Folglich und wichtig kann die DNS-Sequenz aus dem E-Protein kodierenden Gen oder jeglichem Segment des Gens, das ein funktionelles Epitop des E-Proteins kodiert, bestehen. Weiterhin kann die DNS mit DNS, die andere Antigene kodiert, wie z. B. andere bakterielle Außenmembranproteine oder andere bakterielle, Pilz-, parasitäre oder virale Antigene, verschmolzen werden, um ein genetisch verschmolzenes (das ein gemeinsames Peptidrückgrat teilt), mulitivalentes Antigen zu schaffen, zur Verwendung als eine verbesserte Impfstoffzusammensetzung.
Die Auswahl des Promoters wird von dem verwendeten Expressionssystem abhängen. Promotoren unterscheiden sich in ihrer Stärke, d. h. der Fähigkeit, die Transkription zu erleichtern. Im Allgemeinen ist es für den Zweck der Expression eines klonierten Gens wünschenswert, einen starken Promoter zu verwenden, um ein hohes Maß der Transkription des Gens und der Expression in das Genprodukt zu erhalten. Beispiele schließen im Stand der Technik bekannte bakterielle, Phagen- oder Plasmid-Promotoren ein, bei denen ein hohes Maß an Transkription in einem Wirtszellsystem, einschließlich E. coli, beobachtet worden war, den lac-Promoter, trp-Promoter, recA-Promoter, ribosomalen RNS-Promoter, die P_Rund P_L-Promotoren, lacUV5, ompF, bla, lpp, und ähnliche, die verwendet werden können, um die Transkription der eingefügten DNS-Sequenz, die die E-Aminosäuresequenzen kodiert, bereitzustellen.
Zusätzlich können, falls E-Protein, E-Peptide oder E-Oligopeptide letal oder zerstörerisch für die Wirtszellen sein können, der/die Wirtszellstamm/linie und die Expressionsvektoren so gewählt werden, dass die Tätigkeit des Promoters solange gehemmt ist, bis sie spezifisch induziert wird. Zum Beispiel ist bei bestimmten Operons die Zugabe spezifischer Induktoren notwendig für die effiziente Transkription der eingefügten DNS (z. B. wird das lac-Operon induziert durch die Zugabe von Laktose oder Isopropylthio-beta-D galactosid). Eine Reihe an Operons, wie z. B. das trp-Operon, unterliegen unterschiedlichen Kontrollmechanismen. Das trp-Operon wird induziert, wenn Tryptophan im Wachstumsmedium fehlt. Der P_L-Promoter kann durch einen Anstieg der Temperatur von Wirtszellen induziert werden, die einen temperaturempfindlichen Lambda-Repressor enthalten. Auf diese Art und Weise kann mehr als 95% der Promoter-gerichteten Transkription in nicht induzierten Zellen inhibiert werden. Folglich kann die Expression von rekombinantem E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden kontrolliert werden durch die Kultur transfomierter oder transfizierter Zellen unter Bedingungen, so dass der Promoter, der die Expression der inserierten DNS, die E-Aminosäuren kodiert, kontrolliert, nicht induziert wird, und dass, wenn die Zellen eine geeignete Dichte in dem Wachstumsmedium erreichen, der Promoter induziert werden kann für die Expression der inserierten DNS.
Andere Kontrollelemente für die wirksame Gentranskription oder die Translation der Botschaft schließen Enhancer und regulatorische Signale ein. Enhancersequenzen sind DNS-Elemente, die die transkriptorische Effizienz zu erhöhen scheinen auf eine An und Weise, die vergleichsweise unabhängig von ihrer Position und Orientierung bezüglich eines nahegelegenen Gens ist. Folglich kann ein Enhancer in Abhängigkeit von dem verwendeten Wirtszellexpressionsvektorsystem entweder stromaufwärts oder stromabwärts von den eingefügten DNS-Sequenzen, die E-Aminosäuren kodieren, platziert werden, um die transkriptorische Effizienz zu erhöhen. Wie kürzlich in diesem Ausführungsbeispiel erläutert, wurden andere spezifische regulatorische Sequenzen identifiziert, die die Expression des Ekodierenden Gens bewirken können. Diese oder andere regulatorische Stellen, wie z. B. Transkriptions- oder Translationsinitiationssignale, können verwendet werden, um die Expression des Gens, das E oder Genfragmente davon kodiert, zu regulieren. Solche regulatorischen Elemente können in E-Aminosäuren-kodierende DNS-Sequenzen oder nahegelegene Vektor-DNS-Sequenzen eingefügt werden, unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren, die hierin beschrieben sind für die Insertion von DNS-Sequenzen.
Demgemäß können die Bereiche von M. catarrhalis-Nukleotidsequenzen, die E, E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren, in einen Expressionsvektor ligiert werden, an einer spezifischen Stelle in Bezug auf den Promoter, die Kontroll- und regulatorischen Elemente des Vektors, so dass wenn der rekombinante Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird, die E-spezifischen DNS-Sequenzen von M. catarrhalis in der Wirtszelle exprimiert werden können. Zum Beispiel können die E-spezifischen DNS-Sequenzen, die ihre eigenen regulatorischen Elemente enthalten, in einen Expressionsvektor ligiert werden, in einer Beziehung mit oder in Orientierung zu dem Vektor-Promoter und zu Kontrollelementen, was die Expression von E-Aminosäuresequenzen erlauben wird. Der rekombinante Vektor wird dann in die geeigneten Wirtszellen eingeführt und die Wirtszellen werden ausgewählt und gescreent auf jene Zellen, die den rekombinanten Vektor enthalten. Die Selektion und das Screening können durchgeführt werden, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, einschließlich dem Nachweis der Expression eines Markergens (z. B. Arzneimittel-Resistenzmarker), das in dem Plasmid vorhanden ist, Immunoscreening auf die Produktion von E-spezifischen Epitopen unter Verwendung von für E-spezifische Epitope erzeugten Antisera und Sondieren der DNS der Wirtszellen für E-spezifische Nukleotidsequenzen unter Verwendung von einem oder mehreren Oligonukleotiden und gemäß in Ausführungsbeispiel C hierin beschriebenen Verfahren.
Techniken der Gentechnik können auch verwendet werden, um die kodierten E-Peptide oder E-Proteine zu charakterisieren, zu modifizieren und/oder anzupassen. Zum Beispiel kann die ortsgerichtete Mutagenese, um ein Außenmembranproteinfragment in Bereichen außerhalb der geschützten Domänen zu modifizieren, wünschenswert sein, um die Löslichkeit des Subfragmentes zu erhöhen, um eine leichtere Aufreinigung zu ermöglichen. Weiterhin können Techniken der Gentechnik verwendet werden, um DNS-Sequenzen herzustellen, die einen Teil der Aminosäuresequenz von E kodieren. Zum Beispiel kann aus der als SEQ ID Nr. 11 offenbarten Sequenz bestimmt werden, welches Restriktionsenzym oder welche Kombination an Restriktionsenzymen verwendet werden können, um Sequenzen herzustellen, die E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren. Die Restriktionsenzymauswahl kann durchgeführt werden, um nicht die Immunpotenz des resultierenden Peptids oder Oligopeptids zu zerstören. Antigenstellen eines Proteins können in der Größe variieren, aber können aus ungefähr 7 bis ungefähr 14 Aminosäuren bestehen. Folglich, kann ein Protein von der Größe des E viele einzelne Antigenstellen enthalten; folglich könnten viele Genteilsequenzen Antigenepitope von E kodieren. Demzufolge können unter Verwendung von 1 und SEQ ID Nr. 11 als Führung, Restriktionsenzymkombinationen verwendet werden, um DNS-Sequenzen herzustellen, die, wenn sie in den geeigneten Vektor eingefügt werden, fähig sind, die Produktion von E-spezifischen Aminosäuresequenzen (Peptiden oder Oligopeptiden), die unterschiedliche Antigenepitope enthalten, zu lenken.
Ausführungsbeipiel B
Konservierung des E-kodierenden Gens unter M. catarrhalis-Stämmen.
Vorangegangene Studien, unter Verwendung von Antikörperadsorptionsexperimenten, zeigten, dass eine oder mehrere der oberflächenexponierten Determinanten von M. catarrhalis innerhalb der meisten Stämme antigen konserviert waren (Murphy et al., 1989, supra). Diese Studien waren jedoch nicht auf die Konservierung des E-kodierenden Gens unter den Stämmen gerichtet. Für die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung muss das E-kodierende Gen, um in diagnostischen Ansätzen nützlich zu sein, hochkonserviert sein unter den Stämmen von M. catarrhalis. Zusätzlich zeigt ein hochkonserviertes Gen, dass die Proteinsequenz auch hochkonserviert ist. Damit ein bakterielles Protein oder Peptid als ein Antigen in Impfformulierungen gegen Infektion, verursacht durch M. catarrhalis, nützlich ist, muss das Protein oder Peptid Epitope enthalten, die sowohl immunogen als auch unter den Stämmen von M. catarrhalis konserviert sind. Um den Grad der Konservierung des E-kodierenden Gens unter den Stämmen von M. catarrhalis zu bestimmen, wurde genomische DNS gereinigt und aus 19 Isolaten, die aus unterschiedlichen klinischen und geographischen Quellen gewonnen worden waren, aufgereinigt und analysiert. Zuerst wurden die E-spezifischen Gensequenzen der gereinigten DNS der Isolate unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion und von Primern (SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17) amplifiziert. Die Analyse der amplifizierten Produkte durch Agarosegelelektrophorese zeigte, dass das Ekodierende Gen in allen untersuchten Stämmen von derselben Größe war (ungefähr 1,4 kb). Zusätzlich wurden Längenpolymorphismen der Restriktionsfragmente analysiert durch Beschränken der amplifizierten Produkte in Fragmente unter Verwendung von entweder Hind III, Sau96 I, Bsl I, oder Bsg I und Sichtbarmachen der Fragmente durch Elektrophorese auf einem 6% Acrylamidgel, gefärbt mit Ethidiumbromid. Das Bandenmuster der amplifizierten Produkte zeigte keine Abweichung unter den untersuchten Stämmen bezüglich der Anwesenheit der Restriktionsstellen und zeigte geringfügige Unterschiede in der beobachteten Größe der Fragmente, wie dargestellt in 2A für Sau96 I und 2B für Bsl I). Von den vier bei der Restriktion der amplifizierten Produkte verwendeten unterschiedlichen Enzymen, schnitten drei der Enzyme an drei unterschiedlichen Stellen innerhalb der amplifizierten Produkte und eines schnitt an zwei unterschiedlichen Stellen. Folglich zeigen die ähnlichen Ergebnisse in allen Stämmen, dass die an den elf Stellen festgestellten Sequenzen innerhalb der untersuchten Stämme identisch sind. Die in Tabelle 1 aufgelisteten Stämme sind die auf Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus untersuchten Stämme, in derselben Reihenfolge, wie sie auf den Gelen erscheinen (gezeigt in 2A und 2B, beginnend mit Spur 2). Unterschiede in den Restriktionsmustern innerhalb der unterschiedlichen Stämme mögen existieren, aber Unterschiede wurden nicht mit diesen bestimmten untersuchten Restriktionsenzymen gesehen.
Tabelle 1 Isolate von Moraxella catarrhalis
Diese Ergebnisse zeigen, dass das E-kodierende Gen hochkonserviert ist unter den Stämmen von M. catarrhalis und demzufolge haben die hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen Anwendungen für die diagnostische Verwendung und die Verwendung als Impfstoff.
Ausführungsbeispiel C
Verfahren zur Verwendung von E-spezifischen Nukleotidsequenzen in molekularen Diagnoseansätzen für den Nachweis von M. catarrhalis.
Wegen der Konservierung des E-kodierenden Gens, wie in Ausführungsbeispiel B offenbart, können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in molekularen Diagnoseassays für den Nachweis von genetischem Material von M. catarrhalis verwendet werden. Insbesondere, und wie dargestellt durch SEQ ID Nr. 1 – SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 12 – SEQ ID Nr. 18, können E-sequenzspezifische Oligonukleotide synthetisiert werden zur Verwendung als Primer und/oder Sonden bei der Amplifizierung und beim Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren von M. catarrhalis. Jüngere Fortschritte in der Molekularbiologie stellten zahlreiche Mittel bereit, um Nukleinsäuresequenzen enzymatisch zu amplifizieren. Das zur Zeit am häufigsten verwendete Verfahren, PCR^TM (Polymerasekettenreaktion, Cetus Corporation) schließt die Verwendung einer thermostabilen DNS-Polymerase, von bekannten Sequenzen als Primer und Heizzyklen, die die replizierenden Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Stränge trennt und ein Gen von Interesse exponentiell amplifiziert, ein. Andere sich gegenwärtig in der Entwicklung befindliche Amplifikationsverfahren schließen LCR^TM ein (Ligasekettenreaktion, BioTechnica International), die DNS-Ligase verwendet, und eine Sonde, die aus zwei Hälften eines DNS-Segmentes besteht, das komplementär ist zu der Sequenz der zu amplifizierenden DNS; Enzym-QB-Replikase (Gene-Trak Systems) und eine Ribonukleinsäure (RNS)-Sequenzmatrize, die angeheftet ist an eine Sonde, die komplementär ist zu der DNS, die kopiert werden soll, was verwendet wird, um eine DNS-Matrize für die exponentielle Produktion von komplementärer RNS herzustellen; und NASBA^TM (Nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation, Cangene Corporation), die durchgeführt werden kann auf RNS oder DNS als der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz.
Nukleinsäuresonden, die fähig sind zur Hybridisierung mit spezifischen Gensequenzen, wurden erfolgreich verwendet, um spezifische Pathogene in biologischen Proben in Empfindlichkeitsniveaus, die 10³–10⁴ Organismen pro Probe erreichen, nachzuweisen (1990, Gene Probes for Bacteria, Hrsg. Macario und deMacario, Academic Press). Gekoppelt mit einem Verfahren, das die Amplifikation spezifischer Ziel-DNS-Sequenzen erlaubt, können speziesspezifische Nukleinsäuresonden das Maß der Empfindlichkeit des Nachweises von Organismen in einer klinischen Probe stark erhöhen. Die Verwendung dieser Sonden kann den direkten Nachweis ermöglichen, ohne sich auf vorangegangene Kultur- und/oder gewöhnliche biochemische Identifizierungstechniken zu verlassen. Dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist auf Primer gerichtet, die speziesspezifische Sequenzen des E-kodierenden Gens von M. catarrhalis amplifizieren, und es ist gerichtet auf Sonden, die spezifisch mit diesen amplifizierten DNS-Fragmenten hybridisieren. Unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung und gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung können so wenig wie ein M. catarrhalis-Organismus in der Anwesenheit von 10 μg/ml fremder DNS nachgewiesen werden.
Dieses Ausführungsbeispiel ist auf speziesspezifische Oligonukleotide gerichtet, die verwendet werden können, um Sequenzen von M. catarrhalis-DNS zu amplifizieren, falls vorhanden, aus DNS, die extrahiert wurde aus klinischen Proben, einschließlich Mittelohrflüssigkeit, Sputum, Blut und Flüssigkeiten aus dem Nasopharynx, Auge und Drüsen; und um anschließend zu bestimmen, ob Amplifikation sich ereignete. In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Paar an M. catarrhalis-spezifischen DNS-Oligonukleotidprimern verwendet, um mit genomischer DNS von M. catarrhalis zu hybridisieren, die in aus klinischen Proben extrahierter DNS vorhanden sein kann, und um das spezifische Segment der genomischen DNS zwischen den beiden flankierenden Primern zu amplifizieren unter Verwendung von enzymatischer Synthese und dem Durchlaufenlassen von Temperaturzyklen. Jedes Primerpaar ist so gestaltet, dass es nur mit den M. catarrhalis-Nukleotidsequenzen hybridisiert, die das E-kodierende Gen enthalten (d. h. innerhalb des Bereiches des Genoms, das SEQ ID Nr. 11 enthält), für die sie so synthetisiert worden waren, um komplementär zu diesen zu sein; einer für jeden Strang der doppelsträngigen DNS. Folglich ist die Reaktion sogar in der Anwesenheit von Mikrogramm-Mengen heterologer DNS spezifisch. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird auf den Primer, der abgeleitet wurde aus der Sequenz des positiven (Gen-) Strangs der DNS, Bezug genommen werden durch „positiver Primer", und auf den Primer, der abgeleitet wurde von der Sequenz des negativen (komplementären) Strangs, wird Bezug genommen werden durch „negativer Primer".
Die Amplifikation der DNS kann durch jegliches der kommerziell erhältlichen Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Polymerasekettenreaktion verwendet werden, um die DNS zu amplifizieren. Wenn die Primer einmal hybridisiert haben an die gegenüberliegenden Strängen der Ziel-DNS wird die Temperatur erhöht, um die Replikation des spezifischen Segmentes der DNS über den Bereich zwischen den beiden Primern durch eine thermostabile DNS-Polymerase zu erlauben. Dann lässt man die Reaktion wiederholt Thermozyklen durchlaufen, so dass bei jedem Zyklus die Menge der DNS, die die Sequenzen zwischen den beiden Primern darstellt, verdoppelt wird und die spezifische Amplifikation der M. catarrhalis-DNS-Sequenzen, falls vorhanden, resultiert. Die weitere Identifizierung des amplifizierten DNS-Fragmentes, wie abgeleitet von der M. catarrhalis-DNS, kann durchgeführt werden durch Flüssighybridisierung. Dieser Test nutzt eine oder mehrere markierte Oligonukleotide als Sonden, um spezifisch an das amplifizierte Segment der M. catarrhalis-DNS zu hybridisieren. Der Nachweis des Vorhandenseins sequenzspezifischer amplifizierter DNS kann durchgeführt werden unter Verwendung eines jeglichen von zahlreichen im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. eine Gel-Retentions-Analyse mit Autoradiographie. Folglich stellen die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung eine Basis für die Synthese von Oligonukleotiden bereit, die gewerbliche Anwendungen in Diagnosekits für den Nachweis von M. catarrhalis haben. In einem verwandten Ausführungsbeispiel können die als Primer verwendeten Oligonukleotide direkt markiert werden oder synthetisiert werden, um eine Markierung einzubauen. In Abhängigkeit von der verwendeten Markierung können die Amplifikationsprodukte dann nachgewiesen werden, nachdem sie auf eine Affinitätsmatrix gebunden haben, unter Verwendung von Isotopen- oder colorimentrischem Nachweis.
Die DNS kann extrahiert werden aus klinischen Proben, die M. catarrhalis enthalten könnten, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Zum Beispiel können die in der Probe enthaltenen Zellen gewaschen werden in TE-Puffer und durch Zentrifugation pelletiert werden. Die Zellen können dann in 100 μl Amplifikations-Reaktionspuffer, der Detergenzien und Proteinase K enthält, resuspendiert werden. Unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion kann die resultierende Probe zusammengesetzt sein aus den Zellen in 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 0,45% NP40^TM, 0,045% Tween 20^TM und 60 μg/ml Proteinase K Die Probe wird im 55°C-Wasserbad für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wird die Probe bei 95°C für 10 Minuten inkubiert, um die Proteinase K zu hitzeinaktivieren. Die Probe kann dann amplifiziert werden in Übereinstimmung mit dem Protokoll für die Polymerasekettenreaktion, wie unten ausgeführt.
Die M. catarrhalis-DNS kann unter Verwendung jedes von zahlreichen Protokollen für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden. In einer Art dieses Ausführungsbeispiels wurde das E-kodierende Gen von 19 klinischen Isolaten von B. catarrhalis isoliert unter Verwendung der folgenden Bedingungen. Die zu amplifizierende DNS (~1 μg genomische DNS) wurde auf 0,5 μl-Mikrozentrifugenröhrchen verteilt und das Volumen wurde auf 50 μl angepasst indem eine Reaktionsmischung hinzugefügt wurde, die 0,2 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,25 μg jedes positiven und negativen Oligonukleotidprimers, 1 Einheit thermostabile DNS-Polymerase, Polymerase-10×-Puffer (5 μl), 3 mM MgSO₄ (Endkonzentration) und steriles destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen zu erreichen, enthält. Die DNS-Polymerase wird zu der Reaktionsmischung unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt und wird sanft vermischt, nicht verwirbelt. Eine Schicht Mineralöl, ungefähr 2 Tropfen, wird zu jedem Röhrchen hinzugefügt und dann werden die Röhrchen in den Thermocycler gestellt. Dreißig bis fünfunddreißig Zyklen sind im Allgemeinen ausreichend für die bakterielle DNS-Amplifikation. Ein Zyklus besteht aus 15 Sekunden bei 96°C, 1 Minute bei 62°C und 1 Minute bei 74°C. Der erste Zyklus schließt eine 3-minütige Inkubation bei 95°C ein, um die vollständige Denaturierung sicherzustellen.
Oligonukleotide, die nützlich sind als Primer oder Sonden, die spezifisch mit dem Ekodierenden Gen von M. catarrhalis hybridisieren, und die verwendet werden bei DNS-Amplifikation und/oder -Detektion, können biochemisch synthetisiert werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren aus den Nukleotidsequenzen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind. Die Spezifität der Oligonukleotide für M. catarrhalis kann überprüft werden durch eine Genbank-Datenbank- (Genbank) Recherche für jede einzelne Sequenz. Im Allgemeinen sollten die Oligonukleotide selektiert werden auf einen niedrigen G-C-Gehalt. Die Primerpaare, die verwendet wurden für dieses Ausführungsbeispiel, um das gesamte E-kodierende Gen zu amplifizieren, schließen die SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15 ein. Die Primerpaare, die verwendet wurden um Teile des Gens zu amplifizieren, schließen SEQ ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17; und SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 ein.
Für Detektionszwecke können die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung mit einem Radioisotop endmarkiert werden. Sondensequenzen innerhalb der beiden für die Amplifikation der Gensequenz verwendeten Primer können endmarkiert werden unter Verwendung von T₄-Polynukleotidkinase und gamma-³²P-ATP. Zwanzig pMol Sonden-DNS in Kinasepuffer (50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Spermidin-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) werden vermischt mit 120 μCi gamma-³²P-ATP und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die markierte Sonde wird von nicht eingebauter Markierung abgetrennt auf einem 8 %Acrylamidgel, das für 1 Stunde bei 200 Volt in Tris-Borat-EDTA (TBE)- Puffer bei Raumtemperatur laufen gelassen wurde. Die markierte Sonde wird zuerst lokalisiert, indem das Acrylamidgel einem Röntgenfilm für drei Minuten ausgesetzt wird. Das resultierende Autoradiogramm wird dann unter das Gel gelegt und die Bande, die die markierte Sonde enthält, wird von dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wird in einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser zerkleinert und die Sonde wird durch Schüttelinkubation über Nacht bei 37°C eluiert. Die eluierte Sonde wird von den Gelfragmenten durch Zentrifugation unter Verwendung einer Chromatographie-Prepsäule getrennt. Die Radioaktivität der Sonde wird bestimmt durch Zählen von einem Mikroliter der markierten Sonde auf einem Glasfaserfilter durch Flüssigkeitsszintillation. Solche Sondensequenzen können aus jeder der Sequenzen ausgewählt werden, die ausgewiesen sind als SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 12 bis SEQ ID Nr. 18, vorausgesetzt, die Sondensequenz befindet sich innerhalb der beiden Primer, die für die Amplifikation, der in der vorliegenden Erfindung offenbarten, gewünschten Nukleotidsequenz, verwendet werden.
Alternative, im Stand der Technik bekannte Verfahren können verwendet werden, um den Nachweis der amplifizierten Zielsequenzen, in Übereinstimmung mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung, zu verbessern. Die Empfindlichkeit des Nachweises der amplifizierten DNS-Sequenzen kann verbessert werden, indem die Sequenzen der Flüssighybridisierung unterzogen werden. Alternative, im Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren, zusätzlich zu Gelelektrophorese und Gelelektrophorese mit Southern-Hybridisierung und Autoradiographie, die verwendet werden können mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung, schließen ein: Restriktionsenzymverdauung mit Gelelektrophorese; Slot-Blot-Hybridisierung mit einer markierten Oligonukleotidsonde; Amplifikation mit einem radiomarkierten Primer mit Gelelektrophorese, Southern-Hybridisierung und Autoradiographie; Amplifikation mit einem radiomarkierten Primer mit Dot-Blot und Autoradiographie; Amplifikation mit Oligonukleotiden, die Affinitätsmarkierungen (z. B. Biotin; oder einen Primer, der Biotin einbaut, und der andere Primer mit einer Sequenz, die spezifisch ist für ein DNS-bindendes Protein) aufweisen, gefolgt von dem Nachweis in einem affinitätsbasierten Ansatz (z. B. ELISA); und Amplifikation mit Oligonukleotiden, die Fluorophore enthalten, gefolgt von Fluoreszenznachweis.
Ein Ausführungsbeispiel nicht isotopischer Detektion schließt den Einbau von Biotin in die Oligonukleotidprimer der vorliegenden Erfindung ein. Die 5'-Aminogruppe der Primer können biotinyliert sein mit Sulfo-NHS-Biotin, oder Biotin kann direkt eingebaut werden in den Primer, indem der Primer in Anwesenheit von Biotin-markierten dNTPs synthetisiert wird. Die nicht isotopisch markierten Primer können dann verwendet werden für die Amplifikation von DNS aus einer klinischen Probe. Der Nachweis für die Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Zielsequenzen kann durchgeführt werden, indem die amplifizierten Zielsequenzen eingefangen werden unter Verwendung einer Affinitätsmatrix mit daran gebundenem Avidin, gefolgt von der Inkubation mit einem Avidinkonjugat, das ein Enzym enthält, das verwendet werden kann, um den Komplex mit anschließender Substratentwicklung sichtbar zu machen. Alternativ können die amplifizierten Zielsequenzen immobilisiert werden durch Hybridisierung an die entsprechenden Sonden der Zielsequenz, worin die Sonden an einer Matrix befestigt worden sind. Der Nachweis kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Avidinkonjugates, das ein Enzym enthält, welches verwendet werden kann, um den Komplex mit anschließender Substratentwicklung sichtbar zu machen.
Ausführungsbeispiel D
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden in diagnostischen Immunoassays.
E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide können aufgereinigt werden zur Verwendung als ein Immunogen in Impfformulierungen; und als ein Antigen für diagnostische Tests oder zur Herstellung von M. catarrhalis-spezifischen Antisera mit therapeutischem und/oder diagnostischem Wert. E-Protein aus M. catarrhalis oder Peptide davon, oder rekombinantes E-Protein, rekombinante E-Peptide oder rekombinante E-Oligopeptide, hergestellt von einem Expressionsvektorsystem, können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren aufgereinigt werden, einschließlich Detergensextraktion, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, Immunoaffinitäts- oder Größenbestimmungssäulen), differentieller Zentrifugation, differentieller Löslichkeit oder anderen Standardtechniken für die Reinigung von Proteinen. Zum Beispiel kann eine teilweise gereinigte Zubereitung, die primär bakterielle Außenmembranproteine enthält, wie folgt zubereitet werden. Bakterien, die E exprimieren, wurden von 30 Schokoladenagarplatten in 25 ml PBS, pH 7,2 geschabt und durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 20 Minuten bei 4°C geerntet. Das bakterielle Pellet wurde resuspendiert in 10 ml 1 M Natriumacetat – 0,001 M β-Mercaptoethanol (pH 4,0). Ein 90-ml-Volumen einer Lösung, die 5% Zwittergent Z 3– 14 (Calbiochem-Behring) und 0,5% M CaCl₂ enthält, wurde hinzugefügt und die Suspension wurde vermischt für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Nukleinsäuren wurden gefällt durch die Zugabe von 25 ml kaltem Ethanol und anschließender Zentrifugation bei 17.000 × g für 10 Minuten bei 4°C. Die verbleibenden Proteine wurden gefällt durch die Zugabe von 375 ml kaltem Ethanol und gesammelt durch Zentrifugation bei 17.000 × g für 20 Minuten bei 4°C. Den Pellets wurde ermöglicht zu trocknen und sie wurden dann in 10 ml Detergenspuffer, der 0,05% Zwittergent, 0,05 M Tris, 0,01 M EDTA, pH 8,0 enthält, suspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Die bakteriellen Außenmembranproteine sind in der löslichen Fraktion des Detergenspuffers nach der Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4°C vorhanden.
Die Immunoreinigung des E-Proteins von einer Außenmembranproteinzubereitung kann unter im Stand der Technik für die Immunoaffinitätschromatographie bekannten Verfahren durchgeführt werden. E-spezifische monoklonale Antikörper können an eine Chromatographiematrix gekoppelt werden, um eine Affinitätsmatrix zu bilden. Die Außenmembranproteinzubereitung wird dann mit der Affinitätsmatrix inkubiert, wodurch den Antikörpern ermöglicht wird, an E zu binden. Die Affinitätsmatrix wird dann gewaschen, um ungebundene Bestandteile zu entfernen, und E wird dann eluiert von der Affinitätsmatrix, wodurch eine gereinigte Zubereitung von E-Protein resultiert. Das gereinigte E kann als ein Antigen für diagnostische Tests verwendet werden oder kann chemisch oder enzymatisch in Peptide gespalten werden unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind. Alternativ können E-Peptide oder Oligopeptide chemisch synthetisiert werden unter Verwendung der Aminosäuresequenz, die abgeleitet wird von dem E-kodierenden Gen als Bezug. Rekombinantes E-Protein kann gereinigt werden unter Verwendung von ähnlichen Verfahren.
E-Oligopeptide werden hierin als eine Reihe von Peptiden definiert, die einem Teil der Aminosäuresequenz von E-Protein, wie offenbart in SEQ ID Nr. 11, entspricht, die als ein Ganzes oder chemisch gekoppelt synthetisiert werden. Solche Peptide oder Oligopeptide können synthetisiert werden unter Verwendung von einem der zahlreichen im Stand der Technik bekannten Verfahren der Peptidsynthese, einschließlich der Standardfeststoffpeptidsynthese unter Verwendung von tert-Butyloxycarbonylaminosäuren (Mitchell et al., 1978, J. Org. Chem. 43: 2845–2852), unter Verwendung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonylaminosäuren auf einem Polyamidträger (Dryland et al., 1986, J. Chem. So. Perkin Trans. I, 125–137); durch Pepscan-Synthese (Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 03: 259; 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998); oder durch Standardflüssigphasenpeptidsynthese. Modifikation der Peptide oder Oligopeptide, wie zum Beispiel durch Deletion oder Substitution von Aminosäuren (und einschließlich Extensionen und Additionen an Aminosäuren) und auf anderen Wegen, kann so durchgeführt werden, dass nicht wesentlich von den immunologischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids abgewichen wird. Insbesondere kann die Aminosäuresequenz des E-Proteins geändert werden durch Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren mit funktionell äquivalenten Aminosäuren, was in einer Änderung resultiert, die still ist in Begriffen eines beobachteten Unterschieds in dem physikochemischen Verhalten des Proteins, Peptids oder Oligopeptids.
Gereinigtes E-Protein, gereinigte E-Peptide und E-Oligopeptide können verwendet werden als Antigene in Immunoassays für den Nachweis von Moraxella catarrhalisspezifischen Antisera, die vorhanden sind in der Körperflüssigkeit eines Individuums, bei dem vermutet wird, dass es eine Infektion hat, die verursacht wird durch M. catarrhalis. Die Körperflüssigkeiten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Mittelohrflüssigkeit, Sputum, Blut und Flüssigkeiten von dem Nasopharynx, Auge und Drüsen. Der Nachweis von E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden als ein Antigen in Immunoassays, schließt jeden im Stand der Technik bekannten Immunoassay ein, einschließlich aber nicht beschränkt auf Radioimmunoassay, enzymgekoppelte Immunoadsorptionsbestimmung (ELISA), „Sandwich"-Assay, Präzipitinreaktion, Agglutinationsassay, Fluoreszenzimmunoassay und chemilumineszenzbasierter Immunoassay.
Ausführungsbeispiel E
Verfahren und Zusammensetzungen für Impfformulierungen in Bezug auf E, E-Peptide und E-Oligopeptide.
Dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung dient der Bereitstellung von E-Protein und/oder Peptiden davon, die verwendet werden als Immunogene in einem prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfstoff für die aktive Immunisierung, um vor Infektionen, die durch M. catarrhalis verursacht sind, zu schützen oder diese zu behandeln. Für die Impfstoffentwicklung können die E-spezifischen Aminosäuresequenzen, die das Immunogen enthalten, von M. catarrhalis aufgereinigt werden, oder sie können aufgereinigt werden von einem Wirt, der einen rekombinanten Vektor enthält, der E, E-Peptide oder E-Oligopeptide exprimiert. Solche Wirte schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf bakterielle Transformanten, Hefetransformanten, fädige Pilztransformanten und kultivierte Zellen, die entweder infiziert oder transfiziert wurden mit einem Vektor, der E-Aminosäuresequenzen kodiert. Peptide oder Oligopeptide, die Teilen des E-Proteins entsprechen, können durch chemische oder enzymatische Spaltung des E-Proteins hergestellt werden, oder chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren und mit der Aminosäuresequenz, die aus der Nukleotidsequenz des E-kodierenden Gens als Bezug abgeleitet werden. Alternativ können E-Peptide oder E-Oligopeptide von einem rekombinanten Vektor hergestellt werden. In jedem Fall ist das E-Protein-, E-Peptid- oder E-Oligopeptid-Immunogen als das relevante immunogene Material in der Impfformulierung eingeschlossen und ist in therapeutisch wirksamen Mengen eingeschlossen, um eine Immunantwort zu induzieren. Es sind viele Verfahren bekannt für das Einführen einer Impfformulierung in den zu impfenden Menschen oder das zu impfende Tier. Diese schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, okulare, intranasale und orale Verabreichung. Der Impfstoff kann weiterhin einen physiologischen Trägerstoff, wie z. B. eine Lösung, ein Polymer oder Liposomen enthalten; und einen Hilfsstoff oder eine Kombination davon.
Zahlreiche Hilfsstoffe werden im Zusammenhang mit Impfformulierungen verwendet. Die Hilfsstoffe helfen dabei, eine dauerhaftere und ein höheres Maß an Immunität zu erreichen unter Verwendung von kleineren Mengen an Vakzin-Antigen oder geringeren Dosen, als wenn das Vakzin-Antigen alleine verabreicht würde. Der Mechanismus der Hilfsmittelwirkung ist komplex und nicht vollständig verstanden. Er mag jedoch die Immunomodulation durch die Stimulation der Cytokinproduktion, Phagozytose und andere Aktivitäten des Retikuloendothelialensystems einschließen, ebenso wie die verzögerte Freisetzung und Abbau/Bearbeitung des Antigens, um die Immunerkennung zu verstärken. Beispiele an Hilfsmitteln schließen ein inkompletes Freund's Adjuvans, Adjuvans 65 (enthaltend Erdnussöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat), Ölemulsionen, Ribi Adjuvans, die Pluronic-Polyole, Polyamine, Avridin, Quil A, Saponin, MPL, QS-21 und Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, etc.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel dieser Art der Erfindung schließt die Herstellung von E-spezifischen Aminosäuresequenzen als ein Hapten ein, d. h. ein Molekül, das nicht selber eine Immunantwort auslösen kann. In solch einem Fall kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein anderes immunogenes Molekül gebunden werden, das dem gekoppelten Hapten Immunogenität verleihen wird, wenn es dem Immunsystem ausgesetzt wird. Folglich kann solch ein E-spezifisches, an ein Trägermolekül gekoppeltes Hapten, das Immunogen in einer Impfformulierung sein.
Eine weitere Art dieses Ausführungsbeispiels stellt sowohl einen lebenden rekombinanten viralen Impfstoff, rekombinanten bakteriellen Impfstoff rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoff, als auch einen inaktivierten rekombinanten viralen Impfstoff bereit, der verwendet wird, um vor durch M. catarrhalis verursachte Infektionen zu schützen. Vakziniavirus ist das im Stand der Technik bestbekannte Beispiel eines infektiösen Virus, das bearbeitet ist, um Vakzinantigene, die von anderen Organismen abgeleitet sind, zu exprimieren. Das rekombinante, lebende Vakziniavirus, das abgeschwächt ist oder anderweitig behandelt ist, so dass es selbst keine Krankheit verursacht, wird verwendet, um den Wirt zu immunisieren. Die anschließende Replikation des rekombinanten Virus, innerhalb des Wirts, stellt eine fortwährende Stimulierung des Immunsystems mit den Impfstoffantigenen, wie z. B. E oder E-Peptiden bereit, wodurch eine langdauernde Immunität verschafft wird. Andere lebende Vakzinvektoren schließen ein: Adenovirus, Cytomegalovirus und vorzugsweise die Pockenviren, wie z. B. Vakzinia (Paoletti und Panicali, U.S. Patent Nr. 4,603,112) und abgeschwächte Salmonella-Stämme (Stocker et al., U.S. Patent Nrn. 5,210,035; 4,837,151; und 4,735,801; und Curtiss et al., 1988, Vaccine 6: 155–160). Lebende Impfstoffe sind besonders vorteilhaft, da sie das Immunsystem kontinuierlich stimulieren, was eine im Wesentlichen lang anhaltende Immunität verleihen kann. Wenn die Immunantwort vor der anschließenden M. catarrhalis-Infektion schützt, kann der lebende Impfstoff selber in einem vorbeugenden Impfstoff gegen M. catarrhalis verwendet werden.
Um diese An des Ausführungsbeispiels zu erläutern, kann unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken, wie z. B. jene, die im Ausführungsbeispiel A erläutert sind, das E-kodierende Gen oder ein Genfragment, das ein oder mehrere E-Peptide kodiert, in die genomische DNS des Vakziniavirus an einer Stelle eingefügt werden, die die Expression der E-Epitope ermöglicht, aber das Wachstum oder die Replikation des Vakziniavirusvektors nicht negativ beeinflusst. Das resultierende rekombinante Virus kann als das Immunogen in einer Impfformulierung verwendet werden. Dieselben Verfahren können verwendet werden, um eine inaktivierte rekombinante virale Impfformulierung zu bilden, mit der Ausnahme, dass das rekombinante Virus inaktiviert ist, wie zum Beispiel durch im Stand der Technik bekannte chemische Mittel, vor der Verwendung als ein Immunogen und ohne die Immunogenität des exprimierten Immunogens wesentlich zu beeinflussen. Eine Mischung der inaktivierten Viren, die unterschiedliche Epitope exprimieren, kann bei der Formulierung eines multivalenten inaktivierten Impfstoffs verwendet werden. In jedem Fall kann der inaktivierte rekombinante Impfstoff oder die Mischung inaktivierter Viren formuliert werden mit einem geeigneten Hilfsstoff, um die immunologische Antwort auf die Vakzinantigene zu verstärken.
In einer weiteren Variation dieses Ausführungsbeispiels wird das genetische Material direkt verwendet als die Impfformulierung. Nukleinsäure (DNS oder RNS), die Sequenzen enthält, die E, E-Peptid oder E-Oligopeptid kodieren, die operativ gekoppelt sind an ein oder mehrere regulatorische Elemente, können direkt eingeführt werden, um das Individuum zu impfen („direkter Gentransfer") gegen pathogene Stämme von M. catarrhalis. Der direkte Gentransfer in ein geimpftes Individuum, der in der Expression des genetischen Materials durch die Zellen, wie z. B. Gefäßendothelzellen, ebenso wie das Gewebe der Hauptorgane des Individuums resultiert, wurde durch im Stand der Technik vorhandene Techniken gezeigt, wie z. B. durch die intravenöse Injektion eines Expressionsplasmid : kationischer Liposomen-Komplexes (Zhu et al., 1993, Science 261: 209–211). Andere wirksame Verfahren, um Vektor-DNS in eine Zielzelle zu überbringen, sind im Stand der Technik bekannt. In einem Beispiel wurde gereinigte rekombinante Plasmid-DNS, die virale Gene enthält, verwendet, um Vakzine zu impfen (entweder parenteral, mukosal oder über Genkanonenimmunisierung), um eine schützende Immunantwort zu induzieren (Fynan et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478–11482). In einem anderen Beispiel können von einem Individuum entnommene Zellen transfiziert oder elektroperforiert werden durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren, was in der Einführung der rekombinanten Vektor-DNS in die Zielzelle resultiert. Zellen, die die rekombinante Vektor-DNS enthalten, können dann selektiert werden für die Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. über einen Selektionsmarker, der in dem Vektor exprimiert wird und die ausgewählten Zellen können dann erneut in das Individuum eingeführt werden, um E-Protein, E-Peptid oder E-Oligopeptid zu exprimieren.
Ein bevorzugtes Verfahren der Impfung mit genetischem Material umfasst den Scliritt der Verabreichung des Nukleinsäuremoleküls an das Individuum, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eines oder mehrere E-Proteine, E-Peptide oder E-Oligopeptide kodiert, wobei das Nukleinsäuremolekül wirksam an eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, die notwendig sind für die Expression, gekoppelt ist. Das Nukleinsäuremolekül kann direkt verabreicht werden, oder es kann zuerst in einen viralen Vektor eingeführt werden und über den Vektor verabreicht werden. Das Nukleinsäuremolekül kann in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden und kann Verbindungen enthalten, die die Wirksamkeit des Impfstoffs steigern. Diese zusätzlichen Verbindungen schließen ein aber sind nicht beschränkt auf Hilfsmittel, die die Immunantwort modulieren und verstärken oder andere Verbindungen, die die Aufnahme von Nukleinsäure durch die Zellen steigern. Die Immunisierung mit dem Nukleinsäuremolekül kann durch jeden elterlichen [Anmerkung des Übersetzers: muss richtig wohl heißen: parenteralen] Weg (intravenös, intraperitoneal, intradermal, subkutan oder intramuskulär) oder über Kontakt mit Schleimhautoberflächen des Nasopharynx, der Trachea oder des Gastrointestinaltraktes erfolgen.
Als eine Alternative zur aktiven Immunisierung, z. B. dort wo ein immungeschwächtes Individuum unter einer möglicherweise lebensbedrohenden, durch M. catarrhalis verursachten Infektion leidet, kann die Immunisierung passiv sein, d. h. eine Immunisierung, die die Verabreichung von aufgereinigtem menschlichen Immunglobulin umfasst, das Antikörper gegen E-Epitope enthält.
Es sollte verstanden werden, dass während die Erfindung hierin im Detail beschrieben worden ist, die Beispiele nur für erläuternde Zwecke sind. Andere Abwandlungen der Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung, die für Fachleute der Molekularbiologie, der medizinischen Diagnostik und verwandter Disziplinen naheliegend sind, sind beabsichtigt, innerhalb des Schutzumfangs der anhängenden Ansprüche zu liegen.
SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Impfformulierung, umfassend eine immunologisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen Peptids, Oligopeptids oder Proteins mit einem oder mehreren Epitopen von E, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis einer anscheinenden Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in der SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt.
Impfformulierung gemäß Anspruch 1, worin das Peptid, Oligopeptid oder Protein rekombinant aus Zellen hergestellt wurde, die aus einem Wirtszellsystem kultiviert worden sind, das gentechnisch hergestellt wurde, um einen Vektor einzubauen, enthaltend eine Nukleotidsequenz, welche die Expression von DNS-Sequenzen reguliert, die E-Epitope kodieren, wobei das Wirtszellsystem ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Hefe, filamentösen Pilzen, Insektenzelllinien und Säugerzelllinien.
Impfformulierung gemäß Anspruch 1, worin das Peptid oder Oligopeptid über chemische oder enzymatische Spaltung des E-Proteins erzeugt wird.
Impfformulierung gemäß Anspruch 1, worin das Peptid oder Oligopeptid über chemische Synthese erzeugt wird.
Impfformulierung gemäß Anspruch 1, zusätzlich umfassend einen pharmazeutischen Träger.
Im wesentlichen reines antigenisches Peptid, Oligopeptid oder Protein mit einem oder mehreren Epitopen von E, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis mit einer anscheinenden Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt.
Peptid, Oligopeptid oder Protein gemäß Anspruch 6, worin das Peptid, Oligopeptid oder Protein rekombinant aus Zellen hergestellt wurde, kultiviert aus einem Wirtszellsystem, gentechnisch hergestellt, um einen Vektor zu umfassen, enthaltend eine Nukleotidsequenz, welche die Expression von DNS-Sequenzen reguliert, kodierend E-Epitope, worin das Wirtszellsystem ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Hefe, filamentösen Pilzen, Insektenzelllinien und Säugerzelllinien.
Rekombinanter Vektor, umfassend eine DNS-Sequenz, kodierend eine oder mehrere antigene Determinanten oder Epitope von E, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis mit einer anscheinenden Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 8, worin der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Plasmidvektor, einem Phagemidvektor, einem Cosmidvektor und einem viralen Vektor.
Zubereitung für die Verwendung bei der passiven Immunisierung von Individuen, die an einer von M. Catarrhalis verursachten Infektion leiden, wobei die Zubereitung ein gereinigtes Antiserum umfasst, welches eines oder mehrere Epitope von E erkennt, worin E ein Außenmembranprotein von M. Catarrhalis mit einer apparenten Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt.
Gereinigte Oligonukleotide für die Anwendung bei der Detektion von M. Catarrhalis, wobei die Oligonukleotide im Wesentlichen aus Nukleinsäuresequenzen bestehen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr. 16, SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18.
Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit von Moraxella Catarrhalis in einer klinischen Probe, worin das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Lysieren von Moraxella Catarrhalis Zellen in der Probe, um bakterielles genetisches Material freizusetzen; (b) Kontaktieren des genetischen Materials mit zwei Oligonukleotiden unter geeigneten Bedingungen, die die Hybridisierung der Oligonukleotide an das genetische Material gestatten, worin ein erstes Oligonukleotid an einen Bereich in einem Gen hybridisiert, welches den offenen Leserahmen von 1377 Basenpaaren der SEQ ID Nr. 11 umfasst, und ein zweites Oligonukleotid an einen Bereich in dem entsprechenden komplementären Strang hybridisiert; (c) enzymatisches Amplifizieren eines spezifischen Bereichs der Sequenz des genetischen Materials, umfassend das Gen und dessen entsprechenden Strang, unter Anwendung der Oligonukleotide aus Schritt (b) als Primer; und (d) Detektieren der Anwesenheit von amplifizierten Sequenzen des Gens und seines entsprechenden Strangs, worin die Anwesenheit dieser amplifizierten Sequenzen mit der Anwesenheit von M. Catarrhalis in der Probe korreliert.
Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Detektion zusätzlich durch Hybridisierung von amplifizierten Sequenzen mit einer markierten Oligonukleotidsonde erleichtert wird, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, entsprechend einem Bereich in der amplifizierten Sequenz, falls vorhanden, worin der Marker ein Marker ist, von dem bekannt ist, dass er in Oligonukleotide eingebaut wird, ausgewählt insbesondere unter radioaktiven Markern wie ³²P und enzymatischen Markern wie Biotin.
Verfahren zur Detektion von Moraxella Catarrhalis in einer klinischen Probe, worin das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Lysieren von Moraxella Catarrhalis-Zellen in einer erhaltenen klinischen Probe, um bakterielles genetisches Material freizusetzen; (b) Kontaktieren des genetischen Materials mit einer Oligonukleotidsonde, die so synthetisiert ist, dass sie einem Bereich eines Gens, umfassend den offenen Leserahmen von 1377 Basenpaaren der SEQ ID Nr. 11 oder dessen entsprechendem komplementären Strang entspricht, unter geeigneten Bedingungen, welche die Hybridisierung des Oligonukleotids an das genetische Material gestatten; und (c) Detektieren der Wechselwirkung zwischen der Probe und der Sonde, wobei die Wechselwirkung zwischen dem genetischen Material von M. Catarrhalis und der Sonde erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, worin die Probe eine Körperflüssigkeit darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mittelohrfluid, Sputum, Blut und Fluiden aus dem Nasopharynx oder dem Auge oder einem Adenoid.
Verfahren zur Detektion von M. Catarrhalis-spezifischen Antiseren in einer Körperflüssigkeit eines Individuums, umfassend die Anwendung eines Peptids oder Proteins mit einem oder mehreren Epitopen von E als Antigen in einem Immunassay, um mit M. Catarrhalis-spezifischen Antiseren in dem Körperfluid zu interagieren und diese zu detektieren, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis mit einer apparenten Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin der Immunassay ein Test ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Radioimmunassay, einem enzymvermittelten Immunosorptionstest (ELISA), einem „Sandwich"-Test, einer Ausfällungsreaktion, einem Agglutinationstest, einem auf Fluoreszenz basierenden Immuntest und einem auf Chemolumineszenz basierenden Immuntest.
Ein isoliertes Gen oder Fragmente desselben, kodierend Epitope des Außenmembranproteins E von Moraxella Catarrhalis mit einer apparenten Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE, worin das Gen den offenen Leserahmen von 1377 Basepaaren der SEQ ID Nr. 11 umfasst, worin die Fragmente des isolierten Gens 7 bis 14 Aminosäuren kodieren.
Impfformulierung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, das das E-Protein kodiert, oder eines oder mehrere Genfragmente, die eines oder mehrere E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis mit einer apparenten Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt, und worin das Nukleinsäuremolekül operativ mit Kontrollsequenzen verbunden ist, sowie einen pharmazeutischen annehmbaren Träger oder Verdünner, worin die Genfragmente 7 bis 14 Aminosäuren kodieren.
Infektiöser, rekombinanter Mikroorganismus, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül, kodierend eine E-Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem E-Protein, E-Peptiden und E-Oligopeptiden von M. Catarrhalis, worin E ein Außenmembranprotein von Moraxella Catarrhalis mit einer apparenten Molmasse von etwa 35.000 bis etwa 50.000 Dalton nach SDS-PAGE ist, das eine Aminosäuresequenz aufweist, im Wesentlichen wie in SEQ ID Nr. 11 von Aminosäurerest 26 bis 459 gezeigt, und worin der rekombinante Mikroorganismus die E-Aminosäuresequenz unter geeigneten Wachstumsbedingungen exprimiert.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 20, bei dem es sich um einen Vacciniavirus, einen Adenovirus, einen Cytomegalovirus oder ein Bakterium der Genus Salmonella handelt.