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Gebiet der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Zusammensetzungen, die ein Protein und Peptide und Oligopeptide
von diesem enthalten, das verbunden ist mit der äußeren Membran von Moraxella
catarrhalis (bis vor kurzem bezeichnet als Branhamella catarrhalis).
Genauer ist die Erfindung gerichtet auf Zusammensetzungen eines
Proteins, und von Peptiden und Oligopeptiden davon, verbunden mit
einem Außenmembranprotein, „E", das ein hitzemodifizierbares
Protein von M. catarrhalis ist, mit einer anscheinenden Molmasse
von ungefähr
35.000 Dalton bei 25°C
und ungefähr
50.000 Dalton, wenn es auf 100°C
erhitzt wird. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Zubereitung
von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden
unter Verwendung von rekombinanter DNS und/oder biochemischen Techniken.
In Beziehung stehend dazu sind die DNS-Sequenz, die E kodiert, und
Vektoren, die nützlich
sind beim Lenken der Expression von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden,
und Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind, offenbart.
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Die Proteine, Peptide und Oligopeptide
können
verwendet werden als Immunogene in Impfformulierungen für die aktive
Immunisierung; und sie können
verwendet werden, um proteinspezifische und peptidspezifische Antisera
zu erzeugen, die nützlich
sind für
die passive Immunisierung und als Reagenzien für diagnostische Ansätze. Die
offenbarten Nukleotidsequenzen sind für die Synthese korrespondierender
Oligonukleotide bereitgestellt, die als Reagenzien in diagnostischen
Ansätzen
verwendet werden können,
die auf den Nachweis von genetischem Material von M. catarrhalis
gerichtet sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Moraxella catarrhalis (auch bekannt
als Branhamella catarrhalis) ist ein wichtiges Pathogen der menschlichen
Atemwege. M. catarrhalis ist die dritthäufigste allgemeine Ursache
von Mittelohrentzündung
bei Säuglingen
und Kindern, nach Streptococcus pneumoniae und nicht typisierbarer
Haemophilus influenzae, wie dokumentiert worden war in Studien,
in denen Tympanozentese verwendet worden war, um das ätiologische Agens
nachzuweisen (Murphy, 1989, Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S75–S77). M.
catarrhalis ist eine übliche
Ursache von Sinusitis und Konjunktivitis sowohl bei Kindern als
auch bei Erwachsenen (siehe z. B., Bluestone, 1986, Drugs 31: S132–S141);
Brorson et al., 1976, Scand. J. Infect. Dis. 8: 151–155; und
Romberger et al., 1987, South. Med. J. 80: 926–928); es ist eine wichtige
Ursache von Infektionen der unteren Atemwege bei Erwachsenen mit
chronischer Bronchitis und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung
(Murphy et al., 1992, Am. Rev. Respir. Dis. 146: 1067–1083; Catlin,
1990, Clin. Microbiol. Rev. 3: 293–320). Weiterhin kann M. catarrhalis
Lungenentzündung,
Endokarditis, Blutvergiftung und Meningitis bei immungeschwächten Individuen hervorrufen
(Cocchi et al., 1968, Acta Paediatr. Scand. 57: 451–3; Douer
et al., 1977, Ann. Intern. Med. 86: 116–119; McNeely et al., 1976,
Am Rev. Respir. Dis. 114: 399–402).
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Da wiederkehrende Mittelohrentzündung mit
beträchtlicher
Morbidität
verbunden ist, besteht ein Interesse an der Identifikation von Strategien
zur Verhinderung dieser Infektionen. Ein solcher Ansatz ist die
Entwicklung von Impfstoffen. Ein wirksamer Impfstoff zur Verhinderung
von bakterieller Mittelohrentzündung
würde Antigene
einschließen
müssen,
die einen Schutz gegen Infektion durch S. pneumnniae, nicht typisierbare H.
influenzae und M. catarrhalis erzeugen. In der Tat schreitet die
Impfstoffentwicklung für
den Pneumokokkus und nicht typisierbare H. influenzae voran, so
dass mögliche
schützende
Antigene identifiziert worden sind, und kürzlich Testen unterzogen wurden
(siehe z. B. Murphy et al., U.S. Patent Nr. 5,173,294; und Vella
et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4977–4983). Indem diese Impfstoffe
entwickelt werden und verbreiteter verwendet werden, wird die relative
Wichtigkeit von M. catarrhalis als eine Ursache von Mittelohrentzündung im
nächsten Jahrzehnt
ansteigen. Neben Säuglingen
und Kindern, denen ein Impfstoff zur Verhinderung von durch M. catarrhalis
verursachter Mittelohrentzündung
zugute käme,
würden
auch Erwachsene mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung und
immungeschwächte
Kinder und Erwachsene von einem Impfstoff, zur Verhinderung von
durch M. catarrhalis verursachten Infektionen profitieren.
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Bakterielle Bestandteile, die untersucht
worden waren als mögliche
Impfstoffantigene, schließen
Polysaccharide, Lipopolysaccharide oder Abwandlungen davon und Außenmembranproteine
ein. Im Allgemeinen, wie veranschaulicht durch Typ b-Kapselpolysaccharide
von H. influenzae, wurde von Polysaccharidantigenen gezeigt, dass
sie ein schlechtes Immunogen bei Kindern unter einem Alter von 18
Monaten sind. Aktive Immunisierung mit Lipopolysaccharid (LPS) ist
nicht annehmbar wegen seiner innewohnenden Toxizität. Die pathophysiologischen
Wirkungen von LPS können
Fieber, Leukopenie, Leukozytose, das Shwartzman-Sanarelli'sche Phänomen, disseminierte
intravaskuläre
Gerinnung, und in großen
Dosen, Keislaufversagen und Tod sein. Im Allgemeinen sind Proteine
in Säuglingen
mit einem Alter von ungefähr
drei Monaten immunogen. Folglich wurden Außenmembranproteine als mögliche Impfstoffantigene
untersucht.
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Während
jüngste
Studien begannen, sich auf Außenmembranproteine
von M. catarrhalis zu konzentrieren, ist wenig bekannt über die
antigene und molekulare Struktur dieser Proteine. Untersuchungen
der gereinigten Außenmembranen
mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
offenbarte ein ziemlich homogenes Muster innerhalb der Stämme des
Bakteriums (Barlos und Murphy, 1988, J. Infect. Dis. 158: 761–765). Acht
Hauptaußenmembranproteine,
bezeichnet durch die Buchstaben A–H, wurden identifiziert (Murphy
et al., 1989, Microbial Pathogen. 6: 159–174; Barlos et al., 1988,
J. Infect. Dis. 158: 761–765). Experimente,
in denen 20 Stämme
von M. catarrhalis absorbiert waren mit Antisera, die entwickelt
worden waren gegen M. catarrhalis-Stamrn 25240, zeigen, dass Außenmembranprotein
E antigen konservierte Determinanten enthält, die auf den bakteriellen
Oberflächen
exprimiert werden (Murphy et al., 1989, Infect. Immun. 57: 2938–2941).
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Folglich besteht mit der steigenden
Erkennung von M. catarrhalis als einem wichtigen bakteriellen Pathogen,
ein Bedarf für
einen Impfstoff, der in Kindern und Erwachsenen immunogen ist. Solch
ein Impfstoff würde
auf einen bakteriellen Bestandteil gerichtet sein müssen, der
ein oberflächenausgesetztes
Epitop auf intakten Bakterien hat, wobei das Epitop innerhalb der
Stämme
von M. catarrhalis konserviert ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung wird auf
ein Protein, Peptide und Oligopeptide gerichtet, die verbunden sind mit
einem Außenmembranprotein
mit einer anscheinenden Molmasse von ungefähr 35.000 Dalton bis ungefähr 50.000
Dalton von M. catarrhalis, wobei das Protein ein hitzemodifizierbares
Protein zu sein scheint, was in Unterschieden der Wanderung in SDS-Gelen in Abhängigkeit
von der Probenbehandlungstemperatur resultiert. Das E-Protein der
vorliegenden Erfindung und Peptide davon (hier auch bezeichnet als „E-Peptide" oder „E-Oligopeptide"), können als
Immunogene in prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfformulierungen verwendet
werden; oder als ein Antigen in diagnostischen Immunoassays, die
gerichtet sind auf den Nachweis einer M. catarrhalis-Infektion durch
Messen eines Anstiegs im Serumtiter von M. catarrhalis-spezifischem
Antikörper.
Auch können
E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, um E-spezifische Antikörper zu erzeugen, die nützlich sein
könnten
für die
passive Immunisierung und als Reagenzien für diagnostische Ansätze, die
gerichtet sind auf den Nachweis der Anwesenheit von M. catarrhalis in
klinischen Proben. E-Peptide oder E-Oligopeptide können durch chemische Synthesen
oder Aufreinigung von M. catarrhalis erhalten werden, oder können hergestellt
werden aus rekombinanten Vektorexpressionssystemen unter Verwendung
der hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen.
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Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung ist auf den Bau von neuen DNS-Sequenzen und Plasmid-DNS einschließenden Vektoren
und virale DNS, wie z. B. menschlichen Viren, tierische Viren, Insektenviren
oder Bakteriophagen, gerichtet, die verwendet werden können, um
die Expression von E-Protein, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden in geeigneten Wirtszellen,
aus denen das exprimierte Protein oder die Peptide aufgereinigt
werden können,
zu lenken.
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Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung stellt Verfahren zum molekularen Klonieren des Gens, das
E-kodiert, bereit, und verschafft Zusammensetzungen, die Oligonukleotide
innerhalb der E-kodierenden Gensequenz enthalten. Die Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung können
verwendet werden in molekularen Diagnoseansätzen für genetisches Material von
M. catarrhalis durch Nukleinsäurehybridisierung
und schließt
die Synthese von E-Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden zur Verwendung als
Primer und/oder Sonden bei der Amplifizierung und beim Nachweis
amplifizierter Nukleinsäuren
ein.
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Ferner können E-Protein, E-Peptide und
E-Oligopeptide verwendet werden als Immunogene in prophylaktischen
und/oder therapeutischen Impfformulierungen gegen pathogene Stämme von
M. catarrhalis, sei es, dass das Immunogen chemisch synthetisiert
wird, gereinigt wird aus M. catarrhalis oder aus einem rekombinanten
Expressionsvektorsystem. Alternativ können das Gen, das E kodiert,
oder eine oder mehrere Genfragmente, die E-Peptide oder E-Oligopeptide
kodieren, in einen bakteriellen oder viralen Impfstoff eingebaut werden,
der rekombinantes Bakterium oder Virus enthält, das angelegt wurde, um
eine oder mehrere immunogene Epitope von E selber oder in Kombination
mit immunogenen Epitopen anderer pathogener Mikroorganismen herzustellen.
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Weiterhin kann das Gen, das E kodiert,
oder eine oder mehrere Genfragmente, die E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren,
die wirksam an eines oder mehrere regulatorische Elemente gekoppelt
sind, direkt in Menschen eingeführt
werden, um Protein E, E-Peptid oder E-Oligopeptide zu exprimieren,
um eine schützende
Immunantwort auszulösen.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 ist
ein Kay-Doolittle-Hydrophobizitätsprofil
des Außenmembranproteins
E von M. catarrhalis, wie es bestimmt wurde unter Verwendung der
Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz des Gens, das E-kodiert, abgeleitet
worden ist. Positive Werte verkörpern
hydrophobe Bereiche und negative Werte verkörpern hydrophile Bereiche.
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2 stellt
Polyacrylamidgele dar, die gefärbt
wurden mit Ethidiumbromid und die das amplifizierte Produkt der
Genome unterschiedlicher Stämme
von M. catarrhalis nach der Verdauung mit zahlreichen Restriktionsenzymen
enthält.
Spur 1 repräsentiert
DNS-Größenstandards
und die Spuren 2–20
sind die amplifizierten Produkte der Stämme, die in Tabelle 1 jeweils
aufgelistet sind.
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2A ist
ein Gel, das die amplifizierten Produkte zeigt, die mit Sau96 I
eingeschränkt
wurden.
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2B ist
ein Gel, das die amplifizierten Produke zeigt, die mit Bsl I einschränkt wurden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung ist auf
Zusammensetzungen eines bakteriellen Außenmembranproteins und Peptiden
davon von M. catarrhalis gerichtet, worin das Protein mit „E" bezeichnet worden
ist. Das Muster der Migration des E-Proteins auf SDS-PAGE ist charakteristisch
für ein
hitzemodifizierbares Protein. Dies bedeutet, dass das Migrationsmuster
von der vorausgegangenen Probenbearbeitungstemperatur abhängt. Folglich
beträgt
die anscheinende Molmasse ungefähr
35.000 Dalton, wenn die E-Protein enthaltende Probe vor der SDS-PAGE
auf 25°C
erhitzt wurde; und falls die Probe auf 100°C erhitzt wurde, beträgt die anscheinende Molmasse
ungefähr
50.000 Dalton. Wie durch die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung
(SEQ ID Nr. 11) gezeigt wird, offenbart das Ekodierende Gen, dass
die vorausgesagte Aminosäuresequenz
des reifen E-Proteins eine berechnete Molmasse von ungefähr 47.030
Dalton hat. Das E-Protein, die E-Peptide und die E-Oligopeptide
der vorliegenden Erfindung können
hergestellt werden unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren,
wie hier erläutert,
oder sie können
chemisch synthetisiert werden aus der Aminosäuresequenz, die in der vorliegenden
Erfindung offenbart ist. Zusätzlich
können
Peptide durch enzymatische oder chemische Spaltung des reifen Proteins
erzeugt werden. E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide mit einem immunogenen
Epitop(en) können
verwendet werden als Immunogene in zahlreichen Impfformulierungen
zur Vorbeugung von Mittelohrentzündung,
Sinusitis, Konjunktivitis und Infektionen der unteren Atemwege,
die verursacht werden durch M. catarrhalis. Zusätzlich können gemäß der vorliegenden Erfindung
die hergestellten E-Proteine, E-Peptide und E-Oligopeptide verwendet
werden, um M. catarrhalis-spezifische Antisera zu erzeugen, die
nützlich
sind für
die passive Immunisierung gegen Infektionen, die durch M. catarrhalis
verursacht werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner die Nukleotidsequenz des E-kodierenden Gens bereit, ebenso wie
die Aminosäuresequenz,
die von dem isolierten Gen abgeleitet. wird. Gemäß einem Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken,
das E-kodierende Gen oder Genfragmente, die eines oder mehrere E-Peptide
mit einem immunogenen Epitop(en) kodieren, in einen Expressionsvektor
eingebaut, und der rekombinante Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle
eingeführt, wodurch
die Expression dieser Sequenzen in jener bestimmten Wirtszelle gelenkt
wird. Das Expressionssystem, das den in die Wirtszelle eingeführten rekombinanten
Vektor enthält,
kann verwendet werden, (a) um E-Protein, E-Peptide oder E-Oligopeptide
herzustellen, die aufgereinigt werden können zur Verwendung als ein
Immunogen in Impfformulierungen; (b) um E-Protein, E-Peptide oder
E-Oligopeptide herzustellen, die verwendet werden als ein Antigen
für diagnostische
Immunoassays oder zur Herstellung von M. catarrhalisspezifischen
Antisera mit therapeutischem und/oder diagnostischem Wert; (c) oder,
falls der rekombinante Expressionsvektor ein lebendes Virus, wie
z. B. ein Vakziniavirus ist, kann der Vektor selber verwendet werden
als eine lebende oder inaktivierte Impfstoffzubereitung, die eingeführt wird
in die Zellen des Wirts zur Exprimierung von E oder immonogenen
E-Peptiden oder
E-Oligopeptiden; (d) oder, falls der rekombinante Expressionsvektor
in lebende, abgeschwächte
bakterielle Zellen eingeführt
wird, die verwendet werden, um E-Protein,
E-Peptide oder E-Oligopeptide zu exprimieren, um Individuen zu impfen;
(e) oder können
direkt in ein Individuum eingeführt
werden, um gegen das kodierte oder exprimierte E-Protein, E-Peptid
oder E-Oligopeptid zu immunisieren.
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Für
Zwecke der Beschreibung werden die Verfahren und Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung in den folgenden Ausführungsbeispielen erläutert:
Ausführungsbeispiel
A- Molekulares Klonen und Sequenzieren des E-kodierenden Gens und
der Vektoren, die E-spezifische Epitope exprimieren;
Ausführungsbeispiel
B- Konservierung des E-kodierenden Gens unter M. catarrhalis-Stämmen;
Ausführungsbeispiel
C- Verfahren zur Verwendung von E-spezifischen Nukleotidsequenzen
in molekularen Diagnoseansätzen
für den
Nachweis von M. catarrhalis;
Ausführungsbeispiel D- Verfahren
zur Herstellung und Verwendung von E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden
in diagnostischen Immunoassays;
Ausführungsbeispiel E- Verfahren
und Zusammensetzungen für
Impfformulierungen im Zusammenhang mit E, E-Peptiden und E-Oligopeptiden.
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Ausführungsbeispiel A
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Molekulares Klonieren
und Sequenzieren des E-kodierenden Gens und von Vektoren, die E-spezifische
Epitope exprimieren.
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Die verwendete Strategie war die,
genomische DNS von M. catarrhalis zu isolieren, die isolierte DNS in
Fragmente zu spalten, eine genomische Bibliothek, die die Insertion
der Fragmente in einen Expressionsvektor umfasst, zu erzeugen, die
rekombinanten Vektoren in die geeignete Wirtszelle einzuführen und
auf Wirtszellklone, die das E-kodierende Gen enthalten, durch Filterhybridisierung
mit einer Familie degenerierter, markierter Oligonukleotide, die
mit der Aminoendsequenz des E-Proteins übereinstimmen, zu screenen.
Die synthetisierten Oligonukleotide wurden vorgescreent durch Southern
blot auf M. catarrhalis-DNS und E. coli als eine Kontrolle, um festzustellen,
welche degenerierten Oligonukleotide stark an M. catarrhalis-DNS
hybridisieren.
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Moraxella catarrhalis-Stamm 25240,
erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), wurde
als die Quelle bakterieller, genomischer DNS verwendet. M. catarrhalis
ließ man
wachsen auf Schokoladenagarplatten bei 37°C in 5% CO2 oder
in Hirn-Herz-Infusionslösung. Escherichia
coli (E. coli) LE392 wurde als der Wirtsstamm für die genomische Bibliothek
des Bakteriophagen Lambda (EMBL-3) verwendet. In Abhängigkeit
von den Verhältnissen
ließ man
E. coli in Trypton-Nährlösung, die
mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO4 ergänzt wurde,
wachsen; oder für
das Screening auf NZCYM-Agarplatten, die 50 μg/ml Ampicillin enthalten.
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Es wurde eine EMBL3 genomische Bibliothek
erzeugt mit genomischer DNS von M. catarrhalis 25240 unter Verwendung
von kürzlich
beschriebenen Verfahren (Ausubel et al., 1989, Current Protocols
in Molecular Biology, veröffentlicht
von John Wiley and Sons). Genomische DNS von M. catarrhalis-Stamm
25240 wurde unter Verwendung von Detergens-Extraktion und Proteinasebehandlung
aufgereinigt. Die aufgereinigte genomische DNS wurde dann teilweise
mit Restriktionsenzym Sau 3A verdaut, um in der Größe variierende
Fragmente zu erzeugen. Die DNS-Fragmente wurden durch Sucrosegradientenzentrifugation
auf einem 10% bis 40% Sucrosegradienten aufgetrennt. Die Fraktionen,
die Fragmente von ungefähr
9 bis 23 Kilobasen (kb) in der Größe enthielten, wurden gesammelt,
dephosphoryliert unter Verwendung von Kälberdarmphosphatase und anschließend in
Phagenarme ligiert und dann in den Phagen verpackt. Ein Teil der
resultierenden EMBL-3-Bibiliothek wurde auf NZCYM-Platten ausplattiert
mit E. coli LE392 als dem Wirtsstamm.
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Die Plaques wurden auf Nitrocellulosefilterscheiben übertragen
und durch Hybridisierung mit einer Familie an degenerierten, radiomarkierten
Oligonukleotiden (repräsentative
Beispiele sind in den SEQ ID Nr.: 1 – SEQ ID Nr.: 8 offenbart)
gescreent, die der aminoterminalen Sequenz des Außenmembranproteins
E entsprechen. Insgesamt wurden ungefähr 8.100 Plaque gescreent und
6 positive Klone wurden identifiziert. Die anfänglich positiven Plaques wurden
aufgenommen, in Puffer eluiert und dann durch Ausplattieren in niedriger Dichte
aufgereinigt und erneut gescreent mit denselben Oligonukleotiden
bis alle Plaques eines Rescreenings positiv waren. Flüssige Lysate
der positiven Klone wurden verwendet, um die Lambda-DNS, die das
Insert enthält,
zu isolieren. Die isolierte Lambda-DNS wurde dann mit Sal I verdaut und
das Verdaute wurde auf Agarosegelen der Elektrophorese unterzogen,
um die Anwesenheit der Inserts zu bestätigen. Die Insertgrößen der positiven
Klone lagen zwischen 12 Kilobasen (kb) und 17 kb. Der Klon, der
das 12 kb-Insert
enthielt, wurde verwendet, um das E-kodierende Gen, das in dem Insert
enthalten war, zu lokalisieren. Die DNS des Klons wurde geschnitten
mit Sal I und das 12 kb-Insert wurde von den Gelstücken elektroeluiert
und mit einem oder mehreren etlicher unterschiedlicher Enzyme, (Nde
I, Nco I, Hind III, Sac I, Eco RI, und Nde I und Nco I) eingeschränkt. Das
Verdaute wurde der Elektrophorese auf Agarosegelen unterzogen und
die Fragmente wurden durch Southern blot mit den Oligonukleotidsonden
analysiert.
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Ein 4,4 kb Nde I-Sal I-Fragment und
ein 1,9 Nco I-Sal I-Fragment wurden ausgewählt und für das Subklonieren in jedes
der Plasmide pET22b+ oder pGEM5zf manipuliert,
um das anschließende
Sequenzieren zu erleichtern. Nach wiederholten erfolglosen Versuchen,
E. coli mit den rekombinanten Plasmiden zu transformieren, und trotz
Erfolg mit Kontroll-DNS und Transformationskontrollen, wurde geschlossen,
dass die Fragmente, die das E-kodierende Gen oder Teile davon enthalten,
für die
E. coli toxisch waren. Folglich wurde ein alternativer Ansatz unternommen,
um die Nukleotidsequenz zu bestimmen. Die Sequenzen der Enden des
1,9 kb-Fragmentes wurden durch das Verfahren von Maxam-Gilbert bestimmt.
Das 1,9 kb-Fragment
wurde mit Hind III verdaut und zwei Fragmente wurden aufgereinigt,
in 1,1 kb-Fragment
und ein 0,8 kb-Fragment. Diese Fragmente wurden markiert und dann
unter Verwendung des Verfahrens nach Maxam-Gilbert (1977, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74: 560– 564)
sequenziert. Aus dieser Sequenzanalyse wurden zwei zusätzliche
Oligonukleotide synthetisiert (SEQ ID Nr.: 9 und SEQ ID Nr.: 10).
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Zwei Primer (SEQ ID Nr.: 7 und SEQ
ID Nr.: 10) wurden ausgewählt,
um ein Fragment der Insert-DNS des Klons mit dem 12 kb-Insert zu
amplifizieren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion. Die
Reaktionen wurden in einem 50 μl
Volumen mit 0,25 μg
Primern und 2,5 mM dNTP durchgeführt.
Das Vordenaturieren wurde durchgeführt bei 95°C für 3 Minuten. Denaturieren wurde
durchgeführt
bei 96°C
für 15
Sekunden, Annealing bei 62 °C
für 1 Minute
und Polymerisieren bei 74°C
für 1 Minute,
in 15 Zyklen in Anwesenheit von 3 mM MgSO4.
Das Ergebnis der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung dieser
beiden Primer war ein amplifiziertes Produkt von 0,8 kb. Das 0,8
kb-amplifizierte Produkt wurde durch Agarosegel-Elektrophorese und
Elektroelution gereinigt und dann in die Eco RI-Stelle von M13mp18
subkloniert. Einzelsträngige M13-DNS
wurde zubereitet aus der Rekombinante, um die Nukleotidsequenz des
0,8 kb-Produktes durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren zu bestimmen.
Der verbleibende Anteil des E-kodierenden Gens wurde direkt von
dem 12 kb-Insert des Lambda-Klons sequenziert unter Verwendung zusätzlicher
Oligonukleotide, die synthetisiert waren, um der E-kodierenden Genregion
zu entsprechen.
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Aus der gesamten Nukleotidsequenz
(SEQ ID Nr.: 11) wird das E-kodierende Gen definiert als ein offenes
Leseraster aus 1.377 Basenpaaren (die 460 Aminosäuren kodieren), wobei es mit
dem Codon bei Position 154 startet und mit TAA an der Position 1531
endet. Eine mögliche
Ribosomenbindungsstelle GGAGA wurde 5 Basen stromaufwärts des
ATG-Translationsstartcodons
lokalisiert. Dreißig
Basen stromabwärts
des TAA-Stopcodons lag die Sequenz ATAAAAATGCTTGAATTTCAAGCTATTTTTTAT,
ein Palindrom, das eine Stammschleifenstruktur bilden könnte, welche
möglicherweise
als eine transkriptorische Terminationssequenz dient. Der Guanin-
und Cytosin- (G + C)- Gesamtgehalt des Ekodierenden Gens beträgt 43,4%,
was ähnlich ist
zu dem berichteten G + C-Gehalt von 41 für das M. catarrhalis-Genom
(Catlin, 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3: 293–320).
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Die von dem offenen Leseraster abgeleitete
Aminosäuresequenz
definiert E als ein Protein mit einer berechneten Molmasse von 49.334
Dalton. Die für
E abgeleitete Aminosäuresequenz
legte die Anwesenheit eines Signalpeptids mit einer möglichen
Spaltstelle zwischen den Aminosäuren
25 (Ala) und 26 (Ala) nahe. Die ersten 24 Aminosäuren der mutmaßlichen
Spaltstelle der von dem offenen Leseraster abgeleiteten Aminosäuresequenz
entsprechen exakt der N-terminalen Proteinsequenz, die von dem gereinigten
Außenmembranprotein
E bestimmt wurde. Diese Beobachtungen bestätigen weiter, dass das Gen
E kodiert, und dass E als ein Vorläufer synthetisiert wird, der
ein Signalpeptid, das aus 25 Aminosäureresten zusammengesetzt ist,
aufweist. Ein Hydrophobizitätsprofil
der abgeleiteten Aminosäuresequenz
(1) zeigte einen starken
hydrophoben Anteil, der dem Signalpeptid entspricht. Die vorhergesagten
antigenen Determinanten entsprechen den in 1 gezeigten hydrophilen Regionen. Diese
antigenen Determinanten schließen
die Aminosäuren
369 bis 374; 29 bis 34; und 294 bis 299 ein. Die vorhergesagte Molmasse
des reifen Proteins beträgt
47.030 Dalton, was gut mit der Wanderung des Außenmembranproteins E in SDS-PAGE
von M. catarrhalis enthaltenden Proben korreliert. Die Analyse der
Aminosäurezusammensetzung
von E zeigte, dass Alanin, Glycin, Leucin und Valin, die Aminosäuren sind,
die am reichlichsten vorhandenen sind (Bereich 13%–18%), und
dass keine Cysteinreste vorhanden sind.
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Um die transkriptorische Initiationsstelle
des E-kodierenden Gens zu bestimmen, wurde die Primer-Extensions-Analyse
unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Espezifischen Primern
(SEQ ID Nr.: 12 und SEQ ID Nr.: 13) durchgeführt, wobei diese mit dem 5'-Bereich der korrespondierenden
mRNS hybridisieren. Gesamt-RNS wurde durch das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren
aus M. catarrhalis-Stamm 25240 extrahiert. Die Espezifischen Primer
wurden am 5'-Ende
mit [32P]-ATP markiert. Für die Primerverlängerung
wurden 50 μg
der Gesamt-RNS mit 100 fmol der markierten Primer dem Annealing
unterzogen und bei 55°C
für 45 Minuten
inkubiert. Auf dieses folgte die Verlängerung mit reverser Transkriptase
in der Anwesenheit von Desoxyribonukleosidtriphosphaten für eine Stunde
bei 42°C.
Das Primerextensionsprodukt wurde auf einem Acrylamidsequenziergel
mit 8% Harnstoff analysiert. Die Didesoxynukleotidsequenzierreaktionen,
die eine Sequenzierleiter erzeugten und mit denselben Primern geprimt
waren, wurden in benachbarten Spuren ebenfalls der Elektrophorese
unterzogen, um die genaue Base für
die Initiierung des E-entsprechenden Transkriptes abzuschätzen. Die
Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit einem Guanin-Rest an
Position 75 startet, die 78 Basen stromaufwärts des ATG-Codons liegt. Die
mögliche –10 TAAGAT-Sequenz
oder die Pribnow-Box (Nukleotidposition 63–68) wurde sechs Basen stromaufwärts der
+1-Startstelle der Transkription lokalisiert. Die –35 (Position
40–45)
TTGTT-Sequenz wurde 17 Basen stromaufwärts der –10-Sequenz lokalisiert. Zwei
Bereiche mit getrennter Dyadensymmetrie, 5''-TTAATTTCATTTAA-3' und 5'TACAAATGTGTAAGACTTTTGTA-3'', wurden stromabwärts der -35-Region identifiziert,
die eine Rolle bei der Regulation der Expression des E-kodierenden
Gens spielen könnten.
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Basierend auf der Nukleotidsequenz
des E-kodierenden Gens wurden drei Sätze an Oligonukleotidprimern
synthetisiert und verwendet, um Teile des Gens zu amplifizieren
durch Polymerasekettenreaktion, für Subklonierung und Analyse
der Expression. Zwei Primer (SEQ ID Nr.: 14 und SEQ ID Nr.: 15)
wurden verwendet, um 1.573 kb des Gens zu amplifizieren, wobei das
amplifizierte Fragment, das gesamte Gen und die Promoter-Region
enthielt. Ein weiterer Primersatz (SEQ ID Nr.: 16 und SEQ ID Nr.:
17) wurde verwendet, um 1.391 kb des Gens zu amplifizieren, welches
die Sequenz enthielt, die das Leitpeptid mit dem Rest des Gens kodiert.
Ein dritter Primersatz (SEQ ID Nr.: 17 und SEQ ID Nr.: 18) wurde
verwendet, um 1.313 kb des Gens zu amplifizieren, das von der ersten
Aminosäure
des reifen Proteins bis zum Ende des Carboxy-Endes kodiert. Die
drei amplifizierten Produkte, 1.573 kb, 1.391 kb und 1.313 kb, wurden
getrennt in einen Vektor, Phagemid pCR-Script SK+,
subkloniert und in E. coli unter Verwendung von Standardprotokollen
transformiert. Versuche der Transformation mit dem rekombinanten
Plasmid, das das 1.573 kb Fragment enthielt, waren erfolglos, wodurch
wiederum nahegelegt wurde, dass die Expression des M. catarrhalis-Proteins
E in E. coli toxisch ist für die
transformierten Bakterien. Es wurden die Transformanten identifiziert,
die rekombinante Plasmide mit dem 1.391 kb Insert (das gesamte offene
Leseraster, ohne den Promoter) und das 1.313 kb Insert (Sequenz,
die das reife Protein kodiert) enthielten. Die Bestätigung der
Inserts, durch Sequenzieren der Enden der Inserts, zeigte, dass
alle identifizierten Klone die Gen-Sequenzen in der falschen Orientierung
für die
Expression des Proteins durch den Plasmidpromoter enthielten; ein
weiterer Beleg, dass die Expression von Protein E für E. coli
toxisch ist.
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Folglich erläutert dieses Ausführungsbeispiel,
dass Nukleotidsequenzen, die E oder Teile davon kodieren, in verschiedene
Vektoren, einschließlich
Phagenvektoren und Plasmiden, inseriert werden können. Erfolgreiche Expression
des Proteins und der Peptide von Protein E benötigt, dass entweder das Insert,
das das Gen oder Genfragment enthält, welches Epitope von Protein
E kodiert, oder der Vektor selber die notwendigen Elemente für die Transkription
und Translation enthalten, die kompatibel sind mit und erkannt werden
durch das bestimmte Wirtssystem, das für die Expession verwendet wird.
DNS, die E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide kodiert, kann synthetisiert
oder isoliert und sequenziert werden, unter Verwendung der Verfahren und
Primersequenzen, wie dargestellt gemäß den hierin beschriebenen
Ausführungsbeispielen
A, B und E. Eine Reihe an Wirtssystemen kann verwendet werden, um
E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide zu exprimieren, welche einschließen aber
nicht beschränkt
sind auf Bakterien, die mit einem Bakteriophagenvektor, Plasmid-Vektor
oder mit Cosmid-DNS transformiert sind; Hefe, die Hefevektoren enthält; Pilze,
die Pilzvektoren enthalten; Insektenzelllinien, die mit Viren (z.
B. Baculovirus) infiziert sind; und Säugerzelllinien, die mit Plasmid
oder viralen Expressionsvektoren transfiziert sind, oder die infiziert
sind mit rekombinantem Virus (z. B. Vakziniavirus, Adenovirus, adenoassoziiertem
Virus, Retrovirus, etc.).
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Unter Verwendung von im Stand der
Technik der Molekularbiologie bekannten Verfahren, einschließlich der
oben beschriebenen Verfahren, können
zahlreiche Promoter und Enhancer in den Vektor oder die DNS-Sequenz,
die E-Aminosäuresequenzen
kodieren, d. h. rekombinantes Außenmembranprotein E, E-Peptide
oder E-Oligopeptide, eingebaut werden, um die Expression der E-Aminosäuresequenz
zu erhöhen,
vorausgesetzt, dass die gesteigerte Expression der E-Aminosäuresequenzen
verträglich
ist mit (z. B. nicht toxisch ist für) dem bestimmten, verwendeten
Wirtszellsystem. Folglich und wichtig kann die DNS-Sequenz aus dem E-Protein
kodierenden Gen oder jeglichem Segment des Gens, das ein funktionelles
Epitop des E-Proteins kodiert, bestehen. Weiterhin kann die DNS
mit DNS, die andere Antigene kodiert, wie z. B. andere bakterielle Außenmembranproteine
oder andere bakterielle, Pilz-, parasitäre oder virale Antigene, verschmolzen
werden, um ein genetisch verschmolzenes (das ein gemeinsames Peptidrückgrat teilt),
mulitivalentes Antigen zu schaffen, zur Verwendung als eine verbesserte
Impfstoffzusammensetzung.
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Die Auswahl des Promoters wird von
dem verwendeten Expressionssystem abhängen. Promotoren unterscheiden
sich in ihrer Stärke,
d. h. der Fähigkeit,
die Transkription zu erleichtern. Im Allgemeinen ist es für den Zweck
der Expression eines klonierten Gens wünschenswert, einen starken
Promoter zu verwenden, um ein hohes Maß der Transkription des Gens
und der Expression in das Genprodukt zu erhalten. Beispiele schließen im Stand
der Technik bekannte bakterielle, Phagen- oder Plasmid-Promotoren
ein, bei denen ein hohes Maß an
Transkription in einem Wirtszellsystem, einschließlich E.
coli, beobachtet worden war, den lac-Promoter, trp-Promoter, recA-Promoter,
ribosomalen RNS-Promoter, die PRund PL-Promotoren, lacUV5, ompF, bla, lpp, und ähnliche,
die verwendet werden können,
um die Transkription der eingefügten
DNS-Sequenz, die die E-Aminosäuresequenzen
kodiert, bereitzustellen.
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Zusätzlich können, falls E-Protein, E-Peptide
oder E-Oligopeptide letal oder zerstörerisch für die Wirtszellen sein können, der/die
Wirtszellstamm/linie und die Expressionsvektoren so gewählt werden,
dass die Tätigkeit
des Promoters solange gehemmt ist, bis sie spezifisch induziert
wird. Zum Beispiel ist bei bestimmten Operons die Zugabe spezifischer
Induktoren notwendig für
die effiziente Transkription der eingefügten DNS (z. B. wird das lac-Operon
induziert durch die Zugabe von Laktose oder Isopropylthio-beta-D galactosid).
Eine Reihe an Operons, wie z. B. das trp-Operon, unterliegen unterschiedlichen
Kontrollmechanismen. Das trp-Operon wird induziert, wenn Tryptophan
im Wachstumsmedium fehlt. Der PL-Promoter
kann durch einen Anstieg der Temperatur von Wirtszellen induziert
werden, die einen temperaturempfindlichen Lambda-Repressor enthalten.
Auf diese Art und Weise kann mehr als 95% der Promoter-gerichteten
Transkription in nicht induzierten Zellen inhibiert werden. Folglich
kann die Expression von rekombinantem E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden kontrolliert
werden durch die Kultur transfomierter oder transfizierter Zellen
unter Bedingungen, so dass der Promoter, der die Expression der
inserierten DNS, die E-Aminosäuren
kodiert, kontrolliert, nicht induziert wird, und dass, wenn die
Zellen eine geeignete Dichte in dem Wachstumsmedium erreichen, der
Promoter induziert werden kann für
die Expression der inserierten DNS.
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Andere Kontrollelemente für die wirksame
Gentranskription oder die Translation der Botschaft schließen Enhancer
und regulatorische Signale ein. Enhancersequenzen sind DNS-Elemente, die die
transkriptorische Effizienz zu erhöhen scheinen auf eine An und
Weise, die vergleichsweise unabhängig
von ihrer Position und Orientierung bezüglich eines nahegelegenen Gens
ist. Folglich kann ein Enhancer in Abhängigkeit von dem verwendeten
Wirtszellexpressionsvektorsystem entweder stromaufwärts oder
stromabwärts
von den eingefügten
DNS-Sequenzen, die E-Aminosäuren
kodieren, platziert werden, um die transkriptorische Effizienz zu
erhöhen.
Wie kürzlich
in diesem Ausführungsbeispiel
erläutert,
wurden andere spezifische regulatorische Sequenzen identifiziert,
die die Expression des Ekodierenden Gens bewirken können. Diese
oder andere regulatorische Stellen, wie z. B. Transkriptions- oder
Translationsinitiationssignale, können verwendet werden, um die
Expression des Gens, das E oder Genfragmente davon kodiert, zu regulieren.
Solche regulatorischen Elemente können in E-Aminosäuren-kodierende
DNS-Sequenzen oder nahegelegene Vektor-DNS-Sequenzen eingefügt werden,
unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren, die hierin beschrieben
sind für die
Insertion von DNS-Sequenzen.
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Demgemäß können die Bereiche von M. catarrhalis-Nukleotidsequenzen,
die E, E-Peptide
oder E-Oligopeptide kodieren, in einen Expressionsvektor ligiert
werden, an einer spezifischen Stelle in Bezug auf den Promoter,
die Kontroll- und regulatorischen Elemente des Vektors, so dass
wenn der rekombinante Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird,
die E-spezifischen
DNS-Sequenzen von M. catarrhalis in der Wirtszelle exprimiert werden
können.
Zum Beispiel können
die E-spezifischen DNS-Sequenzen, die ihre eigenen regulatorischen
Elemente enthalten, in einen Expressionsvektor ligiert werden, in
einer Beziehung mit oder in Orientierung zu dem Vektor-Promoter
und zu Kontrollelementen, was die Expression von E-Aminosäuresequenzen
erlauben wird. Der rekombinante Vektor wird dann in die geeigneten
Wirtszellen eingeführt
und die Wirtszellen werden ausgewählt und gescreent auf jene
Zellen, die den rekombinanten Vektor enthalten. Die Selektion und das
Screening können
durchgeführt
werden, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, einschließlich dem
Nachweis der Expression eines Markergens (z. B. Arzneimittel-Resistenzmarker),
das in dem Plasmid vorhanden ist, Immunoscreening auf die Produktion
von E-spezifischen Epitopen unter Verwendung von für E-spezifische
Epitope erzeugten Antisera und Sondieren der DNS der Wirtszellen
für E-spezifische
Nukleotidsequenzen unter Verwendung von einem oder mehreren Oligonukleotiden
und gemäß in Ausführungsbeispiel C
hierin beschriebenen Verfahren.
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Techniken der Gentechnik können auch
verwendet werden, um die kodierten E-Peptide oder E-Proteine zu charakterisieren,
zu modifizieren und/oder anzupassen. Zum Beispiel kann die ortsgerichtete
Mutagenese, um ein Außenmembranproteinfragment
in Bereichen außerhalb
der geschützten
Domänen
zu modifizieren, wünschenswert
sein, um die Löslichkeit
des Subfragmentes zu erhöhen,
um eine leichtere Aufreinigung zu ermöglichen. Weiterhin können Techniken
der Gentechnik verwendet werden, um DNS-Sequenzen herzustellen,
die einen Teil der Aminosäuresequenz
von E kodieren. Zum Beispiel kann aus der als SEQ ID Nr. 11 offenbarten
Sequenz bestimmt werden, welches Restriktionsenzym oder welche Kombination
an Restriktionsenzymen verwendet werden können, um Sequenzen herzustellen,
die E-Peptide oder E-Oligopeptide kodieren. Die Restriktionsenzymauswahl
kann durchgeführt
werden, um nicht die Immunpotenz des resultierenden Peptids oder
Oligopeptids zu zerstören.
Antigenstellen eines Proteins können
in der Größe variieren,
aber können
aus ungefähr
7 bis ungefähr
14 Aminosäuren
bestehen. Folglich, kann ein Protein von der Größe des E viele einzelne Antigenstellen
enthalten; folglich könnten
viele Genteilsequenzen Antigenepitope von E kodieren. Demzufolge
können
unter Verwendung von 1 und
SEQ ID Nr. 11 als Führung,
Restriktionsenzymkombinationen verwendet werden, um DNS-Sequenzen
herzustellen, die, wenn sie in den geeigneten Vektor eingefügt werden,
fähig sind,
die Produktion von E-spezifischen Aminosäuresequenzen (Peptiden oder
Oligopeptiden), die unterschiedliche Antigenepitope enthalten, zu
lenken.
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Ausführungsbeipiel B
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Konservierung des E-kodierenden
Gens unter M. catarrhalis-Stämmen.
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Vorangegangene Studien, unter Verwendung
von Antikörperadsorptionsexperimenten,
zeigten, dass eine oder mehrere der oberflächenexponierten Determinanten
von M. catarrhalis innerhalb der meisten Stämme antigen konserviert waren
(Murphy et al., 1989, supra). Diese Studien waren jedoch nicht auf
die Konservierung des E-kodierenden Gens unter den Stämmen gerichtet.
Für die
Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung muss das E-kodierende Gen, um
in diagnostischen Ansätzen
nützlich
zu sein, hochkonserviert sein unter den Stämmen von M. catarrhalis. Zusätzlich zeigt
ein hochkonserviertes Gen, dass die Proteinsequenz auch hochkonserviert
ist. Damit ein bakterielles Protein oder Peptid als ein Antigen
in Impfformulierungen gegen Infektion, verursacht durch M. catarrhalis,
nützlich
ist, muss das Protein oder Peptid Epitope enthalten, die sowohl
immunogen als auch unter den Stämmen
von M. catarrhalis konserviert sind. Um den Grad der Konservierung
des E-kodierenden
Gens unter den Stämmen
von M. catarrhalis zu bestimmen, wurde genomische DNS gereinigt
und aus 19 Isolaten, die aus unterschiedlichen klinischen und geographischen
Quellen gewonnen worden waren, aufgereinigt und analysiert. Zuerst
wurden die E-spezifischen
Gensequenzen der gereinigten DNS der Isolate unter Verwendung der
Polymerasekettenreaktion und von Primern (SEQ ID Nr. 16 und SEQ
ID Nr. 17) amplifiziert. Die Analyse der amplifizierten Produkte
durch Agarosegelelektrophorese zeigte, dass das Ekodierende Gen
in allen untersuchten Stämmen
von derselben Größe war (ungefähr 1,4 kb).
Zusätzlich
wurden Längenpolymorphismen
der Restriktionsfragmente analysiert durch Beschränken der
amplifizierten Produkte in Fragmente unter Verwendung von entweder
Hind III, Sau96 I, Bsl I, oder Bsg I und Sichtbarmachen der Fragmente
durch Elektrophorese auf einem 6% Acrylamidgel, gefärbt mit
Ethidiumbromid. Das Bandenmuster der amplifizierten Produkte zeigte
keine Abweichung unter den untersuchten Stämmen bezüglich der Anwesenheit der Restriktionsstellen
und zeigte geringfügige
Unterschiede in der beobachteten Größe der Fragmente, wie dargestellt
in 2A für Sau96
I und 2B für Bsl I).
Von den vier bei der Restriktion der amplifizierten Produkte verwendeten
unterschiedlichen Enzymen, schnitten drei der Enzyme an drei unterschiedlichen
Stellen innerhalb der amplifizierten Produkte und eines schnitt
an zwei unterschiedlichen Stellen. Folglich zeigen die ähnlichen
Ergebnisse in allen Stämmen,
dass die an den elf Stellen festgestellten Sequenzen innerhalb der
untersuchten Stämme
identisch sind. Die in Tabelle 1 aufgelisteten Stämme sind
die auf Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
untersuchten Stämme,
in derselben Reihenfolge, wie sie auf den Gelen erscheinen (gezeigt
in 2A und 2B, beginnend mit Spur 2).
Unterschiede in den Restriktionsmustern innerhalb der unterschiedlichen
Stämme
mögen existieren,
aber Unterschiede wurden nicht mit diesen bestimmten untersuchten
Restriktionsenzymen gesehen.
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Tabelle
1
Isolate von Moraxella catarrhalis
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Diese Ergebnisse zeigen, dass das
E-kodierende Gen hochkonserviert ist unter den Stämmen von
M. catarrhalis und demzufolge haben die hierin beschriebenen Nukleotidsequenzen
Anwendungen für
die diagnostische Verwendung und die Verwendung als Impfstoff.
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Ausführungsbeispiel C
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Verfahren zur Verwendung
von E-spezifischen Nukleotidsequenzen in molekularen Diagnoseansätzen für den Nachweis
von M. catarrhalis.
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Wegen der Konservierung des E-kodierenden
Gens, wie in Ausführungsbeispiel
B offenbart, können die
Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung in molekularen Diagnoseassays für den Nachweis
von genetischem Material von M. catarrhalis verwendet werden. Insbesondere,
und wie dargestellt durch SEQ ID Nr. 1 – SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr.
12 – SEQ
ID Nr. 18, können
E-sequenzspezifische Oligonukleotide synthetisiert werden zur Verwendung
als Primer und/oder Sonden bei der Amplifizierung und beim Nachweis
von amplifizierten Nukleinsäuren
von M. catarrhalis. Jüngere
Fortschritte in der Molekularbiologie stellten zahlreiche Mittel
bereit, um Nukleinsäuresequenzen
enzymatisch zu amplifizieren. Das zur Zeit am häufigsten verwendete Verfahren,
PCRTM (Polymerasekettenreaktion, Cetus Corporation)
schließt
die Verwendung einer thermostabilen DNS-Polymerase, von bekannten
Sequenzen als Primer und Heizzyklen, die die replizierenden Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Stränge trennt
und ein Gen von Interesse exponentiell amplifiziert, ein. Andere sich
gegenwärtig
in der Entwicklung befindliche Amplifikationsverfahren schließen LCRTM ein (Ligasekettenreaktion, BioTechnica
International), die DNS-Ligase verwendet, und eine Sonde, die aus
zwei Hälften
eines DNS-Segmentes
besteht, das komplementär
ist zu der Sequenz der zu amplifizierenden DNS; Enzym-QB-Replikase
(Gene-Trak Systems) und eine Ribonukleinsäure (RNS)-Sequenzmatrize, die angeheftet ist an
eine Sonde, die komplementär
ist zu der DNS, die kopiert werden soll, was verwendet wird, um
eine DNS-Matrize für
die exponentielle Produktion von komplementärer RNS herzustellen; und NASBATM (Nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation,
Cangene Corporation), die durchgeführt werden kann auf RNS oder
DNS als der zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz.
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Nukleinsäuresonden, die fähig sind
zur Hybridisierung mit spezifischen Gensequenzen, wurden erfolgreich
verwendet, um spezifische Pathogene in biologischen Proben in Empfindlichkeitsniveaus,
die 103–104 Organismen pro Probe erreichen, nachzuweisen
(1990, Gene Probes for Bacteria, Hrsg. Macario und deMacario, Academic
Press). Gekoppelt mit einem Verfahren, das die Amplifikation spezifischer
Ziel-DNS-Sequenzen
erlaubt, können
speziesspezifische Nukleinsäuresonden
das Maß der
Empfindlichkeit des Nachweises von Organismen in einer klinischen
Probe stark erhöhen.
Die Verwendung dieser Sonden kann den direkten Nachweis ermöglichen,
ohne sich auf vorangegangene Kultur- und/oder gewöhnliche
biochemische Identifizierungstechniken zu verlassen. Dieses Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung ist auf Primer gerichtet, die speziesspezifische
Sequenzen des E-kodierenden Gens von M. catarrhalis amplifizieren,
und es ist gerichtet auf Sonden, die spezifisch mit diesen amplifizierten
DNS-Fragmenten hybridisieren. Unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung und gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung können
so wenig wie ein M. catarrhalis-Organismus in der Anwesenheit von
10 μg/ml
fremder DNS nachgewiesen werden.
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Dieses Ausführungsbeispiel ist auf speziesspezifische
Oligonukleotide gerichtet, die verwendet werden können, um
Sequenzen von M. catarrhalis-DNS zu amplifizieren, falls vorhanden,
aus DNS, die extrahiert wurde aus klinischen Proben, einschließlich Mittelohrflüssigkeit,
Sputum, Blut und Flüssigkeiten
aus dem Nasopharynx, Auge und Drüsen;
und um anschließend
zu bestimmen, ob Amplifikation sich ereignete. In einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung wird ein Paar an M. catarrhalis-spezifischen
DNS-Oligonukleotidprimern verwendet, um mit genomischer DNS von
M. catarrhalis zu hybridisieren, die in aus klinischen Proben extrahierter
DNS vorhanden sein kann, und um das spezifische Segment der genomischen
DNS zwischen den beiden flankierenden Primern zu amplifizieren unter
Verwendung von enzymatischer Synthese und dem Durchlaufenlassen
von Temperaturzyklen. Jedes Primerpaar ist so gestaltet, dass es
nur mit den M. catarrhalis-Nukleotidsequenzen
hybridisiert, die das E-kodierende Gen enthalten (d. h. innerhalb
des Bereiches des Genoms, das SEQ ID Nr. 11 enthält), für die sie so synthetisiert
worden waren, um komplementär
zu diesen zu sein; einer für
jeden Strang der doppelsträngigen
DNS. Folglich ist die Reaktion sogar in der Anwesenheit von Mikrogramm-Mengen
heterologer DNS spezifisch. Für
die Zwecke dieser Beschreibung wird auf den Primer, der abgeleitet
wurde aus der Sequenz des positiven (Gen-) Strangs der DNS, Bezug
genommen werden durch „positiver
Primer", und auf
den Primer, der abgeleitet wurde von der Sequenz des negativen (komplementären) Strangs,
wird Bezug genommen werden durch „negativer Primer".
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Die Amplifikation der DNS kann durch
jegliches der kommerziell erhältlichen
Verfahren durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann die Polymerasekettenreaktion verwendet werden,
um die DNS zu amplifizieren. Wenn die Primer einmal hybridisiert
haben an die gegenüberliegenden
Strängen
der Ziel-DNS wird die Temperatur erhöht, um die Replikation des
spezifischen Segmentes der DNS über
den Bereich zwischen den beiden Primern durch eine thermostabile
DNS-Polymerase zu erlauben. Dann lässt man die Reaktion wiederholt Thermozyklen
durchlaufen, so dass bei jedem Zyklus die Menge der DNS, die die
Sequenzen zwischen den beiden Primern darstellt, verdoppelt wird
und die spezifische Amplifikation der M. catarrhalis-DNS-Sequenzen, falls
vorhanden, resultiert. Die weitere Identifizierung des amplifizierten
DNS-Fragmentes, wie abgeleitet von der M. catarrhalis-DNS, kann
durchgeführt
werden durch Flüssighybridisierung.
Dieser Test nutzt eine oder mehrere markierte Oligonukleotide als
Sonden, um spezifisch an das amplifizierte Segment der M. catarrhalis-DNS
zu hybridisieren. Der Nachweis des Vorhandenseins sequenzspezifischer
amplifizierter DNS kann durchgeführt
werden unter Verwendung eines jeglichen von zahlreichen im Stand
der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. eine Gel-Retentions-Analyse mit Autoradiographie.
Folglich stellen die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung
eine Basis für
die Synthese von Oligonukleotiden bereit, die gewerbliche Anwendungen
in Diagnosekits für
den Nachweis von M. catarrhalis haben. In einem verwandten Ausführungsbeispiel können die
als Primer verwendeten Oligonukleotide direkt markiert werden oder
synthetisiert werden, um eine Markierung einzubauen. In Abhängigkeit
von der verwendeten Markierung können
die Amplifikationsprodukte dann nachgewiesen werden, nachdem sie
auf eine Affinitätsmatrix
gebunden haben, unter Verwendung von Isotopen- oder colorimentrischem
Nachweis.
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Die DNS kann extrahiert werden aus
klinischen Proben, die M. catarrhalis enthalten könnten, unter Verwendung
von im Stand der Technik bekannten Verfahren. Zum Beispiel können die
in der Probe enthaltenen Zellen gewaschen werden in TE-Puffer und
durch Zentrifugation pelletiert werden. Die Zellen können dann in
100 μl Amplifikations-Reaktionspuffer,
der Detergenzien und Proteinase K enthält, resuspendiert werden. Unter
Verwendung der Polymerasekettenreaktion kann die resultierende Probe
zusammengesetzt sein aus den Zellen in 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,45%
NP40TM, 0,045% Tween 20TM und
60 μg/ml
Proteinase K Die Probe wird im 55°C-Wasserbad für 1 Stunde
inkubiert. Nach der Inkubation wird die Probe bei 95°C für 10 Minuten
inkubiert, um die Proteinase K zu hitzeinaktivieren. Die Probe kann dann
amplifiziert werden in Übereinstimmung
mit dem Protokoll für
die Polymerasekettenreaktion, wie unten ausgeführt.
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Die M. catarrhalis-DNS kann unter
Verwendung jedes von zahlreichen Protokollen für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch
die Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden. In einer Art dieses
Ausführungsbeispiels
wurde das E-kodierende Gen von 19 klinischen Isolaten von B. catarrhalis
isoliert unter Verwendung der folgenden Bedingungen. Die zu amplifizierende
DNS (~1 μg
genomische DNS) wurde auf 0,5 μl-Mikrozentrifugenröhrchen verteilt
und das Volumen wurde auf 50 μl
angepasst indem eine Reaktionsmischung hinzugefügt wurde, die 0,2 mM dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,25 μg
jedes positiven und negativen Oligonukleotidprimers, 1 Einheit thermostabile
DNS-Polymerase, Polymerase-10×-Puffer
(5 μl),
3 mM MgSO4 (Endkonzentration) und steriles
destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen zu erreichen, enthält. Die
DNS-Polymerase wird zu der Reaktionsmischung unmittelbar vor der
Verwendung hinzugefügt
und wird sanft vermischt, nicht verwirbelt. Eine Schicht Mineralöl, ungefähr 2 Tropfen,
wird zu jedem Röhrchen
hinzugefügt
und dann werden die Röhrchen
in den Thermocycler gestellt. Dreißig bis fünfunddreißig Zyklen sind im Allgemeinen
ausreichend für
die bakterielle DNS-Amplifikation. Ein Zyklus besteht aus 15 Sekunden
bei 96°C,
1 Minute bei 62°C
und 1 Minute bei 74°C.
Der erste Zyklus schließt
eine 3-minütige
Inkubation bei 95°C
ein, um die vollständige
Denaturierung sicherzustellen.
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Oligonukleotide, die nützlich sind
als Primer oder Sonden, die spezifisch mit dem Ekodierenden Gen von
M. catarrhalis hybridisieren, und die verwendet werden bei DNS-Amplifikation und/oder
-Detektion, können biochemisch
synthetisiert werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten
Verfahren aus den Nukleotidsequenzen, die in der vorliegenden Erfindung
offenbart sind. Die Spezifität
der Oligonukleotide für
M. catarrhalis kann überprüft werden
durch eine Genbank-Datenbank- (Genbank) Recherche für jede einzelne Sequenz.
Im Allgemeinen sollten die Oligonukleotide selektiert werden auf
einen niedrigen G-C-Gehalt. Die Primerpaare, die verwendet wurden
für dieses
Ausführungsbeispiel,
um das gesamte E-kodierende Gen zu amplifizieren, schließen die
SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15 ein. Die Primerpaare, die verwendet
wurden um Teile des Gens zu amplifizieren, schließen SEQ
ID Nr. 16 und SEQ ID Nr. 17; und SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18
ein.
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Für
Detektionszwecke können
die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung mit einem Radioisotop endmarkiert
werden. Sondensequenzen innerhalb der beiden für die Amplifikation der Gensequenz
verwendeten Primer können
endmarkiert werden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase
und gamma-32P-ATP. Zwanzig pMol Sonden-DNS
in Kinasepuffer (50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2,
5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Spermidin-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0)
werden vermischt mit 120 μCi
gamma-32P-ATP und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die
markierte Sonde wird von nicht eingebauter Markierung abgetrennt
auf einem 8 %Acrylamidgel, das für
1 Stunde bei 200 Volt in Tris-Borat-EDTA
(TBE)- Puffer bei Raumtemperatur laufen gelassen wurde. Die markierte
Sonde wird zuerst lokalisiert, indem das Acrylamidgel einem Röntgenfilm
für drei
Minuten ausgesetzt wird. Das resultierende Autoradiogramm wird dann
unter das Gel gelegt und die Bande, die die markierte Sonde enthält, wird
von dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wird in einem Milliliter
sterilem destilliertem Wasser zerkleinert und die Sonde wird durch
Schüttelinkubation über Nacht
bei 37°C
eluiert. Die eluierte Sonde wird von den Gelfragmenten durch Zentrifugation
unter Verwendung einer Chromatographie-Prepsäule getrennt. Die Radioaktivität der Sonde
wird bestimmt durch Zählen
von einem Mikroliter der markierten Sonde auf einem Glasfaserfilter
durch Flüssigkeitsszintillation.
Solche Sondensequenzen können
aus jeder der Sequenzen ausgewählt
werden, die ausgewiesen sind als SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 10
und SEQ ID Nr. 12 bis SEQ ID Nr. 18, vorausgesetzt, die Sondensequenz
befindet sich innerhalb der beiden Primer, die für die Amplifikation, der in
der vorliegenden Erfindung offenbarten, gewünschten Nukleotidsequenz, verwendet
werden.
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Alternative, im Stand der Technik
bekannte Verfahren können
verwendet werden, um den Nachweis der amplifizierten Zielsequenzen,
in Übereinstimmung
mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung,
zu verbessern. Die Empfindlichkeit des Nachweises der amplifizierten
DNS-Sequenzen kann verbessert werden, indem die Sequenzen der Flüssighybridisierung
unterzogen werden. Alternative, im Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren,
zusätzlich
zu Gelelektrophorese und Gelelektrophorese mit Southern-Hybridisierung
und Autoradiographie, die verwendet werden können mit den Zusammensetzungen und
Verfahren der vorliegenden Erfindung, schließen ein: Restriktionsenzymverdauung
mit Gelelektrophorese; Slot-Blot-Hybridisierung mit einer markierten
Oligonukleotidsonde; Amplifikation mit einem radiomarkierten Primer
mit Gelelektrophorese, Southern-Hybridisierung und Autoradiographie;
Amplifikation mit einem radiomarkierten Primer mit Dot-Blot und
Autoradiographie; Amplifikation mit Oligonukleotiden, die Affinitätsmarkierungen
(z. B. Biotin; oder einen Primer, der Biotin einbaut, und der andere
Primer mit einer Sequenz, die spezifisch ist für ein DNS-bindendes Protein)
aufweisen, gefolgt von dem Nachweis in einem affinitätsbasierten Ansatz
(z. B. ELISA); und Amplifikation mit Oligonukleotiden, die Fluorophore
enthalten, gefolgt von Fluoreszenznachweis.
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Ein Ausführungsbeispiel nicht isotopischer
Detektion schließt
den Einbau von Biotin in die Oligonukleotidprimer der vorliegenden
Erfindung ein. Die 5'-Aminogruppe
der Primer können
biotinyliert sein mit Sulfo-NHS-Biotin, oder Biotin kann direkt
eingebaut werden in den Primer, indem der Primer in Anwesenheit
von Biotin-markierten dNTPs synthetisiert wird. Die nicht isotopisch
markierten Primer können
dann verwendet werden für
die Amplifikation von DNS aus einer klinischen Probe. Der Nachweis
für die
Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Zielsequenzen kann
durchgeführt
werden, indem die amplifizierten Zielsequenzen eingefangen werden
unter Verwendung einer Affinitätsmatrix
mit daran gebundenem Avidin, gefolgt von der Inkubation mit einem
Avidinkonjugat, das ein Enzym enthält, das verwendet werden kann,
um den Komplex mit anschließender
Substratentwicklung sichtbar zu machen. Alternativ können die
amplifizierten Zielsequenzen immobilisiert werden durch Hybridisierung
an die entsprechenden Sonden der Zielsequenz, worin die Sonden an
einer Matrix befestigt worden sind. Der Nachweis kann durchgeführt werden
unter Verwendung eines Avidinkonjugates, das ein Enzym enthält, welches verwendet
werden kann, um den Komplex mit anschließender Substratentwicklung
sichtbar zu machen.
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Ausführungsbeispiel D
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Verfahren zur Herstellung
und Verwendung von E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden in diagnostischen
Immunoassays.
-
E-Protein, E-Peptide und E-Oligopeptide
können
aufgereinigt werden zur Verwendung als ein Immunogen in Impfformulierungen;
und als ein Antigen für
diagnostische Tests oder zur Herstellung von M. catarrhalis-spezifischen
Antisera mit therapeutischem und/oder diagnostischem Wert. E-Protein
aus M. catarrhalis oder Peptide davon, oder rekombinantes E-Protein,
rekombinante E-Peptide oder rekombinante E-Oligopeptide, hergestellt von einem
Expressionsvektorsystem, können
mit im Stand der Technik bekannten Verfahren aufgereinigt werden,
einschließlich
Detergensextraktion, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, Immunoaffinitäts- oder
Größenbestimmungssäulen), differentieller
Zentrifugation, differentieller Löslichkeit oder anderen Standardtechniken
für die
Reinigung von Proteinen. Zum Beispiel kann eine teilweise gereinigte Zubereitung,
die primär
bakterielle Außenmembranproteine
enthält,
wie folgt zubereitet werden. Bakterien, die E exprimieren, wurden
von 30 Schokoladenagarplatten in 25 ml PBS, pH 7,2 geschabt und
durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 20 Minuten bei 4°C geerntet.
Das bakterielle Pellet wurde resuspendiert in 10 ml 1 M Natriumacetat – 0,001
M β-Mercaptoethanol
(pH 4,0). Ein 90-ml-Volumen einer Lösung, die 5% Zwittergent Z 3– 14 (Calbiochem-Behring)
und 0,5% M CaCl2 enthält, wurde hinzugefügt und die
Suspension wurde vermischt für
1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Nukleinsäuren wurden gefällt durch
die Zugabe von 25 ml kaltem Ethanol und anschließender Zentrifugation bei 17.000 × g für 10 Minuten
bei 4°C.
Die verbleibenden Proteine wurden gefällt durch die Zugabe von 375
ml kaltem Ethanol und gesammelt durch Zentrifugation bei 17.000 × g für 20 Minuten
bei 4°C.
Den Pellets wurde ermöglicht
zu trocknen und sie wurden dann in 10 ml Detergenspuffer, der 0,05%
Zwittergent, 0,05 M Tris, 0,01 M EDTA, pH 8,0 enthält, suspendiert
und für
1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Die bakteriellen Außenmembranproteine
sind in der löslichen
Fraktion des Detergenspuffers nach der Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten
bei 4°C
vorhanden.
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Die Immunoreinigung des E-Proteins
von einer Außenmembranproteinzubereitung
kann unter im Stand der Technik für die Immunoaffinitätschromatographie
bekannten Verfahren durchgeführt
werden. E-spezifische monoklonale Antikörper können an eine Chromatographiematrix
gekoppelt werden, um eine Affinitätsmatrix zu bilden. Die Außenmembranproteinzubereitung
wird dann mit der Affinitätsmatrix
inkubiert, wodurch den Antikörpern
ermöglicht
wird, an E zu binden. Die Affinitätsmatrix wird dann gewaschen,
um ungebundene Bestandteile zu entfernen, und E wird dann eluiert
von der Affinitätsmatrix,
wodurch eine gereinigte Zubereitung von E-Protein resultiert. Das
gereinigte E kann als ein Antigen für diagnostische Tests verwendet
werden oder kann chemisch oder enzymatisch in Peptide gespalten
werden unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind.
Alternativ können
E-Peptide oder Oligopeptide chemisch synthetisiert werden unter Verwendung
der Aminosäuresequenz,
die abgeleitet wird von dem E-kodierenden Gen als Bezug. Rekombinantes
E-Protein kann gereinigt werden unter Verwendung von ähnlichen
Verfahren.
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E-Oligopeptide werden hierin als
eine Reihe von Peptiden definiert, die einem Teil der Aminosäuresequenz
von E-Protein, wie offenbart in SEQ ID Nr. 11, entspricht, die als
ein Ganzes oder chemisch gekoppelt synthetisiert werden. Solche
Peptide oder Oligopeptide können
synthetisiert werden unter Verwendung von einem der zahlreichen
im Stand der Technik bekannten Verfahren der Peptidsynthese, einschließlich der
Standardfeststoffpeptidsynthese unter Verwendung von tert-Butyloxycarbonylaminosäuren (Mitchell
et al., 1978, J. Org. Chem. 43: 2845–2852), unter Verwendung von
9-Fluorenylmethyloxycarbonylaminosäuren auf einem Polyamidträger (Dryland
et al., 1986, J. Chem. So. Perkin Trans. I, 125–137); durch Pepscan-Synthese
(Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 03: 259; 1984, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 3998); oder durch Standardflüssigphasenpeptidsynthese. Modifikation
der Peptide oder Oligopeptide, wie zum Beispiel durch Deletion oder
Substitution von Aminosäuren
(und einschließlich
Extensionen und Additionen an Aminosäuren) und auf anderen Wegen,
kann so durchgeführt
werden, dass nicht wesentlich von den immunologischen Eigenschaften
des Peptids oder Oligopeptids abgewichen wird. Insbesondere kann
die Aminosäuresequenz
des E-Proteins geändert
werden durch Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren mit funktionell äquivalenten
Aminosäuren,
was in einer Änderung
resultiert, die still ist in Begriffen eines beobachteten Unterschieds
in dem physikochemischen Verhalten des Proteins, Peptids oder Oligopeptids.
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Gereinigtes E-Protein, gereinigte
E-Peptide und E-Oligopeptide können
verwendet werden als Antigene in Immunoassays für den Nachweis von Moraxella
catarrhalisspezifischen Antisera, die vorhanden sind in der Körperflüssigkeit
eines Individuums, bei dem vermutet wird, dass es eine Infektion
hat, die verursacht wird durch M. catarrhalis. Die Körperflüssigkeiten
schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf Mittelohrflüssigkeit, Sputum,
Blut und Flüssigkeiten
von dem Nasopharynx, Auge und Drüsen.
Der Nachweis von E, E-Peptiden oder E-Oligopeptiden als ein Antigen
in Immunoassays, schließt
jeden im Stand der Technik bekannten Immunoassay ein, einschließlich aber
nicht beschränkt
auf Radioimmunoassay, enzymgekoppelte Immunoadsorptionsbestimmung
(ELISA), „Sandwich"-Assay, Präzipitinreaktion,
Agglutinationsassay, Fluoreszenzimmunoassay und chemilumineszenzbasierter
Immunoassay.
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Ausführungsbeispiel
E
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Verfahren und Zusammensetzungen
für Impfformulierungen
in Bezug auf E, E-Peptide
und E-Oligopeptide.
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Dieses Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung dient der Bereitstellung von E-Protein und/oder Peptiden
davon, die verwendet werden als Immunogene in einem prophylaktischen
und/oder therapeutischen Impfstoff für die aktive Immunisierung,
um vor Infektionen, die durch M. catarrhalis verursacht sind, zu
schützen
oder diese zu behandeln. Für
die Impfstoffentwicklung können
die E-spezifischen Aminosäuresequenzen,
die das Immunogen enthalten, von M. catarrhalis aufgereinigt werden,
oder sie können
aufgereinigt werden von einem Wirt, der einen rekombinanten Vektor
enthält,
der E, E-Peptide oder E-Oligopeptide
exprimiert. Solche Wirte schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf bakterielle Transformanten, Hefetransformanten, fädige Pilztransformanten
und kultivierte Zellen, die entweder infiziert oder transfiziert
wurden mit einem Vektor, der E-Aminosäuresequenzen
kodiert. Peptide oder Oligopeptide, die Teilen des E-Proteins entsprechen,
können
durch chemische oder enzymatische Spaltung des E-Proteins hergestellt
werden, oder chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von
im Stand der Technik bekannten Verfahren und mit der Aminosäuresequenz,
die aus der Nukleotidsequenz des E-kodierenden Gens als Bezug abgeleitet
werden. Alternativ können
E-Peptide oder E-Oligopeptide
von einem rekombinanten Vektor hergestellt werden. In jedem Fall
ist das E-Protein-,
E-Peptid- oder E-Oligopeptid-Immunogen als das relevante immunogene
Material in der Impfformulierung eingeschlossen und ist in therapeutisch
wirksamen Mengen eingeschlossen, um eine Immunantwort zu induzieren.
Es sind viele Verfahren bekannt für das Einführen einer Impfformulierung
in den zu impfenden Menschen oder das zu impfende Tier. Diese schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf die intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane,
okulare, intranasale und orale Verabreichung. Der Impfstoff kann
weiterhin einen physiologischen Trägerstoff, wie z. B. eine Lösung, ein
Polymer oder Liposomen enthalten; und einen Hilfsstoff oder eine
Kombination davon.
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Zahlreiche Hilfsstoffe werden im
Zusammenhang mit Impfformulierungen verwendet. Die Hilfsstoffe helfen
dabei, eine dauerhaftere und ein höheres Maß an Immunität zu erreichen
unter Verwendung von kleineren Mengen an Vakzin-Antigen oder geringeren
Dosen, als wenn das Vakzin-Antigen alleine verabreicht würde. Der
Mechanismus der Hilfsmittelwirkung ist komplex und nicht vollständig verstanden.
Er mag jedoch die Immunomodulation durch die Stimulation der Cytokinproduktion,
Phagozytose und andere Aktivitäten
des Retikuloendothelialensystems einschließen, ebenso wie die verzögerte Freisetzung
und Abbau/Bearbeitung des Antigens, um die Immunerkennung zu verstärken. Beispiele
an Hilfsmitteln schließen
ein inkompletes Freund's
Adjuvans, Adjuvans 65 (enthaltend Erdnussöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat), Ölemulsionen,
Ribi Adjuvans, die Pluronic-Polyole, Polyamine, Avridin, Quil A,
Saponin, MPL, QS-21 und Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid,
Aluminiumphosphat, etc.
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Ein weiteres Ausführungsbeispiel dieser Art der
Erfindung schließt
die Herstellung von E-spezifischen Aminosäuresequenzen als ein Hapten
ein, d. h. ein Molekül,
das nicht selber eine Immunantwort auslösen kann. In solch einem Fall
kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein anderes immunogenes
Molekül gebunden
werden, das dem gekoppelten Hapten Immunogenität verleihen wird, wenn es dem
Immunsystem ausgesetzt wird. Folglich kann solch ein E-spezifisches,
an ein Trägermolekül gekoppeltes
Hapten, das Immunogen in einer Impfformulierung sein.
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Eine weitere Art dieses Ausführungsbeispiels
stellt sowohl einen lebenden rekombinanten viralen Impfstoff, rekombinanten
bakteriellen Impfstoff rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoff,
als auch einen inaktivierten rekombinanten viralen Impfstoff bereit,
der verwendet wird, um vor durch M. catarrhalis verursachte Infektionen
zu schützen.
Vakziniavirus ist das im Stand der Technik bestbekannte Beispiel
eines infektiösen
Virus, das bearbeitet ist, um Vakzinantigene, die von anderen Organismen
abgeleitet sind, zu exprimieren. Das rekombinante, lebende Vakziniavirus,
das abgeschwächt
ist oder anderweitig behandelt ist, so dass es selbst keine Krankheit
verursacht, wird verwendet, um den Wirt zu immunisieren. Die anschließende Replikation
des rekombinanten Virus, innerhalb des Wirts, stellt eine fortwährende Stimulierung
des Immunsystems mit den Impfstoffantigenen, wie z. B. E oder E-Peptiden
bereit, wodurch eine langdauernde Immunität verschafft wird. Andere lebende
Vakzinvektoren schließen
ein: Adenovirus, Cytomegalovirus und vorzugsweise die Pockenviren,
wie z. B. Vakzinia (Paoletti und Panicali, U.S. Patent Nr. 4,603,112)
und abgeschwächte Salmonella-Stämme (Stocker
et al., U.S. Patent Nrn. 5,210,035; 4,837,151; und 4,735,801; und
Curtiss et al., 1988, Vaccine 6: 155–160). Lebende Impfstoffe sind
besonders vorteilhaft, da sie das Immunsystem kontinuierlich stimulieren,
was eine im Wesentlichen lang anhaltende Immunität verleihen kann. Wenn die
Immunantwort vor der anschließenden
M. catarrhalis-Infektion schützt,
kann der lebende Impfstoff selber in einem vorbeugenden Impfstoff
gegen M. catarrhalis verwendet werden.
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Um diese An des Ausführungsbeispiels
zu erläutern,
kann unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken, wie z.
B. jene, die im Ausführungsbeispiel
A erläutert
sind, das E-kodierende Gen oder ein Genfragment, das ein oder mehrere
E-Peptide kodiert, in die genomische DNS des Vakziniavirus an einer
Stelle eingefügt
werden, die die Expression der E-Epitope ermöglicht, aber das Wachstum oder
die Replikation des Vakziniavirusvektors nicht negativ beeinflusst.
Das resultierende rekombinante Virus kann als das Immunogen in einer
Impfformulierung verwendet werden. Dieselben Verfahren können verwendet
werden, um eine inaktivierte rekombinante virale Impfformulierung
zu bilden, mit der Ausnahme, dass das rekombinante Virus inaktiviert
ist, wie zum Beispiel durch im Stand der Technik bekannte chemische
Mittel, vor der Verwendung als ein Immunogen und ohne die Immunogenität des exprimierten
Immunogens wesentlich zu beeinflussen. Eine Mischung der inaktivierten
Viren, die unterschiedliche Epitope exprimieren, kann bei der Formulierung
eines multivalenten inaktivierten Impfstoffs verwendet werden. In
jedem Fall kann der inaktivierte rekombinante Impfstoff oder die
Mischung inaktivierter Viren formuliert werden mit einem geeigneten
Hilfsstoff, um die immunologische Antwort auf die Vakzinantigene
zu verstärken.
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In einer weiteren Variation dieses
Ausführungsbeispiels
wird das genetische Material direkt verwendet als die Impfformulierung.
Nukleinsäure
(DNS oder RNS), die Sequenzen enthält, die E, E-Peptid oder E-Oligopeptid
kodieren, die operativ gekoppelt sind an ein oder mehrere regulatorische
Elemente, können
direkt eingeführt
werden, um das Individuum zu impfen („direkter Gentransfer") gegen pathogene
Stämme
von M. catarrhalis. Der direkte Gentransfer in ein geimpftes Individuum,
der in der Expression des genetischen Materials durch die Zellen,
wie z. B. Gefäßendothelzellen,
ebenso wie das Gewebe der Hauptorgane des Individuums resultiert,
wurde durch im Stand der Technik vorhandene Techniken gezeigt, wie
z. B. durch die intravenöse Injektion
eines Expressionsplasmid : kationischer Liposomen-Komplexes (Zhu et
al., 1993, Science 261: 209–211).
Andere wirksame Verfahren, um Vektor-DNS in eine Zielzelle zu überbringen,
sind im Stand der Technik bekannt. In einem Beispiel wurde gereinigte
rekombinante Plasmid-DNS, die virale Gene enthält, verwendet, um Vakzine zu
impfen (entweder parenteral, mukosal oder über Genkanonenimmunisierung), um
eine schützende
Immunantwort zu induzieren (Fynan et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 11478–11482).
In einem anderen Beispiel können
von einem Individuum entnommene Zellen transfiziert oder elektroperforiert werden
durch im Stand der Technik bekannte Standardverfahren, was in der
Einführung
der rekombinanten Vektor-DNS in die Zielzelle resultiert. Zellen,
die die rekombinante Vektor-DNS enthalten, können dann selektiert werden
für die
Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z.
B. über
einen Selektionsmarker, der in dem Vektor exprimiert wird und die
ausgewählten
Zellen können
dann erneut in das Individuum eingeführt werden, um E-Protein, E-Peptid
oder E-Oligopeptid zu exprimieren.
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Ein bevorzugtes Verfahren der Impfung
mit genetischem Material umfasst den Scliritt der Verabreichung
des Nukleinsäuremoleküls an das
Individuum, das eine Nukleinsäuresequenz
enthält,
die eines oder mehrere E-Proteine, E-Peptide oder E-Oligopeptide kodiert,
wobei das Nukleinsäuremolekül wirksam
an eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, die notwendig sind
für die
Expression, gekoppelt ist. Das Nukleinsäuremolekül kann direkt verabreicht werden,
oder es kann zuerst in einen viralen Vektor eingeführt werden und über den
Vektor verabreicht werden. Das Nukleinsäuremolekül kann in einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
oder Verdünnungsmittel
verabreicht werden und kann Verbindungen enthalten, die die Wirksamkeit
des Impfstoffs steigern. Diese zusätzlichen Verbindungen schließen ein
aber sind nicht beschränkt
auf Hilfsmittel, die die Immunantwort modulieren und verstärken oder
andere Verbindungen, die die Aufnahme von Nukleinsäure durch
die Zellen steigern. Die Immunisierung mit dem Nukleinsäuremolekül kann durch
jeden elterlichen [Anmerkung des Übersetzers: muss richtig wohl
heißen:
parenteralen] Weg (intravenös,
intraperitoneal, intradermal, subkutan oder intramuskulär) oder über Kontakt
mit Schleimhautoberflächen
des Nasopharynx, der Trachea oder des Gastrointestinaltraktes erfolgen.
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Als eine Alternative zur aktiven
Immunisierung, z. B. dort wo ein immungeschwächtes Individuum unter einer
möglicherweise
lebensbedrohenden, durch M. catarrhalis verursachten Infektion leidet,
kann die Immunisierung passiv sein, d. h. eine Immunisierung, die
die Verabreichung von aufgereinigtem menschlichen Immunglobulin
umfasst, das Antikörper
gegen E-Epitope enthält.
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Es sollte verstanden werden, dass
während
die Erfindung hierin im Detail beschrieben worden ist, die Beispiele
nur für
erläuternde
Zwecke sind. Andere Abwandlungen der Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung,
die für
Fachleute der Molekularbiologie, der medizinischen Diagnostik und
verwandter Disziplinen naheliegend sind, sind beabsichtigt, innerhalb
des Schutzumfangs der anhängenden
Ansprüche
zu liegen.
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