DE60318391T2

DE60318391T2 - Bakteriophagen-lysin

Info

Publication number: DE60318391T2
Application number: DE60318391T
Authority: DE
Inventors: Markus Zimmer; Martin Loessner; Andrew John Morgan
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Hyglos Invest GmbH; Biomerieux SA
Priority date: 2002-02-04
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: WO2003066845A2; AU2003205993B2; US20050153415A1; ES2298495T3; CN1813062A; CA2474145A1; EP1472344A2; EP1472344B1; JP2005516618A; IL162917A0; DK1472344T3; WO2003066845A3; AU2003205993A1; DE60318391D1; ATE382685T1; JP4436135B2; GB0202556D0; US7371375B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues bakterielles Virus (Bakteriophagen) Lysin, das die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 umfasst, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dieses Lysin umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Lysins zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von einer Störung verbunden mit pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere mit Clostridium perfringens.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Zerstörung pathogener Clostridium-Bakterien, insbesondere von Clostridium perfringens.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Wirt transfomiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Bakteriophagen-Lysin, umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis des Clostridium-Bakteriums, insbesondere des Clostridium perfringens, in einer Probe.
Clostridium perfringens ist ein pathogenes Bakterium, das für eine Vielzahl von Störungen, einschließlich nekrotischer Enteritis, Gasbrand und Nahrungmittelvergiftung, verantwortlich ist. C. perfringens ist vorwiegend ein Erdorganismus. C. perfringens ist ein wichtiger pathogener Anaerobier. Es gibt zahlreiche Orte im Körper (z. B. im Darmtrakt und in der Mundhöhle), die im Wesentlichen anaerob sind und in denen zwangsläufig anaerobe Bakterien als Teil der normalen Flora vorkommen können. Andere Teile des Körpers können jedoch als eine Folge von Gewebeschäden oder -verletzungen anaerob werden, was zu einer Reduktion der Blutversorgung des verletzten Gebiets führt, und solche anaeroben Stellen können dann für die Besiedlung durch zwingende Anaerobier, wie C. perfringens, verfügbar werden.
Die Anwesenheit von C. perfringens im Darmtrakt von Tieren kann beispielsweise zu nekrotischer Enteritis, Nahrungsmittelvergiftung und Wachstumsstörung führen. Insbesondere die Anwesenheit von C. perfringens im Darmtrakt von Geflügel, insbesondere von Masthähnchen, wurde mit verschiedenen Leiden in Verbindung gebracht, wie Darmläsion und nektrotischer Enteritis und kann zu einer erheblichen Reduktion im Wachstum von Geflügel führen.
Zusätzlich ist C. perfringens ein verursachender Erreger von Gasbrand, der als Folge von einem Gewebeschaden oder einer Verletzung und damit auf Grund einer anaerober Umgebung, die für die Besiedlung von zwingenden Anaerobier, wie C. perfringens, geeignet ist, entstehen kann.
Wie Viren im Allgemeinen können Bakteriophagen unterteilt werden in solche mit RNA-Genomen (meistens klein und einzelsträngig), in solche mit kleinen DNA-Genomen (im Wesentlichen kleiner als 10 kb, meistens einzelsträngig) und in solche mit mittleren bis großen DNA-Genomen (30–200 kb).
Die Gene in Bakteriophagen können in Gene des Frühstadiums und des Spätstadium gruppiert werden.
In virulenten Phagen werden alle Gene, dessen Produkte für die Phagen-DNA-Synthese und die Wirts-DNA-Aufspaltung benötigt werden, einschließlich solcher, die den Nukleotidmetabolismuns vermitteln und die Proteine, die den Replikationskomplex ausmachen, sofort nach der Infektion exprimiert. Mit der Zeit wird die frühe Synthese abgeschaltet und andere Gene, die für Virionen-Komponenten kodieren, und Lyse-Gene werden aktiviert. Das Ausschalten der frühen Gene wird sowohl auf der transkriptionalen als auch auf der translationalen Ebene hervorgerufen.
Bei temperenten Phagen kann der Phage eine Lysogenie durchmachen, wobei Gene bei einer Infektion, die eine Integration der Phage in das Wirtsgenom verursacht, angeschaltet werden, so dass der Phage dadurch indirekt vermehrt wird. Das lysogene Stadium ist ziemlich stabil, wenn es einmal erreicht ist. Umgebungsbedingte Ereignisse, die den lysogenen Bakterienwirt schädigen, können dazu führen, dass das lysogene Stadium aufgehoben wird und der lytischen Lebenszyklus des integrierten Phagen eingeleitet wird. Der lytischen Lebenszyklus wird von dem Punkt bestimmt, an dem der Phage auf Gene umschaltet (sowohl frühe als auch späte).
Werden erst einmal die späten Gene sowohl in virulenten als auch temperenten Phagen exprimiert, ist das Stadium des Zusammenbaus von Virionen erreicht. Die Köpfe, Schwänze, Schwanzfasern und lösliche Proteine, die die Schwanzfaser-Hinzufügung katalysieren, werden alle separat gebildet. Die Köpfe und Schwänze schließen sich typischerweise zuerst zu Komplexen zusammen und zum Schluss werden Schwanzfasern zu dem Komplex hinzugefügt.
Das Endstadium des Zyklus ist die zelluläre Lyse, bei der Virionen ins Medium freigesetzt werden. Die Lyse erfordert gewöhnlicherweise zwei Genprodukte: Ein Lysin, das die Bindungen, die die N-acetylglukosamine in der unnachgiebigen Mureinschicht verbinden, angreifen; und ein Holin, das Löcher in der inneren Membran verursacht, um dem Lysin zu ermöglichen, sein Substrat zu erreichen.
Somit sind Bakteriophagen-Lysine Phagen-kodierte Zellwand-Hydrolyseenzyme, die während der späten Genexpression in dem lytischen Zyklus der Phagenvermehrung synthetisiert werden und die Freisetzung von vermehrten Virionen von infizierten Zellen durch den Abbau von bakteriellen Peptidoglykan vermitteln.
EP 0 510 907 offenbart ein Lysin von Phagen von Listeria monocytogenes und Formulierungen von solch einem Lysin, im Wesentlichen frei von der Bakteriophage an sich, zusammen mit einem Verfahren zur Zerstörung von L. monocytogenes. Außerdem schlägt EP 0 510 907 ebenfalls die Verwendung von einem Lysin von Phagen von Clostridium tyrobutyricum vor, wobei die Beschreibung weder zeigt wie solch ein isoliertes Lysin erhalten werden kann, noch die Sequenz davon.
Nakamura et al. (Can J Microbiol. 1977 (5): S. 601–606) offenbart die Herstellung eines Zelllysats, das nach einer Durchmusterung mit Mytomycin-C von dem C. perfringens-Stamm KZ219 erhältlich ist, und das möglicherweise ein Lysin enthält (auch „lytisches Agens" genannt, siehe Materialien und Methoden) und der eine lytische Aktivität auf C. perfringens-, C. plagarum- und teilweise auf C. bifermentans-Stämmen aufweist.
WO 00/11472 lehrt ein Nachweisverfahren, das Zellwandbindedomänen von Proteinen und/oder Enzymen verwendet.
Vor der vorliegenden Erfindung war der lytische Zyklus von Bakteriophagen, die C. perfringens infizieren, wenig untersucht.
Der Begriff „Bakteriophage" wie hierein verwendet, soll austauschbar sein mit dem Begriff „Phage".
Ein grundliegender Fund der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung und Sequenzierung einer Nukleotidsequenz, die ein Lysin von einem Bakteriophagen kodiert, der in der Lage ist, pathogene Clostridium-Bakterien zu besiedeln, insbesondere Clostridium perfringens, und die Verwendung von solch einem Lysin, um pathogene Clostriudium-Bakterien, insbesondere pathogene Clostridium perfringens-Bakterien, zu lysieren.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Lysin, umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, erhältlich von einem Bakteriophagen, der in der Lage ist Clostridium perfringens zu besiedeln. Vorzugsweise liegt dieses Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form, das die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin, das die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, umfasst, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin umfasst, wobei die Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus den Folgenden umfasst:

(a) die Nukleotidsequenz dargestellt als SEQ ID NO: 1;
(b) eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Nukleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1 ist;
(c) eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an die Nukleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren;
(d) eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die in der Lage ist, an die Nukleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren;
(e) eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, an die komplementäre Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz dargelegt in SEQ ID NO: 1 zu hybridisieren;
(f) eine Nukleotidsequenz, die eine aus (a), (b), (c), (d) und/oder (e) umfasst.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin kodiert, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) eine Nukleotidsequenz, die die Sequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1 umfasst;
(b) eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die unter hohen und/oder mittleren stringenten Bedingungen an die Sequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 1 hybridisiert; und
(c) eine Nukleotidsequenz, die durch die Degeneration des genetischen Kodes ähnlich ist zur Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein im Wesentlichen reines Lysins, das erhältlich ist oder erhalten wird durch die Expression der Nukleinsäure, die die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Wirt zur Verfügung, der mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert ist.
EP 0 510 907 offenbart einen mikrobiellen Wirt, der mit Mitteln transformiert ist, um ein Lysin von einem Phagen des Listeria monocytogenes zu exprimieren. Die Lehre von EP 0 510 907 kann gemäß der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Wirt zur Verfügung, der mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die eine Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1 umfasst.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Lysin zur Verfügung, das von der Kultivierung eines Wirts gemäß der vorliegenden Erfindung abstammt. Vorzugsweise liegt das Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form vor.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Wirt transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Verwendung als ein Arzneimittel.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von einem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Herstellung von einem Arzneimittel für die Behandlung von einer Störung, Krankheit oder eines Zustands verbunden mit pathogenen Clostridium-Spezies, vorzugsweise mit pathogenen C. perfringens.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von einem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einem Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Herstellung von einem Arzneimittel zur Behandlung von reduzierter Gewichtszunahme verursacht durch pathogene Clostridium-Spezies, vorzugsweise durch pathogene C. perfringens, im Darmtrakt von Geflügel, vorzugsweise von Hühnern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von einem Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form, umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, für die Herstellung von einem Arzneimittel zur Behandlung von reduzierter Gewichtszunahme verursacht durch pathogene Clostridium-Spezies, vorzugsweise durch pathogenen C. perfringens, im Darmtrakt von Geflügel, vorzugsweise von Hühnern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel umfassend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel umfassend ein Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 und/oder einen Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin, umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Packung, die ein oder mehrere Behältnisse umfasst, wobei mindestens ein Behältnis ein oder mehrere Lysine gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen oder mehrere Wirte, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, oder eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Packung, die ein oder mehrere Behältnisse umfasst, wobei mindestens ein Behältnis ein oder mehrere Lysine in einer im Wesentlichen reinen Form umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 und/oder einen oder mehrere Wirte transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 kodiert, umfasst.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Verfahren das Zumischen von einem oder mehreren Lysinen gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einem oder mehrerer Wirte transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, zu einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Träger umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Verfahren das Zumischen von einem oder mehreren Lysinen in einer im Wesentlichen reinen Form umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 und/oder von einem oder mehreren Wirte transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 kodiert, zu einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Zerstörung eines pathogenen Bakteriums der Gattung Clostridium, wobei das Verfahren die Lyse eines pathogenen Clostridium-Bakterium mit einem im Wesentlichen reinen Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Zerstörung eines pathogenen Bakteriums der Gattung Clostridium, wobei das Verfahren die Lyse eines pathogenen Clostridium-Bakteriums mit einem Lysin in einer im Wesentlichen reinen Form, umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2, oder mit einer Zusammensetzung, umfassend das Lysin, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Expressionsvehikel zur Verfügung, das eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, und regulatorische Bereiche, die mit dieser verbunden sind, für die Expression der kodierenden Sequenz in einem geeigneten Wirt umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von einem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einem Wirt transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von einer Wachstumsstörung in Geflügel zur Verfügung, wobei die Wachstumsstörung verursacht wird durch die Besiedelung des Geflügel-Darmtrakts oder Teilen davon durch Clostridium perfringens.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Verfügung zum Nachweis eines pathogenen Clostridium-Bakteriums, vorzugsweise Clostridium perfringens, in einer Probe, unter Verwendung eines diagnostischen Markers, der auf einem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder einem Mimetikum davon basiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis eines pathogenen Clostridium-Bakteriums, vorzugsweise Clostridium perfringens, in einer Probe unter Verwendung von einem diagnostischen Marker zur Verfügung, der auf einem Lysin umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 basiert.
Der Begriff „basierend auf" wie hierin verwendet, bedeutet, dass der diagnostische Marker ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon, umfasst. Geeigneter Weise kann mindestens sowohl der lytische Teil als auch der Zellwandbindungsdomänen-Teil des Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Fall kann der lytische Teil davon voll funktional sein, d. h. in der Lage bakterielle Zellen zu lysieren, oder er kann in einer solchen Weise modifiziert sein, um die lytische Funktion des Lysins zu ändern und/oder auszuschalten. Ein geeignetes Verfahren zur Modifizierung des Lysins kann die Verwendung von zufälliger und/oder zielgerichteter Mutagenese sein. Der diagnostische Marker kann geeigneter Weise nur den Zellwandbindungsdomänen-Teil oder einen Teil des Lysins davon umfassen.
Der diagnostische Marker kann einen Marker umfassen, der bereits identifizierbar ist. Geeignete Marker umfassen Reporter, einschließlich Reporter, die hierin in dem Abschnitt bezeichnet „Reporter" detailliert beschrieben sind. Der Marker kann direkt oder indirekt an das Lysin oder einen Teil davon gebunden sein. Nur beispielhaft kann ein geeigneter Reporter ein fluoreszierendes Protein umfassen. Der Reporter kann entweder direkt oder indirekt an das Lysin oder einen Teil davon gekoppelt sein.
Für den Fall, dass die bakteriellen Zellen durch den diagnostischen Marker lysiert werden, kann die Lyse von einer oder mehreren bakteriellen Zellen beobachtet werden. Die Lyse kann zum Beispiel optisch beobachtet werden. Die Lyse kann durch die Messung der zellulären Gehälter, die durch die Lyse der bakteriellen Zellen freigesetzt werden, beobachtet werden, zum Beispiel kann die Freisetzung von ATP durch Biolumineszenz gemessen werden.
Der diagnostische Marker kann eine feste Phase umfassen (zum Beispiel aber nicht ausschließlich aktiviertes Polystyren, aktiviertes Glas, Silikon oder Glas-ähnliche Materialien, aktiviertes Latex, Gold oder Goldverbindungen, verschiedene ferromagnetische Trägermaterialien, hydrophobisch oder elektrisch geladene synthetische Materialien), die entweder direkt oder indirekt an das Lysin oder einen Teil davon, angelagert sind. Solche Zellen, die in der Lage sind an das Lysin oder einen Teil davon zu binden, können auf der oder gegen die feste Phase immobilisiert sein.
Die Vorteile des Nachweisverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sind, dass es nicht Spezies-spezifisch ist, es einfacher ist als Antikörper gegen Clostridium-Bakterien heranzuziehen und/oder dass sowohl die Bindung als auch der Nachweis leicht erreicht werden können.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung den Zellwandbindungsdomänen-Teil oder einen Teil davon des Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung für die Verwendung zur Arzneimittel Lieferung zur Verfügung.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modifizierung eines Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung, um die lytische Aktivität des Lysins in Bezug auf ein oder mehrere bakterielle Spezies zu verändern.
Das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann modifiziert sein, um das bakterielle Spektrum, bei dem das Lysin aktiv ist, zu erweitern. Alternativ kann das Lysin modifiziert werden, um die Aktivität davon auf eine spezifische bakterielle Spezies und/oder Stamm zu fokussieren; in anderen Worten, um dessen Wirtsspezifität zu erhöhen.
Zur Erleichterung der Einsichtnahme werden diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung jetzt unter geeigneten Absatzüberschriften diskutiert. Jedoch sind die Lehren unter jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf jeden einzelnen Absatz limitiert.
Vorzugsweise liegt die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in einer im Wesentlichen reinen Form vor.
Vorzugsweise liegt die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in einer isolierten Form vor.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, die die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, von einem Bakteriophagen erhältlich, der in der Lage ist, Clostridium perfringens zu infizieren und/oder zu besiedeln.
Geeigneter Weise wird die Nukleinsäure und/oder das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung von einem Bakteriophagen erhalten, der in der Lage ist, Clostridium perfringens zu infizieren und/oder zu besiedeln.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung von einem Bakteriophagen erhältlich oder wird erhalten, der in der Lage ist, Clostridium perfringens zu infizieren und/oder zu besiedeln.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure und/oder das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich oder wird erhalten von der Bakteriophage Φ3626 oder von der Bakteriophage Φ8533.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ferner ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder einen Träger.
Vorzugsweise ist die Störung, Krankheit und/oder Zustand etwas, das mit pathogenen Clostridium-Spezies verbunden ist, vorzugsweise mit Clostridium perfringens.
Entsprechende Störungen, Krankheiten und/oder Zustände umfassen beispielsweise nekrotische Enteritis, Gasbrand, Nahrungsmittelvergiftung, Darmläsionen und reduzierte Gewichtszunahme.
Wie oben geschrieben sind Clostridium-Spezies, insbesondere C. perfringens, im Darmtrakt von bestimmten Tieren, insbesondere Geflügel wie Hähnchen, mit reduziertem Wachstumspotenzial in diesen Tieren im Vergleich zu uninfizierten Tieren verbunden worden. Der Einfluss trat am deutlichsten hervor, wenn die Anzahl an Bakterien im Darmtrakt einen Schwellenwert überschreitet. Zum Beispiel wird der Schwellenwert typischerweise etwa 10⁶–10⁸ cfu/g sein. Das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt umfassend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann für die Behandlung von diesem reduzierten Wachstumspotenzial verwendet werden. In anderen Worten, kann das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt umfassend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Anzahl von Bakterien im Darmtrakt von Tieren, insbesondere von Geflügel wie Hähnchen, zu kontrollieren und damit die Gewichtszunahme bei diesen Tieren zu erhöhen. In einer Ausführungsform können das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt umfassend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung diese Bakterium im Darmtrakt dieses Tieres vollständig entfernen. In einer alternativen Ausführungsform können das Lysin und/oder der Wirt die Anzahl dieser Bakterien unter einen Schwellenwert reduzieren, d. h. unter einen Wert, der zu einer Reduktion der Gewichtszunahme des Tiers führt.
Vorzugsweise ist der Wirt gemäß der vorliegenden Erfindung ein mikrobieller Wirt.
Vorzugsweise ist der Wirt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Nahrungsmittel-geeigneter Mikroorganismus.
Vorzugsweise ist der Wirt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Darm-kollonisierender Organismus.
Geeigneter Weise kann der Wirt ein Organismus sein, vorzugsweise ein Mikroorganismus, der allgemein als sicher anerkannt ist (GRAS).
Vorzugsweise ist der mikrobielle Wirt gemäß der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Mikroorganismen von den folgenden Gattungen: Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Pediococcus.
In einem bevorzugten Aspekt ist der mikrobielle Wirt ein Bakterium von einer oder von mehreren der folgenden Spezies: Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus carnosus oder einer verwandten Spezies.
Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure in diesem Wirt ein oder mehrere Signalsequenzen, die die Sekretion der kodierenden Sequenzen des Lysins der vorliegenden Erfindung durch die Wirtszellmembran regeln.
Vorzugsweise liegt das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung in einer im Wesentlichen reinen Form vor.
Vorzugsweise liegt das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung in einer isolierten Form vor.
Vorzugsweise ist das Clostridium-Bakterium, wie hierin genannt, von der Clostridium perfringens Spezies.
Vorzugsweise befindet sich das Clostridium-Bakterium, wie hierin genannt, im Darmtrakt eines Subjekts.
Entsprechend kann das Clostridium-Bakterium in einem Nahrungsmittel oder einem Getränk sein.
Geeigneter Weise kann das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert sein, zum Beispiel durch zufällige oder ortsspezifische Mutagenese.
Obwohl im Allgemeinen alle Molekulartechniken, die hierin genannt sind, in der Technik gut bekannt sind, können Referenzen insbesondere zu Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4. Auflage, John Wiley & Sons, Inc. gemacht werden.
Lysin
Der Begriff „Lysin", wie hierin verwendet, umfasst den Begriff „Endolysin". Der Begriff „Lysin", wie hierin verwendet, meint jedes Agens wie ein Enzym oder ein Toxin, das in der Lage ist Zellen zu lysieren.
Agens
Der Begriff „Agens", wie hierin verwendet, meint ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder einen Wirt transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
Medikament
Der Begriff "Medikament", wie hierin verwendet, umfasst sowohl Medikamente für die humane als auch für die tierische Verwendung in Human- und Veterinärmedizin. Darüber hinaus umfasst der Begriff „Medikament", wie hierin verwendet, ein Produkt, das für die Beimischung in tierisches Futter entwickelt ist, insbesondere für Geflügelfutter.
Behandlung
Es ist zu verstehen, dass alle Referenzen hierin in Bezug auf Behandlung heilende, lindernde und prophylaktische Behandlung einschließen.
Rekombinante Verfahren
Typischerweise kann die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mit Hilfe von rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden.
Aminosäure-Sequenz
Wie hierin verwendet ist der Begriff „Aminosäuresequenz" ein Synonym für den Begriff „Polypeptid" und/oder den Begriff „Protein". In einigen Beispielen ist der Begriff „Aminosäuresequenz" ein Synonym für den Begriff „Peptide". In einigen Beispielen ist der Begriff „Aminosäuresequenz" ein Synonym für den Begriff „Protein".
Die Aminosäuresequenz kann durch Isolierung von einer geeigneten Quelle bereitgestellt werden, oder sie kann synthetisch hergestellt werden, oder sie kann durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken bereitgestellt werden.
In einem Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz zur Verfügung, die ein Lysin ist, das in der Lage ist die Zellwände von pathogenen Clostridium-Bakterien, vorzugsweise von Clostridium perfringens-Bakterien, zu hydrolysieren.
Vorzugsweise umfasst das Lysin die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2.
Vorzugsweise ist das Lysin ein isoliertes Lysin und/oder ein im Wesentlichen isoliertes Lysin und/oder es ist aufgereinigt und/oder es ist im Wesentlichen aufgereinigt und/oder es ist nichtnativ. Somit kann das Lysin in einer reinen oder in einer im Wesentlichen reinen Form vorliegen.
Es wird verstanden werden, dass das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden kann, die den beabsichtigten Zweck des Lysins nicht beeinträchtigen, wobei das Lysin immer noch als rein und/oder isoliert angesehen werden kann.
Nukleotidsequenz
Der hierin verwendete Begriff „Nukleotidsequenz" ist ein Synonym zu dem Begriff „Polynukleotid".
Die Nukleotidsequenz kann eine DNA oder RNA von genomischen oder synthetischen oder rekombinanten Ursprung sein. Die Nukleotidsequenz kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, je nach dem, ob der Sense- oder der Anti-Sense-Strang oder Kombinationen davon dargestellt sind.
Für einige Anwendungen ist die Nukleotidsequenz vorzugsweise DNA.
In einigen Anwendungen wird die Nukleotidsequenz vorzugsweise durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken bereitgestellt (zum Beispiel rekombinante DNA).
Für einige Anwendungen ist die Nukleotidsequenz vorzugsweise cDNA.
Für einige Anwendungen kann die Nukleotidsequenz vorzugsweise dieselbe sein, wie für diesen Aspekt die natürlich vorkommende Form.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert die Nukleotidsequenz ein Lysin, das in der Lage ist, die Zellwand von Clostridium-Bakterien, vorzugsweise Clostridium perfringens-Bakterien, zu hydrolysieren.
Ein Fachmann wird verstehen, dass zahlreiche verschiedene Nukleotidsequenzen auf Grund der Degeneration des genetischen Kodes das gleiche Lysin kodieren können. Darüber hinaus muss verstanden werden, dass ein Fachmann unter Verwendung von Routine-Techniken Nukleotid-Substitutionen durchführen kann, die die Aktivität, kodiert durch die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, nicht im Wesentlichen beeinflussen, um die Kodon-Verwendung von jedem bestimmten Wirtsorganismus wiederzugeben, indem das Ziel exprimiert werden soll. Somit umfassen die Begriffe „Variante", „Homologe" oder „Derivat" in Bezug auf die Nukleotidsequenz, wie in der beigefügten Sequenzliste dargelegt, jede Substitution von, jede Variation von, jede Modifikation von, jeden Austausch von, jede Deletion von oder jede Addition von einer (oder mehreren) Nukleotid-Formen oder von der Sequenz, die durch die resultierende Nukleotidsequenz kodierend zur Verfügung gestellt wird, und ein funktionales Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, selektiv die Sequenzen, die hierin aufgezeigt sind, zu hybridisieren oder die komplementäre Sequenz der oben genannten Sequenz. Nukleotidsequenzen weisen vorzugsweise mindestens eine Länge von 15 Nukleotiden auf, stärker bevorzugt mindestens eine Länge von 20, 30, 40 oder 50 Nukleotiden. Diese Sequenzen können als Sonden, wie in einem diagnostischen Kit, verwendet werden.
Nukleotidsequenzen, die nicht zu 100% homolog zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind, aber ebenfalls in den Bereich der Erfindung fallen, können in einer Vielzahl von Wegen erhalten werden.
Im Wesentlichen reine Form und/oder isolierte Form
Vorzugsweise liegt das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder das Nukleotide, umfassend die Nukleotidsequenz, die für dasselbige kodierend, in einer im Wesentlichen reinen Form oder in einer isolierten Form vor.
Der Begriff „im Wesentlichen reine Form" wird verwendet um zu zeigen, dass die Verbindung, zum Beispiel ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Nukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, zu einem hohen Grad anwesend ist. Die Verbindung, d. h. ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Nukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, ist erwünschter Weise die überwiegende Verbindung, die in einer Zusammensetzung vorliegt. Vorzugsweise ist sie anwesend zu einem Grad von mehr als 30%, von mehr als 50%, von mehr als 75%, von mehr als 90% oder sogar von mehr als 95%, wobei dieser Grad auf einem Trockengewicht/Trockengewichtsbasis in Bezug auf die Berücksichtigung der gesamten Zusammensetzung bestimmt ist.
Bei sehr hohen Graden (zum Beispiel bei Graden von mehr als 90%, von mehr als 95% oder von mehr als 99%) kann die Verbindung als „isoliert" betrachtet werden. Biologisch aktive Substanzen der vorliegenden Erfindung (einschließlich Polypeptide, Nukleinsäuremoleküle, identifizierte/identifizierbare Reste durch Durchmusterung etc.) können in einer Form zur Verfügung gestellt werden, die im Wesentlichen frei von einer oder mehreren Kontaminanten ist, mit der die Substanz anderenfalls verbunden werden könnte. Somit können sie zum Beispiel im Wesentlichen frei sein von einem oder mehreren potenziell kontaminierenden Polypeptiden und/oder Nukleinsäuremolekülen. Sie können in einer Form zur Verfügung gestellt werden, die im Wesentlichen frei von anderen Zellkomponenten (zum Beispiel von Zellmembranen, von Zytoplasma etc.) ist. Wenn eine Zusammensetzung im Wesentlichen frei von einer gegebenen Kontaminante ist, wird die Kontaminante bei einem niedrigen Grad (zum Beispiel bei einem Grad von weniger als 10%, weniger als 5% oder weniger als 1% von dem Trockengewicht/Trockengewichtsbasis, wie oben beschrieben) sein.
Pharmazeutisch zulässiges Salz
Das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einer Form von – und/oder kann verabreicht werden als – ein pharmazeutisch zulässiges Salz – wie ein Säureadditionssalz oder ein Basensalz – oder ein Solvat davon, einschließlich eines Hydrates davon. Für einen Überblick über geeignete Salze siehe Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1–19.
Typischerweise kann ein pharmazeutisch zulässiges Salz leicht durch die Verwendung einer gewünschten Säure oder Base, wie jeweils anwendbar, hergestellt werden. Das Salz kann von einer Lösung präzipitieren und durch Filtration aufgefangen werden oder durch Evaporation des Lösungsmittels gewonnen werden.
Geeignete Säureadditionssalze werden aus Säuren gebildet, die nicht toxische Salze ausbilden wie zum Beispiel Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydrojodid-, Sulfat-, Bisulfat-, Nitrat-, Phosphat-, Hydrogenphosphat-, Acetat-, Maleat-, Fumarat-, Laktat-, Tartrat-, Citrat-, Glukonat-, Succinat-, Saccharat-, Benzoat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, p-Toluolsulfonat- und Pamoat-Salze.
Geeignete Basensalze werden aus Basen gebildet, die nicht toxische Salze ausbilden wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Aluminium-, Kalzium-, Magnesium-, Zink-, Diolamin-, Olamin-, Ethylendiamin-, Tromethamin-, Chloin-, Megulamin- und Diethanolaminsalze. Für Überblicke über geeignete pharmazeutische Salze siehe Berge et al J. Pharm. Sci., 66, 1–19 (1977); Gould P. L., International J. of Pharmaceutics, 33 (1986), 201–217; und Bighley et al., Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology, Marcel Dekker Inc., New York (1996), Vol. 13, Seite 453–497.
Die pharmazeutisch zulässigen Solvate der Verbindung der Erfindung, d. h. von dem Lysin, umfassen die Hydrate davon.
Nachstehende Verbindungen, einschließlich das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend die Nukleotidsequenz, die das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, ihre pharmazeutisch zulässigen Salze, ihre Solvate und Polymorphe, definiert in jedem Aspekt der Erfindung (ohne Zwischenverbindungen in chemischen Prozessen) werden bezeichnet als „Verbindungen der Erfindung" oder „Agenzien der Erfindung".
Isotopische Variationen
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls alle geeigneten isotopischen Variationen des Lysins oder eines pharmazeutisch zulässigen Salzes davon. Eine isotopische Variation eines Lysins der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch zulässigen Salzes davon, ist definiert als eine, in der mindestens ein Atom durch ein Atom ausgetauscht ist, das dieselbe Ordnungszahl hat, aber eine atomare Masse, die sich von der atomaren Masse, die gewöhnlich in der Natur gefunden wird, unterscheidet. Beispiele für Isotope, die in das Agens und in die pharmazeutisch zulässigen Salze davon enthalten können, umfassen Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor und Chlor wie ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F bzw. ³⁶Cl. Bestimmte isotopische Variationen des Agens und der pharmazeutisch zulässigen Salze davon, zum Beispiel solche, in denen ein radioaktives Isotop, wie ³H oder ¹⁴C enthalten sein kann, sind nützlich in Arzneimittel- und/oder Substratgewebeverteilungsstudien. Isotope mit Tritium markiert, d. h. ³H und Kohlenstoff-14, d. h. ¹⁴C, sind besonders bevorzugt wegen ihrer Leichtigkeit der Herstellung und Detektierbarkeit. Ferner können Substitutionen mit Isotopen wie Deuterium, d. h. ²H, therapeutische Vorteile bieten, die aus einer größeren metabolischen Stabilität resultieren, zum Beispiel erhöhte in vivo Halbwertszeit oder reduzierte Dosierungsvoraussetzungen, so dass diese unter einigen Umständen bevorzugt sein können. Isotopische Variationen des Lysins und den pharmazeutisch zulässigen Salzen davon, können im Allgemeinen durch konventionelle Vorgehensweisen, unter Verwendung von geeigneten isotopischen Variationen geeigneter Reagenzien herstellt werden.
Prodrugs
Ein Fachmann wird erkennen, dass das Lysin der vorliegenden Erfindung von einer Prodrug abstammen kann. Beispiele für Prodrugs umfassen Einheiten, die eine bestimmte geschützte Gruppe/mehrere geschützten Gruppen aufweisen und die keine pharmakologische Aktivität als solche ausbilden können, aber in bestimmten Beispielen können sie verabreicht werden (zum Beispiel oral oder parenteral) und anschließend im Körper metabolisiert werden um das Agens zu bilden, das pharmakologisch aktiv ist.
Alle geschützten Derivate und Prodrugs von Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind von dem Bereich der Erfindung umfasst.
Pro-Reste
Es wird ferner erkannt werden, dass bestimmte Reste bekannt als „Pro-Reste" zum Beispiel wie in „Design of Prodrugs" von H. Bundgaard, Elsevier, 1985 beschrieben (die Offenbarung hiervon ist hiermit durch Bezug aufgenommen), können an geeigneten Funktionalitäten der Agenzien platziert werden. Solche Pro-Pharmaka sind ebenfalls von dem Bereich der Erfindung umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die einen therapeutisch wirksamen Anteil des Agens der vorliegenden Erfindung umfasst, d. h. ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch zulässigen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel (einschließlich Kombinationen davon).
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für die humane und tierische Verwendung in Human- und Veterinärmedizin sein und wird typischerweise irgendeinen oder mehr als ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsmittel umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung in Geflügel sein, insbesondere für Hähnchen. Zulässige Träger oder Verdünnungsmittel für therapeutische Verwendung sind gut bekannt auf dem pharmazeutischen Gebiet und sind zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Die Wahl des pharmazeutischen Trägers, Hilfmittels oder Verdünnungsmittels kann ausgewählt werden in Bezug auf den beabsichtigten Weg der Verabreichung und der pharmazeutischen Standard-Praxis. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können umfassen als – oder zusätzlich zu – dem Träger, Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel jedes (jede) geeignete(n) Bindemittel, Schmiermittel, Suspensionsagens(-agenzien), Beschichtungsagens(-agenzien) und lösendes (lösende) Agens (Agenzien) umfassen.
Konservierungsmittel, Stabilisierer, Farbstoffe und sogar Geschmacksagenzien können in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden. Beispiele von Konservierungsmitteln umfassen Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzoesäure. Antioxidantien und Suspensionagenzien können ebenfalls verwendet werden.
Es kann verschiedene Zusammensetzungs-/Formulierungsvoraussetzungen geben, die von den verschiedenen Zuführungssystemen abhängen. Beispielsweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung so formuliert sein, um unter Verwendung einer Minipumpe zugeführt zu werden oder über einen Schleimhautweg, zum Beispiel durch ein Nasenspray oder Aerosol zur Inhalation oder als einnehmbare Lösung oder parenteral, wobei die Zusammensetzung in einer injezierbaren Form für eine Zufuhr, durch zum Beispiel einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert ist. Alternativ kann die Formulierung entwickelt sein um über beide Wege zugeführt zu werden.
Wenn das Agens über die Schleimhaut durch die Magendarmschleimhaut zugeführen wird, sollte es in der Lage sein, während des Transports durch den Magendarmtrakt stabil zu bleiben; zum Beispiel sollte er resistent sein gegen proteolytische Abbau, stabil bei saurem pH und resistent gegen die Detergenzieneffekte der Galle.
Wenn geeignet können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation verabreicht werden, in Form eines Zäpfchen oder Pessariums, oberflächlich in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder Talkpuder, unter Verwendung eines Hautpflaster, oral in Form von Tabletten, die Hilfsmittel wie Stärke und Laktose enthalten, oder in Kapseln oder Ovula entweder allein oder unter Beimengungen von Hilfsmitteln, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Aroma- oder Farbagenzien enthalten, oder sie können parenteral injiziert werden zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan. Für die parenterale Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in der Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die andere Substanzen enthalten kann, zum Beispiel genug Salze und Monosaccharide, um die Lösung isotonisch zu Blut zu machen. Für bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen verabreicht werden, die in einer konventionellen Art formuliert sein können.
Für einige Ausführungsformen können die Agenzien der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Kombination mit Zyklodextrin verwendet werden. Zyklodextrine sind bekannt dafür Inklusions- und nicht-Inklusionskomplexe mit Arzneimittelmolekülen auszubilden. Die Ausbildung eines Arzneimittel-Zyklodextrinkomplexes kann die Löslichkeit, die Auflösungsrate, die Bioverfügbarkeit und/oder die Stabilitätseigenschaft eines Arzneimittelmoleküls modifizieren. Arzneimittel-Zyklodextrinkomplexe sind im Allgemeinen sinnvoll für die meisten Dosierungsformen und Verabreichungswege. Als eine Alternative zur direkten Komplexierung mit dem Arzneimittel kann Zyklodextrin als Hilfszusatz, zum Beispiel als ein Träger, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler verwendet werden. Alpha-, Beta- und Gamma-Zyklodextrine werden am häufigsten verwendet und geeignete Beispiele sind in WO-A-91/11172 , WO-A-94/02518 und WO-A-98/55148 beschreiben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Agenzien der vorliegenden Erfindung systemisch zugeführt (wie oral, bukkal, sublingual), bevorzugter oral. Somit liegt das Agens vorzugsweise in einer Form vor, die für eine orale Zuführung geeignet ist.
Verabreichung
Der Begriff „verabreicht" umfasst die Zuführung durch virale und nicht-virale Techniken. Virale Zuführungsmechanismen umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, adenovirale Vektoren, adenoassoziierte virale (AAV) Vektoren, herpes-virale Vektoren, retrovirale Vektoren, lentivirale Vektoren und bakkulovirale Vektoren. Nicht-virale Zuführungsmechanismen umfassen Lipidvermittelnde Transfektion, Liposome, Immunliposome, Lipofektin, kationische faciale Amphiphillen (CFAs) und Kombinationen davon.
Das Agens der vorliegenden Erfindung, d. h. ein Lysin der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, kann alleine verabreicht werden, wird jedoch im Allgemeinen als eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht – zum Beispiel, wenn das Agens in Beimischung mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsmittel, Lösungsmittel oder Träger, ausgewählt in Bezug auf den beabsichtigten Weg der Verabreichung und pharmazeutischer Standard-Praxis, vorliegt.
Zum Beispiel kann das Agens (zum Beispiel oral oder oberflächlich) in Form von Tabletten, Kapseln, Ovula, Elixieren, Lösungen oder Suspensionen verabreicht werden, die Geschmacks- oder Farbagenzien enthalten können, für sofortige, verzögerte, modifizierte, nachhaltige, pulsierende oder kontrollierte Freigabeanwendungen.
Die Tabletten können Hilfsmittel enthalten, wie mikrokristalline Zellulose, Laktose, Natriumcitrat, Kalziumkarbonat, zweiwertiges Kalziumphosphat und Glycin, Auflöser wie Stärke (vorzugsweise Getreide, Kartoffel oder Tapioka-Stärke), Natrium-Stärke-Glykolat, Croscarmellose-Natrium und bestimmte Komplexsilikate und Granulationsbindemitteln wie Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC), Hydroxypropylzellulose (HPC), Saccharose, Gelatine und Acazien. Zusätzlich können Schmieragenzien wie Magnesiumstearat, Sterinsäure, Glycerylbehenat und Talk umfasst sein.
Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können ebenfalls als Füller in Gelatinekapseln eingesetzt werden. Bevorzugte Hilfsmittel in diesem Bezug umfassen Laktose, Stärke, Zellulose, Milchzucker oder hoch molekulare Polyethylenglykole. Für wässrige Suspensionen und/oder Elixiere, kann das Agens mit verschiedenen Süßungs- oder Geschmacksagenzien, Farbagenzien oder Färbemitteln oder Farbstoffen, mit emulgierenden und/oder suspendierenden Agenzien und mit Lösungsmitteln wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol und Glycerin und Kombinationen davon, kombiniert werden.
Das Agens, d. h. ein Lysin der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in Tierfutter oder Trockenfutter oder als Tierfutter- oder Trockenfutterzusatz verabreicht werden. Insbesondere kann das Lysin der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, in Futter von Geflügel enthalten sein oder zugefügt werden.
Die Wege der Verabreichung (Zuführung) umfassen, sind aber nicht limitiert auf, einen oder mehrere der Folgenden: oral (zum Beispiel als eine Tablette, Kapsel oder eine einnehmbare Lösung), oberflächlich, über eine Schleimhaut (zum Beispiel als Nasenspray oder Aerosol zur Inhalation), nasal, parenteral (zum Beispiel in einer injizierbaren Form), über Magen-Darm, intraspinal, intraperitonal, intramuskulär, intravenös, intrauterin, intraokulär, intradermal, intrakranial, intratracheal, intravaginal, intrazerebroventrikulär, intrazerebral, subkutan, ophtalmisch (einschließlich intravitreal oder intrakameral), transdermal, rektal, bukkal, penil, vaginal, epidural, sublingual.
Es muss verstanden werden, dass ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, nicht über denselben Weg verabreicht werden muss. Wenn die Zusammensetzung mehr als eine aktive Komponente umfasst, können diese Komponenten ebenfalls auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden.
Wird das Agens der vorliegenden Erfindung parenteral verabreicht, dann umfassen Beispiele von solch einer Verabreichung ein oder mehrere der Folgenden: intravenöse, intraarteriale, intraperitonale, intrathekale, intraventrikuläre, intraurethrale, intrasternale, intrakraniale, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung des Agens; und/oder unter Verwendung von Infusionstechniken.
Für parenterale Verabreichung wird das Agens am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, die andere Substanzen enthalten kann, zum Beispiel genug Salze und Glukose, um die Lösung isotonisch zu Blut zu machen. Die wässrigen Lösungen sollten geeigneter Weise wenn notwendig gepuffert sein (vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9). Die Herstellung von geeigneten parenteralen Formulierungen unter sterilen Bedingungen, ist bereits durch pharmazeutische Standard-Techniken etabliert und dem Fachmann gut gekannt.
Wie gezeigt, kann das Agens der vorliegenden Erfindung intranasal oder durch Inhalation verabreicht werden und kann konventionell in Form eines trockenen Puderinhalators oder einer Aerosolenspray-Darreichung aus einem unter Druck stehenden Behälter, Pumpe, Spray oder Zerstäuber mit der Verwendung von einem geeigneten Treibgas, zum Beispiel Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, einem Hydrofluoralkan wie 1,1,1,2-Tetrafluorethan (HFA 134A^TM) oder 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluorpropan (HFA 227EA^TM), Kohlendioxid oder anderen geeigneten Gasen, zugeführt werden. Für den Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch die zur Verfügungstellung von einem Ventil bestimmt werden, um eine gemessene Menge abzugeben. Der unter Druck stehende Behälter, Pumpe, Spray oder Zerstäuber kann eine Lösung oder Suspension der aktiven Verbindung enthalten, zum Beispiel unter Verwendung einer Mischung aus Ethanol und dem Treibgas als Lösungsmittel, das zusätzlich ein Schmiermittel, zum Beispiel Sorbitantrioleat enthalten kann. Kapseln und Patronen (gemacht zum Beispiel aus Gelatine) für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert sein, um einen Pudermix von dem Agens und einer geeigneten Puderbasis, wie Laktose oder Stärke, zu enthalten.
Alternativ kann das Agens der vorliegenden Erfindung in der Form eines Zäpfchens oder Pessars verabreicht werden oder es kann oberflächlich in Form eines Gels, Hydrogels, einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Talkpuder angewendet werden. Das Agens der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls dermal oder transdermal verabreicht werden, zum Beispiel unter Verwendung von einem Hautpflaster. Sie können ebenfalls über pulmonale oder rektale Wege verabreicht werden. Sie können ebenfalls über den okulären Weg verabreicht werden. Für ophtalmische Verwendung können die Verbindungen als mikronisierte Suspensionen in isotonischer, pH-angepasster, steriler Salzlösung oder vorzugsweise als Lösungen in isotonischer, pH-angepasster, steriler Salzlösung, wahlweise in Kombination mit einem Konservierungsmittel wie einem Benzylalkoniumchlorid formuliert werden. Alternativ können sie in einer Salbe wie Petrolat formuliert werden.
Für oberflächliche Anwendung auf der Haut kann das Agens der vorliegenden Erfindung als eine geeignete Salbe formuliert sein, die die aktive Verbindung suspendiert oder gelöst in zum Beispiel einer Mischung mit einem oder mehreren der Folgenden, enthält: Mineralöl, flüssiges Petrolat, weißes Petrolat, Propylenglykol, Polyoxyethylene-, Polyoxypropylen-Verbindung, emulgierendes Wachs und Wasser. Alternativ kann es in einer geeignete Lotion oder Creme formuliert sein, suspendiert oder gelöst in zum Beispiel einer Mischung von einem oder mehreren der Folgenden: Mineralöl, Sorbitanmonostearat, ein Polyethylenglykol, flüssiges Paraffin, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetearylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch direkte Injektion verabreicht werden.
Für einige Anwendungen wird das Agens vorzugsweise oral verabreicht.
Dosierungen
Typischerweise wird ein Arzt oder Tiermediziner die aktuelle Dosis bestimmen, die für ein individuelles Subjekt am besten geeignet ist. Die spezifische Dosierung und Frequenz der Dosierung kann für jedes einzelne Subjekt verändert werden und wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der spezifischen eingesetzten Verbindung, der metabolischen Stabilität und die Länge der Wirkung dieser Verbindung, das Alter, Körpergewicht, allgemeine Gesundheit, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten, die Art und Zeit der Verabreichung, die Häufigkeit der Ausscheidungen, Arzneimittelkombinationen, die Strenge des einzelnen Zustandes und der Therapie, die das Subjekt durchläuft. Das Agens und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können in Übereinstimmung mit einer Kur von 1 bis 10 Mal pro Tag verabreicht werden, wie ein- oder zweimal pro Tag.
Bei oraler und parenteraler Verabreichung bei Menschen oder Tieren kann die tägliche Dosierung des Agens eine Einzeldosis oder getrennte Dosen sein.
Abhängig von dem Bedürfnis kann das Agens mit einer Dosis von 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden, wie von 0,1 bis 10 mg/kg, stärker bevorzugt von 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht. Selbstverständlich sind die Dosierungen, die hierin genannt sind, exemplarisch für den durchschnittlichen Fall. Selbstverständlich kann es individuelle Beispiele geben, bei denen höhere oder geringere Dosierungsbereiche angebracht sind.
Typischerweise beträgt zum Beispiel die tägliche orale Dosis zwischen 20–1000 mg, vorzugsweise zum Beispiel 50 bis 300 mg.
Geeignete Dosen werden solche einschließen, die eine therapeutische Reduktion der Anzahl an pathogenen Bakterien der Gattung Clostridium, insbesondere von C. perfringens-Bakterien, erlauben.
Formulierung
Die Agenzien der vorliegenden Erfindung können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein, wie durch die Mischung mit einem oder mehreren geeigneten Trägern, Lösungsmitteln oder Hilfsmitteln unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet gekannt sind.
Subjekt
Wie hierin beschrieben, bezieht sich der Begriff „Subjekt" auf Wirbeltiere, insbesondere auf Mitglieder der Säugetierspezies. Der Begriff umfasst, ist jedoch nicht limitiert auf, Haustiere, Sporttiere, landwirtschaftlichen Viehbestand, Primaten und Menschen. Der Begriff „landwirtschaftlicher Viehbestand" umfasst Geflügel, zum Beispiel Hähnchen.
Bioverfügbarkeit
Vorzugsweise sind die Verbindungen der Erfindung (und Kombinationen) oral bioverfügbar. Orale Bioverfügbarkeit bezieht sich auf den Anteil eines oral verabreichten Arzneimittels, der den großen Blutkreislauf erreicht. Die Faktoren, die die orale Bioverfügbarkeit eines Arzneimittels bestimmen, sind Auflösung, Membrandurchlässigkeit und metabolische Stabilität. Typischerweise wird eine stufenförmige Durchmusterung von zunächst in vitro-Techniken und dann in vivo-Techniken verwendet, um die orale Bioverfügbarkeit zu bestimmen.
Auflösung, die Löslichkeit des Arzneimittels durch die wässrigen Bestandteile des Magendarmtrakts (GIT), kann an Hand von in vitro-Löslichkeitsexperimenten, durchgeführt bei geeignetem pH um den GIT nachzuahmen, vorhergesagt werden. Vorzugsweise haben die Verbindungen der Erfindung eine minimale Löslichkeit von 50 mcg/ml. Die Löslichkeit kann durch Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden, wie beschrieben in Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3–25, 1997.
Membrandurchlässigkeit bezieht sich auf den Durchlass der Verbindung durch die Zellen des GIT. Lipophilie ist eine Schlüsseleigenschaft bei der Vorhersage von dieser und ist definiert durch in vitro Log D_7,4-Messungen unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln und Puffer. Vorzugsweise weisen die Verbindungen der Erfindung einen Log D_7,4 von –2 bis +4 auf, stärker bevorzugt von –1 bis +2. Der Log D kann durch Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden wie beschrieben in J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42: 144.
Einschichtige Zelluntersuchungen wie CaCO₂ tragen wesentlich dazu bei, bevorzugte Membrandurchlässigkeiten in der Anwesenheit von Effluxtransportern wie p-Glykoprotein, sog. caco-2-Flux, vorherzusagen. Vorzugsweise haben die Verbindungen der Erfindung einen caco-2-Flux von mehr als 2 × 10^–6 cms^–1, stärker bevorzugt von mehr als 5 × 10^–6 cms^–1. Der caco-Flux-Wert kann durch Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, bestimmt werden wie beschrieben in J. Pharm. Sci, 1990, 79, 595–600.
Metabolische Stabilität behandelt die Fähigkeit des GIT oder der Leber Verbindungen während des Absorptionsprozesses zu metabolisieren: Der erste Durchgangseffekt. Untersuchungssysteme wie Mikrosome, Hepatozyten etc. sind vorhersehbar für metabolische Anfälligkeit. Vorzugsweise zeigen die Agenzien der vorliegenden Erfindung metabolische Stabilität in dem Untersuchungssystem, das einer hepatischen Extraktion von weniger als 0,5 entspricht. Beispiele für Untersuchungssysteme und Datenhandhabung sind beschrieben in Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 201, 4, 36–44, Drug Met. Disp., 2000, 28, 1518–1523.
Aufgrund der Wechselwirkungen der oben beschriebenen Prozesse kann eine weitere Bestätigung, dass ein Arzneimittel in Menschen oral verfügbar sein kann, durch in vivo-Experimente in Tieren erlangt werden. Die absolute Bioverfügbarkeit wird in diesen Studien durch die Verabreichung des Agens getrennt oder in Mischungen über den oralen Weg bestimmt. Für absolute Bestimmungen (% absorbiert) wird auch der intravenöse Weg eingesetzt. Beispiele für die Bemessung von oraler Bioverfügbarkeit in Tieren kann in Drug Met. Disp., 2001, 29, 82–87; J. Med Chem, 1997, 40, 827–829, Drug Med. Disp., 1999, 27, 221–226 gefunden werden.
Chemische Syntheseverfahren
Das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch chemische Synthesetechniken hergestellt werden.
Das Lysin oder Varianten, Homologe, Derivate, Fragmente oder Mimetika davon können unter Verwendung von chemischen Verfahren hergestellt werden, um das Agens als Ganzes oder in Teilen zu synthetisieren. Zum Beispiel können Peptide durch feste Phasentechniken synthetisiert werden, von dem Granulat abgespalten werden und durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (zum Beispiel Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY) aufgereinigt werden. Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalysen oder Sequenzierung bestätigt werden (zum Beispiel das Edman-Abbau Verfahren; Creighton, supra).
Die direkte Synthese des Lysins oder Varianten, Homologen, Derivaten, Fragmenten oder Mimetika davon, kann unter Verwendung von verschiedenen Festphasen-Techniken durchgeführt werden (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202–204) und eine automatisierte Synthese kann zum Beispiel unter Verwendung des ABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) in Übereinstimmung mit den Instruktionen, die durch den Hersteller zur Verfügung gestellt werden, erreicht werden. Darüber hinaus können die Aminosäuresequenzen, die das Agens oder irgendeinen Teil davon umfassen, während der direkten Synthese verändert werden und/oder unter Verwendung von chemischen Verfahren mit einer Sequenz von anderen Untereinheit oder irgendeinem Teil davon, kombiniert werden, um ein abweichendes Agens zu produzieren.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die kodierende Sequenz des Lysins oder Varianten, Homologen, Derivaten, Fragmenten oder Mimetika davon, als Ganzes oder als Teil unter Verwendung von chemischen Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden (siehe Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215–23, Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225–232).
Mimetikum
Der Begriff „Mimetikum", wie hierin verwendet, betrifft jede Chemikalie einschließlich, aber nicht limitiert ist auf, ein Peptid, Polypeptid, Antikörper oder eine andere organische Chemikalie, die dieselbe qualitative Aktivität oder denselben qualitativen Effekt wie ein Bezugsagens aufweist. Das bedeutet, dass ein Mimetikum ein funktionales Äquivalent eines bekannten Agens sein kann.
Chemisches Derivat
Der Begriff „Derivat" oder „derivatisiert", wie hierin verwendet, umfast chemische Modifikationen eines Agens. Veranschaulichung von solchen chemischen Modifikationen würde der Austausch von Wasserstoff durch eine Halogen-Gruppe, eine Alkyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe oder eine Amino-Gruppe sein.
Chemische Modifikation
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Lysin ein chemisch modifiziertes Lysin sein.
Die chemische Modifikation eines Lysins kann entweder die Wasserstoffbrückeninteraktion, Ladungsinteraktion, hydrophobische Interaktion, Van-der-Waals-Interaktion oder Dipol-Interaktion zwischen dem Agens und dem Ziel erhöhen oder reduzieren.
In einem Aspekt kann das identifizierte Lysin als ein Modell (zum Beispiel als eine Vorlage) für die Entwicklung von anderen Verbindungen dienen.
Vektor
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung direkt dem Subjekt verabreicht werden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor umfassend eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin der vorliegenden Erfindung kodiert, dem Subjekt verabreicht.
Vorzugsweise wird das rekombinante Agens unter Verwendung eines genetischen Vektors hergestellt und/oder an den Zielort geliefert.
Wie gut auf dem Gebiet bekannt ist, ist ein Vektor ein Mittel, das den Transfer von einer Einheit aus einer Umgebung zu einer anderen erlaubt oder fördert. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und als Beispiel erlauben einige Vektoren, die in rekombinanten DNA-Techniken verwendet werden, Einheiten wie einen DNA-Abschnitt (wie ein heterologer DNA-Abschnitt, wie ein heterologer cDNA-Abschnitt) in einen Wirt und/oder eine Zielzelle für den Zweck der Replikation des Vektors zu transportieren, der die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung und/oder der die Proteine der Erfindung, die durch die Nukleotidsequenz der Erfindung kodiert werden, umfasst. Beispiele für Vektoren, die in rekombinanten DNA-Techniken verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, Plasmide, Chromosomen, künstliche Chromosomen oder Viren.
Der Begriff „Vektor" umfasst Expressionsvektoren und/oder Transformationsvektoren.
Der Begriff „Expressionsvektor" meint ein Konstrukt, das in der Lage ist, in vivo oder in vitro/ex vivo zu exprimieren.
Der Begriff „Transformationsvektor" meint ein Konstrukt, das in der Lage ist, von einer Spezies in eine andere übertragen zu werden.
Nackte DNA
Die Vektoren, die die Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin der vorliegenden Erfindung, umfassen, können direkt als „ein nacktes Nukleinsäurekonstrukt" verabreicht werden, vorzugsweise ferner umfassend flankierende Sequenzen, die homolog zu dem Wirtszellgenom sind.
Der Begriff „nackte DNA", wie hierin verwendet, betrifft ein Plasmid umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Agens der vorliegenden Erfindung zusammen mit einer kurzen Promotorbereich, um deren Produktion zu regeln, kodiert. Es wird „nackte" DNA genannt, da das Plasmid nicht in irgendeinem Übertragungsvehikel getragen wird. Wenn ein solches DNA-Plasmid in eine Wirtszelle eindringt, wie in eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle, werden die Proteine, die es kodiert (wie ein Agens der vorliegenden Erfindung) innerhalb der Zelle transkribiert und translatiert.
Nicht-virale Zufuhr
Alternativ können die Vektoren, die eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder ein Lysin der vorliegenden Erfindung umfassen, unter Verwendung von einer Vielzahl von nicht-viralen Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie Transfektion, Transformation, Elektroporation und biolistischer Transformation, in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden.
Der hierin verwendete Begriff „Transfektion" betrifft ein Verfahren unter Verwendung von einem nicht-viralen Vektor, um ein Gen an eine Säugetierzielzelle zu liefern.
Typische Transfektionsverfahren umfassen Elektroporation, DNA-Biolistik, Flüssigkeitsvermittelnde Transfektion, komprimierte DNA-vermittelnde Transfektion, Liposome, Immunliposome, Lipofektin, kationische Agensvermittler, kationische faciale Amphiphile (CFAs) (Nature Biotechnology 1996, 14; 556), mehrwertige Kationen wie Spermin, kationische Flüssigkeiten oder Polylysine, 1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)-Propan (DOTAP)-Cholesterol-Komplexe (Wolff und Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16: 421) und Kombinationen davon.
Die Aufnahme von nackten Nukleinsäurekonstrukten durch Säugetierzellen wird durch verschiedene bekannte Transfektionstechniken gefördert zum Beispiel solche, die die Verwendung von Transfektionsagenzien umfassen. Beispiele für diese Agenzien umfassen kationische Agenzien (zum Beispiel Kalziumphosphat und DEAE-Dextran) und Lipofektane (zum Beispiel Lipofektam^TM und Transfektam^TM). Typischerweise sind Nukleinsäurekonstrukte mit dem Transfektionsagens gemischt, um eine Zusammensetzung herzustellen.
Virale Vektoren
Alternativ können die Vektoren, die ein Agens der vorliegenden Erfindung oder eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, in geeignete Wirtszellen unter Verwendung von einer Vielzahl von viralen Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, eingebracht werden, wie zum Beispiel die Infektion mit rekombinanten viralen Vektoren wie Retroviren, Herpes-Simplex-Viren und Adenoviren.
Vorzugsweise ist der Vektor ein rekombinanter viraler Vektor. Geeignete rekombinante virale Vektoren umfassen, sind aber nicht limitiert auf, Adenvirus-Vektoren, Adeno-assoziierte virale (AAV)-Vektoren, Herpesvirus-Vektoren, ein retroviraler Vektor, lentivirale Vektoren, baculovirale Vektoren, Pockenvirus-Vektoren oder Parvovirus-Vektoren (siehe Kestler et al 1999 Human Gene Ther (10)10: 1619–32). Für den Fall von viralen Vektoren ist die Zufuhr der Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Agens der vorliegenden Erfindung kodiert, vermittelt durch virale Infektion einer Zielzelle.
Zielorientierter Vektor
Der Begriff „zielorientierter Vektor" betrifft einen Vektor, dessen Fähigkeit eine Zelle zu infizieren/transfizieren/transduzieren oder in einem Wirt und/oder einer Zielzelle exprimiert zu werden auf bestimmte Zelltypen innerhalb des Wirtsorganismus begrenzt ist. Typischerweise ist die Fähigkeit auf Zellen begrenzt, die einen gemeinsamen oder ähnlichen Phänotyp haben.
Replikationsvektoren
Die Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin der vorliegenden Erfindung kodiert, kann in einem rekombinanten Replikationsvektor eingeschlossen sein. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleotidsequenz in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, um Nukleinsäuren herzustellen, die die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen. Dieses Verfahren umfasst das Einbringen einer Nukleinsäure, umfassend die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, in einen replizierbaren Vektor, das Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und das Wachsen der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Vektors hervorbringen. Der Vektor kann von der Wirtszelle gewonnen werden.
Expressionsvektor
Vorzugsweise ist ein Lysin der vorliegenden Erfindung oder eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, die in einen Vektor eingeschlossen ist, operabel mit einer Kontrollsequenz verknüpft, die in der Lage ist, die Expression der kodierten Sequenz durch die Wirtszelle zur Verfügung zu stellen, d. h. der Vektor ist ein Expressions-Vektor. Der Begriff „operabel verknüpft" betrifft eine Nachbarschaft, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz „operabel verknüpft" mit einer kodierenden Sequenz wird in solch einer Art ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die kompatible zu den Kontrollsequenzen sind. Der Begriff „regulatorische Sequenzen" umfasst Promotoren und Enhancer und andere Expressions-Regulationssignale.
Eine erweiterte Expression des Polynukleotids, das das Polypeptid der Erfindung kodiert, kann auch durch die Auswahl von heterologen regulatorischen Bereichen erreicht werden, zum Beispiel durch Promotor, Leadersequenz für die Sekretions und Terminator-Bereiche, die dazu dienen die Expression und, falls gewünscht, den Sekretionsgrad des Proteins von Interesse von dem ausgewählten Expressionswirt zu erhöhen und/oder die induzierbare Kontrolle der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen.
Ein Lysin der vorliegenden Erfindung, das durch eine rekombinante Wirtszelle hergestellt ist, kann abhängig von der Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor ausgeschieden werden oder intrazellulär enthalten sein. Ein Fachmann wird erkennen, dass Expressionsvektoren, die kodierende Sequenzen eines Agens der vorliegenden Erfindung enthalten, mit Signalsequenzen entwickelt werden können, die die Sekretion der kodierenden Sequenzen des Lysins der vorliegenden Erfindung durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran führen.
Promotoren
Abgesehen von dem nativen Promotor für das Gen des Polypeptids der Erfindung, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des Polypeptids der Erfindung zu lenken.
Der Promotor kann ausgewählt sein aufgrund seiner Effizienz bei der Lenkung der Expression des Polypeptids der Erfindung in dem gewünschten Expressionswirt.
In einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt sein, um die Expression des gewünschten Polypeptids der Erfindung zu lenken. Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die bevorzugt für die Verwendung in Pilzexpressionswirten sind, sind solche, die von den Pilzgenen für Xylanase (xlnA)-, Phytase-, ATP-Synthease-, Untereinheit 9 (oliC)-, Triose-Phosphat-Isomerase (tpi)-, Alkohol-Dehydrogenase (AdhA, α-Amylase (amy)-, Amyloglukosidase-(AG – von dem glaA-Gen), Acetamidase (amdS)- und Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (gpd)-Promotoren erhältlich sind.
Beispiele für starke Hefepromotoren sind solche, die von den Genen für Alkohol-Dehydrogenase, Laktase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphat-Isomerase erhältlich sind.
Beispiele für starke bakterielle Promotoren sind die α-Amylase und SP02-Promotoren sowie Promotoren von extrazellulären Protease-Genen.
Hybridpromotoren können ebenfalls verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Expression in vitro
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in eine geeignete Wirtszelle und/oder Zielzelle transformiert oder transfiziert werden, wie unten beschrieben, um die Expression eines Lysins der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen. Das Verfahren kann die Kultivierung einer Wirtszelle und/oder einer Zielzelle, transformiert mit einem Expressionsvektor, unter Bedingungen umfassen, um die Expression durch den Vektor der kodierenden Sequenz kodierend ein Lysin der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen und optional die Gewinnung des exprimierten Agens der vorliegenden Erfindung. Die Vektoren können zum Beispiel ein Plasmid oder Virusvektoren sein, versehen mit einem Ursprung der Replikation, optional einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und optional einem Regulator des Promotors. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-resistentes Gen für den Fall eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycon-resistentes Gen für einen Säugetiervektor. Die Expression von einem Agens der vorliegenden Erfindung oder eines Zieles der vorliegenden Erfindung kann konstitutiv sein, so dass sie kontinuierlich produziert werden, oder induzierbar, so dass sie eine Anregung benötigen, um die Expression zu starten. Für den Fall einer induzierbaren Expression, kann die Produktion eines Agens der vorliegenden Erfindung oder eines Ziels, wenn erforderlich, durch zum Beispiel die Zugabe von einer induzierbaren Substanz zu dem Kulturmedium, zum Beispiel Dexamethasan oder IPTG, gestartet werden.
Leadersequenz für die Sekretion
Oft ist es für das Polypeptid der Erfindung gewünscht, dass es von dem Expressionswirt in ein Kulturmedium sekretiert wird, von wo das Polypeptid der Erfindung leichter gewonnen werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die native Leadersequenz für die Sekretion des Polypeptids der Erfindung verwendet werden, um die Sekretion des exprimierten Polypeptids der Erfindung zu bewirken. Die Erhöhung der Expression des Polypeptids der Erfindung führt jedoch manchmal zu der Produktion des Proteins in Bereichen über denen, die der Expressionswirt herzustellen und sekretieren kann, was zu einem Engpass führt, so dass das Proteinprodukt innerhalb der Zelle akkumuliert. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung heterologe Leadersequenzen zur Verfügung, um die am effizienteste Sekretation des Polypeptids der Erfindung von den ausgewählten Expressionswirten zur Verfügung zu stellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Leadersequenz für die Sekretion auf der Basis des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Es kann eine heterologe Leadersequenz für die Sekretion ausgewählt werden, der homolog in Bezug auf andere regulatorische Bereiche des Expressionskonstrukts ist. Zum Beispiel kann die Leadersequenz des hochsekretierten Amyloglukosidase (AG)-Proteins in Kombination mit dem Amyloglukosidase (AG)-Promotor an sich, genauso wie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybridsignalsequenzen können ebenfalls im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele für bevorzugte heterologe Leadersequenzen für die Sekretion sind solche, die von dem Pilz Amyloglukosidase (AG)-Gen (glaA – sowohl 18 als auch 24 Aminosäureversionen zum Beispiel von Aspergillus), dem α-Faktorgen (Hefen zum Beispiel Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylase-Gen (Bacillus) abstammen.
Fusionsproteine
Das Lysin der vorliegenden Erfindung kann als ein Fusionsprotein exprimiert werden, um die Extraktion und Aufreinigung und/oder die Zufuhr des Lysins der vorliegenden Erfindung bei einem Subjekt zu unterstützen. Beispiele für Fusionsproteinpartner umfassen Glutathion-S-Transferase (GST), 6 × His, GALA (DNA-Bindungs- und/oder transkriptionale Aktivierungsdomäne) und β-Galaktosidase. Es kann außerdem dienlich sein um die Entfernung der Fusionsproteinsequenz zu erlauben eine proteolytische Spaltungsstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz von Interesse einzufügen. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität des Lysins nicht behindern.
Das Fusionsprotein kann ein Antigen oder eine antigene Determinante verbunden mit der Substanz der vorliegenden Erfindung umfassen. In dieser Ausführungsform kann das Fusionsprotein ein nicht natürlich vorkommendes Fusionsprotein sein, das eine Substanz umfasst, die in dem Sinne der zur Verfügungstellung einer generalisierten Stimulation des Immunsystems als ein Hilfsmittel agiert. Das Antigen oder die antigene Determinante kann entweder an den Amino- oder den Carboxyterminus der Substanz angehängt sein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Aminosäuresequenz an eine heterologe Sequenz ligiert sein, um ein Fusionsprotein zu kodieren. Es kann zum Beispiel für die Durchmusterung von Peptiddatenbanken von Agenzien, die in der Lage sind, die Substanzaktivität zu beeinflussen, sinnvoll sein, eine chimäre Substanz zu kodieren, die ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem kommerziell verfügbaren Antikörper erkannt wird.
Wirtszellen
Eine breite Vielzahl von Wirtszellen kann für die Expression der Nukleotidsequenzen verwendet werden, die das Lysin der vorliegenden Erfindung kodieren. Diese Zellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen sein. Somit stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung zur Verfügung, das die Kultivierung einer Wirtszelle transformiert oder transfiziert mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, unter Bedingungen, um die Expression durch den Vektor einer kodierenden Sequenz, die das Polypeptid kodiert, und die Gewinnung des exprimierten Polypeptids umfasst. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien wie Escherichia coli, Lactobacillus spp., Bacillus spp. und Lactococcus spp, Hefe, faserartige Pilze, Insektenzellen, Säugetierzellen, typische immortalisierte zum Beispiel Mäuse-, CHO-, humane und Affenzelllinien und Derivate davon.
Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Ursprung der Replikation, optional einem Promotor für die Expression des Polypeptids und optional einem Regulator des Promotors, versehen sind. Die Vektoren können einen oder mehrere selektierbare Markergene enthalten. Die am besten geeigneten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind solche, die von der Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation in dem Wirtsorganismus erfordern. Beispiele für Pilzselektionsmarker sind die Gene für Acetamidase (amdS), ATP-Synthease, Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase (pvrA), Phleomycin und Benomylresistenz (benA). Beispiele für nicht-Pilz-Selektionsmarker sind das bakterielle G418-resistente Gen (dieses kann ebenfalls in Hefen verwendet werden, aber nicht in Pilzen), das Ampicillin-resistente Gen (E. coli), das Neomycin-resistente Gen (Bacillus) and das E. coli uidA-Gen, kodierend für β-Glukoronidase (GUS). Die Vektoren können in vitro zum Beispiel für die Produktion von RNA verwendet werden oder um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Wirtszellen zur Verfügung, die transformiert oder transfiziert sind mit einem Polynukleotid der Erfindung. Vorzugsweise werden diese Polynukleotide in einem Vektor für die Replikation und Expression des Polynukleotids getragen. Die Zellen werden ausgewählt um kompatibel zu dem Vektor zu sein, und können zum Beispiel prokaryotische (zum Beispiel bakterielle), Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
Bakterien der Gattung Bacillus und Lactobacillus sind als heterologe Wirte aufgrund ihrer Fähigkeit Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren sehr geeignet. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind solche der Gattung Lactoccus.
Abhängig von der Natur des Polynukleotids, das das Polypeptid der Erfindung kodiert, und/oder dem Bedürfnis weiteren Behandlung des exprimierten Proteins, können eukaryotische Wirte wie Hefen oder Pilze bevorzugt werden. Im Allgemeinen werden Hefezellen vor Pilzzellen bevorzugt, da sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch entweder schlecht von der Hefezelle sekretiert oder in einigen Fällen lassen sie sich nur schlecht weiterbehandeln (zum Beispiel Hyperglykolysation in Hefe). Bei diesen Beispielen sollte eine Pilzwirtszelle ausgewählt werden.
Ein heterologer Wirt kann ebenfalls gewählt werden, wobei das Polypeptid der Erfindung in einer Form produziert wird, die im Wesentlichen frei von anderen Lysinen ist. Dieses kann durch die Auswahl eines Wirts erreicht werden, der normalerweise solche Agenzien nicht produziert.
Beispiele für bevorzugte Expressionswirte innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie Bacillus-Spezies und Lactobacillus-Spezies; und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies und Saccharomyces-Spezies.
Besonders bevorzugte Expressionswirte können ausgewählt werden aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Produktion des Polypeptids der Erfindung durch die Kultivierung in einem konventionellen Nährstofffermentationsmedium von mikrobiellen Expressionswirten beeinflusst werden, die mit einem oder mehreren Polypeptiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden.
Das Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kultivierungsmedium umfassen, das eine Kohlenstoffquelle (zum Beispiel Glukose, Maltose, Molasse etc.), eine Stickstoffquelle (zum Beispiel Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid etc.), eine organische Stickstoffquelle (zum Beispiel Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton etc.) und inorganische Nährstoffquellen (zum Beispiel Phosphat, Magnesium, Natrium, Zink, Eisen etc.) enthält. Wahlweise kann ein Induzierer zugefügt werden.
Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl der Expressionswirte und/oder auf regulatorischen Voraussetzungen des Expressionskonstrukts basieren. Solche Medien sind einem Fachmann gut bekannt. Das Medium kann, wenn gewünscht, zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber anderen potenziellen kontaminierenden Mikroorganismen favorisieren.
Nach der Fermentation können die Zellen aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Nach der Entfernung der Zellen können die verschiedenen Polypeptide der Erfindung gewonnen werden und, wenn gewünscht, mit Hilfe von konventionelle Mitteln aufgereinigt und isoliert werden.
Organismen
Der Begriff „Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfasst jeden Organismus, der eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder Produkte erhalten davon, umfassen kann, wobei eine transkriptionale regulatorische Sequenz die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung erlauben kann, wenn sie im Organismus anwesend ist. Geeignete Organismen können eine Prokaryote, einen Pilz, eine Hefe oder eine Pflanze umfassen. Ein bevorzugter Organismus kann ein Bakterium sein, vorzugsweise der Gattung Lactobacillus, stärker bevorzugt Lactobacillus acidophilus.
Der Begriff „transgener Organismus" in Bezug auf die vorliegende Erfindung umfasst jeden Organismus, der die Nukleinsäure umfassend die Nukleotidsequenz kodierend für das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder Produkten erhalten davon umfasst, wobei die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung innerhalb des Organismus erlauben können. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz im Genom des Organismus enthalten.
Der Begriff „transgener Organismus" schließt keine nativen Nukleotide ein, die Sequenzen in ihrer natürlichen Umgebung kodieren, wenn sie unter der Kontrolle von ihrem nativen Promotor sind, der ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt.
Deshalb umfasst der transgene Organismus der vorliegenden Erfindung einen Organismus, der irgend etwas von, oder Kombination von, der Nukleotidsequenz kodierend für die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, der Konstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung (einschließlich Kombinationen davon), der Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung, der Plasmide gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, der Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung oder der Produkte davon umfasst. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus kann akzeptable Mengen der gewünschten Verbindung herstellen, die einfach von der Zelle oder dem Organismus gewonnen werden können.
Transformation der Wirtszellen/Wirtsorganismen
Wie vorher gezeigt, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder eukaryotischer Organismus sein. Beispiele für geeignete prokaryotische Wirte umfassen E. coli, Bacillus subtilis oder Lactobacillus acidophilus. Lehren zur Transformation von prokaryotischen Wirten sind auf dem Gebiet gut dokumentiert, siehe zum Beispiel Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
Wird ein prokaryotischer Wirt verwendet, dann kann es notwendig sein die Nukleotidsequenz vor der Transformation geeignet zu modifizieren – wie durch die Entfernung von Introns.
In einer anderen Ausführungsform kann der transgene Organismus Hefe sein. In diesem Bezug ist Hefe ebenfalls vielfältig als Vehikel für heterologe Genexpression verwendet worden. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Geschichte in der industriellen Verwendung einschließlich ihrer Verwendung für heterologe Genexpression. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., eds, S. 401–429, Allen und Unwin, London) und von King et al (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E F Walton und G T Yarronton, eds, S. 107–133, Blackie, Glasgow) besprochen.
Aus verschiedenen Gründen ist Saccharomyces cerevisiae gut für die heterologe Genexpression geeignet. Zunächst ist sie beim Menschen nicht pathogen und nicht in der Lage bestimmte Endotoxine zu produzieren. Zweitens hat sie eine lange Geschichte sicherer Verwendung gefolgt von Jahrhunderten von kommerzieller Verwertung für verschiedene Zwecke. Dieses hat zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens haben die ausgiebige kommerzielle Verwendung und die gewidmete Forschung an dem Organismus zu einer Fülle von Wissen über die Genetik und Physiologie, genauso wie großtechnische Fermentationscharakteristiken, von Saccharomyces cerevisisae geführt.
Ein Überblick über die Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion von Genprodukten ist von E Hinchcliffe E Kenny gegeben (1993, „Yeast as a vehicle fort he expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose und J Stuart Harrison, eds, 2. Auflage, Academic Press Ltd.).
Mehrere Typen von Hefevektoren einschließlich integrativer Vektoren, die die Rekombination mit dem Wirtsgenom für den Fortbestand benötigen, und autonome replizierende Plasmidvektoren sind verfügbar.
Um die transgene Saccharomyces herzustellen werden Expressionskonstrukte durch das Einfügen der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in ein Konstrukt, das für die Expression in Hefe entwickelt wurde, herstellt. Etliche Typen von Konstrukten, die für die heterologe Expression verwendet werden, sind entwickelt worden. Die Konstrukte enthalten einen Promotor, der in Hefe aktiv ist, und der an die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung fusioniert ist, wobei üblicher Weise ein Promotor von Hefeursprung verwendet wird wie der GAL1-Promotor. Üblicher Weise wird eine Signalsequenz von Hefeursprung verwendet, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid kodiert. Ein in Hefe aktiver Terminator schließt das Expressionssystem ab.
Für die Transformation von Hefe wurden etliche Transformationsprotokolle entwickelt. Zum Beispiel kann eine transgene Saccharomyces gemäß der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Lehren von Hinnen et al (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163–168) hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung von verschiedenen selektiven Marker ausgewählt. Unter den Marker, die für die Transformation verwendet werden, befinden sich eine Anzahl von auxotrophischen Marker wie LEU2, HIS4 und TRP1 und dominante antibiotisch-resistente-Marker, wie die Aminoglukosid-antibiotischen-Marker, zum Beispiel G418.
Ein anderer Wirtsorganismus ist eine Pflanze. Das Grundprinzip für die Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen ist es, genetische Information in das Pflanzengenom einzubringen, um eine stabile Beibehaltung des eingebrachten genetischen Materials zu erhalten. Zur Einbringung der genetischen Information existieren etliche Techniken, wobei die zwei Hauptprinzipien auf das direkte Einbringen von genetischer Information und das Einbringen von genetischer Information durch die Verwendung von einem Vektorsystem gerichtet sind. Ein Überblick über die allgemeinen Techniken kann in den Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27) gefunden werden. Weitere Lehren in Bezug auf die Transformation von Pflanzen können in EP-A-0449375 gefunden werden.
Reporter
Eine große Anzahl von Reporter können in Nachweisverfahren und Untersuchungsverfahren (genauso wie Durchmusterungen) der vorliegenden Erfindung mit bevorzugten Reporter, die konventionelle detektierbare Signale (zum Beispiel durch Spektroskopie) zur Verfügung stellen, verwendet werden. Als Beispiel kann ein Reportergen ein Enzym kodieren, das eine Reaktion mit veränderten Lichtabsorptionseigenschaften katalysiert.
Beispiele für Reportermoleküle umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, β-Galaktosidase, Invertase, grünes Fluoreszenzprotein, Luciferase, Chloramphenicol, Acetyltransferase, β-Glukoronidase, Exoglukanase und Glukoamylase. Alternativ können radiomarkierte Nukleotide oder Nukleotide mit einer Fluoreszenz-Tag-Markierung in im Entstehen begriffene Transkripte eingebaut werden, die dann identifiziert werden, wenn sie an Oligonukleotid-Sonden binden.
In dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann das Lysin oder ein Teil davon durch genetische translationale Fusion direkt oder indirekt an einen Reporter gebunden sein, geeigneter Weise an ein fluoreszierendes Protein (wie zum Beispiel grünes Fluoreszenzprotein).
Für den Nachweis und die Messung der Expression eines Proteins sind eine Vielzahl von Protokollen auf dem Gebiet bekannt, wie die Verwendung von entweder polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, die spezifisch für das Protein sind. Beispiele umfassen Enzymverknüpfte Immunsorptions-Untersuchungen (ELISA), Radioimmun-Untersuchungen (RIA) und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Eine zweiseitige monoklonal-basierte Immun-Untersuchung, die monoklonale Antikörper verwendet, die reaktiv auf zwei nicht-interferrierende Epitope an Polypeptiden sind, ist bevorzugt, aber auch eine kompetative Bindungsuntersuchung kann verwendet werden. Diese und andere Untersuchungen sind unter anderem beschrieben in Hampton R et al (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddow DE et al (1983, J Exp Med 15 8: 121 1).
Die Produktion des Reportermoleküls kann durch enzymatische Aktivität des Reportergenprodukts, wie β-Galaktosidase, gemessen werden.
Eine große Vielzahl von Markierungs- und Konjugationstechniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und können in etlichen Nuklein- und Aminosäureuntersuchungen verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisations- oder PCR-Sonden zur Detektion der Zielpolynukleotidsequenzen umfassen Oligomarkierung, Nick-Translation, End-Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotids. Alternativ kann die kodierende Sequenz oder jeder Teil davon in einem Vektor für die Produktion von einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet bekannt, kommerziell verfügbar und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch das Zufügen von einer geeigneten RNA-Polymerase wie T7, T3 oder SP6 und markierten Nukleotiden zu synthetisieren.
Eine Anzahl von Unternehmen wie Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madions, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) stellen kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren zur Verfügung. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen solche Radionuklid-, Enzyme-, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder chromogene Agenzien genauso wie Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und Ähnliches. Patente, die die Verwendung von solchen Markierungen lehren, umfassen US-A-3817837 ; US-A-3850752 ; US-A-3939350 ; US-A-3996345 ; US-A-4277437 ; US-A-4275149 und US-A-4366241 . Es können ebenfalls rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, wie in US-A-4816567 gezeigt.
Zusätzliche Verfahren um die Expression von einem bestimmten Molekül zu quantifizieren umfassen Radiomarkierung (Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159: 235–44) oder Biotinylierung (Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229–36) von Nukleotiden, Koamplifikation von einer Kontrollnukleinsäure und Standardkurven, auf denen experimentelle Ergebnisse interpoliert werden. Die Quantifizierung von verschiedenen Proben kann durch das Laufen der Untersuchungen in einem ELISA-Format beschleunigt werden, wobei das Oligomer von Interesse in mehreren Verdünnungen dargeboten wird, und eine spektrophometrische oder kalorimetrische Antwort eine schnelle Quantifizierung ergibt.
Obwohl die Anwesenheit/Abwesenheit von einer Marker-Gen-Expression andeutet, dass das Gen von Interesse ebenfalls anwesend ist, sollte seine Anwesenheit und Expression bestätigt werden. Wenn die Nukleotidsequenz innerhalb einer Marker-Gen-Sequenz eingesetzt wird können beispielsweise rekombinante Zellen, die dieselbe enthalten, durch die Abwesenheit der Marker-Gen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Marker-Gen hinter einer Zielkodierenden Sequenz unter der Kontrolle von einem einzelnen Promotor platziert werden. Die Expression des Marker-Gens als Antwort auf die Induktion oder Selektion zeigt gewöhnlich ebenfalls die Expression des Ziels.
Alternativ können Wirtszellen, die die kodierende Sequenz für das Ziel enthalten und die Zielkodierenden Bereiche exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisation und Protein-Bio-Untersuchungen oder Immununtersuchungstechniken, die Membran-basierende, Lösungs-basierende oder Chip-basierende Technologien für den Nachweis und/oder die Quantifikation der Nukleinsäure oder des Proteins umfassen.
Durchmusterungen
Irgendein oder mehrere der geeigneten Ziele – wie eine Probe ein oder mehrere pathogene Clostridium-Bakterien, insbesondere ein C. perfringens-Bakterium, umfasst – können in jeder in einer Vielzahl von Arzneimittel-Durchmusterungs-Techniken für die Identifizierung eines Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Ziel, das in solch einem Test verwendet wird, kann frei in Lösung, befestigt an einen festen Träger, getragen auf einer Zelloberfläche oder intrazellulär lokalisiert sein. Das Ziel kann ebenfalls in einem tierischen Modell sein, wobei das Ziel ein exogenes oder ein induziertes Ziel sein kann. Das Tiermodell wird ein nicht-humanes Tiermodell sein. Der Wegfall der Zielaktivität oder die Formation des Bindekomplexes zwischen dem Ziel und dem Lysin, das getestet wird, kann gemessen werden.
Es wird erwartet, dass die Untersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung sowohl für eine Durchmusterung im kleinen Maßstab, als auch im großen Maßstab von Testverbindungen und auch für quantitative Untersuchungen geeignet sein werden.
In einem bevorzugten Aspekt umfasst die Durchmusterung der vorliegenden Erfindung mindestens folgende Schritte (die nicht in derselben konsekutiven Reihenfolge ablaufen müssen): (a) Durchführung einer in vitro-Durchmusterung, um zu untersuchen, ob ein Kandidaten-Lysin die relevante Aktivität aufweist (wie die Fähigkeit, ein oder mehrere pathogene Clostridium-Bakterien, vorzugsweise C. perfringens-Bakterien, zu lysieren); und (b) Durchführung einer in vivo-Durchmusterung mit diesem Kandidaten-Lysin (zum Beispiel unter Verwendung eines funktionalen Tiermodells). Wenn das Kandidaten-Agens die Durchmusterung (a) besteht, dann wird typischerweise die Durchmusterung (b) durchgeführt.
Diagnostika
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine diagnostische Zusammensetzung oder ein Kit für den Nachweis von einem Ziel, nämlich einem pathogenen Clostridium-Bakterium, insbesondere eines C. perfringens-Bakteriums, zur Verfügung. In diesem Bezug wird die Zusammensetzung oder das Kit einen diagnostischen Marker umfassen, der auf dem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung basiert, und der in der Lage ist, die Anwesenheit von einem oder mehreren – oder die Abwesenheit von einem oder mehreren – Clostridium-Bakterien, vorzugsweise ein C. perfringens-Bakterium, in einer Testprobe anzuzeigen.
Geeigneter Weise kann die Testprobe zum Beispiel ein Nahrungsmittel, ein Digesta oder eine Testprobe, erhalten aus dem Darmtrakt eines Subjekts, sein.
Die diagnostische Zusammensetzung oder das Kit kann für den Nachweis von einem Ziel verwendet werden, nämlich von einem pathogenen Clostridium-Bakterium, insbesondere von einem C. perfringens-Bakterium, in zum Beispiel einem Nahrungsmittel, Digesta oder etwas Ähnlichem.
Die diagnostische Zusammensetzung oder Kit kann für die Diagnose von Störungen, verursacht durch die Anwesenheit von pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, wie zum Beispiel nekrotischer Enteritis, Lebensmittelvergiftung oder Wundbrand verwendet werden.
Solch eine diagnostische Untersuchung kann zugeschnitten sein, um die Wirkkraft von einem bestimmten Behandlungssystem oder von einem bestimmten Lysin zu evaluieren und kann in Tierstudien, in klinischen Studien oder bei der Beobachtung der Behandlung eines Subjekts verwendet werden. Um eine Basis für die Diagnose der Krankheit zur Verfügung zu stellen, sollte ein normales oder Standardprofil aufgestellt werden. Dieses wird durch die Kombination von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten oder anderen Proben, die von normalen (d. h. nichtinfizierten) Subjekten, entweder tierisch oder human, entnommen wurden, mit dem Lysin der vorliegenden Erfindung bewerkstelligt. Wenn eine Krankheit besteht, wird ein therapeutisches Agens, d. h. ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt transformiert mit einer Nukleotidsequenz, kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, verabreicht und ein Behandlungsprofil oder -werte können erstellt werden. Zum Abschluss kann die Untersuchung auf einer regulären Basis wiederholt werden, um zu beurteilen, ob sich die Werte in Richtung oder rückwärts auf ein normales oder Standardbild entwickeln, d. h. ob die Menge an Bakterien in einer Probe, wie von einem Darm von Geflügel, während dessen Behandlung, reduziert und/oder ausgerottet wird. Sukzessive Behandlungsprofile können verwendet werden, um die Effizienz der Behandlung über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
Diagnostische Test
Um eine Basis für die Diagnose von einer Krankheit zur Verfügung zu stellen, sollten Standardwerte der Menge an pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere von C. perfringens-Bakterien, in einer Probe entwickelt werden. Zum Beispiel muss eine bestimmte Anzahl dieser Bakterien in dem Darmtrakt eines Subjekts nicht unbedingt schädlich für das Individuum sein. Nur wenn sich die bakterielle Anzahl über einen Schwellenwert erhöht, können schädigende Effekte beobachtet werden und ein Krankheitszustand kann erreicht werden. Somit kann der diagnostische Test in der Lage sein, die Anwesenheit von pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, in einer Probe zu identifizieren, aber er kann auch in der Lage sein, den Grad der Infektion zu quantifizieren. Die Menge des Bakteriums in einer Probe kann durch den Vergleich zu einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen, bei denen eine bekannte Menge an Bakterien zugefügt wurde, quantifiziert werden.
Sonden
Ein anderer Aspekt des Gegenstands der Erfindung ist die zur Verfügungstellung von Nukleinsäurehybridisation oder von PCR-Sonden, die in der Lage sind Polynukleotidsequenzen einschließlich genomische Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung oder nah verwandte Moleküle wie Allelen, zu detektieren (insbesondere von solchen, die in der Lage sind, selektiv zu selektieren). Die Spezifität der Sonde, d. h. ob sie von einem hochkonservierten, konservierten oder nicht-konservierten Bereich oder einer Domäne abstammt und die Stringenz der Hybridisation oder Amplifikation (hoch, mittel oder niedrig) wird bestimmen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende Nukleotidsequenzen, die ein Lysin der vorliegenden Erfindung kodieren, identifiziert oder auch verwandte Sequenzen. Sonden für die Detektion von verwandten Nukleinsäuresequenzen werden ausgewählt aus konservierten oder hochkonservierten Nukleotidbereichen der Zielfamilienmitglieder, wobei solche Sonden in einer Ansammlung von degenerierten Sonden verwendet werden können. Für den Nachweis von identischen Nukleinsäuresequenzen, oder wenn maximale Spezifität gewünscht ist, werden Nukleinsäuresonden aus nicht-konservierten Nukleotidbereichen oder einmaligen Bereichen der Zielpolynukleotide ausgewählt. Der Begriff „nicht-konservierte Nukleotidbereich", wie hierein verwendet, betrifft eine Nukleotidbereich, die einmalig für eine Lysin-kodierende Sequenz, die hierin offenbart ist, ist und die nicht in verwandten Familienmitgliedern auftritt.
PCR wie in US-A-4683195 , US-A-4800195 und US-A-4965188 beschrieben stellt zusätzliche Verwendungen für Oligonukleotide, basierend auf der Nukleotidsequenz, zur Verfügung. Solche Oligomere werden im Allgemeinen chemisch synthetisiert, können aber auch enzymatisch generiert werden oder von einer rekombinanten Quelle produziert werden. Oligomere umfassen im Allgemeinen zwei Nukleotidsequenzen, eine mit einer Senseorientierung (5'->3') und eine mit einer Antisenseorientierung (3'<-5'), die unter optimierten Bedingungen für die Identifizierung von einem spezifischen Gen oder einem spezifischen Zustand verwendet werden. Dieselben zwei Oligomere, verschachtelte Mengen an Oligomeren oder auch eine degenerierte Anzahl von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen für die Detektion und/oder Quantifizierung von nahen verwandten DNA- oder RNA-Sequenzen verwendet werden.
Die Nukleinsäuresequenz von einem Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls verwendet werden um Hybridisationssonden, wie vorher beschrieben, zu entwickeln, um die endogene genomische Sequenz zu kartieren. Die Sequenz kann von einem bestimmten Chromosom oder von einem spezifischen Bereich des Chromosoms unter Verwendung von gut bekannten Techniken abgebildet werden. Diese umfassen die in situ-Hybridisation von chromosomalen Verteilungen (Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), fließ-sortierte chromosomale Herstellung oder künstlich-chromosomale Konstruktionen wie YACs, bakterielle künstliche Chromosomen (BACs), bakterielle PI-Konstruktionen oder einzelne Chromosom-cDNA-Bibliotheken.
In situ-Hybridisation von chromosomalen Präparationen und physikalische Kartierungstechniken wie Verbindungsanalysen unter Verwendung von entwickelten chromosomalen Markern sind unschätzbar für die Erweiterung von genetischer Kartierung. Beispiele für genetische Kartierung können in Science (1995; 270: 410f und 1994; 265: 1981f) gefunden werden. Oft kann der Ort von einem Gen auf einem Chromosom von einer anderen Säugetierspezies assoziierte Marker offenbaren, auch wenn die Anzahl oder der Arm von einem bestimmten humanen Chromosom nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können durch physikalische Kartierungen chromosomalen Armen oder Teilen davon zugeordnet werden. Dieses stellt wertvolle Informationen für Forscher zur Verfügung, die nach Krankheitsgenen unter Verwendung von Positionsklonierungen oder anderen Generforschungstechniken suchen. Wenn eine Krankheit oder ein Syndrom erst einmal grob durch genetische Verknüpfung eines bestimmten genomischen Bereichs zugeordnet wurde, können alle Sequenzen, abgebildet in diesem Bereich, assoziierte oder regulatorische Gene für weitere Untersuchung darstellen. Die Nukleotidsequenz des Gegenstands der Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um Unterschiede in der chromosomalen Platzierung aufgrund von Translokation, Inversion, etc. zwischen normalen, tragenden oder betroffenen Individuen festzustellen.
Verwendungen
In einem allgemeinen Sinne kann ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, für die Herstellung von einem Medikament zur Behandlung von einer Störung assoziiert mit der Anwesenheit von pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens-Bakterien, verwendet werden.
Das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder der Wirt, transformiert mit einer Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, kann verwendet werden, um pathogene Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, zu kontrollieren und/oder zu zerstören.
Insbesondere kann ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, in tierischem Futter oder als ein tierischer Futterzusatz verwendet werden, um die Menge an pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, in dem Darmtrakt des Tieres zu reduzieren. Somit können Störungen wie reduzierte Gewichtszunahme und nekrotische Enteritis, verursacht durch die Anwesenheit von pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, vorgebeugt und/oder behandelt werden.
Ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, kann verwendet werden, um Wundbrand und andere Krankheiten, assoziiert mit der Anwesenheit von pathogenen Clostridium-Bakterien, insbesondere C. perfringens, vorzubeugen und/oder zu behandeln.
Zusätzlich oder alternativ hierzu kann ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, in einer Untersuchung verwendet werden, um das verursachende Agens in einem Nahrungsmittelvergiftungs-Ausbruch zu überprüfen oder zu detektieren und/oder um eine Nahrungsmittelvergiftung in einem Individuum vorzubeugen oder zu behandeln und/oder als ein Diagnostikum für Forschungszwecke.
Herstellung von Nahrungsmitteln
Ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder ein Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Nahrungsmitteln einschließlich Tierfutter verwendet werden.
In einer Ausführungsform kann das Nahrungsmittel und/oder der Futterzusatz der vorliegenden Erfindung durch das Beimengen des Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder des Wirts, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, direkt zu einem Nahrungsmittel und/oder eines Futterzusatzes hergestellt werden. Als Beispiel kann das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder der Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, mit einem Getreidebasierenden Nahrungsmittel und/oder Futterzusatz, wie gemahlener Weizen, Mais oder Sojamehl verbunden werden (zum Beispiel durch Aufsprühen).
Es ist ebenfalls möglich, das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder den Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, in ein zweites (und unterschiedliches) Nahrungsmittel und/oder Futter oder Trinkwasser einzugliedern, das dann zu dem Nahrungsmittel und/oder Futterzusatz der vorliegenden Erfindung zugefügt wird. Entsprechend ist es nicht notwendig, dass das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder der Wirt, transformiert mit einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung, in ein Getreide-basierendes Nahrungsmittel und/oder Futterzusatz an sich zugefügt wird, auch wenn solche Beimengungen einen besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung bildet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Nahrungsmittel- und/oder Futterzusatz mit anderen Nahrungsmitteln und/oder Futterzusätzen kombiniert werden, um ein Getreide-basierendes Nahrungsmittel und/oder Futter herzustellen. Solche anderen Nahrungsmittel und/oder Futterkomponenten können ein oder mehrere andere (vorzugsweise thermostabile) Enzymzusätze, Vitaminnahrungsmittel und/oder Futterzusätze, Mineralnahrungsmittel und/oder Futterzusätze und Aminosäurenahrungsmittel und/oder Futterzusätze umfassen. Das resultierende (das kombinierte) Nahrungsmittel und/oder der Futterzusatz, umfassend möglicherweise mehrere verschiedenen Arten von Komponenten, kann dann in einer geeigneten Menge mit anderen Nahrungsmitteln und/oder Futterkomponenten wie Getreide und Proteinzusätze gemixt werden, um ein humanes Nahrungsmittel und/oder ein tierisches Futter zu bilden.
Die Erfindung wird jetzt durch Beispiele weiter beschrieben in denen Bezug auf die folgenden Figuren gemacht wird:
FIGUREN
1, die eine Nukleotidsequenz zeigt;
2, die eine Aminosäuresequenz zeigt;
3, die eine genomische Kartierung zeigt;
4, die ein Diagramm zeigt; und
5, die ein Diagramm zeigt.
Detaillierter:
1 zeigt eine Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) kodierend ein Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung;
2 zeigt eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) eines Lysins gemäß der vorliegenden Erfindung;
3 zeigt eine genomische Kartierung in Bezug auf den Bakteriophagen (Φ3626) von Clostridium perfringens;
4 zeigt ein Diagramm eines Lysins des C. perfringens-Stamm NCTC3110 in einem Medium bei Verwendung von einem Rohextrakt (RE) eines Φ3626 Lysin-produzierenden E. colis; und
5 zeigt ein Diagramm der Substrat-Spezifität eines Lysins der C. perfringens-Bakteriophage Φ3626 von verschiedenen bakteriellen Spezies und Gattungen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Isolierung und Aufreinigung von Bakteriophagen von C. perfringens:
Verfahren: Einundfünfzig clostridiale Stämme isoliert von verschiedenen Quellen wurde auf Lysogenie durch die UV-Irridationstechnik wie beschrieben in Loessner et al (1990 Appl. Environ. Microbiol, 56, 1912–8) durchmustert. Exponentiell wachsende Clostridia (10 ml) wurden für 5 Minuten einem UV-Licht (254 nm, 0,0132 J cm^–2) ausgesetzt. Nach einer Inkubation von 3 Stunden (37°C) in Dunkelheit wurden die Kulturen zentrifugiert (10 Min 8000 g) und steril filtriert. Die Phagenaktivität wurde durch das „Punkt auf dem Rasen" (spot-an-the-lawn) Verfahren gegen alle C. perfringens-Stämme getestet.
Die "Soft Agar" Schichttechnik beschrieben in Adams (1959 Methods of study of bacterial viruses S. 443–457 Bacteriophages, Intersciences Publishers Inc. NY) wurde für die Aufreinigung und Vermehrung der Phagen verwendet. Verdünnungen der Überstände, die eine lytische Aktivität aufweisen, wurden zu 3,5 ml flüssigem soffen Agar hinzugefügt, der mit 0,1 ml einer exponentiell wachsenden Kultur des geeigneten Vermehrungsstamm inokkuliert wurde. Der softe Agar wurde auf TY-Platten gegossen und über Nacht inkubiert. Einzelne gut isolierte Plaques wurden mit einer sterilen Pasteur-Pipette gepickt und in 0,45 ml TV-Medium eingebracht. Nach einer Inkubation von 4 Stunden bei 4°C wurde die Phagen-enthaltene Lösung steril filtriert und für eine zweite Runde der Aufreinigung verwendet.
Für die Isolation von Bakteriophagen-DNA war ein Hochtiter-Bestand (10⁹ pfu/ml) essentiell. Die Phagen wurden durch Flüssigkulturen auf hohe Titer vermehrt. Zu einer Kultur einer geeigneten Wirts (OD_600nm von 0,1) wurde eine Phagenlösung bei einer Multiplizität der Infektion von ungefähr 1 zugefügt. Das Wachstum der infizieren Kultur wurde photometrisch beobachtet und die Phagen wurden nach Entfernung von zellulären Rückständen durch Zentrifugation (10000 g für 10 Minuten) und Steril-Filtration. des Kulturüberstandes geerntet.
Die Aufreinigung von Phagen aus einem Hochtiter-Bestand, der für weitere molekulare Arbeiten notwendig ist, wurde in Zink et al (1992 Appl. Environ. Microbiol. 58, 296–302) beschrieben. Kurzgefasst wurden die Phagen aufgereinigt und durch Polyethylenglykol 8000-Präzipitation, abgestufter CsCl-Dichtegradientzentrifugation und Dialyse aufkonzentriert (siehe zum Beispiel Sambrook et al Molecular Cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die mutmaßlichen Phagenpartikel wurden durch Elektronenmikroskopie (EM) untersucht.
Ergebnisse: Bei den Stämmen ATCC3626 und NCTC8533 beruhte die beobachtete lytische Aktivität des UV-induzierten sterilen Kulturüberstandes auf der Anwesenheit von Bakteriophagen, was durch EM bestätigt wurde. Die Phagen waren von dem Siphoviridae-Typ und wurden Φ3626 und Φ8533 genannt. Der optimale Vermehrungswirt für die zwei Phagen wurde bestimmt zum Stamm NCTC3110 bzw. Stamm ATCC3628.
Beispiel 2: Bestimmung des lytischen Bereichs der Bakteriophagen
Verfahren: Die Fähigkeit von den zwei Phagen C. perfringens-Stämme zu lysieren wurde mit Hilfe der „drop-on-the-lawn"-Technik untersucht. 10 μl der Phagenbestände (10⁷ pfu/ml) wurden auf den Platten aufgebracht, die mit C. perfringens-Stämmen inokkuliert waren. Die lytische Aktivität wurde durch die Ausbildung von Plaque in dem Rasen? der Bakterien nach Inkubation über Nacht beobachtet.
Ergebnisse: Der Phage Φ3626 war lytisch gegen 11 Stämme der 51 C. perfringens-Stämme (21,6%) während der Phage Φ8533 in der Lage war, 4 Stämme (7,8%) zu lysieren.
Beispiel 3: Sequenzierung und Analyse der genomischer DNA der Bakteriophage Φ3626 von C. perfringens
Verfahren: Die genomische DNA von Φ3626 wurde unter Verwendung von Standardverfahren für die Extraktion der Bakteriophagen λ DNA erhalten (siehe Sambrook et al supra). Die Erstellung von genomischen Bibliotheken von der Bakteriophage Φ3626 wurde wie detailliert in Loessner et al (2000 Mol. Microbiol 35, 324–40) beschrieben durchgeführt. Ein zeitlimitierter Verdau der DNA mit Tsp5091 (New England Biolabs) und Vollverdau unter Verwendung von HindIII (MBI Fermentas) und TaqI (Roche) wurde durchgeführt. Fragmente der gewünschten Menge (1–2 kbp) wurden von einem Agarosegel gewonnen und in einen pBluescript-Vektor (Stratagene) ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli DH5αMCR elektroporiert. Blau-weiß-Durchmusterung auf XgaI-enthaltenen Agarplatten wurde für die Identifikation von Inserttragenen Transformanten verwendet. Plasmide wurden aus Kulturen in kleinem Maßstab (Qiaprep Miniprep Kit; Qiagen) isoliert und mit Paul (MBI) verdaut. Fünfundachzig Klone, die unterschiedliche Inserts trugen, die in der Länge zwischen 1–2 kbp variierten, wurden durch Restriktionsschemata in einem Agarosegel identifiziert. Diese Klone wurden für die Sequenzierung unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten (IRD-800 LI-COR)-Standard-Primern, die komplementär zu den Sequenzen der flankierenden multiplen Klonierungsstelle des pBluescript sind, verwendet. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung einer Hitze-stabilen Polymerase (SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing Kit-LC; Epicentre Technologies) und einem automatisierten DNA-Sequenzer (4200 IR²; LI-COR) durchgeführt.
Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung der Software DNASIS Version 2.10 (Hitachi) miteinander abgeglichen. Contigs, die aus dieser Abgleichung stammen, wurden für die Entwicklung von spezifischen Primern verwendet, um die Lücken zu schließen. Verbleibende Lücken wurden durch Primer-Walking der Φ3626-DNA geschlossen bis eine deutliche Kettentermination an der cos-Stelle beobachtet wurde. Die Genomsequenz wurde durch die Bestimmung der Kernsequenzen und der cos-Stelle durch PCR der DNA des lytogenen Wirts unter Verwendung von Primern, die komplementär zu Sequenzen strangaufwärts und strangabwärts der cos-Stelle liegen, beendet. Die PCR-Produkte und die DNA-Abschnitte von der Primer-Walking-Anwendung wurden unter Verwendung der Farbstoff-Terminator-Technik auf einem ABI373A automatisierten DNA-Sequenzer sequenziert.
Für die Analyse der Nukleotide und Aminosäuresequenzen wurden DNASIS/PROSIS (Hitachi) und das Husar Analysis Package, einschließlich dem GCG Package (http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de; Biocomputing Service Group at the German Cancer Research Center, DKFZ) verwendet. Der BLAST-Algorithmus gelehrt in Altschul et al. (1990 J. Mol. Bio 215, 403–10) wurde für die Homologie-Suchen in den verfügbaren Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) oder der Biocomputing Service Group verwendet.
Ergebnisse: Das Φ3626 Genom hat eine Länge von 33507 bp mit 3'-ausladenen einzelsträngigen kohäsiven Enden mit einer Länge von 9 Nukleotiden. Der durchschnittliche molare GC-Gehalt beträgt 28,4 mol%. Eine Bioinformatische Analyse des Φ3626 Genoms offenbarte die Existenz von 50 putativen Protein-kodierenden Bereichen, die 94,1% der Sequenz abdecken.
Die Protein-kodierenden Bereiche des Genoms Φ3626 können in drei hauptfunktionale Muster eingeteilt werden, die durch die Richtung der ORFs deutlich werden (siehe 3). Das erste Muster der cos-Stelle bei Koordinate 1 bis 19804, niedergeschrieben zur Rechten in der genomischen Karte (3), repräsentiert Gene, die strukturelle Proteine und das Lysesystem kodieren. Diese Gene können zusammengefasst werden als „späte Gene". Das zweite Muster befindet sich von bp19805–23645 und kodiert Produkte, die für die Kontrolle der Lysogenie verantwortlich sind, einschließlich der att-Stelle, einer Intergrase, dem Repressor und einem putativen cro-Repressor. Das letzte Muster – das von Nukleotide 23680–33507 reicht – umfasst ORFs, die ausschließlich in die rechte Richtung gerichtet sind (sieh 3). Ihre putativen Produkte sind für die Replikation, Rekombination, Modifikation der Phagen-DNA verantwortlich und repräsentieren die „frühe" Gene.
Beispiel 3a: Sequenzbestimmung des Lysingens
Verfahren: Der Vergleich mit anderen Bakteriophagen (Φ105, Sfi21, Φadh, ΦSLT, ΦPVL) offenbart eine ähnlich Organisation des Genoms des Φ3626. Typischerweise war das Endolysin strangaufwärts dem Lyogenie-Kontrollbereich lokalisiert, dessen ORFs für gewöhnlich in die entgegengesetzte Richtung gerichtet sind (siehe 3). Das Produkt von ORF19 zeigt Ähnlichkeiten (50% von 105 Aminosäuren) mit dem wahrscheinlichen Holin des Bacillus subtilis-Phagen Φ105 (Kobayashe, K et al., unveröffentlicht, Zugangsnummer: AB16282). Unter Verwendung von bioinformatischer Analyse, die TmHMM anwendet, wie beschrieben in Sonnhammer et al. (1998 Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol., 6: 175–182), wurde ermittelt, dass es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass das putative Protein zwei transmembrane Helixbereiche aufweist. Somit wurde tendenziell angenommen, das OFR19 ein Holin des Φ3626 kodiert.
In Bakterioschwanzphagen ist das Endolysin strangabwärts von dem Gen, das das Holin kodiert, lokalisiert (siehe Wang et al. (2000 Ann. Rev. Microbiol. 54: 799: 825)). Eine Homologie-Suche unter Verwendung von BLASTP2 offenbarte eine starke Ähnlichkeit (72–75% von 265–346 Aminosäuren) des abgeleiteten Genprodukts von ORF20 mit hypothetischen Proteinen von C. perfringens mit unbekannter Funktion (siehe Garnier et al. 1988 Plasmid 19: 135–50; Lyristis et al 1994 Mol. Microbiol 12: 761–77; Shimizu et al 1994 J. Bacteriol. 176: 1616–23). Innerhalb des Aminoterminus wurden Ähnlichkeiten zu N-Acetylmuramoyl-L-alaninamidase von unterschiedlichen Quellen angezeigt (Bacillus subtilis-Autolysin, Bacillus cereus-Bakteriophage 12862 Endolysin, CwIV von Paenibacillus polymyxa, mit Ähnlichkeiten von 43–45% von 163–166 Aminosäuren) (siehe Ishikawa et al. 1999 Mol. Gen. Genet 262: 738–48; Kunst et al 1997 Nature 390; 249–56; und Loessner et al 1997 J. Bacteriol 179: 2845–51). Ein „Hidden Markov Model (HMM) Scan" unter Verwendung der PFAM-Datenbank (siehe Durbin et al 1998 Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge Uni. Press) legt ebenfalls die Existenz von einer putativen N-Acetylmuramoyl-L-alaninamidase-Domäne nahe.
Ergebnisse: ORF20 wurde als das Endolysin-kodierende Gen ply3626 identifiziert und wurde direkt strangabwärts des Gens, das das Holin kodiert, gefunden. Die Wahrscheinlichkeit, dass das Enzym eine Amidase-Domäne innerhalb des Aminoterminus besitzt, zeigt ebenfalls, dass ORF20 ein Endolysin war. Keine bekannte Funktion wurde für den Carboxyterminus des Endolysins gezeigt, aber basierend auf den Funden, dass viele Endolysine eine modulare Organisation zeigen (siehe Garcia et al. 1990 Gene 86: 81–8), wird angenommen, dass eine mögliche Zellwandbindungsdomäne innerhalb des Carboxyterminus des ply3626 lokalisiert ist.
Beispiel 4: Expression von ply3626 in E. coli
Basierend auf bioinformatischer Analyse wurden Primer für die Amplifikation von ply3626 unter Verwendung von PCR entwickelt. Es wurden Primer entwickelt, die komplementär zu den Enden der Gene waren und die Restriktionsstellen strangaufwärts und strangabwärts des Gens aufwiesen, um direkte Klonierung in den Expressionsvektor pQE30 (Qiagen) zu ermöglichen. Das PCR-Produkt wurde aufgereinigt, mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease verdaut und in dem vorbereiteten Vektor ligiert. Die Ligationsprodukte wurden durch Elektroporation in E. coli JM109 transformiert, die zuvor durch Transformation mit dem Plasmid pACYC-IRL10, das freundlicherweise von Zdanovsky et al (2000 App. Environ Microbiol 166: 3166–73) zur Verfügung gestellt wurde, hergestellt. Das mit pACYC-IRL10 zur Verfügung gestellte E. coli mit den Genen für tRNAs (ileX, argU und leuW) wird selten in E. coli, aber häufig in Clostridia verwendet.
E. coli transformiert mit dem Vektor kodierend das Endolysin wurden bei Raumtemperatur (22°C) heranwachsen gelassen, wobei das Endolysin einzig durch die Hintergrundexpression des Vektorsystems produziert wurde. Es wurde herausgefunden, dass dieses die Ausbildung von Einschlusskörpern (inclusion bodies) verhindert, die bei der Verwendung von IPTG zur Induktion beobachtet wurden. Nach 16 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000 g, 15 Minuten) geerntet. Die Pellets wurden in PBS-Puffer resuspendiert und der Rohextrakte (RE) der Zellen wurden unter Verwendung einer „French"-Presse bei 40000 kPa hergestellt. Die RE wurden für 30 Minuten bei 35000 g zentrifugiert und steril filtriert. Die Aktivität der Enzyme wurde durch eine Lyse-Untersuchung bei C. perfringens NCTC3110-Zellen gezeigt.
Das Endolysin konnte ebenfalls unter Verwendung des HIS-Tags, fusioniert über den Expressionsvektor pQE30 an das Endolysin, aufgereinigt werden. Das aufgereinigte Endolysin zeigte dieselbe lytische Aktivität wie das Endolysin in dem Rohextrakt.
Beispiel 5: Lyse-Untersuchung mit ply3626 hergestellt durch rekombinante E. coli auf C. perfringens
Für eine photometrische Untersuchung der lytischen Aktivität wurde C. perfringens NCTC3110 als ein Substrat für ply3626 verwendet. Die Bakterien wurden über Nacht herangezogen (500 ml), durch Zentrifugation (8000 g für 15 Minuten) geerntet und in PBS-Puffer (5 ml) resuspendiert. Die Zellen wurden bis zu ihrer Verwendung bei –20°C gelagert. Für die Lyse-Untersuchung wurden die Zellen auf eine optische Dichte von 0,7 bis 0,8 bei 490 nm in PBS-Puffer verdünnt. Zu 180 μl von diesem Substrat wurden 20 μl des Rohextrakts der rekombinanten E. coli, die das Endolysin produzieren, hinzugefügt und die Veränderung der optischen Dichte wurde über die Zeit gemessen. Als eine Negativkontrolle wurde ein Rohextrakt von E. coli verwendet, der den Vektor mit einem 3'-abgeschnittenen ply3626-Gen trägt. Eine sichtbare Reduktion in der optischen Dichte aufgrund der Zerstörung der Zellwände von dem Substrat wurde für den RE, der das Endolysin ply3626 enthält (siehe 4), im Vergleich zur Negativkontrolle gemessen.
Beispiel 6: Substratspezifität
Verfahren: Für die Bestimmung der Substratspezifität des Lysins, erhalten von C. perfringens, wurde die Lyse-Untersuchung mit ply3626 mit verschiedenen Bakterien durchgeführt. 109 Stämme von 49 verschiedenen bakteriellen Spezies wurden auf Sensitivität gegen Ply3626 durchmustert. Die Bakterien wurden unter Standardbedingungen aufgezogen, durch Zentrifugation geerntet und die Pellets wurden in PBS resuspendiert. Diese Bestände wurden bei –20°C bis zur Verwendung gelagert. Die Zellen wurden verdünnt, um eine optische Dichte von 0,5 bis 0,9 (bei 490 nm) zu erhalten und 180 μl der verdünnten Zellsuspension wurde als Substrat für die Lyse-Untersuchung durch Zugabe von 20 μl des Ply3626 enthaltenen Rohextrakt von dem rekombinanten E. coli verwendet.
Eine sigmoidale Reduktion der optischen Dichte wurde im Vergleich zur der Negativkontrolle als Sensitivität auf Ply3626 interpretiert. In dem Fall, wo keine Reduktion detektierbar war, wurde diese als nicht-sensitiv betrachtet.

Eine Liste der verschiedenen untersuchten Bakterien ist in den Tabellen 1 und 2 unten dargestellt (wobei WS Weihenstephan Culture Collection of Microorganisms bedeutet; ATCC American Type Culture Collection, Rockville, USA bedeutet; und NCTC National Collection of Type Cultures, PHLS, London bedeutet: Tabelle 1:

Stämme erhalten von Kultursammlungen
Bakterielle Spezies	WS Nummer	offizielle Nummer	Sensitivität
Bacillus cereus	WS 1537	DSM 31	nein
Bacillus megaterium	WS 1539	DSM 32	nein
Bacillus polymyxa	WS 1538	DSM 36	nein
Bacillus subtilis	WS 1525	DSM 10	nein
Bacillus thuringiensis	WS 2734	DSM 2046	nein
Bifidobacterium gallicum	WS 3390	DSM 20093	nein
Bifidobacterium gallinarum	WS 3410	DSM 20670	nein
Bifidobacterium ruminantium	WS 3381	DSM 6489	nein
Brochothrix thermosphacta	WS 2021	DSM 20171	nein
Campylobacter jejuni	WS 3510	DSM 4688	nein
Clostridium absonum	WS 3511	DSM 599	nein
Clostridium barati	WS 3512	DSM 601	nein
Clostridium fallax	WS 3514	DSM 2631	ja
Clostridium novyi	WS 3515	DSM 5566	nein
Clostridium tetani	WS 3516	DSM 11744	nein
Clostridium beijerinckii	WS 2190	ATCC 6015	nein
Clostridium bifermentans	WS 2189	ATCC 19299	nein
Clostridium butyricum	WS 1619	DSM 552	nein
Clostridium pasteurianum	WS 2195	DSM 525	nein
Clostridium perfringens	WS 2952	DSM 756^T	ja
Clostridium perfringens	WS 2953	DSM 798	ja
Clostridium perfringens	WS 2954	DSM 2943	ja
Clostridium perfringens	WS 2964	NCTC 528	ja
Clostridium perfringens	WS 2965	NCTC 3110	ja
Clostridium perfringens	WS 2966	NCTC 6719	ja
Clostridium perfringens	WS 2969	NCTC 8346	ja
Clostridium perfringens	WS 2970	NCTC 8533	ja
Clostridium perfringens	WS 2971	NCTC 10240	ja
Clostridium perfringens	WS 2972	NCTC 10612	ja
Clostridium perfringens	WS 2974	NCTC 10719	ja
Clostridium perfringens	WS 2975	NCTC 11144	ja
Clostridium perfringens	WS 3004	ATCC 3626	ja
Clostridium perfringens	WS 3005	ATCC 3628	ja
Clostridium sporogenes	WS 1621	DSM 633	nein
Clostridium sporogenes	WS 2186	DSM 1664	nein
Clostridium sporogenes	WS 2187	DSM 795	nein
Clostridium tertium	WS 2188	DSM 2485	nein
Clostridium tetanomorphum	WS 2194	ATCC 19407	nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 1620	DSM 663	nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2191	ATCC 25755	nein
Enterobacter gallinarum	WS 3204	DSM 20628	nein
Enterococcus faecalis	WS 2331	DSM 20478	nein
Enterococcus faecium	WS 1052	DSM 20477	nein
Escherichia coli	WS 1322	DSM 30083	nein
Lactobacillus aviarius subsp. Aviarius	WS 3206	DSM 20655	nein
Lactococcus plantarum	WS 3116	DSM 20686	nein
Leuconostoc carnosum	WS 3102	DSM 5576	nein
Leuconostoc citreum	WS 3103	DSM 5577	nein
Leuconostoc mesenteroides	WS 3105	DSM 20346	nein
Listeria innocua	WS 2257	ATCC 33090	nein
Listeria ivanovii	WS 2256	ATCC 19119	nein
Listeria monocytogenes	WS 2301	ATCC 15313	nein
Pediococcus pentosaceus	WS 1038	DSM 20206	nein
Staphylococcus aureus supsp.	WS 2438	DSM 20231	nein
Aureus
Staphylococcus epidermidis	WS 3341	DSM 20044	nein
Staphylococcus gallinarum	WS 3287	DSM 20610	nein
Streptococcus pyogenes	WS 3154	DSM 20565	nein
Streptococcus thermophilus	WS 2786	DSM 20617	nein

Tabelle 2:

Stämme von verschiedenen anderen Quellen
Bakterielle Spezies	WS Nummer	offizielle Nummer	Sensitivität
Bacillus weihenstephanensis	WS 2480		nein
Clostridium botulinum	WS 3524		nein
Clostridium botulinum	WS 3525		nein
Clostridium perfringens	WS 2955		ja
Clostridium perfringens	WS 2956		ja
Clostridium perfringens	WS 2957		ja
Clostridium perfringens	WS 2958		ja
Clostridium perfringens	WS 2959		ja
Clostridium perfringens	WS 2960		ja
Clostridium perfringens	WS 2961		ja
Clostridium perfringens	WS 2962		ja
Clostridium perfringens	WS 2963		ja
Clostridium perfringens	WS 2981		ja
Clostridium perfringens	WS 2982		ja
Clostridium perfringens	WS 2983		ja
Clostridium perfringens	WS 2984		ja
Clostridium perfringens	WS 2985		ja
Clostridium perfringens	WS 2986		ja
Clostridium perfringens	WS 2987		ja
Clostridium perfringens	WS 2988		ja
Clostridium perfringens	WS 2989		ja
Clostridium perfringens	WS 2990		ja
Clostridium perfringens	WS 2991		ja
Clostridium perfringens	WS 2992		ja
Clostridium perfringens	WS 2993		ja
Clostridium perfringens	WS 2994		ja
Clostridium perfringens	WS 2995		ja
Clostridium perfringens	WS 2996		ja
Clostridium perfringens	WS 2997		ja
Clostridium perfringens	WS 2998		ja
Clostridium perfringens	WS 2999		ja
Clostridium perfringens	WS 3000		ja
Clostridium perfringens	WS 3001		ja
Clostridium perfringens	WS 3002		ja
Clostridium perfringens	WS 3006		ja
Clostridium perfringens	WS 3007		ja
Clostridium perfringens	WS 3008		ja
Clostridium tyrobutyricum	WS 2761		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2762		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2763		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2764		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2765		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2766		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2767		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2768		nein
Clostridium tyrobutyricum	WS 2769		nein
Escherichia coli	WS 1329		nein
Lactobacillus ruminis	WS 2560		nein
Lactococcus lactis	WS 1030		nein
Salmonella enterica Group IV	WS 2870		nein
Enterobacter cloacae	WS 1294		nein

Ergebnisse: Wie in 5 gezeigt waren alle 48 C. perfingens-Stämme sensitiv auf das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung. Nur eine weitere clostridiale Spezies zeigte eine Sensitivität. Dieses war der C. fallax-Stamm DSM 2631. Die Sensitvität des Cl. fallax könnte durch die Zellwandstruktur von dieser clostridialen Spezies begründet sein, die durch das Aufweisen des Peptidglykans der A3γ-Gruppe, die über LL-DAP mit einer Glycinbindung quervernetzt ist, dieselbe ist wie für C. perfringens (siehe Schleifer et al 1972 Bacteriol Rev. 36: 407–77).
Von allen anderen Bakterien, die getestet wurden (ob andere clostridiale Spezies, wie C. botulinum, C. tetani, C. novyi, C. tyrobutyricum oder nicht-clostridiale Bakterien, wie Bacillus, Campylobacter, Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterobacter, E. coli, Listeria, Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus) – 60 insgesamt – wurden keine gefunden, die nicht-sensitiv auf das Lysin gemäß der vorliegenden Erfindung waren.
Somit ist ein Lysin isoliert und sequenziert von einem Bakteriophagen von C. perfringens Spezies-spezifisch oder im Wesentlichen Spezies-spezifisch in Bezug auf C. perfringens. Der Vorteil einer solchen Spezies-Spezifität ist, dass die Verabreichung von dem Lysin an ein Subjekt zu einer selektiven Zerstörung von C. perfringens und/oder C. fallax (beide pathogene Clostridium-Spezies) führen wird, ohne nützlich und/oder harmlose Bakterien zu schädigen.
Alle Publikationen, die in der Beschreibung oben genannt sind, sind hiermit durch Bezug integriert. Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen Verfahren und das System der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann offensichtlich sein ohne sich von dem Umfang und Sinn der vorliegenden Erfindung zu entfernen. Obwohl die vorliegende Erfindung in Verbindung mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte verstanden werden, dass die Erfindung, wie beansprucht, nicht übermäßig limitiert auf solche spezifischen Ausführungsformen sein sollte. In der Tat sind verschiedene Modifikationen der beschriebenen Verfahren zur Ausführung der Erfindung, die für einen Fachmann der Biochemie oder Biotechnologie oder eines verwandten Feldes offensichtlich sind, beabsichtigt vom Umfang der folgenden Ansprüche erfasst zu sein. Sequenzliste

Claims

Ein Lysin umfassend die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2.
Eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin kodiert, das die Aminosäuresequenz gezeigt in SEQ ID NO: 2 umfasst.
Eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Lysin kodiert, die Nukleotidsequenz umfasst die Sequenz gezeigt in SEQ ID NO: 1.
Ein Wirt transformiert mit einer Nukleinsäure, die ein Lysin nach einem der Ansprüche 2 bis 3 kodiert.
Ein Wirt nach Anspruch 4, wobei der Wirt ein mikrobieller Wirt ist.
Ein Wirt nach Anspruch 5, wobei der Wirt ein Lebensmittel geeigneter Organismus ist.
Ein Wirt nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei der Wirt ein Darm kollonisierender Organismus ist.
Ein Wirt nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Wirt ein oder mehrere Mikroorganismen von den folgenden Gattungen ist: Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Pediococcus.
Ein Wirt nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Wirt ein Bakterium von einer oder mehreren der folgenden Arten ist: Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus carnosus oder einer verwandten Art.
Eine Zusammensetzung umfassend ein Lysin nach Anspruch 1.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist und ferner ein pharmazeutisch zulässiges Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Träger umfasst.
Die Verwendung von einem Lysin nach Anspruch 1 für die Herstellung von einem Medikament für die Behandlung von einer Störung, einer Krankheit oder einem Zustand verbunden mit Clostridium perfringens.
Die Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Störung, die Krankheit oder der Zustand eine oder mehrere der Folgenden ist: Gewichtsverlust, nekrotische Enteritis, Wundbrand.
Ein in vitro Verfahren zur Zerstörung eines pathogenen Bakteriums der Gattung Clostridium, wobei das Verfahren die Lyse eines pathogenen Clostridium-Bakteriums mit einem Lysin definiert in Anspruch 1 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 11 umfasst.
Ein in vitro Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Clostridium-Bakterium von der Clostridium perfringens Art ist.
Ein Expressionsvehikel umfassend eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 3 und regulatorische Regionen, die der Expression der kodierten Sequenz in einem geeigneten Wirt zugeordnet werden.
Ein Verfahren zum Nachweis des Clostridium-Bakteriums in einer Probe unter Verwendung eines diagnostischen Markers, der auf dem Lysin nach Anspruch 1 basiert.
Ein Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Clostridium-Bakterium von der Clostridium perfringens Art ist.