ES2298495T3 - Lisina de bacteriofago. - Google Patents
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Abstract
Una lisina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
Description
Lisina de bacteriófago.
La presente invención se refiere a una nueva
lisina de virus bacteriano (bacteriófago) que comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2 y a
composiciones farmacéuticas que comprenden la misma.
La presente invención se refiere adicionalmente
al uso de dicha lisina en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de un trastorno asociado con la bacteria patógena
Clostridium, en particular Clostridium
perfringens.
La presente invención se refiere, además, a; un
procedimiento para destruir la bacteria patógena
Clostridium, en particular Clostridium
perfringens.
La presente invención se refiere, también, a un
huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina del bacteriófago
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No.
2.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un procedimiento de detección de bacterias
Clostridium, en particular Clostridium perfringens, en
una muestra.
Clostridium perfringens es una bacteria
patógena responsable de una variedad de trastornos, que incluyen la
enteritis necrótica, la gangrena gaseosa y en envenenamiento por
alimentos. C. perfringens es predominantemente un organismo
del suelo. C. perfringens es un patógeno anaerobio
importante. Existen varios hábitats en el cuerpo (por ejemplo, el
tracto intestinal y la cavidad oral) que son generalmente
anaerobios, y en los que se pueden encontrar bacterias anaerobias
obligadas como parte de la flora normal. Sin embargo, otras partes
del cuerpo se pueden hacer anaerobias como resultado de una lesión
tisular o de un traumatismo, que resulte en una reducción del
suministro de sangre al lugar dañado, y estos sitios anaerobios
pueden, posteriormente, hacerse disponibles para la colonización
por anaerobios obligados, tales como C. perfringens.
La presencia de C. perfringens en el
tracto intestinal de un animal puede resultar en, por ejemplo,
enteritis necrótica, envenenamiento por alimentos y retraso del
crecimiento. En particular, la presencia de C. perfringens en
el tracto intestinal de aves de corral, en particular de crías de
pollo, se ha asociado con distintos trastornos, tales como lesiones
intestinales y enteritis necrótica, y puede resultar en una
reducción significativa en el crecimiento de las aves de
corral.
corral.
Además, C. perfringens es el agente
causante de la gangrena gaseosa, que ocurre como resultado de una
lesión tisular o de un traumatismo y, de esta forma, de un ambiente
anaerobio, que es adecuado para la colonización de anaerobios
obligados, tales como C. perfringens.
Como los virus en general, los bacteriófagos se
pueden clasificar en aquellos que tienen genomas de ARN (la mayoría
pequeños y de cadena sencilla), y en aquellos que tienen genomas de
ADN pequeños (generalmente menores de 10 kb, la mayoría de cadena
sencilla) y aquellos con genomas de ADN medios y grandes
(30-200 kb).
Los genes en los bacteriófagos están agrupados
en genes de la etapa temprana y de la etapa tardía.
En los fagos virulentos, los genes cuyos
productos se necesitan para la síntesis del ADN del fago y rotura
del ADN del huésped, que incluyen los que median el metabolismo de
nucleótidos y de las proteínas que constituyen el complejo de
replicación, se expresan todos inmediatamente después de la
infección. Con el tiempo, se para la síntesis temprana y se activan
otros genes que codifican los componentes del virión y los genes de
la lisis. La desconexión de los genes tempranos se efectúa tanto a
nivel de transcripción como de traducción.
En los fagos temperados, el fago podría sufrir
lisogenia, en la que se activarían, tras la infección, los genes
que provocan la integración del fago en el genoma del huésped, de
forma que el fago se propagaría indirectamente de esta forma. El
estado lisogénico, una vez establecido, es bastante estable. Los
eventos ambientales que dañan al huésped de la bacteria lisogénica
pueden provocar la ruptura del estado lisogénico y pueden disparar
el ciclo de vida lítico del fago integrado. En este punto, el fago
activa los genes (tanto tempranos como tardíos) que provocan el
ciclo de vida lítico.
Una vez que se han expresado los genes tardíos,
tanto en fagos virulentos como temperados, se establece la etapa de
ensamblaje de viriones. Las cabezas, colas, fibras de la cola y
proteínas solubles que catalizan la adición de las fibras de la
cola se sintetizan independientemente. Normalmente, las cabezas y
las colas se combinan primero para formar complejos y finalmente se
añaden al complejo las fibras de la cola.
\newpage
La etapa final del ciclo es la lisis celular,
que libera los viriones en el medio. Generalmente, la lisis
requiere los productos de dos genes: una lisina, que ataca los
enlaces que unen las N-acetilglucosaminas en la capa
rígida de mureína; y una holina, que genera agujeros en la capa
interna de la membrana, lo que permite que la lisina alcance su
sustrato.
De esta forma, las lisinas de los bacteriófagos
con enzimas son enzimas que hidrolizan la pared celular,
codificadas por el fago, que se sintetizan durante la etapa de
expresión de genes tardíos en el ciclo lítico de multiplicación del
fago y median la liberación de los viriones progenie de la célula
infectada mediante la degradación del peptidoglicano
bacteriano.
El documento EP 0 510 907 revela una lisina de
los fagos de Listeria monocytogenes y formulaciones de esta
lisina sustancialmente libres del bacteriófago mismo, junto con un
procedimiento para destruir L. monocytogenes. Aunque el
documento EP 0 510 907 sugiere también el uso de una lisina de los
fagos de Clostridium tyrobutyricum, la memoria descriptiva no
muestra como obtener tal aislado de lisina, ni la secuencia de la
misma.
Nakamura et al, (Can. J. Microbiol. 1977
(5): p. 601-606) revelan la preparación de un
lisado celular, que se puede obtener a partir de la cepa de C.
perfringens KZ219, después de un análisis con
mitomicina-C, que contiene potencialmente una
lisina (también denominada "agente lítico", véanse Materiales
y Métodos) y que presenta actividad lítica sobre C. perfringens,
C. plagarum y en parte de las cepas de C.
bifermentans.
El documento WO 00/11472 muestra un
procedimiento de detección utilizando dominios de unión a la pared
celular de proteínas y/o enzimas.
Con anterioridad a la presente invención, el
ciclo lítico de los bacteriófagos que infectan a C.
perfringens estaban poco estudiados.
El término "bacteriófago", como se utiliza
en esta descripción, se debe considerar como intercambiable con el
término "fago".
Un aspecto original de la presente invención es
ta identificación es la identificación y secuenciación de una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina a partir de un
bacteriófago capaz de colonizar a la bacteria patógena
Clostridium, en particular Clostridium perfringens, y
al uso de esta lisina para lisar a la bacteria patógena
Clostridium, en particular a la bacteria patógena
Clostridium perfringens.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a una lisina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en
SEQ. ID. No. 2, que se puede obtener a partir de un bacteriófago
capaz de colonizar a Clostridium perfringens.
Preferentemente, dicha lisina esta en una forma sustancialmente
pura.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a una lisina en una forma sustancialmente pura que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No.
2.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina, mostrándose dicha secuencia de
nucleótidos en SEQ. ID. No. 1.
Todavía en un aspecto adicional de la invención,
la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ. ID. No. 1;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que es la complementaria a la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ. ID. No. 1;
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ. ID. No. 1;
- (d)
- una secuencia de nucleótidos que es la complementaria a una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con. la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ. ID. No. 1;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con la complementaria a la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ. ID. No. 1; (k) una secuencia de nucleótidos que comprende una cualquiera de (a), (b), (c), (d), y/o (e).
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina, cuya secuencia de nucleótidos
se selecciona entre el grupo constituido por:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en SEQ. ID. No. 1;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de astringencia alta y/o intermedia con la secuencia mostrada en SEQ. ID. No. 1; y
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que está relacionada con la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. No. 1 por degeneración del código genético.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a una lisina sustancialmente pura que se puede obtener,
o se obtiene, mediante la expresión del ácido nucleico que
comprende la secuencia de nucleótidos, según la presente
invención.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina,
según la presente invención.
El documento EP 0 510 907 revela un huésped
microbiano transformado con los medios necesarios para expresar una
lisina de un fago de Listeria monocytogenes. Las enseñanzas
del documento EP 0 510 907 se podrían adaptar de acuerdo con la
presente invención.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ. ID. No.
1.
La presente invención proporciona, aún, una
lisina derivada del cultivo de un huésped, según la presente
invención. Preferentemente, la lisina es una forma sustancialmente
pura.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a una composición, preferentemente una composición
farmacéutica, que comprende una lisina, según la presente
invención, y/o un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina,
según la presente invención.
La presente invención se refiere, también, a una
lisina, según la presente invención, y/o a un huésped transformado
con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una lisina, según la presente invención, para su uso
como un medicamento.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al uso de una lisina, según la presente invención, y/o a
un huésped transformado con un ácido nucleico que comprende un
ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina, según la presente
invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de un trastorno, enfermedad o afección asociada con las especies
patógenas de Clostridium, preferentemente con C.
perfringens patógena.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al uso de una lisina, según la presente invención, y/o a
un huésped trasformada con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina, según la presente
invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de una reducción en la ganancia de peso provocada por especies
patógenas de Clostridium, preferentemente por C.
perfringens patógena, en el tracto intestinal de aves de
corral, preferentemente pollos.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al uso de una lisina en una forma sustancialmente pura,
que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No.
2, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
reducción en la ganancia de peso provocada por especies patógenas
de Clostridium, preferentemente por C. perfringens
patógena, en el tracto intestinal de aves de corral,
preferentemente pollos.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un medicamento que comprende una lisina, según la
presente invención, y/o a un huésped transformado con un ácido
nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
una lisina, según la presente invención.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un medicamento que comprende una lisina en una
forma sustancialmente pura que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2 y/o un huésped transformado
con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una lisina que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ. ID. No. 2.
La presente invención se refiere, también, a un
paquete farmacéutico que comprende uno o más compartimentos, en los
que, al menos, un compartimento comprende una o más lisinas, según
la presente invención, y/o uno o más huéspedes transformados con un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica una lisina, según la presente invención, o una
composición, según la presente invención.
\newpage
La presente invención se refiere, también, a un
paquete farmacéutico que comprende uno o más compartimentos, en los
que, al menos, un compartimento comprende una o más lisinas en una
forma sustancialmente pura, que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2 y/o uno o más huéspedes
transformados con un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento de preparación de una composición
farmacéutica, comprendiendo dicho procedimiento la mezcla de una o
más lisinas, según la presente invención, y/o uno o más huéspedes
transformados con un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina, según la presente invención,
con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente
aceptables.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento de preparación de una composición
farmacéutica, comprendiendo dicho procedimiento la mezcla de una o
más lisinas en una forma sustancialmente pura que comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2 y/o uno o más
huéspedes transformados con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina que comprende la
secuencia mostrada en SEQ. ID. No. 2 con un diluyente, excipiente o
vehículo farmacéuticamente aceptables.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un procedimiento de destrucción de una bacteria
patógena del género Clostridium, que comprende la lisis de
una bacteria Clostridium patógena con una lisina
sustancialmente pura, según la presente invención, o una
composición, según la presente invención.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a un procedimiento de destrucción de una bacteria
patógena del género Clostridium, que comprende la lisis de
una bacteria Clostridium patógena con una lisina en una forma
sustancialmente pura, que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ. ID. No. 2 o una composición que comprende dicha
lisina.
Todavía en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un vehículo de expresión que comprende un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, según la
presente invención, y las regiones reguladoras asociadas a la misma
para la expresión de la secuencia codificadora en un huésped
adecuado.
La presente invención proporciona,
adicionalmente, el uso de una lisina, según la presente invención,
y/o un huésped transformada con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un lisina, según la presente
invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento
de un trastorno de crecimiento en aves de corral, estando causado
dicho trastorno de crecimiento por la colonización del tracto
intestinal, o de parte del mismo, del ave de corral por
Clostridium perfringens.
La presente invención proporciona, además, un
procedimiento para la detección de un bacteria Clostridium
patógena, preferentemente Clostridium perfringens, en una
muestra, utilizando un marcador de diagnóstico basado en la lisina,
según la presente invención, o una forma mimética de la misma.
La presente invención proporciona, también, un
procedimiento para detectar una bacteria patógena
Clostridium, preferentemente Clostridium perfringens,
en una muestra, utilizando un marcador de diagnóstico basado en una
lisina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ-
ID. No. 2.
El término "basado en", como se utiliza en
esta descripción, significa que el marcador de diagnóstico
comprende una lisina, según la presente invención, o una porción de
la misma. Adecuadamente, se podrían usar, al menos, la porción
lítica y la porción del dominio de unión a la pared celular de la
lisina, según la presente invención. En este caso, la porción
lítica de la misma podría ser completamente funcional, este es,
capaz de lisar las células bacterianas, o podría estar modificada
de tal forma que cambiara y/o eliminara la función lítica de la
lisina. Un procedimiento adecuado de modificación de dicha lisina
podría ser mediante el uso de mutagénesis dirigida y/o al azar. El
marcador de diagnóstico podría, adecuadamente, comprender sólo la
porción del domino de unión a la pared celular, o parte del mismo,
de la lisina.
El marcador de diagnóstico podría comprender un
marcador que fuera fácilmente identificable. Los marcadores
adecuados incluyen indicadores, que incluyen los indicadores
detallados en la sección de esta descripción titulada
"Indicador". El marcador podría estar unido directa o
indirectamente a la lisina o a una porción de la misma. Como forma
de ejemplo únicamente, un indicador adecuado podría incluir una
proteína fluorescente. El indicador podría estar acoplado bien
directa o bien indirectamente a la lisina o a una porción de
ella.
En el caso de que las células bacterianas se
lisen mediante el marcador de diagnóstico, se podría monitorizar la
lisis de una o más células bacterianas. Por ejemplo, la lisis se
podría monitorizar ópticamente. La lisis se podría monitorizar
mediante la medida del contenido celular liberado mediante la lisis
de las células bacterianas, por ejemplo, se podría medir la
liberación de ATP por bioluminiscencia.
El marcador de diagnóstico podría comprender una
fase sólida (por ejemplo, pero no exclusivamente, poliestireno
activado, vidrio activado, silicona o materiales similares al
vidrio, látex activado, oro o compuestos de oro, distintos
materiales portadores ferromagnéticos, materiales sintéticos
hidrófobos o cargados eléctricamente) unidos, directa o
indirectamente, a la lisina o a una porción de ella. Estas células
capaces de unión a dicha lisina o a una porción de ella se pueden
inmovilizar sobre o contra dicha fase sólida.
Las ventajas del procedimiento de detección
según la presente invención es que no es específico de especie, es
más fácil que generar anticuerpos frente a la bacteria
Clostridium, y/o tanto la unión como la detección se pueden
realizar fácilmente.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona la porción del dominio de unión a la pared celular, o
parte de ella, de una lisina, según la presente invención, para su
uso en la liberación de fármacos.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento para la modificación de una lisina,
según la presente invención, con el fin de alterar la actividad
lítica de la lisina respecto a una o más especies bacterianas.
La lisina según la presente invención se podría
modificar con el fin de aumentar el espectro bacteriano sobre el
que la lisina fuera activa. Alternativamente, la lisina se podría
modificar con el fin de enfocar su actividad a una especie y/o cepa
bacteriana específica; en otras palabras, a incrementar la
especificidad de huésped de la misma.
Para facilitar la referencia, este y otros
aspectos de la presente invención se discutirán ahora bajo los
encabezamientos de sección apropiados. Sin embargo, las enseñanzas
de cada sección no se limitan necesariamente a cada una de las
secciones en particular.
Preferentemente, el ácido nucleico, según la
presente invención, está en una forma sustancialmente pura.
Preferentemente, el ácido nucleico, según la
presente invención, está en una forma aislada.
Preferentemente, el ácido nucleico que comprende
la secuencia de nucleótidos, según la presente invención, se puede
obtener a partir de un bacteriófago capaz de infectar y/o colonizar
Clostridium perfringens.
Adecuadamente, el ácido nucleico y/o lisina,
según la presente invención, se obtiene a partir de un bacteriófago
capaz de infectar y/o colonizar Clostridium perfringens.
Preferentemente, el ácido nucleico, según la
presente invención, se puede obtener o se obtiene a partir de un
bacteriófago que ha infectado y/o colonizado Clostridium
perfringens.
Preferentemente, el ácido nucleico y/o lisina,
según la presente invención, se puede obtener o se obtiene a partir
del bacteriófago \phi3626 o a partir del bacteriófago
\phi8533.
Preferentemente, la composición farmacéutica,
según la presente invención, comprende adicionalmente un diluyente,
excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Preferentemente, el trastorno, enfermedad y/o
afección está asociado con las especies de Clostridium
patógenas, preferentemente Clostridium perfringens.
Los trastornos, enfermedades y/o afecciones
adecuados incluyen, por ejemplo, enteritis necrótica, gangrena
gaseosa, envenenamiento por alimentos, lesiones intestinales y
reducción en la ganancia de peso.
Como se estableció anteriormente, la presencia
de las especies de Clostridium, particularmente C.
perfringens, en el tracto intestinal de ciertos animales, en
particular aves de corral, tales como crías de pollo, se ha asociado
con una potencial reducción en el crecimiento en estos animales, en
comparación con animales no infectados. El efecto es más
pronunciado si el número de bacterias en el tracto intestinal
excede un nivel umbral. Por ejemplo, el nivel umbral será,
normalmente, de aproximadamente 10^{6}-10^{8}
cfu/g. La lisina, según la presente invención, y/o
un-huésped que comprenda una lisina, según la
presente invención, se podrían usar en el tratamiento de esta
potencial reducción en el crecimiento. En otras palabras, la
lisina, según la presente invención, y/o un huésped que comprenda
una lisina, según la presente invención, se podrían usar para
controlar el número de bacterias en el tracto intestinal de los
animales, en particular aves de corral, tales como crías de pollo,
aumentando de este modo la ganancia de peso en dichos animales. En
una forma de realización, la lisina, según la presente invención,
y/o un huésped que comprenda una lisina, según la presente
invención, podrían eliminar completamente dicha bacteria en el
tracto intestinal de dicho animal. En una forma de realización
alternativa, la lisina y/o el huésped podrían reducir el número de
dicha bacteria por debajo de un nivel umbral, esto es, aquel nivel
que resulta en una reducción de la ganancia de peso del animal.
Preferentemente, el huésped, según la presente
invención, es un huésped microbiano.
Preferentemente, el huésped, según la presente
invención, es un microorganismo alimentario.
Preferentemente, el huésped, según la presente
invención, es un organismo colonizador del intestino.
Adecuadamente, el huésped podría ser un
organismo, preferentemente un microorganismo, que generalmente se
reconoce como seguro (GRAS).
Preferentemente, el huésped microbiano, según la
presente invención, es uno o más microorganismos de los géneros
siguientes: Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Lactococcus,
Staphylococcus, Pediococcus.
En un aspecto preferido, el huésped microbiano
es una bacteria de una o más de las siguientes especies:
Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus
camosus o especies relacionadas.
Preferentemente, el ácido nucleico en dicho
huésped comprende una o más secuencias señal que dirigen a las
secuencias codificadoras de la secreción de la lisina de la
presente invención a través de la membrana celular del huésped.
Preferentemente, la lisina, según la presente
invención es una forma sustancialmente pura.
Preferentemente, la lisina, según la presente
invención, está en una forma aislada.
Preferentemente, la bacteria Clostridium,
como se menciona en esta descripción, pertenece a las especies de
Clostridium perfringens.
Preferentemente, la bacteria Clostridium,
como se menciona en esta descripción, está en el tracto intestinal
de un individuo.
Adecuadamente, la bacteria Clostridium
podría estar en un alimento o bebida.
Adecuadamente, la lisina, según la presente
invención, podría estar modificada, tal como por mutagénesis
dirigida o al azar.
Aunque en general cualquier técnica molecular
mencionada en esta descripción es muy conocida en la técnica, se
podría hacer referencia en particular a "Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)" y ``Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed. John
Wiley & Sons, Inc.
El término "lisina", como se utiliza en
esta descripción, incorpora al término "endolisina". El
término "lisina", como se utiliza en esta descripción,
significa cualquier agente, tal como una enzima o una toxina, que
es capaz de lisar células.
El término "agente", como se utiliza en
esta descripción, significa una lisina, según la presente
invención, y/o un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina,
según la presente invención.
El término "medicamento", como se utiliza
en esta descripción, incluye medicamentos para su uso tanto en
seres humanos como en animales en medicina humana y veterinaria.
Además, el término "medicamento", como se utiliza en esta
descripción, incluye un producto diseñado para su incorporación en
la alimentación animal, particularmente en la alimentación de aves
de corral.
Se debe apreciar que todas las referencias en
esta descripción a un tratamiento incluyen tratamientos curativos,
paliativos y profilácticos.
Normalmente, la secuencia de nucleótidos de la
presente invención se podría preparar por técnicas de recombinación
del ADN.
Como se utiliza en esta descripción, el término
"secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término
"polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos
casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del
término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia
de aminoácidos" es sinónimo del término "proteína".
La secuencia de aminoácidos se podría preparar
mediante el aislamiento a partir de una fuente adecuada, se podría
generar sintéticamente o se podría preparar mediante el uso de
técnicas de recombinación del ADN.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una secuencia de aminoácidos que es una lisina capaz de hidrolizar
las paredes celulares de bacterias Clostridium,
preferentemente Clostridium perfringens.
Preferentemente, la lisina comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
Preferentemente, la lisina es una lisina aislada
y/o es una lisina sustancialmente aislada y/o está purificada y/o
está sustancialmente purificada y/o no está en forma nativa. Así,
la lisina podría estar en una forma pura o sustancialmente
pura.
Se entenderá que la lisina, según la presente
invención, se podría mezclar con vehículos o diluyentes que no
interfieran con el propósito pretendido de la lisina, y todavía
será considerada como pura y/o aislada.
Como se utiliza en esta descripción, el término
"secuencia de nucleótidos" es sinónimo del término
"polinucleótido".
La secuencia de nucleótidos podría ser ADN o ARN
de origen genómico, sintético o recombinante. La secuencia de
nucleótidos podría ser de cadena doble o sencilla, dependiendo de
si representa la cadena en sentido o la anti-sentido
o una combinación de las mismas.
Para algunas aplicaciones, la secuencia de
nucleótidos es ADN preferentemente.
Para algunas aplicaciones, la secuencia de
nucleótidos se prepara, preferentemente, mediante el uso de
técnicas de recombinación del ADN (por ejemplo, ADN
recombinante).
Para algunas aplicaciones, la secuencia de
nucleótidos es cADN preferentemente.
Para algunas aplicaciones, la secuencia de
nucleótidos podría ser, preferentemente, la misma que la forma que
ocurre naturalmente para este aspecto.
En un aspecto de la presente invención, la
secuencia de nucleótidos codifica una lisina capaz de hidrolizar la
pared celular de la bacteria Clostridium, preferentemente la
bacteria Clostridium perfringens.
Los expertos entenderán que la misma lisina se
puede codificar por numerosas secuencias de nucleótidos distintas
como resultado de la degeneración del código genético. Además, se
entenderá que los expertos podrían, utilizando técnicas de rutina,
introducir sustituciones de nucleótidos que no afecten
sustancialmente a la actividad codificada por la secuencia de
nucleótidos de la presente invención, para reflejar el uso de
codones de cualquier organismo huésped particular, en el que se
vaya a expresar la diana. Así, los términos "variante",
"homólogo" o "derivado" en relación a la secuencia de
nucleótidos establecida en los listados de secuencia adjuntos,
incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de,
reemplazo de, deleción de, o adición de, uno (o más) nucleótidos
de, o a la secuencia, proporcionando la secuencia de nucleótidos
resultante que codifica una lisina funcional, según la
presente
invención.
invención.
La presente invención incluye, también, las
secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar
selectivamente con las secuencias presentadas en esta descripción,
o con las complementarias de las anteriores. Las secuencias de
nucleótidos son preferentemente, al menos de 15 nucleótidos de
longitud, más preferentemente, al menos de 20, 30, 40 ó 50
nucleótidos en longitud. Estas secuencias se podrían utilizar como
sondas, tal como en un kit de diagnóstico.
Se pueden obtener de muchas formas secuencias de
nucleótidos que no son homólogas al 100% a las secuencias de la
presente invención pero que se incluyen en el alcance de la
invención.
Preferentemente, la lisina, según la presente
invención, o el nucleótido que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica a la misma, es una forma sustancialmente
pura o está en una forma aislada.
El término "sustancialmente pura" se
utiliza para indicar que el componente, por ejemplo una lisina,
según la presente invención, y/o un nucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos, según la presente invención, está
presente en un alto nivel. El componente, esto es, una lisina,
según la presente invención, y/o un nucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina, según la presente
invención, es deseablemente el componente predominante presente en
la composición. Preferentemente está presente a un nivel superior
al 30%, superior al 50%, superior al 75%, superior al 90% o incluso
superior al 95%, estando determinado dicho nivel sobre la base de
peso seco/peso seco respecto de la composición total bajo
consideración.
A niveles muy altos (por ejemplo, superiores al
90%, superiores al 95% o superiores al 99%) el componente se podría
considerar como que está "aislado". Las sustancias
biológicamente activas de la presente invención (que incluyen
polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, restos
identificados/identificables mediante análisis, etc.) se podrían
proporcionar en una forma que este sustancialmente libre de uno o
más contaminantes con los que, de otra forma, la sustancia podría
estar asociada. Así, por ejemplo, ellas podrían estar
sustancialmente libres de uno o más polipéptidos potencialmente
contaminantes y/o moléculas de ácido nucleico. Ellas podrían
proporcionarse en una forma que este sustancialmente libre de otros
componentes celulares (por ejemplo, de membranas celulares, de
citoplasma, etc.). Cuando una composición está sustancialmente
libre de un contaminante determinado, el contaminante podría estar
en un nivel bajo (por ejemplo, a un nivel inferior al 10%, inferior
al 5% o inferior al 1% sobre la base de peso seco/peso seco
establecida anteriormente).
La lisina, según la presente invención, podría
estar en forma de, y/o se podría administrar como, una sal
farmacéuticamente aceptable, tal como una sal de adición de ácido o
una sal de base, o un solvato de la misma, que incluye un hidrato
de la misma. Para una revisión de las sales adecuadas ver Berge
et al, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19.
Normalmente, una sal farmacéuticamente aceptable
se podría preparar fácilmente usando el ácido o base deseado de la
forma apropiada. La sal podría precipitar a partir de una solución
y recogerse mediante filtración o se podría recuperar por
evaporación del disolvente.
Las sales de adición de ácido adecuadas se
forman a partir de ácidos que forman sales no tóxicas y los
ejemplos son las sales clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato,
sulfato, bisulfato, nitrato, fosfato, hidrógeno fosfato, acetato,
maleato, fumarato, lactato, tartrato, citrato, gluconato,
succinato, sacarato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato,
bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato.
Las sales de base adecuadas se forman a partir
de bases que forman sales no tóxicas y los ejemplos son las sales
de sodio, potasio, aluminio, calcio, magnesio, zinc, diolamina,
olamina, etilendiamina, trometamina, cloro, meglumina y
dietanolamina. Para revisiones acerca de sales farmacéuticamente
aceptables ver Berge et al., J. Pharm. Sci., 66,
1-19 (1977); Gould P.L., International J. of
Pharmaceutics, 33 (1986), 201-217; y Bighley et
al., Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology, Marcel Dekker
Inc., New York (1996), Vol. 13, páginas
453-497.
Los solvatos farmacéuticamente aceptables del
compuesto de la invención, esto es de la lisina, incluyen los
hidratos de la misma.
De aquí en adelante, los compuestos, que
incluyan a la lisina, según su presente invención, o al huésped
transformado con un ácido nucleico que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la lisina, según la presente invención,
sus sales farmacéuticamente aceptables, sus solvatos y polimorfos,
definidos en cualquier aspecto de la invención (excepto los
compuestos intermedios en el proceso químico) se referirán como
"compuesto de la invención" o "agentes de la
invención".
La presente invención incluye, también, todas
las variaciones isotópicas adecuadas de la lisina o de una sal de
la misma farmacéuticamente aceptable. Una variación isotópica de
una lisina de la presente invención, o de una sal de la misma
farmacéuticamente aceptable, se define como una en la que, al menos,
un átomo se reemplaza por un átomo que tiene el mismo número
atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica
encontrada habitualmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos
que se pueden incorporar en el agente, y las sales de mismo
farmacéuticamente, aceptables incluyen los isótopos de hidrógeno,
carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales
como ^{2}H, ^{3}H, ^{13}C, ^{14}C, ^{15}N, ^{17}O,
^{18}O, ^{31}P ^{32}P, ^{35}S, ^{18}F y ^{36}Cl,
respectivamente. Ciertas variaciones isotópicas del agente, y de las
sales de mismo farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, aquellas
en las que se incorpora un isótopo radiactivo tal como ^{3}H o
^{14}C, son útiles en los estudios de distribución tisular del
fármaco y/o sustrato. Los isótopos tritiados, esto es ^{3}H y
carbono-14, esto es ^{14}C, son particularmente
preferidos por su fácil preparación y su detectabilidad. Además, la
sustitución con isótopos tales como deuterio, esto es ^{2}H, puede
aportar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una
estabilidad metabólica mayor, por ejemplo, vida media in vivo
aumentada o requerimientos de dosificación reducidos y, por tanto,
se podrían preferir en algunas circunstancias. Las variaciones
isotópicas de la lisina, y de las sales de la misma
farmacéuticamente aceptables, se pueden preparar, generalmente,
mediante procedimientos convencionales utilizando las variaciones
isotópicas apropiadas de los reactivos adecuados.
Los expertos en la técnica apreciarán que la
lisina de la presente invención se podría derivar a partir de un
profármaco. Los ejemplos de profármacos incluyen entidades que
tienen ciertos grupos protegidos y que podrían no poseer actividad
farmacológica como tales, pero, en ciertos casos, se podrían
administrar (tal como oral o parenteralmente) y a partir de ese
momento se metabolizarían en el organismo para formar el agente que
fuera farmacológicamente activo.
Todos los derivados y profármacos protegidos de
los compuestos de la presente invención se incluyen en el alcance
de la invención.
Se podrá apreciar que ciertos restos conocidos
como "pro-restos", como por ejemplo los
descritos en "Design of Prodrugs" de H. Bundgaard, Elsevier,
1985 (la revelación de los cuales se incorpora en esta descripción
por referencia), se podrían colocar sobre funcionalidades
apropiadas de los agentes. Tales profármacos se incluyen, también,
en el alcance de la invención.
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La presente invención proporciona, también, una
composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva del agente de la presente invención, esto
es; una lisina según la presente invención, y un vehículo, diluyente
o excipiente, farmacéuticamente aceptable (incluyendo combinaciones
de los mismos).
Las composiciones farmacéuticas podrían ser para
uso humano o animal en medicina humana y veterinaria y,
habitualmente, comprenderán uno cualquiera, o más de uno, de los
diluyentes, vehículos o excipientes, farmacéuticamente aceptables.
En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica
podría ser para su uso en aves de corral, en particular crías de
pollo. Los vehículos o diluyentes aceptables para el uso terapéutico
son muy conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por
ejemplo, en ``Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing
Co. (A.R. Gennaro edil 1985). La elección del vehículo, diluyente o
excipiente farmacéutico se puede realizar en base a la ruta de
administración que se pretenda seguir y a la práctica farmacéutica
estándar. Las composiciones farmacéuticas podrían comprender como,
o además de, vehículo, diluyente o excipiente, cualquier agente
aglutinante, lubricante, de resuspensión, de recubrimiento o
solubilizante.
Se pueden proporcionar agentes conservantes,
estabilizantes, colorantes e incluso aromatizantes, en la
composición farmacéutica. Los ejemplos de agentes conservantes
incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres del ácido
p-hidroxibenzoico. Se podrían usar también agentes
antioxidantes y de resuspensión.
Podría haber diferentes requerimientos de
composición/formulación dependiendo de los distintos sistemas de
liberación. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la
presente invención se podría formular para liberarse utilizando una
mini-bomba o por vía mucosa, por ejemplo, como un
pulverizador o aerosol para inhalación nasal o una solución para
ingerir; o parenteralmente, en la que la composición se formula
para una forma inyectable, para la liberación, por ejemplo, por vía
intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la
formulación se podría diseñar para su liberación por ambas
rutas.
Cuando el agente se va a liberar por vía mucosa
a través de la mucosa gastrointestinal, debería ser capaz de
permanecer estable durante el tránsito a través del tracto
gastrointestinal; por ejemplo, debería ser resistente a la
degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los
efectos detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones
farmacéuticas se pueden administrar por inhalación, en forma de un
supositorio o pesario; tópicamente en forma de loción, disolución,
crema, pomada o polvo para espolvorear; para su uso como parche en
la piel; oralmente en forma de comprimidos que contienen
excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos,
bien solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires,
disoluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o
colorantes; o ellos se pueden inyectar parenteralmente, por ejemplo
intravenosa, intramuscular o subcutáneamente. Para la
administración parenteral, las composiciones se podrían usar mejor
en forma de una solución acuosa estéril que podría contener otras
sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para
hacer la solución isotónica con la sangre. Para la administración
bucal o sublingual, las composiciones se podrían administrar en
forma de comprimidos o pastillas para chupar, que se pueden
formular en la forma
convencional.
convencional.
Para algunas formas de realización, los agentes
de la presente invención se podrían usar, también, en combinación
con una ciclodextrina. Se conoce que las ciclodextrinas forman
complejos de inclusión y de no inclusión con las moléculas de
fármaco. La formación_ de un complejo
fármaco-ciclodextrina podría modificar la
solubilidad, la tasa de disolución, la biodisponibilidad y/o las
propiedades de estabilidad de una molécula de fármaco. Los complejos
fármaco-ciclodextrina son útiles, generalmente,
para la mayoría de las formas de dosificación y de las rutas de
administración. Como una alternativa a la formación directa de
complejos con el fármaco, la ciclodextrina se podría usar como un
aditivo auxiliar, por ejemplo, como un vehículo, diluyente o agente
solubilizante. Las ciclodextrinas alfa, beta y gamma son las
utilizadas más comúnmente y se describen ejemplos adecuados en los
documentos WO-A-91/11172,
WO-A-94/02518 y
WO-A-98/55148.
En una forma de administración preferida, los
agentes de la presente invención se liberan sistémica ente (tal
como oral, bucal o sublingualmente), más preferentemente
oralmente.
Por lo tanto, preferentemente, el agente está en
una forma adecuada para la liberación oral.
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El término "administrado" incluye la
liberación mediante técnicas virales y no virales. Los mecanismos
de liberación viral incluyen, pero no se limitan a, vectores
adenovirales, vectores virales asociados a adenovirus (AAV),
vectores del virus del herpex, vectores retrovirales, vectores
lentivirales y vectores de baculovirus. Los mecanismos de
liberación no virales incluyen la transfección mediada por lípidos,
liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, compuestos anfifílicos
catiónicos superficiales (CFA) y combinaciones de los mismos.
El agente de la presente invención, esto es, una
lisina de la presente invención y/o un huésped transformado con un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleátidos que
codifica una lisina según la presente invención, se podría
administrar de forma aislada pero generalmente se administrará como
una composición farmacéutica, por ejemplo, cuando el agente está en
una mezcla con un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptable, seleccionado en base a la ruta de
administración que se pretende seguir y a la práctica farmacéutica
estándar.
Por ejemplo, el agente se puede administrar (por
ejemplo, oral o tópicamente) en forma de comprimidos, cápsulas,
óvulos, elixires, disoluciones o suspensiones, que podrían contener
agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación
inmediata, retardada, modificada, sostenida, en pulsos o
controlada.
Los comprimidos podrían contener excipientes
tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato sódico,
carbonato cálcico, fosfato cálcico dibásico y glicina; agentes de
desintegración tales como almidón (preferentemente de maíz, patata
o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y
ciertos silicatos complejos; y agentes aglutinantes de granulación
tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),
hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y acacia.
Adicionalmente, se podrían incluir agentes lubricantes tales como
estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y
talco.
Se podrían utilizar, también, composiciones
sólidas de un tipo similar como agentes de carga en cápsulas de
gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen
lactosa, almidón, una celulosa, azúcar dé la leche o
polietilenglicoles de alto peso molecular. Para las suspensiones
acuosas y/o elixires, el agente podía estar en combinación con
varios agentes edulcorantes o aromatizantes, con agentes colorantes
o tintes, con agentes emulsionantes y/o de resuspensión y con
diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y
combinaciones de los mismos.
El agente, esto es, una lisina de la presente
invención y/o un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina
según la presente invención se podría administrar en el alimento o
forraje del animal, o como un suplemento del alimento o forraje del
animal. En particular, la lisina de la presente invención y/o un
huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina según la presente
invención se podría incorporar en, o añadirse, a los alimentos de
las aves de corral.
Las rutas de administración (liberación)
incluyen, pero no se limitan a, una o más entre: oral (por ejemplo,
como un comprimido, cápsula, o como una solución para ingestión),
tópica, vía mucosas (por ejemplo, como un pulverizador nasal o un
aerosol para inhalación), nasal, parenteral (por ejemplo, mediante
una forma inyectable), gastrointestinal, intraespinal,
intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina,
intraocular, intradérmica, intracraneal, intratraqueal,
intravaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutánea,
oftálmica (que incluye en el interior del vítreo o de la cámara),
transdermal, rectal, bucal, fálica, vaginal, epidural,
sublingual.
Se debe entender que una lisina según la
presente invención y/o un huésped transformado con un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
una lisina según la presente invención, no necesitan administrarse
por la misma nata. Del mismo modo, si la composición comprende más
de un componente activo, estos componentes se podrían administrar
por rutas distintas.
Si el agente de la presente invención se
administra parenteralmente, los ejemplos de tal administración
incluyen la administración del agente por uno o más entre:
intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal,
intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal,
intracraneal, intramuscular o subcutáneamente; y/o mediante el uso
de técnicas de
infusión.
infusión.
Para la administración parenteral, es mejor usar
el agente en forma de una solución acuosa estéril que podría
contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa
para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Las
soluciones acuosas deberían estar tamponadas de forma adecuada
(preferentemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación
de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles
se lleva a cabo fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar
muy conocidas por los expertos en la técnica.
Como se indica, el agente de la presente
invención se puede administrar intranasalmente o por inhalación y
se libera convenientemente en forma de un polvo seco para inhalar o
en una presentación de un pulverizador de aerosol en un recipiente
presurizado, bomba, pulverizador o nebulizador, utilizando un
propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano
tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A^{TM})
o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA
227EA^{TM}), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso
de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se podría
determinar proporcionando una válvula para liberar una cantidad
medida. El recipiente presurizado, bomba, pulverizador o
nebulizador, podría contener una solución o suspensión del
compuesto activo, por ejemplo, utilizando una mezcla de etanol y el
propelente como solvente, que podría contener adicionalmente un
lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitan. Las cápsulas y
cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un
inhalador o insuflador se podrían formular para contener una mezcla
en polvo del agente y una base en polvo adecuada, tal como lactosa
o almidón.
Alternativamente, el agente de la presente
invención se puede administrar en forma de un supositorio o
pesario, o se podría aplicar tópicamente en forma de un gel,
hidrogel, loción, disolución, crema, pomada o polvo para
espolvorear. El agente de la presente invención se podría
administrar también dermal o transdermalmente, por ejemplo,
mediante el uso de un parche en la piel. Ellos se podrían
administrar también mediante una ruta pulmonar o rectal. Ellos se
podrían administrar también mediante una ruta ocular. Para el uso
oftálmico, los compuestos se pueden formular como suspensiones
micronizadas en una disolución salina estéril, isotónica, con el pH
ajustado, o preferentemente, como disoluciones en una disolución
salina estéril, isotónica, con el pH ajustado, opcionalmente en
combinación con un conservante tal como un cloruro de
bencilalconio. Alternativamente, ellas se podrían formular en una
pomada tal como vaselina.
Para la aplicación tópica en la piel, el agente
de la presente invención se puede formular como una pomada adecuada
que contiene el compuesto activo resuspendido o disuelto en, por
ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite
mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, un
compuesto de polioxietileno y polioxipropileno, una emulsión de cera
y agua. Alternativamente, se puede formular como una loción o crema
adecuada, resuspendida o disuelta en, por ejemplo, una mezcla de
uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de
sorbitan, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60,
cera de cetil ésteres, alcohol cetearílico,
2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Las composiciones de la presente invención se
podrían administrar mediante inyección directa.
Para algunas aplicaciones, el agente se
administra de forma oral, preferentemente.
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Normalmente, un médico o veterinario
determinarán la dosificación real que será más adecuada para un
individuo particular. El nivel de dosis específica y la frecuencia
de dosificación para cualquier individuo particular se podrían
modificar y dependerán de diversos factores que incluyen la
actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad
metabólica y la extensión de la acción del compuesto, la edad, el
peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, la
forma y el tiempo de administración, la tasa de excreción, la
combinación del fármaco, la gravedad de la afección particular y la
terapia que sufre el individuo. El agente y/o la composición
farmacéutica de la presente invención se podría administrar según
un régimen de 1 a 10 veces por día, tal como de una o dos veces por
día.
Para la administración oral y parenteral a seres
humanos o animales, el nivel de dosificación diaria del agente
podría ser en una dosis individual o en dosis divididas.
Dependiendo de las necesidades, el agente se
podría administrar en un dosis de 0,01 a 30 mg/kg de peso corporal,
tal como de 0,1 a 10 mg/kg, más preferentemente de 0,1 a 1 mg/kg de
peso corporal. Naturalmente, las dosificaciones mencionadas en esta
descripción son ejemplares de un caso promedio. Puede haber, por
supuesto, casos individuales que requieran un intervalo mayor o
menor de dosificación.
Normalmente, la dosis oral diaria podría ser,
por ejemplo, entre 20-1000 mg, preferentemente
50-300 mg, por ejemplo.
Las dosis adecuadas incluirán aquellas que
permitan una reducción terapéutica en el número de bacterias
patógenas del género Clostridium, en particular de bacterias
C. perfringens.
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Los agentes de la presente invención se podrían
formular en una composición farmacéutica, tal como en una mezcla
con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes adecuados,
mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica.
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Como se utiliza en esta descripción, el término
"individuo" se refiere a vertebrados, particularmente a
miembros de las especies de mamíferos. El término incluye, pero no
se limita a, animales domésticos, animales deportivos, ganado
agrícola, primates y seres humanos. El término "ganado
agrícola" incluye a las aves de corral, por ejemplo las crías de
pollo.
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Preferentemente, los compuestos de la invención
(y las combinaciones) son oralmente biodisponibles. La
biodisponibilidad oral se refiere a la proporción de un fármaco
administrado oralmente que alcanza la circulación sistémica. Los
factores que determinan la biodisponibilidad oral de un fármaco son
la disolución, la permeabilidad de la membrana y la estabilidad
metabólica. Normalmente, para determinar la biodisponibilidad oral,
se utiliza una cascada de análisis, con técnicas in vitro,
en primer lugar, y posteriormente con técnicas in vivo.
La disolución, la solubilización del fármaco por
el contenido acuoso del tracto gastrointestinal (TGI), se puede
predecir a partir de experimentos de solubilidad in vitro
realizados a un pH apropiado para mimetizar el TGI.
Preferentemente, los compuestos de la invención tienen una
solubilidad mínima de 50 mcg/ml. La solubilidad se puede determinar
mediante procedimientos estándar, conocidos en la técnica, tales
como los descritos en "Adv. Drug Deliv. Rev. 23,
3-25, 1997".
La permeabilidad de la membrana se refiere al
paso del compuesto a las células del TGI. La lipofilia es una
propiedad clave para predecirla y se define mediante las medidas de
Log D_{7,4} in vitro, utilizando disolventes orgánicos y un
tampón. Preferentemente, los compuestos de la invención tienen un
Log D_{7,4} de -2 a +4, más preferentemente de -1 a +2. El log D
se puede determinar mediante procedimientos estándar conocidos en
la técnica, tales como los descritos en "J. Pharm. Pharmacol.
1990, 42: 144".
Los ensayos en monocapas celulares, tales como
el de CaCO_{2}, refuerzan sustancialmente la predicción de una
permeabilidad de membrana favorable en presencia de transportadores
de flujo de salida, tales como la p-glicoproteína,
denominado de flujo en caco-2. Preferentemente, los
compuestos de la invención tienen un flujo en
caco-2 superior a 2x10^{6} cros^{-1}, más
preferentemente mayor de 5x10^{6} cros^{-1}. El valor de flujo
en caco se puede determinar por procedimientos estándar conocidos
en la técnica, tales como los descritos en "J. Phar. Sci. ,1990,
79, 595-600".
La estabilidad metabólica se refiere a la
capacidad del TGI o del hígado para metabolizar los compuestos
durante el proceso de absorción: el efecto del primer paso. Los
sistemas de ensayo, tales como microsomas, hepatocitos, etc,
predicen la susceptibilidad metabólica. Preferentemente, los agentes
de la presente invención muestran una estabilidad metabólica en el
sistema de ensayo que es equivalente a una extracción hepática menor
de 0,5. Los ejemplos de los sistemas de ensayo y de la manipulación
de datos se describen en "Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 201, 4,
36-44, Drug Met. Disp., 2000, 28,
1518-1523".
Debido a la interacción de los procedimientos
anteriores, una prueba adicional de que un fármaco será oralmente
biodisponible en seres humanos se puede obtener mediante
experimentos in vivo en animales. La biodisponibilidad
absoluta se determina en estos estudios mediante la administración
del agente de forma aislada o en mezclas, por una ruta oral. Para
las determinaciones absolutas (% absorción) se emplea también la
ruta intravenosa. Se pueden encontrar ejemplos de la determinación
de biodisponibilidad oral en animales en "Drug Met. Disp., 2001,
29, 82-87", "J. Med. Chem, 1997, 40,
827-829", Drug Met. Disp., 1999, 27,
221-226.
\vskip1.000000\baselineskip
La lisina según la presente invención se podría
preparar mediante técnicas de síntesis química.
La lisina o las variantes, homólogos, derivados,
fragmentos o compuestos miméticos de la misma, se podrían producir
utilizando procedimientos químicos para sintetizar el agente de
forma completa o parcial. Por ejemplo, los péptidos se pueden
sintetizar mediante técnicas en fase sólida, ruptura de la resina y
purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución
preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures and
Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). La
composición de los péptidos sintéticos se podría confirmar mediante
análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, por el
procedimiento de degradación de Edman; Creighton, supra).
La síntesis directa de la lisina, o de las
variantes, homólogos, derivados, fragmentos o compuestos miméticos
de la misma, se puede realizar utilizando varias técnicas en fase
sólida (Roberge JY et al., (1995) Science 269:
202-204) y se podría llevar a cabo síntesis
automática, por ejemplo, utilizando el ABI 43 1A Peptide
Synthesizer (Perkin Elmer), según las instrucciones proporcionadas
por el fabricante. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos
que comprenden el agente o cualquier parte del mismo, se podrían
alterar durante la síntesis directa y/o combinar, utilizando
procedimientos químicos, con una secuencia de otras subunidades, o
de cualquier parte de las mismas, para producir un agente
variante.
En una forma de realización de la invención
alternativa, las secuencias codificadoras de la lisina o de las
variantes, homólogos, derivados, fragmentos o compuestos miméticos
de la misma, se podrían sintetizar, total o parcialmente,
utilizando procedimientos químicos muy conocidos en la técnica
(véase Caruthers MH et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser
215-23, Horn T. et al. (1980) Nuc. Acids
Res. Symp. Ser. 225-232).
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Como se utiliza en esta descripción, el término
"compuesto mimético" se refiere a cualquier compuesto químico
que incluye, pero no se limita a, un péptido, un polipéptido, un
anticuerpo o cualquier otro compuesto químico orgánico que tenga la
misma actividad o efecto cualitativo que el agente de referencia.
Este compuesto mimético podría ser un equivalente funcional de un
agente conocido.
Los términos "derivado" o
"derivatizado" como se utilizan en esta descripción, incluyen
la modificación química de un agente. Un ejemplo ilustrativo de
estas modificaciones químicas podría ser reemplazar un hidrógeno por
un grupo halo, un grupo alquilo, un grupo acilo o un grupo
amino.
En una forma de realización de la presente
invención, la lisina podría ser una lisina modificada
químicamente.
La modificación química de una lisina podría ser
un aumento o reducción de una interacción del enlace de hidrógeno,
una interacción de carga, una interacción hidrofóbica, una
interacción de Van Der Waals o una interacción de dipolo entre el
agente y la diana.
En un aspecto, la lisina identificada podría
actuar como un modelo (por ejemplo, un molde) para el desarrollo de
otros compuestos.
En una forma de realización de la presente
invención, una lisina según la presente invención se podría
administrar directamente a un individuo.
En otra forma de realización de la presente
invención, se administra a un individuo un vector que comprende un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica un lisina de la presente invención.
Preferentemente, el agente recombinante se
prepara y/o se libera al sitio diana utilizando un vector
genético.
Como se conoce muy bien en la técnica, un vector
es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una
entidad desde un ambiente a otro. Según la presente invención, y a
modo de ejemplo, algunos vectores usados en técnicas de ADN
recombinante permiten que entidades, tales como un segmento de ADN
(tal como un segmento de ADN heterólogo , tal como un segmento de
cADN heterólogo), se transfiera al interior de un huésped y/o una
célula diana, con el propósito de la replicación de los vectores
que comprenden las secuencias de nucleótidos de la presente
invención y/o la expresión de proteínas de la invención, codificada
por las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Los
ejemplos de vectores usados en las técnicas de ADN recombinante
incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas, cromosomas
artificiales o virus.
El término "vector" incluye a los vectores
de expresión y/o a los vectores de transformación.
El término "vector de expresión" significa
una construcción capaz de expresarse in vivo o in
vitro/ex vivo.
El término "vector de transformación"
significa una construcción capaz de transferirse de una especie a
otra.
Los vectores que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican una lisina de la presente invención se
podrían administrar directamente como "una construcción de un
ácido nucleico desnudo" que comprende además, preferentemente,
secuencias flanqueadoras homólogas a las del genoma de la célula
huésped.
Como se utiliza en esta descripción "ADN
desnudo" se refiere a un plásmido que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica un agente de la presente invención junto
con una región promotora corta que controla su producción. Se
denomina ADN "desnudo" porque los plásmidos no se incluyen en
ningún vehículo de liberación. Cuando este plásmido de ADN entra en
la célula huésped, tal como una célula eucariota o procariota, las
proteínas que codifica (tales como un agente de la presente
invención) se transcriben y se traducen en la célula.
Alternativamente, los vectores que comprenden
secuencias de nucleótidos de la presente invención o una lisina de
la presente invención, se podrían introducir en el interior de las
células huésped adecuadas utilizando las distintas técnicas virales
que se conocen en la técnica, tales como transfección,
transformación, electroporación y transformación biolística.
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Como se utiliza en esta descripción, el término
"transfección" se refiere a un proceso que usa un vector no
viral para liberar un gen en una célula diana de un mamífero.
Los procedimientos de transfección habituales
incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada
por lípidos, transfección mediada por ADN compactado, liposomas,
inmunoliposomas, lipofectina, mediada por un agente catiónico,
compuestos anfifílicos catiónicos superficiales (CFA) (Nature
Biotechnology 1996, 14: 556), cationes multivalentes tales como
espermina, lípidos catiónicos o polilisina, complejos
1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano
(DOTAP)-colesterol (Wolff y Trubetskoy, 1998,
Nature Biotechnology 16: 421) y combinaciones de los mismos.
La captación de construcciones de ácido nucleico
desnudo por células de mamífero se aumenta mediante distintas
técnicas de transfección conocidas, por ejemplo las que incluyen el
uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes
incluyen agentes catiónicos (por ejemplo fosfato cálcico y
DEAE-dextrano) y lipofectantes (por ejemplo
lipofectam^{TM} y transfectam^{TM}). Normalmente, las
construcciones de ácido nucleico se mezclan con el agente de
transfección para producir una composición.
Alternativamente, los vectores que comprenden un
agente de la presente invención o secuencias de nucleótidos de la
presente invención, se podrían introducir en el interior de las
células huésped adecuadas utilizando las distintas técnicas virales
que se conocen en la técnica, tales como por ejemplo, infección con
vectores virales recombinantes, tales como retrovirus, virus del
herpes simple y adenovirus.
Preferentemente, el vector es un vector viral
recombinante. Los vectores virales recombinantes adecuados
incluyen, pero no se limitan a, vectores de adenovirus, vectores
virales asociados a adenovirus (AAV), vectores del virus del
herpes, un vector retroviral, vectores lentivirales, vectores de
baculovirus, vectores del virus de la viruela o vectores de
parvovirus (véase Kestler et al., 1999 Human Gene Ther 10
(10): 1619-32). En el caso de vectores virales, la
liberación del ácido nucleico, que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica el agente de la presente invención, está
mediada por la infección viral de una célula diana.
El término "vector dirigido" se refiere a
un vector cuya capacidad para infectar/transfectar/transducir a una
célula o de expresarse en un huésped y/o una célula diana se
restringe a ciertos tipos celulares en el organismo huésped,
generalmente células que tienen un fenotipo común o similar.
El ácido nucleico que comprende las secuencias
de nucleótidos que codifican una lisina de la presente invención se
podrían incorporar en un vector recombinante replicable. El vector
se podría usar para replicar la secuencia de nucleótidos en una
célula huésped compatible. Así, en una forma de realización de la
presente invención, la invención proporciona un procedimiento para
generar ácidos nucleicos, que comprenden las secuencias de
nucleótidos de la presente invención, mediante la introducción de
un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la
presente invención en un vector replicable, la introducción del
vector en una célula huésped compatible y el crecimiento de la
célula huésped bajo condiciones que conducen a la replicación del
vector. El vector se podría recuperar de la célula huésped.
Preferentemente, una lisina de la presente
invención o una secuencia de nucleótidos de la presente invención,
que está insertada en un vector, se une funcionalmente a una
secuencia de control que es capaz de permitir la expresión de la
secuencia codificadora por la célula huésped, esto es, el vector es
un vector de expresión. El término "ligado funcionalmente" se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
están en una relación que les permite funcionar de la forma que se
pretende. Una secuencia reguladora "unida funcionalmente" a
una secuencia codificadora se une de tal forma que la expresión de
la secuencia codificadora se alcanza bajo condiciones compatibles
con las secuencias control. El término "secuencias
reguladoras" incluye elementos promotores y potenciadores y
otras señales de regulación de la expresión.
La expresión potenciada del polinucleótido que
codifica el polipéptido de la invención se podría alcanzar,
también, mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas,
por ejemplo, de regiones promotora, señal de la secreción y
terminadora, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea,
los niveles de secreción de la proteína de interés a partir del
huésped de expresión elegido y/o para proporcionar un control
inducible de la expresión del polipéptido de la presente
invención.
Una lisina de la presente invención producida
por una célula huésped recombinante se podría secretar o se podría
almacenar intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o vector
utilizado. Como entenderán los expertos en la técnica, se pueden
diseñar vectores de expresión, que contienen secuencias que
codifican un agente de la presente invención, con secuencias señal
que dirigen la secreción de las secuencias que codifican la lisina
de la presente invención a través de una membrana celular
procariota o eucariota.
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Además del promotor nativo del gen del
polipéptido de la invención, se podrían usar otros promotores para
dirigir la expresión del polipéptido de la invención.
El promotor se podría seleccionar por su
eficiencia para dirigir la expresión del polipéptido de la
invención en el huésped de expresión deseado.
En otra forma de realización, se podría
seleccionar un promotor constitutivo para dirigir la expresión del
polipéptido de la invención deseado. Los ejemplos de promotores
fuertes constitutivos y/o inducibles que se prefieren para su uso en
huéspedes de expresión fúngicos son aquéllos que se obtienen a
partir de los genes fúngicos de la xilanasa (x/nA), fitasa,
ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa
fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenesa
(AdhA), \alpha-amilasa (amy),
amiloglucosidasa (AG del gen glaA), acetamidasa (amdS)
y gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd).
Los ejemplos de promotores fuertes de levaduras
son los que se obtienen de los genes de alcohol deshidrogenasa,
lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosafosfato
isomerasa.
Los ejemplos de promotores bacterianos fuertes
son los promotores de la \alpha-amilasa y
SP02, así como los promotores de los genes de proteasas
extracelulares.
Se podrían usar también promotores híbridos para
mejorar la regulación inducible de la construcción de
expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de la presente invención se podrían
transformar o transfectar en una célula huésped adecuada y/o en un
célula diana, como se describirá más adelante, para proporcionar la
expresión de una lisina de la presente invención. Este proceso
podría comprender el cultivo de la célula huésped y/o la célula
diana, transformada con un vector de expresión, bajo condiciones que
proporcionen la expresión, a partir del vector, de una secuencia
codificadora que codifica una lisina de la presente invención y,
opcionalmente, la recuperación del agente de la presente invención
expresado. Los vectores podrían ser, por ejemplo, plásmidos o
vectores virales provistos de un origen de replicación,
opcionalmente un promotor, para la expresión de dicho polinucleótido
y, opcionalmente, de un regulador del promotor. Los vectores
podrían contener uno o más genes marcadores seleccionables, por
ejemplo el gen de resistencia a ampicilina, en el caso de un
plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a neomicina, para un
vector de mamíferos. La expresión de un agente de la presente
invención, o una diana de la presente invención, podría ser
constitutiva, de forma que se produjera continuamente, o inducible,
de forma que se requeriría un estímulo para iniciar la expresión.
En el caso de una expresión inducible, la producción de un agente
de la presente invención, o de una diana, se puede iniciar cuando se
requiera, por ejemplo, por la adición de una sustancia inductora al
medio de cultivo, por ejemplo, dexametasona o IPTG.
\vskip1.000000\baselineskip
A menudo, es deseable que el polipéptido de la
invención se secrete, a partir del huésped de expresión, en el
medio de cultivo, a partir del cual se podría recuperar más
fácilmente el polipéptido de la invención. Según la presente
invención, se podría usar la secuencia señal de secreción nativa del
polipéptido de la invención para efectuar la secreción del
polipéptido de la invención expresado. Sin embargo, un aumento en
la expresión del polipéptido de la invención resulta, algunas
veces, en la producción de la proteína a niveles superiores a los
que el huésped de expresión es capaz de procesar y secretar,
creando un cuello de botella de forma que la proteína producto se
acumula en la célula. De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona, también, secuencias señal heterólogas para
proporcionar la secreción más eficiente del polipéptido de la
invención, a partir del huésped de expresión
seleccionado.
seleccionado.
Según la presente invención, la señal de
secreción se podría seleccionar basándose en el huésped de
expresión deseado. Se podría elegir una señal de secreción
heteróloga que sea homóloga a otras regiones reguladoras de la
construcción de expresión. Por ejemplo, se podría usar la señal de
la proteína, altamente secretada, amilogluocosidasa (AG), en
combinación con el mismo promotor de la amilogluocosidasa (AG), así
como en combinación con otros promotores. Se podrían usar, también,
secuencias señal híbridas en el contexto de la presente
invención.
Los ejemplos de secuencias señal de secreción
heterálogas preferidas son las originadas a partir del gen de la
amilogluocosidasa (AG) fúngica (glaA, tanto la versión de 18
como la de 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), el
gen del factor \alpha (levaduras, por ejemplo,
Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de la
\alpha-amilasa
(Bacillus).
(Bacillus).
\vskip1.000000\baselineskip
La lisina de la presente invención se podría
expresar como una proteína de fusión para ayudar en la extracción y
purificación y/o liberación de la lisina de la presente invención a
un individuo. Los ejemplos de moléculas asociadas a las proteínas
de fusión incluyen
glutatión-S-transferasa (GST),
6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o de activación
transcripcional) y \beta-galactosidasa. Podría
ser conveniente, también, incluir un sitio de rotura proteolítica
entre la molécula asociada de la proteína de fusión y la secuencia
de la proteína de interés para permitir la eliminación de las
secuencias de la proteína de fusión. Preferentemente, la proteína
de fusión no impedirá la actividad de la
lisina.
lisina.
La proteína de fusión podría comprender un
antígeno o un determinante antigénico fusionado a la sustancia de
la presente invención. En esta forma de realización, la proteína de
fusión podría ser una proteína de fusión, que no ocurre de forma
natural, que comprenda una sustancia que podría actuar como un
adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación
generalizada del sistema inmune.
El antígeno o determinante antigénico podría
estar unido al extremo amino o al extremo carboxilo terminal de la
sustancia.
En otra forma de realización de la invención, la
secuencia de aminoácidos podría estar unida a una secuencia
heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para
el análisis de una peptidoteca para la detección de agentes capaces
de afectar a la actividad de la sustancia, podría ser útil codificar
una sustancia quimérica que exprese un epítopo heterólogo que sea
reconocido por un anticuerpo, disponible comercialmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden emplear una amplia variedad de células
huésped para la expresión de secuencias de nucleótidos que
codifiquen la lisina de la presente invención. Estas células
huésped podrían ser células huésped tanto procariotas como
eucariotas. Así, en una aspecto adicional de la invención se
proporciona un proceso para la preparación de polipéptidos según la
invención que comprende el cultivo de una célula huésped
transformada o transfectada con un vector de expresión, como se
describió anteriormente, bajo condiciones que proporcionen la
expresión por un vector de un secuencia codificadora que codifique
los polipéptidos, y la recuperación de los polipéptidos expresados.
Las células huésped incluyen bacterias tales como Escherichia
coli, Lactobacillus spp., Bacillus spp. y Lactococcus
spp., levaduras, hongos filamentosos, células de insecto,
células de mamífero, normalmente inmortalizadas, por ejemplo, líneas
celulares de ratón, CHO, de seres humanos y de monos y derivados de
las mismas.
Los vectores podrían ser, por ejemplo, vectores
de plásmidos, virus o fagos que tengan un origen de replicación,
opcionalmente un promotor, para la expresión de dicho
polinucleótido y, opcionalmente, un regulador del promotor. Los
vectores podrían contener uno o más genes marcadores de selección.
Los sistemas de selección más adecuados para los microorganismos
industriales son los formados por el grupo de marcadores de
selección que no requieren una mutación en el organismo huésped.
Ejemplos de marcadores de selección fúngicos son los genes de
acetamidasa (amdS), ATP sintetasa, subunidad 9
(oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), y resistencia a fleomicina y benomil (benA). Los
ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen
bacteriano de resistencia a G418 (este podría utilizarse también en
lavaduras, pero no en hongos), el gen de resistencia a ampicilina
(E. coli), el gen de resistencia a neomicina
(Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que
codifica la \beta-glucuronidasa (GUS). Los
vectores se podrían usar in vitro, por ejemplo para la
producción de ARN, o utilizarse para transfectar o transformar una
célula huésped.
Una forma de realización adicional de la
invención proporciona células huésped, transformadas o
transfectadas con un polinucleótido de la invención.
Preferentemente, dicho polinucleótido está incluido en un vector
para la replicación y expresión de dicho polinucleótido. Las
células se elegirán para que sean compatibles con dicho vector y
podrían, por ejemplo, ser células procariotas (por ejemplo
bacterianas), de hongos, de levaduras o de plantas.
Las bacterias de los géneros Bacillus y
Lactobacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos
debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de
cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las del género
Lactococcus.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido de la invención, y/o de que se desee un
procesamiento adicional de la proteína expresada, se podrían
preferir los huéspedes eucariotas tales como levaduras u hongos. En
general, se prefieren las células de levaduras a las células de
hongos debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo,
algunas proteínas, bien se secretan de forma ineficiente de las
células de levaduras, o bien, en algunos casos, no se procesan
apropiadamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levaduras). En
estos casos, se debería seleccionar un organismo huésped
fúngico.
Se podría elegir, también, un huésped heterólogo
en el que el polipéptido de la invención se produzca en una forma
que esté sustancialmente libre de otras lisinas. Esto se podría
conseguir eligiendo un huésped que normalmente no produzca tales
agentes.
Los ejemplos de huéspedes de expresión
preferidos en el alcance de la presente invención son los hongos,
tales como las especies de Aspergillus y las especies de
Trichoderma; las bacterias tales como las especies de
Bacillus y las especies de Lactobacillus; y las
levaduras tales como las especies de Kluyveromyces y las
especies de
Saccharomyces.
Saccharomyces.
Los huéspedes de expresión particularmente
preferidos se podrían seleccionar entre Aspergillus niger var.
tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis,
Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei,
Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis
y Saccharomyces cerevisiae.
Según la presente invención, la producción del
polipéptido de la invención se puede efectuar mediante el cultivo
de los huéspedes de expresión microbianos, que se han transformado
con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio
de fermentación de nutrientes convencional.
El medio de fermentación puede comprender un
medio de cultivo conocido que contenga una fuente de carbono (por
ejemplo, glucosa, maltosa, molasa, etc.), una fuente de nitrógeno
(por ejemplo, sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico,
etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de
levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes
inorgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro,
etc.). Opcionalmente, se podría añadir un inductor.
La selección del medio apropiado se podría
realizar en base a la elección de los huéspedes de expresión y/o en
base a los requerimientos reguladores de la construcción de
expresión. Estos medios son muy conocidos por los expertos en la
técnica. El medio podría, si se desea, contener componentes
adicionales que favorezcan a los huéspedes de expresión
transformados sobre los otros microorganismos potencialmente
contaminantes.
Después de la fermentación, las células se
pueden separar del medio de fermentación mediante centrifugación o
filtración. Después de separar las células, el polipéptido variante
de la invención se podría recuperar y, si se desea, purificar y
aislar mediante procedimientos convencionales.
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El término "organismo" referido a la
presente invención incluye a cualquier organismo que pudiera
comprender un ácido nucleico que comprenda la secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina según la presente invención y/o
productos obtenido de la misma, en el que la secuencia reguladora de
la trascripción pueda permitir la expresión de la secuencia de
nucleótidos según la presente invención cuando esta presente en el
organismo. Los organismos adecuados podrían incluir un procariota,
un hongo, una levadura o una planta. Un organismo preferido podría
ser una bacteria, preferentemente del género Lactobacillus,
más preferentemente Lactobacillus acidophilus.
El término "organismo transgénico" referido
a la presente invención incluye a cualquier organismo que comprenda
al ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína según la presente invención y/o productos
obtenido de la misma, en el que la secuencia reguladora de la
trascripción puede permitir la expresión de la secuencia de
nucleótidos según la presente invención en el organismo.
Preferentemente la secuencia de nucleótidos se incorpora en el
genoma del organismo.
El término "organismo transgénico" no
incluye a las secuencias codificadoras de nucleótidos nativas en su
entorno natural, cuando ellas están bajo el control de su promotor
nativo, que está también en su entorno natural.
Por tanto, el organismo transgénico
de-la presente invención incluye a un organismo que
comprende una cualquiera de, o combinaciones de, la secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos según la
presente invención, construcciones según la presente invención
(incluyendo combinaciones de las mismas), vectores según la
presente invención, plásmidos según la presente invención, células
según la presente invención, tejidos según la presente invención o
productos de los mismos. La célula u organismo transformado podría
preparar cantidades aceptables del compuesto deseado que se
recuperaría fácilmente a partir de la célula u organismo.
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Como se indicó anteriormente, el organismo
huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos
de huéspedes procariotas adecuados incluyen E. coli, Bacillus
subtilis o Lactobacillus acidophilus. La información
acerca de la transformación de huéspedes procariotas está bien
documentada en la técnica, véase por ejemplo Sambrook et al.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons,
Inc.
Si se utiliza un huésped procariota, podría
haber necesidad de una modificación adecuada de la secuencia de
nucleótidos, tal como la eliminación de intrones.
\newpage
En otra forma de realización, el organismo
transgénico puede ser una levadura. A este respecto, las levaduras
se han utilizado extensamente como vehículo para la expresión
génica heteróloga. Hay una larga historia de uso industrial de las
especies de Saccharomyces cerevisiae, que incluyen su uso
para la expresión génica heteróloga. Goodey et al. (1987,
Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., eds, pp
401-429, Allen and Unwin, London) y King et
al., (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E.F. Walton
and G.T. Yarronton, eds, pp. 107-133, Blackie,
Glasgow) han revisado la expresión génica heteróloga en
Saccharomyces cerevisiae.
Por distintas razones, Saccharomyces
cerevisiae es una especie muy adecuada para expresión génica
heteróloga. Primero, no es patógena para seres humanos y no puede
producir ciertas endotoxinas. Segundo, tienen una larga historia de
uso seguro, después de varios siglos de explotación comercial para
distintos propósitos. Esto ha conducido a una amplia aceptabilidad
pública. Tercero, el uso comercial extensivo y la investigación
invertida en el organismo ha dado como resultado una gran cantidad
de información acerca de la genética y de la fisiología, así como de
las características de fermentación a gran escala de
Saccharomyces cerevisiae.
E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, "Yeast as a
vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol.
5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, eds, 2nd edition,
Academic Press Ltd) proporcionan una revisión de los principios de
la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y
de la secreción de los productos de los genes.
Distintos tipos de vectores de levaduras están
disponibles, que incluyen vectores de integración, que requieren
recombinación con el genoma del huésped para su mantenimiento, y
vectores plásmidos que se replican de forma autónoma.
Con el fin de preparar Saccharomyces
transgénicos, se preparan construcciones para la expresión por
inserción de la secuencia de nucleótidos de la presente invención
en una construcción diseñada para la expresión en levaduras. Se han
desarrollado distintos tipos de construcciones para su uso para
expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor
activo en levaduras, fusionado a la secuencia de nucleótidos de la
presente invención, generalmente se utiliza un promotor de
levaduras, tal como el promotor GAL1. Generalmente, se utiliza una
secuencia señal de levaduras, tal como la secuencia que codifica el
péptido señal SUC2. Un terminador activo en levaduras finaliza el
sistema de expresión.
Para la transformación de levaduras se han
desarrollado distintos protocolos de transformación. Por ejemplo,
se pueden preparar Saccharomyces transgénicos según la
presente invención mediante la información aportada por Hinnen
et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Science
of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104); y
Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153,
163-168).
Las células de levaduras transformadas se
seleccionan usando distintos marcadores de selección. Entre los
marcadores usados para la transformación están varios marcadores
auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores dominantes
de resistencia a antibióticos, tales como los marcadores del
antibiótico aminoglucósido, por ejemplo G418.
Otro organismo huésped es una planta. El
principio básico en la construcción de plantas modificadas
genéticamente es la inserción de información genética en el genoma
de la planta de forma que se obtenga un mantenimiento estable del
material genético insertado. Existen distintas técnicas para la
inserción de información genética, siendo los dos principios
principales la introducción directa de la información genética y la
introducción de la información genética mediante el uso de un
sistema vector. Una revisión de las técnicas generales se podría
encontrar en los artículos de Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol. [1991] 42: 205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech March/April 1994 17-27).
Información adicional acerca de la transformación en plantas se
podría encontrar en el documento
EP-A-0449375.
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Se podrían utilizar una amplia variedad de genes
indicadores en los procedimientos de detección y en los
procedimientos de análisis (así como de cribado) de la presente
invención, prefiriéndose los genes indicadores que proporcionen
señales convenientemente detectables (por ejemplo, por
espectroscopia). A modo de ejemplo, un gen indicador podría
codificar una enzima que catalice una reacción que altere las
propiedades de absorción de luz.
Los ejemplos de moléculas indicadoras incluyen,
pero no se limitan a, \beta-galactosidasa,
invertasa, proteína verde fluorescente, luciferasa, cloramfenicol,
acetiltransferasa, \beta-glucuronidasa,
exo-glucanasa y glucoamilasa. Alternativamente, se
pueden incorporar nucleótidos marcados radiactivamente, o con un
marcador fluorescente, en los transcriptos nacientes, que se
identifican posteriormente por unión a sondas de
oligonucleótidos.
En el procedimiento de detección de la presente
invención, la lisina o una porción de la misma se podría unir,
directa o indirectamente, mediante fusiones traduccionales
genéticas a un indicador, adecuadamente a una proteína fluorescente
(como por ejemplo, la proteína verde fluorescente).
\newpage
En la técnica se conocen una variedad de
protocolos para la detección y medida de la expresión de una
proteína, tal como el uso de anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos de la proteína. Los ejemplos incluyen
enzimoinmunoensayo (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y selección de
células activadas por fluorescencia (FAGS). Se prefiere un
inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales, frente a dos
sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos
epítopos o polipéptidos que no interfieren, pero se puede utilizar
un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen,
entre otras publicaciones, en Hampton R. et al. (1990,
Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) y
Maddox D.E. et al. (1983, J. Exp. Med 158: 1211).
La producción de la molécula indicadora se
podría medir mediante la actividad enzimática del producto de un
gen indicador, tal como \beta-galactosidasa.
Los expertos en la técnica conocen una amplia
variedad de marcajes y técnicas de conjugación y se pueden usar en
distintos ensayos de ácidos nucleicos o aminoácidos. Las técnicas
para producir sondas marcadas para hibridación o PCR, para la
detección de las secuencias de polinucleótidos diana, incluyen
marcaje de oligonucleótidos, desplazamiento de corte (nick
translation), marcaje en el extremo o amplificación por PCR
utilizando nucleótidos marcados. Alternativamente, la secuencia
codificadora, o cualquier porción de ella, se podrían clonar en un
vector para la producción de una sonda de m-ARN.
Estos vectores se conocen en la técnica, están disponibles
comercialmente y se podrían usar para sintetizar sondas de ARN
in vitro por adición de una ARN polimerasa adecuada, tal
como T7, T3 o SP6, y nucleótidos marcados.
Distintas compañías, tales como Pharmacia
Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) y US Biochemical
Corp (Cleveland, OH) proporcionan kit comerciales y protocolos para
estos procedimientos. Las moléculas indicadoras o los marcajes
adecuados incluyen los radionúclidos, enzimas, agentes
fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como
sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y
similares. Las patentes que dan información del uso de tales
marcajes incluyen los documentos
US-A-3817837;
US-A-3850752;
US-A-3939350;
US-A-3996345;
US-A-4277437;
US-A-4275149 y
US-A-4366241. También, se podrían
producir inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el
documento US-A-4816567.
Los procedimientos adicionales para cuantificar
la expresión de una molécula particular incluyen el radiomarcaje
(Melby P.C. et al., 1993. J. Immunol Methods 159:
235-44) o la biotinilación (Duplaa C. et al.,
1993. Anal. Biochem 229-36) de nucleótidos, la
co-amplificación de un ácido nucleico control, y
curvas estándar sobre las que se interpolan los resultados
experimentales. Se podría acelerar la cuantificación de múltiples
muestras mediante la realización de un ensayo en el formato de un
ELISA, en el que el oligómero de interés se presenta en varias
diluciones y se obtiene una cuantificación rápida mediante una
respuesta espectrofotométrica o calorimétrica.
Aunque la presencia/ausencia de expresión de un
marcador genético sugiere que el gen de interés está también
presente, se deberían confirmar su presencia y expresión. Por
ejemplo, si la secuencia de nucleótidos se inserta en la secuencia
de un gen marcador, las células recombinantes que contienen la
misma se podrían identificar por la ausencia de la función del gen
marcador. Alternativamente, un gen marcador se puede colocar en
serie con una secuencia codificadora diana bajo el control de un
único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la
inducción o selección, generalmente, indica también la expresión de
la diana.
Alternativamente, las células huésped que
contienen la secuencia que codifica la diana y que expresan las
regiones codificadoras diana, se podrían identificar por distintos
procedimientos, conocidos por los expertos en la técnica. Estos
procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridación de
ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayo de
proteínas o técnicas de inmunoensayo, que incluyen las tecnologías
con base en la membrana, en solución o en chip, para la detección
y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína.
Una cualquiera, o más de una, de las dianas
apropiadas, tales como una muestra que comprende uno o más
bacterias Clostridium patógenas, en particular bacterias
C. perfringens, se podrían usar para identificar una lisina,
según la presente invención, en cualquiera de las distintas
técnicas de cribado por fármacos. La diana empleada en este
análisis podría estar libre en solución, fijada a un soporte
sólido, expresada sobre una superficie celular o localizada
intracelularmente. La diana podría incluso estar en un modelo
animal, en el que dicha diana podría ser una diana exógena o una
diana introducida. El modelo animal será un modelo animal no
humano. Se podría medir la eliminación de la actividad diana o la
formación de complejos de unión entre la diana y la lisina que se
está analizando.
Se espera que los. procedimientos de análisis de
la presente invención sean adecuados para el cribado, tanto a
pequeña como a gran escala, de los compuestos bajo análisis, así
como en ensayos cuantitativos.
En un aspecto preferido, el cribado de la
presente invención comprende, al menos, las siguientes etapas (que
no son necesariamente en este mismo orden consecutivo): (a)
realizar un cribado in vitro para determinar si una lisina
candidata tiene la actividad relevante (tal como la capacidad de
lisar una o más bacterias Clostridium patógenas,
preferentemente bacterias C. perfringens); y (b) realizar un
cribado in vivo con dicha lisina candidata (por ejemplo,
utilizando un modelo animal funcional). Normalmente, si dicho agente
candidato supera el cribado (a), posteriormente se realiza el
cribado (c).
La presente invención proporciona, también, una
composición o kit de diagnóstico para la detección de una diana,
específicamente una bacteria Clostridium patógena,
particularmente una bacteria C. perfringens. A este
respecto, la composición o kit comprenderá un marcador de
diagnóstico basado en la lisina, según la presente invención, que
es capaz de indicar la presencia de una o más, o incluso la
ausencia de una o más, bacterias Clostridium,
particularmente la bacteria C. perfringens, en una muestra de
ensayo. Adecuadamente, la muestra bajo análisis podría ser, por
ejemplo, un producto alimenticio, un producto de digestión o una
muestra bajo análisis obtenida a partir del tracto intestinal de un
individuo.
La composición o kit de diagnóstico se podrían
usar para la detección de una diana, específicamente una bacteria
Clostridium patógena, particularmente una bacteria C.
perfringens, en, por ejemplo, un producto alimenticio, un
producto de digestión o similar.
La composición o kit de diagnóstico se podría
usar para el diagnóstico de trastornos provocados por la presencia
de una bacteria Clostridium patógena, particularmente C.
perfringens, tal como, por ejemplo, enteritis necrótica,
envenenamiento por alimentos o gangrena.
Tal ensayo de diagnóstico se podría diseñar para
evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento particular o de
una lisina particular y se podría usar en estudios animales, en
ensayos clínicos, o en la monitorización del tratamiento de un
individuo. Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico
de una enfermedad, se debería establecer el perfil normal o
estándar. Este se lleva a cabo mediante la combinación de fluidos
corporales, extractos celulares u otras muestras, tomadas de
individuos normales (esto es, no infectados), bien animales o seres
humanos, con la lisina de la presente invención. Si se establece
enfermedad, se administra un agente terapéutico, esto es, una lisina
según la presente invención y/o un huésped transformado con una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina según la presente
invención, y se podría generar el perfil o los valores del
tratamiento. Finalmente, el ensayo se podría repetir de forma
regular para evaluar si los valores progresan o regresan al patrón
normal o estándar, esto es, si la cantidad de bacterias en una
muestra, tal como en el intestino de un ave de corral durante el
tratamiento del mismo, se reduce y/o se erradica. Se podrían usar
perfiles de tratamiento sucesivos para mostrar la eficacia del
tratamiento a lo largo de un periodo de varios días o de varios
meses.
Con el fin de proporcionar una base para el
diagnóstico de una enfermedad, se deben establecer los valores
normales o estándar de la cantidad de bacterias Clostridium
patógenas, en particular bacterias C. perfringens, en una
muestra. Por ejemplo, un determinado nivel de dicha bacteria en el
tracto intestinal de un individuo podría no ser, necesariamente,
perjudicial para el individuo. Sólo cuanto el número de bacterias
aumenta por encima de un nivel umbral, se podrían observar efectos
perjudiciales y establecer un estado de enfermedad. Así, el
análisis de diagnóstico podría ser capaz de identificar la
presencia de bacterias Clostridium patógenas, en particular
C. perfringens, en una muestra, pero podría ser también
capaz de cuantificar el nivel de infección. La cantidad de
bacterias en una muestra se podría cuantificar mediante su
comparación con una serie de diluciones de controles positivos en
los que se hubiera añadido una cantidad conocida de bacterias.
Otro aspecto de la presente invención es que
proporciona la hibridación de un ácido nucleico o sondas de PCR que
son capaces de detectar (especialmente aquellas que son capaces de
distinguir selectivamente) secuencias de polinucleátidos, que
incluyen secuencias genómicas que codifican una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina según la presente invención, o
moléculas estrechamente relacionadas, tales como alelos. La
especificidad de la sonda, esto es, si se deriva de un región o
dominio altamente conservado, conservado o no conservado, y la
astringencia de la hibridación o amplificación (alta, intermedia o
baja) determinarán si la sonda identifica sólo secuencias de
nucleótidos, que ocurren de forma natural, que codifican una lisina
de la presente invención, o secuencias relacionadas. Las sondas
para la detección de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas se
seleccionan entre regiones de nucleótidos, conservadas o altamente
conservadas, de miembros de una familia diana y tales sondas se
podrían utilizar en un grupo de sondas degeneradas. Para la
detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticos, o en los que
se desea una especificidad máxima, las sondas de ácidos nucleicos
se seleccionan entre regiones de nucleótidos no conservadas o
regiones únicas de los polinucleótidos diana. Como se utiliza en
este documento, el término "región de nucleótidos no
conservada" se refiere a una región de nucleótidos que es única
para una secuencia que codifica la lisina revelada en esta
descripción y que no ocurre en miembros de la familia
relacionados.
La PCR como se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188 proporciona usos
adicionales para oligonucleótidos basados en las secuencias de
nucleótidos. Tales oligómeros se sintetizan químicamente,
generalmente, pero se podrían generar enzimáticamente o producirse
a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros comprenden,
generalmente, dos secuencias de nucleótidos, una con orientación en
sentido (5'->3') y una en sentido contrario (3'<-5') y se
utilizan bajo condiciones optimizadas para la identificación de un
gen o afección específica. Estos dos mismos oligómeros, parejas de
oligómeros solapantes o incluso un grupo de oligómeros degenerados,
se podrían utilizar bajo condiciones de menor astringencia para la
detección y/o cuantificación de secuencias de ADN o ARN
estrechamente relacionadas.
La secuencia del ácido nucleico que codifica una
tisina según la presente invención se puede usar, también, para
generar sondas de hibridación, como las descritas previamente, para
el mapeo de secuencias genómicas endógenas. La secuencia se podría
mapear en un cromosoma particular o en una región específica del
cromosoma usando técnicas muy conocidas. Estas incluyen hibridación
in situ a extensiones de cromosomas (Verma et al.
(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon
Press, New York City), preparaciones de cromosomas seleccionados
por flujo, o construcciones de cromosomas artificiales, tales como
los YAC, los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), las
construcciones PI bacterianas o genotecas de cDNA de un único
cromosoma.
La hibridación in situ de preparaciones
de cromosomas y las técnicas de mapeo físico, tales como el
análisis de ligamiento utilizando marcadores cromosómicos
establecidos, son de gran valor para extender los mapas genéticos.
Se pueden encontrar ejemplos de mapas genéticos en Science (1995;
270: 410f y 1994; 265: 1981f). A menudo la localización de un gen
sobre un cromosoma de otra especie de mamíferos podría revelar
marcadores asociados, incluso si no se conoce el número o el brazo
de un cromosoma humano particular. Se pueden asignar nuevas
secuencias a brazos cromosómicos, o a partes de los mismos,
mediante mapeo físico. Esto proporciona una valiosa información a
los investigadores que buscan los genes asociados a enfermedad
usando clonaje posicional u otras técnicas para descubrir genes.
Una vez que se ha localizado de forma general una enfermedad o
síndrome mediante ligamiento genético a una región genómica
particular, cualquier secuencia que mapee en este área podría
representar un gen regulador o asociado, para su investigación
adicional. La secuencia de nucleótidos de la presente invención se
podría usar también para detectar diferencias en la localización
cromosómica debidas a translocación, inversión, etc., entre
individuos normales, portadores o afectados.
En un sentido general, una lisina según la
presente invención y/o el huésped transformado con una secuencia de
nucleótidos que codifica una lisina según la presente invención, se
podrían usar en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de un trastorno asociado con la presencia de bacterias
Clostridium patógenas, en particular bacterias C.
perfringens.
La lisina según la presente invención y/o el
huésped transformado con una secuencia de nucleótidos que codifica
una lisina según la presente invención, se podrían usar para
analizar y/o destruir bacterias Clostridium patógenas, en
particular C. perfringens.
En particular, una lisina según la presente
invención y/o un huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina
según la presente invención, se podrían usar en la alimentación
animal o como un suplemento alimenticio animal para reducir la
cantidad de bacterias Clostridium patógenas, en particular
bacterias C. perfringens, en el tracto intestinal del
animal. Así, los trastornos tales como una ganancia de peso
reducida y la enteritis necrótica provocada por la presencia de
bacterias Clostridium patógenas, en particular bacterias
C. perfringens, se podría prevenir y/o tratar.
Una lisina según la presente invención y/o un
huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina según la presente
invención, se podrían usar, también, para prevenir y/o tratar la
gangrena y otras enfermedades asociadas con la presencia de
bacterias Clostridium patógenas, en particular bacterias
C. perfringens.
En adición o alternativamente a esto, una lisina
según la presente invención y/o un huésped transformado con un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica una lisina según la presente invención, se podrían usar en
un ensayo para analizar y detectar el agente causante en un brote
de envenenamiento por alimentos y/o para prevenir o tratar el
envenenamiento por alimentos en un individuo y/o como un diagnóstico
para propósitos de investigación.
Una lisina según la presente invención y/o un
huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina según la presente
invención, se podrían usar en la fabricación productos
alimenticios, que incluyen los de alimentación animal.
En una forma de realización, el alimento y/o
suplementos alimenticios de la presente invención se podrían
preparar mezclando la lisina según la presente invención y/o el
huésped transformado con un ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una lisina según la presente
invención, directamente, con un alimento y/o un suplementos
alimenticio. A modo de ejemplo, la lisina según la presente
invención y/o el huésped transformado con un ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lisina
según la presente invención, podrían entrar en contacto (por
ejemplo, por pulverización) con la superficie de un alimento con
base de cereales y/o un suplemento alimenticio tal como harina de
trigo molido, maíz o soja.
También es posible incorporar la lisina según la
presente invención y/o el huésped transformado con un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
una lisina según la presente invención, en un segundo (y diferente)
alimento y/o agua o alimentación para beber que se añade
posteriormente al alimento y/o suplemento alimenticio de la presente
invención. De acuerdo con esto, no es esencial que la lisina según
la presente invención y/o el huésped transformado con un ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
una lisina según la presente invención, se incorporen en el
alimento basado en cereales y/o el suplemento alimenticio mismos,
aunque tal incorporación constituye un aspecto particularmente
preferido de la presente invención.
En una forma de realización de la presente
invención, el alimento y/o suplemento alimenticio se podrían
combinar con otro alimento y/o componente alimenticio para producir
un alimento y/o alimentación con base de cereales. Este otro
alimento y componente alimenticio podría incluir uno o más de otros
(preferentemente termoestables) suplementos enzimáticos, alimentos
y/o suplementos alimenticios vitamínicos, alimento y/o suplementos
alimenticios minerales y alimento- y/o suplementos alimenticios de
aminoácidos. El alimento resultante (combinado) y/o el suplemento
alimenticio que comprende, posiblemente, varios tipos de compuestos
distintos se puede mezclar posteriormente en una cantidad apropiada
con el otro alimento y/o componente alimenticio, tal como
suplementos de cereales o proteínas, para formar un alimento humano
y/o una alimentación animal.
La invención se describirá ahora por medio de
ejemplos en los que se hará referencia a la siguientes Figuras:
La Figura 1 que muestra una secuencia de
nucleótidos;
La Figura 2 que muestra una secuencia de
aminoácidos;
La Figura 3 que muestra un mapa genómico:
La Figura 4 que muestra una gráfica, y
La Figura 5 que muestra una gráfica,
En más detalle;
La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID No. 1) que codifica una lisina según la presente
invención;
La Figura 2 muestra una secuencia de
amiminoácidos (SEQ ID No. 2) de una lisina según la presente
invención;
La Figura 3 muestra un mapa genómico del
bacteriófago (\phi3626) de Clostridium perfringens;
La Figura 4 muestra una gráfica de la lisis de
la cepa NCTC3110 de C. perfringens en un medio usando un
extracto crudo (RE) de E. coli que produce la lisina de
\phi3626; y
La figura 5 muestra una gráfica de especificidad
de sustrato de una lisina del bacteriófago \phi3626 de C.
perfringens frente a distintas especies y géneros de
bacterias.
Procedimiento: Se analizó la capacidad de
lisogenia de cincuenta y una cepas clostridiales, aisladas de
distintas fuentes, mediante la técnica de irradiación UV, como se
describe en Loessner et al. (1990, Appl. Environ. Microbiol,
56, 1912-8). Clostridias en crecimiento exponenecial
(10 ml) se expusieron a luz UV (254 nm, 0,0132 J cm^{-2}) durante
5 minutos. Después de 3 horas de incubación (37ºC) en oscuridad,
los cultivos se centrifugaron (10 min, 8000 g) y se esterilizaron
por filtraron. La actividad de los fagos se analizó mediante el
procedimiento de la placa de lisis sobre el césped bacteriano,
frente a todas las cepas de C. perfringens.
La técnica de la capa de agar blando descrita en
Adams (1959, Methods of study of bacterial viruses p.
443-457. Bacteriophages, Intersciences Publishers
Inc. NY) se utilizó para la purificación y la propagación de los
fagos. Se añadieron diluciones de los sobrenadantes que presentaban
actividad lítica, a 3,5 ml de agar blando fundido inoculado con 0,1
ml de un cultivo en crecimiento exponencial de la cepa en
propagación adecuada. El agar blando se vertió sobre placas TY y se
incubó durante toda la noche. Se recogieren placas individuales,
bien aisladas, con una pipeta Pasteur y se colocaron en 0,45 ml de
medio TY. Después de 4 horas de incubación a 4ºC, la solución que
contenía los fagos se esterilizó por filtración y se usó para un
segundo ciclo de purificación.
Para el aislamiento del ADN a partir de
bacteriófagos, fue esencial un cultivo con un título alto (10^{9}
pfu/ml). Los fagos se propagaron hasta títulos altos mediante
cultivos líquidos. Se añadió una solución de fago a un cultivo del
huésped apropiado (OD_{600 \ nm} de 0,1) con una multiplicidad de
infección de aproximadamente 1. El crecimiento del cultivo
infectado se monitorizó fotométricamente y los fagos se recogieron
después de eliminar los restos celulares por centrifugación (10000
g durante 10 minutos) y se esterilizaron por filtración del
sobrenadante de cultivo.
La purificación de los fagos a partir de
cultivos de título alto, necesaria para el trabajo molecular
adicional, se ha descrito en Zink et al. (1992, Appl.
Environ. Microbiol. 58, 296-302). Brevemente, los
fagos se purificaron y se concentraron mediante precipitación por
polietilenglicol 8000, se sometieron a una centrifugación en
gradiente de densidad de CsCI y se dializaron (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd
ed. Cold Spring Harbor Labaratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Las presuntas partículas de fago se examinaron por microscopia
electrónica (ME).
Resultados: Con las cepas ATCC3626 y
NCTC8533, la actividad lítica observada de un sobrenadante de
cultivo inducido por UV estéril, se debió a la presencia de
bacteriófagos, lo que se confirmó mediante ME. Los fagos fueron del
tipo Siphoviridae, y se denominaron \phi3626 y \phi8533.
Se determinó que el huésped de propagación óptimo para los dos
fagos eran las cepas NCTC3110 y ATCC3628, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento: La capacidad de los dos
fagos pera lisar a las cepas de C. perfringens se analizó
mediante la técnica de la gota sobre el césped bacteriano. Diez
\mul de los cultivos de fagos (10^{7} pfu/ml) se colocaron sobre
placas inoculadas con cepas de C. perfringens. La actividad
lítica se observó por la formación de placas en los céspedes
bacterianos, después de incubación durante toda la noche.
Resultados: El fago \phi3626 fue lítico
frente a 11 cepas de las 51 cepas de C. perfringens (21,6%)
mientras que el fago \phi8533 fue capaz de lisar a 4 cepas
(7,8%).
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento: El ADN genómico de
\phi3626 se obtuvo utilizando el procedimiento estándar para la
extracción del ADN del bacteriófago \lambda (véase Sambrook et
al., supra). La construcción de genotecas del bacteriófago
\phi3626 se realizó como se detalla en Loessner et al.
(2000 Mol. Microbiol. 35, 324-40). Se realizaron
una digestión de tiempo limitado del ADN con Tsp509I (New
England Biolabs) y una digestión total utilizando HindIII
(MBI Fermentas) y TaqI (Roche). Se recuperaron los
fragmentos de la longitud deseada (1-2 kpb) de un
gel de agarosa y se ligaron en el vector pBluescript (Stratagene).
Los productos de ligamiento se electroporaron en E. coli
DH5\alphaMCR, Se realizó un cribado de
blancas-azules sobre placas de agar que contenían
X-gal para la identificación de los transformantes
que contenían el inserto. Los plásmidos se aislaron a partir de
cultivos a pequeña escala (Quiagen Miniprep Kit; Quiagen) y se
digirieron con PauI (MBI). Se identificaron cincuenta y ocho
clones que contenían diferentes insectos, que variaban en una
longitud entre 1-2 kbp, por su patrón de
restricción, en un gel de agarosa. Estos clones se usaron para
secuenciación utilizando los cebadores estándar marcados con
fluorescencia (IRD-800 LI-COR) que
son complementarios a secuencias que flanquean múltiples sitios de
clonaje de pBluescript. La secuenciación se realizó usando una
polimerasa estable al calor (SequiTherm EXCEL II DNA Sequencing
Kit-LC; Epicentre Technologies) en un secuenciador
de ADN automático (4200 IR^{2}; LI-COR).
Las secuencias obtenidas se alinearon utilizando
el software DNASIS, versión 2,10 (Hitachi). Los resultados
derivados de este alineamiento se utilizaron para diseñar cebadores
específicos para cerrar los huecos. Los huecos que quedaban se
cerraron mediante la técnica de "primer walking" sobre ADN de
0626, hasta que se observó una cadena distintiva de terminación en
el sitio cos. La secuencia del genoma se finalizó mediante la
determinación de la secuencia núcleo en el sitio cos mediante PCR
sobre el ADN del huésped lisogénico, utilizando un cebador
complementario a las secuencias anteriores y posteriores al sitio
cos. Los productos de PCR y los segmentos de ADN de la aproximación
de "primer walking" se secuenciaron utilizando la técnica del
terminador teñido en un secuenciador de ADN automático ABI
373A.
Los programas DNASIS/PROSIS (Hitachi) y el Husar
Analysis Package, que incluye el paquete informático GCG
(http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de;
Biocomputing Service Group at the German Cancer Researh Center,
DKFZ), se usaron para el análisis de las secuencias de nucleótidos
y aminoácidos. El algoritmo BLAST, proporcionado en Altschul et
al. (1990, J. Mol. Biol. 215, 403-10), se
utiliza para las búsquedas de homología en las bases de datos
disponibles a través del National Center for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) o el Biocomputing Service
Group.
Resultados: El genoma de \phi3626 tiene
una longitud de 33507 pb con extremos cohesivos de cadena sencilla,
3' protuberantes, con una longitud de 9 nucleótidos. El promedio
molar del contenido en pares GC es del 28,4% molar. El análisis
bioinformático del genoma de \phi3626 revela la existencia de 50
regiones codificadoras de proteínas posibles que cubren el 94,1% de
la secuencia.
Las regiones codificadoras de proteínas del
genoma de \phi3626 se pueden organizar entre tres grupos
funcionales principales, evidentes por la dirección de los ORF
(marcos de lectura abiertos) (véase la Figura 3). El primer grupo a
partir del sitio cos, en las coordenadas de 1 a 19804, transcrito
hacia la derecha del mapa genómico (Figura 3), representa genes que
codifican proteínas estructurales y el sistema lisina. Estos genes
se pueden resumir como "genes tardíos". El segundo grupo está
localizado entre los pares de bases 19805-23645 y
codifica productos responsables del control de la lisogenia, que
incluyen el sitio att, una integrasa, el represor y un
posible represor cro. El último grupo, que va desde el
nucleótido 23680 hasta el 33507, incluye los ORF que se dirigen
únicamente en dirección hacia la derecha (véase la Figura 3). Sus
posibles productos serían responsables de la replicación,
recombinación, modificación del fago de ADN y representan los genes
"tempranos".
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento: La comparación con otros
bacteriófagos (\phi105, Sfi21, \phiadh, \phiSLT, \phiPVL)
revela una organización similar del genoma de \phi3626.
Normalmente, la endolisina se localiza antes de la región de
control de la lisogenia, cuyos ORF están dirigidos, generalmente,
en la dirección opuesta (véase la Figura 3). El producto del -ORF19
presenta similitudes (50% sobre 105 aminoácidos) con la probable
holina del fago \phi105 de Bacillus subtilis (Kobayashi, K.
et al., no publicado. Número de acceso: ABO 16282).
Utilizando un análisis bioinformático implementado TmHMM, como se
describe en Sonnhammer et al. (1998, Proc. Int. Conf.
Intell. Sys. Mol. Biol., 6: 175-182) se estableció
que existe una alta probabilidad de que la presunta proteína tenga
dos regiones transmembrana en hélice. Así, se asumió tentativamente
que ORF19 codifica una holina de \phi3626.
En los bacteriófagos con cola, el gen de la
endolisina se puede localizar después del gen que codifica la
holina (véase Wang et al. (2000, Ann. Rev. Microbiol. 54:
799-825). Una búsqueda de homologías utilizando el
programa BLASTP2 revela una fuerte similitud
(72-75% sobre 265-346 aminoácidos)
del producto genético deducido de ORF20, con proteínas hipotéticas
de C. perfringens de función desconocida (véanse Garnier
et al., 1988, Plasmid 19: 135-50; Lyristis
et al., 1994, Mol. Microbiol. 12: 761-77;
Shimizu et al., 1994, J. Bacteriol. 176:
1616-23). En el extremo amino terminal, éste
presenta similitudes con las
N-acetilmuramoil-L-alanina
amidasas de diferentes fuentes (la autolisina de Bacillus
subtilis, la endolisina del bacteriófago 12862 de Bacillus
cereus, Cw/V de Paenibacillus polymyxa, con similitudes
del 43-45% sobre 163-166
aminoácidos) (véase Ishikawa et al., 1999, Mol. Gen. Genet.
262: 738-48; Kunst et al., 1997, Nature 390;
249-56; y Loessner et al., 1997, J.
Bacteriol. 179: 2845-51). Un barrido por Hidden
Markov Model (HMM) utilizando las bases de datos PFAM (véase Durbin
et al., 1988, Biological Sequence Analysis: Probabilistic
Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge Uni. Press), sugiere
también la existencia de un posible dominio de
N-acetil-muramoil-L
alanina amidasa.
Resultados: La ORF20 se identificó como
la endolisina que codifica el gen ply3626 y se encontró que
está directamente después del gen que codifica la holina. La
probabilidad de que la enzima posea un dominio amidasa en el extremo
amino indica, también, que ORF20 es una endolisina. No se ha
indicado una función conocida para el extremo carboxilo terminal de
la endolisina, pero en base al descubrimiento de que muchas
endolisinas presentan una organización modular (véase García et
al., 1990, Gene 86: 81-8), se asume que un
posible dominio de unión a la pared celular podría estar localizado
en el extremo carboxilo de ply3626.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en el análisis bioinformático, se
diseñaron cebadores para la amplificación de ply3626
utilizando PCR. Los cebadores se diseñaron para ser complementarios
a los extremos del gen y para poseer sitios de restricción antes y
después del gen, para permitir el clonaje directo en el vector de
expresión pQE30 (Quiagen). El producto de PCR se purificó, se
digirió con la endonucleasa de restricción apropiada y se ligó al
vector preparado. Los productos del ligamiento se transformaron por
electroporación en bacterias E. coli JM109, que se habían
preparado previamente por transformación con el plásmido
pACYC-IRL10, amablemente proporcionado por
Zdanovsky et al. (2000, App. Environ. Microbiol. 166:
3166-73). El plásmido pACYC-IRL10
proporciona genes para tARN a E. coli (ileX, argU y
leuW), raramente utilizados en E. coli pero
frecuentemente utilizados en Clostridia.
Las bacterias E. coli transformadas con
el vector que codifica la endolisina, se crecieron a temperatura
ambiente (22ºC), produciendo exclusivamente la endolisina mediante
la expresión de fondo del sistema vector. Se encontró que esto
evitaba la formación de cuerpos de inclusión, que se observaba
mediante el uso de IPTG para la inducción. Después de 16 horas, las
células se recuperaron mediante centrifugación (8000 g, 15
minutos). Los precipitados se resuspendieron en tampón PBS y los
extractos crudos (RE) de las células se prepararon mediante el uso
de una prensa celular francesa a 40000 kPa. El RE se centrifugó
durante 30 minutos a 35000 g y se esterilizó por filtración. La
actividad de la enzima se mostró mediante un ensayo de lisis en
células C. perfringens NCTC3110.
La endolisina se podría purificar, también,
mediante el uso del marcador HIS fusionado con la endolisina
mediante el vector de expresión pQE30. La endolisina purificada
presenta la misma actividad lítica que la endolisina en el extracto
crudo.
Para un ensayo fotométrico de actividad lítica,
se usó C. perfringens NCTC3110 como sustrato para
ply3626. Las bacterias se crecieron durante toda la noche
(500 ml), se recuperaron mediante centrifugación (8000 g durante 15
minutos) y se resuspendieron en tampón PBS (5 ml). Las células se
almacenaron hasta su uso a -20ºC. Para el ensayo de lisis, las
células se diluyeron hasta una densidad óptica de
0,7-0,8, a 490 nm, en tampón PBS. A 180 \mul de
este sustrato, se le añadieron 20 \mul del extracto crudo de
bacterias E. coli recombinantes, que producía la endolisina,
y se midieron los cambios en la densidad óptica a lo largo del
tiempo. Como control negativo, se usó un extracto crudo de bacterias
E. coli que incluía el vector con un gen ply3626
truncado en 3'. Se observó un visible reducción en la densidad
óptica, debida a la disrupción de las paredes celulares del
sustrato, para los RE que contenían la endolisina ply3626
(véase Figura 4), en comparación con el control negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento: Para la determinación de
la especificidad de sustrato de la lisina obtenida de C.
perfringens, se realizó el ensayo de lisis con ply3626,
con distintas bacterias. Se cribaron 109 cepas de 49 especies
bacterianas diferentes por su sensibilidad frente a ply3626.
Las bacterias se crecieron bajo condiciones estándar, se
recuperaron por centrifugación y los precipitados se resuspendieron
en PBS. Estos cultivos se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Las
células se diluyeron para obtener una densidad óptica de
0,5-0,9 (a 490 nm) y se usaron 180 \mul de la
suspensión celular diluida como sustrato para el ensayo de lisis,
añadiendo 20 \mul de extracto crudo que contenía ply3626 de
las bacterias E. coli recombinantes.
Una reducción sigmoidea en la densidad óptica se
interpretó como sensibilidad frente a ply3626, en
comparación con el control negativo. En el caso de que no hubiera
reducción detectable, se consideró como no sensible.
Una lista de las distintas bacterias analizadas
se presenta en las Tablas 1 y 2, a continuación, (en las que WS
significa Weihenstephan Culture Collection of Microorganisms; ATCC
significa American Type Culture Collection, Rockville, EE.UU.; y
NCTC significa National Collection of Type Cultures, PHLS,
Londres:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Resultados: Como se muestra en la Figura
5, las 48 cepas de C. perfringens fueron sensibles a la
lisina según la presente invención. Sólo una especie clostridial
adicional, la cepa C. fallax, mostró alguna sensibilidad. La
sensibilidad de Cl. fallax se podría deber a la estructura de
la pared celular de estas especies clostridiales, que es la misma
que la de C. perfringens, en cuanto a que tiene el
peptidoglicano del grupo A3\gamma entrecruzado, vía
LL-DAP, con una glicina, formando un puente (véase
Schleifer et al., 1972, Bacteriol Rev. 36:
407-77).
De todas las distintas especies bacterianas
analizadas (tanto otras especies clostridiales, tales como C.
botulinum, C. tetani, C. novyi, C. tyrobutyricum, como especies
no clostridiales, tales como Bacillus, Campylobacter,
Leuconostoc. Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Enterobacter,
E. coli, Listeria, Bifidobacterium, Enterococus, Streptococcus,
Staphylococcus), 60 en total, no se encontró ninguna que fuera
sensible a la lisina según la presente invención.
Así, sorprendentemente una lisina aislada y
secuenciada a partir de un bacteriófago de Clostridium
perfringens, es específica de especie, o es sustancialmente
especifica de la especie C. perfringens. La ventaja de esta
especificidad de especie es que la administración de dicha lisina a
un individuo, podrá resultar en la destrucción selectiva de
Clostridium perfringens y/o C. fallax (ambas especies
patógenas de Clostridium) sin dañar a bacterias beneficiosas
y/o no perjudiciales.
Todas las publicaciones mencionadas en la
memoria descriptiva anterior se incorporan en esta descripción por
referencia. Distintas modificaciones y variaciones de los
procedimientos descritos y de los sistemas de la presente
invención, serán evidentes para los expertos en la técnica, sin
alejarse del alcance y del espíritu de la presente invención.
Aunque la presente invención se ha descrito en conexión con formas
de realización específicas preferidas, se debería entender que la
invención, como se reivindica, no se debería limitar indebidamente
a tales formas de realización específicas. De hecho, se pretende
que distintas modificaciones de las formas descritas para llevar a
cabo la invención, que serán obvias para los expertos en bioquímica
y biotecnología o campos relacionados, se incluyan en el alcance de
las siguientes reivindicaciones.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Dansico A/S
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PO11939WO
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3,0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1044
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago
phi-3626
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago phi3626
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Una lisina que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
2. Un ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una lisina que comprende la secuencia
de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 2.
3. Un ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una lisina, cuya secuencia de
nucleótidos comprende la secuencia mostrada en SEQ. ID. No:1.
4. Un huésped transformado con un ácido nucleico
que codifica una lisina según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-3.
5. Un huésped según la reivindicación 4, en el
que dicho huésped es un huésped microbiano.
6. Un huésped según la reivindicación 5, en el
que dicho huésped es un organismo alimentario.
7. Un huésped según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-6, en el que dicho huésped es un
organismo que coloniza el intestino.
8. Un huésped según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-7, en el que dicho huésped es
uno o más microorganismos de los géneros siguientes:
Escherichia, Lactobacillus, Bacillus, Lactococcus,
Staphylococcus, Pediococcus.
9. Un huésped según una cualquiera de las
reivindicaciones 5-8, en el que dicho huésped es
una bacteria entre una o más de las siguientes especies:
Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus
camosus o especies relacionadas.
10. Una composición que comprende una lisina
según la reivindicación 1.
11. Una composición según la reivindicación 10,
en la que la composición es una composición farmacéutica y
comprende adicionalmente un vehículo, excipiente o diluyente,
farmacéuticamente aceptable.
12. El uso de una lisina según la reivindicación
1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un
trastorno, enfermedad o afección asociada con Clostridium
perfringens.
13. El uso según la reivindicación 12 en el que
el trastorno, enfermedad o afección es una o más de las siguientes:
pérdida de peso, enteritis necrótica, gangrena.
14. Un procedimiento in vitro para
destruir bacterias patógenas del género Clostridium,
comprendiendo dicho procedimiento la lisis de bacterias
Clostridium patógenas con la lisina definida en la
reivindicación 1 o con una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 10-11.
15. Un procedimiento in vitro según la
reivindicación 14, en el que dichas bacterias Clostridium
pertenecen a la especie Clostridium perfringens.
16. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-3 y las regiones reguladoras
asociadas a ella, para la expresión de la secuencia codificadora en
un huésped adecuado.
17. Un procedimiento de detección de bacterias
Clostridium en una muestra, utilizando un marcador de
diagnóstico basado en la lisina según la reivindicación 1.
18. Un procedimiento según la reivindicación 17,
en el que dichas bacterias Clostridium pertenecen a la
especie Clostridium perfringens.
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