DE69634918T2 - Polynukleotide und polypeptide aus pathogenen mycobakterien und deren verwendung als diagnostika, impfstoffe und als ziel der chemotherapie - Google Patents

Polynukleotide und polypeptide aus pathogenen mycobakterien und deren verwendung als diagnostika, impfstoffe und als ziel der chemotherapie Download PDF

Info

Publication number
DE69634918T2
DE69634918T2 DE69634918T DE69634918T DE69634918T2 DE 69634918 T2 DE69634918 T2 DE 69634918T2 DE 69634918 T DE69634918 T DE 69634918T DE 69634918 T DE69634918 T DE 69634918T DE 69634918 T2 DE69634918 T2 DE 69634918T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polypeptide
seq
polynucleotide
polypeptides
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69634918T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69634918D1 (de
Inventor
John Hermon-Taylor
Tim Doran
Douglas Millar
Mark Tizard
Mark Loughlin
Nazira Sumar
John Ford
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HAV Vaccines Ltd
Original Assignee
ST GEORG S HOSPITAL MEDICAL SC
St Georg's Hospital Medical School
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ST GEORG S HOSPITAL MEDICAL SC, St Georg's Hospital Medical School filed Critical ST GEORG S HOSPITAL MEDICAL SC
Application granted granted Critical
Publication of DE69634918D1 publication Critical patent/DE69634918D1/de
Publication of DE69634918T2 publication Critical patent/DE69634918T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

  • Diese Erfindung betrifft eine neuartige Polynukleotidsequenz, die wir als "GS" bezeichnet haben und die wir in pathogenen Mycobakterien identifiziert haben. Bei der GS handelt es sich um eine Pathogenitätsinsel innerhalb von 8 kb der DNA, die eine Kernregion von 5,75 kb und ein benachbartes übertragbares Element innerhalb von 2,25 kb umfasst. GS ist in Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium avium subsp. silvaticum und einigen pathogenen Isolaten von M. avium enthalten. Funktionelle Abschnitte der Kernregion der GS sind auch durch Regionen mit einem hohen Grad an Homologie repräsentiert, die wir in Cosmiden identifiziert haben, die genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis enthalten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Hauptursachen von weltweiten Erkrankungen von Mensch und Tier. Obschon herkömmliche Diagnosemethoden einschließlich der Mikroskopie, Kultur und Hauttestung für die Erkennung dieser Erkrankungen existieren, sind verbesserte Methoden, insbesondere neue Immundiagnostika und auf DNA basierende Nachweissysteme, erforderlich. Zur Behandlung der Tuberkulose eingesetzte Arzneimittel stoßen immer häufiger auf das Problem resistenter Organismen. Auf spezifische Pathogenitäts-Determinanten gerichtete neue Arzneimittel, ebenso wie neue Impfstoffe zur Verhütung und Behandlung der Tuberkulose werden benötigt. Die Bedeutung des Mtb als einem globalen Pathogen spiegelt sich in dem Engagement wider, das der Sequenzierung des Gesamtgenoms dieses Organismus zukommt. Dies hat zur Generierung einer großen Menge von DNA-Sequenzdaten der genomischen DNA innerhalb des Cosmids und weiterer Bibliotheken geführt. Obschon die DNA-Sequenz im Fachgebiet bekannt ist, bleiben die Funktionen des überragenden Großteils dieser Sequenzen, der Proteine, die sie codieren, die biologische Bedeutung dieser Proteine und die Gesamtrelevanz und Verwendung dieser Gene und ihrer Produkte als Diagnostika, Impfstoffe und Ziele für die Chemotherapie von tuberkulösen Erkrankungen gänzlich unbekannt.
  • Mycobacterium avium subsp. silvaticum (Mavs) ist ein pathogenes Mycobakterium, das Krankheiten bei Tieren und Vögeln verursacht, doch auch den Menschen befallen kann. Mycobacterium paratuberculosis (Mptb) verursacht eine chronische Entzündung des Darms bei vielen Tierspezies einschließlich Primaten und kann auch zur Crohn-Krankheit beim Menschen führen. Mptb ist mit weiteren chronischen entzündlichen Erkrankungen beim Menschen assoziiert, wie etwa der Sarkoidose. Eine subklinische Mptb-Infektion ist bei landwirtschaftlichem Viehbestand weit verbreitet und ist in der Milch der infizierten Tiere vorhanden. Der Organismus ist gegenüber einer Pasteurisation resistenter als Mtb und kann auf Menschen über den Milcheinzelhandel übertragen werden. Mptb ist auch in der Wasserversorgung vorhanden, insbesondere dem Wasser, das mit dem Ablauf von stark abgegrasten Viehweiden kontaminiert ist. Mptb und Mavs enthalten die Insertionselemente IS900 bzw. IS902, wobei diese mit einer Pathogenität in diesen Organismen verknüpft sind. IS900 und IS902 bieten bequem geeignete hochspezifische Multikopie-DNA-Ziele für den empfindlichen Nachweis dieser Organismen unter Anwendung von auf DNA basierenden Methoden und für die Diagnose von Infektionen bei Tieren und Menschen. Allerdings sind starke Verbesserungen in der Immundiagnostik von Mptb- und Mavs-Infektionen bei Tieren und Menschen vonnöten. Mptb und Mavs sind im Allgemeinen in vivo resistent gegenüber standardmäßigen Antituberkulose-Wirkstoffen. Obschon wesentliche klinische Verbesserungen bei durch Mptb verursachten Infektionen, wie etwa der Crohn-Krankheit, aus der Behandlung von Patienten mit Kombinationen der existierenden Wirkstoffe wie Rifabutin, Clarithromycin oder Azithromycin resultieren können, sind zusätzliche wirksame Arzneimittelbehandlungen erforderlich. Weiterhin besteht ein dringender Bedarf an wirksamen Impfstoffen für die Verhütung und Behandlung von Mptb- und Mavs-Infektionen bei Tieren und Menschen auf der Grundlage der Erkennung spezifischer Pathogenitäts-Determinanten.
  • Pathogenitätsinseln sind im Allgemeinen Regionen von 7–9 kb der DNA, umfassend eine Kerndomäne mit vielfachen ORFs und ein angrenzendes übertragbares Element. Das übertragbare Element codiert auch Proteine, die mit Pathogenität verknüpft sein können, zum Beispiel durch Bereitstellung von Rezeptoren für die zelluläre Erkennung. Pathogenitätsinseln werden als mobile Verpackungen für DNA betrachtet, die, wenn sie in einen Organismus eindringen, daran beteiligt sind, seine Umwandlung von einem nicht-krankmachenden zu einem krankmachenden Stamm hervorzubringen.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1(a) und (b) zeigen eine lineare Karte der Pathogenitätsinsel GS in Mavs (1a) und in Mptb (1b). Die wichtigsten offenen Leseraster sind als ORFs A bis H veranschaulicht. ORFs A bis F finden sich innerhalb der Kernregion von GS. ORFs G und H sind durch den angrenzenden Abschnitt des übertragbaren Elements der GS codiert.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Unter Anwendung einer auf DNA basierenden Differentialanalyse-Technologie haben wir ein neuartiges Polynukleotid in Mptb entdeckt und charakterisiert (Isolate 0022 aus einer Guernsey-Kuh und 0021 aus einem Rotwild). Dieses Polynukleotid umfasst die Genregion, die wird als GS bezeichnet haben. GS ist in Mptb unter Verwendung der Identifizierungs-DNA-Sequenzen SEQ ID NR. 1 und 2 zu finden, wobei die SEQ ID NR. 2 die komplementäre Sequenz zu SEQ ID NR. 1 ist. Die GS ist auch in Mavs identifiziert. Die vollständige DNA-Sequenz, die den positiven Strang der GS aus einem Isolat von Mavs, umfassend 7995 Nukleotide, enthält, einschließlich der Kernregion von GS und des angrenzenden übertragbaren Elements, ist in SEQ ID NR. 3 wiedergegeben. Die DNA-Sequenz, die 4435 bp des positiven Strangs der GS, die von einem Isolat von Mptb erhalten wurde, umfasst, einschließlich der Kernregion der GS (Nukleotide 1614 bis 6047 der GS in Mavs) ist in SEQ ID NR. 4 wiedergegeben. Die DNA-Sequenz der GS von Mptb ist in hohem Maße (99,4 %) homolog zur GS in Mavs. Der verbliebene Abschnitt der DNA-Sequenz der GS in Mptb ist von einem Fachmann des Gebiets unter Anwendung standardmäßiger Laborverfahren ohne weiteres gewinnbar. Die gesamte funktionelle DNA-Sequenz einschließlich der Kernregion und des übertragbaren Elements von GS in Mptb und Mavs, wie oben beschrieben, machen die Polynukleotidsequenzen der Erfindung aus.
  • Es gibt 8 offene Leseraster (ORFs) in GS. Sechs von diesen, bezeichnet als GSA, GSB, GSC, GSD, GSE und GSF, sind durch die Kern-DNA-Region der GS codiert, welche, wie für eine Pathogenitätsinsel charakteristisch, einen unterschiedlichen GC-Gehalt zum Rest des mikrobiellen Genoms aufweist. Zwei ORFs, bezeichnet als GSG und GSH, sind durch das übertragbare Element der GS codiert, deren GC-Gehalt dem des Rests des mycobakteriellen Genoms ähnelt. Die ORF-GSH umfasst zwei Sub-ORFs H1 und H2 auf dem komplementären DNA-Strang, die durch eine programmierte Frameshifting-Stelle verknüpft sind, so dass ein einzelnes Polypeptid von der ORF GSH translatiert wird. Die Nukleotidsequenzen der acht ORFs in GS und deren Translationen sind in SEQ ID NR. 5 bis SEQ ID NR. 29 gezeigt wie folgt:
  • ORF A:
    • SEQ ID NR. 5 Nukleotide 50 bis 427 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 6 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 5.
  • ORF B:
    • SEQ ID NR. 7 Nukleotide 772 bis 1605 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 8 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 7.
  • ORF C:
    • SEQ ID NR. 9 Nukleotide 1814 bis 2845 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 10 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 9.
    • SEQ ID NR. 11 Nukleotide 201 bis 1232 der GS von Mptb
    • SEQ ID NR. 12 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 11.
  • ORF D:
    • SEQ ID NR. 13 Nukleotide 2785 bis 3804 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 14 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 13.
    • SEQ ID NR. 15 Nukleotide 1172 bis 2191 der GS von Mptb
    • SEQ ID NR. 16 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 15.
  • ORF E:
    • SEQ ID NR. 17 Nukleotide 4080 bis 4802 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 18 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 17.
    • SEQ ID NR. 19 Nukleotide 2467 bis 3189 der GS von Mptb
    • SEQ ID NR. 20 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 19.
  • ORF F:
    • SEQ ID NR. 21 Nukleotide 4947 bis 5747 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 22 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 21.
    • SEQ ID NR. 23 Nukleotide 3335 bis 4135 der GS von Mptb
    • SEQ ID NR. 24 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 23.
  • ORF G:
    • SEQ ID NR. 25 Nukleotide 6176 bis 7042 der GS von Mavs
    • SEQ ID NR. 26 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 25.
  • ORF H:
    • SEQ ID NR. 27 Nukleotide 7953 bis 6215 der GS von Mavs.
  • ORF H1:
    • SEQ ID NR. 28 Aminosäuresequenz, codiert durch Nukleotide 7953 bis 7006 der SEQ ID NR. 27
  • ORF H2:
    • SEQ ID NR. 29 Aminosäuresequenz, codiert durch Nukleotide 7009 bis 6215 der SEQ ID NR. 27
  • Die Polynukleotide in Mtb mit Homologie zu den ORFs B, C, E und F der GS in Mptb und Mavs und die Polypeptide, die sie nun als Ergebnis unserer Erfindung bekanntermaßen codieren, sind die folgenden:
  • ORF B:
    • SEQ ID NR. 30 Cosmid MTCY277 Nukleotide 35493 bis 34705
    • SEQ ID NR. 31 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 30.
  • ORF C:
    • SEQ ID NR. 32 Cosmid MTCY277 Nukleotide 31972 bis 32994
    • SEQ ID NR. 33 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 32.
  • ORF D:
    • SEQ ID NR. 34 Cosmid MTCY277 Nukleotide 34687 bis 33956
    • SEQ ID NR. 35 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 34.
  • ORF E:
    • SEQ ID NR. 36 Cosmid MTO24 Nukleotide 15934 bis 15203
    • SEQ ID NR. 37 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 36.
  • ORF F:
    • SEQ ID NR. 38 Cosmid MTO24 Nukleotide 15133 bis 14306
    • SEQ ID NR. 39 Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID NR. 38.
  • Die durch die ORFs A bis H in Mptb und Mavs codierten Proteine und Peptide und die Aminosäuresequenzen von homologen Genen, die wir, wie oben beschrieben, in Mtb entdeckt haben und die angegeben sind in SEQ ID NRn. 31, 33, 35, 37 und 39, und Fragmente davon, umfassen die Polypeptide der Erfindung. Von den Polypeptiden der Erfindung wird geglaubt, dass sie mit einer spezifischen Immunreaktivität und mit der Pathogenität der Wirts-Mikroorganismen, von denen sie erhalten wurden, assoziiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein Polynukleotid in im Wesentlichen isolierter Form bereit, welches zum selektiven Hybridisieren an Sequenz ID NRn. 3 oder 4 oder ein Fragment davon fähig ist. Das Polynukleotid-Fragment kann alternativ eine Sequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NRn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 und 27. Die Erfindung stellt außerdem ein Polynukleotid in im Wesentlichen isolierter Form bereit, dessen Sequenz im Wesentlichen in einer Sequenz besteht, ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NRn. 30, 32, 34, 36 und 38, oder einer entsprechenden Sequenz, die selektiv daran hybridisierbar ist, oder ein Fragment dieser Sequenz oder einer entsprechenden Sequenz.
  • Die Erfindung stellt ferner diagnostische Sonden bereit, z.B. eine Sonde, die ein Fragment von mindestens 15 Nukleotiden eines Polynukleotids der Erfindung umfasst, oder eine Peptid-Nukleinsäure oder einen ähnlichen synthetischen sequenzspezifischen Liganden, die wahlweise eine offenbarende Markierung trägt. Die Erfindung stellt außerdem einen Vektor bereit, der ein Polynukleotid wie oben definiert trägt, insbesondere einen Expressionsvektor.
  • Die Erfindung stellt darüber hinaus ein Polypeptid in im Wesentlichen isolierter Form, welches eine beliebige der Sequenzen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NRn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 und 39, oder ein im Wesentlichen dazu homologes Polypeptid bereit. Die Erfindung stellt außerdem ein Polypeptid-Fragment bereit, welches ein Fragment eines oben definierten Polypeptids umfasst, welches Fragment mindestens 10 Aminosäuren und ein Epitop umfasst. Die Erfindung stellt ebenso Polynukleotide in im Wesentlichen isolierter Form bereit, welche Polypeptide der Erfindung codieren, und Vektoren, die diese Polynukleotide umfassen, als auch Antikörper, die zur Bindung dieser Polypeptide fähig sind. In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Kits bereit, umfassend Polynukleotide, Polypeptide, Antikörper oder synthetische Liganden der Erfindung als auch Verfahren zur Verwendung dieser Kits in der Diagnose des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Mycobakterien in einer Probe. Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Polynukleotide der Erfindung, Polypeptide der Erfindung oder Antisense-Sonden umfassen, als auch die Verwendung dieser Zusammensetzungen in der Behandlung oder Verhütung von durch Mycobakterien verursachten Erkrankungen. Die Erfindung stellt außerdem die durch das Polynukleotid bewirkte Verhütung und Behandlung von Infektionen durch GS-enthaltende pathogene Mycobakterien in Tieren und Menschen als einer Methode zur Erhöhung der in vivo-Empfänglichkeit dieser Mycobakterien für antimikrobielle Wirkstoffe bereit. Die Erfindung stellt darüber hinaus mit den Polynukleotiden der Erfindung transformierte Bakterien oder Viren zur Verwendung als Impfstoffe bereit. Die Erfindung liefert außerdem Mptb oder Mavs, in denen alle oder ein Teil der Polynukleotide der Erfindung deletiert oder abgeschwächt worden sind, um mutierte Organismen von geringerer Pathogenität zur Verwendung als Impfstoffe bei Tieren und Menschen zu erhalten. Die Erfindung bietet darüber hinaus Mfb, in denen alle oder ein Teil der Polynukleotide, die die Polypeptide der Erfindung codieren, deletiert oder abgeschwächt worden sind, um mutierte Organismen von geringerer Pathogenität zur Verwendung als Impfstoffe bei Tieren und Menschen zu erhalten.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist unsere Entdeckung von Homologien zwischen den ORFs B, C und E in GS einerseits und dem Mtb-Cosmid MTCY277 andererseits (Daten von Genbank-Datenbank unter Verwendung der Computerprogramme BLAST und BLIXEM). Die homologen ORFs in MTCY277 liegen aneinander angrenzend, was mit der Form einer anderen Pathogenitätsinsel in Mtb übereinstimmt. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist unsere Entdeckung von Homologien zwischen ORFs E und F in GS und dem Mtb-Cosmid MTO24 (ebenfalls Genbank, wie oben), wobei die homologen ORFs dicht beieinander liegen. Die Verwendung der Polynukleotide und Polypeptide von Mtb (SEQ ID NRn. 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 und 39) in im Wesentlichen isolierter Form als Diagnostika, Impfstoffe und Ziele für die Chemotherapie, für die Behandlung und Verhütung von Mtb-Infektionen bei Menschen und Tieren, und die Prozesse, die an der Präparation und Anwendung dieser Diagnostika, Impfstoffe und neuen Chemotherapeutika beteiligt sind, umfassen weitere Aspekte der Erfindung.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • A. Polynukleotide
  • Die Polynukleotide der Erfindung können, wie hierin definiert, DNA oder RNA umfassen. Es kann sich auch um Polynukleotide handeln, die in sich synthetische oder modifizierte Nukleotide oder Peptid-Nukleinsäuren enthalten. Eine Anzahl verschiedener Arten von Modifikation an Oligonukleotiden ist im Fachgebiet bekannt. Zu diesen zählen Methylphosphonat und Phosphorthioat-Rückgrate, die Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten an das 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollte klar sein, dass die hierin beschriebenen Polynukleotide mittels jeglicher im Fachgebiet verfügbarer Methode modifiziert sein können. Solche Modifikationen können vorgenommen werden, um das Polynukleotid an eine feste Phase zu koppeln, oder um die Erkennung, die in vivo-Aktivität oder die Lebensspanne der Polynukleotide der Erfindung zu erhöhen.
  • Eine Reihe unterschiedlicher Arten von Polynukleotiden der Erfindung wird ins Auge gefasst. Im breitesten Sinne bilden Polynukleotide und Fragmente davon, die zum Hybridisieren an SEQ ID NR. 3 oder 4 fähig sind, einen ersten Aspekt der Erfindung. Dies beinhaltet das Polynukleotid der SEQ ID NR. 3 oder 4. Innerhalb der Klasse von Polynukleotiden sind verschiedene Subklassen der Polynukleotide von besonderem Interesse.
  • Eine Subklasse der Polynukleotide, die von Interesse ist, ist die Klasse der Polynukleotide, die die offenen Leseraster A, B, C, D, E, F, G und H codieren, einschließlich der SEQ ID NRn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 und 27. Wie nachstehend erörtert, enthalten die Polynukleotide, die ORF H codieren, die Polynukleotidsequenzen 7953 bis 7006 und 7009 bis 6215 innerhalb der SEQ ID NR. 27, als auch modifizierte Sequenzen, in denen der Frameshift modifiziert worden ist, so dass die beiden Sub- Leseraster in einem einzigen Leserahmen platziert sind. Dies mag dort erwünscht sein, wo das Polypeptid in rekombinanten Expressionssystemen produziert werden soll.
  • Die Erfindung stellt somit ein Polynukleotid in im Wesentlichen isolierter Form bereit, welches ein beliebiges dieser ORFs oder Kombinationen davon codiert. Zu Kombinationen davon zählen Kombinationen von 2, 3, 4, 5 oder allen der ORFs. Es können Polynukleotide bereitgestellt werden, die ein einzelnes ORF, getragen in einem rekombinanten Vektor, einschließlich der hierin beschriebenen Vektoren, umfassen. Daher stellt in einem bevorzugten Aspekt die Erfindung ein Polynukleotid in im Wesentlichen isolierter Form bereit, das zum selektiven Hybridisieren an die Nukleinsäure fähig ist, die ORFs A bis F der Kernregion der Mptb- und Mavs-Pathogenitätsinseln der Erfindung umfasst. Fragmente davon entsprechend den ORFs A bis E, B is F, A bis D, B bis E, A bis C, B bis D oder jegliche zwei angrenzende ORFs sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.
  • Die Polynukleotide der Erfindung sind zum selektiven Hybridisieren an den entsprechenden Abschnitt der GS-Region oder an die entsprechenden ORFs des Mtb, wie hierin beschrieben, in der Lage. Der Begriff "selektives Hybridisieren" gibt an, dass die Polynukleotide unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz (z.B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei von etwa 50°C bis etwa 60°C) an den entsprechenden Abschnitt der SEQ ID NR. 3 oder 4 oder die komplementären Strängen davon hybridisieren werden, doch nicht an genomische DNA von Mycobakterien, die gewöhnlich nicht-pathogen sind, einschließlich nicht-pathogener Spezies von M. avium. Solche Polynukleotide werden im Allgemeinen zu mindestens 68 %, z.B. mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 oder 90 %, und bevorzugter mindestens 95 % homolog zur entsprechenden DNA der GS sein. Der entsprechende Abschnitt wird sich über eine Region von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, zum Beispiel mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide erstrecken.
  • Mit "entsprechender Abschnitt" ist eine Sequenz aus der GS-Region der gleichen oder im Wesentlichen ähnlichen Größe gemeint, die zum Beispiel durch Computeralignment als den höchsten Grad an Homologie zum Polynukleotid aufweisend bestimmt wurde.
  • Jegliche Kombination der oben genannten Grade von Homologie und Minimalgrößen kann zur Definierung der Polynukleotide der Erfindung angewendet werden, wobei die stringenteren Kombinationen (d.h. höhere Homologie über längere Längen) bevorzugt sind. So bildet zum Beispiel ein Polynukleotid, das zu mindestens 80 % homolog über 25, vorzugsweise 30 Nukleotide ist, einen Aspekt der Erfindung, ebenso wie ein Polynukleotid, das zu mindestens 90 % homolog über 40 Nukleotide ist.
  • Eine weitere Klasse der Polynukleotide der Erfindung ist die Klasse von Polynukleotiden, die die Polypeptide der Erfindung codieren, wobei die Polypeptide der Erfindung in nachstehendem Abschnitt B definiert sind. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes als solchem können die Polynukleotide von einem geringeren Grad an Homologie sein als für die selektive Hybridisation an die GS-Region erforderlich. Codieren solche Polynukleotide jedoch die Polypeptide der Erfindung, so bilden diese Polynukleotide einen weiteren Aspekt. Wo Polypeptide der Erfindung rekombinant erzeugt werden, mag es beispielsweise erwünscht sein, den GC-Gehalt dieser Polynukleotide zu erhöhen. Diese Erhöhung des GC-Gehalts kann zu höheren Expressionsgraden über die Verwendung von für die Wirtszelle, in der die rekombinante Expression stattfindet, geeigneten Codons führen.
  • Eine weitere Klasse von Polynukleotiden der Erfindung ist die, die aus Cosmiden MTCY277 und MT024 (die Mtb-Genomsequenzen enthalten) gewinnbar ist, welche Polynukleotide im Wesentlichen aus dem Fragment des Cosmids bestehen, das ein offenes Leseraster enthält, welches jegliches der homologen ORFs B, C, E bzw. F codiert. Solche Polynukleotide werden nachstehend als Mtb-Polynukleotide bezeichnet. Wo jedoch ganz allgemein auf Polynukleotide Bezug genommen wird, umfasst diese Bezugnahme die Mtb-Polynukleotide, sofern der Kontext nicht ausdrücklich das Gegenteil angibt. Außerdem stellt die Erfindung Polynukleotide bereit, die dasselbe Polypeptid wie die oben genannten ORFs von Mtb codieren, die jedoch aufgrund der Redundanz des genetischen Codes unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen. Diese bilden weitere Mtb-Polynukleotide der Erfindung. Fragmente der Mtb-Polynukleotide, die zur Verwendung als Sonden oder Primer geeignet sind, bilden ebenfalls einen weiteren Aspekt der Erfindung.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Polynukleotide in im Wesentlichen isolierter Form bereit, die zum selektiven Hybridisieren (wobei selektives Hybridisieren wie oben definiert zu verstehen ist) an die Mtb-Polynukleotide der Erfindung fähig sind.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Mtb-Polynukleotide der Erfindung bereit, die entweder am 5'- und/oder 3'-Ende an Polynukleotidsequenzen geknüpft sind, an die sie natürlicherweise nicht angrenzen. Bei diesen Sequenzen handelt es sich typischerweise um Sequenzen, die in Klonier- oder Expressionsvektoren gefunden werden, wie etwa Promotoren, 5'-untranslatierte Sequenzen, 3'-untranslatierte Sequenzen oder Terminationssequenzen. Die Sequenzen können auch weitere Codierungssequenzen enthalten, wie etwa Signalsequenzen, die in der rekombinanten Produktion von Proteinen verwendet werden.
  • Weitere Polynukleotide der Erfindung sind in den begleitenden Beispielen veranschaulicht.
  • Die Polynukleotide der Erfindung können zur Erzeugung eines Primers, z.B. eines PCR-Primers, eines Primers für eine alternative Amplifikationsreaktion, einer Sonde, die z.B. mit einer offenbarenden Markierung mittels herkömmlicher Methoden unter Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen markiert ist, oder einer Sonde, die kovalent an eine feste Phase geknüpft ist, verwendet werden, oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Diese Primer, Sonden und weitere Fragmente können mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, zum Beispiel mindestens 25, 30 oder 40 oder mehr Nukleotide in der Länge betragen und sind auch vom Begriff Polynukleotide der Erfindung, wie hierin verwendet, umfasst.
  • Zu Primern der Erfindung, die bevorzugt sind, zählen auf jeglichen Teil der hierin definierten ORFs gerichtete Primer. Die ORFs von anderen Isolaten der pathogenen Mycobakterien, die eine GS-Region enthalten, können bestimmt werden, und konservierte Regionen innerhalb jedes einzelnen ORF können identifiziert werden. Auf solche konservierte Regionen gerichtete Primer bilden einen weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung. Außerdem können die Primer und weitere Polynukleotide der Erfindung zum Identifizieren, Gewinnen und Isolieren von ORFs verwendet werden, die zur selektiven Hybridisierung an die Polynukleotide der Erfindung fähig sind, die in pathogenen Mycobakterien vorhanden sind, die aber nicht Teil einer Pathogenitätsinsel in jener speziellen Bakterien-Spezies sind. So können über die ORFs B, C, E und F hinaus, die in Mtb identifiziert worden sind, ähnliche ORFs in anderen Pathogenen identifiziert werden, wobei auch ORFs entsprechend den GS ORFs C, D, E, F und H identifizierbar sind.
  • Polynukleotide, wie etwa DNA-Polynukleotide und Sonden gemäß der Erfindung, können rekombinant, synthetisch oder mittels einer beliebigen, den Fachleuten des Gebiets zugänglichen Methode erzeugt werden. Sie können auch mittels standardmäßiger Techniken kloniert werden.
  • Im Allgemeinen werden Primer mittels synthetischer Methoden erzeugt, die die schrittweise Erzeugung der gewünschten Nukleinsäuresequenz, immer ein Nukleotid auf einmal, einbeziehen. Die Methoden hierfür unter Anwendung automatisierter Techniken stehen im Fachgebiet ohne weiteres zur Verfügung. Längere Polynukleotide werden generell unter Verwendung rekombinanter Methoden erzeugt, zum Beispiel unter Anwendung einer PCR-(Polymerase-Kettenreaktions)-Kloniertechnik. Dies bezieht die Erzeugung eines Paars von Primern (z.B. von etwa 15–30 Nukleotiden) zu einer Region der GS, die kloniert werden soll, ein, wobei die Primer in Kontakt mit genomischer DNA von Mycobakterium oder einem Vektor gebracht werden, der/das die GS-Sequenz trägt, die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die eine Amplifikation der gewünschten Region hervorrufen, die Isolierung des amplifizierten Fragments (z.B. durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und die Rückgewinnung der amplifizierten DNA ein. Die Primer können so entworfen werden, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonienrektor kloniert werden kann.
  • Diese Techniken können zum Erhalt aller oder eines Teils der hierin beschriebenen GS- oder ORF-Sequenzen als auch weiterer genomischer Klone, die volle offene Leseraster enthalten, angewendet werden. Obschon diese Techniken im Allgemeinen im Fachgebiet wohlbekannt sind, kann insbesondere verwiesen werden auf Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis T (1989). Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
  • Polynukleotide, die nicht zu 100 % homolog zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind, doch in den Rahmen der Erfindung fallen, können in zahlreichen Weisen erhalten werden.
  • Von weiteren Isolaten oder Stämmen von pathogenen Mycobakterien wird erwartet, dass sie allele Varianten der hierin beschriebenen GS-Sequenzen enthalten, wobei diese zum Beispiel durch Sondieren von genomischen DNA-Bibliotheken erhalten werden, die aus solchen Isolaten oder Stämmen von Bakterien unter Verwendung von GS- oder ORF-Sequenzen als Sonden unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz (zum Beispiel 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C) erhalten werden.
  • Eine besonders bevorzugte Gruppe von pathogenen Mycobakterien sind Isolate von M. paratuberculosis. Auf GS-Regionen dieser Bakterien basierende Polynukleotide sind besonders bevorzugt. Zu bevorzugten Fragmenten dieser Regionen zählen Fragmente, die einzelne offene Leseraster codieren, einschließlich der bevorzugten Gruppen und Kombinationen von offenen Leserastern, die oben erörtert sind.
  • Alternativ können diese Polynukleotide durch positionsgerichtete Mutagenese der GS- oder ORF-Sequenzen oder allelen Varianten davon erhalten werden. Dies kann dort nützlich sein, wo zum Beispiel stumme Codon-Austäusche zu Sequenzen erforderlich sind, um Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in denen die Polynukleotidsequenzen zu exprimieren sind. Weitere Sequenz-Austäusche können erwünscht sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen oder die Eigenschaft oder Funktion des Polypeptids zu verändern, das durch die Polynukleotide der Erfindung codiert ist. Zu dieser veränderten Eigenschaft oder Funktion zählt die Addition von Aminosäuresequenzen von Consensus-Signalpeptiden, die im Fachgebiet zur Bewirkung von Transport und Sekretion des modifizierten Polypeptids der Erfindung bekannt sind. Zu einer weiteren veränderten Eigenschaft wird die Mutagenese eines katalytischen Rests oder die Generierung von Fusionsproteinen mit einem anderen Polypeptid zählen. Solche Fusionsproteine können mit einem Enzym, einem Antikörper oder einem Zytokin oder einem anderen Liganden für einen Rezeptor erhalten werden, um ein Polypeptid der Erfindung auf einen spezifischen Zelltyp in vitro oder in vivo anzuzielen.
  • Die Erfindung stellt außerdem doppelsträngige Polynukleotide bereit, die ein Polynukleotid der Erfindung und sein Komplement umfassen.
  • Die Polynukleotide oder Primer der Erfindung können eine offenbarende Markierung tragen. Zu geeigneten Markierungen zählen Radioisotope wie 32P oder 35S, Enzymmarkierungen, andere Proteinmarkierungen oder kleinere Markierungen wie Biotin oder Fluorophore. Diese Markierungen können an die Polynukleotide oder Primer der Erfindung angefügt und unter Anwendung als solcher bekannter Techniken nachgewiesen werden.
  • Die markierten oder unmarkierten Polynukleotide oder Primer der Erfindung oder Fragmente davon können durch einen Fachmann des Gebiets in auf Nukleinsäure basierenden Tests auf das Vorhandsein oder die Abwesenheit von Mptb, Mavs, anderen GS-enthaltenden pathogenen Mycobakterien oder Mtb, angewendet an Proben von Körperflüssigkeiten, Geweben oder Exkreten von Tieren und Menschen, als auch an Nahrungsmittel- und Umweltproben wie Fluss- oder Grundwasser und die Haushalts-Wasserversorgung, angewendet werden.
  • Zu den menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten zählen Auswurf, Blut, Serum, Plasma, Speichel, Milch, Urin, CSF, Samen, Kot und infizierte Absonderungen; Gewebe einschließlich Darm, Mundgeschwüren, Haut, Lymphknoten, Milz, Lunge und Leber, die chirurgisch oder durch eine Biopsietechnik erhalten wurden. Zu den Tieren zählen insbesondere Handelstiere wie Rinder, Schafe, Ziegen, Wild, Kaninchen, doch können auch Wildtiere und Zootiere getestet werden.
  • Diese Tests umfassen das Zusammenbringen einer menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit oder eines Gewebeextrakts, oder eines Extrakts von einer Umwelt- oder Nahrungsmittelprobe, mit einer Sonde, die ein Polynukleotid oder einen Primer der Erfindung umfasst, unter Hybridisierungsbedingungen und das Nachweisen des zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der Probe gebildeten Duplex. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von Techniken wie der PCR erzielt werden oder durch Immobilisieren der Sonde an einem festen Träger, Entfernen der Nukleinsäure in der Probe, die nicht an die Sonde hybridisiert ist, und dann Nachweisen der Nukleinsäure, die an die Sonde hybridisiert hat. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure an einem festen Träger immobilisiert werden und die Menge der an diesen Träger gebundenen Sonde nachgewiesen werden. Geeignete Assay-Methoden dieser weiteren Formate sind zu finden zum Beispiel in WO89/03891 und WO90/13667.
  • Die markierten oder unmarkierten Polynukleotide der Erfindung oder Fragmente davon können auch zum Identifizieren und Charakterisieren verschiedener Stämme von Mptb, Mavs, weiteren GS-enthaltenden pathogenen Mycobakterien oder Mtb, als auch Eigenschaften wie der Wirkstoffresistenz oder -empfänglichkeit verwendet werden.
  • Die Sonden der Erfindung können in bequemer Weise in Form eines Testkits in einem geeigneten Behälter abgepackt werden. In solchen Kits kann die Sonde an einen festen Träger gebunden sein, wo das Assay-Format, für das der Kit entworfen wurde, diese Bindung erfordert. Der Kit kann auch geeignete Reagenzien zur Behandlung der zu sondierenden Probe, zur Hybridisierung der Sonde an die Nukleinsäure in der Probe, Kontrollreagenzien, Gebrauchsanleitungen und ähnliches enthalten.
  • Die Verwendung der Polynukleotide der Erfindung in der Diagnose von entzündlichen Erkankungen wie der Crohn-Krankheit oder Sarkoidose bei Menschen oder Johne-Krankheit bei Tieren stellt einen bevorzugten Aspekt der Erfindung dar. Die Polynukleotide können auch in der Prognose dieser Erkrankungen verwendet werden. Zum Beispiel kann die Reaktion eines menschlichen oder tierischen Wesens als Reaktion auf ' Antibiotika, Impfung oder andere Therapien unter Anwendung der diagnostischen Methoden der Erfindung über den Verlauf eines Behandlungszeitraums oder im Anschluss an solch eine Behandlung überwacht werden.
  • Die Verwendung von Mtb-Polynukleotiden (insbesondere in Form von Sonden und Primern) der Erfindung bei den oben beschriebenen Methoden bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung, insbesondere zur Detektion, Diagnose oder Prognose von Mtb-Infektionen.
  • B. Polypeptide
  • Zu den Polypeptiden der Erfindung zählen Polypeptide in im Wesentlichen isolierter Form, die durch die GS codiert sind. Dies umfasst die Polypeptide der vollen Länge, die durch den positiven und komplementären negativen Strang der GS codiert sind. Jedes der Polypeptide der vollen Länge wird eine der Aminosäuresequenzen enthalten, wie dargestellt in SEQ ID NRn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 und 29. Die Polypeptide der Erfindung enthalten ferner Varianten dieser Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender alleler Varianten und synthetischer Varianten, die beträchtlich homolog zu den Polypeptiden sind. In diesem Zusammenhang wird beträchtliche Homologie bei einer Sequenz erkannt, die mindestens 70 %, z.B. 80 %, 90 %, 95 % oder 98 % Aminosäure-Homologie (Identität) über 30 oder mehr, z.B. 40, 50 oder 100 Aminosäuren hinweg aufweist. Zum Beispiel ist eine Gruppe der im Wesentlichen homologen Polypeptide die, die zu mindestens 95 % Aminosäure-Identität zu einem Polypeptid nach einem der SEQ ID NRn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 und 29 über ihre gesamte Länge aufweist: Noch bevorzugter beträgt diese Homologie 98 %.
  • Die Polypeptide der Erfindung enthalten ferner die Polypeptidsequenzen der homologen ORFs von Mtb, nämlich die SEQ ID NRn. 31, 35, 37 und 39. Sofern nicht ausdrücklich gegenteilig angegeben, umfasst die Bezugnahme auf Polypeptide der Erfindung und deren Fragmente diese Mtb-Polypeptide und Fragmente und wie hierin definierte Varianten davon (im Wesentlichen zu diesen Sequenzen homolog).
  • Die Polypeptide der Erfindung können mittels der oben erwähnten standardmäßigen Techniken erhalten werden. Die Polypeptide der Erfindung enthalten auch Fragmente der oben genannten Polypeptide der vollen Länge und Varianten davon, einschließlich Fragmente der Sequenzen, wie in SEQ ID NRn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 und 39 dargestellt. Diese Fragmente von zum Beispiel 8, 10, 12, 15 oder bis zu 30 oder 40 Aminosäuren können auch synthetisch unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten standardmäßigen Techniken erhalten werden.
  • Zu bevorzugten Fragmenten zählen solche, die ein Epitop enthalten, insbesondere ein Epitop, welches für die Pathogenität der mycobakteriellen Zelle, von der das Polypeptid abgeleitet ist, spezifisch ist. Geeignete Fragmente werden von einer Größe von mindestens etwa 5, z.B. 8, 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren oder größer sein. Die Epitope können mittels Techniken wie der Peptid-Scanningtechnik, wie beschrieben bei Geysen et al., Mol. Immunol., 23; 709-715 (1986), als auch weiteren im Fachgebiet bekannten Techniken, bestimmt werden.
  • Die Bezeichnung "ein Epitop, das für die Pathogenität der mycobakteriellen Zelle spezifisch ist" bedeutet, dass das Epitop durch einen Abschnitt der GS-Region oder durch die entsprechenden ORF-Sequenzen von Mtb codiert ist, die zur Unterscheidung von pathogenen Mycobakterien von verwandten nicht-pathogenen Mycobakterien einschließlich nicht-pathogener Spezies von M. avium verwendet werden können. Dies kann anhand routinemäßiger Methoden bestimmt werden. Ein Kandidat-Epitop von einem ORF kann präpariert und zur Immunisierung eines Tieres wie einer Ratte oder einem Kaninchen für die Generierung von Antikörpern verwendet werden. Die Antikörper können dann zum Nachweis des Vorhandenseins des Epitops in pathogenen Mycobakterien und zur Bestimmung dessen verwendet werden, dass nicht-pathogene Mycobakterien keinerlei Proteine enthalten, die mit dem Epitop reagieren. Die Epitope können linear oder konformationell sein.
  • Die Polypeptide der Erfindung können in im Wesentlichen isolierter Form vorliegen. Es wird selbstverständlich sein, dass die Polypeptide mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden können, die den angestrebten Zweck des Polypeptids nicht beeinträchtigen und wobei sie nach wie vor als im Wesentlichen isoliert betrachtet werden können. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch in einer im Wesentlichen reinen Form vorliegen, in welchem Fall es generell das Polypeptid in einer Präparation umfasst, in der mehr als 90 %, z.B. 95 %, 98 % oder 99 % des Polypeptids in der Präparation ein Polypeptid der Erfindung ist.
  • Die Polypeptide der Erfindung können modifiziert sein, um ihnen eine gewünschte Eigenschaft oder Funktion zu verleihen, zum Beispiel durch Addition von Histidin-Resten, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder durch Addition einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu fördern.
  • Daher umfassen die Polypeptide der Erfindung Fusionsproteine, zu welchen ein Polypeptid zählt, das das gesamte oder einen Teil von ein oder mehreren ORFs der Erfindung codiert, und das fusioniert an den N- oder C-Terminus einer zweiten Sequenz zur Bereitstellung der gewünschten Eigenschaft oder Funktion ist. Sequenzen, die die Sekretion aus einer Zelle fördern, umfassen zum Beispiel die Hefe-α-Faktor-Signalsequenz.
  • Ein Polypeptid der Erfindung kann mit einer offenbarenden Markierung markiert sein. Die offenbarende Markierung kann jegliche geeignete Markierung sein, die den Nachweis des Polypeptids erlaubt. Zu geeigneten Markierungen zählen Radioisotope, z.B. 125I, 35S-Enzyme, Antikörper, Polynukleotide und Liganden, wie z.B. Biotin. Markierte Polypeptide der Erfindung können in diagnostischen Verfahren verwendet werden, wie z.B. Immunoassays, um die Menge eines Polypeptids der Erfindung in einer Probe zu bestimmen. Polypeptide oder markierte Polypeptide der Erfindung können auch in serologischen oder zellvermittelten Immunoassays für den Nachweis der Immunreaktivität der Polypeptide in Tieren und Menschen unter Anwendung standardmäßiger Protokolle verwendet werden.
  • Ein Polypeptid oder markiertes Polypeptid der Erfindung oder ein Fragment davon kann auch an eine feste Phase, zum Beispiel die Oberfläche eines Immunoassays-Wells, Mikropartikels, Tauchstäbchens oder Biosensors, fixiert werden. Solche markierte und/oder immobilisierte Polypeptide können in Kits in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Gebrauchsanleitungen und ähnlichem abgepackt werden.
  • Diese Polypeptide und Kits können bei Methoden zum Nachweisen von Antikörpern oder der zellvermittelten Immunreaktivität, zu den mycobakteriellen Proteinen und Peptiden, die durch die ORFs der Erfindung codiert sind, und deren alleler Varianten und Fragmente unter Anwendung eines Immunoassays verwendet werden. Die Wirts-Antikörper oder die zellvermittelte Immunreaktivität wird in Menschen oder Tieren mit einem Immunsystem auftreten, welches die Polypeptide der Erfindung detektiert und ihnen gegenüber reaktiv ist. Die Antikörper können in einer biologischen Probe von Menschen oder Tieren vorhanden sein, wobei die biologische Probe eine wie oben de finierte Probe sein kann, insbesondere Blut, Milch oder Speichel.
  • Immunoassay-Methoden sind im Fachgebiet wohlbekannt und umfassen im Allgemeinen:
    • (a) Bereitstellen eines Polypeptids der Erfindung, das ein Epitop umfasst, welches durch einen Antikörper gegen das mycobakterielle Polypeptid bindbar ist;
    • (b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, welche die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben; und
    • (c) Bestimmen, ob ein Antikörper-Antigen-Komplex, der das Polypeptid umfasst, gebildet wurde.
  • Die Immunoassay-Methoden für die zellvermittelte Immunreaktivität in Tieren und Menschen sind ebenfalls im Fachgebiet wohlbekannt (z.B. wie beschrieben bei Weir et al. 1994, J. Immunol. Methods 176; 93-101) und umfassend im Allgemeinen:
    • (a) Bereitstellen eines Polypeptids der Erfindung, das ein Epitop umfasst, welches durch einen Lymphozyten oder Makrophagen oder anderen Zellrezeptor bindbar ist;
    • (b) Inkubieren einer Zellprobe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, die eine zelluläre Immunantwort ermöglichen, wie z.B. die Freisetzung von Zytokinen oder anderen Mediatoren; und
    • (c) Nachweisen des Vorhandenseins des Zytokins oder Mediators im Inkubat.
  • Die Polypeptide der Erfindung können mittels standardmäßiger synthetischer Methoden, wie im Fachgebiet wohlbekannt, oder rekombinant hergestellt werden, wie nachstehend beschrieben.
  • Die markierten oder unmarkierten Polypeptide der Erfindung oder Fragmente davon können auch zum Identifizieren und Charakterisieren verschiedener Stämme von Mptb, Mavs oder anderer GS-enthaltender pathogener Mycobakterien, oder Mtb und Eigenschaften wie der Wirkstoffresistenz oder -empfänglichkeit, verwendet werden.
  • Die Polypeptide der Erfindung können in bequemer Weise in Form eines Testkits in einem geeigneten Behälter abgepackt werden. In diesen Kits kann das Polypeptid an einen festen Träger gebunden sein, wenn das Assay-Format, für das der Kit entworfen wurde, diese Bindung erfordert. Der Kit kann außerdem geeignete Reagenzien zur Behandlung der zu untersuchenden Probe, Kontrollreagenzien, Gebrauchsanleitungen und ähnliches enthalten.
  • Die Verwendung der Polypeptide der Erfindung in der Diagnose entzündlicher Erkrankungen wie der Crohn-Krankheit oder Sarkoidose bei Menschen oder Johne-Krankheit bei Tieren bildet einen bevorzugten Aspekt der Erfindung. Die Polypeptide können auch in der Prognose dieser Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel kann die Reaktion auf ein menschliches oder tierisches Wesen als Reaktion auf Antibiotika oder andere Therapieformen durch Anwendung der diagnostischen Methoden der Erfindung über den Ablauf eines Behandlungszeitraums und im Anschluss an diese Behandlung überwacht werden.
  • Die Verwendung der Mtb-Polypeptide der Erfindung bei den oben beschriebenen Methoden bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung, insbesondere für die Detektion, Diagnose oder Prognose von Mtb-Infektionen.
  • Die Polypeptide der Erfindung können auch bei Assay-Methoden zum Identifizieren von chemischen Kandidat-Verbindungen verwendet werden, die zur Hemmung, Bindung oder Zerstörung der Funktion der Polypeptide, die für die Pathogenität erforderlich ist, nützlich sein werden. Generell beziehen diese Assays das Zusammenbringen des Polypeptids mit einer Kandidat-Inhibitorverbindung und das Beobachten der Fähigkeit der Verbindung, das Polypeptid zu zerstören, zu binden oder zu beeinträchtigen, ein.
  • Es gibt eine Reihe von Wegen, auf denen der Assay formatiert werden kann. Zum Beispiel können jene Polypeptide, die eine enzymatische Funktion aufweisen, unter Verwendung markierter Substrate für das Enzym untersucht werden und die Menge oder Rate der Umwandlung des Substrats in ein Produkt zum Beispiel mittels Chromatographie wie der HPLC oder mittels eines kolorimetrischen Assays gemessen werden. Zu geeigneten Markierungen zählen 35S, 125I, Biotin oder Enzyme wie Meerrettichperoxidase.
  • Zum Beispiel wird davon ausgegangen, dass das Genprodukt von ORF C eine GDP-Mannosedehydratase-Aktivität aufweist. So kann ein Assay auf Inhibitoren des Genprodukts zum Beispiel markierte GDP-Mannose, GDP oder Mannose nutzen und kann die Aktivität des Genprodukts verfolgt werden. ORF D codiert ein Gen, das mit der Synthese und Regulierung von kaspulären Polysacchariden in Verbindung steht, die oftmals mit Invasivität und Pathogenität assoziiert sind. Markierte Polysaccharid-Substrate können in Assays des ORF D-Genprodukts verwendet werden. Das Genprodukt von ORF F codiert ein Protein mit mutmaßlicher Glucosyltransferase-Aktivität, weshalb markierte Aminozucker wie β-1-3-N-Acetylglucosamin als Substrate in den Assays verwendet werden können.
  • Chemische Kandidat-Verbindungen, die verwendbar sind, können natürliche oder synthetische chemische Verbindungen sein, die in Wirkstoff-Screening-Programmen verwendet werden können. Pflanzenextrakte, die mehrere charakterisierte oder uncharakterisierte Komponenten enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
  • Alternativ kann das Polypeptid der Erfindung gegen ein Panel von Peptiden, Nukleinsäuren oder anderen chemischen Funktionalitäten gescreent werden, die durch kombinatorische Chemie generiert werden. Dies wird die Definition von chemischen Entitäten ermöglichen, die an Polypeptide der Erfindung binden. Typischerweise wird das Polypeptid der Erfindung in Kontakt mit einem Panel von Verbindungen aus einer kombinatorischen Bibliothek gebracht werden, wobei entweder das Panel oder das Polypeptid an einer festen Phase unter Bedingungen immobilisiert wird, die zur Bindung des Polypeptids an das Panel geeignet sind. Die feste Phase wird dann unter Bedingungen gewaschen, bei denen lediglich spezifische Wechselwirkungen zwischen dem Polypeptid und einzelnen Mitgliedern des Panels erhalten bleiben, wobei diese spezifischen Mitglieder für weitere Assays genützt oder zum Entwurf weiterer Panels von Kandidat-Verbindungen verwendet werden können.
  • Zum Beispiel ist eine Reihe von Assay-Methoden zur Definierung der Peptid-Wechselwirkungen mit Peptiden bekannt. Zum Beispiel ist in WO86/00991 ein Verfahren zur Bestimmung von Mimotopen beschrieben, welches das Erzeugen von Panels von Katamer-Präparaten, zum Beispiel Octamere von Aminosäuren, bei denen ein oder mehrere der Positionen definiert sind und die verbliebenen Positionen willkürlich mit anderen Aminosäuren besetzt werden, das Bestimmen, welches Katamer an ein Protein von Interesse bindet, und das nochmalige Screening des Proteins von Interesse gegen ein weiteres Panel auf der Grundlage des reaktivsten Katamers erfolgt, bei dem ein oder mehrere zusätzliche bezeichnete Positionen systematisch variiert werden, umfasst. Dies kann über eine Reihe von Zyklen hinweg wiederholt werden und zum Aufbau einer Sequenz einer Bindungskandidat-Verbindung von Interesse verwendet werden.
  • WO89/03430 beschreibt Screening-Methoden, welche die Präparation spezifischer Mimotope ermöglichen, die die immunologische Aktivität eines gewünschten Analyts nachahmen. Diese Mimotope werden durch Umsetzen eines Panels individueller Peptide, wobei die Peptide von systematisch variierender Hydrophobizität, amphipathischen Eigenschaften und Ladungsmustern sind, unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein Antigen von Interesse identifiziert. Daher können im vorliegenden Falle Antikörper gegen das Polypeptid der Erfindung verwendet und die Mimotop-Peptide aus solchen Panels identifiziert werden.
  • C. Vektoren
  • Die Polynukleotide der Erfindung können in einen rekombinanten replizierbaren Vektor eingebaut werden. Der Vektor kann zur Replikation der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. So stellt bei einer weiteren Ausführungsform die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotiden der Erfindung durch Einführen eines Polynukleotids der Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Replikation des Vektors hervorbringen, bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle rückgewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind nachstehend im Zusammenhang mit Expressionsvektoren beschrieben.
  • D. Expressionsvektoren
  • Vorzugsweise wird ein Polynukleotid der Erfindung in einem Vektor operativ mit einer Kontrollsequenz verknüpft, die für die Expression der Codierungssequenz durch die Wirtszelle sorgen kann, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Begriff "operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen eine Funktion in ihrer angestrebten Weise erlaubt. Eine Kontrollsequenz, die an eine Codierungssequenz "operativ geknüpft" ist, wird in solcher Weise ligiert, dass die Expression der Codierungssequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind. Diese Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle wie oben beschrieben transformiert werden, um die Expression eines Polypeptids der Erfindung zu ermöglichen. Folglich stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung bereit, welches das Züchten einer mit einem Expressionsvektor wie oben beschrieben transformierten oder transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression durch den Vektor einer Codierungssequenz bereitzustellen, die die Polypeptide codiert, ermöglichen, und das Rückgewinnen der exprimierten Polypeptide umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Vektoren für die Replikation und Expression von Polynukleotiden der Erfindung oder Fragmenten davon bereit. Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, wahlweise einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und wahlweise einem Regulator für den Promotor ausgestattet sind. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-Resistenzgen im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenzgen für einen Säugervektor. Die Vektoren können in vitro zum Beispiel für die Produktion von RNA oder zum Transfizieren oder Transformieren einer Wirtszelle verwendet werden. Der Vektor kann auch zur in vivo-Verwendung, zum Beispiel bei einer Impfmethode mit nackter DNA oder der Gentherapie, adaptiert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Wirtszellen bereit, die mit den Vektoren für die Replikation und Expression der Polynukleotide der Erfindung, einschließlich der DNA von GS, deren offenen Leserastern und weiteren entsprechenden ORFs, insbesondere ORFs B, C, E und F von Mtb, transformiert oder transfiziert wurden. Die Zellen werden nach ihrer Kompatibilität mit dem Vektor ausgewählt und können zum Beispiel eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle sein.
  • Expressionvektoren sind im Fachgebiet breit verfügbar und können kommerziell bezogen werden. Säuger-Expressionsvektoren können einen Säuger- oder Virus-Promotor umfassen. Säuger-Promotoren umfassen den Metallothioneinpromotor. Virale Promotoren umfassen Promotoren von Adenovirus, den großen SV40-T-Promotor und retrovirale LTR-Promotoren. Zu mit Insektenzellen kompatiblen Promotoren zählen der Polyhedrin-Promotor. Zu Hefe-Promotoren zählen der Alkoholdehydrogenase-Promotor. Zu Bakterien-Promotoren zählen der β-Galactosidase-Promotor.
  • Die Expressionsvektoren können außerdem Enhancer umfassen, und im Falle der eukaryontischen Vektoren Polyadenylierungs-Signalsequenzen stromabwärts der zu exprimierenden Codierungssequenz.
  • Die Polypeptide der Erfindung können in geeigneten Wirtszellen exprimiert werden, zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen, und unter Anwendung standardmäßiger Reinigungstechniken einschließlich zum Beispiel der Affinitätschromatographie, HPLC oder anderen chromatographischen Trenntechniken, rückgewonnen werden.
  • Die Polynukleotide gemäß der Erfindung können auch in die oben beschriebenen Vektoren in einer Antisense-Orientierung inseriert werden, um für die Produktion von Antisense-RNA zu sorgen. Antisense-RNA oder andere Antisense-Polynukleotide oder Liganden können auch mittels synthetischer Methoden erzeugt werden. Solche Antisense-Polynukleotide können in einer Methode zum Kontrollieren der Mengen der Proteine, die durch die ORFs der Erfindung codiert sind, in einer Mycobakterienzelle verwendet werden.
  • Die Polynukleotide der Erfindung können auch von für gentherapeutische Methoden geeigneten Vektoren getragen werden. Zu diesen gentherapeutischen Methoden zählen jene, die zur Bereitstellung von Impfstoffen gegen Krankheiten, die durch pathogene Mycobakterien verursacht werden, oder zur Auffrischung der Immunreaktion eines mit einem pathogenen Mycobakterium infizierten Menschen oder Tiers entworfen wurden.
  • Zum Beispiel beschreiben Ziegner et al., AIDS, 1995, 9; 43–50, die Verwendung eines replikationsdefekten rekombinanten amphotropen Retrovirus zur Auffrischung der Immunreaktion bei Patienten mit einer HIV-Infektion. Solch ein Retrovirus kann zum Tragen eines Polynukleotids modifiziert werden, das ein Polypeptid oder Fragment davon der Erfindung codiert, und das Retrovirus an die Zellen eines menschlichen oder tierischen Wesens verabreicht werden, um eine Immunreaktion gegen das Polypeptid zu erreichen. Das Retrovirus kann direkt an den Patienten verabreicht werden oder kann zur Infizierung von Zellen ex vivo, z.B. Fibroblastenzellen, verwendet werden, die dann in den Patienten, wahlweise nach ihrer Inaktivierung, eingeführt werden. Die Zellen sind erwünschterweise autologe oder HLA-angepasste Zellen von dem menschlichen oder tierischen Wesen.
  • Gentherapeutische Methoden, einschließlich Methoden zur Verstärkung einer Immunreaktion auf ein bestimmtes Pathogen, sind allgemein zum Beispiel in WO95/14091 beschrieben, welche Beschreibung hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Zu rekombinanten viralen Vektoren zählen retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, adeno-assoziiert-virale Vektoren, Vaccinia-Virus-Vektoren, Herpes-Virus-Vektoren und Alphavirus-Vektoren. Alphavirus-Vektoren sind beschrieben zum Beispiel in WO95/07994, welche Beschreibung hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist.
  • Wo eine direkte Verabreichung des rekombinanten viralen Vektors in Betracht gezogen wird, und zwar entweder in Form einer nackten Nukleinsäure oder in Form verpackter Partikel, die die Nukleinsäure tragen, kann dies mittels jeglicher geeigneter Methode vorgenommen werden, zum Beispiel der oralen Verabreichung oder der intravenösen Injektion. 105 bis 108 cfu des Virus stellen eine typische Dosis dar, die beispielsweise wöchentlich über einen Zeitraum von einigen Monaten wiederholt werden kann. Die Verabreichung autologer oder HLA-angepasster Zellen, die mit dem Virus infiziert sind, kann in einigen Fällen bequemer sein. Dies wird im Allgemeinen durch Verabreichung von Dosen von zum Beispiel 105 bis 108 Zellen pro Dosis erreicht werden, die wie oben beschrieben wiederholt werden können.
  • Der rekombinante virale Vektor kann außerdem eine Nukleinsäure umfassen, die zur Exprimierung eines accessorischen Moleküls des Immunsystems fähig ist, das zur Steigerung der Immunantwort entworfen ist. Ein derartiges Molekül kann zum Beispiel ein Interferon sein, insbesondere Interferon-Gamma, ein Interleukin, zum Beispiel IL-1α, IL-1β oder IL-2, oder ein HLA-Klasse I oder II-Molekül. Dies mag dort besonders erwünscht sein, wo der Vektor für die Verwendung in der Behandlung von Menschen oder Tieren vorgesehen ist, die bereits mit einem Mycobakterium infiziert sind, und wo eine Verstärkung der Immunantwort gewünscht wird.
  • E. Antikörper
  • Die Erfindung stellt auch monoklonale oder polyklonale Antikörper zu Polypeptiden der Erfindung oder Fragmente davon bereit. Die Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern zu Polypeptiden der Erfindung bereit. Monoklonale Antikörper können mittels einer herkömmlichen Hybridoma-Technologie unter Verwendung der Polypeptide der Erfindung oder von Peptid-Fragmenten davon als Immunogenen hergestellt werden. Polyklonale Antikörper können auch mittels herkömmlicher Methoden präpariert werden, welche das Beimpfen eines Wirtstiers, zum Beispiel einer Ratte oder eines Kaninchens, mit einem Polypeptid der Erfindung oder Peptid-Fragment davon und das Rückgewinnen von Immunserum umfassen.
  • Um solche Antikörper zu erzeugen, stellt die Erfindung außerdem Polypeptide der Erfindung oder Fragmente davon bereit, die an ein anderes Polypeptid haptenisiert sind, zur Verwendung als Immunogene bei Tieren oder Menschen.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung umfasst der Begriff "Antikörper", sofern nicht gegenteilig spezifiziert, Fragmente von ganzen Antikörpern, die ihre Bindungsaktivität für ein Polypeptid der Erfindung beibehalten. Zu solchen Fragmenten zähen Fv-, F(ab')- und F(ab')2-Fragmente, als auch Einzelketten-Antikörper. Weiterhin können die Antikörper und deren Fragmente humanisierte Antikörper sein, wie z.B. beschrieben in EP-A-239400.
  • Die Antikörper können bei Verfahren zum Nachweisen von Polypeptiden der Erfindung verwendet werden, die in biologischen Proben vorhanden sind (wobei zu solchen Proben menschliche oder tierische Körperproben als auch Umweltproben zählen, wie oben erwähnt), wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Bereitstellen eines Antikörpers der Erfindung;
    • (b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, welche die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben; und
    • (c) Bestimmen, ob der Antikörper-Antigen-Komplex, der den Antikörper umfasst, gebildet wurde.
  • Die Antikörper der Erfindung können an einen festen Träger, zum Beispiel ein Immunoassay-Well, Mikropartikel, Tauchstäbchen oder Biosensor, gebunden werden und/oder in Kits in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Gebrauchsanleitungen und ähnlichem abgepackt werden.
  • Die Antikörper der Erfindung können in der Detektion, Diagnose und Prognose von Erkrankungen verwendet werden; wie oben in Bezug auf die Polypeptide der Erfindung beschrieben.
  • F. Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die ein Polynukleotid oder Polypeptid der Erfindung umfassen, kombiniert mit einem Träger oder Verdünnungsmittel. Zu den Zusammensetzungen der Erfindung zählen Zusammensetzungen, die eine Nukleinsäure, insbesondere einen Expressionsvektor, der Erfindung umfassen. Die Zusammensetzungen beinhalten ferner jene, die einen rekombinanten Virus der Erfindung tragen. Zu solchen Zusammensetzungen zählen pharmazeutische Zusammensetzungen, in welchem Fall der Träger oder das Verdünnungsmittel pharmazeutisch annehmbar sein wird.
  • Zu pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln zählen solche, die in für die Inhalation als auch die orale, parenterale (z.B. intramuskuläre oder intravenöse oder transkutane) Verabreichung geeigneten Formulierungen verwendet werden. Die Formulierungen können bequemerweise in Einheiten-Dosierungsform vorliegen und können mittels einer der im pharmazeutischen Fachgebiet wohlbekannten Methoden präpariert werden. Zu diesen Methoden zählen der Schritt des Inverbindungbringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der ein oder mehrere accessorische Inhaltsstoffe darstellt. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Inverbindungbringen des Wirkstoffs mit Flüssigträgern oder fein zerteilten festen Trägern oder beidem und dann, sofern erforderlich, Formen des Produkts präpariert.
  • Zu für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen zählen zum Beispiel wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und Solute enthalten können, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers machen, und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel enthalten können, und Liposome oder andere mikropartikuläre Systeme, die zur Anzielung des Polynukleotids oder des Polypeptids der Erfindung auf Blutkomponenten oder ein oder mehrere Organe oder zur Anzielung von Zellen, wie etwa M-Zellen des Darms, nach der oralen Verabreichung entworfen sind.
  • G. Impfstoffe
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung neuartige Impfstoffe für die Prävention und Therapie von Infektionen bereit, die durch Mptb, Mavs, andere GS-enthaltende pathogene Mycobakterien und Mtb in Tieren und Menschen verursacht werden. Der Begriff "Impfstoff', wie hierin verwendet, meint ein Mittel, das zur Stimulierung des Immunsystems eines Wirblers, insbesondere eines warmblütigen Wirblers einschließlich Menschen, verwendet wird, um einen Schutz gegen eine zukünftige Schädigung durch einen Organismus bereitzustellen, auf den der Impfstoff gerichtet ist, oder um die Ausrottung eines Organismus in der Behandlung einer etablierten Infektion zu unterstützen. Das Immunsystem wird durch die Produktion von zellulären Immunitäts-Antikörpern, erwünschterweise neutralisierenden Antikörpern, stimuliert, die auf Epitope gerichtet sind, die auf oder in einem pathogenen Mycobakterium zu finden sind, welches eines der ORFs der Erfindung exprimiert. Der so produzierte Antikörper kann ein beliebiger der immunologischen Klassen sein, wie etwa die Immunglobuline A, D, E, G oder M. Impfstoffe, die die Produktion von IGA stimulieren, sind von Interesse, da dies das wichtigste Immunglobulin ist, das durch das Sekretionssystem von warmblütigen Tieren erzeugt wird, wobei die Produktion dieser Antikörper in der Verhütung einer Infektion oder Kolonisation des Darmtrakts hilfreich sein wird. Allerdings wird auch eine IgM- und IgG-Antwort bei systemischen Infektionen wie der Crohn-Krankheit oder der Tuberkulose erwünscht sein.
  • Zu den Impfstoffen der Erfindung zählen Polynukleotide der Erfindung oder Fragmente davon in geeigneten Vektoren, die durch Injektion von nackter DNA unter Anwendung standardmäßiger Protokolle verabreicht werden. Die Polynukleotide der Erfindung oder Fragmente davon in geeigneten Vektoren für die Expression der Polypeptide der Erfindung können durch Injektion, Inhalation oder oral gegeben werden. Zu geeigneten Vektoren zählen M. bovis BCG, M. smegmatis oder andere Mycobakterien, Corynebakterien, Salmonella oder andere Agenzien entsprechend den etablierten Protokollen.
  • Die Polypeptide der Erfindung oder Fragmente davon in im Wesentlichen isolierter Form können als Impfstoffe durch Injektion, Inhalation, orale Verabreichung oder durch transkutane Anwendung gemäß standardmäßigen Protokollen verwendet werden. Adjuvanzien (wie etwa Iscoms oder Polylactidcoglykolid-Verkapselung), Zytokine wie IL-12 und andere Immunmodulatoren können für die selektive Verstärkung der zellvermittelten oder humoralen immunologischen Reaktionen verwendet werden. Die Vakzinierung mit Polynukleotiden und/oder Polypeptiden der Erfindung kann zur Erhöhung der Empfänglichkeit der pathogenen Mycobakterien für antimikrobielle Agenzien in vivo vorgenommen werden.
  • In Fällen, bei denen das Polypeptid korrekt konfiguriert ist, um das korrekte Epitop bereitzustellen, doch zu klein ist, um immunogen zu sein, kann das Polypeptid an einen geeigneten Träger geknüpft werden.
  • Eine Reihe von Techniken zur Erzielung dieser Verknüpfung ist im Fachgebiet bekannt, einschließlich der Bildung von Disulfid-Verknüpfungen unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxlyat (SMCC), erhalten von Pierce Company, Rockford, Illinois (sofern dem Peptid eine Sulfhydrylgruppe fehlt, kann diese durch Addition eines Cystein-Rests verfügbar gemacht werden). Diese Reagenzien schaffen eine Disulfid-Verknüpfung zwischen sich und peptidischen Cystein-Resten an einem Protein, und eine Amidverknüpfung durch das Epsilon-Amino an einem Lysin, oder einer anderen freien Aminogruppe, im anderen Protein. Eie Vielfalt solcher Disulfid/Amid-bildenden Agenzien ist bekannt. Siehe zum Beispiel Immun Rev. (1982) 62:185. Andere bifunktionelle Kopplungsmittel bilden eine Thioether- anstelle einer Disulfid-Verknüpfung. Viele dieser Thioether-bildenden Agenzien sind kommerziell verfügbar und umfassen reaktive Ester von 6-Maleimidocapronsäure, 2-Bromessigsäure, 2-Iodessigsäure, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure und ähnliches. Die Carboxylgruppe kann durch Kombinieren mit Succinimid oder 1-Hydroxyl-2-nitro-4-sulfonsäure, Natriumsalz, aktiviert werden. Weitere Methoden zur Kopplung von Antigenen verwenden das Rotavirus/"Bindungspeptid"-System, das in EPA Veröff. Nr. 259.149 beschrieben ist, deren Beschreibung hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Die vorangegangene Liste erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit, und Modifikationen der benannten Verbindungen können ganz klar verwendet werden. Es kann jeglicher Träger verwendet werden, der nicht selbst die Produktion von für den Wirt schädlichen Antikörpern hervorruft. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie etwa Proteine; Polysaccharide, wie z.B.Latex-funktionalisierte Sepharose®, Agarose, Cellulose, Cellulose-Kügelchen und ähnliches; polymere Aminosäuren, wie z.B. Polyglutaminsäure, Polylysin, Polylactidcoglykolid und ähnliches; Aminosäure-Copolymere; und inaktive Viruspartikel. Besonders nützliche Proteinsubstrate sind Serumalbumine, Napfschnecken-Hämocyanin, Immunglobulin-Moleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin, Tetanus-Toxoid und andere Proteine, die im Fachgebiet wohlbekannt sind.
  • Die Immunogenität der Epitope kann auch erhöht werden, indem sie in Säuger- oder Hefesystemen präpariert werden, die mit partikelbildenden Proteinen fusioniert oder darin angeordnet sind, wie zum Beispiel mit Hepatitis-B-Oberflächenantigen assoziierte Proteine. Siehe z.B. US-A-4.722.840. Konstrukte, worin das Epitop direkt an die Codierungssequenzen des partikelbildenden Proteins geknüpft sind, produzieren Hybride, die bezüglich des Epitops immunogen sind. Außerdem enthalten alle der präparierten Vektoren für HBV spezifische Epitope bei verschiedenen Graden von Immunogenität, wie zum Beispiel das Prä-S-Peptid.
  • Außerdem können Abschnitte der Codierungssequenz des partikelbildenden Proteins durch Codone ersetzt werden, die ein Epitop der Erfindung codieren. Bei dieser Ersetzung können Regionen, die nicht zur Vermittlung der Aggregation der Einheiten erfor derlich sind, um immunogene Partikel in Hefe oder Säugern zu bilden, deletiert werden, was zusätzliche HBV-antigene Stellen aus der Konkurrenz um das Epitop der Erfindung ausschaltet.
  • Impfstoffe können aus ein oder mehreren immunogenen Polypeptiden der Erfindung präpariert werden. Diese Polypeptide können in verschiedenen Wirtszellen (z.B. Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen) exprimiert werden, oder können alternativ aus viralen Präparaten isoliert oder synthetisch hergestellt werden.
  • Über das obige hinaus ist es auch möglich, Lebendimpfstoffe aus abgeschwächten Mikroorganismen zu präparieren, die ein oder mehrere rekombinante Polypeptide der Erfindung exprimieren. Geeignete abgeschwächte Mikroorganismen sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel Viren (z.B. Vaccinia-Virus) als auch Bakterien.
  • Die Präparierung der Impfstoffe, die ein oder mehrere immunogene Polypeptide als aktiven Inhaltsstoff enthalten, ist einem Fachmann des Gebiets bekannt. Typischerweise werden diese Impfstoffe als Injektionslösungen oder als in geeigneter Weise verkapselte orale Präparate und entweder Flüssiglösungen oder Suspensionen zubereitet; feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeiten vor der Einnahme oder Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert oder das Protein in Liposome eingekapselt werden. Die immunogenen aktiven Wirkstoffe werden oftmals mit Arzneimittelträgern gemischt, die pharmazeutisch annehmbar und mit dem Wirkstoff kompatibel sind. Zu geeigneten Arzneimittelträgern zählen zum Beispiel Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder ähnliches und Kombinationen davon. Außerdem kann der Impfstoff, sofern erwünscht, geringfügigere Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel und/oder Adjuvanzien, die die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöhen. Beispiele der Adjuvanzien, die wirksam sein können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, bezeichnet als nor-MDP), N-Acetymuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydoxyphosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835A, bezeichnet als MTP-PE) und RIBI, welches drei aus Bakterien extrahierte Komponenten enthält, nämlich Mo nophosphoryllipid A, Trehalosedimycolat und Zellwandskelett (MPL+TDM+CWS) in einer 2 % Squalen/Tween® 80-Emulsion. Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann durch Messen der Menge an Antikörpern bestimmt werden, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine antigene Sequenz enthält, die aus der Verabreichung dieses Polypeptids in Impfstoffen resultiert, die sich ebenfalls aus den verschiedenen Adjuvanzien zusammensetzen.
  • Die Impfstoffe werden herkömmlicherweise parenteral, zum Beispiel durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht. Zu weiteren Formulierungen, die für andere Verabreichungsformen geeignet sind, zählen Suppositorien, orale Formulierungen oder Klistiere. Für Suppositorien können herkömmliche Bindemittel und Träger zum Beispiel Polyalkylenglykole oder Triglyceride enthalten; diese Suppositorien können aus Gemischen erzeugt werden, die den Wirkstoff im Bereich von 0,5 % bis 10 %, vorzugsweise 1 % bis 2 %, enthalten. Orale Formulierungen umfassen die normalerweise verwendeten Exzipienten, wie beispielsweise pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches. Diese Zusammensetzungen erhalten die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Retard-Formulierungen oder Pulver und enthalten 10 %–95 % des Wirkstoffs, vorzugsweise 25 %–70 %.
  • Die Proteine können zu dem Impfstoff als neutrale oder Salz-Formen formuliert werden. Zu pharmazeutisch geeigneten Salzen zählen die Säureadditionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptids), die mit anorganischen Säuren wie z.B. Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Apfelsäure und ähnlichem gebildet werden. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen abgeleitet sein, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium- Calcium- oder Eisenhydroxiden, und organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichem.
  • Die Impfstoffe werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in einer Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam sein wird. Die zu verabreichende Menge, die allgemein im Bereich von 5 μg bis 250 μg des Antigens pro Dosis liegt, hängt vom zu behandelnden Lebewesen, der Kapazität des Immunsystems des Lebewesen, Antikörper zu synthetisieren, der Verabreichungsform und dem gewünschten Grad an Schutz ab. Die präzise zu verabreichenden Mengen an Wirkstoff hängen von der Beurteilung des betreuenden Arztes ab und können für jedes Lebewesen individuell sein.
  • Der Impfstoff kann bei einem Einzeldosisschema oder vorzugsweise bei einem Mehrfachdosisschema verabreicht werden. Ein Mehrfachdosisschema ist ein solches, bei dem ein primärer Impfvorgang aus 1–10 separaten Dosen bestehen kann, gefolgt von weiteren Dosen, die bei nachfolgenden Zeitintervallen gegeben werden, die zur Aufrechterhaltung oder Verstärkung der Immunantwort erforderlich sind, zum Beispiel nach 1–4 Monaten für eine zweite Dosierung und, sofern erforderlich, nachfolgenden Dosierungen) nach mehreren Monaten. Das Dosierungsschema wird ebenfalls, zumindest zum Teil, durch das individuelle Erfordernis bestimmt werden und hängt von der Beurteilung des betreuenden Arztes ab.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein abgeschwächter Impfstoff bereitgestellt, der ein normalerweise pathogenes Mycobakterium umfasst, welches eine abschwächende Mutation in einem der Gene beherbergt, die ein Polypeptid der Erfindung codieren. Das Gen wird ausgewählt aus der Gruppe von ORFs A, B, C, D, E, F, G und H, einschließlich der homologen ORFS B, C, E und F in Mtb.
  • Das Mycobakterium kann in Form von abgetöteten Bakterien oder als abgeschwächter Lebendimpfstoff verwendet werden. Abgeschwächte Lebendimpfstoff weisen gewisse Vorteile auf. Es wird der vollständige Lebendorganismus verwendet anstelle toter Zellen oder ausgewählter Zellkomponenten, die modifizierte oder denaturierte Antigene aufweisen können. Die Proteinantigene in der äußeren Membran werden ihre tertiären und quaternären Strukturen beibehalten. Daher sollte das Potenzial höher sein, eine gute langfristige Schutzimmunität hervorzurufen.
  • Der Begriff "Mutation" und ähnliches bezieht sich auf eine genetische Läsion in einem Gen, die das Gen nicht-funktionell macht. Dies kann sich entweder auf dem Niveau der Transkription oder der Translation bewegen. Der Begriff umfasst daher die Deletion des gesamten Gens oder eines beträchtlichen Abschnitts davon, ebenso wie Punktmutationen in der Codierungssequenz, die zu verkürzten Genprodukten führen, die nicht zur Ausübung der normalen Funktion des Gens fähig sind.
  • Eine in ein Bakterium der Erfindung eingeführte Mutation wird generell eine nicht-revertierende abschwächende Mutation sein. Nicht-revertierend bedeutet, dass für praktische Zwecke die Wahrscheinlichkeit, dass das mutierte Gen zu seiner normalen Funktion zurückkehrt, gering ist, zum Beispiel kleiner 1 von 106, zum Beispiel kleiner 1 von 109 und sogar kleiner 1 von 1012 Fällen.
  • Ein abgeschwächtes Mycobakterium der Erfindung kann in isolierter Form vorliegen. Dies ist gewöhnlich erwünscht, wenn das Bakterium zu Impfzwecken verwendet werden soll. Der Begriff "isoliert" bedeutet, dass das Bakterium in einer Form vorliegt, in der es gezüchtet, prozessiert oder anderweitig in einer Form verwendet werden kann, in der es ohne weiteres identifizierbar ist und in der es im Wesentlichen unkontaminiert durch andere Bakterienstämme ist, zum Beispiel durch nicht-abgeschwächte Elternstämme oder nicht-verwandte Bakterienstämme. Der Begriff "isoliertes Bakterium" umfasst daher Kulturen einer bakteriellen Mutante der Erfindung, zum Beispiel in Form von Kolonien auf einem festen Medium oder in Form einer Flüssigkultur, als auch gefrorene oder getrocknete Präparationen der Stämme.
  • In einem bevorzugten Aspekt umfasst das abgeschwächte Mycobakterium außerdem mindestens eine zusätzliche Mutation. Hierbei kann es sich um eine Mutation in einem Gen handeln, das für die Erzeugung von Produkten verantwortlich ist, die für das Bakterienwachstum wesentlich sind und in einem menschlichen oder tierischen Wirt abwesend sind. Zum Beispiel wurden Mutationen am Gen für Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (asd) für die Erzeugung von abgeschwächten Stämmen von Salmonella vorgeschlagen. Das asd-Gen ist weiter beschrieben in Gene (1993) 129; 123-128. Eine Läsion im asd-Gen, das das Enzym Aspartat-β-Semialdehyd-Dehydrogenase codiert, würde den Organismus auxotrophisch für den essentiellen Nährstoff Diaminopimelinsäure (DAP) machen, der exogen während der Massenkultur des Vakzine-Stamms zugeführt werden kann. Da diese Verbindung ein wesentlicher Bestandteil der Zellwand von Gram-negativen und einigen Gram-positiven Organismen ist und bei Säugern oder anderen Wirblergeweben abwesend ist, würden die Mutanten in diesen Geweben nach etwa drei Teilungszyklen eine Lyse vollziehen. Analoge Mutationen können an den abgeschwächten Mycobakterien der Erfindung vorgenommen werden.
  • Zusätzlich oder alternativ können die abgeschwächten Mycobakterien eine recA-Mutation tragen. Die recA-Mutation schaltet die homologe Rekombination aus – jener Prozess, der für die Konstruktion der Mutationen ausgenützt wird. Ist die recA-Mutation einmal eingebaut, so macht dies den Stamm zur Reparatur der konstruierten Deletionsmutationen unfähig. Diese Mutation wird abgeschwächte Stämme bereitstellen, bei denen die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination mit DNA von Wildtyp-Stämmen minimiert worden ist. RecA-Gene sind im Fachgebiet breit untersucht und ihre Sequenzen verfügbar gemacht worden. Zur zusätzlichen Sicherheit können weitere Modifikationen vorgenommen werden.
  • Die Erfindung stellt weiterhin einen Prozess zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung bereit, die ein abgeschwächtes Bakterium gemäß der Erfindung enthält, welcher Prozess umfasst (a) Beimpfen eines Kulturgefäßes, das ein Nährstoffmedium enthält, das sich für das bakterielle Wachstum eignet; (b) Kultivieren des Bakteriums; (c) Rückgewinnen der Bakterien und (d) Mischen der Bakterien mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.
  • Abgeschwächte Bakterienstämme gemäß der Erfindung können unter Anwendung einer rekombinanten DNA-Methode konstruiert werden, die als solche bekannt ist. Im Allgemeinen können die bakteriellen Gene durch ein Verfahren der angezielten homologen Rekombination mutiert werden, bei dem ein DNA-Konstrukt, das eine mutierte Form des Gens enthält, in ein Wirtsbakterium eingeführt wird, welches abgeschwächt werden soll. Das Konstrukt wird sich mit dem Wildtyp-Gen, das vom Wirt getragen wird, rekombinieren, wodurch das mutierte Gen in das Wirtsgenom aufgenommen werden kann, um ein Bakterium der vorliegenden Erfindung zu erhalten, das dann isoliert werden kann.
  • Das mutierte Gen kann durch Einführen von Deletionen in das Gen erhalten werden, z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym, welches die Codierungssequenz zweimal schneidet, um einen Abschnitt des Gens auszuschneiden, und dann durch Religieren unter Bedingungen, bei denen der ausgeschnittene Abschnitt nicht wieder in das geschnittene Gen eingeführt wird. Alternativ können Frameshift-Mutationen durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym eingeführt werden, was überhängende 5'- und 3'-Termini zurücklässt, Auffüllen und/oder Zurückschneiden der Überhänge und Religieren. Ähnliche Mutationen können durch positionsgerichtete Mutagenese erreicht werden. Hierbei handelt es sich lediglich um Beispiele der Arten von Techniken, die Fachleuten des Gebiets ohne weiteres zur Verfügung stehen werden.
  • Verschiedene Assays sind zum Nachweis einer erfolgreichen Rekombination verfügbar. Im Falle von Attenuierungen, die ein für die Produktion einer wesentlichen metabolitischen oder katabolitischen Verbindung erforderliches Zielgen mutieren, kann die Auswahl durch ein Screening für Bakterien vorgenommen werden, die zum Wachsen in Abwesenheit solch einer Verbindung unfähig sind. Bakterien können auch mit Antikörpern oder Nukleinsäuren der Erfindung gescreent werden, um die Abwesenheit der Produktion eines mutierten Genprodukts der Erfindung zu bestimmen oder um zu bestätigen, dass die eingeführte genetische Läsion – z.B. eine Deletion – in das Genom des abgeschwächten Stamms eingebaut worden ist.
  • Die Konzentration des abgeschwächten Stamms im Impfstoff wird so formuliert, dass die Zubereitung in bequem geeigneten Einheiten-Dosierungsformen möglich ist. Konzentrationen von etwa 104 bis 109 Bakterien pro ml werden generell geeignet sein, z.B. etwa 105 bis 108, wie etwa 105 pro ml. Abgeschwächte Lebendorganismen können subkutan oder intramuskulär bei bis zu 108 Organismen in ein oder mehreren Dosen verabreicht werden, z.B. etwa 105 bis 108, z.B. etwa 106 oder 107 Organismen in einer einzelnen Dosis.
  • Die Impfstoffe der Erfindung können an die Empfänger zur Behandlung einer etablierten Erkrankung oder zum Schutz gegen Erkrankungen, die durch die entsprechenden Wildtyp-Mycobakterien verursacht werden, wie etwa entzündliche Erkrankungen wie die Crohn-Krankheit oder Sarkoidose beim Menschen oder Johne-Krankheit beim Tier, verabreicht werden. Der Impfstoff kann auf einem beliebigen geeigneten Wege verabreicht werden. Im Allgemeinen sind subkutane oder intramuskuläre Injektionen am be quemsten, doch kann auch eine orale, intranasale oder kolorektale Verabreichung erfolgen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Aspekte der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Tests auf das Vorhandensein der GS-Identifizierungssequenz wurden an 5 μI bakteriellen DNA-Extrakten (25 μg/ml bis 500 μg/ml) unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion, basierend auf den Oligonukleotid-Primern 5'-GATGCCGTGAGGAGGTAAAGCTGC-3' (SEQ ID NR. 40) und 5'-GATACGGCTCTTGAATCCTGCACG-3' (SEQ ID NR. 41) von innerhalb der Identifizierungs-DNA-Sequenzen (SEQ ID NRn. 1 und 2) vorgenommen. Die PCR wurde für 40 Zyklen in Gegenwart von 1,5 mM Magnesium und einer Vereinigungstemperatur von 58°C vorgenommen. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit des korrekten Amplifikationsprodukts zeigte das Vorhandensein oder die Abwesenheit der GS-Identifizierungssequenz im entsprechenden Bakterium an. Die GS-Identifizierungssequenz wird als in allen getesteten Labor- und Zellstämmen von Mptb und Mavs vorhanden nachgewiesen. Dies beihaltet die Mptb-Isolate 0025 (bovines CVL Weybridge), 0021 (caprin, Moredun), 0022 (bovin, Moredun), 0139 (human, Chiodini 1984), 0209, 0208, 0211, 0210, 0212, 0207, 0204, 0206 (bovin, Whipple 1990). Alle Mptb-Stämme waren IS900-positiv. Die Mavs-Stämme umfassen 0010 und 0012 (Waldtaube, Thorel), 0018 (Gürteltier, Portaels) und 0034, 0037, 0038, 0040 (AIDS, Hoffner). Alle Mavs-Stämme waren IS902-positiv. Ein pathogener M. avium-Stamm 0033 (AIDS, Hoffner) enthielt ebenfalls GS-Identifizierungssequenz. Die GS-Identifizierungssequenz ist bei anderen Mycobakterien, einschließlich anderem M. avium, M. malmoense, M. szulgai, M. gordonae, M. chelonei, M. fortuitum, M. phlei, abwesend, ebenso wie E. coli, S. areus, Nocardia sp., Streptococcus sp., Shigella sp., Pseudomonas sp.
  • BEISPIEL 2
  • Zum Erhalt der vollen Sequenz der GS in Mavs und Mptb generierten wir eine Genombank von Mavs unter Anwendung der Restriktionsendonuklease EcoRI und einer Klonierung in den Vektor pUC18. Dies erzielte eine repräsentative Bank, die mit 32P-markierter Identifizierungssequenz gescreent wurde, was einen positiven Klon ergab, der ein 17 kbp-Insert enthielt. Wir konstruierten eine Restriktionskarte dieses Inserts und identifizierten die GS als Fragmente, die für Mavs und Mptb einzigartig sind und nicht in Laborstämmen von M. avium vorkommen. Diese Fragmente wurden in pUC18 und pGEM4Z subkloniert. Wir identifizierten eine GS, die innerhalb einer 8 kb-Region enthalten war. Die volle Nukleotidsequenz wurde für GS an beiden DNA-Strängen unter Anwendung des Primer-Walking und der automatisierten DNA-Sequenzierung bestimmt. Die DNA-Sequenz für GS in Mptb wurde unter Verwendung überlappender PCR-Produkte erhalten, die unter Verwendung von PwoDNA-Polymerase, einem hitzestabilen proof-reading-Enzym, generiert wurden. Die endgültigen DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des GCG-Gelanordnungs-Softwarepakets der University of Wisconsin abgeleitet.
  • BEISPIEL 3
  • Die DNA-Sequenz der GS in Mavs und Mptb wurde als zu mehr als 99 % homolog befunden. Die in GS codierten ORFs wurden unter Verwendung der GeneRunner- und DNAStar-Computerprogramme identifiziert. Acht ORFs wurden identifiziert und als GSA, GSB, GSC, GSD, GSE, GSF, GSG und GSH bezeichnet. Datenbank-Vergleiche wurden gegen die GenEMBL-Datenbank-Release Version 48.0 (9/96) unter Verwendung der BLAST- und BLIXEM-Programme vorgenommen. GSA und GSB codierten Proteine von 13,5 kDa bzw. 30,7 kDa, die beide von unbekannter Funktion sind. GSC codierte ein Protein von 38,4 kDa mit einer Homologie von 65 % zur Aminosäuresequenz von rfbD von V. cholerae, einer Aminosäuresequenz-Homologie von 62 % zu gmd von E. coli und einer Homologie von 58 % zu gca von Ps. Aeruginosa, die alle GDP-D-Mannosedehydratasen sind. Äquivalente Genprodukte in H. influenzae, S. dysenteriae, Y. enterocolitica, N. gonorrhoea, K. pneumoniae und rfbD in Salmonella enterica sind alle an der O-Antigen-Prozessierung beteiligt, die bekanntermaßen an Pathogenität geknüpft ist. GSD codierte ein Protein von 37,1 kDa, das eine Homologie von 58 % auf der DNA-Ebene zu wcaG von E. coli zeigte, einem Gen, das an der Synthese und Regulation von kapsulären Polysacchariden beteiligt ist und ebenfalls mit Pathogenität in Verbindung steht. GSE wurde mit einer > 30 % Aminosäure-Homologie zur rfbT von V. cholerae befunden, das am Transport der spezifischen LPS-Komponenten quer durch die Zellmembran beteiligt ist. In V. cholerae bewirkt das Genprodukt eine Serokonversion vom Inaba- zum "epidemischen" Ogawa-Stamm. GSF codierte ein Protein von 30,2 kDa, welches im Bereich von 25–40 % homolog auf der Aminosäure-Ebene zu mehreren Glukosyltransferasen war wie rfpA von K. pneumoniae, rfbB von K. pneumoniae, IgtD von H. influenzae, Isi von N. gonorrhoae. Ein äquivalentes Gen galE addiert in E. coli β-1-3-N-Acetylglukosamin zu Galactose, wobei letzteres nur in O- und M-Antigenen zu finden ist, die ebenfalls mit Pathogenität in Beziehung stehen. GSH, das ORFs GSH und GSH2 umfasst, codiert ein Protein von insgesamt etwa 60 kDa, welches eine mutmaßliche Transposase mit einer 40–43 % Homologie auf der Aminosäure-Ebene zu dem äquivalenten Genprodukt von IS21 in E. coli aufweist. Diese Familie der Insertionssequenzen ist unter Gram-negativen Bakterien breit verteilt und ist für die Mobilität und Transposition der genetischen Elemente verantwortlich. Ein IS21-artiges Element in B. fragilis ist auf beiden Seiten des β-Lactamase-Gen gespalten, was seine Aktivierung und Expression kontrolliert. Wir programmierten einen E.coli-S30-zellfreien Extrakt mit Plamid-DNA, die die ORF-GSH unter der Kontrolle eines lac-Promotors in Gegenwart eines 35S-Methionins enthielt und zeigten die Translation eines reichlich vorhandenen 60 kDa Proteins. Die Proteine, die zu in anderen Organismen codierten GS homolog sind, sind generell hochgradig antigen. Daher können die durch ORFs in GS codierten Proteine in Immunoassays von Antikörper- oder zellvermittelter Immunreaktivität für die Diagnose von Infektionen verwendet werden, die durch Mycobakterien, insbesondere Mptb, Mavs und Mtb, verursacht werden. Die Erhöhung der Wirts-Immunerkennung von GS-codierten Proteinen durch Impfung mit nackter spezifischer DNA oder rekombinanten GS-Proteinen kann zur Verhütung und Behandlung von Infektionen ausgenützt werden, die durch Mptb, Mavs und Mtb bei Menschen und Tieren verursacht werden. Die Mutation oder Deletion aller oder eines Teils der ORFs A bis H in GS kann zur Generierung abgeschwächter Stämme von Mptb, Mavs oder Mtb mit geringerer Pathogenität zur Verwendung als lebende oder abgetötete Impfstoffe bei Menschen und Tieren angewendet werden. Diese Impfstoffe sind besonders relevant für die Johne-Krankheit bei Tieren, für Erkrankungen, die durch Mptb bei Menschen verursacht werden, wie der Crohn-Krankheit, und für die Behandlung der Tuberkulose, insbesondere dort, wo die Erkrankung durch mehrfache wirkstoffresistente Organismen verursacht ist.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001

Claims (32)

  1. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines pathogenen Mycobakteriums in einer biologischen Probe durch Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer mycobakteriellen Pathogenitätsinsel oder eines Expressionsprodukts davon, welches Verfahren umfasst: Bereitstellen (a) einer Nukleinsäure-Sonde, umfassend ein Fragment von mindestens 15 Nukleotiden eines Polynukleotids, ausgewählt aus: (i) einem Polynukleotid entsprechend der SEQ ID Nr: 3 oder 4; (ii) einem Polynukleotid entsprechend einer beliebigen von SEQ ID Nrn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27; oder (iii) einem Polynukleotid, das ein Polypeptid entsprechend einer beliebigen der SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39 codiert; oder (b) eines Antikörpers, der zur spezifischen Bindung eines Polypeptids fähig ist, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; Inkubieren der biologischen Probe mit der Sonde oder dem Antikörper unter Bedingungen, welche die Hybridisation der Sonde an eine Nukleinsäure oder die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes zulassen, und Nachweisen jeglichen in der Probe gebildeten Nukleinsäure-Duplexes oder Antikörper-Antigen- Komplexes.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe ausgewählt ist aus einer Körperflüssigkeit, -gewebe oder -exkret von einem Menschen oder Tier, oder einer Nahrungsmittel- oder Umweltprobe.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus einem Fv-Fragment, einem F(ab')-Fragment, einem F(ab')2-Fragment, einem einzelkettigen Antikörper oder einem humanisierten Antikörper.
  4. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Antikörpers, der zur spezifischen Bindung eines pathogenen Mycobakteriums in einer Probe von einem Tier oder Menschen fähig ist, welches umfasst: (a) Bereitstellen eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; (b) Inkubieren der Probe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, welche die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes zulassen; und (c) Bestimmen, ob ein Antikörper-Antigen-Komplex, der das Polypeptid umfasst, entstanden ist.
  5. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer zellvermittelten Immunreaktivität gegen ein pathogenes Mycobakterium in einem Tier oder Menschen, welches umfasst: (a) Bereitstellen eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; (b) Inkubieren der Zellprobe von dem Tier oder Menschen mit dem Polypeptid unter Bedingungen, welche eine zelluläre Immunantwort, wie etwa die Freisetzung von Zytokinen oder anderen Mediatoren, oder das Erfolgen einer Reaktion zulassen; und (c) Nachweisen des Vorhandenseins des Zytokins oder Mediators oder der zellulären Reaktion im Inkubat.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Probe ausgewählt ist aus Blut, Milch und Speichel.
  7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sonde oder das Polypeptid eine offenbarende Markierung trägt.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sonde, der Antikörper oder das Polypeptid an einem festen Träger immobilisiert ist.
  9. Test-Kit zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines pathogenen Mycobakteriums in einer Probe, welches umfasst: (a) ein Polypeptid, das zur spezifischen Bindung eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop, fähig ist; (b) einen Antikörper, der zur spezifischen Bindung eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop, fähig ist;
  10. Normalennreise pathogenes Mycobakterium, dessen Pathogenität insgesamt oder teilweise durch das Vorhandensein oder die Expression eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop, vermittelt ist, welches Mycobakterium eine abschwächende Mutation in einem Gen beherbergt, das eines der Polypeptide codiert.
  11. Impfstoff, umfassend ein Mycobakterium nach Anspruch 10.
  12. Impfstoff nach Anspruch 11, wobei das Mycobakterium ausgewählt ist aus Mavs, Mpth und Mtb.
  13. Impfstoff, umfassend: (a) ein Polypeptid, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39; (b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid aus (a); (c) ein Polypeptid mit mindestens 70% Aminosäure-Identität zu einem Polypeptid aus (a) über 30 oder mehr benachbarte Aminosäuren hinweg; (d) ein Fragment eines Polypeptids aus (a), umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; (e) ein Polynukleotid, das zum Exprimieren eines Polypeptids aus (a), (b), (c) oder (d) fähig ist; oder (f) einen Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid aus (e).
  14. Impfstoff nach Anspruch 13, wobei das Polynukleotid aus (e) ausgewählt ist aus: (a) einem Polynukleotid entsprechend einer der SEQ ID Nrn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 und 27; (b) einem Polynukleotid, umfassend ein Polynukleotid aus (a); (c) einem Fragment von mindestens 15 Nukleotiden in der Länge eines Polynukleotids aus (a); oder (d) einem Polynukleotid mit mindestens 90% Homologie zu einem Polynukleotid aus (a), (b) oder (c).
  15. Impfstoff nach Anspruch 13, umfassend: (a) ein Polypeptid entsprechend der SEQ ID Nr. 24; (b) ein Polypeptid, umfassend ein Polypeptid aus (a); (c) ein Polypeptid mit mindestens 70% Aminosäure-Identität zu einem Polypeptid aus (a) über 30 oder mehr benachbarte Aminosäuren hinweg; (d) ein Fragment eines Polypeptids aus (a), umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; (e) ein Polynukleotid, das zum Exprimieren eines Polypeptids aus (a), (b), (c) oder (d) fähig ist; oder (f) einen Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid aus (e).
  16. Impfstoff nach Anspruch 15, wobei das Polynukleotid aus (e) ausgewählt ist aus: (a) einem Polynukleotid entsprechend der SEQ ID Nr. 23; (b) einem Polynukleotid, umfassend die SEQ ID Nr. 23; (c) einem Fragment von mindestens 15 Nukleotiden in der Länge eines Polynukleotids aus (a); oder (d) einem Polynukleotid mit mindestens 90% Homologie zu einem Polynukleotid aus (a), (b) oder (c).
  17. Verwendung eines Polypeptids, Polynukleotids oder Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhütung einer mocybakteriellen Erkrankung bei einem Tier oder Menschen, die durch pathogene Mycobakterien verursacht ist.
  18. Verwendung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 13 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhütung einer mocybakteriellen Erkrankung bei einem Tier oder Menschen, die durch pathogene Mycobakterien verursacht ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Reaktion des Tiers oder Menschen auf die Impfung überwacht oder nachgewiesen wird.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Reaktion durch Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Immunreaktion gegen den Impfstoff in einer Probe von dem Tier oder Menschen überwacht wird.
  21. Verfahren zum Überwachen der Nachweisen einer Reaktion auf die Impfung mit einem Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 16, umfassend den Schritt des Nachweisens des Vorhandenseins einer Immunreaktion gegen den Impfstoff in einer Probe von dem geimpften Menschen oder Tier.
  22. Verwendung nach Anspruch 20 oder eines Verfahrens nach Anspruch 21, wobei die Reaktion über den Verlauf der Impfung überwacht wird.
  23. Verwendung nach Anspruch 20 oder eines Verfahrens nach Anspruch 21, wobei die Reaktion nach einer Impfabfolge überwacht wird.
  24. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei der Nachweis einer Immunreaktion das Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Antikörpers gegen den Impfstoff in der Probe umfasst.
  25. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Antikörper mittels eines Verfahrens nachgewiesen wird, umfassend das Bereitstellen eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop; das Bereitstellen einer Probe von dem Menschen oder Tier; das Inkubieren der Probe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, welche die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes zulassen; und das Bestimmen, ob ein Antikörper-Antigen-Komplex, der das Polypeptid umfasst, entstanden ist.
  26. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Probe ausgewählt ist aus Blut, Milch und Speichel.
  27. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei der Nachweis einer Immunreaktion das Nachweisen einer zellvermittelten Immunreaktivität gegen den Impfstoff in der Probe umfasst.
  28. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 27, wobei die zellvermittelte Immunreaktivität mittels eines Verfahrens nachgewiesen wird, umfassend das Bereitstellen eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypepti de, umfassend mindestens 12 Aminosäuren, wobei das Polypeptid ein Epitop umfasst; das Inkubieren der Zellprobe mit dem Polypeptid unter Bedingungen, welche eine zelluläre Immunantwort zulassen, und das Nachweisen des Vorhandenseins einer zellulären Immunantwort im Inkubat.
  29. Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 28, wobei die zelluläre Immunantwort in der Freisetzung eines Zytokins oder anderen Mediators besteht.
  30. Polypeptid, das zur Verwendung bei einem Verfahren nach Anspruch 4 oder 5 in im wesentlichen isolierter Form geeignet ist, welches eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus den Sequenzen der SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 und 29, oder ein Polypeptid mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu.
  31. Rekombinanter Vektor, der trägt: (a) ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, oder ein Polypeptid mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu; (b) ein Polynukleotid, welches zum spezifischen Hybridisieren an SEQ ID Nr. 3 oder 4 oder ein Fragment davon fähig ist; (c) ein Polynukleotid, welches ein Fragment gemäß (b) ist, welches eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus den Sequenzen der SEQ ID Nrn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27, oder ein Polynukleotid, das zu mindestens 90% homolog dazu ist; oder (d) ein Polynukleotid, welches eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 und 27.
  32. Antikörper, der zur spezifischen Bindung eines Polypeptids, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 31, 33, 35, 37 oder 39, eines Polypeptids mit mindestens 70% Aminosäure-Identität dazu oder eines Fragments von einem der Polypeptide, umfassend mindestens 12 Aminosäuren und ein Epitop, fähig ist.
DE69634918T 1995-12-21 1996-12-23 Polynukleotide und polypeptide aus pathogenen mycobakterien und deren verwendung als diagnostika, impfstoffe und als ziel der chemotherapie Expired - Lifetime DE69634918T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9526178.0A GB9526178D0 (en) 1995-12-21 1995-12-21 Novel polynuceotides and polypeptides in pathogenic mycobacteria and their use as diagnostics,vaccines and targets for chemotherapy
GB9526178 1995-12-21
PCT/GB1996/003221 WO1997023624A2 (en) 1995-12-21 1996-12-23 Polynucleotides and polypeptides in pathogenic mycobacteria and their use as diagnostics, vaccines and targets for chemotherapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69634918D1 DE69634918D1 (de) 2005-08-11
DE69634918T2 true DE69634918T2 (de) 2006-05-18

Family

ID=10785831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69634918T Expired - Lifetime DE69634918T2 (de) 1995-12-21 1996-12-23 Polynukleotide und polypeptide aus pathogenen mycobakterien und deren verwendung als diagnostika, impfstoffe und als ziel der chemotherapie

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6156322A (de)
EP (1) EP0870032B1 (de)
AT (1) ATE299182T1 (de)
AU (1) AU735112B2 (de)
DE (1) DE69634918T2 (de)
GB (1) GB9526178D0 (de)
WO (1) WO1997023624A2 (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9526178D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Taylor John Hermon Novel polynuceotides and polypeptides in pathogenic mycobacteria and their use as diagnostics,vaccines and targets for chemotherapy
GB9806093D0 (en) * 1998-03-20 1998-05-20 Taylor John Hermon Diagnostics and vaccines for mycobacterial infections of animals and humans
US6183957B1 (en) 1998-04-16 2001-02-06 Institut Pasteur Method for isolating a polynucleotide of interest from the genome of a mycobacterium using a BAC-based DNA library application to the detection of mycobacteria
US6638518B1 (en) 1999-02-22 2003-10-28 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting inflammatory responses
BR0005598B1 (pt) * 1999-09-16 2013-03-19 mÉtodo para proteger uma planta crescendo contra insetos rastejantes.
WO2003018053A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccine against mycobacterial-induced diseases
US8231867B2 (en) * 2002-06-03 2012-07-31 Paralab Llc Dietzia bacterium for treatment of disease
DE102004013988A1 (de) * 2004-03-19 2005-10-13 Henkel Kgaa Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis und recA-inaktivierte Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion
US7488580B1 (en) * 2005-03-10 2009-02-10 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Protocol for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in blood
CA2617506C (en) * 2005-08-09 2015-02-03 St George's Enterprises Limited Immunogenic constructs useful for treating mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (map) infection
US8465753B2 (en) * 2007-04-23 2013-06-18 Robert J. Greenstein Combination vaccines against Mycobacterium sp. and methods of using the same
US7846420B2 (en) * 2007-04-23 2010-12-07 Greenstein Robert J Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis vaccines and methods of using the same
WO2012140068A1 (en) 2011-04-11 2012-10-18 Alarum Development Ltd. New vaccines for prevention and treatment of tuberculosis
GB201700487D0 (en) 2017-01-11 2017-02-22 Hermon-Taylor John Diagnostic

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8709803D0 (en) 1987-04-24 1987-05-28 Mcfadden J J Treatment of crohn's disease &c
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
FR2682967B1 (fr) 1991-10-25 1994-01-14 Pasteur Institut Nouveau promoteur de m. paratuberculosis. son utilisation pour le clonage et l'expression de sequences nucleotidiques.
JPH09501823A (ja) * 1993-05-13 1997-02-25 アール．，ジュニア ヤコブス，ウィリアム ｉｎｈＡ遺伝子を用いるミコバクテリア感染の検出および処置のための方法および組成物
DK79893D0 (da) * 1993-07-02 1993-07-02 Statens Seruminstitut New vaccine
GB9526178D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Taylor John Hermon Novel polynuceotides and polypeptides in pathogenic mycobacteria and their use as diagnostics,vaccines and targets for chemotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP0870032B1 (de) 2005-07-06
US20060204521A1 (en) 2006-09-14
US20040260078A1 (en) 2004-12-23
EP0870032A2 (de) 1998-10-14
AU735112B2 (en) 2001-06-28
DE69634918D1 (de) 2005-08-11
US6156322A (en) 2000-12-05
WO1997023624A3 (en) 1997-09-12
ATE299182T1 (de) 2005-07-15
AU1202797A (en) 1997-07-17
WO1997023624A2 (en) 1997-07-03
US7541181B2 (en) 2009-06-02
GB9526178D0 (en) 1996-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69333110T2 (de) Mit dem cytotoxin von helicobacter pylori assoziiertes, immunodominantes antigen verwendbar in impfstoffen und zur diagnose
US7541181B2 (en) Vector carrying a polynucleotide which encodes a GSD polypeptide from Mycobacterium paratuberculosis
DE69632625T2 (de) Mykrobakterielle proteine, mikroorganismen welche diese produzieren und ihre verwendung als impfstoff und zum nachweis von zuberkulose
DE69434681T2 (de) VAKZINE FÜR -i(BRANHAMELLA CATARRHALIS)
DE69837934T2 (de) Multisystemisches kümmerwuchssyndrom durch viren in schweinen
DE4040339C2 (de) Virales Agens
DE69334002T2 (de) Membran-assoziierte immunogene proteine des mycobakterien
DE69737125T3 (de) Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe
DE69531241T2 (de) Impfstoff gegen moraxella catarrhalis
DE60032347T2 (de) Peptide und nachweis zur diagnose von lyme-krankheit und zusammensetzungen zu deren verhütung
US20030228328A1 (en) Vaccine for periodontal disease
DE60318391T2 (de) Bakteriophagen-lysin
DE69433964T2 (de) Multiple Sclerosis Virus
DE60132084T2 (de) Virulenzgene,-proteine und ihre verwendung
DE60036555T2 (de) Polypeptidfragmente mit einem c-terminalen teil von katalase aus helicobacter
DE60133734T2 (de) Polypeptide die polymorphismen aus bordertella pertussis, bordetella parapertussis und bordetella bronchiseptica pertactin wiederholende regionen enthalten, ihre verwendung in diagnostik und immunogene zusammensetzungen
DE69535156T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose von rochalimaea henselae und rochalimaea quintana infektion
DE69629304T2 (de) Membranproteine von leptospira
JPH09510866A (ja) ミコバクテリア毒力因子およびその同定のための方法
DE69633179T2 (de) Transferrinrezeptorgene
AU759553B2 (en) Diagnostics and vaccines for mycobacterial infections of animals and humans
DE60037413T2 (de) Rekombinante adhesin-proteine aus haemophilus influenzae
DE60024977T2 (de) Klonierung und expression von haemophilus somnus transferrin-bindenden proteinen
DE60127401T2 (de) Milchvieh immunisierung mit mig protein
DE60022995T2 (de) Impfstoff

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: HAV VACCINES LTD., LONDON, GB